KR20240026507A - 타노트랜스미션을 촉진시키도록 엔지니어링된 면역 세포 및 이의 용도 - Google Patents

타노트랜스미션을 촉진시키도록 엔지니어링된 면역 세포 및 이의 용도 Download PDF

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윌리엄 조셉 카이저
피터 조셉 고프
사빈 다칼
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Abstract

특정 양태에서, 본 개시내용은 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포에 관한 것이다. 면역 세포는 또한 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 엔지니어링된 면역 세포를 사용하여 타노트랜스미션을 촉진시키고, 면역 반응을 촉진시키고, 암을 치료하는 방법이 또한 개시된다.

Description

타노트랜스미션을 촉진시키도록 엔지니어링된 면역 세포 및 이의 용도
관련 출원
본 출원은 2022년 2월 9일에 출원된 미국 가출원 제63/308,195호 및 2021년 6월 29일에 출원된 미국 가출원 제63/216,505호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 명시적으로 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록의 제출
본 출원과 관련된 서열 목록은 EFS-Web을 통해 전자 형식으로 제출되며, 이로써 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은 129983_00820_Sequence_Listing이다. 텍스트 파일의 크기는 72,183 바이트이며, 텍스트 파일은 2022년 6월 28일에 생성되었다.
후생동물에서, 세포 예정사는 조직 항상성을 유지하고 잠재적으로 유해한 세포를 제거하는 유전학적으로 설정된 필수 과정이다.
[도면의 간단한 설명]
도 1a는 면역 세포에서의 발현을 위한 예시적인 키메라 항원 수용체(CAR) 구축물을 보여준다. 도 1b는 면역 세포에서 타노트랜스미션을 촉진시키는 단백질의 발현을 위한 예시적인 구축물을 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 타노트랜스미션의 유도 후 CT-26 마우스 결장 암종 세포의 상대적인 생존력을 보여준다.
도 3a 및 도 3b는 대식구에서 IFN-연관 유전자 활성화의 자극에 대한 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현(예를 들어, 단독의 또는 RIPK3(cR3) 및/또는 가스더민 E(cGE)와 조합된 TRIF 발현)의 유도 후 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터 생성된 세포 턴오버 인자(CTF)의 영향을 보여준다. 도 3a에서, Tet-유도성 RIPK3은 "RIPK3"으로 지정되고, 구성적 PGK 프로모터를 함유하는 RIPK3 구축물은 "PGK_RIPK3"으로 지정된다. 도 3b에서, 각각의 타노트랜스미션 모듈에 있어서, 처리군은 좌측에서 우측으로, 대조군(CTL), 독시사이클린(Dox), 및 독시사이클린 + B/B 동종이량체화제(homodimerizer)(Dox + 이량체화제)이다.
도 4는 골수 유래 수지상 세포(BMDC)에서의 활성화 마커의 발현의 자극에 대한, TRIF, RIPK3 또는 TRIF 및 RIPK3 발현의 유도 후에 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터 생성된 세포 턴오버 인자(CTF)의 영향을 보여준다. MFI는 평균-형광 세기이다.
도 5a, 도 5b 및 도 5c는 CT-26 마우스 결장 암종 세포가 이식된 마우스의 생존에 대한 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현의 영향을 보여준다. "CT26-TF"는 TRIF 단독을 발현하는 CT-26 세포를 나타내며, "CT26-P_R3"은 RIPK3 단독을 발현하는 세포를 나타낸다. 도 4b에서, 모든 마우스를 항-PD1 항체로 처리하였다.
도 6a는 다양한 타노트랜스미션 페이로드를 발현하는 U937 백혈병 세포로부터의 세포 배양물로 처리되고, 단독의 또는 RIPK3 저해제(GSK872)와 조합된 카스파제 저해제(Q-VD-Oph)로 처리되는 THP-1 Dual 세포에서의 상대적인 NF-kB 활성을 보여준다. 도 6b 및 도 6c는 다양한 타노트랜스미션 페이로드를 발현하는 U937 백혈병 세포로부터의 세포 배양물로 처리되고, 단독의 또는 RIPK3 저해제(GSK872)와 조합된 카스파제 저해제(Q-VD-Oph)로 처리되는 THP-1 Dual 세포에서의 상대적인 IRF 활성을 보여준다. 또한, U937 세포를 단독의 또는 B/B 동종이량체화제와 조합된(이량체화를 유도하기 위해) 독시사이클린으로 처리하였다(타노트랜스미션 폴리펩티드 발현을 유도하기 위해). 도 6a 내지 도 6c에서, +는 독시사이클린으로 처리된 U937 세포를 나타내며, ++는 독시사이클린 및 B/B 동종이량체화제로 처리된 U937 세포를 나타낸다.
도 7a는 단독의 또는 카스파제 저해제와 조합된 타노트랜스미션 폴리펩티드를 발현하는 CT-26 마우스 결장 암종 세포의 생대적인 생존력을 보여준다. 도 7b는 대식구에서의 IFN-연관 유전자 활성화의 자극에 대한, 단독의 또는 카스파제 저해제와 조합된, 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현의 유도 후에 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터 생성된 세포 턴오버 인자(CTF)의 영향을 보여준다. 도 7c는 CT-26 마우스 결장 암종 세포가 이식된 마우스의 생존에 대한, 단독의 또는 카스파제 저해제와 조합된, TRIF+RIPK3 발현의 영향을 보여준다.
도 8은 유도성 미니TRIF 구축물의 발현을 구동하는 항-메조텔린 CAR의 다이어그램을 보여준다.
도 9a 내지 도 9c는 항-메조텔린 CAR 및/또는 유도성 미니TRIF 구축물을 함유하는 Jurkat T 세포주의 총 세포 사멸 퍼센트를 보여준다. 세포를 다양한 농도의 메조텔린 또는 CD3/CD28 활성화제로 처리하고, 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 인큐베이션시켰다. X-축의 수는 메조텔린 농도를 나타낸다.
도 10a 내지 도 10c는 항-메조텔린 CAR 및/또는 유도성 미니TRIF 구축물을 함유하는 Jurkat T 세포주에서 아폽토시스 세포 사멸에 대한 괴사 세포 사멸의 비를 보여준다. 세포를 다양한 농도의 메조텔린 또는 CD3/CD28 활성화제로 처리하고, 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 인큐베이션시켰다. X-축의 수는 메조텔린 농도를 나타낸다.
도 11a 내지 도 11c는 항-메조텔린 CAR 및/또는 유도성 미니TRIF 구축물을 함유하는 Jurkat T 세포주로부터 수집된 세포 턴오버 인자(CTF)로 처리된 THP-1 단핵구에서의 상대적인 IRF 활성을 보여준다. 세포를 다양한 농도의 메조텔린 또는 CD3/CD28 활성화제로 처리하고, 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 인큐베이션시킨 후 CTF를 수집하였다. X-축의 수는 메조텔린 농도를 나타낸다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 조성물은 표적 세포에서 생물학적 반응을 유도하기에 충분한 양의 면역 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 면역 세포는 이종성 표적화 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 이종성 표적화 도메인은 항원 결합 도메인이다. 일 구현예에서, 면역 세포는 세포 턴오버를 촉발시키는 이종성 신호 전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 이종성 신호 전달 도메인은 세포내 신호전달 도메인이다. 일 구현예에서, 표적화 도메인은 신호 전달 도메인에 작동 가능하게 연결된다. 일 구현예에서, 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 신호 전달 도메인의 활성화 시 유전자의 발현을 유도하는 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일 구현예에서, 이종성 프로모터는 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 프로모터, STAT 프로모터, AP-1 프로모터, NF-κB 프로모터, 및 IRF4 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 면역 세포는 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시내용은
(a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열로서, CAR이 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 하나 이상의 핵산 서열; 및
(b) 면역 세포의 활성화 시 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는, 면역 세포에 관한 것이며,
여기서, 면역 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 또는 대식구이다.
일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 TCR-형 신호전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 공동자극 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, CAR은 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 프로모터는 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 시 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도한다. 일 구현예에서, 프로모터는 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 프로모터, STAT 프로모터, NF-κB 프로모터, AP-1 프로모터, 또는 IRF4 프로모터이다. 일 구현예에서, TCR-형 신호전달 도메인은 CD3제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, CD3제타의 세포내 도메인은 하나 이상의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)에서 하나 이상의 티로신 잔기의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 (a) CD3제타의 세포내 도메인과 CD28의 공동자극 신호전달 도메인; (b) CD3제타의 세포내 도메인과 4-1BB의 공동자극 신호전달 도메인; 및 (c) CD28의 공동자극 신호전달 도메인, 4-1BB의 공동자극 신호전달 도메인, CD27 또는 CD134의 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3제타의 세포내 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 도메인의 조합을 포함한다. 일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD28의 공동자극 신호전달 도메인 및 CD3제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 공동자극 신호전달 도메인 및 CD3제타의 세포내 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 암 세포의 표면에서 우선적으로 발현되는 단백질에 결합한다. 일 구현예에서, 암 세포는 고형 암이다. 일 구현예에서, 암은 비-고형 암이다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD23, 카파 경쇄, CD5, CD30, CD70, CD38, CD138, BCMA, CD33, CD123, CD44v6, CS1 및 ROR1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에 결합한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD44v6, CAIX(탄산 탈수효소 IX), CEA(암배아 항원), CD133, c-Met(간세포 성장 인자 수용체), EGFR(표피 성장 인자 수용체), EGFRvIII(III형 변이체 표피 성장 인자 수용체), Epcam(상피 세포 부착 분자), EphA2(에리트로포에틴 생산 간세포 암종 A2), 태아 아세틸콜린 수용체, FRα(엽산 수용체 알파), GD2(강글리오시드 GD2), GPC3(글리피칸-3), GUCY2C(구아닐릴 사이클라제 C), HER1(인간 표피 성장 인자 수용체 1), HER2(인간 표피 성장 인자 수용체 2)(ERBB2), ICAM-1(세포간 부착 분자 1), IL13Ra2(인터류킨 13 수용체 a2), IL11Ra(인터류킨 11 수용체 a), Kras(Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자 상동체), Kras G12D, L1CAM(L1-세포 부착 분자), MAGE, MET, 메조텔린, MUC1(뮤신 1), MUC16 엑토(뮤신 16) , NKG2D(자연 살해 그룹 2 구성원 D), NY-ESO-1, PSCA(전립선 줄기 세포 항원), WT-1(윌름스 종양 1), PSMA1, LAP3, ANXA3, 마스핀, 올팩토메딘 4, CD11b, 인테그린 알파-2, FAP(섬유모세포 활성화 단백질), 루이스-Y 및 TAG72로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에 결합한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 메조텔린에 결합한다.
일 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 사멸 폴드 도메인을 인코딩한다. 일 구현예에서, 사멸 폴드 도메인은 사멸 도메인, 피린(pyrin) 도메인, 사멸 이펙터 도메인(Death Effector Domain; DED), C-말단 카스파제 동원 도메인(CARD), 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 사멸 도메인은 사멸 도메인을 갖는 Fas-관련 단백질(FADD), Fas, 종양 괴사 인자 수용체 1형-관련 사멸 도메인(TRADD), 종양 괴사 인자 수용체 1형(TNFR1), 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터의 것이다. 일 구현예에서, 피린 도메인은 NLR 패밀리 피린 도메인 함유 3(NLRP3) 및 아폽토시스-관련 반점-유사 단백질(ASC)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터의 것이다. 일 구현예에서, 사멸 이펙터 도메인(DED)은 사멸 도메인을 갖는 Fas 관련 단백질(FADD), 카스파제-8 및 카스파제-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터의 것이다. 일 구현예에서, CARD는 RIP-관련 ICH1/CED3-상동성 단백질(RAIDD), 아폽토시스-관련 반점-유사 단백질(ASC), 미토콘드리아 항바이러스-신호전달 단백질(MAVS), 카스파제-1, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터의 것이다.
일 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 톨/인터류킨-1 수용체(TIR) 도메인을 인코딩한다. 일 구현예에서, TIR 도메인은 골수 분화 일차 반응 단백질 88(MyD88), 톨/인터류킨-1 수용체(TIR)-도메인-함유 어댑터-유도 인터페론-β(TRIF), 톨 유사 수용체 3(TLR3), 톨 유사 수용체 4(TLR4), TIR 도메인 함유 연결자 단백질(TIRAP), 전위 쇄-관련 막 단백질(TRAM), 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터의 것이다. 일 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 TIR 도메인을 포함하는 단백질을 인코딩한다. 일 구현예에서, TIR 도메인을 포함하는 단백질은 골수 분화 일차 반응 단백질 88(MyD88), 톨/인터류킨-1 수용체(TIR)-도메인-함유 어댑터-유도 인터페론-β(TRIF), 톨 유사 수용체 3(TLR3), 톨 유사 수용체 4(TLR4), TIR 도메인 함유 연결자 단백질(TIRAP), 전위 쇄-관련 막 단백질(TRAM), 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 TRIF 또는 TRIF 변이체를 인코딩한다. 일 구현예에서, TRIF 변이체는 표 2에 열거된 TRIF 변이체이다. 일 구현예에서, TRIF 변이체는 표 2에 열거된 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 세포 FLICE(FADD-유사 IL-1β-전환 효소)-저해성 단백질(c-FLIP), 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 1(RIPK1), 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 3(RIPK3), Z-DNA-결합 단백질 1(ZBP1), 혼합 계통 키나제 도메인 유사 슈도키나제(MLKL), TIR 도메인 및 RHIM 도메인만을 포함하는 TRIF의 N-말단 절단, 사멸 도메인을 갖는 Fas-관련 단백질의 우성 음성 돌연변이체(FADD-DD), myr-FADD-DD, 저해제 kBα 슈퍼-리프레서(IkBα-SR), 인터류킨-1 수용체-관련 키나제 1(IRAK1), 종양 괴사 인자 수용체 1형-관련 사멸 도메인(TRADD), 카스파제-8의 우성 음성 돌연변이체, 인터페론 조절 인자 3(IRF3), 가스더민-A(GSDM-A), 가스더민-B(GSDM-B), 가스더민-C(GSDM-C), 가스더민-D(GSDM-D), 가스더민-E(GSDM-E), 아폽토시스-관련 반점-유사 단백질(ASC), 그랜자임 A, 이량체화 도메인을 갖는 C-말단 카스파제 동원 도메인을 함유하는 아폽토시스-관련 반점-유사 단백질(ASC-CARD), 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, TIR 도메인 및 RHIM 도메인만을 포함하는 TRIF의 N-말단 절단은 인간 TRIF의 아미노산 잔기 1 내지 311의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, TIR 도메인 및 RHIM 도메인만을 포함하는 TRIF의 N-말단 절단은 SEQ ID NO: 12를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, cFLIP은 인간 cFLIP이다. 일 구현예에서, cFLIP는 카스파제-8 및 FADD 유사 아폽토시스 조절 인자(cFLR)이다. 일 구현예에서, ZBP1은 수용체-상호작용 단백질 호모타입 상호작용 모티프(RHIM) C의 결실, RHIM D의 결실, 및 Za1 도메인의 N-말단에서의 결실을 포함한다. 일 구현예에서, ZBP1은 ZBP1-Za1/RHIM A 절단이다.
일 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 유전자이다. 일 구현예에서, 바이러스 유전자는 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스(KSHV)로부터의 vFLIP(ORF71/K13), 전염성 연속종 바이러스로부터의 MC159L, 말 헤르페스 바이러스 2로부터의 E8, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 또는 뮤린 사이토메갈로바이러스(MCMV)로부터의 vICA, 소 두창 바이러스로부터의 CrmA, 및 아우토그라파 칼리포르니카 멀티캡시드 뉴클레오폴리헤드로바이러스(AcMNPV)로부터의 P35로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3, 카스파제, FADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma, TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D, 가스더민 E, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFSF) 단백질, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2개를 포함하는 키메라 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 단일 전사체로서 전사된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2개는 NF-kB를 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2개는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2개는 외인성 아폽토시스를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2개는 예정 괴사를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 NF-kB를 활성화시키고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 NF-kB를 활성화시키고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 외인성 아폽토시스를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 NF-kB를 활성화시키고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예정 괴사를 촉진시킨다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 외인성 아폽토시스를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예정 괴사를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 아폽토시스를 촉진시키고, 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예정 괴사를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 예정 괴사는 네크롭토시스를 포함한다. 일부 구현예에서, 예정 괴사는 파이롭토시스를 포함한다.
일부 구현예에서, NF-kB를 활성화시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TNFSF 단백질 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, MyD88, MAVS, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 외인성 아폽토시스를 촉진시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, RIPK1, 카스파제, FADD, TRADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 예정 괴사를 촉진시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 변이체를 포함하고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, TRIF 변이체는 표 2에 열거된 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 표 2에 열거된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 TIR 도메인 및 RHIM 도메인만을 포함하는 TRIF의 N-말단 절단이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 인간 TRIF의 아미노산 잔기 1 내지 311의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, TIR 도메인 및 RHIM 도메인만을 포함하는 TRIF의 N-말단 절단은 SEQ ID NO: 12를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩한다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 FADD 우성 음성 돌연변이체(FADD-DN), cFLIP, vICA, 카스파제 8 우성 음성 돌연변이체(Casp8-DN), cIAP1, cIAP2, Tak1, IKK, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 FADD-DN이다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 cFLIP이다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 vICA이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 가스더민 또는 이의 변이체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 변이체를 포함하고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 가스더민은 가스더민 E 또는 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, 변이체는 타노트랜스미션 폴리펩티드의 기능성 단편이다.
일부 구현예에서, 세포는 이량체화 도메인을 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 이량체화 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 이량체화 도메인은 타노트랜스미션 폴리펩티드에 이종성이다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 타노트랜스미션을 촉진시키는 방법에 관한 것이며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 면역 세포를 대상체에서 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 방법에 관한 것이며, 방법은 표적 세포, 또는 표적 세포를 포함하는 조직을 본원에 기재된 바와 같은 면역 세포와, 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 접촉시키는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 촉진을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 촉진시키는 방법에 관한 것이며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 면역 세포를 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하여 대상체에서 면역 반응을 촉진시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 면역 세포는 표적 세포에서 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여된다. 일 구현예에서, 표적 세포는 암 세포, 면역 세포, 내피 세포 및 섬유모세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 대상체는 감염을 갖는다. 일 구현예에서, 표적 세포는 병원체에 감염된다. 일 구현예에서, 감염은 바이러스 감염이다. 일 구현예에서, 감염은 만성 감염이다. 일 구현예에서, 만성 감염은 HIV 감염, HCV 감염, HBV 감염, HPV 감염, B형 간염 감염, C형 간염 감염, EBV 감염, CMV 감염, TB 감염, 및 기생충 감염으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 면역 세포를 대상체에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 면역 세포를 대상체에게 투여하는 것은 대상체에서 암 세포의 증식을 감소시킨다. 일 구현예에서, 암 세포의 증식은 대상체에게 투여된 암 요법으로 인한 암 세포의 과증식이다. 일 구현예에서, 면역 세포를 대상체에게 투여하는 것은 대상체에서 암 세포의 전이를 감소시킨다. 일 구현예에서, 면역 세포를 대상체에게 투여하는 것은 대상체에서 종양의 신생혈관을 감소시킨다.
일 구현예에서, 암을 치료하는 것은 종양 부담의 감소, 종양 크기의 감소, 종양 성장의 저해, 치료 이전에 진행성 암을 갖는 대상체에서의 안정한 암의 달성, 암의 진행까지의 시간 증가 및 생존 시간 증가 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 일 구현예에서, 면역-자극성 세포 턴오버 경로는 암에서 유도된다. 일 구현예에서, 암에는 면역-자극성 세포 턴오버 경로가 결핍되어 있다. 일 구현예에서, 면역-자극성 세포 턴오버 경로는 네크롭토시스, 외인성 아폽토시스, 페롭토시스 및 파이롭토시스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 암은 면역 체크포인트 요법에 반응성인 암이다. 일 구현예에서, 암은 암종, 육종, 림프종, 흑색종, 및 백혈병으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 암은 전이성 암이다. 일 구현예에서, 암은 고형 종양이다.
일 구현예에서, 고형 종양은 결장암, 연조직 육종(STS), 전이성 투명 세포 신세포 암종(ccRCC), 난소암, 위장암, 대장암, 간세포 암종(HCC), 교모세포종(GBM), 유방암, 흑색종, 비-소세포 폐암(NSCLC), 육종, 악성 흉막, 중피종(MPM), 망막모세포종, 신경교종, 수모세포종, 골육종, 유잉 육종, 췌장암, 폐암, 위암, 복부암(stomach cancer), 식도암, 간암, 전립선암, 부인과 암, 비인두 암종, 골육종, 횡문근육종, 요로상피 방광 암종, 신경모세포종, 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 암은 흑색종, 자궁경부암, 유방암, 난소암, 전립선암, 고환암, 요로상피 암종, 방광암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 육종, 대장 선암종, 위장관 간질 종양, 위식도 암종, 대장암, 췌장암, 신장암, 간세포암, 악성 중피종, 백혈병, 림프종, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 이행 세포 암종, 신경모세포종, 형질 세포 신생물, 윌름스 종양, 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 암은 고형 종양이 아니다. 일 구현예에서, 암은 백혈병, 림프종, B 세포 악성종양, T 세포 악성종양, 다발성 골수종, 골수성 악성종양, 및 혈액 악성종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 면역 세포는 대상체에게 정맥내 투여된다. 일 구현예에서, 면역 세포는 대상체에게 종양내 투여된다.
일 구현예에서, 방법은 항-신생물제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 항-신생물제는 화학치료제이다. 일 구현예에서, 항-신생물제는 생물학적 작용제이다. 일 구현예에서, 생물학적 작용제는 항원 결합 단백질이다. 일 구현예에서, 생물학적 작용제는 종양용해성 바이러스이다.
일 구현예에서, 항-신생물제는 면역치료제이다. 일 구현예에서, 면역치료제는 톨(Toll)-유사 수용체(TLR) 효능제, 세포-기반 요법, 사이토카인, 암 백신 및 면역 체크포인트 분자의 면역 체크포인트 조절제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, TLR 효능제는 콜리(Coley) 독소 및 바실러스 칼메트-게랭(BCG)으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 세포-기반 요법은 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포) 요법이다.
일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 CD27, CD28, CD40, OX40, GITR, ICOS, 4-1BB, ADORA2A, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, KIR, LAG-3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 및 VISTA로부터 선택된다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 자극성 면역 체크포인트 분자이며, 면역 체크포인트 조절제는 자극성 면역 체크포인트 분자의 효능제이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 저해성 면역 체크포인트 분자이며, 면역 체크포인트 조절제는 저해성 면역 체크포인트 분자의 길항제이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 소분자, 저해성 RNA, 안티센스 분자 및 면역 체크포인트 분자 결합 단백질로부터 선택된다.
일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 PD-1이며, 면역 체크포인트 조절제는 PD-1 저해제이다. 일 구현예에서, PD-1 저해제는 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab), 피딜리주맙(pidilizumab), SHR-1210, MEDI0680R01, BBg-A317, TSR-042, REGN2810 및 PF-06801591로부터 선택된다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 PD-L1이며, 면역 체크포인트 조절제는 PD-L1 저해제이다. 일 구현예에서, PD-L1 저해제는 두발루맙(durvalumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), MDX-1105, AMP-224 및 LY3300054로부터 선택된다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 CTLA-4이며, 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4 저해제이다. 일 구현예에서, CTLA-4 저해제는 이필리무맙(ipilimumab), 트레멜리무맙(tremelimumab), JMW-3B3 및 AGEN1884로부터 선택된다. 일 구현예에서, 항-신생물제는 히스톤 데아세틸라제 저해제이다. 일 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 저해제는 하이드록삼산, 벤즈아미드, 사이클릭 테트라펩티드, 뎁시펩티드, 친전자성 케톤 또는 지방족 화합물이다. 일 구현예에서, 하이드록삼산은 보리노스타트(vorinostat)(SAHA), 벨리노스타트(belinostat)(PXD101), LAQ824, 트리코스타틴(trichostatin) A 또는 파노빈 오스타트(panobin ostat)(LBH589)이다.
일 구현예에서, 벤즈아미드는 엔티노스타트(entinostat)(MS-275), 01994 또는 모세티노스타트(mocetinostat)(MGCD0103)이다. 일 구현예에서, 사이클릭 테트라펩티드는 트라폭신(trapoxin) B이다. 일 구현예에서, 지방족 산은 페닐 부티레이트 또는 발프로산이다.
본 발명은 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포에 관한 것이다. 타노트랜스미션은 세포 간의, 예를 들어, 신호전달 세포(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 엔지니어링된 면역 세포)와 반응 세포 사이의 소통 과정으로, 반응 세포가 생물학적 반응을 겪도록 신호를 전달하는 신호전달 세포에서 세포 턴오버 경로, 예를 들어, 세포 예정사의 활성화의 결과이다. 타노트랜스미션은 세포 턴오버 경로 유전자, 예를 들어, 세포 예정사 경로 유전자의 발현에 의해 신호전달 세포에서 유도될 수 있다. 세포 턴오버 경로가 활성화된 신호전달 세포는 신호전달 세포에 의해 활발히 방출되는 인자를 통해, 또는 신호전달 세포의 턴오버(예를 들어, 세포 사멸) 동안 반응 세포에 노출되는 신호전달 세포의 세포내 인자를 통해 반응 세포에 신호를 전달할 수 있다. 본 발명의 다양한 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포에 의해 발현된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 증가시키고/시키거나, 면역 세포에서 타노트랜스미션을 억제하는 하나 이상의 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 감소시킴으로써 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시킨다. 따라서, 특정 양태에서, 본 발명은 대상체에서 타노트랜스미션을 촉진시키는 방법에 관한 것이며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 엔지니어링된 면역 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 신호전달 세포(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 엔지니어링된 면역 세포)는 표적 세포(예를 들어, 암 세포)에 의한 타노트랜스미션을 표적 세포와의 접촉 또는 표적 세포로의 근접을 통해 촉진시킴으로써 대상체에서 타노트랜스미션을 추가로 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 세포 턴오버 동안 엔지니어링된 면역 세포에 의해 방출된 인자는 마찬가지로 표적 세포에서 세포 턴오버, 예를 들어, 세포 예정사를 개시하여, 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 방법에 관한 것이며, 방법은 표적 세포, 또는 표적 세포를 포함하는 조직을 본원에 기재된 바와 같은 엔지니어링된 면역 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 추가적으로 세포 턴오버, 예를 들어, 세포 예정사를 촉발시키는 이종성 신호 전달 도메인을 포함한다. 신호 전달 도메인은, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) 세포내 신호전달 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 신호 전달 도메인의 활성화 시 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 프로모터의 전사 제어 하에 있다.
I. 정의
본원에서 사용되는 용어 "투여한다", "투여하는" 또는 "투여"는 대상체의 기관계 내로의, 또는 대상체 내의 또는 대상체 상의 특정 영역으로의 약제학적 조성물 또는 작용제의 임의의 전달 방법을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "조합하여 투여하는", "동시-투여" 또는 "조합 요법"은 개별 제형 또는 단일의 약제학적 제형을 사용한 둘 이상의 활성제의 투여, 또는 둘 모두의(또는 모든) 활성제가 동시에 생물학적 활성을 발휘하는 기간이 존재하게 하는 임의의 순서로의 연속 투여로서 이해된다. 하나의 활성제(예를 들어, 세포 턴오버 또는 세포 예정사를 겪고 타노트랜스미션을 개시하도록 엔지니어링된 면역 세포)는 제2 치료제(예를 들어, 면역치료제)의 활성을 개선시킬 수 있는, 예를 들어, 표적 세포, 예를 들어, 암 세포를 제2 치료제의 활성에 대하여 감작시킬 수 있는 또는 제2 치료제와 상승적 효과를 가질 수 있는 것이 본원에서 고려된다. "조합하여 투여하는"은 작용제가 동시에, 동일한 빈도로 또는 동일한 투여 경로에 의해 투여되는 것을 필요로 하지 않는다. 본원에 사용되는 바와 같이, "조합하여 투여하는", "동시-투여" 또는 "조합 요법"은 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 면역치료제(예를 들어, 면역 체크포인트 조절제)와 함께 세포 턴오버를 겪고 타노트랜스미션을 개시하도록 엔지니어링된 면역 세포의 투여를 포함한다. 면역치료제의 예가 본원에 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 도메인"은 표적 세포 또는 표적 병원체(예를 들어, 진균, 박테리아 또는 바이러스)의 표면 상의 또 다른 단백질에 결합하는 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편이다. 용어 "항원 결합 도메인"은 항체 및 항체 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 항원의 에피토프와 특이적으로 상호작용하는(예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의해) 능력을 보유하는 항체의 적어도 하나의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, 디설파이드-연결된 Fv(sdFv), VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대, sdAb(VL 또는 VH), 낙타류 VHH 도메인, 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편과 같은 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체, 및 단리된 CDR 또는 항체의 다른 에피토프 결합 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv 내로 혼입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조). 항원 결합 단편은 또한 피브로넥틴 III형(Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기반한 스캐폴드 내로 그라프팅될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디가 기재되어 있는 미국 특허 제6,703,199호 참조).
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하고, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어, 합성 링커, 예를 들어, 짧은 가요성 폴리펩티드 링커를 통해 연속적으로 연결되고, 단쇄 폴리펩티드로서 발현될 수 있고, 여기서 scFv는 이것이 유래된 온전한 항체의 특이성을 보유한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 바와 같이 scFv는 VL 및 VH 가변 영역을, 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 단부와 관련하여 어느 순서로든 가질 수 있고, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역 세포에서 발현될 때 세포에 표적 세포(예를 들어, 암 세포)에 대한 특이성 및 세포내 신호 발생을 제공하는 일련의 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, CAR은 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 TCR-형 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 하기 정의된 바와 같이 적어도 하나의 공동자극 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CAR을 구성하는 일련의 폴리펩티드는 동일한 폴리펩티드 쇄에 있다(예를 들어, CAR은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질이다). 일부 구현예에서, CAR을 구성하는 일련의 폴리펩티드는 서로 인접하지 않으며, 예를 들어, 상이한 폴리펩티드 쇄에 있다. 일부 구현예에서, CAR을 구성하는 일련의 폴리펩티드는 이량체화 분자의 존재 시, 폴리펩티드를 서로 커플링할 수 있는, 예를 들어, 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링할 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다. 일 구현예에서, CAR의 TCR-형 신호전달 도메인은 T 세포 수용체 복합체와 회합된 CD3 제타 쇄이다.
본원에서 사용되는 용어 "T 세포 수용체(TCR)-형 신호전달 도메인" 또는 "TCR-형 신호전달 도메인"은 T 세포 수용체(TCR)를 통해 항원-의존적 일차 활성화를 개시하는 CAR의 세포내 신호전달 도메인의 성분을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "공동자극 신호전달 도메인"은 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여 T 세포에 의한 공동자극 반응, 예컨대, 비제한적으로 증식을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너로부터의 도메인을 지칭한다. 공동자극 신호전달 도메인은 효율적인 면역 반응에 필요한 항원 수용체 또는 이들의 리간드 이외의 세포 표면 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 공동자극 신호전달 도메인은 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 단백질로부터 유래될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "신호 전달 도메인"은 이차 메신저를 생성하거나 이러한 메신저에 반응함으로써 이펙터로서 기능함으로써 규정된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위해 세포 내에서 정보를 전달함으로써 작용하는 단백질의 기능적 부분을 지칭한다.
폴리펩티드와 관련하여 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "변이체"는 상응하는 야생형 폴리펩티드와 적어도 하나의 아미노산 잔기가 상이한 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 상응하는 자연 발생 폴리펩티드와 상이한 적어도 하나의 활성을 갖는다. 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "변이체"는 상응하는 야생형 폴리뉴클레오티드와 적어도 하나의 뉴클레오티드가 상이한 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드 또는 변이체 폴리뉴클레오티드는 상응하는 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이체는 폴리펩티드의 기능성 단편이다.
폴리펩티드와 관련하여 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "기능성 단편"은 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성, 예를 들어, 타노트랜스미션을 촉진시키는 능력을 보유하는 폴리펩티드의 부분을 지칭한다. 일부 구현예에서, 기능성 단편은 폴리펩티드의 도메인, 예를 들어, 폴리펩티드의 RHIM 도메인, 사멸 폴드 도메인, 또는 TIR 도메인이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드의 기능성 단편은 도메인의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 도메인의 부분이다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "사멸 폴드 도메인"은 아폽토시스, 염증, 및 다른 세포 신호전달 과정에 관여하는 단백질에서 발견되는 6개 내지 7개의 단단히 꼬인 α-나선을 특징으로 하는 구조적으로 정의된 모티프를 지칭한다. 사멸 폴드 도메인은 호모타입 단백질-단백질 상호작용을 통해 서로 결합하여, 세포 턴오버 및 다른 세포 신호전달 경로의 개시에 관여하는 큰 기능적 복합체의 형성을 초래한다. 사멸 폴드 도메인의 예는 사멸 도메인(DD), 사멸 이펙터 도메인(DED), 카스파제 동원 도메인(CARD), 피린 도메인(PYD), 사멸 도메인을 갖는 Fas-관련 단백질(FADD), Fas 사멸 도메인, 종양 괴사 인자 수용체 유형 1-관련 사멸 도메인(TRADD), 및 종양 괴사 인자 수용체 1형(TNFR1)을 포함한다. 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Lahm et al., 2003, Cell Death & Differentiation 10: 10-12]을 참조한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "링커"는 2개의 폴리펩티드 서열을 함께 연결하기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용되는 글리신 및/또는 세린 잔기와 같은 아미노산으로 이루어진 가요성 펩티드를 지칭한다. 일 구현예에서, 링커는 Gly/Ser 링커이고, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9, n=10, n=11, n=12, n=13, n=14 또는 n=15이다. 일부 구현예에서, 링커는 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 링커는 (Gly2Ser), (GlySer) 또는 (Gly3Ser)의 다중 반복부를 포함한다. 또한, 전체가 본원에 참조로 포함되는 제WO2012/138475호에 기재된 링커가 포함된다. 일부 구현예에서, 링커는 문헌[Whitlow et al, Protein Eng. (1993) 6(8): 989-895]에 기재된 바와 같은 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO: 26)이다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 미만의 아미노산 잔기를 포함한다. 링커는 이어서 약물의 부착 또는 고형 지지체에 대한 부착과 같은 추가 기능을 위해 변형될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "증가시키는" 및 "감소시키는"은 조절하여, 각각 참조에 비하여 더 크거나 더 낮은 파라미터의 양, 기능 또는 활성을 초래하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물의 투여 이후에, 파라미터(예를 들어, IRF의 활성화, NFkB의 활성화, 대식구의 활성화, 종양의 크기 또는 성장)는 대상체에서 투여 이전의 파라미터의 양에 비하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 또는 그 이상 증가하거나 감소할 수 있다. 일반적으로, 측정기준은 투여 이후에 투여가 언급된 효과를 가졌던 시간, 예를 들어, 치료 섭생이 시작된 후 적어도 1일, 1주, 1개월, 3개월, 6개월에 측정된다. 유사하게, 예비-임상 파라미터(예컨대 본원에 기재된 조성물에 의한, 시험관 내에서의 세포의 NFkB 또는 IRF의 활성화 및/또는 시험 포유동물의 종양 부담의 감소)는 투여 이전의 파라미터의 양에 비하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 또는 그 이상 증가하거나 감소할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항-신생물제"는 암의 치료를 위해 사용되는 약물을 지칭한다. 항-신생물제는 화학치료제(예를 들어, 알킬화제, 항대사산물, 항종양 항생제, 국소이성질화효소(topoisomerase) 저해제, 유사분열 저해제 코르티코스테로이드 및 효소), 생물학적 항암제 및 면역 체크포인트 조절제를 포함한다.
"암 치료 섭생" 또는 "항-신생물 섭생"은 특정 일정에 따른 특정 양의 하나 이상의 항-신생물제의 대상체로의 투여를 포함하는 암의 치료를 위해 임상적으로 허용된 투여 프로토콜이다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "이종성"은 조합하여 자연 발생하지 않는 요소들의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 면역 세포에 이종성인 폴리뉴클레오티드는 면역 세포에서 자연 발생하지 않거나, 자연에서 발생하는 위치와 상이한 면역 세포의 위치에서 발생하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단은 이들이 자연에서 결합되지 않은 핵산 서열에 결합될 수 있다. 면역 세포에 이종성인 폴리펩티드는 면역 세포에서 자연 발생하지 않는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "면역 체크포인트" 또는 "면역 체크포인트 분자"는 신호를 조절하는 면역계 내의 분자이다. 면역 체크포인트 분자는 자극성 체크포인트 분자일 수 있고, 즉, 신호를 증가시킬 수 있거나, 또는 저해성 체크포인트 분자일 수 있고, 즉, 신호를 감소시킬 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 "자극성 체크포인트 분자"는 신호를 증가시키거나, 공동-자극성인 면역계 내의 분자이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "저해성 체크포인트 분자"는 신호를 감소시키거나 공동-저해성인 면역계 내의 분자이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "면역 체크포인트 조절제"는 대상체에서 면역 체크포인트의 활성을 변경시킬 수 있는 작용제이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD27, CD28, CD40, OX40, GITR, ICOS, 4-1BB, ADORA2A, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, KIR, LAG-3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 및 VISTA를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 면역 체크포인트 분자의 기능을 변경시킨다. 면역 체크포인트 조절제는 면역 체크포인트의 효능제 또는 길항제일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 면역 체크포인트 결합 단백질(예를 들어, 항체, 항체 Fab 단편, 이가 항체, 항체 약물 컨쥬게이트, scFv, 융합 단백질, 2가 항체 또는 4가 항체)이다. 다른 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 소분자이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 항-PD1, 항-PD-L1, 또는 항-CTLA-4 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "면역치료제"는 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 약제학적으로 허용 가능한 화합물, 조성물 또는 요법제를 지칭한다. 면역치료제는 면역 체크포인트 조절제, 톨-유사 수용체(TLR) 효능제, 세포-기반 요법, 사이토카인 및 암 백신을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "종양학적 장애" 또는 "암" 또는 "신생물"은 백혈병, 림프종, 흑색종, 암종 및 육종을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 인간에서 발견되는 모든 유형의 암 또는 신생물을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "종양학적 장애", "암" 및 "신생물"은 상호교환 가능하게 사용되며, 단수 또는 복수 형태로, 그들을 숙주 유기체에 대하여 병원성이게 만드는 악성 변환을 겪은 세포를 지칭한다. 원발성 암 세포(즉, 악성 변환의 부위 근처로부터 수득되는 세포)는 널리 확립된 기법, 특히 조직학적 검사에 의해 비-암성 세포와 용이하게 구별될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 암 세포의 정의는 원발성 암 세포뿐만 아니라, 암 줄기 세포, 및 암 전구 세포 또는 암 세포 선조로부터 유래된 임의의 세포를 포함한다. 이는 전이된 암 세포, 및 암 세포로부터 유래된 시험관 내 배양물 및 세포주를 포함한다.
암의 병기결정에 대한 구체적인 기준은 종양 크기, 조직학적 특징, 종양 마커 및 해당 분야의 숙련자에게 공지된 다른 기준에 기초하여 특정 암 유형에 좌우된다. 일반적으로, 암 병기는 하기와 같이 기재될 수 있다: (i) 병기 0, 원 위치에서의 암종; (ii) 병기 I, 병기 II 및 병기 III, 숫자가 더 커질수록, 더 큰 종양 크기 및/또는 인근 림프절 및/또는 원발성 종양의 위치에 인접한 조직 또는 기관으로 처음 발생되는 기관을 넘어선 암의 확산을 포함하는 더욱 광범위한 질병을 나타냄; 및 (iii) 병기 IV, 암이 원위 조직 또는 기관으로 확산됨.
"고형 종양"은 예를 들어, CAT 스캔, MR 영상화, X-선, 초음파 또는 촉진과 같은 절차에 의해; 종양 덩어리에 기초하여 검출 가능하고/하거나 환자로부터 수득 가능한 시료 내의 하나 이상의 암-특이적 항원의 발현 때문에 검출 가능한 종양이다. 종양은 측정 가능한 치수를 가질 필요는 없다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 "대상체"는 인간 또는 비-인간 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 의미할 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 본 발명의 방법을 사용한 치료의 개시 이전에, 검출 가능한 또는 진단받은 암을 갖는다. 특정 구현예에서, 대상체는 본 발명의 방법을 사용한 치료의 개시 이전에, 검출 가능한 또는 진단받은 감염, 예를 들어, 만성 감염을 갖는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "자살 유전자"는 약물의 비독성 전구체를 세포독성 화합물로 전환시키는 단백질(예를 들어, 효소)을 인코딩하는 유전자를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포 턴오버"는 세포 내에서 물질을 재정렬하고 전파하며, 궁극적으로 세포 사멸을 초래하는 역학적 과정을 나타낸다. 세포 턴오버는 세포 턴오버 인자의 세포로부터의 생산 및 방출을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포 턴오버 인자"는 세포 턴오버를 겪고 있는 세포에 의해 생산되고, 궁극적으로 세포로부터 방출되고 다른 세포의 생물학적 활성에 영향을 미치는 분자 및 세포 단편이다. 세포 턴오버 인자는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질, 핵산, 소분자 및 세포 단편(예를 들어, 소낭 및 세포막 단편)을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포 턴오버 경로 유전자"는 세포 턴오버 경로를 촉진하거나, 유도하거나, 다르게는 이에 기여하는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "세포 예정사"는 다세포 유기체의 세포에 대한 중요한 말단 경로를 지칭하고, 형태형성, 조직 항상성의 유지, 및 유해 세포의 제거를 포함하는 다양한 생물학적 사건에 관여한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "세포 예정사 유전자"는 세포 예정사 경로를 촉진시키거나, 유도하거나, 달리 이에 기여하는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "타노트랜스미션"은 반응 표적 세포가 생물학적 반응을 겪도록 신호를 전달하는 신호전달 세포(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 엔지니어링된 면역 세포)에서 세포 턴오버 경로, 예를 들어, 세포 예정사의 활성화에 따른 세포 간의 소통이다. 타노트랜스미션은, 예를 들어, 이러한 경로를 촉진시키는 이종성 유전자의 발현을 통해 상기 세포에서 세포 턴오버 경로 유전자의 조절에 의해 신호전달 세포에서 유도될 수 있다. 표 1 내지 표 6은 다양한 세포 턴오버 경로를 촉진시킬 수 있는 예시적인 유전자 및 폴리펩티드를 기재한다. 세포 턴오버 경로가 이에 따라 활성화된 신호전달 세포는 신호전달 세포에 의해 활발히 방출되는 인자를 통해, 또는 신호전달 세포의 세포 턴오버(예를 들어, 세포 사멸) 동안 반응 표적 세포에 노출되는 신호전달 세포의 세포내 인자를 통해 반응 표적 세포에 신호를 전달할 수 있다. 특정 구현예에서, 활성화된 신호전달 세포는 반응 표적 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 면역자극 반응(예를 들어, 염증 유발 반응)을 촉진시킨다.
본원에 사용되는 바와 같은 "타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드"는 신호전달 세포(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 엔지니어링된 면역 세포)에서의 발현이 신호전달 세포에 의한 타노트랜스미션의 증가를 초래하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리펩티드, 즉, 신호전달 세포에서의 발현이 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 증가시키는 폴리펩티드를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 타노트랜스미션을 억제하는 폴리펩티드의 신호전달 세포에서 발현 및/또는 활성을 감소시킨다. 예를 들어, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 타노트랜스미션을 억제하는 폴리펩티드의 신호전달 세포에서 발현 및/또는 활성을 감소시키는 RNA 분자를 인코딩할 수 있다.
"치료적 유효량"은 질병을 치료하기 위하여 환자에게 투여되는 경우, 이러한 질병에 대한 치료를 달성하기에 충분한 화합물 또는 조성물의 양을 의미한다. 질병을 예방하기 위해 투여되는 경우, 양은 질병의 발병을 회피하거나 지연시키기에 충분하다. "치료적 유효량"은 화합물 또는 조성물, 질병 및 그의 중증도 및 치료될 환자의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다. 치료적 유효량은 치유적일 필요가 없다. 치료적 유효량은 질병 또는 질환이 발생하는 것을 온전히 예방할 필요는 없다. 대신에, 치료적 유효량은 질병 또는 질환의 발병, 중증도 또는 진행을 적어도 지연시키거나 감소시킬 양이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료", "치료하는" 및 그의 동족어는 질병, 질환 또는 장애를 개선시키거나, 호전시키거나, 안정화시키거나, 예방하거나, 치유하려는 의도를 갖는 대상체의 의료적 관리를 지칭한다. 이 용어는 능동적 치료(질병, 질환 또는 장애를 개선하는 것에 관한 치료), 원인 치료(관련 질병, 질환 또는 장애의 원인에 관한 치료), 완화 치료(증상의 완화를 위해 설계된 치료), 예방적 치료(관련 질병, 질환 또는 장애의 발생을 최소화하거나, 부분적으로 또는 완전히 저해하는 것에 관한 치료); 및 지지적 치료(또 다른 요법을 보충하기 위해 사용되는 치료)를 포함한다.
II. 세포 턴오버 경로
본원에 기재된 면역 세포는 면역 세포에서 세포 턴오버 경로를 조절하여 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 개시하도록 엔지니어링될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현을 통해 면역 세포에서 면역-자극성 세포 턴오버 경로를 유도하도록 엔지니어링된다.
면역-자극성 세포 턴오버 경로는 세포에서 활성화될 때, 다른 면역 세포와 같은 반응 세포에서 면역-자극 반응을 촉진시키는 세포 턴오버 경로이다. 면역-자극성 세포 턴오버 경로는 예정 괴사(예를 들어, 네크롭토시스, 파이롭토시스), 아폽토시스, 예를 들어, 외인성 및/또는 내인성 아폽토시스, 자가포식, 페롭토시스, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
예정 괴사
본원에서 사용되는 바와 같이, "예정 괴사"는 아폽토시스 동안 발생하는 막 온전성의 유지와 대조적으로, 형태학적 특징, 예컨대 세포 팽윤(온코시스(oncosis)), 막 파열 및 세포 내용물의 방출을 갖는 유전학적으로 제어된 세포 사멸을 지칭한다. 일부 구현예에서, 예정 괴사는 파이롭토시스이다. 일부 구현예에서, 예정 괴사는 네크롭토시스이다.
파이롭토시스
본원에서 사용되는 바와 같이, "파이롭토시스"는 카스파제 1-, 카스파제 4-, 또는 카스파제 5-의존적 세포 예정사의 선천적인 염증 과정을 지칭한다. 파이롭토시스의 가장 독특한 생화학적 특징은 카스파제-1의 조기의 유도된 근접-매개된 활성화이다. 카스파제-1, 4 또는 5의 파이롭토시스 활성화는 NOD-유사 수용체(NLR) 또는 기타 센서, 예컨대 카스파제-1 활성화를 촉진하는 연결자 단백질 ASC를 동원하는 시토졸 DNA 센서 흑색종 부재 2(absent in melanoma 2; AIM2)를 수반하는 인플라마좀(inflammasome)으로 알려져 있는 다중단백질 플랫폼의 맥락에서 발생할 수 있다. 카스파제-4/5는 LPS에 의해 직접적으로 활성화될 수 있다. 둘 모두의 경우에, 활성 카스파제-1은 단백질분해 성숙 및 발열성 인터류킨-1β(IL-1β) 및 IL-18의 방출을 촉매한다. 또한, 일부(전부는 아님) 경우에, 카스파제 활성화는 GSDM-D를 표적화하여, 막 파열 및 세포 사멸을 구동한다. 문헌[Galluzzi et al., 2018, Cell Death Differ. Mar; 25(3): 486-541]을 참조한다.
