WO2007023725A1 - 遺伝子ワクチン - Google Patents

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WO2007023725A1
WO2007023725A1 PCT/JP2006/316156 JP2006316156W WO2007023725A1 WO 2007023725 A1 WO2007023725 A1 WO 2007023725A1 JP 2006316156 W JP2006316156 W JP 2006316156W WO 2007023725 A1 WO2007023725 A1 WO 2007023725A1
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WO
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antigen
trif
myd88
vaccine
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PCT/JP2006/316156
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Fumihiko Takeshita
Shin Sasaki
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Yokohama City University
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    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides

Definitions

  • the present invention relates to a gene chain capable of strongly inducing an immune response to a desired antigen.
  • vaccines have been widely used to confer immunity against various infectious diseases.
  • Conventionally used vaccines include live attenuated vaccines, inactivated biological vaccines, inactivated vaginal toxin vaccines, and the like.
  • these vaccines cannot be administered to immunocompromised patients.
  • it is difficult to develop inactivated vaccines or attenuated vaccines against these pathogens, which are difficult to culture in vitro.
  • the cells contain substances that cause harmful side effects, such as endotoxins, which can lead to the risk of side effects.
  • Non-patent Document 1 A gene vaccine is a recombinant vector containing the antigen gene of the pathogen that you want to confer immunity, and when this is administered to humans, the antigen is continuously produced in human cells and antibody production against the antigen is induced. And immunity against the pathogen is conferred.
  • the antigen gene if the antigen gene is incorporated into a vector, the antigen is produced in the cell, so that a vaccine against a pathogen that cannot be cultured in vitro can be produced.
  • non-toxic pathogen antigens can be used alone, they can be administered to immunocompromised patients who are not at risk of side effects.
  • gene vaccines generally have a problem that immune responses to pathogen antigens are weak and it is difficult to impart strong immunity to pathogens.
  • an adjuvant a substance that enhances the immune response.
  • Administering adjuvants such as Freund's adjuvant prepared from bacteria Is widely practiced.
  • Known adjuvants include lipopolysaccharide (LPS) derived from pathogenic bacteria, derivatives thereof, and toxins such as tetanus toxoid.
  • LPS lipopolysaccharide
  • a Winores vector When a Winores vector is used as a vector for a genetic vaccine, an immune response occurs against a virus-derived part, so that the virus part functions as an adjuvant.
  • the adjuvant effect on the virus part also has a problem that the effect is not sustained by allergic reaction.
  • plasmid vectors As a vector for gene vaccines, there is no toxic 'dangerous' risk due to viruses. It is also well known to use plasmid vectors. When using plasmid vectors, the viral portion is the same as when using viral vectors. Since the adjuvant effect cannot be obtained, the immunity-imparting effect is further reduced.
  • Non-Patent Document 1 Tang D. et al., Nature 356, 152-154, 1992
  • Non-Patent Document 2 Kenji Okuda et al., Methods in Molecular Medicine, 1999, vol.29, pp. 197-204
  • Non-Patent Document 3 Hildegund C. et al., Methods in Molecular Medicine, 1999, vol.29, pp.251-260
  • an object of the present invention is to provide a novel gene vaccine having a greater immunization effect than conventional gene vaccines.
  • the inventors of the present application incorporated a gene for a Toll-like receptor adapter molecule into a gene vaccine and produced the adapter molecule together with the target antigen in the cell. As a result, it was found that the adapter molecule functions as an adjuvant and the immunity-imparting ability of the gene vaccine is improved, and the present invention has been completed.
  • the present invention comprises an antigen gene and a ToU-like receptor adapter molecule gene, and comprising the recombinant vector capable of expressing the antigen gene and the adapter molecule gene in a cell.
  • a genetic vaccine for conferring immunity against is provided.
  • a gene vaccine having a higher immunization effect than conventional gene vaccines is provided.
  • an adapter molecule of a Toll-like receptor is produced in the same cell together with an antigen molecule to be immunized, and the adapter molecule exerts an adjuvant effect and acts against an antigen.
  • the immune response is enhanced, and the immunity-imparting effect against pathogens containing the antigen is enhanced.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for explaining a method for constructing a gene vaccine of the present invention.
  • FIG. 2 is a genetic map of the pGA vector used for constructing the genetic vaccine of the present invention.
  • FIG. 3 shows the results of determining the characteristics of TLR adapters as activators of NF-kB and IFN- ⁇ promoters.
  • FIG. 4A shows the structure of a DNA vaccine with or without MyD88 or TRIF gene adjuvant.
  • Single antigen only pGA-LacZ, pGA-GFP, and CMV9-HA
  • both antigen and adjuvant molecules pDX-LacZ-MyD88, pDX-GFP-MyD88, CMV9-HA-MyD88, pDX-LacZ-TRIF , pDX-GFP-TRIF, and CMV9-HA-TRIF.
  • FIG. 4B is a diagram showing LacZ activity and firefly luciferase activity of cells co-transformed with a vector containing a luciferase gene and the DNA vaccine of the present invention or a DNA vaccine for comparison.
  • FIG. 5 is a graph showing promotion of a humoral immune response by MyD88 gene adjuvant.
  • mice 5 individuals, Z group
  • mice were immunized with pGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, or pDX-LacZ-TRIF by imEPT.
  • Blood samples were collected at 4 and 6 weeks, and the titers of A) anti-LacZ IgG serum, B) Ig Gl ( ⁇ ), and IgG2a (country) were examined by ELISA.
  • Bb p ⁇ 0.05; Aa, p ⁇ 0.01.
  • FIG. 6A is a graph showing promotion of cellular immune response by MyD88 and TRIF gene adjuvant. Mice were immunized as described in the legend to FIG. A) Spleen cells were prepared from individual mice and stimulated in vitro with 1 ⁇ g / ml of class I (H-2 d ) peptide (country) or class I (H-2 b ) peptide (mouth) for 24 hours. did. mRNA extraction and reverse transcription were performed as described in Materials and Methods. IFN- ⁇ , IL-4, and 18S rRNA levels were examined for aliquots of the reaction. IFN- ⁇ and IL-4 mRNA expression levels were normalized to 18S rRNA levels and described as relative mRNA expression levels. The graph shows the average valuator SD. a and c, p 0.05; b, p 0.01.
  • FIG. 6B is a diagram showing an analysis result by FACS.
  • Spleen cells were prepared and stimulated in vitro with 12 g / ml rLacZ for 22 hours. Subsequently, 1 ⁇ g / ml GolgiPlug was added, and the cells were further cultured for 2 hours. After fixation, the cells were stained with PE fusion anti-CD4 or CD8 antibody and FITC fusion anti-IFN- ⁇ antibody, washed and analyzed by FACS. Cells are initially sieved to lymphocytes and then to CD4 or CD8 positive cells. The frequency is the percentage of IFN- ⁇ + CD4 + or CD8 + cells relative to total CD4 + or CD8 + cells, respectively.
  • FIG. 6C CTL lines (effector cells) were prepared as described in Materials and Methods. MHC haplotype fit (H- 2 ⁇ ⁇ ) ⁇ 815 cells 1 mu g / ml of class I (H- 2 d) peptide (land) Alternatively, it was stimulated with a class I (H-2 b ) peptide (mouth) for 1 hour and used as a target cell. The effector cells and target cells were mixed at a ratio of 6, 12.5, 25, and 50 (E / T ratio), cultured for 4 hours, and then LDH activity of the culture supernatant was quantified. The graph shows the average worker SD of was calculated as the mounting serial in Materials and Methods 0/0-specific lysis. c and f, p 0.01; b and e, p ⁇ 0.001; a, d, and g, p ⁇ 0.0001.
  • FIG. 8A shows activation of cells present in the inflow region LN after imEPT with MyD88 and TRIF gene adjuvant.
  • 72 hours after the second immunization with 50 ⁇ g of pGA-GFP, pDX-GFP-MyD88, or pGA-GFP-TRIF by imEPT the inflow region LN (inguinal region LN) was taken out and homogenized. Single cell suspensions of LN were surface stained with PE-fused anti-CD 11c or CD40 antibody, washed and then analyzed by FACS. The frequency is the percentage of CDl lc + or CD40 + cells to total cells. Shows the mean value SD value of the sample adjusted from 10 independent LNs.
  • FIG. 8B is a diagram showing the expression levels of various site force-ins and the like in cells present in the inflow region LN after imEPT with MyD88 and TRIF gene adjuvant.
  • the expression levels of class IV, CD40, CD80, and CD86 were analyzed by real-time PCR.
  • the graph shows the mean value SD value of 10 independent LN force adjusted samples.
  • the vertical axis shows the relative mRNA expression level with the untreated group as 1.
  • FIG. 9A shows that influenza DNA clones incorporating MyD88 or TRIF gene adjuvants effectively protect mice against infectivity of lethal doses of influenza virus.
  • mice 10 individuals in Z group
  • mice were immunized with 2 g of pGA-GFP, CMV9-HA, CMV9-HA-MyD88, or CMV9-HA-TRIF by imEPT.
  • the mice received 4 or 20 LD of influenza virus A / PR / 8 /
  • FIG. 9B is a diagram showing the results of monitoring the survival rate for 12 days after FIG. 9A.
  • ⁇ pGA- GFP; ⁇ , CMV9-HA; ⁇ , CMV9- HA- MyD88; ⁇ , CMV9- HA- TRIF
  • gene means a nucleic acid encoding a polypeptide, and is not necessarily limited to a natural gene transmitted to a parent cocoon, and may be a synthesized nucleic acid or the like. Good. As a nucleic acid, stable point DNA is preferable.
  • the gene vaccine of the present invention contains a gene for an adapter molecule of a Toll-like receptor (TolHike receptor, hereinafter referred to as "TLR" t), which is a feature of the gene clone of the present invention. It is. TLRs play an important role in sensing pathogens such as microorganisms and viruses and inducing an initial immune response against invading pathogens. The ability of the TLR gene to be homologous to the Drosophila Toll gene is also called a Toll-like receptor.
  • Toll-like receptor Toll-like receptor
  • TLR recognizes highly conserved structural motifs expressed by pathogens, such as flagellin (a protein that makes up bacterial flagella), bacterial DNA, double-stranded viral RNA And cell wall constituent factors such as LPS, peptide darican, and lipopeptide. About 11 TLRs are known in humans and mice.
  • TLR adapter molecules are proteins involved in signal transduction in the cascade from TLR activation to NF- ⁇ B activity or type I IFN production induction Various types are known.
  • the inventors of the present application have introduced a gene encoding this TLR adapter molecule into a gene vaccine and expressed it in the same cell together with the antigen of interest, whereby an adjuvant effect is exhibited and an immunization effect is enhanced. The knowledge has been obtained and the present invention has been achieved.
  • the TLR adapter molecule may be a known! /, Misaligned TLR !, or misaligned adapter molecule.
  • preferred adapter molecules include MyD88, TRIF (also called TICAM1), TIRAP, and TRAM. , IRAKI, IRAK4, TRAF6, RIP1, IKK-i, TBK1 and RIG-1. Of these, MyD88 and TRIF are particularly preferred.
  • These adapter molecules themselves are well known, and the base sequence of the gene and the amino acid sequence encoded by the gene are also known. For example, the nucleotide sequence of MyD88 gene and the amino acid sequence encoded by it are described in GenBank Accession No. NM-002468.
  • the TRIF / TICAM1 sequence is GenBank Accession No. (the same applies below) AB093555, TIRAP is AF406652, TRAM is AY232653, IRAKI is L76191, IRAK4 is AY283670, TRAF6 is U78798, RIP1 is NM_003804, IKK-i is AB016590 TBK1 is described in AF191838 and RIG-1 is described in AY180973 (all the adapter molecules described in the above GenBank Accession No. are derived from humans).
