WO2007023725A1

WO2007023725A1 - 遺伝子ワクチン

Info

Publication number: WO2007023725A1
Application number: PCT/JP2006/316156
Authority: WO
Inventors: Fumihiko Takeshita; Shin Sasaki
Original assignee: Yokohama City University
Priority date: 2005-08-25
Filing date: 2006-08-17
Publication date: 2007-03-01
Also published as: JPWO2007023725A1

Abstract

従来の遺伝子ワクチンよりも免疫付与効果の大きい新規な遺伝子ワクチンが開示されている。抗原に対する免疫を付与するための遺伝子ワクチンは、抗原遺伝子と、Toll様受容体のアダプター分子の遺伝子を含み、細胞内で前記抗原遺伝子及び前記アダプター分子遺伝子を発現することができる組換えベクターから成る。この遺伝子ワクチンを投与すると、免疫を付与する対象となる抗原分子とともに、Toll様受容体のアダプター分子が同一細胞内で産生され、該アダプター分子がアジュバント効果を発揮して、抗原に対する免疫応答が増強され、ひいては該抗原を含む病原体に対する免疫力付与効果が高められる。

Description

明細書

遺伝子ワクチン

技術分野

[0001] 本発明は、所望の抗原に対する免疫応答を強く誘起することができる遺伝子ヮクチンに関する。

背景技術

[0002] 従来から、ワクチンは種々の感染症に対する免疫を付与するために広く用いられている。従来力も用いられているワクチンは、弱毒化生ワクチン、不活化生物ワクチン、不活ィ匕毒素ワクチン等である。しかしながら、これらのワクチンは、免疫不全患者に対して投与することができない。また、生体外で培養することが困難な病原体も少なくなぐこれらの病原体に対する不活化ワクチンや弱毒化ワクチンを開発することは困難である。さらに、全細胞を用いる従来の不活ィ匕ワクチンでは、細胞が、例えば内毒素のような、有害な副作用を引き起こす物質を含んでおり、それによつて副作用が起きる危険'性ちある。

[0003] これらの問題を解決するワクチンとして近年、遺伝子ワクチンが注目されて、る（非特許文献 1)。遺伝子ワクチンは、免疫を付与したい病原体が持つ抗原遺伝子を含む組換えベクターであり、これをヒトに投与すると、ヒトの細胞内で持続的に抗原が生産され、該抗原に対する抗体産生が誘起され、該病原体に対する免疫が付与される。遺伝子ワクチンでは、抗原遺伝子をベクターに組み込めば、細胞内で該抗原が生産されるため、生体外で培養できない病原体に対するワクチンを作ることができる。また、病原体の抗原としては、単独では無毒なものを採用することができるので、副作用の危険がなぐ免疫不全患者に対して投与することも可能である。

[0004] し力しながら、遺伝子ワクチンは、一般に、病原体の抗原に対する免疫応答が弱く、病原体に対して強い免疫力を付与することが困難であるという問題がある。強い免疫応答を誘起するために、アジュバント (免疫応答を増強する物質)を用いることが知られており、抗体医薬等に用いる特異抗体を動物に生産させる場合等には、免疫原と共に、結核菌から調製したフロインドのアジュバント等のアジュバントを投与することが広く行なわれている。公知のアジュバントとしては、病原菌由来のリポ多糖 (LPS)やその誘導体、テタヌストキソイド等の毒素が知られている。しかしながら、このようなァジュバントをヒトに適用することは危険が大きく、用いられて、な、。

[0005] 遺伝子ワクチンに用いるベクターとして、ウイノレスベクターを用いた場合には、ウイルス由来の部分に対する免疫応答が起きるので、ウィルス部分が多少なりともアジュバントとして機能する。しかし、ウィルスによる毒性が発揮されて副作用が生じる危険性がある。また、ウィルス部分に対するアジュバント効果も、アレルギー反応により効果が持続しないという問題がある。遺伝子ワクチンのベクターとして、ウィルスによる毒 '性の危険'性がない、プラスミドベクターを用いることも広く知られている力プラスミドベクターを用いた場合には、ウィルスベクターを用いた場合のようにウィルス部分によるアジュバント効果が得られないため、免疫力付与効果はさらに小さくなる。

[0006] 遺伝子ワクチンによる免疫力付与効果を高めるために、遺伝子ワクチン内に、インターロイキンやインターフェロン等のサイト力インの遺伝子をみ込んでおき、細胞内で抗原と共にサイト力インを生産させることも知られている（非特許文献 2、 3)。しかしながら、これらの方法によっても必ずしも満足できる免疫付与効果は得られて、な、

[0007] 非特許文献 1： Tang D. et al., Nature 356, 152-154, 1992

非特許文献 2 : Kenji Okuda et al., Methods in Molecular Medicine, 1999, vol.29, pp. 197-204

非特許文献 3 : Hildegund C. et al., Methods in Molecular Medicine, 1999, vol.29, pp .251-260

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] したがって、本発明の目的は、従来の遺伝子ワクチンよりも免疫付与効果の大きい新規な遺伝子ワクチンを提供することである。

課題を解決するための手段

[0009] 本願発明者らは、鋭意研究の結果、遺伝子ワクチンに Toll様受容体のアダプター分子の遺伝子をみ込み、目的とする抗原と共に該アダプター分子を細胞内で生産することにより、該アダプター分子がアジュバントとして機能して、遺伝子ワクチンの免疫付与力が向上することを見出し、本発明を完成した。

[0010] すなわち、本発明は、抗原遺伝子と、 ToU様受容体のアダプター分子の遺伝子を含み、細胞内で前記抗原遺伝子及び前記アダプター分子遺伝子を発現することができる組換えベクターから成る、前記抗原に対する免疫を付与するための遺伝子ワクチンを提供する。

発明の効果

[0011] 本発明によれば、従来の遺伝子ワクチンよりも免疫付与効果が高!ヽ遺伝子ワクチンが提供された。本発明の遺伝子ワクチンを投与すると、免疫を付与する対象となる抗原分子とともに、 Toll様受容体のアダプター分子が同一細胞内で産生され、該ァダブター分子がアジュバント効果を発揮して、抗原に対する免疫応答が増強され、ひいては該抗原を含む病原体に対する免疫力付与効果が高められる。

図面の簡単な説明

[0012] [図 1]本発明の遺伝子ワクチンの構築方法を説明するための模式図である。

[図 2]本発明の遺伝子ワクチンの構築に用いた pGAベクターの遺伝子地図である。

[図 3]NF-kB及び IFN- βプロモーターの活性化因子としての TLRアダプターの特性を決定した結果を示す図である。 25ngの pTK-RL、 25 ngの 5 X NF- κ B-luc、又は pG LhlFN jS - lucと合わせて、 250 ngの pFLAG- CMV- 4 (CMV4), pGA- LacZ, pFLAG- C MV-4-MyD88, pFLAG- CMV- 4- TRIF, pFLAG- CMV- 4- TIRAP, pFLAG- CMV- 4- T OLLIP, pFLAG-CMV-4-IRAKl ,又は pFLAG- CMV- 4- TRAF6で HEK293細胞（4 X 10⁵個）を共トランスフエタトした。トランスフエタト 48時間後にホタルルシフェラーゼ活性を定量し、ゥミシィタケルシフェラーゼ活性に対し標準化した。独立した 3回の実験の内の 1回で得られたデータの値を示して、る。