본 개시내용의 방법에서, 파이롭토시스는 면역 세포에서 파이롭토시스를 유도하는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현을 통해 면역 세포에서 유도될 수 있다. 면역 세포에서 파이롭토시스를 유도할 수 있는 폴리펩티드에는 NLR, ASC, GSDM-D, AIM2 및 BIRC1이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
몇몇 방법이 당업계에 알려져 있으며, 특정 마커의 검출을 통해 파이롭토시스를 겪고 있는 세포를 확인하고, 다른 유형의 세포 디스어셈블리 및/또는 세포 사멸과 구별하기 위해 사용될 수 있다. 파이롭토시스는 카스파제-1, 카스파제-4 또는 카스파제-5 활성을 필요로 하며, 보통 전구-IL-1b 및/또는 전구-IL-18의 가공, 이들 성숙 사이토카인의 방출, 및 GSDM-D의 카스파제-1/4/5 절단 단편에 의한 막 투과성을 동반한다. GSDM-B 및 GSDM-E를 포함하는 다른 가스더민이 또한 파이롭토시스에 관여하고, 파이롭토시스의 마커로서 사용될 수 있다.
네크롭토시스
네크롭토시스는 세포 예정사 경로의 주요 유형이다. 네크롭토시스는 세포 팽윤, 세포소기관 기능장애 및 세포 용해를 수반한다(Wu W, et al., (2012) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 82, 249-258). 일반적으로 우발적으로 또는 조절되지 않고 발생하는 괴사와 달리, 네크롭토시스는 세포 대사 및 유전독성 스트레스 또는 다양한 항암제에 의해 유도될 수 있는 조절된 과정이다. 네크롭토시스는 정상적인 발달 동안 필수적인 역할을 한다. 또한, 이는 암을 포함하는 다양한 인간 질병의 발병기전에 연루되었다(Fulda S, (2013), Cancer Biol Ther. 14(11):999-1004). 일부 구현예에서, 네크롭토시스는 수용체 상호작용 단백질 키나제 3(RIP1- 및/또는 RIPK3)/혼합 계통 키나제-유사(MLKL)-의존적 괴사를 지칭한다. 알킬화 DNA 손상, 흥분독소(excitotoxin) 및 사멸 수용체의 라이게이션을 포함하는 몇몇 트리거는 네크롭토시스를 유도할 수 있다. 예를 들어, 카스파제(및 특히, 카스파제-8 또는 카스파제-10)가 (예를 들어, 유전자 낙아웃 또는 RNA 간섭, RNAi에 의한) 유전학적 조작에 의해 저해되거나, 약리학적 작용제(예를 들어, 화학적 카스파제 저해제)에 의해 차단되는 경우, RIPK3은 MLKL을 인산화하여, 막 포어 내로의 MLKL 어셈블리를 야기하며, 이는 괴사 세포 사멸의 실행을 궁극적으로 활성화시킨다. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Galluzzi et al., 2018, Cell Death Differ. Mar; 25(3): 486-541]을 참조한다.
본 개시내용의 방법에서, 네크롭토시스는 면역 세포에서 네크롭토시스를 유도하는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현을 통해 면역 세포에서 유도될 수 있다. 면역 세포에서 네크롭토시스를 유도할 수 있는 폴리펩티드에는 톨-유사 수용체 3(TLR3), TLR4, TIR 도메인 함유 연결자 단백질(TIRAP), 톨/인터류킨-1 수용체(TIR)-도메인-함유 어댑터-유도 인터페론-β(TRIF), Z-DNA-결합 단백질 1(ZBP1), 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 1(RIPK1), 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 3(RIPK3), 혼합 계통 키나제 도메인 유사 슈도키나제(MLKL), 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), FS-7-관련 표면 항원(FAS), TNF-연관 아폽토시스 유도 리간드 수용체(TRAILR) 및 종양 괴사 인자 수용체 1형-관련 사멸 도메인 단백질(TRADD)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
몇몇 방법이 당업계에 알려져 있으며, 특정 마커의 검출을 통해 네크롭토시스를 겪고 있는 세포를 확인하고, 다른 유형의 세포 디스어셈블리 및/또는 세포 사멸과 구별하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 전형적으로 세포의 면역블롯 또는 면역염색에 의해 이들 번역후 변형을 검출하는 항체에 의한 RIPK1, RIPK3 및 MLKL의 인산화를 포함한다. 네크롭토시스는 카스파제 활성화의 부재, 신속한 막 투과성, 막으로의 MLKL 재국소화, 세제 불용성 분획 내로의 RIPK3 및 MLKL의 축적, RIPK3/MLKL 복합체 형성 및 MLKL 올리고머화에 의해 아폽토시스 및 파이롭토시스와 구별될 수 있다. 네크롭토시스는 유전학적으로, 그리고 약리학적으로 RIPK3 및 MLKL 둘 모두 및 이들의 활성화의 요건에 의해 정의될 수 있다.
아폽토시스
본원에 사용되는 바와 같은 아폽토시스는 세포 수축, 핵 축합 및 단편화, 동적 막 수포 및 이웃 또는 세포외 기질에 대한 접착성 손실을 포함하여, 죽어가는 세포의 특이적 형태학적 및 생화학적 변화를 특징으로 하는 세포 예정사의 유형을 지칭한다(Nishida K, et al., (2008) Circ. Res. 103, 343-351). 2개의 기본적인 아폽토시스 신호전달 경로가 존재한다: 외인성 및 내인성 경로(Verbrugge I, et al., (2010) Cell. 143:1192-2). 내인성 아폽토시스 경로는 DNA 손상, 성장 인자 박탈, 및 산화 스트레스를 포함하는 다양한 세포내 자극에 의해 활성화된다. 아폽토시스의 외인성 경로는 사멸 리간드가 사멸 수용체에 결합하고, 이어서 사멸-유도 신호전달 복합체의 조립에 의해 개시되는데, 이는 다운스트림 이펙터 카스파제를 활성화시켜 세포 사멸을 직접 유도하거나 미토콘드리아-매개 고유 아폽토시스 경로를 활성화시킨다(Verbrugge I, et al., (2010) Cell.143:1192-2).
외인성 아폽토시스
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 '외인성 아폽토시스'는 특정 막횡단 수용체에 의해 감지되고 전파되는 세포외 스트레스 신호에 의해 유도되는 아폽토시스 세포 사멸의 예를 말한다. 외인성 아폽토시스는 다양한 사멸 수용체(즉, 각각 FAS/CD95, TNFα 수용체 1(TNFR1) 및 TRAIL 수용체(TRAILR)1-2)로의 리간드, 예컨대 FAS/CD95 리간드(FASL/CD95L), 종양 괴사 인자 α(TNFα) 및 TNF(리간드) 상과, 구성원 10(TNFSF10, TNF-연관 아폽토시스 유도 리간드, TRAIL로 가장 잘 알려져 있음)의 결합에 의해 개시될 수 있다. 대안적으로, 외인적 아폽토시스-유발 신호는 이들의 특이적인 리간드의 농도가 결정적인 임계치 수준 미만으로 떨어질 때만 치명적인 기능을 발휘하는 네트린 수용체(예를 들어, ans-D 및 대장 암종 내 결실, DCC)를 포함하는 소위 '의존적 수용체'에 의해 전송될 수 있다. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Galluzzi et al., 2018, Cell Death Differ. Mar; 25(3): 486-541]을 참조한다.
본 개시내용의 방법에서, 외인성 아폽토시스는 표적 세포에서 외인성 아폽토시스를 유도하는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현을 통해 면역 세포에서 유도될 수 있다. 표적 세포에서 외인성 아폽토시스를 유도할 수 있는 폴리펩티드에는 TNF, Fas 리간드(FasL), TRAIL(및 이의 동족 수용체), TRADD, 사멸 도메인을 갖는 Fas-관련 단백질(FADD), 전환 성장 인자 베타-활성화 키나제 1(Tak1), 카스파제-8, XIAP, BID, 카스파제-9, APAF-1, CytoC, 카스파제-3 및 카스파제-7이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 표적 세포에서 외인성 아폽토시스를 저해할 수 있는 폴리펩티드에는 아폽토시스의 세포 저해제 단백질 1(Cellular Inhibitor of Apoptosis Protein 1; cIAP1), cIAP2, Ikka 및 Ikkb가 포함된다. 몇몇 방법이 당업계에 알려져 있으며, 특정 마커의 검출을 통해 아폽토시스를 겪고 있는 세포를 확인하고, 다른 유형의 세포 디스어셈블리 및/또는 세포 사멸과 구별하기 위해 사용될 수 있다. 아폽토시스는 카스파제 활성화를 필요로 하며, 카스파제 활성화의 저해제 및/또는 카스파제, 예컨대 카스파제-8 또는 카스파제-9의 부재에 의한 사멸의 예방에 의해 억제될 수 있다. 카스파제 활성화는 특이적인 기질, 예컨대 PARP 및 DFF45, 및 600가지 초과의 추가의 단백질의 절단에 의해 세포를 체계적으로 분해한다. 아폽토시스 세포막은 포스포티딜-세린의 외재화 및 동시의 막 수포형성(blebbing)과 함께, 처음에 온전하게 유지된다. 미토콘드리아 외막은 전형적으로 파열되어, 단백질, 예컨대 CytoC 및 HTRA2를 시토졸 내로 방출한다. 핵 DNA는 분리된 단편으로 절단되며, 이는 당업계에 알려져 있는 검정에 의해 검출될 수 있다.
자가포식
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "자가포식"은 재순환을 위해 예정된 세포질 거대분자 및 세포소기관을 둘러싸는 이중 막-결합 구조인 자가포식소체의 형성으로 시작하는 진화적으로 보존된 이화작용 과정을 지칭한다(Liu JJ, et al., (2011) Cancer Lett. 300, 105-114). 자가포식은 생리학적으로 스트레스 조건 하에서의 생존을 위한 세포 전략 및 메커니즘이다. 특정 상황 하에 과활성화될 때, 과도한 자가포식은 세포 사멸을 초래한다(Boya P, et al., (2013) Nat Cell Biol. 15(7):713-20).
본 개시내용의 방법에서, 자가포식은 면역 세포에서 자가포식을 유도하는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현을 통해 면역 세포에서 유도될 수 있다.
페롭토시스
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "페롭토시스"는 철 의존적이고 반응성 산소 종의 생산을 수반하는 조절된 세포 사멸의 과정을 지칭한다. 일부 구현예에서, 페롭토시스는 치사 수준으로의 지질 하이드로퍼옥사이드의 철-의존적 축적을 수반한다. 페롭토시스에 대한 민감성은 아미노산, 철, 및 다중불포화 지방산 대사, 및 글루타티온, 인지질, NADPH, 및 코엔자임 Q10의 생합성을 포함하는 수많은 생물학적 과정과 밀접하게 관련되어 있다. 페롭토시스는 미토콘드리아와 무관하지만 일부 세포 상황에서 NADPH 옥시다제에 의존적인 세포질 및 지질 ROS 둘 모두의 생산을 초래하는 대사 기능장애를 수반한다(예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Dixon et al., 2012, Cell 149(5):1060-72] 참조).
본 개시내용의 방법에서, 페롭토시스는 면역 세포에서 발현될 때 페롭토시스를 저해하는 면역 세포에 내인성인 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현을 통해 면역 세포에서 유도될 수 있다. 페롭토시스를 저해하는 단백질은 FSP1, GPX4, 및 System XC를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
몇몇 방법이 해당 분야에 알려져 있으며, 페롭토시스를 겪는 세포를 확인하고 특정 마커의 검출을 통해 다른 유형의 세포 분해 및/또는 세포 사멸과 구별하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Stockwell et al., 2017, Cell 171: 273-285] 참조). 예를 들어, 페롭토시스는 치명적인 지질 과산화로부터 발생할 수 있기 때문에, 지질 과산화를 측정하는 것은 철-의존적 세포 분해를 겪는 세포를 확인하는 한 가지 방법을 제공한다. C11-BODIPY 및 Liperfluo는 지질 ROS를 검출하기 위한 신속하고 간접적인 수단을 제공하는 친지성 ROS 센서이다(Dixon et al., 2012, Cell 149: 1060-1072). 액체 크로마토그래피(LC)/탠덤 질량 분석법(MS) 분석은 또한 특정 산화 지질을 직접 검출하는 데 사용될 수 있다(Friedmann Angeli et al., 2014, Nat. Cell Biol. 16: 1180-1191; Kagan et al., 2017, Nat. Chem. Biol. 13: 81-90). 이소프로스탄 및 말론디알데하이드(MDA)는 또한 지질 과산화를 측정하는 데 사용될 수 있다(Milne et al., 2007, Nat. Protoc. 2: 221-226; Wang et al., 2017, Hepatology 66(2): 449-465). MDA를 측정하기 위한 키트는 상업적으로 입수 가능하다(Beyotime, 아이먼, 중국).
페롭토시스를 연구하기 위한 다른 유용한 검정은 철 존재비 및 GPX4 활성을 측정하는 것을 포함한다. 철 존재비는 유도 결합 플라즈마-MS 또는 칼세인 AM 켄칭뿐만 아니라 다른 특정 철 프로브를 사용하여 측정될 수 있고(Hirayama and Nagasawa, 2017, J. Clin. Biochem. Nutr. 60: 39-48; Spangler et al., 2016, Nat. Chem. Biol. 12: 680-685), 반면에 GPX4 활성은 LC-MS를 사용하여 세포 용해물에서 포스파티딜콜린 하이드로퍼옥사이드 환원을 사용하여 검출될 수 있다(Yang et al., 2014, Cell 156: 317-331). 또한, 페롭토시스는 글루타티온(GSH) 함량을 측정함으로써 평가될 수 있다. GSH는, 예를 들어, 상업적으로 입수 가능한 GSH-Glo 글루타티온 검정(프로메가(Promega), 매디슨, WI)을 사용하여 측정될 수 있다.
페롭토시스는 또한 하나 이상의 마커 단백질의 발현을 측정함으로써 평가될 수 있다. 적합한 마커 단백질은 글루타티온 퍼옥시다제 4(GPX4), 프로스타글란딘-엔도퍼옥사이드 신타제 2(PTGS2), 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 마커 단백질 또는 마커 단백질을 인코딩하는 핵산의 발현 수준은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역전사효소 PCR 분석, 정량적 실시간 PCR, 단일-가닥 입체형태 다형성 분석(SSCP), 미스매치 절단 검출, 헤테로듀플렉스 분석, 노던 블롯 분석, 웨스턴 블롯 분석, 동소 혼성화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 서열분석, 분해 단편 길이 다형성 분석 및 이의 조합 또는 하위-조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 해당 분야에 알려져 있는 적합한 기법을 이용하여 결정될 수 있다.
IV. 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포
본 발명의 면역 세포는 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 표적 세포에서 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 면역 세포의 활성화 시 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 이종성 프로모터의 전사 제어 하에 있을 수 있고, 예를 들어, 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 면역 세포에 포함된 신호 전달 도메인의 활성화 및/또는 표적 항원에 대한 결합 시 활성화된다. 적합한 프로모터는 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 프로모터, STAT 프로모터, AP-1 프로모터, NF-κB 프로모터, 및 IRF4 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
면역 세포에서 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현은 면역 세포에서 세포 턴오버 경로를 변경할 수 있다. 예를 들어, 면역 세포에서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현은 면역 세포의 정상적인 세포 턴오버 경로를, 예를 들어, 네크롭토시스, 아폽토시스, 자가포식, 페롭토시스 또는 파이롭토시스와 같은 타노트랜스미션을 촉진시키는 세포 턴오버 경로로 변경할 수 있다.
일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 각각 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 2개, 3 개, 4 개 또는 5개의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 타노트랜스미션을 촉진시키는 예시적인 폴리펩티드는 하기 표 1에 제공된다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 야생형 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 야생형 단백질의 생물학적 활성 단편, 예를 들어, 야생형 단백질의 N-말단 또는 C-말단 절단을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 인간 단백질, 예를 들어, 인간 야생형 단백질을 인코딩한다.
[표 1]
타노트랜스미션을 촉진시키는 예시적인 폴리펩티드
Figure pct00001
Figure pct00002
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 3(RIPK3), Z-DNA-결합 단백질 1(ZBP1), 혼합 계통 키나제 도메인 유사 슈도키나제(MLKL), 톨/인터류킨-1 수용체(TIR)-도메인-함유 어댑터-유도 인터페론-β(TRIF), TIR 도메인 및 RHIM 도메인만을 포함하는 TRIF의 N-말단 절단, 인터페론 조절 인자 3(IRF3), 사멸 도메인을 갖는 절단된 Fas-관련 단백질(FADD), 및 세포 FLICE(FADD-유사 IL-1β-전환 효소)-저해성 단백질(c-FLIP) 중 임의의 하나 이상을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 가스더민-A(GSDM-A), 가스더민-B(GSDM-B), 가스더민-C(GSDM-C), 가스더민-D(GSDM-D), 가스더민-E(GSDM-E), 이량체화 도메인과 C-말단 카스파제 동원 도메인을 함유하는 아폽토시스-관련 반점-유사 단백질(ASC-CARD), 및 이의 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, TIR 도메인 및 RHIM 도메인만을 포함하는 TRIF의 N-말단 절단은 인간 TRIF(예를 들어, 미니-TRIF)의 아미노산 잔기 1 내지 311의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 TRIF의 변이체, 예를 들어, 야생형 인간 TRIF 단백질의 변이체를 인코딩한다. 예시적인 인간 TRIF 변이체는 하기 표 2에 제공된다.
[표 2]
인간 TRIF 및 이의 변이체
Figure pct00003
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 cIAP1, cIAP2, IKKa, IKKb, XIAP 및 Nemo로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩한다. 이들 폴리펩티드는 세포 사멸을 억제할 수 있지만, 예를 들어, NF-kB 활성화를 촉진함으로써 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 면역 세포에서 cIAP1, cIAP2, IKKα, IKKβ, XIAP 및/또는 Nemo의 발현 증가는 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시킨다. 다른 구현예에서, 면역 세포에서 cIAP1, cIAP2, IKKα, IKKβ, XIAP 및/또는 Nemo의 발현 감소는, 예를 들어, 이들 단백질에 의한 세포 사멸의 억제를 약화시켜 세포 턴오버를 촉진시킴으로써 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시킨다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 사멸 폴드 도메인을 인코딩한다. 사멸 폴드 도메인의 예는 사멸 도메인, 피린 도메인, 사멸 이펙터 도메인(DED), C-말단 카스파제 동원 도메인(CARD), 및 이의 변이체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 사멸 도메인은 사멸 도메인을 갖는 Fas-관련 단백질(FADD)의 사멸 도메인, Fas 수용체의 사멸 도메인, 종양 괴사 인자 수용체 1형-관련 사멸 도메인 단백질(TRADD)의 사멸 도메인, 종양 괴사 인자 수용체 1형(TNFR1)의 사멸 도메인, 및 이의 변이체로부터 선택된다. FADD는 208개의 아미노산으로 구성된 23 kDa 단백질이다. 이는 2개의 주요 도메인을 함유한다: C 말단 사멸 도메인(DD) 및 N 말단 사멸 이펙터 도메인(DED). 도메인은 각각 6개의 α-나선으로 이루어지며 서로 구조적으로 유사하다. FADD의 DD는 이들의 DD를 통해 원형질막에서 Fas 수용체와 같은 수용체에 결합한다. FADD의 DED는 프로카스파제 8과 같은 세포내 분자의 DED에 결합한다. 일부 구현예에서, FADD-DD는 FADD-DD의 우성 음성 돌연변이체, 또는 미리스톨화된 FADD-DD(myr-FADD-DD)이다.
일부 구현예에서, 피린 도메인은 NLR 패밀리 피린 도메인 함유 3(NLRP3) 및 아폽토시스-관련 반점-유사 단백질(ASC)로부터 선택된 단백질로부터의 것이다.
일부 구현예에서, 사멸 이펙터 도메인(DED)는 사멸 도메인을 갖는 Fas 관련 단백질(FADD), 카스파제-8 및 카스파제-10으로부터 선택된 단백질로부터의 것이다.
일부 구현예에서, CARD는 RIP-관련 ICH1/CED3-상동성 단백질(RAIDD), 아폽토시스-관련 반점-유사 단백질(ASC), 미토콘드리아 항바이러스-신호전달 단백질(MAVS), 카스파제-1, 및 이의 변이체로부터 선택된 단백질로부터의 것이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 TIR 도메인을 포함하는 단백질을 인코딩한다. TIR 도메인은 골수 분화 일차 반응 단백질 88(MyD88), 톨/인터류킨-1 수용체(TIR)-도메인-함유 어댑터-유도 인터페론-β(TRIF), 톨 유사 수용체 3(TLR3), 톨 유사 수용체 4(TLR4), TIR 도메인 함유 연결자 단백질(TIRAP), 및 전위 쇄-관련 막 단백질(TRAM)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 단백질로부터의 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 세포 FLICE(FADD-유사 IL-1β-전환 효소)-저해성 단백질(c-FLIP), 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 1(RIPK1), 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 3(RIPK3), Z-DNA-결합 단백질 1(ZBP1), 혼합 계통 키나제 도메인 유사 슈도키나제(MLKL), TIR 도메인 및 RHIM 도메인만을 포함하는 TRIF의 N-말단 절단, FADD, 저해제 kBα 슈퍼-리프레서(IkBα-SR), 인터류킨-1 수용체-관련 키나제 1(IRAK1), 종양 괴사 인자 수용체 1형-관련 사멸 도메인(TRADD), 카스파제-8의 우성 음성 돌연변이체, 인터페론 조절 인자 3(IRF3), 가스더민-A(GSDM-A) 및 이의 돌연변이체, 가스더민-B(GSDM-B) 및 이의 돌연변이체, 가스더민-C(GSDM-C) 및 이의 돌연변이체, 가스더민-D(GSDM-D) 및 이의 돌연변이체, 가스더민-E(GSDM-E) 및 이의 돌연변이체, 아폽토시스-관련 반점-유사 단백질(ASC), 그랜자임 A, 및 이량체화 도메인과 C-말단 카스파제 동원 도메인을 함유하는 아폽토시스-관련 반점-유사 단백질(ASC-CARD), 및 이의 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, cFLIP은 인간 cFLIP이다. 일부 구현예에서, cFLIP는 카스파제-8 및 FADD 유사 아폽토시스 조절 인자(cFLR)이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 유전자이다. 일부 구현예에서, 바이러스 유전자는 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스(KSHV)로부터의 vFLIP(ORF71/K13), 전염성 연속종 바이러스로부터의 MC159L, 말 헤르페스 바이러스 2로부터의 E8, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 또는 뮤린 사이토메갈로바이러스(MCMV)로부터의 vICA, 소 두창 바이러스로부터의 CrmA, 및 아우토그라파 칼리포르니카 멀티캡시드 뉴클레오폴리헤드로바이러스(AcMNPV)로부터의 P35로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩한다.
본원에 기재된 바와 같은 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리펩티드 중 임의의 것은 타노트랜스미션을 촉진시키는 이들의 능력을 추가로 향상시키도록 돌연변이될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, ZBP1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 수용체-상호작용 단백질 호모타입 상호작용 모티프(RHIM) C의 결실, RHIM D의 결실, RHIM B의 결실, 및 Zα1 도메인의 N-말단을 인코딩하는 영역에서의 결실 중 임의의 하나, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, ZBP1은 ZBP1 Za1/RHIM A 절단이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 1(RIPK1)의 발현 또는 활성을 저해한다. RIPK1은 TNF 및 Fas와 같은 사멸 수용체의 하류에서 네크롭토시스를 구동함으로써 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있다. 그러나, RIPK1의 RHIM 도메인은 또한 비정상적인 RHIM 올리고머화를 방지함으로써 TRIF- 및 ZBP1-매개 네크롭토시스를 저해할 수 있어, 네크롭토시스가 또한 RIPK1의 부재 하에 향상될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, RIPK1은 TRIF- 및 ZBP1-매개 네크롭토시스를 예방함으로써 타노트랜스미션을 저해할 수 있다.
타노트랜스미션을 촉진시키는 융합 단백질
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 융합 단백질은 하기 표 3에 열거된 도메인 중 둘 이상, 예를 들어, 표 3에 열거된 도메인 중 2개, 3개, 4개 또는 5개를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 TRIF TIR 도메인, TRIF RHIM 도메인 및 ASC-CARD를 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 이 융합 단백질은 카스파제-1을 동원하고 파이롭토시스를 활성화시킬 것이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 ZBP1 Za2 도메인 및 ASC-CARD를 포함한다. 이 융합 단백질은 파이롭토시스를 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 RIPK3 RHIM 도메인 및 카스파제 대형 서브유닛/소형 서브유닛(L/S) 도메인을 포함한다. 이 융합 단백질은 카스파제의 구성적 활성화를 구동하여, 표 3에 나타낸 바와 같이, 선택된 카스파제 L/S 도메인에 따라 상이한 유형의 세포 사멸을 야기할 것이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 TRIF TIR 도메인, TRIF RHIM 도메인 및 FADD 사멸 도메인(FADD-DD)을 포함한다. 이 융합 단백질은 아폽토시스를 차단하지만, 네크롭토시스를 유도한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 저해제 kBα 슈퍼-리프레서(IkBαSR) 및 카스파제-8 DED 도메인을 포함한다. 이 융합 단백질은 NF-kB를 저해하고 아폽토시스를 유도한다.
[표 3]
타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리펩티드 도메인. 제시된 약어는 사멸 도메인(DD), 사멸 이펙터 도메인(DED), 카스파제 동원 도메인(CARD), 및 대형 서브유닛/소형 서브유닛(L/S)이다. 폴리펩티드 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 대략적인 크기가 나타나 있다.
Figure pct00004
일부 구현예에서, 면역 세포는 타노트랜스미션을 촉진시키는 단지 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 이러한 단일 폴리뉴클레오티드는 단지 하나의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이러한 단일 폴리뉴클레오티드는 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드, 예를 들어, TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3, 카스파제, FADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma, TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D, 가스더민 E, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFSF) 단백질, 이의 변이체, 및 이의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩한다.
다른 구현예에서, 면역 세포는 타노트랜스미션을 촉진시키는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링되고, 여기서 각각의 폴리뉴클레오티드는 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하고, 예를 들어, 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3, 카스파제, FADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma, TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D, 가스더민 E, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFSF) 단백질, 이의 변이체, 및 이의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적합한 카스파제는 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-2, 카스파제-3, 카스파제-4, 카스파제-5, 카스파제-6, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-10, 카스파제-11 및 카스파제-12를 포함한다.
예시적인 TNFSF 단백질은 하기 표 4에 제공된다.
[표 4]
예시적인 TNFSF 단백질. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Locksley et al., 2001, Cell. 104 (4): 487-501]으로부터 조정됨.
Figure pct00005
Figure pct00006
타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 하기 표 5에 제공된다. 표 5의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는(또는 이에 대해 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는) 임의의 다른 폴리뉴클레오티드 서열이 또한 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
[표 5]
타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00007
Figure pct00008
둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드는 별도의 폴리펩티드로서 발현될 수 있거나, 이들은 키메라 단백질 내에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 단일 전사체로서 전사된다.
본원에 기재된 타노트랜스미션 폴리펩티드는 NF-kB의 활성화, IRF3 및/또는 IRF7의 활성화, 아폽토시스의 촉진, 및 예정 괴사(예를 들어, 네크롭토시스 또는 파이롭토시스)의 촉진을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 메커니즘을 통해 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있다. 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 조합이 사용되는 경우, 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 각각은 유사한 메커니즘을 통해 또는 상이한 메커니즘을 통해 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2가지는 NF-kB를 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2가지는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2가지는 아폽토시스를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2가지는 예정 괴사(예를 들어, 네크롭토시스 또는 파이롭토시스)를 촉진시킨다.
둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드가 상이한 메커니즘을 통해 타노트랜스미션을 촉진시키는 경우, 메커니즘의 다양한 조합이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 NF-kB를 활성화시키고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 NF-kB를 활성화시키고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 아폽토시스를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 NF-kB를 활성화시키고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예정 괴사(예를 들어, 네크롭토시스 또는 파이롭토시스)를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 아폽토시스를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예정 괴사(예를 들어, 네크롭토시스 또는 파이롭토시스)를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 아폽토시스를 촉진시키며, 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예정 괴사(예를 들어, 네크롭토시스 또는 파이롭토시스)를 촉진시킨다.
일부 구현예에서, NF-kB를 활성화시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TNFSF 단백질 및 이의 기능성 단편 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, MyD88, MAVS, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3 및 이의 기능성 단편 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 아폽토시스를 촉진시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, RIPK1, 카스파제, FADD, TRADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma 및 이의 기능성 단편 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 예정 괴사(예를 들어, 네크롭토시스 또는 파이롭토시스)를 촉진시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 및 이의 기능성 단편 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드의 조합은 TRADD 및 TRAF2, TRADD 및 TRAF6, TRADD 및 cIAP1, TRADD 및 cIAP2, TRADD 및 XIAP, TRADD 및 NOD2, TRADD 및 MyD88, TRADD 및 TRAM, TRADD 및 HOIL, TRADD 및 HOIP, TRADD 및 Sharpin, TRADD 및 IKKg, TRADD 및 IKKa, TRADD 및 IKKb, TRADD 및 RelA, TRADD 및 MAVS, TRADD 및 RIGI, TRADD 및 MDA5, TRADD 및 Tak1, TRADD 및 TBK1, TRADD 및 IKKe, TRADD 및 IRF3, TRADD 및 IRF7, TRADD 및 IRF1, TRADD 및 TRAF3, TRADD 및 카스파제, TRADD 및 FADD, TRADD 및 TNFR1, TRADD 및 TRAILR1, TRADD 및 TRAILR2, TRADD 및 FAS, TRADD 및 Bax, TRADD 및 Bak, TRADD 및 Bim, TRADD 및 Bid, TRADD 및 Noxa, TRADD 및 Puma, TRADD 및 TRIF, TRADD 및 ZBP1, TRADD 및 RIPK1, TRADD 및 RIPK3, TRADD 및 MLKL, TRADD 및 가스더민 A, TRADD 및 가스더민 B, TRADD 및 가스더민 C, TRADD 및 가스더민 D, TRADD 및 가스더민 E, TRAF2 및 TRAF6, TRAF2 및 cIAP1, TRAF2 및 cIAP2, TRAF2 및 XIAP, TRAF2 및 NOD2, TRAF2 및 MyD88, TRAF2 및 TRAM, TRAF2 및 HOIL, TRAF2 및 HOIP, TRAF2 및 Sharpin, TRAF2 및 IKKg, TRAF2 및 IKKa, TRAF2 및 IKKb, TRAF2 및 RelA, TRAF2 및 MAVS, TRAF2 및 RIGI, TRAF2 및 MDA5, TRAF2 및 Tak1, TRAF2 및 TBK1, TRAF2 및 IKKe, TRAF2 및 IRF3, TRAF2 및 IRF7, TRAF2 및 IRF1, TRAF2 및 TRAF3, TRAF2 및 카스파제, TRAF2 및 FADD, TRAF2 및 TNFR1, TRAF2 및 TRAILR1, TRAF2 및 TRAILR2, TRAF2 및 FAS, TRAF2 및 Bax, TRAF2 및 Bak, TRAF2 및 Bim, TRAF2 및 Bid, TRAF2 및 Noxa, TRAF2 및 Puma, TRAF2 및 TRIF, TRAF2 및 ZBP1, TRAF2 및 RIPK1, TRAF2 및 RIPK3, TRAF2 및 MLKL, TRAF2 및 가스더민 A, TRAF2 및 가스더민 B, TRAF2 및 가스더민 C, TRAF2 및 가스더민 D, TRAF2 및 가스더민 E, TRAF6 및 cIAP1, TRAF6 및 cIAP2, TRAF6 및 XIAP, TRAF6 및 NOD2, TRAF6 및 MyD88, TRAF6 및 TRAM, TRAF6 및 HOIL, TRAF6 및 HOIP, TRAF6 및 Sharpin, TRAF6 및 IKKg, TRAF6 및 IKKa, TRAF6 및 IKKb, TRAF6 및 RelA, TRAF6 및 MAVS, TRAF6 및 RIGI, TRAF6 및 MDA5, TRAF6 및 Tak1, TRAF6 및 TBK1, TRAF6 및 IKKe, TRAF6 및 IRF3, TRAF6 및 IRF7, TRAF6 및 IRF1, TRAF6 및 TRAF3, TRAF6 및 카스파제, TRAF6 및 FADD, TRAF6 및 TNFR1, TRAF6 및 TRAILR1, TRAF6 및 TRAILR2, TRAF6 및 FAS, TRAF6 및 Bax, TRAF6 및 Bak, TRAF6 및 Bim, TRAF6 및 Bid, TRAF6 및 Noxa, TRAF6 및 Puma, TRAF6 및 TRIF, TRAF6 및 ZBP1, TRAF6 및 RIPK1, TRAF6 및 RIPK3, TRAF6 및 MLKL, TRAF6 및 가스더민 A, TRAF6 및 가스더민 B, TRAF6 및 가스더민 C, TRAF6 및 가스더민 D, TRAF6 및 가스더민 E, cIAP1 및 cIAP2, cIAP1 및 XIAP, cIAP1 및 NOD2, cIAP1 및 MyD88, cIAP1 및 TRAM, cIAP1 및 HOIL, cIAP1 및 HOIP, cIAP1 및 Sharpin, cIAP1 및 IKKg, cIAP1 및 IKKa, cIAP1 및 IKKb, cIAP1 및 RelA, cIAP1 및 MAVS, cIAP1 및 RIGI, cIAP1 및 MDA5, cIAP1 및 Tak1, cIAP1 및 TBK1, cIAP1 및 IKKe, cIAP1 및 IRF3, cIAP1 및 IRF7, cIAP1 및 IRF1, cIAP1 및 TRAF3, cIAP1 및 카스파제, cIAP1 및 FADD, cIAP1 및 TNFR1, cIAP1 및 TRAILR1, cIAP1 및 TRAILR2, cIAP1 및 FAS, cIAP1 및 Bax, cIAP1 및 Bak, cIAP1 및 Bim, cIAP1 및 Bid, cIAP1 및 Noxa, cIAP1 및 Puma, cIAP1 및 TRIF, cIAP1 및 ZBP1, cIAP1 및 RIPK1, cIAP1 및 RIPK3, cIAP1 및 MLKL, cIAP1 및 가스더민 A, cIAP1 및 가스더민 B, cIAP1 및 가스더민 C, cIAP1 및 가스더민 D, cIAP1 및 가스더민 E, cIAP2 및 XIAP, cIAP2 및 NOD2, cIAP2 및 MyD88, cIAP2 및 TRAM, cIAP2 및 HOIL, cIAP2 및 HOIP, cIAP2 및 Sharpin, cIAP2 및 IKKg, cIAP2 및 IKKa, cIAP2 및 IKKb, cIAP2 및 RelA, cIAP2 및 MAVS, cIAP2 및 RIGI, cIAP2 및 MDA5, cIAP2 및 Tak1, cIAP2 및 TBK1, cIAP2 및 IKKe, cIAP2 및 IRF3, cIAP2 및 IRF7, cIAP2 및 IRF1, cIAP2 및 TRAF3, cIAP2 및 카스파제, cIAP2 및 FADD, cIAP2 및 TNFR1, cIAP2 및 TRAILR1, cIAP2 및 TRAILR2, cIAP2 및 FAS, cIAP2 및 Bax, cIAP2 및 Bak, cIAP2 및 Bim, cIAP2 및 Bid, cIAP2 및 Noxa, cIAP2 및 Puma, cIAP2 및 TRIF, cIAP2 및 ZBP1, cIAP2 및 RIPK1, cIAP2 및 RIPK3, cIAP2 및 MLKL, cIAP2 및 가스더민 A, cIAP2 및 가스더민 B, cIAP2 및 가스더민 C, cIAP2 및 가스더민 D, cIAP2 및 가스더민 E, XIAP 및 NOD2, XIAP 및 MyD88, XIAP 및 TRAM, XIAP 및 HOIL, XIAP 및 HOIP, XIAP 및 Sharpin, XIAP 및 IKKg, XIAP 및 IKKa, XIAP 및 IKKb, XIAP 및 RelA, XIAP 및 MAVS, XIAP 및 RIGI, XIAP 및 MDA5, XIAP 및 Tak1, XIAP 및 TBK1, XIAP 및 IKKe, XIAP 및 IRF3, XIAP 및 IRF7, XIAP 및 IRF1, XIAP 및 TRAF3, XIAP 및 카스파제, XIAP 및 FADD, XIAP 및 TNFR1, XIAP 및 TRAILR1, XIAP 및 TRAILR2, XIAP 및 FAS, XIAP 및 Bax, XIAP 및 Bak, XIAP 및 Bim, XIAP 및 Bid, XIAP 및 Noxa, XIAP 및 Puma, XIAP 및 TRIF, XIAP 및 ZBP1, XIAP 및 RIPK1, XIAP 및 RIPK3, XIAP 및 MLKL, XIAP 및 가스더민 A, XIAP 및 가스더민 B, XIAP 및 가스더민 C, XIAP 및 가스더민 D, XIAP 및 가스더민 E, NOD2 및 MyD88, NOD2 및 TRAM, NOD2 및 HOIL, NOD2 및 HOIP, NOD2 및 Sharpin, NOD2 및 IKKg, NOD2 및 IKKa, NOD2 및 IKKb, NOD2 및 RelA, NOD2 및 MAVS, NOD2 및 RIGI, NOD2 및 MDA5, NOD2 및 Tak1, NOD2 및 TBK1, NOD2 및 IKKe, NOD2 및 IRF3, NOD2 및 IRF7, NOD2 및 IRF1, NOD2 및 TRAF3, NOD2 및 카스파제, NOD2 및 FADD, NOD2 및 TNFR1, NOD2 및 TRAILR1, NOD2 및 TRAILR2, NOD2 및 FAS, NOD2 및 Bax, NOD2 및 Bak, NOD2 및 Bim, NOD2 및 Bid, NOD2 및 Noxa, NOD2 및 Puma, NOD2 및 TRIF, NOD2 및 ZBP1, NOD2 및 RIPK1, NOD2 및 RIPK3, NOD2 및 MLKL, NOD2 및 가스더민 A, NOD2 및 가스더민 B, NOD2 및 가스더민 C, NOD2 및 가스더민 D, NOD2 및 가스더민 E, MyD88 및 TRAM, MyD88 및 HOIL, MyD88 및 HOIP, MyD88 및 Sharpin, MyD88 및 IKKg, MyD88 및 IKKa, MyD88 및 IKKb, MyD88 및 RelA, MyD88 및 MAVS, MyD88 및 RIGI, MyD88 및 MDA5, MyD88 및 Tak1, MyD88 및 TBK1, MyD88 및 IKKe, MyD88 및 IRF3, MyD88 및 IRF7, MyD88 및 IRF1, MyD88 및 TRAF3, MyD88 및 카스파제, MyD88 및 FADD, MyD88 및 TNFR1, MyD88 및 TRAILR1, MyD88 및 TRAILR2, MyD88 및 FAS, MyD88 및 Bax, MyD88 및 Bak, MyD88 및 Bim, MyD88 및 Bid, MyD88 및 Noxa, MyD88 및 Puma, MyD88 및 TRIF, MyD88 및 ZBP1, MyD88 및 RIPK1, MyD88 및 RIPK3, MyD88 및 MLKL, MyD88 및 가스더민 A, MyD88 및 가스더민 B, MyD88 및 가스더민 C, MyD88 및 가스더민 D, MyD88 및 가스더민 E, TRAM 및 HOIL, TRAM 및 HOIP, TRAM 및 Sharpin, TRAM 및 IKKg, TRAM 및 IKKa, TRAM 및 IKKb, TRAM 및 RelA, TRAM 및 MAVS, TRAM 및 RIGI, TRAM 및 MDA5, TRAM 및 Tak1, TRAM 및 TBK1, TRAM 및 IKKe, TRAM 및 IRF3, TRAM 및 IRF7, TRAM 및 IRF1, TRAM 및 TRAF3, TRAM 및 카스파제, TRAM 및 FADD, TRAM 및 TNFR1, TRAM 및 TRAILR1, TRAM 및 TRAILR2, TRAM 및 FAS, TRAM 및 Bax, TRAM 및 Bak, TRAM 및 Bim, TRAM 및 Bid, TRAM 및 Noxa, TRAM 및 Puma, TRAM 및 TRIF, TRAM 및 ZBP1, TRAM 및 RIPK1, TRAM 및 RIPK3, TRAM 및 MLKL, TRAM 및 가스더민 A, TRAM 및 가스더민 B, TRAM 및 가스더민 C, TRAM 및 가스더민 D, TRAM 및 가스더민 E, HOIL 및 HOIP, HOIL 및 Sharpin, HOIL 및 IKKg, HOIL 및 IKKa, HOIL 및 IKKb, HOIL 및 RelA, HOIL 및 MAVS, HOIL 및 RIGI, HOIL 및 MDA5, HOIL 및 Tak1, HOIL 및 TBK1, HOIL 및 IKKe, HOIL 및 IRF3, HOIL 및 IRF7, HOIL 및 IRF1, HOIL 및 TRAF3, HOIL 및 카스파제, HOIL 및 FADD, HOIL 및 TNFR1, HOIL 및 TRAILR1, HOIL 및 TRAILR2, HOIL 및 FAS, HOIL 및 Bax, HOIL 및 Bak, HOIL 및 Bim, HOIL 및 Bid, HOIL 및 Noxa, HOIL 및 Puma, HOIL 및 TRIF, HOIL 및 ZBP1, HOIL 및 RIPK1, HOIL 및 RIPK3, HOIL 및 MLKL, HOIL 및 가스더민 A, HOIL 및 가스더민 B, HOIL 및 가스더민 C, HOIL 및 가스더민 D, HOIL 및 가스더민 E, HOIP 및 Sharpin, HOIP 및 IKKg, HOIP 및 IKKa, HOIP 및 IKKb, HOIP 및 RelA, HOIP 및 MAVS, HOIP 및 RIGI, HOIP 및 MDA5, HOIP 및 Tak1, HOIP 및 TBK1, HOIP 및 IKKe, HOIP 및 IRF3, HOIP 및 IRF7, HOIP 및 IRF1, HOIP 및 TRAF3, HOIP 및 카스파제, HOIP 및 FADD, HOIP 및 TNFR1, HOIP 및 TRAILR1, HOIP 및 TRAILR2, HOIP 및 FAS, HOIP 및 Bax, HOIP 및 Bak, HOIP 및 Bim, HOIP 및 Bid, HOIP 및 Noxa, HOIP 및 Puma, HOIP 및 TRIF, HOIP 및 ZBP1, HOIP 및 RIPK1, HOIP 및 RIPK3, HOIP 및 MLKL, HOIP 및 가스더민 A, HOIP 및 가스더민 B, HOIP 및 가스더민 C, HOIP 및 가스더민 D, HOIP 및 가스더민 E, Sharpin 및 IKKg, Sharpin 및 IKKa, Sharpin 및 IKKb, Sharpin 및 RelA, Sharpin 및 MAVS, Sharpin 및 RIGI, Sharpin 및 MDA5, Sharpin 및 Tak1, Sharpin 및 TBK1, Sharpin 및 IKKe, Sharpin 및 IRF3, Sharpin 및 IRF7, Sharpin 및 IRF1, Sharpin 및 TRAF3, Sharpin 및 카스파제, Sharpin 및 FADD, Sharpin 및 TNFR1, Sharpin 및 TRAILR1, Sharpin 및 TRAILR2, Sharpin 및 FAS, Sharpin 및 Bax, Sharpin 및 Bak, Sharpin 및 Bim, Sharpin 및 Bid, Sharpin 및 Noxa, Sharpin 및 Puma, Sharpin 및 TRIF, Sharpin 및 ZBP1, Sharpin 및 RIPK1, Sharpin 및 RIPK3, Sharpin 및 MLKL, Sharpin 및 가스더민 A, Sharpin 및 가스더민 B, Sharpin 및 가스더민 C, Sharpin 및 가스더민 D, Sharpin 및 가스더민 E, IKKg 및 IKKa, IKKg 및 IKKb, IKKg 및 RelA, IKKg 및 MAVS, IKKg 및 RIGI, IKKg 및 MDA5, IKKg 및 Tak1, IKKg 및 TBK1, IKKg 및 IKKe, IKKg 및 IRF3, IKKg 및 IRF7, IKKg 및 IRF1, IKKg 및 TRAF3, IKKg 및 카스파제, IKKg 및 FADD, IKKg 및 TNFR1, IKKg 및 TRAILR1, IKKg 및 TRAILR2, IKKg 및 FAS, IKKg 및 Bax, IKKg 및 Bak, IKKg 및 Bim, IKKg 및 Bid, IKKg 및 Noxa, IKKg 및 Puma, IKKg 및 TRIF, IKKg 및 ZBP1, IKKg 및 RIPK1, IKKg 및 RIPK3, IKKg 및 MLKL, IKKg 및 가스더민 A, IKKg 및 가스더민 B, IKKg 및 가스더민 C, IKKg 및 가스더민 D, IKKg 및 가스더민 E, IKKa 및 IKKb, IKKa 및 RelA, IKKa 및 MAVS, IKKa 및 RIGI, IKKa 및 MDA5, IKKa 및 Tak1, IKKa 및 TBK1, IKKa 및 IKKe, IKKa 및 IRF3, IKKa 및 IRF7, IKKa 및 IRF1, IKKa 및 TRAF3, IKKa 및 카스파제, IKKa 및 FADD, IKKa 및 TNFR1, IKKa 및 TRAILR1, IKKa 및 TRAILR2, IKKa 및 FAS, IKKa 및 Bax, IKKa 및 Bak, IKKa 및 Bim, IKKa 및 Bid, IKKa 및 Noxa, IKKa 및 Puma, IKKa 및 TRIF, IKKa 및 ZBP1, IKKa 및 RIPK1, IKKa 및 RIPK3, IKKa 및 MLKL, IKKa 및 가스더민 A, IKKa 및 가스더민 B, IKKa 및 가스더민 C, IKKa 및 가스더민 D, IKKa 및 가스더민 E, IKKb 및 RelA, IKKb 및 MAVS, IKKb 및 RIGI, IKKb 및 MDA5, IKKb 및 Tak1, IKKb 및 TBK1, IKKb 및 IKKe, IKKb 및 IRF3, IKKb 및 IRF7, IKKb 및 IRF1, IKKb 및 TRAF3, IKKb 및 카스파제, IKKb 및 FADD, IKKb 및 TNFR1, IKKb 및 TRAILR1, IKKb 및 TRAILR2, IKKb 및 FAS, IKKb 및 Bax, IKKb 및 Bak, IKKb 및 Bim, IKKb 및 Bid, IKKb 및 Noxa, IKKb 및 Puma, IKKb 및 TRIF, IKKb 및 ZBP1, IKKb 및 RIPK1, IKKb 및 RIPK3, IKKb 및 MLKL, IKKb 및 가스더민 A, IKKb 및 가스더민 B, IKKb 및 가스더민 C, IKKb 및 가스더민 D, IKKb 및 가스더민 E, IKKb 및 RelA, IKKb 및 MAVS, IKKb 및 RIGI, IKKb 및 MDA5, IKKb 및 Tak1, IKKb 및 TBK1, IKKb 및 IKKe, IKKb 및 IRF3, IKKb 및 IRF7, IKKb 및 IRF1, IKKb 및 TRAF3, IKKb 및 카스파제, IKKb 및 FADD, IKKb 및 TNFR1, IKKb 및 TRAILR1, IKKb 및 TRAILR2, IKKb 및 FAS, IKKb 및 Bax, IKKb 및 Bak, IKKb 및 Bim, IKKb 및 Bid, IKKb 및 Noxa, IKKb 및 Puma, IKKb 및 TRIF, IKKb 및 ZBP1, IKKb 및 RIPK1, IKKb 및 RIPK3, IKKb 및 MLKL, IKKb 및 가스더민 A, IKKb 및 가스더민 B, IKKb 및 가스더민 C, IKKb 및 가스더민 D, IKKb 및 가스더민 E, RelA 및 MAVS, RelA 및 RIGI, RelA 및 MDA5, RelA 및 Tak1, RelA 및 TBK1, RelA 및 IKKe, RelA 및 IRF3, RelA 및 IRF7, RelA 및 IRF1, RelA 및 TRAF3, RelA 및 카스파제, RelA 및 FADD, RelA 및 TNFR1, RelA 및 TRAILR1, RelA 및 TRAILR2, RelA 및 FAS, RelA 및 Bax, RelA 및 Bak, RelA 및 Bim, RelA 및 Bid, RelA 및 Noxa, RelA 및 Puma, RelA 및 TRIF, RelA 및 ZBP1, RelA 및 RIPK1, RelA 및 RIPK3, RelA 및 MLKL, RelA 및 가스더민 A, RelA 및 가스더민 B, RelA 및 가스더민 C, RelA 및 가스더민 D, RelA 및 가스더민 E, MAVS 및 RIGI, MAVS 및 MDA5, MAVS 및 Tak1, MAVS 및 TBK1, MAVS 및 IKKe, MAVS 및 IRF3, MAVS 및 IRF7, MAVS 및 IRF1, MAVS 및 TRAF3, MAVS 및 카스파제, MAVS 및 FADD, MAVS 및 TNFR1, MAVS 및 TRAILR1, MAVS 및 TRAILR2, MAVS 및 FAS, MAVS 및 Bax, MAVS 및 Bak, MAVS 및 Bim, MAVS 및 Bid, MAVS 및 Noxa, MAVS 및 Puma, MAVS 및 TRIF, MAVS 및 ZBP1, MAVS 및 RIPK1, MAVS 및 RIPK3, MAVS 및 MLKL, MAVS 및 가스더민 A, MAVS 및 가스더민 B, MAVS 및 가스더민 C, MAVS 및 가스더민 D, MAVS 및 가스더민 E, RIGI 및 MDA5, RIGI 및 Tak1, RIGI 및 TBK1, RIGI 및 IKKe, RIGI 및 IRF3, RIGI 및 IRF7, RIGI 및 IRF1, RIGI 및 TRAF3, RIGI 및 카스파제, RIGI 및 FADD, RIGI 및 TNFR1, RIGI 및 TRAILR1, RIGI 및 TRAILR2, RIGI 및 FAS, RIGI 및 Bax, RIGI 및 Bak, RIGI 및 Bim, RIGI 및 Bid, RIGI 및 Noxa, RIGI 및 Puma, RIGI 및 TRIF, RIGI 및 ZBP1, RIGI 및 RIPK1, RIGI 및 RIPK3, RIGI 및 MLKL, RIGI 및 가스더민 A, RIGI 및 가스더민 B, RIGI 및 가스더민 C, RIGI 및 가스더민 D, RIGI 및 가스더민 E, MDA5 및 Tak1, MDA5 및 TBK1, MDA5 및 IKKe, MDA5 및 IRF3, MDA5 및 IRF7, MDA5 및 IRF1, MDA5 및 TRAF3, MDA5 및 카스파제, MDA5 및 FADD, MDA5 및 TNFR1, MDA5 및 TRAILR1, MDA5 및 TRAILR2, MDA5 및 FAS, MDA5 및 Bax, MDA5 및 Bak, MDA5 및 Bim, MDA5 및 Bid, MDA5 및 Noxa, MDA5 및 Puma, MDA5 및 TRIF, MDA5 및 ZBP1, MDA5 및 RIPK1, MDA5 및 RIPK3, MDA5 및 MLKL, MDA5 및 