TWI588155B - 具有人類ｏｘ４０專一性之抗體分子 - Google Patents

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Description

具有人類OX40專一性之抗體分子
本發明係有關於具有對OX40之抗原決定子之抗體分子及包含該抗體分子之組成物。本發明也係關於抗體分子之治療用途、製造該等抗體分子之組成物及方法。
OX40(又稱做CD134、TNFRSF4、ACT35或TXGP1L)係TNF受體超族中的一個成員，包括4-1BB、CD27、CD30及CD40。OX40之胞外配體結合功能域係由3完整半胱胺酸豐富功能域(CRD)及一部分第四C端CRD所組成(Bodmer等人，2002，生化科學趨勢，27，19-26)。
OX40之配體為OX40L及3 OX40複本結合至三元體配體而形成OX40-OX40L複合體(Compaan及Hymowitz，2006，結構，14，1321-1330)。OX40屬於與細胞膜結合的受體；但也可檢測得可溶性同功型(Taylor and Schwarz，2001，免疫學方法期刊，255，67-72)。可溶性形式功能意義目前未知。OX40在休眠T細胞不表現，但在T細胞接合T細胞受體(TCR)後的活化T細胞上一過性地表現。OX40的配體亦即OX40L乃TNF家族的一個成員且係表現在活化抗原呈現細胞(APC)上，包括B細胞、巨噬細胞、內皮細胞及樹狀細胞(DC)。
OX40為主要共同刺激受體具有最佳T細胞增殖及活存所要求的CD28及OX40之循序接合。OX40接合至活化T細胞上結果導致CD4+及CD8+ T細胞的細胞激素製造及增殖提升(Gramaglia等人，2000，免疫學期刊， 165，3043-3050，Bansal-Pakala等人，2004，免疫學期刊，172，4821-425)且可貢獻於正在進行中的Th1及Th2回應(Gramaglia等人，1998，免疫學期刊，161，6510-6517，Arestides等人，2002，歐洲免疫學期刊，32，2874-2880)。OX40共同刺激延長T細胞的存活超過免疫反應的初始效應物期，且透過抑制效應物T細胞的死亡而增加記憶T細胞的數目。
當免疫活化為過量或無法控制時，可能發生病理性過敏、氣喘、發炎、自體免疫及其它相關疾病。因OX40的功能係提升免疫反應，因此可能惡化自體免疫病及發炎病。
於疾病模型中OX40/OX40L交互作用所扮演的角色已經在OX40基因剔除小鼠獲得驗證。於實驗性過敏性腦脊髓炎(EAE)中，此乃一種多發性硬化的模型，於OX40基因剔除小鼠發現較少有嚴重臨床疾病病徵及中樞神經系統(CNS)內部發炎性浸潤的減輕(Carboni等人，2003，神經免疫學期刊，145，1-11)。又，OX40基因剔除小鼠使用卵白蛋白接種及挑釁，具有減輕的肺發炎(嗜伊紅血球減少80-90%)，黏膜製造減少，及呼吸道過度敏感顯著減輕(Jember等人，2001，J.Exp.Med.,193,387-392)。對鼠OX40配體的單株抗體已經顯示於類風濕性關節炎的膠原蛋白誘發關節炎(Yoshioka等人，2000，歐洲免疫學期刊，30，2815-2823)、EAE(Nohara等人，2001，免疫學期刊，166，2108-2115)、非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠(Pakala等人，2004，歐洲免疫學期刊，34，3039-3046)、 T細胞復原小鼠的大腸炎(Malmstrom等人，2001，免疫學期刊，166，6972-6981，Totsuka等人，2003，美國生理學期刊胃腸肝膽生理學，284，G595-G603)及肺發炎模型(Salek-Ardakani等人，2003，歐洲免疫學期刊，33，861-869)顯示有利的效果。對人類OX40L之抗體已經在恆河猴肺發炎模型側寫，結果導致於過敏原挑釁後支氣管灌洗液內的IL-5、IL-13及效應物記憶T細胞的含量減低(Seshasayee等人，2007，臨床研究期刊，117，3868-3878)。
於若干自體免疫病及發炎病已經注意到OX40的表現增加。此點包括從類風濕性關節炎病人的滑膜液單離的T細胞上OX40的表現增加(Brugnoni D等人，1998，英國風濕期刊，37，584-585；Yoshioka等人，2000，歐洲免疫學期刊，30，2815-2823；Giacomelli R等人，2001，臨床實驗風濕病19，317-320)。同時，於患有潰瘍性大腸炎及克隆氏病病人的胃腸道組織發現OX40的表現增加(Souza等人，1999，腸道，45，856-863；Stuber等人，2000，歐洲臨床研究期刊，30，594-599)及於多發性硬化病人的活動性病灶也觀察得OX40的表現增加(Carboni等人，2003，神經免疫學期刊，145，1-11)。在人類呼吸道平滑肌(ASM)及氣喘病人也檢測得OX40L。ASM細胞對OX40/OX40L的接合比較健康給予體顯示更高的發炎反應，指示OX40/OX40L路徑在氣喘病所扮演的角色(Burgess等人，2004，過敏臨床免疫學期刊，113，683-689；Burgess等人，2005，過敏臨床免疫學期刊， 115，302-308)。也曾經報告從系統性紅斑性狼瘡(SLE)病人的周邊血液單離的CD4+ T細胞表現於疾病活性相關聯的OX40的濃度升高(Patschan等人，2006，臨床實驗免疫學，145，235-242)。
OX40在過敏、氣喘及與自體免疫及發炎相聯結的疾病中扮演特定角色，此等疾病的一個治療辦法係透過抗OX40L抗體或拮抗性抗OX40抗體的使用而阻擋OX40-OX40L的傳訊。
抗OX40L抗體已經描述，例如參考WO2006/029879。曾經描述無數促效性抗OX40抗體，但極少已知拮抗性抗OX40抗體。兔多株抗小鼠OX40抗體係藉Stuber等人，1996，歐洲實驗醫學，183，979-989製造，該抗體阻斷OX40與OX40L的交互作用。鼠單株抗體131及315結合人類OX40，係藉Imura等人，1996，實驗醫學期刊，2185-2195製造。
完全人類拮抗性抗體已經說明於WO2007/062245，此等抗體的最高親和力具有對細胞表面表現OX40(活化T細胞)的親和力為11 nM。
人化拮抗性抗體已經說明於WO2008/106116及對OX40具有最佳親和力的抗體具有0.94 nM的親和力。
曾經描述其它抗OX40抗體，包括市面上得自電子生科公司(eBioscience)的鼠L106(美國專利案6,277,962)及鼠ACT35。
發明人先前於國際專利申請案WO2010/096418描述高度親和力拮抗性抗OX40抗體。
發明人先前也在國際專利申請案WO2010/035012描述新穎多重專一性抗體融合分子，後文稱作為Fab-dsFv且於此處例示說明於圖1。相同申請案提供有用的抗白蛋白結合可變區，可用來延長分子的半生期。
於本發明中，此等白蛋白結合可變區已經改良且以Fab-dsFv格式與WO2010/096418所述抗OX-40抗體組合。因此本發明提供一種結合人類OX40及人類血清白蛋白二者的雙專一性抗體融合蛋白，其係適合用於由OX40所媒介的或係與OX40的濃度升高相聯結的病理病症之治療或預防。
圖式簡單說明
圖1顯示本發明之雙專一性抗體融合蛋白(Fab-dsFV格式)。
圖2-8顯示根據本文揭示與抗體有關之某些胺基酸或DNA序列。
圖9a顯示雅利撒螢光(AlexaFluor)488標記的A26 Fab-dsFv結合至活化人類CD4+OX40+T細胞。
圖9b顯示於活性人類CD4+、OX40+ T細胞上於5% HSA存在下，A26 Fab’、A26 Fab-Fv及A26 Fab’-PEG的結合。
圖10a顯示A26 Fab-dsFv對於從暴露於家塵蟎(Dermatophagoides pteronyssinus)過敏原萃取物的PBMC所製造的細胞激素之影響。
圖10b顯示於Hu-NSG小鼠模型中A26 Fab-dsFv抑 制CD4+及CD8+ T細胞增殖的能力。
圖11a顯示藉A26 Fab-dsFv抑制OX40L結合至人類活化CD4+ OX40+ T細胞。
圖11b顯示藉A26 Fab’、A26 Fab-Fv及A26 Fab’-PEG及二對照組抑制OX40L結合至人類活化CD4+ OX40+ T細胞。
圖12a顯示A26 Fab-Fv抑制人類失誤淋巴細胞反應(MLR)。
圖12b顯示A26 Fab-Fv抑制於人類MLR期間的IFN-γ製造。
圖13顯示使用家塵蟎過敏原萃取物在二次抗原再度刺激後A26 Fab-Fv減低活化(CD25+)CD4+ T細胞的百分比。
圖14顯示於細胞轉移劑量相依性前投予Fab-Fv及Fab-PEG可於Hu-NSG模型抑制CD4+及CD8+ T細胞增殖。
人化CA044_00026抗OX40抗體於此處係稱作為A26。
本發明之抗體融合分子於此處稱作為Fab-dsFv係例示說明於圖1。於本發明中，Fab部分(包含第一重及輕鏈可變區及恆定功能域)結合人類OX40，及dsFv部分(包含藉雙硫鍵鏈接的第二重及輕鏈可變區)結合人類血清白蛋白。特別，Fab部分包含衍生自拮抗性抗OX40抗體的CDR，Fv部分包含人化抗白蛋白抗體的重及輕鏈可變 區，此等白蛋白結合可變區係藉雙硫鍵鏈接。
如此本發明提供一種結合人類OX40及人類血清白蛋白的雙專一性抗體融合蛋白，其係包括：一重鏈，其係從N端依次地包括一第一重鏈可變功能域(VH1)、一CH1功能域、及一第二重鏈可變功能域(VH2)，一輕鏈，其係從N端依次地包括一第一輕鏈可變功能域(VL1)、一CL功能域、及一第二輕鏈可變功能域(VL2)，其中該重鏈與該輕鏈係排齊，使得VH1與VL1形成一第一抗原結合位置，及VH2與VL2形成一第二抗原結合位置，其中由該第一抗原結合位置所結合的該抗原係為人類OX40，及由該第二抗原結合位置所結合的該抗原係為人類血清白蛋白，其中該重鏈之第一可變功能域(VH1)係包括為CDR-H1之SEQ ID NO：1指定的序列、為CDR-H2之SEQ ID NO：2指定的序列、及為CDR-H3之SEQ ID NO：3指定的序列，及該輕鏈之第一可變功能域(VL1)係包括為CDR-L1之SEQ ID NO：4指定的序列、為CDR-L2之SEQ ID NO：5指定的序列、及為CDR-L3之SEQ ID NO：6指定的序列，其中該第二重鏈可變功能域(VH2)係具有SEQ ID NO：11指定的序列，及該第二輕鏈可變功能域(VL2)係具有SEQ ID NO：12指定的序列，及 該第二重鏈可變功能域(VH2)與該第二輕鏈可變功能域(VL2)係藉一雙硫鍵鏈接。
於抗體可變功能域的殘基係依據Kabat等人設計的系統以習知方式編號。本系統係陳述於Kabat等人，1987，於免疫學關注蛋白質序列，美國國家衛生及人類服務部，美國國家衛生院(NIH)(後文稱作為「Kabat等人(參見上文)」)。除非另行指示否則此種編號系統係用於本說明書。
Kabat殘基標示並非經常性地直接與胺基酸殘基的線性編號有關。實際線性胺基酸序列可含有比苛刻Kabat編號更少個或更多個胺基酸，相對應於基本可變功能域結構的結構成分的縮短或插入，包括框架決定區或互補決定區(CDR)。藉將抗體序列中的同源殘基與「標準」Kabat編號序列對齊，可對指定抗體決定殘基的正確Kabat編號。
依據Kabat編號系統，重鏈可變功能域之CDR係位在殘基31-35(CDR-H1)、殘基50-65(CDR-H2)及殘基95-102(CDR-H3)。但依據Chothia(Chothia,C.及Lesk,A.M.美國分子生物學期刊，196，901-917(1987))，相當於CDR-H1之回路從殘基26延伸至殘基32。如此除非另行指示，否則此處採用的「CDR-H1」意圖指殘基26至35，如藉Kabat編號系統與Chothia拓樸學回路定義的組合描述。
依據Kabat編號系統，輕鏈可變功能域之CDR係位在殘基24-34(CDR-L1)、殘基50-56(CDR-L2)及殘基 89-97(CDR-L3)。
本發明之雙專一性融合蛋白質包含先前於WO2010/096418描述的抗OX40拮抗性抗體之Fab片段。如此處使用，「拮抗性」一詞描述可抑制及/或中和OX40之生物傳訊活性的抗體融合蛋白，例如藉阻斷OX40結合至OX40配體或實質上減少OX40結合至OX40配體，如此抑制OX40的活化。
抗體的篩選以識別結合OX40的抗體可使用測量結合至人類OX40之檢定分析及測量阻斷OX40結合至其配體OX40L的能力的檢定分析進行。結合檢定分析的實例為ELISA，特別使用人類OX40及人類Fc之融合蛋白質，其制動在平板上，及採用軛合的二次抗體以檢測結合至融合蛋白質之抗OX40抗體。阻斷檢定分析之實例為測量OX40配體融合蛋白質結合至人類CD4細胞上的OX40之阻斷作用的基於流量細胞計量術檢定分析。使用螢光標記的二次抗體來檢測結合至細胞的OX40配體融合蛋白量。此種檢定分析係尋找當上清液中的抗體阻斷配體融合蛋白質結合至OX40時信號的減低。阻斷檢定分析的額外實例為一種檢定分析，由OX40配體融合蛋白包覆至一平板媒介的天然人類T細胞共同刺激的阻斷作用係藉測量氚化胸腺苷結合加以測量。
於本發明中，可變區經人化。人化抗體(包括CDR-接枝抗體)為具有得自非人種屬的一或多個互補決定區(CDR)及得自人類免疫球蛋白分子的框架區(例如參考US 5,585,089；WO91/09967)。須瞭解只需要移轉CDR 的專一性決定殘基而非整個CDR(例如參考Kashmiri等人，2005，方法，36，25-34)。人化抗體可選擇性地進一步包含衍生自非人種屬的一或多個框架殘基，從該殘基導出CDR。