[図 4A]MyD88又は TRIF遺伝子アジュバントを組み込んだ又は組み込まない DNAワクチンの構造を示す図である。単一抗原のみ（pGA-LacZ, pGA-GFP,及び CMV9-HA )又は抗原及びアジュバント分子の両方（pDX- LacZ- MyD88, pDX- GFP- MyD88, C MV9-HA-MyD88, pDX- LacZ- TRIF, pDX- GFP- TRIF,及び CMV9- HA- TRIF)を発現する DNAワクチンの模式図。 [図 4B]ルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターと、本発明の DNAワクチン又は比較のための DNAワクチンとを共トランスフエタトした細胞の LacZ活性及びホタルルシフェラーゼ活性を示す図である。 25 ngの pTK- RL, 25 ngの 5 X NF- κ B- luc又は pGLhIFN β -1 ucと合わせて、 250 ngの pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIFで HE K293細胞 (4 X 10⁵個)を共トランスフエタトした。トランスフエタト 48時間後に LacZ活性及びホタルルシフェラーゼ活性を定量し、ゥミシィタケルシフェラーゼ活性に対し標準化した。独立した 3回の実験の平均値士 SDの値を示している。 c及び d, p < 0.01; e及び f , ρ < 0.001; a及び b, p < 0.0001。

[図 5]MyD88遺伝子アジュバントによる体液性免疫反応の促進を示す図である。 0週及び 4週で imEPTにより pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIFでマウス (5個体 Z群）を免疫した。 4週及び 6週で採血し、次いで A)抗 LacZ IgG血清、 B) Ig Gl (□)、及び IgG2a (國)の力価を ELISAにより調べた。 Bb, p < 0.05; Aa, p < 0.01。

[図 6A]MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントによる細胞性免疫反応の促進を示す図である。図 5の説明文中に記載したとおりにマウスを免疫した。 A)個々のマウスより脾臓細胞を調製し、 1 μ g/mlのクラス I (H-2^d)ペプチド（國）又はクラス I (H-2^b)ペプチド (口)で 24時間インビトロで刺激した。 mRNAの抽出及び逆転写は材料及び方法中に記載したとおりに行なった。反応の一定分量について IFN- γ , IL-4,及び 18S rRNA レベルを調べた。 IFN- γ及び IL-4の mRNA発現レベルを 18S rRNAレベルに対して標準化し、相対 mRNA発現レベルとして記載した。グラフは平均値士 SDを示す。 a及び c , pく 0.05; b, pく 0.01。

[図 6B]FACSによる解析結果を示す図である。脾臓細胞を調製し、 12 g/mlの rLacZ で 22時間インビトロで刺激した。次いで 1 μ g/mlの GolgiPlugを添カ卩し、該細胞をさらに 2時間培養した。固定後、細胞を PE融合抗 CD4又は CD8抗体及び FITC融合抗 IFN- γ抗体で染色、洗浄し、 FACSにより解析した。細胞は初めはリンパ球、次いで CD4 又は CD8陽性細胞に篩い分けされる。頻度はそれぞれ全 CD4+又は CD8+細胞に対する IFN- γ + CD4+又は CD8+細胞のパーセントである。

[図 6C]CTL系統 (エフェクター細胞）は材料及び方法中に記載したとおりに調製した。 MHCハプロタイプ適合（H- 2Κ^α) Ρ815細胞を 1 μ g/mlのクラス I (H- 2^d)ペプチド（國）又はクラス I (H-2^b)ペプチド（口）と共に 1時間パルス刺激し、標的細胞として用いた。該エフェクター細胞及び標的細胞を 6, 12.5, 25,及び 50 (E/T比)の比率で混合し、 4 時間培養し、次いで培養上清の LDH活性を定量した。グラフは材料及び方法中に記載した通りに算出した⁰ /₀特異的溶解の平均値士 SDを示す。 c及び f, pく 0.01 ; b及び e , p < 0.001 ; a, d,及び g, p < 0.0001。

圆 7]TRIFを介するアジュバント効果の基礎をなす機構を説明する図である。 50 g の pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIFを imEPTによりマウス（3/ 群)の大腿四頭筋中に投与した。投与 3日後又は 7日後、注入された筋肉を取り出してホモジナイズし、遠心した。上清の LacZ活性及びタンパク質濃度を定量した。ダラフはタンパク質濃度に対して標準化した LacZ活性の平均値士 SDを示す。 a, c,及び d , ρく 0.05; b, ρく 0.01。

[図 8A]MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントでの imEPT後における流入領域 LN中に存在する細胞の活性化を示す図である。 50 μ gの pGA- GFP, pDX-GFP-MyD88,又は pGA- GFP-TRIFでの imEPTによる 2回目の免疫から 72時間後、流入領域 LN (鼠径部 LN)を取り出しホモジナイズした。 LNの単一細胞懸濁液を PE融合抗 CD 11c又は C D40抗体で表面染色、洗浄し、次いで FACSにより解析した。頻度は全細胞に対する CDl lc+又は CD40+細胞のパーセントである。 10個の独立した LNから調整したサンプルの平均値士 SD値を示す。

[図 8B]MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントでの imEPT後における流入領域 LN中に存在する細胞中の各種サイト力イン等の発現量を示す図である。 50 μ gの pGA- GFP, pDX-GFP-MyD88,又は pGA-GFP-TRIFでの imEPTによる追加免疫から 24又は 72時間後、流入領域 LN (鼠径部 LN)を取り出し、ホモジナイズして TRIzol試薬中に懸濁した。 mRNAを抽出し逆転写した。 cDNAの一定分量中における IFN- γ , IL-12 p40, IL -18, IL- 4, IL- 6, IFN- β , TNF- a , IP- 10, JE/MCP-1 , MHCクラス I, MFCクラス Π, C D40, CD80,及び CD86の発現レベルをリアルタイム PCRにより解析した。グラフは 10 個の独立した LN力調整したサンプルの平均値士 SD値を示す。縦軸は、無処置の群を 1とした相対 mRNA発現量を示す。 Af, Ba, Bb, Be, Be, Bf, Bg, Bh, Bj, Bk, Bn, B o, Bp, Bq, Br, Bs, Bt, Bu, Bv, Bx, By, Bz,及び BA, p < 0.05; Aa, Ac, Ad, Ae, Ag, Bd, Bi, Bl, Bm,及び Bw, p < 0.01; Ab, p < 0.001。

[図 9A]MyD88又は TRIF遺伝子アジュバントを組み込んだインフルエンザ DNAヮクチンはマウスを致死量のインフルエンザウイルス感染力も効果的に防御することを示す図である。 0週及び 4週の時点において imEPTにより 2 gの pGA-GFP, CMV9-HA, C MV9-HA-MyD88,又は CMV9- HA- TRIFでマウス（10個体 Z群）を免疫した。 2回目の免疫の 2週間後、マウスに 4 LD 又は 20 LD 量のインフルエンザウイルス A/PR/8/

