CN114651012A - 与CD117/c-KIT和CD3结合的双特异性结合剂 - Google Patents

与CD117/c-KIT和CD3结合的双特异性结合剂 Download PDF

Info

Publication number
CN114651012A
CN114651012A CN202080076507.9A CN202080076507A CN114651012A CN 114651012 A CN114651012 A CN 114651012A CN 202080076507 A CN202080076507 A CN 202080076507A CN 114651012 A CN114651012 A CN 114651012A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
gly
tyr
seq
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080076507.9A
Other languages
English (en)
Inventor
J·基弗
R·迈伯勒
M·曼茨
D·内里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Universitaet Zuerich
Original Assignee
Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Universitaet Zuerich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ, Universitaet Zuerich filed Critical Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Publication of CN114651012A publication Critical patent/CN114651012A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及包含至少第一结合结构域和第二结合结构域的双特异性结合剂，其中所述第一结合结构域结合CD117/c‑KIT，并且其中所述第二结合结构域结合CD3(图1)。

Description

与CD117/c-KIT和CD3结合的双特异性结合剂
技术领域
本申请涉及与CD117/c-KIT和CD3结合的双特异性结合剂。
背景技术
双特异性抗体能够将T细胞活性重新定向到靶细胞，代表了一类有效的抗体产品，以实现体内选择性杀生物作用。在T细胞存在的情况下，双特异性抗体可以在亚纳摩尔浓度下杀死靶细胞[15]。一种能够同时识别人CD19和CD3抗原的双特异性抗体产品(blinatumomab)已获得上市许可，用于治疗费城染色体阴性的复发性或难治性B细胞前体急性淋巴细胞白血病(ALL)[16]。Blinatumomab是一种双特异性T细胞接合剂(BiTETM)，一种通过两个单链Fv抗体片段的顺序融合产生[17,18]的重组抗体形式。
自我更新和未成熟的造血干细胞和祖细胞(HSCP)在造血过程中产生骨髓和淋巴谱系[1]。单个造血干细胞也可能是血液系统恶性肿瘤的起源，例如急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)[2,3]。这些病症通常难以治疗，因为通过治疗干预难以区分AML和祖细胞，或者特别激进的治疗方案存在清髓风险。
预处理后HSCT为特征的治疗方法可能是一些AML患者的救命选择。以高剂量化疗为基础的调理，然后进行造血干细胞移植可能导致癌症治愈，但与大量毒性和不可忽略的死亡率相关[4]。这种治疗程序通常将不适合积极化疗方案的患者(例如老年患者)排除在外，他们宁愿在姑息治疗中接受低甲基化药物治疗[5]。积极的预处理方案也可能导致AML患者的骨髓抑制时间延长，就其对感染的易感性而言具有潜在的负面影响[6]。由于这些原因，大量的研究工作正致力于发现更具选择性的预处理策略和对AML细胞具有有效杀生物活性的药剂[7,8]。
已提出用单克隆抗体选择性靶向CD117(c-Kit)作为去除内源性HSPC(造血干细胞和祖细胞)的策略，从而实现有效但温和的预处理。Irving Weissmann及其同事已经证明，在免疫功能低下[9]和免疫功能正常[7]的小鼠中，使用针对c-Kit抗原的IgG形式的单克隆抗体可以有效消除HSPC。这种可以通过与抗CD47抗体的组合来增强的介入程序最近已被转化为临床环境，其使用抗试剂盒治疗抗体(AMG 191)(TAB-470CL)作为炎症性疾病的潜在疗法，并且还可能在严重联合免疫缺陷(SCID)患者的造血干细胞移植之前启用更温和的调理方法[10]。临床前药物KTN0182A是一种抗KIT、含有吡咯并苯二氮卓(PBD)的抗体-药物偶联物，在体外和体内对多种肿瘤类型均显示出抗肿瘤活性。然而，到目前为止，还没有这样的产品进入市场。
因此，本发明的一个目的是改进患有肿瘤疾病的患者的治疗选择。
本发明的另一个目的是为患有CD117阳性疾病的患者提供进一步的治疗选择。
本发明的另一个目的是为患有急性髓系白血病(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS)的患者提供进一步的治疗选择。
这些和进一步的目的根据本发明的独立权利要求的方法和装置满足。从属权利要求涉及特定实施方案。
发明内容
本发明提供了一种双特异性结合剂，其至少包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域结合CD117/c-KIT并且其中所述第二结合结构域结合CD3。以下将详细讨论本发明及其特征和实施方案的一般优点。
附图说明
图1：CD117xCD3的克隆、表达和表征
(A)CD117xCD3的链排列。c-Kit抗体79D[19]以VL79D-接头-VH79D的链顺序克隆，并以VHBlinCD3-VLBlinCD3的顺序遗传融合到抗CD3抗体OKT3的人源化版本，本文称为BlinCD3。这种双特异性结合剂的一个示例性序列在本文中显示为SEQ ID NO 25(SEQ ID NO 34还包含信号肽和His标签)。将得到的构建体克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)中。(B)CD117xCD3蛋白的示意图。融合蛋白的N端标为(N')，而His6标签位于C端。(C)纯化的双特异性抗体的SDS-PAGE，显示以约55kDa的预期(单体)大小迁移。M＝标记，NR＝非还原条件。(D)纯化产物的质谱分析显示2053道尔顿的单个N-糖基化，证实了53475Da的理论质量(另参见图7)。(E)在Biacore实验中，CD117xCD3在指定浓度下与重组靶抗原人c-Kit的结合。
图2：靶细胞的CD117表达和CD117xCD3针对细胞系的生物体外活性
(A)HL60靶细胞系的FACS谱，显示不同水平的CD117表达，其由c-Kit转导程序产生。(B)靶细胞系上抗原密度的定量分析。HL60low、HL60med和HL60high细胞显示分别表达7909±960、25146±2964和114597±11450个拷贝的靶抗原CD117。(C)靶细胞系的特异性裂解取决于CD117xCD3的浓度以及靶抗原密度。效应子(人类细胞)与目标物(具有不同c-Kit表达水平的HL60细胞系)的比例为10:1。(D)在1μg/ml的固定CD117xCD3浓度下，效应物与目标物的比例从1:20变化到20:1。
图3：CD117xCD3的生物体外活性
靶细胞系HL60low、HL60med和HL60high的特异性裂解取决于双特异性抗体的浓度和抗原密度。添加IL-2以增强基线T细胞活化并没有显著改变裂解活性。
图4：CD117xCD3对原代骨髓样本和患者AML样本的生物体外活性
(A)来自健康供体的三个不同骨髓样本(BM#249、BM#333、#BM 351)中的CD117表征揭示了细胞间不同的抗原密度。(B)在存在人T细胞和双特异性抗体浓度范围(10ng/ml、100ng/ml和1000ng/ml)的情况下对来自(A)的骨髓样本进行特异性裂解。(C)对三种不同AML患者样本的分析显示样本内和患者间比较中的CD117表达变异性(显示了CD45dim胚细胞)。(D)在存在自体T细胞的情况下以浓度依赖性方式特异性裂解(C)的胚细胞样品。所有6个样本(B+D)的效应物与目标物的比率为10:1。所有实验一式三份进行。(E)患者样品#878的体外杀伤试验实例FACS图。CD45dim胚细胞群以BiTETM浓度依赖性方式特异性裂解。
图5：CD117xCD3在预防性环境中针对AML细胞系的体内生物活性
(A)AML小鼠模型和CD117xCD3治疗的实验方案：第0天，对8周龄的NSG小鼠进行亚致死照射，并在3-6小时后通过尾部注射4x106 HL60-luc-GFP-cKitHIGH细胞。第1天，注射4x106个人类供体T细胞，以及第一剂25μg CD117xCD3。在治疗组中，每天注射25μg双特异性抗体，持续18天。第21天，处死小鼠，从它们的股骨中冲洗出骨髓细胞并染色用于FACS分析。(B)终端分析：小鼠骨髓中GFP+HL60HIGH细胞的定量。在治疗组中，不存在GFP+细胞，而在对照组中，植入范围为0.1-30％。(C)小鼠骨髓中人T细胞的定量。注射人T细胞的两组显示T细胞植入范围为0.1-20％。两组之间无统计学差异。
图6：通过FACS在分离的人类T细胞上测试CD117xCD3与CD3的结合。
(A)CD117xCD3的氨基酸序列。(B)CD117xCD3的尺寸排阻色谱图谱。(C)流式细胞仪数据显示与HL60 c-Kithigh细胞和人T细胞结合，但不与HL60 wt细胞结合。
图7：CD117xCD3的质谱分析
(A)CD117xCD3的质谱分析显示质量为55526道尔顿的单峰。(B)用PnGase处理后CD117xCD3的质谱分析显示2057道尔顿的N-连接糖基化。CD117xCD3的理论质量：53475道尔顿。
图8：c-Kit细胞外部分的制备和质量控制
(A)人c-Kit胞外部分的结构域4&a5的氨基酸序列。(B)SDS PAGE显示单条重组c-Kit。(C)尺寸排阻色谱显示单个主峰的大小约为重组蛋白预期大小的两倍，显示出二聚体状态。
图9：不同双特异性抗体形式的概述
图取自Spiess等人，2015[55]，其内容通过引用并入本文。
图10：Okt3的scFv序列(SEQID No 27)与其人源化变体BlinCD3(SEQID NO 28)之间的比对。
两种抗体具有93％的序列同一性。CDR以粗体标记。
发明详述
在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的装置的特定组成部件或所描述的方法的工艺步骤，因为这样的装置和方法可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不旨在限制。必须注意的是，如在说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一("a","an")”和“所述(the)”包括单数和/或复数指示物，除非上下文另有明确规定。此外，应当理解，在给出由数值限定的参数范围的情况下，所述范围被认为包括这些限制值。
还应当理解，本文所公开的实施方案并不意味着被理解为彼此不相关的单个的实施方案。与一个实施方案一起讨论的特征旨在也结合本文所示的其它实施方案来公开。在一种情况下，如果一个实施方案没有公开特定的特征，而另一个实施方案公开，则本领域技术人员将理解，这不一定意味着所述特征不意味着与所述其它实施方案一起公开。本领域技术人员将理解，本申请的要点是还为其他实施方案公开所述特征，但是仅为了清楚的目的并且为了将说明书保持在可管理的大小中，尚未这样做。