於本發明中，如WO2010/096418描述，VH1及VL1之CDR係衍生自稱作為A26的抗體。因此，於本發明之雙專一性抗體融合蛋白中，重鏈之第一可變功能域(VH1)包含為CDR-H1之SEQ ID NO：1指定的序列、為CDR-H2之SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：23指定的序列、及為CDR-H3之SEQ ID NO：3指定的序列，及該輕鏈之第一可變功能域(VL1)係包括為CDR-L1之SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：24指定的序列、為CDR-L2之SEQ ID NO：5指定的序列、及為CDR-L3之SEQ ID NO：6指定的序列。
須瞭解可對由本發明所提供的CDR做一或多個胺基酸取代、添加及/或刪除而不顯著改變抗體結合OX40及中和OX40活性的能力。熟諳技藝人士例如可使用WO2010/096418所述方法容易地測試任何胺基酸取代、添加及/或刪除的影響以決定OX40結合及OX40/OX40L交互作用的抑制。因此，本發明提供一種具有針對人類OX40之專一性的雙專一性抗體，包含CDR-H1(SEQ ID NO：1)、CDR-H2(SEQ ID NO：2)、CDR-H3(SEQ ID NO：3)、CDR-L1(SEQ ID NO：4)、CDR-L2(SEQ ID NO：5)及CDR-L3(SEQ ID NO：6)如圖2(c)所示，其中於CDR的一或多者中一或多個胺基酸，例如1或2個胺基酸已經以另一個胺基酸取代，諸如後文定義等相似胺基酸。
於一個實施例中，本發明之雙專一性抗體融合蛋白包含一重鏈，其中該重鏈之第一可變功能域包含三個CDR，其中該CDRH-1序列具有與SEQ ID NO：1指定的序列至少90%相同度或相似度，CDRH-2具有與SEQ ID NO：2指定的序列至少90%相同度或相似度及/或CDRH-3具有與SEQ ID NO：3指定的序列至少90%相同度或相似度。於另一個實施例中，本發明之雙專一性抗體融合蛋白包含一重鏈，其中該重鏈之第一可變功能域包含三個CDR，其中該CDRH-1序列具有與SEQ ID NO：1指定的序列至少95%或98%相同度或相似度，CDRH-2具有與SEQ ID NO：2指定的序列至少95%或98%相同度或相似度及/或CDRH-3具有與SEQ ID NO：3指定的序列至少95%或98%相同度或相似度。
「相同度」如此處使用，指示在對齊序列中任何特定位置，二序列間的胺基酸殘基為相同。「相似度」如此處使用，指示在對齊序列中的任何特定位置，二序列間的胺基酸殘基具有相似類型。舉例言之，白胺酸可取代異白胺酸或纈胺酸。經常彼此取代的其它胺基酸包括但非限於：-苯基丙胺酸、酪胺酸及色胺酸(具有芳香族側鏈的胺基酸)；-離胺酸、精胺酸及組胺酸(具有鹼性側鏈的胺基酸)；-天冬酸及麩胺酸(具有酸性側鏈的胺基酸)；-天冬醯胺及麩胺(具有醯胺側鏈的胺基酸)；及-半胱胺酸及蛋胺酸(具有含硫側鏈的胺基酸)。相同 程度及相似程度方便計算(運算分子生物學，Lesk，A.M.編輯，牛津大學出版社，紐約，1988；生物運算、資訊及基因體計畫，Smith,D.W.編輯，學術出版社，紐約，1993；序列資料之電腦分析，第1部分，Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編輯，修馬納(Humana)出版社，紐澤西1994；分子生物學之序列分析，von Heinje G.，學術出版社，1987；序列分析引子，Gribskov,M.及Devereux,J.編輯，安史塔通(M Stockton)出版社，紐約，1991)；BLASTTM軟體得自NCBI(Altschul,S.F.等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W.& States,D.J.1993，自然遺傳學3：266-272，Madden,T.L.等人，1996，Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人，1997，核酸研究25：3389-3402；Zhang,J.& Madden,T.L.1997，基因體研究7：649-656)。
於另一個實施例中，本發明之雙專一性抗體融合蛋白包含一重鏈，其中該重鏈之第一可變功能域包含三個CDR，其中該CDRL-1序列具有與SEQ ID NO：4指定的序列至少90%相同度或相似度，CDRL-2具有與SEQ ID NO：5指定的序列至少90%相同度或相似度及/或CDRL-3具有與SEQ ID NO：6指定的序列至少90%相同度或相似度。於另一個實施例中，本發明之雙專一性抗體融合蛋白包含一重鏈，其中該重鏈之第一可變功能域包含三個CDR，其中該CDRL-1序列具有與SEQ ID NO：4指定的序列至少95%或98%相同度或相似度，CDRL-2具有與SEQ ID NO：5指定的序列至少95%或98%相同度或相似 度及/或CDRL-3具有與SEQ ID NO：6指定的序列至少95%或98%相同度或相似度。
於一個實施例中，本發明所提供的雙專一性抗體融合蛋白的Fab部分為人化或CDR接枝抗體分子包含於SEQ ID NO：1、2、3、4、5及/或6提供的CDR中之一或多者(圖2(c))或其變體。如此處使用，「經CDR接枝的抗體分子」一詞係指抗體分子其中重鏈及/或輕鏈含有得自給予體抗體(例如屬單株抗體)的一或多個CDR(若有所需，包括一或多個改性CDR)接枝至受體抗體(例如人類抗體)的重鏈及/或輕鏈可變區框架。有關其綜論請參考Vaughan等人，自然生物技術，16，535-539，1998。於一個實施例中，替代轉移整個CDR，只有得自前文描述的CDR中任一者的專一性決定殘基中的一或多者轉移至人類抗體框架(例如參考Kashmiri等人，2005，方法，36，25-34)。於一個實施例中，只有得自前文描述之CDR中一或多者的專一性決定殘基係轉移至人類抗體框架。於另一個實施例中，只有得自前文所述各個CDR之專一性決定殘基移轉至人類抗體框架。
當CDR或專一性決定殘基被接枝時，具有有關CDR從其中衍生的給予體抗體類別/型別之任一種適當受體可變區框架序列皆可使用，包括小鼠、靈長類及人類框架區。適合地，依據本發明之CDR接枝抗體具有包含人類受體框架區的一個可變功能域以及前述CDR或專一性決定殘基中之一或多者。如此一個實施例中，提供一種中和CDR接枝抗體，其中可變功能域包含人類受體框架 區及非人類給予體CDR。
可用於本發明之人類框架實例為KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY及POM(Kabat等人，參見上文)。例如KOL及NEWM可用於重鏈，REI可用於輕鏈，及EU、LAY及POM可用於重鏈及輕鏈二者。另外，可使用人類生殖細胞序列；此等資訊可得自：http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/。
於本發明之CDR接枝抗體中，受體重鏈及輕鏈並非必要衍生自相同抗體，若有所需，可包含具有衍生自不同鏈的框架區之組合鏈。
本發明之第一重鏈可變功能域(VH1)之適當框架區係衍生自人類亞群VH3序列1-3 3-07連同JH4。輕鏈可變功能域(VL1)之輕鏈的適當框架區係衍生自人類生殖細胞亞群VK1序列2-1 1-02連同JK4。
又，於本發明之CDR接枝抗體可變區中，框架區無需具有與受體抗體確切相同的序列。例如，不尋常的殘基可能針對受體鏈類別或型別改變為更常見的殘基。另外，於受體框架區的擇定的殘基可改變，使得其係相對應於出現在給予體抗體相同位置的殘基(參考Reichmann等人，1998，自然，332，323-324)。此等改變可維持至最少需要回復給予體抗體的親和力。於需要改變的受體框架區中選擇殘基的協定係陳述於WO 91/09967。
較佳地，於本發明之第一重鏈可變區(VH1)中，若受體重鏈具有人類VH3序列1-3 3-07連同JH4，則除了一或多個給予體CDR之外，重鏈之受體框架區包含在位置 37、73、78或94中之至少一者的給予體殘基(依據Kabat等人，(參見上文))。如此，提供雙專一性抗體融合蛋白，其中在重鏈的第一可變功能域之位置37、73、78及94的至少該等殘基為給予體殘基。
較佳地，於本發明之第一輕鏈可變區(VL1)中，若受體輕鏈具有人類亞群VK1序列2-1 1-02連同JK4，則除了一或多給予體CDR外，輕鏈之受體框架區包含在位置64或71中之至少一者的給予體殘基。因此，提供一種雙專一性抗體融合蛋白，其中在輕鏈第一可變功能域的位置64及71之至少該等殘基為給予體殘基。
給予體殘基為得自給予體抗體的殘基，已經從其中原先衍生CDR的抗體。
於一個實施例中，本發明之雙專一性抗體融合蛋白包含一重鏈，其中該重鏈之第一可變功能域(VH1)包含於圖2(b)SEQ ID NO：8指定的序列。
須瞭解一或多個胺基酸例如1或2個胺基酸可對由本發明所提供的第一重鏈及輕鏈可變功能域做取代、添加、及/或刪除而不會顯著變更抗體融合蛋白質結合至OX40及中和OX40活性的能力。任何胺基酸取代、添加及/或刪除的影響容易由熟諳技藝人士例如使用WO2010/096418所述方法決定OX40結合及配體阻斷測試。
於一個實施例中，本發明之雙專一性抗體融合蛋白質包含一重鏈，其中該重鏈之第一可變功能域包含一序列具有與圖2(b)SEQ ID NO：8指定序列至少60%相同度 或相似度。於一個實施例中，本發明之雙專一性抗體融合蛋白質包含一重鏈(VH1)，其中該重鏈之第一可變功能域包含一序列具有與圖2(b)SEQ ID NO：8指定序列至少70%、80%、90%、95%或98%相同度或相似度。
於一個實施例中，本發明之雙專一性抗體融合蛋白包含一輕鏈，其中該輕鏈之第一可變功能域(VL1)包含圖2(a)SEQ ID NO：7指定的序列。
於一個實施例中，本發明之雙專一性抗體融合蛋白質包含一輕鏈，其中該輕鏈之第一可變功能域包含一序列具有與SEQ ID NO：7指定序列至少60%相同度或相似度。於一個實施例中，本發明之雙專一性抗體融合蛋白質包含一輕鏈，其中該輕鏈之第一可變功能域包含一序列具有與SEQ ID NO：7指定序列至少70%、80%、90%、95%或98%相同度或相似度。
於一個實施例中，本發明之雙專一性抗體融合蛋白包含一重鏈，其中該重鏈之第一可變功能域(VH1)包含SEQ ID NO：8指定的序列及輕鏈，其中該輕鏈之第一可變功能域(VL1)包含SEQ ID NO：7指定的序列。
於本發明之另一個實施例中，該抗體融合蛋白包含一重鏈及一輕鏈，其中該重鏈之第一可變功能域包含一序列具有與SEQ ID NO：8指定的序列至少60%相同度或相似度及該輕鏈之第一可變功能域包含一序列具有與SEQ ID NO：7指定的序列至少60%相同度或相似度。較佳地，該抗體融合蛋白包含一重鏈及一輕鏈，其中該重鏈之第一可變功能域包含一序列具有與SEQ ID NO：8指 定的序列至少70%、80%、90%、95%或98%相同度或相似度及該輕鏈之第一可變功能域包含一序列具有與SEQ ID NO：7指定的序列至少70%、80%、90%、95%或98%相同度或相似度。
於本發明之雙專一性抗體融合蛋白中，重鏈包含CH1功能域及輕鏈包含CL功能域，包括κ(kappa)或λ(lambda)。
於一個實施例中，本發明之雙專一性抗體融合蛋白包含一重鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO：10指定的序列及一輕鏈，其中該輕鏈包含SEQ ID NO：9指定的序列。
須瞭解一或多個胺基酸，例如1或2個胺基酸，可對本發明提供的抗體可變功能域及/或恆定功能域做取代、添加及/或刪除而不會顯著變更抗體結合至OX40及中和OX40活性的能力。任何胺基酸取代、添加及/或刪除之效果方便由熟諳技藝人士例如使用WO2010/096418所述方法測試，以決定OX40/OX40L交互作用的OX40結合及阻斷作用。
於本發明之一個實施例中，抗體融合蛋白包含一重鏈，其中重鏈的VH1及CH1功能域包含與SEQ ID NO：10指定的序列具有至少60%相同度或相似度之一序列。同理，該抗體融合蛋白包含一重鏈，其中重鏈的VL1及CL功能域包含與SEQ ID NO：10指定的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%相同度或相似度之一序列。
於一個實施例中，依據本發明之雙專一性抗體融合蛋白包含一輕鏈包含圖2(d)，SEQ ID NO：9指定的序列。
於本發明之一個實施例中，該抗體融合蛋白包含一輕鏈，其中該輕鏈之VL1及CH1功能域包含具有與SEQ ID NO：9指定的序列至少60%相同度或相似度之一序列。舉例言之，該抗體融合蛋白包含一輕鏈，其中該輕鏈之VL1及CH1功能域包含具有與SEQ ID NO：9指定的序列至少70%、80%、90%、95%或98%相同度或相似度之一序列。
藉本發明之雙專一性抗體融合蛋白結合的第二抗體為人類血清白蛋白。此種人類血清白蛋白係藉Fab-dsFv的Fv部分結合，該Fab-dsFv係由第二重鏈及輕鏈可變區功能域VH2及VL2組成。於本發明中，VH2及VL2係衍生自WO2010/035012所述抗體中之一者且表示該抗體之改良的更多人接枝。