  • the sequence of human MyD88 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the sequence of human TRIF is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • the base sequences of these adapter molecule genes are known, for example, they should be prepared by a conventional method such as reverse transcription PCR using RNA extracted from mosquitoes such as human macrophages expressing TLR. It is also possible to prepare a commercially available human spleen cDNA library in a saddle type by a conventional method such as PCR (see Examples below).
  • adapter genes such as MyD88 and TRIF that are preferably used in the present invention are commercially available, commercially available products can also be used.
  • adapter molecules described above are known to have natural mutants. In that case, mutant genes of the natural adapter molecules can also be used.
  • a polypeptide having physiological activity has a physiological activity even when a small number of amino acids constituting the amino acid sequence are substituted or deleted, or a small number of amino acids are inserted or added. Is well known to be maintained. Therefore, above It has a homology of 70% or more with the amino acid sequence of the natural adapter molecule, and exhibits a vaccine adjuvant effect when expressed in cells together with the antigen encoded in the gene vaccine.
  • Adapter molecules can also be used in the present invention.
  • the homology of the amino acid sequence of such a mutant adapter molecule with respect to the natural amino acid sequence is preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
  • the homology between the two amino acid sequences is that the sequences are aligned so that the number of matching amino acids is the largest, and the number of matching amino acids is the total number of amino acids (the total number of amino acids).
  • the number divided by the shorter amino acid number is expressed as a percentage, and can be easily calculated by known software such as BLAST.
  • the length of the mutated adapter molecule is different from the natural type, the length is preferably 70% or more of the natural type, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more.
  • the amino acid sequence of the mutant adapter molecule is the amino acid sequence of the natural adapter molecule in which one to several amino acids are substituted and Z or deleted, and Z or one to several. More preferably, the amino acid is inserted and Z or added.
  • an amino acid substituted physiological activity is often maintained even if the amino acid is substituted with an amino acid having a similar property.
  • substitution an amino acid substituted with an amino acid having a similar property is preferable.
  • the 20 types of amino acids that make up natural proteins are neutral amino acids with low polarity side chains (Gly, He, Val, Leu, Ala, Met, Pro) and neutral amino acids with hydrophilic side chains (Asn , Gin, Thr, Ser, Tyr Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp)
  • substitution between these groups does not change the properties of the polypeptide.
  • the gene vaccine of the present invention is characterized in that the gene of the adapter molecule described above is incorporated, and the other parts may be similar to the known gene vaccines in conventional strength.
  • the antigen gene to be incorporated into the gene vaccine is not particularly limited as long as it is an antigen possessed by a pathogen to which immunity is to be conferred and can be prevented or alleviated by an antibody against the antigen. Used for known gene vaccines Thus, the antigen gene can also be used as a deviation.
  • antigen genes that can be used in the present invention include hemagglutinin (HA) and nuclear protein (NP) of influenza virus, AIDS virus coat protein (gag, pol, env), and Pseudomonas aeruginosa
  • HA hemagglutinin
  • NP nuclear protein
  • the ability to exemplify known genes such as components (OprF / I, PilA, PcrV, FliC) and the like is not limited to these.
  • the gene vaccine of the present invention is obtained by incorporating the antigen gene and adapter molecule gene into a vector for mammalian cells.
  • Mammalian cell vectors themselves are well known in this field and are also commercially available, and known vectors and commercially available products can be used as they are.
  • PcDNA3.1 (+) catalog No. V790-20
  • pcDNA3.1 —Xcatalog No. V795-20
  • these mammalian cell vectors have a replication origin that allows replication in mammalian cells, a promoter region that enables expression of foreign genes, and a multiplicity for inserting foreign genes. It has a clawing site.
  • the vector may be a virus-derived vector used as a vector for mammalian cells such as retroviruses and adenoviruses.
  • the gene vaccine of the present invention can be obtained by incorporating the antigen gene and the adapter molecule gene into a vector for mammalian cells, and the antigen gene is a promoter that controls transcription of the antigen gene. It is preferable that the adapter molecule gene is located downstream and is located downstream of a promoter different from the promoter of the antigen gene that controls transcription of the adapter molecule gene. That is, the antigen gene and the adapter gene are preferably controlled by different promoters. However, in order to ensure that both antigen and adapter molecule are produced in the same cell, it is preferable to use the same type of promoter as each promoter, but different types of promoters may be used. .
  • an antigen gene or an adapter molecule gene is inserted into the multicloning region of a vector for mammalian cells, and then downstream of the terminator region (polyA etc.) of the multicloning site.
  • the restriction enzyme site located in is cleaved, and the promoter + adapter molecule gene (the adapter gene is inserted first) at this cut site.
  • it can be constructed by inserting a cassette sequence of (antigen gene) + terminator.
  • a cassette of antigen (or adapter molecule gene) + terminator is inserted into the multicloning site of the vector for mammalian cells, and a cassette of promoter + adapter molecule (or antigen gene) is downstream of the terminator. It is possible to build even if it is possible to insert.
  • the antigen genes and adapter genes incorporated into the gene vaccine are not necessarily limited to one, but two or more different antigen genes or two or more different adapter molecule genes may be incorporated. However, if the number of genes is too large, the size of the gene vaccine becomes too large and it becomes difficult to enter the cells, so the total number of antigen genes and adapter molecule genes is preferably 4 or less. Thus, even when multiple antigen gene adapter molecule genes are incorporated, a desired gene vaccine can be obtained by inserting a cassette of promoter + antigen (adapter molecule) gene + terminator into the restriction enzyme site in the vector. Can be built.
  • the gene vaccine itself can be administered to a mammal by a well-known method.
  • the cell can be preferably administered by parenteral administration such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intravenous administration and the like.
  • a gene vaccine suspended in a buffer solution such as a phosphate buffer (PBS) can be administered.
  • PBS phosphate buffer
  • the strength of the electric field is not particularly limited, but is usually 10V / cn! ⁇ 60V / cm, preferably 25V / cm ⁇ 35V / cm
  • pulse duration is usually 20ms ⁇ 100ms, preferably 40ms ⁇ 60ms
  • pulse is usually 1 to 6 times, preferably 2 to 4 times.
  • Intradermal administration can be performed by a known method using a commercially available gene gun. That is, the gene vaccine can be administered by immobilizing onto a gold particle and driving the gold particle into the skin of the animal's body with a gene gun together with an adhesive such as polyvinylpyrrolidone. Dosage can be appropriately selected depending on the antigen such as the type usually per body weight lkg, 1 ⁇ ⁇ ⁇ 1000 g about by weight of the gene vaccine, good Mashiku about 100 ⁇ g ⁇ 200 ⁇ g It is.
  • the gene vaccine of the present invention is administered.
  • an immune response to the antigen occurs more strongly, and immunity against a pathogen having the antigen can be imparted more strongly. That is, the production of specific antibodies to the antigen is further increased (increase in humoral immune response), the production of cytodynamic ins such as interferon is increased, and the CTL (cytotoxic T cell) activation reaction is stronger. Be guided.
  • the cDNA fragment encoding the antigen and the TLR adapter molecule was also amplified by PCR with the parent plasmid force, and incorporated into the gene vaccine by the method described later.
  • FLAG-tagged expression vectors CMV4—MyD88, CMV4-TRIF, CMV4-TIRAP, CMV4—TOLLIP, CMV4-IRA K1, and CMV4-TRAF6 are known methods (Eur J Immunol, vol. 35, 2477-2485, 2005 ).
  • LacZ or EGFP cDNA was amplified from pSV- ⁇ -galatatosidase (Promega, Madison, Wis.) Or pEGFP-Nl (BD Biosciences, San Jose, Calif.), Respectively.
  • Influenza virus A / PR / 8/34 strain (H1N1 type) HA (amino acids 18-866, SEQ ID NOs: 5, 6) is from pJW4303 / Hl (J Virol, vol. 76, 6652-6659, 2002) Amplified and introduced into the PFLAG-CMV9 vector (Sigma, St Louis, MO). The sequence of the cloned PCR product was confirmed using ABI PRISM Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.).
  • the gene vaccines of the present invention were constructed as follows (Fig. 1).
  • the receptor plasmid shown in FIG. 1 is based on a known pGA vector (Ross et al., Nat. Immunol. 1, 127-131 (2000) or a commercially available pFLAG CMV9 vector (manufactured by Sigma)).
  • the genetic map of pGA is shown in Figure 2.
  • the pGA vector is a cytomegalovirus (CMV) immediate media for initiating transcription of inserted genes from eukaryotic organisms.
  • CMV cytomegalovirus
  • pFLAG CMV9 vector (manufactured by Sigma) also has a structure similar to that of the pGA vector (but has an ampicillin resistance gene, not a kanamycin resistance gene).
  • the LacZ gene is inserted into the Hindm-X hoi site of the pGA vector, the GFP gene is inserted into the BamHI-Avrll site of the pGA vector, and the HA gene is inserted into the Notl-BamHI site of the pFLAG C MV9 vector (Sigma).
  • the receptor plasmids shown were constructed ("pGA recipient LacZ”, "pGA recipient GFP”, and "pFLAG CM V9 recipient HA”, respectively).
  • the inserted LacZ gene, GFP gene, and HA gene were prepared as follows.
  • the LacZ gene was prepared by amplifying the LacZ gene contained in commercially available pSV-j8-galactosidase (Promega, Madison, Wis.) By PCR.
  • One set of primers used for PCR was 5 -GGG AAG CTT ACC ATG TCG TTT ACT TTG ACC AAC AAG—3 ′ and 5 GGG CTC GAG TTA TTT TTG ACA CCA GAC CAA CTG G—3 ′.
  • the GFP gene was prepared by amplifying the GFP gene contained in commercially available pEGFP-Nl (BD Biosciences, San Jose, Calif.) By PCR.
  • the primer sets used for PCR were 5-CCC GGA TCC ACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG C—3 ′ and 5′—T CCT AGG TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3 ′.
  • the region encoding amino acids 18 to 566 of the HA gene (SEQ ID NOs: 5 and 6) contained in the known pJW4303 / Hl vector (J Virol, vol. 76, 6652-6659, 2002) It was prepared by amplification.
  • the primer set used for PCR was 5′-AGC TGC GGC CGC AGA CAC AAT ATG TAT AGG—3 ′ and CGG GAT CCT CAG ATG CAT ATT CTG CAC TG C-3 ′.
  • the donor plasmid shown in FIG. 1 is based on the above-described pGA vector or pBluescript SK (+) vector (commercially available cloning vector available from Stratagene).
  • the donor plasmid of Fig. 1 was constructed by inserting the MyD88 gene or TRIF gene into the Hindlll-EcoRI site of the pGA vector ("pGA donor MyD8 8 " and "pGA donor T RIF") (LacZ or GFP-containing gene vaccine preparation) for).
  • the resulting donor plasmid pGA do nor MyD88 and pGA donor TRIF, et al.
  • MyD88 5 -GGA ATT CAC CAT GGC TGC AGG AGG TCC C GG-3 'and 5' -CCC AAG CTT CAG GGC AGG GAC AAG GCC TTG-3 '
  • TRIF 5'- G GA ATT CAC CAT GGC CTG CAC AGG CCC ATC—3 'and 5 CCC AAG CTT CAT TCT GCC TCC TGC GTC TTG-3'
  • CMV promoter—IntronA-MyD88 and TRIF cDNA-polyA fragments were excised using pGA donor MyD88 and pGA donor TRIF force Notl, respectively, and inserted into the Notl site of pGA recipient Lac Z or pGA recipient GFP, respectively.