50 50

34を接種した。以後 12日間の体重をモニターした。グラフは 0日における体重に対する体重のパーセントを示す。死亡した個体は†で示す。

[図 9B]図 9Aの以後 12日間の生存率をモニターした結果を示す図である。〇， pGA- GFP;▲, CMV9-HA; ■， CMV9- HA- MyD88; ·, CMV9- HA- TRIF

発明を実施するための最良の形態

[0013] 本発明において、「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする核酸を意味し、必ずしも親カゝら子へ伝えられる天然の遺伝子に限定されるものではなぐ合成された核酸等であつてもよい。核酸としては、安定性の点力 DNAが好ましい。

[0014] 本発明の遺伝子ワクチンは、 Toll様受容体 (TolHike receptor,以下「TLR」 t 、うことがある)のアダプター分子の遺伝子を含んでおり、この点が本発明の遺伝子ヮクチンの特徴である。 TLRは、微生物やウィルス等の病原体を感知し、進入する病原体に対して初期の免疫応答を引き起こす重要な役割を担うものである。 TLRの遺伝子は、ショウジヨウバエの Toll遺伝子と相同性を有すること力も Toll様受容体と呼ばれる。 TL Rは、病原体により発現される高度に保存された構造モチーフを認識するものであり、このような構造モチーフとしては、フラジェリン (細菌の鞭毛を構成するタンパク質)、細菌 DNA、二本鎖ウィルス RNAや LPS、ペプチドダリカン、リポペプチド等の細胞壁構成因子が包含される。ヒトおよびマウスでは約 11種類の TLRが知られている。

[0015] TLRに病原体由来の上記構造モチーフ（リガンド）が結合することにより TLRが刺激されると、適切な免疫応答を指揮するサイト力イン、ケモカインの分泌を誘導する転写因子 NF- κ Bの活性化や I型インターフェロン（IFN)の産生を誘導するシグナルカスケードが始動される。 TLRの活性化から、 NF- κ Bの活性ィ匕または I型 IFNの産生誘導に至るまでのカスケードにおけるシグナル伝達に係るタンパク質が TLRアダプター分子と呼ばれ、種々のものが知られている。本願発明者らは、この TLRアダプター分子をコードする遺伝子を、遺伝子ワクチンに組み込んでおき、対象となる抗原と共に同一細胞内で発現させることにより、アジュバント効果が発揮され、免疫付与効果が高まるという新知見を得、本発明に至ったものである。

[0016] TLRのアダプター分子は、公知の!/、ずれの TLRの!、ずれのアダプター分子であつてもよいが、好ましいアダプター分子の例として、 MyD88、 TRIF(TICAM1とも呼ばれる )、 TIRAP、 TRAM, IRAKI、 IRAK4, TRAF6、 RIP1、 IKK- i、 TBK1及び RIG- 1を挙げることができる。これらのうち、 MyD88及び TRIFが特に好ましい。これらのアダプタ一分子自体は周知であり、その遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列も知られている。例えば、 MyD88遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は、 GenBank Accession No. NM— 002468に記載されている。同様に、 TRIF/TICAM1 の配列は、 GenBank Accession No. (以下同じ） AB093555、 TIRAPは AF406652、 TR AMは AY232653、 IRAKIは L76191、 IRAK4は AY283670、 TRAF6は U78798、 RIP1は NM_003804、 IKK- iは AB016590、 TBK1は AF191838、 RIG- 1は AY180973に記載されている（以上の GenBank Accession No.に記載されているアダプター分子は全てヒト由来）。なお、ヒト MyD88の配列を配列表の配列番号 1に、ヒト TRIFの配列を配列表の配列番号 3に示す。

[0017] これらのアダプター分子遺伝子は、その塩基配列が公知であるので、例えば TLRを発現しているヒトマクロファージ等カも抽出した RNAを铸型とする逆転写 PCR等の常法により作製することができるし、市販のヒト脾臓 cDNAライブラリーを铸型として PCR 等の常法により作製することもできる（下記実施例参照)。また、本発明において好ましく用いられる MyD88や TRIF等のアダプター分子の遺伝子は巿販もされているので、市販品を用いることもできる。

[0018] 上記したアダプター分子には、天然の変異体が知られているものもあり、その場合には、その天然のアダプター分子の変異体遺伝子を用いることもできる。また、一般に、生理活性を有するポリペプチドは、そのアミノ酸配列を構成するアミノ酸のうち少数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、又は少数のアミノ酸が挿入されたり付加された場合でもその生理活性が維持される場合があることは周知である。したがって、上記した天然のアダプター分子のアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有し、遺伝子ワクチン内にコードされる前記抗原と共に細胞内で発現された際に該ワクチンのアジュバント効果を発揮する変異型のアダプター分子もまた本発明にお、て用いることができる。このような変異型のアダプター分子のアミノ酸配列の、天然型のアミノ酸配列に対する相同性は、好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上である。なお、ここで、二者のアミノ酸配列の相同性は、一致するアミノ酸の数が最も多くなるように配列を整列し、一致して、るアミノ酸の数を全体のアミノ酸の数 (全体のアミノ酸の数が異なる場合には短い方のアミノ酸の数)で除したものを百分率で表したものであり、 BLAST のような周知のソフトにより容易に算出できる。なお、変異型のアダプター分子の長さが天然型と異なる場合、その長さは天然型の 70%以上が好ましぐさらに好ましくは 9 0%以上、さらに好ましくは 95%以上である。また、変異型のアダプター分子のァミノ酸配列は、天然型のアダプター分子のアミノ酸配列において、 1個ないし数個のアミノ酸が置換し及び Z若しくは欠失し、並びに Z又は 1個ないし数個のアミノ酸が挿入され及び Z若しくは付加されたものである場合がさらに好ましい。アミノ酸が置換する場合、類似した性質のアミノ酸に置換しても生理活性が維持される場合が多!ヽので、置換の場合は、類似した性質のアミノ酸に置換したものが好ましい。すなわち、天然のタンパク質を構成する 20種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸 (Gly , He, Val, Leu, Ala, Met, Pro),親水性側鎖を有する中性アミノ酸 (Asn, Gin, Thr, Se r, Tyr Cys)、酸性アミノ酸 (Asp, Glu)、塩基性アミノ酸 (Arg, Lys, His),芳香族アミノ酸 ( Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多い。もっとも、上記したような変異型を用いる必要は特になぐ天然型のアダプター分子を用いることが好ましい

[0019] 本発明の遺伝子ワクチンは、上記したアダプター分子の遺伝子が組み込まれていることを特徴とし、他の部分は、従来力も周知の遺伝子ワクチンと同様であってよい。

[0020] 遺伝子ワクチンに組み込む抗原遺伝子としては、免疫力を付与したい病原体が有する抗原であって、それに対する抗体により該病原体による発症が防止又は緩和されるものであればよぐ何ら限定されるものではなぐ公知の遺伝子ワクチンに用いられて、る抗原遺伝子は、ずれも用いることができる。本発明に用いることができる抗原遺伝子の例としては、インフルエンザウイルスのへマグルチニン (HA)及び核タンパク（NP)、エイズウイルスの外被タンパク（gag、 pol、 env)並びに緑膿菌の構成成分（O prF/I、 PilA、 PcrV、 FliC)等の公知の遺伝子を例示することができる力これらに限定されるものではない。

