JP2022547491A - ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴおよびＣＤ３に結合する二重特異性結合剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、前記第１の結合ドメインがＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに結合し、前記第２の結合ドメインがＣＤ３に結合する二重特異性結合剤に関する（図１）。

Description

本出願は、ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴおよびＣＤ３に結合する二重特異性結合剤に関する。

二重特異性抗体は、Ｔ細胞の活性を標的細胞に対してリダイレクトすることができ、ｉｎ ｖｉｖｏで選択的な殺生物作用を実現するための強力な抗体製品である。二重特異性抗体は、Ｔ細胞の存在下でナノモル以下の濃度で標的細胞を殺すことができる［１５］。ヒトＣＤ１９抗原およびＣＤ３抗原を同時に認識することができる１つの二重特異性抗体製品（ブリナツモマブ）は、フィラデルフィア染色体陰性の再発または難治性のＢ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療薬として販売承認を取得している［１６］。ブリナツモマブは二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ^TM）であり、２つの単鎖Ｆｖ抗体フラグメントの連続融合によって生成される組換え抗体フォーマットである［１７、１８］。

自己再生および未成熟造血幹・前駆細胞（ＨＳＣＰ）は、造血において骨髄性系列およびリンパ系列を生み出す［１］。単一の造血幹細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）や骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）などの血液悪性腫瘍の原因となることもある［２、３］。これらの病態は、治療的介入によってＡＭＬ細胞と前駆細胞を区別することが困難であるか、特に積極的なレジメンでは骨髄破壊のリスクがあるため、治療が難しいことがよくある。

前処置とそれに続くＨＳＣＴを特徴とする治療アプローチは、一部のＡＭＬ患者にとって命を救う選択肢となる可能性がある。高用量化学療法に基づく前処置とその後の造血幹細胞移植は、がん治癒につながる可能性があるが、かなりの毒性および無視できない死亡率と関連している［４］。この治療法は、積極的な化学療法レジメンに適さない患者（例えば、高齢の患者）を除外することが多く、むしろ緩和的な設定で脱メチル化剤を投与することができる［５］。また、積極的な処置レジメンは、ＡＭＬ患者の骨髄抑制を長期化させ、感染症に対する感受性という点で悪影響を及ぼす可能性がある［６］。そのため、より選択的な前処置戦略や、ＡＭＬ細胞に対して強力な殺生物活性を持つ薬剤の発見に、多大な研究努力が注がれている［７，８］。

モノクローナル抗体によるＣＤ１１７（ｃ－Ｋｉｔ）の選択的標的化は、内因性ＨＳＰＣ（造血幹細胞および前駆細胞）を除去する戦略として提案されており、効果的でありながら穏やかな前処置を可能にする。Ｉｒｖｉｎｇ Ｗｅｉｓｓｍａｎｎらは、免疫不全マウス［９］と免疫能力のあるマウス［７］の両方で、ｃ－Ｋｉｔ抗原に対するＩｇＧフォーマットのモノクローナル抗体を使用してＨＳＰＣを効率的に除去できることを実証した。抗ＣＤ４７抗体との組合せによって強化できるこの介入手順は、最近、炎症性疾患の潜在的な治療法として抗Ｋｉｔ治療抗体（ＡＭＧ １９１）（ＴＡＢ－４７０ＣＬ）を使用した臨床設定に変換された。また、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）患者の造血幹細胞移植のより穏やかな前処置アプローチを可能にする可能性もある［１０］。前臨床剤であるＫＴＮ０１８２Ａは、抗ＫＩＴであるピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む抗体薬物コンジュゲートであり、さまざまな種類の腫瘍に対してｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示す。しかし、これまでのところ、そのような製品は市場に出回っていない。

したがって、本発明の１つの目的は、腫瘍性疾患に苦しむ患者の治療オプションを改善することである。

本発明のさらなる目的の一つは、ＣＤ１１７陽性疾患に罹患している患者に対するさらなる治療オプションを提供することである。

本発明のさらなる目的の１つは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）に罹患している患者にさらなる治療オプションを提供することである。

これらおよび他の目的は、独立した請求項に記載の方法および手段によって達成される。従属請求項は、具体的な実施形態に関連する。

本発明は、少なくとも第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含む二重特異性結合剤を提供し、ここで、前記第１の結合ドメインは、ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに結合し、前記第２の結合ドメインは、ＣＤ３に結合する。本発明とその特徴および実施形態の一般的な利点について、以下に詳細に説明する。

ＣＤ１１７ｘＣＤ３のクローニング、発現、および特徴づけ。（Ａ）ＣＤ１１７ｘＣＤ３の鎖の配置。ｃ－Ｋｉｔ抗体７９Ｄ［１９］をＶＬ_79D－リンカー－ＶＨ_79Dの鎖順でクローニングし、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のヒト化バージョン（本明細書ではＢｌｉｎＣＤ３という）とＶＨ_BlinCD3－ＶＬ_BlinCD3の順に遺伝的に融合させた。このような二重特異性結合剤の１つの例示的な配列は、本明細書では配列番号２５として示されている（配列番号３４は、シグナルペプチドおよびＨｉｓタグも含む）。得られたコンストラクトを哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングした。（Ｂ）ＣＤ１１７ｘＣＤ３タンパク質の概略図。融合タンパク質のＮ末端を（Ｎ’）で示し、Ｃ末端にはＨｉｓ₆タグが見られる。（Ｃ）～５５ｋＤａの予想される（単量体）サイズでの移動を示す精製二重特異性抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。Ｍ＝マーカー、ＮＲ＝非還元条件。（Ｄ）精製物の質量分析では、２’０５３ダルトンの単一のＮ－グリコシル化が見られ、５３’４７５ダルトンの理論質量を確認した（図７も参照）。（Ｅ）示された濃度でのＢｉａｃｏｒｅ実験における組換え標的抗原ヒトｃ－ＫｉｔへのＣＤ１１７ｘＣＤ３の結合。

標的細胞のＣＤ１１７発現および細胞株に対するＣＤ１１７ｘＣＤ３の生物学的ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性。（Ａ）ＨＬ６０標的細胞株のＦＡＣＳプロファイル。ｃ－Ｋｉｔ形質導入手順によって生成された、さまざまなレベルのＣＤ１１７発現を示す。（Ｂ）標的細胞株の抗原密度の定量分析。ＨＬ６０^low、ＨＬ６０^med、ＨＬ６０^highの細胞は、それぞれ７９０９±９６０、２５１４６±２９６４、１１４５９７±１１４５０コピーの標的抗原ＣＤ１１７を発現することが示された。（Ｃ）標的細胞株の特異的溶解は、ＣＤ１１７ｘＣＤ３の濃度、および標的抗原密度に依存する。エフェクター（ヒトＴ細胞）と標的（異なるｃ－Ｋｉｔ発現レベルのＨＬ６０細胞株）の比率は１０：１である。（Ｄ）１μｇ／ｍｌの固定ＣＤ１１７ｘＣＤ３濃度で、エフェクターと標的の比率を１：２０から２０：１まで変化させた。

ＩＬ－２の存在下でのＣＤ１１７ｘＣＤ３の生物学的ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性。標的細胞株ＨＬ６０^low、ＨＬ６０^med、およびＨＬ６０^highの特異的溶解は、二重特異性抗体の濃度と抗原密度に依存していた。ＩＬ－２を添加してＴ細胞の活性化を高めても、溶菌活性に大きな変化は見られなかった。

初代骨髄サンプルおよび患者ＡＭＬサンプルに対するＣＤ１１７ｘＣＤ３の生物学的ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性。（Ａ）健康なドナー（ＢＭ＃２４９、ＢＭ＃３３３、＃ＢＭ ３５１）からの３つの異なる骨髄サンプルにおけるＣＤ１１７発現は、細胞間で変動する抗原密度を明らかにした。（Ｂ）ヒトＴ細胞および二重特異性抗体の濃度範囲（１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌ）の存在下での（Ａ）からの骨髄サンプルの特異的溶解。（Ｃ）３つの異なるＡＭＬ患者サンプルの分析は、サンプル内および患者間の比較の両方でＣＤ１１７発現の変動性を示した（ＣＤ４５^dim芽球細胞が示されている）。（Ｄ）濃度依存的に自己Ｔ細胞の存在下での（Ｃ）からの芽球細胞サンプルの特異的溶解。６つのサンプルすべてでエフェクターと標的の比率が１０：１（Ｂ＋Ｄ）。すべての実験は３回行った。（Ｅ）患者サンプル＃８７８のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷アッセイのＦＡＣＳプロットの例。ＣＤ４５^dim芽球細胞集団は、ＢｉＴＥ^TM濃度依存的に特異的に溶解された。

予防的設定におけるＡＭＬ細胞株に対するＣＤ１１７ｘＣＤ３の生物学的ｉｎ ｖｉｖｏ活性。（Ａ）ＡＭＬマウスモデルおよびＣＤ１１７ｘＣＤ３治療の実験スキーム：０日目、８週齢のＮＳＧマウスに亜致死量の放射線を照射し、３－６時間後に尾静脈から４ｘ１０⁶ＨＬ６０－ｌｕｃ－ＧＦＰ－ｃＫｉｔ^HIGH細胞を注入した。１日目、４ｘ１０⁶のヒトドナーＴ細胞を静脈内注射し、２５μｇのＣＤ１１７ｘＣＤ３を初回投与した。治療群では、２５μｇの二重特異性抗体を１８日間毎日注射した。２１日目、マウスを犠牲にし、骨髄細胞を大腿骨から洗い流し、ＦＡＣＳ分析のために染色した。（Ｂ）最終分析：マウスの骨髄中のＧＦＰ⁺ ＨＬ６０^HIGH細胞の定量化。ｒｏｒｏ治療群ではＧＦＰ＋細胞は存在しなかったが、対照群では生着率は０．１～３０％であった。（Ｃ）マウスの骨髄中のヒトＴ細胞の定量化。ヒトＴ細胞を注射した２つの群では、Ｔ細胞の生着率が０．１～２０％であった。両群間に統計的な有意差は認められなかった。

