CN115361968A - 在抗原靶向免疫疗法中增加抗原阴性细胞死亡 - Google Patents

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Abstract

描述了组合疗法，其包括(i)表达嵌合抗原受体(CAR)或类似分子的免疫细胞，和(ii)保留或增强肿瘤坏死因子α(TNFα)对癌细胞的体内作用的化合物。所述组合疗法导致杀伤免疫疗法靶向的抗原阳性细胞附近的抗原阴性细胞，从而降低逃逸变体的存活能力并提供其他益处。

Description

在抗原靶向免疫疗法中增加抗原阴性细胞死亡
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年3月31日提交的美国临时专利申请第63/003,209号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开提供了组合疗法，其包括(i)表达嵌合抗原受体(CAR)或类似分子的免疫细胞，和(ii)保留或增强肿瘤坏死因子α(TNFα)对癌细胞的体内作用的化合物。所述化合物可以是小分子或通过免疫细胞影响基因或蛋白质表达的分子。组合疗法导致杀伤免疫疗法靶向的抗原阳性细胞附近的抗原阴性细胞，从而降低逃逸变体的存活能力并提供其他益处。
背景技术
根据世界卫生组织(World Health Organization)的数据，癌症是全球第二大死亡原因，并且在2018年导致估计960万人死亡。多年来，癌症的治疗选择是手术、化疗和放疗。近年来，出现了更多的靶向疗法，通过识别和利用主要在癌细胞中看到的特定分子变化来特异性靶向那些细胞。例如，在基因工程化免疫系统的T细胞以靶向和杀伤不需要的细胞类型(诸如癌细胞)方面已经取得了显著的进展。这些T细胞中的许多已经被基因工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。CAR是包括几种不同亚组分的蛋白质，所述几种不同亚组分允许遗传修饰的T细胞识别和杀伤癌细胞。所述亚组分包括至少细胞外组分和细胞内组分。细胞外组分包括与优先存在于不需要的细胞表面上的抗原特异性地结合的结合结构域。当结合结构域结合此类抗原时，细胞内组分向T细胞发出信号以破坏结合的细胞。CAR还包括可以连接细胞外组分与细胞内组分的跨膜结构域，以及可以增强CAR功能的其他亚组分。例如，包括一个或多个接头序列，诸如间隔区，可以使CAR具有额外的构象灵活性，通常增加结合结构域结合靶细胞抗原的能力。
使用表达CAR的T细胞(CAR-T)的临床试验显示，当常规治疗失败时，在患有难治性大B细胞淋巴瘤的患者中有阳性反应(Neelapu等人2017N Engl J Med 377:2531-2544)。然而，虽然基因工程化CAR-T细胞成功地导致癌细胞破坏，但其未能在体内为某些适应症提供延长的抗癌活性。例如，抗原阴性复发是抗原导向免疫疗法后治疗失败的常见原因。
肿瘤坏死因子-α(TNFα)调节细胞功能，包括细胞凋亡、免疫反应以及细胞生长和分化。在癌细胞附近，TNFα促进癌细胞死亡。TNFα途径可被肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员的其他成员调节，以增强或抑制TNFα诱导的细胞死亡。凋亡蛋白的细胞抑制剂(cIAP)也可以在癌细胞附近，并且相反地保护癌细胞免受TNFα的细胞杀伤作用。因此，已经开发了减少或阻断cIAP的作用的治疗性cIAP拮抗剂。
发明内容
本公开提供了免疫疗法的施用，诸如表达CAR的免疫细胞与增强或保持TNFα的体内细胞杀伤作用的化合物的组合。如本文所示，这些组合疗法允许杀伤由CAR或类似分子结合的抗原阳性细胞。增强或保持TNFα的作用还可以允许有效杀伤靶向抗原阳性细胞区域内的抗原阴性癌细胞，因此降低逃逸变体的存活能力以及其他益处。
增强或保持TNFα的体内细胞杀伤作用的化合物在本文中被称为TNFα信号增强因子。在特定的实施方案中，TNFα信号增强因子包括激活肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员的分子，所述肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员增强TNFα信号传导途径成员。在特定的实施方案中，TNFα信号增强因子包括抑制TNFSRF成员的分子，所述TNFSRF成员抑制TNFα信号传导途径成员。在特定的实施方案中，分子可以包括敲入增强TNFα信号传导途径成员的TNFRSF成员的基因工程化分子，或敲低/敲除或以其他方式破坏抑制TNFα信号传导途径成员的TNFRSF成员的活性的基因工程化分子。
在特定的实施方案中，基因工程化分子可以导致一种或多种以下蛋白质的表达：TWEAK(肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导剂)；TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)；和LIGHT(与淋巴毒素同源，表现出可诱导的表达并与HSV糖蛋白D竞争结合疱疹病毒进入介体，是一种在T淋巴细胞上表达的受体)。
在特定的实施方案中，经遗传修饰以表达CAR或类似分子的免疫细胞也经遗传修饰以表达一种或多种TNFα信号增强因子。在特定的实施方案中，经遗传修饰以表达CAR或类似分子的免疫细胞也经遗传修饰以敲低、敲除或以其他方式破坏一种或多种抑制TNFα信号传导途径成员的TNFRSF成员。
在特定的实施方案中，TNFα信号增强因子是选自例如以下的小分子或蛋白质：BV-6、CUDC-427、GDC-0152、LCL161、罗卡酰胺(Rocaglamide)、西罗莫司(Sirolimus)、七叶素(Escin)、恩利卡生(Emricasan)、比瑞那帕(Birinapant)、ASTX660、AZD5582、KILLERTRAILTM(Enzo Life Sciences,Farmingdale,NY)、BI 891065、DEBIO 1143、APG-1387、HGS1029和AEG35156。
附图说明
图1A-1D.抗原阴性杀伤测定的示意图。用铬51(Cr51)标记CD33-pos AML细胞系ML1或来自CRISPR-Cas9靶向的CD33缺陷的ML1细胞，并以下四种组合中的一种培养：(图1A)＝CD33-pos-Cr51标记与CD33-neg细胞，(图1B)＝CD33-neg-Cr51标记与CD33-pos细胞，(图1C)＝CD33-pos-Cr51标记与CD33-pos细胞，(图1D)＝CD33-neg-Cr51标记与CD33-neg细胞。使细胞暴露于CD33PROXCAR-T细胞持续4小时或24小时。然后通过闪烁计数器测量上清液中的Cr51水平并计算为从自发细胞裂解(仅在培养基中)中减去相对于最大细胞裂解(来自去污剂)的细胞毒性百分比。由CAR-T细胞裂解的细胞被划分为颅骨和交叉骨。箭头代表Cr51释放。
图2A-2H.CD33导向的CD8+CAR-T细胞在不同的CAR长度和不同的供体中显示出强效的抗原阴性旁观者杀伤。将铬51标记的CD33阳性(pos)AML细胞系ML1或来自CRISPR-Cas9靶向的CD33缺陷的ML1细胞与CD33导向的1H7 CAR-T细胞共培养4小时或24小时，收集细胞上清液并通过闪烁计数器分析释放的辐射。将细胞毒性百分比计算为闪烁减去背景除以最大释放(由去污剂处理引起)乘以100％。培养4小时后，1H7 CAR-T细胞导致抗原特异性杀伤CD33-pos ML1靶(柱标为★和■)，但不杀伤CD33阴性(neg)ML1靶(柱标为●和◆)。相反，在24小时时，且仅当与CD33-pos ML1靶细胞一起培养时，观察到铬标记的CD33-neg ML1细胞的强烈杀伤(柱标为●)，从而指示抗原阳性靶细胞激活CAR-T细胞促进了抗原阴性旁观者AML细胞死亡。在具有长或短间隔区的CAR结构中观察到了这种效应。(图2A)-(图2D)健康供体04：(图2A)4小时；短间隔区；(图2B)24小时；短间隔区；(图2C)4小时；中等间隔区；(图2D)24小时；中等间隔区；(图2E)-(图2H)健康供体07：(图2E)4小时；短间隔区；(图2F)24小时；短间隔区；(图2G)4小时；中等间隔区；(图2H)24小时；中等间隔区。
图3A、3B.CD33导向的CD4+CAR-T细胞显示出强效的抗原阴性旁观者杀伤作用。将铬51标记的CD33-pos AML细胞系ML1或来自CRISPR-Cas9靶向的CD33缺陷的ML1细胞与CD33导向的1H7 CD4+CAR-T细胞共培养4小时或24小时，收集细胞上清液并通过闪烁计数器分析释放的辐射。将细胞毒性百分比计算为闪烁减去背景除以最大释放(由去污剂处理引起)乘以100％。(图3A)培养4小时后，1H7CD4+CAR-T细胞导致抗原特异性杀伤CD33-pos ML1靶(柱标为★和■)，但不杀死CD33-neg ML1靶(柱标为●和◆)。(图3B)相反，在24小时时，仅当与CD33-pos ML1靶标一起培养时，观察到铬标记的CD33-neg ML1细胞的强烈杀伤(柱标为●)，从而指示抗原阳性靶细胞激活CD4+CAR-T细胞也促进抗原阴性旁观者AML细胞死亡。
图4.抗原阴性杀伤也见于流式细胞毒性测定。在十天内，在IL-7和IL-15中扩增针对CD33的膜近端组分(C2集)的1H7 CAR-T细胞。然后将CAR-T细胞在以下三种条件中的一种下共培养24小时：1)表达内源水平的CD33的荧光标记的ML1细胞(CD33pos GFP)与通过成簇的规则间隔的短回文重复序列-Cas9(CRISPR-Cas9)技术获得的CD33遗传缺陷的非荧光ML1细胞(CD33neg)；2)CD33neg GFP细胞与不表达GFP的CD33pos细胞；3)CD33neg GFP细胞与不表达GFP的CD33neg细胞。然后通过对细胞进行针对膜联蛋白V和7AAD染色来评估细胞死亡。通过TrueCount珠计数对膜联蛋白V阳性、膜联蛋白V和7AAD阳性或7AAD阳性细胞的总数进行定量并测量相对于100％细胞死亡的细胞死亡百分比(ML1细胞在1200W微波加热15秒)。此数据表明抗原阴性细胞的杀伤不限于铬51释放测定。
图5A-5C.抗原阴性细胞杀伤依赖于TNFα和FasL。将铬51标记的CD33-pos AML细胞系ML1或来自CRISPR-Cas9靶向的CD33缺陷的ML1细胞与CD33导向的1H7 CD8+CAR-T细胞在不同水平的TNFα抑制剂(图5A)、IFNγ抑制剂(图5B)或FasL抑制剂(图5C)下以10:1的效应物与靶标比率共培养24小时。将细胞毒性百分比计算为闪烁减去背景除以最大释放(由去污剂处理引起)乘以100％。TNFα抑制几乎没有导致抗原阴性细胞死亡。
图6.可经调节以增强抗原靶向免疫疗法中的抗原阴性细胞死亡的肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员。
图7.嵌合抗原受体(CAR)诱导抗原阳性细胞(A)的死亡和肿瘤坏死因子α(TNFα，A)的表达，所述肿瘤坏死因子α可通过TNF受体超家族(TNFRSF)向附近的抗原阴性细胞(B)发出信号，从而诱导“旁观者杀伤”，如本文所示。然而，此细胞死亡受到在癌症中过度表达的蛋白质的抑制，所述蛋白质通常抑制TNFα诱导的细胞死亡，诸如TNF-受体相关因子2(TRAF2)。一种公开的CAR-T细胞疗法的增强包括引入含有上游NFAT启动子的CAR基因的顺式转基因。通过CAR的信号传导(C)将导致从NFAT启动子的转录(D)和随后的以下蛋白质的表达(E)：膜结合形式的TNF相关的凋亡弱诱导(mTWEAK)；TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)；或淋巴毒素同源物，其表现出可诱导的表达并与HSV糖蛋白D竞争结合疱疹病毒进入介体，是一种在T淋巴细胞上表达的受体(LIGHT)。已知所有这三种蛋白质通过例如诱导TNFα诱导的细胞死亡的抑制剂的降解来降低TNFα诱导的细胞死亡的阈值(F-G)。
图8.药物增强、TNFα介导的抗原阴性杀伤同时保持正常造血的示意图。针对CD33的膜近端结构域的CAR-T细胞向CD33-pos AML细胞递送有效的杀伤信号(A)，同时促进肿瘤坏死因子α(TNFα，B)的释放。TNFα在造血干细胞中诱导静止状态和细胞存活(C)。然而，在癌细胞中，TNFα引起细胞死亡(D)，这被在AML中过度表达的调节细胞死亡的内源性抑制剂阻止(E)。这些细胞抑制剂又可以被已经在临床试验中验证或正在临床使用的药理学抑制剂抑制(F，和例如图9A和10)。
图9A、9B.具有据称增强TNFα介导的细胞死亡的能力的SMAC/Diablo模拟物及用其获得的结果。(9A)SMAC/Diablo模拟物是一类降低TNFα介导的信号传导和细胞死亡阈值的药物。(9B)抗原阴性杀伤可以被SMAC/Diablo模拟物增强。将CD33缺陷的荧光标记的ML1细胞(CD33neg GFP)和非荧光ML1亲代细胞(CD33pos，顶部)或ML1 CD33 KO细胞(CD33neg，底部)与各种SMAC/Diablo模拟物以图9A中列出的浓度共培养。24小时后，使ML1细胞暴露于培养基或CD33导向的CAR-T细胞。然后通过对细胞进行针对膜联蛋白V和7AAD染色来评估细胞死亡。将活细胞总数评估为GFP阳性膜联蛋白V和7AAD阴性细胞并通过TrueCount珠计数进行定量。将抗原阴性细胞死亡百分比计算为(培养基对照孔中的总细胞死亡–CAR-T孔中的总细胞死亡)/培养基对照孔中的总细胞死亡×100％。****p<0.0001，***p<0.001，ns相较于媒介物(DMSO)对照不显著，采用普通单向ANOVA和事后邓尼特检验(post-hoc Dunnetttest)。
图10.已经在小鼠和人中试验并且可以在本公开的教导中使用的小分子TNFα信号传导调节剂的额外实例。
图11.支持本公开的示例性序列。
具体实施方式
根据世界卫生组织的数据，癌症是全球第二大死亡原因，并且在2018年估计导致960万人死亡。多年来，癌症的治疗选择是手术、化疗和放疗。近年来，出现了更多的靶向疗法，通过识别和利用主要在癌细胞中看到的特定分子变化来特异性靶向那些细胞。例如，在基因工程化免疫系统的T细胞以靶向和杀伤不需要的细胞类型(诸如癌细胞)方面已经取得了显著的进展。这些T细胞中的许多已经被基因工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)构建体。CAR是包括几种不同亚组分的蛋白质，所述几种不同亚组分允许遗传修饰的T细胞识别和杀伤癌细胞。所述亚组分包括至少细胞外组分和细胞内组分。
细胞外组分包括与优先存在于不需要的细胞表面上的抗原特异性地结合的结合结构域。当结合结构域结合此类抗原时，细胞内组分指导T细胞破坏所结合的癌细胞。结合结构域通常是来源于单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)，但其也可以基于包括例如抗体样抗原结合位点或T细胞受体(TCR)的其他形式。
细胞内组分基于包括效应结构域而提供激活信号。第一代CAR利用CD3ζ的胞质区作为效应结构域。第二代CAR利用CD3ζ与分化簇28(CD28)或4-1BB(CD137)组合，而第三代CAR利用CD3ζ与细胞内效应结构域内的CD28和4-1BB组合。
CAR通常还包括在分子内用于各种目的的一个或多个接头序列。例如，跨膜结构域可以用于将CAR的细胞外组分与细胞内组分连接。通常被称为结合结构域近膜的间隔区的柔性接头序列可以用于在结合结构域和细胞膜之间产生额外的距离。这可能有利于减少对基于与膜接近的结合的空间位阻。用于此目的的常见间隔区是IgG4接头。根据靶细胞抗原，可以使用更紧凑的间隔区或更长的间隔区。在本文别处更详细地描述了其他潜在的CAR亚组分。
使用表达CAR的T细胞的临床试验显示，当常规治疗失败时，在患有难治性大B细胞淋巴瘤的患者中有阳性反应(Neelapu等人2017N Engl J Med 377:2531-2544)。然而，尽管CAR构建体可以成功地对T细胞进行基因工程化以导致癌细胞破坏，但其不能在体内为某些适应症提供延长的抗癌活性。例如，抗原阴性复发是抗原导向的免疫疗法后治疗失败的常见原因，诸如用表达CAR的T细胞(通常称为CAR-T细胞)治疗。本公开提供了经修饰以表达针对特定细胞抗原的CAR或类似分子的免疫细胞也可以在通过靶向细胞抗原的存在进行初始引发后诱导不表达抗原的癌细胞的杀伤。例如，针对髓样恶性肿瘤相关抗原CD33的CAR-T细胞可以在通过表达CD33的靶标初始引发后(即在存在CD33阳性细胞的情况下)诱导CD33阴性细胞的杀伤。这使得CAR-T细胞首先被靶抗原激活，然后杀伤肿瘤微环境中不表达靶抗原的其他细胞，从而提供了增加缓解深度和降低抗原阴性逃逸风险的机会。
已经确定，这种观察到的“旁观者杀伤”依赖于TNFα途径信号，如当TNFα或FasL被抑制时对抗原阴性细胞死亡的抑制所证明。因此，本公开提供了免疫疗法的施用，诸如表达CAR的免疫细胞与增强或保持TNFα的体内细胞杀伤作用的化合物的组合。如本文所示，这些组合疗法允许杀伤由CAR或类似分子结合的抗原阳性细胞。增强或保持TNFα的作用还可以允许有效杀伤靶向抗原阳性细胞区域内的抗原阴性癌细胞，因此降低逃逸变体的存活能力以及其他益处。
增强或保持TNFα的体内细胞杀伤作用的化合物在本文中被称为TNFα信号增强因子。在特定的实施方案中，TNFα信号增强因子包括激活、增强或支持肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员的分子，所述肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员激活、增强或支持TNFα信号传导途径成员。在特定的实施方案中，TNFα信号增强因子包括激活、增强或支持TNFα信号传导途径成员的分子。激活是指将分子从非活性状态改变为活性状态。增强是指将分子从活性状态带到更活性的状态。支持是指在以其他方式下调分子活性的条件下维持分子的激活状态。
在特定的实施方案中，TNFα信号增强因子包括使TNFSRF成员失活、抑制或破坏TNFSRF成员的分子，所述TNFSRF成员使TNFα信号传导途径成员失活、抑制或破坏TNFα信号传导途径成员。失活是指将分子从活性状态变为非活性状态。抑制是指将分子从活性状态带入活性较低的状态。破坏是指在以其他方式保持分子活性的条件下降低分子的激活状态和/或阻止分子的功能形式的表达。
在特定的实施方案中，TNFα信号增强因子可以包括基因工程化分子，其敲入增强TNFα信号传导途径成员的TNFRSF成员或敲低/敲除或以其他方式破坏抑制TNFα信号传导途径成员的TNFRSF成员的表达。
在特定的实施方案中，可以在CAR-T细胞和其他抗原导向的疗法中进行蛋白质工程化修饰，诸如增加TNF相关的死亡信号的表面表达，以增强旁观者杀伤。此外，这些增强机制倾向于仅发生在恶性肿瘤中，因此保护正常组织并降低毒性。在特定的实施方案中，TNFα信号增强因子包括一种或多种以下蛋白质：TWEAK(肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导剂)；TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)；和LIGHT(与淋巴毒素同源，表现出可诱导的表达并与HSV糖蛋白D竞争结合疱疹病毒进入介体，是一种在T淋巴细胞上表达的受体)。这些蛋白质降低了TNFα诱导的细胞死亡的阈值。不受理论的限制，这些蛋白质通过诱导抑制TNFα诱导的细胞死亡的分子的降解来降低TNFα诱导的细胞死亡的阈值。在特定的实施方案中，经遗传修饰以表达CAR或类似分子的免疫细胞也经遗传修饰以表达或包括一种或多种TNFα信号增强因子。
在特定的实施方案中，经遗传修饰以表达CAR或类似分子的免疫细胞也经遗传修饰以敲低、敲除或以其他方式灭活一种或多种抑制TNFα信号传导途径成员的TNFRSF成员。
图6提供了TNFRSF成员的表，以及在本公开的上下文中，对于被分类为TNFα信号增强因子的分子，是否应增强或抑制特定家族成员。如图6中所示，TNFα信号增强因子激活、增强和/或支持TNFRSF成员1A、1B、3、6、8、10A、10B、12A、19和/或21的作用，和/或使TNFRSF成员6B、10C和/或10D的作用失活、抑制或破坏TNFRSF成员6B、10C和/或10D的作用。
此外，若干临床可用的小分子可以通过阻断TNFα介导的细胞死亡的抑制剂来增强抗原阴性旁观者细胞杀伤。在特定的实施方案中，这些小分子包括以下中的一种或多种：BV-6、CUDC-427、GDC-0152、LCL161、罗卡酰胺、西罗莫司、恩利卡生、比瑞那帕、ASTX660、AZD5582、KILLERTRAILTM、BI 891065、DEBIO 1143、APG-1387、HGS1029、七叶素和AEG35156。在特定的实施方案中，小分子TNFα信号增强因子是cIAP拮抗剂。小分子TNFα信号增强因子也可以是SMAC模拟物。第二种线粒体来源的半胱天蛋白酶激活因子(SMAC)是与cIAP结合的线粒体蛋白(也称为DIABLO)。这种结合导致释放半胱天冬酶来激活细胞凋亡并导致cIAP的耗尽。SMAC模拟物模拟SMAC对cIAP的作用。
与本公开相关的以下方面和选项现在被更详细地描述如下：(I)免疫细胞；(II)细胞样品收集和细胞富集；(III)遗传修饰细胞群体以表达嵌合抗原受体(CAR)和任选的TNFα信号增强因子蛋白；(III-A)基因工程化技术；(III-B)CAR亚组分；(III-B-i)结合结构域和靶向细胞抗原；(III-B-ii)间隔区(III-B-iii)跨膜结构域；(III-B-iv)细胞内效应结构域；(III-B-v)接头；(III-B-vi)控制特征，包括标签盒、转导标志物和/或自杀开关；(III-C)TNFα信号增强因子蛋白；(IV)细胞激活培养条件；(V)离体制造的细胞配制品；(VI)TNFα信号增强因子–小分子和蛋白质；(VII)纳米颗粒配制品；(VIII)使用方法；(IX)试剂盒；(X)示例性实施方案；和(XI)结束段落。这些标题仅为组织目的而提供，并且不限制本公开的范围或解释。
(I)免疫细胞。本公开描述了经遗传修饰以表达CAR的免疫细胞和经遗传修饰以表达或包括TNFα信号增强因子的免疫细胞。在特定的实施方案中，经遗传修饰以表达CAR的免疫细胞与经遗传修饰以表达或包括TNFα信号增强因子的免疫细胞相同。
经遗传修饰的细胞可以包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞、造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)和/或HSC和HPC的混合物(即HSPC)。在特定的实施方案中，经遗传修饰的细胞包括T细胞。
已经发现了几种不同的T细胞亚群，每种亚群具有不同的功能。例如，大多数T细胞具有作为几种蛋白质的复合物存在的T细胞受体(TCR)。实际的T细胞受体由两条单独的肽链构成，所述肽链由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生并且被称为α-和β-TCR链。
γδT细胞代表在其表面上具有不同T细胞受体(TCR)的T细胞的小亚群。在γδT细胞中，TCR由一个γ链和一个δ链组成。此组T细胞比αβT细胞更不常见(总T细胞的2％)。
CD3在所有成熟T细胞上表达。激活的T细胞表达4-1BB(CD137)、CD69和CD25。CD5和转铁蛋白受体也在T细胞上表达。
T细胞还可以被分为辅助细胞(CD4+T细胞)和细胞毒性T细胞(CTL、CD8+T细胞)，其包括细胞溶解T细胞。T辅助细胞在免疫过程中辅助的其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活、以及其他功能。这些细胞也被称为CD4+T细胞，因为它们在其表面上表达CD4蛋白。当辅助T细胞与肽抗原一起被在抗原呈递细胞(APC)表面上表达的MHC II类分子呈递时，辅助T细胞被激活。一旦被激活，其迅速分裂并分泌调控或辅助主动免疫应答的称为细胞因子的小蛋白质。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞并且还与移植排斥有关。这些细胞也被称为CD8+T细胞，因为它们在其表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合在身体几乎每个细胞的表面上存在的与MHC I类相关的抗原而识别它们的靶标。
如本文所用的“中央记忆”T细胞(或“TCM”)是指在其表面上表达CD62L或CCR7和CD45RO并且与原初细胞(naive cell)相比不表达CD45RA或具有降低的CD45RA表达的抗原经历的CTL。在特定的实施方案中，中央记忆细胞对于CD62L、CCR7、CD25、CD127、CD45RO和CD95的表达呈阳性的，并且与原初细胞相比具有降低的CD45RA表达。
如本文所用的“效应记忆”T细胞(或“TEM”)是指与中央记忆细胞相比在其表面上不表达CD62L或具有降低的CD62L表达并且与原初细胞相比不表达CD45RA或具有降低的CD45RA表达的抗原经历的T细胞。在特定的实施方案中，与原初细胞或中央记忆细胞相比，效应记忆细胞对于CD62L和CCR7的表达呈阴性，并且具有可变的CD28和CD45RA表达。与记忆或原初T细胞相比，效应T细胞对颗粒酶B和穿孔素呈阳性。
如本文所用的“原初”T细胞是指与中枢或效应记忆细胞相比表达CD62L和CD45RA而不表达CD45RO的非抗原经历的T细胞。在特定的实施方案中，原初CD8+T淋巴细胞的特征在于原初T细胞的表型标志物(包括CD62L、CCR7、CD28、CD127和CD45RA)的表达。
自然杀伤细胞(也称为NK细胞、K细胞和杀伤细胞)响应于干扰素或巨噬细胞来源的细胞因子而被激活。其用于抑制病毒感染，同时适应性免疫反应产生可以清除感染的抗原特异性细胞毒性T细胞。NK细胞表达CD8、CD16和CD56，但不表达CD3。