  • -LacZ-MyD88, pDX-GFP-MyD88, pDX-LacZ-TRIF and pDX-GFP-TRIF were prepared, respectively.
  • Transient transfections were performed using FuGene 6 (Roche Diagnostics, Indian apolis, IN) according to the manufacturer's protocol.
  • HEK293 cells (3 X 10 4 ) were added to each expression plasmid (CMV4, CMV4-MyD88, CMV4- TRIF, CMV4- TIRAP, CMV4- TOLLI P, CMV4-IRAK1, CMV4- TRAF6, pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88 PDX-LacZ-TRIF, 200 ng), reporter plasmid (p5xNF- ⁇ B-luc or pGL3 hlFN ⁇ , 25 ng), and control luciferase plasmid (pTK-RL, 25 ng, Promega, Co-transferred in Madison, Wisconsin.
  • luciferase activity was measured using the Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) according to the manufacturer's protocol. Or j8-Gal Reporter Gen LacZ activity was measured using e Assay kit (Roche Diagnostics). Finally, the firefly luciferase or LacZ activity of individual cell lysates was normalized to the Renilla luciferase activity.
  • mice Eight-week-old female BALB / c mice were purchased from SLC (Shizuoka Prefecture) and bred at an animal facility in a specific pathogen-free environment. After anesthesia with a ketamine Z xylazine mixture, the quadriceps muscles of the mice (group of 8 animals) were pGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, pDX-LacZ-TRIF, pGA-GFP, pDX-GFP-MyD88 , pDX- GFP- TRIF, CMV9- HA, CMV9- HA- MyD88, or CMV9- HA-of TRIF, plasmid solution containing Zureka (1 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 saline, 50 ⁇ 1 / muscle) injection did.
  • the injection site was electrified with an electric field strength of 30 V / cm—constant, 50 ms ⁇ 3 pulses.
  • the second immunization was performed 4 weeks after the first immunization. All animal experiments were approved by the institutional animal care 'welfare committee, and the mice were handled according to NIH Animal Care Guidelines.
  • Serum antibody titers were measured by ELISA as previously described. Immune plates (Nalge Nunc International, Rochester, NY) were coated with anti-LacZ antibody (rLacZ, (TOYOBO)) dissolved in 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.0) at 1 / z g / ml. The plate was blocked with PBST + 1% BSA, and a reduced dilution of serum collected from the immunized mouse force was placed on the plate and the plate was incubated at 37 ° C for 2 hours. React the bound IgG with HRP-labeled anti-mouse IgG, IgGl, or IgG2a antibody (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Alan.) And then act as a substrate in citrate buffer and H0
  • Reacted with 2-2-azino-bis Reacted with 2-2-azino-bis.
  • Relative antibody concentrations were obtained by a colorimetric assay based on a high titer and comparison with a calibration curve prepared using antiserum.
  • Spleen cells were collected 2 weeks after the last immunization. The cells were incubated with 12 / z g / ml rLacZ (Sigma) at 37 ° C for 24 hours, and 1 ⁇ g / ml GolgiPlug (BD Biosciences) was added 2 hours before the end of the incubation. Staining buffer (3% FCS and 0.1% NaN)
  • Spleen cells were collected 2 weeks after the last immunization. The cells were incubated with 1 ⁇ g / ml H-2 d -restricted Lac Z class I peptide (TPHPARIGL) for 24 hours at 37 ° C. Alternatively, inguinal LN cells were collected 24 or 72 hours after the last immunization. These cells were then lysed in 800 1 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) and total RNA was isolated. Reverse transcription: 25 ng / ml oligo (dT), 200 U Superscript III reverse transcription
  • first strand buffer 50 mM Tris-HCl; pH 7.5, 75 mM KC1, and 2.5 mM MgCl 2
  • enzyme Invitrogen
  • 2 mM dNTP 2 mM dNTP
  • 10 mM DTT 10 U ribonuclease inhibitor
  • Real-time PCR was performed using IFN- ⁇ , IL-12 p40, IL-18, IL-4, IL-6, IFN- ⁇ , TNF-a, IP—10, JE / MCP—1, MHC class I (Dl), MHC class II (Ea), CD40, CD80, CD86, or 18S rRNA specific TaqMan probes (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) And ABI PRISM 7700 sequence detection system (Applied Biosystems) were used.
  • CTL isolates (effector cells) were prepared after incubation with peptides and 20 U / ml IL-2 (Sigma) for 4 days at 37 ° C.
  • target cells P815 cells pulse-stimulated with 1 mg / ml H-2 b -restricted LacZ class I peptide (DAPIYTNV, control peptide) or H-2 d -restricted LacZ class I peptide were used.
  • the target cells (1 ⁇ 10 4 cells) were cultured with the proliferated effector cells for 4 hours.
  • the amount of LDH that also released the target cell force was measured using a Cytotox 96 (Promega) system and% specific cell lysis was calculated according to the manufacturer's protocol.
  • Intramuscular electoroporation 50 ⁇ g of pGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, or pDX-LacZ-TRIF is administered to BLAB / c mice (3 mice / group) did.
  • the injected muscles (6 muscles / group) were removed, homogenized in cell lysis reagent (Roche Diagnostics), and freeze-thawed 3 times. After centrifugation, the supernatant was collected and the LacZ activity or protein concentration was measured using
  • the LacZ activity of individual cell lysates was then normalized to the protein concentration.
  • 293T cells were transiently transfected with either pGA-GFP, pDX-GFP-MyD88, or pDX-GFP-TRIF.
  • genomic DNA was extracted from the cells using the Nuclepspin kit (Macherey-Nagel, Easton, Pa.) According to the manufacturer's instructions. 1 ⁇ g from each sample DNA was subjected to ligation-mediated PCR using ApoAlert LM-PCR kit (BD Biosciences). That is, 12 and 24 nucleotide adapters were ligated to the ends of the genomic DNA for 12 hours at 16 ° C. using T4 DNA ligase. Subsequently, PCR was performed for 24 cycles using 12 nucleotides and 24 nucleotides as primers. PCR products were separated on a 1.5% agarose gel, stained with bromide, and confirmed under UV light.
  • Virus A / PR / 8/34 was inoculated into the nose of mice. Thereafter, the body weight and mortality of the inoculated mice were observed for 10 days.
  • TLR adapter molecules including MyD 88, TRIF, TIRAP, TOLLIP, IRAKI, and TRAF6 in NF- ⁇ and IFN in HEK293 cells.
  • TLR adapter molecules including MyD 88, TRIF, TIRAP, TOLLIP, IRAKI, and TRAF6 in NF- ⁇ and IFN in HEK293 cells.
  • NF- ⁇ is a major transcription factor that regulates the expression of genes involved in innate immune activation such as cytoforce-ins, chemokines, and co-occurrence stimulating molecules.
  • Type I IFNs including both IFN-a and IFN-18, are essential for antigen presentation as well as innate immunity.
  • MyD88 was the strongest inducer of NF- ⁇ activation among the TLR adapter molecules, while TRIF was able to activate the IFN-8
  • MyD88 or TRIF is introduced into the same antigen presenting cell (APC) together with the antigen (direct priming), and in these cells These molecules were able to perform an effective antigen presentation action.
  • APC antigen presenting cell
  • the double expression plasmid shown in Figure 4A was constructed. Subsequently, the antigen expression ability and endogenous cell activation ability of these constructs were examined.
  • HEK293T cells were transfected with pGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, or pDX-LacZ-TRIF, the level of LacZ activity in the cell lysate was similar (FIG. 4B).
  • NF- ⁇ -dependent luciferase activity is more than 7.8 times greater when tranfected with pDX-LacZ-MyD88 than when tranfected with control plasmid (pGA-LacZ). It was increasing. When transferred with pDX-LacZ-TRIF, the IFN-j8 promoter-dependent luciferase activity increased more than 11.7 times that of the control plasmid. Thus, these data indicate that MyD88 and TRIF gene adjuvants retain the function of acting as endogenous cell activity factors without modulating the expression level of the antigen (LacZ) when incorporated into a vaccine plasmid vector. Show that! / Speak.
  • mice were injected with pGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, or pDX-LacZ-TRIF by intramuscular electoroporation (imEPT). Administered. After the first immunization (4 weeks), these plasmid DNA vaccines induced anti-LacZ IgG at similar low levels ( Figure 5A).
  • pDX-LacZ-MyD88 induced anti-LacZ IgG serum at a level 7.4 times higher than the control plasmid (pGA-LacZ)!
  • pDX-LacZ-TRIF induced anti-LacZ IgG serum production at the same level as the control plasmid (Fig. 5A).
  • IgG subtype levels were also examined.
  • pDX-LacZ-MyD88 had the same level of IgGl subtype that induced anti-LacZ IgG2a serum at a level higher than 15.0 times compared to the control plasmid (Fig. 5B).
  • Antigen-specific production of IFN- ⁇ and IL-4 was examined in splenocytes prepared with immunized mouse force. Two weeks after the second immunization, splenocytes were prepared and restimulated in vitro with H-2 d -restricted MHC class I peptides. The cellular force was also extracted from total RNA, subjected to reverse transcription, and then the IFN- ⁇ cDNA level was quantified by real-time PCR. Compared with cells obtained from the control group, splenocytes obtained from the pDX-LacZ-MyD88 group were 2.4 times higher and splenocytes obtained from the pDX-LacZ-TRIF group were higher than 6.6 times.
  • pDX-LacZ-TRIF most strongly induced a CTL response (Fig. 6C).
  • p DX-LacZ-MyD88 was also more capable of inducing a CTL response than the control plasmid ( Figure 6C).
  • a GFP expression plasmid line was constructed (Fig. 4A) and tranfected into HEK293 cells. Next, the appearance of the cells was examined under a fluorescence microscope. Interestingly, cells transfected with pDX-GFP-TRI F appeared to fragment and appeared to die within 48 hours after the transfate. In order to confirm the phenomenon that occurred in cells transfected with pDX-GFP-TRIF, genomic DNA was extracted and subjected to LM-PCR analysis to detect DNA fragmentation. As shown in Figure 7C, overexpression of TRIF induced DNA fragmentation, a typical feature of apoptosis.
  • This mechanism may also contribute to the strong immunogenicity caused by DNA vaccines incorporating TRIF gene adjuvants.
  • the fluorescence microscope observation was performed as follows. That is, HEK293 cells ( 4 ⁇ 10 4 cells) were transfected with 250 ng of pGA-GFP, pDX-GFP-MyD88, or pDX-GFP-TRIF. After 48 hours of transfection, the cells were analyzed with a fluorescence microscope. Three independent experiments were performed. Electrophoresis was performed as follows.
  • HEK293 cells 4 ⁇ 10 4 cells were transfected with or without 250 ng of pGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, or pDX-LacZ-TRIF. After 48 hours of transfer, genomic DNA was collected and LM-PCR was performed as described in Materials and Methods. Run an aliquot of the reaction on a 1% agarose gel This was confirmed by bronzing jizimu dyeing. Two independent experiments were performed.
  • Inguinal LN was removed 24 hours and 72 hours after the second immunization, and mRNA expression levels of cyto force in, chemo in, IFN, and cell surface molecules were quantified using real-time PCR.
  • Thl site force-in levels such as IFN- ⁇ , IL-12 p40, and IL-18 are markedly higher than controls after 72 hours of immunization with pDX-GF P-MyD88 or pDX-GFP-TRIF. It was controlled.
  • Th2 site force-ins such as IL-4 and IL-6 were also upregulated 72 hours after immunization in both groups.
  • IL-6 mRNA was significantly increased in the pDX-GFP-MyD88 group compared to the pDX-GFP-TRIF group! /.