ＣＤ１１７ｘＣＤ３のＣＤ３への結合は、単離したヒトＴ細胞でＦＡＣＳによりテストされた。（Ａ）ＣＤ１１７ｘＣＤ３のアミノ酸配列。（Ｂ）ＣＤ１１７ｘＣＤ３のサイズ排除クロマトグラフィープロファイル。（Ｃ）ＨＬ６０ ｃ－Ｋｉｔ^high細胞およびヒトＴ細胞への結合を示すフローサイトメトリーデータ、ただしＨＬ６０ ｗｔ細胞には結合しない。

ＣＤ１１７ｘＣＤ３の質量分析。（Ａ）ＣＤ１１７ｘＣＤ３の質量分析では、質量５５５２６ダルトンの単一ピークが確認された。（Ｂ）ＰｎＧａｓｅ処理後のＣＤ１１７ｘＣＤ３の質量分析により、２０５７ダルトンのＮ－結合型グリコシル化が確認された。ＣＤ１１７ｘＣＤ３の理論上の質量：５３４７５ダルトン。

ｃ－Ｋｉｔの細胞外部分の調製と品質管理。（Ａ）ヒトｃ－Ｋｉｔの細胞外部分のドメイン４および５のアミノ酸配列。（Ｂ）ＳＤＳ ＰＡＧＥで、組換えｃ－Ｋｉｔの単一バンドを確認した。（Ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーでは、組換えタンパク質の予想サイズの約２倍のサイズに１つの主要ピークが見られ、二量体の状態が明らかになった。

さまざまな二重特異性抗体フォーマットの概要。図はＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．２０１５［５５］より引用。その内容は参照により本明細書に援用される。

Ｏｋｔ３（配列番号２７）とそのヒト化バリアントであるＢｌｉｎＣＤ３（配列番号２８）のｓｃＦｖ配列間のアラインメントを示す。両抗体の配列の同一性は９３％である。ＣＤＲは太字で表示されている。

発明の詳細な説明

本発明を詳細に説明する前に、本発明は説明されたデバイスの特定の構成要素部分に限定されず、あるいはそのようなデバイスおよび方法は変化する可能性があるので、説明された方法のプロセス工程に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することを意図したものではないことも理解されたい。明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈が明確に別途指示しない限り、単数形および／または複数形の参照を含むことに留意されたい。さらに、数値によって区切られるパラメータ範囲が与えられる場合、その範囲は、これらの限界値を含むものとみなされることを理解されたい。

さらに、本明細書に開示される実施形態は、互いに関連しない個々の実施形態として理解されることを意味しないことを理解されたい。一実施形態で議論される特徴は、本明細書に示される他の実施形態に関連しても開示されることを意味する。１つの場合において、特定の特徴が１つの実施形態で開示されず、別の実施形態で開示される場合、当業者は、前記特徴が前記他の実施形態で開示されることを意味しないことを必ずしも意味しないことを理解するのであろう。当業者であれば、他の実施形態についても前記特徴を開示することが本出願の主旨であるが、単に明瞭にするため、及び本明細書を管理可能な量に維持するために、これが行われていないことを理解されよう。

さらに、本明細書で参照される先行技術文献の内容は、参照により援用される。これは、特に、標準的または通常方法を開示する先行技術文献を指す。その場合、参照による援用は、十分に実施可能な開示を可能にし、長い反復を避ける目的がある。

本発明の第１の態様によれば、少なくとも第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含む二重特異性結合剤が提供され、前記第１の結合ドメインはＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに結合し、前記第２の結合ドメインはＣＤ３に結合する。別の実施形態では、前記第１の結合ドメインはＣＤ３に結合し、前記第２の結合ドメインはＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに結合する。

好ましくは、ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴは、例えばＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ１０７２１の下で開示されるようなヒトＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴである。

一実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ０７７６６の下で開示されるように、ＣＤ３のイプシロンサブユニット、好ましくはヒトＣＤ３に結合する。

マスト／幹細胞成長因子受容体（ＳＣＦＲ）は、プロトオンコジーンｃ－ＫＩＴまたはチロシンプロテインキナーゼＫＩＴまたはＣＤ１１７とも呼ばれ、ヒトではＫＩＴ遺伝子によってコードされる受容体型チロシンキナーゼタンパク質である。この遺伝子については、異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが見つかっている。ＫＩＴは、１９８７年にドイツの生化学者Ａｘｅｌ Ｕｌｌｒｉｃｈによって、猫の肉腫ウイルス腫瘍遺伝子ｖ－ｋｉｔの細胞ホモログとして最初に記述された。

ＣＤ１１７は、造血幹細胞や他の細胞型の表面に発現するサイトカイン受容体である。この受容体の変化した形態は、いくつかのタイプのがんに関連している可能性がある。ＣＤ１１７は、幹細胞因子（ある種の細胞を増殖させる物質）と結合するＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼで、「ｓｔｅｅｌ因子」または「ｃ－ｋｉｔリガンド」とも呼ばれる。この受容体が幹細胞因子（ＳＣＦ）と結合すると二量体を形成し、固有のチロシンキナーゼ活性を活性化し、次に細胞内でシグナルを伝播するシグナル伝達分子をリン酸化し活性化する［１０］。活性化後、受容体はユビキチン化されて、リソソームへの輸送と最終的破壊のマークが付けられる。ＣＤ１１７を介したシグナル伝達は、細胞の生存、増殖、および分化において役割を果たす。例えば、ＣＤ１１７シグナルはメラノサイトの生存に必要であり、また、造血や配偶子形成にも関与している。

ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼファミリーの他のメンバーと同様に、ＣＤ１１７は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、膜近傍ドメイン、および細胞内チロシンキナーゼドメインで構成されている。細胞外ドメインは５つの免疫グロブリン様ドメインからなり、プロテインキナーゼドメインは約８０アミノ酸からなる親水性挿入配列で中断されている。リガンド幹細胞因子は、２番目と３番目の免疫グロブリンドメインを介して結合する。

ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）分子は、特定の抗体によって認識される細胞表面のマーカーで、細胞の種類、分化の段階、活性を識別するために使用される。ＣＤ１１７は、骨髄中の特定の種類の造血（血液）前駆細胞を識別するために使用される重要な細胞表面マーカーである。具体的には、造血幹細胞（ＨＳＣ）、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、共通骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ）は、ＣＤ１１７を高レベルで発現する。共通リンパ系前駆細胞（ＣＬＰ）は、ＣＤ１１７の低表面レベルを発現する。ＣＤ１１７はまた、胸腺の最も初期の胸腺細胞前駆細胞－早期Ｔ細胞系前駆細胞（ＥＴＰ／ＤＮ１）およびＤＮ２胸腺細胞は高レベルのｃ－Ｋｉｔを発現していることを同定する。また、マウス前立腺幹細胞のマーカーでもある。また、マスト細胞、皮膚のメラノサイト、消化管のＣａｊａｌ間質細胞はＣＤ１１７を発現している。ヒトでは、ＣＲＴＨ２（ＣＤ２９４）の発現を欠くヘルパー様自然リンパ球（ＩＬＣ）でのｃ－ｋｉｔの発現を使用して、ＩＬＣ３集団をマークする。

ヒトでは、ＣＤ１１７／ｃ－Ｋｉｔはとりわけ造血細胞に存在し、造血の初期段階において重要な役割を担っているが、ＡＭＬ芽球にも発現している［１１－１４］。

免疫学では、ＣＤ３（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ３）Ｔ細胞共受容体は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞）とＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞）の両方の活性化に役立つ。タンパク質複合体で構成され、４つの異なる鎖で構成されている。哺乳類では、複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２つのＣＤ３ε鎖を含む。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびζ鎖（ゼータ鎖）と結合して、Ｔリンパ球に活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、およびＣＤ３分子が一緒になってＴＣＲ複合体を構成する。

ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの関連性の高い細胞表面タンパク質である。

アスパラギン酸残基を含むＣＤ３鎖の膜貫通領域は負に帯電しており、これらの鎖が正に帯電したＴＣＲ鎖と結合することを可能にする特性である。

ＣＤ３分子の細胞内テールには、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（略してＩＴＡＭ）として知られる単一の保存モチーフがあり、ＴＣＲのシグナル伝達能に不可欠である。ζ鎖の細胞内テールには３つのＩＴＡＭモチーフが存在する。

ＣＤ３上のＩＴＡＭがリン酸化されると、ＣＤ３鎖はＺＡＰ７０（ｚｅｔａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる酵素と結合できるようになる。この酵素は、Ｔ細胞のシグナル伝達カスケードにおいて重要なキナーゼである。ＣＤ３はＴ細胞の活性化に必要であるため、これを標的とした薬剤（多くはモノクローナル抗体）が免疫抑制療法として研究されている（例えば、１型糖尿病やその他の自己免疫疾患に対するｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ（ＴＲＸ４）、臓器移植患者における急性拒絶反応を抑えるＭｕｒｏｍｏｎａｂ－ＣＤ３（ＯＫＴ３（登録商標）など）。

一般に、ＣＤ３と他の標的を同時に標的とする多重特異的結合剤は、現在開発中か、あるいはすでに承認されている。最初に承認された二重特異性抗体の１つは、ＣＤ３およびＣＤ１９を標的とするブリナツモマブ（商品名Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（登録商標））であり、フィラデルフィア染色体陰性の再発または難治性急性リンパ芽球性白血病の二次治療として使用されている。これらのコンストラクトの基本的な考え方は、腫瘍特異的な標的を介して腫瘍細胞に結合し、ＣＤ３結合部位を介してＴ細胞に関与するというものである。

このように、コンセプトは興味深いが、それを臨床的に有利な薬剤にすることは、そう簡単ではない。二重特異性抗体の歴史は、失敗と失望に彩られている。

カツマキソマブ（商品名レモバブ（登録商標））は、ブリナツモマブよりさらに早く承認され、ＥｐＣＡＭ陽性のがん患者の悪性腹水の治療に使用されていた。ＣＤ３やＥｐＣＡＭと結合するが、２０１７年に市場から撤退した。