巨噬细胞(及其前体，单核细胞)存在于身体的每个组织中(在某些情形中为小胶质细胞、库普弗细胞(Kupffer cell)和破骨细胞)，在那里其吞噬凋亡细胞、病原体和其他非自身组分。单核细胞/巨噬细胞表达CD11b；F4/80；CD68；CD11c；IL-4Rα；和/或CD163。
未成熟的树突细胞(即预激活)吞噬外周的抗原和其他非自身组分，随后以激活的形式迁移到淋巴组织的T细胞区域，在那里其向T细胞提供抗原呈递。树突细胞表达CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD21、CD35、CD39、CD40、CD86、CD101、CD148、CD209和DEC-205。
造血干/祖细胞或HSPC指造血干细胞和造血祖细胞的组合。
造血干细胞是指未分化的造血细胞，其能够在体内自我更新，在体外基本上无限增殖，并且能够分化成所有其他造血细胞类型。
造血祖细胞是来源于造血干细胞或胎儿组织的细胞，其能够进一步分化为成熟细胞类型。在某些实施方案中，造血祖细胞是CD24loLin-CD117+造血祖细胞。HPC可以分化成(i)骨髓祖细胞，其最终产生单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板或树突细胞；或(ii)最终产生T细胞、B细胞和NK细胞的淋巴祖细胞。
相对于其他类型的造血细胞，HSPC可对HSPC上表达水平增加的特定标志物呈阳性。例如，此类标志物包括CD34、CD43、CD45RO、CD45RA、CD59、CD90、CD109、CD117、CD133、CD166、HLA DR或其组合。此外，相对于其他类型的造血细胞，HSPC对于表达的标志物可以是阴性的。例如，此类标志物包括Lin、CD38或其组合。优选地，HSPC是CD34+细胞。
细胞或细胞群体对特定标志物呈“阳性”或表达特定标志物的表述是指特定标志物在细胞上或细胞中的可检测存在。当提及表面标志物时，所述术语可以指如通过流式细胞术所检测的表面表达的存在，例如，通过用特异性地结合标志物的抗体染色并检测所述抗体，其中所述染色可通过流式细胞术检测，所述染色的水平实质上高于用同种型匹配的对照在其他相同条件下进行相同程序检测的染色，和/或所述染色的水平实质上类似于已知对标志物呈阳性的细胞的水平，和/或所述染色的水平实质上高于已知对标志物呈阴性的细胞的水平。
细胞或细胞群体对特定标志物呈“阴性”或缺乏标志物的表达的表述是指特定标志物在细胞上或细胞中基本上没有可检测的存在。当提及表面标志物时，所述术语可以指如通过流式细胞术所检测的表面表达的不存在，例如，通过用特异性地结合标志物的抗体染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术不可检测到，所述染色的水平实质上高于用同种型匹配的对照在其他相同条件下进行相同程序检测的染色的水平，和/或所述染色的水平实质上低于已知对标志物呈阳性的细胞的水平，和/或所述染色的水平与已知对标志物呈阴性的细胞的水平相比实质上类似。
根据本公开的教导进行遗传修饰的细胞可以是患者来源的细胞(自体的)，或在适当时可以是同种异体的。
(II)细胞样品收集和细胞富集。样品收集和富集的方法是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，细胞来源于细胞系。在一些实施方案中，细胞获自异种来源，例如，获自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或猪。在特定的实施方案中，细胞来源于人。
在一些实施方案中，T细胞来源于样品或自样品分离，所述样品诸如全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官，和/或来源于其的细胞。在特定的实施方案中，来自受试者的循环血液的细胞例如通过单采术或白细胞分离术获得。在特定的实施方案中，样本含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、HSC、HPC、HSPC、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞，并且进一步处理是必要的。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以除去血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或介质中以用于随后的处理步骤。在特定的实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺少钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。根据制造商的说明书，可以使用半自动“流通(flow-through)”离心机(例如，Cobe2991细胞处理器，Baxter)完成洗涤。也可以进行切向流过滤(TFF)。在特定的实施方案中，细胞可以在洗涤后重新悬浮在各种生物相容性缓冲液中，诸如无Ca++/Mg++的PBS。
分离可以包括一个或多个不同的细胞制备和分离步骤，包括基于一种或多种特性的分离，所述特性诸如大小、密度、对特定试剂的敏感性或抗性，和/或对抗体或其他结合配偶体的亲和力，例如免疫亲和力。在特定的实施方案中，使用相同的装置或设备在单一过程流中顺序地和/或同时地进行分离。在特定的实施方案中，由相同的起始组合物或材料，诸如由相同的样品进行不同群体的分离、培养和/或工程化。
在特定的实施方案中，可以通过使用基于密度的细胞分离方法和相关方法来富集样品中的T细胞。例如，通过溶解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心样品，可以从外周血中的其他细胞类型中分离出白细胞。
在特定的实施方案中，可以使用未针对特定T细胞类型富集的大量T细胞群体。在特定的实施方案中，可以基于基于细胞标志物的阳性和/或阴性选择来富集和/或分离选定的T细胞类型。在阳性选择中，具有结合的细胞标志物的细胞被保留以供进一步使用。在阴性选择中，未被捕获剂(诸如细胞标志物的抗体)结合的细胞被保留以供进一步使用。在一些实例中，两个部分都可以被保留以供将来使用。
分离不必导致特定细胞群体或表达特定标志物的细胞的100％富集或去除。例如，特定类型细胞的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不必导致完全没有不表达标志物的细胞。同样，特定类型细胞的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不必导致所有这种细胞的完全去除。
在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的部分经受另一个分离步骤，诸如随后的阳性或阴性选择。
在一些实施方案中，细胞标志物的抗体或结合结构域结合到固体支持物或基质，诸如磁珠或顺磁性珠，以允许阳性和/或阴性选择的细胞分离。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术分离(separate/isolate)细胞和细胞群(综述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis Research Protocols,第2卷:CellBehavior In Vitro and In Vivo,第17-25页,S.A.Brooks and U.Schumacher
Figure BDA0003865811660000161
HumanaPress Inc.编辑,Totowa,NJ)；也参见美国专利US 4,452,773；US 4,795,698；US 5,200,084；和EP 452342。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是通过磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec,Auburn,CA)。MACS系统能够高纯度选择附着有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以一种模式运行，其中在施加外部磁场之后，非靶标和靶标物质被顺序洗脱。也就是说，附着在磁化颗粒上的细胞被保持在原位，而未附着的物质被洗脱。然后，在完成此第一洗脱步骤后，被捕获在磁场中并被阻止洗脱的物质以某种方式被释放，使得其可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，非靶标细胞被标记并从异源细胞群体中耗尽。
在一些实施方案中，通过流式细胞术收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群体，其中在液流中携带针对多种细胞表面标志物染色的细胞。在一些实施方案中，通过制备规模(FACS)分选来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群体。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群体(参见例如，WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355-376)。在这两种情况下，细胞可以用多种标志物进行标记，从而允许以高纯度分离明确的细胞亚群。
上文描述不同T细胞亚群的细胞标志物。在特定的实施方案中，通过阳性或阴性选择技术分离特定T细胞亚群，诸如对以下一种或多种表面标志物呈阳性或表达高水平的以下一种或多种表面标志物的细胞：例如CCR7、CD45RO、CD8、CD27、CD28、CD62L、CD127、CD4和/或CD45RA T细胞。
CD3+、CD28+T细胞可被阳性选择，并使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如
Figure BDA0003865811660000171
M-450 CD3/CD28 T细胞扩增器)进行扩增。
在特定的实施方案中，CD8+或CD4+选择步骤用于分离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。此类CD8+和CD4+群体可以通过对在一种或多种初始、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或表达程度相对较高的标志物进行阳性或阴性选择而进一步分类为亚群。在特定的实施方案中，分选细胞以获得1:1的CD8+与CD4+比率。
在一些实施方案中，对中央记忆T(TCM)细胞进行富集。在特定的实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L亚群中。PBMC可以诸如通过使用抗CD8和抗CD62L抗体富集或耗尽CD62L、CD8和/或CD62L+CD8+部分。
在一些实施方案中，中央记忆T(TCM)细胞的富集基于CCR7、CD45RO、CD27、CD62L、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，其基于对表达或高表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞，并对表达CCR7、CD45RO和/或CD62L的细胞进行阳性选择或富集来进行富集TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个方面，从基于CD4表达选择的阴性细胞部分开始进行富集中央记忆T(TCM)细胞，其经历了基于CD14和CD45RA表达的阴性选择和基于CD62L的阳性选择。在一些方面，此类选择是同时进行的，而在其他方面，这种选择是以任意顺序依次进行的。在一些方面，用于制备CD8+细胞群体或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+细胞群体或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性部分被保留，任选地在一个或多个其他的阳性或阴性选择步骤之后。
在一特定的实例中，使PBMC样品或其他白细胞样品经受CD4+细胞的选择，其中保留阴性和阳性部分。然后对阴性部分进行基于CD14和CD45RA或RORl表达的阴性选择，和基于中央记忆T细胞的标志物特征(诸如CCR7、CD45RO和/或CD62L)的阳性选择，其中阳性和阴性选择以任一顺序进行。
在特定的实施方案中，细胞富集产生大量CD8+FAC分选的细胞群体。
可以基于已知的标志物分布和技术富集其他细胞类型。例如，可以使用与磁性细胞分离器(例如
Figure BDA0003865811660000181
细胞分离系统(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany))连接的直接或间接缀合于磁性颗粒的抗CD34抗体来富集CD34+HSC、HSP和HSPC。
(III)遗传修饰细胞群体以表达嵌合抗原受体(CAR)和/或TNFα信号增强因子。细胞群体经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)和/或TNFα信号增强因子。
(III-A)基因工程化技术。本文公开的编码CAR和/或TNFα信号增强因子的所需基因可通过本领域已知的任何方法引入细胞，所述方法包括转染、电穿孔、显微注射、脂转染、磷酸钙介导的转染、用包括基因序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合、体内纳米颗粒介导的递送等。本领域已知许多用于将外源基因引入细胞的技术(参见例如，Loeffler和Behr,1993,Meth.Enzymol.217:599-618；Cohen等人1993,Meth.Enzymol.217:618-644；Cline,1985,Pharmac.Ther.29:69-92)并且可以使用，只要受体细胞的必要发育和生理功能没有被过度破坏即可。所述技术可提供基因向细胞的稳定转移，使得基因可由细胞表达，并且在某些情形中，优选可由其细胞后代遗传和表达。
术语“基因”指编码本文所述的CAR和/或TNFα信号增强因子的核酸序列(可与多核苷酸或核苷酸序列互换使用)。此定义包括各种序列多态性、突变和/或序列变体，其中此类改变基本上不影响编码的CAR和/或TNFα信号增强因子的功能。术语“基因”不仅包括编码序列，还包括调控区，诸如启动子、增强子和终止区。所述术语还可包括从mRNA转录物剪接的所有内含子和其他DNA序列，连同由可变剪接位点产生的变体。编码所述分子的基因序列可以是指导嵌合分子的表达的DNA或RNA。这些核酸序列可以是转录成RNA的DNA链序列或翻译成蛋白质的RNA序列。核酸序列包括全长核酸序列以及来源于全长蛋白质的非全长序列。所述序列还可以包括原始序列的简并密码子或可以被引入以在特定细胞类型中提供密码子偏好的序列。如本领域普通技术人员所理解，在整个公开内容中引用了完整基因序列的部分。
编码CAR和/或TNFα信号增强因子的基因序列在本文提供，并且也可以通过合成或重组方法从相关氨基酸序列和本文提供的其他描述中容易地制备。在实施方案中，编码任何这些序列的基因序列还可以在编码序列的5'和/或3'端具有一个或多个限制酶位点，以便提供对编码所述序列的基因序列的容易切除和用编码不同序列的另一基因序列对编码所述序列的基因序列进行替代。在实施方案中，可以对编码所述序列的基因序列进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。
“编码”是指基因中特定核苷酸序列的特性，诸如cDNA或mRNA，以用作合成其他大分子(诸如确定的氨基酸序列)的模板。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则所述基因编码蛋白质。“编码蛋白质的基因序列”包括所有彼此简并的核苷酸序列，其编码相同的氨基酸序列或形式和功能基本相似的氨基酸序列。
编码表达的CAR和/或TNFα信号增强子的超过一个部分的多核苷酸基因序列可以彼此可操作地连接并与相关的调控序列可操作地连接。例如，在调控序列与外源核酸序列之间可能存在功能性连接，从而引起后者的表达。对于另一个实例，当第一核酸序列被置于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列可以与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并且在必要或有帮助的情况下，将编码区接合到同一阅读框中。
在特定的实施方案中，启动子是NFAT启动子。NFAT启动子以Ca2+依赖性方式驱动可操作连接的编码序列的表达。在特定的实施方案中，NFAT启动子包括任意数量的结合基序，例如，一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或至多十二个结合基序。在特定的实施方案中，NFAT启动子包括四个至八个NFAT结合基序。
在本文所述的任何实施方案中，多核苷酸可包括编码自切割多肽的多核苷酸，其中编码自切割多肽的多核苷酸位于编码CAR构建体的多核苷酸与编码TNFα信号增强因子和/或转导标志物(例如，tEGFR)的多核苷酸之间。示例性的自切割多肽包括来自猪捷申病毒-1(porcine teschovirus-1)(P2A)、明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)(T2A)、马甲型鼻炎病毒(equine rhinitis A virus)(E2A)、手足口病毒(foot-and-mouth diseasevirus)(F2A)或其变体的2A肽(参见图11)。2A肽的其他示例性核酸和氨基酸序列示于例如Kim等人.(PLOS One6:e18556(2011)中。
“载体”是能够转运另一种核酸的核酸分子。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒或噬菌体。“表达载体”是指当其存在于适当的环境中时，能够指导由所述载体携带的一个或多个基因编码的蛋白质的表达的载体。
“慢病毒”是指能够感染分裂和非分裂细胞的逆转录病毒属。慢病毒的几个实例包括HIV(人类免疫缺陷病毒：包括HIV 1型和HIV 2型)；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
“逆转录病毒”是具有RNA基因组的病毒。“γ-逆转录病毒”是指逆转录病毒科的一个属。示例性的γ病毒包括小鼠干细胞病毒、鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮组织增生病毒。
可以使用逆转录病毒载体(参见Miller,等人,1993,Meth.Enzymol.217:581-599)。在此类实施方案中，将待表达的基因克隆到逆转录病毒载体中以用于将其递送到细胞中。在特定的实施方案中，逆转录病毒载体包括包装和整合病毒基因组所必需的所有顺式作用序列，即(a)载体各末端处的长末端重复序列(LTR)或其部分；(b)负链和正链DNA合成的引物结合位点；和(c)基因组RNA掺入病毒体所必需的包装信号。关于逆转录病毒载体的更多细节可以见于Boesen,等人,1994,Biotherapy 6:291-302；Clowes,等人,1994,J.Clin.Invest.93:644-651；Kiem,等人,1994,Blood 83:1467-1473；Salmons和Gunzberg,1993,Human Gene Therapy 4:129-141；以及Grossman和Wilson,1993,Curr.Opin.inGenetics and Devel.3:110-114。也可以使用腺病毒、腺相关病毒(AAV)和甲病毒(alphaviruse)。参见Kozarsky和Wilson,1993,Current Opinion in Genetics andDevelopment 3:499-503；Rosenfeld,等人,1991,Science 252:431-434；Rosenfeld,等人,1992,Cell 68:143-155；Mastrangeli,等人,1993,J.Clin.Invest.91:225-234；Walsh,等人,1993,Proc.Soc.Exp.Bioi.Med.204:289-300；以及Lundstrom,1999,J.Recept.SignalTransduct.Res.19:673-686。基因递送的其他方法包括使用哺乳动物人工染色体(Vos,1998,Curr.Op.Genet.Dev.8:351-359)；脂质体(Tarahovsky和Ivanitsky,1998,Biochemistry(Mosc)63:607-618)；核酶(Branch和Klotman,1998,Exp.Nephrol.6:78-83)；以及三链DNA(Chan和Glazer,1997,J.Mol.Med.75:267-282)。
存在大量适用于本公开的可用病毒载体，包括被鉴定用于人基因疗法应用的那些病毒载体(参见Pfeifer和Verma,2001,Ann.Rev.Genomics Hum.Genet.2:177)。使用逆转录病毒和慢病毒载体以及包装细胞以用于用包括CAR转基因的病毒颗粒转导哺乳动物宿主细胞的方法描述于例如US 8,119,772；Walchli,等人,2011,PLoS One6:327930；Zhao,等人,2005,J.Immunol.174:4415；Engels,等人,2003,Hum.Gene Ther.14:1155；Frecha,等人,2010,Mol.Ther.18:1748；以及Verhoeyen,等人,2009,Methods Mol.Biol.506:97中。逆转录病毒和慢病毒载体构建体和表达系统也是可商购的。
也可以利用靶向基因工程化方法来：(i)插入用于表达其活性应被增强的TNFRS家族成员的基因，和/或(ii)破坏待被抑制的TNFRS家族成员的活性。在特定的实施方案中，破坏这些家族成员的活性可以基于利用靶向基因工程化方法破坏其编码序列和/或表达。
CRISPR(成簇的规则间隔短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关蛋白)核酸酶系统是基于细菌系统的用于基因工程化的工程化核酸酶系统。关于CRISPR-Cas系统及其组分的信息描述于例如US8697359、US8771945、US8795965、US8865406、US8871445、US8889356、US8889418、US8895308、US8906616、US8932814、US8945839、US8993233和US8999641和与其相关的申请；以及WO2014/018423、WO2014/093595、WO2014/093622、WO2014/093635、WO2014/093655、WO2014/093661、WO2014/093694、WO2014/093701、WO2014/093709、WO2014/093712、WO2014/093718、WO2014/145599、WO2014/204723、WO2014/204724、WO2014/204725、WO2014/204726、WO2014/204727、WO2014/204728、WO2014/204729、WO2015/065964、WO2015/089351、WO2015/089354、WO2015/089364、WO2015/089419、WO2015/089427、WO2015/089462、WO2015/089465、WO2015/089473和WO2015/089486、WO2016205711、WO2017/106657、WO2017/127807和与其相关的申请中。
特定的实施方案利用锌指核酸酶(ZFN)作为基因编辑剂。ZFN是经工程化以在特定位置结合并切割DNA的一类位点特异性核酸酶。ZFN用于在DNA序列中的特定位点处引入双链断裂(DSB)，这使得ZFN能够靶向各种不同细胞中的基因组内的独特序列。
对于在本公开的教导中有用的关于ZFN和ZFN的额外信息，参见例如US 6,534,261；US 6,607,882；US 6,746,838；US 6,794,136；US 6,824,978；6,866,997；US 6,933,113；6,979,539；US 7,013,219；US 7,030,215；US 7,220,719；US 7,241,573；US 7,241,574；US 7,585,849；US 7,595,376；US 6,903,185；US 6,479,626；US 2003/0232410和US2009/0203140以及Gaj等人,Nat Methods,2012,9(8):805-7；Ramirez等人,Nucl AcidsRes,2012,40(12):5560-8；Kim等人,Genome Res,2012,22(7):1327-33；Urnov等人,NatureReviews Genetics,2010,11:636-646；Miller等人Nature biotechnology 25,778-785(2007)；Bibikova等人Science 300,764(2003)；Bibikova等人Genetics 161,1169-1175(2002)；Wolfe等人Annual review of biophysics and biomolecular structure 29,183-212(2000)；Kim等人Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 93,1156-1160(1996)；和Miller等人The EMBO journal 4,1609-1614(1985)。