[0021] 本発明の遺伝子ワクチンは、上記抗原遺伝子及びアダプター分子遺伝子を哺乳動物細胞用のベクター中に組み込んだものである。哺乳動物細胞用ベクター自体は、この分野において周知であり、巿販もされており、公知のベクターや市販品をそのまま用いることができる。例えば、 Invitrogen社から市販されて!、る pcDNA3.1(+)(catal og No. V790— 20)や pcDNA3.1(— Xcatalog No. V795— 20)等を好ましく用いることができるがこれらに限定されるものではない。周知のとおり、これらの哺乳動物細胞用べクタ一は、哺乳動物細胞内での複製を可能にする複製開始点、外来遺伝子の発現を可能にするプロモーター領域、外来遺伝子を挿入するためのマルチクローユング部位等を有する。なお、ベクターは、レトロウイルスやアデノウイルスのような哺乳動物細胞用のベクターとして用いられて、るウィルス由来のベクターであってもよ、。

[0022] 本発明の遺伝子ワクチンは、哺乳動物細胞用のベクターに上記抗原遺伝子と上記アダプター分子遺伝子を組み込むことにより得ることができるが、前記抗原遺伝子は、該抗原遺伝子の転写を制御するプロモーターの下流に位置し、前記アダプタ一分子遺伝子は、該アダプター分子遺伝子の転写を制御する、前記抗原遺伝子のプロモーターとは異なるプロモーターの下流に位置することが好ましい。すなわち、抗原遺伝子及びアダプター遺伝子は、それぞれ別のプロモーターにより制御されることが好ましい。もっとも、同一細胞内で抗原とアダプター分子の両方が生産されることを確保するために、各プロモーターとしては同じ種類のプロモーターを用いることが好ましいが、異なる種類のプロモーターであってもよい。

[0023] 本発明の遺伝子ワクチンは、哺乳動物細胞用のベクターのマルチクローユング部位に、抗原遺伝子又はアダプター分子遺伝子を挿入し、次いで、マルチクローニング部位のターミネータ一領域 (polyA等）の下流にある制限酵素部位を切断し、この切断部位に、プロモーター +アダプター分子遺伝子 (先にアダプター遺伝子を挿入した場合には抗原遺伝子） +ターミネータ一のカセット配列を挿入することにより構築することができる。あるいは、哺乳動物細胞用のベクターのマルチクローユング部位に、抗原 (又はアダプター分子遺伝子） +ターミネータ一のカセットを挿入し、該ターミネ一ターの下流にプロモーター +アダプター分子（又は抗原遺伝子）のカセットを挿人すること〖こよっても構築することができる。

[0024] 遺伝子ワクチンに組み込まれる抗原遺伝子やアダプター遺伝子は、必ずしも 1つずつに限定されるものではなぐ異なる 2種類以上の抗原遺伝子や異なる 2種類以上のアダプター分子遺伝子を組み込んでもよい。もっとも、遺伝子の数が多くなりすぎると遺伝子ワクチンのサイズが大きくなりすぎて細胞に入りにくくなるので、抗原遺伝子とアダプター分子遺伝子の合計は 4個以下が好ましい。このように、抗原遺伝子ゃァダプター分子遺伝子を複数組み込む場合でも、プロモーター +抗原 (アダプター分子）遺伝子 +ターミネータ一のカセットをベクター内の制限酵素部位に挿入することにより、所望の遺伝子ワクチンを構築することができる。

[0025] 哺乳動物への遺伝子ワクチンの投与自体は、周知の方法により行うことができる。

すなわち、好ましくは、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、静脈内投与等の非経口投与により投与することができる。遺伝子ワクチンをリン酸緩衝液 (PBS)等の緩衝液に懸濁したものを投与することができる。投与に際し、細胞内への遺伝子ワクチンの侵入を容易にするために、注射部位に電界パルスを与えることが好ましい。この場合、電界の強さは、特に限定されないが、通常、 10V/cn！〜 60V/cm程度、好ましくは 25V/ cm〜35V/cm程度、パルスの持続時間は、通常、 20ミリ秒〜 100ミリ秒、好ましくは、 40 ミリ秒〜 60ミリ秒程度であり、パルスを通常、 1回〜 6回、好ましくは 2回〜 4回程度当てることができる。また、皮内投与は、市販の遺伝子銃を用いて周知の方法により行うことができる。すなわち、遺伝子ワクチンを、金粒子上に固定し、この金粒子を、ポリビ -ルピロリドンのような接着剤と共に遺伝子銃で動物の体表力皮内に打ち込むことにより投与することができる。投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重 lkg当たり、遺伝子ワクチンの重量で 1 μ _§〜1000 g程度、好ましくは 100 μ g〜200 μ g程度である。

[0026] 下記実施例において具体的に示されるように、本発明の遺伝子ワクチンを投与すると、アダプター分子遺伝子を含まない公知の遺伝子ワクチンと比較して、抗原に対する免疫応答がより強く起き、該抗原を有する病原体に対する免疫力をより強力に付与することができる。すなわち、抗原に対する特異抗体の生産がより増大し (体液性免疫反応の増大）、インターフェロン等のサイト力インの生産量が増大し、 CTL (細胞障害性 T細胞)活性化反応がより強く誘導される。

[0027] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例

[0028] 方法

発現プラスミド

抗原及び TLRアダプター分子をコードする cDNA断片を親プラスミド力も PCRにより増幅し、後述する方法により遺伝子ワクチンに組み込んだ。 FLAGタグを施した発現ベクター CMV4— MyD88, CMV4-TRIF, CMV4-TIRAP, CMV4— TOLLIP, CMV4-IRA K1,及び CMV4- TRAF6は公知の方法（Eur J Immunol, vol. 35, 2477-2485, 2005)により作製した。 LacZ又は EGFPの cDNAはそれぞれ pSV- β -ガラタトシダーゼ（Promeg a,ウィスコンシン州 Madison)又は pEGFP-Nl (BD Biosciences,カリフォルニア州 San Jose)から増幅した。インフルエンザウイルス A/PR/8/34株 (H1N1型）の HA (アミノ酸 1 8番 -566番、配列番号 5、 6)は pJW4303/Hl (J Virol, vol. 76, 6652-6659, 2002)から増幅し PFLAG-CMV9ベクター（Sigma,ミズーリ州 St Louis)に導入した。クローユングした PCR産物の配列は ABI PRISM Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems,カリフオル-ァ州 Foster City)を用いて確認した。

[0029] より具体的には、本発明の遺伝子ワクチンである pDX- LacZ- MyD88、 pDX- LacZ- T RIF、 CMV-HA- MyD88及び CMV9-HA- TRIFは次のようにして構築した（図 1参照）。