Ｘｅｎｃｏｒ社のＣＤ１２３ｘＣＤ３抗体ＸｍＡｂ１４０４５（ＷＯ２０１７２１０４４３）は、２０１９年２月に２名の患者が死亡し、臨床開発が中止となった。その他、ＣＤ１９ＸＣＤ３（Ａｆｆｉｍｅｄ社のＡＦＭ１１、ＷＯ２０１３０１３７００）、ＣＤ３ｘＢ７－Ｈ３（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ社のＭＧＤ００９、ＵＳ９４４１０４９Ｂ２）を標的とする製品も、Ｊ＆Ｊ社のＣＤ１２３ｘＣＤ３二重特異性ＪＮＪ－６３７０９１７８（ＥＰ３１８９０８１Ａ１）と同様に規制プロセスから取り下げられた。

以下に示すように、本発明による二重特異性結合剤（ＣＤ１１７ｘＣＤ３と呼ばれることもある）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＳＰＣとＡＭＬ細胞の両方に対してＴ細胞活性を強力にリダイレクトすることが可能であることがわかった。播種性白血病のマウスモデルにおいて、ＣＤ１１７ｘＣＤ３は骨髄へのＡＭＬ生着を完全に阻害した。本製品は、造血幹細胞移植に先立ち、様々な血液疾患の患者において、抗ｃ－Ｋｉｔ免疫グロブリンに代わるマイルドな前処置戦略として有利に働くものである。さらに、ＣＤ１１７ｘＣＤ３の強力な抗白血病活性は、根絶が難しいとされるＡＭＬ細胞を効率的に殺傷することに寄与する可能性がある。したがって、ＣＤ３および異なる標的を標的化する他の二重特異性抗体の有利な代替手段も提供する。

一実施形態によれば、二重特異性結合剤は、モノマーまたはヘテロマーのタンパク質またはペプチドであるか、または少なくとも１つのペプチド配列を含む。

一実施形態によれば、二重特異性結合剤は、抗体から誘導される少なくとも１つの伸張を含む。

一実施形態によれば、そのような伸張は、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくは３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１～３）または６つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３）の組である。

一実施形態によれば、そのような伸張は、少なくとも１つの可変抗体ドメイン、好ましくは２つの可変抗体ドメイン（重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン）の組においてである。

本発明の一実施形態によれば、前記第１の結合ドメインは、ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴの細胞外ドメインに結合し、および／または前記第２の結合ドメインは、ＣＤ３のε鎖および／またはＣＤ３のγ鎖に結合する。本発明の別の実施形態によれば、前記第２の結合ドメインは、ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴの細胞外ドメインに結合し、および／または前記第１の結合ドメインは、ＣＤ３のε鎖および／またはＣＤ３のγ鎖に結合する。

本発明の一実施形態によれば、二重特異性結合剤は、完全長抗体または抗体フラグメントのフォーマットであり、後者は標的結合特性を保持している。

一般的に、二重特異性抗体の多くのフォーマットが評価されてきた。レビューについては、例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ（２０１５）［５５］を参照し、その内容は、参照により本明細書に援用される。二重特異性抗体は、５つの明確な構造グループに分類される。
（ｉ） 二重特異性ＩｇＧ（ＢｓＩｇＧ）
（ｉｉ） 抗原結合部位が追加されたＩｇＧ
（ｉｉｉ） 二重特異性抗体フラグメント
（ｉｖ） 二重特異性融合タンパク質、および
（ｖ） 二重特異性抗体コンジュゲート。

さらに、よく区別されるのが
（ｉ） 非対称二重特異性抗体（異なる抗原への結合部分を含む異なる鎖を有するヘテロポリマー抗体）および
（ｉｉ） 対称二重特異性抗体（ヘテロポリマーまたはモノマー／単鎖抗体、異なる抗原への異なる結合部分が同じ鎖上にある場合）である。

一般に、モノマー／単鎖の構成であることが多い小型フォーマットは、血清半減期が短いため、頻繁あるいは恒常的に投与する必要があるが、サイトカインストームのような副作用が生じた場合には、直ちに治療を中断できる選択肢を提供するものである。

非対称型二重特異性抗体は、異なる鎖の翻訳後対合の際にしばしば問題を引き起こす。４種類の抗体鎖（各特異性ごとに重鎖および軽鎖）を同時に発現させると、不規則なペアリングが起こり、１０種類の産物ができ、そのうちの１種類だけが正しいバリアントとなることがある。ただし、これらのミスペアリングの問題は、さまざまな技術的アプローチで対処できる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ、２０１８を参照）。
各フォーマットの概要については、図１０を参照。これらのフォーマットはそれぞれ異なる特性や利点をもたらし、それゆえ、特に、
・ 各抗原の結合価、
・ 抗原結合部位の形状、ｃ、
・ 鎖のペアリングの正しさ、
・ 薬物動態的半減期
・ そして場合によってはエフェクター機能
などを優先して選ぶことができる。

本発明の実施形態によれば、二重特異性結合剤は、以下からなる群から選択される少なくとも１つのフォーマットである。
・ ＤＶＤ－Ｉｇ
・ ノブ・イン・ホール
・ クロスマブ
・ ＢｉＴＥ^TM
・ ナノボディ
・ ダイアボディ
・ ＤＡＲＴ^TM
・ ＴａｎｄＡｂ^TM、および／または
・ ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ

これらのフォーマットは、当業者によく知られている（定義については、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ（２０１５）［５５］を参照）。当業者は、本明細書に開示されるような可変ドメインおよび／またはＣＤＲの組を使用して、日常的な手段によって上記のフォーマットを作成することができる。

本発明の一実施形態によれば、二重特異性結合剤は、ＢｉＴＥのフォーマットである。

ＢｉＴＥフォーマットは、本質的に、ペプチドリンカー、通常はアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（「Ｇ４Ｓ」）を含むリンカーによって互いに結合された２つのｓｃＦｖフォーマットされた抗体からなる。得られた単鎖の質量は約５５ｋＤである。前記ＢｉＴＥは、以下のフォーマットを有することができる（可変ドメイン間のダッシュは任意のリンカーを表し、数字はＣＤ３またはＣＤ１１７のいずれかに対する親和性を表す）。
・ＶＨ₁－ＶＬ₁－ＶＬ₂－ＶＨ₂
・ＶＬ₁－ＶＨ₁－ＶＨ₂－ＶＬ₂
・ＶＬ₁－ＶＨ₁－ＶＬ₂－ＶＨ₂
・ＶＨ₁－ＶＬ₁－ＶＨ₂－ＶＬ₂

サイズが小さいため、ＢｉＴＥフォーマットは患者の非常に迅速なクリアランスプロファイルに関連付けられている。ブリナツモマブは、臨床的に承認された唯一のＢｉＴＥであり、一定流量の点滴ポンプを使用することにより、２８日間の持続点滴を行うことが可能である。そのため、重篤な有害事象が発生した場合には、直ちに抗体投与を中止することが可能である。

ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖはＢｉＴＥフォーマットと似ているが、第１または第２の標的の可変ドメインが重複している点が異なる（例えば以下に示す）。
・ＶＨ₁－ＶＬ₁－ＶＨ₁－ＶＬ₁－ＶＬ₂－ＶＨ₂
・ＶＬ₁－ＶＨ₁－ＶＬ₁－ＶＨ₁－ＶＨ₂－ＶＬ₂
・ＶＬ₁－ＶＨ₁－ＶＬ₁－ＶＨ₁－ＶＬ₂－ＶＨ₂
・ＶＨ₁－ＶＬ₁－ＶＨ₁－ＶＬ₁－ＶＨ₂－ＶＬ₂

ＴａｎｄＡｂ（Ｔａｎｄｅｍ Ｄｉａｂｏｄｙ）のフォーマットは、例えば以下のようなものである。
・ ＶＬ₁－ＶＨ₂－ＶＬ₂－ＶＨ₁
・ ＶＬ₂－ＶＨ₁－ＶＬ₁－ＶＨ₂

ＤＡＲＴフォーマットは、２本の鎖がシステインリンカーによって互いに接続された二量体フォーマットである。
・ 鎖１：ＶＬ_1-ＶＨ₂
・ 鎖２：ＶＨ_1-ＶＬ₂

本発明の一実施形態によれば、ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに結合する第１の結合ドメインが、
ａ） 配列番号１９および２０に記載の、抗ＣＤ１１７抗体７９Ｄの重鎖／軽鎖可変領域配列ペアに含まれる重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組を含むか、
ｂ） 以下の配列を含む重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組を含むか、
・ ＨＣ ＣＤＲ１（配列番号１または３５）、
・ ＨＣ ＣＤＲ２（配列番号２または３６）、
・ ＨＣ ＣＤＲ３（配列番号３または３７）、
・ ＬＣ ＣＤＲ１（配列番号４または３８）、
・ ＬＣ ＣＤＲ２（配列番号５または３９）、および
・ ＬＣ ＣＤＲ３（配列番号６または４０）、
ｃ） ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つがそれぞれの配列番号１～６または配列番号３５～４０に対して最大３個のアミノ酸置換を有するか、および／または
ｄ） ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つがそれぞれの配列番号１～６または配列番号３５～４０に対して６６％以上の配列同一性を有し、
ここで、ＣＤＲは、ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに結合できるように、適切なタンパク質フレームワークに埋め込まれている。

配列番号１～６および３５～４０の２つの組は同じ抗体に関連するが、ＣＤＲが定義された命名法が異なる。

本明細書中で使用される、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、両方の重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域内に見出される非隣接抗原結合部位を意味することを意図している。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら（１９７７）， Ｋａｂａｔら（１９９１）， Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）およびＭａｃＣａｌｌｕｍら，（１９９６）によって記載されており、定義では、互いに対して比較したときにアミノ酸残基の重複またはサブセットを含んでいる。それにもかかわらず、抗体または移植された抗体のＣＤＲまたはそのバリアントを参照するいずれかの定義の適用は、本明細書中で定義され使用される用語の範囲内であることが意図されている。上記参照の各々によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基は、比較として以下の表１に示す。ＣＤＲの定義はケースごとに異なるため、この番号付けは同封の配列表に実際に開示されたＣＤＲとは異なる可能性があることに注意すること。