此外，本文引用的现有技术文献的内容通过引用并入本文。这尤其涉及公开了标准或常规方法的现有技术文献。在这种情况下，通过引用并入的主要目的是提供足够的公开内容，并避免冗长的重复。
根据本发明的第一方面，提供了至少包含第一结合结构域和第二结合结构域的双特异性结合剂，其中所述第一结合结构域结合CD117/c-KIT，并且其中所述第二结合结构域结合CD3。在其他实施方案中，所述第一结合结构域结合CD3，所述第二结合结构域结合CD117/c-KIT。
优选地，CD117/c-KIT是人CD117/c-KIT，如例如在UniProt标识符P10721下所公开的。
在一个实施方案中，CD3结合结构域结合CD3优选人CD3的ε-亚基，例如，在UniProt标识符P07766下公开的。
肥大/干细胞生长因子受体(SCFR)，也称为原癌基因c-KIT或酪氨酸-蛋白激酶KIT或CD117，是人中由KIT基因编码的受体酪氨酸激酶蛋白。对于该基因已经发现了编码不同同种型的多种转录变体。KIT在1987年由德国生物化学协会首次描述为猫肉瘤病毒癌基因v-kit的细胞同源物。
CD117是在造血干细胞以及其它细胞类型的表面上表达的细胞因子受体。这种受体的改变形式可能与某些类型的癌症有关。CD117是III型受体酪氨酸激酶，其结合干细胞因子(引起某些类型细胞生长的物质)，也称为“青灰因子"或“c-kit配体”。当该受体与干细胞因子(SCF)结合时，其形成激活其固有酪氨酸激酶活性的二聚体，进而磷酸化并激活在细胞中传播信号的信号转导分子。[10]活化后，所述受体被泛素化以标记其转运至溶酶体并最终被破坏。通过CD117发出的信号在细胞存活、增殖和分化中发挥作用。例如，CD117信号传导是黑素细胞存活所需的，并且它也参与造血和配子发生。
与受体酪氨酸激酶III家族的其它成员一样，CD117由细胞外结构域、跨膜结构域、近膜结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域组成。细胞外结构域由5个免疫球蛋白样结构域组成，蛋白激酶结构域被约80个氨基酸的亲水插入序列中断。配体干细胞因子通过第二和第三免疫球蛋白结构域结合。
分化簇(CD)分子是细胞表面上的标记，如由特异性抗体组识别的，用于识别细胞类型、分化阶段和细胞活性。CD117是用于识别骨髓中某些类型的造血(血液)祖细胞的重要细胞表面标记。具体而言，造血干细胞(HSC)、多能祖细胞(MPP)和普通髓系祖细胞(CMP)表达高水平的CD117。共同淋巴祖细胞(CLP)表达低表面水平的CD117。CD117还识别胸腺早期T谱系祖细胞(ETP/DN1)中最早的胸腺细胞祖细胞和DN2胸腺细胞表达高水平的c-Kit。它也是小鼠前列腺干细胞的标志物。此外，肥大细胞，皮肤中的黑素细胞和消化道中的Cajal间质细胞表达CD117。在人类中，缺乏CRTH2(CD294)表达的辅助样先天淋巴样细胞(ILCs)中的c-kit表达用于标记ILC3群体。
在人类中，CD117/c-Kit尤其存在于造血细胞中并且在造血的早期阶段中起关键作用，但也在AML母细胞中表达[11-14]。
在免疫学上，CD3(分化簇3)T细胞共受体有助于活化细胞毒性T细胞(CD8+初始T细胞)和T辅助细胞(CD4+初始T细胞)。它由蛋白质复合物组成并由4条不同的链组成。在哺乳动物中，复合物含有CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与T细胞受体(TCR)和ζ链(zeta链)结合，在T淋巴细胞中产生活化信号。TCR，ζ-链和CD3分子一起构成TCR复合物。
CD3γ、CD3δ和CD3ε链是含有单个细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。
CD3链的跨膜区含有天冬氨酸残基，带负电荷，这一特性使这些链与带正电荷的TCR链结合。
CD3分子的胞内尾部含有单一保守基序，称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或简称ITAM，其对于TCR的信号传导能力是必需的。ζ链的细胞内尾部含有3个ITAM基序。
CD3上ITAM的磷酸化使得CD3链能够结合称为ZAP70(zeta相关蛋白)的酶，这是在T细胞的信号级联中重要的激酶。由于CD3是T细胞活化所必需的，因此正在研究针对它的药物(通常是单克隆抗体)作为免疫抑制剂疗法(例如，用于1型糖尿病和其他自身免疫性疾病的奥替利珠单抗(TRX4)，或Muromonab-CD3
Figure BDA0003623417940000053
以减少器官移植患者的急性排斥反应。
通常，相当少的靶向CD3连同另一靶标的多特异性结合剂目前正在开发中，或甚至已经被批准。首次批准的双特异性抗体之一是Blinatumomab(商品名
Figure BDA0003623417940000052
)，其靶向CD3和CD19，并用作费城染色体阴性复发性或难治性急性成淋巴细胞性白血病的二线治疗。这些构建体的基本思想是通过肿瘤特异性靶结合肿瘤细胞，并通过CD3结合部分与T细胞结合。
因此，尽管所述构思似乎是令人感兴趣的，但其向提供临床优势的药物的转化不如其看起来那么容易。双特异性抗体的历史表现为失败和失望。
Catumaxomab(商品名
Figure BDA0003623417940000061
)，其甚至早于Blinatumomab批准，并且用于治疗患有EpCAM阳性癌症的人的恶性腹水。它结合CD3和EpCAM，但在2017年退出市场。
2019年2月2名患者死亡后，Xencor的CD123xCD3抗体XmAb 14045(WO 2017210443)的临床开发停止。靶向CD19xCD3(Affimed的AFM11，WO 2013013700)和CD3xB7-H3(Macrogenic的MGD009，US 9441049B2)的其它产品以及J&J的CD123xCD3双特异性JNJ-63709178(EP 3189081A1)也从监管程序中撤出。
如下所示，根据本发明的双特异性结合剂(有时称为CD117xCD3)能够在体外有效地重新定向针对HSPC和AML细胞的T细胞活性。在弥散性白血病的小鼠模型中，CD117xCD3完全消除了进入骨髓的AML。该产品代表了抗c-Kit免疫球蛋白的有利替代物，用于在HSCT之前对患有各种类型血液病的患者进行温和的预处理策略。此外，CD117xCD3的强效抗白血病活性可能有助于有效杀伤AML细胞，其众所周知难以根除。因此，它还提供了靶向CD3和不同靶标的其它双特异性抗体的有利替代。
根据一个实施方案，双特异性结合剂是单或异聚蛋白或肽或包含至少一个肽序列。
根据一个实施方案，双特异性结合剂包含至少一个衍生自抗体的区段(stretch)。
根据一个实施方案，这样的区段是至少一个互补决定区(CDR)，优选在一组3个CDR(CDR1-3)或6个CDR(HCDR1-3和LCDR1-3)中。
根据一个实施方案，这样的区段是至少一个可变抗体结构域，优选在一组2个可变抗体结构域中(重链可变结构域和轻链可变结构域)。
根据本发明的一个实施方案，所述第一结合结构域结合CD117/c-KIT的细胞外结构域和/或所述第二结合结构域结合CD3的ε链和/或CD3的γ链。根据本发明的另一个实施方案，所述第二结合结构域结合CD117/c-KIT的细胞外结构域和/或所述第一结合结构域结合CD3的ε链和/或CD3的γ链。
根据本发明的一个实施方案，双特异性结合剂是全长抗体或抗体片段的形式，后者保留靶结合性质。
通常，已经评价了双特异性抗体的大量形式。对于综述，参见例如Spiess等人(2015)[55]，其内容通过引用并入本文。双特异性抗体分为五个不同的结构组：
(i)双特异性IgG(BsIgG)，
(ii)附加有额外的抗原结合部分的IgG，
(iii)双特异性抗体片段，
(iv)双特异性融合蛋白，和
(v)双特异性抗体偶联物。
此外，通常区分为
(i)不对称双特异性抗体(具有包含与不同抗原的结合部分的不同链的杂聚(heteropolymeric)抗体)，和
(ii)对称双特异性抗体，(杂聚或单体/单链抗体，其中对不同抗原的不同结合部分在相同链上)
一般而言，通常为单体/单链构型的小的形式(format)具有较短的血清半衰期，其使得需要频繁甚至恒定给药，但提供了在发生副作用(如免疫风暴)时立即中断治疗的选择。
不对称双特异性抗体在涉及不同链的翻译后配对时经常引起问题。在4种不同抗体链(每种特异性的重链和轻链)的同时表达中，可能发生不规则配对，从而产生10种不同的产物，其中只有一种是正确的变体。然而，这些错配问题可以用不同的技术方法解决(参见Wang等人，2018)。
不同形式的概述见图10。这些形式中的每一种都带来不同的特性和优点，并且因此可以被选择为优选的形式。
·各抗原的结合价，
·抗原结合位点的几何结构，c
·链配对的正确性，
·药代动力学半衰期
·并且在一些情况下，效应器功能。
根据本发明的实施方案，双特异性结合剂是选自以下的至少一种形式：
·DVD-Ig
·Knobs in Holes
·Crossmab
·BiTETM
·Nanobody
·Diabody
·DARTTM
·TandAbTM，和/或
·scDb-scFv
这些形式是本领域技术人员熟知的(对于定义，参见Spiess等人(2015)[55])。本领域技术人员可以使用本文公开的可变结构域和/或CDR组通过常规方法创建上述形式。
根据本发明的一个实施方案，所述双特异性结合剂呈BiTE形式。
BiTE形式基本上由通过肽接头，通常是包含氨基酸序列GGGGs("G4S")的接头彼此连接的两个scFv形式的抗体组成。所得单链具有约55kD的重量。所述BiTE可以具有以下形式(可变结构域之间的破折号表示任选的接头，数字表示对CD3或CD117的亲和力)。
VH1-VL1-VL2-VH2
VL1-VH1-VH2-VL2
VL1-VH1-VL2-VH2
VH1-VL1-VH2-VL2
由于其小尺寸，BiTE形式与患者中非常快速清除谱相关。Blinatumomab是市场上唯一的临床上批准的BiTE，由于使用具有恒流静脉泵，它可以28天连续输注使用。这样，如果发生严重的不良事件，就有机会立即暂停抗体给药。
scDb-scFv与BiTE形式相似，不同之处仅在于第一或第二靶标的可变结构域是重复的，例如如下图所示：
VH1-VL1-VH1-VL1-VL2-VH2
VL1-VH1-VL1-VH1-VH2-VL2
VL1-VH1-VL1-VH1-VL2-VH2
VH1-VL1-VH1-VL1-VH2-VL2
TandAb(Tandem Diabody)形式例如如下：
VL1-VH2-VL2-VH1
VL2-VH1-VL1-VH2
DART形式是二聚体形式，其中两条链通过半胱氨酸接头彼此连接：
链1：VL1-VH2
链2：VH1-VL2
根据本发明的一个实施方案，第一结合结构域结合CD117/c-KIT
a)包含一组重链/轻链互补决定区(CDR)，该组重链/轻链互补决定区(CDR)包含在如SEQ ID NOs 19和20所示的抗CD117抗体79D的重链/轻链可变区序列对中，
b)包含一组包含以下序列的重链/轻链互补决定区(CDR)
HC CDR1(SEQ ID NO 1或35)
HC CDR2(SEQ ID NO 2或36)
HC CDR3(SEQ ID NO 3或37)
LC CDR1(SEQ ID NO 4或38)
LC CDR2(SEQ ID NO 5或39)，和
LC CDR3(SEQ ID NO 6或40)
c)包含b)的重链/轻链互补决定区(CDR)，条件是至少一个CDR相对于相应的SEQID NO 1-6或SEQ ID NO 35-40具有至多3个氨基酸取代，和/或
d)包含b)的重链/轻链互补决定区(CDR)，条件是至少一个CDR与相应的SEQ ID NO1-6或SEQ ID NO 35-40具有≥66％的序列同一性，