  • Factors that regulate APC functions such as IFN- ⁇ and TNF-a, chemokines such as IP-10 and JE / MCP-1, and APC functions such as MHC class II, CD40, CD80, and CD86
  • the elements related to were also up-regulated 72 hours after immunization in both pDX-GFP-MyD88 and pDX-GFP-TRIF groups compared to the control group (FIG. 8B).
  • mice are vaccinated twice with pGA-GFP (control vector), CMV9-HA, CMV9-HA-MyD88, or CMV9-TRIF, then 4 or 20 times the amount of influenza virus A / PR /
  • mice 8/34 was inoculated intranasally. As shown in FIG. 9A, severe levels of weight loss were observed in mice vaccinated with CMV9-GFP, CMV9-HA, and CMV9-HA-MyD88. In mice vaccinated with CMV9-HA-TRIF, 20 times the amount of LD

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Abstract

従来の遺伝子ワクチンよりも免疫付与効果の大きい新規な遺伝子ワクチンが開示されている。抗原に対する免疫を付与するための遺伝子ワクチンは、抗原遺伝子と、Toll様受容体のアダプター分子の遺伝子を含み、細胞内で前記抗原遺伝子及び前記アダプター分子遺伝子を発現することができる組換えベクターから成る。この遺伝子ワクチンを投与すると、免疫を付与する対象となる抗原分子とともに、Toll様受容体のアダプター分子が同一細胞内で産生され、該アダプター分子がアジュバント効果を発揮して、抗原に対する免疫応答が増強され、ひいては該抗原を含む病原体に対する免疫力付与効果が高められる。

Description

明 細 書
遺伝子ワクチン
技術分野
[0001] 本発明は、所望の抗原に対する免疫応答を強く誘起することができる遺伝子ヮクチ ンに関する。
背景技術
[0002] 従来から、ワクチンは種々の感染症に対する免疫を付与するために広く用いられて いる。従来力も用いられているワクチンは、弱毒化生ワクチン、不活化生物ワクチン、 不活ィ匕毒素ワクチン等である。しかしながら、これらのワクチンは、免疫不全患者に対 して投与することができない。また、生体外で培養することが困難な病原体も少なくな ぐこれらの病原体に対する不活化ワクチンや弱毒化ワクチンを開発することは困難 である。さらに、全細胞を用いる従来の不活ィ匕ワクチンでは、細胞が、例えば内毒素 のような、有害な副作用を引き起こす物質を含んでおり、それによつて副作用が起き る危険'性ちある。
[0003] これらの問題を解決するワクチンとして近年、遺伝子ワクチンが注目されて 、る（非 特許文献 1)。遺伝子ワクチンは、免疫を付与したい病原体が持つ抗原遺伝子を含 む組換えベクターであり、これをヒトに投与すると、ヒトの細胞内で持続的に抗原が生 産され、該抗原に対する抗体産生が誘起され、該病原体に対する免疫が付与される 。遺伝子ワクチンでは、抗原遺伝子をベクターに組み込めば、細胞内で該抗原が生 産されるため、生体外で培養できない病原体に対するワクチンを作ることができる。ま た、病原体の抗原としては、単独では無毒なものを採用することができるので、副作 用の危険がなぐ免疫不全患者に対して投与することも可能である。
[0004] し力しながら、遺伝子ワクチンは、一般に、病原体の抗原に対する免疫応答が弱く 、病原体に対して強い免疫力を付与することが困難であるという問題がある。強い免 疫応答を誘起するために、アジュバント (免疫応答を増強する物質)を用いることが知 られており、抗体医薬等に用いる特異抗体を動物に生産させる場合等には、免疫原 と共に、結核菌から調製したフロインドのアジュバント等のアジュバントを投与すること が広く行なわれている。公知のアジュバントとしては、病原菌由来のリポ多糖 (LPS)や その誘導体、テタヌストキソイド等の毒素が知られている。しかしながら、このようなァ ジュバントをヒトに適用することは危険が大きく、用いられて 、な 、。
[0005] 遺伝子ワクチンに用いるベクターとして、ウイノレスベクターを用いた場合には、ウイ ルス由来の部分に対する免疫応答が起きるので、ウィルス部分が多少なりともアジュ バントとして機能する。しかし、ウィルスによる毒性が発揮されて副作用が生じる危険 性がある。また、ウィルス部分に対するアジュバント効果も、アレルギー反応により効 果が持続しないという問題がある。遺伝子ワクチンのベクターとして、ウィルスによる毒 '性の危険'性がない、プラスミドベクターを用いることも広く知られている力 プラスミド ベクターを用いた場合には、ウィルスベクターを用いた場合のようにウィルス部分によ るアジュバント効果が得られないため、免疫力付与効果はさらに小さくなる。
[0006] 遺伝子ワクチンによる免疫力付与効果を高めるために、遺伝子ワクチン内に、イン ターロイキンやインターフェロン等のサイト力インの遺伝子を み込んでおき、細胞内 で抗原と共にサイト力インを生産させることも知られている（非特許文献 2、 3)。しかし ながら、これらの方法によっても必ずしも満足できる免疫付与効果は得られて 、な 、
[0007] 非特許文献 1： Tang D. et al., Nature 356, 152-154, 1992
非特許文献 2 : Kenji Okuda et al., Methods in Molecular Medicine, 1999, vol.29, pp. 197-204
非特許文献 3 : Hildegund C. et al., Methods in Molecular Medicine, 1999, vol.29, pp .251-260
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] したがって、本発明の目的は、従来の遺伝子ワクチンよりも免疫付与効果の大きい 新規な遺伝子ワクチンを提供することである。
課題を解決するための手段
[0009] 本願発明者らは、鋭意研究の結果、遺伝子ワクチンに Toll様受容体のアダプター 分子の遺伝子を み込み、 目的とする抗原と共に該アダプター分子を細胞内で生産 することにより、該アダプター分子がアジュバントとして機能して、遺伝子ワクチンの免 疫付与力が向上することを見出し、本発明を完成した。
[0010] すなわち、本発明は、抗原遺伝子と、 ToU様受容体のアダプター分子の遺伝子を 含み、細胞内で前記抗原遺伝子及び前記アダプター分子遺伝子を発現することが できる組換えベクターから成る、前記抗原に対する免疫を付与するための遺伝子ワク チンを提供する。
発明の効果
[0011] 本発明によれば、従来の遺伝子ワクチンよりも免疫付与効果が高!ヽ遺伝子ワクチン が提供された。本発明の遺伝子ワクチンを投与すると、免疫を付与する対象となる抗 原分子とともに、 Toll様受容体のアダプター分子が同一細胞内で産生され、該ァダブ ター分子がアジュバント効果を発揮して、抗原に対する免疫応答が増強され、ひいて は該抗原を含む病原体に対する免疫力付与効果が高められる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]本発明の遺伝子ワクチンの構築方法を説明するための模式図である。
[図 2]本発明の遺伝子ワクチンの構築に用いた pGAベクターの遺伝子地図である。
[図 3]NF-kB及び IFN- βプロモーターの活性化因子としての TLRアダプターの特性 を決定した結果を示す図である。 25ngの pTK-RL、 25 ngの 5 X NF- κ B-luc、又は pG LhlFN jS - lucと合わせて、 250 ngの pFLAG- CMV- 4 (CMV4), pGA- LacZ, pFLAG- C MV-4-MyD88, pFLAG- CMV- 4- TRIF, pFLAG- CMV- 4- TIRAP, pFLAG- CMV- 4- T OLLIP, pFLAG-CMV-4-IRAKl ,又は pFLAG- CMV- 4- TRAF6で HEK293細胞（4 X 105個）を共トランスフエタトした。トランスフエタト 48時間後にホタルルシフェラーゼ活 性を定量し、ゥミシィタケルシフェラーゼ活性に対し標準化した。独立した 3回の実験 の内の 1回で得られたデータの値を示して 、る。
[図 4A]MyD88又は TRIF遺伝子アジュバントを組み込んだ又は組み込まない DNAワク チンの構造を示す図である。単一抗原のみ（pGA-LacZ, pGA-GFP,及び CMV9-HA )又は抗原及びアジュバント分子の両方（pDX- LacZ- MyD88, pDX- GFP- MyD88, C MV9-HA-MyD88, pDX- LacZ- TRIF, pDX- GFP- TRIF,及び CMV9- HA- TRIF)を発 現する DNAワクチンの模式図。 [図 4B]ルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターと、本発明の DNAワクチン又は比較のた めの DNAワクチンとを共トランスフエタトした細胞の LacZ活性及びホタルルシフェラー ゼ活性を示す図である。 25 ngの pTK- RL, 25 ngの 5 X NF- κ B- luc又は pGLhIFN β -1 ucと合わせて、 250 ngの pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIFで HE K293細胞 (4 X 105個)を共トランスフエタトした。トランスフエタト 48時間後に LacZ活性及 びホタルルシフェラーゼ活性を定量し、ゥミシィタケルシフェラーゼ活性に対し標準化 した。独立した 3回の実験の平均値士 SDの値を示している。 c及び d, p < 0.01; e及び f , ρ < 0.001; a及び b, p < 0.0001。
[図 5]MyD88遺伝子アジュバントによる体液性免疫反応の促進を示す図である。 0週 及び 4週で imEPTにより pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIFでマウ ス (5個体 Z群）を免疫した。 4週及び 6週で採血し、次いで A)抗 LacZ IgG血清、 B) Ig Gl (□)、及び IgG2a (國)の力価を ELISAにより調べた。 Bb, p < 0.05; Aa, p < 0.01。
[図 6A]MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントによる細胞性免疫反応の促進を示す図 である。図 5の説明文中に記載したとおりにマウスを免疫した。 A)個々のマウスより脾 臓細胞を調製し、 1 μ g/mlのクラス I (H-2d)ペプチド（國）又はクラス I (H-2b)ペプチド (口)で 24時間インビトロで刺激した。 mRNAの抽出及び逆転写は材料及び方法中に 記載したとおりに行なった。反応の一定分量について IFN- γ , IL-4,及び 18S rRNA レベルを調べた。 IFN- γ及び IL-4の mRNA発現レベルを 18S rRNAレベルに対して標 準化し、相対 mRNA発現レベルとして記載した。グラフは平均値士 SDを示す。 a及び c , pく 0.05; b, pく 0.01。
[図 6B]FACSによる解析結果を示す図である。脾臓細胞を調製し、 12 g/mlの rLacZ で 22時間インビトロで刺激した。次いで 1 μ g/mlの GolgiPlugを添カ卩し、該細胞をさらに 2時間培養した。固定後、細胞を PE融合抗 CD4又は CD8抗体及び FITC融合抗 IFN- γ抗体で染色、洗浄し、 FACSにより解析した。細胞は初めはリンパ球、次いで CD4 又は CD8陽性細胞に篩い分けされる。頻度はそれぞれ全 CD4+又は CD8+細胞に対 する IFN- γ + CD4+又は CD8+細胞のパーセントである。
[図 6C]CTL系統 (エフェクター細胞）は材料及び方法中に記載したとおりに調製した 。 MHCハプロタイプ適合（H- 2Κα) Ρ815細胞を 1 μ g/mlのクラス I (H- 2d)ペプチド（國） 又はクラス I (H-2b)ペプチド（口）と共に 1時間パルス刺激し、標的細胞として用いた。 該エフェクター細胞及び標的細胞を 6, 12.5, 25,及び 50 (E/T比)の比率で混合し、 4 時間培養し、次いで培養上清の LDH活性を定量した。グラフは材料及び方法中に記 載した通りに算出した0 /0特異的溶解の平均値士 SDを示す。 c及び f, pく 0.01 ; b及び e , p < 0.001 ; a, d,及び g, p < 0.0001。