本明細書中で使用する場合、抗体可変領域に関連して使用する場合の用語「フレームワーク」は、抗体の可変領域内のＣＤＲ領域外の全てのアミノ酸残基を意味するように入力する。したがって、可変領域のフレームワークは約１００から１２０アミノ酸の長さであるが、ＣＤＲ以外のアミノ酸のみを参照することを意図している。

一実施形態では、「標的Ｘに結合することができる」という用語は、十分な結合親和性で結合することを意味すると理解されるべきである。そのような実施形態では、それぞれの結合ドメインは、１０^-4以下のＫ_Dで標的に結合する。Ｋ_Dは、抗体とその抗原の間の平衡解離定数、ｋ_off/ｋ_onの比率である。Ｋ_Dと親和性は反比例の関係にある。Ｋ_D値は抗体の濃度（特定の実験に必要な抗体の量）に関連しているため、Ｋ_D値が低いほど（濃度が低いほど）、結合ドメインの高い親和性になる。

次の表は、モノクローナル抗体の典型的なＫ_D範囲を示している。

本発明の一実施形態によれば、ＣＤ３に結合する第２の結合ドメインは、
ａ） 以下の配列ＯＫＴ３、ＢｌｉｎＣＤ３を含む重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組を含むか、
ｂ） 配列番号２１および２２、または配列番号２３および２４に記載の抗ＣＤ３抗体ＢｌｉｎＣＤ３、ＯＫＴ３、および［・・・］のいずれか１つの重鎖／軽鎖可変領域配列ペアに含まれる重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組を含むか、
ｃ） 以下の配列を含む重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組を含むか、
・ ＨＣ ＣＤＲ１（配列番号７または４１）、
・ ＨＣ ＣＤＲ２（配列番号８または４２）、
・ ＨＣ ＣＤＲ３（配列番号９または４３）、
・ ＬＣ ＣＤＲ１（配列番号１０または４４）
・ ＬＣ ＣＤＲ２（配列番号１１または４５）、および
・ ＬＣ ＣＤＲ３（配列番号１２または４６）、
ｄ） 以下の配列を含む重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組を含むか、
・ ＨＣ ＣＤＲ１（配列番号１３）、
・ ＨＣ ＣＤＲ２（配列番号１４）、
・ ＨＣ ＣＤＲ３（配列番号１５）、
・ ＬＣ ＣＤＲ１（配列番号１６）、
・ ＬＣ ＣＤＲ２（配列番号１７）、および
・ ＬＣ ＣＤＲ３（配列番号１８）、
ｅ） ｂ）またはｃ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つが、それぞれの配列番号７～１２または配列番号４１～４６または配列番号１３～１８に対して最大３個のアミノ酸置換を有するか、および／または
ｆ） ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つが、それぞれの配列番号７～１２または配列番号４１～４６または配列番号１３～１８に対して６６％以上の配列同一性を有し、
ここで、ＣＤＲは、ＣＤ３に結合できるように適切なタンパク質フレームワークに埋め込まれている。

配列番号７～１２および４１～４６の２つの組は、同じ抗体に関連しているが、ＣＤＲが定義された異なる命名法にのみ関連している。

本明細書で使用する場合、７９Ｄは、Ｒｅｓｈｅｔｎｙａｋ ｅｔ ａｌ．２０１３に記載されている抗ＣＤ１１７／ｃ－Ｋｉｔ抗体であり、その内容は、参照により本明細書に援用される。

本明細書で使用される場合、ＯＫＴ３は、Ｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．２０１７に記載されている抗体であり、その内容は、参照により本明細書に援用される。

ＯＫＴ３のＩＮＮはムロモナブ－ＣＤ３である。ＯＫＴ３は米国によって承認された１９８５年にＦＤＡ（米国食品医薬品局）から、ヒトに対する医薬品として世界で初めて承認されたモノクローナル抗体である。Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ－ＣＤ３は、ＩｇＧフォーマットで提供されるマウス抗体で、ＣＤ３εを標的としている。それは、同種異系の腎臓、心臓および肝臓移植の急性の糖質コルチコイド耐性拒絶の治療のために承認されている。また、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病の治療に使用することも検討されている。

本明細書で使用される場合、ＢｌｉｎＣＤ３は、Ｄｒｕｇｂａｎｋ、アクセッション番号ＤＢ０９０５２、ＡＡ残基２５６～４９８に記載されている抗体であり、その内容は参照により本明細書に援用される。ＢｌｉｎＣＤ３は、ヒト化によってＯＫＴ３に由来し（Ｄｏｒｋｅｎ ｅｔ ａｌ、２０１８）、可変ドメインで約９３％の配列同一性を持っている。図１１にアライメントを示す。ＣＤＲは太字で表示されている。ＬＣＤＲ ２と３のみが、それぞれのＣ末端ＡＡ残基が互いにわずかに異なる。

好ましくは、二重特異性結合剤は、最大２つのアミノ酸置換、より好ましくは最大１つのアミノ酸置換を有する。

好ましくは、ＣＤＲの少なくとも１つは、それぞれの配列番号に対して６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する。

本明細書で使用される場合、「％配列同一性」という用語は、以下のように理解されなければならない：比較する２つの配列は、配列間の相関が最大になるようにアライメントされる。これには、アラインメントの程度を高めるために、一方または両方の配列に「ギャップ」を挿入することが含まれる場合がある。次に、比較される各配列の全長にわたって％の同一性を決定することができ（いわゆる全体的アラインメント）、これは、特に、長さが同じか類似しているか、または長さが短く規定されている配列（いわゆる局所的アラインメント）に適している。上記文脈において、少なくとも、例えば、照会アミノ酸配列に対して９５％の「配列同一性」を有するアミノ酸配列は、対象アミノ酸配列の配列が、照会アミノ酸配列の各々１００アミノ酸当たり最大５個のアミノ酸変化を含み得ることを除いて、対象アミノ酸配列の配列が照会配列と同一であることを意味するよう意図されている。言い換えると、照会アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を得るためには、対象アミノ酸配列中のアミノ酸残基の５％（１００個中５個）までを別のアミノ酸で挿入または置換するか、欠失させてもよい。２つ以上の配列の同一性および相同性を比較する方法は、当該技術分野において周知である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、例えば数学的アルゴリズムを用いて決定することができる。数学的アルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴまたはＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＦＡＳＴＡなどのプログラムのＢＬＡＳＴファミリーに統合されているが、限定するものではない。他の配列とある程度同一である配列は、これらのプログラムによって同定することができる。さらに、ウィスコンシン配列分析パッケージ、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰにおいて利用可能なプログラム９．１が、２つのポリペプチド配列間の％同一性を決定するために使用され得る。ここで言及されているのが、参照配列に対して特定の程度の配列同一性を共有するアミノ酸配列である場合、配列の相違は、好ましくは保存的アミノ酸置換によるものである。好ましくは、そのような配列は、例えば、より遅い速度であり得るが、参照配列の活性を保持する。

好ましくは、ＣＤＲの少なくとも１つは、以下を含むＣＤＲ配列修飾に対象であった。
・ 親和性成熟
・ 免疫原性の低下

所定の抗体の親和性がｉｎ ｖｉｔｒｏ増加する過程における親和性成熟天然の対応物と同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性の成熟も変異と選択の原理に基づいている。これは、抗体、抗体フラグメントまたは抗体ミメティックのような他のペプチド分子を最適化するために首尾よく使用されている。ＣＤＲ内部のランダム変異は、放射線、化学的変異原またはエラープローンＰＣＲを用いて導入される。さらに、チェーンシャフリングによって遺伝的多様性を増加させることができる。ファージディスプレイ法のようなディスプレイ法を用いて２、３ラウンドの変異と選択を行うと、通常、低ナノモル域で親和性をもつ抗体フラグメントが生じる。原理については、Ｅｙｌｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）を参照のこと。その内容は、参照により本明細書に援用される。

ヒト化抗体は、マウス配列由来のＣＤＲ領域を、必要なフレームワーク復帰変異とともに、ヒト配列由来のＶ領域に含む。したがって、ヒト化抗体を患者に投与すると、ＣＤＲ自体が免疫原性の反応を引き起こすことができる。ＣＤＲによって引き起こされる免疫原性を減少させる方法は、Ｈａｒｄｉｎｇら（２０１０）に開示されており、その内容は、参照により本明細書に援用される。

本発明の一実施形態によれば、フレームワークはヒトＶＨ／ＶＬフレームワークである。ＶＨはＩｇＧ形抗体の重鎖可変ドメインの略であり、ＶＬは軽鎖可変ドメイン（カッパまたはラムダ）の略である。

本発明の１つの実施形態によれば、ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに結合する第１の結合ドメインは、以下のものを含む。
ａ） 抗体７９Ｄの可変ドメイン
ｂ） 重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）
・ ＨＣ ＶＤ（配列番号１９）、および
・ ＬＣ ＶＤ（配列番号２０）
ｃ） ｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）、ただし
・ ＨＣ ＶＤは、それぞれの配列番号１９に対して８０％以上の配列同一性を有するか、および／または
・ ＬＣ ＶＤはそれぞれの配列番号２０に対して８０％以上の配列同一性をする、
ｄ） ｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）、ただし、ＨＣ ＶＤまたはＬＣ ＶＤの少なくとも１つが、それぞれの配列番号１９および／または２０に対して最大１０個のアミノ酸置換を有する、
上記の二重特異性結合剤は、依然としてＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに結合することができる。