其中所述CDR嵌入合适的蛋白质框架中，以便能够结合CD117/c-KIT。
两组SEQ ID No 1-6和35-40涉及相同的抗体，但仅涉及根据其定义CDR的不同命名法。
如本文所用，术语"CDR"或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区域已由Kabat等人(1977)、Kabat等人(1991)、Chothia等人(1987)和Maccallum等人(1996)描述，其中当相互比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植的抗体或其变体的CDR旨在落入如本文所定义和使用的术语的范围内。包含由上述引用的每篇参考文献定义的CDR的氨基酸残基列于下表1中作为比较。注意，该编号可能与实际公开于随附序列表中的CDR不同，因为CDR定义因情况而异。
Kabat1 Chothia2 MacCallum3
VH CDR1 31-35 26-32 30-35
VH CDR2 50-65 53-55 47-58
VH CDR3 95-102 96-101 93-101
VL CDR1 24-34 26-32 30-36
VL CDR2 50-56 50-52 46-55
VL CDR3 89-97 91-96 89-96
表1：CDR定义
如本文所用，当提及抗体可变区使用时，术语“框架”意指抗体可变区内的CDR区之外的所有氨基酸残基。因此，可变区构架的长度为约100-120个氨基酸，但仅指CDR之外的那些氨基酸。
在一个实施方案中，术语“能够结合靶X”应理解为意指以足够的结合亲和力结合。在这样的实施方案中，相应的结合结构域以10-4或更小的KD结合靶标。KD是抗体与其抗原之间的平衡解离常数，koff/kon的比率。KD与亲和力成反比关系。KD值涉及抗体的浓度(特定实验所需的抗体量)，因此KD值越低(浓度越低)，结合结构域的亲和力越高。下表显示了单克隆抗体的典型KD范围。
K<sub>D</sub>值 摩尔范围
10<sup>-4</sup>至10<sup>-6</sup> 微摩尔(μM)
10<sup>-7</sup>至10<sup>-9</sup> 纳摩尔(nM)
10<sup>-10</sup>至10<sup>-12</sup> 皮摩尔(pM)
10<sup>-13</sup>至10<sup>-15</sup> 飞摩尔(fM)
表2.KD和摩尔值
根据本发明的一个实施方案，第二结合结构域结合CD3
a)包含一组重链/轻链互补决定区(CDR)，其包含以下序列OKT3，BlinCD3
b)包含一组重链/轻链互补决定区(CDR)，其包含在抗CD3抗体BlinCD3，OKT3和[…]之一的重链/轻链可变区序列对中，如SEQ ID NO 21和22，或SEQ ID NO 23和24所示
c)包含一组含有以下序列的重链/轻链互补决定区(CDR)
HC CDR1(SEQ ID NO 7或41)
HC CDR2(SEQ ID NO 8或42)
HC CDR3(SEQ ID NO 9或43)
LC CDR1(SEQ ID NO 10或44)
LC CDR2(SEQ ID NO 11或45)，和
LC CDR3(SEQ ID NO 12或46)
d)包含一组含有以下序列的重链/轻链互补决定区(CDR)
HC CDR1(SEQ ID NO 13)
HC CDR2(SEQ ID NO 14)
HC CDR3(SEQ ID NO 15)
LC CDR1(SEQ ID NO 16)
LC CDR2(SEQ ID NO 17)，和
LC CDR3(SEQ ID NO 18)
e)包含b)或c)的重链/轻链互补决定区(CDR)，条件是至少一个CDR相对于相应的SEQ ID NO 7-12或SEQ ID NO 41-46或SEQ ID NO 13-18具有至多3个氨基酸取代，和/或
f)包含b)的重链/轻链互补决定区(CDR)，条件是至少一个CDR与相应的SEQ ID NO7-12或SEQ ID NO 41-46或SEQ ID NO 13-18具有≥66％的序列同一性，
其中所述CDR嵌入合适的蛋白质框架中，以便能够结合CD3。
两组SEQ ID Nos 7-12和41-46涉及相同的抗体，但是仅涉及根据其定义CDR的不同命名法。
本文所用的79D是Reshetnyak等人，2013描述的抗CD117/c-Kit抗体，其内容通过引用并入本文。
如本文所用，OKT3是Horn等人，2017描述的抗体，其内容通过引用并入本文。
OKT3的INN是muromonab-CD3。OKT3在1985年被美国食品和药品管理局(FDA批准，使其成为在任何地方被批准作为人类药物的第一种单克隆抗体。Muromonab-CD3是以IgG形式提供并靶向CD3ε的鼠抗体。它被批准用于治疗同种异体肾、心脏和肝移植的急性糖皮质激素抗性排斥。还研究了其用于治疗T细胞急性淋巴细胞白血病。
如本文所用，BlinCD3是描述于Drugbank，登录号DB 09052，AA残基256-498中的抗体，其内容通过引用并入本文。BlinCD3通过人源化(Dorken等人，2018)衍生自OKT3，并且在可变结构域中与OKT3具有约93％的序列同一性。参见图11，其中CDR以粗体标记。仅LCDR2和LCDR3在各自的C末端AA残基上彼此略有不同。
优选地，双特异性结合剂具有至多2个氨基酸取代，且更优选至多1个氨基酸取代。
优选地，至少一个CDR与相应的SEQ ID NO具有≥67％，≥68％，≥69％，≥70％，≥71％，≥72％，≥73％，≥74％，≥75％，≥76％，≥77％，≥78％，≥79％，≥80％，≥81％，≥82％，≥83％，≥84％，≥85％，≥86％，≥87％，≥88％，≥89％，≥90％，≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，最优选≥99％的序列同一性。
如本文所用，术语“％序列同一性”应理解如下：将待比较的两个序列进行比对以给出序列之间的最大相关性。这可以包括在一个或两个序列中插入“间隙”，以提高比对的程度。然后可以在每个被比较的序列的整个长度上确定％同一性(所谓的全局比对)，这特别适合于相同或相似长度的序列，或在较短的，限定的长度上确定％同一性(所谓的局部比对)，这更适合于不等长度的序列。在上述上下文中，与查询氨基酸序列具有至少例如95％的“序列同一性”的氨基酸序列意在表示主题氨基酸序列的序列与查询序列相同，除了主题氨基酸序列可包括每100个查询氨基酸序列最多5个氨基酸改变。换言之，为了获得与查询氨基酸序列具有至少95％同一性的序列的氨基酸序列，可以将主题序列中至多5％(100个中的5个)的氨基酸残基插入或用另一种氨基酸取代或缺失。比较两个或多个序列的同一性和同源性的方法是本领域熟知的。两个序列相同的百分比可以例如通过使用数学算法来确定。优选的但非限制性的数学算法的实例被并入到BLAST程序家族中，例如BLAST或NBLAST程序和FASTA。在一定程度上与其它序列相同的序列可由这些程序识别。此外，wisconsin序列分析软件包9.1版中可获得的程序，例如程序BESTFIT和GAP，可用于两个多肽序列之间的百分比同一性。如果在本文中提及与参考序列具有特定程度的序列同一性的氨基酸序列，则所述序列差异优选是由于保守氨基酸取代。优选地，这样的序列保留参考序列的活性，例如，尽管可能以较慢的速率。
优选地，至少一个CDR经过CDR序列修饰，包括
亲和力成熟
免疫原性降低
在体外增加给定抗体的亲和力的过程中的亲和力成熟。与天然对应物一样，体外亲和力成熟基于突变和选择的原理。它已成功地用于优化抗体，抗体片段或其它肽分子如抗体模拟物。使用辐射、化学诱变剂或易错PCR引入CDR内的随机突变。此外，通过链改组可以增加遗传多样性。使用如噬菌体展示的展示方法的两轮或三轮突变和选择通常产生亲和力在低纳摩尔范围内的抗体片段。原理参见Eylenstein等人(2016)，其内容通过引用并入本文。
人源化抗体含有鼠序列衍生的CDR区，其已经连同任何必需的构架回复突变一起移植到人序列衍生的V区中。因此，当人源化抗体给予患者时，CDR能引起免疫原性反应。Harding等人(2010)公开了降低由CDR引起的免疫原性的方法，其内容通过引用并入本文。
根据本发明的一个实施方案，构架是人VH/VL构架。VH代表IgG型抗体的重链可变区，而VL代表轻链可变区(κ或λ)。
根据本发明的一个实施方案，结合CD117/c-KIT的第一结合结构域包含：
a)抗体79D的一个可变结构域
b)重链/轻链可变结构域(VD)
HC VD(SEQ ID NO 19)，和
LC VD(SEQ ID NO 20)
c)b)的重链/轻链可变结构域(VD)，其前提是
所述HCVD与相应的SEQ ID NO 19具有≥80％的序列同一性，和/或
所述LCDVD与相应的SEQ ID NO 20具有≥80％的序列同一性，
d)b)的重链/轻链可变结构域(VD)，条件是HCVD或LCVD中的至少一个相对于相应的SEQ ID NO 19和/或20具有至多10个氨基酸取代，
所述双特异性结合剂仍然能够结合CD117/c-KIT。
“可变结构域”当用于指抗体或其重链或轻链时，是指赋予抗原结合到分子上并且不是恒定区的抗体部分。该术语包括其功能片段，其保持整个可变区的部分或全部结合功能。可变区结合片段包括，例如，功能片段如Fab，F(ab)2，Fv，单链Fv(scfv)等。这些功能片段是本领域技术人员熟知的。因此，这些术语在描述异数可变区的功能片段中的使用旨在对应于本领域技术人员熟知的定义。这些术语描述于例如Huston等人(1993)或Plückthun和Skerra(1990)中。
根据本发明的一个实施方案，结合至CD3的第二结合结构域包含
a)选自OKT3和BlinCD3的一种抗体的可变结构域
b)重链/轻链可变结构域(VD)
HC VD(SEQ ID NO 21或23)，和
LC VD(SEQ ID NO 22或24)
c)b)的重链/轻链可变结构域(VD)，其前提是
所述HCVD与相应的SEQ ID NO 21或23具有≥80％的序列同一性，和/或
LCDVD与相应的SEQ ID NO 22或24具有≥80％的序列同一性。
d)b)的重链/轻链可变结构域(VD)，条件是HCVD或LCVD中的至少一个相对于相应的SEQ ID NO具有至多10个氨基酸取代，
所述双特异性结合剂仍然能够结合CD3。
优选地，至少一个可变结构域与相应的SEQ ID NO具有≥81％，≥82％，≥83％，≥84％，≥85％，≥86％，≥87％，≥88％，≥89％，≥90％，≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99的序列同一性。
根据本发明的一个实施方案，至少一个氨基酸取代是保守氨基酸取代。
“保守氨基酸取代”对抗体功能的影响比非保守取代小。尽管有许多方法将氨基酸分类，但通常根据它们的结构和它们的R基团的一般化学特征将它们分类成六个主要的组。
在一个实施方案中，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的取代。例如，本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括氨基酸和
■碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，
■酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，
■不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，
■非极性侧链(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，