圆 7]TRIFを介するアジュバント効果の基礎をなす機構を説明する図である。 50 g の pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIFを imEPTによりマウス（3/ 群)の大腿四頭筋中に投与した。投与 3日後又は 7日後、注入された筋肉を取り出し てホモジナイズし、遠心した。上清の LacZ活性及びタンパク質濃度を定量した。ダラ フはタンパク質濃度に対して標準化した LacZ活性の平均値士 SDを示す。 a, c,及び d , ρく 0.05; b, ρく 0.01。
[図 8A]MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントでの imEPT後における流入領域 LN中に 存在する細胞の活性化を示す図である。 50 μ gの pGA- GFP, pDX-GFP-MyD88,又 は pGA- GFP-TRIFでの imEPTによる 2回目の免疫から 72時間後、流入領域 LN (鼠径 部 LN)を取り出しホモジナイズした。 LNの単一細胞懸濁液を PE融合抗 CD 11c又は C D40抗体で表面染色、洗浄し、次いで FACSにより解析した。頻度は全細胞に対する CDl lc+又は CD40+細胞のパーセントである。 10個の独立した LNから調整したサンプ ルの平均値士 SD値を示す。
[図 8B]MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントでの imEPT後における流入領域 LN中に 存在する細胞中の各種サイト力イン等の発現量を示す図である。 50 μ gの pGA- GFP, pDX-GFP-MyD88,又は pGA-GFP-TRIFでの imEPTによる追加免疫から 24又は 72時 間後、流入領域 LN (鼠径部 LN)を取り出し、ホモジナイズして TRIzol試薬中に懸濁し た。 mRNAを抽出し逆転写した。 cDNAの一定分量中における IFN- γ , IL-12 p40, IL -18, IL- 4, IL- 6, IFN- β , TNF- a , IP- 10, JE/MCP-1 , MHCクラス I, MFCクラス Π, C D40, CD80,及び CD86の発現レベルをリアルタイム PCRにより解析した。グラフは 10 個の独立した LN力 調整したサンプルの平均値士 SD値を示す。縦軸は、無処置の 群を 1とした相対 mRNA発現量を示す。 Af, Ba, Bb, Be, Be, Bf, Bg, Bh, Bj, Bk, Bn, B o, Bp, Bq, Br, Bs, Bt, Bu, Bv, Bx, By, Bz,及び BA, p < 0.05; Aa, Ac, Ad, Ae, Ag, Bd, Bi, Bl, Bm,及び Bw, p < 0.01; Ab, p < 0.001。
[図 9A]MyD88又は TRIF遺伝子アジュバントを組み込んだインフルエンザ DNAヮクチ ンはマウスを致死量のインフルエンザウイルス感染力も効果的に防御することを示す 図である。 0週及び 4週の時点において imEPTにより 2 gの pGA-GFP, CMV9-HA, C MV9-HA-MyD88,又は CMV9- HA- TRIFでマウス（10個体 Z群）を免疫した。 2回目 の免疫の 2週間後、マウスに 4 LD 又は 20 LD 量のインフルエンザウイルス A/PR/8/
50 50
34を接種した。以後 12日間の体重をモニターした。グラフは 0日における体重に対す る体重のパーセントを示す。死亡した個体は†で示す。
[図 9B]図 9Aの以後 12日間の生存率をモニターした結果を示す図である。〇， pGA- GFP;▲, CMV9-HA; ■， CMV9- HA- MyD88; ·, CMV9- HA- TRIF
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明において、「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする核酸を意味し、必ずしも親 カゝら子へ伝えられる天然の遺伝子に限定されるものではなぐ合成された核酸等であ つてもよい。核酸としては、安定性の点力 DNAが好ましい。
[0014] 本発明の遺伝子ワクチンは、 Toll様受容体 (TolHike receptor,以下「TLR」 t 、うこ とがある)のアダプター分子の遺伝子を含んでおり、この点が本発明の遺伝子ヮクチ ンの特徴である。 TLRは、微生物やウィルス等の病原体を感知し、進入する病原体に 対して初期の免疫応答を引き起こす重要な役割を担うものである。 TLRの遺伝子は、 ショウジヨウバエの Toll遺伝子と相同性を有すること力も Toll様受容体と呼ばれる。 TL Rは、病原体により発現される高度に保存された構造モチーフを認識するものであり、 このような構造モチーフとしては、フラジェリン (細菌の鞭毛を構成するタンパク質)、 細菌 DNA、二本鎖ウィルス RNAや LPS、ペプチドダリカン、リポペプチド等の細胞壁構 成因子が包含される。ヒトおよびマウスでは約 11種類の TLRが知られている。
[0015] TLRに病原体由来の上記構造モチーフ（リガンド）が結合することにより TLRが刺激 されると、適切な免疫応答を指揮するサイト力イン、ケモカインの分泌を誘導する転写 因子 NF- κ Bの活性化や I型インターフェロン（IFN)の産生を誘導するシグナルカスケ ードが始動される。 TLRの活性化から、 NF- κ Bの活性ィ匕または I型 IFNの産生誘導に 至るまでのカスケードにおけるシグナル伝達に係るタンパク質が TLRアダプター分子 と呼ばれ、種々のものが知られている。本願発明者らは、この TLRアダプター分子を コードする遺伝子を、遺伝子ワクチンに組み込んでおき、対象となる抗原と共に同一 細胞内で発現させることにより、アジュバント効果が発揮され、免疫付与効果が高まる という新知見を得、本発明に至ったものである。
[0016] TLRのアダプター分子は、公知の!/、ずれの TLRの!、ずれのアダプター分子であつ てもよいが、好ましいアダプター分子の例として、 MyD88、 TRIF(TICAM1とも呼ばれる )、 TIRAP、 TRAM, IRAKI、 IRAK4, TRAF6、 RIP1、 IKK- i、 TBK1及び RIG- 1を挙げる ことができる。これらのうち、 MyD88及び TRIFが特に好ましい。これらのアダプタ一分 子自体は周知であり、その遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列も 知られている。例えば、 MyD88遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列 は、 GenBank Accession No. NM— 002468に記載されている。同様に、 TRIF/TICAM1 の配列は、 GenBank Accession No. (以下同じ） AB093555、 TIRAPは AF406652、 TR AMは AY232653、 IRAKIは L76191、 IRAK4は AY283670、 TRAF6は U78798、 RIP1は NM_003804、 IKK- iは AB016590、 TBK1は AF191838、 RIG- 1は AY180973に記載され ている（以上の GenBank Accession No.に記載されているアダプター分子は全てヒト 由来）。なお、ヒト MyD88の配列を配列表の配列番号 1に、ヒト TRIFの配列を配列表 の配列番号 3に示す。
[0017] これらのアダプター分子遺伝子は、その塩基配列が公知であるので、例えば TLRを 発現しているヒトマクロファージ等カも抽出した RNAを铸型とする逆転写 PCR等の常 法により作製することができるし、市販のヒト脾臓 cDNAライブラリーを铸型として PCR 等の常法により作製することもできる（下記実施例参照)。また、本発明において好ま しく用いられる MyD88や TRIF等のアダプター分子の遺伝子は巿販もされているので 、市販品を用いることもできる。
[0018] 上記したアダプター分子には、天然の変異体が知られているものもあり、その場合 には、その天然のアダプター分子の変異体遺伝子を用いることもできる。また、一般 に、生理活性を有するポリペプチドは、そのアミノ酸配列を構成するアミノ酸のうち少 数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、又は少数のアミノ酸が挿入されたり付加された 場合でもその生理活性が維持される場合があることは周知である。したがって、上記 した天然のアダプター分子のアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有し、遺伝子ワク チン内にコードされる前記抗原と共に細胞内で発現された際に該ワクチンのアジュバ ント効果を発揮する変異型のアダプター分子もまた本発明にお 、て用いることができ る。このような変異型のアダプター分子のアミノ酸配列の、天然型のアミノ酸配列に対 する相同性は、好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上である。なお、ここで 、二者のアミノ酸配列の相同性は、一致するアミノ酸の数が最も多くなるように配列を 整列し、一致して 、るアミノ酸の数を全体のアミノ酸の数 (全体のアミノ酸の数が異な る場合には短い方のアミノ酸の数)で除したものを百分率で表したものであり、 BLAST のような周知のソフトにより容易に算出できる。なお、変異型のアダプター分子の長さ が天然型と異なる場合、その長さは天然型の 70%以上が好ましぐさらに好ましくは 9 0%以上、さらに好ましくは 95%以上である。また、変異型のアダプター分子のァミノ 酸配列は、天然型のアダプター分子のアミノ酸配列において、 1個ないし数個のアミ ノ酸が置換し及び Z若しくは欠失し、並びに Z又は 1個ないし数個のアミノ酸が挿入 され及び Z若しくは付加されたものである場合がさらに好ましい。アミノ酸が置換する 場合、類似した性質のアミノ酸に置換しても生理活性が維持される場合が多!ヽので、 置換の場合は、類似した性質のアミノ酸に置換したものが好ましい。すなわち、天然 のタンパク質を構成する 20種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸 (Gly , He, Val, Leu, Ala, Met, Pro),親水性側鎖を有する中性アミノ酸 (Asn, Gin, Thr, Se r, Tyr Cys)、酸性アミノ酸 (Asp, Glu)、塩基性アミノ酸 (Arg, Lys, His),芳香族アミノ酸 ( Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間で の置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多い。もっとも、上記したよう な変異型を用いる必要は特になぐ天然型のアダプター分子を用いることが好ましい
[0019] 本発明の遺伝子ワクチンは、上記したアダプター分子の遺伝子が組み込まれてい ることを特徴とし、他の部分は、従来力も周知の遺伝子ワクチンと同様であってよい。
[0020] 遺伝子ワクチンに組み込む抗原遺伝子としては、免疫力を付与したい病原体が有 する抗原であって、それに対する抗体により該病原体による発症が防止又は緩和さ れるものであればよぐ何ら限定されるものではなぐ公知の遺伝子ワクチンに用いら れて 、る抗原遺伝子は 、ずれも用いることができる。本発明に用いることができる抗 原遺伝子の例としては、インフルエンザウイルスのへマグルチニン (HA)及び核タンパ ク（NP)、エイズウイルスの外被タンパク（gag、 pol、 env)並びに緑膿菌の構成成分（O prF/I、 PilA、 PcrV、 FliC)等の公知の遺伝子を例示することができる力 これらに限定 されるものではない。
[0021] 本発明の遺伝子ワクチンは、上記抗原遺伝子及びアダプター分子遺伝子を哺乳 動物細胞用のベクター中に組み込んだものである。哺乳動物細胞用ベクター自体は 、この分野において周知であり、巿販もされており、公知のベクターや市販品をその まま用いることができる。例えば、 Invitrogen社から市販されて!、る pcDNA3.1(+)(catal og No. V790— 20)や pcDNA3.1(— Xcatalog No. V795— 20)等を好ましく用いることができ るがこれらに限定されるものではない。周知のとおり、これらの哺乳動物細胞用べクタ 一は、哺乳動物細胞内での複製を可能にする複製開始点、外来遺伝子の発現を可 能にするプロモーター領域、外来遺伝子を挿入するためのマルチクローユング部位 等を有する。なお、ベクターは、レトロウイルスやアデノウイルスのような哺乳動物細胞 用のベクターとして用いられて 、るウィルス由来のベクターであってもよ 、。