特定的实施方案可以使用转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)作为基因编辑剂。TALEN指包括转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合蛋白和DNA切割结构域的融合蛋白。TALEN通过在DNA中诱导双DSB来编辑基因和基因组，这诱导细胞中的修复机制。通常，两个TALEN必须结合并位于靶DNA位点的两侧，以使DNA切割结构域二聚化并诱导DSB。关于TALEN的额外信息，参见US 8,440,431；US 8,440,432；US 8,450,471；US 8,586,363；和US 8,697,853；以及Joung和Sander,Nat Rev Mol Cell Biol,2013,14(l):49-55；Beurdeley等人,Nat Commun,2013,4:1762；Scharenberg等人,Curr Gene Ther,2013,13(4):291-303；Gaj等人,Nat Methods,2012,9(8):805-7；Miller等人Nature biotechnology 29,143-148(2011)；Christian等人Genetics 186,757-761(2010)；Boch等人Science 326,1509-1512(2009)；和Moscou和Bogdanove,Science 326,1501(2009)。
特定的实施方案可以利用MegaTAL作为基因编辑剂。MegaTAL具有sc稀有切割核酸酶结构，其中TALE与大范围核酸酶的DNA切割结构域融合。大范围核酸酶(也称为归巢核酸内切酶)是在同一结构域中同时具有DNA识别和核酸酶功能的单肽链。与TALEN相比，megaTAL只需要递送单个肽链来实现功能活性。
已经描述了导致靶细胞类型的选择性体内遗传修饰的纳米颗粒，并且可以在本公开的教导中使用。在特定的实施方案中，纳米颗粒可以是描述于WO2014153114、WO2017181110和WO201822672中的那些纳米颗粒。
(III-B)CAR亚组分。如前所述，CAR分子包括几个不同的亚组分，其允许遗传修饰的细胞识别和杀伤不需要的细胞，如癌细胞。所述亚组分包括至少细胞外组分和细胞内组分。细胞外组分包括特异性地结合优先存在于不需要的细胞表面上的抗原标志物的结合结构域。当结合结构域结合这些抗原标志物时，细胞内组分激活细胞以破坏所结合的细胞。CAR还包括连接细胞外组分与细胞内组分的跨膜结构域，以及可以增强CAR功能的其他亚组分。例如，包括间隔区和/或一个或多个接头序列可以允许CAR具有额外的构象灵活性，通常增加结合结构域结合靶细胞标志物的能力。
(III-B-i)结合结构域和靶向细胞抗原。结合结构域包括与细胞抗原结合以形成复合物的任何物质。结合结构域的选择可能取决于限定靶细胞表面的细胞抗原的类型和数目。结合结构域的实例包括细胞抗原配体、受体配体、抗体、肽、肽适体、受体(例如，T细胞受体)或其组合和工程化片段或形式。
抗体是结合结构域的一个实例，并且包括特异性地结合细胞抗员的完整抗体或抗体的结合片段，例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2和单链(sc)形式及其片段。抗体或抗原结合片段可以包括多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、非人抗体、重组抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、小型抗体(mini bodies)和线性抗体中的全部或一部分。其功能片段包含单结构域抗体，诸如骆驼科动物来源的纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH)等。
在一些情形中，scFv可以根据本领域已知的方法制备(参见例如，Bird等人,(1988)Science 242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。ScFv分子可以通过使用柔性多肽接头将抗体的VH区和VL区连接在一起而产生。如果使用短多肽接头(例如在5-10个氨基酸之间)，则阻止链内折叠。还需要链间折叠以使两个可变区一起形成功能性表位结合位点。关于接头取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448；US 2005/0100543；US 2005/0175606；US 2007/0014794；以及WO2006/020258和WO2007/024715。
scFv可以包含在其VL区和VH区之间的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个氨基酸残基的接头。在特定的实施方案中，接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。通常，用于连接scFv的VH和VL的接头序列为5个至35个氨基酸的长度。在特定的实施方案中，VH-VL接头包含5个至35个氨基酸、10个至30个氨基酸或15个至25个氨基酸。接头长度的变化可以保持或增强活性，在活性研究中产生优异的功效。
在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在特定的实施方案中，接头序列包含甘氨酸和丝氨酸重复序列的组，诸如一个至十个(GlyxSery)n重复序列，其中x和y独立地为0至10的整数，条件是x和y不都是0，并且其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数)，并且其中连接的VH-VL区形成功能性免疫球蛋白样结合结构域(例如，scFv、scTCR)。特定的实例的包括(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:1)、(Gly3Ser)n(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:2)、(Gly3Ser)n(Gly2Ser)n(SEQ ID NO:3)、(Gly3Ser)n(Gly4Ser)1(SEQ ID NO:4)、(Gly4Ser)1(SEQ ID NO:5)、(Gly3Ser)1(SEQ ID NO:6)或(Gly2Ser)1。在特定的实施方案中，接头是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:7)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:8)。如上文参考scTCR所述，此类接头也可以用于连接T细胞受体Vα/β和Cα/β链(例如，Vα-Cα、Vβ-Cβ、Vα-Vβ)。
另外的实例包括基于scFv的抓捕抗体(grababody)和可溶性VH结构域抗体。这些抗体仅使用重链可变区形成结合区域。参见例如Jespers等人,Nat.Biotechnol.22:1161,2004；Cortez-Retamozo等人,Cancer Res.64:2853,2004；Baral等人,Nature Med.12:580,2006；以及Barthelemy等人,J.Biol.Chem.283:3639,2008。
在一些情形中，有利的是结合结构域来源于其最终将用于的相同物种。例如，对于用于人，抗原结合结构域包含人抗体、人源化抗体或其片段或工程化形式可能是有益的。与非人抗体相比，来自人起源的抗体或人源化抗体在人体内具有降低的免疫原性或没有免疫原性，并且具有较低数量的非免疫原性表位。抗体及其工程化片段通常将被选择为在人受试者中具有降低的水平或无抗原性。
在特定的实施方案中，结合结构域包含人源化抗体或其工程化片段。在一些方面，非人抗体是人源化的，其中抗体的一个或多个氨基酸残基被修饰以增加与在人中天然产生的抗体或其片段的相似性。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。如本文所提供的，人源化抗体或抗体片段包含来自非人免疫球蛋白分子的一个或多个CDR和框架区，其中包括框架的氨基酸残基完全或大部分来源于人种系。在一个方面，抗原结合结构域是人源化的。人源化抗体可以使用本领域已知的多种技术来产生，所述技术包括CDR-移植(参见例如欧洲专利第EP 239,400号；WO 91/09967；以及US 5,225,539、US 5,530,101和US 5,585,089)、镶面或表面重修(参见例如EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering,7(6):805-814；和Roguska等人,1994,PNAS,91:969-973)；链改组(参见例如US.5,565,332)；以及在例如US 2005/0042664；US2005/0048617；US 6,407,213；US 5,766,886；WO 9317105；Tan等人,J.Immunol.,169:1119-25(2002)；Caldas等人,Protein Eng.,13(5):353-60(2000)；Morea等人,Methods,20(3):267-79(2000)；Baca等人,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)；Roguska等人,Protein Eng.,9(10):895-904(1996)；Couto等人,Cancer Res.,55(23增刊):5973s-5977s(1995)；Couto等人,CancerRes.,55(8):1717-22(1995)；Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)；和Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)中所公开的技术。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的对应残基取代，以改变(例如改善)细胞抗原结合。这些框架取代通过本领域熟知的方法鉴定，例如，通过模拟CDR和框架残基的相互作用来鉴定对于细胞抗原结合重要的框架残基以及通过序列比较来鉴定在特定位置的不寻常框架残基。(参见例如，US 5,585,089；和Riechmann等人,1988,Nature,332:323)。
可以使用如本领域的普通技术人员已知的获得单克隆抗体的方法、噬菌体展示的方法、产生人抗体或人源化抗体的方法或使用经工程化以产生抗体的转基因动物或植物的方法来制备特异性地结合特定细胞抗原的抗体(参见例如，US 6,291,161和US 6,291,158)。部分或完全合成的抗体的噬菌体展示文库是可获得的，并且可以筛选出能结合细胞抗原的抗体或其片段。例如，可以通过筛选Fab噬菌体文库中与感兴趣的细胞抗原特异性地结合的Fab片段来鉴定结合结构域(参见Hoet等人,Nat.Biotechnol.23:344,2005)。人抗体的噬菌体展示文库也是可用的。另外，在方便的系统(例如，小鼠(HuMAb
Figure BDA0003865811660000281
(GenPharm Int’l.Inc.,Mountain View,CA)、TC
Figure BDA0003865811660000282
(Kirin Pharma Co.Ltd.,Tokyo,JP)、
Figure BDA0003865811660000283
(Medarex,Inc.,Princeton,NJ))、羊驼、鸡、大鼠、仓鼠、兔等)中使用感兴趣的细胞抗原作为免疫原进行杂交瘤开发的传统策略可以用于开发结合结构域。在特定的实施方案中，抗体特异性地结合优先由特定不需要的细胞类型表达的细胞抗原，并且不与非特异性组分或不相关靶标交叉反应。一旦鉴定，可以分离和/或确定抗体的氨基酸序列和编码所述抗体的基因序列。
结合结构域的替代性来源包括编码随机肽文库的序列或编码替代性非抗体支架的环区中的工程化多样性氨基酸的序列，诸如scTCR(参见例如，Lake等人,Int.Immunol.11:745,1999；Maynard等人,J.Immunol.Methods 306:51,2005；US 8,361,794)、纤维蛋白原结构域(参见例如，Weisel等人,Science 230:1388,1985)、Kunitz结构域(参见例如，US 6,423,498)、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin；Binz等人,J.Mol.Biol.332:489,2003和Binz等人,Nat.Biotechnol.22:575,2004)、纤连蛋白结合结构域(纤连蛋白(adnectin)或单抗体(monobody)；Richards等人,J.Mol.Biol.326:1475,2003；Parker等人,Protein Eng.Des.Selec.18:435,2005和Hackel等人(2008)J.Mol.Biol.381:1238-1252)、半胱氨酸结小蛋白(Vita等人,1995,Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)92:6404-6408；Martin等人,2002,Nat.Biotechnol.21:71,2002和Huang等人(2005)Structure 13:755,2005)、三角形四肽重复结构域(Main等人,Structure 11:497,2003和Cortajarena等人,ACS Chem.Biol.3:161,2008)、富含亮氨酸的重复结构域(Stumpp等人,J.Mol.Biol.332:471,2003)、脂质运载蛋白结构域(参见例如，WO 2006/095164；Beste等人,Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)96:1898,1999和
Figure BDA0003865811660000291
等人,Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)106:8198,2009)、V样结构域(参见例如，US2007/0065431)、C型凝集素结构域(Zelensky和Gready,FEBS J.272:6179,2005；Beavil等人,Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)89:753,1992和Sato等人,Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)100:7779,2003)、具有抗原结合结构域的mAb2区或Fc区(FcabTM(F-Star Biotechnology,Cambridge UK；参见例如WO 2007/098934和WO 2006/072620)、犰狳重复蛋白(参见例如，Madhurantakam等人,Protein Sci.21:1015,2012；WO2009/040338)、亲和素(affilin)(Ebersbach等人,J.Mol.Biol.372:172,2007)、亲和体(affibody)、亲和多聚体(avimer)、扭结菌素(knottin)、fynomer、atrimer、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(Weidle等人,Cancer Gen.Proteo.10:155,2013)或类似物(Nord等人,Protein Eng.8:601,1995；Nord等人,Nat.Biotechnol.15:772,1997；Nord等人,Euro.J.Biochem.268:4269,2001；Binz等人,Nat.Biotechnol.23:1257,2005；Boersma和Plückthun,Curr.Opin.Biotechnol.22:849,2011)。
肽适体包括在两个末端与蛋白质支架附接的肽环(其对细胞抗原具有特异性)。这种双重结构限制将肽适体的结合亲和力增加至与抗体相当的水平。可变环长度通常为8至20个氨基酸，并且支架可以是稳定、可溶、小且无毒的任何蛋白质。可以使用不同的系统(诸如酵母双杂交系统(例如Gal4酵母双杂交系统)或LexA相互作用捕获系统)进行肽适体选择。
在特定的实施方案中，结合结构域是sc T细胞受体(scTCR)，其包括Vα/β和Cα/β链(例如，Vα-Cα、Vβ-Cβ、Vα-Vβ)或包括对感兴趣的细胞抗原(例如，肽-MHC复合物)具有特异性的Vα-Cα、Vβ-Cβ、Vα-Vβ对。
在特定的实施方案中，工程化CAR包括与已知或鉴定的TCR Vα、Vβ、Cα或Cβ的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列，其中每个CDR包括来自与靶向细胞抗原特异性地结合的TCR或其片段或衍生物相比的零个变化或至多一个、两个或三个变化。
在特定的实施方案中，工程化CAR包括来源于或基于已知或鉴定的TCR(例如，高亲和力TCR)的Vα、Vβ、Cα或Cβ的Vα、Vβ、Cα或Cβ区，并且当与已知或鉴定的TCR的Vα、Vβ、Cα或Cβ相比时包含一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)插入、一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)缺失、一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)或上述变化的组合。插入、缺失或取代可以是在Vα、Vβ、Cα或Cβ区中的任何位置，包括在这些区域的氨基末端或羧基末端或两个末端，条件是每个CDR包含零个变化或至多一个、两个或三个变化并且提供含有经修饰的Vα、Vβ、Cα或Cβ区的靶结合结构域，所述靶结合结构域仍然可以以与野生型类似的亲和力和作用力特异性地结合其靶标。
可以选择结合结构域来结合与不需要的细胞类型相关的许多细胞抗原，例如癌细胞标志物。示例性的细胞抗原包括A33；BAGE；Bcl-2；β-连环蛋白；BCMA；B7H4；BTLA；CA125；CA19-9；CD3；CD5；CD20；CD21；CD22；CD25；CD28；CD30；CD33；CD37；CD38；CD40；CD52；CD44v6；CD45；CD56；CD79b；CD80；CD81；CD86；CD123；CD134；CD137；CD151；CD171；CD276；CEA；CEACAM6；c-Met；CS-1；CTLA-4；细胞周期蛋白B1；DAGE；EBNA；EGFR；EGFRvIII；肝配蛋白B2；ErbB2；ErbB3；ErbB4；EphA2；雌激素受体；FAP；铁蛋白；甲胎蛋白(AFP)；FLT1；FLT4；叶酸结合蛋白；FOLR；Frizzled；GAGE；G250；GD-2；GHRHR；GHR；GITR；GM2；GPRC5D；gp75；gp100(Pmel17)；gp130；HLA；HER-2/neu；HPV E6；HPV E7；hTERT；HVEM；IGF1R；IL6R；KDR；Ki-67；LewisA；Lewis Y；LIFRβ；LRP；LRP5；LTβR；MAGE；MART；间皮素(mesothelin)；MUC；MUC1；MUM-1-B；myc；NYESO-1；O-乙酰基GD-2；O-乙酰基GD3；OSMRβ；p53；PD1；PD-L1；PD-L2；PRAME；孕酮受体；PSA；PSMA；PTCH1；RANK；ras；Robo1；RORl；存活蛋白(survivin)；TCRα；TCRβ；肌腱蛋白(tenascin)；TGFBR1；TGFBR2；TLR7；TLR9；TNFR1；TNFR2；TNFRSF4；TWEAK-R；TSTA酪氨酸酶；VEGF；和WT1。
与前列腺癌相关的特定细胞抗原包括PSMA、WT1、前列腺干细胞抗原(PSCA)和SV40T。与乳腺癌相关的特定细胞抗原包括HER2和ERBB2。与卵巢癌相关的特定细胞抗原包括L1-CAM、MUC16的细胞外结构域(MUC-CD)、叶酸结合蛋白(叶酸受体)、Lewis Y、间皮素和WT-1。与胰腺癌相关的特定细胞抗原包括间皮素、CEA和CD24。与多发性骨髓瘤相关的特定细胞抗原包括BCMA、GPRC5D、CD38和CS-1。与白血病和/或淋巴瘤相关的特定抗原包括CLL-1、CD123、CD33和PD-L1。
在特定的实施方案中，CAR的结合结构域可以结合CD33。在特定的实施方案中，CAR的结合结构域结合细胞抗原CD33。在特定的实施方案中，结合CD33的结合结构域来源于吉妥珠单抗(gemtuzumab)、阿昔利珠单抗(aclizumab)或HuM195中的一种。在特定的实施方案中，CD33结合结构域是包括可变轻链和可变重链的人或人源化结合结构域，所述可变轻链包括包含TASSSVNYIH(SEQ ID NO:14)的CDRL1序列、包含TSKVAS(SEQ ID NO:15)的CDRL2序列和包含QQWRSYPLT(SEQ ID NO:16)的CDRL3序列，并且所述可变重链包括包含DYVVH(SEQID NO:17)的CDRH1序列、包含YINPYNDGTKYNEKFKG(SEQ ID NO:18)的CDRH2序列和包含DYRYEVYGMDY(SEQ ID NO:19)的CDRH3序列。
在特定的实施方案中，CD33结合结构域是包括可变轻链和可变重链的人或人源化scFv，所述可变轻链包括包含RASEVDNYGISFMN(SEQ ID NO:20)的CDRL1序列、包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的CDRL2序列和包含QQSKEVPW(SEQ ID NO:22)的CDRL3序列，并且所述可变重链包括包含DYNMH(SEQ ID NO:23)的CDRH1序列、包含YIYPYNGGTGYNQKFKS(SEQ ID NO:24)的CDRH2序列和包含GRPAMDY(SEQ ID NO:25)的CDRH3序列。关于结合CD33的结合结构域的更多信息，参见美国专利第8759494号。
在特定的实施方案中，结合人CD33的序列包括可变轻链，所述可变轻链包含序列：
DIVLTQSPTIMSASPGERVTMTCTASSSVNYIHWYQQKSGDSPKRWIFDTSKVASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWRSYPLTFGDGTRLELKRADAAPTVS(SEQ ID NO:26，和可变重链，所述可变重链包含序列：
EVKLQESGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTDYVVHWLKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEVSSLTSEDSAVYYCARDYRYEVYGMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:27)。
在特定的实施方案中，结合人CD33的序列包括可变轻链，所述可变轻链包含序列：
DIVLTQSPTIMSASPGERVTMTCTASSSVNYIHWYQQKSGDSPKRWIFDTSKVASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWRSYPLTFGDGTRLELKRADAAPTVS(SEQ ID NO:26)，和可变重链，所述可变重链包含序列：
DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSANSSVSYIHWYQQKSGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWTSHPLTFGTGTKLQLKRADAAPTVS(SEQ ID NO:28)。
在特定的实施方案中，CAR的结合结构域结合细胞抗原CD33DeltaE2(CD33ΔE2)。在特定的实施方案中，结合CD33ΔE2的结合结构域来源于1H7。在特定的实施方案中，1H7结合结构域包括可变轻链，所述可变轻链包括包含RASQDINYYLN(SEQ ID NO:45)的CDRL1序列、包含YYSSRLHS(SEQ ID NO:46)的CDRL2序列、包含QQDDALPYT(SEQ ID NO:47)的CDRL3序列、包含KASGYAFSNYWMN(SEQ ID NO:48)的CDRH1序列、包含QINPGDGDTN(SEQ ID NO:49)的CDRH2序列和包含AREDRDYFDY(SEQ ID NO:50)的CDRH3序列。此CDR组是根据North。
在特定的实施方案中，1H7结合结构域包括可变轻链，所述可变轻链包括包含QDINYY(SEQ ID NO:163)的CDRL1序列、包含YSS的CDRL2序列、包含QQDDALPYT(SEQ ID NO:47)的CDRL3序列、包含GYAFSNYW(SEQ ID NO:164)的CDRH1序列、包含INPGDGDT(SEQ ID NO:165)的CDRH2序列和包含AREDRDYFDY(SEQ ID NO:50)的CDRH3序列。此CDR组是根据IMGT。
在特定的实施方案中，1H7结合结构域包括可变轻链，所述可变轻链包括包含RASQDINYYLN(SEQ ID NO:45)的CDRL1序列、包含YSSRLHS(SEQ ID NO:166)的CDRL2序列、包含QQDDALPYT(SEQ ID NO:47)的CDRL3序列、包含NYWMN(SEQ ID NO:167)的CDRH1序列、包含QINPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO:168)的CDRH2序列和包含EDRDYFDY(SEQ ID NO:169)的CDRH3序列。此CDR组是根据Kabat。