於一個實施例中，第二重鏈可變功能域(VH2)具有圖3(a)SEQ ID NO：11指定的序列。
於一個實施例中，第二重鏈可變功能域(VL2)具有圖3(b)SEQ ID NO：12指定的序列。
因此，本發明提供一種結合人類OX40及人類血清白蛋白的雙專一性抗體融合蛋白，其係包括：一重鏈，其係從N端依次地包括一第一重鏈可變功能域(VH1)、一CH1功能域、及一第二重鏈可變功能域(VH2)，一輕鏈，其係從N端依次地包括一第一輕鏈可變功能域(VL1)、一CL功能域、及一第二輕鏈可變功能域(VL2)， 其中該重鏈與該輕鏈係排齊，使得VH1與VL1形成一第一抗原結合位置，及VH2與VL2形成一第二抗原結合位置，其中由該第一抗原結合位置所結合的該抗原係為人類OX40，及由該第二抗原結合位置所結合的該抗原係為人類血清白蛋白，其中該重鏈之第一可變功能域(VH1)係包括為CDR-H1之SEQ ID NO：1指定的序列、為CDR-H2之SEQ ID NO：2指定的序列、及為CDR-H3之SEQ ID NO：3指定的序列，及該輕鏈之第一可變功能域(VL1)係包括為CDR-L1之SEQ ID NO：4指定的序列、為CDR-L2之SEQ ID NO：5指定的序列、及為CDR-L3之SEQ ID NO：6指定的序列，其中該第二重鏈可變功能域(VH2)係具有SEQ ID NO：11指定的序列，及該第二輕鏈可變功能域(VL2)係具有SEQ ID NO：12指定的序列，及該第二重鏈可變功能域(VH2)與該第二輕鏈可變功能域(VL2)係藉一雙硫鍵鏈接。
較佳地，CH1功能域及第二重鏈可變功能域(VH2)係透過鏈接基連結，及CL功能域及第二輕鏈可變功能域(VL2)係透過鏈接基連結。任一種適當胜肽鏈接基序列皆可使用，在各鏈可相同或相異。適當鏈接基先前已經於WO2010/035012描述且爰引於此並融入本說明書的揭示。適當鏈接基之實例顯示於圖3(c)及圖3(d)。於一個實施例中，CH1功能域與第二重鏈可變功能域(VH2)間之 鏈接基包含圖3(c)SEQ ID NO：13給定的序列或係由SEQ ID NO：13組成。於一個實施例中，CH1功能域與第二重鏈可變功能域(VH2)間之鏈接基包含圖3(c)SEQ ID NO：13給定的序列或係由SEQ ID NO：14組成。於一個實施例中，CL功能域與第二輕鏈可變功能域(VL2)間之鏈接基包含圖3(d)SEQ ID NO：14給定的序列或係由SEQ ID NO：14組成。
於一個實施例中，輕鏈的鏈接基為15胺基酸序列，特別為GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：29)。
於一個實施例中，輕鏈的鏈接基為16胺基酸序列，特別為SGGGGSGGGGTGGGGS(SEQ ID NO：30)。
於一個實施例中，本發明提供雙專一性抗體融合蛋白其中該重鏈包含圖3(e)(SEQ ID NO：15)指定的序列或由該序列組成及輕鏈包含圖3(f)(SEQ ID NO：16)指定的序列或由該序列組成。
於本發明之一個實施例中，雙專一性抗體融合蛋白包含一重鏈及一輕鏈，其中該重鏈包含與SEQ ID NO：15指定的序列具有至少60%相同度或相似度之一序列及該輕鏈包含與SEQ ID NO：16指定的序列具有至少60%相同度或相似度之一序列。概略言之，該抗體融合蛋白包含一重鏈，其中該重鏈包含與SEQ ID NO：15指定的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%相同度或相似度之一序列及一輕鏈，其中該輕鏈包含與SEQ ID NO：16指定的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%相同度或相似度之一序列。
本發明之抗體融合分子適合具有高度結合親和力，特別為對人類OX40之皮莫耳濃度(picomolar)親和力及對人類血清白蛋白之奈莫耳濃度親和力。親和力可使用技藝界已知之任一種適當方法測量，包括表面質粒基因體共振例如百歐可(BIAcoreTM)，如針對OX40述於WO2010/096418及針對血清白蛋白述於WO2010/035012，使用經單離的天然或重組OX40或血清白蛋白或適當融合蛋白/多肽測量。
於一個實例中，親和力係使用如WO2010/096418所述的重組人類OX40胞外功能域測量。於一個實例中，使用的重組人類OX40胞外功能域為二元體，例如Fc融合二元體。較佳地，本發明之抗體融合分子具有針對經單離的人類OX40之結合親和力約200 pM或以下。於一個實施例中，本發明之抗體分子具有約100 pM或以下之結合親和力。於一個實施例中，本發明之抗體分子具有約50 pM或以下之結合親和力。於一個實施例中，本發明之抗體分子具有約40 pM或以下之結合親和力。
本發明之抗體融合分子適合對表現在活化T細胞表面上的人類OX40具有高度結合親和力，例如奈莫耳濃度親和力或皮莫耳濃度親和力。親和力可使用技藝界已知之任一種適當方法測量，包括如WO2010/096418所述方法使用活化CD4+ OX40+人類T細胞測量。特別，本發明之抗體融合分子具有對細胞表面表現的人類OX40之結合親和力約為2 nM或以上。於一個實例中，本發明之抗體分子具有針對細胞表面表現的人類OX40之結合親 和力約為1 nM或以上。於另一個實例中，本發明之抗體分子具有針對細胞表面表現的人類OX40之結合親和力約為0.5 nM或以上。於另一個實例中，本發明之抗體分子具有針對細胞表面表現的人類OX40之結合親和力約為0.2 nM或以上。
適合地，本發明之抗體融合分子具有對經單離的人類血清白蛋白之結合親和力約為50 nM或以下。適合地，本發明之抗體融合分子具有對經單離的人類血清白蛋白之結合親和力約為20 nM或以下。於一個實例中，本發明之抗體融合分子具有對經單離的人類血清白蛋白之結合親和力約為10 nM或以下。於一個實例中，本發明之抗體融合分子具有對經單離的人類血清白蛋白之結合親和力約為5 nM或以下。於一個實例中，本發明之抗體融合分子具有對經單離的人類血清白蛋白之結合親和力約為2 nM或以下。
本發明之抗體融合分子可結合人類血清白蛋白及馬來猴、小鼠及大鼠血清白蛋白。於一個實施例中，本發明之抗體融合蛋白以5 nM或以下之親和力結合馬來猴血清白蛋白。
本發明之抗體融合分子可結合人類血清白蛋白及馬來猴、小鼠及大鼠血清白蛋白。於一個實施例中，本發明之抗體融合蛋白以5 nM或以下之親和力結合小鼠血清白蛋白。
本發明之抗體融合分子可同時結合人類OX40及人類血清白蛋白。
優異地，本發明之融合分子對OX40具有高度親和力，也具有於活體內的足夠半生期而於治療上有用，例如半生期係於5日至15日，諸如7日至11日之範圍。
須瞭解由本發明為人類OX40及/或人類血清白蛋白提供的抗體融合蛋白之親和力可使用技藝界已知之任一種方法改變。因此本發明係有關於本發明之抗體分子之變異株，其對OX40或人類血清白蛋白具有改良親和力。此等變異株可藉多種親和力熟成方案獲得，包括突變複數CDR(Yang等人，分子生物學期刊，254，392-403，1995)、鏈混洗(Marks等人，生物/技術，10，779-783，1992)、大腸桿菌(E.coli)突變種系之使用(Low等人，分子生物學期刊，250，359-368，1996)、DNA混洗(Patten等人，流行生技觀點，8，724-733，1997)、噬菌體顯示(Thompson等人，分子生物學期刊，256，77-88，1996)及性聚合酶連鎖反應(PCR)(Crameri等人，自然，391，288-291，1998)。Vaughan等人(參見上文)討論此等親和力成熟方法。
於一個實施例中，本發明之雙專一性抗體融合分子阻斷OX40與OX40L間之交互作用。適合測定抗體阻斷此種交互作用的能力之無數檢定分析係說明於WO2010/096418。於一個實施例中，本發明提供一種對人類OX40具有專一性之抗體融合蛋白，其可於低於0.5 nM濃度抑制人類OX40L之結合(於2微克/毫升之終濃度測試)結合至活化人類CD4+OX40+T細胞達50%。於一個實施例中，用於檢定分析之人類OX40L為天然人類 OX40。於一個實施例中，用於檢定分析之人類OX40L為重組人類OX40。
若有所需，用於本發明之抗體可軛合至一或多個效應物分子。須瞭解效應物分子可包含單一效應物分子或二或多個此等分子，如此鏈接而形成單一分子可附接至本發明之抗體。當期望獲得鏈接至效應物分子的抗體片段時，可藉標準化學或重組DNA程序製備，其中抗體片段係直接或透過偶合劑而鏈接至效應物分子。軛合此等效應物分子之抗體之技術為技藝界眾所周知(例如Hellstrom等人，控制藥物遞送，第2版；Robinson等人編輯，1987，623-53頁；Thorpe等人，1982年，免疫綜論，62：119-58；及Dubowchik等人，1999年，藥理學及治療學83，67-123)。特定化學程序例如包括WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476及WO 03/031581。另外，當效應物分子為蛋白質或多肽時，鏈結可使用重組DNA程序達成，例如描述於WO 86/01533及EP0392745。
如此處使用之效應物分子一詞例如為抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白質、例如酶、其它抗體或抗體片段、合成或天然聚合物、核酸及其片段例如DNA、RNA及其片段，放射性核種、特別為放射碘、放射性同位素、螯合金屬、奈米粒子及通報子基諸如螢光化合物或可藉NMR或ESR光譜術檢測得化合物。
效應物分子之實例包括胞毒素或胞毒劑包括任何對細胞有害(例如殺死)的作用劑。實例包括使君子抑制素 類(combrestatins)、多拉抑制素類(dolastatins)、伊波席隆類(epothilones)、史陶羅孢靈(staurosporin)、美坦喜諾類(maytansinoids)、海綿抑制素類(spongistatins)、塊莖素(rhizoxin)、哈力軟骨素類(halichondrins)、羅里定類(roridins)、半史特林類(hemiasterlins)、紫杉(taxol)、賽托拉辛(cytochalasin)B、葛米希定(gramicidin)D、溴化乙鎓(ethidium bromide)、吐根鹼(emetine)、米妥黴素(mitomycin)、伊托波賽(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、文克斯汀(vincristine)、文布斯汀(vinblastine)、秋水仙素(colchicin)、多索盧比辛(doxorubicin)、道諾盧比辛(daunorubicin)、二羥基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米差黴素(mithramycin)、放線黴素(actinomycin)D、1-去氫睪固酮、糖皮質激素類、普羅卡因(procaine)、特差卡因(tetracaine)、利度卡因(lidocaine)、波帕諾羅(propranolol)、及普洛黴素(puromycin)及其類似物或其同系物。
效應物分子也包括但非限於代謝產物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤、6-硫基鳥嘌呤、喜塔拉賓(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、德卡巴金(decarbazine))、烷化劑(例如美克瑞沙明(mechlorethamine)、布索方(busulfan)、二溴甘露糖醇、史翠佐托辛(streptozotocin)、米妥黴素C、及順式二氯二胺鉑(II)(DDP)、希伯丁(cisplatin))、蒽環素類(anthracyclines)(例如道諾盧比辛(前稱道諾黴素(daunomycin))及多索盧比辛)、抗生素類(例如達諾黴素(dactinomycin)(前名放線黴素))、布利歐 黴素(bleomycin)、米差黴素、蒽黴素(anthramycin)(AMC)、卡里齊黴素類(calicheamicins)或度卡黴素類(duocarmycines)及抗有絲分裂劑(例如文克斯汀及文布斯汀)。
其它效應物分子可包括螯合放射性核種諸如111In及90Y、Lu177、Bi213、Californium252、Ir192及W188/Rh188；或藥物諸如但非限於烷基磷酸膽鹼類、拓樸異構酶I抑制劑、紫杉類及蘇拉明(suramin)。其它效應物分子包括蛋白質、胜肽及酶。關注的酶包括但非限於蛋白質分解酶、水解酶、溶解酶、異構酶、轉移酶。關注的蛋白質、多肽及胜肽包括但非限於免疫球蛋白類；毒素類諸如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒素(ricin)A、假單胞桿菌(pseudomonas)外毒素或白喉(diphtheria)毒素；蛋白質諸如胰島素、腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生神經生長因子或組織胞質素原活化劑；血栓形成劑或抗血管新生劑，例如血管抑制素或內皮抑制素；或生物反應改性劑諸如淋巴激素、介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、粒狀細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、粒狀細胞群落刺激因子(G-CSF)、神經生長因子(NGF)或其它生長因子及免疫球蛋白。
