CN104829720B - Kir结合剂和使用其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够通过减少抑制性KIR信号转导而不减少KIR对HLA‑C的结合来促进NK细胞介导的靶细胞的杀伤的试剂和方法。如此处所描述的，在KIR结合其HLA I类配体后，通过KIR的负信号的转导可包括配体结合诱导的KIR分子的构象再定向(reorientation)，该构象再定向允许相邻的KIR之间在特定的结构域中形成相互作用，从而导致加速的群集。提供了通过例如减少或阻止KIR的二聚化而不减少或阻止HLA结合来减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的方法和试剂例如单克隆抗体。

Description

KIR结合剂和使用其的方法
本申请是申请日为2006年1月6日、申请号为200680001919.6、发明名称为“KIR结合剂和使用其的方法”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及能够通过减少抑制性KIR信号转导来增进NK介导的靶细胞杀伤的试剂和方法。此外，本发明涉及这些试剂用于制备药物的用途以及产生抗体的方法和产生这些抗体的杂交瘤和转染的细胞系。
发明背景
天然杀伤(NK)细胞是参与免疫和宿主免疫监督系统的淋巴细胞的亚群。
NK细胞是在骨髓中从淋巴祖细胞发育而来的单核细胞，且形态学特征和生物学性质一般包括簇决定子(cluster determinant)(CDs)CD16、CD56和/或CD57的表达；在细胞表面缺乏α/β或γ/δTCR复合物；结合和杀死不能表达“自身”主要组织相容性复合物(MHC)/人白细胞抗原(HLA)蛋白的靶细胞的能力；和杀死表达能激活NK受体的配体的肿瘤细胞或其他疾病细胞的能力。NH细胞的特征在于其结合和杀死几种类型的肿瘤细胞而无需预先免疫或激活的能力。NK细胞也可释放对免疫系统产生调控效应的可溶性蛋白和细胞因子；和可进行多轮细胞分裂和产生子细胞，所述子细胞具有和亲本细胞相似的生物学特征。被干扰素和/或细胞因子激活后，NK细胞通过要求NK细胞和靶细胞之间直接的、机械接触的机制介导肿瘤细胞和和感染有细胞内病原体的细胞的裂解。靶细胞的裂解包括细胞毒性颗粒从NK细胞释放至结合的靶的表面，和效应蛋白例如穿过靶质膜和诱导凋亡或编程性细胞死亡的穿孔蛋白和粒酶B的释放。正常健康的细胞受到保护而免受NK细胞的裂解。
基于其生物学特性，在本领域已提出了各种基于NK细胞的调节的治疗和疫苗接种策略。然而，NK细胞的活性受到包括刺激和抑制信号的复合机制的调控。
简而言之，NK细胞的裂解活性受各种细胞表面受体调控，所述受体通过与靶细胞上的配体相互作用转导正或负细胞内信号。通过这些受体传导的正和负信号之间的平衡确定靶细胞是否被NK细胞裂解(杀死)。NK细胞刺激性信号可由天然毒性受体(NCR)例如NKp30、NKp44和NKp46；和CD94/NKG2C受体、NKG2D受体、某些激活杀伤细胞Ig样受体(KIR)和其他激活NK受体介导(Lanier,Annual Review of Immunology 2005；23:225-74)。NK细胞的抑制性信号可由受体如识别主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的Ly49、CD94/NKG2A和某些抑制性KIR介导(等人,Nature 1986；319:675-8；等人,Science1989；246:666-8)。这些抑制性受体结合存在于其他细胞上的MHC I类分子(包括HLA I类)的多态性决定子并抑制NK细胞介导的裂解。
已在人和非人灵长类动物中表征了KIR，其是存在于某些淋巴细胞亚群(包括NK细胞和一些T细胞)上的多态性1型跨膜分子。KIR与MHC I类分子的α1和2结构域中的决定子相互作用且，如上所述，不同的KIR对于NK细胞是刺激性的或是抑制性的。
KIR的命名法基于细胞外结构域的数目(分别具有两个和三个细胞外Ig结构域的KIR2D和KIR3D)和胞质尾区是长的(KIR2DL或KIR3DL)还是短的(KIR2DS或KIR3DS)。在存在于单个个体中的NK群体内，给定的KIR的存在或不存在的情况在NK细胞之间是可变化的。在人中，也存在相对高水平的KIR基因的多态性，某些KIR基因存在于一些但非所有的个体中。NK细胞上的KIR等位基因的表达是受到随机调控的，意思是，在给定的个体中，依赖于个体的基因型，给定的淋巴细胞可表达1、2或更多种不同的KIR。单个个体的NK细胞通常表达不同的KIR组合，从而提供了具有不同的对于MHC I类分子的特异性的NK细胞库(repertoire)。
某些KIR基因产物，当与恰当的配体结合时，引起淋巴细胞活性的刺激。激活性KIR都具有短胞质尾区和带电荷的跨膜残基，所述带正电荷的跨膜残基与具有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的衔接分子结合，所述衔接分子传导刺激信号给NK细胞。相反地，抑制性KIR具有包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的长胞质尾区，所述胞质尾区在与其MHCI类配体结合后将抑制性信号转导至NK细胞。已报导，将NK细胞与表达HLA-C的昆虫细胞混合足以诱导KIR的群集以及KIR和SHP-1的磷酸化(Faure等人,J Immunol2003；170:6107-6114)。也已报导KIR2DL1在Co(2+)存在的情况下的二聚化以及用Ala取代氨基末端His消除了KIR2DL1结合Co(2+)的能力(Fan等人,J.Biol.Chem.2000.98:1734)。
已知的抑制性KIR包括KIR2DL和KIR3DL亚家族的成员。具有两个Ig结构域的抑制性KIR(KIR2DL)识别HLA-C同种异型(al lotype)：KIR2DL2(以前称为p58.2)和紧密相关的等位基因产物KIR2DL3都识别“组1”HLA-C同种异型(包括HLA-Cw1、-3、-7和-8)，然而KIR2DL1(p58.1)识别“组2”HLA-C同种异型(例如HLA-Cw2、-4、-5和-6)。被KIR2DL1识别是由在HLA-C等位基因的位点80上存在Lys残基决定的。KIR2DL2和KIR2DL3的识别由在HLA-C的位置80上存在Asn残基决定的。重要的是，绝大部分HLA-C等位基因在位置80上具有Asn或Lys残基。因此，KIR2DL1、-2和-3一起识别几乎所有在人中发现的HLA-C同种异型。一种具有3个Ig结构域的KIR即KIR3DL1(p70)识别由HLA-Bw4等位基因共有的表位。最后，KIR3DL2(p140)(其作为具有3个Ig结构域的分子的二硫键合的同型二聚体组成型地存在)识别HLA-A3和-A11。
尽管多个抑制性KIR和/或其他MHC I类特异性抑制性受体(Moretta等人,Eur JImmunogenet.1997；24(6):455-68；Valiante等人,Immunol Rev 1997；155:155-64；Lanier,Annu Rev Immunol1998；16:359-93)可由NK细胞共表达，但在任何给定的个体NK库中，存在只表达单种KIR的细胞，所述细胞从而只被特定的MHC I类等位基因(或属于相同的MHC I类同种异型的组的等位基因)抑制。人MHC I类分子通常称为人组织相容性抗原(HLA)I类。
与其靶发生KIR-配体错配的NK细胞群体或克隆，即表达不识别宿主的任何HLA分子的KIR的那些，已显示在白血病患者中在同种异体骨髓移植后介导有效的、救命的抗肿瘤反应(Ruggeri等人,Science2002,295:2097-2100)。背后的机制据认为是HLA错配的造血移植导致供体来源的NK细胞的扩增，所述NK细胞表达不识别接受者中的任何HLA配体的KIR从而不受通过KIR的抑制。这些同种异型NK克隆产生有效的抗肿瘤活性。该反应在诊断为急性髓性白血病(AML)且用KIR-MHC错配的单倍同一性(haplo-identical)移植物治疗的患者中是非常强烈的。通过患者的药物治疗再产生该效应的一个方法可以是施用阻断KIR/HLA相互作用的试剂以激活患者的内源NK细胞。
已显示某些对于KIR2DL1是特异性的单克隆抗体阻断KIR2DL1与“组2”的HLA-C同种异型例如HLA-Cw4的相互作用(Moretta等人,J Exp Med 1993；178:597-604)，且促进NK介导的表达那些HLA-C同种异型的靶细胞的裂解。阻断KIR2DL2/3与HLA-Cw3或类似的同种异型的抗KIR2DL2/3单克隆抗体也已得到描述(Moretta等人,J Exp Med1993；178:597-604)。Watzl等人(Tissue Antigens 2000；56:240-247)产生了识别KIR的多个同种型的交叉反应性鼠类抗体，但这些抗体不加强NK细胞的裂解活性。此外，Spaggiari等人(Blood2002；99:1706-1714和Blood 2002；100:4098-4107)进行了使用抗各种KIR的鼠类单克隆抗体的实验。这些抗体中的一种抗体NKVSF1(也称作Pan2D)据报导识别KIR2DL1(CD158a)、KIR2DL2(CD158b)和KIR2DS4(p50.3)的共同表位。Shin等人(Hybridoma 1999；18:521-7)也报导了表示为A210和A803g、能够结合所有KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DS4的两种单克隆抗体的产生。A210和A803g都不干扰KIR和HLA-C之间的结合或能够阻断抑制性KIR信号转导。.
WO2005003172、WO2005003168和WO2005009465描述了KIR2DL1和KIR2DL2/3交叉反应性抗体例如DF200、1-7F9、1-4F1、1-6F5和1-6F1，以及描述了DF200和1-7F9增强NK细胞的细胞毒性。
WO0050081描述了通过将例如B细胞或NK细胞与调控化合物接触来使其脱敏的方法，所述化合物抑制与传感器组分的结合。
WO0002583描述了通过阻止NK-T细胞受体对MHC分子的结合来治疗例如牛皮癣的方法。
WO9849292和WO2005060375一般涉及KIR或其他NK细胞受体以及针对其的抗体。
然而，以前分离试剂例如能够中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的抗体的尝试集中在阻止KIR和其对应的HLA分子例如HLA-C的相互作用上。仍然存在对能够激活NK细胞的治疗性试剂的可选择的靶的需要。
本发明提供了这样的新靶，以及结合这些靶的新试剂和使用其的方法。
发明概述
本发明部分地基于新试剂的发现，所述试剂结合一种或多种人抑制性KIR的决定子，且通过不包括阻止KIR和其HLA-C配体之间的结合的新机制来引起NK细胞的加强作用，所述NK细胞表达这些KIR基因产物中的至少一种。在一个实施方案中，所述试剂通过减少或阻止KIR的二聚化来减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制，这反过来导致NK细胞活性的加强。
因此，在一个方面，本发明提供了结合或与抑制性人杀伤IgG样受体(KIR)的细胞外部分相互作用的试剂，其中所述试剂减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制而无可检测地减少KIR和该KIR的HLA I类配体之间的结合。在一个实施方案中，所述试剂通过减少或阻止KIR的群集(cluster)减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制。在另一个实施方案中，所述试剂也或可选择地通过减少或阻止KIR的二聚化来减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制。
在一个实施方案中，所述试剂减少或阻止结构域1相关性相互作用位点之间的相互作用。结构域1相关性相互作用位点可包含至少一个对应于例如SEQ ID NO:14的残基1-92中的一个残基的氨基酸残基。例如，结构域1相关性相互作用位点可包含至少一个对应于H1、E2、H5、R6、D31、V32、M33、F34、E35、H36、H50、D57、G58、V59、V83、T84、H85、S86、Q89、L90、S91或A92的氨基酸残基。
在另一个实施方案中，所述试剂减少或阻断结构域2相关性相互作用位点之间的相互作用。结构域2相关性相互作用位点可包含至少一个对应于例如SEQ ID NO:14的残基108-200的一个残基的氨基酸残基。例如，结构域2相关性相互作用位点可包含至少一个对应于P108、S109、L110、S111、A112、Q113、P114、L114、G115、T125、S127、S129、R131、K155、V156、N157、G158、T159、Q161、A162、D163、S192、D193、P194、L195、L196、V197、S198、V199或T200的氨基酸残基。例如，KIR2DL1的结构域2相关性相互作用位点可包含氨基酸残基L110、S111、A112、Q113、P/L114(表示残基114可以是P或L)和L195。
在上述实施方案的任一实施方案中，由本发明提供的试剂可以例如减少或阻止KIR家族成员的同型二聚化(homodimerization)、异型二聚化(heterodimerization)中的至少一种或同时二种。例如，所述试剂可减少或阻止KIR2DL1的同型二聚化。
所述试剂可以是任何合适的化合物例如抗体或其片段。所述抗体片段可选自例如Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、单链抗体片段和多特异性抗体。抗体可以是例如人抗体、人源化的抗体或嵌合抗体或来源于该抗体的抗体片段。
在一个实施方案中，所述试剂是交叉反应性KIR结合试剂，例如，交叉反应性抗KIR抗体或其片段。所述片段可以例如结合KIR2DL1和KIR2DL3中的每一种。在一个实施方案中，所述试剂可以是例如抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段在对KIR2DL1和KIR2DL3中的至少一种的结合中与包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列的抗体竞争。例如，所述试剂可以是包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列的抗体或抗体片段。在可选择的实施方案中，所述试剂可以是在对KIR2DL1和KIR2DL3中的至少一种的结合中与包含SEQ ID NO:21的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列的抗体竞争的抗体或抗体片段。例如，所述试剂是包含SEQ ID NO:21的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列的抗体或抗体片段。
在另一个方面，本发明提供了本发明的试剂作为药物的用途。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，所述组合物以有效地在患者中可检测地加强NK细胞的细胞毒性的量包含本发明的试剂和一种或多种药物可接受的载体或稀释剂。在一个实施方案中，药物制剂还包含选自免疫调节剂、激素剂、化学治疗剂、抗血管生成剂(anti-angiogenic agent)、凋亡剂和阻止HLA对抑制性KIR受体的结合的抗体的治疗剂。
在另一个方面，本发明提供了通过将NK细胞与有效量的本发明的试剂接触来减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的方法。所述试剂可以例如减少或阻止KIR的二聚化。所述试剂也可以是单克隆抗KIR抗体或其片段。在一个实施方案中，所述试剂在对KIR2DL1和KIR2DL3中至少一种的结合中与包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列的抗体竞争。在另一个实施方案中，所述试剂在对KIR2DL1和KIR2DL3中至少一种的结合中与包含SEQ ID NO:21的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列竞争。
在另一个方面，本发明提供了使用本发明的试剂制备用于癌症、感染性疾病、病毒感染或免疫病症的药物的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗癌症。在该实施方案中，所述癌症可以选自例如急性和慢性髓细胞样白血病(AML和CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓异常增生综合征、非何杰金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、恶性黑色素瘤和结肠直肠癌。在可选择的实施方案中，所述药物用于治疗由选自人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)和埃博拉病毒的病毒引起的病毒感染
在另一个方面，本发明提供了用于癌症的治疗的方法，该方法包括给患有癌症的受试者施用有效量的本发明的试剂。所述试剂可以是例如人的、人源化的或嵌合的交叉反应性单克隆抗KIR抗体或其片段。在一个实施方案中，所述试剂在对KIR2DL1和KIR2DL3中至少一种的结合中与包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列的抗体竞争。在另一个实施方案中，所述试剂对KIR2DL1和KIR2DL3中至少一种的结合中与包含SEQ ID NO:21的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列竞争。所述方法还包括施用选自免疫调节剂、激素剂、化学治疗剂、抗血管生成剂、凋亡剂和阻止HLA对抑制性KIR受体的结合的抗体的治疗剂。
在另一个方面，本发明提供了能够中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的试剂，所述试剂通过下列方式获得：a)产生候选试剂库；b)选择与抑制性KIR的细胞外部分结合或相互作用的任何候选剂；和c)选择来自步骤b)的能够中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制而不减少抑制性KIR和该KIR的HLA I类配体之间的结合的任何候选试剂；其中步骤b)和c)的顺序可颠换。在一个实施方案中，所述方法还包括选择交叉反应性KIR结合剂的步骤。所述试剂可以是例如单克隆抗体或其片段。
在另一个方面，本发明提供了产生能够减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的抗体或抗体片段的方法，其包括步骤：a)用包含KIR的至少细胞外部分的免疫原性组合物免疫非人动物；b)从免疫的动物制备抗体，其中所述抗体结合KIR；c)选择来自(b)的能够中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制而不减少抑制性KIR和该KIR的HLA I类配体之间的结合的任何抗体；和d)任选地制备所述抗体的片段。
在另一个方面，本发明提供了在对KIR2DL1和KIR2DL3中至少一种的结合中与包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列的抗体竞争的分离的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体或抗体片段在对KIR2DL1和KIR2DL3中至少一种的结合中与包含SEQID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列的抗体结合相同的KIR2DL1表位。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含对应于SEQ ID NO:17的残基31-35的CDR H1区、对应于SEQID NO:17的残基50-66的CDR H2、对应于SEQ ID NO:17的残基99-108的CDR H3；对应于SEQID NO:18的残基24-34的CDR L1；对应于SEQ ID NO:18的残基50-56的CDR L2，和对应于SEQID NO:18的残基89-97的CDR L3。在另一个实施方案中，权利要求44至46中任一项的抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了在对KIR2DL1和KIR2DL3的至少一个的结合中与包含SEQ ID NO:21的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列的抗体竞争的分离的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体或抗体片段在对KIR2DL1和KIR2DL3的至少一个的结合中与包含SEQ ID NO:21的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列的抗体结合相同的KIR2DL1表位。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段包含对应于SEQ ID NO:21的残基31-35的CDR H1区、对应于SEQ ID NO:21的残基50-66的CDR H2、对应于SEQ ID NO:21的残基98-103的CDRH3；对应于SEQ ID NO:18的残基24-34的CDR L1；对应于SEQ ID NO:18的残基50-56的CDRL2，和对应于SEQ ID NO:18的残基89-97的CDR L3。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:21的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列。
本发明也提供编码前述方面的任一方面的抗体或抗体片段的核苷酸序列、包含该核苷酸序列的表达载体、用该载体转染的宿主细胞和产生抗体的方法，该方法包括在适合于所述抗体表达的条件下培养该宿主细胞。
本发明的这些和其他方面描述于下面部分。
附图描述
图1A分别用来自前面(D1在左侧，D2在右侧)、上方(D1在左侧，D2在右侧)和后面(D2在左侧，D1在右侧)的视图来图解说明结构域1相关性相互作用位点在KIR2DL1(1NKR.pdb)结构上的位置。
图1B分别用来自前方(D1在左侧，D2在右侧)、上方(D1在左侧，D2在右侧)和后方(D2在左侧，D1在右侧)的视图来图解说明结构域2相关性相互作用位点在KIR2DL1(1NKR.pdb)结构上的位置。
图1C显示KIR2DL1-HLACw4在NK细胞和靶细胞之间的交界面中的群集模型。不受理论束缚，据认为在KIR2DL1(深灰色)与HLACw4(浅灰色)结合后，首先形成了KIR2DL1-HLACw4二聚体。所述二聚体能够形成图解说明的D1-D1和D2-D2相互作用，从而在NK细胞和靶细胞之间的界面中产生群集的二聚体。
图2A-2H显示KIR2DL1(SEQ ID NO:1)、2DL2(SEQ ID NO:2)、2DL3(SEQ ID NO:3)、2DL4(SEQ ID NO:4)、2DS1(SEQ ID NO:5)、2DS2(SEQ ID NO:6)、2DS3(SEQ ID NO:7)、2DS4(SEQ ID NO:8)和2DS5(SEQ ID NO:9)序列的比对，显示结构域1和结构域2相关性相互作用位点的对应残基。
图3A至3I显示3DL1(SEQ ID NO:10)、3DL2(SEQ ID NO:11)、3DL3(SEQ ID NO:12)、3DS1(SEQ ID NO:13)和2DL1(SEQ ID NO:1)的比对，显示结构域1和结构域2相关性相互作用位点的对应残基。
图4显示在KIR2DL1/1-7F9Fab’结构的晶体堆积(REF分析)中两个对称相关的KIR2DL1分子(分别为X、Y Z和Y、X、1/3-Z)。第一KIR2DL1分子以灰色的管状图和参与与第二分子相互作用的二聚体的残基表面图一起标示。第二KIR2DL1分子以黑色实心带状图案标示。
图5显示通过流式细胞仪进行的KIR特异性单克隆抗体(mAbs)的初步筛选。用来自杂交瘤(从KIR2DL1免疫的小鼠产生的)的组织培养上清液温育YTS(A)和YTS-2DL1(B)细胞。用APC缀合的对于小鼠IgG是特异性的第二Ab片段检测Ab结合，通过流式细胞仪(FACSarray)显现所述结合。直方图描述来自1-26F117杂交瘤的抗KIR抗体对表达KIR2DL1的YTS-2DL1细胞的特异性结合，但不对KIR2DL1阴性YTS细胞结合。