[0030] 図 1に示す受容体プラスミドは、公知の pGAベクター（Ross et al.， Nat. Immunol. 1, 127-131(2000》又は市販の pFLAG CMV9ベクター (Sigma社製）を基本とするものである。 pGAの遺伝子地図を図 2に示す。図 2に示されるように、 pGAベクターは、真核生物由来の挿入遺伝子の転写を開始するためのサイトメガロウィルス (CMV)の immediat e-earlyプロモータ^ ~~ hイントロン Aと、転写終結のためのゥシ成長ホルモン (BGH)のポリアデ-レーシヨンシグナル (polyA)と、原核生物細胞内での複製を可能にするための Col El originと、カナマイシン耐性遺伝子と、真核生物由来の挿入遺伝子の安定性を高める λ TOターミネータ一とを含むプラスミドである。 pFLAG CMV9ベクター (S igma社製)も pGAベクターと類似した構造 (ただしカナマイシン耐性遺伝子ではなくァンピシリン耐性遺伝子を有する）を有する。 LacZ遺伝子は、 pGAベクターの Hindm-X hoi部位、 GFP遺伝子は、 pGAベクターの BamHI-Avrll部位、 HA遺伝子は、 pFLAG C MV9ベクター (Sigma社製）の Notl- BamHI部位に挿入し、図 1に示す受容体プラスミドを構築した（それぞれ、「pGA recipient LacZ」、「pGA recipient GFP」、「pFLAG CM V9 recipient HA」 )。

[0031] なお、挿入した LacZ遺伝子、 GFP遺伝子、 HA遺伝子は次のようにして調製した。 La cZ遺伝子は、市販の pSV- j8 -ガラクトシダーゼ（Promega,ウィスコンシン州 Madison) 中に含まれて、る LacZ遺伝子を PCRにより増幅して調製した。 PCRに用いたプライマ一セット ίま、 5 -GGG AAG CTT ACC ATG TCG TTT ACT TTG ACC AAC AAG— 3 'と 5し GGG CTC GAG TTA TTT TTG ACA CCA GAC CAA CTG G— 3'であった。 G FP遺伝子は、市販の pEGFP- Nl (BD Biosciences,カリフォルニア州 San Jose)中に含まれて、る GFP遺伝子を PCRにより増幅して調製した。 PCRに用いたプライマーセッ卜は、 5 -CCC GGA TCC ACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG C— 3'と 5'— T ΤΤ CCT AGG TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC- 3'であった。 HA遺伝子は、公知の pJW4303/Hlベクター（J Virol, vol. 76, 6652-6659, 2002)に含まれる HA 遺伝子 (配列番号 5、 6)の、アミノ酸 18番 -566番をコードする領域を PCRにより増幅して調製した。 PCRに用いたプライマーセットは、 5'- AGC TGC GGC CGC AGA CAC AAT ATG TAT AGG— 3'と 5し CGG GAT CCT CAG ATG CAT ATT CTG CAC TG C- 3 'であった。

[0032] 一方、図 1に示す供与体プラスミドは、上記した pGAベクター又は pBluescript SK (+) ベクター（Stratagene社より市販されて!、る周知のクロー-ングベクター）を基本とするものである。 pGAベクターの Hindlll-EcoRI部位に、 MyD88遺伝子又は TRIF遺伝子を挿入して図 1の供与体プラスミドを構築した (「pGA donor MyD8⁸」及び「pGA donor T RIF」） (LacZ又は GFP含有遺伝子ワクチン調製用）。得られた供与体プラスミド pGA do nor MyD88及び pGA donor TRIF力ら、 Notlにより、 CMV promoter- IntronA-MyD88 断片及び TRIF cDNA- polyA断片をそれぞれ切り出し、 pBluescript SK(+)ベクターの Notl部位に挿入して供与体プラスミド「pBluescript SK (+) MyD88」及び「pBluescript S K (+) TRIFjを構築した (HA含有遺伝子ワクチン調製用)。

[0033] なお、挿入した MyD88遺伝子及び TRIF遺伝子は、ヒト脾臓 cDNAライブラリー（クローンテック社より巿販）を铸型とし、それぞれ次のプライマーセットを用いた PCRにより増幅して調製した。 MyD88: 5 -GGA ATT CAC CAT GGC TGC AGG AGG TCC C GG- 3'と 5 '-CCC AAG CTT CAG GGC AGG GAC AAG GCC TTG- 3'、 TRIF: 5'- G GA ATT CAC CAT GGC CTG CAC AGG CCC ATC— 3'と 5し CCC AAG CTT CAT TCT GCC TCC TGC GTC TTG- 3'

[0034] pGA donor MyD88及び pGA donor TRIF力ら Notlにより、それぞれ CMV promoter— I ntronA- MyD88及び TRIF cDNA- polyA断片を切り出し、それぞれ pGA recipient Lac Zまたは pGA recipient GFPの Notl部位に挿入してそれぞれ pDX-LacZ-MyD88、 pD X- GFP- MyD88、 pDX-LacZ- TRIF及び pDX- GFP- TRIFをそれぞれ作製した。また、 p Bluescript SK (+) MyD88及び pBluescript SK (+) TRIF力ら Sailにより、 CMV promoter - IntronA- MyD88断片及び TRIF cDNA- polyA- Sail断片をそれぞれ切り出し、 pFLAG CMV9 recipient HAの Sail部位に挿入して CMV9- HA- MyD88及び CMV9- HA- TRIF をそれぞれ作製した。

[0035] 細胞のトランスフエクシヨン及びレポーター遺伝子アツセィ

製造者のプロトコールに従い、 FuGene 6 (Roche Diagnostics,インディアナ州 Indian apolis)を用いて一過的トランスフエクシヨンを行った。 HEK293細胞（3 X 10⁴)を、各発現プラスミド (CMV4, CMV4-MyD88, CMV4- TRIF, CMV4- TIRAP, CMV4- TOLLI P, CMV4-IRAK1, CMV4- TRAF6, pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIF, 200 ng)、レポータープラスミド (p5xNF- κ B- luc又は pGL3 hlFN β , 25 ng)、及びコントロールのゥミシィタケルシフェラーゼプラスミド (pTK-RL, 25 ng, Promega,ウイスコンシン州 Madison)で共トランスフエタトした。トランスフエクシヨン後細胞を 48時間ィンキュペートし、製造者のプロトコ一ノレに従い Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。あるいは、 j8 - Gal Reporter Gen e Assay kit (Roche Diagnostics)を用いて LacZ活性を測定した。最後に、個々の細胞溶解物のホタルルシフェラーゼ活性又は LacZ活性をゥミシィタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。

[0036] 免疫計画

8週齢の雌 BALB/cマウスを SLC (静岡県)より購入し、特定の病原体フリーな環境下の動物施設で飼育した。ケタミン Zキシラジン混合液で麻酔した後、該マウス (8匹 Z 群）の大腿四頭筋に、 pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88, pDX- LacZ- TRIF, pGA- GFP, pDX-GFP-MyD88, pDX— GFP— TRIF, CMV9— HA, CMV9— HA— MyD88,又は CMV9— HA- TRIFの、ずれかを含むプラスミド溶液 (1 μ _§/ μ 1生理食塩水、 50 μ 1/筋)を注射した。 CUY21EDIT (NepaGene,東京)を用いて、 30 V/cm—定、 50ミリ秒 X 3パルスの電界強度で注射部位をエレクト口ポレーシヨンした。 2回目の免疫は 1回目の免疫の 4 週間後に行なった。全ての動物実験は施設の動物管理'福祉委員会に承認され、マウスは NIH動物管理ガイドラインに従って取り扱われた。