其它效應物分子可包括例如可用於診斷的可檢測物質。可檢測物質的實例包括各種酶、假體基團、螢光物質、發光材料、生物發光材料、放射性核種、正子發射金屬(用在正子發射斷層掃描術)、及非放射性順磁性金屬離子。大致上參考美國專利案第4,741,900號有關可軛 合至抗體用作為診斷的金屬離子。適當酶包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙醯基膽鹼酯酶；適當假體基團包括鏈絲菌抗生物素、抗生物素及生物素；適當螢光材料包括繖形酮(umbelliferone)、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三基胺螢光素、二甲胺基萘磺醯氯(dansyl chloride)及藻紅蛋白；適當冷光材料包括魯米諾(luminol)；適當生物冷光材料包括蟲螢光素酶、蟲螢光素、及亞夸靈(aequorin)；及適當放射性核種包括125I、131I、111In及99Tc。
當效應物分子為聚合物時，效應物分子通常為合成或天然聚合物，例如經光學取代的直鏈或分支鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚氧伸烷基聚合物或分支或未經分支多醣，例如同-多醣或雜-多醣。
可存在於前述合成聚合物上的特定選擇性取代基包括一或多個羥基甲基或甲氧基。
合成聚合物之特定實例包括選擇性經取代之直鏈或分支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，特別為選擇性地經取代之聚(乙二醇)諸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
特定天然聚合物包括乳糖、戊糖、葡萄聚糖、肝醣或其衍生物。
如此處使用「衍生物」一詞意圖包括反應性衍生物，例如硫醇基選擇性反應性基諸如順丁烯二醯亞胺類等。反應性基團可直接或透過鏈接基節段而鏈接至聚合物。須瞭解此種基團的殘基將於某些情況下形成為產物的一 部分作為抗體片段與聚合物間的鏈接基。
聚合物的大小可視需要改變，但通常係在500Da至50000Da，例如5000至40000Da諸如20000至40000Da之分子量範圍。
於一個實例中，適當效應物分子可透過位在抗體融合蛋白的任何可用胺基酸支鏈或終端胺基酸官能基附接，例如任何自由態胺基、亞胺基、硫醇基、羥基或羧基。此等胺基酸可天然出現於抗體片段或可使用重組DNA方法基因改造成為片段(例如參考US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971)。
本發明也提供一種經單離的DNA序列編碼本發明之抗體分子的重鏈及/或輕鏈。適宜地，該DNA序列編碼本發明之抗體分子之重鏈或輕鏈。本發明之DNA序列可包含合成DNA，例如經由化學處理、cDNA、基因體DNA或其任一種組合製造。編碼本發明之抗體分子的DNA序列可藉熟諳技藝人士眾所周知之方法獲得。例如，編碼抗體重鏈及輕鏈之部分或全部的DNA序列可視期望而從所決定的DNA序列合成或基於相對應的胺基酸序列合成。
編碼受體框架序列的DNA為熟諳技藝人士廣泛易得且容易基於其已知胺基酸序列合成。
分子生物學之標準技術可用於製備本發明抗體分子之編碼DNA序列。期望的DNA序列可使用寡核苷酸合成技術完全或部分合成。位置導向突變發生及聚合酶連鎖反應(PCR)技術可視何者適當而使用。
適當序列之實例係提供於圖5(a)SEQ ID NO：21；圖5(b)SEQ ID NO：22；圖6(a)SEQ ID NO：23；圖6(b)SEQ ID NO：24。SEQ ID NO：21之核苷酸1-63及SEQ ID NO：23之核苷酸1-63編碼信號肽序列OmpA，其經裂解而獲得本發明之拮抗性抗體融合分子。本發明也提供一種經單離的DNA序列，其編碼本發明之抗體融合蛋白之重鏈包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22。本發明也提供一種經單離的DNA序列，其編碼本發明之抗體融合蛋白之輕鏈包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24。
適當序列之其它實例提供於圖7(a)SEQ ID NO：25；圖7(b)SEQ ID NO：26；圖8(a)SEQ ID NO：27；圖6(b)SEQ ID NO：28。SEQ ID NO：25之核苷酸1-57及SEQ ID NO：27的核苷酸1-60編碼得自小鼠抗體B72.3之信號肽序列(Whittle等人，1987年，蛋白質工程學1(6)499-505)，經裂解而獲得本發明之拮抗性抗體融合分子。本發明也提供經單離的DNA序列編碼人類抗體融合蛋白質重鏈其包含SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26。本發明也提供經單離的DNA序列編碼人類抗體融合蛋白質輕鏈其包含SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28。
本發明也係關於選殖或表現載體包含一或多個本發明之DNA序列。因此，提供一種選殖或表現載體包含編碼本發明之抗體融合蛋白質的一或多個DNA序列。適當地，選殖或表現載體包含兩個DNA序列，分別編碼本發明之抗體分子的輕鏈及重鏈。適合地，依據本發明之載體包含SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：23指定的序列。SEQ ID NO：21之核苷酸1-63及SEQ ID NO：23之核苷酸1-63編碼得自OmpA之信號肽序列。
載體可組成之一般方法、轉移感染方法及培養方法為熟諳技藝人士眾所周知。就此方面而言，參考「分子生物學之流行方案」，1999年，F.M.Ausubel(編輯)，威利科技公司，紐約及冷泉港出版社出版的Maniatis手冊。
也提供一種包含一或多個選殖或表現載體的宿主細胞，該等載體係包含編碼本發明之抗體融合蛋白的一或多個DNA序列。任何適當宿主細胞/載體系統皆可用以表現編碼本發明之抗體分子的DNA序列。細菌諸如大腸桿菌及其它微生物系統可用於真核生物，例如哺乳動物，也可使用宿主細胞表現系統。適當哺乳動物宿主細胞表現系統包括CHO、骨髓瘤細胞或融合瘤細胞。
本發明也提供一種製造依據本發明之抗體融合分子之方法，包含於適合導致編碼本發明之抗體分子的DNA所得蛋白質表現之條件下，培養含有本發明之載體之宿主細胞，及單離該抗體分子。
為了製造包含重鏈及輕鏈之產物，細胞系可使用兩種載體轉移，編碼輕鏈多肽之第一載體及編碼重鏈多肽之第二載體。另外，可使用單一載體，該載體包括編碼輕鏈及重鏈多肽之序列。
當本發明之抗體融合蛋白用於病理病況之治療及/或預防時，本發明也提供一種包含本發明之抗體分子組合醫藥上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑中之一或多者的醫藥或診斷組成物。如此，提供本發明之抗體融合蛋 白質用於藥物的製造。該組成物通常係供應為無菌醫藥組成物之一部分且通常包括醫藥上可接受之載劑。本發明之醫藥組成物可額外包含醫藥上可接受之輔劑。
本發明也提供一種醫藥或診斷組成物之製備方法，包含添加及混合本發明之抗體融合蛋白連同醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑中之一或多者。
抗體融合分子可為醫藥或診斷組成物中的唯一活性成分，或可伴隨其它活性成分包括其它抗體成分，例如抗TNF、抗IL-1β、抗T細胞、抗IFNγ或LPS抗體、或非抗體成分諸如黃嘌呤類。其它適當活性成分包括可誘發耐藥性的抗體例如抗CD3抗體或抗CD4抗體。
於又一實施例中，依據本文揭示之抗體融合蛋白或組成物係採用以組合額外醫藥活性劑，例如皮質類固醇(諸如丙酸芙提卡松(fluticasone))及/或β-2-促效劑(例如沙布塔摩(salbutamol)、沙美特羅(salmeterol)或佛摩特羅(formoterol))或細胞生長及增殖抑制劑(諸如拉帕黴素(rapamycin)、環磷醯胺(cyclophosphmide)、甲胺喋呤)或其它CD28及/或CD40抑制劑。於一個實施例中，抑制劑為小分子。於另一個實施例中，抑制劑為該目標之專一性抗體。
醫藥組成物適合包含治療上有效量之本發明之抗體融合蛋白。如此處使用，「治療上有效量」一詞係指需要治療、改善或預防目標疾病或病症，或具有可檢測的治療或預防效果之治療劑用量。針對任何抗體，治療有效量初步可於細胞培養檢定分析或於動物模型通常為齧齒 類、兔類、犬類、豬類或靈長類估計。動物模型也可用來決定適當濃度範圍及投藥途徑。然後此等資訊可用來決定供人類投藥的有用劑量及途徑。
用於人體的精確治療有效量將取決於病情嚴重程度、個體的年齡、體重及性別、飲食、投藥時間及頻率、藥物組合、對治療的反應敏感度及耐藥性/反應。此等用量可藉例行實驗決定或係落入於臨床醫師的判定範圍內。通常治療有效量為0.01毫克/千克至50毫克/千克，例如0.1毫克/千克至20毫克/千克。醫藥組成物可以每劑含有預定量之本發明活性劑的單位劑型方便的包裝呈現。
組成物可個別投予病人或可組合其它作用劑、藥物或激素投予(例如同時、循序或分開投予)。
本發明之抗體融合分子之投予劑量係取決於治療的病況本質、所呈現的發炎程度以及抗體分子是否預防使用或治療既有的病況。
劑量頻率將取決於抗體融合分子的半生期及其效果持續時間。若抗體分子具有短半生期(例如2小時至10小時)，則需要每日投予一劑或多劑。另外，若抗體分子具有長半生期(例如2日至15日)，則只需要每日一次投藥、每週一次或甚至每一個月或兩個月一次。
醫藥上可接受之載劑本身不應誘導對接受該組成物的個體產生有害的抗體，也不應具有毒性。適當載劑可為大型代謝緩慢的巨分子諸如蛋白質類、多肽類、微脂粒類、多醣類、聚乳酸類、聚乙醇酸類、聚合胺基酸類、 胺基酸共聚物類及無活性病毒粒子。
可使用醫藥上可接受之鹽類，例如無機酸鹽類，諸如氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽及硫酸鹽及有機酸鹽類諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽及苯甲酸鹽。
治療性組成物中之醫藥上可接受之載劑可額外含有益體諸如水、鹽水、甘油及乙醇。此外，附屬物質諸如濕潤劑或乳化劑或pH緩衝物質可存在於此等組成物。此等載劑許可醫藥組成物被調配為錠劑、丸劑、糖衣錠、膠囊劑、液劑、膠漿劑、糖漿劑、料漿劑及懸浮液劑，用於由病人口服攝食。
適當投藥劑型包括適合經腸道外投藥的劑型，例如藉注射或輸注，例如藉大劑量注射或連續輸注。當產品係用於注射或輸注時，產品可呈於油性或水性載媒劑的懸浮液劑、溶液劑或乳液劑，產品可含有配方劑諸如懸浮劑、保藏劑、安定劑及/或分散劑。另外，抗體分子可呈乾燥形式，用來於使用適當無菌液體重新調製。
一旦配方時，本發明之組成物可直接投予個體。可接受治療的個體可為動物。但於一或多個實施例中，組成物適合投予人體。
適宜地，於依據本文揭示之配方中，最終配方之pH係於抗體或片段的等電點數值不同，例如若配方的pH為7，則8-9或以上的pI可能為適合。雖然不欲受理論所限，但相信如此最終將提供具有改良安定性之最終配方，例如抗體或片段留在溶液內。
例如於一個面向中，優異地，本文揭示之融合分子 不具有相對應於總中性分子的pI。如此使得分子對凝聚較不敏感。
本發明之醫藥組成物可藉多種途徑中之任一種投予，包括但非限於口服、靜脈、肌肉、動脈內、髓內、鞘內、室內、穿皮、經皮(例如參考WO98/20734)、皮下、腹內、鼻內、腸道、局部、舌下、陰道內或直腸途徑。沈積性噴霧也可用來投予本發明之醫藥組成物。典型地，醫藥組成物可製備成注射劑，包括液體溶液劑或懸浮液劑。也可製備適合在注射前溶解於或懸浮於液體載媒劑的固體劑型。
組成物的直接遞送可藉皮下、腹內、靜脈或肌肉注射達成，或遞送至組織間隙空間。組成物也可投予病灶內部。劑量處理可為單劑時程或多劑時程。須瞭解組成物內之活性成分將為抗體分子。因此將對胃腸道的分解作用敏感。如此，若組成物與藉利用胃腸道途徑投藥，則該組成物須含有可保護抗體免於分解，但一旦已經從胃腸道吸收後，可釋放抗體的作用劑。
醫藥上可接受之載劑的徹底討論請參考雷明頓(Remington’s)製藥科學(默克出版公司(Mack Publishing Company)，紐約，1991年)。
於一個實施例中，配方係提供為包括吸入投藥用之局部投藥配方。
適當可吸入性製劑包括可吸入性散劑、含有推進劑氣體之定量噴霧劑，或不含推進劑氣體的可吸入性溶液劑。依據本文揭示含有活性成分之可吸入性散劑單純係 由前述活性物質或由前述活性物質與生理上可接受之賦形劑組成。
此等可吸入性散劑可包括單醣類(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、雙醣類(例如乳糖、蔗糖、麥芽糖)、寡醣類及多醣類(例如葡萄聚糖類)、多元醇類(例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇)、鹽類(例如氯化鈉、碳酸鈣)或此等彼此之混合物。適合使用單醣或雙醣，特別乳糖或葡萄糖的使用時並不排除其水合物形式。