抗体またはその重鎖または軽鎖に関連して使用される「可変ドメイン」は、分子上に抗原結合を付与し、かつ定常領域ではない抗体の一部を意味することを意図している。この用語は、可変領域全体の結合機能の一部を維持するその機能性フラグメントを含むことを意図している。可変領域結合フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃｆｖ）などの機能性フラグメントが含まれる。このような機能性フラグメントは当業者には周知である。したがって、ヘテロマー可変領域の機能性フラグメントを記述する際のこれらの用語の使用は、当業者に周知の定義に対応することを意図している。そのような用語は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、（１９９３）またはＰｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ （１９９０）に記載されている。
本発明の一実施形態によれば、ＣＤ３に結合する第２の結合ドメインは、
ａ） ＯＫＴ３とＢｌｉｎＣＤ３からなるグループから選択された１つの抗体の可変ドメイン
ｂ） 重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）
・ ＨＣ ＶＤ（配列番号２１または２３）、および
・ ＬＣ ＶＤ（配列番号２２または２４）
ｃ） ｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）、ただし
・ ＨＣＶＤは、それぞれの配列番号２１または２３に対して８０％以上の配列同一性を有し、および／または
・ ＬＣＤＶＤは、それぞれの配列番号２２または２４に対して８０％以上の配列同一性を有する、
ｄ） ｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）であって、但しＨＣＶＤまたはＬＣＶＤの少なくとも１つが、それぞれの配列番号に対して最大１０個のアミノ酸置換を有する重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）であって、
上記の二重特異性結合剤は依然としてＣＤ３に結合することができる

好ましくは、可変ドメインの少なくとも１つは、それぞれの配列番号に対して、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列同一性を有する。

本発明の一実施形態によれば、少なくとも１つのアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。

「保存的アミノ酸置換」は、非保存的置換よりも抗体機能への影響が小さい。アミノ酸の分類にはいろいろな方法があるが、それらの構造とＲ基の全般的な化学的性質に基づいて、しばしば６つの主要な群に分類される。

一実施形態では、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されたものである。例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、以下を有するアミノ酸が含まれる。
・ 塩基性側鎖（リジン、アルギニン、ヒスチジンなど）、
・ 酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸など）、
・ 非荷電極性側鎖（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインなど）、
・ 非極性側鎖（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンなど）、
・ β分岐側鎖（スレオニン、バリン、イソロイシンなど）、
・ 芳香族側鎖（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなど）。

他の保存されたアミノ酸置換は、ペプチドの電荷を修飾するためにアスパラギンをアスパラギン酸に置換する場合のように、アミノ酸側鎖ファミリーを横切って起こることもできる。したがって、例えば、ＨＲドメインポリペプチド中の予測される非必須アミノ酸残基は、ファミリーを越えて同じ側鎖ファミリーまたはホモログ由来の別のアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸についてはアスパラギン、グルタミン酸についてはグルタミン）と置換されることが好ましい。保存的変化には、さらに、化学的に相同な非天然アミノ酸（すなわち、ロイシンの代わりに合成非天然疎水性アミノ酸、トリプトファンの代わりに合成非天然芳香族アミノ酸）の置換を含むことができる。

本発明の実施形態によれば、対応する可変重鎖領域（ＶＨ）および対応する可変軽鎖領域（ＶＬ）領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の順序で配置される。
・ Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ３）、
・ Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）、
・ Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ３）、
・ Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）、
・ Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）、
・ Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）、
・ Ｖ_H（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）、および／または
・ Ｖ_H（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）、
ここで、「リンカー」という用語は、例えば、配列番号３２、３２、または３３に開示されているような、任意のポリペプチドリンカーを定義する。これらの実施形態はすべて、本明細書の他の場所で論じられているＢｉＴＥフォーマットに準拠している。

そのような実施形態の例は、配列番号２５、２６、３４、５９および６０のいずれかに与えられている。なお、配列によっては、Ｈｉｓタグやシグナル配列が含まれる場合がある。これらの配列は、Ｈｉｓタグおよび／またはシグナル配列の有無にかかわらず開示されているものとする。

本発明の実施形態によれば、対応する可変重鎖領域（ＶＨ）および対応する可変軽鎖領域（ＶＬ）領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の順序で配置される。
・ Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ３）

この実施形態は、本明細書の他の場所で論じられているｓｃＤｂ－ｓｃＦｖフォーマットに準拠している。そのような実施形態の例は、配列番号６１に示されている。

本発明のさらなる実施形態によれば、対応する可変重鎖領域（ＶＨ）および対応する可変軽鎖領域（ＶＬ）領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の順序で配置される。
・ Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）－Ｖ_H（ＣＤ３）

この実施形態は、本明細書の他の場所で論じられているＴａｎｄＡｂフォーマットに準拠している。そのような実施形態の例は、配列番号６２に示されている。

本発明のさらなる実施形態によれば、対応する可変重鎖領域（ＶＨ）および対応する可変軽鎖領域（ＶＬ）領域は、Ｎ末端からＣ末端までの順序で、異形二量体構成で配置される。
・ 鎖１：Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）－Ｃｙｓ
・ 鎖２：Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）－Ｃｙｓ

Ｃ末端の２つのシステイン残基によってジスルフィド結合が確立されている。この実施形態は、本明細書の他の場所で論じられているＤＡＲＴフォーマットに準拠している。そのような実施形態の例は、配列番号６３および６４に示されている。

本発明の一実施形態によれば、ＣＤ３に結合する第２結合ドメインは
ａ）配列番号２８または２９のいずれか１つに記載されているｓｃＦｖ様配列を含むか、または
ｂ）配列番号２８または２９のいずれか１つに対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

好ましくは、配列は、それぞれの配列番号に対して、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列同一性を有する。

本発明の一実施形態によれば、ＣＤ１１７／ｃＫＩＴに結合する第１結合ドメインは
ａ）配列番号２７に記載のｓｃＦｖ様配列を含むか、または
ｂ）配列番号２７に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

好ましくは、配列は、それぞれの配列番号に対して、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列同一性を有する。

本発明の１つの実施形態によれば、二重特異性結合剤は
ａ）配列番号２５、２６、３４、５９または６０から選択される配列の少なくとも１つを含むか、または
ｂ）配列番号２５、２６、３４、５９または６０に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

なお、配列によっては、Ｈｉｓタグやシグナル配列が含まれる場合がある。これらの配列は、Ｈｉｓタグおよび／またはシグナル配列の有無にかかわらず開示されているものとする。同様に、それぞれの請求項によって提供される保護は、Ｈｉｓタグおよび／またはシグナル配列の有無かわらず、実施形態を包含することを意図する。

好ましくは、配列は、それぞれの配列番号に対して、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列同一性を有する。

本発明の一実施形態によれば、二重特異性結合剤は、以下の少なくとも１つを有する。
請求項１４に記載の二重特異性結合剤と比較して、
・ ＳＰＲによって測定して、ＣＤ３に対して５０％以上の標的結合親和性を有するか、および／または
・ ＳＰＲによって測定して、ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに対して５０％以上の標的結合親和性を有する。

本明細書中で使用される場合、用語「結合親和性」は、結合相互作用の強度を意味することが意図され、したがって、実際の結合親和性ならびに見かけの結合親和性の両方を含む。実際の結合親和性は、解離速度に対する会合速度の比である。したがって、結合親和性を付与または最適化するには、結合親和性の所望のレベルを達成するためにこれらの成分のいずれかまたは両方を変更することが含まれる。見かけの親和性には、例えば、相互作用のアビディティを含むことができる。例えば、二価のヘテロマー可変領域結合フラグメントは、その価数のために改変された、または最適化された結合親和性を示すことができる。

結合剤の親和性を測定するのに適した方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を通してである。この方法は、表面プラズモン波が金属／液体界面で励起されたときに生じる現象に基づいている。光は試料に接していない表面の側表面に照射され、反射され、ＳＰＲは角度と波長の特定の組合せで反射光強度の低下を引き起こす。生体分子結合事象は表層での屈折率の変化を引き起こし、これはＳＰＲシグナルの変化として検出される。結合事象は、受容体－リガンド対間の結合会合または解離のいずれかであり得る。屈折率の変化は、基本的に瞬時に測定することができ、したがって、親和性定数の個々の構成要素の決定を可能にする。より具体的には、この方法は、会合速度（ｋ_on）および解離速度（ｋ_off）の正確な測定を可能にする。

ｋ_on およびｋ_off を測定すると、変更された可変領域または最適化された可変領域を特定できるため、効果的である。例えば、改変された可変領域、またはそのヘテロマー結合断片は、例えば、類似の結合親和性を示す可変領域およびヘテロマー結合フラグメントと比較して、より高いｋ_onを有するため、より有効であり得る。ｋ_onが高い分子ほど、より速い速度でその標的に特異的に結合して阻害することができるので、効果の増大がもたらされる。同様に、本発明の分子は、同様の結合親和性を有する分子と比較してより低いｋ_off値を示すので、より効果的であり得る。ｋ_off速度が低い分子ほど効力が高くなるのは、いったん結合すると、分子の標的からの解離が遅くなるからである。そのヘテロマー可変領域結合断片を含む本発明の改変された可変領域および最適化された可変領域に言及されているが、会合および解離速度を測定するための上述の方法は、治療または診断のためのより効果的な結合剤を同定するために、本質的に任意の抗体またはそのフラグメントに適用可能である。

表面プラズモン共鳴を用いた会合および解離速度を含む親和性を測定する方法は、当業者においてよく知られており、例えば、ＪｏｎｓｓｏｎおよびＭａｌｍｑｕｉｓｔ、（１９９２）およびＷｕら（１９９８）に記載することができる。さらに、結合相互作用を測定するための当技術分野でよく知られている１つの装置は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（スウェーデン、ウプサラ）を通じて市販されているＢＩＡｃｏｒｅ ２０００機器である。

好ましくは、前記標的結合親和性は、二重特異性結合剤のそれと比較して、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％以上、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。

本発明の別の態様によれば、上記の説明による二重特異性結合剤とＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴおよびＣＤ３への結合を競合させる二重特異性結合剤が提供される。