[0037] ELISA

ELISAによって以前記載したとおりに血清抗体価を測定した。免疫プレート (Nalge N unc International,ニューヨーク州 Rochester)を、 0.1 M重炭酸塩緩衝液（pH 9.0)中に 1 /z g/mlに溶解した抗 LacZ抗体 (rLacZ、（TOYOBO))で被覆した。該プレートを PB ST + 1% BSAでブロッキングし、免疫したマウス力も収集した血清の低減希釈液を該プレートにカ卩え、プレートを 37°Cで 2時間インキュベートした。結合した IgGを HRP標識した抗マウス IgG, IgGl,又は IgG2a抗体（Southern Biotechnology Associates,ァラノマ州 Birmingham)と反応させ、次いでクェン酸緩衝液及び H 0中で基質として作用

2 2

する 2-2-アジノ-ビスと反応させた。力価の高!、抗血清を用いて作製した検量線と比較することによる比色アツセィで、相対的抗体濃度を得た。

[0038] 細胞内サイト力イン染色（Intracellular cytokine staining; ICCS)アツセィ

最後の免疫の 2週間後に脾臓細胞を収集した。該細胞を 12 /z g/mlの rLacZ (Sigma) と共に 37°Cにて 24時間インキュベートし、インキュベート終了 2時間前に 1 μ g/mlの Go lgiPlug (BD Biosciences)を添カ卩した。該細胞を染色緩衝液（3% FCS及び 0.1% NaNを

3 含む PBS)で洗浄し、 4%正常マウス血清でブロッキングして、フィコエリトリン結合抗マウス CD4抗体（L3T4, BD Biosciences)又は CD8抗体（Ly- 2, BD Biosciences)で染色した。次いで該細胞を固定、浸透可能化し、 FITC結合抗マウス IFN- γ抗体 (XMG1. 2, BD Biosciences)で 4°Cにて 30分間染色後、フローサイトメトリー解析に付した。

[0039] リアルタイム PCR

最後の免疫の 2週間後に脾臓細胞を収集した。該細胞を 1 μ g/mlの H-2^d-制限 Lac Zクラス Iペプチド (TPHPARIGL)で 24時間 37°Cにてインキュベートした。あるいは、最後の免疫の 24時間後又は 72時間後に鼠径部の LN細胞を収集した。これらの細胞を次いで 800 1の TRIzol試薬（Invitrogen,カリフォルニア州 Carlsbad)中に溶解し、全 R NAを単離した。逆転写は、 25 ng/mlのオリゴ (dT) , 200 Uの Superscript III逆転写

12-18

酵素（Invitrogen), 2 mM dNTP, 10 mM DTT,及び 10 Uのリボヌクレアーゼ阻害剤を含む第一鎖緩衝液（50 mM Tris-HCl; pH 7.5, 75 mM KC1,及び 2.5 mM MgCl )中

2 で 50°Cにて 1時間行なった。リアルタイム PCRは、 IFN- γ , IL- 12 p40, IL- 18, IL- 4, IL -6, IFN- β , TNF- a , IP— 10, JE/MCP— 1 , MHC class I (Dl), MHC class II (Ea), CD 40, CD80, CD86,又は 18S rRNAに特異的な TaqManプローブ（Applied Biosystems, カリフォルニア州 Foster City)及び ABI PRISM 7700 sequence detection system (App lied Biosystems)を用いて行なった。個々のサンプルにおける IFN- γ , IL- 12 p40, IL -18, IL— 4, IL— 6, IFN- β , TNF- a , IP— 10, JE/MCP— 1 , MHCクラス I (Dl), MHCクラス II (Ea), CD40, CD80,及び CD86の相対 mRNA発現レベルは、 18S rRNAのレベルに対して正規化した。

[0040] CTLアツセィ

最後の免疫の 2週間後に脾臓細胞を収集した。 1

ペプチド及び 20 U/mlの IL-2 (Sigma)と共に 37°Cにて 4日間インキュベートした後、 C TL分離株 (エフェクター細胞)を調製した。標的細胞として、 1 mg/mlの H-2^b-制限 La cZクラス Iペプチド（DAPIYTNV,コントロールペプチド）又は H- 2^d-制限 LacZクラス Iぺプチドと共にパルス刺激した P815細胞を用いた。該標的細胞（1 X 10⁴個）を増殖したエフェクター細胞と共に 4時間培養した。標的細胞力も放出された LDHの量は、 Cytot ox 96 (Promega)システムを用いて測定し、製造者のプロトコールに従い％特異的細胞溶解を算出した。 [0041] インビボレポーター遺伝子アツセィ

筋肉内エレクト口ポレーシヨン (intramuscular electoroporation; imEPT)〖こより 50 μ g の pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIFのいずれかを BLAB/cマウス（3マウス/群）に投与した。投与 3日後又は 7日後に、注入された筋肉（6筋/群)を取り出し、細胞溶解試薬（Roche Diagnostics)中でホモジナイズし、凍結融解を 3回行なつた。遠心後、上清を回収し、 LacZ活性又はタンパク質濃度をそれぞれ |8 _ガラクトシダーゼアツセィシステム（Roche)又は BCAタンパク質アツセィキット（Bio-Rad,カリフォル-ァ州 Hercules)を用いて測定した。次いで、個々の細胞溶解物の LacZ活性をタンパク質濃度に対して正規ィ匕した。

[0042] ライゲーシヨン介在 PCR(LM-PCR)によるアポトーシス細胞からの DNA断片の増幅

293T細胞を、 pGA- GFP, pDX- GFP- MyD88,又は pDX- GFP- TRIFのいずれかで一過的にトランスフエタトした。トランスフエクシヨンの 48時間後、製造者の指示書に従い Nuclepspinキット（Macherey- Nagel,ペンシルバニア州 Easton)を用いて該細胞からゲノム DNAを抽出した。各サンプル DNAから 1 μ gを、 ApoAlert LM- PCRキット（BD Biosciences)を用いたライゲーシヨン介在 PCR法に付した。すなわち、該ゲノム DNA の末端に 12ヌクレオチド及び 24ヌクレオチドのアダプターを、 T4 DNAリガーゼを用いて 16°Cにて 12時間ライゲーシヨンした。次いで、 12ヌクレオチド及び 24ヌクレオチドをプライマーとして用いて、 PCRを 24サイクル行なった。 PCR産物を 1.5%ァガロースゲルにて分離し臭化工チジゥム染色後 UV光下で確認した。

[0043] インフルエンザ接種

pGA-GFP, CMV9-HA, CMV9— HA— MyD88,又は CMV9— HA— TRIFによる 2回目の免疫の 2週間後、 1 X 10⁴ PFU (4 LD )又は 5 X 10⁴ PFU (20 LD )のインフルエンザ