於肺臟沈積之粒子要求粒子大小小於10微米，諸如1至9微米，例如0.1至5微米，特別為1至5微米。活性成分(諸如抗體或抗體片段)之粒子大小特別重要。
可用於製備可吸入性噴霧劑的推進劑氣體為技藝界所已知。適當推進劑氣體係選自於烴類諸如正丙烷、正丁烷或異丁烷及鹵代烴類諸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、環丙烷或環丁烷之氯化及/或氟化衍生物。前述推進劑氣體可以其本身或呈混合物形式使用。
特別適合之推進劑氣體為選自於TG11、TG12、TG134a及TG227之鹵化烷衍生物。前述鹵化烴類中，以TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)及TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物為特佳。
含推進劑氣體之可吸入性噴霧劑也含有其它成分諸如助溶劑、安定劑、表面活性劑(界面活性劑)、抗氧化劑、潤滑劑及調整pH的手段。全部此等成分皆為技藝界所已知。
依據本發明之含有推進劑氣體之可吸入性噴霧劑可 含有高達5%重量比之活性物質。依據本發明之噴霧劑例如含有0.002至5%重量比，0.01至3%重量比，0.015至2%重量比，0.1至2%重量比，0.5至2%重量比或0.5至1%重量比之活性成分。
另外，局部投予肺臟也可藉液體溶液劑或懸浮液劑配方投予，例如採用裝置例如霧化器，例如連結至壓縮機的霧化器(例如帕利呼吸設備公司(Pari Respiratory Equipment,Inc.)，美國維吉尼亞州，里奇蒙郡製造的連結至帕利主機(Pari Master(R))的帕利LC-噴霧(Pari LC-Jet Plus(R))霧化器)。
本發明之抗體融合蛋白可於溶劑例如呈溶液或懸浮液形式遞送。可懸浮於適當生理溶液，例如鹽水或其它藥理上可接受之溶劑或緩衝液。技藝界已知之緩衝溶液每一毫升水可含有0.05毫克至0.15毫克EDTA二鈉，8.0毫克至9.0毫克氯化鈉，0.15毫克至0.25毫克聚山梨酸酯，0.25毫克至0.30毫克無水檸檬酸，及.45毫克至0.55毫克檸檬酸鈉，因而達成約4.0至5.0的pH。懸浮液例如可採用增溶化抗體。
治療性懸浮液劑或溶液劑配方也可含有一或多種賦形劑。賦形劑為技藝界眾所周知且包括緩衝劑(例如檸檬酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑及碳酸氫鹽緩衝劑)、胺基酸類、尿素、醇類、抗壞血酸、磷脂類、蛋白質類(例如血清白蛋白)、EDTA、氯化鈉、微脂粒類、甘露糖醇、山梨糖醇、及甘油。溶液劑或懸浮液劑也可包囊於微脂粒或可生物分解微球內。配方通常係採用無 菌製造方法以實質上無菌劑型提供。
如此可包括藉熟諳技藝人士熟悉之方法將配方用的緩衝溶劑/溶液藉過濾滅菌，抗體於無菌緩衝溶劑溶液內無菌懸浮，及配方藉熟諳技藝人士熟知之方法配送入無菌容器內。
依據本文揭示之可霧化配方例如可呈包裝於鋁箔包裝的單劑單位(例如已密封的塑膠容器或小瓶)提供。各個容器含有例如2毫升體積溶劑/溶液緩衝劑之單位劑量。
此處揭示之抗體融合蛋白適合經霧化遞送。
也涵蓋本發明之抗體可使用基因治療投予。為了達成此項目的，於適當DNA成分控制之下，含有編碼抗體分子之重鏈及輕鏈的DNA序列被導入病人體內，使得抗體鏈從DNA序列表現且於原位組裝。
本發明也提供用於控制發炎疾病例如急性或慢性發炎病的抗體融合分子(或包含該抗體融合分子之組成物)。適宜地，抗體分子(或包含該抗體分子之組成物)可用來減輕發炎過程或預防發炎過程。於一個實施例中，提供活化T細胞的原位製造，特別涉及不當發炎免疫反應，例如被徵召至此種發炎免疫反應的附近或位置。
如此處採用，活化T細胞的減少比較治療前或未經治療可減少10、20、30、40、50、60、70、80、90或以上百分比。優異地，依據本發明使用抗體、片段或組成物治療許可減低活化T細胞的含量，而不減少病人的全面性T細胞含量(未經活化的T細胞)。如此導致較少副 作用，且可防止病人體內T細胞的耗竭。
本發明也提供本發明之抗體融合分子用於由OX40所媒介或與OX40之濃度升高相聯結的病理病症之治療或預防。該病理病症例如可選自於感染(病毒性、細菌性、真菌性及寄生蟲)、與感染相聯結的內毒性休克、關節炎、類風濕性關節炎、氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨盆腔發炎性疾病、阿茲海默氏病、發炎性腸病、克隆氏病、潰瘍性大腸炎、皮羅尼氏病(Peyronie’s Disease)、乳糜瀉、膽囊病、披洛尼朵病(Pilonidal disease)、腹膜炎、乾癬、血管炎、手術沾黏、中風、第I型糖尿病、萊姆氏病、關節炎、腦膜炎、自體免疫性葡萄膜炎、中樞神經系統及周邊神經系統之免疫媒介的發炎病症諸如多發性硬化、狼瘡(諸如系統性紅斑性狼瘡)及基蘭巴爾症候群(Guillain-Barr syndrome)、異位性皮膚炎、自體免疫性肝炎、纖維變性肺泡炎、葛雷夫氏病(Grave’s disease)、IgA腎病變、特發性血小板缺少性紫斑、梅尼爾氏病(Meniere’s disease)、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、肉狀瘤病、硬皮病、韋格納氏(Wegener’s)肉芽腫、其它自體免疫病症、胰炎、創傷(手術)、植體對宿主病、移植排斥、心臟病包括缺血性心臟病諸如心肌梗塞及動脈硬化、血管內凝血、骨質吸收、骨質疏鬆、骨關節炎、牙周炎及胃酸過少。
於一個實施例中，依據本發明之抗體融合蛋白係用於治療過敏、COPD、自體免疫病、類風濕性關節炎、氣喘、植體對宿主病、克隆氏病、潰瘍性大腸炎、第1型 糖尿病、多發性硬化、系統性紅斑性狼瘡、重症肌無力、葛雷夫氏病、移植排斥、韋格納氏肉芽腫、賀諾雄蘭(Henoch-Schonlein)紫斑、系統性硬化或病毒誘發肺發炎。
於一個實施例中，依據本發明之抗體融合蛋白可用於選自於由下列所組成的疾病之治療：過敏、COPD、自體免疫病、類風濕性關節炎、氣喘、植體對宿主病、克隆氏病、潰瘍性大腸炎、第1型糖尿病、多發性硬化、系統性紅斑性狼瘡、重症肌無力、葛雷夫氏病、移植排斥、韋格納氏肉芽腫、賀諾雄蘭紫斑、系統性硬化或病毒誘發肺發炎。
本發明也提供依據本發明之抗體融合分子用於疼痛，特別與發炎相聯結的疼痛之治療或預防。
於一個實施例中，本文揭示之融合分子發揮作用的機轉包括T細胞增殖或存活抑制、TReg產生的增強、B細胞分化減少及/或細胞激素製造減少中之一或多者。
本發明進一步提供依據本發明之抗體融合分子或組成物用於由OX40所媒介的或與OX40濃度升高相聯結的病理病症之治療或預防用藥物的製造，特別該病理病症為類風濕性關節炎、氣喘或COPD。
本發明進一步提供依據本發明之抗體分子、片段或組成物用於本文描述的一或多種醫藥適應症的治療或預防用藥物的製造。
本發明之抗體融合分子或組成物可用在任一種治療，於該種治療中期望減少OX40對人體或動物體的影 響。OX40可能在體內循環，或可能以非期望的高濃度存在於侷限在身體的特定位置，例如發炎部位。
於一個實施例中，本發明之抗體融合分子或包含該抗體融合分子之組成物係用於發炎病諸如此處所述疾病的控制。
本發明也提供一種治療患有OX40所媒介的病症或患有該病症風險之人體或動物體之方法，該方法包含對該個體投予有效量之本發明之抗體融合分子或包含該抗體融合分子之組成物。
於一個實施例中，提供一種結合人類OX40及人類血清白蛋白的雙專一性抗體融合蛋白呈實質上純化形式，特別為不含或實質上不含內毒素及/或宿主細胞蛋白或DNA。
如前文使用之純化形式意圖表示至少90%純度，諸如91、92、93、94、95、96、97、98、99% w/w或以上的純度。
實質上不含內毒素通常係指每毫克抗體產物的內毒素含量為1 EU或以下，諸如每毫克產物0.5 EU或0.1 EU。
實質上不含宿主細胞蛋白或DNA通常係指每毫克抗體產物的宿主細胞蛋白或DNA含量為400微克或以下，諸如每毫克100微克或以下，特別每毫克20微克，視何者適宜決定。
本發明之抗體融合分子也可用於診斷，例如用於涉及OX40的疾病狀態的活體內診斷及造影。
優異地，本融合分子相信以適當治療劑量投予人體為安全，特別由於本融合分子並非超促效劑，因此不可能引發細胞激素風暴。
如此處使用的超促效劑係指於無TCR接合之下膨脹T細胞。
於一個實施例中，A26 Fab-Fv減少分裂指數指示在族群中有較少細胞接受分裂；此種影響推定係由於表現OX40的NK細胞所媒介。分裂指數表示在原先族群中的細胞已經進行細胞分裂且包括未分裂細胞。
增殖指數只反映出有反應族群的增殖，及於一個實施例中，使用此種測量法A26 Fab-Fv的抑制效果相對減低。
於本說明書脈絡中，包含一詞意圖表示包括。
當技術上適當時可組合本發明之多個實施例。
此處所述實施例包含某些特徵/元件。揭示內容也擴充至包含該等特徵/元件或主要包含該等特徵/元件的分開實施例。
於後文實施例中，本發明進一步係藉舉例說明，實施例參考附圖，附圖中：
實施例
圖式之詳細說明
圖1：本發明之雙專一性抗體融合蛋白，稱作為Fab-dsFv。
圖2：
a)抗體A26之輕鏈V區(SEQ ID NO：7)
b)抗體A26之重鏈V區(SEQ ID NO：8)
c)抗體A26之CDRH1(SEQ ID NO：1)、CDRH2(SEQ ID NO：2)、CDRH3(SEQ ID NO：3)、CDRL1(SEQ ID NO：4)、CDRL2(SEQ ID NO：5)及CDRL3(SEQ ID NO：6)
d)抗體A26 Fab成分之輕鏈(SEQ ID NO：9)
e)抗體A26 Fab成分之輕鏈(SEQ ID NO：10)
圖3
a)抗白蛋白Fv成分645gH5之重鏈(SEQ ID NO：11)
b)抗白蛋白Fv成分645gL4之輕鏈(SEQ ID NO：12)
c)鏈接基1(SEQ ID NO：13)
d)鏈接基2(SEQ ID NO：14)
e)Fab-dsFv重鏈(SEQ ID NO：15)
f)Fab-dsFv輕鏈(SEQ ID NO：16)
圖4
a)645g1重鏈可變功能域(SEQ ID NO：17)
b)645g1輕鏈可變功能域(SEQ ID NO：18)
c)A26 Fab-dsFv 645gH1(SEQ ID NO：19)
d)A26 Fab-dsFv 645gH1(SEQ ID NO：20)
圖5
a)DNA編碼Fab-dsFv之重鏈包括OmpA前導子(SEQ ID NO：21)
b)DNA編碼Fab-dsFv之重鏈不含OmpA前導子(SEQ ID NO：22)
圖6
a)DNA編碼Fab-dsFv之輕鏈包括OmpA前導子(SEQ ID NO：23)
b)DNA編碼Fab-dsFv之輕鏈不含OmpA前導子(SEQ ID NO：24)
圖7
a)DNA編碼Fab-dsFv之重鏈包括B72.3前導子(SEQ ID NO：25)
b)DNA編碼Fab-dsFv之重鏈不含B72.3前導子(SEQ ID NO：26)
圖8
a)DNA編碼Fab-dsFv之輕鏈包括B72.3前導子(SEQ ID NO：27)
b)DNA編碼Fab-dsFv之輕鏈不含B72.3前導子(SEQ ID NO：28)
圖9a顯示雅利撒螢光(AlexaFluor)488標記A26 Fab-dsFv結合至活化人CD4+OX40+T細胞
圖9b顯示於活化人CD4+、OX40+T細胞上的5% HSA存在下A26 Fab’、A26 Fab-Fv及A26 Fab’-PEG之結合。
圖10a顯示A26 Fab-dsFv對於從暴露於家塵蟎(Dermatophagoides pteronyssinus)過敏原萃取物的PBMC之細胞激素製造的影響。
圖10b顯示於Hu-NSG小鼠模型中A26 Fab-dsFv抑制CD4+及CD8+ T細胞增殖的能力。
圖11a顯示藉A26 Fab-dsFv對OX40L結合至人類活化CD4+ OX40+ T細胞的抑制作用。
圖11b顯示藉A26 Fab’、A26 Fab-Fv及A26 Fab’-PEG及二對照組對OX40L結合至人類活化CD4+ OX40+ T細胞的抑制作用。
圖12a顯示A26 Fab-Fv抑制人類失誤淋巴細胞反應(MLR)。
圖12b顯示A26 Fab-Fv於人類MLR期間抑制IFN-γ的製造。
圖13顯示使用家塵蟎過敏原萃取物二次抗原再度刺激後，A26 Fab-Fv減低活化(CD25+)CD4+ T細胞的百分比。
圖14顯示於細胞轉移劑量相依性之前投予Fab-Fv及Fab-PEG抑制於Hu-NSG模型中CD4+及CD8+ T細胞增殖。
DNA操弄及一般方法
勝任(Competent)大腸桿菌種系用於轉形及例行培養生長。DNA限剪及修飾酶係得自羅氏診斷公司(Roche Diagnostics Ltd.)及新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)。質體製劑係使用麥西(Maxi)質體純化套組(葵亞金公司(QIAGEN)，型錄號碼12165)進行。DNA排序反應係使用ABI(稜鏡大染色(Prism Big Dye)終結器排序套組(型錄號碼4304149)進行且於ABI 3100自動化排序器(應用生物系統公司(Applied Biosystems)上進行)。資料係使用程式排序器(吉納可(Genecodes))分析。寡核苷酸係得自希格瑪公司(Sigma)或英維仇貞公司(Invitrogen)。編碼初始V區序列之基因係藉DNA2.0藉 自動化合成方法組成，且經修改來藉寡核苷酸導向突變發生產生接枝版本。Fab-Fv之濃度係藉以蛋白質-G為基的HPLC方法測定。