このような結合剤のフォーマットまたは構造に関しては、上記と同様の好ましい実施形態が適用される。本明細書で使用する「結合を競合する」という用語は、活性を有する第２の結合剤と同じ標的に結合する活性を有する第１の結合剤に関して使用され、ここで第２の結合剤は第１の結合剤のバリアントまたは関連もしくは非類似の結合剤である。第１の結合剤による結合の効率（例えば、動力学または熱力学）は、第２の結合剤による効率基質結合と同じであってもよいし、それ以上であってもよいし、それ以下であってもよい。例えば、基質に結合するための平衡結合定数（Ｋ_D）は、２つの結合剤について異なる可能性がある。

結合に対するこのような競合は、競合結合アッセイで適切に測定することができる。そのようなアッセイは、Ｆｉｎｃｏら２０１１に開示されており、その内容は参照により本明細書に援用され、特許請求項の解釈のためのそれらの意味は、Ｄｅｎｇら２０１８に開示されており、その内容は参照により本明細書に援用される。

本発明の別の態様によれば、上記の説明による二重特異性結合剤と本質的に同じ、または同じ、ＣＤ３およびＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴ上のエピトープに結合する二重特異性結合剤が提供される。
この特性を試験するために、適当なエピトープ地図作成技術が利用可能であり、とりわけ、以下を含む：
・ Ｘ線共結晶解析と低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）
・ アレイ－ベースのオリゴ－ペプチドスキャニング
・ 部位特異的変異誘発マッピング
・ ハイスループットショットガン変異誘発エピトープマッピング
・ 水素－重水素交換
・ 架橋結合質量分析法

これらの方法は、特に、Ｂａｎｉｋら（２０１０）、およびＤｅＬｉｓｓｅｒ （１９９９）において開示され、議論されており、その内容は、参照により本明細書に援用される。

本発明の別の態様によれば、前述の請求項のいずれか１つに記載の結合剤をコードする核酸が提供される。

コードされた結合剤の所定の配列は、そのような核酸分子が、遺伝コードの縮重のために異なる配列を有することができる。

このような核酸分子は、薬学的目的に使用することができる。このような場合、患者に投与されるのはＲＮＡ由来の分子であり、患者のタンパク質発現機構がそれぞれの結合剤を発現する。ｍＲＮＡは、例えば、適当なリポソーム中で送達され得、免疫応答を回避し、および／または折りたたみおよび翻訳効率を改善するための特異的配列または修飾ウリジンヌクレオシド類のいずれかを含み、時には、それらを特定の細胞型に標的化するための５’および／または３’末端でのキャップ修飾を含む。

このような核酸分子は、発現宿主をトランスフェクトし、次いで実際の結合剤を発現させるために用いることができる。このような場合、その分子は、任意に適当なベクターに組み込まれるｃＤＮＡであり得る。

本発明の別の態様によれば、前述の請求項のいずれか１項に記載の二重特異性結合剤又は核酸と、任意に１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。

本発明の別の態様によれば、（ｉ）前述の請求項のいずれか１項に記載の二重特異性結合剤又は医薬組成物と、（ｉｉ）１つ又は複数の治療的活性化合物とを含む組合せが提供される。

本発明の別の態様によれば、
・ 腫瘍性疾患と診断されているか、
・ 腫瘍性疾患に罹患しているか、または
・ 腫瘍性疾患の発症のリスクがある
ヒトまたは動物対象の治療におけるまたはそのような状態の予防のため（医薬品の製造において）使用するための前述の請求項のいずれか１項に記載の二重特異性結合剤、医薬組成物または組合せ。

本発明の別の態様によれば、腫瘍性疾患を治療または予防するための方法が提供され、それを必要とする対象に、前述の請求項のいずれか１つによる有効量の二重特異性結合剤、医薬組成物または組合せを投与することを含む。

好ましくは、腫瘍性疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からなる群から選択される。

本発明の別の態様によれば、部品の治療キットが提供され、それは以下を含む：
ａ） 前述の請求項のいずれかによる二重特異性結合剤、医薬組成物または組合せ、
ｂ） 組成物、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ） キットの使用のための説明書。

このような実施形態は、例えば、患者による自己投与のためのペンまたは注射器、あるいは経皮適用のための絆創膏などである。

本発明は図面および前記の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲の研究から、請求される発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、他の要素又はステップを排除するものではなく、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」は複数形を除外するものではない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組合せを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲のどの引用符号も、範囲を限定すると解釈するべきではない。

本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端まで示される；本明細書に開示される全ての核酸配列は、５’－＞３’で示される。
材料及び方法
１．二重特異性抗体の構築

二重特異性抗体は、抗ヒトｃ－Ｋｉｔ抗体７９Ｄ［１９］、（本明細書では配列番号２９として示すｓｃＦｖ配列）、およびＢｌｉｎＣＤ３と呼ばれる抗ヒトＣＤ３抗体ＯＫＴ３［２０］のヒト化バージョン（本明細書では配列番号２８として示すｓｃＦｖ配列）から構築された。それは、ＶＬ_79D－リンカー_15aa－ＶＨ_79D－リンカー_5aa－ＶＨ_BlinCD3－リンカー_18aa－ＶＬ_BlinCD3－Ｈｉｓ₆の順序で連続オーバーラップＰＣＲによって遺伝的に組み立てられ、哺乳類の排泄シグナル配列の下流のｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにクローン化されました。最初のステップでは、ＶＬ_79D、ＶＨ_79D、ＶＨ_BlinCD3およびＶＬ_BlinCD3のｃＤＮＡ配列が増幅された。２番目のステップでは、ＶＬ_79D－リンカー_15aa－ＶＨ_79DおよびＶＨ_BlinCD3－リンカー_18aa－ＶＬ_BlinCD3フラグメントがアセンブルされ、最後のクローニングステップでは、２つのｓｃＦｖコーディングフラグメントがアセンブルされて完全なコンストラクトが生成された。次に、最終フラグメントをメーカーのプロトコルに従ってＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦとＮｏｔＩで消化し、発現ベクターにライゲーションした。
２．細胞株

二重特異性抗体の産生には、懸濁液中のチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ－Ｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。懸濁液中のＣＨＯ－Ｓ細胞は、８ｍＭウルトラグルタミンとＨＴサプリメントを添加したＰｏｗｅｒＣＨＯ培地のシェーカーインキュベーター（３７℃）で培養した。

ＨＬ－６０細胞（ＣＣＬ－２４０^TM、ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、バージニア州、米国）は、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。
３．タンパク質の発現と精製

二重特異性抗体は、一過性の遺伝子発現によって産生された。１リットルの生産のために、４ｘ１０⁹のＣＨＯ－Ｓ細胞をＰＲＯＣＨＯ４（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁しました。プラスミドＤＮＡ（３２００μｇ）と１０ｍｌ １ｍｇ／ｍｌポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を細胞懸濁液に加えた。次に、トランスフェクトされた培養物をシェーカーインキュベーター内で３１℃で６日間インキュベートした。融合タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養培地から精製され、次にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析された。
４．表面プラズモン共鳴

二重特異性抗体溶液をろ過し（０．２２μｍ ＰＶＤＦフィルターを使用）、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｓ２００装置と抗原をコートしたＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア）を用いてその結合特性を分析した。このチップは、メーカーのプロトコルに従ってヒトｃ－Ｋｉｔドメイン４＆５を共有結合させて調製したものである。
５．Ｔ細胞の分離

ヒトＰＢＭＣは、健康なドナー（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ Ｚｕｒｉｃｈ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから提供）の過剰な緩衝液から密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｃｈｉｃａｇｏ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ， ＵＳＡ）により濃縮された。ＥａｓｙＳｅｐＴＭビーズ（ヒトＴ細胞分離キット、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）を使用してヒトＴ細胞をネガティブに分離した。精製したＴ細胞を１０％ＤＭＳＯを添加した９０％ＦＣＳで凍結保存し、解凍するまで液体窒素で保存した。
６．健康なドナーからのＡＭＬ患者細胞と骨髄細胞

健康な骨髄提供者とＡＭＬ患者は、書面での同意を得ており、スイス・チューリッヒ州の倫理委員会により研究が承認された（２００９－００６２）。チューリッヒ大学病院腫瘍・血液内科（スイス・チューリッヒ）にて、寛解期にあるＡＭＬ患者の末梢血サンプルを採取した。すべての骨髄由来のヒト細胞は、チューリッヒ大学病院の腫瘍内科および血液学部門のバイオバンクによって処理された。細胞の収集と凍結保存の手順は以前に説明された。骨髄穿刺液は、最初の診断検査中にＡＭＬ患者から取得された。単核細胞（ＭＮＣ）を密度勾配遠心で濃縮した後、ビーズベースの免疫磁選によりＣＤ３⁺細胞とＣＤ１９⁺細胞をＬＤカラムで除去した（いずれもＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）。同種移植に使用された輸血バッグや輸液システムの残骸から、ＢＭ由来の健全なＨＳＰＣを分離した。密度勾配遠心分離によるＭＮＣの濃縮後、ＣＤ３４マイクロビーズとＬＳカラム（ともにＭｉｌｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）によりＣＤ３４⁺細胞の精製を行った。すべてのヒト初代細胞は、前述のように凍結培地で凍結保存された。
７．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ 細胞傷害性アッセイ

ＡＭＬ細胞株、初代骨髄細胞、ＡＭＬ患者サンプルに対するＴ細胞活性の定量化には、既報のプロトコルからフローサイトメトリー細胞傷害性アッセイを採用した。つまり、ＡＭＬ細胞株（ＣＤ１１７^negative、ＣＤ１１７^low、ＣＤ１１７^medまたはＣＤ１１７^high）を、ＰＫＨ２６ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｋｅｒ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、製造者のプロトコルにしたがって染色を行った。標的細胞は、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ^TM、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ Ｕ／ｍｌ／１００μｇ／ｍｌ、すべてＧｉｂｃｏ（登録商標）， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）添加のａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ中でエフェクターと標的細胞の比率を１０：１にしてヒトＴ細胞と混合し２４時間培養をした。細胞傷害性試験開始前に、ＣＡＲ Ｔ細胞はＩＬ－２無添加の培地で一晩培養した。二重特異性抗体を培地で希釈し、所定の濃度で添加した。２４時間後、細胞をＴＯ－ＰＲＯ^TM－３ Ｉｏｄｉｄｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。特異的殺傷力は、式によって算出した。［１－生標的細胞（サンプル）／生標的細胞（対照）］－１００、前記の通り［２１］。