가스더민 A, MDA5 및 가스더민 B, MDA5 및 가스더민 C, MDA5 및 가스더민 D, MDA5 및 가스더민 E, Tak1 및 TBK1, Tak1 및 IKKe, Tak1 및 IRF3, Tak1 및 IRF7, Tak1 및 IRF1, Tak1 및 TRAF3, Tak1 및 카스파제, Tak1 및 FADD, Tak1 및 TNFR1, Tak1 및 TRAILR1, Tak1 및 TRAILR2, Tak1 및 FAS, Tak1 및 Bax, Tak1 및 Bak, Tak1 및 Bim, Tak1 및 Bid, Tak1 및 Noxa, Tak1 및 Puma, Tak1 및 TRIF, Tak1 및 ZBP1, Tak1 및 RIPK1, Tak1 및 RIPK3, Tak1 및 MLKL, Tak1 및 가스더민 A, Tak1 및 가스더민 B, Tak1 및 가스더민 C, Tak1 및 가스더민 D, Tak1 및 가스더민 E, TBK1 및 IKKe, TBK1 및 IRF3, TBK1 및 IRF7, TBK1 및 IRF1, TBK1 및 TRAF3, TBK1 및 카스파제, TBK1 및 FADD, TBK1 및 TNFR1, TBK1 및 TRAILR1, TBK1 및 TRAILR2, TBK1 및 FAS, TBK1 및 Bax, TBK1 및 Bak, TBK1 및 Bim, TBK1 및 Bid, TBK1 및 Noxa, TBK1 및 Puma, TBK1 및 TRIF, TBK1 및 ZBP1, TBK1 및 RIPK1, TBK1 및 RIPK3, TBK1 및 MLKL, TBK1 및 가스더민 A, TBK1 및 가스더민 B, TBK1 및 가스더민 C, TBK1 및 가스더민 D, TBK1 및 가스더민 E, IKKe 및 IRF3, IKKe 및 IRF7, IKKe 및 IRF1, IKKe 및 TRAF3, IKKe 및 카스파제, IKKe 및 FADD, IKKe 및 TNFR1, IKKe 및 TRAILR1, IKKe 및 TRAILR2, IKKe 및 FAS, IKKe 및 Bax, IKKe 및 Bak, IKKe 및 Bim, IKKe 및 Bid, IKKe 및 Noxa, IKKe 및 Puma, IKKe 및 TRIF, IKKe 및 ZBP1, IKKe 및 RIPK1, IKKe 및 RIPK3, IKKe 및 MLKL, IKKe 및 가스더민 A, IKKe 및 가스더민 B, IKKe 및 가스더민 C, IKKe 및 가스더민 D, IKKe 및 가스더민 E, IRF3 및 IRF7, IRF3 및 IRF1, IRF3 및 TRAF3, IRF3 및 카스파제, IRF3 및 FADD, IRF3 및 TNFR1, IRF3 및 TRAILR1, IRF3 및 TRAILR2, IRF3 및 FAS, IRF3 및 Bax, IRF3 및 Bak, IRF3 및 Bim, IRF3 및 Bid, IRF3 및 Noxa, IRF3 및 Puma, IRF3 및 TRIF, IRF3 및 ZBP1, IRF3 및 RIPK1, IRF3 및 RIPK3, IRF3 및 MLKL, IRF3 및 가스더민 A, IRF3 및 가스더민 B, IRF3 및 가스더민 C, IRF3 및 가스더민 D, IRF3 및 가스더민 E, IRF7 및 IRF1, IRF7 및 TRAF3, IRF7 및 카스파제, IRF7 및 FADD, IRF7 및 TNFR1, IRF7 및 TRAILR1, IRF7 및 TRAILR2, IRF7 및 FAS, IRF7 및 Bax, IRF7 및 Bak, IRF7 및 Bim, IRF7 및 Bid, IRF7 및 Noxa, IRF7 및 Puma, IRF7 및 TRIF, IRF7 및 ZBP1, IRF7 및 RIPK1, IRF7 및 RIPK3, IRF7 및 MLKL, IRF7 및 가스더민 A, IRF7 및 가스더민 B, IRF7 및 가스더민 C, IRF7 및 가스더민 D, IRF7 및 가스더민 E, IRF1 및 TRAF3, IRF1 및 카스파제, IRF1 및 FADD, IRF1 및 TNFR1, IRF1 및 TRAILR1, IRF1 및 TRAILR2, IRF1 및 FAS, IRF1 및 Bax, IRF1 및 Bak, IRF1 및 Bim, IRF1 및 Bid, IRF1 및 Noxa, IRF1 및 Puma, IRF1 및 TRIF, IRF1 및 ZBP1, IRF1 및 RIPK1, IRF1 및 RIPK3, IRF1 및 MLKL, IRF1 및 가스더민 A, IRF1 및 가스더민 B, IRF1 및 가스더민 C, IRF1 및 가스더민 D, IRF1 및 가스더민 E, TRAF3 및 카스파제, TRAF3 및 FADD, TRAF3 및 TNFR1, TRAF3 및 TRAILR1, TRAF3 및 TRAILR2, TRAF3 및 FAS, TRAF3 및 Bax, TRAF3 및 Bak, TRAF3 및 Bim, TRAF3 및 Bid, TRAF3 및 Noxa, TRAF3 및 Puma, TRAF3 및 TRIF, TRAF3 및 ZBP1, TRAF3 및 RIPK1, TRAF3 및 RIPK3, TRAF3 및 MLKL, TRAF3 및 가스더민 A, TRAF3 및 가스더민 B, TRAF3 및 가스더민 C, TRAF3 및 가스더민 D, TRAF3 및 가스더민 E, 카스파제 및 FADD, 카스파제 및 TNFR1, 카스파제 및 TRAILR1, 카스파제 및 TRAILR2, 카스파제 및 FAS, 카스파제 및 Bax, 카스파제 및 Bak, 카스파제 및 Bim, 카스파제 및 Bid, 카스파제 및 Noxa, 카스파제 및 Puma, 카스파제 및 TRIF, 카스파제 및 ZBP1, 카스파제 및 RIPK1, 카스파제 및 RIPK3, 카스파제 및 MLKL, 카스파제 및 가스더민 A, 카스파제 및 가스더민 B, 카스파제 및 가스더민 C, 카스파제 및 가스더민 D, 카스파제 및 가스더민 E, FADD 및 TNFR1, FADD 및 TRAILR1, FADD 및 TRAILR2, FADD 및 FAS, FADD 및 Bax, FADD 및 Bak, FADD 및 Bim, FADD 및 Bid, FADD 및 Noxa, FADD 및 Puma, FADD 및 TRIF, FADD 및 ZBP1, FADD 및 RIPK1, FADD 및 RIPK3, FADD 및 MLKL, FADD 및 가스더민 A, FADD 및 가스더민 B, FADD 및 가스더민 C, FADD 및 가스더민 D, FADD 및 가스더민 E, TNFR1 및 TRAILR1, TNFR1 및 TRAILR2, TNFR1 및 FAS, TNFR1 및 Bax, TNFR1 및 Bak, TNFR1 및 Bim, TNFR1 및 Bid, TNFR1 및 Noxa, TNFR1 및 Puma, TNFR1 및 TRIF, TNFR1 및 ZBP1, TNFR1 및 RIPK1, TNFR1 및 RIPK3, TNFR1 및 MLKL, TNFR1 및 가스더민 A, TNFR1 및 가스더민 B, TNFR1 및 가스더민 C, TNFR1 및 가스더민 D, TNFR1 및 가스더민 E, TRAILR1 및 TRAILR2, TRAILR1 및 FAS, TRAILR1 및 Bax, TRAILR1 및 Bak, TRAILR1 및 Bim, TRAILR1 및 Bid, TRAILR1 및 Noxa, TRAILR1 및 Puma, TRAILR1 및 TRIF, TRAILR1 및 ZBP1, TRAILR1 및 RIPK1, TRAILR1 및 RIPK3, TRAILR1 및 MLKL, TRAILR1 및 가스더민 A, TRAILR1 및 가스더민 B, TRAILR1 및 가스더민 C, TRAILR1 및 가스더민 D, TRAILR1 및 가스더민 E, TRAILR2 및 FAS, TRAILR2 및 Bax, TRAILR2 및 Bak, TRAILR2 및 Bim, TRAILR2 및 Bid, TRAILR2 및 Noxa, TRAILR2 및 Puma, TRAILR2 및 TRIF, TRAILR2 및 ZBP1, TRAILR2 및 RIPK1, TRAILR2 및 RIPK3, TRAILR2 및 MLKL, TRAILR2 및 가스더민 A, TRAILR2 및 가스더민 B, TRAILR2 및 가스더민 C, TRAILR2 및 가스더민 D, TRAILR2 및 가스더민 E, FAS 및 Bax, FAS 및 Bak, FAS 및 Bim, FAS 및 Bid, FAS 및 Noxa, FAS 및 Puma, FAS 및 TRIF, FAS 및 ZBP1, FAS 및 RIPK1, FAS 및 RIPK3, FAS 및 MLKL, FAS 및 가스더민 A, FAS 및 가스더민 B, FAS 및 가스더민 C, FAS 및 가스더민 D, FAS 및 가스더민 E, Bax 및 Bak, Bax 및 Bim, Bax 및 Bid, Bax 및 Noxa, Bax 및 Puma, Bax 및 TRIF, Bax 및 ZBP1, Bax 및 RIPK1, Bax 및 RIPK3, Bax 및 MLKL, Bax 및 가스더민 A, Bax 및 가스더민 B, Bax 및 가스더민 C, Bax 및 가스더민 D, Bax 및 가스더민 E, Bak 및 Bim, Bak 및 Bid, Bak 및 Noxa, Bak 및 Puma, Bak 및 TRIF, Bak 및 ZBP1, Bak 및 RIPK1, Bak 및 RIPK3, Bak 및 MLKL, Bak 및 가스더민 A, Bak 및 가스더민 B, Bak 및 가스더민 C, Bak 및 가스더민 D, Bak 및 가스더민 E, Bim 및 Bid, Bim 및 Noxa, Bim 및 Puma, Bim 및 TRIF, Bim 및 ZBP1, Bim 및 RIPK1, Bim 및 RIPK3, Bim 및 MLKL, Bim 및 가스더민 A, Bim 및 가스더민 B, Bim 및 가스더민 C, Bim 및 가스더민 D, Bim 및 가스더민 E, Bid 및 Noxa, Bid 및 Puma, Bid 및 TRIF, Bid 및 ZBP1, Bid 및 RIPK1, Bid 및 RIPK3, Bid 및 MLKL, Bid 및 가스더민 A, Bid 및 가스더민 B, Bid 및 가스더민 C, Bid 및 가스더민 D, Bid 및 가스더민 E, Noxa 및 Puma, Noxa 및 TRIF, Noxa 및 ZBP1, Noxa 및 RIPK1, Noxa 및 RIPK3, Noxa 및 MLKL, Noxa 및 가스더민 A, Noxa 및 가스더민 B, Noxa 및 가스더민 C, Noxa 및 가스더민 D, Noxa 및 가스더민 E, Puma 및 TRIF, Puma 및 ZBP1, Puma 및 RIPK1, Puma 및 RIPK3, Puma 및 MLKL, Puma 및 가스더민 A, Puma 및 가스더민 B, Puma 및 가스더민 C, Puma 및 가스더민 D, Puma 및 가스더민 E, TRIF 및 ZBP1, TRIF 및 RIPK1, TRIF 및 RIPK3, TRIF 및 MLKL, TRIF 및 가스더민 A, TRIF 및 가스더민 B, TRIF 및 가스더민 C, TRIF 및 가스더민 D, TRIF 및 가스더민 E, ZBP1 및 RIPK1, ZBP1 및 RIPK3, ZBP1 및 MLKL, ZBP1 및 가스더민 A, ZBP1 및 가스더민 B, ZBP1 및 가스더민 C, ZBP1 및 가스더민 D, ZBP1 및 가스더민 E, RIPK1 및 RIPK3, RIPK1 및 MLKL, RIPK1 및 가스더민 A, RIPK1 및 가스더민 B, RIPK1 및 가스더민 C, RIPK1 및 가스더민 D, RIPK1 및 가스더민 E, RIPK3 및 MLKL, RIPK3 및 가스더민 A, RIPK3 및 가스더민 B, RIPK3 및 가스더민 C, RIPK3 및 가스더민 D, RIPK3 및 가스더민 E, MLKL 및 가스더민 A, MLKL 및 가스더민 B, MLKL 및 가스더민 C, MLKL 및 가스더민 D, MLKL 및 가스더민 E, 가스더민 A 및 가스더민 B, 가스더민 A 및 가스더민 C, 가스더민 A 및 가스더민 D, 가스더민 A 및 가스더민 E, 가스더민 B 및 가스더민 C, 가스더민 B 및 가스더민 D, 가스더민 B 및 가스더민 E, 가스더민 C 및 가스더민 D, 가스더민 C 및 가스더민 E, 가스더민 D 및 가스더민 E, TNFSF 단백질 및 TRADD, TNFSF 단백질 및 TRAF2, TNFSF 단백질 및 TRAF6, TNFSF 단백질 및 cIAP1, TNFSF 단백질 및 cIAP2, TNFSF 단백질 및 XIAP, TNFSF 단백질 및 NOD2, TNFSF 단백질 및 MyD88, TNFSF 단백질 및 TRAM, TNFSF 단백질 및 HOIL, TNFSF 단백질 및 HOIP, TNFSF 단백질 및 Sharpin, TNFSF 단백질 및 IKKg, TNFSF 단백질 및 IKKa, TNFSF 단백질 및 IKKb, TNFSF 단백질 및 RelA, TNFSF 단백질 및 MAVS, TNFSF 단백질 및 RIGI, TNFSF 단백질 및 MDA5, TNFSF 단백질 및 Tak1, TNFSF 단백질 및 TBK1, TNFSF 단백질 및 IKKe, TNFSF 단백질 및 IRF3, TNFSF 단백질 및 IRF7, TNFSF 단백질 및 IRF1, TNFSF 단백질 및 TRAF3, TNFSF 단백질 및 카스파제, TNFSF 단백질 및 FADD, TNFSF 단백질 및 TNFR1, TNFSF 단백질 및 TRAILR1, TNFSF 단백질 및 TRAILR2, TNFSF 단백질 및 FAS, TNFSF 단백질 및 Bax, TNFSF 단백질 및 Bak, TNFSF 단백질 및 Bim, TNFSF 단백질 및 Bid, TNFSF 단백질 및 Noxa, TNFSF 단백질 및 Puma, TNFSF 단백질 및 TRIF, TNFSF 단백질 및 ZBP1, TNFSF 단백질 및 RIPK1, TNFSF 단백질 및 RIPK3, TNFSF 단백질 및 MLKL, TNFSF 단백질 및 가스더민 A, TNFSF 단백질 및 가스더민 B, TNFSF 단백질 및 가스더민 C, TNFSF 단백질 및 가스더민 D, TNFSF 단백질 및 가스더민 E, 및 이의 변이체, 및 이의 기능성 단편으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
특정 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 기능성 단편를 포함하고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 기능성 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
특정 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MLKL 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
일부 구현예에서, Bid의 기능성 단편은 절단된 Bid(tBID)이다. TNFR1/Fas 결합은 시토졸 BID를 절단된 tBID로 절단시키며, 이는 미토콘드리아로 전위된다. tBID 폴리펩티드는 막-표적화된 사멸 리간드로서 기능한다. Bak-결핍 미토콘드리아 및 차단 항체에 의해, tBID가 이의 미토콘드리아 파트너 BAK에 결합하여, 시토크롬 c를 방출시키는 것이 드러났다. 활성화된 tBID는 BAK의 알로스테릭 활성화를 초래하여, 시토크롬 C 유출을 위해 제안된 포어 내로의 이의 막내 올리고머화를 유도하고, 사멸 수용체로부터 세포 사멸까지 경로를 통합한다. 문헌[Wei et al., 2000, Genes & Dev. 14: 2060-2071]을 참조한다.
특정 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 tBID 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 바이러스는 TRIF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
엔지니어링된 바이러스에 포함될 추가 폴리뉴클레오티드는 하기에 기술되어 있다.
카스파제 저해제
엔지니어링된 바이러스는 표적 세포에서 카스파제 활성을 저해하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포에서 카스파제 활성을 저해하는 폴리뉴클레오티드는 표적 세포에 대하여 내인성인 하나 이상의 카스파제의 발현 또는 활성을 감소시킨다. 카스파제의 발현을 감소시키는 폴리뉴클레오티드는 안티센스 DNA 분자, 안티센스 RNA 분자, 이중 가닥 RNA, siRNA, 또는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR)-CRISPR 관련(Cas)(CRISPR-Cas) 시스템 가이드 RNA가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 표적 세포에서 카스파제 활성을 저해하는 폴리뉴클레오티드는 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 바이러스 단백질 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편이다. 예시적인 바이러스 단백질 카스파제 저해제는 하기 표 6에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 인간 단백질 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편이다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9 및 카스파제 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 카스파제를 저해한다. 특정 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 카스파제 8을 저해한다. 특정 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 카스파제 10을 저해한다. 특정 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 카스파제 8 및 카스파제 10을 저해한다.
[표 6]
예시적인 바이러스 단백질 카스파제 저해제. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Mocarski et al., 2011, Nat Rev Immunol Dec 23;12(2):79-88. doi: 10.1038/nri3131]으로부터 조정됨. BHV-4, 소 헤르페스바이러스 4; CMV, 사이토메갈로바이러스; DAI, 인터페론 조절 인자의 DNA-의존적 활성화제; EHV-1, 말 헤르페스바이러스 1; FADD, FAS-관련 사멸 도메인 단백질; HPV-16, 인간 파필로마바이러스 16; HSV, 단순 헤르페스 바이러스; KSHV, 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스; MCMV, 뮤린 사이토메갈로바이러스; MCV, 전염성 연속종 바이러스; RHIM, RIP 호모타입 상호작용 모티프; RIP, 수용체-상호작용 단백질; TRIF, IFNβ를 유도하는 TIR 도메인-함유 연결자 단백질; vICA, 카스파제 8 활성화의 바이러스 저해제; vIRA, RIP 활성화의 바이러스 저해제.
Figure pct00009
일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 Fas 관련 사멸 도메인 단백질(FADD) 우성 음성 돌연변이체(FADD-DN), 카스파제 8 활성화의 바이러스 저해제(vICA), 세포 FLICE(FADD-유사 IL-1β-전환 효소)-저해성 단백질(cFLIP), 카스파제 8 우성 음성 돌연변이체(Casp8-DN), 아폽토시스의 세포 저해제 단백질-1(cIAP1), 아폽토시스의 세포 저해제 단백질-1(cIAP2), 아폽토시스의 X-연관 저해제(XIAP), TGFβ-활성화된 키나제 1(Tak1), IκB 키나제(IKK), 및 이의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 FADD-DN이다. 사멸 유도 신호전달 복합체(Death Inducing Signaling Complex; DISC)는 FADD를 포함하는 연결자 단백질 및 개시제 카스파제, 예컨대 카스파제 8을 동원한다. 문헌[Morgan et al., 2001, Cell Death & Differentiation volume 8, pages 696-705]을 참조한다. DISC에서의 카스파제 8의 응집은 카스파제 캐스케이드 및 아폽토시스의 활성화를 야기한다. FADD는 2개의 단백질 상호작용 도메인으로 이루어진다: 사멸 도메인 및 사멸 이펙터 도메인. FADD가 DISC의 필수 성분이기 때문에, 사멸 도메인을 함유하지만, 사멸 이펙터 도메인을 함유하지 않는 우성 음성 돌연변이체(FADD-DN)가 사멸 수용체-유도된 아폽토시스의 연구에서 광범위하게 사용되어 왔다. FADD-DN은 이것이 수용체에 결합하지만, 카스파제 8을 동원할 수 없기 때문에, 우성 음성 저해제로서 기능한다.
특정 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 vICA이다. vICA 단백질은 UL36 유전자에 의해 인코딩되는 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 단백질이다. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Skaletskaya et al., PNAS July 3, 2001 98 (14) 7829-7834]을 참조한다. vICA 단백질은 카스파제-8의 프로-도메인에 대한 결합 및 이의 활성화의 방지에 의해 Fas-매개된 아폽토시스를 저해한다.
특정 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 cFLIP이다. cFLIP 단백질은 종양 괴사 인자-α(TNF-α), Fas-L 및 TNF-연관 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL)-유도된 아폽토시스를 억제하는 주요 항-아폽토시스 조절제 및 저항성 인자이다. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Safa, 2012, Exp Oncol Oct;34(3):176-84]을 참조한다. cFLIP 단백질은 인간 세포에서 긴(cFLIP(L)), 짧은(cFLIP(S)) 및 cFLIP(R) 스플라이스 변이체로서 발현된다. cFLIP 단백질은 리간드-의존적인 및 -독립적인 방식으로 FADD 및/또는 카스파제-8 또는 -10 및 TRAIL 수용체 5(DR5)에 결합하며, 아폽토시스 저해성 복합체(AIC)를 형성한다. 이 상호작용은 차례로, 사멸-유도 신호전달 복합체(DISC) 형성 및 카스파제 캐스케이드의 이후의 활성화를 방지한다. c-FLIP(L) 및 c-FLIP(S)는 다양한 신호전달 경로에서 다기능 역할을 갖는 것으로도 알려져 있다. 특정 구현예에서, cFLIP는 cFLIP(L)이다. 특정 구현예에서, cFLIP는 cFLIP(S)이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 FADD-DN 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 vICA 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 cFLIP 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 FADD-DN 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
가스더민
가스더민은 막 투과화 및 파이롭토시스를 유발하는 포어-형성 이펙터 단백질의 과이다. 가스더민 단백질에는 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D 및 가스더민 E가 포함된다. 가스더민은 유연성 링커에 의해 연결된 세포독성 N-말단 도메인 및 C-말단 리프레서 도메인을 함유한다. 이들 2개의 도메인 사이의 단백질분해적 절단은 세포독성 도메인에 대한 분자내 저해를 제거하여, 이것이 세포막 내로 삽입되고, 큰 올리고머 포어를 형성하도록 하며, 이는 이온 항상성을 파괴하고, 세포 사멸을 유도한다. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Broz et al., 2020, Nature Reviews Immunology 20: 143-157]을 참조한다. 예를 들어, 가스더민 E(GSDME, DFNA5로도 알려져 있음)는 카스파제 3에 의해 절단됨으로써, GSDME-발현 세포에서 비염증성 아폽토시스를 파이롭토시스로 전환시킬 수 있다. 유사하게, 카스파제 1, 4 및 5는 가스더민 D를 절단하고, 이를 활성화시킨다.
둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 또는 벡터(예를 들어, 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물은 가스더민 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가스더민의 기능성 단편은 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D 또는 가스더민 E의 N-말단 도메인이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 E 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 D N-말단 도메인 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 E N-말단 도메인 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 tBID 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 E 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
엔지니어링된 면역 세포에서의 발현을 위한 추가 단백질
상기 표 5에 제공된 것들과 같은, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 이외에, 본원에 개시된 엔지니어링된 면역 세포는 면역-자극 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 면역 자극성 단백질은 전환 성장 인자 베타(TGF-β)의 길항제, 콜로니-자극 인자, 사이토카인, 면역 체크포인트 조절제, flt3 리간드 또는 flt3의 항체 효능제이다.
콜로니-자극 인자는 과립구-대식구 콜로니-자극 인자(GM-CSF)일 수 있다. 일 구현예에서, GM-CSF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ICP34.5 유전자 좌 내로 삽입된다.
사이토카인은 인터류킨일 수 있다. 일부 구현예에서, 인터류킨은 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-24, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 적합한 사이토카인에는 I형 인터페론, 인터페론 감마, III형 인터페론 및 TNFα가 포함된다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 저해성 면역 체크포인트 단백질의 길항제이다. 저해성 면역 체크포인트 단백질의 예에는 ADORA2A, B7-H3, B7-H4, KIR, VISTA, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, Tim3, BTLA 및 CTLA4가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 자극성 면역 체크포인트 단백질의 효능제이다. 자극성 면역 체크포인트 단백질의 예에는 CD27, CD28, CD40, OX40, GITR, ICOS 및 4-1BB가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 자극성 면역 체크포인트 단백질의 효능제는 CD40 리간드(CD40L), ICOS 리간드, GITR 리간드, 4-1-BB 리간드, 0X40 리간드 및 이의 임의의 것의 변형된 버전으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 자극성 면역 체크포인트 단백질의 효능제는 CD40, ICOS, GITR, 4-1-BB 및 0X40으로부터 선택되는 단백질의 항체 효능제이다.
상기 표 5에 제공된 것들과 같은, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 이외에, 본원에 개시된 엔지니어링된 면역 세포는 자살 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "자살 유전자"는 약물의 비독성 전구체를 세포독성 화합물로 전환시키는 단백질(예를 들어, 효소)을 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 자살 유전자는 FK506 결합 단백질(FKBP)-FAS, FKBP-카스파제-8, FKBP-카스파제-9, 시토신 데아미나제(CDase) 활성을 갖는 폴리펩티드, 티미딘 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제(UPRTase) 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, CDase 활성을 갖는 폴리펩티드는 FCY1, FCA1 또는 CodA이다.
일부 구현예에서, UPRTase 활성을 갖는 폴리펩티드는 FUR1 또는 이의 변이체, 예를 들어, FUR1Δ105이다. FUR1Δ105는 코딩 영역의 5' 영역에서 처음 105개 뉴클레오티드를 결여하는 FUR1 유전자이며, 이는 처음 35개 아미노산 잔기가 N-말단에서 결실된 UPRTase의 합성을 가능하게 한다. FUR1Δ105는 고유 단백질의 위치 36에서 메티오닌으로 시작한다.
자살 유전자는 융합 단백질, 예를 들어, CDase 및 UPRTase 활성을 갖는 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 codA::upp, FCY1::FUR1, FCYl::FUR1Δ105(FCU1) 및 FCU1-8 폴리펩티드로부터 선택된다.
타노트랜스미션을 저해하는 폴리펩티드
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 타노트랜스미션을 저해하는 면역 세포에 내인성인 폴리펩티드의 면역 세포에서의 발현 또는 활성을 감소시키는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, siRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)이다. 타노트랜스미션을 저해할 수 있는 면역 세포에 내인성인 예시적인 폴리펩티드는 하기 표 7에 제공된다.
[표 7]
면역 세포에서 타노트랜스미션을 저해하는 예시적인 폴리펩티드.
Figure pct00010
타노트랜스미션을 저해하는 유전자의 발현을 감소시키는 폴리뉴클레오티드는 안티센스 DNA 분자, 안티센스 RNA 분자, 이중 가닥 RNA, siRNA, 또는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR)-CRISPR 관련(Cas)(CRISPR-Cas) 시스템 가이드 RNA를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
IV. 신호 전달 도메인 및 표적화 도메인
본 발명의 엔지니어링된 면역 세포는 세포 턴오버를 촉발시키는 이종성 신호 전달 도메인(예를 들어, 세포내 신호전달 도메인) 및/또는 엔지니어링된 면역 세포를 표적 세포로 지시하는 이종성 표적화 도메인(예를 들어, 항원 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 반드시 신호 전달 도메인 및 표적화 도메인이 작동 가능하게 연결될 필요는 없다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 신호 전달 도메인 및 표적화 도메인은 이종이량체화 소분자의 존재 하에서만 조립되어, 엔지니어링된 면역 세포는 표적 항원이 결합되고 소분자가 신호 전달 도메인 및 표적화 도메인을 함께 가져올 때만 활성화된다. 문헌[Wu et al., 2015, Science Oct 16; 350(6258): aab4077]을 참조한다.
일부 구현예에서, 이종성 신호 전달 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, ITAM을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 그러나, 본원에 기재된 바와 같은 세포내 신호전달 도메인 이외의 다른 유형의 이종성 신호 전달 도메인이 또한 엔지니어링된 면역 세포에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이종성 신호 전달 도메인은 합성 노치(synNotch) 수용체 신호전달 시스템을 포함한다. SynNotch 수용체 신호전달 시스템은 세포-세포 신호전달 수용체 Notch로부터의 코어 조절 도메인을 함유하지만, 합성 항원 결합 도메인(예를 들어, 단쇄 항체) 및 합성 세포내 전사 도메인을 갖는다(Gordon et al., 2015; Morsut et al., 2016). synNotch 수용체가 동족 항원에 결합할 때, synNotch 수용체는 천연 Notch 활성화와 유사한 유도된 막횡단 절단을 겪음으로써, 세포내 전사 도메인을 방출하여 핵으로 들어가고 동족 상류 시스-활성화 프로모터에 의해 조절되는 표적 유전자의 발현을 활성화시킨다. 따라서, synNotch 신호전달 시스템은 맞춤화된 항원 인식 사건이 이종성 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드의 발현을 구동할 수 있는 엔지니어링된 면역 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. SynNotch 신호전달 시스템은, 예를 들어, 미국 특허 제9,670,281호; 문헌[Roybal et al., 2016, Cell 167: 419-432]; 및 문헌[Morsut et al., 2016, Cell 164(4): 780-91]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 이종성 표적화 도메인은 항원 결합 도메인이다. 그러나, 항원 결합 도메인 이외의 다른 유형의 이종성 표적화 도메인이 또한 엔지니어링된 면역 세포에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이종성 표적화 도메인은 HIF1α의 산소 민감성 서브도메인이다. 이 산소 민감성 서브도메인은 특정 종양의 특징인 저산소 환경에 반응성이다. 문헌[Juillerat et al., 2017, Sci. Rep. 7: 39833]을 참조한다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인(예를 들어, 항원 결합 도메인)은 신호 전달 도메인(예를 들어, 세포내 신호전달 도메인)에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인 및 신호 전달 도메인은 키메라 항원 수용체(CAR) 내에 함유된다.
키메라 항원 수용체(CAR)
본 발명의 엔지니어링된 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 요망되는 항원(예를 들어, 종양 항원)에 대한 항체-기반 특이성을 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하여 특이적 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하는 분자이다.
일부 구현예에서, CAR은 신호 전달 도메인(예를 들어, 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 엔지니어링된 면역 세포를 표적 세포로 지시하는 표적화 도메인(예를 들어, 항원 결합 도메인)을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함한다. CAR은 항원 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 힌지 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 면역 세포의 활성화 시, 예를 들어, 표적 항원에 대한 CAR의 항원-결합 도메인의 결합 및/또는 신호 전달 도메인, 예를 들어, CAR의 세포내 신호전달 도메인의 활성화 시, 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 이종성 프로모터의 전사 제어 하에 있을 수 있고, 예를 들어, 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
면역 세포에서 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현은 면역 세포에서 세포 턴오버 경로를 변경할 수 있다. 예를 들어, 면역 세포에서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현은 면역 세포의 정상 세포 턴오버 경로를, 예를 들어, 네크롭토시스, 아폽토시스, 자가포식, 페롭토시스 또는 파이롭토시스와 같은 타노트랜스미션을 촉진시키는 세포 턴오버 경로로 변경할 수 있다.
A. 항원 결합 도메인 및 이의 표적
항원 결합 도메인은 표적 세포 또는 병원체, 예를 들어, 암 세포, 진균 세포, 박테리아 세포, 또는 바이러스 상의 표면 마커를 인식하는 엔지니어링된 면역 세포의 표면 상의 표적-특이적 결합 요소이다. CAR에 대한 항원 결합 도메인의 선택은 표적 세포 또는 병원체의 표면에서 발견되는 표적 단백질의 유형에 좌우된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 암 세포(예를 들어, 고형 종양 세포 또는 비-고형 암 세포)의 표면 상의 표적 단백질에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 진균 세포, 예를 들어, 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 표면 상의 표적 단백질에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 박테리아 세포의 표면 상의 표적 단백질에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 바이러스, 예를 들어, HIV, HBV, HCV 또는 CMV의 표면 상의 표적 단백질에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 병원체에 감염된 숙주 세포의 표면 상의 표적 단백질에 특이적으로 결합한다.
표적 세포가 종양 세포일 때, 항원 결합 도메인 표적 단백질은 종양-특이적 항원(TSA) 또는 종양-관련 항원(TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 고유하며 신체의 다른 세포에서는 발생하지 않는다. TAA는 종양 세포에 고유하지 않으며, 대신에 또한 항원에 대한 면역 관용의 상태를 유도하지 못하는 조건 하의 정상(예를 들어, 비-암) 세포에서 발현된다. TAA는 면역계가 미성숙하고 반응할 수 없을 때 태아 발달 동안 정상 세포에서 발현되는 항원일 수 있거나, 이들은 정상 세포에서는 정상적으로 매우 낮은 수준으로 존재하지만 종양 세포에서는 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
암 세포에서 항원 결합 도메인 및 상응하는 표적 단백질의 선택은 치료될 암의 특정 유형에 좌우될 것이다. 일부 구현예에서, 암 세포는 고형 종양 세포이다. 고형 종양 세포의 표면에서 발견되는 단백질은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Martinez et al., 2019, Front Immunol. Feb 5;10:128; 및 Fesnak et al., 2016, Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81]에 기재되어 있다. 항원 결합 도메인에 의해 표적화될 수 있는 고형 종양 세포의 표면 상의 비-제한적인 예시적인 단백질은 하기 표 8에 제공된다. 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 메조텔린에 결합한다.
[표 8]
고형 종양에 대한 예시적인 항원 결합 도메인 표적 단백질
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
참고문헌
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
일부 구현예에서, 표적 세포는 비-고형 종양 세포, 즉, 비-고형 암 세포이다. 비-고형 종양 세포의 표면에서 발견되는 단백질은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Fesnak et al., 2016, Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81]에 기재되어 있다. 항원 결합 도메인에 의해 표적화될 수 있는 비-고형 종양 세포의 표면 상의 비-제한적인 예시적인 단백질은 하기 표 9에 제공된다.
[표 9]
비-고형 종양에 대한 예시적인 항원 결합 도메인 표적 단백질
Figure pct00018
Figure pct00019
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 병원체, 예를 들어, 박테리아 세포, 진균 세포 또는 바이러스 상의 표적 단백질에 결합한다. 항원 결합 도메인에 의해 표적화될 수 있는 병원체의 표면 상의 단백질은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Seif et al., 2019, Front Immunol. 10: 2711]에 기재되어 있다. 항원 결합 도메인에 의해 표적화될 수 있는 병원체의 표면 상의 비-제한적인 예시적인 단백질은 하기 표 10에 제공된다.
[표 10]
병원체에 대한 예시적인 항원 결합 도메인 표적 단백질
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 상의 표적 단백질, 예를 들어, gp120에 결합한다. 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD4 세그먼트가 공동수용체 결합에 관여하는 gp120 상의 고도로 보존된 CD4-유도 에피토프를 인식하는 17b 인간 모노클로날 항체의 단쇄 가변 단편에 연결된 이중특이적 분자를 포함하거나 이로 이루어진다. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Liu et al., 2015, J Virol 89(13):6685-6694]을 참조한다. 추가의 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 인간 C-형 렉틴의 탄수화물 인식 도메인에 연결된 인간 CD4의 세그먼트를 포함하는 이중특이적 분자를 포함하거나 이로 이루어진다. 이러한 항원 결합 도메인은 아마도 임상적으로 유의한 바이러스 변이체(즉, 일차 수용체 결합 부위 및 고밀도 올리고만노스 패치)에서 보존되어야 하는 HIV-1 gp120 상의 2개의 독립적인 영역을 표적화한다. 문헌[Ghanem et al., 2018, Cytotherapy 2018; 20(3):407-419]을 참조한다.
일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 각각 상이한 단백질에 표적화되는 하나 초과의 항원 결합 도메인(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 항원 결합 도메인)을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 TCR-형 신호전달 도메인에 작동 가능하게 연결된 제1 항원 결합 도메인, 및 공동자극 신호전달 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
B. 힌지 도메인
CAR의 세포외 영역, 즉, CAR의 항원 결합 도메인은 힌지 도메인, 예를 들어, 인간 단백질로부터의 힌지를 통해 막횡단 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 힌지는 인간 Ig(면역글로불린) 힌지, 예를 들어, IgG4 힌지, 또는 CD8a 힌지일 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 IgD 힌지를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 저해성 살해 세포 Ig-유사 수용체(KIR) 2DS2 힌지를 포함한다. 적합한 힌지 도메인의 아미노산 서열 및 힌지 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 각각 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,911,993호 및 미국 특허 제10,273,300호에 기재되어 있다.
C. 막횡단 도메인
CAR은 선택적으로 힌지 도메인을 통해 CAR의 항원 결합 도메인에 융합된 막횡단 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 CAR에서 다른 도메인 중 하나와 자연적으로 회합되며, 예를 들어, CAR에서 다른 도메인 중 하나와 동일한 단백질로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 대한 막횡단 도메인의 결합을 피하도록 선택되거나 아미노산 치환에 의해 변형된다. 막횡단 도메인은 자연 발생 단백질로부터 유래될 수 있거나 엔지니어링될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 막횡단 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 특정 관심의 막횡단 영역은 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 알파, 베타 또는 제타 쇄로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 이의 적어도 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다).
대안적으로, 막횡단 도메인은 엔지니어링될 수 있으며, 이러한 경우 이는 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 주로 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 막횡단은 막횡단 도메인의 각각의 말단에 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛을 포함한다. 선택적으로, 예를 들어, 2개 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 폴리펩티드 링커는 CAR의 막횡단 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블렛은 적합한 링커의 일례이다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인이다.
D. 세포내 신호전달 도메인
CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CAR이 발현되는 면역 세포의 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "이펙터 기능"은 세포의 특수 기능을 지칭한다. T 세포의 이펙터 기능은, 예를 들어, 세포용해 활성 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 헬퍼 활성일 수 있다. 단백질의 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에 쇄 전체를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 정도까지, 이러한 절단된 부분은 이펙터 기능 신호를 전달하는 한 온전한 쇄 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 용어 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 단백질의 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
CAR에서 사용하기에 적합한 다양한 세포내 신호전달 도메인은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Fesnak et al.,, 2016, Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81; 및 Tokarew et al., 2019, Br J Cancer. Jan;120(1):26-37]에 기재되어 있다. CAR에서 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 성분의 예는 T 세포 수용체(TCR) 및 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 공동-수용체의 세포질 서열뿐만 아니라, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다. TCR 단독을 통해 발생된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 충분하지 않으며 이차 또는 공동-자극 신호가 또한 필요한 것으로 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화는 2개의 별개의 부류의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개된다고 할 수 있다: TCR을 통해 항원-의존적 일차 활성화를 개시하는 것들(즉, TCR-형 신호전달 도메인) 및 이차 또는 공동-자극 신호(즉, 공동자극 신호전달 도메인)를 제공하도록 항원-독립적 방식으로 작용하는 것들.
TCR-형 신호전달 도메인은 자극 방식으로 또는 저해 방식으로 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 TCR-형 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 일차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다.
특정 구현예에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타로부터의 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 인간 CD3 제타 단백질 아미노산 서열은, 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함되는 Uniprot 수탁 번호 P20963에 제공된다. CD3 제타의 세포질 신호전달 서열은 CD3 제타 단백질의 아미노산 잔기 52 내지 164로 이루어진다. CD3 제타의 세포질 신호전달 서열은 CD3 제타 단백질의 아미노산 잔기 61 내지 89, 100 내지 128, 및 131 내지 159에 3개의 ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 CD3 제타 ITAM에서 하나 이상의 티로신 잔기는 돌연변이된다. 3개의 CD3 제타 ITAM 모두를 포함하는 CAR에서 신호전달의 중복성은 역효과적인 T 세포 분화 및 고갈을 촉진시킬 수 있는 것으로 사료된다. 따라서, 하나 이상의 CD3제타 ITAM에서 하나 이상의 티로신 잔기를 돌연변이시키는 것은 이들의 인산화 및 다운스트림 신호전달을 방해하여, 개선된 치료 프로파일을 갖는 CAR을 생성할 수 있다. 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Feucht et al., 2019, Nature Medicine Jan; 25(1): 82-88]을 참조한다. 일부 구현예에서, 티로신 잔기는 또 다른 아미노산, 예를 들어, 페닐알라닌을 이용한 치환에 의해 돌연변이된다.
세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자로부터의 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 공동자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 이들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 쇄 부분 및 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 도메인은 면역-자극 분자로부터, 예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 중 하나 이상으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 도메인은 저해성 면역 체크포인트 단백질, 예를 들어, PD-1 또는 B7-H3으로부터의 것이다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인 내의 TCR-형 신호전달 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인은 무작위 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 선택적으로, 예를 들어, 2개 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 폴리펩티드 링커가 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블렛은 적합한 링커의 일례이다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 세포내 도메인을 포함한다. 신호전달 도메인의 다양한 조합이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, CAR 세포내 신호전달 도메인은 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개의 상이한 단백질로부터의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CAR 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 세포내 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 세포내 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 세포내 도메인 및 CD28 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 세포내 도메인, CD28 및 4-1BB의 신호전달 도메인, 및 CD27 또는 CD134의 신호전달 도메인을 포함한다. CAR 세포내 신호전달 도메인에서 사용하기에 적합한 다양한 신호전달 도메인의 아미노산 서열, 및 이들을 인코딩하는 핵산 서열은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,911,993호에 기재되어 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 (a) CD3제타의 세포내 도메인과 CD28의 공동자극 신호전달 도메인; (b) CD3제타의 세포내 도메인과 4-1BB의 공동자극 신호전달 도메인; 및 (c) CD28의 공동자극 신호전달 도메인, 4-1BB의 공동자극 신호전달 도메인, CD27 또는 CD134의 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3제타의 세포내 도메인의 조합으로부터 선택된 신호전달 도메인의 조합을 포함한다.
엔지니어링된 면역 세포는 CAR 활성화 시 구성적으로 또는 유도적으로 발현되는 단백질, 예컨대, 사이토카인(예를 들어, 인터류킨 12(IL-12))을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 CAR로 형질도입된 T 세포는 보편적 사이토카인-매개 사멸을 위해 재지시된 T 세포(TRUCK)로 지칭된다. 이러한 CAR의 활성화는 엑소사이토시스(퍼포린, 그랜자임) 또는 사멸 리간드-사멸 수용체(Fas-FasL, TRAIL) 시스템과 같은 몇몇 상승적 메커니즘을 통해 요망되는 사이토카인의 생산 및 분비를 촉진시켜 종양 사멸을 촉진시킨다. 문헌[Tokarew et al., 2019, Br J Cancer. Jan;120(1):26-37]을 참조한다.
일부 구현예에서, CAR 세포내 신호전달 도메인은 IL-12의 활성화 또는 전사를 구동하는 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR 세포내 신호전달 도메인은 IL-12 활성화 또는 IL-12 전사를 구동하는 도메인, 예컨대, STAT3/5 결합 모티프를 갖는 IL-2Rβ 절단된 세포내 인터류킨 2β 쇄 수용체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 수용체의 항원-특이적 활성화는 TCR(예를 들어, CD3ζ 도메인을 통해), 공동자극(예를 들어, CD28 도메인) 및 사이토카인(JAK-STAT3/5) 신호전달을 동시에 촉발시키며, 이는 전체 T 세포 활성화 및 증식을 구동하는 데 생리학적으로 필요한 3개의 상승적 신호 모두를 효과적으로 제공한다. 문헌[Tokarew et al., 2019, Br J Cancer. Jan;120(1):26-37]을 참조한다.
CAR 세포내 신호전달 도메인에 존재할 수 있는 신호전달 도메인의 비-제한적인 예시적인 조합은 하기 표 11에 제공된다.
[표 11]
예시적인 CAR 세포내 신호전달 도메인.
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참고문헌
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CAR을 인코딩하는 벡터
엔지니어링된 면역 세포에서 발현을 위한 CAR은 CAR의 도메인을 인코딩하는 핵산 서열, 예를 들어, 항원 결합 도메인을 인코딩하는 핵산 서열, 막횡단 도메인을 인코딩하는 핵산 서열, 및 세포내 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(이들 모두는 작동 가능하게 연결됨)을 포함하는 DNA 구축물에 의해 인코딩될 수 있다. CAR을 인코딩하는 DNA 구축물은 힌지 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이들 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 해당 분야에 알려져 있는 재조합 방법을 이용하여, 예를 들어, 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 유전자를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 표준 기법을 이용하여 유전자를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접적으로 단리함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 클로닝되기보다는 합성에 의해 생산될 수 있다.