實施例1
於A26Fab-645dsFv中645個不同人化接枝之產生及分析
發明人先前描述Fab-dsFv抗體格式(圖1)(偶爾於此處簡稱為Fab-Fv)及於WO2010/035012稱作為「645gH1gL1」的人化抗白蛋白抗體。發明人先前已經描述於WO2010/096418中稱作為「A26」之人化拮抗性抗OX40抗體及其PEG化Fab’片段的產生。此處發明人描述稱作為645dsgH5gL4的抗體「645」之新穎改良人化接枝的產生及結合於Fv成分之接枝及於Fab成分之「A26」可變區之Fab-dsFv抗體分子的產生。A26之可變區係給定於圖2a及圖2b(SEQ ID NO：7及8)。組合A26之可變區及恆定區序列係顯示於圖2d及圖2e(SEQ ID NO：9及10)。
645gH1及gL1之序列係顯示於圖4(a)及(b)，SEQ ID NO：17及18。當使用Fab’-PEG或A26 Fab’-PEG等詞時表示WO2010/096418所述的A26 Fab-40KPEG’。
1.1 A26Fab-645dsFv(gH1gL1)及A26Fab-645dsFv(gH5gL4)G4S鏈接基質體的組成
A26Fab-645dsFv(gL1)輕鏈的總編碼區(SEQ ID NO：20)係在HCMV-MIE啟動基因及SV40E polyA序列的控制之下選殖入UCB哺乳動物表現載體。645dsFv(gL1) 之輕鏈可變區(SEQ ID NO：18)係藉重疊PCR方法突變成645dsFv(gL4)(SEQ ID NO：12)。A26Fab-645dsFv(gH1)輕鏈的總編碼區(SEQ ID NO：19)係在HCMV-MIE啟動基因及SV40E polyA序列的控制之下選殖入UCB哺乳動物表現載體。645dsFv(gH1)之重鏈可變區(SEQ ID NO：17)係藉重疊PCR方法突變成645dsFv(gH5)(SEQ ID NO：11)。組成體藉排序證實。二組成體含有圖3(d)SEQ ID NO：14指定的3xG4S鏈接基。
1.2 A26Fab-645dsFv(gH1gL1)及A26Fab-645dsFv(gH5gL4)之哺乳動物表現
依據製造商的指示使用英維仇貞293感染素(293fectin)轉移感染試劑以重鏈及輕鏈質體轉移感染HEK293細胞。簡言之，25微克重量質體及25微克輕鏈質體與100微升293感染素及1700微升歐提波(Optipro)媒體於室溫培養20分鐘。然後混合物添加至50x106 HEK293細胞於50毫升懸浮液及於37℃振搖培養6日。6日後，於1500xg離心收集上清液歷經10分鐘以去除細胞及然後進行0.22微米無菌過濾。
1.3 A26Fab-645dsFv(gH1gL1)及A26Fab-645dsFv(gH5gL4)之蛋白質G純化
約50毫升經0.22微米過濾的上清液使用阿米康(Amicon)雅徹-15(Ultra-15)濃縮機具有10 kDa分子量截留膜離心濃縮至約2毫升及於擺出轉子(swing out rotor)於4000xg離心。1.8毫升濃縮上清液以1毫升/分鐘施用至以20 mM磷酸鹽，40 mM NaCl pH 7.4平衡的1毫升 迦瑪納普斯(Gammabina Plus)希法羅斯(Sepharose)(GE健康照護公司(GE Healthcare))管柱。管柱以20 mM磷酸鹽、40 mM NaCl pH 7.4洗滌，結合材料以0.1 M甘胺酸/HCl pH 2.7洗提。收集洗提峰，使用2 M Tris/HCl pH8.5將pH調整至約pH7。濃縮pH經調整的洗提分，及使用Amicon Ultra-15濃縮機具有10 kDa分子量截留膜滲濾入20 mM磷酸鹽，150 mM NaCl pH 7.4及於擺出轉子於4000xg離心至終體積約0.3毫升。
1.4 尺寸排除分析A26Fab-645dsFv(gH1gL1)及A26Fab-645dsFv(gH5gL4)
經蛋白質G純化的樣本係藉尺寸排除HPLC分析。樣本於舒跑德(Superdex)200 10/300 GL崔康(Tricorn)管柱(GE健康照護公司)上分離，使用PBS pH 7.4的等張梯度以1毫升/分鐘展開。峰檢測係於280奈米進行，與已知分子量蛋白質相對於洗提體積之標準曲線做比較求出名目分子量。645dsFv之人化接枝從gH1gL1改成gH5gL4，結果導致表現的A26Fab-645dsFv的單體百分比從59%增至71%，增加12%，而dsFv的熱的安定性無任何變化(資料未顯示)或dsFv對HSA的結合親和力並無任何改變(資料未顯示)。
實施例2
2.1 A26 Fab-dsFv(645gH5gL4)結合OX40之百歐可動力學
於本實施例及隨後各實施例中，A26 Fab-dsFv 645gH5gL4具有SEQ ID NO：15指定的重鏈序列(圖3(e)) 及SEQ ID NO：16指定的輕鏈序列(圖3(f))亦即重鏈含有圖3(c)SEQ ID NO：13指定的G4S、G4T、G4S鏈接基。
BIA(生物分子交互作用分析)係使用百歐可T200(GE健康照護公司)進行。親和力純質(Affinipure)F(ab’)2片段山羊抗人IgG，F(ab’)2片段專一性(捷克森免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))係透過胺偶合化學制動在CM5感測器晶片上至捕集濃度5000反應單位(RU)。HBS-EP緩衝液(10 mM HEPES pH 7.4，0.15 M NaCl，3 mM EDTA，0.05%界面活性劑P20，GE照護公司)用作為流動緩衝液，流速為10微升/分鐘。A26 Fab’於0.5微克/毫升或A26Fab-dsFv於1微克/毫升的10微升注射用於藉制動化抗人IgG-F(ab’)2捕捉。以30微升/分鐘流速於各種濃度(25 nM至1.5625 nM)，人類OX40係在捕捉的A26上滴定。表面藉2x10微升注射50 mM HCl，接著以10微升/分鐘流速藉5微升注射5 mM NaOH再生。背景扣除結合曲線係遵照標準程序使用T200評估軟體(版本1.0)分析。動態參數係從匹配演算法測定。
2.2 A26 Fab-dsFv(645gH5gL4)結合白蛋白之百歐可動力學
BIA(生物分子交互作用分析)係使用百歐可T200(GE健康照護公司)進行。親和力純質F(ab’)2片段山羊抗人IgG，F(ab’)2片段專一性(捷克森免疫研究公司)係透過胺偶合化學制動在CM5感測器晶片上至捕集濃度5000反應單位(RU)。HBS-EP緩衝液(10 mM HEPES pH 7.4，0.15 M NaCl，3 mM EDTA，0.05%界面活性劑P20，GE照護公司)用作為流動緩衝液，流速為10微升/分鐘。A26 Fab’於0.75微克/毫升或Fab-Fv於1微克/毫升的10微升注射用於藉制動化抗人IgG-F(ab’)2捕捉。以30微升/分鐘流速於各種濃度(50 nM至6.25 nM)，人類血清白蛋白(HSA)、小鼠血清白蛋白(MSA)及恆河猴血清白蛋白(CSA)於所捕捉的Fab-Fv上滴定。表面藉2x10微升注射50 mM HCl，接著以10微升/分鐘流速藉5微升注射5 mM NaOH再生。背景扣除結合曲線係遵照標準程序使用T200評估軟體(版本1.0)分析。動態參數係從匹配演算法測定。
2.3 A26Fab-dsFv(645gH5gL4)同時結合OX40及白蛋白之驗證
評估人類OX40及人類血清白蛋白同時結合至A26 Fab-dsFv。如於百歐可動力學中用於結合A26 Fab-dsFv白蛋白的方法陳述，A26 Fab-dsFv組成體係捕捉至感測器晶片表面。50 nM HAS、25 nM OX40或具有終濃度50 nM HSA及25 nM OX40的混合溶液係分別於經捕捉的A26 Fab-dsFv上滴定。組合HSA/OX40溶液之結合反應係相當於獨立注射的反應。如此證實Fab-dsFv可同時結合至人類OX40及HSA二者。
2.4 A26 Fab-dsFv(645gH5gL4)之基於細胞的親和力方法：
A26 Fab-Fv結合至人類活化CD4+ OX40+ T細胞。
PBMC係在斐可(Ficoll)梯度上分離且於37℃，5%二氧化碳，100%濕度使用4微克/毫升PHA-L活化3日。使用磁珠(用於人類之CD4+ T細胞單離套組II；米特尼生技公司(Miltenyi Biotec))藉負面選擇單離CD4+ T細胞。約1x105細胞於4℃於抗體存在下於Facs緩衝液(PBS/0.2% BSA/0.09% NaN3)或Facs緩衝液補充5% HSA共同培養。抗體終濃度係於48 nM-0.0005 nM之範圍。藉流體細胞計量術使用法斯凱伯(FACScalibur)(貝騰迪金森公司(Becton Dickinson))分析前，細胞於PBS洗滌。在兩種緩衝液狀況下產生兩個滴定細胞集合，一個使用 A26 Fab-dsFv及第二個使用不相關的對照組Fab-Fv來測定非專一性結合。結合抗體的莫耳數係由使用包含不同的但已知數量之螢光染料的珠粒所產生的標準曲線，使用內插值算出。幾何平均螢光值係在細胞及珠粒之流動細胞計量分析決定。非專一性結合從A26 Fab-dsFv值中扣除，如此產生的專一性結合曲線係藉線性迴歸使用一個位置結合方程式(圖板稜鏡®(Graphpad Prism))測定KD。
為了測定A26 Fab-dsFv對細胞表面表現抗原的親和力，使用活化CD4+OX40+ T細胞，及雅利撒螢光488標記的A26 Fab-dsFv進行飽和結合實驗。橫跨一定抗體濃度範圍平衡使抗體對受體的專一性結合用來決定KD，假設在結合曲線上的任一點只有極小分量的抗體結合至受體。
結合方程式係使用下示描述：
抗體與受體結合速率=kon x[受體free]x[抗體free]
受體-抗體複體解離速率=koff x[受體-抗體]
平衡時，結合率與解離率為相等，可導出描述結合等溫線的方程式；於半對數作圖上結合為S狀。KD係藉koff/kon定義，可從結合曲線計算為出現半最大結合的濃度。
經雅利撒螢光488標記的A26 Fab-Fv結合至活化人類CD4+OX40+ T細胞係藉流動細胞計量術跨5-對數濃度 範圍測量。
A26 Fab-Fv之代表性結合曲線顯示於圖9A。
從5個不同給予體在活化細胞上獲得的平均KD值為145 pM。A26 Fab、A26 Fab-Fv及A26 Fab-PEG之比較性結合曲線顯示於圖9B。
線圖表示4次或5次實驗的平均，不同給予體用在各次實驗。
PBMC係在斐可梯度上分離且於37℃，5%二氧化碳，100%濕度使用4微克/毫升PHA-L活化3日。其後，使用磁珠(用於人類之CD4+ T細胞單離套組II；米特尼生技公司)藉負面選擇單離CD4+ T細胞。約1x105細胞於4℃於抗體存在下於Facs緩衝液(PBS/0.2% BSA/0.09% NaN3)或Facs緩衝液補充5% HSA共同培養。抗體終濃度係於48 nM-0.0005 nM之範圍。藉流體細胞計量術使用法斯凱伯(貝騰迪金森公司)分析前，細胞於PBS洗滌。針對各個A26格式對同型對照抗體產生滴定資料集合來決定非專一性結合。結合抗體的莫耳數係由使用包含不同的但已知數量之螢光染料的珠粒所產生的標準曲線，使用內插值算出。幾何平均螢光值係在細胞及珠粒之流動細胞計量分析決定。非專一性結合從A26 Fab-dsFv值中扣除，如此產生的專一性結合曲線係藉線性迴歸使用一個位置結合方程式(圖板稜鏡®)測定KD。
實施例3：A26 Fab-Fv調節從暴露於家塵蟎過敏原萃取物的PBMC製造細胞激素
PBMC係藉在斐可梯度上從過敏性志願者單離。純化後的PBMC以在96孔圓底孔板中每孔200微升之終濃度的測試抗體(濃度範圍50微克/毫升至0.0005微克/毫升)存在下暴露於25微克/毫升家塵蟎過敏原萃取物。於37℃，5%二氧化碳，100%濕度，培養6日後，獲得上清液及藉MSD檢定IL-13含量。圖10(a)之線圖顯示從4者中一個代表性給予體的代表性資料，於該處IL-13製造的抑制作用之平均EC50為0.87 nM(0.6 nM至1.07 nM)之範圍。
表5：於試管試驗中於人類HDM中A26抗體之平均EC50值EC50值係使用圖板稜鏡®軟體藉非線性迴歸從個別給予體抑制曲線計算
使用家塵蟎過敏原萃取物二次抗原再度刺激後A26 Fab-Fv減少活化(CD25+)CD4+T細胞的百分比。
得自過敏性給予體的CD4+ T細胞係在無抗體存在下或10微克/毫升A26 Fab’PEG、A26 Fab-Fv或Ctrl Fab’(A33 Fab’)存在下使用25微克/毫升家塵蟎過敏原萃取物(格利爾(Greer))及自生APC於試管內刺激7日。細胞經洗滌及休息3日，然後如前述再度使用家塵蟎萃取物刺激(圖13)。3日後，細胞經洗滌且使用螢光染色表面CD3、CD4及CD25。細胞係在FACS康妥(Canto)流量細胞儀(BD)藉流量細胞計量術分析。在分析前細胞係閘控在活淋巴細胞及CD3+CD4+表現資料表示n=3給予體包括平均。n.s,A26 Fab-Fv比較對照組Fab’(有意義係使用成對2尾端T細胞測量)。
實施例4：於Hu-NSG小鼠模型A26 Fab-Fv抑制CD4+及CD8+T細胞增殖。
將1x107人類PBMC移轉入腹腔前1日，小鼠經皮下給予0.03、0.3、3或30毫克/千克A26 Fab-Fv。14日後，在終端麻醉之下藉心臟穿刺放血，然後藉斬首殺死。血液中人類CD4+及CD8+細胞數目係藉FACS分析測定 (圖10(b))。資料(n=10)係以平均值±標準差表示，統計分析係藉單向ANOVA使用邦菲羅尼(Bonferroni)後測試進行。數值以%抑制±標準差表示。