在特定的实施方案中，1H7结合结构域包括可变轻链，所述可变轻链包括包含RASQDINYYLN(SEQ ID NO:45)的CDRL1序列、包含YSSRLHS(SEQ ID NO:166)的CDRL2序列、包含QQDDALPYT(SEQ ID NO:47)的CDRL3序列、包含GYAFSNY(SEQ ID NO:170)的CDRH1序列、包含NPGDGD(SEQ ID NO:171)的CDRH2序列和包含EDRDYFDY(SEQ ID NO:169)的CDRH3序列。此CDR组是根据Chothia。
在特定的实施方案中，1H7结合结构域包括可变轻链，所述可变轻链包含序列：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDINYYLNWYQQKPDGTVKLLIYYSSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEQEDIATYFCQQDDALPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:51)，和可变重链，所述可变重链包含序列：
QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFSNYWMNWVKQRPGKGLEWIGQINPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREDRDYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:52)。
在特定的实施方案中，CAR的结合结构域结合细胞抗原Her2。在特定的实施方案中，结合HER2的结合结构域来源于曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀(Herceptin))。在特定的实施方案中，结合结构域包括可变轻链和可变重链，所述可变轻链包括包含KASQDVSIGVA(SEQ ID NO:53)的CDRL1序列、包含ASYRYT(SEQ ID NO:54)的CDRL2序列和包含QQYYIYPYT(SEQ ID NO:55)的CDRL3序列，并且所述可变重链包括包含GFTFTDYTMD(SEQID NO:56)的CDRH1序列、包含DVNPNSGGSIYNQRFK(SEQ ID NO:57)的CDRH2序列和包含LGPSFYFDY(SEQ ID NO:58)的CDRH3序列。
在特定的实施方案中，CAR的结合结构域结合细胞抗原PD-L1。在特定的实施方案中，结合PD-L1的结合结构域来源于帕博利珠单抗或FAZ053(诺华(Novartis))中的至少一种。在特定的实施方案中，结合结构域包括可变轻链和可变重链，所述可变轻链包括包含RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:59)的CDRL1序列、包含LASYLES(SEQ ID NO:60)的CDRL2序列和包含QHSRDLPLT(SEQ ID NO:61)的CDRL3序列，并且所述可变重链包括包含NYYMY(SEQ IDNO:62)的CDRH1序列、包含GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:63)的CDRH2序列和包含RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:64)的CDRH3序列。
PD-L1的示例性结合结构域可以包括或来源于阿维鲁单抗(Avelumab)或阿特珠单抗(Atezolizumab)。在特定的实施方案中，阿维鲁单抗的可变轻链包含：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:65)。
在特定的实施方案中，阿维鲁单抗的可变重链包含：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:66)。
在特定的实施方案中，阿维鲁单抗的CDR区包括：CDRL1：TGTSSDVGGYNYVS(SEQ IDNO:67)；CDRL2：DVSNRPS(SEQ ID NO:68)；CDRL3：SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:69)；CDRH1：SGFTFSSYIMM(SEQ ID NO:70)；CDRH2：SIYPSGGITFYADTVKG(SEQ ID NO:71)；和CDRH3：IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:72)。
在特定的实施方案中，阿特珠单抗的可变轻链包含：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:73)。
在特定的实施方案中，阿特珠单抗的可变重链包含：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:74)。
在特定的实施方案中，阿特珠单抗的CDR区包括：CDRL1：RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:75)；CDRL2：SASFLYS(SEQ ID NO:76)；CDRL3：QQYLYHPAT(SEQ ID NO:77)；CDRH1：SGFTFSDSWIH(SEQ ID NO:78)；CDRH2：WISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:79)；和CDRH3：RHWPGGFDY(SEQ ID NO:80)。
在特定的实施方案中，CAR的结合结构域结合细胞抗原PSMA。在特定的实施方案中，结合结构域包括可变轻链，所述可变轻链包括包含KASQDVGTAVD(SEQ ID NO:81)的CDRL1序列、包含WASTRHT(SEQ ID NO:82)的CDRL2序列、包含QQYNSYPLT(SEQ ID NO:83)的CDRL3序列。在特定的实施方案中，结合结构域包括可变重链，所述可变重链包括包含GYTFTEYTIH(SEQ ID NO:84)的CDRH1序列、包含NINPNNGGTTYNQKFED(SEQ ID NO:85)的CDRH2序列和包含GWNFDY(SEQ ID NO:86)的CDRH3序列。
间皮素的示例性结合结构域可以包括或来源于阿麦妥单抗(Amatuximab)。
在特定的实施方案中，阿麦妥单抗的可变轻链包含：
DIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:98)。
在特定的实施方案中，阿麦妥单抗的可变重链包含：
QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSS(SEQ ID NO:99)。
在特定的实施方案中，阿麦妥单抗的CDR区包括：
CDRL1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO:100)；CDRL2：DTSKLAS(SEQ ID NO:101)；和CDRL3:QQWSKHPLT(SEQ ID NO:102)；CDRH1：GYSFTGYTMN(SEQ ID NO:103)；CDRH2：LITPYNGASSYNQ(SEQ ID NO:104)；和CDRH3：GGYDGRGFDY(SEQ ID NO:105)。
如前所述，结合结构域可以采用多种工程化形式，包括例如Fab片段、scFv、基于scFv的抓捕抗体和可溶性VH结构域抗体。
在特定的实施方案中，CAR的结合结构域包含或是与轻链可变区(VL)或重链可变区(VH)或两者的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列，其中每个CDR包含和与感兴趣的细胞抗原特异性地结合的单克隆抗体或其片段或衍生物相比的零个变化或至多一个、两个或三个变化。
在特定的实施方案中，当与已知单克隆抗体的VH相比时，本公开的结合结构域VH区可以来源于或基于已知单克隆抗体的VH，并且可以含有一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)插入、一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)缺失、一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)、或上述变化的组合。插入、缺失或取代可以是在VH区中的任何地方，包括在所述区域的氨基末端或羧基末端或两个末端，条件是每个CDR包含零个变化或至多一个、两个或三个变化，并且条件是含有经修饰的VH区的结合结构域仍然可以以类似于野生型结合结构域的亲和力特异性地结合其靶标。
在特定的实施方案中，当与已知单克隆抗体的VL相比时，本公开的结合结构域中的VL区来源于或基于已知单克隆抗体的VL并且含有一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)插入、一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)缺失、一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)或上述变化的组合。插入、缺失或取代可以是在VL区中的任何地方，包括在所述区域的氨基末端或羧基末端或两个末端，条件是每个CDR包含零个变化或至多一个、两个或三个变化，并且条件是含有经修饰的VL区的结合结构域仍然可以以类似于野生型结合结构域的亲和力特异性地结合其靶标。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，所述方案包括由以下文献中描述的那些方案：Kabat等人(1991)"Sequences ofProteins of Immunological Interest,"第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(Kabat编号方案)；Al-Lazikani等人(1997)J MolBiol 273:927-948(Chothia编号方案)；Maccallum等人(1996)J Mol Biol 262:732-745(Contact编号方案)；Martin等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.,86:9268-9272(AbM编号方案)；Lefranc M P等人(2003)Dev Comp Immunol 27(1):55-77(IMGT编号方案)；以及Honegger和Pluckthun(2001)J Mol Biol 309(3):657-670("Aho"编号方案)。给定CDR或FR的边界可根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案两者的编号均是基于最常见的抗体区域序列长度，并通过插入字母(例如“30a”)调节插入，并且一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。在特定实施方案中，本文公开的抗体CDR序列是根据Kabat编号。
(III-B-ii)间隔区。间隔区用于产生距其他CAR亚组分适当的距离和/或灵活性。如上所述，在特定的实施方案中，间隔区的长度是定制的，以用于结合特定的细胞抗原和介导破坏。在特定的实施方案中，可以基于细胞抗原表位的位置、结合结构域对表位的亲和力和/或靶向剂在与细胞抗原结合后介导细胞破坏的能力来选择间隔区长度。
间隔区通常包括具有10个至250个氨基酸、10个至200个氨基酸、10个至150个氨基酸、10个至100个氨基酸、10个至50个氨基酸或10个至25个氨基酸的那些间隔区。
在特定的实施方案中，间隔区是5个氨基酸、8个氨基酸、10个氨基酸、12个氨基酸、14个氨基酸、20个氨基酸、21个氨基酸、26个氨基酸、27个氨基酸、45个氨基酸或50个氨基酸。这些长度符合短间隔区的条件。
在特定的实施方案中，间隔区是100个氨基酸、110个氨基酸、120个氨基酸、125个氨基酸、128个氨基酸、131个氨基酸、135个氨基酸、140个氨基酸、150个氨基酸、160个氨基酸或170个氨基酸。这些长度符合中等间隔区的条件。
长间隔区有超过170个氨基酸。
示例性的间隔区包括免疫球蛋白铰链区的全部或一部分。免疫球蛋白铰链区可以是野生型免疫球蛋白铰链区或改变的野生型免疫球蛋白铰链区。在某些实施方案中，免疫球蛋白铰链区是人免疫球蛋白铰链区。如本文所用，“野生型免疫球蛋白铰链区”是指插入在抗体重链中发现的CH1和CH2结构域(对于IgG、IgA和IgD)之间并连接二者或插入在CH1和CH3结构域(对于IgE和IgM)之间并连接二者的天然存在的上部和中部铰链氨基酸序列。
免疫球蛋白铰链区可以是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM铰链区。IgG铰链区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区。来自IgG1、IgG2、lgG3、lgG4或IgD的序列可以单独使用或与CH2区的全部或部分；CH3区的全部或一部分；或CH2区的全部或一部分和CH3区的全部或一部分组合使用。
在特定的实施方案中，间隔区是包括IgG4铰链区的短间隔区。在特定的实施方案中，短间隔区是SEQ ID NO:129或由SEQ ID NO:130编码的序列。在特定的实施方案中，间隔区是包括IgG4铰链区和IgG4铰链CH3区的中等间隔区。在特定的实施方案中，中等间隔区由SEQ ID NO:131编码。在特定的实施方案中，间隔区是长间隔区，包括IgG4铰链区、IgG4 CH3区和IgG4 CH2区。在特定的实施方案中，长间隔区由SEQ ID NO:132编码。
可以使用本文所述的CAR的铰链区的其他实例包括在1型膜蛋白(诸如CD8α、CD4、CD28和CD7)的胞外区中存在的铰链区，其可以是野生型或其变体。
在特定的实施方案中，间隔区包括包含II型C凝集素结构域间(茎)区或分化簇(CD)分子茎区的铰链区。II型C凝集素或CD分子的“茎区”是指位于C型凝集素样结构域(CTLD；例如，类似于天然杀伤细胞受体的CTLD)和疏水部分(跨膜结构域)之间的II型C凝集素或CD分子的细胞外结构域部分。例如，人CD94的细胞外结构域(GenBank登录号AAC50291.1)对应于氨基酸残基34-179，但CTLD对应于氨基酸残基61-176，因此人CD94分子的茎区包括氨基酸残基34-60，其位于疏水部分(跨膜结构域)和CTLD之间(参见Boyington等人,Immunity 10:15,1999；关于其他茎区的描述，还参见Beavil等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 89:153,1992；以及Figdor等人,Nat.Rev.Immunol.2:11,2002)。这些II型C凝集素或CD分子还可以具有在茎区和跨膜区或CTLD之间的接点氨基酸(如下所述)。在另一个实例中，233个氨基酸的人NKG2A蛋白(GenBank登录号P26715.1)具有氨基酸71-93范围内的疏水部分(跨膜结构域)和氨基酸94-233范围内的细胞外结构域。CTLD包含氨基酸119-231，并且茎区包含氨基酸99-116，其侧翼可以为另外的接点氨基酸。其他II型C凝集素或CD分子以及它们的细胞外配体结合结构域、茎区和CTLD是本领域已知的(关于人CD23、CD69、CD72、NKG2A和NKG2D的序列及它们的描述，分别参见例如GenBank登录号NP 001993.2；AAH07037.1；NP001773.1；AAL65234.1；CAA04925.1)。
(III-B-iii)跨膜结构域。如所指示，CAR内的跨膜结构域用于通过细胞膜连接细胞外组分和细胞内组分。跨膜结构域可以将所表达的分子锚定在经修饰细胞的膜中。
跨膜结构域可以来源于天然来源和/或合成来源。当来源是天然来源时，跨膜结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜结构域可以包含至少T细胞受体CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22；CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154的α、β或ζ链的跨膜区。在特定的实施方案中，跨膜结构域可以包括至少例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD 11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D或NKG2C的跨膜区。在特定的实施方案中，也可以使用多种人铰链，包括人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链、IgD铰链)、GS接头(例如本文所述的GS接头)、KIR2DS2铰链或CD8a铰链。
在特定的实施方案中，跨膜结构域具有在细胞膜中热力学稳定的三维结构，并且通常长度在15至30个氨基酸的范围内。跨膜结构域的结构可以包括α螺旋、β折叠桶(βbarrel)、β折叠片(βsheet)、β螺旋或其任何组合。
跨膜结构域可以包含与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如在CAR的胞外区内的一个或多个氨基酸(例如胞外区的至多15个氨基酸)和/或在CAR的胞内区内的一个或多个另外的氨基酸(例如细胞内组分的至多15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域来自与信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域所来源的相同的蛋白质。在另一个方面，跨膜结构域不是来源于CAR的任何其他结构域所来源的相同蛋白质。在一些情形中，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其他非预期成员的相互作用最小化。在特定的实施方案中，跨膜结构域由编码CD28跨膜结构域的核酸序列(SEQ ID NO:133-136)编码。在特定的实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:137和138)。
(III-B-iv)细胞内效应结构域。CAR的细胞内效应结构域负责表达CAR的细胞的激活。因此，术语“效应结构域”是指包括足以转导激活信号的细胞内结构域的任何部分。当接收到适当的信号时，效应结构域可以直接或间接促进细胞中的生物或生理反应。在某些实施方案中，效应结构域是结合时接收信号的蛋白质或蛋白质复合物的一部分，或其直接与靶分子结合，这会触发来自效应结构域的信号。当效应结构域含有一个或多个信号传导结构域或基序，诸如基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)时，效应结构域可以直接促进细胞应答。在其他实施方案中，效应结构域将通过与一种或多种直接促进细胞应答的其他蛋白质(诸如共刺激结构域)缔合而间接促进细胞应答。
效应结构域可以在与由癌细胞表达的细胞抗原结合时激活经修饰的细胞的至少一种功能。经修饰的细胞的激活可以包括分化、增殖和/或激活或其他效应功能中的一种或多种。在特定的实施方案中，效应结构域可以包含包括T细胞受体和共刺激结构域的细胞内信号传导组分，其可以包括来自共受体或共刺激分子的细胞质序列。
效应结构域可以包含一个、两个、三个或更多个细胞内信号传导组分(例如，受体信号传导结构域、细胞质信号传导序列)、共刺激结构域或其组合。示例性效应结构域包括选自以下的信号传导和刺激结构域：4-1BB(CD137)、CARD11、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD27、CD28、CD79A、CD79B、DAP10、FcRα、FcRβ(FcεR1b)、FcRγ、Fyn、HVEM(LIGHTR)、ICOS、LAG3、LAT、Lck、LRP、NKG2D、NOTCH1、pTα、PTCH2、OX40、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、TCRα、TCRβ、TRIM、Wnt、Zap70或其任何组合。在特定的实施方案中，示例性效应结构域包括选自以下的信号传导和共刺激结构域：CD86、FcγRIIa、DAP12、CD30、CD40、PD-1、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性地结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、GADS、PAG/Cbp、NKp44、NKp30或NKp46。
以刺激方式起作用的细胞内信号传导组分序列可以包括iTAM。包含初级细胞质信号传导序列的iTAM的实例包括来源于CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD66d、CD79a、CD79b、以及常见的FcRγ(FCER1G)、FcγRlla、FcRβ(FcεRib)、DAP10和DAP12的那些。在特定的实施方案中，CD3ζ的变体保留了至少一个、两个、三个或全部ITAM区。
在特定的实施方案中，效应结构域包括与细胞质信号传导蛋白缔合的细胞质部分，其中细胞质信号传导蛋白是淋巴细胞受体或其信号传导结构域、包括多个ITAM的蛋白质、共刺激结构域或其任何组合。
细胞内信号传导组分的另外的实例包括CD3ζ链的细胞质序列、和/或在结合结构域接合后共同起作用以启动信号转导的共同受体。
共刺激结构域是其激活可能是对细胞抗原结合的有效淋巴细胞应答所必需的结构域。一些分子可互换作为细胞内信号传导组分或共刺激结构域。共刺激结构域的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD 137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性地结合的配体。例如，CD27共刺激已被证明在体外增强人CART细胞的扩增、效应功能和存活，并且在体内增强人T细胞持久性和抗癌活性(Song等人Blood.2012；119(3):696-706)。此类共刺激结构域分子的另外实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDlld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDlla、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDllc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉的)、NKG2D、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp和CD19a。
在特定的实施方案中，编码细胞内信号传导组分的核酸序列包括CD3z编码序列(SEQ ID NO:139-141)和4-1BB信号传导编码序列的变体(SEQ ID NO:144-146)。在特定的实施方案中，细胞内信号传导组分的氨基酸序列包括CD3ζ的变体(SEQ ID NO:142和143)和4-1BB细胞内信号传导组分的一部分(SEQ ID NO:147和148)。
在特定的实施方案中，细胞内信号传导组分包括(i)CD3ζ的信号传导结构域的全部或一部分，(ii)4-1BB的信号传导结构域的全部或一部分，或(iii)CD3ζ和4-1BB的信号传导结构域的全部或一部分。在特定的实施方案中，细胞内信号传导组分包括(i)CD3ζ的信号传导结构域的全部或一部分，(ii)4-1BB的信号传导结构域的全部或一部分，(iii)CD28的信号传导结构域的全部或一部分，(iv)CD3ζ、4-1BB和CD28的信号传导结构域的全部或一部分。
细胞内组分还可以包括以下项的一种或多种蛋白质：Wnt信号传导途径(例如，LRP、Ryk或ROR2)、NOTCH信号传导途径(例如，NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3或NOTCH4)、Hedgehog信号传导途径(例如，PTCH或SMO)、受体酪氨酸激酶(RTK)(例如，表皮生长因子(EGF)受体家族、成纤维细胞生长因子(FGF)受体家族、肝细胞生长因子(HGF)受体家族、胰岛素受体(IR)家族、血小板衍生生长因子(PDGF)受体家族、血管内皮生长因子(VEGF)受体家族、原肌球蛋白受体激酶(tropomycin receptor kinase，Trk)受体家族、肝配蛋白(Eph)受体家族、AXL受体家族、白细胞酪氨酸激酶(LTK)受体家族、具有免疫球蛋白样和EGF样结构域1的酪氨酸激酶(TIE)受体家族、受体酪氨酸激酶样孤儿(ROR)受体家族、酪氨酸激酶受体结构域(DDR)受体家族、转染期间重排(RET)受体家族、酪氨酸蛋白激酶样(PTK7)受体家族、相关受体酪氨酸激酶(RYK)受体家族、或肌肉特异性激酶(MuSK)受体家族)；G蛋白偶联受体，GPCR(Frizzled或Smoothened)；丝氨酸/苏氨酸激酶受体(BMPR或TGFR)；或细胞因子受体(IL1R、IL2R、IL7R或IL15R)。
(III-B-v)接头。如本文所用，接头可以包括用于连接分子的两个其他亚组分的CAR分子的任何部分。一些接头不用于除了连接组分之外的目的，而许多接头用于另外的目的。例如，接头可以连接scFv的抗体来源的结合结构域的VL和VH，并且作为CAR的亚组分部分之间的接合氨基酸。