CAR을 인코딩하는 DNA 구축물은 면역 세포로의 전달을 위해 벡터에 삽입된다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 딸 세포에서 트랜스진의 장기간 안정적인 통합 및 이의 증식을 가능하게 하기 때문에 장기간 유전자 전달을 달성하기에 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 간세포와 같은 비-증식성 세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 뮤린 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가적인 이점을 갖는다. 이들은 또한 낮은 면역원성의 추가 이점을 갖는다.
CAR을 인코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩티드 또는 이의 일부를 인코딩하는 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결하고, 구축물을 발현 벡터에 혼입시킴으로써 달성된다. 벡터는 진핵생물에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유한다. 유전자 전달 방법은 해당 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,399,346호, 제5,580,859호, 제5,589,466호를 참조한다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자 요법 벡터이다. 핵산 서열은 다수의 유형의 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드 내로 클로닝될 수 있다. 특정 관심 벡터는 발현 벡터 및 복제 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 해당 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)], 및 다른 바이러스 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능성인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택 가능 마커를 함유한다(예를 들어, 제WO 01/96584호; 제WO 01/29058호; 및 미국 특허 제6,326,193호). 포유동물 세포로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 해당 분야에 알려져 있는 기법을 이용하여 벡터에 삽입되고 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다.
이후, 재조합 바이러스는 분리되고 생체내 또는 생체외에서 대상체의 세포에 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 해당 분야에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 해당 분야에 알려져 있다. 일 구현예에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 추가적인 프로모터 요소, 예를 들어, 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 적합한 프로모터의 일례는 즉시 조기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 이에 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동할 수 있는 강한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 다른 예는 신장 성장 인자-1α(EF-1α), 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK), 또는 유전자 발현을 구동하는 능력을 보유하는 이의 단편을 포함한다. 그러나, 유인원 바이러스 40(SV40) 조기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 즉시 조기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대, 비제한적으로, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 유도성 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 유도성 프로모터의 사용은 이러한 발현이 요망될 때 이것이 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 작동시키거나, 발현이 요망되지 않을 때 발현을 중지할 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
CAR 폴리펩티드 또는 이의 일부의 발현을 평가하기 위해, 면역 세포에 도입되는 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염시키거나 감염시키려는 세포의 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선택을 촉진시키기 위해 선택 가능 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 이 둘 모두를 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 선택 가능 마커는 DNA의 별도의 조각에 운반되고 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택 가능 마커와 리포터 유전자 둘 모두는 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 적절한 조절 서열이 측접될 수 있다. 유용한 선택 가능 마커는, 예를 들어, 항생제내성 유전자, 예컨대, neo 등을 포함한다. 리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 면역 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하는 데 사용된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제, 분비된 알칼리성 포스파타제, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]).
엔지니어링된 면역 세포는 필요한 경우 세툭시맙 또는 리툭시맙(rituximab)의 투여를 통해 엔지니어링된 면역 세포의 사멸을 가능하게 하는 안전성 스위치로서 세툭시맙 에피토프 또는 리툭시맙 에피토프를 추가로 포함할 수 있다. 문헌[Wang et al., 2011, Blood 118:1255-63; 및 Sommer et al., 2019, Mol Ther. 27(6):1126-1138]을 참조한다.
벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포의 생산 방법은 해당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)]을 참조한다.
III. 엔지니어링될 면역 세포의 유형
타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 세포 턴오버를 촉발시키는 신호 전달 도메인(예를 들어, 세포내 신호전달 도메인) 및 엔지니어링된 면역 세포를 표적 세포로 지시하는 표적화 도메인(예를 들어, 항원 결합 도메인)을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링될 수 있는 면역 세포는 T-림프구(T-세포), 대식구, 자연 살해(NK) 세포, 및 수지상 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
T-림프구(T-세포)
일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 T-림프구(T-세포)이다. T-세포는 B 세포가 항체-생산 세포로 발달하는 것을 돕는 능력, 단핵구/대식구의 살균 작용을 증가시키는 능력, 특정 유형의 면역 반응의 저해, 표적 세포의 직접 사멸, 및 염증 반응의 동원을 포함하여, 광범위한 면역 기능을 매개한다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)). T-세포는 이들이 발현하는 세포 표면 수용체에 기초하여 2개의 별개의 부류로 세분된다. 대부분의 T 세포는 α 및 β-쇄로 이루어진 T 세포 수용체(TCR)를 발현한다. 작은 그룹의 T 세포는 γ 및 δ 쇄로 구성된 수용체를 발현한다. α/β T 세포 중에는 2개의 서브-계통이 있다: 공동수용체 분자 CD4를 발현하는 것들(CD4+ T 세포); 및 CD8을 발현하는 것들(CD8+ T 세포). 이들 세포는 항원을 인식하는 방법 및 이의 이펙터 및 조절 기능이 상이하다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 T 세포는 α/β T 세포이다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 T 세포는 γ/δ T 세포이다.
CD4+ T 세포는 면역계의 주요 조절 세포이다. 이들의 조절 기능은 T 세포가 활성화될 때 발현이 유도되는 CD40 리간드와 같은 이들의 세포-표면 분자의 발현, 및 활성화될 때 이들이 분비하는 광범위한 사이토카인 둘 모두에 좌우된다. T 세포는 또한 중요한 이펙터 기능을 매개하며, 이들 중 일부는 이들이 분비하는 사이토카인의 패턴에 의해 결정된다. 사이토카인은 표적 세포에 직접 독성일 수 있고 강력한 염증 메커니즘을 동원할 수 있다. 또한, T 세포, 특히 CD8+ T 세포는 CTL에 의해 인식되는 항원을 발현하는 표적 세포를 효율적으로 용해시킬 수 있는 세포독성 T-림프구(CTL)로 발달할 수 있다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)). T 세포는 또한 이들의 기능에 기초하여 헬퍼 T 세포; 세포 면역 유도에 관여하는 T 세포; 조절 T(Treg) 세포; 및 세포독성 T 세포로서 분류될 수 있다.
T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. T 세포는 FicollTM 분리와 같은 해당 분야의 숙련자에게 공지된 많은 기법을 이용하여 대상체로부터 수집된 혈액의 단위로부터 수득될 수 있다. T 세포는 또한 전혈이 개체로부터 제거되고, 선택된 성분으로 분리되고, 나머지는 순환으로 되돌아는 과정인 성분채집술(apheresis)을 통해 수집될 수 있다. 성분채집술 산물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 일 양태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 세척되어 혈장 분획을 제거하고, 선택적으로, 후속 가공 단계를 위해 세포를 적절한 완충제 또는 배지에 배치할 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 인산염 완충 염수(PBS)로 세척된다. 혈액 샘플로부터 T 세포를 분리하는 방법은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 각각 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,911,993호 및 제10,273,300호에 기재되어 있다. 또한, 해당 분야에서 이용 가능한 많은 T 세포주가 사용될 수 있다. T 세포의 유전적 변형 전 또는 후에(예를 들어, 바람직한 CAR 및/또는 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위해), T 세포는 일반적으로, 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692, 964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 활성화되고 확장될 수 있다. 본 개시내용의 방법의 일부 구현예에서, T-세포는 치료될 대상체에 대해 자가유래이다. 일부 구현예에서, T-세포는 치료될 대상체에 대해 동종이계이다.
키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하기 위해 T-세포를 엔지니어링하는 방법은 본원 및 해당 분야에, 예를 들어, 각각 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,911,993호 및 미국 특허 제10,273,300호에 기재되어 있다.
대식구
일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 대식구이다. 대식구는 포식작용이라 불리는 과정에서 세포 파편, 이물질, 미생물 및 암 세포와 같은 물질을 삼키고 소화한다. 식세포작용 외에, 대식구는 비특이적 방어(선천성 면역)에서 중요한 역할을 하고 또한 림프구와 같은 다른 면역 세포를 동원함으로써 특정 방어 메커니즘(적응 면역)을 개시하는 것을 돕는다. 예를 들어, 대식구는 T 세포에 대한 항원 제시자로서 중요하다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 대식구는, 예를 들어, 증식성, 조건부 발달-정지된, 일차 대식구 전구체로부터 제조될 수 있다. 형질전환되지 않은 자가-재생 전구체 세포는 GM-CSF 또는 Flt3L이 보충된 배지 중 골수 전구체에서 전사 인자 Hoxb8의 과발현에 의해 확립된다. Hoxb8 활성은 전구체 분화의 차단을 초래한다. 이는 빠르게 증식하는 클로닝 가능한 세포를 생성한다. Hoxb8 활성의 제거는 전구체가 분화를 재개하고 분화된 대식구를 생산할 수 있게 한다. 문헌[Lee et al., 2016, J Control Release. 2016 Oct 28;240:527-540]을 참조한다. 본 개시내용의 방법의 일부 구현예에서, 대식구는 치료될 대상체에 대해 자가유래이다. 일부 구현예에서, 대식구는 치료될 대상체에 대해 동종이계이다.
키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하기 위해 대식구를 엔지니어링하는 방법은 본원 및 해당 분야, 예를 들어, 문헌[Klichinsky et al., 2020, Nat Biotechnol]에 기재되어 있다. 예를 들어, 인간 제대혈로부터의 CD34+ 조혈 줄기/전구 세포(HS/PC)는 클론원성 검정에서 형질도입되고 성장될 수 있다. 타노트랜스미션을 촉진시키는 이종성 폴리뉴클레오티드는 hTIE2 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다. TIE2 프로모터는 종양 부위에서 대식구의 분화 시 발현된다. 문헌[Escobar et al., 2014, Sci Transl Med 6, 217ra3]을 참조한다. TIE2는 2개의 면역글로불린-유사 도메인, 3개의 표피 성장 인자(EGF)-유사 도메인 및 3개의 피브로넥틴 III형 반복부를 함유하는 고유의 세포외 영역을 보유한다. 이는 인간 종양에서 널리 발현되며, 기질 메탈로프로테이나제(MMP) 및 사이토카인의 분비를 자극함으로써 많은 암의 진행에서 중심적인 역할을 한다.
일부 구현예에서, 엔지니어링된 대식구는 CD147 분자의 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현한다. CD147은 인간에서 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이고, 인간 종양에서 널리 발현되며, 기질 메탈로프로테이나제(MMP) 및 사이토카인의 분비를 자극함으로써 많은 암의 진행에서 중심적인 역할을 한다. CD147은 ECM의 분해를 담당하는 MMP의 발현을 통한 세포외 기질(ECM) 리모델링에 필수적이다. ECM의 분해는 표적 세포, 예를 들어, 종양 세포에 대한 접근을 개선시킨다. 예를 들어, ECM의 분해는 면역 세포에 의한 종양 침윤을 개선시킬 수 있다. 문헌[Caruana et al., 2015, Nature Medicine May; 21(5): 524-529]을 참조한다. 타노트랜스미션을 촉진시키는 이종성 폴리뉴클레오티드는 CD147에 의해 활성화된 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다. CD147에 의해 활성화되는 프로모터의 예는 NF-κB 프로모터, AP1 결합 및 사이클릭 AMP 반응 요소-결합 단백질 프로모터, 및 활성화 전사 인자-2 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 문헌[Xiong et al., 2014, Int J Mol Sci. Oct; 15(10): 17411-17441]을 참조한다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 대식구는 CD147의 내부 신호전달을 촉발시키고 MMP의 발현을 증가시키기 위해 종양 항원 HER2의 인식 후에 활성화되는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CAR은 인간 HER2를 표적화하는 단쇄 항체 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 인간 HER2, 마우스 IghG1의 힌지 영역, 및 예를 들어, 마우스 CD147 분자의 CD147의 막횡단 및 세포내 영역을 표적화하는 단쇄 항체 단편을 포함한다. 문헌[Zhang et al., 2019, British Journal of Cancer volume 121, pages 837-845]을 참조한다.
자연 살해(NK) 세포
일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 자연 살해(NK) 세포이다. NK 세포는 임의의 사전 자극 또는 면역화 없이 특정 종양 및 바이러스 감염된 세포를 용해시키는 세포독성 림프구이다. NK 세포는 말초 혈액으로부터 단리될 수 있거나, 제대혈, 골수, 인간 배아 줄기 세포, 및 유도된 다능성 줄기 세포로부터 시험관내에서 생성될 수 있다. 예를 들어, NK-92, NKL, 및 YTS와 같은 NK 세포주는 본원에 기재된 키메라 항원 수용체 구축물 중 임의의 것을 발현하도록 안정적으로 형질감염될 수 있다. 일부 구현예에서, NK 세포는 이종성 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 신호 전달 도메인은 DAP10의 세포질 도메인으로부터의 YINM 도메인, 및/또는 CD244의 세포질 도메인으로부터의 티로신-기반 모티프 TIYXX(V/I)를 포함한다. 문헌[Lanier, 2008, Nat Immunol. 9(5):495-502]을 참조한다. 일부 구현예에서, NK 세포는 이종성 표적화 도메인, 예를 들어, 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 디시알로강글리오시드 GD2를 인식한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항-GD2 ch14.18 단쇄 Fv 항체 융합 단백질로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, NK 세포는 키메라 항원 수용체를 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 디시알로강글리오시드 GD2를 인식하는 항원 결합 도메인, 예를 들어, 항-GD2 ch14.18 단쇄 Fv 항체 융합 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 항원 결합 도메인을 포함한다. 키메라 항원 수용체는 신호전달 모이어티로서 CD3 쇄를 추가로 포함할 수 있다. 문헌[Esser et al., 2012, J. Cell. Mol. Med. 16: 569-581]을 참조한다.
키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하기 위해 NK 세포를 엔지니어링하는 방법은 본원 및 해당 분야, 예를 들어, 미국 특허 제10,273,300호에 기재되어 있다. 본 개시내용의 방법의 일부 구현예에서, NK 세포는 치료될 대상체에 대해 자가유래이다. 일부 구현예에서, NK 세포는 치료될 대상체에 대해 동종이계이다.
수지상 세포
일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 수지상 세포이다. 수지상 세포(DC)는 병원체에 대한 면역 반응을 자극하고, 무해한 항원에 대하여 면역 항상성을 유지하는 데 결정적인 역할을 한다. DC는 면역 반응의 유도 및 조절에 필수적인 특수 항원-감지 및 항원-제시 세포(APC)의 이종 그룹을 나타낸다. 말초 혈액 중에서, 인간 DC는 T-세포(CD3, CD4, CD8), B-세포(CD19, CD20) 및 단핵구 마커(CD14, CD16)가 결여되지만, HLA-DR 및 다른 DC 계통 마커(예를 들어, CD1a, CD1c)를 고도로 발현하는 세포로서 특성화된다. 문헌[Murphy et al., Janeway's Immunobiology. 8th ed. Garland Science; New York, NY, USA: 2012. 868p]을 참조한다. 수지상 세포를 제조하고 엔지니어링하는 방법은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Osada et al., 2015, J Immunotherapy May; 38(4):155-64]에 기재되어 있다.
VI. 엔지니어링된 면역 세포를 위한 표적 세포
타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 세포 턴오버를 촉발시키는 신호 전달 도메인(예를 들어, 세포내 신호전달 도메인) 및 엔지니어링된 면역 세포를 표적 세포로 지시하는 표적화 도메인(예를 들어, 항원 결합 도메인)을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포는 다양한 상이한 표적 세포에서 생물학적 반응을 유도할 수 있다.
표적 세포의 유형은 암 세포, 면역 세포, 내피 세포, 및 섬유모세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포에 의한 타노트랜스미션은 대상체에서 내인성 면역 세포의 면역 활성을 유도하거나 증가시켜, 대상체에서 면역-자극 반응을 촉진시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포에 의한 타노트랜스미션은 내인성 면역 세포, 예컨대, 종양-관련 대식구의 표현형을 변화시키고, 이를 보다 염증성으로 만들 수 있다. 엔지니어링된 면역 세포에 의해 표적 세포에서 조절될 수 있는 다른 생물학적 반응은, 예를 들어, 암 세포 성장의 촉진, 및 혈관형성을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포에 의한 타노트랜스미션은 암-촉진 표현형에서 멀리 내인성 암-관련 섬유모세포의 표현형을 변화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포에 의한 타노트랜스미션은 내인성 내피 세포에 의한 혈관형성을 저해할 수 있다.
엔지니어링된 면역 세포에 의해 표적 세포에서 유도된 생물학적 반응은 또한 표적 세포에 의한 타노트랜스미션의 촉진일 수 있다. 예를 들어, 엔지니어링된 면역 세포에 의한 세포 턴오버 인자의 생산은 차례로 표적 세포에서 세포 턴오버를 유도하여, 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있다. 엔지니어링된 면역 세포는 하나 초과의 유형의 표적 세포를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 내인성 면역 세포의 면역 활성을 증가시키고, 또한 또 다른 유형의 표적 세포, 예컨대, 암 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시킨다. 암 세포에 의한 타노트랜스미션의 촉진은 내인성 면역 세포의 면역 활성을 증가시키는 암 세포에 의한 추가적인 세포 턴오버 인자의 생산을 유도하여, 대상체에서 면역-자극 반응을 추가로 증폭시킬 수 있다. 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있는 세포 턴오버 인자는 사이토카인(예를 들어, IL6 및 IL1과 같은 염증성 사이토카인), 면역조절 단백질(예를 들어, IFN), 성장 인자(예를 들어, FGF VEGF), 케모카인, ATP, 히스톤, 핵산(예를 들어, DNA, RNA), 포스파티딜-세린, 열 충격 단백질(HSP), 고 이동성 그룹 박스 1 단백질(HMGB1) 및 칼레티쿨린을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
엔지니어링된 면역 세포는 표적 세포가 겪는 세포 턴오버의 유형을 변화시킴으로써 표적 세포(예를 들어, 암 세포)에서 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포에 의한 세포 턴오버 인자의 생산은 표적 세포에서의 세포 턴오버 경로를 비-면역-자극성 세포 턴오버 경로에서 면역-자극성 세포 턴오버 경로, 예를 들어, 네크롭토시스, 외인성 아폽토시스, 페롭토시스, 파이롭토시스 및 이들의 조합으로 변경할 수 있다.
엔지니어링된 면역 세포에 의해 생산된 다양한 상이한 세포 턴오버 인자는, 예를 들어, 표적 세포에서 면역-자극성 세포 턴오버 경로를 유도함으로써 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 표적 세포에서 타노트랜스미션을 촉진시키는 그랜자임(예를 들어, 그랜자임 A)을 생산할 수 있다. 그랜자임은 퍼포린-매개 공극을 통해 표적 세포로 전달될 수 있는 세린 프로테아제의 패밀리이다. 세포독성 림프구로부터의 그랜자임 A는 GSDM-B를 절단하여 표적 암 세포에서 파이롭토시스를 촉발시키는 것으로 나타났다. 문헌[Zhou et al., 2020, Science 368(6494)]을 참조한다. 따라서, 표적 암 세포로의 엔지니어링된 면역 세포에 의해 생산된 그랜자임 A의 전달은 암 세포에서 파이롭토시스의 유도를 통해 암 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포에 의해 생산된 세포 턴오버 인자는 표적 세포에서 면역-자극성 세포 턴오버 경로를 유도하여 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 사이토카인이다. 다른 세포 턴오버 인자는 암 세포에 대한 파트너를 결합하고 암 세포에서 세포 턴오버를 유도함으로써, 타노트랜스미션을 촉진시키는 FasL 또는 다른 TNF 패밀리 구성원을 포함한다.
본원에 기재된 암 중 임의의 것의 세포는 엔지니어링된 면역 세포에 대한 표적 세포로서 적합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 전이성 암 세포이다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 종양 미세환경(TME)에서의 세포, 예컨대, 종양 관련 대식구(TAM), 암 관련 섬유모세포(CAF), 또는 종양 관련 내피 세포이다.
일부 구현예에서, 표적 세포는 비만 세포, 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 대식구, 수지상 세포, 림프구(예를 들어, B-세포 및 T 세포) 및 본원에 기재된 다른 면역 세포들 중 임의의 것으로부터 선택된 면역 세포이다.
표적 세포는 엔지니어링된 면역 세포에 의해 생산된 세포 턴오버 인자와 접촉되도록 엔지니어링된 면역 세포에 충분히 근접하다.
VII. 타노트랜스미션을 촉진시키는 방법
본 발명의 엔지니어링된 면역 세포는 대상체에서 타노트랜스미션을 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 양태에서, 본 발명은 대상체에서 타노트랜스미션을 촉진시키는 방법에 관한 것이며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 엔지니어링된 면역 세포를 대상체에서 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 투여하는 단계를 포함한다. 엔지니어링된 면역 세포에서 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드의 발현은 엔지니어링된 면역 세포가 면역 세포의 턴오버(예를 들어, 사멸) 동안 면역 세포에 의해 활발히 방출되거나 노출되는 세포 턴오버 인자를 생산하도록 유도한다. 이들 인자는 생물학적 반응(예를 들어, 면역 활성의 증가)을 겪도록 반응 세포(예를 들어, 면역 세포)에 신호를 전달한다.
일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 표적 세포, 예를 들어, 암 세포에 의한 타노트랜스미션을 추가로 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 엔지니어링된 면역 세포에 의해 생산된 세포 턴오버 인자에 대한 표적 세포의 노출은 이어서 표적 세포에서 세포 턴오버 인자의 생산을 개시할 수 있고, 이에 의해 또한 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있다. 이에 따라, 특정 양태에서, 본 개시내용은 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 방법에 관한 것이며, 방법은 표적 세포, 또는 표적 세포를 포함하는 조직을 본원에 기재된 바와 같은 엔지니어링된 면역 세포와, 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 접촉시키는 단계를 포함한다.
면역 활성을 증가시키는 방법
일 양태에서, 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포는 대상체, 예를 들어, 증가된 면역 활성으로부터 이익을 얻을 대상체에서 면역 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 촉진을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 촉진시키는 방법에 관한 것이며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 엔지니어링된 면역 세포를 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하여 대상체에서 면역 반응을 촉진시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현 시 엔지니어링된 면역 세포에 의해 생산된 인자는 반응 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 면역-자극 반응(예를 들어, 염증 유발 반응)을 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 면역 반응은 항암 반응이다.
본 개시내용의 방법에 따르면, 면역 활성은 엔지니어링된 면역 세포와, 예를 들어, 비만 세포, 자연 살해(NK) 세포, 호염기구, 호중구, 단핵구, 대식구, 수지상 세포, 호산구, 림프구(예를 들어, B-림프구(B-세포)), 및 T-림프구(T-세포)) 중 임의의 하나 이상을 포함하여 대상체에 내인성인 광범위한 면역 세포의 상호작용에 의해 조절될 수 있다.
면역 세포의 유형
비만 세포는 히스타민 및 항응고제인 헤파린이 풍부한 과립을 함유하는 과립구의 한 유형이다. 비만 세포는 활성화될 때, 염증성 화합물을 과립으로부터 국소 미세환경 내로 방출한다. 비만 세포는 알러지, 아나필락시스, 상처 치유, 혈관형성, 면역 관용, 병원체에 대한 방어, 및 혈액-뇌 장벽 기능에서 역할을 수행한다.
자연 살해(NK) 세포는 임의의 이전의 자극 또는 면역화 없이 특정 종양 및 바이러스 감염 세포를 용해시키는 세포독성 림프구이다. NK 세포는 또한 다양한 사이토카인, 예를 들어, IFN-감마(IFNγ), TNF-알파(TNFα), GM-CSF 및 IL-3의 강력한 생성자이다. 따라서, NK 세포는 또한 면역계에서 조절 세포로서 기능하여, 다른 세포 및 반응에 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 인간에서, NK 세포는 광범위하게 CD56+CD3- 림프구로서 정의된다. NK 세포의 세포독성 활성은 세포 표면 상의 수용체로부터의 활성화 및 저해 신호 간의 균형에 의해 엄격하게 제어된다. NK 세포 활성화를 저해하는 수용체의 주요 그룹은 저해성 살해 면역글로불린-유사 수용체(KIR)이다. 이들 수용체는 표적 세포 상의 자가 MHC 부류 I 분자의 인식 시에, 활성화 신호전달 캐스케이드를 중단시키는 저해성 신호를 운반하여, 정상적인 MHC 부류 I 발현을 갖는 세포를 NK 세포 용해로부터 보호한다. 활성화 수용체는 자연 세포독성 수용체(NCR) 및 NKG2D를 포함하며, 이는 표적 세포 표면 상의 상이한 리간드와의 결합을 통하여 세포용해 작용을 향해 균형을 이루게 한다. 따라서, 표적 세포의 NK 세포 인식은 다수의 활성화 및 저해성 수용체로부터 운반되는 신호의 통합을 포함하는 과정에 의해 엄격하게 조절된다.
단핵구는 조직 내로 동원되기 전에 수시간/수일 동안 혈 중 순환하는 골수-유래 단핵 식세포이다. 문헌[Wacleche et al., 2018, Viruses (10)2: 65]을 참조한다. 그들의 표면에서의 다양한 케모카인 수용체 및 세포 부착 분자의 발현은 그들이 골수에서 혈액 내로 유출된 후에, 혈액으로부터 조직 내로 동원되게 한다. 단핵구는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생생물 감염에 대한 반응을 제공하는 면역계의 선천적 아암(arm)에 속한다. 그들의 기능은 식세포작용을 통한 병원체의 사멸, 반응성 산소 종(ROS), 산화질소(NO), 마이엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase) 및 염증성 사이토카인의 생산을 포함한다. 단핵구는 특정 조건 하에서, 암 및 감염성 및 자가면역 질병 동안 T-세포 반응을 자극하거나 저해할 수 있다. 그들은 또한 조직 회복 및 혈관신생에 연루된다.
대식구는 식세포작용으로 지칭되는 과정에서 세포 데브리스, 외래 물질, 미생물 및 암 세포와 같은 물질을 포식하고 소화시킨다. 대식구는 식세포작용 외에도, 비특이적인 방어(선천 면역)에서 결정적인 역할을 수행하며, 또한, 림프구와 같은 다른 면역 세포를 동원함으로써 특이적인 방어 메커니즘(획득 면역)의 개시를 돕는다. 예를 들어, 대식구는 T 세포에 대한 항원 제시자로서 중요하다. 염증을 증가시키고 면역계를 자극하는 것 외에도, 대식구는 또한 중요한 항-염증 역할을 수행하며, 사이토카인의 방출을 통해 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 염증을 조장하는 대식구는 M1 대식구로 지칭되는 한편, 염증을 감소시키고 조직 회복을 조장하는 대식구는 M2 대식구로 지칭된다. 일부 구현예에서, 대식구는 종양-관련 대식구이다.
수지상 세포(DC)는 병원체에 대한 면역 반응을 자극하고, 무해한 항원에 대하여 면역 항상성을 유지하는 데 결정적인 역할을 한다. DC는 면역 반응의 유도 및 조절에 필수적인 특수 항원-감지 및 항원-제시 세포(APC)의 이종성 그룹을 나타낸다. 말초 혈액 중에서, 인간 DC는 T-세포(CD3, CD4, CD8), B-세포(CD19, CD20) 및 단핵구 마커(CD14, CD16)가 결여되지만, HLA-DR 및 다른 DC 계통 마커(예를 들어, CD1a, CD1c)를 고도로 발현하는 세포로서 특성화된다. 문헌[Murphy et al., Janeway's Immunobiology. 8th ed. Garland Science; New York, NY, USA: 2012. 868p]을 참조한다. 일부 구현예에서, 수지상 세포는 CD103+ 수지상 세포이다.
용어 "림프구"는 신체의 도처의 림프 조직에서 형성되고, 정상 성인에서 질병에 대해 신체를 방어하는 데 큰 역할을 수행하는 순환하는 혈액 중 총 백혈구 수의 약 22 내지 28%를 구성하는 작은 백혈구를 지칭한다. 개별 림프구는 이들이 이들의 유전 물질의 재조합(예를 들어, T 세포 수용체 및 B 세포 수용체를 생성시키기 위함)을 통해 구조적으로 관련된 항원의 제한된 세트에 반응하도록 수임된다는 점에서 특화되어 있다. 면역계와, 주어진 항원의 처음 접촉 전에 존재하는 이러한 수임은 림프구의 표면 막 상의 항원 상의 결정인자(에피토프)에 특이적인 수용체의 존재에 의해 발현된다. 각각의 림프구는 고유한 수용체 집단을 가지며, 이들 모두는 동일한 조합 부위를 갖는다. 림프구의 하나의 세트, 또는 클론은 이의 수용체의 조합 영역의 구조에서 또 다른 클론과 상이하며, 따라서 그것이 인식할 수 있는 에피토프가 상이하다. 림프구는 이들의 수용체의 특이성뿐만 아니라 이들의 기능에 있어서도 서로 상이하다. (Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999), at p. 102).
림프구는 항체-분비 세포의 전구체인 B-림프구(B-세포), 및 T-림프구(T-세포)를 포함한다.
B-림프구(B-세포)
B-림프구는 골수의 조혈 세포로부터 유래된다. 성숙 B-세포는 그의 세포 표면에 의해 인식되는 에피토프를 발현하는 항원으로 활성화될 수 있다. 활성화 과정은 항원에 의한 막 Ig 분자의 가교 결합(가교 결합 의존적 B-세포 활성화)에 의존하여 직접적일 수 있거나, 동족체 도움으로 언급되는 과정에서 헬퍼 T-세포와의 상호작용을 통해 간접적일 수 있다. 많은 생리학적 상황에서, 수용체 가교 결합 자극 및 동족체 도움은 상승작용하여 더욱 격렬한 B-세포 반응을 제공한다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).
가교 결합 의존적 B-세포 활성화는 항원이 세포 표면 수용체의 결합 부위에 상보적인 에피토프의 다수의 카피를 발현하는 것을 요구하는데, 이는 각각의 B-세포가 동일한 가변 영역을 갖는 Ig 분자를 발현하기 때문이다. 이러한 요건은 반복 에피토프를 갖는 다른 항원, 예를 들어, 미생물의 캡슐 다당류 또는 바이러스 외피 단백질에 의해 충족된다. 가교 결합 의존적 B-세포 활성화는 이들 미생물에 대해 마운팅되는 주요 보호 면역 반응이다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).
동족체 도움은 B-세포가 수용체와 가교 결합할 수 없는 항원에 대한 반응을 마운팅시키는 것을 가능하게 하고, 동시에 이들이 약한 가교 결합 사건에 의해 자극되는 경우 불활성화로부터 B 세포를 구제하는 공동자극 신호를 제공한다. 동족체 도움은 B-세포의 막 면역글로불린(Ig)에 의한 항원의 결합, 항원의 세포내이입, 및 세포의 엔도솜/리소좀 구획 내에서의 펩티드로의 그의 단편화에 좌우된다. 생성된 펩티드 중 일부는 부류 II 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자로 공지된 세포 표면 단백질의 특화된 세트의 그루브 내로 로딩된다. 생성된 부류 II/펩티드 복합체는 세포 표면 상에서 발현되며, CD4+ T-세포로 지정된 T-세포의 세트의 항원-특이적 수용체에 대한 리간드로서 작용한다. CD4+ T-세포는 이들의 표면 상에 B-세포의 부류 II/펩티드 복합체에 특이적인 수용체를 갖는다. B-세포 활성화는 그의 T 세포 수용체(TCR)를 통한 T 세포의 결합에 좌우될 뿐만 아니라 이 상호작용은 또한 T-세포 상의 활성화 리간드(CD40 리간드)가 B-세포 활성화를 신호전달하는 B-세포 상의 그의 수용체(CD40)에 결합하는 것을 가능하게 한다. 또한, T 헬퍼 세포는 B 세포 상의 사이토카인 수용체에 결합함으로써 자극된 B-세포의 성장 및 분화를 조절하는 몇몇 사이토카인을 분비한다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction, "Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).
항체 생산을 위한 동족체 도움 동안, CD40 리간드는 활성화된 CD4+ T 헬퍼 세포 상에서 일시적으로 발현되며, 이는 항원-특이적 B 세포 상의 CD40에 결합함으로써 제2 공동자극 신호를 전달한다. 후자의 신호는 B 세포 성장 및 분화, 및 항원과 마주치는 배 중심 B 세포의 아폽토시스의 방지에 의한 기억 B 세포의 생성에 필수적이다. B 및 T 세포 둘 모두에서의 CD40 리간드의 과발현은 인간 SLE 환자에서 병원성 자가항체 생산에 연루된다(Desai-Mehta, A. et al., J. Clin. Invest. Vol. 97(9), 2063-2073, (1996)).
T-림프구(T-세포)
조혈 조직의 전구체로부터 유래된 T-림프구는 흉선에서 분화를 겪으며, 이후 말초 림프 조직 및 림프구의 재순환 풀로 시딩된다. T-림프구 또는 T 세포는 광범위한 면역학적 기능을 매개한다. 이들은 B 세포가 항체-생산 세포로 발달하는 것을 돕는 능력, 단핵구/대식세포의 살균 작용을 증가시키는 능력, 특정 유형의 면역 반응의 저해, 표적 세포의 직접 사멸, 및 염증 반응의 동원을 포함한다. 이들 효과는 특정 세포 표면 분자의 T 세포 발현 및 사이토카인의 분비에 좌우된다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).
T 세포는 이들의 항원 인식의 메커니즘에 있어서 B 세포와 상이하다. B 세포의 수용체인 면역글로불린은 가용성 분자 또는 미립자 표면 상의 개별적 에피토프에 결합한다. B-세포 수용체는 고유 분자의 표면 상에서 발현된 에피토프를 알아본다. 항체 및 B-세포 수용체는 세포외 유체 내의 미생물에 결합하고 이에 대해 보호하도록 진화한 반면, T 세포는 다른 세포의 표면 상의 항원을 인식하고, 이들 항원 제시 세포(APC)의 거동과 상호작용하고 이를 변경시킴으로써 이들의 기능을 매개한다. T 세포를 활성화시킬 수 있는 말초 림프 기관에는 수지상 세포, 대식구 및 B 세포의 3개의 주요 유형의 APC가 존재한다. 이들 중 가장 강력한 것은 수지상 세포이며, 이의 유일한 기능은 T 세포에 외래 항원을 제시하는 것이다. 미성숙 수지상 세포는 피부, 장, 및 기도를 포함하여 신체의 도처의 조직에 위치한다. 이들이 이들 부위에서 침입 미생물과 마주치는 경우, 이들은 병원체 및 이들의 산물을 세포내이입하고, 이들을 림프를 통해 국소 림프절 또는 장 관련 림프 기관으로 운반한다. 병원체와 마주치면, 수지상 세포가 항원-포획 세포에서, T 세포를 활성화시킬 수 있는 APC로 성숙하도록 유도된다. APC는 T 세포를 활성화하여 이펙터 세포가 되도록 하는 역할을 갖는 이들의 표면 상의 3가지 유형의 단백질 분자를 디스플레이한다: (1) 외래 항원을 T 세포 수용체에 제시하는 MHC 단백질; (2) T 세포 표면 상의 상보적인 수용체에 결합하는 공동자극 단백질; 및 (3) T 세포가 활성화되기에 충분히 길게 APC에 결합할 수 있게 하는 세포-세포 부착 분자("Chapter 24: The adaptive immune system," Molecular Biology of the Cell, Alberts, B. et al., Garland Science, NY, (2002)).
T-세포는 이들이 발현하는 세포 표면 수용체에 기초하여 2개의 별개의 부류로 세분된다. 대부분의 T 세포는 α 및 β 쇄로 이루어진 T 세포 수용체(TCR)를 발현한다. 작은 그룹의 T 세포는 γ 및 δ 쇄로 구성된 수용체를 발현한다. α/β T 세포 중에서 보조수용체 분자 CD4를 발현하는 것(CD4+ T 세포); 및 CD8을 발현하는 것(CD8+ T 세포)의 2개의 하위-계열이 존재한다. 이들 세포는 이들이 항원을 인식하는 방법 및 이들의 이펙터 및 조절 기능에 있어서 상이하다. CD4+ T 세포는 T 세포 항원 수용체를 사용하여 엔도솜 또는 파고솜에서 생성되고 주요 조직적합성 복합체 분자에 결합된 숙주 세포 표면에서 나타나는 펩티드를 인식하는 적응 면역계의 핵심 세포이다. 이들의 조절 기능은 T 세포가 활성화되는 경우에 발현이 유도되는 이들의 세포-표면 분자, 예를 들어, CD40 리간드의 발현, 및 활성화되는 경우 이들이 분비하는 다양한 종류의 사이토카인 둘 모두에 좌우된다.
T 세포는 또한 중요한 이펙터 기능을 매개하며, 이중 일부는 이들이 분비하는 사이토카인의 패턴에 의해 결정된다. 사이토카인은 표적 세포에 직접적으로 독성일 수 있고, 강력한 염증 메커니즘을 동원할 수 있다.
또한, T 세포, 특히 CD8+ T 세포는 CTL에 의해 인식되는 항원을 발현하는 표적 세포를 효율적으로 용해시킬 수 있는 세포독성 T-림프구(CTL)로 발생할 수 있다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).
T 세포 수용체(TCR)는 부류 II 또는 부류 I MHC 단백질의 특화된 그루브에 결합된 항원의 단백질분해에 의해 유래되는 펩티드로 이루어진 복합체를 인식한다. CD4+ T 세포는 펩티드/부류 II 복합체만 인식하는 반면, CD8+ T 세포는 펩티드/부류 I 복합체를 인식한다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).
TCR의 리간드(즉, 펩티드/MHC 단백질 복합체)는 APC 내에서 생성된다. 일반적으로, 부류 II MHC 분자는 세포내이입 과정을 통해 APC에 의해 흡수된 단백질로부터 유래된 펩티드에 결합한다. 이들 펩티드-로딩된 부류 II 분자는 이후 세포의 표면 상에서 발현되며, 여기서 이들은 발현된 세포 표면 복합체를 인식할 수 있는 TCR을 갖는 CD4+ T 세포에 의해 결합되도록 이용 가능해진다. 따라서, CD4+ T 세포는 세포외 공급원에서 유래된 항원과 반응하도록 특화되어 있다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).
대조적으로, 부류 I MHC 분자는 주로 바이러스 단백질과 같은 내부적으로 합성된 단백질로부터 유래된 펩티드가 로딩된다. 이들 펩티드는 프로테오솜에 의한 단백질분해에 의해 시토졸 단백질로부터 생산되고, 조면 소포체로 전위된다. 일반적으로 9개 아미노산 길이로 구성된 이러한 펩티드는 부류 I MHC 분자에 결합되고, 세포 표면으로 이동되며, 여기서 이들은 적절한 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포에 의해 인식될 수 있다. 이는 T 세포 시스템, 특히 CD8+ T 세포에, 나머지 유기체의 세포의 것(예를 들어, 바이러스 항원) 또는 돌연변이체 항원(예를 들어, 활성 종양유전자 산물)과 상이하거나 이보다 훨씬 더 많은 양으로 생산되는 단백질(온전한 형태의 이들 단백질이 세포 표면 상에서 발현되지 않거나 분비되지 않더라도)을 발현하는 세포를 검출하는 능력을 제공한다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).
T 세포는 또한 이들의 기능에 기초하여 헬퍼 T 세포; 세포 면역을 유도하는 데 관여하는 T 세포; 억제인자 T 세포; 및 세포독성 T 세포로 분류될 수 있다.
헬퍼 T 세포
헬퍼 T 세포는 B 세포를 자극하여 단백질 및 다른 T 세포-의존적 항원에 대한 항체 반응을 일으키는 T 세포이다. T 세포 의존적 항원은 개별 에피토프가 이들이 B 세포의 막 면역글로불린(Ig)을 가교 결합시킬 수 없거나 비효율적으로 가교 결합시킬 수 있도록 단지 1회 또는 제한된 횟수로만 나타나는 면역원이다. B 세포는 이들의 막 Ig를 통해 항원에 결합하고, 복합체는 세포내이입을 겪는다. 엔도솜 및 리소좀 구획 내에서, 항원은 단백질분해 효소에 의해 펩티드로 단편화되고, 생성된 펩티드 중 하나 이상이 부류 II MHC 분자로 로딩되어 이 소포 구획을 통해 수송된다. 이후, 생성된 펩티드/부류 II MHC 복합체는 B-세포 표면 막으로 유출된다. 펩티드/부류 II 분자 복합체에 특이적인 수용체를 갖는 T 세포는 B-세포 표면 상의 이 복합체를 인식한다. (Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999)).
B-세포 활성화는 T 세포의 TCR을 통한 T 세포의 결합 및 T-세포 CD40 리간드(CD40L)와 B 세포 상의 CD40의 상호작용 둘 모두에 좌우된다. T 세포는 CD40L을 구성적으로 발현하지 않는다. 오히려, CD40L 발현은 CD80 또는 CD86 및 T 세포의 TCR에 의해 인식되는 동족 항원 둘 모두를 발현하는 APC와의 상호작용의 결과로서 유도된다. CD80/CD86은 활성화된 B 세포 및 T 세포를 포함하는 헬퍼 상호작용이 효율적인 항체 생산을 야기할 수 있도록 휴지가 아닌 활성화된 B 세포에 의해 일반적으로 발현된다. 그러나, 많은 경우에, T 세포 상에서의 CD40L의 초기 유도는 수지상 세포와 같이 CD80/86을 구성적으로 발현하는 APC의 표면 상에서의 항원의 그들의 인식에 좌우된다. 이러한 활성화된 헬퍼 T 세포는 이후 B 세포와 효율적으로 상호작용하고 이를 도울 수 있다. B 세포 상에서의 막 Ig의 가교 결합은 비효율적일지라도 CD40L/CD40 상호작용과 상승작용하여 활발한 B-세포 활성화를 제공할 수 있다. 증식, Ig 분비, 및 발현되는 Ig 부류의 부류 전환을 포함하는 B-세포 반응의 후속 사건은 T 세포-유래 사이토카인의 작용에 좌우되거나 이에 의해 향상된다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).
CD4+ T 세포는 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10을 주로 분비하는 세포(TH2 세포) 또는 IL-2, IFN-γ 및 림프독소를 주로 생산하는 세포(TH1 세포)로 분화하는 경향이 있다. TH2 세포는 B 세포가 항체 생산 세포로 발생하는 것을 돕는 데 매우 효과적인 반면, TH1 세포는 단핵구 및 대식구의 살균 활성의 향상, 및 세포내 소포 구획에서 미생물을 용해시키는 데 있어서의 결과적인 증가된 효율을 포함하는 세포 면역 반응의 효과적인 유도인자이다. TH2 세포의 표현형(즉, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)을 갖는 CD4+ T 세포는 효율적인 헬퍼 세포이나, TH1 세포는 또한 헬퍼가 될 능력을 갖는다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction, "Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).
세포 면역 유도에서의 T 세포 연루
T 세포는 또한 세포내 미생물을 파괴하는 단핵구 및 대식구의 능력을 향상시키는 작용을 할 수 있다. 특히, 헬퍼 T 세포에 의해 생산된 인터페론-감마(IFN-γ)는 산화질소의 생성 및 종양 괴사 인자(TNF) 생산의 유도를 포함하는, 단핵 포식세포가 세포내 박테리아 및 기생을 파괴하는 몇몇 메커니즘을 향상시킨다. TH1 세포는 IFN-γ를 생산하므로 살균 작용을 향상시키는 데 효과적이다. 대조적으로, TH2 세포에 의해 생산되는 주요 사이토카인 중 2개인 IL-4 및 IL-10은 이들 활성을 차단한다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).
조절성 T(Treg) 세포
면역 항상성은 면역 반응의 개시와 하향조절 사이의 제어된 균형에 의해 유지된다. 아폽토시스 및 T 세포 무반응(T 세포가 항원과 마주친 후에 본질적으로 기능적으로 불활성화되는 내성 메커니즘(Schwartz, R. H., "T cell anergy", Annu. Rev. Immunol., Vol. 21: 305-334 (2003)) 둘 모두의 메커니즘이 면역 반응의 하향조절에 기여한다. 제3 메커니즘은 억제인자 또는 조절성 CD4+ T(Treg) 세포에 의한 활성화된 T 세포의 활성 억제에 의해 제공된다(문헌[Kronenberg, M. et al., Nature, Vol. 435: 598-604 (2005)]에서 개괄됨). IL-2 수용체 알파(IL-2Rα) 쇄를 구성적으로 발현하는 CD4+ Treg(CD4+ CD25+)는 무반응성이고 억제성인 자연 발생 T 세포 하위세트이다(Taams, L. S. et al., Eur. J. Immunol. Vol. 31: 1122-1131 (2001)). 이들의 뮤린 대응부와 유사한 인간 CD4+ CD25+ Treg는 흉선에서 생성되며, 세포-세포 접촉 의존적 메커니즘을 통해 반응자 T 세포의 증식을 억제하는 능력, IL-2를 생산할 수 없음, 및 시험관 내에서의 무반응성 표현형을 특징으로 한다. 인간 CD4+ CD25+ T 세포는 CD25 발현의 수준에 따라 억제성(CD25high) 및 비억제성(CD25low) 세포로 나뉠 수 있다. 전사 인자의 포크헤드(forkhead) 계열의 구성원인 FOXP3는 뮤린 및 인간 CD4+ CD25+ Treg에서 발현되는 것으로 밝혀졌고, CD4+ CD25+ Treg 발생을 제어하는 주된 유전자인 것으로 보인다(Battaglia, M. et al., J. Immunol., Vol. 177: 8338-8347, (2006)). 따라서, 일부 구현예에서, 면역 반응의 증가는 조절성 T 세포의 활성화 또는 증식의 결여와 관련될 수 있다.
세포독성 T 림프구
표적 세포 내에서 생산된 단백질 유래의 펩티드를 인식하는 CD8+ T 세포는 이들이 표적 세포의 용해를 야기한다는 점에서 세포독성 특성을 갖는다. CTL-유도 용해의 메커니즘은 표적 세포의 막에 삽입하여, 세포의 용해를 촉진할 수 있는 분자인 퍼포린(perforin)의 CTL에 의한 생산을 포함한다. 퍼포린-매개 용해는 활성화된 CTL에 의해 생산된 일련의 효소인 그랜자임(granzyme)에 의해 향상된다. 많은 활성 CTL은 또한 이들의 표면 상에 다량의 fas 리간드를 발현한다. CTL의 표면 상의 fas 리간드와 표적 세포의 표면 상의 fas의 상호작용은 표적 세포에서 아폽토시스를 개시하여, 이들 세포의 사멸을 야기한다. CTL-매개 용해는 바이러스 감염된 세포의 파괴를 위한 주요 메커니즘인 것으로 보인다.
림프구 활성화
용어 "활성화" 또는 "림프구 활성화"는 RNA, 단백질 및 DNA의 합성 및 림포카인의 생산을 초래하는 특정 항원, 비특이적 미토겐 또는 동종이형 세포에 의한 림프구의 자극을 지칭하며; 이는 다양한 이펙터 및 기억 세포의 증식 및 분화로 이어진다. T-세포 활성화는 TCR/CD3 복합체와 부류 I 또는 부류 II MHC 분자의 그루브에 결합된 펩티드인 그의 동족 리간드의 상호작용에 좌우된다. 수용체 결합에 의해 움직이도록 설정된 분자 사건은 복잡하다. 그 중에서 가장 초기 단계는 몇몇 신호전달 경로를 제어하는 기질 세트의 티로신 인산화를 야기하는 티로신 키나제의 활성화인 것으로 보인다. 이들은 TCR을 ras 경로에 연결시키는 어댑터 단백질의 세트, 포스포리파제 Cγ1을 포함하며, 이의 티로신 인산화는 이의 촉매 활성을 증가시키고, 이노시톨 인지질 대사 경로에 참여시켜, 세포내 유리 칼슘 농도의 상승, 및 단백질 키나제 C 및 세포 성장 및 분화를 제어하는 일련의 다른 효소의 활성화를 야기한다. T 세포의 완전한 반응은 수용체 결합에 더하여 보조 세포-운반 공동자극 활성, 예를 들어, APC 상의 CD80 및/또는 CD86에 의한 T 세포 상의 CD28의 결합을 필요로 한다.