图6显示在抗KIR mAbs不存在或存在的情况下LCL 721.221-Cw4靶细胞通过YTS-2DL1NK细胞的裂解，如所显示的。用来自选择的亚克隆的杂交瘤的组织培养上清液预温育KIR2DL1特异性YTS-2DL1细胞，所述杂交瘤产生识别至少KIR2DL1和-3的mAbs。然后在51Cr释放细胞毒性测定法(E:T比例＝6:1)中测量这些细胞杀死51Cr标记的LCL721.221-Cw4细胞的能力。在抗KIR抗体不存在的情况下，大约5％的靶细胞被杀死，然而交叉反应性人mAb 1-7F9诱导大约25％的特异性杀伤。新鉴定的交叉反应性mAbs 1-26F117-A3和-A4特异性地诱导杀伤，显示这些抗体是KIR抑制性mAbs，其能够减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制。
图7显示在各种抗KIR mAbs存在的情况下检测KIR2DL1对HLA-Cw4结合的竞争测定的结果。在亚克隆的抗KIR杂交瘤存在或不存在的情况下或在对照抗体存在的情况下预温育KIR2DL1-hFc(20μg/ml的终浓度)。然后使用流式细胞仪(FACSarray)研究KIR2DL1-hFc对LCL 721.221-Cw4细胞上的HLA-Cw4的结合。在干扰KIR-HLA结合的mAb存在的情况下，与在mAb不存在的情况下KIR2DL1-hFc的结合相比，较少的KIR2DL1-hFc结合LCL 721.221-Cw4细胞，这导致了向点阵图中的X轴上的左侧的偏移。(A)当用DF200预温育时，KIR2DL1-hFc对HLA-Cw4的结合以DF200剂量依赖性的方式被竞争，然而KIR2DL1-hFc结合不与KIR2DL2特异性mAb GL183(对照)竞争。当用1-26F117-A3(B)或1-26F117-A4(C)预温育时，KIR2DL1-hFc对HLA-Cw4的结合不被阻止。相反地，如由点阵图中LCL721.221-Cw4的双阳性染色所显示的，LCL 721.221-Cw4细胞被KIR2DL1-hFc/1-26F117-A3或KIR2DL1-hFc/1-26F117-A4复合物结合，这确认了HLA-Cw4和1-26F117-A3、或HLA-Cw4和1-26F117-A4可同时结合KIR2DL1。(D)对照(无mAb)。
图8显示和图7中的实验相似的、使用纯化的1-26F117的浓度不断增加的实验的结果。所述结果确认了由克隆1-26F117产生的抗体不影响KIR/HLA-Cw4相互作用。(A)2μg/ml。(B)10μg/ml。(C)20μg/ml。(D)50μg/ml。(E)在MAb不存在的情况下KIR2DL1-hFc的结合(对照)。(F)在KIR2DL1-hFc和一抗mAb不存在的情况下二抗的背景结合。
定义
本发明的“试剂”包括小分子、多肽、蛋白、抗体或抗体片段。小分子，在本发明的说明书中，在一个实施方案中是指具有分子量小于1000道尔顿，特别地小于800道尔顿，更特别地小于500道尔顿的化合物。
术语“多肽”此处不是指特定长度的被编码的产物，因而包括肽、寡肽和蛋白。所述多肽也可以是多肽的天然发生的等位基因变体或经基因工程改造的变体，以及一般的蛋白。
术语“抗体”，如此处所用的，是指具有特异性结合抗原(例如，KIR)的能力的免疫球蛋白分子。除非另外指出或通过上下文清楚地否认，术语“抗体”包括，但不限于，全长抗体、抗体片段和抗体衍生物；单克隆和多克隆抗体；人和非人抗体以及人源化的和嵌合形式的非人抗体。
术语“抗体片段”，如此处所用的，是指包含抗体的一个或多个片段的分子，所述片段保留特异性结合抗原(例如，KIR)的能力。包含在术语“抗体片段”的范围内的结合性片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH I结构域组成的单价片段；(ii)F(ab)2和F(ab')2片段，即包含通过铰链区上的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)，(vi)单链Fv(scFv)(参见例如,Bird等人(1988)Science242:423-426:和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)；(vii)双抗体(diabodies)，其是二价、双特异性抗体，其中在单条多肽链上表达VH和VL结构域，但使用的连接体太短以致不能使相同链上的两个结构域配对，从而迫使所述结构域与另一条链上的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点(参见例如.,Holliger,P.,等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak,R.J.,等人(1994)Structure2:1121-1123)；和(viii)包含重链-轻链对的一条链的单价抗体(一些IgG亚类的抗体例如，IgG4，已知自发地“分裂”成两个单价片段)。
此处使用的术语“抗体衍生物”，用于称呼全长抗体或抗体片段的变体，所述变体保留亲本分子特异性结合抗原(例如，KIR)的能力，其中亲本分子的一个或多个氨基酸已被化学修饰，例如，通过烷基化、PEG化、酰化、酯的形成或酰胺的形成等进行化学修饰。这包括，但不限于，PEG化的抗体、半胱氨酸-PEG化抗体和其变体。
在本发明的上下文中，“结合”或“相互作用”或“反应”是指试剂(例如抗体)对其决定子(例如表位)的解离常数Kd低于10-4M的任何结合。术语“结合”或“相互作用”或“反应”在适当时可与“特异性结合”、“特异性相互作用”或“特异性反应”互换使用。所述相互作用包括氢键、疏水键和离子键。
在本发明的上下文中，术语“结合决定子的试剂”指特异性和/或亲和性地结合所述决定子的试剂。结合所述决定子的抗体指特异性和/或亲和性地结合的抗体。
术语“减少或阻止二聚体化”应当理解为在细胞的表面干扰或阻止或消除KIR受体的二聚体的过程。
此处使用的KIR的“二聚化”包括异二聚化，表示KIR家族的两个不同成员之间的二聚化，和同二聚化，表示两个相同KIR家族成员的二聚体的形成。
术语“亲和力”，如此处所用的，是指抗体对表位的结合的强度。抗体的亲和力由解离常数Kd给出，解离常数定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，[Ag]是未结合抗原的摩尔浓度。亲和力常数Ka由1/Kd定义。确定mAb的亲和力的优选的方法可在Harlow,等人,Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988),Coligan等人,eds.,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.andWiley Interscience,N.Y.,(1992,1993),和Muller,Meth.Enzymol.92:589-601(1983)中查找到，所述参考资料以其全文在此引用作为参考。本领域熟知的用于确定mAb亲和力的一个优选的和标准的方法是使用Biacore仪器。
在本发明的上下文中，“决定子”指由人KIR基因家族的几个基因产物共有的相互作用或结合的位点。
术语“表位”定义为抗原决定簇，其为抗原上与抗体结合的区域或部位。蛋白表位可包含直接参与结合的氨基酸残基和被特异性抗原结合抗体或肽有效地封闭的氨基酸残基，即在抗体的“足迹”内的氨基酸残基。其是复合抗原分子上可与抗体或受体(例如，T淋巴细胞受体)结合的最简单形式或最小结构区域。表位可以是线性的或构象/结构的。
术语“线性表位”定义为由在氨基酸的线性序列(一级结构)上是连续的氨基酸残基组成的表位。
术语“构象或结构表位”定义为由氨基酸残基组成的表位，所述氨基酸残基并非全都连续，因而表现为氨基酸线性序列的分离的部分，所述分离的部分通过分子的折叠(二级、三级和/或四级结构)相互靠拢。构象表位依赖于三维结构。因此术语“构象”通常可与“结构”互换使用。
术语“抗体结合性肽”定义为以充分高的亲和力与抗体结合的肽。
术语“免疫原”是能够诱导体液抗体和/或细胞介导的免疫应答而不诱导免疫耐受性的物质。术语“免疫原”有时可和‘抗原’互换使用，然而所述术语指刺激免疫应答和与其产物例如抗体反应的能力。相反地，‘抗原’表示与抗体起反应的物质。主要的免疫原是蛋白或多糖，其游离或附着至微生物。
术语“免疫原性”是指诱导体液抗体和/或细胞介导的免疫应答的能力。
如此处所用的，“杀伤细胞Ig样受体”或“KIR”，是指由作为KIR基因家族的成员的基因编码的或由从该基因制备的cDNA编码的蛋白或多肽。可在称为“书架(Bookshelf)”的NCBI网站获得(通过World-Wide Web(WWW)地址ncbi.nlm.nih.gov/books进入)的由M.Carrington和P.Norman编著的“The KIR Gene Cluster”中提供KIR的详细综述，包括KIR基因和KIR基因产物的命名法以及示例性KIR的Genbank目录号。可在公共数据库包括GenBank获得人KIR基因和cDNA以及其蛋白产物的序列。属于人KIR基因家族的人基因的非限定性示例性GenBank条目具有下列目录号：KIR2DL1:Genbank目录号U24076、NM_014218、AAR16197或L41267；KIR2DL2:Genbank目录号U24075或L76669；KIR2DL3:Genbank目录号U24074或L41268；KIR2DL4:Genbank目录号X97229；KIR2DS1:Genbank目录号X89892；KIR2DS2:Genbank目录号L76667；KIR2DS3:Genbank目录号NM_012312或L76670(剪接变体)；KIR3DL1:Genbank目录号L41269；和KIR2DS4:Genbank目录号AAR26325。
KIR可包含1至3个细胞外结构域，且可具有长(即，超过40个氨基酸)或短(即，少于40个氨基酸)胞质尾区。如前面所描述的，这些特征决定了KIR的命名。示例性KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3蛋白包含下列各自的表示其细胞外结构域的氨基酸序列：
KIR2DL1细胞外结构域：
HEGVHRKPSLLAHPGXLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGMFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCYGSVTHSPYQVSAPSDPLDIVIIGLYEKPSLSAQXGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLH(SEQ IDNO:14)，其中位置16上“X”是P或R，且其中位置114上“X”是P或L，代表等位基因变体。
KIR2DL2细胞外结构域：
HEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVRFEHFLLHREGKFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHECRFSAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVIGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLH(SEQ IDNO:15)
KIR2DL3细胞外结构域：
HEGVHRKPSLLAHPGPLVKSEETVILQCWSDVRFQHFLLHREGKFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRFSAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSETGNPRHLH(SEQ IDNO:16).
术语“KIR2DL”是指其为KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3或KIR2DL4分子的KIR分子。
术语“KIR2DL2/3”是指KIR2DL2和KIR2DL3受体中的任一受体或两个受体。这两个受体具有非常高的同源性，其是相同基因的等位形式，且在本领域被认为在功能上是相似的。
除非另外指出，术语“MHC”包括所有哺乳动物中的MHC分子，而“HLA”分子是指人MHC分子。
“交叉反应性”KIR结合剂是结合超过一种KIR分子的试剂。例如，“交叉反应性抗KIR抗体”是特异性结合超过一种KIR分子的抗体。
“特异性结合”或“特异性”是指抗体或其他试剂可检测地结合存在于抗原上的表位同时具有相对低的几乎不可检测的与其他蛋白或结构(例如存在于NK细胞或其他细胞类型上的其他蛋白)结合的能力。可使用例如，Biacore仪器通过结合或竞争结合测定法相对地确定特异性。可以例如大约10:1、大约20:1、大约50:1、大约100:1、大约10.000:1或更大的对特异性抗原的结合的亲和性/亲和力相对对其他不相关分子的非特异性结合的亲和性/亲和力的比率来展示特异性。对于人KIR是特异的KIR结合抗体有时可展示对其他物种的相似KIR的特异性结合。
第一抗体与第二抗体“显著地”或“至少部分地”结合相同的表位的术语是指第一抗体的表位结合位点包含组成第二抗体的表位结合位点的抗原的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的氨基酸残基。
抗KIR抗体“阻止”KIR分子对HLA分子的结合的能力是指在使用溶解的或细胞表面结合的KIR和HLA分子的测定中，抗体可检测地以剂量依赖性的方式减少KIR分子对HLA分子的结合，其中KIR分子在缺少抗体的情况下可检测地结合HLA分子。在实施例中提供了用于确定抗KIR抗体是否能够进行该阻止作用的示例性测定法。
试剂“减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制”或“加强NK细胞的细胞毒性”的能力是指，表达KIR的NK细胞，当与抗体接触时，与对照相比，在所述试剂存在的情况下更能够裂解在其表面上表达特定MHC或HLA I类(其为所述KIR的配体)的靶细胞。“抑制的减少”或“加强”是指和对照相比，NK细胞的细胞毒性的任何可检测的增加，包括至少5％、至少10％、至少20％、至少40％、至少70％、至少100％、至少500％、至少1000％或更高或例如，大约50-100％、大约100-500％或大约100-2000％更高、或至少大约1.5倍、至少大约2倍、至少大约3倍、至少大约5倍、至少大约10倍、或至少大约20倍更高的增加。这可在合适的测定法例如细胞毒性测定法中进行测量，在所述细胞毒性测定法中，在与所述试剂不存在的情况下(例如对照)相比，在所述试剂存在的情况下更多的靶细胞被NK细胞裂解。例如，可通过例如经典的细胞毒性铬释放检测法检测所述试剂的可检测地增加特异性裂解的能力，即当将表达给定的KIR的NK细胞群体与表达关联MHC I类分子(被在NK细胞上表达的KIR识别)的靶细胞接触时，与在无抗体的情况下所得的特异性裂解的水平进行比较来检测。可选择地，术语“减少KIR介导的抑制”是指在使用表达一种或几种KIR的NK细胞克隆和靶细胞的铬测定法中(所述靶细胞只表达一种HLA同种异型(所述HLA同种异型被NK克隆的一种KIR识别)且不表达其他HLA I类分子(所述分子被NK克隆上的其他KIR识别))，使用抗体获得的细胞毒性水平应当为使用对照抗体例如抗KIR mAb GL183或EB6(可从Immunotech,France商购获得)获得的细胞毒性的至少60％、优选地至少70％或更多，所述对照抗体阻止KIR和HLA-C之间的相互作用。
术语“治疗”是指包括预防所述疾病、病症或病状或使之减轻至最低。因此，除非另外指出或由上下文清楚地否定，“治疗”是指试剂或包含所述试剂的组合物的预防性和治疗性施用。然而，试剂或包含所述试剂的组合物的治疗性施用以及试剂或包含所述试剂的预防性施用可分别被认为是本发明的独特的方面。例如，其中经鉴定无疾病或病症的症状或临床相关性表现的患者的“治疗”是预防性治疗。
术语“有效量”是指，当以合适的剂量递送且进行适合的时间段时，足以获得想要的结果，例如，可检测的和/或显著地减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制、或可检测地和/或显著地减少KIR二聚化的量。依赖于想要的用途，“有效量”也可以是“治疗有效量”、“预防有效量”、“生理有效量”或其组合。“治疗有效量”是指当以合适的剂量递送合适的时间段时，在患者或其他宿主中有效地获得想要的治疗结果(例如，诱导、促进和/或增强与减少病症一个或多个方面有关的生理反应，例如减缓癌症进程、减轻病毒病症状、在一段时间内(例如在初始治疗后18-60个月内)增加存活的可能性、减少与癌细胞扩散相关的生长和/或减少肿瘤生长的复发的可能性)的试剂或组合物的量。治疗有效量可根据因素例如个体的疾病状况、年龄、性别和体重以及组合物在个体中引发想要的应答的能力而变化。治疗有效量也是其中施用的组合物的任何毒性或有害效应被治疗有益效应超过的量。“预防有效量”是指在必需的剂量和时间段内，有效地获得想要的预防结果(例如，与未接受预防性治疗方案的相似患者相比，发生病症的可能性的减少、病症的强度或传播的减少、危重病症期间存活可能性的增加、疾病状况的发病延迟、危重病症扩散的降低等)的量。一般地，因为在疾病的早期阶段之前或之时使用预防性剂量，所以预防有效量将低于治疗有效量。“生理有效”量是指足以诱导、促进和/或增强想要的生理效应的量。
术语“基本上同一”，在两个氨基酸序列的情况下，是指当通过例如程序GAP或BESTFIT，使用缺省缺口权重进行最佳比对时，序列共有至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约98％或至少大约99％的序列同一性。在一个实施方案中，不相同的残基位置的差异在于保守性氨基酸取代(在本说明书的其他地方进一步描述)。通常使用序列分析软件测量序列同一性。蛋白分析软件通过使用分配至各种取代、缺失和其他修饰(包括保守性氨基酸取代)的相似性的取代匹配相似序列。例如，公共可获得的GCG软件包含程序例如“Gap”和“Bes tFi t”，使用缺省参数，所述程序可用于确定密切相关的多肽(例如来自不同物种的生物的同源多肽)之间或野生型蛋白和其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，GCG版本6.1。也可使用FASTA，使用缺省或推荐的参数比较多肽序列。GCG版本6.1中的程序，FASTA(例如,FASTA2和FASTA3)提供了查询和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(Pearson,Methods Enzymol.1990；183:63-98；Pearson,Methods Mol.Biol.2000；132:185-219)。当将序列与包含大量来自各种生物的序列的数据库进行比较时，另一个优选的算法是使用缺省参数的计算机程序BLAST，特别是blastp。参见例如，Altschul等人,J.Mol.Biol.1990；215:403-410；Altschul等人,Nucleic Acids Res.1997；25:3389-402(1997)；将它们各自在此引用作为参考。两个基本上同一的氨基酸序列中的“对应的”氨基酸位置是通过此处提到的任一种蛋白质分析软件(通常使用缺省参数)进行比对的氨基酸位置。
“分离的”试剂通常是指不与显著量(例如，超过大约1％、超过大约2％、超过大约3％或超过大约5％)的外来和不想要的生物分子(例如，非KIR结合生物分子，例如，抗体)结合的试剂，所述生物分子包含在其中产生所述分子的细胞、细胞培养物、化学介质或动物中。“分离的”试剂也可指由于人干预(无论自动的、人工的或两者的)的原因已通过纯化阶段，进行了有效长度的时间(例如，至少大约10分钟、至少大约20分钟、至少1小时或更长)的纯化的试剂。
发明描述
本发明部分地基于抗体的发现，所述抗体能够减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制而不阻断KIR对其HLA配体的结合，和部分地基于以下发现，即当KIR与其I类HLA配体结合时，通过KIR介导的负信号的转导涉及配体结合诱导的、KIR分子的构象再定位(reorientation)，这使得相邻的KIR之间在特定的结构域中形成相互作用，从而导致加速的群集。尽管以前已知配体结合导致通过KIR介导的信号转导，但未曾描述过可完全解释配体结合(发生在细胞外侧上的KIR的细胞外部分)如何被传递至KIR的胞质尾区并导致细胞内信号转导的机制，所述信号转导只有当配体被结合时发生，当没有配体结合时不发生。此外，在文献中已描述了一些类型的受体的群集，据认为，在本发明之前还不知道通过使用加入的试剂可减少或阻止NK细胞抑制性受体例如KIR的二聚化或群集。允许KIR分子的二聚化的KIR上的位点的发现现在可提供该现象的解释，从而允许治疗性试剂的开发和鉴定，所述试剂通过靶向与HLA结合无关的这些和其他位点阻止通过KIR介导的抑制性信号转导。
如实施例中所描述的，现已发现通过KIR介导的抑制性信号转导的起始和传递需要两个或更多个KIR相互之间紧密靠拢，即，二聚化。不限定于理论，当KIR与靶细胞上的MHCI类配体结合时，假定开始进行二聚化过程。这可使KIR受体相互紧密靠近，从而允许通过涉及KIR的胞质尾区中的某些酪氨酸残基的磷酸化的机制起始抑制性信号转导。尽管允许配体-结合诱导的KIR二聚化的精确事件在分子细节上还不清楚，但已报导KIR的群集(将几个KIR分子相互拉近靠拢)足以诱导抑制性信号转导(Faure等人，同上)。已发现通过干扰该二聚化、群集或拉近靠拢过程，可阻止抑制性信号转导的起始和传递。以前，只知道可能通过阻止KIR对其MHC I类配体的结合来减少KIR信号转导。此处描述的是新的试剂，所述试剂阻止抑制性信号转导的起始而不干扰KIR与HLA I类的相互作用，但相反地通过例如，阻止或减少KIR的二聚化和/或随后的群集来调节配体-结合下游的KIR信号转导。与阻止配体结合的试剂相比，这些新试剂的有利方面是其不阻止KIR-I类相互作用促成NK细胞对靶细胞的附着，从而促进NK被靶细胞的正激活。其他有利方面是这些mAb的表位以及KIR二聚化位点在KIR家族的成员中比配体-结合结构域更保守，从而，可更容易地获得与KIR家族的不同成员之间交叉反应的mAb。通过多个KIR阻止负信号转导的抗体对于治疗目的是有利的，因为其诱导通过更大比例的NK细胞进行的裂解。
如实施例中所描述的，已鉴定的一种这样的试剂是鼠类IgG1单克隆抗体1-26F117-A3。该抗体是交叉反应性的，结合至少KIR2DL1和KIR2DL3；加强NK细胞的细胞毒性；且不减少KIR2DL1对HLA-C的结合。1-26F117-A3的VH和VL区域的氨基酸序列已确定如下：
VH区域(SEQ ID NO:17):
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASDYSFTGYFMNWVMQSQEKSLEWIGRINPFNGDAFYNQKFKGKATLTVDKSSNTAHMELRSLTSEDSAVYYCARLDYRGYFFDYWGQGTTLTVSS
VL区域(SEQ ID NO:18):
DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQSVGSAVGWYQQKPGQSPKLLIYSASTRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSDDLADYFCHQYSRYPLSFGSGTKLEMKR。
1-26F117-A3的VH和VL区域的CDR已确定如下：
CDR H1:GYFMN(SEQ ID NO:17的残基31-35)
CDR H2:RINPFNGDAFYNQKFKG(SEQ ID NO:17的残基50-66)
CDR H3:LDYRGYFFDY(SEQ ID NO:17的残基99-108).
CDR L1:KASQSVGSAVG(SEQ ID NO:18的残基24-34)
CDR L2:SASTRYT(SEQ ID NO:18的残基50-56)
CDR L3:HQYSRYPLS(SEQ ID NO:18的残基89-97)。
1-26F117-A3的VL和VH区的cDNA序列已确定如下：
VH区(SEQ ID NO:19):
gaggttcagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtaagg
cttctgattactcatttactggctactttatgaactgggtgatgcagagccaagaaaagagccttgagtg
gattggacgtattaatcctttcaatggtgatgctttctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattg
actgtggacaaatcctctaacacagcccacatggagctccggagcctgacatctgaggactctgcagtct
attattgtgcaagattggattaccgcggctacttctttgactactggggccaaggcaccacgctcacagt
ctcatca.