[0022] 本発明の遺伝子ワクチンは、哺乳動物細胞用のベクターに上記抗原遺伝子と上記 アダプター分子遺伝子を組み込むことにより得ることができるが、前記抗原遺伝子は 、該抗原遺伝子の転写を制御するプロモーターの下流に位置し、前記アダプタ一分 子遺伝子は、該アダプター分子遺伝子の転写を制御する、前記抗原遺伝子のプロ モーターとは異なるプロモーターの下流に位置することが好ましい。すなわち、抗原 遺伝子及びアダプター遺伝子は、それぞれ別のプロモーターにより制御されることが 好ましい。もっとも、同一細胞内で抗原とアダプター分子の両方が生産されることを確 保するために、各プロモーターとしては同じ種類のプロモーターを用いることが好まし いが、異なる種類のプロモーターであってもよい。
[0023] 本発明の遺伝子ワクチンは、哺乳動物細胞用のベクターのマルチクローユング部 位に、抗原遺伝子又はアダプター分子遺伝子を挿入し、次いで、マルチクローニン グ部位のターミネータ一領域 (polyA等）の下流にある制限酵素部位を切断し、この切 断部位に、プロモーター +アダプター分子遺伝子 (先にアダプター遺伝子を挿入し た場合には抗原遺伝子） +ターミネータ一のカセット配列を挿入することにより構築 することができる。あるいは、哺乳動物細胞用のベクターのマルチクローユング部位 に、抗原 (又はアダプター分子遺伝子） +ターミネータ一のカセットを挿入し、該ター ミネ一ターの下流にプロモーター +アダプター分子（又は抗原遺伝子）のカセットを 挿人すること〖こよっても構築することができる。
[0024] 遺伝子ワクチンに組み込まれる抗原遺伝子やアダプター遺伝子は、必ずしも 1つず つに限定されるものではなぐ異なる 2種類以上の抗原遺伝子や異なる 2種類以上の アダプター分子遺伝子を組み込んでもよい。もっとも、遺伝子の数が多くなりすぎると 遺伝子ワクチンのサイズが大きくなりすぎて細胞に入りにくくなるので、抗原遺伝子と アダプター分子遺伝子の合計は 4個以下が好ましい。このように、抗原遺伝子ゃァダ プター分子遺伝子を複数組み込む場合でも、プロモーター +抗原 (アダプター分子） 遺伝子 +ターミネータ一のカセットをベクター内の制限酵素部位に挿入することによ り、所望の遺伝子ワクチンを構築することができる。
[0025] 哺乳動物への遺伝子ワクチンの投与自体は、周知の方法により行うことができる。
すなわち、好ましくは、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、静脈内投与等の非経口 投与により投与することができる。遺伝子ワクチンをリン酸緩衝液 (PBS)等の緩衝液に 懸濁したものを投与することができる。投与に際し、細胞内への遺伝子ワクチンの侵 入を容易にするために、注射部位に電界パルスを与えることが好ましい。この場合、 電界の強さは、特に限定されないが、通常、 10V/cn！〜 60V/cm程度、好ましくは 25V/ cm〜35V/cm程度、パルスの持続時間は、通常、 20ミリ秒〜 100ミリ秒、好ましくは、 40 ミリ秒〜 60ミリ秒程度であり、パルスを通常、 1回〜 6回、好ましくは 2回〜 4回程度当 てることができる。また、皮内投与は、市販の遺伝子銃を用いて周知の方法により行う ことができる。すなわち、遺伝子ワクチンを、金粒子上に固定し、この金粒子を、ポリビ -ルピロリドンのような接着剤と共に遺伝子銃で動物の体表力 皮内に打ち込むこと により投与することができる。投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することが できるが、通常、体重 lkg当たり、遺伝子ワクチンの重量で 1 μ §〜1000 g程度、好 ましくは 100 μ g〜200 μ g程度である。
[0026] 下記実施例において具体的に示されるように、本発明の遺伝子ワクチンを投与する と、アダプター分子遺伝子を含まない公知の遺伝子ワクチンと比較して、抗原に対す る免疫応答がより強く起き、該抗原を有する病原体に対する免疫力をより強力に付与 することができる。すなわち、抗原に対する特異抗体の生産がより増大し (体液性免 疫反応の増大）、インターフェロン等のサイト力インの生産量が増大し、 CTL (細胞障 害性 T細胞)活性化反応がより強く誘導される。
[0027] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実 施例に限定されるものではない。
実施例
[0028] 方法
発現プラスミド
抗原及び TLRアダプター分子をコードする cDNA断片を親プラスミド力も PCRにより 増幅し、後述する方法により遺伝子ワクチンに組み込んだ。 FLAGタグを施した発現 ベクター CMV4— MyD88, CMV4-TRIF, CMV4-TIRAP, CMV4— TOLLIP, CMV4-IRA K1,及び CMV4- TRAF6は公知の方法（Eur J Immunol, vol. 35, 2477-2485, 2005)に より作製した。 LacZ又は EGFPの cDNAはそれぞれ pSV- β -ガラタトシダーゼ（Promeg a,ウィスコンシン州 Madison)又は pEGFP-Nl (BD Biosciences,カリフォルニア州 San Jose)から増幅した。インフルエンザウイルス A/PR/8/34株 (H1N1型）の HA (アミノ酸 1 8番 -566番、配列番号 5、 6)は pJW4303/Hl (J Virol, vol. 76, 6652-6659, 2002)から 増幅し PFLAG-CMV9ベクター（Sigma,ミズーリ州 St Louis)に導入した。クローユング した PCR産物の配列は ABI PRISM Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems,カリフ オル-ァ州 Foster City)を用いて確認した。
[0029] より具体的には、本発明の遺伝子ワクチンである pDX- LacZ- MyD88、 pDX- LacZ- T RIF、 CMV-HA- MyD88及び CMV9-HA- TRIFは次のようにして構築した（図 1参照）。
[0030] 図 1に示す受容体プラスミドは、公知の pGAベクター（Ross et al.， Nat. Immunol. 1, 127-131(2000》又は市販の pFLAG CMV9ベクター (Sigma社製）を基本とするものであ る。 pGAの遺伝子地図を図 2に示す。図 2に示されるように、 pGAベクターは、真核生 物由来の挿入遺伝子の転写を開始するためのサイトメガロウィルス (CMV)の immediat e-earlyプロモータ^ ~~ hイントロン Aと、転写終結のためのゥシ成長ホルモン (BGH)の ポリアデ-レーシヨンシグナル (polyA)と、原核生物細胞内での複製を可能にするた めの Col El originと、カナマイシン耐性遺伝子と、真核生物由来の挿入遺伝子の安 定性を高める λ TOターミネータ一とを含むプラスミドである。 pFLAG CMV9ベクター (S igma社製)も pGAベクターと類似した構造 (ただしカナマイシン耐性遺伝子ではなくァ ンピシリン耐性遺伝子を有する）を有する。 LacZ遺伝子は、 pGAベクターの Hindm-X hoi部位、 GFP遺伝子は、 pGAベクターの BamHI-Avrll部位、 HA遺伝子は、 pFLAG C MV9ベクター (Sigma社製）の Notl- BamHI部位に挿入し、図 1に示す受容体プラスミド を構築した（それぞれ、「pGA recipient LacZ」、 「pGA recipient GFP」、 「pFLAG CM V9 recipient HA」 )。
[0031] なお、挿入した LacZ遺伝子、 GFP遺伝子、 HA遺伝子は次のようにして調製した。 La cZ遺伝子は、市販の pSV- j8 -ガラクトシダーゼ（Promega,ウィスコンシン州 Madison) 中に含まれて 、る LacZ遺伝子を PCRにより増幅して調製した。 PCRに用いたプライマ 一セット ίま、 5 -GGG AAG CTT ACC ATG TCG TTT ACT TTG ACC AAC AAG— 3 'と 5し GGG CTC GAG TTA TTT TTG ACA CCA GAC CAA CTG G— 3'であった。 G FP遺伝子は、市販の pEGFP- Nl (BD Biosciences,カリフォルニア州 San Jose)中に 含まれて 、る GFP遺伝子を PCRにより増幅して調製した。 PCRに用いたプライマーセ ッ卜は、 5 -CCC GGA TCC ACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG C— 3'と 5'— T ΤΤ CCT AGG TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC- 3'であった。 HA遺伝子 は、公知の pJW4303/Hlベクター（J Virol, vol. 76, 6652-6659, 2002)に含まれる HA 遺伝子 (配列番号 5、 6)の、アミノ酸 18番 -566番をコードする領域を PCRにより増幅し て調製した。 PCRに用いたプライマーセットは、 5'- AGC TGC GGC CGC AGA CAC AAT ATG TAT AGG— 3'と 5し CGG GAT CCT CAG ATG CAT ATT CTG CAC TG C- 3 'であった。
[0032] 一方、図 1に示す供与体プラスミドは、上記した pGAベクター又は pBluescript SK (+) ベクター（Stratagene社より市販されて!、る周知のクロー-ングベクター）を基本とする ものである。 pGAベクターの Hindlll-EcoRI部位に、 MyD88遺伝子又は TRIF遺伝子を 挿入して図 1の供与体プラスミドを構築した (「pGA donor MyD88」及び「pGA donor T RIF」） (LacZ又は GFP含有遺伝子ワクチン調製用）。得られた供与体プラスミド pGA do nor MyD88及び pGA donor TRIF力ら、 Notlにより、 CMV promoter- IntronA-MyD88 断片及び TRIF cDNA- polyA断片をそれぞれ切り出し、 pBluescript SK(+)ベクターの Notl部位に挿入して供与体プラスミド「pBluescript SK (+) MyD88」及び「pBluescript S K (+) TRIFjを構築した (HA含有遺伝子ワクチン調製用)。
[0033] なお、挿入した MyD88遺伝子及び TRIF遺伝子は、ヒト脾臓 cDNAライブラリー（クロ ーンテック社より巿販）を铸型とし、それぞれ次のプライマーセットを用いた PCRにより 増幅して調製した。 MyD88: 5 -GGA ATT CAC CAT GGC TGC AGG AGG TCC C GG- 3'と 5 '-CCC AAG CTT CAG GGC AGG GAC AAG GCC TTG- 3'、 TRIF: 5'- G GA ATT CAC CAT GGC CTG CAC AGG CCC ATC— 3'と 5し CCC AAG CTT CAT TCT GCC TCC TGC GTC TTG- 3'
[0034] pGA donor MyD88及び pGA donor TRIF力ら Notlにより、それぞれ CMV promoter— I ntronA- MyD88及び TRIF cDNA- polyA断片を切り出し、それぞれ pGA recipient Lac Zまたは pGA recipient GFPの Notl部位に挿入してそれぞれ pDX-LacZ-MyD88、 pD X- GFP- MyD88、 pDX-LacZ- TRIF及び pDX- GFP- TRIFをそれぞれ作製した。また、 p Bluescript SK (+) MyD88及び pBluescript SK (+) TRIF力ら Sailにより、 CMV promoter - IntronA- MyD88断片及び TRIF cDNA- polyA- Sail断片をそれぞれ切り出し、 pFLAG CMV9 recipient HAの Sail部位に挿入して CMV9- HA- MyD88及び CMV9- HA- TRIF をそれぞれ作製した。
[0035] 細胞のトランスフエクシヨン及びレポーター遺伝子アツセィ