T-기억 세포
적응 면역 반응을 통한 병원체의 인식 및 근절 후, 대다수(90 내지 95%)의 T 세포는 아폽토시스를 겪고, 나머지 세포는 중추 기억 T 세포(TCM), 이펙터 기억 T 세포(TEM), 및 상주 기억 T 세포(TRM)으로 지정된 기억 T 세포 풀을 형성한다(Clark, R.A., "Resident memory T cells in human health and disease", Sci. Transl. Med., 7, 269rv1, (2015)).
표준 T 세포와 비교하여, 이들 기억 T 세포는 특정 표면 마커의 발현, 상이한 사이토카인 프로파일의 신속한 생산, 직접적인 이펙터 세포 기능의 능력, 및 독특한 귀소 분포 패턴과 같은 독특한 표현형과 함께 오래 지속된다. 기억 T 세포는 병원체의 재감염을 제거함으로써 면역계의 균형을 신속하게 회복시키기 위해 이들 각각의 항원에 대한 재노출 시에 신속한 반응을 나타낸다. 자가면역 기억 T 세포가 자가면역 질병을 치료하거나 치유하려는 대부분의 시도를 방해한다는 것을 입증하는 증거가 증가하고 있다(Clark, R.A., "Resident memory T cells in human health and disease", Sci. Transl. Med., Vol. 7, 269rv1, (2015)).
면역 활성의 증가
본원에 기재된 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리펩티드, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 엔지니어링된 면역 세포는 조직 또는 대상체에서 본원에 기재된 면역 세포, 예를 들어, 대식구, 단핵구, 수지상 세포, B-세포, T-세포 및 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포(예를 들어, CD4+, CD8+ 또는 CD3+ T 세포) 중 임의의 하나 이상의 수준 또는 활성을 증가시킴으로써 조직 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 조직 또는 대상체에서 하기 중 하나 이상을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다: 대식구의 수준 또는 활성, 단핵구의 수준 또는 활성, 수지상 세포의 수준 또는 활성, T-세포의 수준 또는 활성, B-세포의 수준 또는 활성, 및 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포(예를 들어, CD4+, CD8+ 또는 CD3+ T 세포)의 수준 또는 활성.
일부 양태에서, 본 개시내용은 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포를 조직 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 조직 또는 대상체에서의 대식구, 단핵구, B-세포, T-세포 및/또는 수지상 세포의 수준 또는 활성의 증가 방법에 관한 것이며, 여기서 면역 세포는 엔지니어링된 면역 세포로 처리되지 않은 조직 또는 대상체에 비하여, 대식구, 단핵구, B-세포, T 세포 및/또는 수지상 세포의 수준 또는 활성을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구현예에서, 대상체는 증가된 수준 또는 활성의 대식구, 단핵구, 수지상 세포, B-세포, 및/또는 T-세포를 필요로 한다. 일 구현예에서, 대식구, 단핵구, B-세포, T-세포 또는 수지상 세포의 수준 또는 활성은 엔지니어링된 면역 세포로 처리되지 않은 조직 또는 대상체에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%, 또는 적어도 2배, 4배, 6배, 8배 또는 10배 증가된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 엔지니어링된 면역 세포로 처리되지 않은 조직 또는 대상체에 비하여 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포의 수준 또는 활성을 증가시키기에 충분한 양으로 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 조직 또는 대상체에서의 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포의 수준 또는 활성의 증가 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 대상체는 증가된 수준 또는 활성의 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포를 필요로 한다. 일 구현예에서, CD4+, CD8+, 또는 CD3+ 세포의 수준 또는 활성은 엔지니어링된 면역 세포로 처리되지 않은 조직 또는 대상체에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%, 또는 적어도 2배, 4배, 6배, 8배 또는 10배 증가된다.
본 발명의 엔지니어링된 면역 세포는 또한, 면역 세포에 의해 생산되는 면역 유발 사이토카인의 수준 또는 활성을 증가시킴으로써 세포, 조직 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포는 세포, 조직 또는 대상체에서 면역 세포에 의해 생산되는 면역 유발 사이토카인의 수준 또는 활성을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구현예에서, 면역 유발 사이토카인은 IFN-α, IL-1, IL-12, IL-18, IL-2, IL-15, IL-4, IL-6, TNF-α, IL-17 및 GMCSF로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 신호 전달 도메인 및/또는 표적화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포를 내인성 면역 세포의 NFkB 경로, 인터페론 IRF 신호전달, 및/또는 STAT 신호전달에서 염증 유발 전사 반응을 유도하기에 충분한 양으로 조직 또는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 조직 또는 대상체에 내인성인 면역 세포에서 염증 유발 전사 반응을 유도하는, 예를 들어, 조직 또는 대상체의 면역 세포에서 NFkB 경로, 인터페론 IRF 신호전달, 및/또는 STAT 신호전달을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 엔지니어링된 면역 세포는 또한 핵산의 세포내 센서, 예를 들어, 인터페론 유전자의 자극인자(STING)를 통한 신호전달의 조절에 의해 세포, 조직 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포를 핵산의 세포내 센서, 예를 들어, 인터페론 유전자의 자극인자(STING)를 통한 신호전달의 조절에 의해 세포, 조직 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시키기에 충분한 양으로, 세포, 조직 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 핵산의 세포내 센서, 예를 들어, 인터페론 유전자의 자극인자(STING)를 통한 신호전달의 조절에 의한 세포, 조직 또는 대상체에서 면역 활성의 증가 방법에 관한 것이다.
본 발명의 엔지니어링된 면역 세포는 또한 항체 반응의 유도 또는 조절에 의해 조직 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포는 조직 또는 대상체에서 항체 반응을 조절하기에 충분한 양으로 투여된다.
따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포를 조직 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 조직 또는 대상체의 면역 세포에서 항체 반응의 유도 또는 조절에 의한 조직 또는 대상체에서의 면역 활성의 증가 방법에 관한 것이며, 여기서 면역 세포는 엔지니어링된 면역 세포로 처리되지 않은 조직 또는 대상체에 비하여 조직 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포를 세포, 조직 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포, 조직 또는 대상체에서 면역 유발 사이토카인의 수준 또는 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 면역 세포는 엔지니어링된 면역 세포로 처리되지 않은 세포, 조직 또는 대상체에 비하여 면역 유발 사이토카인의 수준 또는 활성을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구현예에서, 면역 유발 사이토카인은 IFN-α, IL-1, IL-12, IL-18, IL-2, IL-15, IL-4, IL-6, TNF-α, IL-17 및 GMCSF로부터 선택된다. 일 구현예에서, 대상체는 증가된 수준 또는 활성의 면역 유발 사이토카인을 필요로 한다. 일 구현예에서, 면역 유발 사이토카인의 수준 또는 활성은 엔지니어링된 면역 세포로 처리되지 않은 세포, 조직 또는 대상체에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%, 또는 적어도 2배, 4배, 6배, 8배 또는 10배 증가된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 엔지니어링된 면역 세포의 투여 이전에, 세포, 조직 또는 대상체를 하기 중 하나 이상에 대하여 평가하는 단계를 추가로 포함한다: 대식구의 수준 또는 활성; 단핵구의 수준 또는 활성; 수지상 세포의 수준 또는 활성; CD4+ 세포, CD8+ 세포 또는 CD3+ 세포의 수준 또는 활성; T 세포의 수준 또는 활성; B 세포의 수준 또는 활성 및 면역-유발 사이토카인의 수준 또는 활성.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 엔지니어링된 면역 세포의 투여 이후에, 세포, 조직 또는 대상체를 하기 중 하나 이상에 대하여 평가하는 단계를 추가로 포함한다: NFkB, IRF 또는 STING의 수준 또는 활성; 대식구의 수준 또는 활성; 단핵구의 수준 또는 활성; 수지상 세포의 수준 또는 활성; CD4+ 세포, CD8+ 세포 또는 CD3+ 세포의 수준 또는 활성; T 세포의 수준 또는 활성; 및 면역-유발 사이토카인의 수준 또는 활성.
NFkB, IRF 또는 STING의 수준 또는 활성; 대식구의 수준 또는 활성; 단핵구의 수준 또는 활성; 수지상 세포의 수준 또는 활성; CD4+ 세포, CD8+ 세포 또는 CD3+ 세포의 수준 또는 활성; T 세포의 수준 또는 활성; 및 면역-유발 사이토카인의 수준 또는 활성을 측정하는 방법이 당업계에 알려져 있다.
예를 들어, NFkB, IRF 또는 STING의 단백질 수준 또는 활성은 ELISA, 웨스턴(Western) 블롯 또는 동소 혼성화를 포함하는 해당 분야에 알려져 있는 적합한 기법에 의해 측정될 수 있다. NFkB, IRF 또는 STING를 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA)의 수준은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역전사효소 PCR 분석, 정량적 실시간 PCR, 단일-가닥 입체형태 다형성 분석(SSCP), 미스매치 절단 검출, 헤테로듀플렉스 분석, 노던 블롯 분석, 동소 혼성화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 서열분석, 분해 단편 길이 다형성 분석 및 그의 조합 또는 하위-조합을 포함하는 해당 분야에 알려져 있는 적합한 기법을 사용하여 측정될 수 있다.
대식구의 수준 및 활성을 측정하는 방법은 예를 들어, 문헌[Chitu et al., 2011, Curr Protoc Immunol 14: 1-33]에 기재되어 있다. 단핵구의 수준 및 활성은 예를 들어, 문헌[Henning et al., 2015, Journal of Immunological Methods 423: 78-84]에 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 측정될 수 있다. 수지상 세포의 수준 및 활성은 예를 들어, 문헌[Dixon et al., 2001, Infect Immun. 69(7): 4351-4357]에 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 측정될 수 있다. 이들 참고문헌의 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
T 세포의 수준 또는 활성은 인간 CD4+ T-세포-기반의 증식 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 세포를 형광 염료 5,6-카복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지한다. 증식하는 세포는 CFSE 형광 세기의 감소를 보이며, 이는 유세포분석에 의해 직접적으로 측정된다. 대안적으로, 방사성 티미딘 혼입을 사용하여 T 세포의 성장 속도를 평가할 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 반응의 증가는 조절 T 세포(Treg)의 활성화 감소와 관련될 수 있다. 기능성 활성 T reg는 시험관 내 Treg 억제 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 검정은 문헌[Collinson and Vignali (Methods Mol Biol. 2011; 707: 21-37, 본원에 그의 전문이 참조로 포함됨)]에 기재되어 있다.
면역유발 사이토카인의 수준 또는 활성은 예를 들어, CD8+ T 세포에서 정량화될 수 있다. 구현예들에서, 면역유발 사이토카인은 인터페론 알파(IFN-α), 인터류킨-1(IL-1), IL-12, IL-18, IL-2, IL-15, IL-4, IL-6, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), IL-17 및 과립구-대식구 콜로니-자극 인자(GMCSF)로부터 선택된다. 정량화는 항원 자극에 반응하여 주어진 사이토카인(예를 들어, IFN-α)을 분비하는 T 세포를 검출하는 ELISPOT(효소-연결 면역스폿) 기법을 사용하여 수행될 수 있다. T 세포를 예를 들어, 항-IFN-α 항체로 코팅된 웰 내에서 항원-제시 세포와 배양한다. 분비된 IFN-α는 코팅된 항체에 의해 포획된 다음, 발색 기질에 커플링된 제2 항체를 사용하여 드러난다. 따라서, 국소 분비된 사이토카인 분자는 스폿을 형성하며, 각각의 스폿은 하나의 IFN-α 분비 세포에 상응한다. 스폿의 수는 분석된 시료에서 주어진 항원에 특이적인 IFN-α 분비 세포의 빈도를 결정하게 한다. ELISPOT 검정은 또한, TNF-α, 인터류킨-4(IL-4), IL-6, IL-12 및 GMCSF의 검출에 있어서 기재된 바 있다.
VIII. 장애의 치료 방법
타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포는 세포 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포는 증가된 면역 활성으로부터 이익을 얻을 수 있는 장애, 예컨대, 암 및 감염성 질병 및 장애의 치료에 사용될 수 있다.
A. 암
본원에 제공되는 바와 같이, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포는 내인성 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포 등)의 면역 활성을 촉진시키거나 유도할 수 있으며, 이에 따라, 면역 세포 기능, 예를 들어, 암의 치료를 위한 면역요법에 관여하는 것들을 향상시킬 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 방법은 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포를 대상체에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함한다.
면역계가 자가를 비-자가와 구별하지 못하게 하기 위하여 다양한 복잡한 중첩 메커니즘을 이용하는 암 세포의 능력은 면역감시를 회피하기 위한 암의 기본 메커니즘을 나타낸다. 메커니즘(들)은 항원 제시의 파괴, T 세포 활성화 또는 저해를 제어하는 조절 경로(면역 체크포인트 조절)의 파괴, 면역 억제에 기여하는 세포(Treg, MDSC)의 동원 또는 면역 활성에 영향을 미치는 인자(IDO, PGE2)의 방출을 포함한다. (문헌[Harris et al., 2013, J Immunotherapy Cancer 1:12]; 문헌[Chen et al., 2013, Immunity 39:1]; 문헌[Pardoll, et al., 2012, Nature Reviews: Cancer 12:252]; 및 문헌[Sharma et al., 2015, Cell 161:205] 참조, 이의 각각은 본원에 그의 전문이 참조로 포함됨.)
본원에 기재된 방법을 사용한 치료를 위한 암에는 예를 들어, 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는 포유동물에서 관찰되는 모든 유형의 암 또는 신생물 또는 악성 종양이 포함된다: 육종, 흑색종, 암종, 백혈병 및 림프종.
용어 "육종"은 일반적으로 배아 연결 조직과 같은 물질로 구성되고, 일반적으로 미소섬유 또는 균질한 물질에 매립된 밀접하게 팩킹된 세포로 구성된 종양을 지칭한다. 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 육종의 예는 예를 들어, 연골육종, 섬유육종, 림프육종, 흑색육종, 점액육종, 골육종, 아베메티 육종(Abemethy's sarcoma), 지방세포 육종(adipose sarcoma), 지방육종, 포상연부육종(alveolar soft part sarcoma), 법랑모세포 육종(ameloblastic sarcoma), 포도상 육종(botryoid sarcoma), 녹색종 육종(chloroma sarcoma), 융모막 암종(chorio carcinoma), 배아육종, 윌름스 종양 육종(Wilms' tumor sarcoma), 자궁내막 육종(endometrial sarcoma), 간질 육종, 유잉 육종, 근막 육종(fascial sarcoma), 섬유모세포 육종, 거대세포 육종, 과립구성 육종, 호지킨 육종, 특발성 다발성 색소출혈성 육종(idiopathic multiple pigmented hemorrhagic sarcoma), B 세포의 면역모세포성 육종(immunoblastic sarcoma of B cells), 림프종, T-세포의 면역모세포성 육종, 젠센 육종(Jensen's sarcoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 쿠퍼 세포 육종(Kupffer cell sarcoma), 혈관육종, 백혈구육종, 악성 중간엽 육종(malignant mesenchymoma sarcoma), 방골성 육종(parosteal sarcoma), 망상세포 육종(reticulocytic sarcoma), 라우스 육종, 장액낭종 육종(serocystic sarcoma), 활액 육종, 자궁 육종, 점액성 지방육종, 평활근 육종, 방추 세포 육종, 섬유조직형성 육종 및 모세혈관확장성 육종(telangiectaltic sarcoma)을 포함한다.
용어 "흑색종"은 피부 및 다른 기관의 멜라닌세포계에서 발생하는 종양을 의미하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 흑색종은 예를 들어, 선단 흑자성 흑색종, 무색소성 흑색종, 양성 소아 흑색종, 클라우드만 흑색종(Cloudman's melanoma), S91 흑색종, 하딩-파세이(Harding-Passey) 흑색종, 연소성 흑색종, 악성 흑자 흑색종(lentigo maligna melanoma), 악성 흑색종, 결절성 흑색종, 조갑하 흑색종, 및 표재 확장성 흑색종(superficial spreading melanoma)을 포함한다.
용어 "암종"은 주변 조직에 침윤하고 전이를 일으키는 경향이 있는 상피 세포로 이루어진 새로운 악성 성장을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 암종은 예를 들어, 세엽 암종(acinar carcinoma), 소엽 암종(acinous carcinoma), 샘낭 암종(adenocystic carcinoma), 선낭암종(adenoid cystic carcinoma), 선암종, 부신피질 암종, 폐포성 암종, 폐포세포암종, 기저세포 암종, 바닥세포 암종, 기저양 암종, 기저편평세포 암종, 세기관지폐포 암종, 세기관지성 암종, 기관지원성 암종, 대뇌양 암종(cerebriform carcinoma), 담관세포 암종, 융모암종, 콜로이드질 암종, 결장의 결장 선암종, 면포암종, 자궁체부암종, 사상암종(cribriform carcinoma), 경결형 암종(carcinoma en cuirasse), 피부 암종(carcinoma cutaneum), 원주상 암종(cylindrical carcinoma), 원주상 세포암종, 관암종, 듀럼 암종(carcinoma durum), 배아 암종, 뇌양 암종, 에피에모이드 암종(epiemoid carcinoma), 선양 상피 암종(carcinoma epitheliale adenoides), 외장성 암종(exophytic carcinoma), 궤양외 암종(carcinoma ex ulcere), 섬유성 암종(carcinoma fibrosum), 젤라틴형 암종(gelatiniform carcinoma), 젤라틴성 암종(gelatinous carcinoma), 거대 세포 암종, 거대 세포성 암종(carcinoma gigantocellulare), 샘암종(glandular carcinoma), 과립막 세포 암종(granulosa cell carcinoma), 털기질 암종(hair-matrix carcinoma), 간세포양 암종(hepatoid carcinoma), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 허슬 세포 암종(Hurthle cell carcinoma), 유리질 암종(hyaline carcinoma), 하이페메프로이드 암종(hypemephroid carcinoma), 초기 배아 암종(infantile embryonal carcinoma), 상피내암종(carcinoma in situ), 표피내 암종(intraepidermal carcinoma), 상피내암종(intraepithelial carcinoma), 크롬페쳐 암종(Krompecher's carcinoma), 컬키츠키 세포 암종(Kulchitzky-cell carcinoma), 거대 세포 암종(large-cell carcinoma), 수정체 암종(lenticular carcinoma), 수정체양 암종(carcinoma lenticulare), 지방성 암종(lipomatous carcinoma), 림프상피 암종(lymphoepithelial carcinoma), 수양 암종(carcinoma medullare), 수질 암종(medullary carcinoma), 멜라닌성 암종(melanotic carcinoma), 피부연성 암종(carcinoma molle), 메르켈 세포 암종, 점액 암종(mucinous carcinoma), 뮤시파룸 암종(carcinoma muciparum), 점액세포 암종(carcinoma mucocellulare), 점액표피양 암종(mucoepidermoid carcinoma), 점막 암종(carcinoma mucosum), 점액 암종(mucous carcinoma), 점액종성 암종(carcinoma myxomatodes), 비인두 암종, 연맥세포 암종(oat cell carcinoma), 화골성 암종(carcinoma ossificans), 유골 암종(osteoid carcinoma), 유두상 암종, 문맥주위 암종(periportal carcinoma), 전침윤 암종(preinvasive carcinoma), 가시 세포 암종(prickle cell carcinoma), 풀모양 암종(pultaceous carcinoma), 신장의 신세포 암종, 예비 세포 암종(reserve cell carcinoma), 육종성 암종(carcinoma sarcomatodes), 슈나이더 암종(schneiderian carcinoma), 경성 암종(scirrhous carcinoma), 음낭 암종, 인환세포암종, 단순 암종(carcinoma simplex), 소세포 암종, 솔라노이드 암종(solanoid carcinoma), 구상 세포 암종(spheroidal cell carcinoma), 방추 세포 암종, 해면질 암종(carcinoma spongiosum), 편평 암종(squamous carcinoma), 편평 세포 암종, 스트링 암종(string carcinoma), 모세혈관확장성 암종(carcinoma telangiectaticum), 모세혈관확장고리 암종(carcinoma telangiectodes), 이행 세포 암종, 결절성 암종(carcinoma tuberosum), 결절 암종(tuberous carcinoma), 우췌상 암종(verrucous carcinoma), 경부 편평 세포 암종, 편도 편평 세포 암종 및 융모상 암종(carcinoma villosum)을 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 신세포 암종이다.
용어 "백혈병"은 "아구"로 지칭되는 미성숙 백혈구의 비정상적 증가를 특징으로 하는 혈액 또는 골수의 암의 유형을 지칭한다. 백혈병은 광범위한 질병을 포괄하는 광범위한 용어이다. 결국, 이는 혈액, 골수, 및 림프계에 영향을 미치는 훨씬 더 넓은 그룹의 질병의 부분이며, 이는 모두 혈액학적 신생물로서 알려져 있다. 백혈병은 4개의 주요 분류, 급성 림프구성(또는 림프모구) 백혈병(ALL), 급성 골수성(또는 골수 또는 비-림프성) 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 및 만성 골수성 백혈병(CML)으로 나뉠 수 있다. 백혈병의 추가 유형은 모발상 세포 백혈병(HCL), T-세포 전림프구성 백혈병(T-PLL), 거대 과립 림프구성 백혈병, 및 성인 T-세포 백혈병을 포함한다. 특정 구현예에서, 백혈병은 급성 백혈병을 포함한다. 특정 구현예에서, 백혈병은 만성 백혈병을 포함한다.
용어 "림프종"은 림프 세포로부터 발생된 혈구 종양의 그룹을 지칭한다. 림프종의 2가지 주요 범주는 호지킨 림프종(HL) 및 비-호지킨 림프종(NHL)이다. 림프종은 림프 조직의 임의의 신생물을 포함한다. 주요 부류는 림프 및 혈액 둘 모두에 속하고 둘 모두에 만연한 백혈구의 한 유형인 림프구의 암이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 엔지니어링된 면역 세포, 및 엔지니어링된 면역 세포를 포함하는 조성물은 다양한 유형의 고형 종양, 예를 들어, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암), 방광암, 비뇨생식기암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 신장(신세포)암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암(예를 들어, 갑상선 유두암), 피부암, 골암, 뇌암, 자궁경부암, 간암, 복부암, 구강암, 식도암, 아데노이드 낭성 암, 신경모세포종, 고환암, 자궁암, 갑상선암, 두경부암, 신장암, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암), 중피종, 난소암, 육종, 복부암, 자궁암, 자궁경부암, 수모세포종 및 외음부암의 치료를 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 피부 암은 흑색종, 편평 세포 암종 및 피부 T-세포 림프종(CTCL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 고형 종양은 결장암, 연조직 육종(STS), 전이성 투명 세포 신세포 암종(ccRCC), 난소암, 위장암, 대장암, 간세포 암종(HCC), 교모세포종(GBM), 유방암, 흑색종, 비-소세포 폐암(NSCLC), 육종, 악성 흉막, 중피종(MPM), 망막모세포종, 신경교종, 수모세포종, 골육종, 유잉 육종, 췌장암, 폐암, 위암, 복부암, 식도암, 간암, 전립선암, 부인과 암, 비인두 암종, 골육종, 횡문근육종, 요로상피 방광 암종, 신경모세포종, 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 고형 종양을 표적화하기 위한 예시적인 항원 결합 도메인 표적 단백질이 표 8에 제공된다.
특정 구현예에서, 암은 "면역학적으로 차가운(immunologically cold)" 암, 예를 들어, 침윤성 T 세포를 거의 함유하지 않는 종양 또는 면역계에 의해 인식되지 않고 강한 반응을 야기하지 않는 암일 수 있으며, 이는 현재의 면역요법으로 치료하기 어렵게 만든다. 예를 들어, 일 구현예에서, 암은 흑색종, 자궁경부암, 유방암, 난소암, 전립선암, 고환암, 요로상피 암종, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 육종, 대장 선암종, 위장관 간질 종양, 위식도 암종, 대장암, 췌장암, 신장암, 악성 중피종, 백혈병, 림프종, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 이행 세포 암종, 신경모세포종, 형질 세포 신생물, 윌름스 종양 및 간세포암(예를 들어, 간세포 암종)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 요법은 또 다른 항-신생물(예를 들어, 면역치료) 섭생을 사용한 암에 대한 치료가 이전에 실패한 대상체에게 실행될 수 있다. "항-신생물 섭생이 실패한 대상체"는 RECIST 1.1 기준에 따라 항-신생물 섭생을 사용한 치료에 반응하지 않거나, 그에 대한 반응을 중단한, 즉, 단독으로 또는 가능한 경우 항-신생물 요법과 함께 종종 임상적으로 권고되는 수술 및/또는 방사선 요법과 함께 항-신생물 섭생 동안 또는 그의 완료 후에 표적 병변에서 완전 반응, 부분 반응 또는 안정한 질병을 달성하지 않거나; 또는 비-표적 병변의 완전 반응 또는 비-CR/비-PD를 달성하지 않는 암을 갖는 대상체이다. RECIST 1.1 기준은 예를 들어, 문헌[Eisenhauer et al., 2009, Eur. J. Cancer 45:228-24](이는 본원에 그의 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있으며, 하기에 더욱 상세히 논의된다. 실패한 항-신생물 섭생은 예를 들어, 종양 성장, 증가된 종양 부담 및/또는 종양 전이를 초래한다. 본원에 사용되는 바와 같은 실패한 항-신생물 섭생은 용량 제한 독성, 예를 들어, 독성을 야기하는 항-신생물제 또는 섭생을 사용한 치료의 지속 또는 재개를 허용할 수 없게 하는 III급 또는 IV급 독성으로 인하여 종료된 치료 섭생을 포함한다. 일 구현예에서, 대상체는 하나 이상의 항-혈관신생제의 투여를 포함하는 항-신생물 섭생을 사용한 치료에 실패한 바 있다.
실패한 항-신생물 섭생은 연장된 기간, 예를 들어, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 또는 임상적으로 정의된 치유보다 더 짧은 임의의 기간 동안 모든 표적 및 비-표적 병변에 대하여 적어도 안정한 질병을 초래하지 않는 치료 섭생을 포함한다. 실패한 항-신생물 섭생은 항-신생물제를 사용한 치료 동안 적어도 하나의 표적 병변의 진행성 질병을 초래하거나, 또는 치료 섭생의 종료 후 2주 미만, 1개월 미만, 2개월 미만, 3개월 미만, 4개월 미만, 5개월 미만, 6개월 미만, 12개월 미만, 또는 18개월 미만에 또는 임상적으로 정의된 치유보다 더 짧은 임의의 기간 미만에 진행성 질병을 초래하는 치료 섭생을 포함한다.
실패한 항-신생물 섭생은 암에 대하여 치료되는 대상체가 임상적으로 정의된 치유, 예를 들어, 치료 섭생의 종료 후 5년의 완전 반응을 달성하며, 대상체가 이후에, 예를 들어, 치료 섭생을 종료한지 5년 초과, 6년 초과, 7년 초과, 8년 초과, 9년 초과, 10년 초과, 11년 초과, 12년 초과, 13년 초과, 14년 초과 또는 15년 초과 후에 별개의 암을 갖는 것으로 진단을 받은 치료 섭생을 포함하지 않는다.
RECIST 기준은, 임상 시험에 이용하기 위하여, 고형 종양 측정에 대한 표준 접근법을 제공하고, 종양 크기 변화를 객관적으로 평가하기 위한 정의를 제공하는 데 이용되는 임상적으로 승인된 평가 기준이다. 또한, 이러한 기준은 고형 종양에 대한 치료를 받고 있는 개체의 반응을 모니터링하는 데 이용될 수 있다. RECIST 1.1 기준은 문헌[Eisenhauer et al., 2009, Eur. J. Cancer 45:228-24]에 상세히 논의되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 표적 병변에 대한 반응 기준은 다음을 포함한다:
완전 반응(CR): 모든 표적 병변이 사라짐. 임의의 병적 림프절(표적이든지 비-표적이든지)은 10 ㎜ 미만의 단축의 감소를 가져야 한다.
부분 반응(PR): 기준선 합계 직경을 참조로 하여, 표적 병변의 직경의 합의 적어도 30% 감소.
진행성 질병(PD): 연구에서 최소 합계(이는 연구에서 최소값이면 기준선 합계를 포함한다)를 참조로 하여, 표적 병변 직경 합계의 적어도 20% 증가. 20%의 상대적 증가에 더하여, 합계는 또한 적어도 5 mm의 절대치 증가를 나타내야 한다. (주의: 하나 이상의 새로운 병변의 출현도 진행으로 고려한다.)
안정한 질병(SD): 연구 중의 최소 합계 직경을 참조로 하여, PR로 확정될 만한 충분한 수축과 PD로 확정될 만한 충분한 증가가 모두 나타나지 않음.
또한, RECIST 1.1 기준은 측정 가능할 수 있는 병변으로 정의되는 비-표적 병변을 고려하나, 측정할 필요는 없으며, 원하는 시점에서 정성적으로 평가해야 할 뿐이다. 비-표적 병변에 대한 반응 기준은 다음을 포함한다:
완전 반응(CR): 모든 비-표적 병변의 소실 및 종양 마커 수준의 정규화. 모든 림프절은 크기가 비-병원성이어야 한다(10 mm 미만의 단축).
비-CR/비-PD: 하나 이상의 비-표적 병변(들)의 지속 및/또는 정상 한계 초과의 종양 마커 수준의 유지.
진행성 질병(PD): 기존의 비-표적 병변의 명백한 진행. 하나 이상의 새로운 병변의 출현도 진행으로 고려된다. 비-표적 질병을 기초로 "명백한 진행"을 달성하기 위하여, 비-표적 질병의 전체 수준에서 실질적인 악화가 존재하여, 표적 질병의 SD 또는 PR의 존재 하에서도, 전체 종양 부담이 치료를 중단할 만큼 충분히 증가한다. 하나 이상의 비-표적 병변의 크기의 적당한 "증가"는 보통은 명백한 진행 상태로 확정하기에 충분하지 않다. 그러므로, 표적 질병에서의 SD 또는 PR에 직면한, 비-표적 질병에서의 변화만을 기초로 한 전체 진행의 지정은 극히 드물 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물 및 조합 요법제는 불응성 암을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. "불응성 암"은 처음에 화학- 또는 방사선 요법에 비반응성이거나, 시간이 지나면서 화학- 또는 방사선 요법에 비반응성이 되는, 수술이 비효과적인 악성종양이다.
본 개시내용은 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 엔지니어링된 면역 세포를 투여하여, 종양 세포 성장이 저해되도록 하는 단계를 포함하는 대상체에서의 종양 세포 성장의 저해 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 암을 치료하는 것은 대조군, 예를 들어, 엔지니어링된 면역 세포로 처리되지 않은 대상체에 비하여 생존을 연장시키거나, 종양 진행까지의 시간을 연장시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 제1 용량의 엔지니어링된 면역 세포의 투여 이전에 암(예를 들어, 종양)을 갖는 것으로 확인된다. 특정 구현예에서, 대상체는 엔지니어링된 면역 세포의 처음의 투여 시에 암(예를 들어, 종양)을 갖는다.
일 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포의 투여는 암 세포의 증식의 감소, 암 세포의 전이의 감소, 종양의 혈관신생의 감소, 종양 부담의 감소, 종양 크기, 중량 또는 부피의 감소, 종양 성장의 저해, 암의 진행까지의 시간의 증가 및/또는 종양학적 장애를 갖는 대상체의 생존 시간의 연장 중 하나 이상을 초래한다. 특정 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포의 투여는 엔지니어링된 면역 세포를 투여하지 않은 상응하는 대조군 대상체에 비하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% 또는 500%만큼, 암 세포의 증식을 감소시키고/시키거나, 암 세포의 전이를 감소시키고/시키거나, 종양의 혈관신생을 감소시키고/시키거나, 종양 부담을 감소시키고/시키거나, 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나, 대상체의 생존 시간을 연장한다. 특정 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포의 투여는 엔지니어링된 면역 세포를 투여하지 않은 종양학적 장애에 걸린 상응하는 대조군 대상체의 집단에 비하여, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% 또는 500%만큼, 암 세포의 증식을 감소시키고/시키거나, 암 세포의 전이를 감소시키고/시키거나, 종양의 혈관신생을 감소시키고/시키거나, 종양 부담을 감소시키고/시키거나, 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나, 종양학적 장애에 걸린 대상체의 집단의 생존 시간을 연장한다. 일부 구현예에서, 암 세포의 증식은 대상체에게 투여된 암 요법으로 인한 암 세포의 과증식이다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포의 투여는 치료 이전에 진행성 종양학적 장애를 갖는 대상체에서 종양학적 장애를 안정화시킨다.
본 발명의 엔지니어링된 면역 세포와 하나 이상의 추가 치료제의 조합 요법
용어 "조합하여 투여하는", "조합 요법", "동시-투여하는" 또는 "동시-투여"는 하나 이상의 추가의 치료제와 조합된, 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포, 즉, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포의 투여를 지칭할 수 있다. 하나 이상의 추가의 치료제는 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포의 투여 이전에, 이와 동시에 또는 이와 실질적으로 동시에, 이후에 또는 이와 간헐적으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 엔지니어링된 면역 세포의 투여 이전에 투여된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 엔지니어링된 면역 세포와 동시에 투여된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 엔지니어링된 면역 세포의 투여 이후에 투여된다.
하나 이상의 추가의 치료제 및 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포는 상가적으로 또는 상승적으로 작용한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제와 엔지니어링된 면역 세포는 상승적으로 작용한다. 일부 구현예에서, 종양학적 장애 또는 감염의 치료에 상승적 효과가 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제와 엔지니어링된 면역 세포의 조합은 암에 대한 면역 반응의 지속성을 개선시키며, 즉, 이의 기간을 연장한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제와 엔지니어링된 면역 세포는 상가적으로 작용한다.
1. 면역 체크포인트 조절제
일부 구현예에서, 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포와 조합하여 투여되는 추가의 치료제는 면역 체크포인트 분자의 면역 체크포인트 조절제이다. 면역 체크포인트 분자의 예에는 LAG-3(Triebel et al., 1990, J. Exp. Med. 171: 1393-1405), TIM-3(Sakuishi et al., 2010, J. Exp. Med. 207: 2187-2194), VISTA(Wang et al., 2011, J. Exp. Med. 208: 577-592), ICOS(Fan et al., 2014, J. Exp. Med. 211: 715-725), OX40(Curti et al., 2013, Cancer Res. 73: 7189-7198) 및 4-1BB(Melero et al., 1997, Nat. Med. 3: 682-685)가 포함된다.
면역 체크포인트는 자극성 면역 체크포인트(즉, 면역 반응을 자극하는 분자) 또는 저해성 면역 체크포인트(즉, 면역 반응을 저해하는 분자)일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 저해성 면역 체크포인트의 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 자극성 면역 체크포인트의 효능제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 면역 체크포인트 결합 단백질(예를 들어, 항체, 항체 Fab 단편, 이가 항체, 항체 약물 컨쥬게이트, scFv, 융합 단백질, 2가 항체 또는 4가 항체)이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 1가지 초과의 면역 체크포인트에 결합하거나, 그의 활성을 조절할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 자극성 및 저해성 면역 체크포인트, 및 이들 면역 체크포인트를 조절하는 분자의 예는 하기에 제공되어 있다.