VL区(SEQ ID NO:20):
gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacaacagtaggagacagggtcagcatcacctgca
aggccagtcagagtgtgggtagcgctgtaggctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaactact
gatttactcagcatccactcggtacactggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagat
ttcactctcaccattaccaatatgcagtctgatgacctggcagattatttctgtcaccaatatagcagat
atcctctctcgttcggctcggggacaaagttggaaatgaaacgg.
已鉴定的另一种这样的试剂是鼠类IgG1单克隆抗体1-26F117-A4。如实施例中描述的，该抗体加强NK细胞的细胞毒性；和不减少KIR2DL1对HLA-C的结合。1-26F117-A4的VH和VL区的氨基酸序列已确定如下：
VH区(SEQ ID NO:21):
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVSWVRQPPGKGLEWLGLIWGDGRTNYHSALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQIDDTATYYCARRGAMDYWGQGTSVTVSS
VL序列与1-26F117-A3的VL序列同一；(SEQ ID NO:18)。
1-26F117-A4的VH和VL区的CDR确定如下：
CDR H1:DYGVS(SEQ ID NO:21的残基31-35)
CDR H2:LIWGDGRTNYHSALISR(SEQ ID NO:21的残基50-66)
CDR H3:RGAMDY(SEQ ID NO:21的残基98-103)
CDR L1:KASQSVGSAVG(SEQ ID NO:18的残基24-34)
CDR L2:SASTRYT(SEQ ID NO:18的残基50-56)
CDR L3:HQYSRYPLS(SEQ ID NO:18的残基89-97).
1-26F117的VL和VH区的cDNA序列已确定如下：
VH区(SEQ ID NO:22):
caggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgcactg
tctcagggttctcactaaccgactatggtgtaagctgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtg
gctgggactaatatggggtgacgggcgcacaaattatcattcagctctcatatccagactgagcatcagc
aaggataactccaagagccaagttttcttaaaactgaacagtctgcaaattgatgacacagccacatact
actgtgccagaaggggtgctatggactactggggtcaaggaacctcggtcaccgtctcctca.
VL区(SEQ ID NO:23):
gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacaacagtaggagacagggtcagcatcacctgca
aggccagtcagagtgtgggtagcgctgtaggctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaactact
gatttactcagcatccactcggtacactggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagat
ttcactctcaccattaccaatatgcagtctgatgacctggctgattatttctgtcaccaatatagcagat
atcctctctcgttcggctcggggacaaagttggaaatgaaacgg.
因此，在一个方面，本发明涉及KIR结合试剂和药物组合物，所述试剂包括小分子、多肽和抗体(包括抗体片段或衍生物)，所述试剂能够减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制而不干扰KIR与HLA的结合，所述药物组合物单独地包含该试剂或和其他活性剂组合。在一个实施方案中，所述试剂是结合例如KIR2DL1和KIR2DL2和/或KIR2DL3的交叉反应性抗KIR抗体。在另一个实施方案中，所述试剂是能够减少KIR2DL介导的NK细胞的细胞毒性的抑制的抗体。
在另一个方面，本发明涉及使用这些试剂(包括抗体)增强KIR介导的NK细胞的细胞毒性、增强NK细胞介导的靶细胞的杀伤和治疗癌症或病毒病的方法。在一个实施方案中，所述方法是增强KIR2DL介导的或KIR2DL1-和KIR2DL2/3介导的NK细胞的细胞毒性的方法。在另一个实施方案中，所述方法是在例如人个体中通过表达KIR2DL1受体或KIR2DL2/3受体的NK细胞、或表达KIR2DL1和KIR2DL2/3中任一个或两者的NK细胞群体增强细胞毒性的方法。
在另一个方面，本发明涉及产生和/或鉴定这些试剂(包括抗体)的方法，即通过产生和筛选抗KIR结合抗体或其他试剂的文库，然后选择抗体或试剂,所述抗体或试剂(a)减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制，和(b)不减少KIR对HLA的结合，其中步骤(a)和(b)任选地可颠换。在一个实施方案中，步骤(a)包括选择减少KIR2DL介导的、或KIR2DL1和KIR2DL2/3介导的NK细胞的细胞毒性的抑制的试剂。此处描述了，特别是在实施例中描述了用于进行这些方法的合适的测定。在本发明的一个方面，使用相同或相似的方法制备和鉴定产生本发明的抗体的杂交瘤。
在另一个方面，本发明涉及在对KIR2DL1和KIR2DL3的至少一种的结合中与1-26F117-A3和/或1-26F117-A4竞争的抗体或其他试剂。
在另一个方面，本发明涉及在对KIR2DL1和KIR2DL3的至少一种的结合中与抗体(所述抗体包含基本上由1-26F117-A3和/或1-26F117-A4的VH和VL序列组成的VH和VL序列)竞争的抗体或其他试剂。
在示例性实施方案中，所述试剂是抗体例如全长鼠类、人、人源化或嵌合抗体；或其片段或衍生物。在一个实施方案中，所述抗体结合与1-26F117结合的表位相同的表位。在另一个实施方案中，所述抗体结合与1-26F117结合的表位基本相同的表位。在另一个实施方案中，所述试剂是结合KIR2DL1和/或KIR2DL3上的表位的单克隆抗体，所述表位被单克隆抗体1-26F117-A3和/或1-26F117-A4识别，或被包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列的单克隆抗体识别，或被包含SEQ ID NO:21的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列的单克隆抗体识别。在另一个实施方案中，抗体，包括其片段或衍生物，包含与1-26F117-A3或1-26F117-A4的VH和/或VL相同或基本上同一的VH和/或VL区域。在另一个实施方案中，所述抗体，包括其片段或衍生物，包含与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:21具有至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH区域。在另一个实施方案中，所述抗体，包括其片段或衍生物，包含与SEQ ID NO:18具有至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL区域。在另一个实施方案中，所述抗体，包括其片段或衍生物，包含与1-26F117-A3或1-26F117-A4的CDR H1、H2、H3、L1、L2和L3区相同的或基本上同一的CDR H1、H2、H3、L1、L2和L3区。在特定的实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:17的VH序列、SEQ ID NO:18的VL序列，以及鼠类IgG1恒定重链区的序列(GenBank目录号D78344，特此明确以其全文引用作为参考)和鼠类IgG1恒定轻链区的序列(GenBank目录号V00807，特此明确地以其全文引用作为参考)。在另一个实施方案中，所述抗体包含基本上分别由SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的VH和VL序列组成的VH和VL序列。在另一个特定的实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:21的VH序列、SEQ IDNO:18的VL序列以及鼠类IgG1恒定重链区的序列(GenBank目录号D78344,特此以其全文引用作为参考)和鼠类IgG1恒定轻链区的序列(GenBank目录号V00807,特此以其全文引用作为参考)。在另一个实施方案中，所述抗体包含基本上分别由SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:18的VH和VL序列组成的VH和VL序列。在另一个实施方案中，所述抗体是分离的抗体。制备和鉴定此类抗体的方法也描述于本文中。本发明也涉及编码这些抗体的核苷酸序列、包含这些序列的表达载体、包含这些载体的宿主细胞和从这些宿主细胞产生这些抗体的方法。
在另一个方面，本发明涉及结合或与存在于人KIR基因产物上的决定子相互作用的试剂，其中所述试剂能够通过减少或阻止KIR的二聚化来减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制。
在另一个方面，本发明涉及通过减少或阻止KIR的二聚化来减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的方法。
在另一个方面，本发明涉及用作药物的本发明的试剂。
在另一个方面，本发明涉及使用本发明的试剂制备用于治疗癌症、感染性疾病、病毒感染或免疫病症的药物的用途。
在另一个方面，本发明涉及包含已融合至永生化细胞的来源于非人哺乳动物宿主的B细胞的杂交瘤，所述非人哺乳动物已用包含存在于人KIR多肽上的决定子的抗原免疫，其中所述杂交瘤产生结合存在于人KIR多肽上的决定子的单克隆抗体，且其中所述抗体能够通过减少或阻止KIR的二聚化在表达所述人KIR多肽产物的NK细胞群体中来中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制。
在另一个方面，本发明涉及通过下列方式分离能够中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的试剂：
a)提供试剂；和
b)在所述试剂存在情况下在有利于二聚化的条件下(例如表达HLA-C或其他KIR配体的靶细胞存在的情况下)检测KIR的二聚化；
c)从(b)选择能够中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的试剂，其中步骤(c)和(d)的顺序可任意颠换。
在另一个方面，本发明涉及用于产生结合人KIR受体基因产物上的决定子的抗体或抗体片段的方法，其中所述抗体能够减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制，所述方法包括步骤：
a)用包含KIR多肽的免疫原免疫非人动物；
b)从所述免疫的动物制备抗体，其中所述抗体结合所述KIR多肽；
c)选择阻止KIR二聚化的抗体；
d)从(c)选择能够中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的抗体，其中步骤(c)和(d)的顺序可任意颠换。
在另一个方面，本发明涉及包含本发明的试剂和一种或多种药物可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
在特定的实施方案中，所述试剂是单克隆抗体或其衍生物或片段。
在特定的实施方案中，本发明的试剂是结合KIR上的一个决定子从而阻止或减少抑制性信号转导的试剂例如单克隆抗体或小分子或肽或蛋白。
在特定的实施方案中，所述KIR基因产物是抑制性KIR基因产物。一些KIR基因产物在本质上是抑制性的。所有这些确认的抑制性KIR具有长胞质尾区，且在其胞质内(intracytoplasmic)部分展示一个或多个招募负责抑制性信号转导的磷酸酶的氨基酸基元。不同的KIR和不同亚型的HLA I类抗原相互作用。已知的抑制性KIR受体包括KIR2DL和KIR3DL亚家族的成员。
在特定的实施方案中，所述决定子是表位，且更特别地是构象表位。
在特定的实施方案中，所述试剂是抗体。
减少抑制性KIR信号转导
本发明的抗体能够中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制；特别是由KIR2DL受体介导的抑制，更特别地至少是KIR2DL1和KIR2DL2/3两者的抑制。因此这些抗体在其阻断，至少部分地阻断由KIR受体介导的抑制性信号转导途径的意义上“减少”或“阻断”二聚化。更重要地，几种类型的抑制性KIR受体特别是几种KIR2DL受体基因产物，更特别地至少KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3展示该抑制活性，从而这些抗体可高效地用于不同的受试者。可通过各种测定法或检测法例如结合或细胞测定法评估KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的抑制。用于检测mAb是否满足本发明的标准，即具有(1)减少KIR介导的抑制性信号转导的能力，(2)不阻断KIR-HLA I类相互作用，的示例性方法如下(也参见实施例)：
(1)可在标准4小时体外细胞毒性测定中使用表达KIR2DL1的NK细胞和表达HLA-Cw4的靶细胞检测试剂减少KIR介导的信号转导的能力。这些NK细胞不杀死表达HLA-Cw4的靶细胞，因为KIR2DL1识别HLA-Cw4，从而导致KIR的二聚化，这反过来导致阻止NK介导的细胞裂解的抑制性信号转导的起始和传递。通过本领域内熟知的标准方法，如Coligan等人,eds.,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience,N.Y.,(1992,1993)中的例子所描述的方法，进行所述体外细胞毒性测定法。在加入NK细胞之前用51Cr标记靶细胞，然后以从细胞释放入培养基的51Cr(作为杀死的结果)的比例来评估杀伤作用。阻止KIR二聚化的试剂或阻止KIR结合HLA-Cw4的试剂的加入导致通过KIR介导的抑制性信号转导的起始和传递的阻止。因此这些试剂的加入导致NK介导的靶细胞的杀伤的增加。因此，该步骤鉴定了试剂，所述试剂通过例如阻止配体结合或阻止KIR的二聚化或参与将信号从细胞外侧转导至细胞内侧的其他分子事件(表明KIR已结合了配体)来阻止KIR诱导的负信号转导。在特定的51Cr释放细胞毒性测定中，表达KIR2DL1的YTS效应细胞(YTS-2DL1)可杀死LCL 721.221-Cw3靶细胞，但不杀死LCL721.221-Cw4细胞。相反地，缺少KIR的YTS效应细胞(YTS)有效地杀伤两种细胞系。因此YTS-2DL1由于HLA-Cw4诱导的通过KIR2DL1的抑制性信号转导的原因不能杀死LCL 721.221-Cw4细胞。当在该51Cr释放细胞毒性测定法中用本发明的阻断性抗KIR mAb或mAb预温育YTS-2DL1细胞时，LCL721.221-Cw4细胞以抗KIR mAb浓度依赖性的方式被杀死。
(2)为确定试剂是否阻止KIR与HLA I类的相互作用，进行下列检测：在浓度不断增加的受试抗KIR mAb的情况下或不存在受试抗KIRmAb的情况下，在4℃下用10ug/ml可溶性KIR2DL1-Fc融合蛋白(如Wagtmann等人Immunity.1995.第3卷,pages 801-809中描述的产生的和纯化的)温育用HLA-Cw4转染的细胞系721.221(Litwin等人Journal ofExperimental Medicine.1993.第178卷,pages1321-1336)，进行30分钟。洗涤细胞，然后用识别KIR-Fc融合蛋白的Fc部分的二抗温育，再洗涤，然后通过标准的方法在流式细胞仪(FACScalibur,Beckton Dickinson)上进行分析。在抗KIR mAb不存在的情况下，KIR-Fc蛋白充分地结合721.221-Cw4细胞。在阻止KIR对HLA-C的结合的抗KIR mAb存在的情况下，KIR-Fc对所述细胞的结合减少，该mAb被称为“阻断性mAb”。如果抗KIR mAb不导致KIR-Fc蛋白对细胞的结合的减少，那么所述抗KIR mAb被称为“非阻断性”mAb。
如果抗KIR mAb通过表达KIR的NK细胞诱导表达HLA-C的靶细胞的杀死(通过上面的实验1)并且其不阻止KIR对HLA-C的结合(上述的实验2中)，那么所述mAb是本发明的抗体，其通过例如减少二聚化而不是阻止KIR对HLA-C的结合来阻断抑制性KIR信号转导。
本发明的抗体能够减少例如部分地或完全中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制。例如，本发明的优选的抗体能够诱导匹配的或HLA相容的或自体的靶细胞群体(即在所述抗体不存在的情况下不能有效地被NK细胞裂解的细胞群体)的裂解。因此，本发明的抗体也可被确定在体外和体内具有促进、加强或提高NK细胞的细胞毒性的活性。
在免疫和抗体产生后，可进行特定的选择步骤以分离本发明的抗体。在鉴定为能够结合KIR多肽的单克隆抗体后，立即就其减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制而不减少对HLA结合的能力，和/或其阻止KIR二聚化的能力选择所述抗体。可如此处所描述的方法进行该选择。
在特定的方面，本发明也涉及产生结合人KIR受体基因产物上的决定子的抗体或抗体片段的方法，其中所述抗体能够减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制，其包括步骤：
(a)用包含KIR多肽的免疫原免疫非人哺乳动物；
(b)从所述免疫的动物制备抗体，其中所述抗体结合所述KIR多肽，
(c)选择(b)的能够减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的抗体，和
(d)选择(c)的不减少KIR对HLA-C的结合的抗体，
其中步骤(c)和(d)的顺序可任意地颠换。
在一个实施方案中，步骤(b)中制备的抗体是单克隆抗体。因此，如此处所用的，术语“从所述免疫的动物制备抗体”包括从免疫的动物获得B细胞且使用这些B细胞产生表达抗体的杂交瘤，和从免疫的动物的血清直接获得抗体。在另一个实施方案中，如在针对表达相关HLA I类分子的靶细胞的铬释放测定法中所测量的，步骤(c)中选择的抗体引起至少10％的由NK细胞(所述NK细胞展示至少一种被所述抗体识别的KIR)介导的NK细胞毒性的抑制的增加或减少，优选地至少40或50％或更优选地至少70％的NK细胞毒性的增加。
根据另一个实施方案，本发明提供了包含来自非人宿主的B细胞的杂交瘤，其中所述B细胞产生结合存在于人KIR受体基因产物例如人抑制性KIR受体基因产物上的决定子的抗体，且所述抗体能够减少所述受体的抑制性活性。如此处所描述的通过将来自免疫的非人哺乳动物的脾细胞与永生化细胞系融合建立本发明的杂交瘤。就该抗体的存在筛选通过该融合产生的杂交瘤。特别地，所述杂交瘤产生不阻止KIR对HLA-C结合和/或识别存在于上述的结构域1或结构域2或同源结构域上的决定子且导致NK细胞的细胞毒性的加强的抗体。
在分开的方面，本发明的试剂在对KIR2DL1或KIR2DL3的结合中与1-26F117-A3和/或1-26F117-A4和/或本发明的其他抗体竞争，和/或结合与KIR2DL1和/或KIR2DL3结合的表位相同的或基本相同的表位。可使用本领域内已知的各种方法鉴定这些试剂。例如，可使用已知的筛选测定法确定与本发明的抗体例如1-26F117-A3和/或1-26F117-A4竞争的一种或多种抗体，在所述测定法中，可评估抗体的竞争。许多这样的测定法可常规地实施且在本领域内是熟知的(参见例如，美国专利5,660,827，其明确地在此引用作为参考)。例如，当从不同来源的动物获得要被检查的受试抗体时，或其甚至是不同的Ig同种型时，可使用简单的竞争测定法，在所述测定法中，将对照抗体(例如1-26F117-A3或1-26F117-A4)与受试抗体混合，然后施用于包含KIR2DL1和/或KIR2DL3的任一种或两者的样品中。基于例如ELISA、放射免疫测定法、Western印迹法以及BIACORE分析的使用的方案适合用于该简单竞争研究。
在某些实施方案中，可在施用于KIR抗原样品之前，将对照抗体和不同量的受试抗体(例如以大约1:1、1:2、1:10或大约1:100的比例)预混合一段时间。可选择地，可简单地分开地加入对照和不同量的受试抗体并在暴露于KIR抗原样品期间混合。只要可区分结合的和游离的抗体(例如，通过使用分离或洗涤技术以除去未结合的抗体)以及区分对照抗体和受试抗体(例如，通过使用物种特异性或同种型特异性二抗或通过用可检测的标记特异性地标记对照抗体)，就能够确定受试抗体是否减少对照抗体对不同KIR2DKL抗原的结合，表明所述受试抗体识别与对照识别的表位基本上相同的表位。在完全无关的抗体(不结合KIR的抗体)存在的情况下的(标记的)对照抗体的结合可用作对照高值。可通过将所述标记的对照抗体与相同的但未标记的抗体一起温育来获得对照低值，在所述温育中可发生竞争并减少标记的抗体的结合。在检测测定法中，在受试抗体存在的情况下标记的抗体的反应的显著降低表明受试抗体识别基本上相同的表位，即其为与标记的对照抗体竞争的抗体。例如，在大约1:1或1:10和大约1:100之间的1-26F117对受试抗体的任何比例时减少1-26F117对照抗体对KIR2DL1和KIR2DL3抗原中的一种或两者的结合达至少大约50％，例如至少大约60％或更优选地至少大约70％(例如，大约65-100％)的受试抗体被认为是与1-26F117对照抗体竞争的抗体。
也可通过例如流式细胞仪估量竞争。在该检测中，首先可用对照抗体(例如1-26F117-A3或1-26F117-A4)温育具有给定的KIR的细胞，然后用标记有荧光色素或生物素的受试抗体进行温育。如果在和饱和量的对照抗体预温育后获得的结合是在没有用对照抗体预温育的情况下通过受试抗体获得的结合(如通过荧光方法测量的)的大约80％、优选地大约50％、大约40％或更少(例如，大约30％)，那么所述抗体被认为与对照抗体竞争。可选择地，如果用标记的对照抗体(由荧光色素或生物素标记)获得的对细胞(所述细胞用饱和量的受试抗体预温育)的结合是在没有用所述受试抗体预温育的情况下获得的结合的大约80％、优选地大约50％、大约40％或更少(例如，大约30％)，那么抗体被认为与对照抗体竞争。
也可有利地使用简单竞争测定法，在所述测定法中以饱和浓度预吸附受试抗体并将所述抗体用于在其上固定了KIR2DL1或KIR2DL2/3中的一种或两者的表面。简单竞争测定法的表面优选地是BIACORE芯片(或适合用于表面等离子共振分析的其他介质)。测量对照抗体(例如1-26F117-A3或1-26F117-A4)对包被有KIR的表面的结合。将单独的对照抗体对包含KIR的表面的该结合与在受试抗体存在的情况下对照抗体的结合进行比较。在受试抗体存在的情况下，对照抗体对包含KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面的结合的显著减少表明所述受试抗体识别与对照抗体识别的表位基本相同的表位，这样受试抗体“竞争”对照抗体。减少对照抗体对KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原两者的结合达至少大约20％或更多、至少大约40％、至少大约50％、至少大约70％或更多的任何受试抗体可被当作与所述对照抗体竞争的抗体。优选的，这样的受试抗体可减少对照抗体对至少KIR2DL1、2和3抗原中的各抗原的结合达至少大约50％(例如，至少大约60％、至少大约70％或更多)。将认识到，对照和受试抗体的顺序可交换；即，在竞争测定中，可首先将对照抗体结合至表面，然后再将受试抗体与表面接触。优选地，首先将具有更高的对于KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原的亲和力的抗体结合至包含KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面，如所预期的，看到的对于二抗(假定所述抗体是竞争的)结合的减少更明显。在此处的实施例中以及例如在Saunal和Regenmortel,(1995)J.Immunol.Methods 183:33-41中提供了这些测定法的其它实例，所述参考资料的公开内容在此引用作为参考。