結果顯示於圖14。
Hu-NSG模型驗證A26 Fab-Fv於活體內顯著抑制人類T細胞增殖，且支援A26 Fab-Fv作為抑制T細胞媒介病理的有用治療候選者。此外，Fab-Fv格式在比Fab’PEG格式更低的劑量提供更高的效果。此種給予體T細胞的異種增殖反應減少可證實A26 Fab-Fv為GVHD的有用治療劑。
實施例5：配體封阻能力
A26 Fab-dsFv封阻細胞表面表現OX40與重組OX40L交互作用的能力係使用基於流量計量術的配體封阻檢定分析測定。簡言之，活化人類CD4+OX40+T細胞使用A26 Fab-Fv滴定預先培養。隨後重組OX40L添加至細胞且許可於A26 Fab-dsFv存在下結合。然後使用加標記的二次反應劑藉流量細胞計量術檢測OX40L的結合比例。圖11顯示抑制曲線表示得自三個獨立給予體的結合資料，證實A26 Fab-dsFv可完全封阻OX40L的結合。重組OX40L結合的抑制平均IC50為0.44 nM(n=3給予體)。
方法：藉A26 Fab-Fv抑制OX40L結合至人類活化CD4+OX40+T細胞
PBMC係在斐可梯度上單離及於37℃，5%二氧化碳，100%濕度使用4微克/毫升PHA-L(希格瑪公司)活化 3日。然後使用MACS管柱(米特尼生技公司，CD4+ T細胞單離套組II)藉負面選擇而從培養中純化CD4+ T細胞。2x105 CD4+ T細胞係於4℃在A26 Fab-dsFv(終濃度範圍10微克/毫升0.000056微克/毫升(136.6 nM-0.000765 nM))存在下培養30分鐘。OX40L(生物素化CD252 muCD8，安賽爾(Ancell))係以終濃度2微克/毫升添加，及於4℃又培養30分鐘。細胞經洗滌，使用FACS康妥(貝騰迪金森公司)藉流量細胞計量術分析前，與經PE標記的鏈絲菌抗生物素(捷克森免疫研究公司)測定OX40L的結合狀況。使用匹配的非OX40結合Fab-dsFv作為對照。抑制曲線係藉非線性迴歸(圖板稜鏡®)分析測定IC50。表示3個獨立給予體的組合資料之抑制曲線顯示於圖11，其中資料點表示平均值及誤差柱表示標準差(SEM)。
藉A26 Fab-Fv抑制重組OX40L結合至OX40的平均EC50為0.445 nM。比較上，A26 Fab’PEG用在配體封阻略微強度減低(EC50=0.739 nM)，而A26 Fab’具有比Fab-Fv邊際更高的強度(EC50=0.242 nM)，顯示如下。
EC50值係使用圖板稜鏡®軟體藉非線性迴歸從個別給予體抑制曲線求出。
實施例6於試管檢定分析中A26 Fab-Fv於機能性人體的功效
於抗原驅動的人類淋巴細胞檢定分析範圍評估A26 Fab-Fv對OX40-OX40L相依性細胞交互作用的影響。此等檢定分析係在5%人類血清存在下進行以確保Fv區的白蛋白結合位置的飽和，如於活體內預測出現的情況。
A26 Fab-Fv抑制混合淋巴細胞反應
單向過敏原混合淋巴細胞反應(MLR)為異種反應性T細胞活化及增殖的試管試驗模型(Bach等人，1964，O’Flaherty等人，2000)。給予體T細胞係經由識別在不相關給予體刺激劑PBMC的異種MHC抗原而活化，結果導致細胞增殖及細胞激素的製造(Lukaces等人，1993)。T淋巴細胞異種反應顯示受異種基因MHC抗原及結合胜肽二者的驅動(Sherman等人，1993)。MLR反應幅度係與反應子-刺激子對之間的MHC不相匹配程度有關(Forrester等人，2004)。MLR反應結果導致來自相對應給予體的細胞增殖及Th1(IL-2、IFN-γ及TNF-α)及Th2(IL-4、IL-5、IL-10及IL-13)T細胞衍生細胞激素的製造。於MLR的確切細胞激素作用輪廓相信對反應子-刺激子對具有專一性(Jordan等人，2002)。MLR檢定分析廣泛用於研究T細胞活化路徑，篩選免疫抑制藥物，預測在移植接受者預測可能的給予體器官排斥(Bromelow等人，2001)。
A26 Fab-Fv對試管試驗人類異種反應性T細胞活化及增殖的影響大致上係如O’Flaherty等人，2000所述使用MLR檢定分析研究。得自兩個不相關給予體的PBMC在A26 Fab-Fv、A26 Fab’或A26 Fab’PEG存在或不存在下共同培養，藉3H-胸苷結合測量細胞增殖。如圖12所示，以濃度相依性方式，A26 Fab-Fv抑制細胞增殖，具有EC50值為0.56 nM(40.9奈克/毫升)及55%最大抑制(n=3給予體對)。A26 Fab-Fv比A26 Fab’PEG略微更強，前者具有0.88 nM的EC50值，而A26 Fab’具有0.25 nM之EC50值，如表7所示。
得自兩個不相關給予體的人類PBMC係單離自全血。得自一個給予體的細胞藉γ-射線照射而變成去活化，以產生刺激子族群。得自其餘給予體的細胞形成反應子族群。刺激子族群及反應子族群以1：1比例混合(1x105細胞/給予體)，於A26 Fab’、A26 Fab-Fv或A26 Fab’PEG(0.4奈克-25微克/毫升)存在下培養6日。室內反應劑CA162-01297.1 Fab-Fv用作為同型匹配對照組。於第6日藉3H-胸苷結合測量細胞增殖(0.5 μCi/孔)。資料顯示為於無生物試劑存在下相對於反應子加刺激子反應的抑制百分比，且為得自三個給予體對的組合資料。EC50值係使用圖板稜鏡®軟體計算。
得自人類MLR之上清液也經分析來研究A26 Fab-Fv對細胞激素製造的影響。如圖5.4所示，於MLR，A26 Fab-Fv顯著抑制IFN-γ的製造達81%平均值(n=3給予體對)。
得自兩個不相關給予體的人類PBMC係從全血單離。來自一個給予體的細胞藉照射γ射線而去活化產生刺激子族群。來自剩餘給予體的細胞形成反應子族群。刺激子及反應子族群以1：1比例混合(1x105細胞/給予體)及於25微克/毫升A26 Fab’、A26 Fab-Fv或A26 Fab’PEG或對照組(A33 Fab’或CA162.01297.1)存在下培養6日。收穫上清液及使用MSD檢定分析來檢定分析IFN-γ含量。抑制百分比係相對於使用不含抗體培養的細胞計算。線圖表示從三個給予體所得匯集資料(平均±標準差)。**=p<0.01；A26 Fab-Fv比較對照組Fab-Fv(顯著性使用成對2尾端T試驗測定)。
實施例7於人類MLR A26 Fab-Fv結合至NK細胞
研究於MLR內部A26 Fab-Fv對NK細胞分裂的影響。T淋巴細胞異種反應驅動混合淋巴細胞反應，A26 Fab-Fv顯著抑制此種系統中T細胞的分裂及IFNγ的製 造。抑制NK細胞分裂也促成IFNγ製造的減少。使用CFSE加標記反應子細胞抑制NK細胞分裂係藉FACS分析分裂中的族群獲得驗證(圖5.6)。顯示細胞分裂的兩個不同測量值。分裂指數表示原先族群中的一個細胞已經進行細胞分裂平均次數且包括未分裂的細胞；A26 Fab-Fv減少分裂指數，指示在族群中有較少細胞進行分裂；此種效應推定係由表現OX40的NK細胞所媒介。增殖指數只反映反應族群的增殖，使用本測量值，A26 Fab-Fv的抑制效果相對減低。
實施例8於人體於試管試驗中A26 Fab-Fv之平均KD/EC50值
當然須瞭解本發明僅供舉例說明而非限制性，在落入於申請專利之範圍內可對細節做修改。本發明之各個具體例之較佳特徵經過適當調整後也適合其它具體例之較佳特徵。本說明書中引用的全部公開文獻包括但非限於專利案及專利申請案係爰引於此如個別公開文獻已經完整陳述且特地個別地指示併述於此以供參考。
圖1顯示本發明之雙專一性抗體融合蛋白(Fab-dsFV格式)。
圖2-8顯示根據本文揭示與抗體有關之某些胺基酸或DNA序列。
圖9a顯示雅利撒螢光(AlexaFluor)488標記的A26 Fab-dsFv結合至活化人類CD4+OX40+T細胞。
圖9b顯示於活性人類CD4+、OX40+ T細胞上於5% HSA存在下，A26 Fab’、A26 Fab-Fv及A26 Fab’-PEG的結合。
圖10a顯示A26 Fab-dsFv對於從暴露於家塵蟎(Dermatophagoides pteronyssinus)過敏原萃取物的PBMC所製造的細胞激素之影響。
圖10b顯示於Hu-NSG小鼠模型中A26 Fab-dsFv抑制CD4+及CD8+ T細胞增殖的能力。
圖11a顯示藉A26 Fab-dsFv抑制OX40L結合至人類活化CD4+ OX40+ T細胞。
圖11b顯示藉A26 Fab’、A26 Fab-Fv及A26 Fab’-PEG及二對照組抑制OX40L結合至人類活化CD4+ OX40+ T細胞。
圖12a顯示A26 Fab-Fv抑制人類失誤淋巴細胞反應(MLR)。
圖12b顯示A26 Fab-Fv抑制於人類MLR期間的IFN-γ製造。
圖13顯示使用家塵蟎過敏原萃取物在二次抗原再 度刺激後A26 Fab-Fv減低活化(CD25+)CD4+ T細胞的百分比。
圖14顯示於細胞轉移劑量相依性前投予Fab-Fv及Fab-PEG可於Hu-NSG模型抑制CD4+及CD8+ T細胞增殖。
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<213> 人造
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<223> CDRH1
<400> 1
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> CDRH2
<400> 2
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> CDRH3
<400> 3
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> CDRL1
<400> 4
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> CDRL2
<400> 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> CDRL3
<400> 6
<210> 7
<211> 108
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 抗體A26之輕鏈可變區
<400> 7
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 抗體A26之重鏈可變區
<400> 8
<210> 9
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 抗OX40抗體Fab成分之輕鏈
<400> 9
<210> 10
<211> 220
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 抗OX40抗體Fab成分之重鏈
<400> 10
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 抗白蛋白Fab成分之重鏈
<400> 11
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 抗白蛋白Fv成分之輕鏈
<400> 12
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 鏈接基1
<400> 13
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 鏈接基1
<400> 14
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> A26 Fab重-(G4S,G4T,G4S)-645dsFv(gH5)
<400> 15
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> A26 Fab輕-(3xG4S)-645dsFv(gL4)
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<212> PRT
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<220>
<223> 645gH1重鏈可變功能域
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<223> 645gL1輕鏈可變功能域
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<223> A26 Fab重-(3xG4S)-645dsFv(gH1)
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<212> PRT
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<223> A26 Fab輕-(3xG4S)-645dsFv(gL1)
<400> 20
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<211> 1137