健康な骨髄（ＢＭ）ドナーの造血細胞の特異的溶解を定量化するために、ＢＭ由来の全単核球をエフェクターと標的の比率が１０：１のＴ細胞と４８時間共培養した。共培養は解凍後すぐに開始した。

ヒトＡＭＬ初代細胞に対する特異的溶解の解析のために、自己のヒトＴ細胞をＡＭＬ患者のＢＭ由来単核細胞とエフェクター対標的比１０：１で４８時間共培養した。共培養を開始する前に、単核細胞を解凍し、２０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｇｌｕｔａｍａｘ^TM、５０μＭ ２メルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍｌ 幹細胞因子（ＳＣＦ）、５０ｎｇ／ｍｌ トロンボポエチン（ＴＰＯ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６ および １０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３ リガンド（すべて組換えヒトタンパク質、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（登録商標）， Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ， ＮＪ， ＵＳＡ）添加のＩＭＤＭで３日間培養した。

細胞は、ＣＤ３、ＣＤ１１７、ＣＤ４５、ＬＩＶＥ／ ＤＥＡＤ^TM Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ の発現を染色し、上記のようにフローサイトメトリーで解析した。
８．ＡＭＬマウスのＢｉＴＥ処置

実験デザインの概略を図５Ａに示す。つまり、ＮＳＧマウスに致死量以下の放射線を照射し、続いて４＊１０⁶ＨＬ６０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を静脈内注射した。翌日、４＊１０⁶個のヒトＴ細胞を静脈内注射し、エフェクターと標的の比率を１：１にした。１日目から、治療群のマウスに２５μｇのＣＤ１１７ｘＣＤ３を１８日間毎日注射しました。２１日目に、マウスを犠牲にした。その大腿骨はＰＢＳで洗浄され、骨髄細胞はさらにＦＡＣＳ解析のために処理された。
９．フローサイトメトリー

マウスの骨髄から単一細胞懸濁液を調製した。赤血球はＲＢＣ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ （ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）で溶解した。死細胞の排除には、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用した。表面抗原は蛍光標識された抗体で染色された。データはＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏまたはＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ ＩＩフローサイトメーター（いずれもＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ， ＵＳＡ）で取得した。データ解析とプレゼンテーションにはＦｌｏｗＪｏ （ｖ１０．０．７， ＦｌｏｗＪｏ， ＬＬＣ， Ａｓｈｌａｎｄ， ＯＲ， ＵＳＡ）を使用した。
結果
１．ＣＤ１１７ｘＣＤ３のクローニング、発現、および特徴づけ

ＣＤ１１７ｘＣＤ３は、可変抗体ドメインにＶＬ－ＶＨ－ＶＨ－ＶＬ配置を選択し、ＢｉＴＥ^TMフォーマットでクローニングされ発現された［図１Ａ、Ｂ］。ｃ－Ｋｉｔ認識には７９Ｄ抗体［１９］を使用し、ＣＤ３標的化には、ブリナツモマブ構造内でこのｓｃＦｖフラグメントがうまく使用されていることからＯＫＴ３部分を選択した［２２］。ＢｉＴＥ^TM製品を構成する２つのｓｃＦｖフラグメント間のリンカーには、可変抗体ドメイン間の望ましくないペアリングやＴａｎｄａｂ形成を最小限に抑えるため、短いＧｌｙ₄Ｓｅｒリンカーを選択した［２３］。この融合タンパク質をｐｃＤＮＡ３．１由来のベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、一過性遺伝子発現法によりＣＨＯ細胞で発現させた［２４］。製品の完全なアミノ酸配列と追加のタンパク質の特性は、図２に記載されている。７９Ｄ抗体のＶＨドメインはＶＨ３ファミリーに属し、プロテインＡ結合が可能であるため、ＣＤ１１７ｘＣＤ３はプロテインＡクロマトグラフィーで均質に精製された［２５］。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で単一のバンドが見えた［図１Ｃ］。質量分析により、単一のピークが明らかになった［図１Ｄ］。ただし、Ｎ－結合型グリコシル化の結果として、その質量（５５’５２８ Ｄａ）は予測値（５３’４７５ Ｄａ）よりも大きくなった［図７］。

このタンパク質がＣＤ１１７ｘＣＤ３の機能的特性評価を容易にしたため、ｃ－Ｋｉｔの細胞外部分の調製と品質管理を図８に示す。組換えｃ－Ｋｉｔに対する結合特性をＢＩＡｃｏｒｅ解析で検証したところ、ｓｃＦｖフォーマットの７９Ｄ抗体で以前に報告されたものと類似した動学的な会合・解離プロファイルが明らかになった［図１Ｄ］［１９］。ヒトＴ細胞上のＣＤ３へのＣＤ１１７ｘＣＤ３の結合は、単離されたヒトＴ細胞上のＦＡＣＳによってテストされた［図６］
２．ＣＤ１１７ｘＣＤ３の生物活性

ＣＤ１１７ｘＣＤ３の殺生物性を明らかにするために、ＨＬ６０を親株とするＡＭＬ細胞株［２６］を作成し、その表面に異なるレベルのｃ－Ｋｉｔを発現させた。ＦＡＣＳ手法を使用して測定した場合、セルあたりそれぞれ約８’０００、２５’０００、１１５’０００のｃ－Ｋｉｔコピーを表す、３つのサブライン（ＨＬ６０ ｃ－Ｋｉｔ ｈｉｇｈ、ｍｅｄ、ｌｏｗと呼ばれる）に注目した。［図２Ａ、Ｂ］。エフェクター：標的細胞の比率が１０：１のＣＤ１１７ｘＣＤ３およびヒトＴ細胞のさまざまな濃度の存在下で、３つの細胞株の用量依存的なｉｎ ｖｉｔｒｏでの死滅を観察することができた［図２Ｃ］。ＨＬ６０ ｃ－Ｋｉｔ^high細胞株は、約１．８ｎＭに相当する１００ ｎｇ／ｍｌのＢｉＴＥ^TMで効率的に根絶することができる。１０００ ｎｇ／ｍｌのＣＤ１１７ｘＣＤ３と異なるエフェクター：標的細胞比を使用して、同様の実験を繰り返した。ＨＬ６０ ｃ－Ｋｉｔ^high細胞とｃ－Ｋｉｔ^med細胞の両方が、エフェクター：標的比が１：１と低い場合に定量的に死滅する可能性がある一方で、ｃ－Ｋｉｔ低細胞の除去には高密度のヒトＴ細胞が必要であることが観察された［図２Ｄ］。非形質導入ＨＬ６０細胞に対する殺生物効果は無視できるほど低く、標的細胞を殺すためにｃ－ＫｉｔとＣＤ３抗原を同時に関与させる必要があることが確認された。

我々は最近、抗体を用いたインターロイキン２（ＩＬ２）の骨髄またはＡＭＬ患者のクロロマ病巣への標的送達が、強力な抗白血病活性と関連している可能性を報告した［２７，２８］。このため、組換えヒトＩＬ２存在下と非存在下で細胞殺傷実験を行った。しかし、このｉｎ ｖｉｔｒｏの環境では、ＩＬ２を加えてもＣＤ１１７ｘＣＤ３の細胞殺傷性は変わらなかった［図３］。

ＣＤ１１７ｘＣＤ３の殺生物活性をより臨床に近い状況で特徴づけるために、健常人ドナーのＨＳＰＣ（図４Ａ、Ｂ）と患者由来のＡＭＬ芽球（図４Ｃ、Ｄ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞殺傷実験を行った。ＣＤ１１７ｘＣＤ３は、濃度依存的に両方のタイプの標的細胞を効率的に殺傷することができた。ＣＤ１１７ｘＣＤ３濃度１μｇ／ｍｌで完全な細胞溶解が観察されたのは、ＦＡＣＳによる強いＣＤ１１７染色を特徴とする検体（すなわち、２／３のＨＳＰＣサンプルとＡＭＬ芽球の１／３のサンプル）であった（図４）。図４Ｅの２次元ＦＡＣＳプロファイルは、自己Ｔ細胞の存在下でのＣＤ１１７ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ^TMによる選択的かつ用量依存的なＡＭＬ芽細胞死を示す一例である。

次に、ＣＤ１１７ｘＣＤ３の抗白血病性をｉｎ ｖｉｖｏのシステムで検討した。致死量以下の照射を受けたＮＳＧマウスは、４ｘ１０⁶ルシフェラーゼおよびＧＦＰを形質導入したＨＬ６０ ｃ－Ｋｉｔ^high細胞の静脈内注射を受けた後、４ｘ１０⁶ヒトＴ細胞を投与し、ＣＤ１１７ｘＣＤ３を繰り返し注射した（２５μｇ／日で１８日間）［図５Ａ］。ルシフェリンの腹腔内注射により、ＩＶＩＳ撮像による病勢進行のモニタリングが可能となった［２９］［図９］。マウスは２１日目に安楽死させ、骨髄中の白血病幹細胞の存在をＦＡＣＳで評価した。図５Ｂは、生理食塩水注射またはＴ細胞のみを投与したすべての対照マウスで、骨髄へのＡＭＬ生着が観察されたことを示している。一方、ＣＤ１１７ｘＣＤ３のメトロノミック投与により、ＡＭＬの生着が完全に抑制されることがわかった。生理食塩水存在下でＴ細胞を投与したマウスとＣＤ１１７ｘＣＤ３処理群では、骨髄中のヒトＴ細胞密度に統計的に有意な差が認められなかったことから［図５Ｃ］、ＢｉＴＥ^TM処理の結果、２１日目までにＴ細胞が拡大されなかったことが示唆された。
ディスカッション