50 50

ウィルス A/PR/8/34をマウスの鼻内に接種した。以後 10日間、被接種マウスの体重及び死亡率を観察した。

[0044] 統計的解析

全ての実験は 2回以上反復した。 0.05未満の p値を統計的有意としたスチューデント t検定により統計的有意性を評価した。

[0045] 結果 TLR又は TLRリガンド非存在下における TLRアダプター分子の過剰発現による NF- K B及び IFN- βプロモーターの活性化

遺伝子アジュバントとして最適な候補分子を検索するため、本願発明者らは、 MyD 88, TRIF, TIRAP, TOLLIP, IRAKI ,及び TRAF6を含む公知の TLRアダプター分子について、 HEK293細胞中において NF- κ Β及び IFN- βプロモーターを活性化する能力を調べた。 NF- κ Βは、サイト力イン、ケモカイン、及び共起刺激分子のような先天免疫活性化に関与する遺伝子の発現を調節する主要な転写因子である。 IFN- a 及び IFN- 18の両者を含むタイプ Iの IFNは、先天免疫と同様、抗原提示に不可欠である。図 3に示す通り、 TLRアダプター分子のうち、 MyD88が NF- κ Β活性化を最も強く誘導し、一方で TRIFは IFN- |8プロモーターを最も高いレベルで活性ィ匕することができた。従って、遺伝子アジュバントの候補分子として MyD88及び TRIFが選ばれた。

[0046] MyD88又は TRIFのための発現カセットと共に組み込まれたワクチンプラスミドの力価

MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントの最大限の効果を得るため、抗原と共に MyD8 8又は TRIFを同一の抗原提示細胞（antigen presenting cell; APC)中に導入し（直接的な初回抗原刺激)、該細胞においてこれらの分子が有効な抗原提示作用を行なえるようにした。この目的に到達するため、図 4Aに示す二重発現プラスミドを構築した。次いで、これらの構築物の抗原発現能及び内生細胞活性化能を調べた。 HEK293T 細胞を pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIFでトランスフエタトした場合、細胞溶解物中における LacZ活性レベルは同程度であった（図 4B)。予想されたとおり、 pDX- LacZ- MyD88でトランスフエタトした場合には、コントロールプラスミド（p GA-LacZ)でトランスフエタトした場合と比較して、 NF- κ Β依存のルシフェラーゼ活性は 7.8倍以上増加していた。 pDX- LacZ- TRIFでトランスフエタトした場合は、 IFN- j8プ口モーター依存のルシフェラーゼ活性はコントロールプラスミドの 11.7倍以上に増加していた。従って、これらのデータは、 MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントはワクチンプラスミドベクター中に組み込まれた際に抗原 (LacZ)の発現レベルを変調させることなく内生細胞活性ィ匕因子として働く機能を保持するとヽうことを示して！/ヽる。

[0047] MyD88遺伝子アジュバントと共に組み込まれた DNAワクチンにより起こる体液性免疫反応の促進 DNAワクチンプラスミドに組み込まれた MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントの効果を調べるため、 pGA-LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIFを筋肉内エレタトロポレーシヨン（intramuscular electoroporation; imEPT)によりマウスに投与した。 1 回目の免疫後（4週）では、これらのプラスミド DNAワクチンは抗 LacZ IgGを同程度の低レベルで誘導して、た（図 5A)。 2回目の免疫後（6週）では、 pDX-LacZ-MyD88は抗 LacZ IgG血清をコントロールプラスミド（pGA-LacZ)よりも 7.4倍以上高!、レベルで誘導していた。 pDX-LacZ-TRIFは抗 LacZ IgG血清生産をコントロールプラスミドと同程度のレベルで誘導していた（図 5A)。 IgGサブタイプのレベルも調べた。 pDX-LacZ - MyD88は、コントロールプラスミドと比較して、抗 LacZ IgG2a血清を 15.0倍以上の高レベルで誘導していた力 IgGlサブタイプは同レベルであった（図 5B)。これらの結果は、 MyD88遺伝子アジュバントは DNAワクチンにより起こる抗原特異的な体液性免疫反応を効果的に促進するとヽうことを示してヽる。

MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントにより変調される細胞性免疫反応

免疫されたマウス力も調製された脾細胞において、 IFN- γ及び IL-4の抗原特異的生産を調べた。 2回目の免疫の 2週間後、脾細胞を調製し、 H-2^d-制限 MHCクラス Iぺプチドでインビトロにおいて再刺激した。該細胞力も全 RNAを抽出し、逆転写反応に付し、次いで IFN- γの cDNAレベルをリアルタイム PCRにより定量した。コントロール群から得られた細胞と比較して、 pDX-LacZ-MyD88群から得られた脾細胞は 2.4倍以上、 pDX- LacZ- TRIF群から得られた脾細胞は 6.6倍以上の高レベルで IFN- γの mR NAを生産していた力一方で全ての群由来の細胞はクラス Iペプチド刺激に対する反応において IL-4を同程度の低レベルで生産していた（図 6A)。あるいは、脾細胞を rLacZ全タンパク質で刺激し、次いで CD4+及び CD8+ Tリンパ球からの IFN- γの生産を ICCS解析により調べた。 pDX- LacZ- MyD88及び pDX- LacZ- TRIFワクチン接種両方において、 CD4+及び CD8+ Tリンパ球による IFN- γ生産の誘導が認められた（図 6 B)。最後に、クラス I LacZペプチドでパルス刺激した P815 (H-2K^d)細胞を標的とした CTLアツセィを行なった。 pDX- LacZ- TRIFが最も強く CTL反応を誘発した（図 6C)。 p DX-LacZ-MyD88もまたコントロールプラスミドよりも CTL反応を強く誘導する能力があつた（図 6C)。これらの結果より、 MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントは DNAワクチンにより引き起こされる Th-1支配の抗原特異的細胞性免疫反応の規模を増大することが明らかとなった。

[0049] MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントの効果に関与する交差提示機構

これらの遺伝子アジュバントによる DNAワクチンの免疫原性の増強の基礎をなす機構を見極めるため、インビボでの抗原発現レベルを調べた。図 7Aに示すとおりに、これらのプラスミドを用いて imEPTを行なった後の筋肉内 LacZ発現レベルを調べた。 pD X- LacZ- MyD88及び pDX- LacZ- TRIFでは筋肉内 LacZタンパク質発現レベルがコントロールよりも有意に低ぐ遺伝子アジュバントカセットの挿入によりプラスミドのサイズが増すにつれてトランスフエクシヨン効率が低下することがわかる。従って、この結果は少なくとも、これらの遺伝子アジュバントが単に抗原の発現レベルを増大し、それによって抗原の交差提示を増大しているという可能性を排除するものである。