製造者のプロトコールに従い、 FuGene 6 (Roche Diagnostics,インディアナ州 Indian apolis)を用いて一過的トランスフエクシヨンを行った。 HEK293細胞（3 X 104)を、各 発現プラスミド (CMV4, CMV4-MyD88, CMV4- TRIF, CMV4- TIRAP, CMV4- TOLLI P, CMV4-IRAK1, CMV4- TRAF6, pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIF, 200 ng)、レポータープラスミド (p5xNF- κ B- luc又は pGL3 hlFN β , 25 ng)、及 びコントロールのゥミシィタケルシフェラーゼプラスミド (pTK-RL, 25 ng, Promega,ウイ スコンシン州 Madison)で共トランスフエタトした。トランスフエクシヨン後細胞を 48時間ィ ンキュペートし、製造者のプロトコ一ノレに従い Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。あるいは、 j8 - Gal Reporter Gen e Assay kit (Roche Diagnostics)を用いて LacZ活性を測定した。最後に、個々の細胞 溶解物のホタルルシフェラーゼ活性又は LacZ活性をゥミシィタケルシフェラーゼ活性 に対して標準化した。
[0036] 免疫計画
8週齢の雌 BALB/cマウスを SLC (静岡県)より購入し、特定の病原体フリーな環境下 の動物施設で飼育した。ケタミン Zキシラジン混合液で麻酔した後、該マウス (8匹 Z 群）の大腿四頭筋に、 pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88, pDX- LacZ- TRIF, pGA- GFP, pDX-GFP-MyD88, pDX— GFP— TRIF, CMV9— HA, CMV9— HA— MyD88,又は CMV9— HA- TRIFの 、ずれかを含むプラスミド溶液 (1 μ §/ μ 1生理食塩水、 50 μ 1/筋)を注射し た。 CUY21EDIT (NepaGene,東京)を用いて、 30 V/cm—定、 50ミリ秒 X 3パルスの 電界強度で注射部位をエレクト口ポレーシヨンした。 2回目の免疫は 1回目の免疫の 4 週間後に行なった。全ての動物実験は施設の動物管理'福祉委員会に承認され、マ ウスは NIH動物管理ガイドラインに従って取り扱われた。
[0037] ELISA
ELISAによって以前記載したとおりに血清抗体価を測定した。免疫プレート (Nalge N unc International,ニューヨーク州 Rochester)を、 0.1 M重炭酸塩緩衝液（pH 9.0)中 に 1 /z g/mlに溶解した抗 LacZ抗体 (rLacZ、（TOYOBO))で被覆した。該プレートを PB ST + 1% BSAでブロッキングし、免疫したマウス力も収集した血清の低減希釈液を該 プレートにカ卩え、プレートを 37°Cで 2時間インキュベートした。結合した IgGを HRP標識 した抗マウス IgG, IgGl,又は IgG2a抗体（Southern Biotechnology Associates,ァラノ マ州 Birmingham)と反応させ、次いでクェン酸緩衝液及び H 0中で基質として作用
2 2
する 2-2-アジノ-ビスと反応させた。力価の高!、抗血清を用いて作製した検量線と比 較することによる比色アツセィで、相対的抗体濃度を得た。
[0038] 細胞内サイト力イン染色（Intracellular cytokine staining; ICCS)アツセィ
最後の免疫の 2週間後に脾臓細胞を収集した。該細胞を 12 /z g/mlの rLacZ (Sigma) と共に 37°Cにて 24時間インキュベートし、インキュベート終了 2時間前に 1 μ g/mlの Go lgiPlug (BD Biosciences)を添カ卩した。該細胞を染色緩衝液（3% FCS及び 0.1% NaNを
3 含む PBS)で洗浄し、 4%正常マウス血清でブロッキングして、フィコエリトリン結合抗マ ウス CD4抗体（L3T4, BD Biosciences)又は CD8抗体（Ly- 2, BD Biosciences)で染色 した。次いで該細胞を固定、浸透可能化し、 FITC結合抗マウス IFN- γ抗体 (XMG1. 2, BD Biosciences)で 4°Cにて 30分間染色後、フローサイトメトリー解析に付した。
[0039] リアルタイム PCR
最後の免疫の 2週間後に脾臓細胞を収集した。該細胞を 1 μ g/mlの H-2d-制限 Lac Zクラス Iペプチド (TPHPARIGL)で 24時間 37°Cにてインキュベートした。あるいは、最 後の免疫の 24時間後又は 72時間後に鼠径部の LN細胞を収集した。これらの細胞を 次いで 800 1の TRIzol試薬（Invitrogen,カリフォルニア州 Carlsbad)中に溶解し、全 R NAを単離した。逆転写は、 25 ng/mlのオリゴ (dT) , 200 Uの Superscript III逆転写
12-18
酵素（Invitrogen), 2 mM dNTP, 10 mM DTT,及び 10 Uのリボヌクレアーゼ阻害剤を 含む第一鎖緩衝液（50 mM Tris-HCl; pH 7.5, 75 mM KC1,及び 2.5 mM MgCl )中
2 で 50°Cにて 1時間行なった。リアルタイム PCRは、 IFN- γ , IL- 12 p40, IL- 18, IL- 4, IL -6, IFN- β , TNF- a , IP— 10, JE/MCP— 1 , MHC class I (Dl), MHC class II (Ea), CD 40, CD80, CD86,又は 18S rRNAに特異的な TaqManプローブ（Applied Biosystems, カリフォルニア州 Foster City)及び ABI PRISM 7700 sequence detection system (App lied Biosystems)を用いて行なった。個々のサンプルにおける IFN- γ , IL- 12 p40, IL -18, IL— 4, IL— 6, IFN- β , TNF- a , IP— 10, JE/MCP— 1 , MHCクラス I (Dl), MHCクラス II (Ea), CD40, CD80,及び CD86の相対 mRNA発現レベルは、 18S rRNAのレベルに 対して正規化した。
[0040] CTLアツセィ
最後の免疫の 2週間後に脾臓細胞を収集した。 1
Figure imgf000016_0001
ペプチド及び 20 U/mlの IL-2 (Sigma)と共に 37°Cにて 4日間インキュベートした後、 C TL分離株 (エフェクター細胞)を調製した。標的細胞として、 1 mg/mlの H-2b-制限 La cZクラス Iペプチド（DAPIYTNV,コントロールペプチド）又は H- 2d-制限 LacZクラス Iぺ プチドと共にパルス刺激した P815細胞を用いた。該標的細胞（1 X 104個）を増殖した エフェクター細胞と共に 4時間培養した。標的細胞力も放出された LDHの量は、 Cytot ox 96 (Promega)システムを用いて測定し、製造者のプロトコールに従い％特異的細 胞溶解を算出した。 [0041] インビボレポーター遺伝子アツセィ
筋肉内エレクト口ポレーシヨン (intramuscular electoroporation; imEPT)〖こより 50 μ g の pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIFのいずれかを BLAB/cマウ ス（3マウス/群）に投与した。投与 3日後又は 7日後に、注入された筋肉（6筋/群)を取 り出し、細胞溶解試薬（Roche Diagnostics)中でホモジナイズし、凍結融解を 3回行な つた。遠心後、上清を回収し、 LacZ活性又はタンパク質濃度をそれぞれ |8 _ガラクトシ ダーゼアツセィシステム（Roche)又は BCAタンパク質アツセィキット（Bio-Rad,カリフォ ル-ァ州 Hercules)を用いて測定した。次いで、個々の細胞溶解物の LacZ活性をタ ンパク質濃度に対して正規ィ匕した。
[0042] ライゲーシヨン介在 PCR(LM-PCR)によるアポトーシス細胞からの DNA断片の増幅
293T細胞を、 pGA- GFP, pDX- GFP- MyD88,又は pDX- GFP- TRIFのいずれかで 一過的にトランスフエタトした。トランスフエクシヨンの 48時間後、製造者の指示書に従 い Nuclepspinキット（Macherey- Nagel,ペンシルバニア州 Easton)を用いて該細胞か らゲノム DNAを抽出した。各サンプル DNAから 1 μ gを、 ApoAlert LM- PCRキット（BD Biosciences)を用いたライゲーシヨン介在 PCR法に付した。すなわち、該ゲノム DNA の末端に 12ヌクレオチド及び 24ヌクレオチドのアダプターを、 T4 DNAリガーゼを用い て 16°Cにて 12時間ライゲーシヨンした。次いで、 12ヌクレオチド及び 24ヌクレオチドを プライマーとして用いて、 PCRを 24サイクル行なった。 PCR産物を 1.5%ァガロースゲル にて分離し臭化工チジゥム染色後 UV光下で確認した。
[0043] インフルエンザ接種
pGA-GFP, CMV9-HA, CMV9— HA— MyD88,又は CMV9— HA— TRIFによる 2回目の 免疫の 2週間後、 1 X 104 PFU (4 LD )又は 5 X 104 PFU (20 LD )のインフルエンザ
50 50
ウィルス A/PR/8/34をマウスの鼻内に接種した。以後 10日間、被接種マウスの体重 及び死亡率を観察した。
[0044] 統計的解析
全ての実験は 2回以上反復した。 0.05未満の p値を統計的有意としたスチューデント t検定により統計的有意性を評価した。
[0045] 結果 TLR又は TLRリガンド非存在下における TLRアダプター分子の過剰発現による NF- K B及び IFN- βプロモーターの活性化
遺伝子アジュバントとして最適な候補分子を検索するため、本願発明者らは、 MyD 88, TRIF, TIRAP, TOLLIP, IRAKI ,及び TRAF6を含む公知の TLRアダプター分子 について、 HEK293細胞中において NF- κ Β及び IFN- βプロモーターを活性化する 能力を調べた。 NF- κ Βは、サイト力イン、ケモカイン、及び共起刺激分子のような先 天免疫活性化に関与する遺伝子の発現を調節する主要な転写因子である。 IFN- a 及び IFN- 18の両者を含むタイプ Iの IFNは、先天免疫と同様、抗原提示に不可欠であ る。図 3に示す通り、 TLRアダプター分子のうち、 MyD88が NF- κ Β活性化を最も強く 誘導し、一方で TRIFは IFN- |8プロモーターを最も高いレベルで活性ィ匕することがで きた。従って、遺伝子アジュバントの候補分子として MyD88及び TRIFが選ばれた。
[0046] MyD88又は TRIFのための発現カセットと共に組み込まれたワクチンプラスミドの力価
MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントの最大限の効果を得るため、抗原と共に MyD8 8又は TRIFを同一の抗原提示細胞（antigen presenting cell; APC)中に導入し（直接 的な初回抗原刺激)、該細胞においてこれらの分子が有効な抗原提示作用を行なえ るようにした。この目的に到達するため、図 4Aに示す二重発現プラスミドを構築した。 次いで、これらの構築物の抗原発現能及び内生細胞活性化能を調べた。 HEK293T 細胞を pGA- LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIFでトランスフエタトした 場合、細胞溶解物中における LacZ活性レベルは同程度であった（図 4B)。予想され たとおり、 pDX- LacZ- MyD88でトランスフエタトした場合には、コントロールプラスミド（p GA-LacZ)でトランスフエタトした場合と比較して、 NF- κ Β依存のルシフェラーゼ活性 は 7.8倍以上増加していた。 pDX- LacZ- TRIFでトランスフエタトした場合は、 IFN- j8プ 口モーター依存のルシフェラーゼ活性はコントロールプラスミドの 11.7倍以上に増加 していた。従って、これらのデータは、 MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントはワクチン プラスミドベクター中に組み込まれた際に抗原 (LacZ)の発現レベルを変調させること なく内生細胞活性ィ匕因子として働く機能を保持すると ヽうことを示して！/ヽる。