我々は、ヒトｃ－Ｋｉｔ（造血幹細胞およびＡＭＬ芽球に発現）およびＣＤ３抗原（Ｔ細胞に発現）に結合する新規の二重特異性抗体を記載する。この抗体は、特に、様々なレベルのｃ－Ｋｉｔを表面に発現しているＡＭＬ細胞株を、Ｔ細胞の存在下で、濃度および抗原密度依存的に選択的に殺傷することができる。この二重特異性抗体は、ｃ－Ｋｉｔが陽性の健康なドナーの骨髄細胞も溶解した。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、この抗体はｃ－Ｋｉｔ陽性細胞株のマウスの骨髄への生着を完全に阻止した。
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配列

下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯ ＳＴ ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。

Claims (23)

1. 少なくとも第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、前記第１の結合ドメインがＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに結合し、前記第２の結合ドメインがＣＤ３に結合する二重特異性結合剤。
2. 前記第１の結合ドメインがＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴの細胞外ドメインに結合し、および／または前記第２の結合ドメインがＣＤ３のε鎖および／またはＣＤ３のγ鎖に結合する、請求項１に記載の二重特異性結合剤。
3. 全長抗体または抗体フラグメントのフォーマットである、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性結合剤。
4. 以下からなる群から選択される少なくとも１つのフォーマットである、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性結合剤。
   ・ ＤＶＤ－Ｉｇ
   ・ ノブ・イン・ホール
   ・ クロスマブ
   ・ ＢｉＴＥ^TM
   ・ ナノボディ
   ・ ダイアボディ
   ・ ＤＡＲＴ^TM
   ・ ＴａｎｄＡｂ^TM、および／または
   ・ ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ。
5. ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに結合する第１の結合ドメインが、
   ａ） 配列番号１９および２０に記載の、抗ＣＤ１１７抗体７９Ｄの重鎖／軽鎖可変領域配列ペアに含まれる重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組を含むか、
   ｂ） 以下の配列を含む重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組を含むか、
   ・ ＨＣ ＣＤＲ１（配列番号１または３５）、
   ・ ＨＣ ＣＤＲ２（配列番号２または３６）、
   ・ ＨＣ ＣＤＲ３（配列番号３または３７）、
   ・ ＬＣ ＣＤＲ１（配列番号４または３８）、
   ・ ＬＣ ＣＤＲ２（配列番号５または３９）、および
   ・ ＬＣ ＣＤＲ３（配列番号６または４０）、
   ｃ） ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つが、それぞれの配列番号１～６または配列番号３５～４０に対して最大３個のアミノ酸置換を有するか、および／または
   ｄ） ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つが、それぞれの配列番号１～６または配列番号３５～４０に対して６６％以上の配列同一性を有し、
   ここで、ＣＤＲは、ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに結合できるように、適切なタンパク質フレームワークに埋め込まれている、
   前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性結合剤。
6. ＣＤ３に結合する第２の結合ドメインが、
   ａ） 以下の配列ＯＫＴ３、ＢｌｉｎＣＤ３を含む重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組を含むか、
   ｂ） 配列番号２１および２２、または配列番号２３および２４に記載の抗ＣＤ３抗体ＢｌｉｎＣＤ３、ＯＫＴ３、および［・・・］のいずれか１つの重鎖／軽鎖可変領域配列ペアに含まれる重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組を含むか、
   ｃ） 以下の配列を含む重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組を含むか、
   ・ ＨＣ ＣＤＲ１（配列番号７または４１）、
   ・ ＨＣ ＣＤＲ２（配列番号８または４２）、
   ・ ＨＣ ＣＤＲ３（配列番号９または４３）、
   ・ ＬＣ ＣＤＲ１（配列番号１０または４４）
   ・ ＬＣ ＣＤＲ２（配列番号１１または４５）、および
   ・ ＬＣ ＣＤＲ３（配列番号１２または４６）、
   ｄ） 以下の配列を含む重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組を含むか、
   ・ ＨＣ ＣＤＲ１（配列番号１３）、
   ・ ＨＣ ＣＤＲ２（配列番号１４）、
   ・ ＨＣ ＣＤＲ３（配列番号１５）、
   ・ ＬＣ ＣＤＲ１（配列番号１６）、
   ・ ＬＣ ＣＤＲ２（配列番号１７）、および
   ・ ＬＣ ＣＤＲ３（配列番号１８）、
   ｅ） ｂ）またはｃ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つが、それぞれの配列番号７～１２または配列番号４１または配列番号１３～１８に対して最大３個のアミノ酸置換を有するか、および／または
   ｆ） ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つが、それぞれの配列番号７～１２または配列番号４１または配列番号１３～１８に対して６６％以上の配列同一性を有し、
   ここで、ＣＤＲは、ＣＤ３に結合できるように適切なタンパク質フレームワークに埋め込まれている、
   前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性結合剤。
7. フレームワークがヒトＶＨ／ＶＬフレームワークである、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性結合剤。
8. ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに結合する第１の結合ドメインが、
   ａ） 抗体７９Ｄの可変ドメイン、
   ｂ） 重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）
   ・ ＨＣ ＶＤ（配列番号１９）、および
   ・ ＬＣ ＶＤ（配列番号２０）、
   ｃ） ｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）、ただし
   ・ ＨＣ ＶＤは、それぞれの配列番号１９に対して８０％以上の配列同一性を有するか、および／または
   ・ ＬＣ ＶＤは、それぞれの配列番号２０に対して８０％以上の配列同一性を有する、
   ｄ） ｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）、ただしＨＣ ＶＤまたはＬＣ ＶＤの少なくとも１つは、それぞれの配列番号１９および／または２０に対して最大１０個のアミノ酸置換を有する、
   を含み、
   上記の二重特異性結合剤は、依然としてＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに結合することができる、
   前述の請求項のいずれか１項に記載の二重特異性結合剤。
9. ＣＤ３に結合する第２の結合ドメインが、
   ａ） ＯＫＴ３およびＢｌｉｎＣＤ３からなる群から選択された１つの抗体の可変ドメイン、
   ｂ） 重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）
   ・ ＨＣ ＶＤ（配列番号２１または２３）、および
   ・ ＬＣ ＶＤ（配列番号２２または２４）、
   ｃ） ｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）、ただし
   ・ ＨＣＶＤは、それぞれの配列番号２１または２３に対して８０％以上の配列同一性を有するか、および／または
   ・ ＬＣＤＶＤは、それぞれの配列番号２２または２４に対して８０％以上の配列同一性を有する、
   ｄ） ｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）、ただし、ＨＣＶＤまたはＬＣＶＤの少なくとも１つがそれぞれの配列番号に対して最大１０個のアミノ酸置換を有する、
   を含み、
   前記二重特異性結合剤は依然としてＣＤ３に結合することができる、
   前記請求項のいずれか１項に記載の二重特異性結合剤。
10. 少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的アミノ酸置換である、前述の請求項のいずれか１つに対する前述の請求項のいずれか１つに記載の二重特異性結合剤。
11. 対応する可変重鎖領域（ＶＨ）および対応する可変軽鎖領域（ＶＬ）領域が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の順序で配置されている、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性結合剤。
    ・ Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ３）、
    ・ Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）、
    ・ Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ３）、
    ・ Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）、
    ・ Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）、
    ・ Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）、
    ・ Ｖ_H（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）、
    ・ Ｖ_H（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ３）－リンカー－Ｖ_L（ＣＤ１１７）－リンカー－Ｖ_H（ＣＤ１１７）、
    ここで、「リンカー」という用語は、任意のポリペプチドリンカーを定義する。
12. ＣＤ３に結合する第２の結合ドメインが
    ａ） 配列番号２８または２９のいずれか１つに記載されているｓｃＦｖ様配列を含むか、または
    ｂ） 配列番号２８または２９のいずれか１つに対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性結合剤。
13. ＣＤ１１７／ｃＫＩＴに結合する第１の結合ドメインが
    ａ） 配列番号２７に記載のｓｃＦｖ様配列を含むか、または
    ｂ） 配列番号２７に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性結合剤。
14. 前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性結合剤であって、
    ａ） 配列番号２５、２６、３４、５９または６０から選択される配列の少なくとも１つを含むか、または
    ｂ） 配列番号２５、２６、３４、５９または６０に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    二重特異性結合剤。
15. 請求項１４に記載の二重特異性結合剤と比較して、
    ・ ＳＰＲによって測定して、ＣＤ３に対して５０％以上の標的結合親和性を有するか、および／または
    ・ ＳＰＲによって測定して、ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴに対して５０％以上の標的結合親和性を有する、
    前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性結合剤。
16. ＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴおよびＣＤ３への結合について、請求項１４に記載の二重特異性結合剤と競合する二重特異性結合剤。
17. ＣＤ３およびＣＤ１１７／ｃ－ＫＩＴ上の、請求項１４に記載の二重特異性結合剤と本質的に同じまたは同じエピトープに結合する二重特異性結合剤。
18. 前述の請求項のいずれか一項に記載の結合剤をコードする核酸。
19. 前述の請求項のいずれか１つに記載の二重特異性結合剤または核酸、および任意選択で１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
20. （ｉ）前述の請求項のいずれか１つに記載の二重特異性結合剤または医薬組成物、および（ｉｉ）１つまたは複数の治療的活性化合物を含む組合せ。
21. ・ 腫瘍性疾患と診断されているか、
    ・ 腫瘍性疾患に罹患しているか、または
    ・ 腫瘍性疾患の発症のリスクがある
    ヒトまたは動物対象の治療におけるまたはそのような状態の予防のため（医薬品の製造において）使用するための前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性結合剤、医薬組成物または組合せ。
22. 腫瘍性疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、前述の請求項のいずれか１つに従って有効量の二重特異性結合剤、医薬組成物または組合せを投与することを含む方法。
23. 以下を含む部品の治療キット：
    ａ） 前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性結合剤、医薬組成物または組合せ、
    ｂ） 組成物、組成物または組合せを投与するための装置、および
    ｃ） キットの使用のための説明書。

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