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 重鏈A26-645(gH5)包括大腸桿菌OmpA先導子
<400> 21
<210> 22
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 重鏈A26-645(gH5)
<400> 22
<210> 23
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 輕鏈A26-645(gH5)包括大腸桿菌OmpA先導子
<400> 23
<210> 24
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 輕鏈A26-645(gL4)
<400> 24
<210> 25
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 重鏈A26-645(gH5)包括B72.3先導子序列
<400> 25
<210> 26
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 重鏈A26-645(gH5)
<400> 26
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<212> DNA
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<223> 輕鏈A26-645(gL4)包括B72.3先導子序列
<400> 27
<210> 28
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<212> DNA
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<223> 輕鏈A26-645(gL4)
<400> 28

Claims (49)

  1. 一種結合人類OX40及人類血清白蛋白的抗體融合蛋白，其係包括：一重鏈，其係從N端依次地包括一第一重鏈可變功能域(VH1)、一CH1功能域、及一第二重鏈可變功能域(VH2)，一輕鏈，其係從N端依次地包括一第一輕鏈可變功能域(VL1)、一CL功能域、及一第二輕鏈可變功能域(VL2)，其中該重鏈與該輕鏈係排齊，使得VH1與VL1形成一第一抗原結合位置，及VH2與VL2形成一第二抗原結合位置，其中由該第一抗原結合位置所結合的該抗原係為人類OX40，及由該第二抗原結合位置所結合的該抗原係為人類血清白蛋白，其中該重鏈之第一可變功能域(VH1)係包括為CDR-H1之SEQ ID NO：1指定的序列、為CDR-H2之SEQ ID NO：2指定的序列、及為CDR-H3之SEQ ID NO：3指定的序列，及該輕鏈之第一可變功能域(VL1)係包括為CDR-L1之SEQ ID NO：4指定的序列、為CDR-L2之SEQ ID NO：5指定的序列、及為CDR-L3之SEQ ID NO：6指定的序列，其中該第二重鏈可變功能域(VH2)係具有SEQ ID NO：11指定的序列，及該第二輕鏈可變功能域(VL2)係具有SEQ ID NO：12指定的序列，及 該第二重鏈可變功能域(VH2)與該第二輕鏈可變功能域(VL2)係藉一雙硫鍵鏈接。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體融合蛋白，其係拮抗OX40結合至OX40L。
  3. 如申請專利範圍第1項之抗體融合蛋白，其中在該CH1功能域與該第二重鏈可變功能域(VH2)間有一胜肽鏈接基。
  4. 如申請專利範圍第1項之抗體融合蛋白，其中在該CL功能域與該第二輕鏈可變功能域(VL2)間有一胜肽鏈接基。
  5. 如申請專利範圍第1項之抗體融合蛋白，其中在該CH1功能域與該第二重鏈可變功能域(VH2)間有一胜肽鏈接基，且在該CL功能域與該第二輕鏈可變功能域間有一胜肽鏈接基。
  6. 如申請專利範圍第1項之抗體融合蛋白，其中該第一重鏈可變功能域(VH1)係包含SEQ ID NO：8指定的序列。
  7. 如申請專利範圍第1項之抗體融合蛋白，其中該第一輕鏈可變功能域(VL1)係包含SEQ ID NO：7指定的序列。
  8. 如申請專利範圍第1項之抗體融合蛋白，其中該第一重鏈可變功能域(VH1)包含SEQ ID NO：8指定的序列，且該第一輕鏈可變功能域(VL1)包含SEQ ID NO：7指定的序列。
  9. 如申請專利範圍第1項之抗體融合蛋白，其中該重鏈 係包含SEQ ID NO：15指定的序列或係由SEQ ID NO：15指定的序列組成。
  10. 如申請專利範圍第1項之抗體融合蛋白，其中該輕鏈係包含SEQ ID NO：16指定的序列或係由SEQ ID NO：16指定的序列組成。
  11. 如申請專利範圍第1項之抗體融合蛋白，其中該重鏈包含SEQ ID NO：15指定的序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO：16指定的序列。
  12. 如申請專利範圍第1項之抗體融合蛋白，其中該重鏈係由SEQ ID NO：15指定的序列組成，且該輕鏈係由SEQ ID NO：16指定的序列組成。
  13. 一種結合人類OX40及人類血清白蛋白的抗體融合蛋白，其係具有：包含SEQ ID NO：15指定的序列之一重鏈及包含SEQ ID NO：16指定的序列之一輕鏈。
  14. 如申請專利範圍第1至13項中任一項之抗體融合蛋白，其係用於治療。
  15. 如申請專利範圍第1至13項中任一項之抗體融合蛋白，其係用於由OX40所媒介的或與OX40的濃度升高相關的病理病症之治療或預防。
  16. 如申請專利範圍第15項之抗體融合蛋白，其中該病理病症係選自由下列所組成之群組：過敏、慢性阻塞性肺病、自體免疫病、類風濕性關節炎、氣喘、植體對宿主病、發炎性腸病、克隆氏病(Crohn’s disease)、潰瘍性大腸炎、第1型糖尿病、多發性硬化、系統性紅斑性狼瘡、狼瘡腎炎、重症肌無力、葛雷夫氏病 (Grave’s disease)、移植排斥、韋格納氏肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)、賀諾雄蘭紫斑(Henoch-Schönlein purpura)、系統性硬化、病毒誘發肺發炎、骨盆腔發炎性疾病、皮羅尼氏病(Peyronie’s Disease)、乳糜瀉、腹膜炎、乾癬(psoriasis)、血管炎、腦膜炎(meningoencephalitis)、自體免疫性葡萄膜炎(autoimmune uveitis)、中樞及周邊神經系統之免疫媒介的發炎病症、多發性硬化、基蘭巴爾症候群(Guillain-Barré syndrome)、異位性皮膚炎、自體免疫性肝炎、纖維變性肺泡炎(fibrosing alveolitis)、IgA腎病變、特發性血小板缺少性紫斑(idiopathic thrombocytopenic purpura)、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、肉狀瘤病、硬皮病、胰炎、及牙周炎。
  17. 如申請專利範圍第15項之抗體融合蛋白，其中該病理病症係選自由下列所組成之群組：類風濕性關節炎、慢性阻塞性肺病、發炎性腸病、克隆氏病、潰瘍性大腸炎、乳糜瀉、乾癬、第1型糖尿病、系統性紅斑性狼瘡、基蘭巴爾症候群、異位性皮膚炎、葛雷夫氏病、及特發性血小板缺少性紫斑。
  18. 如申請專利範圍第15項之抗體融合蛋白，其中該病理病症為類風濕性關節炎。
  19. 如申請專利範圍第15項之抗體融合蛋白，其中該病理病症為發炎性腸病。
  20. 如申請專利範圍第15項之抗體融合蛋白，其中該病理病症係選自由下列所組成之群組：克隆氏病、潰瘍 性大腸炎、及乳糜瀉。
  21. 如申請專利範圍第15項之抗體融合蛋白，其中該病理病症為異位性皮膚炎。
  22. 如申請專利範圍第15項之抗體融合蛋白，其中該病理病症為乾癬。
  23. 如申請專利範圍第15項之抗體融合蛋白，其中該病理病症為系統性紅斑性狼瘡。
  24. 如申請專利範圍第15項之抗體融合蛋白，其中該病理病症係選自由下列所組成之群組：第1型糖尿病、基蘭巴爾症候群、葛雷夫氏病、及特發性血小板缺少性紫斑。
  25. 如申請專利範圍第15項之抗體融合蛋白，其中該病理病症為過敏。
  26. 如申請專利範圍第15項之抗體融合蛋白，其中該病理病症為氣喘。
  27. 如申請專利範圍第15項之抗體融合蛋白，其中該病理病症為植體對宿主病。
  28. 如申請專利範圍第15項之抗體融合蛋白，其中該病理病症為移植排斥。
  29. 一種經單離的DNA序列，其係編碼如申請專利範圍第1至13項中任一項之抗體融合蛋白的重鏈及/或輕鏈。
  30. 一種選殖或表現載體，其係包含一或多個如申請專利範圍第29項之DNA序列。
  31. 如申請專利範圍第30項之載體，其中該載體係包含 SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：24指定的序列。
  32. 一種宿主細胞，其係包含一或多個如申請專利範圍第30或31項之選殖或表現載體。
  33. 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之抗體融合蛋白之製造方法，其包含培養如申請專利範圍第32項之宿主細胞及單離該抗體融合蛋白。
  34. 一種醫藥組成物，其係包含如申請專利範圍第1至13項中任一項之抗體融合蛋白組合醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑中之一或多者。
  35. 如申請專利範圍第34項之醫藥組成物，其係額外地包含至少一種其它活性成分。
  36. 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之抗體融合蛋白之用途，其係用以製造由OX40所媒介的或與OX40的濃度升高相關的病理病症之治療或預防用藥物。
  37. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該病理病症係選自由下列所組成之群組：過敏、慢性阻塞性肺病、自體免疫病、類風濕性關節炎、氣喘、植體對宿主病、發炎性腸病、克隆氏病、潰瘍性大腸炎、第1型糖尿病、多發性硬化、系統性紅斑性狼瘡、狼瘡腎炎、重症肌無力、葛雷夫氏病、移植排斥、韋格納氏肉芽腫、賀諾雄蘭紫斑、系統性硬化、病毒誘發肺發炎、骨盆腔發炎性疾病、皮羅尼氏病、乳糜瀉、腹膜炎、乾癬、血管炎、腦膜炎、自體免疫性葡萄膜炎、中樞及周邊神經系統之免疫媒介的發炎病症、多發性硬化、基蘭 巴爾症候群、異位性皮膚炎、自體免疫性肝炎、纖維變性肺泡炎、IgA腎病變、特發性血小板缺少性紫斑、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、肉狀瘤病、硬皮病、胰炎、及牙周炎。
  38. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該病理病症係選自由下列所組成之群組：類風濕性關節炎、慢性阻塞性肺病、發炎性腸病、克隆氏病、潰瘍性大腸炎、乳糜瀉、乾癬、第1型糖尿病、系統性紅斑性狼瘡、基蘭巴爾症候群、異位性皮膚炎、葛雷夫氏病、及特發性血小板缺少性紫斑。
  39. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該病理病症為類風濕性關節炎。
  40. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該病理病症為發炎性腸病。
  41. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該病理病症係選自由下列所組成之群組：克隆氏病、潰瘍性大腸炎、及乳糜瀉。
  42. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該病理病症為異位性皮膚炎。
  43. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該病理病症為乾癬。
  44. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該病理病症為系統性紅斑性狼瘡。
  45. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該病理病症係選自由下列所組成之群組：第1型糖尿病、基蘭巴爾 症候群、葛雷夫氏病、及特發性血小板缺少性紫斑。
  46. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該病理病症為過敏。
  47. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該病理病症為氣喘。
  48. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該病理病症為植體對宿主病。
  49. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該病理病症為移植排斥。
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