可使用本领域技术人员已知的方法确定抗体或其他试剂是否结合与本发明的抗体例如1-26F117-A3或1-26F117-A4识别的表位区域相同或基本相同的表位区域。在表位作图/表征方法的实例中，可使用在KIR2DL1或KIR2DL2/3蛋白中暴露的氨基/羧基的化学修饰通过表位“足迹法”确定抗KIR抗体的表位区域。该足迹法技术的一个特定例子是使用HXMS(通过质谱测定法检测的氢氘交换)，其中发生受体和配体蛋白酰胺质子的氢/氘交换、结合和回复交换(back exchange)，其中参与蛋白结合的主链酰胺基团受到保护而免受回复交换，从而仍保持氘化。可通过胃蛋白酶的蛋白水解作用、快速微柱高效液相色谱分离(fastmicrobore high-performance liquid chromatography)和/或电喷雾电离质谱法(electrospray ionization mass spectrometry)在该点上鉴定相关区域。参见，例如，Ehring H,Analytical Biochemistry,第267卷(2)pp.252-259(1999)和/或Engen,J.R.和Smith,D.L.(2001)Anal.Chem.73,256A-265A。合适的表位鉴定技术的另一个例子是核磁共振表位作图(NMR)，其中一般比较游离抗原和与抗原结合肽例如抗体复合的抗原的二维核磁共振谱的信号的位置。通常用15N选择性地对抗原进行同位素标记，以使在NMR谱中只看到对应于抗原的信号而看不到来自抗原结合肽的信号。和游离的抗原的谱相比，来源于参与和抗原结合肽相互作用的氨基酸的抗原信号通常在复合物的谱中发生位置偏移，从而可以该方式鉴定参与结合的氨基酸。参见，例如，Ernst Schering Res FoundWorkshop.2004；(44):149-67；Huang等人,Journal of Molecular Biology,第281卷(1)pp.61-67(1998)；和Saito和Patterson,Methods.1996Jun；9(3):516-24。
也可使用质谱测定法进行表位作图/表征。参见例如，Downward,J MassSpectrom.2000Apr；35(4):493-503和Kiselar和Downard,Anal Chem.1999May 1；71(9):1792-801。
也可将蛋白酶降解技术用于表位作图和鉴定中。可通过蛋白酶降解，例如通过以大约1:50的胰蛋白酶对KIR2DL1或KIR2DL2/3的比例在37℃和pH 7-8下进行降解，然后就肽的鉴定进行质谱(MS)分析来确定抗原决定簇相关区域/序列。随后可通过将接受胰蛋白酶降解的样品与用抗体温育然后接受例如胰蛋白酶的降解的样品比较，然后鉴定被抗KIR抗体保护免受胰蛋白酶切割的肽(从而揭示抗体的足迹)。其他酶如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶也可或可选择地用于相似的表位表征法。此外，酶促降解可提供用于分析潜在的抗原决定簇序列在KIR结合剂的背景中是否存在于KIR2DL1的区域内的快速方法。如果所述多肽不被暴露表面，其很可能与免疫原性/抗原性无关。关于相似技术的描述，参见例如，Manca,AnnIst Super Sanita.1991；27(1):15-9。
定点诱变是用于阐明结合表位的另一个技术。例如，在“丙氨酸扫描”中，用丙氨酸残基置换蛋白片段内的各残基，并测量结合亲和力的结果。如果突变导致亲和力的明显减小，那么其很可能参与结合。对于结构表位是特异性的单克隆抗体(即，不结合未折叠的蛋白的抗体)可用于验证丙氨酸置换不影响蛋白的总体折叠。参见，例如，Clackson和Wells,Science 1995；267:383-386；和Wells,Proc Natl Acad Sci USA 1996；93:1-6。
也可将电子显微镜用于表位“足迹印迹(foot-printing)”。例如，Wang等人,Nature 1992；355:275-278协同使用冷冻电镜术(cryoelectron micros-copy)、三维图像重建和X(射)线衍射晶体分析法确定天然豇豆花叶病毒的衣壳表面上的Fab片段的物理足迹。
用于表位估计的“标记-游离(label-free)”测定法的其他形式包括表面等离子共振(SPR,BIACORE)和生物膜层反射光谱分析技术(reflectometric interferencespectroscopy)(RifS)。参见例如，等人,Journal Of MolecularRecognition1990；3:208-14；Nice等人,J.Chromatogr.1993；646:159-168；Leipert等人,Angew.Chem.Int.Ed.1998；37:3308-3311；等人,Biosensors andBioelectronics 2002；17:937-944。
也应当指出，可在此处描述的一个或多个示例性竞争测定法中鉴定抗体，所述抗体结合与本发明的抗体结合的表位相同或基本相同的表位。
KIR二聚化的阻止
根据本发明，在不干扰KIR对HLA-C的结合的情况下阻止NK细胞的细胞毒性的抑制的一个方法是阻止KIR的二聚化。在一个方面中，不干扰KIR对HLA-C的结合的情况下阻止NK细胞的细胞毒性的抑制的另一个方法是阻止KIR的群集。
如实施例1中所描述的，使用不同的分子建模方法，包括“保守位点方法”、“蛋白质-蛋白质对接方法”和“晶体堆叠方法”(全部在下面进行描述)，发现在KIR上存在允许两个KIR相互作用的位点。一个这样的位点，此处定义为“结构域1相关性相互作用位点”，位于KIR的结构域1中，对应于KIR2DL1(SEQ ID NO:14)的细胞外部分的残基1-101。该位点包含折叠的多肽内的许多相邻氨基酸残基。组成该位点的氨基酸可被本发明的试剂结合。一个KIR分子中的相互作用位点中的氨基酸可与相邻的KIR中的相同位点中的氨基酸相互作用。因此，KIR-KIR二聚化包括一个KIR中的“结构域1相关性相互作用位点”中的氨基酸与另一个KIR中的“结构域1相关性相互作用位点”中的氨基酸之间的相互作用。该另一个KIR可以是相同的类型，例如KIR2DL1-KIR2DL1相互作用。然而，因为“结构域1相关性相互作用位点”在大多数或所有其他KIR中是保守的，因此，所述相互作用也可以存在于不同的KIR之间，例如KIR2DL1-KIR2DL2或KIR2DL1-KIR2DS3或是其他相互作用。
除了KIR的结构域1中的相互作用位点外，也鉴定了结构域2中的不同的相互作用位点，所述位点称为“结构域2相关性相互作用位点”。KIR的结构域2对应于KIR2DL1(SEQ IDNO:14)的细胞外部分的残基105-200。两个KIR可通过一个KIR中的“结构域2相关性相互作用位点”中的氨基酸与另一个KIR中的“结构域2相关性相互作用位点”中的氨基酸之间的相互作用二聚化。“结构域2相关性相互作用位点”中的氨基酸在大多数或所有其他KIR中是保守的；因此二聚化可发生在相同类型的两个KIR之间(例如KIR2DL2-KIR2DL2或KIR2DL3-KIR2DL3)或不同类型的KIR之间(例如KIR2DL1-KIR2DL2或KIR2DL1-KIR2DS4)。
本发明因此提供了用于阻止KIR二聚化的试剂和相关方法，其中所述试剂可结合结构域1或2相关性相互作用位点内的KIR决定子，从而通过干扰结构域1或2相关性相互作用位点中包含的氨基酸之间的相互作用来抑制或减少KIR的二聚化。所述决定子可包含在所述结构域1或2相关性相互作用位点中，然而，所述决定子也可与相互作用位点相邻但仍然影响二聚化。在一个实施方案中，所述决定子是表位，特别是结构表位。
特别地，决定子可由至少两个KIR2DL受体组群的成员所共有。更特别地，决定子可由至少KIR2DL1和KIR2DL2和-3所共有。本发明的某些抗体，除了识别KIR2DL的多个基因产物外，也可识别存在于其他抑制性KIR例如KIR3DL受体组群的基因产物上的决定子。此外，本发明的抗体可与激活性KIR交叉反应，所述KIR包括但不限于KIR2DS1、或KIR2DS2或KIR2DS3。决定子或表位可代表由所述KIR家族成员共有的表位片段或构象表位。
与KIR的结构域1或结构域2相关的本发明的相互作用位点作为相邻的氨基酸残基存在于折叠的多肽中，从而为构象相互作用位点。在实施例中给出和在下面产生特定残基和其位置。在本发明的一个实施方案中，所述决定子是与结构域1或2相关性相互作用位点相邻或包含在其中的构象表位。
根据上面，在本发明的一个方面，通过抑制两个结构域1相关性相互作用位点之间的相互作用来减少或阻止KIR的二聚化。
在另一个方面，通过抑制两个结构域2相关性相互作用位点之间的相互作用来减少或阻止KIR的二聚化。
在另一个方面，本发明提供了产生结合人KIR受体基因产物上的决定子的抗体或抗体片段的方法，其中所述抗体能够减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制，其包括步骤：
(a)用包含KIR多肽的免疫原免疫非人哺乳动物；
(b)从所述免疫的动物制备抗体，其中所述抗体结合所述KIR多肽，
(c)选择(b)的阻止KIR基因产物二聚化的抗体，和
(d)选择(c)的能够减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的抗体，其中步骤(c)和(d)的顺序可任意颠换。
在一个实施方案中，步骤(b)中制备的抗体是单克隆抗体。因此，术语“从所述免疫的动物中制备抗体”，如此处所用的，包括从免疫的动物中获得B细胞和使用这些B细胞产生表达抗体的杂交瘤，以及直接从免疫的动物的血清获得抗体。在另一个实施方案中，步骤(c)中选择的抗体是结合本发明的决定子且阻止KIR二聚化的抗体，更特别地结合本发明的结构域1或结构域2相关性相互作用位点且阻止KIR二聚化的抗体。在另一个实施方案中，如在针对表达相关HLA I类分子的靶细胞的标准铬释放测定法中所测量的，步骤(d)中选择的抗体引起至少10％的由NK细胞(所述NK细胞展示至少一种被所述抗体识别的KIR)介导的NK细胞毒性的抑制的增加或减少，优选地至少40或50％或更优选地至少70％的NK细胞毒性的增加。
根据另一个实施方案，本发明提供了包含来自非人宿主的B细胞的杂交瘤，其中所述B细胞产生结合存在于人KIR受体基因产物例如人抑制性KIR受体基因产物上的决定子的抗体，且所述抗体能够减少所述受体的抑制性活性。如此处所描述的通过将来自免疫的非人哺乳动物的脾细胞与永生化细胞系融合建立本发明的杂交瘤。就该抗体的存在筛选通过该融合产生的杂交瘤。特别地，所述杂交瘤产生识别存在于上述结构域1或结构域2或同源结构域上的决定子且通过减少或阻止KIR的二聚化导致NK细胞的加强的抗体。
可使用本领域内已知的方法(经过简单修改)检测试剂是否通过阻止KIR二聚化或群集来减少KIR介导的抑制。例如，由Faure等人(J Immunol.2003；170:6107-14)描述的基于荧光共振能量转移(FRET)的方法可适用于下列检测本发明的试剂是否减少或阻止KIR二聚化和/或群集的测定。在该测定法中，将表达KIR2DL1的细胞系YTS-2DL1和表达重组HLA-Cw4分子(其为KIR2DL1的配体)的靶细胞一起温育。转染的HLA-Cw4分子在其C末端包含当用454nm激光激发时分别发射绿色或黄色光的绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP)。将用Cw4-GFP和Cw4-YFP构建体共转化的细胞与YTS-2DL1NK细胞混合，在37℃下温育20分钟，并固定细胞缀合物。然后通过在激光共聚焦扫描显微镜上在454nm下进行激发，同时记录光谱荧光图像(spectral fluorescent images)来进行FRET分析。通过光漂白YFP信号，可获得来自GFP蛋白的荧光测量值，所述蛋白依赖于其对YFP的接近程度(即当荧光从YFP向GFP转移时)可在不同的波长上发射光(FRET信号)。当HLA-Cw4分子均匀地分布在处于静息状态的转染的细胞的表面时，非常少量的HLA-Cw4分子形成这样近的接近(少于这是产生FRET信号所必需的，此时荧光从YFP转移至GFP)。然而，在YTS-2DL1细胞存在的情况下，HLA-Cw4分子形成非常近的靠拢，这可通过从YFP至GFP的荧光转换来检测(Faure等人JImmunol.2003；170:6107-14)。因为KIR-HLA I类结合的化学计量学是1:1(Fan等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996；93:7178)，所以HLA-Cw4的紧密靠近、或群集或二聚化(如由FRET所显示的)暗示着KIR的相似地紧密靠近。通过在抗KIR mAb存在或不存在的情况下进行该测定法，获得抗KIR mAb影响KIR群集或二聚化的能力的测量。通过HLA-Cw4-GFP将FRET减少至当在NK细胞不存在的情况下温育靶细胞时观察到的水平的抗KIR mAb表明为阻止KIR群集或二聚化的mAb。
在相同类型的测定法的可选择的形式中，使用表达野生型HLA-Cw4或某些KIR(所述KIR在YTS细胞中重组地表达，在C末端上具有GFP或YFP标签)的另一种HLA-C配体的靶细胞。GFP和YFP标记的KIR被HLA-C结合导致产生FRET信号的群集或二聚化。阻止KIR的群集或二聚化的抗KIR mAb的加入导致减少的FRET信号转导。
在可选择的测定法中，特定抗KIR结合试剂例如抗体是否阻止KIR二聚化可通过检测所述试剂是否结合KIR的结构域1或2来确定。经鉴定结合结构域1或2的试剂应当减少或阻止KIR二聚化。在实施例8中提供了用于检测试剂对结构域1或2的结合的示例性测定法。
通过对KIR家族的特定成员KIR2DKL1建模来鉴定结构域1或结构域2相关性相互结合位点，所述结合位点包含如图1中和实施例1和2中所示的两个构象相互作用位点。关于KIR2DL1(SEQ ID NO:14)和KIR2DS2(始于SEQ ID NO:6的残基22，参见图3)的细胞外部分的氨基酸序列，已如此处和实施例1和2中所解释的预测了下列相互作用位点。
结构域1相关性相互作用位点：
H1、E2、H5、R6、D31、V32、M33、F34、E35、H36、H50、D57、G58、V59、V83、T84、H85、S86、Q89、L90、S91、A92。
结构域2相关性相互作用位点：
P108、S109、L110、S111、A112、Q113、P114(或L114)、G115、T125、S127、S129、R131、K155、V156、N157、G158、T159、Q161、A162、D163、S192、D193、P194、L195、L196、V197、S198、V199和T200。
因此在一个实施方案中，结构域1相关性相互作用位点包含氨基酸位点H1、E2、H5、R6、D31、V32、M33、F34、E35、H36、H50、D57、G58、V59、V83、T84、H85、S86、Q89、L90、S91、A92。
在另一个实施方案中，结构域2相关性相互作用位点包含氨基酸位点P108、S109、L110、S111、A112、Q113、P114(或L114)、G115、T125、S127、S129、R131、K155、V156、N157、G158、T159、Q161、A162、D163、S192、D193、P194、L195、L196、V197、S198、V199和T200。
可通过KIR2DL、KIR2DS、KIR3DL和KIR3DS序列的序列比对预测对应于KIR2DL1中的结构域1和2的其他KIR中的结构域。代表性例子显示于图2和3，其显示KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5的比对，并标明结构域1和结构域2相互作用残基(“1”表示结构域1；“2”表示结构域2)(图2)，以及3DL1、3DL2、3DL3、3DS1、2DL1的比对，并标明结构域1和结构域2相关性相互作用残基(图3)。
结合其他KIR家族成员中的这些同源序列且减少或阻止二聚化的试剂也包含在本发明的范围之内。在本说明书中，“人KIR基因产物”是指由KIR基因编码的蛋白。
建模方法
当从X射线实验或同源性建模获知蛋白的3维结构时，存在至少3个鉴定具有功能性意义的残基的不同方法。在保守位点方法中，通过序列比对比较蛋白结构上的位点以鉴定保守位点。在蛋白质-蛋白质分子对接方法中，可将蛋白质与其自身或另一个蛋白对接以鉴定功能显著的残基。在晶体堆积法中，就蛋白在晶体中堆积在相同或不同组成的其他蛋白上的机制检查X射线晶体以确定功能性位点。
在保守位点法中，潜在的相互作用位点可横跨这些蛋白的分子表面。通过其在表面上的位置和围绕该位置的大小界定各位点。当已确定与所述位点相关联的原子时，可根据其残基的组成说明所述位点。然后将通过其残基确定的位点与系列相关蛋白(例如同源物、直向同源物、类似物或嵌合体)的序列比对中的相同位置中的残基比较，可鉴定在几种相关蛋白中具有相同残基组成的保守位点。这些保守位点与功能意义相关(del Sol MA,Pazos F,Valencia A,2003,J.Mol.Biol.326:1289-1302)。
在蛋白-蛋白分子对接法中(所述方法最近已进行了综述(Schneidman-DuhovnyD,Nussinov R,Wolfson HJ,2004,Curr.Med.Chem.11:91-107))，两个表面由表面上的特征描述。特征包括氢键形成能力、电荷和疏水性。在基于网格(grid)的方法中，将空间分成立方体，各立方体根据其相对于表面的位置(内部、表面、外部)被赋予值和分配相关的特征组。现可通过搜寻完全的3移动和3转动自由度使用通过评分函数获得的表面的暴力式匹配(Brute force matching)。通过Fast Fourier Transform操控平移并且在标准的旋转空间离散化内按照独立的计算处理旋转。从最高的评分复合开始，可通过许多方法例如形状互补、范德瓦尔斯相互作用、疏水性、静电、去溶剂化、氢键、原子接触能量(atomic contactenergy)、残基-残基配对统计和亲水基团配对对结果进行过滤和评分。可详细地评估最高评分复合并鉴定相互作用的残基。
在晶体堆积法中，就蛋白在晶体中堆积在其自身和其他蛋白上的机制(不仅为了对称减少的配位，而且为了晶胞和其相邻单元内的所有相关堆积)检查X射线结晶。在该方法中，就其相互作用分析了在3x3x3的晶胞网格内的所有蛋白，将所述蛋白绘制在数据透视表中，链编号示于列，残基编号以水平方向显示，相互作用示于单元格内。通过各链的总相互作用数目进行的分选鉴定了具有完全的邻域组的链，且可选择这些链中的一条链在只具有蛋白和其所有相互作用邻域的减少的结构组中进一步分析。可详细地评估各相互作用和鉴定相互作用的残基。
现在可通过突变分析研究功能方面来验证具有功能意义的残基，且所述残基用作抑制功能效应的治疗剂的靶。
抗体
依赖于重链中的恒定结构域的类型，将抗体分配至5种主要类型中的一种类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类型中的几种类型进一步分成亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。对应于免疫球蛋白的不同类型的重链恒定区分别称为“α”、“δ”、“ε”、“γ”和“μ”。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。IgG和/或IgM是用于本发明的优选的抗体种类，因为其是生理状态下最普遍的抗体并且因为其在实验室条件下最容易制备。在一个实施方案中，为了避免在体内耗尽NK细胞，本发明的抗体是IgG4亚类或IgG1或IgG2的单克隆抗体，所述抗体不结合Fc受体且不固定补体。
全长抗体包含4个多肽链，即由二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链。各重链由重链可变区(此处缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。各轻链包含轻链可变区(此处缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。各VH和VL由三个CDR和4个FR组成，按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列。
本发明的抗体可由本领域已知的许多技术产生。一般地，通过用包含KIR多肽例如抑制性KIR多肽(优选地KIR2DL多肽，更优选地人KIR2DL多肽)的免疫原免疫非人动物来产生其。KIR多肽可包含人KIR多肽的全长序列或其片段或衍生物，一般地免疫原性片段，即包含在表达抑制性KIR受体的细胞的表面上暴露的表位的多肽的部分。这些片段通常包含成熟多肽序列的至少7个连续氨基酸，更优选地其至少10个连续氨基酸。其基本上来源于受体的细胞外结构域。更优选的是人KIR2DL多肽，其包含至少一个，更优选地两个全长KIRDL多肽的细胞外Ig结构域，且能够模拟存在于KIR2DL受体中的至少一个构象表位。在其他实施方案中，所述多肽包含KIR2DL1(SEQ ID NO:14)的细胞外Ig结构域的至少8个连续氨基酸。
在最特别的实施方案中，免疫原包含脂质膜中特别是在细胞表面上的野生型人KIR2DL多肽。在一个特定实施方案中，免疫原包含完整的NK细胞，特别是完整的人NK细胞，任选地被处理的或被裂解的NK细胞。
在优选的实施方案中，非人动物是哺乳动物例如啮齿目动物(例如，小鼠、大鼠等)、牛、猪、马、兔、山羊、绵羊等。此外，非人哺乳动物可以通过基因改造或基因工程产生“人”抗体，例如XenomouseTM(Abgenix)或HuMAb-MouseTM(Medarex)。
可以本领域熟知的用于在小鼠中刺激抗体产生的任何方式(参见，例如E.Harlow和D.Lane,Antibodies:A Laboratory Manual.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1988))进行用抗原免疫非人哺乳动物的步骤。然后将免疫原悬浮于或溶解在缓冲液(任选地具有佐剂，例如完全弗氏佐剂)。用于确定免疫原的量、缓冲液的类型和佐剂的量的方法对于本领域内技术人员来说是熟知的且在本发明中不以任何方式受到限定。对于不同的免疫原这些参数可以不同，但其容易被阐明。
类似地，足以刺激抗体产生的免疫的位置和频率在本领域也是熟知的。在一般的免疫方案中，在第一天用抗原腹膜内注射非人动物，然后大约一周后再次注射。这之后在大约第20天进行抗原的回收注射，所述抗原任选地具有佐剂例如不完全弗氏佐剂。通过静脉内进行回忆注射(recall injection)，且回忆注射可重复连续数天。之后在第40天静脉内或腹膜内进行加强注射，通常不用佐剂。该方案导致在大约40天后产生抗原特异性抗体生产性B细胞。也可使用其他方案，只要其导致表达针对用于免疫的抗原的抗体的B细胞产生。
关于多克隆抗体的制备，从免疫的非人动物获得血清，然后通过熟知的技术分离存在于其中的抗体。可使用上面所示的连接至固体支持物的任一免疫原亲和纯化血清以获得与抑制性KIR受体反应的抗体。
在可选择的实施方案中，分离来自未免疫的非人哺乳动物的淋巴细胞，在体外培养所述细胞，然后将其在细胞培养中暴露于免疫原。然后收获所述淋巴细胞并进行下面描述的融合步骤。
对于单克隆抗体，下一步骤是从免疫的非人哺乳动物分离脾细胞，随后用永生化的细胞融合这些脾细胞以形成抗体生产性杂交瘤。从非人哺乳动物分离脾细胞在本领域是熟知的，其通常包括从麻醉的非人哺乳动物取出脾脏，将其切割成小碎片，从脾被膜挤压脾细胞并使之通过细胞筛网的尼龙网进入合适的缓冲液中以产生单细胞悬浮液。洗涤、离心这些细胞并将其重悬浮于裂解任何红细胞的缓冲液中。再次离心该溶液，最终将剩下的沉淀物中的淋巴细胞重悬于新配制的缓冲液中。
在分离后且以单细胞悬浮液的形式存在后，将淋巴细胞融合至永生化细胞系。这通常是小鼠骨髓瘤细胞系，尽管用于建立杂交瘤的许多其他永生化细胞系在本领域是已知的。优选的鼠类骨髓瘤系包括，但不限于，来源于可从Salk Institute Cell DistributionCenter,San Diego,Cal if.U.S.A.获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系或可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection),Rockville,Maryland U.S.A获得的X63 Ag8653和SP-2细胞。使用聚乙二醇等进行融合。然后将所得的杂交瘤培养在包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质的选择性培养基中。例如，如果亲本杂交瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