■β-支化侧链(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和
■芳族侧链(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。
其它保守氨基酸取代也可以在氨基酸侧链家族中发生，例如当用天冬酰胺取代天冬氨酸以修饰肽的电荷时。因此，例如，HR结构域多肽中预测的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族或家族间同源物的另一氨基酸残基替代(例如天冬酰胺替代天冬氨酸，谷氨酰胺替代谷氨酸)。保守性改变可进一步包括化学上同源的非天然氨基酸的取代(即合成的非天然疏水性氨基酸代替亮氨酸，合成的非天然芳族氨基酸代替色氨酸)。
根据本发明的实施方案，相应的可变重链区(VH)和相应的可变轻链区(VL)从N-末端到C-末端按以下顺序排列。
VL(CD117)-接头-VH(CD117)-接头-VH(CD3)-接头-VL(CD3),
VL(CD117)-接头-VH(CD117)-接头-VL(CD3)-接头-VH(CD3),
VH(CD117)-接头-VL(CD117)-接头-VH(CD3)-接头-VL(CD3),
VH(CD117)-接头-VL(CD117)-接头-VL(CD3)-接头-VH(CD3),
VL(CD3)-接头-VH(CD3)-接头-VH(CD117)-接头-VL(CD117),
VL(CD3)-接头-VH(CD3)-接头-VL(CD117)-接头-VH(CD117),
VH(CD3)-接头-VL(CD3)-接头-VH(CD117)-接头-VL(CD117),和/或
VH(CD3)-接头-VL(CD3)-接头-VL(CD117)-接头-VH(CD117),
其中术语“接头”定义了任选的多肽接头，如例如在SEQ ID NO 32、32或33中所公开的。这些实施方案都符合本文别处讨论的多肽BiTE形式。
这样的实施方案的实例在SEQ ID Nos 25、26、34、59和60的任一个中给出。注意，在一些序列中包括His标签和/或信号序列。这些序列应该被认为是在有和没有His标签和/或信号序列的情况下公开的。
根据本发明的实施方案，相应的可变重链区(VH)和相应的可变轻链区(VL)从N-末端到C-末端按以下顺序排列
VH(CD117)-接头-VL(CD117)-接头-VH(CD117)-接头-VL(CD117)-接头-VH(CD3)-接头-VL(CD3)。
该实施方案符合本文别处讨论的scDb-scFv形式。这样的实施方案的实例在SEQID NO 61中给出。
根据本发明的其它实施方案，相应的可变重链区(VH)和相应的可变轻链区(VL)从N-末端到C-末端按以下顺序排列。
VL(CD3)-接头-VH(CD117)-接头-VL(CD117)-VH(CD3)。
该实施例符合本文别处讨论的TandAb格式。这样的实施方案的实例在SEQ IDNO62中给出。
根据本发明的其它实施方案，相应的可变重链区(VH)和相应的可变轻链区(VL)区以本文的二聚体构型从N-末端到C-末端按以下顺序排列
链1：VL(CD3)-接头-VH(CD117)-Cys
链2：VL(CD117)-接头-VH(CD3)-Cys
与由两个C-末端半胱氨酸残基建立的二硫键。该实施方案符合本文别处讨论的DART格式。这样的实施方案的实例在SEQ ID NO 63和64中给出。
根据本发明的一个实施方案，结合CD3的第二结合结构域
a)包含如SEQ ID NOs 28或29中任一个所示的scFv样序列，或
b)包含与SEQ ID NOs 28或29中任一个具有≥80％序列同一性的氨基酸序列。
优选地，该序列与相应的SEQ ID NO具有≥81％，≥82％，≥83％，≥84％，≥85％，≥86％，≥87％，≥88％，≥89％，≥90％，≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99的序列同一性。
根据本发明的一个实施方案，结合CD117/cKIT的第一结合结构域
a)包含如SEQ ID NO 27所示的scFv样序列，或
b)包含与SEQ ID NOs 27具有≥80％序列同一性的氨基酸序列。
优选地，该序列与相应的SEQ ID NO具有≥81％，≥82％，≥83％，≥84％，≥85％，≥86％，≥87％，≥88％，≥89％，≥90％，≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99的序列同一性。
根据本发明的一个实施方案，双特异性结合剂
a)包含选自SEQ ID NO 25，26，34，59或60的至少一种序列，或
b)包含与SEQ ID NO 25，26，34，59或60具有≥80％序列同一性的氨基酸序列。
注意在一些序列中包括His标签和/或信号序列。这些序列应该被认为是在有和没有His标签和/或信号序列的情况下公开的。同样，由相应的专利权利要求提供的保护旨在涵盖具有和不具有His标签和/或信号序列的实施方案。
优选地，该序列与相应的SEQ ID NO具有≥81％，≥82％，≥83％，≥84％，≥85％，≥86％，≥87％，≥88％，≥89％，≥90％，≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99的序列同一性。
根据本发明的一个实施方案，与权利要求14的双特异性结合剂相比，所述双特异性结合剂具有以下至少之一
≥50％对CD3的靶结合亲和力，通过SPR测量，和/或
≥50％对CD117/c-KIT的靶结合亲和力，通过SPR测量。
本文所用的术语“结合亲和力”是指结合相互作用的强度，因此包括实际结合亲和力以及表观结合亲和力。实际结合亲和力是结合速率与解离速率的比率。因此，赋予或优化结合亲和力包括改变这些组分中的一种或两种以实现所需水平的结合亲和力。表观亲和力可包括例如相互作用的亲和力。例如，二价异聚可变区结合片段由于其化合价而可以表现出改变的或优化的结合亲和力。
测量结合剂亲和力的合适方法是通过表面等离子体共振(SPR)。该方法基于当表面等离子体激元波在金属/液体界面处被激发时发生的现象。光被导向不与样品接触的表面侧并从其反射，并且SPR在角度和波长的特定组合下引起反射光强度的降低。生物分子结合事件引起表面层折射率的变化，其被检测为SPR信号的变化。结合事件可以是受体-配体对之间的结合缔合或解离。可以基本上瞬时地测量折射率的变化，因此允许确定亲和常数的各个分量。更具体地，该方法能够精确测量缔合速率(kon)和解离速率(koff)。
kon和koff值的测量可以是有利的，因为它们可以识别治疗上更有效的改变的可变区或优化的可变区。例如，改变的可变区或其异聚结合片段可以是更有效的，因为相似结合亲和力的可变区和异聚结合片段相比，它具有例如更高的kon值。由于具有较高kon值的分子能够以更快的速率特异性结合和抑制其靶标，因此赋予了增加的效力。类似地，本发明的分子可以更有效，因为与具有类似结合亲和力的分子相比，它表现出较低的koff值。可以观察到用具有较低koff速率的分子观察到的功效增加，因为一旦结合，分子从其靶解离较慢。尽管参考本发明的改变的可变区和优化的可变区(包括其异侧可变区结合片段)进行了描述，但是上述用于测量结合和解离速率的方法基本上适用于任何抗体或其片段，用于鉴定更有效的结合剂，用于治疗或诊断目的。
用于测量亲和力的方法，包括使用表面等离子共振的结合和解离速率在本领域中是众所周知的，并且可以在例如Jonsson和Malmquist(1992)和Wu等人(1998)中找到描述。此外，本领域公知的用于测量结合相互作用的一种装置是BIAcore 2000仪器，其可通过Pharmacia Biosensor(Uppsala,Sweden)商购获得。
优选地，与双特异性结合剂相比，所述靶结合亲和力为≥51％，≥52％，≥53％，≥54％，≥55％，≥56％，≥57％，≥58％，≥59％，≥60％，≥61％，≥62％，≥63％，≥64％，≥65％，≥66％，≥67％，≥68％，≥69％，≥70％，≥71％，≥72％，≥73％,≥74％,≥75％，≥76％，≥77％,≥78％，≥79％，≥80％，≥81％，≥82％，≥83％，≥84％，≥85％，≥86％，≥87％，≥88％，≥89％，≥90％，≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，和最优选≥99％。
根据本发明的另一方面，提供了双特异性结合剂，其与根据以上描述的双特异性结合剂竞争结合CD117/c-KIT和CD3。
关于这种粘合剂的形式或结构，应用与上述相同的优选实施方案。本文所用的术语“竞争结合”用于指与具有活性的第二结合剂结合相同靶标的具有活性的第一结合剂，其中第二结合剂是第一结合剂的变体或相关或不同的结合剂。第一结合剂的结合效率(例如动力学或热力学)可以等于或大于或小于第二结合剂的底物结合效率。例如，两种结合剂与底物结合的平衡结合常数(KD)可以不同。
这种对结合的竞争可以用竞争性结合测定适当地测定。Finco等人，2011公开了这样的测定，其内容通过引用并入本文，并且其用于解释专利权利要求的含义在Deng等人2018中公开，其内容通过引用并入本文。
根据本发明的另一个方面，提供了双特异性结合剂，其结合与上述双特异性结合剂基本相同或相同的CD3和CD117/c-KIT上的表位。
为了测试该特征，可使用合适的表位作图技术，除其他外，
●X射线共晶体学和低温电子显微术(cryo-EM)
●基于阵列的寡肽扫描
●定点诱变作图
●高通量鸟枪诱变表位作图
●氢-氘交换
●交联耦合质谱
这些方法尤其在Banik等人(2010)和DeLisser(1999)中公开和讨论，其内容通过引用并入本文。
根据本发明的另一方面，提供了编码根据前述权利要求中任一项的结合剂的核酸。
在提供的编码结合剂的给定序列中，由于遗传密码的简并性，这种核酸可以具有不同的序列。
这样的核酸可用于药物目的。在这种情况下，它是施用给患者的RNA衍生的分子，其中患者的蛋白质表达机构表达相应的结合剂。mRNA可以例如在合适的脂质体中递送并且包含特定序列或修饰的尿苷核苷以避免免疫反应和/或提高折叠和翻译效率，有时在5'-和/或3'末端包含帽修饰以靶向它们到特定的细胞类型。
这种核酸可用于转染表达宿主，然后表达实际的结合剂。在这种情况下，所述分子可以是任选整合到合适载体中的cDNA。
根据本发明的另一方面，提供了药物组合物，其包含根据前述权利要求任一项的双特异性结合剂或核酸，和任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂。
根据本发明的另一方面，提供了组合，其包含(i)根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂或药物组合物和(ii)一种或多种治疗活性化合物。
根据本发明的另一方面，提供根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂、药物组合物或组合(用于制备药物)用于治疗人类或动物受试者，所述受试者
被诊断为发展肿瘤性疾病，
患有肿瘤性疾病，或
处于发展肿瘤性疾病风险，
或用于预防这种病症。
根据本发明的另一方面，提供了用于治疗或预防肿瘤疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂、药物组合物或组合。
优选地，肿瘤性疾病选自急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)。
根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗性药盒，其包括
a)根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂、药物组合物或组合