根据接头的预期功能，接头可以是柔性的、刚性的或半刚性的。接头可以包括接合氨基酸。例如，在特定的实施方案中，接头为CAR的不同组分之间的构象移动提供了灵活性和空间。常用的柔性接头包括Gly-Ser接头。在特定的实施方案中，接头序列包括甘氨酸和丝氨酸重复序列组，诸如一个至十个(GlyxSery)n重复序列，其中x和y独立地是0至10的整数，条件是x和y不都是0，并且其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数)。特定的实例包括(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:1)、(Gly3Ser)n(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:2)、(Gly3Ser)n(Gly2Ser)n(SEQ ID NO:3)或(Gly3Ser)n(Gly4Ser)1(SEQ ID NO:4)。在特定的实施方案中，接头是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:7)、(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:8)、(Gly4Ser)2(SEQ ID NO:106)、(Gly4Ser)1(SEQ ID NO:5)、(Gly3Ser)2(SEQ ID NO:107)、(Gly3Ser)1(SEQ ID NO:6)、(Gly2Ser)2(SEQ ID NO:108)或(Gly2Ser)1、GGSGGGSGGSG(SEQ ID NO:109)、GGSGGGSGSG(SEQ ID NO:110)或GGSGGGSG(SEQ ID NO:111)。
在特定的实施方案中，接头区是(GGGGS)n(SEQ ID NO:1)，其中n是包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或更大的整数。在特定的实施方案中，间隔区是(EAAAK)n(SEQ ID NO:112)，其中n是包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或更大的整数。
在一些情况下，柔性连接件可能无法保持特定用途所需的CAR距离或定位。在这些情况下，刚性或半刚性接头可能是有用的。刚性或半刚性接头的实例包括富含脯氨酸的接头。在特定实施方案中，富含脯氨酸的接头是比仅基于偶然性所预期的具有更多脯氨酸残基的肽序列。在特定实施方案中，富含脯氨酸的接头是具有至少30％、至少35％、至少36％、至少39％、至少40％、至少48％、至少50％或至少51％脯氨酸残基的接头。富含脯氨酸的接头的特定实例包括富含脯氨酸的唾液蛋白(PRP)的片段。
接头可对切割敏感(可切割接头)，诸如酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割。可替代地，接头可以基本上抗切割(例如，稳定的接头或不可裂解的接头)。在一些方面，接头是带正电荷的接头、亲水接头或基于二羧酸的接头。
当不需要和/或不想要由间隔区提供的距离时，接合氨基酸可以是用于连接序列的接头。例如，接合氨基酸可以是可用于连接共刺激细胞内信号传导组分的短氨基酸序列。在特定的实施方案中，接合氨基酸是9个氨基酸或更少的氨基酸(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸)。在特定的实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的接合氨基酸接头。在特定的实施方案中，单个氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸)可以用作合适的接合氨基酸。
(III-B-vi)控制特征，包括标签盒、转导标志物和/或自杀开关。在特定的实施方案中，CAR构建体可以包括一个或多个标签盒和/或转导标志物。标签盒和转导标志物可用于体外、体内和/或离体激活、促进增殖、检测、富集、分离、追踪、耗尽和/或消除遗传修饰的细胞。“标签盒”指独特的合成肽序列，其附着于、融合于CAR或是CAR的部分，同源结合分子(例如，配体、抗体或其他结合配偶体)能够特异性结合于其上，其中结合特性可用于激活、促进增殖、检测、富集、分离、追踪、耗尽和/或消除标记蛋白和/或表达标签蛋白的细胞。转导标志物可以用于相同的目的，但来源于天然存在的分子并且通常使用将转导标志物与CAR分子的其余部分分开的跳跃元件来表达。
结合同源结合分子的标签盒包括例如His标签(HHHHHH；SEQ ID NO:113)、Flag标签(DYKDDDDK；SEQ ID NO:114)、Xpress标签(DLYDDDDK；SEQ ID NO:115)、Avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE；SEQ ID NO:116)、钙调蛋白标签(Calmodulin tag)(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL；SEQ ID NO:117)、聚谷氨酸标签(Polyglutamate tag)，HA标签(YPYDVPDYA；SEQ ID NO:118)、Myc标签(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:119)、链球菌标签(Strep tag)(其指代原始
Figure BDA0003865811660000481
标签(WRHPQFGG；SEQ ID NO:120)、
Figure BDA0003865811660000482
标签II(WSHPQFEK；SEQ ID NO:121(IBA Institut fur Bioanalytik,Germany)；参见，例如US 7,981,632)、Softag 1(SLAELLNAGLGGS；SEQ ID NO:122)、Softag 3(TQDPSRVG；SEQ ID NO:123)和V5标签(GKPIPNPLLGLDST；SEQ ID NO:124)。
特异性地结合本文所公开的标签盒序列的缀合物结合分子可商购获得。例如，His标签抗体可商购自供应商，包括Life Technologies、Pierce Antibodies和GenScript。Flag标签抗体可商购自供应商，包括Pierce Antibodies、GenScript和Sigma-Aldrich。Xpress标签抗体可商购自供应商，包括Pierce Antibodies、Life Technologies和GenScript。Avi标签抗体可商购自供应商，包括Pierce Antibodies、IsBio和Genecopoeia。钙调蛋白标签抗体可商购自供应商，包括Santa Cruz Biotechnology、Abcam和PierceAntibodies。HA标签抗体可商购自供应商，包括Pierce Antibodies、Cell Signal和Abcam。Myc标签抗体可商购自供应商，包括Santa Cruz Biotechnology、Abcam和Cell Signal。链球菌标签抗体可商购自供应商，包括Abcam、Iba和Qiagen。
转导标志物可以选自截短的CD19(tCD19；参见Budde等人,Blood 122:1660,2013)；截短的人EGFR(tEGFR；参见Wang等人,Blood 118:1255,2011)；人CD34的细胞外结构域；和/或组合CD34的靶表位的RQR8(参见Fehse等人,Mol.Therapy 1(5Pt 1)；448–456,2000)和CD20抗原(参见Philip等人,Blood 124:1277–1278)中的至少一种。
在特定的实施方案中，可将编码iCaspase9构建体(iCasp9)的多核苷酸作为自杀开关插入CAR构建体中。
控制特征可以存在于CAR的多个拷贝中，或者可以使用跳跃元件表达为不同的分子(SEQ ID NO:149-152)。例如，CAR可以具有一个、两个、三个、四个或五个标签盒和/或也可以表达一种、两种、三种、四种或五种转导标志物。例如，实施方案可以包括具有两个Myc标签盒、或His标签和HA标签盒、或HA标签和Softag 1标签盒、或Myc标签和SBP标签盒的CAR构建体。示例性的转导标志物和同源对描述于US 13/463,247中。
在CAR中包括至少一个控制特征的一个优点是向受试者施用的表达CAR的细胞可以使用标签盒的同源结合分子来增加或耗尽。在某些实施方案中，本公开提供了通过使用对标签盒具有特异性的抗体、使用对控制特征具有特异性的同源结合分子、或通过使用表达CAR并对控制特征具有特异性的第二修饰细胞来耗尽表达CAR的经修饰的细胞的方法。可以使用对控制特征具有特异性的的耗尽剂来实现对经修饰的细胞的消除。例如，如果使用tEGFR，则可以使用与细胞毒性试剂(诸如毒素、放射性金属)融合或缀合的抗tEGFR结合结构域(例如，抗体、scFv)，或可以使用抗tEGFR/抗CD3双特异性scFv或抗tEGFR CAR T细胞。
在某些实施方案中，可以通过使用特异性地结合控制特征的抗体(例如，抗标签抗体)或通过特异性地结合控制特征的其他同源结合分子在体内检测或跟踪表达嵌合分子的经修饰的细胞，所述控制特征的结合配偶体缀合至荧光染料、放射性示踪剂、氧化铁纳米颗粒或本领域已知的用于通过X射线、CT扫描、MRI扫描、PET扫描、超声、流式细胞术、近红外成像系统或其他成像形式检测的其他成像剂(参见例如Yu等人，Theranostics 2:3,2012)。
因此，与没有标签盒的经修饰的细胞相比，表达具有CAR的至少一种控制特征的经修饰的细胞可以例如更容易地被鉴定、分离、分选、诱导增殖、追踪和/或消除。
(III-C)TNFα信号增强因子。如先前所指示，图6中提供了TNFRS家族成员，包括化合物是否应激活或抑制所述家族成员的活性，以符合TNFα信号增强因子的条件。在特定的实施方案中，细胞被遗传修饰以表达一个或多个增强TNFα的TNFRSF成员。在特定的实施方案中，细胞被遗传修饰以抑制抑制TNFα的TNFRSF成员或使其失活。经遗传修饰表达TNFα信号增强因子蛋白的细胞可以是经遗传修饰表达CAR的同一细胞或可以是不同的细胞。
可以表达为TNFα信号增强因子的蛋白质的特定实例包括TWEAK(肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导剂)；TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)；和LIGHT(与淋巴毒素同源，表现出可诱导的表达并与HSV糖蛋白D竞争结合疱疹病毒进入介体，是一种在T淋巴细胞上表达的受体)。
TWEAK(也称为TNFRSF12A)最初于1997年被描述为肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员。TWEAK是一种细胞表面相关的II型跨膜蛋白，但一种较小的生物活性形式也可以释放到细胞外环境中。目前已知存在一种受体以生理亲和力结合TWEAK，并且其是一种I型跨膜蛋白，在文献中被称为TWEAK受体(TweakR)或成纤维细胞生长因子诱导型14(Fn14)。TweakR/Fn14是迄今为止描述的TNF受体(TNFR)超家族的最小成员，其似乎通过募集几种不同的TNFR相关因子来发出信号。TWEAK具有多种生物活性，包括刺激细胞生长和血管生成，诱导炎性细胞因子，以及在一些实验条件下，刺激细胞凋亡。(PMID:12787562)。关于TWEAK的额外信息，参见WO2011084714A2。
TRAIL/Apo2L是肿瘤坏死因子(TNF)配体家族的成员，能够通过其死亡受体的参与启动凋亡。TRAIL选择性地诱导多种肿瘤细胞和转化细胞的凋亡，但不诱导大多数正常细胞的凋亡，并且因此作为一种有前途的癌症治疗剂引起了强烈的兴趣。TRAIL在免疫系统的不同细胞上表达，并且在T细胞和自然杀伤细胞介导的肿瘤监视和抑制肿瘤转移中发挥作用。
也称为肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)的LIGHT是TNF超家族的分泌蛋白。其被疱疹病毒进入介体(HVEM)和诱饵受体3识别。关于LIGHT的更多信息，参见EP3105317B1和US20050163747。
(IV)细胞激活培养条件。细胞群体可以在培养起始组合物中孵育，以扩增遗传修饰的细胞群体。孵育可以在培养容器中进行，所述培养容器诸如袋、细胞培养板、烧瓶、室、色谱柱、交联凝胶、交联聚合物、柱、培养皿、中空纤维、微量滴定板、涂有二氧化硅的玻璃板、管、管组、孔、小瓶或用于培养或培育细胞的其他容器。
培养条件可以包括以下项中的一种或多种：特定的培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂(例如营养物、氨基酸、抗生素、离子)和/或刺激因子(诸如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体)以及设计用于激活细胞的任何其他剂。
在一些方面，根据诸如US 6,040,1 77，Klebanoff等人(2012)JImmunother.35(9):651-660,Terakura等人(2012)Blood.1:72-82，和/或Wang等人(2012)JImmunother.35(9):689-701中描述的那些技术进行孵育。
用于培养T细胞的示例性培养基包括(i)补充有非必需氨基酸、丙酮酸钠和青霉素/链霉素的RPMI；(ii)含有HEPES、5-15％人血清、1-3％L-谷氨酰胺、0.5-1.5％青霉素/链霉素和0.25x10-4至0.75x10-4 Mβ-巯基乙醇的RPMI；(iii)补充有10％胎牛血清(FBS)、2mML-谷氨酰胺、10mM HEPES、100U/ml青霉素和100m/mL链霉素的RPMI-1640；(iv)补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、100U/ml青霉素和100m/mL链霉素的DMEM培养基；和(v)补充有5％人AB血清(Gemcell,West Sacramento,CA)、1％HEPES(Gibco,Grand Island,NY)、1％Pen-Strep(Gibco)、1％GlutaMax(Gibco)和2％N-乙酰半胱氨酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的X-Vivo 15培养基(Lonza,Walkersville,MD)。T细胞培养基也可商购自Hyclone(Logan,UT)。下文更详细地描述了可以添加到此类培养基中的额外T细胞激活组分。
在一些实施方案中，通过以下方式来扩增T细胞：向培养起始组合物中加入饲养细胞(诸如非分裂外周血单核细胞(PBMC))，(例如，使得对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群体包含至少5个、10个、20个或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包括γ辐射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用3000拉德至3600拉德范围内的伽马射线照射PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前，将饲养细胞添加到培养基中。
任选地，孵育可以进一步包括添加非分裂EBV转化的淋巴母细胞样细胞(LCL)作为饲养细胞。LCL可以用6000拉德至10,000拉德范围内的伽马射线照射。在一些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量提供，诸如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少10∶1。
在一些实施方案中，刺激条件包括适于人T淋巴细胞生长的温度，例如，至少25℃、至少30℃或37℃。
T细胞的激活培养条件包括培养起始组合物的T细胞增殖或扩增的条件。T细胞激活条件可以包括一种或多种细胞因子，例如白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和/或IL-21。IL-2可以1-100ng/μl的范围(例如，40ng/μl、50ng/μl或60ng/μl)被包括。IL-7、IL-15和/或IL-21可以分别以0.1-50ng/μl的范围(例如，5ng/μl、10ng/μl或15ng/μl)被包括。特定的实施方案利用25IU/μl和50IU/μl的IL-2。特定的实施方案利用分别以10ng/μl包括的IL-7、IL-15和IL-21。
在特定的实施方案中，T细胞激活培养条件可以包括T细胞刺激表位。T细胞刺激表位包括CD3、CD27、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8、CD28、CD30、CD40、CD56、CD83、CD90、CD95、4-1BB(CD137)、B7-H3、CTLA-4、Frizzled-1(FZD1)、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、HVEM、ICOS、IL-1R、LAT、LFA-1、LIGHT、MHCI、MHCII、NKG2D、OX40、ROR2和RTK。
CD3是T细胞受体的主要信号转导元件。如先前所指示，CD3在所有成熟T细胞上表达。在特定的实施方案中，CD3刺激分子(即CD3结合结构域)可以来源于OKT3抗体(参见US5,929,212；US 4,361,549；
Figure BDA0003865811660000531
CRL-8001TM；和Arakawa等人,J.Biochem.120,657-662(1996))、20G6-F3抗体、4B4-D7抗体、4E7-C9或18F5-H10抗体。
在特定的实施方案中，CD3刺激分子可以至少0.25ng/ml或0.5ng/ml的浓度或以2.5-10μg/ml的浓度被包括在培养基中。特定的实施方案利用5μg/ml的CD3刺激分子(例如，OKT3)。
在特定的实施方案中，与avi标签相关的激活分子可以被生物素化并与链霉亲和素珠结合。此方法可用于创建例如可移除的T细胞表位刺激激活系统。
CD28的示例性结合结构域可以包括或来源于TGN1412、CD80、CD86或9D7抗体。结合CD28的额外抗体包括9.3、KOLT-2、15E8、248.23.2、EX5.3D10和CD28.3(作为合成的单链Fv构建体根据GenBank登记号AF451974.1保藏；也参见Vanhove等人,BLOOD,2003年7月15日,第102卷,第2期,第564-570页)。此外，1YJD提供了与促有丝分裂抗体的Fab片段复合的人CD28的晶体结构(5.11A1)。在特定的实施方案中，选择不与9D7竞争的抗体。
4-1BB结合结构域可以来源于LOB12、IgG2a、LOB12.3或IgG1，如Taraban等人Eur JImmunol.2002年12月；32(12):3617-27中所描述。在特定的实施方案中，4-1BB结合结构域来源于US 9,382,328中所述的单克隆抗体。额外的4-1BB结合结构域描述于US 6,569,997；US 6,303,121；和Mittler等人Immunol Res.2004；29(1-3):197-208中。
也可以使用OX40(CD134)和/或ICOS激活。OX40结合结构域描述于US20100196359；US 20150307617；WO 2015/153513；WO2013/038191；和Melero等人Clin Cancer Res.2013年3月1号；19(5):1044-53中。可结合并激活ICOS的示例性结合结构域描述于例如US20080279851和Deng等人Hybrid Hybridomics.2004年6月；23(3):176-82中。
当呈可溶形式时，T细胞激活剂可以与另一种分子(诸如聚乙二醇(PEG)分子)偶联。可以使用任何合适的PEG分子。通常，分子量高达1000Da的PEG分子可溶于水或培养基中。在一些情况下，此类基于PEG的试剂可以使用可商购的激活PEG分子(例如，可从NOFNorth America Corporation,Irvine,Calif.,USA获得的PEG-NHS衍生物，或可从CreativePEGWorks,Chapel Hills,N.C.,USA获得的激活的PEG衍生物)来制备。
在特定的实施方案中，细胞刺激剂被固定在培养基内的固相上。在特定的实施方案中，固相是培养容器(例如，袋、细胞培养板、室、色谱柱、交联凝胶、交联聚合物、柱、培养皿、中空纤维、微量滴定板、涂有二氧化硅的玻璃板、管、管组、孔、小瓶、用于培养或培育细胞的其他结构或容器)的表面。
在特定的实施方案中，可以向培养基中添加固相。此类固相可以包括例如珠、中空纤维、树脂、膜和聚合物。
示例性的珠包括磁珠、聚合珠和树脂珠(例如，
Figure BDA0003865811660000541
Sepharose、
Figure BDA0003865811660000542
Superflow和
Figure BDA0003865811660000543
MacroPrep IBA GmbH,Gottingen))。抗CD3/抗CD28珠是用于T细胞扩增的可商购试剂(Invitrogen)。这些珠是均匀的、4.5μm超顺磁的、无菌的、非热原性聚苯乙烯珠，涂有针对人T细胞上CD3和CD28细胞表面分子的亲和纯化单克隆抗体的混合物。中空纤维可从TerumoBCT Inc.(Lakewood,Colo.,USA)获得。树脂包括金属亲和色谱(IMAC)树脂(例如，TALON树脂(Westburg,Leusden))。膜包括纸以及色谱基质的膜基底(例如，硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜)。
示例性的聚合物包括多糖，诸如多糖基质。此类基质包括琼脂糖凝胶(例如，SuperflowTM琼脂糖或
Figure BDA0003865811660000554
材料，诸如如SuperflowTM
Figure BDA0003865811660000551
其可以不同的珠和孔大小商购)或交联葡聚糖凝胶。另一个说明性实例是微粒交联的琼脂糖基质，葡聚糖共价结合于其上，其可作为
Figure BDA0003865811660000552
或
Figure BDA0003865811660000553
商购(以各种珠大小和各种孔大小)，两者均可从GE Healthcare获得。
可以使用的合成聚合物包括聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、多糖和琼脂糖的共聚物(例如，聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物)或多糖和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺。葡聚糖和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物的一个实例是
Figure BDA0003865811660000555
(Pharmacia Fine Chemicals,Inc.,Piscataway,NJ)系列材料。
特定的实施方案可以利用与合成或天然聚合物偶联的二氧化硅颗粒，例如多糖接枝的二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮接枝的二氧化硅、聚环氧乙烷接枝的二氧化硅、聚(2-羟乙基天冬酰胺)二氧化硅和聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝的二氧化硅。
细胞激活剂可以通过共价键固定至固相，或可以通过非共价连接可逆地固定。
在特定的实施方案中，T细胞激活培养基包含在含有HEPES、5-15％人血清、1-3％L-谷氨酰胺、0.5-1.5％Pen/strep、0.25x10-4至0.75x10-4 Mβ-巯基乙醇的RPMI内培养的FACS分选的T细胞群体，其中IL-7、IL-15和IL-21分别以5-15(例如，10)ng/μl被包括。在0.1-0.5x10e6铺板细胞/孔的平底孔板中进行培养。在激活后第3天，将细胞转移至TC处理的板。
在特定的实施方案中，T细胞激活培养基包含在含有HEPES、10％人血清、2％L-谷氨酰胺、1％Pen/strep、0.5x10-4 Mβ-巯基乙醇的RPMI内培养的FACS分选的CD8+T群体，其中IL-7、IL-15和IL-21分别以5-15(例如，10)ng/μl被包括。在平底非组织培养(TC)处理的96/48孔板中进行培养，每孔铺有0.1-0.5x10e6个细胞。在激活后第3天，将细胞转移至TC处理的板。
HSC/HSP的培养条件可以包括用Notch激动剂进行扩增(参见例如，US 7,399,633；US 5,780,300；US 5,648,464；US 5,849,869；和US 5,856,441；并且培养条件中存在的生长因子如下：25-300ng/ml SCF、25-300ng/ml Flt-3L、25-100ng/ml TPO、25-100ng/ml IL-6和10ng/ml IL-3。在更特定的实施方案中，可以使用50ng/ml、100ng/ml或200ng/ml SCF；50ng/ml、100ng/ml或200ng/ml Flt-3L；50ng/ml或100ng/ml TPO；50ng/ml或100ng/ml IL-6；以及10ng/ml IL-3。