i. 자극성 면역 체크포인트 분자
CD27은 나이브 T 세포의 항원-특이적 증식을 지원하며, T 세포 기억의 생성을 위하여 필수적이다(예를 들어, 문헌[Hendriks et al. (2000) Nat. Immunol. 171 (5): 433-40] 참조). CD27은 또한, B 세포의 기억 마커이다(예를 들어, 문헌[Agematsu et al. (2000) Histol. Histopathol. 15 (2): 573-6] 참조). CD27 활성은 림프구 및 수지상 세포 상의 그의 리간드, CD70의 일시적인 이용 가능성에 의해 결정된다(예를 들어, 문헌[Borst et al. (2005) Curr. Opin. Immunol. 17 (3): 275-81] 참조). CD27에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD27의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD27에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-CD27 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD27 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD27 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD27-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 바를릴루맙(varlilumab)(셀덱스 테라퓨틱스(Celldex Therapeutics))이다. 추가의 CD27-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,248,183호, 제9,102,737호, 제9,169,325호, 제9,023,999호, 제8,481,029호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0185870호, 제2015/0337047호, 제2015/0299330호, 제2014/0112942호, 제2013/0336976호, 제2013/0243795호, 제2013/0183316호, 제2012/0213771호, 제2012/0093805호, 제2011/0274685호, 제2010/0173324호; 및 PCT 공개 제WO 2015/016718호, 제WO 2014/140374호, 제WO 2013/138586호, 제WO 2012/004367호, 제WO 2011/130434호, 제WO 2010/001908호 및 제WO 2008/051424호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
CD28. 분화 클러스터 28(CD28)은 T 세포 활성화 및 생존에 필요한 공동-자극 신호를 제공하는 T 세포 상에서 발현되는 단백질 중 하나이다. T-세포 수용체(TCR)에 더하여 CD28을 통한 T 세포 자극은 다양한 인터류킨(특히 IL-6)의 생산을 위한 강력한 신호를 제공할 수 있다. 수지상 세포 상에서 발현되는 그의 2개의 리간드, CD80 및 CD86과의 결합은 T 세포 증식을 촉진시킨다(예를 들어, 문헌[Prasad et al. (1994) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91(7): 2834-8] 참조). CD28에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD28의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD28에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-CD28 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD28 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD28 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD28-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TAB08(테라맙 엘엘씨(TheraMab LLC)), 룰리주맙(lulizumab)(BMS-931699로도 알려져 있음, 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)) 및 FR104(오에스이 이뮤노테라퓨틱스(OSE Immunotherapeutics))로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 CD28-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,119,840호, 제8,709,414호, 제9,085,629호, 제8,034,585호, 제7,939,638호, 제8,389,016호, 제7,585,960호, 제8,454,959호, 제8,168,759호, 제8,785,604호, 제7,723,482호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0017039호, 제2015/0299321호, 제2015/0150968호, 제2015/0071916호, 제2015/0376278호, 제2013/0078257호, 제2013/0230540호, 제2013/0078236호, 제2013/0109846호, 제2013/0266577호, 제2012/0201814호, 제2012/0082683호, 제2012/0219553호, 제2011/0189735호, 제2011/0097339호, 제2010/0266605호, 제2010/0168400호, 제2009/0246204호, 제2008/0038273호; 및 PCT 공개 제WO 2015198147호, 제WO 2016/05421호, 제WO 2014/1209168호, 제WO 2011/101791호, 제WO 2010/007376호, 제WO 2010/009391호, 제WO 2004/004768호, 제WO 2002/030459호, 제WO 2002/051871호 및 제WO 2002/047721호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
CD40. 분화 클러스터 40(CD40, TNFRSF5로도 알려져 있음)은 항원 제시 세포를 포함하는 다양한 면역계 세포 상에서 관찰된다. 다르게는 CD154로 알려져 있는 CD40L은 CD40의 리간드이며, 활성화된 CD4+ T 세포의 표면 상에서 일시적으로 발현된다. CD40 신호전달은 수지상 세포가 성숙하는 것을 '인가'함으로써 T-세포 활성화 및 분화를 촉발시키는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 문헌[O'Sullivan et al. (2003) Crit. Rev. Immunol. 23 (1): 83-107] 참조). CD40에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD40의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD40에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-CD40 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD40 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD40 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 다세투주맙(dacetuzumab)(제넨테크(Genentech)/시애틀 지네틱스(Seattle Genetics)), CP-870,893(화이자(Pfizer)), 블레셀루맙(bleselumab)(아스텔라스 파마(Astellas Pharma)), 루카투무맙(lucatumumab)(노바티스(Novartis)), CFZ533(노바티스; 예를 들어, 문헌[Cordoba et al. (2015) Am. J. Transplant. 15(11): 2825-36] 참조), RG7876(제넨테크 인코포레이티드(Genentech Inc.)), FFP104(판제네틱스, 비.브이.(PanGenetics, B.V.)), APX005(아펙시젠(Apexigen)), BI 655064(뵈링거 인겔하임(Boehringer Ingelheim)), Chi Lob 7/4(캔서 리서치 유케이(Cancer Research UK); 예를 들어, 문헌[Johnson et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21(6): 1321-8] 참조), ADC-1013(바이오인벤트 인터내셔널(BioInvent International)), SEA-CD40(시애틀 제네틱스), XmAb 5485(젠코르(Xencor)), PG120(판제네틱스 비.브이.), 테넬릭시맙(teneliximab)(브리스톨-마이어스 스큅; 예를 들어, 문헌[Thompson et al. (2011) Am. J. Transplant. 11(5): 947-57] 참조) 및 AKH3(비오겐(Biogen); 예를 들어, 국제 공개 제WO 2016/028810호)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD40-결합 단백질이다. 추가의 CD40-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,234,044호, 제9,266,956호, 제9,109,011호, 제9,090,696호, 제9,023,360, 제9,023,361호, 제9,221,913호, 제8,945,564호, 제8,926,979호, 제8,828,396호, 제8,637,032호, 제8,277,810호, 제8,088,383호, 제7,820,170호, 제7,790,166호, 제7,445,780호, 제7,361,345호, 제8,961,991호, 제8,669,352호, 제8,957,193호, 제8,778,345호, 제8,591,900호, 제8,551,485호, 제8,492,531호, 제8,362,210호, 제8,388,971호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0045597호, 제2016/0152713호, 제2016/0075792호, 제2015/0299329호, 제2015/0057437호 제2015/0315282호, 제2015/0307616호, 제2014/0099317호, 제2014/0179907호, 제2014/0349395호, 제2014/0234344호, 제2014/0348836호, 제2014/0193405호, 제2014/0120103호, 제2014/0105907호, 제2014/0248266호, 제2014/0093497호, 제2014/0010812호, 제2013/0024956호, 제2013/0023047호, 제2013/0315900호, 제2012/0087927호, 제2012/0263732호, 제2012/0301488호, 제2011/0027276호, 제2011/0104182호, 제2010/0234578호, 제2009/0304687호, 제2009/0181015호, 제2009/0130715호, 제2009/0311254호, 제2008/0199471호, 제2008/0085531호, 제2016/0152721호, 제2015/0110783호, 제2015/0086991호, 제2015/0086559호, 제2014/0341898호, 제2014/0205602호, 제2014/0004131호, 제2013/0011405호, 제2012/0121585호, 제2011/0033456호, 제2011/0002934호, 제2010/0172912호, 제2009/0081242호, 제2009/0130095호, 제2008/0254026호, 제2008/0075727호, 제2009/0304706호, 제2009/0202531호, 제2009/0117111호, 제2009/0041773호, 제2008/0274118호, 제2008/0057070호, 제2007/0098717호, 2007/0218060호, 제2007/0098718호, 제2007/0110754호; 및 PCT 공개 제WO 2016/069919호, 제WO 2016/023960호, 제WO 2016/023875호, 제WO 2016/028810호, 제WO 2015/134988호, 제WO 2015/091853호, 제WO 2015/091655호, 제WO 2014/065403호, 제WO 2014/070934호, 제WO 2014/065402호, 제WO 2014/207064호, 제WO 2013/034904호, 제WO 2012/125569호, 제WO 2012/149356호, 제WO 2012/111762호, 제WO 2012/145673호, 제WO 2011/123489호, 제WO 2010/123012호, 제WO 2010/104761호, 제WO 2009/094391호, 제WO 2008/091954호, 제WO 2007/129895호, 제WO 2006/128103호, 제WO 2005/063289호, 제WO 2005/063981호, 제WO 2003/040170호, 제WO 2002/011763호, 제WO 2000/075348호, 제WO 2013/164789호, 제WO 2012/075111호, 제WO 2012/065950호, 제WO 2009/062054호, 제WO 2007/124299호, 제WO 2007/053661호, 제WO 2007/053767호, 제WO 2005/044294호, 제WO 2005/044304호, 제WO 2005/044306호, 제WO 2005/044855호, 제WO 2005/044854호, 제WO 2005/044305호, 제WO 2003/045978호, 제WO 2003/029296호, 제WO 2002/028481호, 제WO 2002/028480호, 제WO 2002/028904호, 제WO 2002/028905호, 제WO 2002/088186호 및 제WO 2001/024823호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
OX40. OX40 수용체(CD134로도 알려져 있음)는 이펙터 및 기억 T 세포의 증식을 촉진시킨다. OX40은 또한, T-조절 세포의 분화 및 활성을 억제하며, 사이토카인 생산을 조절한다(예를 들어, 문헌[Croft et al. (2009) Immunol. Rev. 229(1): 173-91] 참조). OX40에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 OX40의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 OX40에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-OX40 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 OX40 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 OX40 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 MEDI6469(아고녹스(AgonOx)/메드이뮨(Medimmune)), 포갈리주맙(pogalizumab)(MOXR0916 및 RG7888로도 알려져 있음; 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)), 타볼릭시주맙(tavolixizumab)(MEDI0562로도 알려져 있음; 메드이뮨) 및 GSK3174998(글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline))로 이루어진 군으로부터 선택되는 OX40-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 추가의 OX-40-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,163,085호, 제9,040,048호, 제9,006,396호, 제8,748,585호, 제8,614,295호, 제8,551,477호, 제8,283,450호, 제7,550,140호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0068604호, 제2016/0031974호, 제2015/0315281호, 제2015/0132288호, 제2014/0308276호, 제2014/0377284호, 제2014/0044703호, 제2014/0294824호, 제2013/0330344호, 제2013/0280275호, 제2013/0243772호, 제2013/0183315호, 제2012/0269825호, 제2012/0244076호, 제2011/0008368호, 제2011/0123552호, 제2010/0254978호, 제2010/0196359호, 제2006/0281072호; 및 PCT 공개 제WO 2014/148895호, 제WO 2013/068563호, 제WO 2013/038191호, 제WO 2013/028231호, 제WO 2010/096418호, 제WO 2007/062245호 및 제WO 2003/106498호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
GITR. 글루코코르티코이드-유도된 TNFR 과 관련 유전자(GITR)는 Treg, CD4 및 CD8 T 세포 상에서 구성적으로 또는 조건적으로 발현되는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 상과의 구성원이다. GITR은 TCR 라이게이션 및 활성화 이후 이펙터 T 세포 상에서 신속하게 상향조절된다. 인간 GITR 리간드(GITRL)는 이차 림프계 기관 및 일부 비림프계 조직 내의 APC 상에서 구성적으로 발현된다. GITR:GITRL 상호작용의 다운스트림 효과는 Treg 활성의 약화를 유도하고, CD4+ T 세포 활성을 향상시켜, Treg-매개의 면역억제의 역전 및 증가된 면역 자극을 초래한다. GITR에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 GITR의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 GITR에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-GITR 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 GITR 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 GITR 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TRX518(리프 테라퓨틱스(Leap Therapeutics)), MK-4166(머크 앤드 컴퍼니(Merck & Co.)), MEDI-1873(메드이뮨), INCAGN1876(아제누스(Agenus)/인사이트(Incyte)) 및 FPA154(파이브 프라임 테라퓨틱스(Five Prime Therapeutics))로 이루어진 군으로부터 선택되는 GITR-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 추가의 GITR-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,309,321호, 제9,255,152호, 제9,255,151호, 제9,228,016호, 제9,028,823호, 제8,709,424호, 제8,388,967호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0145342호, 제2015/0353637호, 제2015/0064204호, 제2014/0348841호, 제2014/0065152호, 제2014/0072566호, 제2014/0072565호, 제2013/0183321호, 제2013/0108641호, 제2012/0189639호; 및 PCT 공개 제WO 2016/054638호, 제WO 2016/057841호, 제WO 2016/057846호, 제WO 2015/187835호, 제WO 2015/184099호, 제WO 2015/031667호, 제WO 2011/028683호 및 제WO 2004/107618호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
ICOS. 유도성 T-세포 공동자극인자(ICOS, CD278로도 알려져 있음)는 활성화된 T 세포 상에서 발현된다. 그의 리간드는 ICOSL이며, 이는 주로 B 세포 및 수지상 세포 상에서 발현된다. ICOS는 T 세포 이펙터 기능에 중요하다. ICOS 발현은 T 세포 활성화 시에 상향-조절된다(예를 들어, 문헌[Fan et al. (2014) J. Exp. Med. 211(4): 715-25] 참조). ICOS에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 ICOS의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 ICOS에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-ICOS 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 ICOS 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 ICOS 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 MEDI-570(JMab-136으로도 알려져 있음, 메드이뮨), GSK3359609(글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)/INSERM) 및 JTX-2011(조운스 테라퓨틱스(Jounce Therapeutics))로 이루어진 군으로부터 선택되는 ICOS-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 추가의 ICOS-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,376,493호, 제7,998,478호, 제7,465,445호, 제7,465,444호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0239978호, 제2012/0039874호, 제2008/0199466호, 제2008/0279851호; 및 PCT 공개 제WO 2001/087981호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
4-1BB. 4-1BB(CD137로도 알려져 있음)는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 상과의 구성원이다. 4-1BB(CD137)는 II형 막횡단 당단백질이며, 이는 프라이밍된 CD4+ 및 CD8+ T 세포, 활성화된 NK 세포, DC 및 호중구 상에서 유도적으로 발현되며, 활성화된 대식구, B 세포 및 DC 상에서 관찰되는 4-1BB 리간드(4-1BBL)에 결합되는 경우 T 세포 공동자극 분자로서 작용한다. 4-1BB 수용체의 라이게이션은 NF-κB, c-Jun 및 p38 신호전달 경로의 활성화를 야기하며, 구체적으로 항아폽토시스 유전자 BcL-x(L) 및 Bfl-1의 발현을 상향조절함으로써 CD8+ T 세포의 생존을 촉진시키는 것으로 나타난 바 있다. 이 방식으로, 4-1BB는 준최적의 면역 반응을 부스팅하거나, 심지어 구제하는 역할을 한다. 4-1BB에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 4-1BB의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 4-1BB에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-4-1BB 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 4-1BB 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 4-1BB 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 4-1BB-결합 단백질이며, 이는 우렐루맙(urelumab)(BMS-663513으로도 알려져 있음; 브리스톨-마이어스 스큅) 또는 우토밀루맙(utomilumab)(화이자)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 4-1BB-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 4-1BB-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,382,328호, 제8,716,452호, 제8,475,790호, 제8,137,667호, 제7,829,088호, 제7,659,384호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0083474호, 제2016/0152722호, 제2014/0193422호, 제2014/0178368호, 제2013/0149301호, 제2012/0237498호, 제2012/0141494호, 제2012/0076722호, 2011/0177104호, 제2011/0189189호, 제2010/0183621호, 제2009/0068192호, 제2009/0041763호, 2008/0305113호, 제2008/0008716호; 및 PCT 공개 제WO 2016/029073호, 제WO 2015/188047호, 제WO 2015/179236호, 제WO 2015/119923호, 제WO 2012/032433호, 제WO 2012/145183호, 제WO 2011/031063호, 제WO 2010/132389호, 제WO 2010/042433호, 제WO 2006/126835호, 제WO 2005/035584호, 제WO 2004/010947호; 및 문헌[Martinez-Forero et al. (2013) J. Immunol. 190(12): 6694-706] 및 문헌[Dubrot et al. (2010) Cancer Immunol. Immunother. 59(8): 1223-33]에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
ii. 저해성 면역 체크포인트 분자
ADORA2A. 아데노신 A2A 수용체(A2A4)는 7개의 막횡단 알파 나선을 보유하는 G-단백질-커플링된 수용체(GPCR) 과의 구성원이며, 암 요법에서 중요한 체크포인트로서 간주된다. A2A 수용체는 과반응성 면역 세포를 음성적으로 조절할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ohta et al. (2001) Nature 414(6866): 916-20] 참조). ADORA2A에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 ADORA2A의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 ADORA2A에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-ADORA2A 항체)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 ADORA2A-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 ADORA2A 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 ADORA2A 길항제이다. ADORA2A-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2014/0322236호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
B7-H3. B7-H3(CD276으로도 알려져 있음)은 B7 상과, 즉, T-세포 반응을 공동자극하거나 하향-조절하는 분자의 군에 속한다. B7-H3은 인간 T-세포 반응을 강력하게, 그리고 지속적으로 하향-조절한다(예를 들어, 문헌[Leitner et al. (2009) Eur. J. Immunol. 39(7): 1754-64] 참조). B7-H3에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 B7-H3의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 B7-H3에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-B7-H3 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 B7-H3 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 B7-H3 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 DS-5573(다이치 산교, 인코포레이티드(Daiichi Sankyo, Inc.)), 에노블리투주맙(enoblituzumab)(마크로제닉스, 인코포레이티드(MacroGenics, Inc.)) 및 8H9(슬로안 케터링 인스티튜트 포 캔서 리서치(Sloan Kettering Institute for Cancer Research); 예를 들어, 문헌[Ahmed et al. (2015) J. Biol. Chem. 290(50): 30018-29] 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-B7-H3-결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 B7-H3-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. B7-H3-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,371,395호, 제9,150,656호, 제9,062,110호, 제8,802,091호, 제8,501,471호, 제8,414,892호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0352224호, 제2015/0297748호, 제2015/0259434호, 제2015/0274838호, 제2014/032875호, 제2014/0161814호, 제2013/0287798호, 제2013/0078234호, 제2013/0149236호, 제2012/02947960호, 제2010/0143245호, 제2002/0102264호; PCT 공개 제WO 2016/106004호, 제WO 2016/033225호, 제WO 2015/181267호, 제WO 2014/057687호, 제WO 2012/147713호, 제WO 2011/109400호, 제WO 2008/116219호, 제WO 2003/075846호, 제WO 2002/032375호; 및 문헌[Shi et al. (2016) Mol. Med. Rep. 14(1): 943-8]에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
B7-H4. B7-H4(O8E, OV064 및 V-세트 도메인-함유 T-세포 활성화 저해제(VTCN1)로도 알려져 있음)는 B7 상과에 속한다. T 세포의 B7-H4 라이게이션은 세포 주기를 정지시킴으로써, 성장, 사이토카인 분비 및 세포독성의 발생에 극심한 저해 효과를 갖는다. 마우스 내로의 B7-H4Ig의 투여는 항원-특이적 T 세포 반응을 손상시키는 반면, 특이적인 모노클로널 항체에 의한 내인성 B7-H4의 차단은 T 세포 반응을 촉진시킨다(예를 들어, 문헌[Sica et al. (2003) Immunity 18(6): 849-61] 참조). B7-H4에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 B7-H4의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 B7-H4에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-B7-H4 항체)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 B7-H4-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 B7-H4 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 B7-H4 길항제이다. B7-H4-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,296,822호, 제8,609,816호, 제8,759,490호, 제8,323,645호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0159910호, 제2016/0017040호, 제2016/0168249호, 제2015/0315275호, 제2014/0134180호, 제2014/0322129호, 제2014/0356364호, 제2014/0328751호, 제2014/0294861호, 제2014/0308259호, 제2013/0058864호, 제2011/0085970호, 제2009/0074660호, 제2009/0208489호; 및 PCT 공개 제WO 2016/040724호, 제WO 2016/070001호, 제WO 2014/159835호, 제WO 2014/100483호, 제WO 2014/100439호, 제WO 2013/067492호, 제WO 2013/025779호, 제WO 2009/073533호, 제WO 2007/067991호 및 제WO 2006/104677호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
BTLA. CD272로도 알려져 있는 B 및 T 림프구 약화인자(Attenuator)(BTLA)는 그의 리간드로서 HVEM(헤르페스바이러스 유입 매개체)을 갖는다. BTLA의 표면 발현은 나이브(naive)로부터 이펙터 세포 표현형으로의 인간 CD8+ T 세포의 분화 동안 점차 하향조절되지만, 종양-특이적 인간 CD8+ T 세포는 높은 수준의 BTLA를 발현한다(예를 들어, 문헌[Derre et al. (2010) J. Clin. Invest. 120 (1): 157-67] 참조). BTLA에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 BTLA의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 BTLA에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-BTLA 항체)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 BTLA-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 BTLA 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 BTLA 길항제이다. BTLA-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,346,882호, 제8,580,259호, 제8,563,694호, 제8,247,537호; 미국 특허 출원 공개 제2014/0017255호, 제2012/0288500호, 제2012/0183565호, 제2010/0172900호; 및 PCT 공개 제WO 2011/014438호 및 제WO 2008/076560호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
CTLA-4. 세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4)는 면역 조절 CD28-B7 면역글로불린 상과의 구성원이며, B7-의존적 및 B7-독립적 경로 둘 모두를 통하여 면역억제를 촉진시키도록 나이브 및 휴지 T 림프구 상에서 작용한다(예를 들어, 문헌[Kim et al. (2016) J. Immunol. Res., 14] 참조). CTLA-4는 소위 CD152로도 알려져 있다. CTLA-4는 T 세포 활성화에 대한 임계값을 조절한다. 예를 들어, 문헌[Gajewski et al. (2001) J. Immunol. 166(6): 3900-7]을 참조한다. CTLA-4에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-CTLA-4 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CTLA-4 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CTLA-4 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 이필리무맙(예르보이(Yervoy); 메다렉스(Medarex)/브리스톨-마이어스 스큅), 트레멜리무맙(이전에 티실리무맙(ticilimumab); 화이자/아스트라제네카(AstraZeneca)), JMW-3B3(유니버시티 오브 아베르딘(University of Aberdeen)) 및 AGEN1884(아제누스)로 이루어진 군으로부터 선택되는 CTLA-4-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 추가의 CTLA-4 결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제8,697,845호; 미국 특허 출원 공개 제2014/0105914호, 제2013/0267688호, 제2012/0107320호, 제2009/0123477호; 및 PCT 공개 제WO 2014/207064호, 제WO 2012/120125호, 제WO 2016/015675호, 제WO 2010/097597호, 제WO 2006/066568호 및 제WO 2001/054732호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
KIR. 살해 면역글로불린-유사 수용체(KIR)는 세포를 NK-매개의 세포 용해로부터 보호하는 자연 살해(NK) 세포 기능을 음성적으로 조절하는 다양한 레퍼토리의 MHCI 결합 분자를 포함한다. KIR은 일반적으로 NK 세포 상에서 발현되지만, 종양 특이적 CTL 상에서도 검출된 바 있다. KIR에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 KIR의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 KIR에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-KIR 항체)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 KIR-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 KIR 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 KIR 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 리릴루맙(lirilumab)(BMS-986015로도 알려져 있음; 브리스톨-마이어스 스큅)이다. 추가의 KIR 결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제8,981,065호, 제9,018,366호, 제9,067,997호, 제8,709,411호, 제8,637,258호, 제8,614,307호, 제8,551,483호, 제8,388,970호, 제8,119,775호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0344576호, 제2015/0376275호, 제2016/0046712호, 제2015/0191547호, 제2015/0290316호, 제2015/0283234호, 제2015/0197569호, 제2014/0193430호, 제2013/0143269호, 제2013/0287770호, 2012/0208237호, 제2011/0293627호, 제2009/0081240호, 제2010/0189723호; 및 PCT 공개 제WO 2016/069589호, 제WO 2015/069785호, 제WO 2014/066532호, 제WO 2014/055648호, 제WO 2012/160448호, 제WO 2012/071411호, 제WO 2010/065939호, 제WO 2008/084106호, 제WO 2006/072625호, 제WO 2006/072626호 및 제WO 2006/003179호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
LAG-3, 림프구-활성화 유전자 3(LAG-3, CD223으로도 알려져 있음)은 CD4-관련 막횡단 단백질이며, 이는 MHC II에 경쟁적으로 결합하며, T 세포 활성화를 위한 공동-저해성 체크포인트로서 작용한다(예를 들어, 문헌[Goldberg and Drake (2011) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 344: 269-78] 참조). LAG-3에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 LAG-3의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 LAG-3에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-PD-1 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 LAG-3 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 LAG-3 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 펨브롤리주맙(케이트루다(Keytruda); 이전에 람브롤리주맙(lambrolizumab); 머크 앤드 컴퍼니, 인코포레이티드), 니볼루맙(오프디보(Opdivo); 브리스톨-마이어스 스큅), 피딜리주맙(CT-011, 큐어테크(CureTech)), SHR-1210(인사이트/지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니, 리미티드(Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.)), MEDI0680(AMP-514로도 알려져 있음; 앰플이뮨 인코포레이티드(Amplimmune Inc.)/메드이뮨), PDR001(노바티스), BGB-A317(베이진 리미티드(BeiGene Ltd.)), TSR-042(ANB011로도 알려져 있음; 아납티스바이오(AnaptysBio)/테사로, 인코포레이티드(Tesaro, Inc.)), REGN2810(리제네론 파마슈티컬즈, 인코포레이티드(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)/사노피-아벤티스(Sanofi-Aventis)) 및 PF-06801591(화이자)로 이루어진 군으로부터 선택되는 LAG-3-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 추가의 PD-1-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,181,342호, 제8,927,697호, 제7,488,802호, 제7,029,674호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0152180호, 제2011/0171215호, 제2011/0171220호; 및 PCT 공개 제WO 2004/056875호, 제WO 2015/036394호, 제WO 2010/029435호, 제WO 2010/029434호, 제WO 2014/194302호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
PD-1. 세포 예정사 단백질 1(PD-1, CD279 및 PDCD1로도 알려져 있음)은 면역계를 음성적으로 조절하는 저해성 수용체이다. 주로 나이브 T 세포에 영향을 미치는 CTLA-4와 대조적으로, PD-1은 면역 세포 상에서 더욱 광범위하게 발현되며, 주변 조직에서, 그리고 종양 미세환경에서, 성숙 T 세포 활성을 조절한다. PD-1은 T 세포 수용체 신호전달을 간섭함으로써 T 세포 반응을 저해한다. PD-1은 2가지 리간드, PD-L1 및 PD-L2를 갖는다. PD-1에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-1의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-1에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-PD-1 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 PD-1 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 PD-1 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 펨브롤리주맙(케이트루다; 이전에 람브롤리주맙; 머크 앤드 컴퍼니, 인코포레이티드), 니볼루맙(오프디보; 브리스톨-마이어스 스큅), 피딜리주맙(CT-011, 큐어테크), SHR-1210(인사이트/지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니, 리미티드), MEDI0680(AMP-514로도 알려져 있음; 앰플이뮨 인코포레이티드/메드이뮨), PDR001(노바티스), BGB-A317(베이진 리미티드), TSR-042(ANB011로도 알려져 있음; 아납티스바이오/테사로, 인코포레이티드), REGN2810(리제네론 파마슈티컬즈, 인코포레이티드/사노피-아벤티스) 및 PF-06801591(화이자)로 이루어진 군으로부터 선택되는 PD-1-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 추가의 PD-1-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,181,342호, 제8,927,697호, 제7,488,802호, 제7,029,674호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0152180호, 제2011/0171215호, 제2011/0171220호; 및 PCT 공개 제WO 2004/056875호, 제WO 2015/036394호, 제WO 2010/029435호, 제WO 2010/029434호, 제WO 2014/194302호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
PD-L1/PD-L2. PD 리간드 1(PD-L1, B7-H1로도 알려져 있음) 및 PD 리간드 2(PD-L2, PDCD1LG2, CD273 및 B7-DC로도 알려져 있음)는 PD-1 수용체에 결합한다. 두 리간드 모두는 CD28 및 CTLA-4와 상호작용하는 B7-1 및 B7-2 단백질과 동일한 B7 과에 속한다. PD-L1은 예를 들어, 상피 세포, 내피 세포 및 면역 세포를 포함하는 많은 세포 유형 상에서 발현될 수 있다. PDL-1의 라이게이션은 IFNγ, TNFα 및 IL-2 생산을 감소시키며, 감소된 T 세포 반응성 및 증식뿐 아니라 항원-특이적 T 세포 아네르기와 관련된 항-염증성 사이토카인인 IL10의 생산을 자극한다. PDL-2는 대부분 항원 제시 세포(APC) 상에서 발현된다. PDL2 라이게이션은 또한 T 세포 억제를 초래하지만, PDL-1-PD-1 상호작용이 G1/G2 단계에서 세포 주기 정지를 통하여 증식을 저해하는 경우, PDL2-PD-1 결합은 낮은 항원 농도에서 B7:CD28 신호를 차단하고, 높은 항원 농도에서 사이토카인 생산을 감소시킴으로써 TCR-매개의 신호전달을 저해하는 것으로 나타났다. PD-L1 및 PD-L2에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-L1의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-L1에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-PD-L1 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 PD-L1 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 PD-L1 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 두발루맙(MEDI-4736으로도 알려져 있음; 아스트라제네카(AstraZeneca)/셀진 코포레이션(Celgene Corp.)/메드이뮨), 아테졸리주맙(티센트릭(Tecentriq); MPDL3280A 및 RG7446으로도 알려져 있음; 제네테크 인코포레이티드(Genetech Inc.)), 아벨루맙(MSB0010718C로도 알려져 있음; 머크 세로노(Merck Serono)/아스트라제네카); MDX-1105(메다렉스(Medarex)/브리스톨-마이어스 스큅), AMP-224(앰플이뮨(Amplimmune), 글락소스미스클라인), LY3300054(일리 릴리 앤드 컴퍼니(Eli Lilly and Co.))로 이루어진 군으로부터 선택되는 PD-L1-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 Fc-융합 단백질)이다. 추가의 PD-L1-결합 단백질은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2016/0084839호, 제2015/0355184호, 제2016/0175397호 및 PCT 공개 제WO 2014/100079호, 제WO 2016/030350호, 제WO2013181634호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-L2의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-L2에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-PD-L2 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 PD-L2 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 PD-L2 길항제이다. PD-L2-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,255,147호, 제8,188,238호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0122431호, 제2013/0243752호, 제2010/0278816호, 제2016/0137731호, 제2015/0197571호, 제2013/0291136호, 제2011/0271358호; 및 PCT 공개 제WO 2014/022758호 및 제WO 2010/036959호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
TIM-3. T 세포 면역글로불린 뮤신 3(TIM-3, A형 간염 바이러스 세포 수용체(HAVCR2)로도 알려져 있음)은 S-형 렉틴 갈렉틴-9(Gal-9)에 결합하는 I형 당단백질 수용체이다. TIM-3은, 림프구, 간, 소장, 흉선, 신장, 비장, 폐, 근육, 망상적혈구 및 뇌 조직 상에서 광범위하게 발현되는 리간드이다. Tim-3은 원래 IFN-γ 분비 Th1 및 Tc1 세포 상에서 선택적으로 발현되는 것으로 확인되었다(Monney et al. (2002) Nature 415: 536-41). TIM-3 수용체에 의한 Gal-9의 결합은 다운스트림 신호전달을 촉발시켜, T 세포 생존 및 기능을 음성적으로 조절한다. TIM-3에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TIM-3의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TIM-3에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-TIM-3 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 TIM-3 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 TIM-3 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TSR-022(아납티스바이오(AnaptysBio)/테사로, 인코포레이티드(Tesaro, Inc.)) 및 MGB453(노바티스(Novartis))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-TIM-3 항체이다. 추가의 TIM-3 결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,103,832호, 제8,552,156호, 제8,647,623호, 제8,841,418호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0200815호, 제2015/0284468호, 제2014/0134639호, 제2014/0044728호, 제2012/0189617호, 제2015/0086574호, 제2013/0022623호; 및 PCT 공개 제WO 2016/068802호, 제WO 2016/068803호, 제WO 2016/071448호, 제WO 2011/155607호 및 제WO 2013/006490호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
VISTA. T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA, 혈소판 수용체 Gi24로도 알려져 있음)는 T 세포 반응을 음성적으로 조절하는 Ig 상과 리간드이다. 예를 들어, 문헌[Wang et al., 2011, J. Exp. Med. 208: 577-92]을 참조한다. APC 상에서 발현되는 VISTA는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식 및 사이토카인 생산을 직접적으로 억제한다(Wang et al. (2010) J Exp Med. 208(3): 577-92). VISTA에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 VISTA의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 VISTA에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-VISTA 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 VISTA 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 VISTA 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TSR-022(아납티스바이오/테사로, 인코포레이티드) 및 MGB453(노바티스)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VISTA-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. VISTA-결합 단백질(예를 들어, 항체)이 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2016/0096891호, 제2016/0096891호; 및 PCT 공개 제WO 2014/190356호, 제WO 2014/197849호, 제WO 2014/190356호 및 제WO 2016/094837호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
적어도 하나의 면역 체크포인트 조절제와 조합하여 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포를 대상체에게 투여함으로써 종양학적 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 대상체의 면역 반응을 자극한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 자극성 면역 체크포인트(예를 들어, CD27, CD28, CD40, OX40, GITR, ICOS, 또는 4-1BB)의 발현 또는 활성을 자극하거나 증가시킨다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 저해성 면역 체크포인트(예를 들어, A2A4, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 또는 VISTA)의 발현 또는 활성을 저해하거나 감소시킨다.
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD27, CD28, CD40, OX40, GITR, ICOS, 4-1BB, A2A4, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 및 VISTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 분자를 표적화한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD27, CD28, CD40, OX40, GITR, ICOS, 4-1BB, A2A4, B7-H3, B7-H4, BTLA, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 및 VISTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 분자를 표적화한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4, PD-L1 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 분자를 표적화한다. 추가의 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-L1 및 PD-1로부터 선택되는 면역 체크포인트 분자를 표적화한다.
일부 구현예에서, 1가지 초과의(예를 들어, 2, 3, 4, 5가지 또는 그 이상의) 면역 체크포인트 조절제가 대상체에게 투여된다. 1가지 초과의 면역 체크포인트 조절제가 투여되는 경우, 조절제는 각각 자극성 면역 체크포인트 분자를 표적화할 수 있거나, 또는 각각 저해성 면역 체크포인트 분자를 표적화할 수 있다. 다른 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 자극성 면역 체크포인트를 표적화하는 적어도 하나의 조절제 및 저해성 면역 체크포인트 분자를 표적화하는 적어도 하나의 면역 체크포인트 조절제를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 결합 단백질, 예를 들어, 항체이다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "결합 단백질"은 표적 분자, 예를 들어, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 항체 또는 그의 항원 결합 부분이며, 표적 분자는 면역 체크포인트 분자이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 표적 분자(예를 들어, 면역 체크포인트 분자)에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 리간드이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 수용체이다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 결합 단백질의 예는 인간화 항체, 항체 Fab 단편, 이가 항체, 항체 약물 컨쥬게이트, scFv, 융합 단백질, 2가 항체 및 4가 항체를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 쇄, 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄 또는 그의 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체로 구성된 임의의 면역글로불린(Ig) 분자를 지칭한다. 이러한 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 항체 형식은 해당 분야에 알려져 있다. 전장 항체에서, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어져 있다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어져 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더욱 보존된 영역 사이에 배치된 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 하기의 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어져 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 뮤린 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이다. 다른 구현예에서, 항체는 키메라 항체이다. 키메라 및 인간화 항체는 CDR 그라프팅 접근법(예를 들어, 미국 특허 제5,843,708호; 제6,180,370호; 제5,693,762호; 제5,585,089호; 및 제5,530,101호 참조), 쇄 셔플링 전략(예를 들어, 미국 특허 제5,565,332호; 문헌[Rader et al. (1998) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 95: 8910-8915] 참조), 분자 모델링 전략(미국 특허 제5,639,641호) 등을 포함하는 해당 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 "항원 결합 부분"(또는 간단히 "항체 부분")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것이 나타났다. 또한 이러한 항체 구현예는 둘 이상의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는; 이중특이적, 이중 특이적 또는 다중-특이적 형식일 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어져 있는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어져 있는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일의 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어져 있는 Fv 단편, (v) 단일의 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편(내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Ward et al. (1989) NATURE 341: 544-546]; 및 제WO 90/05144 A1호); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH가 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 그들은, 재조합 방법을 이용하여, 그들을 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단쇄 Fv(scFv)로 알려져 있음)를 형성하는 단일의 단백질 쇄로 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) SCIENCE 242:423-426]; 및 문헌[Huston et al. (1988) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 85:5879-5883] 참조). 또한, 이러한 단쇄 항체는 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 다른 형태의 단쇄 항체, 예컨대, 디아바디도 또한 포함된다. 항원 결합 부분은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv 내로 혼입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조).
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각에 3개의 CDR이 존재하며, 이는 가변 영역의 각각에 대하여 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된다. 본원에 사용되는 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일의 가변 영역에 존재하는 3개의 CDR의 군을 지칭한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의된다. 카바트에 의해 기재된 시스템(Kabat et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))은 항체의 임의의 가변 영역에 적용 가능한 명확한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐 아니라 3개의 CDR을 정의하는 정밀한 잔기 경계도 또한 제공한다. 이들 CDR은 카바트 CDR로 지칭될 수 있다. 초티아(Chothia) 및 동료는 카바트 CDR 내의 특정한 하위-부분이 아미노산 서열의 수준에서 큰 다양성을 가짐에도 불구하고 거의 동일한 펩티드 백본 입체형태를 채택한다는 것을 발견하였다(Chothia et al. (1987) J. MOL. BIOL. 196: 901-917, and Chothia et al. (1989) NATURE 342: 877-883). 이들 하위-부분은 L1, L2, 및 L3 또는 H1, H2, 및 H3으로 지정되었으며, 여기서 "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 나타낸다. 이들 영역은 초티아 CDR로 지칭될 수 있으며, 이는 카바트 CDR과 중첩되는 경계를 갖는다. 카바트 CDR과 중첩되는 CDR을 정의하는 다른 경계는 문헌[Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139] 및 문헌[MacCallum et al. (1996) J. MOL. BIOL. 262(5): 732-45]에 의해 기재되어 있다. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 시스템 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있으나, 그럼에도 불구하고, 비록 특정 잔기 또는 잔기의 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의적으로 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견의 견지에서 단축될 수 있거나 길어질 수는 있지만, 카바트 CDR과 중첩될 것이다. 본원에 사용된 방법은, 비록 바람직한 구현예가 카바트 또는 초티아 정의된 CDR을 사용한다고 해도, 이들 시스템 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)인 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체를 지칭한다. 대개, 인간화 항체 및 그의 항체 단편은 수여자의 상보성-결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 요망되는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종, 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR(공여자 항체)로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수여자 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화 항체/항체 단편은 수여자 항체, 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열 중 어느 것에서도 관찰되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 추가로 개선하고 최적화시킬 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 그의 항체 단편은 적어도 하나, 전형적으로, 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하며, FR 영역의 모든 또는 상당한 부분은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체 또는 항체 단편은 또한, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다. 추가의 상세설명에 대하여, 문헌[Jones et al. (1986) NATURE 321: 522-525]; 문헌[Reichmann et al. (1988) NATURE 332: 323-329]; 및 문헌[Presta (1992) CURR. OP. STRUCT. BIOL. 2: 593-596]을 참조하며, 이의 각각은 본원에 그의 전문이 참조로 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역컨쥬게이트" 또는 "항체 약물 컨쥬게이트"는 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 또 다른 작용제, 예컨대 화학치료제, 독소, 면역치료제, 영상화 프로브 등의 연결을 지칭한다. 연결은 공유 결합 또는 정전기력을 통한 것과 같은 비-공유적 상호작용일 수 있다. 해당 분야에 알려져 있는 다양한 링커를 사용하여, 면역컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 또한, 면역컨쥬게이트는 면역컨쥬게이트를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 융합 단백질의 형태로 제공될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "융합 단백질"은 원래 개별 단백질(펩티드 및 폴리펩티드 포함)를 위해 코딩된 2가지 이상의 유전자 또는 유전자 단편의 연결을 통해 생성된 단백질을 지칭한다. 융합 유전자의 번역은 원래의 단백질의 각각으로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일의 단백질을 초래한다.
"2가 항체"는 2개의 항원-결합 부위를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 지칭한다. 2개의 항원 결합 부위는 동일한 항원에 결합할 수 있거나, 그들은 각각 상이한 항원에 결합할 수 있으며, 이 경우에, 항체 또는 항원-결합 단편은 "이중특이적"으로 특성화된다. "4가 항체"는 4개의 항원-결합 부위를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 지칭한다. 특정 구현예에서, 4가 항체는 이중특이적이다. 특정 구현예에서, 4가 항체는 다중특이적이며, 즉, 2가지 초과의 상이한 항원에 결합한다.
Fab(항원 결합 단편) 항체 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역 1(CH1) 부분으로 이루어진 폴리펩티드 및 경쇄 가변(VL) 및 경쇄 불변(CL) 부분으로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 항체의 1가 항원-결합 도메인을 포함하는 면역반응성 폴리펩티드이며, CL 및 CH1 부분은 바람직하게는 Cys 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 함께 결합된다.
면역 체크포인트 조절제 항체는 적어도 4가지의 주요 범주를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다: i) T 세포 또는 자연 살해(NK) 세포 상에서 직접적으로 저해 경로를 차단하는 항체(예를 들어, PD-1 표적화 항체, 예컨대 니볼루맙 및 펨브롤리주맙, TIM-3을 표적화하는 항체 및 LAG-3, 2B4, CD160, A2aR, BTLA, CGEN-15049 및 KIR을 표적화하는 항체), ii) T 세포 또는 NK 세포 상에서 직접적으로 자극성 경로를 활성화시키는 항체(예를 들어, OX40, GITR 및 4-1BB를 표적화하는 항체), iii) 면역 세포 상에서 억제 경로를 차단하거나, 항체-의존적 세포 세포독성에 의존하여, 면역 세포의 억제 집단을 고갈시키는 항체(예를 들어, CTLA-4 표적화 항체, 예컨대 이필리무맙, VISTA를 표적화하는 항체 및 PD-L2, Gr1 및 Ly6G를 표적화하는 항체) 및 iv) 암 세포 상에서 직접적으로 억제 경로를 차단하거나, 항체-의존적 세포 세포독성에 의존하여, 암 세포에 대한 세포독성을 향상시키는 항체(예를 들어, 리툭시맙, PD-L1을 표적화하는 항체 및 B7-H3, B7-H4, Gal-9 및 MUC1을 표적화하는 항체). 체크포인트 저해제의 예는 예를 들어, CTLA-4의 저해제, 예컨대 이필리무맙 또는 트레멜리무맙; PD-1 경로의 저해제, 예컨대 항-PD-1, 항-PD-L1 또는 항-PD-L2 항체를 포함한다. 예시적인 항-PD-1 항체는 제WO 2006/121168호, 제WO 2008/156712호, 제WO 2012/145493호, 제WO 2009/014708호 및 제WO 2009/114335호에 기재되어 있다. 예시적인 항-PD-L1 항체는 제WO 2007/005874호, 제WO 2010/077634호 및 제WO 2011/066389호에 기재되어 있으며, 예시적인 항-PD-L2 항체는 제WO 2004/007679호에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 융합 단백질, 예를 들어, 면역 체크포인트 조절제의 활성을 조절하는 융합 단백질이다.
일 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 치료적 핵산 분자, 예를 들어, 면역 체크포인트 단백질 또는 mRNA의 발현을 조절하는 핵산이다. 핵산 치료제는 해당 분야에 널리 알려져 있다. 핵산 치료제는 세포 내의 표적 서열에 상보성인 단일 가닥 및 이중 가닥(즉, 적어도 15개 뉴클레오티드 길이의 상보성 영역을 갖는 핵산 치료제) 핵산 둘 모두를 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 치료제는 면역 체크포인트 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 대하여 표적화된다.
안티센스 핵산 치료제는 단일 가닥 핵산 치료제, 전형적으로 약 16 내지 30개 뉴클레오티드 길이이며, 배양물 내의 또는 유기체 내의 표적 세포에서의 표적 핵산 서열에 상보성이다.
또 다른 양태에서, 작용제는 단일-가닥 안티센스 RNA 분자이다. 안티센스 RNA 분자는 표적 mRNA 내의 서열에 상보성이다. 안티센스 RNA는 mRNA로의 염기 쌍형성 및 번역 기구의 물리적인 방해에 의해 화학량론적 방식으로 번역을 저해할 수 있으며, 문헌[Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355]을 참조한다. 안티센스 RNA 분자는 표적 mRNA에 상보성인 약 15 내지 30개 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 안티센스 핵산, 화학적 변형 및 치료적 용도에 관한 특허는 예를 들어, 하기를 포함한다: 화학적으로 변형된 RNA-함유 치료적 화합물에 관한 미국 특허 제5,898,031호; 치료제로서의 이들 화합물의 이용 방법에 관한 미국 특허 제6,107,094호; 단일-가닥의 화학적으로 변형된 RNA-유사 화합물의 투여에 의한 환자의 치료 방법에 관한 미국 특허 제7,432,250호; 및 단일-가닥의 화학적으로 변형된 RNA-유사 화합물을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 미국 특허 제7,432,249호. 미국 특허 제7,629,321호는 복수의 RNA 뉴클레오시드 및 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 사용한 표적 mRNA의 절단 방법에 관한 것이다. 이 단락에 열거된 특허의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 핵산 치료제는 또한 이중 가닥 핵산 치료제를 포함한다. 본원에 상호교환 가능하게 사용되는 바와 같이, "dsRNA 작용제", "dsRNA", "siRNA", "iRNA 작용제"로도 지칭되는 "RNAi 작용제", "이중 가닥 RNAi 작용제", 이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자는 하기 정의된 바와 같이 2개의 역-평행하고 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는, 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, RNAi 작용제는 또한 dsiRNA를 포함할 수 있다(예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공개 제20070104688호 참조). 일반적으로, 각각의 가닥의 뉴클레오티드의 대부분은 리보뉴클레오티드이지만, 본원에 기재된 바와 같이, 각각의 또는 둘 모두의 가닥은 하나 이상의 비-리보 뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "RNAi 작용제"는 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있으며; RNAi 작용제는 다수의 뉴클레오티드에서 실질적인 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 본원에 개시되거나 해당 분야에 공지된 모든 유형의 변형을 포함할 수 있다. siRNA 유형 분자에서 사용된 임의의 이러한 변형은 본 명세서 및 청구범위의 목적을 위하여 "RNAi 작용제"에 의해 포함된다. 본 발명의 방법에 사용되는 RNAi 작용제는 예를 들어, 제WO/2012/037254호 및 제WO 2009/073809호에 개시된 바와 같이 화학적 변형을 갖는 작용제를 포함하고, 이들의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
면역 체크포인트 조절제는 예를 들어, 표준 투여량을 사용함으로써 종양학적 장애를 치료하기 위하여 적절한 투여량으로 투여될 수 있다. 해당 분야의 숙련자는 일상적인 실험에 의해 종양학적 장애를 치료하기 위한 면역 체크포인트 조절제의 비-독성 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량은 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있으며, 예를 들어, 면역 체크포인트 조절제의 제조처에 의해 제공되는 제품 인서트(product insert)로부터 수득될 수 있다. 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량의 예는 하기 표 12에 제공되어 있다. 다른 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 특정 종양학적 장애에 대한 치료를 위한 치료 기준 하에서 종양학적 장애를 치료하기 위해 사용되는 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량과 상이한(예를 들어, 더 낮은) 투여량으로 투여된다.
[표 12]
면역 체크포인트 조절제의 예시적인 표준 투여량
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특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제의 투여되는 투여량은 특정 종양학적 장애에 대한 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 낮다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제의 투여되는 투여량은 특정 종양학적 장애에 대한 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량의 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5%이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제의 조합이 투여되는 경우, 면역 체크포인트 조절제 중 적어도 하나는 특정 종양학적 장애에 대한 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량보다 더 낮은 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제의 조합이 투여되는 경우, 면역 체크포인트 조절제 중 적어도 2가지는 특정 종양학적 장애에 대한 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량보다 더 낮은 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제의 조합이 투여되는 경우, 면역 체크포인트 조절제 중 적어도 3가지는 특정 종양학적 장애에 대한 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량보다 더 낮은 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제의 조합이 투여되는 경우, 면역 체크포인트 조절제의 전부는 특정 종양학적 장애에 대한 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량보다 더 낮은 용량으로 투여된다.
본 발명의 엔지니어링된 면역 세포와 조합하여 투여될 수 있는 추가의 면역치료제에는 톨-유사 수용체(TLR) 효능제, 세포-기반 요법, 사이토카인 및 암 백신이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
2. TLR 효능제
TLR은 미생물로부터 유래된 구조적으로 보존된 분자를 인식하는 단일 막-스패닝 비-촉매적 수용체이다. TLR은 인터류킨-1 수용체와 함께 "인터류킨-1 수용체/톨-유사 수용체 상과"로 알려져 있는 수용체 상과를 형성한다. 이 과의 구성원은 구조적으로, 세포외 류신-풍부 반복(LRR) 도메인, 막근접(juxtamembrane) 시스테인 잔기의 보존된 패턴 및 MyD88, TIR 도메인-함유 연결자(TRAP) 및 IFNβ를 유도하는 TIR 도메인-함유 연결자(TRIF)를 포함하는 TIR 도메인-함유 어댑터를 동원함으로써 다운스트림 신호전달을 위한 플랫폼을 형성하는 세포질내 신호전달 도메인을 특징으로 한다(O'Neill et al., 2007, Nat Rev Immunol 7, 353).
TLR은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 및 TLR10을 포함한다. TLR2는 펩티도글리칸, 박테리아 리포펩티드, 리포테이코산, 마이코박테리아 리포아라비노만난 및 효모 세포벽 성분을 포함하는 다수의 미생물 산물에 대한 세포 반응을 매개한다. TLR4는 패턴 인식 수용체(PRR) 과에 속하는 막횡단 단백질이다. 그의 활성화는 세포내 신호전달 경로 NF-κB 및 염증성 사이토카인 생산을 야기하며, 이는 선천 면역계의 활성화를 담당한다. TLR5는 침입하는 이동성 박테리아 유래의 박테리아 플라젤린을 인식하는 것으로 알려져 있으며, 염증성 장 질병을 포함하는 많은 질병의 발병에 연루되는 것으로 밝혀졌다.
TLR 효능제가 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 제US2014/0030294호에 기재되어 있으며, 이는 본원에 그의 전문이 참조로 포함되다. 예시적인 TLR2 효능제는 마이코박테리아 세포벽 당지질, 리포아라비노만난(LAM) 및 만노실화 포스파티딜이노시톨(PIIM), MALP-2 및 Pam3Cys, 및 그의 합성 변이체를 포함한다. 예시적인 TLR4 효능제는 지질다당류 또는 그의 합성 변이체(예를 들어, MPL 및 RC529) 및 지질 A 또는 그의 합성 변이체(예를 들어, 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Cluff et al., 2005, Infection and Immunity, p. 3044-3052:73]; 문헌[Lembo et al., 2008, The Journal of Immunology 180, 7574-7581]; 및 문헌[Evans et al., 2003, Expert Rev Vaccines 2:219-29]을 참조한다. 예시적인 TLR5 효능제는 플라젤린 또는 그의 합성 변이체(예를 들어, TLR5 활성화에 비-필수적인 플라젤린의 부분을 결실시킴으로써 제조되는 감소된 면역원성을 갖는 약리학적으로 최적화된 TLR5 효능제(예컨대 CBLB502))를 포함한다.
추가의 TLR 효능제는 콜리 독소 및 바실리 칼메트-게랭(BCG)을 포함한다. 콜리 독소는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 및 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 종의 사멸된 박테리아로 이루어진 혼합물이다. 문헌[Taniguchi et al., 2006, Anticancer Res. 26 (6A): 3997-4002]을 참조한다. BCG는 약독화된 살아 있는 소 결핵 바실러스, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 균주로부터 제조된다. 문헌[Venkataswamy et al., 2012, Vaccine. 30 (6): 1038-1049]을 참조한다.
3. 세포 기반 요법
암의 치료를 위한 세포-기반 요법은 대상체로의 면역 세포(예를 들어, T 세포, 종양-침윤 림프구(TIL), 자연 살해 세포, 및 수지상 세포)의 투여를 포함한다. 자가 세포-기반 요법에서, 면역 세포는 그들을 투여한 동일한 대상체로부터 유래된다. 동종이계 세포-기반 요법에서, 면역 세포는 한 대상체로부터 유래되며, 상이한 대상체로 투여된다. 면역 세포는 대상체로의 투여 이전에, 예를 들어, 사이토카인을 이용한 처리에 의해 활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 면역요법에서와 같이, 대상체로의 투여 이전에 유전학적으로 변형된다.
일부 구현예에서, 세포-기반 요법은 입양 세포 전달(ACT)을 포함한다. ACT는 전형적으로 3가지 부분으로 이루어진다: 림프-고갈(lympho-depletion), 세포 투여 및 고 용량의 IL-2를 사용한 요법. ACT에서 투여될 수 있는 세포의 유형에는 종양 침윤 림프구(TIL), T 세포 수용체(TCR)-형질도입된 T 세포 및 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포가 포함된다.
종양-침윤 림프구는 유방암을 포함하는 많은 고형 종양에서 관찰되는 면역 세포이다. 그들은 세포독성 T 세포 및 헬퍼 T 세포, 및 B 세포, 대식구, 자연 살해 세포 및 수지상 세포의 혼합물을 포함하는 세포의 집단이다. 자가 TIL 요법을 위한 일반적인 절차는 하기와 같다: (1) 절제된 종양을 단편으로 분해하고; (2) 각각의 단편을 IL-2에서 성장시키고, 림프구를 증식시켜 종양을 파괴하고; (3) 순수한 림프구의 집단이 존재한 후에, 이들 림프구를 증량시키고; (4) 최대 1011개의 세포로 증량시킨 후에, 림프구를 환자 내로 주입한다. 문헌[Rosenberg et al., 2015, Science 348(6230):62-68]을 참조하며, 이는 본원에 그의 전문이 참조로 포함된다.
TCR-형질도입된 T 세포는 종양-특이적 TCR의 유전학적 유도를 통해 생성된다. 이것은 종종 특정 항원-특이적 TCR을 레트로바이러스 백본 내로 클로닝시킴으로써 행해진다. 혈액을 환자로부터 채혈하고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 추출한다. PBMC를 IL-2의 존재 하에 CD3으로 자극한 다음, 항원-특이적 TCR을 인코딩하는 레트로바이러스로 형질도입한다. 이들 형질도입된 PBMC를 시험관 내에서 추가로 증량시키고, 다시 환자 내로 주입한다. 문헌[Robbins et al., 2015, Clinical Cancer Research 21(5):1019-1027]을 참조하며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함된다.
키메라 항원 수용체(CAR)는 세포외 항원 인식 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 신호전달 도메인(예컨대 CD3ζ, CD28 및 4-1BB)을 함유하는 재조합 수용체이다. CAR은 항원-결합 및 T-세포-활성화 기능 둘 모두를 갖는다. 따라서, CAR을 발현하는 T 세포는 당지질, 탄수화물 및 단백질을 포함하는 매우 다양한 세포 표면 항원을 인식할 수 있으며, 세포질 동시자극의 활성화를 통하여 이들 항원을 발현하는 악성 세포를 공격할 수 있다. 문헌[Pang et al., 2018, Mol Cancer 17: 91]을 참조하며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 세포-기반 요법은 자연 살해(NK) 세포-기반 요법이다. NK 세포는 임의의 이전의 감작 또는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자 발현의 제한 없이, 종양 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 큰 과립 림프구이다. 문헌[Uppendahl et al., 2017, Frontiers in Immunology 8: 1825]을 참조한다. 고-용량 IL-2 요법을 사용한 자가 림포카인-활성화된 살해(LAK) 세포의 입양 전달은 인간 임상 시험에서 평가된 바 있다. LAK 면역요법과 유사하게, 사이토카인-유도된 살해(CIK) 세포는 항-CD3 mAb, IFN-γ 및 IL-2의 자극과 함께 말초 혈액 단핵 세포 배양물로부터 발생한다. CIK 세포는 혼합된 T-NK 표현형을 특징으로 하며(CD3+CD56+), 난소 및 자궁경부암에 대하여 LAK 세포에 비하여 향상된 세포독성 활성을 나타낸다. 일차 감량 수술 및 애쥬번트(adjuvant) 카보플라틴/파클리탁셀 화학요법 이후 자가 CIK 세포의 입양 전달을 조사하는 인간 임상 시험도 또한 행한 바 있다. 문헌[Liu et al., 2014, J Immunother 37(2): 116-122]을 참조한다.
일부 구현예에서, 세포-기반 요법은 수지상 세포-기반의 면역요법이다. 종양 용해물로 처리된 수지상 세포(DC)를 사용한 백신접종은 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 치료적 항종양 면역 반응을 증가시키는 것으로 나타났다. 문헌[Jung et al., 2018, Translational Oncology 11(3): 686-690]을 참조한다. DC는 항원을 포획하고 처리하며, 림프 기관 내로 이동하며, 림프구 동시자극 분자를 발현하며, 면역 반응을 개시하는 사이토카인을 분비한다. 그들은 또한 종양-관련 항원에 특이적인 수용체를 발현하는 면역학적 이펙터 세포(T 세포)를 자극하며, 면역 리프레서, 예컨대 CD4+CD25+Foxp3+ 조절 T(Treg) 세포의 수를 감소시킨다. 예를 들어, 종양 세포 용해물-DC 혼성물에 기초한 신세포 암종(RCC)을 위한 DC 백신접종 전략은 예비임상 및 임상 시험에서 치료적 능력을 보여주었다. 문헌[Lim et al., 2007, Cancer Immunol Immunother 56: 1817-1829]을 참조한다.
4. 사이토카인
IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21을 포함하는 몇몇 사이토카인은 면역 세포, 예컨대 NK 세포 및 T 세포의 활성화를 위하여 암의 치료에 사용되었다. IL-2는 항종양 면역성의 유도를 희망하여, 임상적으로 처음 사용된 사이토카인 중 하나이다. 고 용량에서 단일의 작용제로서 IL-2는 신세포 암종(RCC) 및 전이성 흑색종을 갖는 일부 환자에서 관해를 유도한다. 저 용량 IL-2를 또한 조사하였으며, 생물학적 활성을 유지하면서 독성을 감소시키기 위한 노력으로 IL-2 αβγ 수용체(IL-2Rαβγ)를 선택적으로 라이게이션시키는 것이 목적이었다. 문헌[Romee et al., 2014, Scientifica, Volume 2014, Article ID 205796, 18 pages]을 참조하며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함된다.
인터류킨-15(IL-15)는 인터류킨-2(IL-2)와 구조적 유사성을 갖는 사이토카인이다. IL-2와 같이, IL-15는 IL-2/IL-15 수용체 베타 쇄(CD122) 및 공통 감마 쇄(감마-C, CD132)로 구성된 복합체에 결합하며, 이를 통해 신호를 전달한다. 재조합 IL-15를 고형 종양(예를 들어, 흑색종, 신세포 암종)의 치료에 대하여 그리고 암 환자에서 입양 전달 이후 NK 세포의 지원에 대하여 평가하였다. 상기 언급된 문헌[Romee et al.]을 참조한다.