杂交瘤通常生长在巨噬细胞滋养层上。所述巨噬细胞优选地来自用于分离脾细胞的非人哺乳动物的同胞仔且在涂板杂交瘤前几天一般用不完全弗氏佐剂等进行预处理。融合法描述于(Goding,“Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,”pp.59-103(Academic Press,1986))。
使细胞在选择培养基上生长足够的时间以形成集落和产生抗体。这通常在7和14天之间。然后就结合KIR基因产物的抗体的产量测定杂交瘤集落。该测定法通常是比色ELISA型测定法，尽管可使用几种其他类型的测定法，包括如在本领域内熟知的免疫沉淀法、放射免疫测定法、Biacore测定法或闪烁迫近分析法(Scintillation Proximityassays)(SPA)。检查对于想要的抗体生产是阳性的小孔以确定一个或多个不同的集落是否存在。如果存在超过一个集落，可再克隆细胞并进行培养以确保只有单个细胞已形成产生想要的抗体的集落。通常将具有单个明显集落的阳性小孔再克隆和再测定以确保只检测到和产生一种单克隆抗体。
然后在合适的培养基例如DMEM或RPMI-1640中更大规模地培养被确认产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤。可选择地，在动物中以腹水肿瘤的方式在体内培养杂交瘤细胞。
在充分生长以产生想要的单克隆抗体后，将包含单克隆抗体的培养基(或腹水)与细胞分离并纯化存在于其中的单克隆抗体。通常使用A蛋白或蛋白G-Sepharose或连接至固体支持物例如琼脂糖或Sepharose小珠的抗小鼠Ig(所有都描述于例如AntibodyPurification Handbook,Amersham Biosciences,publication No.18-1037-46,EditionAC,其公开内容在此引用作为参考)通过层析进行纯化。一般通过使用低pH缓冲液(pH3.0或更低的甘氨酸或醋酸盐缓冲液)从A蛋白/G蛋白柱洗脱结合的抗体，立即中和包含抗体的级分。按需要混合、透析和浓缩这些级分。
根据可选择的实施方案，从杂交瘤分离编码本发明的抗体的DNA，将其置于合适的表达载体以转染入合适的宿主。然后将所述宿主用于抗体或其变体的重组生产，所述变体是例如该单克隆抗体的人源化形式、抗体的活性片段或包含所述抗体的抗原识别部分的嵌合抗体。特别地，用于该实施方案中的DNA编码抗体，所述抗体识别KIR2DL基因产物的包含决定子的结构域1和/或结构域2，且引起表达这些KIR受体中的至少一种受体的NK细胞的加强。
使用常规的方法(例如通过使用能够特异性结合编码鼠类抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离编码本发明的单克隆抗体的DNA并对其进行测序。分离后，可将DNA置于表达载体中，然后将所述载体转染入宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。编码抗体的DNA在细菌中的重组表达在本领域是熟知的(参见，例如，Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.,5,pp.256(1993)；和Pluckthun,Immunol.Revs.,130,pp.151(1992)。
也可如Ward等人(Nature 341(1989)544)中公开的，通过选择免疫球蛋白的组合文库产生抗体。
抗体片段和衍生物
可通过本领域已知的技术产生本发明的抗体的片段和衍生物。“免疫反应性片段”包含完整的抗体的部分，该部分通常为抗原结合位点或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；双抗体；任何抗体片段，所述片段为具有由连续氨基酸残基的连续序列组成的一级结构的多肽(此处称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv(scFv)分子(2)只包含一个轻链可变结构域而无相联的重链部分的单链多肽，或包含轻链可变结构域的3个CDR的其部分和(3)只包含重链可变结构域或其包含所述重链可变区的三个CDR的片段而无相联的轻链部分的单链多肽；和从抗体片段形成的多特异性抗体。例如，Fab和F(ab’)2片段可按照常规的方法通过分离的抗体的蛋白酶降解产生。
可选择地，可修饰产生本发明的抗体的杂交瘤的DNA以编码本发明的片段。然后将修饰的DNA插入表达载体并用于转化或转染合适的细胞，所述细胞然后表达想要的片段。
在可选择的实施方案中，可在插入表达载体之前修饰产生本发明的抗体的杂交瘤的DNA，通过例如用人重链和轻链恒定区的编码序列置换取代同源非人序列(例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,pp.6851(1984))或通过将非人免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列来进行修饰。这样，制备了具有原始抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂交”抗体。一般地，用这些非免疫球蛋白多肽替换本发明的抗体的恒定结构域。
因此，也可将本发明的抗体制造成“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的部分与原始抗体中的对应的序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种的抗体或属于另一种抗体类型或亚类的抗体以及所述抗体的片段的对应序列相同或同源，只要其展示想要的生物学活性(Cabilly等人,同上；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,pp.6851(1984))。
来自已知的可变重链(VH)和可变轻链(VL)链和人的恒定区的抗体的重组产生已由例如下列研究者进行了描述：Ruker等人(Annals of the New York Academy ofSciences.1991；646:212-219)，其报导了人单克隆抗HIV-1抗体在CHO细胞中的表达；Bianchi等人(Biotechnology and Bioengineering.2003；84:439-444)，其描述了使用反式互补表达载体高水平表达全长抗体，No Soo Kim等人(Biotechnol.Prog.2001；17:69-75),其描述了在二氢叶酸还原酶介导的基因扩增期间在CHO细胞的人源化抗体表达中的克隆变异发生的关键决定子；King等人(Biochemical Journal.1992；281:317-323)，其报导了小鼠-人嵌合抗体和嵌合Fab’片段的表达、纯化和表征；WO 2003064606，其描述了分离的人单克隆抗体，所述抗体包含人重链和人轻链可变区，两者都包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列；和WO 2003040170，其描述了嵌合或人单克隆抗体以及特异性结合并激活人CD40的抗原结合部分。
在示例性实施方案中，产生了来自1-26F117-A3或1-26F117-A4VH和VL序列或其衍生物或变体的嵌合重组mAb。为将抗体基因亚克隆入哺乳动物表达载体，基于编码mAb的重链和轻链可变区的cDNA，设计分别用于扩增可变轻链(VL)和可变重链(VH)基因的引物。通过PCR修饰可变区以包含Kozak序列、前导序列和单一限制性内切酶位点。对于VL，通过设计5’PCR引物以引入HindIII位点、Kozak序列和与可变轻链区的前导序列的5’末端同源来获得其。3’引物与可变区的3’末端同源且在可变区的3’边界引入BsiWI位点。除了在5’和3’末端引入NotI和NheI位点分别取代HindIII和BsiWI外，以相似的方式产生VH区。
使用标准技术将扩增的基因产物各自克隆入商购可获得的或其他已知的真核表达载体中，所述载体包含人或非人抗体的轻链和重链恒定区。商购可获得的载体的实例是pASK84，可从ATCC(美国典型培养物保藏中心，目录号87094)商购获得。用HindIII和BsiWI降解VL DNA片段并将其连接入真核表达载体，所述载体包含编码对氨苄青霉素具有抗性的β-内酰胺酶基因和大肠杆菌复制起点(pUC)；所得的质粒称为VLCL。用NotI和NheI降解VHDNA片段并将其导入如上所述导入VL片段获得的VLCL载体。所得的质粒包含在相同的质粒上编码抗体的重链和轻链的功能表达盒。将连接的质粒用于转化大肠杆菌。从这些氨苄青霉素抗性细菌群体制备质粒DNA并用于转染入CHO细胞或其他哺乳动物细胞系。可使用标准的方法如例如“Molecular Cloning”,Sambrook等人中描述的方法进行转染和细胞培养。所得的结果是稳定地表达和分泌目的抗体分子(例如包含其原始VH和VL区域和来源于人mAb的恒定区的1-26F117的嵌合形式)的转染的细胞系。
可在下列GenBank条目中找到编码人IgG的恒定区的完整cDNA序列，其各自以其全文在此引用作为参考：
人IgG1恒定重链区：GenBank目录号：J00228
人IgG2恒定重链区：GenBank目录号：J00230
人IgG3恒定重链区：GenBank目录号：X04646
人IgG4恒定重链区：GenBank目录号：K01316
人κ轻链恒定区：GenBank目录号：J00241。
可选择地，可将1-26F117-A3或1-26F117-A4的VH和VL区或其突变体或衍生物克隆入编码截短的恒定区的载体以表达抗体片段(例如，Fab片段)。
可按照相似的原理产生抗体的同种型转换。例如，可通过将编码VL和VH序列的cDNA亚克隆入质粒获得具有和1-26F117-A3或-A4的特异性完全相同的特异性但却是不同同种型的抗体，所述质粒包含编码κ轻链恒定区和选自IgG1或IgG2或IgG3或IgG4的恒定重链区的重链恒定区的cDNA。因此，所产生的抗体可具有任何同种型，因此可使用本领域内的常规技术对抗体进行同种型转换。这些技术包括使用直接的重组技术(参见，例如,美国专利4,816,397)、细胞-细胞融合技术(参见例如，美国专利5,916,771)和本领域已知的其他合适方法。因此，由本发明提供的抗体的效应作用可随亲本抗体的同种型通过同种型转换变成例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体而被“改变”，以用于各种治疗或其他用途。
根据另一个实施方案，本发明的抗体是人源化的。本发明的抗体的“人源化”形式是包含最少的来源于鼠类免疫球蛋白的序列的特殊嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基可被原始抗体(供体抗体)的CDR的残基取代，同时保持想要的原始抗体的特异性、亲和力和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基可被对应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含未在接受者抗体或引入的CDR或框架序列中发现的残基。可进行这些修饰以进一步改善和最优化抗体性能。一般地，人源化抗体基本上包含至少一个，通常两个可变结构域的所有残基，其中所有或基本上所有CDR区对应于原始抗体的CDR区并且所有或基本上所有FR区都是人免疫球蛋白共有序列。最适宜地，人源化抗体也包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少部分。关于其他详细内容参见Jones等人,Nature,321,pp.522(1986)；Reichmann等人,Nature,332,pp.323(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2,pp.593(1992)。因此，可使用此处描述的本领域已知的恒定区和框架区人mAb序列和已建立的技术产生包含1-26F117-A3或1-26F117-A4的VH和VL CDR区和来自人mAb的恒定区和框架区的1-26F117-A3或1-26F117-A4的人源化形式。
用于人源化本发明的抗体的方法在本领域内是熟知的。一般地，本发明的人源化抗体具有从原始抗体导入其中的一个或多个氨基酸。这些鼠类或其他非人氨基酸残基通常称作“引入(import)”残基，其通常取自“引入的”可变结构域。可基本上按照下面Winter和合作者(Jones等人,Nature,321,pp.522(1986)；Riechmann等人,Nature,332,pp.323(1988)；Verhoeyen等人,Science,239,pp.1534(1988))的方法进行人源化。因此，这些“人源化”抗体是嵌合抗体(Cabilly等人,美国专利4,816,567)，其中显著少于完整的人可变结构域被来自原始抗体的对应序列替代。实际上，本发明的人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能地一些FR残基被来自原始抗体中的类似位置的残基置换。
用于产生人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择对于减少抗原性非常重要。根据所谓的“最佳匹配(best-fit)”法，对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选本发明的抗体的可变结构域的序列。然后接受最接近小鼠的序列的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.,151,pp.2296(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196,pp.901(1987))。另一个方法使用来自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。可将相同的框架用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89,pp.4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.,51,pp.1993))。
更重要的是，对抗体进行人源化，同时保留对于多种抑制性KIR受体的高亲和力和其他有利的生物学特性。为实现该目的，根据优选的方法，使用亲本和人源化序列的三维模型通过分析亲本序列和各种概念上的人源化产物的方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的且对于本领域技术人员来说是熟悉的。可获得举例说明和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响所述候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从共有序列和引入序列中选择和组合FR残基以获得想要的抗体特征例如增加的对于靶抗原的亲和力。一般地，CDR残基直接地且最明显地参与影响抗原结合。
制造“人源化”单克隆抗体的另一个方法是使用(Abgenix,Fremont,CA)作为用于免疫的小鼠。XenoMouse是本发明的鼠类宿主，其免疫球蛋白基因已被功能性人免疫球蛋白基因置换。因此，由该小鼠产生的或在来自该小鼠的B细胞的杂交瘤中产生的抗体已是人的抗体。XenoMouse描述于美国专利6,162,963。可使用HuMAb-MouseTM(Medarex)进行类似的方法。
也可按照各种其他技术产生人抗体，例如通过使用其他转基因动物(所述动物已通过基因工程改造而表达人抗体库(Jakobovitz等人,Nature 362(1993)255))进行免疫或通过使用噬菌体展示方法选择抗体库来产生人抗体。这些技术对于本领域技术人员来说是熟知的且可如本申请中所公开的从单克隆抗体开始进行。
本发明范围内的其他衍生物包括官能化的抗体，即缀合至或共价地结合至毒素(例如蓖麻毒素、白喉毒素、相思豆毒素和假单胞菌外毒素)、可检测的部分(例如荧光部分、放射性同位素或显像剂)、PEG分子或固体支持物(例如琼脂糖小珠)等的抗体。用于将这些其他试剂缀合或共价地连接至抗体的方法在本领域内是熟知的。
当本发明的抗体用于诊断目的时对可检测的部分的缀合是有用的。这些目的包括，但不限于，就其细胞表面具有KIR的NK细胞的存在测定生物样品和在活生物体中检测具有KIR的NK细胞的存在。这些测定和检测方法也是本发明的可选择的实施方案。
本发明的抗体至固体支持物的缀合用作从来源例如生物液体亲和纯化NK细胞(所述细胞在其细胞表面具有KIR)的工具。该纯化方法是本发明的另一个可选择的实施方案，所得的NK细胞的纯化群体也是本发明的另一个可选择的实施方案。
在可选择的实施方案中，可将本发明的抗体单独地或与用于靶向递送至动物的另一种物质一起整合入脂质体(“免疫脂质体”)。这些其他物质包括用于递送基因以进行基因治疗或用于递送反义RNA、RNAi或siRNA以抑制NK细胞中的基因的核酸、或用于NK细胞的靶向杀伤的毒素或药物。
用于产生结合人KIR受体基因产物上的决定子的抗体或抗体片段的上述方法也可用于分离其他试剂，其中所述抗体能够减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制。在一个特定的实施方案中，本发明涉及用于通过下列步骤分离能够中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的试剂的方法：
a)提供受试试剂库；和
b)选择在有助于二聚化的条件下(例如在表达HLA-C或其他KIR配体的靶细胞存在的情况下)减少或阻止KIR的二聚化的受试试剂；
c)选择来自(b)的能够中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的试剂，其中步骤(b)和(c)的顺序可任意颠换。
在另一个特定的实施方案中，本发明涉及用于通过下列步骤分离能够中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的方法：
a)提供受试试剂库；和
b)选择在有助于KIR对HLA-C结合的条件下(例如在表达HLA-C或其他KIR配体的靶细胞存在的情况下)不可检测地和/或不显著地减少或阻止KIR对HLA的结合的受试试剂；
c)选择来自(b)的能够中和KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的试剂，其中步骤(b)和(c)的顺序可任意颠换。
组合物和施用
本发明也提供了组合物，所述组合物在任何合适的媒介物中以在患者或包含NK细胞的生物样品中有效地可检测地增强NK细胞的细胞毒性的量包含上面定义的试剂例如抗体，包括其片段和衍生物。所述组合物还包含药物可接受的载体。
此处所用的术语“生物样品”包括但不限于生物流体(例如血清、淋巴或血液)、细胞样品或组织样品(例如骨髓)。
可用于这些组合物的药物可接受的载体包括，但不限于，离子交换剂、铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸盐、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
本发明的组合物可用于在患者或生物样品中增强NK细胞活性的方法。该方法包括将所述组合物与所述患者或生物样品接触的步骤。该方法可用于诊断和治疗目的。
在特定的实施方案中，本发明涉及通过例如减少或阻止KIR的二聚化但不减少KIR对其HLA配体的结合来减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的方法。
在其他实施方案中，通过试剂对决定子或所有KIR以及潜在的其他KIR中的同源相互作用位点的结合来阻止二聚化，所述决定子影响KIR2DL1、-2或-3的结构域1或2相关性相互作用位点之间的相互作用。
在其他实施方案中，本发明涉及使用试剂例如抗体来减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的方法，所述试剂在对KIR2DL1和KIR2DL3的至少一个的结合中与包含抗体1-26F117-A3或-A4的VH和VL序列的抗体竞争。
在其他实施方案中，本发明涉及使用试剂例如抗体来减少KIR介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制的方法，所述试剂结合被包含抗体1-26F117-A3或-A4的VH和VL序列的抗体识别的KIR2DL1和/或KIR2DL3的表位。
对于与生物样品的一起使用，依赖于样品的性质(液体或固体)，可通过简单地与样品混合或直接用于样品施用抗体组合物。可在任何合适的装置(板、药袋(pouch)、烧瓶等)中直接将生物样品与抗体接触。对于患者的使用，必需配制用于给患者施用的组合物。
本发明的另一个目的是提供药物制剂，所述药物制剂包含以1mg/ml至500mg/ml的浓度存在的抗KIR结合试剂，其中所述制剂具有2.0至10.0的pH。所述制剂还可包含缓冲系统、防腐剂、等渗剂(tonicity agent)、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，所述药物制剂是水性制剂，即包含水的制剂。该制剂通常为溶液或悬浮液。在本发明的其他实施方案中，所述药物制剂是水溶液。术语“水性制剂”被定义为包含至少50％w/w的水的制剂。术语“水溶液”定义为包含至少50％w/w的水的溶液，而术语“水性悬浮液”定义为包含至少50％w/w的水的悬浮液。
在另一个实施方案中，药物制剂是冷冻干燥制剂，在使用前医生或患者向其中加入溶剂和/或稀释剂。
在另一个实施方案中，药物制剂是即时可用无需任何预先溶解的干燥制剂(例如冻干或喷雾干燥的)。
在其他方面，本发明涉及包含试剂的水溶液和缓冲剂的药物制剂，其中所述试剂以1mg/ml或以上的浓度存在，其中所述制剂具有大约2.0至10.0的pH。
在本发明的另一个实施方案中，制剂的pH选自2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9和10.0。
在本发明的其他实施方案中，所述缓冲剂选自醋酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、N-二(羟乙基)甘氨酸、曲辛、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些特定缓冲剂中的各缓冲剂构成了本发明的可选择的实施方案。
在本发明的其他实施方案中，所述制剂还包含药物可接受的防腐剂。在本发明的其他实施方案中，所述防腐剂选自苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟苯酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、三氯叔丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己啶、脱氢醋酸钠、氯甲酚、对羟苯甲酸乙酯、苄索氯铵、氯苯甘醚(3对-氯苯氧基丙烷-1,2-二醇)或其混合物。在本发明的其他实施方案中，防腐剂以0.1mg/ml至20mg/ml的浓度存在。在本发明的其他实施方案中，防腐剂以0.1mg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的其他实施方案中，防腐剂以5mg/ml至10mg/ml的浓度存在。在本发明的其他实施方案中，防腐剂以10mg/ml至20mg/ml的浓度存在。这些特定的防腐剂中的各防腐剂构成了本发明的可选择的实施方案。防腐剂在药物组合物中的用途对于本领域技术人员来说是熟知的。为了方便，参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy,第19版,1995。