b)用于施用所述组合物、组合物或组合的装置
c)使用说明书。
这样的实施方案是例如用于患者自我给药的笔或注射器，或用于透皮应用的膏药。
实施例
虽然已经在附图和前面的描述中详细说明和描述了本发明，但是这样的说明和描述应当被认为是说明性的或示例性的而不是限制性的；本发明不限于所公开的实施方案。通过研究附图，公开内容和所附权利要求，本领域技术人员在实践所要求保护的本发明时可以理解和实现所公开的实施方案的其它变型。在权利要求中，词语“包括”不排除其他成分或步骤，并且不定冠词“a”或“an”不排除多个。在相互不同的从属权利要求中引用某些措施的事实并不表示不能有利地使用这些措施的组合。权利要求中的任何参考符号不应被解释为限制范围。
本文公开的所有氨基酸序列显示为从N-末端到C-末端；本文公开的所有核酸序列显示为5'->3'。
材料和方法
1.双特异性抗体的构建
双特异性抗体由抗人c-Kit抗体79D[19]的序列(scFv序列在本文中显示为SEQ IDNO 29)人源化版本的抗人CD3抗体OKT3[20]构建而成，称为BlinCD3(scFv序列在本文中显示为SEQ ID NO 28)。它通过连续重叠PCR以VL79D-接头15aa-VH79D-接头5aa-VHBlinCD3-接头18aa-VLBlinCD3-His6的顺序进行基因组装，并克隆到哺乳动物排泄信号序列下游的pcDNA3.1表达载体中。第一步，扩增VL79D，VH79D，VHBlinCD3和VLBlinCD3的cDNA序列。在第二步中，装配VL79D-接头15aa-VH79D和VHBlinCD3-接头18aa-VLBlinCD3片段，在最后的克隆步骤中，装配两个scFv-编码片段以产生完整的构建体。然后根据制造商的方案用HindIII-HF和NotI消化最终的片段并连接到表达载体中。
2.细胞系
为了产生双特异性抗体，使用悬浮液中的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-S，Invitrogen)。悬浮的CHO-S细胞在摇床培养箱(37℃)中的PowerCHO培养基中培养，添加8mMUltraglutamin和HT补充剂。
HL-60细胞(CCL-240TM,
Figure BDA0003623417940000171
Manassas,VA,USA)在添加了10％FCS和1％青霉素/链霉素的Dulbeccos改良Eagle培养基(DMEM)中培养。
3.蛋白质表达和纯化
双特异性抗体是通过瞬时基因表达产生的。对于1l的制备，将4×109CHO-S细胞重悬于PROCHO4(Lonza)中。将质粒DNA(3200μg)和10ml 1mg/ml聚乙烯亚胺(PEI)添加到细胞悬液中。然后将转染的培养物在摇床培养箱中于31℃培养6天。通过蛋白A亲和层析从细胞培养基中纯化融合蛋白，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析。
4.表面等离子体共振
过滤双特异性抗体溶液(使用0.22μm PVDF过滤器)并使用BIAcore S200仪器和抗原包被的CM5传感器芯片(GE Healthcare)分析它们的结合特性，该芯片是根据人类c-Kit结构域4&5的共价偶联制备的制造商的协议。
5.T细胞分离
通过密度梯度离心(Ficoll-Paque Plus，GE Healthcare，Chicago，Illinois，USA)从健康供体的过量血沉棕黄层(由Blutspendedienst Zürich，瑞士提供)中富集人PBMC。使用EasySepTM珠(人类T细胞分离试剂盒，STEMCELL Technologies，温哥华，加拿大)对人类T细胞进行阴性分离。将纯化的T细胞冷冻保存在补充有10％DMSO的90％FCS中，并储存在液氮中直至解冻。
6.AML患者细胞&健康供者骨髓细胞
健康的骨髓供体和AML患者签署了书面知情同意书，研究得到了瑞士苏黎世州伦理委员会的批准(2009-0062)。在苏黎世大学医院(瑞士苏黎世)的医学肿瘤学和血液学系收集了缓解期AML患者的外周血样本。所有骨髓来源的人体细胞均由苏黎世大学医院医学肿瘤学和血液学系的生物库处理。之前描述了细胞收集和冷冻保存程序。在初始诊断检查期间从AML患者获得骨髓抽吸物。单核细胞(MNC)通过密度梯度离心富集，然后通过基于珠子的免疫磁性选择(均为Miltenyi生物技术)在LD柱上耗尽CD3+和CD19+细胞。从用于同种异体BM移植的剩余输液袋和输液系统中分离出BM衍生的健康HSPC。在通过密度梯度离心富集MNC后，通过CD34微珠和LS柱(均为Milltenyi Biotech)纯化CD34+细胞。如前所述，所有原代人类细胞都冷冻保存在冷冻培养基中。
7.体外细胞毒性测定
流式细胞术细胞毒性试验改编自先前公布的方案，用于量化针对AML细胞系、原代骨髓细胞和AML患者样本的T细胞活性。简而言之，根据制造商的方案，用用于通用细胞膜标记的PKH26红色荧光细胞连接试剂盒(Sigma Aldrich)对AML细胞系(CD117negative、CD117low、CD117med或CD117high)进行染色。在高级RPMI中，靶细胞与人T细胞以10:1的效应物与靶物的比例混合，补充10％FCS、2mM GlutamaxTM和青霉素/链霉素(100U/ml/100μg/ml，所有
Figure BDA0003623417940000181
Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)并孵育24小时。在细胞毒性测定开始之前，将CAR T细胞在不含IL-2的培养基中培养过夜。双特异性抗体在培养基中稀释并以指定浓度添加。24小时后，用TO-PROTM-3Iodide(Thermo Fisher)对细胞进行染色，并通过流式细胞仪进行分析。特异性杀伤的计算公式为：[1-活靶细胞(样品)/活靶细胞(对照)]·100，如前所述[21]。
为了量化来自健康骨髓(BM)供体的造血细胞的特异性裂解，将总BM衍生的单核细胞与T细胞以10:1的效应物与靶标比率共培养48小时。解冻后立即开始共培养。
为了分析针对原代人AML细胞的特异性裂解，将自体人T细胞与来自AML患者的BM衍生的单核细胞以10:1的效应物与目标物的比例共培养48小时。在开始共培养之前，将单核细胞解冻并在补充有20％FCS、1％青霉素/链霉素、GlutamaxTM、50μM 2巯基乙醇、10ng/ml干细胞因子(SCF)、50ng/ml血小板生成素(TPO)、10ng/ml IL-6和10ng/ml Flt3配体(所有重组人蛋白，
Figure BDA0003623417940000191
Rocky Hill,NJ,USA)的IMDM中培养3天。
针对CD3、CD117、CD45和LIVE/DEADTMFixable Aqua Dead Cell Stain Kit对细胞进行染色，并如上所述通过流式细胞术进行分析。
8.AML小鼠的BiTE治疗
实验设计的示意图如图5A所示。简而言之，对NSG小鼠进行亚致死照射，随后静脉内注射4×106HL60-Luc-GFP细胞。第二天，静脉内注射4×106人T细胞，产生1:1的效应物与靶标比率。从第1天开始，给治疗组中的小鼠每天注射25μg CD117xCD3，持续18天。在第21天，处死小鼠。他们的股骨用PBS冲洗，骨髓细胞被进一步处理用于FACS分析。
9.流式细胞仪
从小鼠骨髓制备单细胞悬浮液。用RBC裂解缓冲液(biolegend，sandiego，CA，USA)裂解红细胞。Zombie Aqua(BioLegend)用于排除死细胞。表面抗原用荧光标记的抗体染色。数据是在BD FACSCanto或BD LSRFortessa II流式细胞仪(Becton Dickinson,FranklinLakes,NJ,USA)上获得的。使用Flowjo(v10.0.7,Flowjo,LLC,Ashland,OR,USA)进行数据分析和呈现。
结果
1.图1：CD117xCD3的克隆、表达和表征
CD117xCD3被克隆并以BiTETM格式表达，为可变抗体结构域选择VL-VH-VH-VL排列[图1A,B]。我们使用79D抗体进行c-Kit识别[19]，而OKT3部分被选择用于CD3靶向，因为该scFv片段已成功用于blinatumomab结构[22]。选择Gly4Ser接头作为组成BiTETM产品的两个scFv片段之间的接头，以尽量减少可变抗体结构域之间的不希望配对或Tandab形成[23]。将融合蛋白克隆到pcDNA3.1衍生载体(Invitrogen)中，并通过瞬时基因表达方法在CHO细胞中表达[24]。产物的完整氨基酸序列和另外的蛋白质表征可见于图2。CD117xCD3使用蛋白A层析纯化至同质，因为79D抗体VH结构域属于VH3家族并且能够与蛋白A结合[25]。SDS-PAGE电泳可见一条带[图1C]。质谱分析显示单峰[图1D]，其质量(55'528Da)大于预测的峰值(53'475Da)，这是N-连接糖基化的结果[图7]。
图8描述了c-Kit的胞外部分的制备和质量控制，因为该蛋白质促进了CD117xCD3的功能表征。通过BIAcore分析测试了与重组c-Kit的结合特性，揭示了与先前报道的scFv格式的79D抗体相似的动力学结合和解离谱[图1D][19]。通过FACS在分离的人类T细胞上测试CD117xCD3与人类T细胞上的CD3的结合[图6]
2.CD117xCD3的生物活性
为了表征CD117xCD3的杀生物特性，我们产生了衍生自HL60亲本系的AM细胞系[26]，其在它们的表面上不同水平的c-Kit。我们将注意力集中在三个亚系(称为HL60c-Kit高、中和低)上，如使用FACS方法测量的，它们分别表达每个细胞约8'000、25'000和115'000c-Kit拷贝[图2A，B]。在不同浓度的CD117xCD3和人T细胞存在的情况下，可以观察到三种细胞系的剂量依赖性体外杀伤，效应细胞：靶细胞比率为10:1[图2C]。HL60 c-Kit高细胞系可在100ng/ml BiTETM下有效根除，相当于～1.8nM。我们使用1000ng/ml的CD117xCD3和不同的效应物重复了类似的实验：靶细胞比率。我们观察到HL60c-Kit高和c-Kit中等细胞均可在效应物：靶比例低至1：1，而c-Kit低细胞的去除需要更高密度的人T细胞[图2D]。对非转导HL60细胞的杀生物作用低得可忽略不计，这证实了需要c-Kit和CD3抗原同时参与靶细胞杀伤。
我们最近报道，基于抗体的白细胞介素2(IL2)靶向递送至AML患者的骨髓或绿色瘤病变可能与有效的抗白血病活性有关[27,28]。为此，我们在存在和不存在重组人IL2的情况下进行了细胞杀伤实验。然而，在该体外环境中，加入IL2不改变CD117xCD3的细胞杀伤特性[图3]。
为了在更接近临床情况的环境中表征CD117xCD3的杀生物活性，我们使用来自健康供体的HSPC[图4A,B]和患者来源的AML胚细胞[图4C,D]进行体外细胞杀伤实验。CD117xCD3可以以浓度依赖性方式有效杀伤两种类型的靶细胞。对于这些样本，在1μg/mlCD117xCD3浓度下观察到完全细胞裂解，其特征是通过FACS进行的强烈CD117染色(即2/3HSPC样本和1/3AML原始样本)[图4]。图4E的二维FACS曲线说明了在自体T细胞存在的情况下，CD117xCD3 BiTETM选择性和剂量依赖性AML母细胞杀伤的一个例子。