IL-12는 NK 세포 세포독성을 향상시키는 그의 능력에 기초하여, 원래 "NK 세포 자극 인자(NKSF)"로서 확인된, p35 및 p40 서브유닛(IL-12α 및 β 쇄)으로 구성된 이종이량체 사이토카인이다. 병원체와 마주칠 때, IL-12는 활성화된 수지상 세포 및 대식구에 의해 방출되며, 활성화된 T 및 NK 세포 상에서 주로 발현되는 그의 동족 수용체에 결합한다. 수많은 예비임상 연구에 의해, IL-12가 항종양 능력을 갖는 것이 뒷받침되었다. 상기 언급된 문헌[Romee et al.]을 참조한다.
IL-18은 염증유발 IL-1 과의 구성원이며, IL-12와 같이, 활성화된 식세포에 의해 분비된다. IL-18은 예비임상 동물 모델에서 유의미한 항종양 활성이 입증되고, 인간 임상 시험에서 평가된 바 있다. 문헌[Robertson et al., 2006, Clinical Cancer Research 12: 4265-4273]을 참조한다.
IL-21은 NK 세포 및 CD8+ T 세포를 자극하는 그의 능력으로 인하여 항종양 면역요법을 위해 사용되었다. 생체외 NK 세포 증식을 위하여, 막 결합된 IL-21는 유효한 결과와 함께 K562 자극인자 세포에서 발현되었다. 문헌[Denman et al., 2012, PLoS One 7(1)e30264]을 참조한다. 재조합 인간 IL-21은 또한, 용해성 CD25를 증가시키고, CD8+ 세포 상의 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현을 유도하는 것으로 나타났다. IL-21를 고형 종양의 치료를 위한 몇몇 임상 시험에서 평가하였다. 상기 언급된 문헌[Romee et al.]을 참조한다.
5. 암 백신
치료적 암 백신은 적합한 애쥬번트의 보조와 함께, 암에 대한 환자 자신의 면역 반응, 특히 CD8+ T 세포 매개된 반응을 강화시킴으로써 암 세포를 제거한다. 암 백신의 치료적 효능은 정상 세포에 비하여 종양 세포에 의한 종양 관련 항원(TAA)의 차등적인 발현에 좌우된다. TAA는 세포 단백질로부터 유래하며, 면역 관용 또는 자가면역 효과를 회피하기 위하여, 암 세포 상에서 주로 또는 선택적으로 발현되어야 한다. 문헌[Circelli et al., 2015, Vaccines 3(3): 544-555]을 참조한다. 암 백신은 예를 들어, 수지상 세포(DC) 기반의 백신, 펩티드/단백질 백신, 유전학적 백신 및 종양 세포 백신을 포함한다. 문헌[Ye et al., 2018, J Cancer 9(2): 263-268]을 참조한다.
본 발명의 조합 요법은 종양학적 장애의 치료를 위하여 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포 및 추가의 치료제의 조합 요법은 종양 세포 성장을 저해한다. 따라서, 본 발명은 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포 및 적어도 하나의 추가의 치료제를 대상체에게 투여하여, 종양 세포 성장이 저해되게 하는 단계를 포함하는 대상체에서의 종양 세포 성장의 저해 방법을 추가로 제공한다. 특정 구현예에서, 암을 치료하는 것은 대조군에 비하여 생존을 연장시키거나, 종양 진행까지의 시간을 연장시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군은 추가의 치료제로 처리되지만, 엔지니어링된 면역 세포로 처리되지 않은 대상체이다. 일부 구현예에서, 대조군은 엔지니어링된 면역 세포로 처리되지만, 추가의 치료제로 처리되지 않은 대상체이다. 일부 구현예에서, 대조군은 추가의 치료제 또는 엔지니어링된 면역 세포로 처리되지 않은 대상체이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 제1 용량의 엔지니어링된 면역 세포 또는 제1 용량의 추가의 치료제의 투여 이전에 종양을 갖는 것으로 확인된다. 특정 구현예에서, 대상체는 엔지니어링된 면역 세포의 처음의 투여 시에 또는 추가의 치료제의 처음의 투여 시에 종양을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포 및 하나 이상의 추가의 치료제를 포함하는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 사이클의 조합 요법제를 대상체에게 투여한다. 대상체를 각 사이클의 마지막에 반응 기준에 대하여 평가한다. 대상체를 또한 치료 섭생이 충분히 용인되는 것을 보장하기 위하여, 각 사이클 내내 유해 사건(예를 들어, 응고, 빈혈, 간 및 신장 기능 등)에 대하여 모니터링한다.
1가지 초과의 추가의 치료제, 예를 들어, 2, 3, 4, 5가지 또는 그 이상의 추가의 치료제가 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포와 조합하여 투여될 수 있다는 것을 주의해야 한다.
일 구현예에서, 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포 및 본원에 기재된 바와 같은 추가의 치료제의 투여는 종양 크기, 중량 또는 부피의 감소, 진행까지의 시간 증가, 종양 성장의 저해 및/또는 종양학적 장애를 갖는 대상체의 생존 시간의 연장 중 하나 이상을 초래한다. 특정 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포 및 추가의 치료제의 투여는 엔지니어링된 면역 세포가 투여되지만, 추가의 치료제가 투여되지 않은 상응하는 대조군 대상체에 비하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% 또는 500%만큼 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나 대상체의 생존 시간을 연장시킨다. 특정 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포 및 추가의 치료제의 투여는 엔지니어링된 면역 세포가 투여되지만, 추가의 치료제가 투여되지 않은 종양학적 장애에 걸린 상응하는 대조군 대상체의 집단에 비하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% 또는 500%만큼 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나 종양학적 장애에 걸린 대상체 집단의 생존 시간을 연장시킨다. 다른 구현예에서, 엔지니어링된 면역 세포 및 추가의 치료제의 투여는 처리 이전에 진행성 종양학적 장애를 갖는 대상체에서 종양학적 장애를 안정화시킨다.
특정 구현예에서, 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포 및 추가의 치료제(예를 들어, 면역치료제)를 이용한 치료는 예를 들어, 표준 투여량의 하나 이상의 항신생물(예를 들어, 화학치료)제를 투여함으로써 추가의 항-신생물제, 예컨대 치료할 특정 암의 치료를 위한 치료 기준과 조합된다. 특정 암 유형에 대한 치료 기준은 예를 들어, 암의 유형 및 중증도, 대상체의 연령, 체중, 성별 및/또는 병력 및 이전의 치료의 성공 또는 실패에 기초하여, 해당 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 치료 기준은 외과술, 방사선, 호르몬 요법, 항체 요법, 성장 인자, 사이토카인을 사용한 요법 및 화학요법 중 어느 하나 또는 그의 조합을 포함한다. 일 구현예에서, 추가의 항-신생물제는 철-의존적 세포 디스어셈블리를 유도하는 작용제 및/또는 면역 체크포인트 조절제가 아니다.
본원에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 추가의 항-신생물제는 화학치료제(예를 들어, 알킬화제, 예컨대 알트레타민(Altretamine), 부술판(Busulfan), 카보플라틴(Carboplatin), 카무스틴(Carmustine), 클로람부실(Chlorambucil), 시스플라틴(Cisplatin), 사이클로포스파미드, 다카르바진(Dacarbazine), 로무스틴(Lomustine), 멜팔란(Melphalan), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 테모졸로미드(Temozolomide), 티오테파(Thiotepa); 항대사물질, 예컨대, 5-플루오로우라실(5-FU), 6-머캅토퓨린(6-MP); 카페시타빈(Capecitabine)(젤로다(Xeloda)®), 시타라빈(Cytarabine)(아라(Ara)-C®), 플록수리딘(Floxuridine), 플루다라빈(Fludarabine), 젬시타빈(Gemcitabine)(젬자르(Gemzar)®), 하이드록시우레아, 메토트렉세이트(Methotrexate), 페메트렉시드(Pemetrexed)(알림타(Alimta)®); 항종양 항생제, 예컨대 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(Daunorubicin), 독소루비신(Doxorubicin)(아드리아마이신(Adriamycin)®), 에피루비신(Epirubicin), 이다루비신(Idarubicin)), 악티노마이신(Actinomycin)-D, 블레오마이신(Bleomycin), 미토마이신(Mitomycin)-C, 미톡산트론(Mitoxantrone)(국소이성질화효소 II 저해제로서도 작용함); 국소이성질화효소 저해제, 예컨대 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan)(CPT-11), 에토포시드(Etoposide)(VP-16), 테니포시드(Teniposide), 미톡산트론(Mitoxantrone)(항종양 항생제로서도 작용함); 유사분열 저해제, 예컨대 도세탁셀(Docetaxel), 에스트라무스틴(Estramustine), 익사베필론(Ixabepilone), 파클리탁셀(Paclitaxel), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 비노렐빈(Vinorelbine); 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손(Prednisone), 메틸프레드니솔론(Methylprednisolone)(솔루메드롤(Solumedrol)®), 덱사메타손(Dexamethasone)(데카드론(Decadron)®); 효소, 예컨대 L-아스파라기나제 및 보르테조밉(bortezomib)(벨케이드(Velcade)®))를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 항-신생물제는 또한, 생물학적 항암제, 예를 들어, 항-TNF 항체, 예를 들어, 아달리무맙(adalimumab) 또는 인플릭시맙(infliximab); 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙, 항-VEGF 항체, 예컨대 베바시주맙(bevacizumab); 항-HER2 항체, 예컨대 트라스투주맙(trastuzumab); 항-RSV, 예컨대 팔리비주맙(palivizumab)을 포함한다.
B. 감염성 질병
본원에 제공되는 바와 같이, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포는 대상체에 내인성인 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포 등)에서 면역 활성을 유도하거나 증가시킬 수 있고, 따라서 박테리아 및/또는 바이러스 감염의 저해, 및/또는 감염을 치료하기 위한 면역 감시 및 면역 기억 기능의 회복과 같은 면역 세포 기능을 향상시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 엔지니어링된 면역 세포를 사용하여 대상체에서 감염 또는 감염성 질병, 예를 들어, 만성 감염을 치료한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "감염"은 유기체(즉, 대상체)의 세포 또는 조직이 감염성 물질에 의해 감염된 임의의 상태를 지칭한다(예를 들어, 대상체는 세포내 병원체 감염, 예를 들어, 만성 세포내 병원체 감염을 갖는다). 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "감염성 물질"은 감염된 유기체의 적어도 하나의 세포 내의 외래 생물학적 엔티티(즉, 병원체)를 지칭한다. 예를 들어, 감염성 물질은 박테리아, 바이러스, 원생동물 및 진균을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특히 세포내 병원체가 관심 대상이다. 감염성 질병은 감염성 물질에 의해 야기되는 장애이다. 일부 감염성 물질은 특정 조건 하에서 인식 가능한 증상 또는 질병을 야기하지 않지만, 변경된 조건 하에서 증상 또는 질병을 야기할 가능성을 갖는다. 대상 방법은 바이러스 감염, 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤파드나 바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스 또는 인간 파필로마 바이러스; 세포내 박테리아 감염, 예를 들어, 마이코박테리움(Mycobacterium), 클라미도필라(Chlamydophila), 에를리키아(Ehrlichia), 리케치아(Rickettsia), 브루셀라(Brucella), 레지오넬라(Legionella), 프란시셀라(Francisella), 리스테리아(Listeria), 콕시엘라(Coxiella), 나이세리아(Neisseria), 살모넬라(Salmonella), 예르시니아(Yersinia) 종 또는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori); 및 세포내 원생동물 병원체, 예를 들어, 플라스모듐(Plasmodium) 종, 트리파노소마(Trypanosoma) 종, 지아르디아(Giardia) 종, 톡소플라스마(Toxoplasma) 종 또는 리슈마니아(Leishmania) 종을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 만성 병원체 감염의 치료에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 감염성 질병은 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: HIV, 인플루엔자, 헤르페스(Herpes), 지아르디아, 말라이아, 리슈마니아, 간염 바이러스(A, B, 및 C), 헤르페스 바이러스(예를 들어, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus)), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스(flavivirus), 에코바이러스(echovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 콕사키 바이러스(coxsackie virus), 코르노바이러스(cornovirus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 생볼거리 바이러스(mumps virus), 로타바이러스(rotavirus), 홍역 바이러스(measles virus), 풍진 바이러스(rubella virus), 파보바이러스(parvovirus), 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스(dengue virus), 유두종 바이러스(papillomavirus), 연속종 바이러스(molluscum virus), 폴리오바이러스(poliovirus), 공수병 바이러스(rabies virus), JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스(arboviral encephalitis virus)에 의한 병원성 감염, 박테리아 클라미디아(chlamydia), 리케치아 박테리아, 마이코박테리아, 포도상구균, 연쇄상구균, 폐렴구균, 수막구균 및 코노콕시(conococci), 클레브시엘라(klebsiella), 프로테우스(proteus), 세라티아(serratia), 슈도모나스(pseudomonas), 이. 콜라이(E. coli), 레지오넬라(legionella), 디프테리아(diphtheria), 살모넬라, 바실러스(bacilli), 콜레라(cholera), 파상풍, 보툴리누스 식중독, 탄저병, 전염병, 렙토스피라증(leptospirosis), 및 라임병 박테리아에 의한 병원성 감염, 진균 칸디다(알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis) 등), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스페르길루스(Aspergillus)(푸미가투스(fumigatus), 니게르(niger) 등), 무코랄스 속(Genus Mucorales)(무코르(mucor), 압시디아(absidia), 리조푸스(rhizophus)), 스포로트릭스 스켄키(Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라즈마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum)에 의한 병원성 감염, 및 기생생물 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜라이(Balantidium coli), 나에글레리아포울레리(Naegleriafowleri), 아칸트아메바(Acanthamoeba) 종, 기아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리디움(Cryptosporidium) 종, 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondi) 및/또는 니포스트론길루스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)에 의한 병원성 감염.
용어 "만성 감염"은 약 1개월 이상, 예를 들어, 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월 동안 지속되는 감염을 지칭한다. 일부 구현예에서, 만성 감염은 감염된 영역(들) 내의 및/또는 그 주변의 증가된 항-염증성 케모카인의 생산과 관련된다. 만성 감염은 HIV 감염, HCV 감염, HBV 감염, HPV 감염, B형 간염 감염, C형 간염 감염, EBV 감염, CMV 감염, TB 감염, 및 세포내 박테리아 또는 기생충 감염을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 만성 감염은 박테리아 감염이다. 일부 구현예에서, 만성 감염은 바이러스 감염이다.
IX. 약제학적 조성물 및 투여 방식
특정 양태에서, 본 개시내용은 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 조성물은 표적 세포에서 생물학적 반응을 유도하기에 충분한 양의 면역 세포를 포함한다. 본원에 기재된 약제학적 조성물은 임의의 적합한 제형으로 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 응용에 좌우된다.
특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내 및 피하 주사를 포함하는 비경구 투여에 적합하다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여에 적합하다. 추가의 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 종양내 투여에 적합하다.
비경구 투여용 약제학적 조성물은 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 정맥내 투여를 위하여, 제형은 수용액일 수 있다. 수용액은 행크스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution), 인산염 완충 염수(PBS), 생리학적 염수 완충액 또는 기타 적합한 염 또는 조합을 포함하여, 비경구적으로 운반된 제형에 적절한 pH 및 오스몰농도를 달성할 수 있다. 수용액을 사용하여 투여용 제형을 원하는 농도로 희석할 수 있다. 수용액은 용액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 제2인산나트륨, 제1인산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨 및 주사용수를 함유하는 인산염 완충 염수 용액을 포함한다.
해당 분야의 숙련자에게 용이하게 명백할 바와 같이, 투여될 유용한 생체내 투여량 및 특정 투여 방식은 연령, 체중, 고통의 중증도 및 치료되는 포유동물 종, 사용되는 특정 화합물 및 이들 화합물이 사용되는 특정 용도에 따라 달라질 것이다. 원하는 결과를 달성하는 데 필요한 투여량 수준인 유효한 투여량 수준의 결정은 일상적인 방법, 예를 들어, 인간 임상 시험, 동물 모델 및 시험관내 연구를 사용하여 해당 분야의 숙련자에 의해 달성될 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물은 비경구로 투여된다. 특정 구현예에서, 조성물은 주사 또는 주입에 의해 운반된다. 일 구현예에서, 본원에 제공되는 조성물은 종양에 직접 주사함으로써 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 정맥내 주사 또는 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 투여는 전신이다. 특정 구현예에서, 투여는 국소이다.
실시예
본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 출원 내내 언급된 모든 참고문헌, GenBank 수탁번호 및 유전자 번호, 및 공개된 특허 및 특허 출원의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 당업자는 본 발명이 개시된 구조, 물질, 조성물 및 방법에 대한 변동과 함께 실시될 수 있는 것을 인식할 것이며, 이러한 변동은 본 발명의 범위 내인 것으로 간주된다.
실시예 1. 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리펩티드, 및 별도로 CAR을 포함하는 엔지니어링된 T 세포의 제조(여기서 CAR 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 공동자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함함).
벡터의 생성
CAR 구축물을 인코딩하는 유전자를 합성하고 렌티바이러스 발현 벡터(CAR 벡터) 내로 클로닝한다. CAR은 표적 항원에 대해 지시된 scFv, 인간 CD8a로부터 유래된 힌지 및 막횡단 도메인, 공동자극 도메인(예를 들어, CD28 또는 4-1BB), 및 인간 CD3ξ의 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진다. CAR 이외에, 구축물은 리보솜 스킵핑 부위(P2A, 도 1a에 개략된 구축물) 후에 형광 선택 가능 마커(예컨대, ZS-그린)를 함유한다. 하기 실시예 5 내지 실시예 10에 기재된 것들과 같은 타노트랜스미션을 촉진시키는 유전자 모듈을 합성하고, 활성화 유도된 T 세포 프로모터의 다운스트림에서 별도의 렌티바이러스 벡터, 예를 들어, NF-AT(타노 벡터) 내로 클로닝한다. 타노트랜스미션 모듈 이외에, 구축물은 리보솜 스킵핑 부위(F2A, 도 1b에 개략된 구축물) 후에 형광 선택 가능 마커(예컨대, DT-Tomato)를 함유한다.
렌티바이러스 스톡의 생성
293 T 세포를 형질감염 전날에 플레이팅한다. 렌티바이러스 패키징 믹스와 함께 CAR 벡터 DNA를 이용하여 293T 세포를 형질감염시킴으로써 CAR의 생성을 위한 렌티바이러스 스톡을 생산한다. 293T 세포를 렌티바이러스 패키징 믹스와 함께 타노 벡터 DNA로 형질감염시킴으로써 타노 벡터에 대한 별도의 렌티바이러스 스톡을 제조한다. 바이러스 스톡을 형질감염 24시간 및 48시간 후에 수확하고, 0.22 uM 필터를 통해 여과하여 렌티바이러스 스톡을 제조한다.
CAR T 세포의 생성
Pan T 세포를 건강한 인간 공여자로부터의 PBMC로부터 단리한다. 단리된 T 세포를 2일 내지 3일 동안 활성화 비드로 활성화시키고, 비드를 제거한다. 렌티바이러스 스톡을 활성화된 T 세포에 첨가하여 T 세포를 형질도입한다. T 세포를 CAR 벡터 또는 타노 벡터, 또는 이 둘 모두를 사용하여 형질도입하여, 각각 대조군 CAR T 세포, 대조군 타노 T 세포 및 타노 CAR T 세포를 제조한다. 형질도입 1일 내지 3일 후에, 성장을 지원하기 위해 사이토카인(예를 들어, 인간 IL-2)의 존재 하에 형질도입된 T 세포를 대규모 확장 배양으로 옮긴다. 실험을 위해 제8일과 제12일 사이에 세포를 수확한다. 일부 실험에서, 세포를 확장 전 또는 후에 형광 또는 선택 가능 마커의 발현에 기초하여 정제한다.
실시예 2. 시험관내에서 엔지니어링된 T 세포 기능의 평가.
CAR T 세포 표현형
실시예 1에서 상기 기재된 바와 같이 생성된 CAR T 세포의 표현형을 T 세포 노화, 고갈, 및 기능의 마커, 예를 들어, CD4, CD8, CD25, 4-1BB, CD27, KLRG1, CD57에 대한 유세포 분석에 의해 평가한다. 또한, CAR T 세포의 대사 적합성을, 예를 들어, 미토콘드리아 기능 및 산화환원 상태에 대한 검정을 이용하여 평가한다. CAR T 세포의 표현형을 이들의 표적 항원의 존재 또는 부재 둘 모두 하에서 평가한다.
CAR T 세포 기능 및 타노트랜스미션
루시퍼라제-표지된 인간 종양 세포(예를 들어, BXPC-1, Capan-2, HT-1080, HT-29)를 편평-바닥 96-웰 플레이트에 5000개 내지 10000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅한다. CAR T 세포를 10:1 내지 0.1:1 범위의 T 세포:표적 비로 첨가한다. 24시간 후, 이들 공동-배양물로부터의 상청액을 수확하고, 리포팅된 세포주와 함께 인큐베이션시켜 NF-Kb 및 IRF 활성에 대한 효과를 측정한다. 또한, 상청액에서 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFNγ)의 수준을 측정한다. 잔여 루시퍼라제 활성의 수준을 측정함으로써 표적 사멸의 정도를 결정한다. 다른 실험에서, 표적의 T 세포 사멸의 동역학을 다양한 비의 표적 세포 및 T 세포를 함유하는 플레이트의 연속적인 살아있는 세포 영상화에 의해 결정한다.
실시예 3. 암의 면역결핍 마우스 모델에서 CAR T 세포 기능의 평가.
상이한 수준의 항원 표적(예를 들어, BXPC-1, Capan-2, ASC-1)을 발현하는 인간 종양 세포를 면역결핍 NSG 마우스의 옆구리에 피하 이식한다. 종양이 확립되면, 마우스를 마우스 당 1×105 내지 1×107 범위의 상이한 용량의 CAR T로 1회 처리한다. 종양 성장 동역학을 모니터링하고, 종양 성장에 대한 상이한 CAR T 세포의 효과를 평가한다. 일부 실험에서, 항-종양 CAR T 세포 반응의 지속성을 평가하기 위해 마우스의 반대쪽 옆구리를 새로운 종양으로 시험감염시킨다.
실시예 4. 암의 면역적격 마우스 모델에서 뮤린화된 CAR T 세포의 평가.
온전한 면역계에 대한 CAR T 세포 활성의 효과를 평가하는 연구를 위해, 도 1a 및 도 1b에 기재된 CAR 구축물을 뮤린화한다. 구축물을 인간 항원을 표적화하는 VH 및 VL 도메인, 및 인간 대신 마우스 CD28 및 마우스 CD3제타 신호전달 도메인을 사용하여 레트로바이러스 백본(예를 들어, SFG) 내로 클로닝하고, 이에 따라 마우스 T 세포를 자극한다. 이들 구축물을 사용하여 이전에 기재된 바와 같이 안정한 패키징 세포주를 생성하고 일차 뮤린 T 세포를 유전적으로 변형시킨다(Lee et al., Cancer Res 2011, 71(8):2871). 마우스 CAR T 세포를 마우스 종양 세포(예를 들어, 인간 항원 표적(예를 들어, 메조텔린)을 발현하도록 변형된 B16 또는 CT26)와 함께 배양한다.
동족 항원을 발현하는 B16 또는 CT26 종양을 WT 마우스에 피하 이식한다. 종양을 촉진할 수 있게 될 때, 마우스를 뮤린화된 CAR T로 처리하고 종양 성장 동역학을 모니터링한다. 또한, CAR T의 존재 하에 종양에 대한 숙주 면역 반응을 모니터링한다. 일부 실험에서, 체크포인트 저해제 항체(예를 들어, 항-마우스 PD-1)를 또한 CAR T 세포와 투여하고, 종양 성장 및 숙주 면역 반응에 대한 효과를 평가한다.
실시예 5. 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 발현하는 CT-26 마우스 결장 암종 세포에서의 세포 사멸의 유도
CT-26 마우스 결장 암종 세포(ATCC; CRL-2638)를 pLVX-Tet3G 벡터(다카라(Takara); 631358)로부터 유래된 렌티바이러스로 형질도입하여, 인간 PGK 프로모터에 의한 안정한 Tet-On 트랜스활성화제(transactivator) 발현을 확립하였다. Tet-On 시스템에서, 유전자 발현은 독시사이클린에 의해 유도 가능하다. 모든 렌티바이러스 형질도입을 293T 세포(ATCC; CRL-3216) 및 렌티바이러스 패키징 믹스(Lentivirus Packaging Mix)(바이오세티아(Biosettia); pLV-PACK)를 사용하는 표준 생산 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 이어서, CT-26-Tet3G 세포를 pLVX-TRE3G(다카라; 631193)에서 인간 TRIF ORF를 발현하는 렌티바이러스로 형질도입하였다(수탁 번호: NM_182919). CT-26-Tet3G 세포를 대안적으로 또는 부가적으로 마우스 RIPK3 ORF를 발현하는 벡터로 형질도입하였으며(수탁 번호: NM_019955.2); RIPK3 발현을 pLV-EF1a-MCS-IRES-Hyg(바이오세티아; cDNA-pLV02)의 구성적 PGK 프로모터 유도체에 의해 구동하였다. 둘 모두의 ORF를 B-B 리간드(다카라; 635059)로의 결합 시에 올리고머화하는 2개의 탠덤 DmrB 도메인의 부가에 의해 변형시켜, 올리고머화를 촉진시키기 위한 B/B 동종이량체화제(1 μM)를 사용한 단백질 활성화를 가능하게 하였다. 초기 시험 후에, B/B를 사용한 이량체화는 TRIF 구축물의 활성에 실질적인 영향을 갖지 않았지만, RIPK3 발현 구축물의 활성을 촉진시켰다. 따라서, 모든 이후의 실험에서, B/B-유도된 이량체화는 TRIF를 포함하는 임의의 구축물을 활성화시키기 위하여 사용하지 않았고, 오직 RIPK3을 발현하는 단일의 구축물을 활성하기 위해서만 사용하였다. 이와 같이, B/B 이량체화제가 TRIF-유도된 활성에 영향을 갖지 않았지만, 이를 실험 환경에 포함시켜, 실험 조건이 모든 군 간에 비슷하였음을 보장하였다. 예를 들어, 도 3b에 나타나 있고, 실시예 6에 기재된 바와 같이, 이량체화제의 부가는 상기 기재된 엔지니어링된 CT-26 세포로부터의 세포 배양물로 처리되는 대식구에서 IRF 활성에 영향을 거의 갖지 않았다.
표기된 타노트랜스미션 모듈을 발현하는 CT26 마우스 결장 암종 세포를 시딩한 후에, 독시사이클린(1 mg/mL; 시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 0219895525) 및 B/B 동종이량체화제(1 μM)로 24시간 동안 처리하여, 올리고머화를 통해 발현 및 단백질 활성화를 촉진시켰다. 상대적인 세포 생존력을 제조처의 설명에 따라 처리 후 24시간째에 리얼타임-글로(RealTime-Glo) MT 세포 생존력 검정 키트(프로메가, 카탈로그 번호 G9712)를 사용하여 결정하고, 그래프로 작성하여, 상대 발광 단위(RLU)에 의해 측정되는 상대적인 생존력을 보여주였다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, TRIF, RIPK3, 또는 TRIF+RIPK3의 유도된 발현 및 올리고머화는 CT-26-Tet3G(Tet3G) 부모 세포주에 비하여 세포 생존력의 감소를 유도하였다. 이들 결과는 암 세포에서의 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 발현이 암 세포의 생존력을 감소시키는 것을 보여준다.
개별 실험에서, TRIF, RIPK3, 또는 TRIF 및 RIPK3을 발현하는 암 세포에서의 가스더민 E(GSDME)의 발현의 영향을 시험하였다. CT-26-Tet3G 세포를 pLV-EF1a-MCS-IRES-Puro 벡터(바이오세티아) 내로 클로닝된 인간 GSDME(NM_004403.3)로 형질도입하였다. GSDME를 또한, 상기 기재된 CT-26-Tet3G-TRIF 및 CT26-Tet3G-TRIF-RIPK3 세포 내로 형질도입하였다. 이들 세포를 시딩한 후에, 24시간 동안 독시사이클린(1 mg/mL; 시그마 알드리치, 0219895525)으로 처리하여, 발현을 촉진시켰다. 상대적인 세포 생존력을 제조처의 설명에 따라 처리 후 24시간째에 리얼타임-글로 MT 세포 생존력 검정 키트(프로메가, 카탈로그 번호 G9712)를 사용하여 결정하고, 그래프로 작성하여, 상대 발광 단위(RLU)에 의해 측정되는 상대적인 생존력을 보여주였다. B/B 이량체화제는 이들 실험을 위해 사용하지 않았다.
도 2b에 나타낸 바와 같이, TRIF 및 TRIF+RIPK3의 발현은 CT-26-Tet3G 부모 세포주에 비하여 세포 생존력을 감소시켰으며, 이에 의해, 도 2a에 제시된 결과가 확인된다. 또한, GSDME-발현 세포에서의 TRIF 또는 TRIF+RIPK3 단백질 발현의 유도는 또한 CT-26-Tet3G 부모 세포에 비하여 세포 생존력을 감소시켰다. 종합하여, 이들 결과는 암 세포에서의 TRIF, RIPK3 및 GSDME를 포함하는 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 발현이 암 세포의 생존력을 감소시키는 것을 보여준다.
실시예 6. 대식구 내의 인터페론 자극된 유전자(ISG) 리포터에 대한 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 발현하는 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터의 세포 턴오버 인자(CTF)의 영향
J774-Dual™ 세포(인비보겐(Invivogen), J774-NFIS)를 96-웰 배양 플레이트에 100,000개 세포/웰로 시딩하였다. J774-Dual™ 세포를 2개의 유도 가능한 리포터 구축물의 안정한 통합에 의해 마우스 J774.1 대식구-유사 세포주로부터 유도하였다. 이들 세포는 5 카피의 NF-κB 전사 반응 요소 및 3 카피의 c-Rel 결합 부위에 융합된 IFN-β 최소 프로모터의 제어 하에 분비형 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 발현한다. J774-Dual™ 세포는 또한, 5개의 인터페론-자극된 반응 요소(ISRE)와 함께 ISG54 최소 프로모터의 제어 하에 분비형 루시퍼라제를 인코딩하는 루시아(Lucia) 루시퍼라제 유전자를 발현할 수 있다. 결과적으로, J774-Dual™ 세포는 SEAP의 활성의 평가에 의한 NF-κB 경로, 및 루시아 루시퍼라제의 활성의 모니터링에 의한 인터페론 조절 인자(IRF) 경로의 동시의 연구를 가능하게 한다.
세포 턴오버 인자(CTF)를 함유하는 배양 배지를 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터 생성하였다. 실시예 5에 기재된 타노트랜스미션 모듈에 더하여, 완전히 Tet-유도성 프로모터를 함유하는 추가의 RIPK3 구축물도 또한 평가하였다. 이 Tet-유도성 RIPK3은 도 3a에서 "RIPK3"으로 지정되어 있으며, (실시예 5에 기재된) PGK 프로모터를 함유하는 RIPK3 구축물은 도 3a에서 "PGK_RIPK3"으로 지정되어 있다.
대조군도 또한 포함시켰으며, 이는 면역자극성 타노트랜스미션 없이 세포 사멸을 유도하는 것으로 예측될 것이다. 이들 대조군 구축물은 i) 인간 Bid의 C-말단 카스파제 절단물(NM_197966.3), ii) 인간 GSDMD의 N-말단 카스파제 절단물(NM_001166237.1), iii) 합성적으로 이량체화 가능한 형태의 인간 카스파제-8(DmrB-카스파제-8), 또는 iv) 둘 모두의 DmrB-카스파제-8 및 인간 GSDME(NM_004403.3)를 발현한다. 이어서, J774-Dual™ 세포를 표기된 CTF로 24시간 동안 자극하였다. 세포 배양 배지를 수집하고, 루시퍼라제 활성을 QUANTI-Luc(인비보겐; rep-qlc1) 검정을 사용하여 측정하였다. 인터페론-자극된 반응 요소(ISRE) 프로모터 활성화를 대조군 세포주, CT-26-Tet3G와 비교하여 그래프로 작성하였다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 시험된 CT-26 세포주 중에, (단독으로 또는 RIPK3과 조합하여) TRIF를 발현하는 세포로부터 수집된 배양 배지만이 J774-Dual™ 세포에서 ISRE/IRF 리포터 유전자 활성화를 유도하였다.
개별 실험에서, 가스더민 E(GSDME)와 TRIF 또는 TRIF+RIPK3의 조합된 발현의 영향을 시험하였다. CTF를 함유하는 배양 배지를 실시예 5에 기재된 바와 같이 TRIF 또는 TRIF+RIPK3을 발현하는 CT-26 세포로부터 및 또한 TRIF+가스더민-E 또는 TRIF+RIPK3+가스더민-E를 발현하는 CT-26 세포로부터 생성하였다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, TRIF(iTRIF), TRIF+RIPK3(iTRIF_cR3), TRIF+가스더민-E(iTRIF_cGE), 또는 TRIF+RIPK3+가스더민-E(iTRIF_cR3_cGE)를 발현하는 CT-26 세포로부터의 배양 배지는 각각 J774-Dual™ 세포에서 ISRE/IRF 리포터 유전자 활성화를 유도하였다. 실시예 5에서 논의된 바와 같이, 이량체화제의 첨가는 ISRE/IRF 리포터 유전자 활성화에 영향을 거의 갖지 않았다.
종합하여, 이들 결과는 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 발현하는 암 세포로부터 생산된 CTF가 면역 세포에서 면역-자극 경로(즉, IRF 경로)를 활성화시키는 것을 보여준다.
실시예 7. 골수 유래 수지상 세포(BMDC)에 대한 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 발현하는 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터의 세포 턴오버 인자(CTF)의 영향
골수 세포를 GM-CSF 충분한 RPMI 배양 배지를 사용하여 8일 동안 수지상 세포로 분화시켰다. 2 mL당 400,000개 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 제8일에, 골수 유래 수지상 세포(BMDC)를 수거하고, 100,000개 세포/웰을 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 이어서, BMDC를 실시예 5에 기재된 엔지니어링된 CT-26 세포로부터 유래된 CTF를 함유하는 배지로 자극하였다. 24시간째에, 자극된 세포를 수거하고, 세포 표면 마커 CD86, CD40 및 PD-L1의 발현을 유세포분석에 의해 측정하고, 평균-형광 세기(MFI)를 Tet3G 대조군과 비교하여 그래프로 작성하였다. 항체의 공급처는 하기와 같았다: CD86(바이오레전드(Biolegend), 카탈로그 번호 105042); CD40(바이오레전드, 카탈로그 번호 102910); PD-L1(바이오레전드, 카탈로그 번호 124312). 세포 표면 마커 CD86, CD40 및 PD-L1의 발현은 수지상 세포 성숙을 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 시험된 CT-26 세포주 중에, (단독으로 또는 RIPK3과 조합하여) TRIF를 발현하도록 엔지니어링된 세포로부터 수집된 배양 배지만이 CD86, CD40 또는 PD-L1의 세포 표면 발현을 상승시켰다. 이들 결과는 TRIF 또는 TRIF 및 RIPK3 둘 모두를 발현하도록 엔지니어링된 CT-26 세포로부터의 CTF가 수지상 세포의 성숙을 유도하였음을 나타낸다. 수지상 세포에서의 CD86 및 CD40의 상향조절은 T 세포를 활성화시키는 능력의 증가를 나타낸다. 따라서, 결과는 TRIF, 또는 TRIF 및 RIPK3을 발현하도록 엔지니어링된 암 세포로부터의 CTF가 수지상 세포의 성숙을 유도하고, T 세포를 활성화시키는 이들의 능력을 증가시킬 것을 나타낸다.
실시예 8. 결장 암종의 마우스 모델에서 종양 성장 및 생존에 대한 단독의 또는 항-PD1 항체와 조합된 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현의 영향
실시예 5에 기재된 바와 같은 TRIF 또는 TRIF+RIPK3 타노트랜스미션 모듈을 보유하는 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 트립신 처리하고, 무혈청 배지 중에 1x106개 세포/mL로 재현탁화시켰다. 세포를 BALB/c 마우스의 우측 피하 옆구리 내로 주사하였다(100 mL). CT-26 세포 주사 후 제11일 내지 제18일에, 보통의 식수에 독시사이클린(시그마 알드리치, 카탈로그 번호 D9891)을 2 mg/ml로 보충하여, 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현을 유도하였으며, 제11일 내지 제18일에, B/B 동종이량체화제(다카라, 카탈로그 번호 632622) 2 mg/kg을 매일 복강내 주사에 의해 투여하였다. 항-PD1 항체(바이오엑스셀(BioXcell), 카탈로그 번호 BP0273) 및 아이소타입 대조군을 제14일, 제17일 및 제21일에 투여하였다. IACUC 지침에 따라 종양이 2000 mm3에 도달한 때 또는 실험 종점에 마우스를 안락사시켰다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, 단독의 TRIF(CT26-TF)의 발현은 CT-26-Tet3G 대조군(Tet3G-아이소타입 대조군) 및 CT26-RIPK3 세포(CT26-P_R3)에 비하여 생존을 증가시켰으며, TRIF 및 RIPK3의 조합(Trif_RIPK3-아이소타입 대조군)을 사용하여 훨씬 더 큰 이익이 관찰되었다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, TRIF를 보유하는 CT-26 세포(CT26-TF) 또는 TRIF+RIPK3을 보유하는 CT-26 세포(TRIF_RIPK3)를 주사한 마우스의 생존은 항-PD-1 항체를 이용한 처리에 의해 향상되었으며, 이들 처리군 둘 모두는 100% 생존을 나타낸다(선 중첩).
개별 실험에서, 실시예 6에 기재된 TRIF+GSDME 및 TRIF+RIPK3+GSDME 타노트랜스미션 모듈을 보유하는 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 트립신 처리하고, 무혈청 배지 중에 1x106개 세포/mL로 재현탁화시켰다. 이 실험을 위하여 B/B 동종이량체화제를 사용하지 않았다. 세포를 BALB/c 마우스의 우측 피하 옆구리 내로 주사하였다(100 mL). CT-26 세포 주사 후 제15일 내지 제21일에, 마우스에 625 mg/kg의 독시사이클린 하이클레이트(엔비고(Envigo) TD.01306)를 보충한 Teklad 기본 식이를 공급하였다. IACUC 지침에 따라 종양이 2000 mm3에 도달한 때 또는 실험 종점에 마우스를 안락사시켰다.
도 5c에 나타낸 바와 같이, TRIF 또는 TRIF+RIPK3과 조합된 GSDME의 발현은 단지 TRIF만을 또는 단지 TRIF-RIPK3만을 발현하는 종양이 이식된 마우스에 비하여 생존을 추가로 향상시켰다.
실시예 9. 타노트랜스미션 폴리펩티드를 발현하는 U937 인간 골수성 백혈병 세포에 대한 화학적 카스파제 저해제의 영향
U937 인간 골수성 백혈병 세포 및 THP1-Dual 세포를 각각 ATCC 및 인비보겐으로부터 획득하였다. U937은 골수성 백혈병 세포주이다. 인간 타노트랜스미션 폴리펩티드(tBid, 카스파제 8, RIPK3 또는 TRIF)를 발현하는 U937 세포를 실시예 5 및 6에 기재된 방법 및 실시예 5에 기재된 독시사이클린-유도 가능한 발현 시스템을 사용하여 생성하였다.
THP1-Dual 세포는 NF-kB 또는 IRF 경로의 활성화 시에 리포터 단백질을 유도하는 인간 단핵 세포주이다. 이는 5 카피의 NF-κB 컨센서스 전사 반응 요소 및 3 카피의 c-Rel 결합 부위에 융합된 IFN-β 최소 프로모터에 의해 구동되는 분비형 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 발현한다. THP1-Dual 세포는 또한, 5개의 IFN-자극된 반응 요소와 함께 ISG54 최소 프로모터의 제어 하의 루시아 유전자, 즉, 분비형 루시퍼라제 리포터 유전자를 특징으로 한다. 결과적으로, THP1-Dual 세포는 SEAP의 활성의 모니터링에 의한 NF-kB 경로 및 분비형 루시퍼라제(루시아)의 활성의 평가에 의한 IRF 경로의 동시의 연구를 가능하게 한다.
조정 배지를 생성하기 위하여, 500만개의 U937-tet3G, U937-tBid, U937-카스파제8, U937-RIPK3 또는 U937-TRIF 세포를 RPMI 중에 10 cm 디쉬(dish)에 시딩한 후에, 독시사이클린(1 μg/mL)으로 24시간 동안 처리하여, 발현을 유도하였다. B/B 동종이량체화제(100 nM)를 U937-카스파제8, U937-RIPK3 및 U937-TRIF 세포 배양물에 첨가하여, 올리고머화를 통해 발현 및 단백질 활성화를 촉진시켰다. 또한, U937-TRIF 세포를 또한, 4 μM Q-VD-Oph(범-카스파제 저해제), 10 μM GSK872(RIPK3 저해제) 또는 둘 모두의 조합으로 처리하였다. 세포를 24시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 조정 배지를 수거하고, 멸균 여과하였다.
NF-kB 또는 IRF 리포터 발현에 대한 타노트랜스미션 폴리펩티드 영향을 측정하기 위하여, 100,000개의 THP1-Dual 세포/웰을 100 μl 부피 중에 96-웰 편평-바닥 플레이트에 시딩하였다. 타노트랜스미션 모듈을 발현하는 U937 세포로부터 생성되는 조정 배지 100 μl를 각각의 웰에 첨가하였다. 24시간 인큐베이션 기간 후에, 20 μl의 THP1-Dual 세포 배양 상청액을 편평-바닥 96-웰 백색(불투명) 검정 플레이트에 전달하고, 50 μl의 QUANTI-Luc 검정 용액을 각각의 웰에 첨가한 직후에, 플레이트 판독기에 의해 발광을 판독하였다. NF-kB 활성을 측정하기 위하여, 20 μl의 THP1-Dual 배양 상청액을 편평-바닥 96-웰 투명 검정 플레이트에 전달하고, 180 μl의 재현탁화된 QUANTI-Blue 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 655 nm에서 플레이트 판독기를 사용하여 SEAP 수준을 측정하였다.
도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, 단독의 또는 RIPK3 저해제(Q-VD-Oph+GSK872)와 조합된 카스파제 저해제(Q-VD-Oph)로 처리된 U937-TRIF 세포로부터의 세포 배양물을 이용한 THP-1 Dual 세포의 처리는, NF-kB 활성화 및 IRF 활성을 크게 증가시켰다. (도 6a 내지 도 6c에서, +는 독시사이클린으로 처리되는 U937 세포를 나타내고, ++는 독시사이클린 및 B/B 동종이량체화제로 처리되는 U937 세포를 나타낸다). 단독의 RIPK3 저해제로 처리되는 U937-TRIF 세포로부터의 세포 배양 배지는 THP-1 Dual 세포의 NF-kB 활성화에 영향을 거의 갖지 않았으며, 이는 증가된 NF-kB 활성화가 카스파제 저해로 인한 것이었음을 나타낸다. 도 6b 및 도 6c에 나타낸 바와 같이, 카스파제 저해제로 처리하지 않은 U937-TRIF 세포로부터의 세포 배양 배지를 이용한 THP-1 Dual 세포의 처리는 또한 IRF 활성을 증가시켰지만, 카스파제 저해제로 처리한 U937-TRIF 세포보다는 더 적은 정도였다.
종합하여, 이들 결과는 TRIF를 발현하는 인간 암 세포로부터 생산된 CTF가 면역 세포에서 면역-자극 경로(즉, NF-kB 및 IRF 경로)를 활성화시키며, 카스파제 저해가 이의 효과를 향상시키는 것을 보여준다.
실시예 10. 카스파제 저해제 단백질을 포함하는 조합 타노트랜스미션 폴리펩티드의 발현에 의한 CT-26 마우스 결장 암종 세포에서의 타노트랜스미션의 조절
본 실시예에 기재된 실험은 TRIF 및 RIPK3을 발현하는 암 세포에서의 타노트랜스미션에 대한 카스파제 저해제 단백질의 발현의 영향을 시험하였다.
실시예 5에 기재된 바와 같은, 타노트랜스미션 폴리펩티드 TRIF 및 RIPK3을 발현하는 CT26 마우스 결장 암종 세포를 하기: (i) 우성 음성 버전의 사멸 도메인을 갖는 인간 Fas-관련 단백질(FADD; 수탁 번호 NM_003824); (ii) 짧은 버전의 인간 세포 FLICE-유사 저해성 단백질(cFLIP; 수탁 번호 NM_001127184.4); 또는 (iii) 카스파제의 바이러스 저해제(vICA, HCMV 유전자 UL36; 수탁 번호 NC_006273.2)를 인코딩하는 유전자로 형질도입하여, 카스파제 활성을 저해함으로써 타노트랜스미션을 조절하였다. FADD-DN, cFLIP 및 vICA를 각각 pLV-EF1a-MCS-IRES-Puro 벡터(바이오세티아) 내로 클로닝하고, CT26-TRIF-RIPK3 발현 세포를 형질도입하기 위하여 사용하였다.
이들 세포를 시딩한 후에, 독시사이클린(1 mg/mL; 시그마 알드리치, 0219895525)으로 24시간 동안 처리하여, 발현을 촉진시켰다. 이 실험에서 B/B 동종이량체화제를 사용하지 않았다. 상대적인 세포 생존력을 제조처의 설명에 따라 리얼타임-글로 MT 세포 생존력 검정 키트(프로메가, 카탈로그 번호 G9712)를 사용하여 처리 후 24시간째에 결정하고, 그래프로 작성하여, 상대 발광 단위(RLU)에 의해 측정되는 상대적인 생존력을 보여주었다.
도 7a에 나타낸 바와 같이, CT26-TRIF+RIPK3 세포에서의 FADD-DN, cFLIP 또는 vICA 중 어느 하나의 발현은 TRIF+RIPK3 발현에 의해 유도되는 암 세포 생존력의 감소를 약화시켰다. 그러나, CT26 세포에서의 cFLIP+TRIF+RIPK3 또는 vICA+TRIF+RIPK3의 발현은 부모 CT26-Tet3G 세포주에 비하여 암 세포 생존력을 단독의 TRIF-RIPK3보다 더 적은 정도로만 여전히 감소시켰다. 도 7a를 참조한다.
다음으로, CTF를 함유하는 배양 배지를 상기 기재된 바와 같이 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터 생성하였다. 이어서, J774-Dual™ 세포를 표기된 CTF로 24시간 동안 자극하였다. 세포 배양 배지를 수집하고, 루시퍼라제 활성을 QUANTI-Luc(인비보겐; rep-qlc1) 검정을 사용하여 측정하였다. 인터페론-자극 반응 요소(ISRE) 프로모터 활성화를 대조군 세포주, Tet3G에 비하여 그래프로 작성하였다. 도 7b에 나타낸 바와 같이, TRIF 또는 TRIF+RIPK3을 발현하는 CT26 세포주로부터 수집된 배지는 J774-Dual 세포에서 IRF 리포터 발현을 유도하였다. 또한, TRIF+RIPK3에 더하여 FADD-DN, cFLIP 또는 vICA를 발현하는 CT26 세포로부터의 배지는 또한, J774-Dual 세포에서 IRF 리포터 활성화를 유도하였다.
상기 기재된 FADD-DN, cFLIP 또는 vICA 타노트랜스미션 모듈을 보유하는 CT-26-TRIF+RIPK3 마우스 결장 암종 세포를 트립신 처리하고, 무혈청 배지 중에 1x106개 세포/mL로 재현탁화시켰다. 이 실험에는 B/B 동종이량체화제를 사용하지 않았다. 세포를 면역-적격 BALB/c 마우스의 우측 피하 옆구리 내로 주사하였다(100 μL). CT-26 세포 주사 후 제15일 내지 제21일에, 마우스에 625 mg/kg의 독시사이클린 하이클레이트(엔비고 TD.01306)가 보충된 Teklad 기본 식이를 제공하였다. IACUC 지침에 따라 종양이 2000 mm3에 도달한 때 또는 실험 종점에 마우스를 안락사시켰다.