在本发明的其他实施方案中，所述制剂还包含等渗剂。在本发明的其他实施方案中，等渗剂选自盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醛(例如甘油(丙三醇)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物。可使用任何糖例如单、双或多糖、或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。在一个实施方案中，所述糖添加剂是蔗糖。糖醇定义为具有至少一个-OH基的C4-C8碳氢化合物，其包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，所述糖醇添加剂是甘露醇。上面提到的糖或糖醇可单独地使用或组合地使用。对使用的量没有固定的限制，只要所述糖或糖醇在液体制剂中是可溶的且不会不利地影响使用本发明的方法获得的稳定性效果。在一个实施方案中，糖或糖醇浓度在大约1mg/ml和大约150mg/ml之间。在本发明的其他实施方案中，等渗剂以1mg/ml至50mg/ml的浓度存在。在本发明的其他实施方案中，等渗剂以1mg/ml至7mg/ml的浓度存在。在本发明的其他实施方案中，等渗剂以8mg/ml至24mg/ml的浓度存在。在本发明的其他实施方案中，等渗剂以25mg/ml至50mg/ml的浓度存在。这些特定的等渗剂中的各等渗剂构成了本发明的可选择的实施方案。等渗剂在药物组合物中的用途对于本领域技术人员来说是熟知的。为了方便，参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy,第19版,1995。
在本发明的其他实施方案中，制剂还包含螯合剂。在本发明的其他实施方案中，螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐和其混合物。在本发明的其他实施方案中，螯合剂以0.1mg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的其他实施方案中，螯合剂以0.1mg/ml至2mg/ml的浓度存在。在本发明的其他实施方案中，螯合剂以2mg/ml至5mg/ml的浓度存在。这些特定的螯合剂中的各螯合剂构成了本发明的可选择的实施方案。螯合剂在药物组合物中的用途对于本领域技术人员来说是熟知的。为了方便，参考Remington：TheScience and Practice of Pharmacy,第19版,1995。
在本发明的其他实施方案中，制剂还包含稳定剂。稳定剂在药物组合物中的用途对于本领域技术人员来说是熟知的。为了方便，参考Remington：The Science andPractice of Pharmacy,第19版,1995。
更特别地，本发明的组合物是稳定的液体药物组合物，其治疗活性组分包括多肽，所述多肽可能在液体药物制剂的贮藏期间展现聚集体形成。“聚集体形成”是指多肽分子之间导致寡聚物的形成的物理相互作用，所述寡聚物可保持可溶性，或为从溶液中沉淀的大的可见的聚集物。“在贮藏期间”意指液体药物组合物或制剂在制备后不立即给受试者施用。相反地，在制备后，将其以液体形式、以冷冻状态或以无水形式(以在以后重新形成液体形式或适合于给受试者施用的其他形式)包装贮藏。“无水形式”意指通过冷冻干燥(即，冻干；参见例如，Williams and Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.38:48-59)、喷雾干燥(参见，Masters(1991)in Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific andTechnical,Essez,U.K.),pp.491-676；Broadhead等人(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18:1169-1206；和Mumenthaler等人(1994)Pharm.Res.11:12-20)、风干(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology25:459-470；和Roser(1991)Biopharm.4:47-53)干燥液体药物组合物或制剂。在液体药物组合物的贮藏期由多肽产生的聚集体形成可不利地影响该多肽的生物学活性，导致所述药物组合物的治疗功效的丧失。此外，当使用输注系统施用包含所述多肽的药物组合物时，聚集体形成可产生其他问题例如管、膜或泵的阻塞。
本发明的药物组合物还可包含足以减少在组合物贮藏期间由多肽产生的聚集体形成的量的氨基酸碱。“氨基酸碱”是指氨基酸或氨基酸的组合，其中任何给定的氨基酸以其游离的碱形式或以其盐形式存在。当使用氨基酸的组合时，所有氨基酸可以其游离碱的形式存在，或一些可以其游离的碱形式存在而其他以其盐形式存在。在一个实施方案中，用于制备本发明的组合物的氨基酸是具有带电荷侧链的氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(例如，甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸和其混合物)的任何立体异构体或这些立体异构体的组合可存在于本发明的药物组合物中，只要所述特定的氨基酸以其游离的碱形式或其盐形式存在。在一个实施方案中，使用L-立体异构体。本发明的组合物也可用这些氨基酸的类似物进行配制。“氨基酸类似物”是指天然发生的氨基酸的衍生物，所述衍生物产生想要的作用，即减少在本发明的液体药物组合物贮藏期间由多肽产生的聚集体形成。合适的精氨基酸类似物包括，例如，氨基胍、鸟氨酸和N-单乙基L-精氨酸，合适的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和buthionine，合适的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L半胱氨酸。对于其他氨基酸也是这样，即将氨基酸类似物以其游离的碱形式或其盐形式整合入组合物。在本发明的其他实施方案中，以足以防止或延迟蛋白聚集的浓度使用氨基酸或氨基酸类似物。
在本发明的其他实施方案中，当用作治疗剂的多肽是包含至少一个易于这样氧化(即甲硫氨酸残基至甲硫氨酸亚砜的氧化)的甲硫氨酸残基时，可加入甲硫氨酸(或其他含硫氨基酸或氨基酸类似物)以抑制甲硫氨酸残基至甲硫氨酸亚砜的氧化。“抑制”是指一段时间内甲硫氨酸被氧化的最小积累。抑制甲硫氨酸氧化导致多肽更多地以其恰当的分子形式保留。可使用甲硫氨酸的任一立体异构体(L或D)或其组合。加入的量应当是足以抑制甲硫氨酸残基的氧化从而使甲硫氨酸亚砜的量可为管理机构接受的量。一般地，这意味着组合物包含不超过大约10％至大约30％的甲硫氨酸亚砜。一般地，这可通过加入甲硫氨酸以使加入的甲硫氨酸对甲硫氨酸残基的比率在大约1:1至大约1000:1例如10:1至大约100:1的范围内来实现。
在本发明的其他实施方案中，制剂还包含选自高分子量聚合物或低分子量化合物的稳定剂。在本发明的其他实施方案中，所述稳定剂选自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、包含硫的物质如单硫代甘油、巯基乙酸和2-甲基硫乙醇和不同的盐(例如氯化钠)。这些特定的稳定剂中的各稳定剂构成了本发明的可选择的实施方案。
药物组合物也可包含额外的稳定剂，所述稳定剂进一步增强此处的治疗活性多肽的稳定性。对本发明特别有益的稳定剂包括，但不限于，甲硫氨酸和EDTA以及非离子型表面活性剂，所述甲硫氨酸和EDTA保护多肽免受甲硫氨酸氧化，所述非离子型表面活性剂保护多肽免受与冻融或机械剪切相关的聚集。
在本发明的其他实施方案中，所述制剂还包含表面活性剂。在本发明的其他实施方案中，表面活性剂选自去垢剂、乙氧基化蓖麻油、聚乙醇酸化甘油(polyglycolyzedglycerides)、乙酰甘油单酯、山梨醇脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛沙姆例如F68、泊洛沙姆188和407、Triton X-100)、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚乙烯衍生物例如烷基化和烷氧基化衍生物(吐温，例如Tween-20、Tween-40、Tween-80和Brij-35)、甘油单酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、醇、甘油、凝集素和磷脂(例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油和鞘磷脂)、磷脂的衍生物(例如二棕榈酰磷脂酸)和溶血磷脂质(例如棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝氨酸和乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)和溶血磷脂胆碱磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，例如溶血磷脂胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱的十二烷基和十四烷基衍生物、和极性首基的修饰，即胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇、和带正电荷的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸、和甘油磷脂(例如脑磷脂)、甘油糖脂(例如galactopyransoide)、鞘糖脂(例如神经酰胺、神经节苷脂)、十二烷基磷酸胆碱、鸡蛋溶血卵磷脂、夫西地酸衍生物-(例如牛磺二氢夫西地酸钠等)、长链脂肪酸和其盐C6-C12(例如油酸和辛酸)、酰基肉毒碱和衍生物、赖氨酸、精氨酸或组氨酸的Nα酰化衍生物、或赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物、包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸和中性或酸性氨基酸的任一组合的二肽的Nα酰化衍生物、包含中性氨基酸和两个带电荷氨基酸的任一组合的三肽的Nα酰化衍生物、DSS(多库酯钠，CAS注册号[577-11-7])、多库酯钙，CAS注册号[128-49-4])、多库酯钾，CAS注册号[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)、辛酸钠、胆酸或其衍生物、胆汁酸或其盐和甘氨酸或牛磺酸缀合物、熊脱氧胆酸、胆酸钠、去氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘胆酸钠、N-十六烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸、阴离子(烷基-芳基-磺酸)单价表面活性剂、两性离子表面活性剂(例如N-烷基-N,N-二甲基氨基-1-丙磺酸、3-胆胺(cholamido)-1-丙基二甲基氨基-1-丙磺酸、阳离子表面活性剂(季铵碱)(例如溴化十六烷基三甲铵、氯化十六烷基吡啶)、非离子型表面活性剂(例如十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷)、poloxamine(例如Tetronic’s)，其为向乙二胺的连续加入环氧丙烷和环氧乙烷衍生的四官能嵌段共聚物，或表面活性剂可选自咪唑啉衍生物或其混合物。这些特定的表面活性剂中的各表面活性剂构成了本发明的可选择的实施方案。
药物组合物中表面活性剂的用途对于本领域技术人员来说是熟知的。为了方便，参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版，1995。
在本发明的其他实施方案中，制剂还包含蛋白酶抑制剂例如EDTA(乙二胺四乙酸)和盐酸苄脒(benzamidine HCl)，但也可使用其他商购可获得的蛋白酶抑制剂。为了抑制自身催化，蛋白酶抑制剂的使用在包含蛋白酶的酶原的药物组合物中特别有用。
其他成分可能存在于本发明的药物组合物中。这些额外的组分可包括湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、渗透压改性剂(tonicity modifiers)、螯合剂、金属离子、油质媒介物(oleaginous vehicle)、蛋白(例如，人血清白蛋白、明胶或蛋白)和两性离子(例如，氨基酸例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，这些额外的组分不应当不利地影响本发明的药物制剂的总体稳定性。
可将包含本发明的试剂的药物组合物在几个部位例如在局部位置例如皮肤和粘膜位置给需要该治疗的患者施用，在不经吸收的位置例如，动脉内、静脉内、心脏内施用和在涉及吸收的位置例如皮肤内、皮肤下、肌内或腹内给患者施用。
本发明的药物组合物的施用可通过几个施用途径，例如，舌、舌下、颊、口内、经口、胃和肠、鼻、肺，例如通过细支气管和肺泡或其组合、表皮、皮肤、透皮、阴道、直肠、眼，例如通过结膜、输尿管和胃肠外给需要该治疗的患者施用。
本发明的组合物可以几种剂型施用，例如，作为溶液、悬浮液、乳剂、微乳剂、多层乳剂、泡沫剂、软膏、糊剂、膏剂、软膏剂、片剂、包衣片剂、冲洗剂、胶囊剂，例如硬明胶胶囊剂和软明胶胶囊剂、栓剂、直肠用胶囊剂、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、粉剂、气雾剂、吸入剂、滴眼剂、眼膏、眼冲洗剂(ophthalmic rinse)、阴道栓剂、阴道环、阴道软膏剂、注射液、原位转化液例如原位胶凝作用、原位装置(in situ setting)、原位沉淀、原位结晶、输注液和埋植剂施用。
可通过例如共价、疏水和静电相互作用进一步将本发明的组合物混合于或附着至药物载体、药物递药系统和先进的药物递药系统以进一步增强复合物的稳定性、增加生物利用度、增加可溶性、减少不利作用、完成本领域技术人员熟知的定时治疗和增加患者的顺应性或其任何组合。载体、药物递药系统和先进的药物递药系统包括，但不限于，聚合物例如纤维素和衍生物、多糖，例如葡聚糖和衍生物、淀粉和衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和异丁烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸和其嵌段共聚物、聚乙二醇、载体蛋白例如白蛋白、凝胶，例如，热凝胶系统(thermogelling systems)，例如本领域技术人员熟知的嵌段共聚物系统、微团(micelle)、脂质体、微球、纳米颗粒、液晶和其分散体、L2相和其分散体，其对于脂-水系统中的相位行为领域内的技术人员来说熟知的、多聚体微团、多层乳剂、自身乳化、自身微乳化环糊精和其衍生物以及树枝状聚合物(dendrimer)。
通过使用例如定量吸入器、干粉吸入装置和喷雾器(所有装置对于本领域技术人员来说是熟知的)将本发明的组合物以固体、半固体、粉剂和溶液的制剂用于试剂的肺部施用。
本发明的组合物特别适合用于控制释放、持续释放、延长释放、阻释和缓释药物递药系统的配制。更特别地，但不限于，组合物用于胃肠外控制释放和持续释放系统(两个系统都导致施用次数的多倍减少)的配制，这对本领域技术人员来说是熟知的。更优选地的是用于皮下施用的控制释放和持续释放系统。不限制本发明的范围，有用的控制释放系统和组合物的例子是水凝胶、油质凝胶、液晶、聚合物微团、微球、纳米颗粒。
用于产生用于本发明的组合物的控制释放系统的方法包括，但不限于，结晶、浓缩、共结晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压匀浆、胶囊化、喷雾干燥、微胶囊化、凝聚、相分离、溶剂蒸发以产生微球、挤出和超临界流体方法。一般参考Handbook of PharmaceuticalControlled Release(Wise,D.L.,ed.Marcel Dekker,New York,2000)和Drug and thePharmaceutical Sciences第99卷:Protein Formulation and Delivery(MacNally,E.J.,ed.Marcel Dekker,New York,2000)。
可通过注射器(任选地笔样注射器)经皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射来进行胃肠外给药。可选择地，可通过输注泵进行胃肠外给药。其他选择是组合物，所述组合物可以是用于以鼻或肺喷雾剂的形式施用药剂的溶液或悬浮液。作为其他选择，也可使包含本发明的试剂的药物组合物适合于经皮肤施用，例如通过无针注射或从贴剂，任选地离子电渗疗法贴剂或透粘膜例如经口腔施用来进行施用。
可使用适合于肺部药物递药的任何已知类型的装置以溶液、悬浮液或无水粉剂的形式将试剂在媒介物中通过肺部途径施用。这些装置的例子包括，但不限于，三种常见类型的用于肺部药物递药的气雾剂发生器，可包括喷射器或超声喷雾器、定量吸入器或干粉吸入装置(Cf.Yu J,Chien YW.Pulmonary drug delivery:Physiologic and mechanisticaspects.Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4)(1997)395-453)。
基于标准的检测方法学，颗粒的空气动力学直径(da)定义为单位密度(1g/cm3)的参照标准球状颗粒的几何等效直径。在最简单的情况下，对于球状颗粒，如下列公式所描述的，da作为密度比率的平方根的函数与参照直径(d)成比例：
对于非球状颗粒，对该关系作出改变(参考Edwards DA,Ben-Jebria A,LangerR.Recent advances in pulmonary drug delivery using large,porous inhaledparticles.J Appl Physiol84(2)(1998)379-385)。术语“MMAD”和“MMEAD”已进行了详尽描述且在本领域是已知的(参考Edwards DA,Ben-Jebria A,Langer R)，其表示空气动力学颗粒大小分布的中值的测度。Recent advances in pulmonary drug delivery usinglarge,porous inhaled particles.J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。质量中值直径(MMAD)和有效质量中值直径(mass median effective aerodynamic diameter)(MMEAD)可互换使用，其为统计参数，经验性地描述气溶胶颗粒的大小与其沉积在肺部的潜能相关而不依赖实际的形状、大小或密度(参考Edwards DA,Ben-Jebria A,Langer R.Recentadvances in pulmonary drug del ivery using large,porous inhaled particles.JAppl Physiol 84(2)(1998)379-385)。通常根据用压紧器(impactor)获得的测量值计算MMAD，所述压紧器是测量空气中颗粒惰性行为的仪器。
在其他实施方案中，可通过任何已知的雾化技术例如喷雾法雾化制剂，从而获得小于10μm、更优选地在1-5μm之间和最优选地在1-3μm之间的气溶胶颗粒的MMAD。优选的颗粒大小基于用于将药物递送入深肺处的最有效大小，在所述深肺处蛋白被最佳地吸收(参考Edwards DA,Ben-Jebria A,Langer A,Recent advances in pulmonary drug deliveryusing large,porous inhaled particles.J Appl Physiol84(2)(1998)379-385)。
包含试剂的肺制剂的深肺沉积可任选地通过使用吸入技术的改变(例如，但不限于：缓慢的吸收流动(例如30L/min)、憋气和定进冲动)来进一步最佳化。
术语“稳定的制剂”是指具有增加的物理稳定性、增加的化学稳定性或增加的物化稳定性的制剂。
此处使用的术语蛋白(例如抗体)制剂的“物理稳定性”是指蛋白形成生物学失活和/或蛋白的不溶性聚集体的趋势，所述蛋白的生物学失活和/或不溶性聚集是由于蛋白暴露于热-机械应激和/或与失稳的界面和表面例如疏水性表面和界面相互作用的结果。在将装于合适的容器(例如筒或瓶)中的制剂在不同的温度下暴露于机械/物理应激(例如搅拌)进行不同时间后，通过目检和浊度测量估计蛋白水溶液制剂的物理稳定性。在黑暗的背景下在聚焦的光中进行制剂的目检。通过目检评分划分浊度的等级来表征制剂的浊度，所述目检评分将浊度按等级分为例如0至3级(显示无浊度的制剂对应于目检评分0，在日光中显示目检浊度的制剂对应于目检评分3)。当制剂在日光中显示可见浊度时，在蛋白聚集上其被分类为物理不稳定的。可选择地，可通过本领域技术人员熟知的简单浊度测量法估计制剂的浊度。也可通过使用蛋白的构象状态的波谱试剂(spectroscopic agent)或探针估计蛋白水溶液制剂的物理稳定性。所述探针优选地是优先结合蛋白的非天然构象的小分子。蛋白结构的小分子波谱探针的一个例子是硫磺素T。硫磺素T是已被广泛用于淀粉状蛋白纤维(amyloid fibril)的检测的荧光染料。在纤维和可能的其他蛋白构型也存在的情况下，当硫磺素T结合至纤维蛋白形式时，其在大约450nm处产生新的激发最大值和在大约482nm处产生增强的发射值。未结合的硫磺素T在所述波长上基本上无荧光。
其他小分子可用作蛋白结构从天然至非天然状态的改变的探针。例如优先结合蛋白的暴露的疏水斑的“疏水斑”探针。疏水斑通常在其天然状态下埋藏在蛋白的三级结构内，但当蛋白开始去折叠或变性时开始显露。这些小分子波谱探针的例子是芳香族染料、疏水染料，例如antrhacene、吖啶、菲咯啉等。其他光谱探针是金属-氨基酸复合物，例如疏水氨基酸例如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸等的钴金属复合物。
此处使用的术语蛋白制剂的“化学稳定性”是指导致化学降解产物的形成的蛋白结构的化学共价改变，所述化学降解产物，和天然的蛋白结构相比，具有潜在更低的生物学功效和/或潜在增加的免疫原性。依赖于天然蛋白的类型和性质以及蛋白暴露的环境，可形成不同的化学降解产物。化学降解的消除最不可能完全避免，如本领域技术人员所熟知的，通常在蛋白制剂的贮藏和使用期间观察到不断增加的量的化学降解产物。大部分蛋白易于脱酰胺，所述脱酰胺是其中谷氨酰胺或天冬酰胺残基的侧链酰胺基被水解形成游离羧酸的过程。其他降解途径包括高分子量转化产物的形成，其中两个或更多个蛋白分子通过转酰胺基作用和/或二硫化物相互作用共价地相互结合，从而形成共价连接的二聚体、寡聚体和多聚体降解产物(Stability of Protein Pharmaceuticals,Ahern.T.J.&Manning M.C.,Plenum Press,New York 1992)。氧化(例如甲硫氨酸残基的)可被认为是化学降解的另一种变型。可通过在暴露于不同的环境条件(降解产物的形成通常可通过例如增加温度加速)后，在不同的时间点上测量化学降解产物的量来估计蛋白制剂的化学稳定性。通常通过依赖于分子大小和/或电荷使用各种层析技术(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)分离降解产物来确定各单个降解产物的量。
因此，如上面所概述的，“稳定的制剂”是指具有增加的物理稳定性、增加的化学稳定性或增加的物化稳定性的制剂。一般地，制剂在达到有效期前必须在使用和贮藏期间(符合推荐的使用和贮藏条件)保持稳定。
在本发明的一个实施方案中，包含本发明的试剂的药物制剂在超过6周的使用和超过3年的贮藏中是稳定的。
在本发明的另一个实施方案中，包含本发明的试剂的药物制剂在超过4周的使用和超过3年的贮藏中是稳定的。
在本发明的另一个实施方案中，包含本发明的试剂的药物制剂在超过4周的使用中和超过2年的贮藏中是稳定的。
在本发明的另一个实施方案中，包含本发明的试剂的药物制剂在超过2周的使用中和超过2年的贮藏中是稳定的。
如上所述，本发明的组合物可通过例如口服、胃肠外施用、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、阴道或通过植入型药盒施用。此处使用的术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，口服、腹膜内或静脉内施用组合物。
本发明的组合物的无菌可注射形式可以是水性悬浮液或油性悬浮液。可按照本领域内已知的技术使用合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂配制这些悬浮液。所述无菌注射制剂也可以是无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射液或悬浮液例如1,3-丁二醇中的溶液。在可使用的可接受的媒介物和溶剂中，有水、林格氏溶液(Ringer’s solution)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、不挥发油常规地用作溶剂或悬浮介质。为了该目的，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸例如油酸和其甘油酯衍生物可用于可注射物的制备，对于天然的药物可接受的油例如橄榄油或蓖麻油特别是以其聚氧乙烯化形式存在的油也是这样。这些油溶液或悬浮液也可包含长链醇稀释剂或分散剂，例如通常用于配制药物可接受的剂型(包括乳剂和混悬液)的羧甲基纤维素或类似的分散剂。常用于生产药物可接受的固体、液体或其他剂型的其他常用的表面活性剂，例如Tweens、Spans和其他乳化剂或生物利用度增强剂也可用于配制目的。