然后我们研究了CD117xCD3在体内系统中的抗白血病特性。亚致死辐照的NSG小鼠接受静脉注射4x106荧光素酶-和GFP-转导的HL60 c-Kit高细胞，然后施用4x106人类T细胞并重复注射CD117xCD3(25μg/天，持续18天)[图5A]。腹腔注射萤光素可以通过IVIS成像监测疾病进展[29][图9]。在第21天对小鼠实施安乐死，并通过FACS评估骨髓中白血病干细胞的存在。图5B显示在仅接受盐水注射或T细胞的所有对照小鼠中观察到AML植入骨髓中。相反，CD117xCD3的节律性给药导致AML植入的完全抑制。在存在盐水的情况下接受T细胞的小鼠或在CD117xCD3治疗组[图5C]中未观察到骨髓中人类T细胞密度的统计学显着差异，这表明T细胞在第21天尚未扩增，作为BiTETM处理的结果。
讨论
我们已经描述了新的双特异性抗体，其与人类c-Kit(在HSCP和AML胚细胞上表达)和CD3抗原(在T细胞上表达)结合。所述抗体尤其能够在T细胞存在下以浓度和抗原密度依赖性方式选择性杀死在其表面上表达各种水平的c-Kit的AML细胞系。双特异性抗体还裂解来自健康供体的骨髓细胞，其对c-Kit呈阳性。在体内，抗体完全阻止c-Kit阳性细胞系移入小鼠骨髓。
参考文献：
1.Orkin,S.H.and L.I.Zon,Hematopoiesis:an evolving paradigm for stemcell biology.Cell,2008.132(4):p.631-44.
2.Ng,S.W.,et al.,A 17-gene stemness score for rapid determination ofrisk in acute leukaemia.Nature,2016.540(7633):p.433-437.
3.Bonnet,D.and J.E.Dick,Human acute myeloid leukemia is organized asa hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.Nat Med,1997.3(7):p.730-7.
4.Gyurkocza,B.and B.M.Sandmaier,Conditioning regimens forhematopoietic cell transplantation:one size does not fit all.Blood,2014.124(3):p.344-53.
5.Dohner,H.,et al.,Diagnosis and management of AML in adults:2017ELNrecommendations from an international expert panel.Blood,2017.129(4):p.424-447.
6.Buckley,S.A.,et al.,Prediction of adverse events during intensiveinduction chemotherapy for acute myeloid leukemia or high-grademyelodysplastic syndromes.Am J Hematol,2014.89(4):p.423-8.
7.Chhabra,A.,et al.,Hematopoietic stem cell transplantation inimmunocompetent hosts without radiation or chemotherapy.Sci Transl Med,2016.8(351):p.351ra105.
8.Majeti,R.,et al.,CD47 is an adverse prognostic factor andtherapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells.Cell,2009.138(2):p.286-99.
9.Czechowicz,A.,et al.,Efficient transplantation via antibody-basedclearance of hematopoietic stem cell niches.Science,2007.318(5854):p.1296-9.
10.AMG191,Conditioning/CD34+CD90 Stem Cell Transplant Study for SCIDPatients:.2016.
11.Lennartsson,J.and L.Ronnstrand,Stem cell factor receptor/c-Kit:from basic science to clinical implications.Physiol Rev,2012.92(4):p.1619-49.
12.Tsao,A.S.,et al.,C-kit receptor expression in acute leukemias-association with patient and disease characteristics and with outcome.LeukRes,2004.28(4):p.373-8.
13.Valverde,L.R.,et al.,C-kit receptor(CD117)expression in acuteleukemia.Ann Hematol,1996.72(1):p.11-5.
14.Wells,S.J.,et al.,CD117/CD34 expression in leukemic blasts.Am JClin Pathol,1996.106(2):p.192-5.
15.Schanzer,J.M.,et al.,A novel glycoengineered bispecific antibodyformat for targeted inhibition of epidermal growth factor receptor(EGFR)andinsulin-like growth factor receptor type I(IGF-1R)demonstrating uniquemolecular properties.J Biol Chem,2014.289(27):p.18693-706.
16.Goebeler,M.E.and R.Bargou,Blinatumomab:a CD19/CD3 bispecific Tcell engager(BiTE)with unique anti-tumor efficacy.Leuk Lymphoma,2016.57(5):p.1021-32.
17.Neri,D.,et al.,High-affinity antigen binding by chelatingrecombinant antibodies(CRAbs).J Mol Biol,1995.246(3):p.367-73.
18.Nagorsen,D.,et al.,Blinatumomab:a historical perspective.PharmacolTher,2012.136(3):p.334-42.
19.Reshetnyak,A.V.,et al.,Structural basis for KIT receptor tyrosinekinase inhibition by antibodies targeting the D4 membrane-proximalregion.Proc Natl Acad Sci U S A,2013.110(44):p.17832-7.
20.Horn,L.A.,et al.,CD3xPDL1 bi-specific T cell engager(BiTE)simultaneously activates T cells and NKT cells,kills PDL1(+)tumor cells,andextends the survival of tumor-bearing humanized mice.Oncotarget,2017.8(35):p.57964-57980.
21.Schlereth,B.,et al.,Potent inhibition of local and disseminatedtumor growth in immunocompetent mouse models by a bispecific antibodyconstruct specific for Murine CD3.Cancer Immunol Immunother,2006.55(7):p.785-96.
22.Loffler,A.,et al.,A recombinant bispecific single-chain antibody,CD19 x CD3,induces rapid and high lymphoma-directed cytotoxicity byunstimulated T lymphocytes.Blood,2000.95(6):p.2098-103.
23.Yang,F.,W.Wen,and W.Qin,Bispecific Antibodies as a DevelopmentPlatform for New Concepts and Treatment Strategies.Int J Mol Sci,2016.18(1).
24.Derouazi,M.,et al.,Serum-free large-scale transient transfectionof CHO cells.Biotechnol Bioeng,2004.87(4):p.537-45.
25.Hoogenboom,H.R.and G.Winter,By-passing immunisation.Humanantibodies from synthetic repertoires of germline VH gene segments rearrangedin vitro.J Mol Biol,1992.227(2):p.381-8.
26.Birnie,G.D.,The HL60 cell line:a model system for studying humanmyeloid cell differentiation.Br J Cancer Suppl,1988.9:p.41-5.
27.Gutbrodt,K.L.,et al.,Antibody-based delivery of interleukin-2 toneovasculature has potent activity against acute myeloid leukemia.Sci TranslMed,2013.5(201):p.201ra118.
28.Schliemann,C.,et al.,Targeting interleukin-2 to the bone marrowstroma for therapy of acute myeloid leukemia relapsing after allogeneichematopoietic stem cell transplantation.Cancer Immunol Res,2015.3(5):p.547-56.
29.Zinn,K.R.,et al.,Noninvasive bioluminescence imaging in smallanimals.ILAR J,2008.49(1):p.103-15.
30.Czechowicz,A.,et al.,Selective hematopoietic stem cell ablationusing CD117-antibody-drug-conjugates enables safe and effectivetransplantation with immunity preservation.Nat Commun,2019.10(1):p.617.
31.Kontermann,R.E.,Dual targeting strategies with bispecificantibodies.MAbs,2012.4(2):p.182-97.