도 7c에 나타낸 바와 같이, 타노트랜스미션 모듈(즉, TRIF+RIPK3, TRIF+RIPK3+FADD-DN, TRIF+RIPK3+cFLIPS, 또는 TRIF+RIPK3+vICA)을 발현하는 모든 종양의 성장은 대조군 CT26-Tet3G 세포에 비하여 감소되었다. 특히, TRIF+RIPK3과 조합된 FADD-DN 또는 vICA의 발현은 부모 CT26-TRIF+RIPK3 세포에 비하여 종양 성장을 추가로 감소시켰다. 흥미로운 점은, TRIF+RIPK3에 더하여 FADD-DN 또는 vICA를 포함하는 타노트랜스미션 모듈이 생체내에서 종양 성장을 감소시키는 데 가장 효과적이었지만, 시험관내에서 FADD-DN+TRIF+RIPK3은 TRIF+RIPK3 세포에 비하여 CT26 암 세포 생존력에 대하여 영향을 거의 갖지 않은 한편, vICA+TRIF+RIPK3 동시발현은 시험관내에서 TRIF+RIPK3에 비하여 세포 사멸을 향상시켰다. 이들 결과는 타노트랜스미션 모듈에 의한 암 세포 사멸의 세기에 더하여, 이들 모듈의 발현으로 인한 암 세포에 의해 생산된 정밀한 세포 턴오버 인자(CTF) 프로필이 또한 생체내에서 종양 세포에 대한 면역 반응에 기여할 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 11. 항-메조텔린 CAR 및/또는 유도성 미니TRIF를 발현하는 Jurkat T 세포에서 세포 사멸 경로 및 세포 턴오버 인자 활성의 평가
이 실험의 목표는 세포 사멸 방식에 대한 유도성 미니TRIF 발현의 효과, 및 미니TRIF가 발현된 세포에 의해 생산된 세포 턴오버 인자의 면역 자극 활성을 결정하는 것이었다.
항-메조텔린 CAR 및/또는 미니TRIF를 포함하는 유도성 페이로드를 함유하는 Jurkat T 세포를 렌티바이러스 형질도입 접근법을 이용하여 제조하였다. CAR은 항-메조텔린 scFv(SS1), CD3z 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 또는 4-1BB를 포함하는 공동자극 도메인을 함유하였다. 미니TRIF는 T 세포 활성화 유도된 프로모터 NF-AT의 전사 제어 하에 있었다. CAR 및 미니TRIF 구축물의 다이어그램은 도 8에 제공된다. 모든 렌티바이러스를 실시예 5에 기재된 바와 같이 생성하였다. 제조사의 지침에 따라 TransDux Max(System Biosciences; LV680A-1)를 사용하여 NF-AT/미니TRIF, 4-1BB 공동자극 도메인을 함유하는 항-메조텔린 CAR 또는 CD28 공동자극 도메인을 함유하는 항-메조텔린 CAR을 발현하는 렌티바이러스를 사용하여 Jurkat T 세포를 형질도입하였다. NF-AT/미니TRIF 렌티바이러스를 사용하여 형질도입된 세포를 퓨로마이신으로 선택하여 안정한 TS미니TRIFJurkat 세포를 생성하였다. CAR메조텔린-bbz+TS미니TRIFJurkat 세포 및 CAR메조텔린-28z+TS미니TRIFJurkat 세포를 생성하기 위해, 4-1BB를 함유하는 항-메조텔린 CAR 또는 CD28을 함유하는 항-메조텔린 CAR을 발현하는 렌티바이러스를 사용하여 안정한 TS미니TRIFJurkat 세포주를 형질도입하였다.
하기 세포주를 평가하였다.
Figure pct00026
세포를 96-웰 편평 바닥 세포 배양 플레이트에 100,000개 세포/웰로 시딩하였다. 재조합 인간 메조텔린-Fc 키메라 단백질(0 ng/ml, 30 ng/ml, 62 ng/ml, 125 ng/ml, 250 ng/ml, 500 ng/ml, Biolegend Cat#593202) 또는 인간 CD3/CD28 활성화제(25 ul/ml, Stemcell Technologies Cat#10971)를 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 37℃, 5% CO2에서 24시간, 48시간, 또는 72시간 동안 인큐베이션시켰다. CD3/CD28 활성화제를 사용하여 내인성 T 세포 수용체(TCR)를 활성화시킨 반면, 재조합 메조텔린를 사용하여 CAR을 활성화시켰다. 각각의 시점에, THP1-Dual 검정을 위해 세포 배양물로부터 CTF를 함유하는 배양 배지를 수집하고, 세포를 수확하고, 고정성 생존력 염료 eFluor™ 780(1:2000, 인비트로젠(Invitrogen) Cat#65-0865-14) 및 아넥신(Annexin) V(인비트로젠 Cat#88-8005-74)를 사용하여 염색하여 세포 생존력을 평가하였다. 고정성 생존력 염료 eFluor™ 780은 죽은 세포를 표지한다. 따라서, eFluor™ 780 표지된 세포의 백분율은 배양물에서 총 세포 사멸 백분율을 반영한다. 아넥신 V 염색은 아폽토시스 세포 사멸을 나타낸다.
세포 사멸 방식에 대한 CAR 및 미니TRIF의 효과를 조사하기 위해, 아폽토시스 세포 집단에 대한 괴사 세포 집단의 비를 고정성 생존력 염료 eFluor™ 780과 조합하여 아넥신 V 염색을 이용하여 분석하였다. 괴사 세포 집단은 아넥신 V- 및 생존력 염료 eFluor780+인 세포로 정의되는 반면, 아폽토시스 세포 집단은 아넥신 V+ 및 생존력 염료 eFluor780+ 세포로 정의된다.
상이한 CAR Jurkat 세포로부터 수집된 CTF 샘플을 THP1-Dual 검정에 사용하여 CTF의 면역원성을 조사하였다. THP1-dual 리포터를 96-웰 편평 바닥 플레이트에 100,000개 세포/웰로 시딩하였다. CTF 샘플을 THP1-dual 리포터 세포에 1:1 비로 첨가하고, 37'C, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 세포 배양 배지를 수집하고, QUANTI-Luc 검정(인비보젠(Invivogen))을 사용하여 IRF 리포터 발현(루시퍼라제 활성)을 측정하였다.
결과
도 9a 내지 도 9c에 도시된 바와 같이, CAR-발현 세포는 표적 결합 시 용량-의존적 방식으로 사멸되었고, 세포에서 미니TRIF 페이로드의 발현은 세포 사멸의 전체 양을 변화시키지 않았다.
도 10a 내지 도 10c에 도시된 바와 같이, 아폽토시스 세포에 대한 괴사의 비는 미니TRIF 구축물을 함유하지 않은 상응하는 세포(CAR메조텔린-bbz Jurkat)와 비교하여 CAR메조텔린-bbz + TS미니TRIF Jurkat 세포에서 용량-의존적 방식으로 증가하였는데, 이는 미니TRIF의 유도성 발현이 아폽토시스로부터 괴사로의 세포 사멸 방식의 변화를 촉진시켰음을 가리킨다. 또한, 48시간 및 72시간 시점에 미니TRIF 구축물을 함유하지 않은 상응하는 세포(CAR메조텔린-28z Jurkat)에 비해 CAR메조텔린-28z + TS미니TRIF Jurkat 세포에서 유사하지만 더 작은 괴사 세포 사멸의 증가가 관찰되었다. 이들 결과는 미니TRIF 발현이 아폽토시스 세포 사멸로부터 괴사 세포 사멸로의 변화를 촉진시켰음을 추가로 입증해 준다.
도 11a 내지 도 11c에 도시된 바와 같이, 미니TRIF 페이로드-발현 CAR Jurkat T 세포로부터의 CTF는 THP1-Dual 세포에서 IRF 리포터 발현을 활성화시킨 반면, 미니TRIF 구축물을 함유하지 않은 Jurkat T 세포로부터의 CTF는 단지 배경 수준의 IRF 리포터 발현을 야기하였다. 이들 결과는 Jurkat T 세포에서 미니TRIF의 발현이 이들 세포에 의해 생산된 CTF의 면역 자극 활성을 증가시켰음을 입증해 준다. 또한, IRF 활성에 대한 효과는 72시간 시점에 수확된 CTF로 처리된 THP1 세포에서 더 높았는데, 이는 면역 자극 CTF의 수준이 시간이 지남에 따라 증가하였음을 시사한다.
결론
미니TRIF의 유도성 발현은 아폽토시스로부터 괴사로의 세포 사멸 방식의 변화를 촉진시키고, 이러한 세포에 의해 생산된 CTF의 면역 자극 활성을 증가시켰다.
본 개시내용의 서열
Figure pct00027
Figure pct00028
SEQUENCE LISTING <110> FLAGSHIP PIONEERING INNOVATIONS V, INC. <120> IMMUNE CELLS ENGINEERED TO PROMOTE THANOTRANSMISSION AND USES THEREOF <130> 129983-00820 <140> <141> <150> US 63/308,195 <151> 2022-02-09 <150> US 63/216,505 <151> 2021-06-29 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2139 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggcttgca caggaccttc tctgcccagc gcctttgata tcctgggagc cgctggacag 60 gacaagctgc tgtacctgaa gcacaagctg aaaacccctc ggcctggctg ccagggacaa 120 gatctgctgc atgctatggt gctgctgaag ctgggccaag agacagaggc cagaatcagc 180 ctggaagccc tgaaggctga tgccgtggct agactggttg ccagacaatg ggctggcgtg 240 gacagcacag aggaccctga agaacctcct gacgtgtcct gggccgtcgc cagactgtat 300 catctgctgg ccgaagagaa gctgtgcccc gcctctctga gagatgtggc ctatcaagaa 360 gccgtgcgga ccctgagcag cagggatgat catagactgg gcgagctgca ggacgaggcc 420 cggaatagat gtggctggga tattgctggc gaccccggca gcattagaac cctgcagtct 480 aacctgggct gcctgcctcc atcttctgcc ctgccatctg gcacaagaag cctgcctaga 540 cctatcgacg gcgtgtccga ttggagccag 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cagccagcct gctgagcggc ctggtcagac tggacgagca cagccagatt 1020 ttcgccagaa aagtggccaa caccttcaag cctcaccggc tgcaggcccg gaaagccatg 1080 tggcggaagg aacaggacac cagagccctg agagagcaga gccagcacct ggatggcgaa 1140 agaatgcagg ccgctgccct gaatgccgcc tacagcgcct acctgcagag ctacctgtct 1200 tatcaggccc agatggaaca gctgcaggtg gcttttggca gccacatgtc cttcggcacc 1260 ggcgctcctt acggtgccag gatgcccttc ggaggccagg tgccactggg agcccctcct 1320 ccttttccta cctggcccgg ctgcccccaa cctccacctc tgcatgcttg gcaagctgga 1380 acacctccac caccttctcc aaagcctgcc gcatttcccc agtccctgcc ttttcctcag 1440 agccctgctt tcccaaccgc cagcccagct cctccccaga gccctggact gcagcctctg 1500 atcatccacc acgcccagat ggtgcagctc ggactgaaca accacatgtg gaaccagaga 1560 ggctctcagg ctcctgagga caagacacag gaggccgagt ga 1602 <210> 14 <211> 533 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIF variant <400> 14 Met Pro Ile Asp Gly Val Ser Asp Trp Ser Gln Gly Cys Ser Leu Arg 1 5 10 15 Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ile Ser Gln 20 25 30 Ser Pro Thr 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Thr Phe Cys Glu Asp Phe Gln Val Pro Gly 245 250 255 Arg Gly Glu Leu Ser Cys Leu Gln Asp Ala Ile Asp His Ser Ala Phe 260 265 270 Ile Ile Leu Leu Leu Thr Ser Asn Phe Asp Cys Arg Leu Ser Leu His 275 280 285 Gln Val Asn Gln Ala Met Met Ser Asn Leu Thr Arg Gln Gly Ser Pro 290 295 300 Asp Cys Val Ile Pro Phe Leu Pro Leu Glu Ser Ser Pro Ala Gln Leu 305 310 315 320 Ser Ser Asp Thr Ala Ser Leu Leu Ser Gly Leu Val Arg Leu Asp Glu 325 330 335 His Ser Gln Ile Phe Ala Arg Lys Val Ala Asn Thr Phe Lys Pro His 340 345 350 Arg Leu Gln Ala Arg Lys Ala Met Trp Arg Lys Glu Gln Asp Thr Arg 355 360 365 Ala Leu Arg Glu Gln Ser Gln His Leu Asp Gly Glu Arg Met Gln Ala 370 375 380 Ala Ala Leu Asn Ala Ala Tyr Ser Ala Tyr Leu Gln Ser Tyr Leu Ser 385 390 395 400 Tyr Gln Ala Gln Met Glu Gln Leu Gln Val Ala Phe Gly Ser His Met 405 410 415 Ser Phe Gly Thr Gly Ala Pro Tyr Gly Ala Arg Met Pro Phe Gly Gly 420 425 430 Gln Val Pro Leu Gly Ala Pro Pro Pro Phe Pro Thr Trp Pro Gly Cys 435 440 445 Pro Gln Pro Pro Pro Leu His Ala Trp Gln Ala Gly Thr Pro Pro Pro 450 455 460 Pro Ser Pro Lys Pro Ala Ala Phe Pro Gln Ser Leu Pro Phe Pro Gln 465 470 475 480 Ser Pro Ala Phe Pro Thr Ala Ser Pro Ala Pro Pro Gln Ser Pro Gly 485 490 495 Leu Gln Pro Leu Ile Ile His His Ala Gln Met Val Gln Leu Gly Leu 500 505 510 Asn Asn His Met Trp Asn Gln Arg Gly Ser Gln Ala Pro Glu Asp Lys 515 520 525 Thr Gln Glu Ala Glu 530 <210> 15 <211> 483 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIF variant <400> 15 atggagtcta gcagcgagca gaaattctac aacttcgtga tcctgcacgc cagagccgac 60 gagcacattg ccctgagagt gcgcgaaaag ctggaagccc tgggagttcc tgatggcgcc 120 accttctgcg aggatttcca agtgcctgga agaggcgagc tgagctgtct gcaggatgcc 180 atcgatcaca gcgccttcat catcctgctg ctgaccagca acttcgactg cagactgagc 240 ctgcaccaag tgaaccaggc catgatgagc aacctgacca gacagggcag ccccgattgc 300 gtgatcccat tcctgcctct ggaaagcagc cctgctcagc tgtctagcga tacagcctct 360 ctgctgtctg gactcgtgcg gctggatgag cacagccaga tcttcgccag aaaggtggcc 420 aacaccttca agccccatcg gctgcaggcc agaaaagcca tgtggcggaa agagcaggac 480 tga 483 <210> 16 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIF variant <400> 16 Met Glu Ser Ser Ser Glu Gln Lys Phe Tyr Asn Phe Val Ile Leu His 1 5 10 15 Ala Arg Ala Asp Glu His Ile Ala Leu Arg Val Arg Glu Lys Leu Glu 20 25 30 Ala Leu Gly Val Pro Asp Gly Ala Thr Phe Cys Glu Asp Phe Gln Val 35 40 45 Pro Gly Arg Gly Glu Leu Ser Cys Leu Gln Asp Ala Ile Asp His Ser 50 55 60 Ala Phe Ile Ile Leu Leu Leu Thr Ser Asn Phe Asp Cys Arg Leu Ser 65 70 75 80 Leu His Gln Val Asn Gln Ala Met Met Ser Asn Leu Thr Arg Gln Gly 85 90 95 Ser Pro Asp Cys Val Ile Pro Phe Leu Pro Leu Glu Ser Ser Pro Ala 100 105 110 Gln Leu Ser Ser Asp Thr Ala Ser Leu Leu Ser Gly Leu Val Arg Leu 115 120 125 Asp Glu His Ser Gln Ile Phe Ala Arg Lys Val Ala Asn Thr Phe Lys 130 135 140 Pro His Arg Leu Gln Ala Arg Lys Ala Met Trp Arg Lys Glu Gln 145 150 155 <210> 17 <211> 276 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIF variant <400> 17 atgcctatcg acggcgtgtc cgactggtcc caaggctgca gcctgagaag caccggcagc 60 cctgctagcc tggcctctaa tctggaaatc agccaatctc caacaatgcc ccagagccct 120 gccttcccca ccgccagccc agctcctcct cagtctcccg gcctgcagcc tctgatcatc 180 caccacgccc agatggtgca gctgggcctg aacaaccaca tgtggaacca gcggggaagc 240 caggcccctg aggacaaaac ccaggaggcc gaatga 276 <210> 18 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIF variant <400> 18 Met Pro Ile Asp Gly Val Ser Asp Trp Ser Gln Gly Cys Ser Leu Arg 1 5 10 15 Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ile Ser Gln 20 25 30 Ser Pro Thr Met Pro Gln Ser Pro Ala Phe Pro Thr Ala Ser Pro Ala 35 40 45 Pro Pro Gln Ser Pro Gly Leu Gln Pro Leu Ile Ile His His Ala Gln 50 55 60 Met Val Gln Leu Gly Leu Asn Asn His Met Trp Asn Gln Arg Gly Ser 65 70 75 80 Gln Ala Pro Glu Asp Lys Thr Gln Glu Ala Glu 85 90 <210> 19 <211> 591 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIF variant <400> 19 atgcctatcg acggagtgtc cgactggtcc cagggatgta gccttagaag caccggcagc 60 cctgctagcc tggcctctaa cctggaaatc agccagagcc ctacaatgcc agagagcagc 120 agcgagcaga aattctacaa cttcgtgatt ctgcacgcca gagccgacga gcacatcgcc 180 ctgagagtgc gggaaaagct ggaggccctg ggcgtgcctg atggcgccac cttctgcgaa 240 gattttcagg tccccggcag aggcgagctg agctgcctgc aggacgctat cgaccacagc 300 gccttcatca tcctgctgct gacaagcaac ttcgactgca ggctgagcct gcaccaggtg 360 aaccaggcca tgatgagcaa tctgaccaga cagggctccc cagattgcgt gatccccttc 420 ctgcctctgg agagctctcc tgcacagctg tcttctgaca ccgccagcct gctctccggc 480 ctggtgcggc tggacgagca ttctcaaatc ttcgccagaa aagtggccaa cacctttaag 540 ccccacagac tgcaagctcg gaaggccatg tggcggaagg aacaggattg a 591 <210> 20 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIF variant <400> 20 Met Pro Ile Asp Gly Val Ser Asp Trp Ser Gln Gly Cys Ser Leu Arg 1 5 10 15 Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ile Ser Gln 20 25 30 Ser Pro Thr Met Pro Glu Ser Ser Ser Glu Gln Lys Phe Tyr Asn Phe 35 40 45 Val Ile Leu His Ala Arg Ala Asp Glu His Ile Ala Leu Arg Val Arg 50 55 60 Glu Lys Leu Glu Ala Leu Gly Val Pro Asp Gly Ala Thr Phe Cys Glu 65 70 75 80 Asp Phe Gln Val Pro Gly Arg Gly Glu Leu Ser Cys Leu Gln Asp Ala 85 90 95 Ile Asp His Ser Ala Phe Ile Ile Leu Leu Leu Thr Ser Asn Phe Asp 100 105 110 Cys Arg Leu Ser Leu His Gln Val Asn Gln Ala Met Met Ser Asn Leu 115 120 125 Thr Arg Gln Gly Ser Pro Asp Cys Val Ile Pro Phe Leu Pro Leu Glu 130 135 140 Ser Ser Pro Ala Gln Leu Ser Ser Asp Thr Ala Ser Leu Leu Ser Gly 145 150 155 160 Leu Val Arg Leu Asp Glu His Ser Gln Ile Phe Ala Arg Lys Val Ala 165 170 175 Asn Thr Phe Lys Pro His Arg Leu Gln Ala Arg Lys Ala Met Trp Arg 180 185 190 Lys Glu Gln 195 <210> 21 <211> 2166 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIF variant <400> 21 atgcctatcg acggcgtgtc cgattggagc cagggatgtt ctctgcggag cacaggctct 60 cccgcctctc tggccagcaa cctggaaatc agccaatctc ctaccatgcc cgaaagctct 120 tctgagcaga agttctacaa ctttgtgatc ctgcacgccc gggccgacga gcacatcgcc 180 ctgagagtgc gggaaaagct ggaagccctg ggcgtgcccg acggcgcaac attttgtgaa 240 gatttccagg ttcctggtag aggagagctt tcctgtctgc aagacgccat tgaccacagc 300 gccttcatca tcctgctgct gacatctaac ttcgactgca gactgtccct gcaccaggtg 360 aatcaggcca tgatgagcaa tctgaccaga cagggcagcc ctgactgcgt gatccccttc 420 ctgccactgg aaagcagccc tgctcagctg agtagcgaca ccgccagcct gctcagcggc 480 ctggtcagac tggacgaaca ctctcaaatc ttcgccagaa aagtggctaa taccttcaag 540 ccccaccggc tgcaggccag aaaggctatg tggcggaaag aacaggatgg ccccggcgga 600 tccagcggca gcagctgcgt caaactgtgg cctagcggcg cccctgcccc tctggtgtcc 660 atcgaggaac tggaaaacca agagcttgtc ggcaagggcg gcttcggcac tgttttcaga 720 gctcaacaca gaaagtgggg ctacgacgtg gccgtgaaga tcgtgaacag caaggccatc 780 agcagagaag tgaaggccat ggccagcctg gacaacgagt tcgtgctgag actggaggga 840 gtgatcgaga aggtgaactg ggaccaggat cctaaacccg ccctggtgac aaagttcatg 900 gaaaacggca gcctgagcgg actgctgcag agccaatgtc ctagaccttg gcccctgctg 960 tgccggctcc tgaaggaagt ggtgctcggc atgttctacc tgcatgatca gaatcccgtg 1020 ctgctgcaca gagatctgaa accctccaac gtgctgctgg atcctgagct gcacgtgaag 1080 ctggccgatt tcggcctgag cacctttcag ggcggcagtc agagcggcac aggcagcggc 1140 gagcctggcg gcaccctggg ctacctggct cctgagctgt tcgtgaatgt gaatcggaag 1200 gccagcacag cttctgacgt gtatagcttt ggcatcctga tgtgggccgt gctggctgga 1260 agggaagttg agctgcccac cgagcccagc ctggtgtacg aggccgtgtg caaccggcag 1320 aaccggccaa gcctggccga gctgcctcag gctggccctg agacacctgg ccttgagggc 1380 ctgaaggagc tcatgcagct gtgctggagc tccgagccaa aggacagacc atctttccag 1440 gagtgcctgc ctaagaccga cgaggtgttc cagatggtgg aaaacaacat gaacgccgcc 1500 gtcagcaccg tgaaggactt tctgagccag ctgagatctt ccaatagacg cttcagcatc 1560 cctgagtctg gacagggagg aacagagatg gacggattcc ggagaaccat cgagaaccag 1620 cactcccgga acgacgtgat ggtcagcgag tggctgaaca agctgaacct ggaagagcct 1680 ccaagctcag tgcccaagaa gtgcccctct ctgaccaaaa gaagcagagc ccaggaggaa 1740 caggtgcctc aggcctggac cgccggaaca agcagcgaca gcatggccca gcctccgcaa 1800 acacctgaaa ccagcacctt cagaaaccag atgcctagcc ccaccagcac cggcacccct 1860 tcccctggcc ccagaggcaa ccagggcgca gagcggcagg gcatgaactg gtcctgccgc 1920 acccccgagc ccaaccctgt gaccggccgg cctctggtga acatctacaa ctgcagcggt 1980 gtgcaggtgg gtgataacaa ttacctgacc atgcagcaga ccaccgctct gccaacatgg 2040 ggcctcgccc cttctggcaa gggcagaggc ctgcagcatc ctcctcctgt gggctctcag 2100 gaaggaccta aggaccccga ggcctggagc aggcctcagg gctggtacaa ccactcaggc 2160 aaatga 2166 <210> 22 <211> 721 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIF variant <400> 22 Met Pro Ile Asp Gly Val Ser Asp Trp Ser Gln Gly Cys Ser Leu Arg 1 5 10 15 Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ile Ser Gln 20 25 30 Ser Pro Thr Met Pro Glu Ser Ser Ser Glu Gln Lys Phe Tyr Asn Phe 35 40 45 Val Ile Leu His Ala Arg Ala Asp Glu His Ile Ala Leu Arg Val Arg 50 55 60 Glu Lys Leu Glu Ala Leu Gly Val Pro Asp Gly Ala Thr Phe Cys Glu 65 70 75 80 Asp Phe Gln Val Pro Gly Arg Gly Glu Leu Ser Cys Leu Gln Asp Ala 85 90 95 Ile Asp His Ser Ala Phe Ile Ile Leu Leu Leu Thr Ser Asn Phe Asp 100 105 110 Cys Arg Leu Ser Leu His Gln Val Asn Gln Ala Met Met Ser Asn Leu 115 120 125 Thr Arg Gln Gly Ser Pro Asp Cys Val Ile Pro Phe Leu Pro Leu Glu 130 135 140 Ser Ser Pro Ala Gln Leu Ser Ser Asp Thr Ala Ser Leu Leu Ser Gly 145 150 155 160 Leu Val Arg Leu Asp Glu His Ser Gln Ile Phe Ala Arg Lys Val Ala 165 170 175 Asn Thr Phe Lys Pro His Arg Leu Gln Ala Arg Lys Ala Met Trp Arg 180 185 190 Lys Glu Gln Asp Gly Pro Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ser Cys Val Lys 195 200 205 Leu Trp Pro Ser Gly Ala Pro Ala Pro Leu Val Ser Ile Glu Glu Leu 210 215 220 Glu Asn Gln Glu Leu Val Gly Lys Gly Gly Phe Gly Thr Val Phe Arg 225 230 235 240 Ala Gln His Arg Lys Trp Gly Tyr Asp Val Ala Val Lys Ile Val Asn 245 250 255 Ser Lys Ala Ile Ser Arg Glu Val Lys Ala Met Ala Ser Leu Asp Asn 260 265 270 Glu Phe Val Leu Arg Leu Glu Gly Val Ile Glu Lys Val Asn Trp Asp 275 280 285 Gln Asp Pro Lys Pro Ala Leu Val Thr Lys Phe Met Glu Asn Gly Ser 290 295 300 Leu Ser Gly Leu Leu Gln Ser Gln Cys Pro Arg Pro Trp Pro Leu Leu 305 310 315 320 Cys Arg Leu Leu Lys Glu Val Val Leu Gly Met Phe Tyr Leu His Asp 325 330 335 Gln Asn Pro Val Leu Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Val Leu 340 345 350 Leu Asp Pro Glu Leu His Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ser Thr 355 360 365 Phe Gln Gly Gly Ser Gln Ser Gly Thr Gly Ser Gly Glu Pro Gly Gly 370 375 380 Thr Leu Gly Tyr Leu Ala Pro Glu Leu Phe Val Asn Val Asn Arg Lys 385 390 395 400 Ala Ser Thr Ala Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Ile Leu Met Trp Ala 405 410 415 Val Leu Ala Gly Arg Glu Val Glu Leu Pro Thr Glu Pro Ser Leu Val 420 425 430 Tyr Glu Ala Val Cys Asn Arg Gln Asn Arg Pro Ser Leu Ala Glu Leu 435 440 445 Pro Gln Ala Gly Pro Glu Thr Pro Gly Leu Glu Gly Leu Lys Glu Leu 450 455 460 Met Gln Leu Cys Trp Ser Ser Glu Pro Lys Asp Arg Pro Ser Phe Gln 465 470 475 480 Glu Cys Leu Pro Lys Thr Asp Glu Val Phe Gln Met Val Glu Asn Asn 485 490 495 Met Asn Ala Ala Val Ser Thr Val Lys Asp Phe Leu Ser Gln Leu Arg 500 505 510 Ser Ser Asn Arg Arg Phe Ser Ile Pro Glu Ser Gly Gln Gly Gly Thr 515 520 525 Glu Met Asp Gly Phe Arg Arg Thr Ile Glu Asn Gln His Ser Arg Asn 530 535 540 Asp Val Met Val Ser Glu Trp Leu Asn Lys Leu Asn Leu Glu Glu Pro 545 550 555 560 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Claims (117)

  1. (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로서, CAR이 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및
    (b) 면역 세포의 활성화 시 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 면역 세포로서,
    T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 또는 대식구인 면역 세포.
  2. 제1항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 적어도 하나의 TCR-형 신호전달 도메인을 포함하는 면역 세포.
  3. 제2항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 적어도 하나의 공동자극 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 면역 세포.
  4. 제3항에 있어서, CAR이 힌지 도메인을 추가로 포함하는 면역 세포.
  5. 제1항에 있어서, 프로모터가 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 시 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 면역 세포.
  6. 제1항에 있어서, 이종성 프로모터가 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 프로모터, STAT 프로모터, AP-1 프로모터, NF-κB 프로모터, 및 IRF4 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 세포.
  7. 제2항에 있어서, TCR-형 신호전달 도메인이 CD3제타의 세포내 도메인을 포함하는 면역 세포.
  8. 제7항에 있어서, CD3제타의 세포내 도메인이 하나 이상의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)에서 하나 이상의 티로신 잔기의 돌연변이를 포함하는 면역 세포.
  9. 제1항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이
    (a) CD3제타의 세포내 도메인과 CD28의 공동자극 신호전달 도메인;
    (b) CD3제타의 세포내 도메인과 4-1BB의 공동자극 신호전달 도메인; 및
    (c) CD28의 공동자극 신호전달 도메인, 4-1BB의 공동자극 신호전달 도메인, CD27 또는 CD134의 공동자극 신호전달 도메인, 및 CD3제타의 세포내 도메인
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 도메인의 조합을 포함하는 면역 세포.
  10. 제1항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 CD28의 공동자극 신호전달 도메인 및 CD3제타의 세포내 도메인을 포함하는 면역 세포.
  11. 제1항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 4-1BB의 공동자극 신호전달 도메인 및 CD3제타의 세포내 도메인을 포함하는 면역 세포.
  12. 제1항에 있어서, 항원 결합 도메인이 암 세포의 표면에서 우선적으로 발현되는 단백질에 결합하는 면역 세포.
  13. 제12항에 있어서, 암 세포가 고형 암인 면역 세포.
  14. 제12항에 있어서, 암이 비-고형 암인 면역 세포.
  15. 제1항에 있어서, 항원 결합 도메인이 메조텔린에 결합하는 면역 세포.
  16. 제1항에 있어서, 항원 결합 도메인이 CD19, CD20, CD22, CD23, 카파 경쇄, CD5, CD30, CD70, CD38, CD138, BCMA, CD33, CD123, CD44v6, CS1 및 ROR1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에 결합하는 면역 세포.
  17. 제1항에 있어서, 항원 결합 도메인이 CD44v6, 탄산 탈수효소 IX(CAIX), 암배아 항원(CEA), CD133, 간세포 성장 인자 수용체(c-Met), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), III형 변이체 표피 성장 인자 수용체(EGFRvIII), 상피 세포 부착 분자(Epcam), 에리트로포에틴 생산 간세포 암종 A2(EphA2), 태아 아세틸콜린 수용체, 엽산 수용체 알파(Fra), 강글리오시드 GD2(GD2), 글리피칸-3(GPC3), 구아닐릴 사이클라제 C(GUCY2C), 인간 표피 성장 인자 수용체 1(HER1), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2), 세포간 부착 분자 1(ICAM-1), 인터류킨 13 수용체 a2(IL13Ra2), 인터류킨 11 수용체 a(IL11Ra), Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자 상동체(Kras), Kras G12D, L1-세포 부착 분자(L1CAM), MAGE, MET, 메조텔린, 뮤신 1(MUC1), 뮤신 16(MUC16 엑토), 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D), NY-ESO-1, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 윌름스 종양 1(WT-1), PSMA1, LAP3, ANXA3, 마스핀, 올팩토메딘 4, CD11b, 인테그린 알파-2, 섬유모세포 활성화 단백질(FAP), 루이스-Y 및 TAG72로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에 결합하는 면역 세포.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 인코딩하는 면역 세포.
  19. 제18항에 있어서, TRIF 변이체가 표 2에 열거된 TRIF 변이체인 면역 세포.
  20. 제18항에 있어서, TRIF 변이체가 표 2에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 면역 세포.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 사멸 폴드 도메인을 인코딩하는 면역 세포.
  22. 제21항에 있어서, 사멸 폴드 도메인이 사멸 도메인, 피린(pyrin) 도메인, 사멸 이펙터 도메인(Death Effector Domain; DED), C-말단 카스파제 동원 도메인(CARD), 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 세포.
  23. 제22항에 있어서, 사멸 도메인이 사멸 도메인을 갖는 Fas-관련 단백질(FADD), Fas, 종양 괴사 인자 수용체 1형 관련 사멸 도메인(TRADD), 종양 괴사 인자 수용체 1형(TNFR1), 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터의 것인 면역 세포.
  24. 제22항에 있어서, 피린 도메인이 NLR 패밀리 피린 도메인 함유 3(NLRP3) 및 아폽토시스-관련 반점-유사 단백질(ASC)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터의 것인 면역 세포.
  25. 제22항에 있어서, 사멸 이펙터 도메인(DED)이 사멸 도메인을 갖는 Fas-관련 단백질(FADD), 카스파제-8 및 카스파제-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터의 것인 면역 세포.
  26. 제22항에 있어서, CARD가 RIP-관련 ICH1/CED3-상동성 단백질(RAIDD), 아폽토시스-관련 반점-유사 단백질(ASC), 미토콘드리아 항바이러스-신호전달 단백질(MAVS), 카스파제-1, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터의 것인 면역 세포.
  27. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 톨/인터류킨-1 수용체(TIR) 도메인을 인코딩하는 면역 세포.
  28. 제27항에 있어서, TIR 도메인이 골수 분화 일차 반응 단백질 88(MyD88), 톨/인터류킨-1 수용체(TIR)-도메인-함유 어댑터-유도 인터페론-β(TRIF), 톨 유사 수용체 3(TLR3), 톨 유사 수용체 4(TLR4), TIR 도메인 함유 연결자 단백질(TIRAP), 전위 쇄-관련 막 단백질(TRAM), 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터의 것인 면역 세포.
  29. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 TIR 도메인을 포함하는 단백질을 인코딩하는 면역 세포.
  30. 제29항에 있어서, TIR 도메인을 포함하는 단백질이 골수 분화 일차 반응 단백질 88(MyD88), 톨/인터류킨-1 수용체(TIR)-도메인-함유 어댑터-유도 인터페론-β(TRIF), 톨 유사 수용체 3(TLR3), 톨 유사 수용체 4(TLR4), TIR 도메인 함유 연결자 단백질(TIRAP), 전위 쇄-관련 막 단백질(TRAM), 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 세포.
  31. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 세포 FLICE(FADD-유사 IL-1β-전환 효소)-저해성 단백질(c-FLIP), 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 1(RIPK1), 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 3(RIPK3), Z-DNA-결합 단백질 1(ZBP1), 혼합 계통 키나제 도메인 유사 슈도키나제(MLKL), TIR 도메인 및 RHIM 도메인만을 포함하는 TRIF의 N-말단 절단, 사멸 도메인을 갖는 Fas-관련 단백질의 우성 음성 돌연변이체(FADD-DD), myr-FADD-DD, 저해제 kBα 슈퍼-리프레서(IkBα-SR), 인터류킨-1 수용체-관련 키나제 1(IRAK1), 종양 괴사 인자 수용체 1형-관련 사멸 도메인(TRADD), 카스파제-8의 우성 음성 돌연변이체, 인터페론 조절 인자 3(IRF3), 가스더민-A(GSDM-A), 가스더민-B(GSDM-B), 가스더민-C(GSDM-C), 가스더민-D(GSDM-D), 가스더민-E(GSDM-E), 아폽토시스-관련 반점-유사 단백질(ASC), 그랜자임 A, 이량체화 도메인을 갖는 C-말단 카스파제 동원 도메인을 함유하는 아폽토시스-관련 반점-유사 단백질(ASC-CARD), 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 면역 세포.
  32. 제31항에 있어서, TIR 도메인 및 RHIM 도메인만을 포함하는 TRIF의 N-말단 절단이 인간 TRIF의 아미노산 잔기 1 내지 311의 결실을 포함하는 면역 세포.
  33. 제31항에 있어서, TIR 도메인 및 RHIM 도메인만을 포함하는 TRIF의 N-말단 절단이 SEQ ID NO: 12를 포함하거나 이로 이루어지는 면역 세포.
  34. 제31항에 있어서, cFLIP가 인간 cFLIP인 면역 세포.
  35. 제31항에 있어서, cFLIP가 카스파제-8 및 FADD 유사 아폽토시스 조절 인자(cFLR)인 면역 세포.
  36. 제31항에 있어서, ZBP1이 수용체-상호작용 단백질 호모타입 상호작용 모티프(RHIM) C의 결실, RHIM D의 결실, 및 Za1 도메인의 N-말단에서의 결실을 포함하는 면역 세포.
  37. 제31항에 있어서, ZBP1이 ZBP1-Za1/RHIM A 절단인 면역 세포.
  38. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 바이러스 유전자를 포함하는 면역 세포.
  39. 제38항에 있어서, 바이러스 유전자가 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스(KSHV)로부터의 vFLIP(ORF71/K13), 전염성 연속종 바이러스로부터의 MC159L, 말 헤르페스 바이러스 2로부터의 E8, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 또는 뮤린 사이토메갈로바이러스(MCMV)로부터의 vICA, 소 두창 바이러스로부터의 CrmA, 및 아우토그라파 칼리포르니카 멀티캡시드 뉴클레오폴리헤드로바이러스(AcMNPV)로부터의 P35로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 면역 세포.
  40. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하고, 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드가 TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3, 카스파제, FADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma, TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D, 가스더민 E, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFSF) 단백질, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 세포.
  41. 제40항에 있어서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 적어도 2개의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 폴리뉴클레오티드가 TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3, 카스파제, FADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma, TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D, 가스더민 E, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFSF) 단백질, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 면역 세포.
  42. 제40항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2개를 포함하는 키메라 단백질을 인코딩하는 면역 세포.
  43. 제40항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 단일 전사체로서 전사되는 면역 세포.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하는 면역 세포.
  45. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하는 면역 세포.
  46. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하는 면역 세포.
  47. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 MAVS 또는 이의 변이체를 포함하고, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하는 면역 세포.
  48. 제44항에 있어서, TRIF 변이체가 표 2에 열거된 TRIF 변이체이거나, 표 2에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 면역 세포.
  49. 제44항에 있어서, TRIF 변이체가 TIR 도메인 및 RHIM 도메인만을 포함하는 TRIF의 N-말단 절단인 면역 세포.
  50. 제44항에 있어서, TRIF 변이체가 인간 TRIF의 아미노산 잔기 1 내지 311의 결실을 포함하는 면역 세포.
  51. 제49항에 있어서, TIR 도메인 및 RHIM 도메인만을 포함하는 TRIF의 N-말단 절단이 SEQ ID NO: 12를 포함하거나 이로 이루어지는 면역 세포.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하는 면역 세포.
  53. 제52항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 FADD 우성 음성 돌연변이체(FADD-DN), cFLIP, vICA, 카스파제 8 우성 음성 돌연변이체(Casp8-DN), cIAP1, cIAP2, Tak1, IKK, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 세포.
  54. 제52항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 FADD-DN인 면역 세포.
  55. 제52항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 cFLIP인 면역 세포.
  56. 제52항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 vICA인 면역 세포.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 가스더민 또는 이의 변이체를 인코딩하는 면역 세포.
  58. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 인코딩하고, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 인코딩하고, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 가스더민 또는 이의 변이체를 인코딩하는 면역 세포.
  59. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 MAVS 또는 이의 변이체를 인코딩하고, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 인코딩하고, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 가스더민 또는 이의 변이체를 인코딩하는 면역 세포.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 가스더민이 가스더민 E 또는 이의 변이체인 면역 세포.
  61. 제18항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체가 타노트랜스미션 폴리펩티드의 기능성 단편인 면역 세포.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 이량체화 도메인을 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 면역 세포.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 이량체화 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질 내에 포함되는 면역 세포.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 이량체화 도메인이 타노트랜스미션 폴리펩티드에 이종성인 면역 세포.
  65. 대상체에서 타노트랜스미션을 촉진시키는 방법으로서, 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 면역 세포를 대상체에서 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  66. 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 방법으로서, 표적 세포, 또는 표적 세포를 포함하는 조직을 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 면역 세포와, 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  67. 면역 반응의 촉진을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 촉진시키는 방법으로서, 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 면역 세포를 면역 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하여 대상체에서 면역 반응을 촉진시키는 단계를 포함하는 방법.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여되는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 표적 세포가 암 세포, 면역 세포, 내피 세포 및 섬유모세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  70. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 감염을 갖는 방법.
  71. 제66항 및 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 병원체에 감염된 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 감염이 바이러스 감염인 방법.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 감염이 만성 감염인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 만성 감염이 HIV 감염, HCV 감염, HBV 감염, HPV 감염, B형 간염 감염, C형 간염 감염, EBV 감염, CMV 감염, TB 감염, 및 기생충 감염으로부터 선택되는 방법.
  75. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 면역 세포를 대상체에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 면역 세포를 대상체에게 투여하는 것이 대상체에서 암 세포의 증식을 감소시키는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 암 세포의 증식이 대상체에게 투여된 암 요법으로 인한 암 세포의 과증식인 방법.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포를 대상체에게 투여하는 것이 대상체에서 암 세포의 전이를 감소시키는 방법.
  79. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포를 대상체에게 투여하는 것이 대상체에서 종양의 혈관신생을 감소시키는 방법.
  80. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하는 것이 종양 부담의 감소, 종양 크기의 감소, 종양 성장의 저해, 치료 이전에 진행성 암을 갖는 대상체에서의 안정한 암의 달성, 암의 진행까지의 시간 증가 및 생존 시간 증가 중 임의의 하나 이상을 포함하는 방법.
  81. 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 면역-자극성 세포 턴오버 경로가 암에서 유도되는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 암에 면역-자극성 세포 턴오버 경로가 결핍되어 있는 방법.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 면역-자극성 세포 턴오버 경로가 네크롭토시스, 외인성 아폽토시스, 페롭토시스 및 파이롭토시스로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  84. 제75항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 면역 체크포인트 요법에 반응성인 암인 방법.
  85. 제75항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 암종, 육종, 림프종, 흑색종, 및 백혈병으로부터 선택되는 방법.
  86. 제75항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 전이성 암인 방법.
  87. 제75항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 고형 종양인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 고형 종양이 결장암, 연조직 육종(STS), 전이성 투명 세포 신세포 암종(ccRCC), 난소암, 위장암, 대장암, 간세포 암종(HCC), 교모세포종(GBM), 유방암, 흑색종, 비-소세포 폐암(NSCLC), 육종, 악성 흉막, 중피종(MPM), 망막모세포종, 신경교종, 수모세포종, 골육종, 유잉 육종, 췌장암, 폐암, 위암, 복부암(stomach cancer), 식도암, 간암, 전립선암, 부인과 암, 비인두 암종, 골육종, 횡문근육종, 요로상피 방광 암종, 신경모세포종, 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  89. 제75항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 흑색종, 자궁경부암, 유방암, 난소암, 전립선암, 고환암, 요로상피 암종, 방광암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 육종, 대장 선암종, 위장관 간질 종양, 위식도 암종, 대장암, 췌장암, 신장암, 간세포암, 악성 중피종, 백혈병, 림프종, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 이행 세포 암종, 신경모세포종, 형질 세포 신생물, 윌름스 종양, 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  90. 제75항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 고형 종양이 아닌 방법.
  91. 제90항에 있어서, 암이 백혈병, 림프종, B 세포 악성종양, T 세포 악성종양, 다발성 골수종, 골수성 악성종양, 및 혈액 악성종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  92. 제65항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 대상체에게 정맥내 투여되는 방법.
  93. 제65항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 대상체에게 종양내 투여되는 방법.
  94. 제65항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 항-신생물제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 항-신생물제가 화학치료제인 방법.
  96. 제94항에 있어서, 항-신생물제가 생물학적 작용제인 방법.
  97. 제96항에 있어서, 생물학적 작용제가 항원 결합 단백질인 방법.
  98. 제96항에 있어서, 생물학적 작용제가 종양용해 바이러스인 방법.
  99. 제94항에 있어서, 항-신생물제가 면역치료제인 방법.
  100. 제99항에 있어서, 면역치료제가 톨-유사 수용체(TLR) 효능제, 세포-기반 요법, 사이토카인, 암 백신, 및 면역 체크포인트 분자의 면역 체크포인트 조절제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  101. 제100항에 있어서, 세포-기반 요법이 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포) 요법인 방법.
  102. 제100항에 있어서, 면역 체크포인트 분자가 CD27, CD28, CD40, OX40, GITR, ICOS, 4-1BB, ADORA2A, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, KIR, LAG-3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, 및 VISTA로부터 선택되는 방법.
  103. 제100항에 있어서, 면역 체크포인트 분자가 자극성 면역 체크포인트 분자이고, 면역 체크포인트 조절제가 자극성 면역 체크포인트 분자의 효능제인 방법.
  104. 제100항에 있어서, 면역 체크포인트 분자가 저해성 면역 체크포인트 분자이고, 면역 체크포인트 조절제가 저해성 면역 체크포인트 분자의 길항제인 방법.
  105. 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 체크포인트 조절제가 소분자, 저해성 RNA, 안티센스 분자, 및 면역 체크포인트 분자 결합 단백질로부터 선택되는 방법.
  106. 제100항에 있어서, 면역 체크포인트 분자가 PD-1이고, 면역 체크포인트 조절제가 PD-1 저해제인 방법.
  107. 제106항에 있어서, PD-1 저해제가 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab), 피딜리주맙(pidilizumab), SHR-1210, MEDI0680R01, BBg-A317, TSR-042, REGN2810 및 PF-06801591로부터 선택되는 방법.
  108. 제100항에 있어서, 면역 체크포인트 분자가 PD-L1이고, 면역 체크포인트 조절제가 PD-L1 저해제인 방법.
  109. 제108항에 있어서, PD-L1 저해제가 두발루맙(durvalumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), MDX-1105, AMP-224 및 LY3300054로부터 선택되는 방법.
  110. 제100항에 있어서, 면역 체크포인트 분자가 CTLA-4이고, 면역 체크포인트 조절제가 CTLA-4 저해제인 방법.
  111. 제110항에 있어서, CTLA-4 저해제가 이필리무맙(ipilimumab), 트레멜리무맙(tremelimumab), JMW-3B3 및 AGEN1884로부터 선택되는 방법.
  112. 제94항에 있어서, 항-신생물제가 히스톤 데아세틸라제 저해제인 방법.
  113. 제112항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 저해제가 하이드록삼산, 벤즈아미드, 사이클릭 테트라펩티드, 뎁시펩티드, 친전자성 케톤 또는 지방족 화합물인 방법.
  114. 제113항에 있어서, 하이드록삼산이 보리노스타트(vorinostat)(SAHA), 벨리노스타트(belinostat)(PXD101), LAQ824, 트리코스타틴(trichostatin) A 또는 파노빈 오스타트(panobin ostat)(LBH589)인 방법.
  115. 제113항에 있어서, 벤즈아미드가 엔티노스타트(entinostat)(MS-275), 01994 또는 모세티노스타트(mocetinostat)(MGCD0103)인 방법.
  116. 제113항에 있어서, 사이클릭 테트라펩티드가 트라폭신(trapoxin) B인 방법.
  117. 제113항에 있어서, 지방족 화합물이 페닐 부티레이트 또는 발프로산인 방법.
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