可以任何口服可接受的剂型(包括，但不限于，胶囊剂、片剂、水悬浮液或溶液)口服施用本发明的组合物。在用于口服使用的片剂情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常也加入润滑剂例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当需要用于口服使用的水悬浮液时，将活性成分和乳化剂和悬浮剂混合。如果想要，也可加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
可选择地，本发明的组合物可以用于直肠施用的栓剂形式施用。可通过将所述试剂和合适的非刺激性赋形剂混合来制备这些剂型，所述赋形剂在室温下是固体但在直肠温度下是液体，从而可在直肠中熔化以释放药物。这些材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
也可局部施用本发明的组合物，特别是当治疗的靶包括容易进行局部施用的区域或器官(包括眼病、皮肤病或下肠道病)时。容易制备用于这些区域或器官的各区域或器官的合适的局部制剂。
可以直肠栓剂(参见上面)或合适的灌肠剂进行下肠道的局部施用。也可使用局部透皮贴剂。
对于局部施用，可以合适的软膏配制组合物，所述软膏包含悬浮在或溶解在一种或多种载体中的活性组分。用于本发明的化合物的局部施用的载体包括，但不限于，矿物油、液体石蜡、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可选择地，可在合适的洗剂或乳膏剂中配制包含悬浮或溶解在一种或多种药物可接受的载体中的活性组分的组合物。合适的载体包括，但不限于，矿物油、山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、十六醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
对于眼用途，可将组合物配制为等渗的经pH调整的无菌盐水中的微粒化混悬剂，或优选地配制为等渗的经pH调整的无菌盐水中的溶液，具有或不具有防腐剂例如苯扎氯铵。可选择地，对于眼用途，可在软膏例如凡士林中配制组合物。
也可通过鼻用气雾剂或吸入剂施用本发明的组合物。按照药物配制领域内熟知的技术制备这些组合物，所述组合物可配制为盐水、苯甲醇或其他合适的防腐剂、增加生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他常规稳定剂或分散剂中的溶液。
已显示几种单克隆抗体在临床表现中是有效的，例如Rituxan(Rituximab)、Herceptin(Trastuzumab)或Xolair(Omalizumab)，且可对本发明的抗体使用相似的施用方案(即，配制和/或剂量和/或施用方案)。可根据用于这些产品的已知的方法，例如使用厂商说明书，确定用于施用的方案和剂量。例如，可在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性使用小瓶中以10mg/mL的浓度提供单克隆抗体。在用于注射的9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨醇酯80和无菌水中配制用于静脉内施用的产品。将pH调整为6.5。本发明的交叉反应性KIR抗体的示例性合适剂量范围可在大约10mg/m2和500mg/m2之间。然而，要认识到这些方案是示例性的，考虑到抗体的亲和力和必须要在临床试验中确定的抗KIR抗体的耐受性，要对最佳的日程安排和方案进行改变。考虑抗体的亲和力和其药物动力学参数，确定饱和NK细胞24小时、48小时、72小时或一周或一月的抗KIR的注射量和日程安排。
根据另一个实施方案，本发明的抗体组合物还可包含另一种治疗剂，包括通常用于特定治疗目的(为了该治疗目的施用所述抗体)的试剂。额外的治疗剂通常以该试剂在被治疗的特定疾病或病症的单一疗法中通常使用的量存在于组合物中。所述治疗剂包括，但不限于，用于癌症治疗的治疗剂、用于治疗感染性疾病的治疗剂、用于其他免疫治疗的治疗剂、细胞因子(例如IL-2或IL-15)、其他抗体或其他抗体的片段。
例如，可获得许多用于治疗癌症的治疗剂。本发明的抗体组合物和方法可与任何其他方法一起使用，所述其他方法通常用于治疗特定的疾病，特别是肿瘤、癌症疾病或患者表现的其他疾病或病症。只要不知道特定的治疗方法在本质上对患者有损害，且不显著地抵消基于抑制性KIR抗体的治疗，可考虑其与本发明的组合。
对于实体瘤治疗，本发明可和经典的方法例如手术、放射疗法、化学疗法等一起使用。因此本发明提供了组合疗法，在所述疗法中，本发明的KIR抗体在手术或放射治疗的同时、之前或之后使用；或和常规化学治疗剂、放射治疗剂或抗血管生成剂、或靶向的免疫毒素或凝血配体(coaguligand)一起、在之前或之后使用。
当治疗方案中的一种或多种试剂和本发明的组合物一起使用时，不要求组合的结果是当各治疗独立进行时观察到的效果的累加。尽管至少累加效应通常是想要的，但高于单一治疗的任何增加的抗癌效果将是有益的。同样，没有对组合治疗要展示协同效应的特殊要求，尽管这是可能且是有利的。
为了实施组合抗癌治疗，可简单地以在动物中有效地导致其组合抗癌作用的方式给患者施用本发明的组合物和另一种抗癌剂。因此以有效地导致其在肿瘤脉管内组合存在和其在肿瘤环境中的组合作用的量和时间提供所述试剂。为实现该目的，可以单一组合物的方式或作为不同的组合物使用相同或不同的施用途径同时给患者施用本发明的组合物和抗癌剂。
可选择地，本发明的组合物可以例如从数分钟至数周和数月的间隔在抗癌剂治疗之前或之后施用。将确保抗癌剂和本发明的组合物中的活性剂对癌症产生有利的组合效应。作为例子，可给患有非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的患者施用本发明的抗体。通常用Rituximab的组合和称为CHOP的化学治疗剂的组合治疗这些患者。因此，本发明的抗KIR抗体可用于治疗使用Rituximab和CHOP进行治疗的患者，通过在治疗方案中组合所有所述药剂的施用来进行使用，在所述治疗方案中在同一天或不同的天施用药剂，具有更长的治疗周期。
可在施用本发明的组合物之前、同时或之后施用其他抗癌剂。然而，当将抗体的免疫缀合物用于本发明的抗体组合物时，可同时或顺次施用各种抗癌剂。
在一些情况下，显著地延长治疗时间期限甚至可以是想要的，其中抗癌剂或抗癌治疗的施用和本发明的组合物的施用之间相隔数天(2、3、4、5、6或7)、数周(1、2、3、4、5、6、7或8)或甚至数月(1、2、3、4、5、6、7或8)。这在使用抗癌治疗显著破坏肿瘤例如使用手术或化学疗法并且施用本发明的组合物以预防微小转移或肿瘤再生的情况下可能是有利的。
也可想象，可使用超过一次的本发明的基于抗KIR剂的组合物或抗癌剂的施用。这些药剂可在交替的天或周互换施用；或在使用本发明的抗KIR剂组合物的治疗的周期之后进行抗癌剂治疗的周期。无论如何，为了获得肿瘤的消退，使用组合疗法，所需要的是无论施用的次数多少，以有效地产生抗肿瘤效果的组合量递送两种药剂。
关于手术，任何手术干预可与本发明一起实施。关于放射疗法，可涉及在癌细胞内局部地诱导DNA破坏的任何机制，例如γ辐照、X射线、UV辐照、微波和甚至电子发射等。也可涉及放射性同位素至癌细胞的定向递送，且可将这和靶向抗体或其他靶向手段一起使用。
在其他方面，可将免疫调节化合物或方案和本发明一起施用或作为本发明的组合物的部分施用。优选的免疫调节化合物的实例包括细胞因子。在这些组合的方法中可使用各种细胞因子。用于本发明涉及的组合物的细胞因子的实例包括IL-1αIL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNF-α、TNF-β、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。按照标准的方案，根据临床指征例如患者的状况和细胞因子的相对毒性，施用用于本发明的组合治疗或组合物的细胞因子。其他免疫调节化合物(所述化合物可和本发明的组合物或作为本发明的组合物的部分一起施用)包括特异性结合淋巴细胞上的其他抑制性受体的抗体，包括但不限于抗体例如抗CTLA4抗体或抗CD94/NKG2A抗体(参见，例如，美国出版的专利申请20030095965)。本领域已知的这些分子的变体和衍生物也可或可选择地用于这些方法，和如果合适，整合入本发明的组合物。
在某些实施方案中，本发明的包含非HLA阻断性、抑制性、任选地阻断性抗KIR抗体的治疗性组合物可和化学治疗剂或激素治疗剂一起使用或还可包含所述治疗剂。许多激素治疗剂和化学治疗剂可用于此处公开的组合疗法。作为示例的所述化学治疗剂包括，但不限于，烷化剂、抗代谢物、细胞毒性抗生素、长春花碱，例如阿霉素、更生霉素、丝裂霉素C、去甲柔红霉素、柔红霉素、多柔比星、他莫昔芬、紫杉酚、紫杉特尔、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、环磷酰胺、塞替派、甲氨蝶呤、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)、氨蝶呤、考布他汀和其衍生物和前药。
激素试剂包括，但不限于，例如LHRH激动剂例如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林和布舍瑞林；抗雌激素例如它莫西芬和托瑞米芬；抗雄激素例如氟他米特、尼鲁米特、环丙孕酮和比卡鲁胺；芳香酶抑制剂例如阿纳曲唑、依西美坦、来曲唑和法倔唑；和progestagen例如medroxy、氯地孕酮和甲地孕酮。
如将被本领域技术人员所理解的，化学治疗剂的合适剂量接近在其中单独地施用或和其他化学治疗剂一起施用所述化学治疗剂的临床治疗中使用的剂量。仅作为例子，可使用试剂例如顺铂和其他DNA烷化剂。顺铂已被广泛用于治疗癌症，用于临床应用的有效剂量为每三周5天20mg/m2，总共三个疗程。顺铂不能被口服吸收，因而必需通过静脉内、皮下、瘤内或腹膜内注射给药。
其他有用的化学治疗剂包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物和破坏多核苷酸前体的合成和保真度的试剂。用于组合治疗的许多示例性化学治疗剂列于美国专利6,524,583的表C中，所述试剂和适应症的公开内容明确地在此引用作为参考。所列的各试剂是示例性的而不是限定性的。本领域技术人员参考“Remington's PharmaceuticalSciences”第15版，第33章，特别是第624-652页。依赖于被治疗的状况可能发生剂量的改变。实施治疗的医生能够确定个体受试者的合适剂量。
本发明的组合物可和任何一种或多种抗血管生成治疗剂一起使用或还可包含抗血管生成剂。这些药剂的实例包括各自针对VEGF或VEGF受体的中和抗体、反义RNA、siRNA、RNAi、RNA适体和核酶(美国专利6,524,583，其公开内容在此引用作为参考)。如WO 98/16551中所描述的也可使用具有抗血管生成特性的VEGF的变体，所述申请明确地在此引用作为参考。和组合疗法一起使用的其他示例性抗血管生成剂列于美国专利6,524,583的表D中，所述试剂和适应症的公开内容明确地在此引用作为参考。
也可有利地将本发明的组合物和诱导凋亡的方法一起使用或所述组合物可包含凋亡剂。例如，已鉴定了许多抑制凋亡或编程性细胞死亡的癌基因。该类型中的示例性癌基因包括，但不限于，bcr-abl、bcl-2(和bcl-1、细胞周期蛋白D1不同；GenBank目录号M14745,X06487；美国专利5,650,491和5,539,094；各自在此引用作为参考)和家族成员，包括Bcl-x1、Mcl-1、Bak、A1和A20。首先在T细胞淋巴瘤中发现bcl-2的过量表达。癌基因bcl-2通过结合Bax并使Bax失活发挥作用，所述Bax是凋亡途径中的蛋白。bcl-2功能的抑制阻止了Bax的失活，从而使凋亡途径继续进行。该种类的癌基因的抑制，例如使用反义核苷酸序列、RNAi、siRNA或小分子化合物进行抑制，可用于本发明以促进编程性细胞死亡(美国专利5,650,491、5,539,094和5,583,034；各自在此引用作为参考)。
本发明的抗KIR试剂也可包含分子或和分子一起使用，所述分子包含靶向部分例如针对靶细胞例如靶肿瘤细胞上的特定标记的抗体、配体或其缀合物(“靶向试剂”)。一般说来，用于本发明的这些额外方面的靶向试剂优选地识别可接近的肿瘤抗原，所述肿瘤抗原优选地、或特异性地在肿瘤位置表达。靶向试剂通常结合肿瘤细胞的表面表达的、表面可接近的或表面定位的组分。靶向试剂也优选地展示高亲和力的特性；和在体内不产生显著的对维持生命的正常组织的副作用，所述正常组织是例如选自心脏、肾、大脑、肝脏、骨髓、结肠、乳房、前列腺、甲状腺、胆囊、肺、肾上腺、肌肉、神经纤维、胰腺、皮肤或人体内的其他维持生命的器官或组织中的一种或多种组织。如此处所用的，术语“不产生显著副作用”是指靶向试剂，当在体内施用时，只产生可忽略的或临床上可控制的副作用，例如在化学治疗期间通常遇到的副作用。
在肿瘤的治疗中，本发明的组合物可额外的包含辅助化合物或可和辅助化合物一起使用。辅助化合物可包括例如抗呕吐药例如5-羟色胺拮抗剂和治疗剂例如酚噻嗪系、取代的苯酰胺类、抗组胺剂、丁酰苯类、皮质激素、苯二氮杂类和大麻素类；二膦酸盐例如唑来膦酸和帕米膦酸；和造血生长因子例如促红细胞生成素和G-CSF，例如非格司亭、来格司亭和darbepoietin。
在另一个实施方案中，识别不同的表位或决定子的本发明的两种或更多种抗体或其他试剂可以单一组合物的方式混合以减少或中和尽可能多的KIR基因产物的抑制性效应。包含本发明的交叉反应性抑制性KIR抗体或其片段或衍生物的组合的组合物甚至能够具有更广泛的用途，因为很可能存在小百分比的缺乏被单一交叉反应性抗体识别的各抑制性KIR基因产物的人群。类似地，本发明的抗体组合物还可包含阻止KIR对HLA的结合的一种或多种交叉反应性或非交叉反应性抗体。这些组合可在治疗中再次提供更广泛的用途。因此，本发明的抗体可和阻止一种或多种例如KIR2DL1、KIR2DLK2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2和KIR3DL3的HLA结合的另一种抗KIR抗体混合。
本发明也提供了在需要其的患者中增加NK细胞活性的方法，其包括给所述患者施用本发明的组合物。所述方法更明确地用于在具有疾病的患者中增加NK细胞活性，在所述疾病中，增加的NK细胞活性是有益的，所述疾病涉及、影响或由易被NK细胞裂解的细胞引起，或其由不充足的NK细胞活性引起或特征在于不充足的NK细胞活性，例如癌症、感染性疾病或免疫病症。
更特别地，本发明的方法和组合物用于治疗各种癌症和其他增殖疾病包括，但不限：癌，包括膀胱、乳腺、结肠、肾、肝脏、肺、卵巢、前列腺、胰腺、胃、子宫颈、甲状腺和皮肤的癌，包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤(hairy cell lymphoma)和Burketts淋巴瘤；骨髓谱系的造血肿瘤(hematopoietictumor)，包括急性和慢性髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病和骨髓增生异常综合征；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和模纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、模纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病(xeroderma pigmentosum)、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌。
可根据本发明治疗的优选的病症包括淋巴谱系的造血系统肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞病症例如T幼淋巴细胞白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑回状细胞类型；大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)，优选地T细胞类型的；塞扎里氏综合征(SS)；成人T细胞性白血病淋巴瘤(ATLL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；peripheral/post-thymic T celllymphoma(多形和免疫母细胞亚型)；血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(Angio immunoblasticT-cell lymphoma)；血管中心(鼻)T细胞淋巴瘤(Angiocentric(nasal)T-cell lymphoma)；间变性(Ki 1+)大细胞淋巴瘤(Anaplastic(Ki1+)large cell lymphoma)；肠T-细胞淋巴瘤；T淋巴母细胞；淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)。
也可根据本发明治疗其他增殖病症，包括例如超常增生、纤维变性(特别是与肺有关的，但也有其他类型的纤维变性，例如肾脏纤维变性)、血管发生、牛皮癣、动脉粥样硬化和血管中的平滑肌增生例如狭窄或血管成形术后的再狭窄。基于KIR抗体的治疗可用于治疗或预防感染性疾病，包括优选地由病毒、细菌、原生动物、霉菌或真菌感染引起的任何感染。这些病毒感染生物包括，但不限于，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、I型单纯疱疹病毒(HSV-1)、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)、牛疫、鼻病毒、埃可病毒群、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头状瘤病毒、乳头状瘤病毒、细胞巨化病毒、棘状病毒(echinovirus)、虫媒病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒和人免疫缺陷症病毒1型或2型(HIV-1,HIV-2)。细菌组成另一优选的种类的传染性生物，包括但不限于下列：葡萄球菌(Staphylococcus)；链球菌，包括化脓性链球菌(S.pyogenes)；肠球菌(Enterococcl)；杆菌属(Bacillus)，包括炭疽杆菌(Bacillusanthracis)，和,乳杆菌(Lactobacillus)；李斯特菌属(Listeria)；白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；加德纳菌属(Gardnerella)包括阴道加特纳菌(G.vaginalis)；诺卡氏菌属(Nocardia)；链霉菌属(Streptomyces)；普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)；梅毒螺旋体(Treponerna)；空肠弯曲菌(Camplyobacter)；假单胞菌属(Pseudomonas)包括绿脓杆菌(P.aeruginosa)；军团杆菌属(Legionella)；奈瑟氏菌属(Neisseria)包括淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitides)；黄杆菌属(Flavobacterium)包括脑膜脓毒性金黄杆菌(F.meningosepticum)和F.odoraturn；布鲁氏杆菌属(Brucella)；博代菌属(Bordetella)包括百日咳鲍特氏菌(B.pertussis)和犬支气管败血波氏杆菌(B.bronchiseptica)；大肠杆菌属包括大肠杆菌(E.coli)、克雷白杆菌属(Klebsiella)；肠道细菌属(Enterobacter)、粘质沙雷菌(Serratia)包括粘质沙雷氏菌(S.marcescens)和液化沙雷杆菌(S.liquefaciens)；爱德华菌属(Edwardsiella)；变形菌(Proteus)包括奇异变形杆菌(P.mirabilis)和P.vulgaris；链杆菌(Streptobacillus)；立克次氏体科(Rickettsiaceae)包括R.fickettsfi、衣原体属(Chlamydia)包括鹦鹉热衣原体(C.psittaci)和沙眼衣原体(C.trachornatis)；分枝杆菌(Mycobacterium)包括人型结核杆菌(M.tuberculosis)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、M.folluiturn、麻风分枝杆菌(M.laprae)、禽分枝杆菌(M.avium)、牛型结核杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)和M.lepraernurium；和诺卡氏菌属(Nocardia)。原生动物可包括但不限于，利什曼原虫、kokzidioa和锥虫属。寄生虫包括但不限于，衣原体和立克次体。感染性疾病的完全目录可在疾病控制中心(CDC)下的国家感染性疾病中心(NCID)的网站(World-Wide Web(www)地址cdc.gov/ncidod/diseases/)上找到,其目录在此引用作为参考。所有所述疾病是使用本发明的抑制性，任选地交叉反应性KIR抗体治疗的候选疾病。
这些方法可单独地或和其他医疗和/或治疗剂(例如放射治疗、化学治疗或基因治疗)一起使用本发明的试剂，例如抗体、其片段和衍生物。当这些方法包括使用治疗剂的额外治疗时，可将这些治疗剂和本发明的抗体一起以单剂型或分开地、多剂型施用。当以分开的剂型施用时，可在本发明的抗体施用前、施用的同时或施用后施用所述额外的试剂。
本发明的其他方面和有利方面公开于下列实施例部分，所述实施例应当被认为是说明性的而不限定本申请的范围。
实施例
实施例1:KIR的结构域1和2相关性相互作用位点的鉴定。
使用上述一般方法发现参与KIR2DL1的二聚化的可能的结构域。
本实施例显示通过KIR介导的负信号转导(在KIR结合其HLA I类配体后)包括配体结合诱导的KIR的构象再定位，这允许相邻的KIR之间形成结构域1-结构域1和结构域2-结构域2相互作用，从而导致加速的群集。尽管以前已知配体结合导致通过KIR介导的信号转导，但还未曾描述过机制，所述机制能够完全解释配体结合(对细胞外侧上的KIR的细胞外部分的结合)是如何被传递至KIR的胞质尾区并且只有当配体结合时才导致信号转导，但当无配体结合时不产生信号转导。允许KIR分子二聚化的KIR上的位点的发现现在可提供该现象的解释，且允许发展可通过靶向这些位点以阻止通过KIR介导的抑制性信号转导的治疗剂。
分析
本实施例根据Fan等人,1997,Nature第389卷:96-100:Domain 1comprisesresidues 6-101 of KIR and Domain 2 comprises amino acids residues 105-200使用KIR的残基和结构域的命名法。
通过对KIR2DL1(1NKR.pdb)使用保守位点方法和KIR2DL1(人)、KIR2DL2(人)、KIR2DL3(人)、KIR2DS1(人)、KIR2DS2(人)、KIR2DS3(人)、KIR2DS4(人)、KIR(Q8MK11，猕猴)、KIR(Q8MK12，猕猴)的比对，鉴定了下列保守位点：P108、S109、L110、S111、A112、Q113、P114、G115、T125、S127、S129、T159、Q161、A162、D163、S192、L195。
通过使用蛋白质-蛋白质分子对接法(其中来自1IM9.pdb的2个KIR2DL1-HLA CW4复合物已置于H2K二聚体的上部，如Mitra等人2004(Current Biology第14卷:718-724)提出的)，鉴定了该KIR-HLA二聚体允许通过结构域1-结构域1：R6、D31、V32、M33、F34、E35、D57、G58、V59、V83、T84、H85、S86、Q89和结构域2-结构域2：S109、L110、S111、A112、Q113、T125、S127、S129、R131、K155、V156、N157、G158、T159、Q161、D163、L195相互作用群集的机制。