[0050] TRIF過剰発現によって誘発される細胞内での諸現象

MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントによって誘発される細胞内での諸現象を調べるため、 GFP発現プラスミド系列を構築し（図 4A)、 HEK293細胞中にトランスフエタトした。次いで、蛍光顕微鏡下で細胞の外観を調べた。興味深いことに、 pDX-GFP-TRI Fでトランスフエタトした細胞は断片化を起こし、トランスフエタト後 48時間以内に死滅するように見えた。 pDX-GFP-TRIFでトランスフエタトした細胞内で起こる現象を確認するために、ゲノム DNAを抽出し、 LM- PCR解析に付して DNAの断片化を検出した。図 7Cに示すとおり、 TRIFの過剰発現によりアポトーシスの典型的な特徴である DNA の断片化が誘導された。この機構もまた、 TRIF遺伝子アジュバントを組み込んだ DNA ワクチンによって起こる強い免疫原性に寄与しているものと考えられる。なお、蛍光顕微鏡観察は次のように行なった。すなわち、 250 ngの pGA- GFP, pDX- GFP- MyD88, 又は pDX- GFP- TRIFで HEK293細胞（4 X 10⁴個)をトランスフエタトした。トランスフエクト 48時間後、該細胞を蛍光顕微鏡で解析した。 3回の独立した実験を行なった。また、電気泳動は次のようにして行なった。すなわち、 250 ngの pGA- LacZ, pDX- LacZ- M yD88,又は pDX- LacZ- TRIFと共に又はこれらを含めずに HEK293細胞（4 X 10⁴個)をトランスフエタトした。トランスフエタト 48時間後、ゲノム DNAを回収し材料及び方法中に記載した通りに LM-PCRを行なった。反応の一定分量を 1%ァガロースゲルで泳動し臭化工チジゥム染色して確認した。 2回の独立した実験はを行なった。

[0051] MyD88又は TRIF遺伝子アジュバントを組み込んだ DNAワクチンによる免疫後の流入領域リンパ節 (lymph node; LN)細胞集団

近年の免疫学の概念的枠組みは、 APCは末梢で抗原を捕捉した後に流入領域 LN に入り、そこで続ヽて起こる獲得免疫反応におヽて重要な役割を果たしてヽるとヽぅことを明らかにしている。従って、鼠径部 LNの単一細胞懸濁液を 2回目の免疫の 3日後に調製し、表面マーカー染色後、異なる細胞型数を FACS解析により見積もった。休止中の LNと比較して、 CDl lc+榭状細胞数は、いずれのプラスミドで imEPT処理を行なっても処理後 72時間以内に増加していた（図 8A)。興味あることに、 pDX-GFP- MyD及び pDX- GFP-TRIFで imEPT処理すると、コントロールプラスミドと比較して CD4 0+細胞数が増加しており、このことより流入領域 LNにお、て MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントは CD40+成熟 Bリンパ球及び CD40+活性ィ匕 Tリンパ球の数を増加させることがわかった（図 8A)。

[0052] MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントを組み込んだ DNAワクチンによる免疫後の流入領域 LNにおけるサイト力イン、ケモカイン、 IFN、及び細胞表面分子の変調

2回目の免疫の 24時間後及び 72時間後に鼠径部 LNを取り出し、サイト力イン、ケモ力イン、 IFN、及び細胞表面分子の mRNA発現レベルをリアルタイム PCRを用いて定量した。 IFN- γ , IL- 12 p40,及び IL- 18のような Thlサイト力インのレベルは、 pDX- GF P-MyD88又は pDX- GFP-TRIFでの免疫 72時間後ではコントロールに比べ顕著に上方制御されていた。 IL-4及び IL-6のような Th2サイト力インも両方の群において免疫 7 2時間後で上方制御されていた。興味深いことに、 IL- 6の mRNAは pDX- GFP- TRIF群と比較すると pDX- GFP-MyD88群の方が顕著に増加して!/、た。 IFN- β及び TNF- a のような APCの機能を調節する因子、 IP-10及び JE/MCP-1のようなケモカイン、並びに MHCクラス II, CD40, CD80,及び CD86のような APCの機能に関連する要素もまた、コントロール群と比べて pDX- GFP- MyD88及び pDX- GFP- TRIF群の両方にお!、て免疫 72時間後で上方制御されて、た（図 8B)。

[0053] MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントのインフルエンザ DNAワクチンへの適用

MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントのインフルエンザ DNAワクチンへの実用化を検討するため、 HA抗原を標的とする一連のワクチンを構築した（図 4A)。 pGA-GFP( コントロールベクター）、 CMV9- HA, CMV9-HA-MyD88,又は CMV9- TRIFでマウスを 2回ワクチン接種し、次いで LD の 4倍又は 20倍量のインフルエンザウイルス A/PR/

50

8/34を鼻内接種した。図 9Aに示すとおり、 CMV9-GFP, CMV9-HA,及び CMV9-HA -MyD88でワクチン接種したマウスにおいては重篤なレベルの体重低下が観察された。 CMV9-HA-TRIFでワクチン接種されたマウスでは、 LD の 20倍量のインフルェン

50

ザを接種した後であっても体重低下は中度レベルであった。最後に、 CMV9-HA-My D88でワクチン接種した場合は、コントロールプラスミド CMV9-HA (生存率 40%)と比較した際に 4 LD 量のウィルス接種に対して中度レベルの防御効果 (生存率 60%)が見

50

られた。 CMV9-HA-TRIFでワクチン接種した場合は、致死レベル（4 LD 量）のイン

50 フルェンザウィルス感染に対し完全な防御効果が認められた。これらのマウスをその 5倍量（20 LD50)のウィルスで接種した場合であっても、コントロール群では生存は 20 %以下であつたが、 CMV9-HA-TRIFでワクチン接種したマウスでは 70%が生存した。

Claims

請求の範囲

[1] 抗原遺伝子と、 Toll様受容体のアダプター分子の遺伝子を含み、細胞内で前記抗原遺伝子及び前記アダプター分子遺伝子を発現することができる組換えベクターから成る、前記抗原に対する免疫を付与するための遺伝子ワクチン。

[2] 前記アダプター分子が、 MyD88、 TRIF、 TIRAP、 TRAM, IRAKI、 IRAK4, TRAF6、

RIP1、 IKK-i, TBKl及び RIG-I並びにこれらの天然のアダプター分子のアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有し、遺伝子ワクチン内にコードされる前記抗原と共に細胞内で発現された際に該ワクチンのアジュバント効果を発揮する変異型のアダプター分子力も成る群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 1記載の遺伝子ワクチン。

[3] 前記アダプター分子が、 MyD88、 TRIF、 TIRAP、 TRAM, IRAKI、 IRAK4, TRAF6、

RIP1、 IKK-ΰ TBKl及び RIG-Iから成る群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 2 記載の遺伝子ワクチン。

[4] 前記アダプター分子が、 MyD88及び Z若しくは TRIF又はその前記変異型である請求項 2記載の遺伝子ワクチン。

[5] 前記アダプター分子が、 MyD88及び Z又は TRIFである請求項 4記載の遺伝子ワクチン。

[6] 前記抗原遺伝子は、該抗原遺伝子の転写を制御するプロモーターの下流に位置し、前記アダプター分子遺伝子は、該アダプター分子遺伝子の転写を制御する、前記抗原遺伝子のプロモーターとは異なるプロモーターの下流に位置する請求項 1な V、し 5の、ずれか 1項に記載の遺伝子ワクチン。

[7] 前記抗原遺伝子のプロモーターと、前記アダプター分子遺伝子のプロモーターが同一種類のプロモーターである請求項 6記載の遺伝子ワクチン。

[8] 前記ベクターがプラスミドベクターである請求項 1ないし 7のいずれ力 1項に記載の遺伝子ワクチン。