(V)离体制造的细胞配制品。在特定的实施方案中，可以从培养基中收获经遗传修饰的细胞，并且洗涤并浓缩到治疗有效量的载剂中。示例性的载剂包括盐水、缓冲盐水、生理盐水、水、汉克氏溶液(Hanks'solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)、Nonnosol-R(Abbott Labs)、PLASMA-LYTE
Figure BDA0003865811660000561
(Baxter Laboratories,Inc.,Morton Grove,IL)、甘油、乙醇及其组合。
在特定的实施方案中，载剂可以补充有人血清白蛋白(HSA)或其他人血清组分或胎牛血清。在特定的实施方案中，用于输注的载剂包括具有5％HAS或葡萄糖的缓冲盐水。额外等渗剂包括多元糖醇，包括三元或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。
载剂可以包括缓冲剂，诸如柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、富马酸盐缓冲液、葡萄糖酸盐缓冲液、草酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和/或三甲胺盐。
稳定剂是指一大类赋形剂，其功能范围从膨胀剂到有助于防止细胞粘附于容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以包括多元糖醇；氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油和环醇(诸如纤维醇)；PEG；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即<10个残基)；蛋白质，诸如HSA、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖，诸如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖，诸如棉子糖；以及多糖，诸如葡聚糖。
在必要或有益的情况下，组合物或配制品可以包含局部麻醉剂，诸如利多卡因(lidocaine)，以减轻注射部位的疼痛。
示例性防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵、氯化六烃季铵、对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
组合物或配制品中细胞的治疗有效量可以大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于1010个细胞或大于1011个细胞。
在本文公开的组合物和配制品中，细胞的体积通常为1升或更小、500毫升或更小、250毫升或更小或100毫升或更小。因此，施用细胞的密度通常大于104个细胞/毫升、107个细胞/毫升或108个细胞/毫升。
如所指示，组合物包括至少一种经遗传修饰的细胞类型(例如，经修饰的T细胞、NK细胞或干细胞)。配制品可以包含不同类型的经遗传修饰的细胞(例如，T细胞、NK细胞和/或干细胞的组合)。
不同类型的经遗传修饰的细胞或细胞亚群(例如，经修饰的T细胞、NK细胞和/或干细胞)可以以不同的比率，例如1:1:1比率、2:1:1比率、1:2:1比率、1:1:2比率、5:1:1比率、1:5:1比率、1:1:5比率、10:1:1比率、1:10:1比率、1:1:10比率、2:2:1比率、1:2:2比率、2:1:2比率、5:5:1比率、1:5:5比率、5:1:5比率、10:10:1比率、1:10:10比率、10:1:10比率等提供。这些比率也适用于表达相同或不同CAR组分的细胞数量。如果仅组合两种细胞类型或配制品内仅包含2种表达的CAR组分的组合，则所述比率可包括可由上述提供的3个数字组合产生的任何2个数字的组合。在实施方案中，在体外、体内和/或离体测试组合的细胞群的功效和/或细胞增殖，并且选择提供细胞功效和/或增殖的细胞比率。特定的实施方案包括1:1比率的CD4 T细胞和CD8 T细胞。
本文公开的基于细胞的组合物可以被制备以供通过例如注射、输注、灌注或灌洗来施用。所述组合物和配制品可以进一步配制用于骨髓、静脉内、皮内、动脉内、结内、淋巴内、腹膜内、病变内、肿瘤内、膀胱内和/或皮下注射。
(VI)TNFα信号增强因子-小分子和蛋白质。在本公开中使用的可以用作小分子TNFα信号增强因子的化合物包括BV-6、CUDC-427、GDC-0152、LCL161、罗卡酰胺、西罗莫司、恩利卡生、比瑞那帕、ASTX660、AZD5582、BI 891065、DEBIO 1143、APG-1387、HGS1029、AEG35156、七叶素和KILLERTRAILTM。
在特定的实施方案中，TNFα信号增强因子选自罗卡酰胺、西罗莫司和恩利卡生：
罗卡酰胺(1R,2R,3S,3aR,8bS)-1,8b-二羟基-6,8-二甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-N,N-二甲基-3-苯基-2,3-二氢-1H-环戊[b][1]苯并呋喃-2-甲酰胺，
Figure BDA0003865811660000591
西罗莫司(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-12-[(2R)-1-[(1S,3R,4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]丙-2-基]-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-戊酮，
Figure BDA0003865811660000592
和
恩利卡生(3S)-3-[[(2S)-2-[[2-(2-叔丁基苯胺基)-2-氧代乙酰基]氨基]丙酰基]氨基]-4-氧代-5-(2,3,5,6-四氟苯氧基)戊酸，
Figure BDA0003865811660000601
在特定的实施方案中，扩增TNFα的化合物是SMAC模拟物，包括：比瑞那帕(2S)-N-[(2S)-1-[(2R,4S)-2-[[6-氟-2-[6-氟-3-[[(2R,4S)-4-羟基-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]吡咯烷-2-基]甲基]-1H-吲哚-2-yl]-1H-吲哚-3-基]甲基]-4-羟基吡咯烷-1-基]-1-氧代丁-2-基]-2-(甲基氨基)丙烯酰胺，
Figure BDA0003865811660000602
LCL161(2S)-N-[(1S)-1-环己基-2-[(2S)-2-[4-(4-氟苯甲酰基)-1,3-噻唑-2-基]吡咯烷-1-基]-2-氧乙基]-2-(甲基氨基)丙烯酰胺，
Figure BDA0003865811660000611
ASTX660 1-[6-[(4-氟苯基)甲基]-5-(羟甲基)-3,3-二甲基-2H-吡咯并[3,2-b]吡啶-1-基]-2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙烯酮，
Figure BDA0003865811660000612
BI 891065；CUDC-427(2S)-1-[(2S)-2-环己基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]乙酰基]-N-[2-(1,3-噁唑-2-基)-4-苯基-1,3-噻唑-5-基]吡咯烷-2-甲酰胺，
Figure BDA0003865811660000621
DEBIO 1143(5S,8S,10aR)-N-二苯甲基-5-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-3-(3-甲基丁酰基)-6-氧代-1,2,4,5,8,9,10,10a-八氢吡咯并[1,2-a][1,5]二氮芳辛-8-甲酰胺，
Figure BDA0003865811660000622
APG-1387(5S,8S,10aR)-3-[3-[[(5S,8S,10aR)-8-(二苯甲基氨基甲酰基)-5-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-6-氧代-1,2,4,5,8,9,10,10a-八氢吡咯并[1,2-a][1,5]二氮芳辛-3-基]磺酰基]苯基]磺酰基-N-二苯甲基-5-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-6-氧代-1,2,4,5,8,9,10,10a-八氢吡咯并[1,2-a][1,5]二氮芳辛-8-甲酰胺，
Figure BDA0003865811660000631
HGS1029；AEG35156；AZD5582(2S)-1-[(2S)-2-环己基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]乙酰基]-N-[(1S,2R)-2-[6-[[(1S,2R)-1-[[(2S)-1-[(2S)-2-环己基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]乙酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]-2,3-二氢-1H-茚-2-基]氧基]己-2,4-二炔氧基]-2,3-二氢-1H-茚-1-基]吡咯烷-2-甲酰胺，
Figure BDA0003865811660000632
APG-1387(5S,8S,10aR)-3-[3-[[(5S,8S,10aR)-8-(二苯甲基氨基甲酰基)-5-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-6-氧代-1,2,4,5,8,9,10,10a-八氢吡咯并[1,2-a][1,5]二氮芳辛-3-基]磺酰基]苯基]磺酰基-N-二苯甲基-5-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-6-氧代-1,2,4,5,8,9,10,10a-八氢吡咯并[1,2-a][1,5]二氮芳辛-8-甲酰胺，
Figure BDA0003865811660000641
GDC-0152(2S)-1-[(2S)-2-环己基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]乙酰基]-N-(4-苯基噻二唑-5-基)吡咯烷-2-甲酰胺，
Figure BDA0003865811660000642
WX20120108
Figure BDA0003865811660000643
SM-122(3S,6S,10As)-N-二苯甲基-6-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-5-氧代-2,3,6,7,8,9,10,10a-八氢-1H-吡咯并[1,2-a]氮芳辛-3-甲酰胺，
Figure BDA0003865811660000651
SM-164(3S,6S,10As)-N-[(S)-[1-[4-[4-[4-[4-[(S)-[[(3S,6S,10aS)-6-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-5-氧代-2,3,6,7,8,9,10,10a-八氢-1H-吡咯并[1,2-a]氮芳辛-3-羰基]氨基]-苯基甲基]三唑-1-基]丁基]苯基]丁基]三唑-4-基]-苯基甲基]-6-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-5-氧代-2,3,6,7,8,9,10,10a-八氢-1H-吡咯并[1,2-a]氮芳辛-3-甲酰胺，
Figure BDA0003865811660000652
BV-6(S,S,2S,2'S)-N,N'-((2S,2'S)-(己烷-1,6-二基双(氮杂二基))双(3-氧代-1,1-二苯基丙烷-3,2-二基))双(1-((S)-2-环己基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)乙酰基)吡咯烷-2-甲酰胺)，
Figure BDA0003865811660000661
AZD5582((2S)-1-[(2S)-2-环己基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]乙酰基]-N-[(1S,2R)-2-[6-[[(1S,2R)-1-[[(2S)-1-[(2S)-2-环己基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]乙酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]-2,3-二氢-1H-茚-2-基]氧基]己-2,4-二炔氧基]-2,3-二氢-1H-茚-1-基]吡咯烷-2-甲酰胺)，
Figure BDA0003865811660000671
CUDC-427((2S)-1-[(2S)-2-环己基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]乙酰基]-N-[2-(1,3-噁唑-2-基)-4-苯基-1,3-噻唑-5-基]吡咯烷-2-甲酰胺)，
Figure BDA0003865811660000681
或
七叶素((2S,3S,4S,5R,6R)-6-[[(3S,4S,4aR,6aR,6bS,8R,8aR,9R,10R,12aS,14aR,14bR)-9-乙酰氧基-8-羟基-4,8a-双(羟甲基)-4,6a,6b,11,11,14b-六甲基-10-[(Z)-2-甲基丁-2-烯酰基]氧基-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-十四氢苉-3-基]氧基]-4-羟基-3,5-双[[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)氧杂环己-2-基]氧基]氧杂环己烷-2-甲酸
Figure BDA0003865811660000682
KILLERTRAILTM是指一种重组蛋白，包括在N端处融合到His标签和接头肽的人TRAIL的细胞外结构域(aa 95-281)。
如所指示，可以使用TNF超家族配体调节的细胞死亡的SMAC模拟物和增强因子。关于具有类似功能特性的其他SMAC模拟结构和衍生物的额外信息，参见：US2018155322、US2017037004、US2015158908、US8986993、US8283372、US2019031766、US2019185511、US2019135794、US2018186882、US2018179183、US2018065959、US9783538、US2019151295、US8716236、US8664212、US8278293、WO2020024932、WO2019122941、WO2019122337、WO2015109391、AU2017223233、WO2017117684、WO2019165215、US20160184383、US20170319592、US2010317593、US2018193470、US8883771、US8980837、US8202902、US20120238766、EP1693059、US20100098770、WO2006116727、WO2018017426和PMID:31316176。本公开还包括本文描述或提及的化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、互变异构体、对映异构体、立体异构体和非对映异构体的用途。关于小分子TNFα小分子的更多信息，参见Trace等人,Annu.Rev.Med.1994；45:491-503；WO2017117684；US2018065959；和US9783538。
(VII)纳米颗粒配制品。导致本文所述的细胞和/或小分子的体内遗传修饰的纳米颗粒可以单独或组合配制成组合物，以施用于受试者。组合物包括用至少一种药学上可接受的载剂配制的纳米颗粒和/或小分子。
对于注射，组合物可以配制为水溶液，诸如在缓冲液中，包括汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水。水溶液可以包含配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，所述配制品可呈冻干和/或粉末形式，以便在使用前用合适的媒介物(例如无菌的无热原水)复原。
使用不同的溶剂(例如，二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、三醋精、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、苯酚或其组合)可以改变纳米颗粒大小和结构，以调节释放特性。其他有用的溶剂包括水、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、丙酮、甲醇、异丙醇(IPA)、苯甲酸乙酯和苯甲酸苯甲酯。
示例性的释放调节剂可以包括表面活性剂、清洁剂、内相粘度增强剂、络合剂、表面活性分子、助溶剂、螯合剂、稳定剂、纤维素衍生物、(羟丙基)甲基纤维素(HPMC)、醋酸HPMC、醋酸纤维素、普朗尼克(pluronic)(例如，F68/F127)、聚山梨醇酯、
Figure BDA0003865811660000701
(CrodaAmericas,Wilmington,Delaware)、聚乙烯醇(PVA)、
Figure BDA0003865811660000702
(Croda Americas,Wilmington,Delaware)、醋酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)、盐和缓冲剂。
本文所公开的任何组合物可以有利地包含任何其他药学上可接受的载剂，所述药学上可接受的载剂包括不会产生显著不利反应、过敏反应或其他超过施用益处的不合宜反应的那些载剂。在Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版Mack PrintingCompany,1990中公开了示例性药学上可接受的载剂和配制品。此外，可以按照US FDA生物标准办公室和/或其他相关外国监管机构的要求，制备配制品以满足无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
(VIII)使用方法。本文公开的方法包括用本文公开的组合物和配制品治疗受试者(人、兽医动物(狗、猫、爬行动物、鸟等)、牲畜(马、牛、山羊、猪、鸡等)和研究动物(猴、大鼠、小鼠、鱼等)。治疗受试者包括递送治疗有效量。治疗有效量包括提供有效量、防治性治疗和/或治疗性治疗的那些。
“有效量”是在受试者中导致所需生理变化所必需的组合物的量。例如，有效量可以提供免疫原性抗癌效果。通常施用有效量用于研究目的。本文公开的有效量可在与癌症发展或进展的评估相关的动物模型或体外测定中产生统计学上显著的效果。可以提供有效量的免疫原性组合物，其中所述有效量刺激免疫反应。
“预防性治疗”包括对不显示癌症体征或症状或仅显示癌症早期体征或症状的受试者施用的治疗，使得出于减少或降低进一步发展癌症的风险的目的施用治疗。因此，预防性治疗用作针对癌症的预防性治疗。在特定的实施方案中，预防性治疗减少、延迟或防止来自原发性癌症肿瘤部位的转移发生。
“治疗性治疗”包括对表现出癌症症状或体征的受试者施用的治疗，并且出于减轻或消除癌症的那些体征或症状的目的向受试者施用。治疗性治疗可以减少、控制或消除癌症的存在或活性，和/或减少控制或消除癌症的副作用。
作为有效量，预防性治疗或治疗性治疗并不相互排斥，并且在特定的实施方案中，施用的剂量可以实现超过一种的治疗类型。
在特定的实施方案中，治疗有效量提供抗癌效果。抗癌效果包括癌细胞数量的减少、转移数量的减少、肿瘤体积的减小、预期寿命的增加、癌细胞中诱导的化学或放射敏感性、抑制癌细胞附近的血管生成、抑制癌细胞增殖、抑制肿瘤生长、防止或减少转移、延长受试者寿命、减少癌症相关疼痛和/或减少治疗后癌症的复发或再发。在特定的实施方案中，本文公开的组合治疗增强了抗原阴性旁观者细胞的杀伤。
“肿瘤”是由细胞(称为赘生性细胞或肿瘤细胞)的异常生长形成的肿胀或损伤。“肿瘤细胞”是通过快速、不受控制的细胞增殖而生长的异常细胞，并且在启动新生长的刺激停止后继续生长。肿瘤显示出部分或完全缺乏与正常组织的结构组织和功能协调，并且通常形成明显的组织块，其可以是良性的、恶性前的或恶性的。
可以使用本文所述的组合治疗治疗的癌症类型包括前列腺癌、乳腺癌、干细胞癌、卵巢癌、间皮瘤、肾细胞癌黑素瘤、胰腺癌、肺癌、HBV诱发的肝细胞癌和多发性骨髓瘤。可治疗的其他示例性癌症包括髓母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、卵巢透明细胞腺癌、卵巢子宫内膜样腺癌、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺内分泌肿瘤、恶性横纹肌样瘤、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样瘤、脉络丛癌、脉络丛乳头状瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、神经胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、松果体母细胞瘤、癌肉瘤、脊索瘤、性腺外生殖细胞瘤、肾外横纹肌样瘤、神经鞘瘤、皮肤鳞状细胞癌、软骨肉瘤、软组织透明细胞肉瘤、尤因肉瘤(ewing sarcoma)、胃肠道间质瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、上皮样肉瘤、肾髓质癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和未另行指明的(NOS)肉瘤。
急性髓性白血病(AML)、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)、骨髓增生异常综合征(MDS)、自然杀伤细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL，又称急性淋巴细胞性淋巴瘤)、慢性粒细胞白血病(CML)、其他白血病、血液系统癌症或肿瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma，HL)、B细胞HL、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤(难治性、复发性等)、系统性肥大细胞增多症(SM)、嗜酸性粒细胞增多综合征(HES)、骨髓纤维化、贫血、系统性红斑狼疮(SLE)、银屑病和系统性硬化症(硬皮病)也可以用本文公开的组合治疗来治疗。
对于施用，治疗有效量(在本文中也称为剂量)可以基于体外测定和/或动物模型研究的结果进行初步估计。此类信息可用于更准确地确定感兴趣的受试者的有用剂量。向特定受试者施用的实际剂量可以由医师、兽医或研究人员考虑参数诸如物理和生理因素的因素来确定，所述因素包括靶标、体重、病情严重程度、癌症类型、癌症阶段、以前或同时进行的治疗干预、受试者的自发病和施用途径。
施用的治疗有效量可以包括大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于1010个细胞或大于1011个细胞。
纳米颗粒和/或小分子的有用剂量可以在0.1μg/kg至5μg/kg或0.5μg/kg至1μg/kg的范围内。在其他实例中，剂量可以包括1μg/kg、15μg/kg、30μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、70μg/kg、90μg/kg、150μg/kg、350μg/kg、500μg/kg、750μg/kg、1000μg/kg、0.1to 5mg/kg，或0.5mg/kg至1mg/kg。在其他实例中，剂量可以包括1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、70mg/kg、100mg/kg、300mg/kg、500mg/kg、700mg/kg、1000mg/kg或更多。
示例性的比瑞那帕剂量包括0.1至70mg/m2。示例性的LCL161剂量包括10mg至3000mg。示例性的AEG35156剂量包括10-500mg/m2。示例性的西罗莫司剂量包括2-20mg负荷剂量和1-10mg每日剂量。示例性的CUDC-427剂量包括在21天周期中每天100-600mg持续14天。
治疗有效量可通过在治疗方案(例如，每天、每隔一天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每2周、每3周、每月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月或每年)的过程期间施用单剂量或多剂量来实现。治疗有效量也可以通过在21天或28天周期中在1-4周内施用剂量来实现。
如所指示，本文公开的组合物和配制品可以通过例如注射、输注、灌注或灌洗来施用，并且可以更特定地包括通过一种或多种骨髓、静脉内、皮内、动脉内、淋巴结内、淋巴内、腹膜内、病变内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、肿瘤内、肌内、膀胱内和/或皮下输注和/或弹丸注射来施用。