通过使用晶体堆积法，KIR2DS2(1M4K.pdb)的X射线结构中的各蛋白被鉴定为具有6个相互作用的邻域，这些邻域中的一个是对称的结构域1-结构域1相互作用，其中V32、M33、F34、V83、T84、Q89、L90、S91、A92与另一个蛋白上的相同残基相互作用。C末端面对符合膜结合蛋白的相同侧。因为在相互作用区域，2DS2的序列和2DL2相同，因而残基与对接结果相同。此外，在所有KIR X射线衍射结构中未确定N末端的位置，这可通过2个锌位点交联结构域1-结构域1相互作用来解释：2个Zn位点是E2(A)、H5(A)、D31(A)、H85(B)和H1(A)、E35(B)、H36(B)、H50(B)。
因此我们确定，结构域1相关性相互作用位点：H1、E2、H5、R6、D31、V32、M33、F34、E35、H36、H50、D57、G58、V59、V83、T84、H85、S86、Q89、L90、S91、A92和结构域2相关性相互作用位点：P108、S109、L110、S111、A112、Q113、P114、G115、T125、S127、S129、R131、K155、V156、N157、G158、T159、Q161、A162、D163、S192、L195并声称和一个或多个这些残基相互作用的任何治疗剂将减少或阻止KIR受体的信号转导。关于举例说明，参见图1A至1C。
此处涉及的蛋白数据库(PDB；蛋白质数据库)描述于：H.M.Berman,J.Westbrook,Z.Feng,G.Gilliland,T.N.Bhat,H.Weissig,I.N.Shindyalov,P.E.Bourne:The ProteinData Bank.Nucleic Acids Research,28pp.235-242(2000)。
PDB标识符总是4个文字数字式字符例如1NKR&1OM3，有时称为1NKR.pdb&1OM3.pdb。
实施例2:与HuKIR1-7F9-Fab’复合的KIR2DL1的晶体结构揭示KIR2DL1/KIR2DL1同型二聚体
用X射线衍射晶体分析法解析了与交叉反应性抗KIR抗体1-7F9的Fab’片段复合的KIR2DL1的晶体结构并将其提高至的分辨率。该结果确证了在该晶体结构中存在KIR2DL1-KIR2DL1二聚体界面。
材料和方法
将细胞外KIR2DL1(SEQ ID NO:14的氨基酸1-223，残基16为精氨酸(R)，残基114为亮氨酸(L)，且包含额外的N-末端甲硫氨酸(M)残基)和1-7F9的人抗KIR Fab’(具有SEQ IDNO:24的轻链序列和SEQ ID NO:25的残基1-221的重链序列)混合，KIR2DL1稍微过量，在凝胶过滤柱上纯化复合物。然后浓缩复合物至大约13.5mg/ml。在10％的PEG6000和500mM柠檬酸盐缓冲液(pH为4.2)中使用悬滴法生长晶体。将晶体在液N2中快速冷冻并在100K下使用beam-l ine BL711I,MAX-lab,Lund,Sweden收集分辨率的晶体学数据。通过XDS程序(Kabsch,J.Appl.Crystallogr.1993；26:795-800)整合数据。关于结构测定分子置换，使用CCP4套件的MOLREP程序(Bailey,Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.1994；50:760-763)和PDB存储的结构1RZJ(Fab部分1)和1NKR(KIR)。使用ARP/WARP程序(Lamzin和Wilson,Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.1993；49:129-147)进行相位改善，使用QUANTA程序(可从Accelrys Inc.,San Diego,CA,USA商购获得)进行对X射线衍生的结构模型的人工修改。在CCP4套件的REFMAC5计算机程序中进行精细加工。通过ARP/WARP程序加上水分子。所述模型包含KIR2DL1的残基6-114和124-200、1-7F9轻链的1-212和1-7F9重链的1-136和143-224。此外，放置了330个水分子。模型的R-和R-free分别是0.191和0.253。
结果
通过CCP4套件的CONTACT计算机程序使用的截断距离(cut-off distance)鉴定具有对称的“X,Y,Z”和“Y,X,1/3-Z”的KIR2DL1之间的接触残基。发现所得的KIR的结构域2中的二聚体界面包含下列KIR2DL1(SEQ ID NO:14)的残基：L110、S111、A112、Q113、L114、D193、P194、L195、L196、V197、S198、V199和T200)。KIR2DL1二聚体界面和参与氢键结合的残基也标示在图4中的KIR2DL1的氨基酸序列中。通过CCP4程序AREAIMAOL计算，二聚体界面的面积为在晶体堆积中，包含残基115-123的KIR2DL1的环没有定制(order)。因此生物学重要的界面残基也可包含该范围内的残基。
表1显示与1-7F9Fab’VL链复合的KIR2DL1的晶体结构中的KIR2DL1-KIR2DL1相互作用。使用的截断值。通过CCP4的CONTACT计算机程序使用对称卡(X,Y,Z)和(Y,X,1/3-Z)鉴定接触。在最后一栏中“***”表示由CONTACT计算的，该接触上存在氢键的强可能性，“*”表示弱可能性空白表示程序认为没有氢键形成的可能性。在计算中忽略水分子。
表1. KIR2DL1-KIR2DL1相互作用
实施例3:鼠类抗KIR抗体的产生
本实施例描述了抗KIR抗体的产生和鉴定，所述抗体(1)不干扰HLA-C的结合和(2)能够增强NK细胞的细胞毒性。
免疫和融合
通过标准的方法用20μg可溶性KIR2DL1蛋白免疫正常的RBF小鼠3次，所述可溶性KIR2DL1蛋白对应于在大肠杆菌中产生并在体外重折叠的KIR2DL1(SEQ ID NO:14)的完整的细胞外结构域。通过静脉内注射用20μg可溶性KIR2DL1加强免疫小鼠，并在三天后将其杀死。在无菌条件下取出脾脏并分散成单细胞悬浮液。通过电融合方法进行脾细胞和FOX-NY骨髓瘤细胞的融合。将细胞播种在微量滴定板中并在37℃、5％CO2下培养。在两周的时期内更换含有用于选择的AAT的组织培养基3次。
为了产生单克隆和稳定的杂交瘤，使用极限稀释法亚克隆细胞。以1个细胞/孔的密度将细胞播种在96孔板中。两周后，在间接ELISA中筛选来自各孔的上清液并就与1-7F9(参见下面)的竞争对其进行检测。然后将来自阳性小孔的细胞转移至更大的培养体积，再次扩增和亚克隆直至获得稳定和单克隆的细胞系(通过向亲本克隆的名称中加上-A1、-A2、-A3、-A4来标识亚克隆)。然后对亚克隆进行相似的或额外的检测，此外还对通过选择的亚克隆产生的单克隆抗体进行测序。
杂交瘤的初步筛选
通过检测通过流式细胞仪识别为KIR2DL1阳性的细胞的上清液，就KIR2DL1特异性mAb的产生筛选来源于KIR2DL1免疫的RBF小鼠的杂交瘤。以1:2的稀释度将组织培养上清和YTS(KIR2DL1阴性)和YTS-2DL1(KIR2DL1阳性)一起温育。在冰上温育1小时后，用DMEM/2％FCS洗涤细胞，然后用APC缀合的驴抗小鼠二抗Ab片段在冰上温育30分钟。在用PBS充分洗涤后，使用FACSarray(BD Biosciences)分析Ab对活细胞的结合。当杂交瘤组织培养上清液中的小鼠mAb结合YTS-2DL1但不结合YTS细胞(参见图5)时，MAb被称为‘KIR2DL1阳性’。
此外，在间接ELISA测定中，通过检测KIR2DL1和-3的细胞外结构域的识别，就KIR2DL1和-3交叉反应性(或“panKIR”)mAb检测组织培养上清液。为进行该检测，用0.5μg/ml PBS中的山羊抗小鼠IgG特异性Ab(Caltech,Ca)包被Nunc免疫板并在4℃下过夜。用含有0.05％Tween-20的PBS封闭板15分钟，然后用PBS/0.05％Tween-20洗涤。加入来自杂交瘤细胞的培养上清液并将板在室温下温育1小时。在再一次洗涤后，以1μg/ml的浓度加入可溶性的生物素化的KIR2DL1或KIR2DL3，然后温育1小时。洗涤后，加入100μl的Streptavidin-HRPO溶液。在进行另1小时的温育后，洗涤板，然后按照厂商所描述的用TMB底物(Kem-EN-Tec)进行显影。在直接偶联至96孔板的ELISA读数计上测量450nm处的吸光率。
根据初步筛选，克隆被鉴定为产生交叉反应性mAb，包括命名为1-26F117的克隆。在BiaCore测定法、NK细胞毒性测定法和KIR配体结合测定法(参见下面)中进一步检测这些克隆。
实施例4:与1-7F9竞争对KIR2DL1和-3的结合
为确定选择的小鼠交叉反应性mAb是否在不同于人mAb 1-7F9结合的表位上结合KIR2DL1和-3，通过表面等离子共振分析测量其竞争1-7F9对KIR2DL1和/或-3的结合的能力。在Biacore 3000仪(Biacore AB,Uppsala,Sweden)上进行该测量。使用标准的胺偶联试剂盒(Biacore AB)将相同量的纯化的1-7F9固定在CM5传感芯片(Biacore AB,Uppsala,Sweden)上的所有4个流体室(flow-cell)中。以10μg/ml的浓度将HBS-EP缓冲液(10mMHEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％聚山梨酯20(v/v))中的纯化的重组KIR2DL3注射入流体室1和3，以10μl/分钟的流速进行1分钟。随后，以10μg/ml的浓度将HBS-EP缓冲液中的纯化的重组KIR2DL1注射入流体室2和4，以10μl/分钟的流速进行1分钟。在注射KIR2DL1和KIR2DL3后，将在HBS-EP中以1:1.5稀释的杂交瘤组织培养上清液的第一样品注射入流体室1和2，以10μl/分钟的流速进行1分钟。随后，在相似的条件下将第二样品注射入流体室3和4。当RU反应>20时将样品评定为阳性结合。最后，通过注射10mM甘氨酸-HCl pH 1.8，在30μl/分钟的流速下进行15秒，进行传感芯片的再生。
在测定中，发现1-26F117不与1-7F9竞争对KIR2DL1和-3的结合，表明该抗体在与1-7F9的结合表位不同的表位上结合KIR分子。
实施例5:NK细胞毒性测定法
在NK细胞毒性测定法中检测选择的交叉反应性mAb抑制KIR功能的能力。用来自产生选择的mAb的杂交瘤的组织培养上清液预温育YTS-2DL1细胞，以1:2的稀释度进行30分钟。然后，以6:1的E:T比例加入表达KIR2DL1-配体HLA-Cw4的51Cr标记的LCL 721.221-Cw4细胞。在37℃下在潮湿的CO2培养箱中温育4小时后，在γ辐射计数器中测量释放入组织培养基中的51Cr。通过计算组织培养基中测量的51Cr的百分比(与从Triton X-100裂解的细胞中释放的最大51Cr相比)确定样品中靶细胞的特异性杀伤。以三次重复分析样品。
和在任何抗KIR mAb不存在的条件下大约5％的杀伤率相比，在参照mAb即1-7F9(20μg/ml)存在的情况下，YTS-2DL1在该测定中杀死大约24％的LCL 721.221-Cw4细胞。当鼠类受试mAb能诱导为在mAb不存在的情况下的杀伤的至少1.5倍的靶细胞的杀伤时，即当将mAb不存在的情况下的杀伤规范为1，在KIR阻断性mAb的存在的情况下的杀伤至少为1.5时，鼠类受试mAb被认定为KIR阻断性的。如图6中所示，对于1-26F117-A3和1-26F117-A4，抗体1-26F117诱导的YTS-2DL1对LCL 721.221-Cw4细胞的杀伤分别为在mAb不存在的情况下的杀伤的3.7倍和接近2倍。
实施例6:KIR2DL1-Fc配体结合竞争测定法
为确定阻断KIR信号转导(如实施例5中所确定的)的抗KIR mAb，例如1-26F117-A3和1-26F117-A4是否能够通过阻止KIR对其HLA配体的结合诱导NK裂解，测量这些mAb阻止KIR2DL1和HLA-Cw4之间的相互作用的能力。为进行该测量，除了用鼠类IgG1Fc替代人Fc外，如(Wagtmann等人,Immuni ty 1995；3(6):801-9)中所述产生可溶性KIR2DL1-Fc蛋白。可溶性KIR-Fc结合表达被KIR2DL1识别的特定HLA-C同种异型的细胞，通过流式细胞仪，使用对于KIR-Fc蛋白的鼠类Fc部分是特异性的荧光色素缀合的二抗Ab显现该结合。例如，KIR2DL1-Fc结合用HLA-Cw*0402(LCL 721.221-Cw4转染子)(Litwin等人,J Exp Med.1993；178:1321-36)转染的细胞但不结合未转染的LCL 721.221细胞。
以与用于诱导NK裂解的量相似的量使用1-26F117-A3或1-26F117-A4杂交瘤上清液在冰上预温育KIR2DL1-Fc 30分钟。然后，向DMEM/2％FCS中的温育混合物加入0.5x104LCL 721.221-Cw4细胞，再将所述混合物在冰上温育60分钟。在DMEM/2％FCS中洗涤后，用1:1的抗小鼠IgG的二抗Ab片段(PE缀合的)和抗人IgG的二抗Ab片段(APC缀合的)的混合物温育反应混合物。在冰上温育30分钟后，用PBS洗涤细胞数次，通过流式细胞仪(FACSarray)分析KIR2DL1-hFc和抗KIR mAb的结合。
在本测定法中，mAb 1-26F117-A3和1-26F117-A4不阻止KIR2DL1-hFc和LCL721.221-Cw4细胞之间的相互作用，表明1-26F117-A3和-A4阻断KIR信号转导而不阻止KIR对HLA配体的结合。下述事实强调了这点，所述事实是，1-26F117-A3和1-26F117-A4通过KIR2DL1-hFc与LCL 721.221-Cw4细胞结合，导致FACS点图中双阳性染色的细胞(参见图7B)。作为对照，在用不同浓度的已知的mAbDF200进行的相同类型的测定中，以DF200剂量依赖性的方式阻止了KIR2DL1-hFc对LCL 721.221-Cw4细胞的结合，但当用已知的KIR2DL2特异性mAb GL183预温育KIR2DL1-hFc时，其不阻止KIR2DL1-hFc对LCL 721.221-Cw4细胞的结合(图7A)。
在其中用不同浓度(2-50μg/ml)的纯化的1-26F117预温育KIR2DL1-hFc的相似的测定中，确认了该克隆不产生阻止KIR2DL1对HLA-Cw4的结合(参见图8)的抗体。因此，1-26F117克隆产生阻断KIR信号转导而不影响KIR-配体相互作用的抗体。
实施例7:KIR2DL1-Fc配体结合竞争测定法
通过竞争可溶性重组KIR-Fc融合蛋白对表达HLA-C的细胞的结合评价抗KIR mAbs1-7F9、1-4F1和DF200阻止HLA-C和KIR分子之间的相互作用的能力。
为检测抗KIR mAb是否可阻止KIR2DL1-Fc和HLA-Cw4之间的相互作用，用不断增加的浓度的抗KIR mAb预温育KIR2DL1-Fc蛋白，然后加入至LCL 721.221-Cw4细胞，在4℃下进行温育，洗涤，用APC缀合的抗鼠类IgG1Fc温育，洗涤，并用标准的方法，通过流式细胞仪在FACScalibur或FACScanto(Beckton Dickinson)上进行分析。
DF200、1-7F9和1-4F1阻止KIR2DL1-Fc对表达HLA-Cw4的细胞的结合，表明这些mAb阻止KIR2DL1和HLA-Cw4之间的相互作用。
实施例8:结构域1或2结合的检测
本实施例描述了如何确定选择的抗体或其他试剂是否结合KIR的结构域1或结构域2。
测量抗KIR抗体或其他试剂对重组的截短的KIR形式(由连接至Fc片段的细胞外结构域2组成)的结合。通过从编码KIR2DL1-Fc的构建体删除编码结构域1的核苷酸制备该构建体，将所得的构建体(称为KIR2DL1-D2-Fc)转染入COS细胞或HEK293，然后如对于完整的KIR2DL1-Fc所描述的(参见实施例6和7，和Wagtmann等人1995,同上)那样，在A蛋白上纯化KIR2DL1-D2-Fc蛋白。
通过表面等离子共振分析测量抗KIR试剂对纯化的KIR2DL1-D2-Fc的结合。在Biacore 3000仪(Biacore AB,Uppsala,Sweden)上进行该测定。使用标准的胺偶联试剂盒(Biacore AB)将相同量的纯化的KIR2DL1-D2-Fc固定在CM5传感芯片(Biacore AB,Uppsala,Sweden)上的所有4个流体室中。以10μg/ml的浓度将HBS-EP缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％聚山梨酯20(v/v))中的纯化的重组KIR2DL1-D2-Fc注射入流体室，以10μl/分钟的流速进行1分钟。在注射KIR2DL1-D2-Fc后，将在HBS-EP缓冲液中以1:1.5稀释的杂交瘤组织培养上清液注射入分开的流体室中，以10μl/分钟的流速进行1分钟。当RU反应>20时，将样品评定为阳性结合。最后，通过注射10mM甘氨酸-HCl pH 1.8，以30μl/分钟的流速进行15秒来进行传感芯片的再生。因此显示结合KIR2DL1-D2-Fc的杂交瘤上清液包含结合KIR的结构域2的mAb，然而不结合KIR2DL1-D2-Fc的杂交瘤上清液被认定包含结合结构域1或结合横跨结构域1和结构域2的复合表位的mAb。
可使用KIR2DL1-D1-Fc构建体进行相似的测定以确定抗KIR抗体或其他KIR结合试剂是否结合结构域1。
***
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本发明包括在此处提供的方面或权利要求中引用的主题的所有变化和等同物以使适用法律允许的范围最大化。

Claims (25)

1.与抑制性人杀伤IgG样受体2DL(KIR2DL)的细胞外部分结合或相互作用的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段减少KIR2DL介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制而没有可检测地减少所述KIR2DL和所述KIR2DL的HLA I类配体之间的结合，
其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(i)对应于SEQ ID NO:17的残基31-35的CDR H1区域；对应于SEQ ID NO:17的残基50-66的CDR H2；对应于SEQ ID NO:17的残基99-108的CDR H3；对应于SEQ ID NO:18的残基24-34的CDR L1；对应于SEQ ID NO:18的残基50-56的CDR L2；和对应于SEQ ID NO:18的残基89-97的CDR L3；或者
(ii)对应于SEQ ID NO:21的残基31-35的CDR H1区域；对应于SEQ ID NO:21的残基50-66的CDR H2；对应于SEQ ID NO:21的残基98-103的CDR H3；对应于SEQ ID NO:18的残基24-34的CDR L1；对应于SEQ ID NO:18的残基50-56的CDR L2；和对应于SEQ ID NO:18的残基89-97的CDR L3。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段实现下列中的一种或多种：
(i)通过减少或阻止KIR2DL的群集来减少KIR2DL介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制；
(ii)通过减少或阻止KIR2DL的二聚化来减少KIR2DL介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制；
(iii)减弱或阻止结构域1相关性相互作用位点之间的相互作用；或者
(iv)减弱或阻止结构域2相关性相互作用位点之间的相互作用。
3.权利要求2的抗体或其抗原结合片段，其中
(i)所述KIR2DL结构域1相关性相互作用位点包含至少一个对应于SEQ ID NO:14的残基1-92中的一个残基的氨基酸残基；或者
(ii)所述KIR2DL结构域2相关性相互作用位点包含至少一个对应于SEQ ID NO:14的残基108-200中的一个残基的氨基酸残基。
4.权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段减少或阻止KIR2DL家族成员中的同型二聚化、异型二聚化中的至少一种或二者。
5.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段减少或阻止KIR2DL1的同型二聚化。
6.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述片段选自Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、单链抗体片段和多特异性抗体。
7.权利要求1或6的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或前述任一种抗体的抗原结合片段。
8.权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是结合KIR2DL1和KIR2DL2/3的交叉反应性KIR2DL结合试剂。
9.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有SEQID NO:17所示的氨基酸序列的VH链和具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VL链。
10.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的VH链和具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VL链。
11.权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段用作药物。
12.一种药物组合物，其以有效地在患者中可检测地增强NK细胞的细胞毒性的量包含权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段和一种或多种药物可接受的载体或稀释剂。
13.权利要求12的药物组合物，其还包含选自免疫调节剂、激素剂、化学治疗剂、抗血管生成剂、凋亡剂和阻止HLA结合抑制性KIR受体的抗体的治疗剂。
14.有效量的权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于在有此需要的受试者中减少KIR2DL介导的对NK细胞的细胞毒性的抑制。
15.权利要求14的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗KIR2DL抗体或其抗原结合片段。
16.权利要求14的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
(i)具有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的可变重链(VH)和具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的可变轻链(VL)；或者
(ii)具有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的可变重链(VH)和具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
17.权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症、感染性疾病或免疫病症。
18.权利要求17的用途，其中所述感染性疾病包括病毒感染。
19.权利要求17的用途，其中所述药物用于治疗癌症。
20.权利要求19的用途，其中所述癌症选自急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓异常增生综合征、非何杰金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、肾细胞癌、恶性黑色素瘤和结肠直肠癌。
21.权利要求18的用途，其中所述病毒感染由选自人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)和埃博拉病毒的病毒引起。
22.编码权利要求1的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
23.包含权利要求22的核苷酸序列的表达载体。
24.用权利要求23的载体转染的宿主细胞。
25.产生抗体的方法，其包括在适合于所述抗体表达的条件下培养权利要求24的宿主细胞。
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