[0047] MyD88遺伝子アジュバントと共に組み込まれた DNAワクチンにより起こる体液性免疫 反応の促進 DNAワクチンプラスミドに組み込まれた MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントの効果 を調べるため、 pGA-LacZ, pDX- LacZ- MyD88,又は pDX- LacZ- TRIFを筋肉内エレ タトロポレーシヨン（intramuscular electoroporation; imEPT)によりマウスに投与した。 1 回目の免疫後（4週）では、これらのプラスミド DNAワクチンは抗 LacZ IgGを同程度の 低レベルで誘導して 、た（図 5A)。 2回目の免疫後（6週）では、 pDX-LacZ-MyD88は 抗 LacZ IgG血清をコントロールプラスミド（pGA-LacZ)よりも 7.4倍以上高!、レベルで 誘導していた。 pDX-LacZ-TRIFは抗 LacZ IgG血清生産をコントロールプラスミドと同 程度のレベルで誘導していた（図 5A)。 IgGサブタイプのレベルも調べた。 pDX-LacZ - MyD88は、コントロールプラスミドと比較して、抗 LacZ IgG2a血清を 15.0倍以上の高 レベルで誘導していた力 IgGlサブタイプは同レベルであった（図 5B)。これらの結 果は、 MyD88遺伝子アジュバントは DNAワクチンにより起こる抗原特異的な体液性免 疫反応を効果的に促進すると ヽうことを示して ヽる。
MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントにより変調される細胞性免疫反応
免疫されたマウス力も調製された脾細胞において、 IFN- γ及び IL-4の抗原特異的 生産を調べた。 2回目の免疫の 2週間後、脾細胞を調製し、 H-2d-制限 MHCクラス Iぺ プチドでインビトロにおいて再刺激した。該細胞力も全 RNAを抽出し、逆転写反応に 付し、次いで IFN- γの cDNAレベルをリアルタイム PCRにより定量した。コントロール 群から得られた細胞と比較して、 pDX-LacZ-MyD88群から得られた脾細胞は 2.4倍以 上、 pDX- LacZ- TRIF群から得られた脾細胞は 6.6倍以上の高レベルで IFN- γの mR NAを生産していた力 一方で全ての群由来の細胞はクラス Iペプチド刺激に対する 反応において IL-4を同程度の低レベルで生産していた（図 6A)。あるいは、脾細胞を rLacZ全タンパク質で刺激し、次いで CD4+及び CD8+ Tリンパ球からの IFN- γの生産 を ICCS解析により調べた。 pDX- LacZ- MyD88及び pDX- LacZ- TRIFワクチン接種両 方において、 CD4+及び CD8+ Tリンパ球による IFN- γ生産の誘導が認められた（図 6 B)。最後に、クラス I LacZペプチドでパルス刺激した P815 (H-2Kd)細胞を標的とした CTLアツセィを行なった。 pDX- LacZ- TRIFが最も強く CTL反応を誘発した（図 6C)。 p DX-LacZ-MyD88もまたコントロールプラスミドよりも CTL反応を強く誘導する能力があ つた（図 6C)。これらの結果より、 MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントは DNAワクチン により引き起こされる Th-1支配の抗原特異的細胞性免疫反応の規模を増大すること が明らかとなった。
[0049] MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントの効果に関与する交差提示機構
これらの遺伝子アジュバントによる DNAワクチンの免疫原性の増強の基礎をなす機 構を見極めるため、インビボでの抗原発現レベルを調べた。図 7Aに示すとおりに、こ れらのプラスミドを用いて imEPTを行なった後の筋肉内 LacZ発現レベルを調べた。 pD X- LacZ- MyD88及び pDX- LacZ- TRIFでは筋肉内 LacZタンパク質発現レベルがコン トロールよりも有意に低ぐ遺伝子アジュバントカセットの挿入によりプラスミドのサイズ が増すにつれてトランスフエクシヨン効率が低下することがわかる。従って、この結果 は少なくとも、これらの遺伝子アジュバントが単に抗原の発現レベルを増大し、それに よって抗原の交差提示を増大しているという可能性を排除するものである。
[0050] TRIF過剰発現によって誘発される細胞内での諸現象
MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントによって誘発される細胞内での諸現象を調べ るため、 GFP発現プラスミド系列を構築し（図 4A)、 HEK293細胞中にトランスフエタトし た。次いで、蛍光顕微鏡下で細胞の外観を調べた。興味深いことに、 pDX-GFP-TRI Fでトランスフエタトした細胞は断片化を起こし、トランスフエタト後 48時間以内に死滅 するように見えた。 pDX-GFP-TRIFでトランスフエタトした細胞内で起こる現象を確認 するために、ゲノム DNAを抽出し、 LM- PCR解析に付して DNAの断片化を検出した。 図 7Cに示すとおり、 TRIFの過剰発現によりアポトーシスの典型的な特徴である DNA の断片化が誘導された。この機構もまた、 TRIF遺伝子アジュバントを組み込んだ DNA ワクチンによって起こる強い免疫原性に寄与しているものと考えられる。なお、蛍光顕 微鏡観察は次のように行なった。すなわち、 250 ngの pGA- GFP, pDX- GFP- MyD88, 又は pDX- GFP- TRIFで HEK293細胞（4 X 104個)をトランスフエタトした。トランスフエク ト 48時間後、該細胞を蛍光顕微鏡で解析した。 3回の独立した実験を行なった。また 、電気泳動は次のようにして行なった。すなわち、 250 ngの pGA- LacZ, pDX- LacZ- M yD88,又は pDX- LacZ- TRIFと共に又はこれらを含めずに HEK293細胞（4 X 104個)を トランスフエタトした。トランスフエタト 48時間後、ゲノム DNAを回収し材料及び方法中 に記載した通りに LM-PCRを行なった。反応の一定分量を 1%ァガロースゲルで泳動 し臭化工チジゥム染色して確認した。 2回の独立した実験はを行なった。
[0051] MyD88又は TRIF遺伝子アジュバントを組み込んだ DNAワクチンによる免疫後の流入 領域リンパ節 (lymph node; LN)細胞集団
近年の免疫学の概念的枠組みは、 APCは末梢で抗原を捕捉した後に流入領域 LN に入り、そこで続 ヽて起こる獲得免疫反応にお ヽて重要な役割を果たして ヽると ヽぅ ことを明らかにしている。従って、鼠径部 LNの単一細胞懸濁液を 2回目の免疫の 3日 後に調製し、表面マーカー染色後、異なる細胞型数を FACS解析により見積もった。 休止中の LNと比較して、 CDl lc+榭状細胞数は、いずれのプラスミドで imEPT処理を 行なっても処理後 72時間以内に増加していた（図 8A)。興味あることに、 pDX-GFP- MyD及び pDX- GFP-TRIFで imEPT処理すると、コントロールプラスミドと比較して CD4 0+細胞数が増加しており、このことより流入領域 LNにお 、て MyD88及び TRIF遺伝子 アジュバントは CD40+成熟 Bリンパ球及び CD40+活性ィ匕 Tリンパ球の数を増加させるこ とがわかった（図 8A)。
[0052] MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントを組み込んだ DNAワクチンによる免疫後の流入 領域 LNにおけるサイト力イン、ケモカイン、 IFN、及び細胞表面分子の変調
2回目の免疫の 24時間後及び 72時間後に鼠径部 LNを取り出し、サイト力イン、ケモ 力イン、 IFN、及び細胞表面分子の mRNA発現レベルをリアルタイム PCRを用いて定 量した。 IFN- γ , IL- 12 p40,及び IL- 18のような Thlサイト力インのレベルは、 pDX- GF P-MyD88又は pDX- GFP-TRIFでの免疫 72時間後ではコントロールに比べ顕著に上 方制御されていた。 IL-4及び IL-6のような Th2サイト力インも両方の群において免疫 7 2時間後で上方制御されていた。興味深いことに、 IL- 6の mRNAは pDX- GFP- TRIF群 と比較すると pDX- GFP-MyD88群の方が顕著に増加して!/、た。 IFN- β及び TNF- a のような APCの機能を調節する因子、 IP-10及び JE/MCP-1のようなケモカイン、並び に MHCクラス II, CD40, CD80,及び CD86のような APCの機能に関連する要素もまた 、コントロール群と比べて pDX- GFP- MyD88及び pDX- GFP- TRIF群の両方にお!、て 免疫 72時間後で上方制御されて 、た（図 8B)。
[0053] MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントのインフルエンザ DNAワクチンへの適用
MyD88及び TRIF遺伝子アジュバントのインフルエンザ DNAワクチンへの実用化を 検討するため、 HA抗原を標的とする一連のワクチンを構築した（図 4A)。 pGA-GFP( コントロールベクター）、 CMV9- HA, CMV9-HA-MyD88,又は CMV9- TRIFでマウス を 2回ワクチン接種し、次いで LD の 4倍又は 20倍量のインフルエンザウイルス A/PR/
50
8/34を鼻内接種した。図 9Aに示すとおり、 CMV9-GFP, CMV9-HA,及び CMV9-HA -MyD88でワクチン接種したマウスにおいては重篤なレベルの体重低下が観察され た。 CMV9-HA-TRIFでワクチン接種されたマウスでは、 LD の 20倍量のインフルェン
50
ザを接種した後であっても体重低下は中度レベルであった。最後に、 CMV9-HA-My D88でワクチン接種した場合は、コントロールプラスミド CMV9-HA (生存率 40%)と比較 した際に 4 LD 量のウィルス接種に対して中度レベルの防御効果 (生存率 60%)が見
50
られた。 CMV9-HA-TRIFでワクチン接種した場合は、致死レベル（4 LD 量）のイン
50 フルェンザウィルス感染に対し完全な防御効果が認められた。これらのマウスをその 5倍量（20 LD50)のウィルスで接種した場合であっても、コントロール群では生存は 20 %以下であつたが、 CMV9-HA-TRIFでワクチン接種したマウスでは 70%が生存した。

Claims

請求の範囲
[1] 抗原遺伝子と、 Toll様受容体のアダプター分子の遺伝子を含み、細胞内で前記抗 原遺伝子及び前記アダプター分子遺伝子を発現することができる組換えベクターか ら成る、前記抗原に対する免疫を付与するための遺伝子ワクチン。
[2] 前記アダプター分子が、 MyD88、 TRIF、 TIRAP、 TRAM, IRAKI、 IRAK4, TRAF6、
RIP1、 IKK-i, TBKl及び RIG-I並びにこれらの天然のアダプター分子のアミノ酸配列 と 70%以上の相同性を有し、遺伝子ワクチン内にコードされる前記抗原と共に細胞 内で発現された際に該ワクチンのアジュバント効果を発揮する変異型のアダプター 分子力も成る群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 1記載の遺伝子ワクチン。
[3] 前記アダプター分子が、 MyD88、 TRIF、 TIRAP、 TRAM, IRAKI、 IRAK4, TRAF6、
RIP1、 IKK-ΰ TBKl及び RIG-Iから成る群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 2 記載の遺伝子ワクチン。
[4] 前記アダプター分子が、 MyD88及び Z若しくは TRIF又はその前記変異型である請 求項 2記載の遺伝子ワクチン。
[5] 前記アダプター分子が、 MyD88及び Z又は TRIFである請求項 4記載の遺伝子ワク チン。
[6] 前記抗原遺伝子は、該抗原遺伝子の転写を制御するプロモーターの下流に位置 し、前記アダプター分子遺伝子は、該アダプター分子遺伝子の転写を制御する、前 記抗原遺伝子のプロモーターとは異なるプロモーターの下流に位置する請求項 1な V、し 5の 、ずれか 1項に記載の遺伝子ワクチン。
[7] 前記抗原遺伝子のプロモーターと、前記アダプター分子遺伝子のプロモーターが 同一種類のプロモーターである請求項 6記載の遺伝子ワクチン。
[8] 前記ベクターがプラスミドベクターである請求項 1ないし 7のいずれ力 1項に記載の 遺伝子ワクチン。
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