在某些实施方案中，将细胞或基于纳米颗粒或小分子的配制品与任何数量的相关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用于患者。在特定的实施方案中，细胞或基于纳米颗粒或小分子的配制品可以与化疗、放射、免疫抑制剂(诸如环孢菌素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate)和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(诸如CAM PATH)、抗CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达滨(fludaribine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和放射组合使用。
(IX)试剂盒。本文公开的试剂盒包括实施本文公开的组合疗法的组分。所述组分可以基于正在实施的特定实施方案而变化。试剂盒的实施方案可以包括例如以下中的一种或多种：免疫细胞(例如，T细胞(例如，CD4+、CD8+)、B细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞、HSC、HPC、HSPC)，其被预遗传修饰和/或遗传修饰以(i)表达CAR或类似分子和/或TNFα信号增强因子蛋白，或(ii)具有抑制TNFα信号传导途径成员的TNFRS家族成员的破坏活性(参见图6)；编码CAR、TCR、CAR/TCR杂合体和/或一种或多种TNFα信号增强因子(例如，TWEAK、TRAIL、LIGHT，并且参见图6)的基因，所述信号增强因子是导致抑制TNFα信号传导途径成员的TNFRS家族成员的表达和/或活性破坏的分子(参见图6)；TNFα信号增强因子蛋白(例如，TWEAK、TRAIL、LIGHT，并且参见图6)；TNFα信号增强因子小分子(例如，BV-6、CUDC-427、GDC-0152、LCL161、罗卡酰胺、西罗莫司、七叶素、恩利卡生、比瑞那帕、ASTX660、AZD5582、KILLERTRAILTM、BI 891065、DEBIO 1143、APG-1387、HGS1029和AEG35156)；洗涤缓冲液；PBS；Percoll和/或Ficoll梯度；磁珠；载体(例如，病毒载体)，CRISPR基因编辑组分；碱基编辑组分；纳米颗粒；袋、细胞培养板、烧瓶、室、色谱柱、交联凝胶、交联聚合物、柱、培养皿、中空纤维、微量滴定板、涂有二氧化硅的玻璃板、管、管组、孔、小瓶或用于培养或培育细胞的其他容器；一种或多种细胞因子，例如白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和/或IL-21；CD3刺激分子；CD28刺激分子；4-1BB刺激分子；Notch激动剂；盐水、水、汉克氏溶液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、富马酸盐缓冲液、葡萄糖酸盐缓冲液、草酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和/或三甲胺盐。
(X)示例性实施方案。
1.一种组合治疗，其包括
(i)经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，所述CAR包含细胞外组分和细胞内组分，其中所述细胞外组分包括结合由癌细胞表达的抗原的结合结构域，并且其中所述细胞内组分包括效应结构域；和
(ii)肿瘤坏死因子α(TNFα)信号增强因子。
2.如实施方案1所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子激活、增强或支持肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员的作用，所述肿瘤坏死因子受体超家族成员激活、增强或支持TNFα信号传导途径成员，和/或其中所述TNFα信号增强因子激活、增强或支持TNFα信号传导途径成员的作用。
3.如实施方案1或2所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子使TNFRSF成员的作用失活、抑制或破坏TNFRSF成员的作用，所述TNFRSF成员使TNFα信号传导途径成员失活、抑制或破坏TNFα信号传导途径成员。
4.如实施方案1至3中任一项所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子激活、增强或支持TNFRSF成员1A、1B、3、6、8、10A、10B、12A、19和/或21，和/或使TNFRSF成员6B、10C和/或10D的作用失活、抑制或破坏TNFRSF成员6B、10C和/或10D的作用。
5.如实施方案1至4中任一项所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子是引起TNFα信号增强因子蛋白表达的分子。
6.如实施方案1至5中任一项所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子是TNFα信号增强因子蛋白。
7.如实施方案5或6所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子蛋白包括肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导剂(TWEAK)；肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)；和/或淋巴毒素同源物，其表现出可诱导的表达并与HSV糖蛋白D竞争结合疱疹病毒进入介体，是一种在T淋巴细胞上表达的受体(LIGHT)。
8.如实施方案1至7中任一项所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子是破坏使TNFα信号传导途径成员失活、抑制或破坏TNFα信号传导途径成员的TNFRSF成员的表达的分子。
9.如实施方案8所述的组合治疗，其中所述破坏使TNFα信号传导途径成员失活、抑制或破坏TNFα信号传导途径成员的TNFRSF成员的表达的分子包括CRISPR/Cas分子、锌指核酸酶分子、TALEN或megaTAL。
10.如实施方案8或9所述的组合治疗，其中所述破坏使TNFα信号传导途径成员失活、抑制或破坏TNFα信号传导途径成员的TNFRSF成员的表达的分子包括碱基编辑器。
11.如实施方案1至10中任一项所述的组合治疗，其中表达所述CAR的如实施方案1所述的免疫细胞还包含或表达TNFα信号增强因子。
12.如实施方案1至11中任一项所述的组合治疗，其中表达所述CAR的如实施方案1所述的免疫细胞也被遗传修饰以包含或表达TNFα信号增强因子。
13.如实施方案1至12中任一项所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子包括小分子或蛋白质：
选自以下中的一种或多种：BV-6、CUDC-427、GDC-0152、LCL161、七叶素、罗卡酰胺、西罗莫司、恩利卡生、比瑞那帕、ASTX660、AZD5582、BI 891065、DEBIO 1143、APG-1387、HGS1029、AEG35156、具有人TRAIL的细胞外结构域的重组蛋白以及具有人TRAIL的细胞外结构域和接头的重组蛋白(例如，KILLERTRAILTM)；
选自以下中的一种或多种：BV-6、CUDC-427、GDC-0152、LCL161、ASTX660、AZD5582、比瑞那帕和具有人TRAIL的细胞外结构域的重组蛋白以及具有人TRAIL的细胞外结构域和接头的重组蛋白(例如，KILLERTRAILTM)；
选自以下中的一种或多种：BV-6、CUDC-427、GDC-0152和LCL161；或
选自以下中的一种或多种：罗卡酰胺、西罗莫司、恩利卡生、BI891065、DEBIO1143、APG-1387、HGS1029和AEG35156。
14.如实施方案1至13中任一项所述的组合治疗，其中所述CAR和/或所述TNFα信号增强因子的表达由NFAT启动子控制。
15.如实施方案1至14中任一项所述的组合治疗，其中所述结合结构域是T细胞受体(TCR)或来源于抗体的CDR。
16.如实施方案1至15中任一项所述的组合治疗，其中所述结合结构域特异性结合A33；BAGE；Bcl-2；β-连环蛋白；BCMA；B7H4；BTLA；CA125；CA19-9；CD3；CD5；CD20；CD21；CD22；CD25；CD28；CD30；CD33；CD37；CD38；CD40；CD52；CD44v6；CD45；CD56；CD79b；CD80；CD81；CD86；CD123；CD134；CD137；CD151；CD171；CD276；CEA；CEACAM6；CLL-1；c-Met；CS-1；CTLA-4；细胞周期蛋白B1；DAGE；EBNA；EGFR；EGFRvIII；肝配蛋白B2；ErbB2；HER2；ErbB4；EphA2；雌激素受体；FAP；铁蛋白；甲胎蛋白(AFP)；FLT1；FLT4；叶酸结合蛋白；FOLR；Frizzled；GAGE；G250；GD-2；GHRHR；GHR；GITR；GM2；GPRC5D；gp75；gp100(Pmel 17)；gp130；HLA；HER-2/neu；HPV E6；HPV E7；hTERT；HVEM；IGF1R；IL6R；KDR；Ki-67；Lewis A；Lewis Y；LIFRβ；LRP；LRP5；LTβR；MAGE；MART；间皮素；MUC；MUC1；MUM-1-B；myc；NYESO-1；O-乙酰基GD-2；O-乙酰基GD3；OSMRβ；p53；PD1；PD-L1；PD-L2；PRAME；孕酮受体；PSA；PSMA；PTCH1；RANK；ras；Robo1；RORl；存活蛋白；TCRα；TCRβ；肌腱蛋白；TGFBR1；TGFBR2；TLR7；TLR9；TNFR1；TNFR2；TNFRSF4；TWEAK-R；TSTA酪氨酸酶；VEGF；或WT1。
17.如实施方案1至16所述的组合治疗，其中所述结合结构域特异性结合HER2、ERBB2、CD33、PSMA、PD-L1、MUC16、FOLR、CD123或CLL-1。
18.如实施方案1至17中任一项所述的组合治疗，其中所述结合结构域来源于包括FMC63、SJ25C1、HD37、赫赛汀、帕博利珠单抗、FAZ053、阿维鲁单抗、阿特珠单抗或阿麦妥单抗的CDR集合、VH或VL的抗体。
19.如实施方案1至15中任一项所述的组合治疗，其中所述结合结构域包括scFv。
20.如实施方案1至15或19中任一项所述的组合治疗，其中所述结合结构域包括
(a)包含TASSSVNYIH(SEQ ID NO:14)的CDRL1、包含TSKVAS(SEQ ID NO:15)的CDRL2、包含QQWRSYPLT(SEQ ID NO:16)的CDRL3、包含DYVVH(SEQ ID NO:17)的CDRH1、包含YINPYNDGTKYNEKFKG(SEQ ID NO:18)的CDRH2以及包含DYRYEVYGMDY(SEQ ID NO:19)的CDRH3；
(b)包含RASEVDNYGISFMN(SEQ ID NO:20)的CDRL1、包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的CDRL2、包含QQSKEVPW(SEQ ID NO:22)的CDRL3、包含DYNMH(SEQ ID NO:23)的CDRH1、包含YIYPYNGGTGYNQKFKS(SEQ ID NO:24)的CDRH2以及包含GRPAMDY(SEQ ID NO:25)的CDRH3；
(c)可变轻链，所述可变轻链包含：
DIVLTQSPTIMSASPGERVTMTCTASSSVNYIHWYQQKSGDSPKRWIFDTSKVASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWRSYPLTFGDGTRLELKRADAAPTVS(SEQ ID NO:26)，和可变重链，所述可变重链包含：
EVKLQESGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTDYVVHWLKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEVSSLTSEDSAVYYCARDYRYEVYGMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:27)；
(d)可变轻链，所述可变轻链包含：
DIVLTQSPTIMSASPGERVTMTCTASSSVNYIHWYQQKSGDSPKRWIFDTSKVASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWRSYPLTFGDGTRLELKRADAAPTVS(SEQ ID NO:26)，和可变重链，所述可变重链包含：DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSANSSVSYIHWYQQKSGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWTSHPLTFGTGTKLQLKRADAAPTVS(SEQ ID NO:28)；
(e)包含RASQDINYYLN(SEQ ID NO:45)的CDRL1、包含YYSSRLHS(SEQ ID NO:46)的CDRL2、包含QQDDALPYT(SEQ ID NO:47)的CDRL3、包含KASGYAFSNYWMN(SEQ ID NO:48)的CDRH1、包含QINPGDGDTN(SEQ ID NO:49)的CDRH2以及包含AREDRDYFDY(SEQ ID NO:50)的CDRH3；
(f)包含QDINYY(SEQ ID NO:163)的CDRL1、包含YSS的CDRL2、包含QQDDALPYT(SEQID NO:47)的CDRL3、包含GYAFSNYW(SEQ ID NO:164)的CDRH1、包含INPGDGDT(SEQ ID NO:165)的CDRH2以及包含AREDRDYFDY(SEQ ID NO:50)的CDRH3；
(g)包含RASQDINYYLN(SEQ ID NO:45)的CDRL1、包含YSSRLHS(SEQ ID NO:166)的CDRL2、包含QQDDALPYT(SEQ ID NO:47)的CDRL3、包含NYWMN(SEQ ID NO:167)的CDRH1、包含QINPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO:168)的CDRH2以及包含EDRDYFDY(SEQ ID NO:169)的CDRH3；
(h)包含RASQDINYYLN(SEQ ID NO:45)的CDRL1、包含YSSRLHS(SEQ ID NO:166)的CDRL2、包含QQDDALPYT(SEQ ID NO:47)的CDRL3、包含GYAFSNY(SEQ ID NO:170)的CDRH1、包含NPGDGD(SEQ ID NO:171)的CDRH2以及包含EDRDYFDY(SEQ ID NO:169)的CDRH3；或
(i)可变轻链，所述可变轻链包含：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDINYYLNWYQQKPDGTVKLLIYYSSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEQEDIATYFCQQDDALPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:51)，和可变重链，所述可变重链包含：QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFSNYWMNWVKQRPGKGLEWIGQINPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREDRDYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:52)。
21.如实施方案1至20中任一项所述的组合治疗，其中所述细胞外组分和所述细胞内组分通过跨膜结构域连接。
22.如权利要求21所述的组合治疗，其中所述跨膜结构域是T细胞受体CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的α、β或ζ链的跨膜结构域。
23.如权利要求21所述的组合治疗，其中所述跨膜结构域是CD28的跨膜结构域。
24.如实施方案1至23中任一项所述的组合治疗，其中所述效应结构域包括CD3ζ、CD28、4-1BB、CD27、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C和/或B7-H3的细胞内信号传导结构域。
25.如实施方案1至24中任一项所述的组合治疗，其中所述效应结构域包括CD3ζ、CD28和/或4-1BB的细胞内信号传导结构域。
26.如实施方案1至25中任一项所述的组合治疗，其中所述效应结构域包括CD3ζ和4-1BB的细胞内信号传导结构域。
27.如实施方案1至25中任一项所述的组合治疗，其中所述效应结构域包括CD3ζ的变体(SEQ ID NOs:142或143)和4-1BB的一部分(SEQ ID NO:147或148)。
28.如实施方案1至27中任一项所述的组合治疗，其中所述CAR还包括结合结构域与细胞内组分之间的间隔区。
29.如实施方案28所述的组合治疗，其中所述间隔区包括免疫球蛋白铰链区或其部分。
30.如实施方案29或30所述的组合治疗，其中所述间隔区包括IgG4铰链区、IgG4铰链区和IgG4铰链CH3区，或IgG4铰链区、IgG4CH3区和IgG4 CH2区。
31.如实施方案1至30中任一项所述的组合治疗，其中所述CAR还包括控制特征，所述控制特征包括标签盒、转导标志物和/或自杀开关。
32.如实施方案1至31中任一项所述的组合治疗，其中所述CAR由SEQ ID NO:176或177编码。
33.如实施方案1至32中任一项所述的组合治疗，其中所述遗传修饰的免疫细胞是T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞/巨噬细胞、造血干细胞或造血祖细胞。
34.如实施方案33所述的组合治疗，其中所述T细胞选自CD3 T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和/或原初T细胞。
35.如实施方案33所述的组合治疗，其中所述T细胞是CD4 T细胞和/或CD8 T细胞。
36.如实施方案35所述的组合治疗，其包括1:1比率的CD4 T细胞和CD8 T细胞。
37.如实施方案1至36中任一项所述的组合治疗，其中所述遗传修饰的免疫细胞是离体的或体内的。
38.如实施方案1至37中任一项所述的组合治疗，其中所述组合治疗包括组合物，所述组合物包含至少两种离体遗传修饰的细胞类型，以表达所选组合治疗的CAR。
39.如实施方案38所述的组合治疗，其中所述至少两种细胞类型包括T细胞和自然杀伤细胞、T细胞和单核细胞/巨噬细胞、T细胞和造血干细胞、T细胞和造血祖细胞、自然杀伤细胞和单核细胞/巨噬细胞、自然杀伤细胞和造血干细胞、自然杀伤细胞和造血祖细胞、单核细胞/巨噬细胞和造血干细胞、单核细胞/巨噬细胞和造血祖细胞或造血干细胞和造血祖细胞。
40.如实施方案139中任一项所述的组合治疗，其包括引起细胞的体内遗传修饰以表达所述组合治疗的CAR部分的纳米颗粒。
41.如实施方案1至40中任一项所述的组合治疗，其包括引起细胞的体内遗传修饰以表达或包含TNFα信号增强因子的纳米颗粒。
42.一种细胞，其经遗传修饰以包含或表达如实施方案1至41中任一项所述的组合治疗。
43.如实施方案42所述的细胞，其中TNFα信号增强因子的表达由NFAT启动子控制。
44.如实施方案42或43所述的细胞，其中所述细胞是离体的或体内的。
45.如实施方案42至44中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞/巨噬细胞、造血干细胞或造血祖细胞。
46.如实施方案45所述的细胞，其中所述T细胞是CD3 T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和/或原初T细胞。
47.如实施方案45所述的细胞，其中所述T细胞是CD4 T细胞和/或CD8 T细胞。
48.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如实施方案1至41中任一项所述的组合治疗，从而治疗所述有需要的受试者的所述癌症。
49.如实施方案48所述的方法，其中所述治疗提供抗癌效果。
50.如实施方案49所述的方法，其中所述抗癌效果针对白血病、前列腺癌、乳腺癌、干细胞癌、卵巢癌、间皮瘤、肾细胞癌黑素瘤、胰腺癌、肺癌、HBV诱导的肝细胞癌或多发性骨髓瘤。
51.一种试剂盒，其包括实施如实施方案1至41中任一项所述的组合治疗的组分、如实施方案42至47中任一项所述的细胞和/或如实施方案48至50中任一项所述的方法。
(XI)结束段落。本文提供的核酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基和氨基酸残基的字母缩写来显示，如37C.F.R.§1.822中所定义并在WIPO标准ST.25(1998)，附录2，表1和表3中所阐述。仅显示了每个核酸序列的一条链，但是互补链被理解为包括在合适的实施方案中。
就本文未明确提供的程度而言，本文公开的蛋白质的编码序列和本文公开的编码序列的蛋白质序列可容易地从本领域普通技术人员获得。
本文所公开和引用的序列的变体也包括在内。使用本领域熟知的计算机程序，诸如DNASTARTM(Madison,Wisconsin)软件可以找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不破坏生物活性的指南。优选地，本文所公开的蛋白质变体中的氨基酸改变是保守氨基酸改变，即类似带电或不带电氨基酸的取代。保守性氨基酸改变涉及在其侧链相关的氨基酸家族之一的取代。
在肽或蛋白质中，氨基酸的合适的保守性取代是本领域技术人员已知的，并且通常可在不改变所得分子的生物活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，一般来说，多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物活性(参见例如，Watson等人Molecular Biology of the Gene,第4版,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页)。天然存在的氨基酸通常分为以下保守性取代家族：第1组：丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)；第2组：(酸性)：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)；第3组：(酸性；也分类为极性带负电的残基及其酰胺)：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、Asp和Glu；第4组：Gln和Asn；第5组：(碱性；也分类为极性带正电的残基)：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；第6组(大的脂族非极性残基)：异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)和半胱氨酸(Cys)；第7组(不带电的极性)：酪氨酸(Tyr)、Gly、Asn、Gln、Cys、Ser和Thr、第8组(大的芳族残基)：苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和Tyr；第9组(非极性)：脯氨酸(Pro)、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met和Trp；第11组(脂族)：Gly、Ala、Val、Leu和Ile；第10组(小的脂族非极性或弱极性残基)：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；以及第12组(含硫)：Met和Cys。另外的信息可以见于Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman and Company。
在制作此类变化时，可考虑氨基酸的亲水性指数。本领域中通常了解亲水性氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用性生物功能方面的重要性(Kyte和Doolittle,1982,J.Mol.Biol.157(1),105-32)。已基于每种氨基酸的疏水性和电荷特征对每种氨基酸指定亲水性指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些值是：Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；Gln(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)；和Arg(-4.5)。
本领域已知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或得分的其他氨基酸取代，并且仍然产生具有相似生物活性的蛋白质，即仍然获得生物学功能等同的蛋白质。在进行此类改变时，优选其亲水指数在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水指数在±1以内的氨基酸的取代，甚至更特别优选亲水指数在±0.5以内的氨基酸的取代。在本领域中还应了解，可基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。
如US 4,554,101中所详述，以下亲水性值已被指定给氨基酸残基：Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Thr(-0.4)；Pro(-0.5±1)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；Trp(-3.4)。应理解，氨基酸可被取代成具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学上等效的且特别是免疫学上等效的蛋白质。在此类改变中，优选其亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在±1以内的氨基酸的取代，甚至更特别优选亲水性值在±0.5以内的氨基酸的取代。
如上所概述，氨基酸取代可以基于氨基酸侧链取代的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。
如别处所指示，基因序列的变体可以包括密码子优化的变体、序列多态性、剪接变体和/或在统计学显著程度上不影响编码产物的功能的突变。
本文所公开的蛋白质、核酸和基因序列的变体还包括与本文所公开的蛋白质、核酸或基因序列具有至少70％序列同一性、80％序列同一性、85％序列同一性、90％序列同一性、95％序列同一性、96％序列同一性、97％序列同一性、98％序列同一性或99％序列同一性的序列。
“序列同一性％”是指如通过比较序列所确定的两种或更多种序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还意指在蛋白质、核酸或基因序列之间的序列相关程度，如通过此类序列的串之间的匹配所确定的。“同一性”(经常被称为“相似性”)可以通过已知方法来容易地计算，所述方法包括在以下文献中所描述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press,NY(1988)；Biocomputing:Informatics andGenome Projects(Smith,D.W.编辑)Academic Press,NY(1994)；Computer Analysis ofSequence Data,Part I(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press,NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(Von Heijne,G.编辑)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)OxfordUniversity Press,NY(1992)。确定同一性的优选方法被设计为给出在所测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法编写于可公开获得的计算机程序中。序列比对和同一性百分比计算可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR,Inc.,Madison,Wisconsin)的Megalign程序来执行。序列的多重比对还可使用Clustal比对方法(Higgins和Sharp CABIOS,5,151-153(1989)以默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)来执行。相关程序还包括GCG程序套件(威斯康星软件包9.0版，Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wisconsin)；BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；DNASTAR(DNASTAR,Inc.,Madison,Wisconsin)；以及并入Smith-Waterman算法的FASTA程序(Pearson,Comput.Methods Genome Res.,[Proc.Int.Symp.](1994),Meeting Date 1992,111-20.编辑：Suhai,Sandor.出版商：Plenum,New York,N.Y.。在本公开的上下文内，将了解在将序列分析软件用于分析的情况下，分析的结果是基于所引用的程序的“默认值”。如本文所用，“默认值”将意指在首次初始化时用软件最初加载的值或参数的任何集合。
变体还包括在严格杂交条件下与本文公开的序列杂交并提供与参考序列相同功能的核酸分子。示例性严格杂交条件包括在42℃下在包含50％甲酰胺、5XSSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5XDenhardt氏溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的剪切的鲑鱼精DNA的溶液中孵育过夜，随后在50℃下在0.1XSSC中洗涤过滤器。杂交和信号检测严格性的改变主要通过控制甲酰胺浓度(较低甲酰胺百分比导致严格性降低)；盐条件或温度来实现。例如，中等严格条件包括在37℃下在包含6XSSPE(20XSSPE＝3M NaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA，pH 7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鲑鱼精子阻断DNA的溶液中过夜孵育；然后在50℃下用1XSSPE、0.1％SDS洗涤。另外，为了获得甚至更低的严格性，可在更高的盐浓度(例如5XSSC)下进行严格杂交后进行的洗涤。上述条件的变化可以通过包括和/或替换杂交实验中用于抑制背景的备选阻断试剂来实现。典型的阻断试剂包括Denhardt氏试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑鱼精DNA和可商购获得的的专有配制品。由于相容性的问题，包含特定阻断试剂可能需要改变上述杂交条件。
“特异性地结合”是指结合结构域(例如，CAR结合结构域或纳米颗粒选择的细胞靶向配体的结合结构域)以等于或大于105M-1的亲和力或Ka(即，具有1/M单位的特定结合相互作用的平衡缔合常数)与其同源结合分子缔合，而不与相关环境样品中的任何其他分子或组分显著缔合。“特异性地结合”在本文中也称为“结合”。结合结构域可以被分类为“高亲和力”或“低亲和力”。在特定的实施方案中，“高亲和力”结合结构域是指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1或至少1013M-1的那些结合结构域。在特定的实施方案中，“低亲和力”结合结构域是指Ka为高达107M-1、高达106M-1、高达105M-1的那些结合结构域。可替代地，亲和力可以被定义为与M单位的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)(例如，10-5M至10-13M)。在某些实施方案中，结合结构域可以具有“增强的亲和力”，其是指选择的或工程化的结合结构域与同源结合分子的结合比野生型(或亲本)结合结构域更强。例如，增强的亲和力可能是由于对同源结合分子的Ka(平衡缔合常数)高于参考结合结构域，或由于对同源结合分子的Kd(解离常数)低于参考结合结构域，或由于对同源结合分子的解离速率(Koff)低于参考结合结构域。已知多种测定用于检测特异性地结合特定同源结合分子的结合结构域以及确定结合亲和力，诸如Western印迹、ELISA和
Figure BDA0003865811660000881
分析(也参见例如，Scatchard,等人,1949,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；和US5,283,173、US 5,468,614或等同物)。
除非另外指明，否则本公开的实践可以采用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。这些方法描述于以下出版物中。参见例如Sambrook,等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989)；F.M.Ausubel,等人编,CurrentProtocols in Molecular Biology,(1987)；the series Methods IN Enzymology(Academic Press,Inc.)；M.MacPherson,等人,PCR:A Practical Approach,IRL Press atOxford University Press(1991)；MacPherson等人编.PCR 2:Practical Approach,(1995)；Harlow和Lane编Antibodies,A Laboratory Manual,(1988)；和R.I.Freshney编Animal Cell Culture(1987)。
如本领域普通技术人员将了解的，本文所公开的每个实施方案可包含以下、基本上由或由以下组成：所述实施方案特别陈述的要素、步骤、成分或组分。因此，术语“包括(include)”或“包括(including)”应解释为叙述：“包含(comprise)、由……组成或基本上由……组成”。过渡术语“包括/包含(comprise)”或“包括/包含(comprises)”意指具有但不限于，并且允许包括未指定的要素、步骤、成分或组分，即使是主要量。过渡短语“由……组成”排除未指定的任何要素、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由……组成”将实施方案的范围限制为指定的要素、步骤、成分或组分以及并不实质地影响所述实施方案的那些要素、步骤、成分或组分。材料效应将导致对不需要的细胞(例如，癌细胞)的抗原非依赖性杀伤的统计学显著减少。
除非另外指示，否则说明书和权利要求中所用的表示成分的量，如分子量的性质、反应条件等的所有数值均应当理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求中所陈述的数值参数都是近似值，所述近似值可根据本发明要寻求获得的所需性质而变化。在最低限度，并且不试图将等效物原则的应用限制于权利要求的范围，每个数值参数均应当至少根据报告的有效数字的数值和通过应用普通四舍五入技术来解读。当要求进一步清楚时，术语“约”当与陈述的数值或范围结合使用时具有本领域技术人员合理地归于它的含义，即将稍微大于或稍微小于陈述值或范围表示为在以下范围内：陈述值的±20％；陈述值±19％；陈述值±18％；陈述值±17％；陈述值±16％；陈述值±15％；陈述值±14％；陈述值±13％；陈述值±12％；陈述值±11％；陈述值±10％；陈述值±9％；陈述值±8％；陈述值±7％；陈述值±6％；陈述值±5％；陈述值±4％；陈述值±3％；陈述值±2％；或陈述值±1％。
尽管陈述本发明的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中所陈述的数值尽可能准确地报告。然而，任何数值固有地包含必然由在其各自的测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。
除非本文另外指示或者与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在所附权利要求书的上下文中)使用的术语“一个/种”、“所述”以及类似的指代语应解读为涵盖单数和复数指代语。本文中列举数值的范围仅意在作为一种单个地提及落在所述范围内的每个单独数值的速记方法。除非本文另外指出，将每个单个值并入说明书，如同其在本文中被单独引用一样。除非本文中另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文中所描述的所有方法都可以按任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意在更好地说明本发明，而不会对原本要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解读为指示任何未要求保护的要素是实施本发明所必需的。
本文所公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应解读为是限制性的。每一群组成员均可单独地或以与所述群组的其他成员或本文中存在的其他要素的任何组合的方式被提及和被要求保护。可预见，出于简便和/或可专利性的原因，一个组的一个或多个成员可包括于所述组内，或从所述组中删除。当出现任何这种包括或删除时，本说明书被认为含有所修改的组，因此满足所附权利要求中使用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。
本文描述了本发明的某些实施方案，包括为本发明人所知用于实施本发明的最佳模式。当然，本领域技术人员在阅读前面的描述后将会明了这些所描述实施方案的变化形式。本发明人期望熟练的技术人员适当地采用这样的变化形式，并且本发明人打算以不同于本文具体描述的方式的方式实践本发明。因此，本发明包括适用法律允许的本发明所附权利要求中所叙述的主题的所有修改形式和等效形式。此外，除非本文另外指示或明显地与上下文矛盾，否则本发明涵盖其所有可能变体中的上述元素的任何组合。
此外，在整个说明书中，已经大量参考了专利、印刷的出版物、期刊文章和其他书面文本(本文的参考材料)。每一参考材料关于它们的参考教义单个地以引用的方式整体并入本文。
最后，应当理解，本文所公开的本发明的实施方案是对本发明原理的说明。可采用的其他修改形式也在本发明的范围内。因此，例如但不限于，可根据本文的教义利用本发明的替代配置。因而，本发明不限于明确示出和描述的实施方案。
本文示出的细节是作为实例并且仅出于说明性讨论本发明的优选实施方案的目的给出的，并且之所以呈现所述细节，是为了提供被认为是本发明的各个实施方案的原理和概念方面的最有用且易理解的描述的内容。就此而言，除对于本发明的基本理解所必需的之外，没有企图更详细地示出本发明的结构细节，借助于附图和/或实施例所作的描述使得本领域技术人员明了如何可以在实践中体现本发明的若干形式。
除非在实施例中明确并毫无疑问地修改或是当含义的应用使得任何构建无意义或基本上无意义，否则在本公开中使用的定义和解释意指并且旨在控制任何未来构建。在术语的解读将使它变得无意义或基本上无意义的情况下，定义应该从韦氏字典(Webster'sDictionary)第3版或本领域普通技术人员已知的字典诸如生物化学和分子生物学牛津字典(Attwood T等人编辑,Oxford University Press,Oxford,2006)中取得。

Claims (41)

1.一种组合治疗，其包括
(iii)经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，所述CAR包含细胞外组分和细胞内组分，其中所述细胞外组分包含结合由癌细胞表达的抗原的结合结构域，并且其中所述细胞内组分包含效应结构域；和
(iv)肿瘤坏死因子α(TNFα)信号增强因子。
2.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子激活、增强或支持肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员的作用，所述肿瘤坏死因子受体超家族成员激活、增强或支持TNFα信号传导途径成员，和/或其中所述TNFα信号增强因子激活、增强或支持TNFα信号传导途径成员的作用。
3.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子使TNFRSF成员的作用失活、抑制或破坏TNFRSF成员的作用，所述TNFRSF成员使TNFα信号传导途径成员失活、抑制或破坏TNFα信号传导途径成员。
4.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子激活、增强或支持TNFRSF成员1A、1B、3、6、8、10A、10B、12A、19和/或21，和/或使TNFRSF成员6B、10C和/或10D的作用失活、抑制或破坏TNFRSF成员6B、10C和/或10D的作用。
5.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子是引起TNFα信号增强因子蛋白表达的分子。
6.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子是TNFα信号增强因子蛋白。
7.如权利要求5所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子蛋白包括肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导剂(TWEAK)；肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)；和/或淋巴毒素同源物，其表现出可诱导的表达并与HSV糖蛋白D竞争结合疱疹病毒进入介体，是一种在T淋巴细胞上表达的受体(LIGHT)。
8.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子是破坏使TNFα信号传导途径成员失活、抑制或破坏TNFα信号传导途径成员的TNFRSF成员的表达的分子。
9.如权利要求8所述的组合治疗，其中所述破坏使TNFα信号传导途径成员失活、抑制或破坏TNFα信号传导途径成员的TNFRSF成员的表达的分子包括CRISPR/Cas分子、锌指核酸酶分子、TALEN或megaTAL。
10.如权利要求8所述的组合治疗，其中所述破坏使TNFα信号传导途径成员失活、抑制或破坏TNFα信号传导途径成员的TNFRSF成员的表达的分子包括碱基编辑器。
11.如权利要求1所述的组合治疗，其中表达所述CAR的如权利要求1所述的免疫细胞还包含或表达TNFα信号增强因子。
12.如权利要求1所述的组合治疗，其中表达所述CAR的如权利要求1所述的免疫细胞也被遗传修饰以包含或表达TNFα信号增强因子。
13.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述TNFα信号增强因子包括选自以下一种或多种的小分子：BV-6、CUDC-427、GDC-0152、LCL161、罗卡酰胺、西罗莫司、七叶素、恩利卡生、比瑞那帕、ASTX660、AZD5582、BI 891065、DEBIO 1143、APG-1387、HGS1029、AEG35156，以及具有连接至His标签和接头肽的人TRAIL的胞外结构域的重组蛋白。
14.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述CAR和/或所述TNFα信号增强因子的表达由NFAT启动子控制。
15.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述结合结构域是T细胞受体(TCR)或来源于抗体的CDR。
16.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述结合结构域特异性结合A33；BAGE；Bcl-2；β-连环蛋白；BCMA；B7H4；BTLA；CA125；CA19-9；CD3；CD5；CD20；CD21；CD22；CD25；CD28；CD30；CD33；CD37；CD38；CD40；CD52；CD44v6；CD45；CD56；CD79b；CD80；CD81；CD86；CD123；CD134；CD137；CD151；CD171；CD276；CEA；CEACAM6；CLL-1；c-Met；CS-1；CTLA-4；细胞周期蛋白B1；DAGE；EBNA；EGFR；EGFRvIII；肝配蛋白B2；ErbB2；HER2；ErbB4；EphA2；雌激素受体；FAP；铁蛋白；甲胎蛋白(AFP)；FLT1；FLT4；叶酸结合蛋白；FOLR；Frizzled；GAGE；G250；GD-2；GHRHR；GHR；GITR；GM2；GPRC5D；gp75；gp100(Pmel 17)；gp130；HLA；HER-2/neu；HPV E6；HPV E7；hTERT；HVEM；IGF1R；IL6R；KDR；Ki-67；Lewis A；Lewis Y；LIFRβ；LRP；LRP5；LTβR；MAGE；MART；间皮素；MUC；MUC1；MUM-1-B；myc；NYESO-1；O-乙酰基GD-2；O-乙酰基GD3；OSMRβ；p53；PD1；PD-L1；PD-L2；PRAME；孕酮受体；PSA；PSMA；PTCH1；RANK；ras；Robo1；RORl；存活蛋白；TCRα；TCRβ；肌腱蛋白；TGFBR1；TGFBR2；TLR7；TLR9；TNFR1；TNFR2；TNFRSF4；TWEAK-R；TSTA酪氨酸酶；VEGF；或WT1。
17.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述结合结构域特异性结合HER2、ERBB2、CD33、PSMA、PD-L1、MUC16、FOLR、CD123或CLL-1。
18.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述结合结构域来源于包含FMC63、SJ25C1、HD37、赫赛汀、帕博利珠单抗、FAZ053、阿维鲁单抗、阿特珠单抗或阿麦妥单抗的CDR集合、VH或VL的抗体。
19.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述细胞外组分和所述细胞内组分通过跨膜结构域连接。
20.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述效应结构域包含4-1BB和/或CD3ζ。
21.如权利要求19所述的组合治疗，其中所述CAR还包含所述结合结构域与所述跨膜结构域之间的间隔区。
22.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述CAR还包含控制特征或用控制特征表达，所述控制特征包括标签盒、转导标志物和/或自杀开关。
23.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述经遗传修饰的免疫细胞是T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞/巨噬细胞、造血干细胞或造血祖细胞。
24.如权利要求23所述的组合治疗，其中所述T细胞选自CD3 T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和/或原初T细胞。
25.如权利要求23所述的组合治疗，其中所述T细胞是CD4 T细胞和/或CD8 T细胞。
26.如权利要求25所述的组合治疗，其包含1:1比率的CD4 T细胞和CD8 T细胞。
27.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述经遗传修饰的免疫细胞是离体的或体内的。
28.如权利要求1所述的组合治疗，其中所述组合治疗包括组合物，所述组合物包含至少两种经离体遗传修饰的细胞类型，以表达所选组合治疗的CAR。
29.如权利要求28所述的组合治疗，其中所述至少两种细胞类型包括T细胞和自然杀伤细胞、T细胞和单核细胞/巨噬细胞、T细胞和造血干细胞、T细胞和造血祖细胞、自然杀伤细胞和单核细胞/巨噬细胞、自然杀伤细胞和造血干细胞、自然杀伤细胞和造血祖细胞、单核细胞/巨噬细胞和造血干细胞、单核细胞/巨噬细胞和造血祖细胞或造血干细胞和造血祖细胞。
30.如权利要求1所述的组合治疗，其包括引起细胞的体内遗传修饰以表达所述组合治疗的CAR部分的纳米颗粒。
31.如权利要求1所述的组合治疗，其包括引起细胞的体内遗传修饰以表达或包含TNFα信号增强因子的纳米颗粒。
32.一种细胞，其经遗传修饰以包含或表达权利要求1所述的组合治疗。
33.如权利要求32所述的细胞，其中CAR的表达由NFAT启动子控制。
34.如权利要求32所述的细胞，其中所述细胞是离体的或体内的。
35.如权利要求32所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞/巨噬细胞、造血干细胞或造血祖细胞。
36.如权利要求35所述的细胞，其中所述T细胞是CD3 T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和/或原初T细胞。
37.如权利要求35所述的细胞，其中所述T细胞是CD4 T细胞和/或CD8 T细胞。
38.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1所述的组合治疗，从而治疗所述有需要的受试者的所述癌症。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述治疗提供抗癌效果。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述抗癌效果针对白血病、前列腺癌、乳腺癌、干细胞癌、卵巢癌、间皮瘤、肾细胞癌黑素瘤、胰腺癌、肺癌、HBV诱导的肝细胞癌或多发性骨髓瘤。
41.一种试剂盒，其包括实施权利要求1所述的组合治疗的组分、权利要求32所述的细胞和/或权利要求38所述的方法。
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