32.Portell,C.A.,C.M.Wenzell,and A.S.Advani,Clinical and pharmacologicaspects of blinatumomab in the treatment of B-cell acute lymphoblasticleukemia.Clin Pharmacol,2013.5(Suppl 1):p.5-11.
33.Brinkmann,U.and R.E.Kontermann,The making of bispecificantibodies.MAbs,2017.9(2):p.182-212.
34.Rodney A.Prell,D.W.L.,Wendy G.Halpern,Anu V.Connor,Chapter 14-Nonclinical Development of Multi-targeting Biopharmaceuticals.NonclinicalDevelopment of Novel Biologics,Biosimilars,Vaccines and Specialty Biologics,ed.D.J.H.Lisa M.Plitnick.2013:Academic Press.
35.Yuraszeck,T.,S.Kasichayanula,and J.E.Benjamin,Translation andClinical Development of Bispecific T-cell Engaging Antibodies for CancerTreatment.Clin Pharmacol Ther,2017.101(5):p.634-645.
36.Hipp,S.,et al.,A novel BCMA/CD3 bispecific T-cell engager for thetreatment of multiple myeloma induces selective lysis in vitro and invivo.Leukemia,2017.31(8):p.1743-1751.
37.Friedrich,M.,et al.,Regression of human prostate cancer xenograftsin mice by AMG 212/BAY2010112,a novel PSMA/CD3-Bispecific BiTE antibodycross-reactive with non-human primate antigens.Mol Cancer Ther,2012.11(12):p.2664-73.
38.Smith,E.J.,et al.,A novel,native-format bispecific antibodytriggering T-cell killing of B-cells is robustly active in mouse tumor modelsand cynomolgus monkeys.Sci Rep,2015.5:p.17943.
39.Kabat et al.,J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)and Kabat et al.,Sequences of protein of immunological interest.(1991)
40.Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)
41.MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)
42.Reshetnyak,A.V.,et al.,Structural basis for KIT receptor tyrosinekinase inhibition by antibodies targeting the D4 membrane-proximalregion.Proc Natl Acad Sci U S A,2013.110(44):p.17832-7.
43.Horn,L.A.,et al.,CD3xPDL1 bi-specific T cell engager(BiTE)simultaneously activates T cells and NKT cells,kills PDL1(+)tumor cells,andextends the survival of tumor-bearing humanized mice.Oncotarget,2017.8(35):p.57964-57980.
44.Dorken B,Riethmuller G,Kufer P,Lutterbuse R,Bargou R,LofflerA.inventors；Micromet Ag,assignee.CD19xCD3 specific polypeptides and usesthereof.United States patent US 7575923 B2.2009.Aug 18
45.Eylenstein,et al,Molecular basis of in vitro affinity maturationand functional evolution of a neutralizing anti-human GM-CSF antibody,mAbs,8:1,176-186(2016)
46.Harding,The immunogenicity of humanized and fully humanantibodies.MAbs.2010May-Jun；2(3):256–265.
47.Huston et al.,Cell Biophysics,22:189-224(1993)；
48.Plückthun and Skerra,Meth.Enzymol.,178:497-515(1989)and in Day,E.D.,Advanced Immunochemistry,Second Ed.,Wiley-Liss,Inc.,New York,N.Y.(1990)
49.Jonsson and Malmquist,Advances in Biosnsors,2:291-336(1992)
50.Wu et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:6037-6042(1998).
51.Finco et al,Comparison of competitive ligand-binding assay andbioassay formats for the measurement of neutralizing antibodies to proteintherapeutics.J Pharm Biomed Anal.2011Jan 25；54(2):351-8.doi:10.1016/j.jpba.2010.08.029.Epub 2010Sep 21
52.Deng et al.,Enhancing antibody patent protection using epitopemapping information MAbs.2018Feb-Mar；10(2):204–209.
53.Banik,SSR；Doranz,BJ(2010)."Mapping complex antibody epitopes".Genetic Engineering&Biotechnology News.3(2):25–8.
54.DeLisser,HM(1999).Epitope mapping.Methods Mol Biol.96.pp.11–20.
55.Spiess C et al,Alternative molecular formats and therapeuticapplications for bispecific antibodies.Mol Immunol.2015Oct；67(2Pt A):95-106.
56.Wang,A systematic approach for analysis and characterization ofmispairing in bispecific antibodies with asymmetric architecture.
序列
以下序列构成本申请公开的一部分。WIPO ST 25兼容的电子序列表也与本申请一起提供。为免生疑问，如果下表中的序列与电子序列表存在差异，则该表中的序列应视为正确的序列。
Figure BDA0003623417940000231
Figure BDA0003623417940000241
Figure BDA0003623417940000251
Figure BDA0003623417940000261
Figure BDA0003623417940000271
Figure BDA0003623417940000281
序列表
<110> ETH苏黎世公司 & 苏黎世大学
<120> 与 CD117/c-KIT 和 CD3 结合的双特异性结合剂
<130> ED 41398
<160> 64
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 1
Phe Asn Ile Ser Val Tyr Met Met His
1 5
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 2
Trp Val Ala Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 3
Arg Tyr Val Tyr His Ala Leu Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 4
Gln Arg Gly Leu Arg Asn Val Ala Val Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 5
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 6
Gln Gln Trp Ala Val His Ser Leu Ile
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 7
Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His
1 5
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 8
Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 9
Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 10
Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
1 5
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 11
Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 12
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 13
Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His
1 5
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 14
Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 15
Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 16
Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
1 5
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 17
Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 18
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe
1 5
<210> 19
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 19
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Val
20 25 30
Tyr Met Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Tyr Val Tyr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Gly Leu Arg Asn
20 25 30
Val Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Val His
85 90 95
Ser Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 21
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 22
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 23
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 24
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg
100 105
<210> 25
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Gly Leu Arg Asn
20 25 30
Val Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Val His
85 90 95
Ser Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Val Tyr Met Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser
165 170 175
Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Tyr Val Tyr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly
245 250 255
Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr
260 265 270
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg
275 280 285
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly
290 295 300
Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr
305 310 315 320
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
325 330 335
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr
340 345 350
Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val
355 360 365
Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val
370 375 380
Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro
385 390 395 400
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr
405 410 415
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile
420 425 430
Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala
450 455 460
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu
465 470 475 480
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
485 490
<210> 26
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Gly Leu Arg Asn
20 25 30
Val Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Val His
85 90 95
Ser Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Val Tyr Met Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser
165 170 175
Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Tyr Val Tyr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly
245 250 255
Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala
260 265 270
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg
275 280 285
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly
290 295 300
Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr
305 310 315 320
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
325 330 335
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr
340 345 350
Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val
355 360 365
Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val
370 375 380
Asp Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro
385 390 395 400
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr
405 410 415
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile
420 425 430
Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala
450 455 460
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe
465 470 475 480
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg
485 490
<210> 27
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Asn Arg
<210> 28
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 28
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys
<210> 29
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Gly Leu Arg Asn
20 25 30
Val Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Val His
85 90 95
Ser Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Val Tyr Met Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser
165 170 175
Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Tyr Val Tyr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 30
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 33
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 33
Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Val Asp
<210> 34
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 34
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Gly
35 40 45
Leu Arg Asn Val Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
100 105 110
Ala Val His Ser Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Val
165 170 175
Tyr Met Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ala Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Arg Tyr Val Tyr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln
260 265 270
Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser
275 280 285
Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val
290 295 300
Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro
305 310 315 320
Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr
325 330 335
Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser
340 345 350
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp
355 360 365
Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
370 375 380
Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
385 390 395 400
Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser
405 410 415
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser
420 425 430
Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys
435 440 445
Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg
450 455 460
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser
465 470 475 480
Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser
485 490 495
Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His
500 505 510
His His His His
515
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 35
Gly Phe Asn Ile Ser Val Tyr
1 5
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 36
Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr
1 5
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 37
Tyr Val Tyr His Ala Leu Asp Tyr
1 5
<210> 38
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 38
Arg Ala Ser Gln Arg Gly Leu Arg Asn Val Ala Val Ala
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 39
Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser
1 5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 40
Gln Gln Trp Ala Val His Ser Leu Ile Thr
1 5 10
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 41
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
1 5
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 42
Asn Pro Ser Arg Gly Tyr
1 5
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 43
Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 44
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 46
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 47
Gly Phe Asn Ile Ser Val Tyr
1 5
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 48
Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr
1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 49
Tyr Val Tyr His Ala Leu Asp Tyr
1 5
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 50
Arg Ala Ser Gln Arg Gly Leu Arg Asn Val Ala Val Ala
1 5 10
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 51
Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser
1 5
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 52
Gln Gln Trp Ala Val His Ser Leu Ile Thr
1 5 10
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 53
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
1 5
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 54
Asn Pro Ser Arg Gly Tyr
1 5
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 55
Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 56
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 57
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 58
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 59
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Gly Leu Arg Asn
20 25 30
Val Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Val His
85 90 95
Ser Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Val Tyr Met Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser
165 170 175
Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Tyr Val Tyr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly
245 250 255
Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr
260 265 270
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg
275 280 285
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly
290 295 300
Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr
305 310 315 320
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
325 330 335
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr
340 345 350
Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val
355 360 365
Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val
370 375 380
Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro
385 390 395 400
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr
405 410 415
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile
420 425 430
Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala
450 455 460
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu
465 470 475 480
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His
485 490 495
His
<210> 60
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Gly Leu Arg Asn
20 25 30
Val Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Val His
85 90 95
Ser Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Val Tyr Met Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser
165 170 175
Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Tyr Val Tyr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly
245 250 255
Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala
260 265 270
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg
275 280 285
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly
290 295 300
Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr
305 310 315 320
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
325 330 335
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr
340 345 350
Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val
355 360 365
Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val
370 375 380
Asp Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro
385 390 395 400
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr
405 410 415
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile
420 425 430
Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala
450 455 460
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe
465 470 475 480
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg His His His His
485 490 495
His His
<210> 61
<211> 730
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 61
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Val
20 25 30
Tyr Met Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Tyr Val Tyr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ser Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr
115 120 125
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
130 135 140
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Gly Leu Arg Asn Val Ala Val Ala Trp
145 150 155 160
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala
165 170 175
Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser
180 185 190
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
195 200 205
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Val His Ser Leu Ile Thr Phe
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
260 265 270
Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Val Tyr Met Met His Trp Val Arg Gln
275 280 285
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser
290 295 300
Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
305 310 315 320
Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
325 330 335
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Val Tyr His Ala
340 345 350
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
355 360 365
Ser Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
370 375 380
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Gly
385 390 395 400
Leu Arg Asn Val Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
405 410 415
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro
420 425 430
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
435 440 445
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
450 455 460
Ala Val His Ser Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
465 470 475 480
Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala
485 490 495
Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser
500 505 510
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro
515 520 525
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr
530 535 540
Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp
545 550 555 560
Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
565 570 575
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys
580 585 590
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu
595 600 605
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp
610 615 620
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
625 630 635 640
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
645 650 655
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
660 665 670
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
675 680 685
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
690 695 700
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
705 710 715 720
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
725 730
<210> 62
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 62
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser
100 105 110
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
115 120 125
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Val
130 135 140
Tyr Met Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
145 150 155 160
Val Ala Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
165 170 175
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
180 185 190
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
195 200 205
Cys Ala Arg Tyr Val Tyr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
210 215 220
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
225 230 235 240
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
245 250 255
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Gly Leu Arg Asn Val Ala Val Ala
260 265 270
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser
275 280 285
Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg
290 295 300
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
305 310 315 320
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Val His Ser Leu Ile Thr
325 330 335
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly
355 360 365
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg
370 375 380
Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
385 390 395 400
Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys
405 410 415
Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
420 425 430
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
435 440 445
Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
450 455 460
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
465 470
<210> 63
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 63
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser
100 105 110
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
115 120 125
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Val
130 135 140
Tyr Met Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
145 150 155 160
Val Ala Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
165 170 175
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
180 185 190
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
195 200 205
Cys Ala Arg Tyr Val Tyr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
210 215 220
Leu Val Thr Val Ser Ser Cys
225 230
<210> 64
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体或接头序列
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Gly Leu Arg Asn
20 25 30
Val Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Val His
85 90 95
Ser Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
115 120 125
Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr
130 135 140
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
145 150 155 160
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
165 170 175
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser
180 185 190
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
210 215 220
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Cys
225 230 235

Claims (23)

1.一种双特异性结合剂，所述结合剂至少包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域结合CD117/c-KIT，且其中所述第二结合结构域结合CD3。
2.根据权利要求1的双特异性结合剂，其中所述第一结合结构域结合CD117/c-KIT的细胞外结构域和/或所述第二结合结构域结合CD3的ε链和/或CD3的γ链。
3.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其为全长抗体或抗体片段的形式。
4.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其为至少一种选自以下的形式：
·DVD-Ig
·Knobs in Holes
·Crossmab
·BiTETM
·Nanobody
·Diabody
·DARTTM
·TandAbTM，和/或
·scDb-scFv。
5.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其中结合CD117/c-KIT的第一结合结构域
a)包含一组重链/轻链互补决定区(CDR)，该组重链/轻链互补决定区(CDR)包含在抗CD117抗体79D的如SEQ ID NO 19和20所示的重链/轻链可变区序列对中，
b)包含一组包含以下序列的重链/轻链互补决定区(CDR)
HC CDR1(SEQ ID NO 1或35)
HC CDR2(SEQ ID NO 2或36)
HC CDR3(SEQ ID NO 3或37)
LC CDR1(SEQ ID NO 4或38)
LC CDR2(SEQ ID NO 5或39)，和
LC CDR3(SEQ ID NO 6或40)
c)包含b)的重链/轻链互补决定区(CDR)，条件是至少一个CDR相对于对应的SEQ ID NO1-6或SEQ ID NO 35-40具有至多3个氨基酸取代，和/或
d)包含b)的重链/轻链互补决定区(CDR)，条件是至少一个CDR与对应的SEQ ID NO 1-6或SEQ ID NO 35-40具有≥66％的序列同一性，
其中所述CDR嵌入合适的蛋白质框架中，以便能够结合CD117/c-KIT。
6.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其中所述结合CD3的第二结合结构域
a)包含一组重链/轻链互补决定区(CDR)，其包含以下序列OKT3，BlinCD3，
b)包含一组重链/轻链互补决定区(CDR)，其包含在抗CD3抗体BlinCD3，OKT3和[…]之一的如SEQ ID NO 21和22，或SEQ ID NO 23和24所示的重链/轻链可变区序列对中，
c)包含一组含有以下序列的重链/轻链互补决定区(CDR)
HC CDR1(SEQ ID NO 7或41)
HC CDR2(SEQ ID NO 8或42)
HC CDR3(SEQ ID NO 9或43)
LC CDR1(SEQ ID NO 10或44)
LC CDR2(SEQ ID NO 11或45)，和
LC CDR3(SEQ ID NO 12或46)
d)包含一组含有以下序列的重链/轻链互补决定区(CDR)
HC CDR1(SEQ ID NO 13)
HC CDR2(SEQ ID NO 14)
HC CDR3(SEQ ID NO 15)
LC CDR1(SEQ ID NO 16)
LC CDR2(SEQ ID NO 17),和
LC CDR3(SEQ ID NO 18)
e)包含b)或c)的重链/轻链互补决定区(CDR)，条件是至少一个CDR相对于对应的SEQID NO 7-12或SEQ ID NO 41或SEQ ID NO 13-18具有至多3个氨基酸取代，和/或
f)包含b)的重链/轻链互补决定区(CDR)，条件是至少一个CDR与对应的SEQ ID NO 7-12或SEQ ID NO 41或SEQ ID NO 13-18具有≥66％的序列同一性，
其中所述CDR嵌入合适的蛋白质框架中，以便能够结合CD3。
7.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其中所述框架是人VH/VL框架。
8.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其中结合CD117/c-KIT的第一结合结构域包含：
a)抗体79D的可变结构域
b)重链/轻链可变结构域(VD)
·HC VD(SEQ ID NO 19)，和
·LC VD(SEQ ID NO 20)
c)b)的重链/轻链可变结构域(VD)，其前提是
所述HCVD与相应的SEQ ID NO 19具有≥80％的序列同一性，和/或
所述LCDVD与相应的SEQ ID NO 20具有≥80％的序列同一性，
d)b)的重链/轻链可变结构域(VD)，条件是HCVD或LCVD中的至少一个相对于相应的SEQID NO 19和/或20具有至多10个氨基酸取代，
所述双特异性结合剂仍然能够结合CD117/c-KIT。
9.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其中结合CD3的第二结合结构域包含：
a)选自OKT3和BlinCD3的一种抗体的可变结构域，
b)重链/轻链可变结构域(VD)
·HC VD(SEQ ID NO 21或23)，和
·LC VD(SEQ ID NO 22或24)
c)b)的重链/轻链可变结构域(VD)，其前提是
·所述HCVD与相应的SEQ ID NO 21或23具有≥80％的序列同一性，和/或
·所述LCDVD与相应的SEQ ID NO 22或24具有≥80％的序列同一性
d)b)的重链/轻链可变结构域(VD)，条件是HCVD或LCVD中的至少一个相对于相应编号的序列具有至多10个氨基酸取代，
所述双特异性结合剂仍然能够结合CD3。
10.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性结合剂，其中至少一个氨基酸取代是保守氨基酸取代。
11.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性结合剂，其中相应的重链可变区(VH)和相应的轻链可变区(VL)从N端到C端按以下顺序排列，
VL(CD117)-接头-VH(CD117)-接头-VH(CD3)-接头-VL(CD3),
VL(CD117)-接头-VH(CD117)-接头-VL(CD3)-接头-VH(CD3),
VH(CD117)-接头-VL(CD117)-接头-VH(CD3)-接头-VL(CD3),
VH(CD117)-接头-VL(CD117)-接头-VL(CD3)-接头-VH(CD3),
VL(CD3)-接头-VH(CD3)-接头-VH(CD117)-接头-VL(CD117),
VL(CD3)-接头-VH(CD3)-接头-VL(CD117)-接头-VH(CD117),
VH(CD3)-接头-VL(CD3)-接头-VH(CD117)-接头-VL(CD117),
VH(CD3)-接头-VL(CD3)-接头-VL(CD117)-接头-VH(CD117),
其中术语“接头”定义任选的多肽接头。
12.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其中所述结合CD3的第二结合结构域
a)包含如SEQ ID NOs 28或29中任一个所示的scFv样序列，或
b)包含与SEQ ID NOs 28或29中任一个具有≥80％序列同一性的氨基酸序列。
13.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其中所述结合CD117/cKIT的第一结合结构域
a)包含如SEQ ID NO 27所示的scFv样序列，或
b)包含与SEQ ID NO 27具有≥80％的序列同一性的氨基酸序列。
14.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其
a)包含选自SEQ ID NO 25、26、34、59或60的至少一种序列，或
b)包含与SEQ ID NO 25、26、34、59或60具有≥80％序列同一性的氨基酸序列。
15.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性结合剂，与权利要求14的双特异性结合剂相比，所述双特异性结合剂具有以下中的至少一种：
≥50％对CD3的靶结合亲和力，通过SPR测量，和/或
≥50％对CD117/c-KIT的靶结合亲和力，通过SPR测量。
16.一种双特异性结合剂，所述结合剂与权利要求14的双特异性结合剂竞争结合CD117/c-KIT和CD3。
17.一种双特异性结合剂，所述结合剂结合与根据权利要求14的双特异性结合剂基本相同或相同的CD3和CD117/c-KIT上的表位。
18.一种编码前述权利要求中任一项的结合剂的核酸。
19.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的双特异性结合剂或核酸，以及任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。
20.一种组合，所述组合包含(i)根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂或药物组合物和(ii)一种或多种治疗活性化合物。
21.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂、药物组合物或组合，其用于(在制备药物中)治疗人或动物受试者，所述受试者
·被诊断为发展肿瘤性疾病，
·患有发展肿瘤性疾病，或
·处于发展肿瘤性疾病风险，
或用于预防这种病症。
22.一种治疗或预防肿瘤性疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据前述权利要求中任一项所述的双特异性结合剂、药物组合物或组合。
23.一种治疗性药盒，其包括：
a)根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂、药物组合物或组合
b)用于施用所述组合物、组合物或组合的装置，和
c)使用说明书。
CN202080076507.9A 2019-09-04 2020-09-04 与CD117/c-KIT和CD3结合的双特异性结合剂 Pending CN114651012A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1912681.2 2019-09-04
GBGB1912681.2A GB201912681D0 (en) 2019-09-04 2019-09-04 Bispecific binding agent that binds to cd117/c-kit and cd3
PCT/EP2020/074807 WO2021044008A1 (en) 2019-09-04 2020-09-04 Bispecific binding agent that binds to CD117/c-KIT and CD3

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114651012A true CN114651012A (zh) 2022-06-21

Family

ID=68207073

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080076507.9A Pending CN114651012A (zh) 2019-09-04 2020-09-04 与CD117/c-KIT和CD3结合的双特异性结合剂

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220315653A1 (zh)
EP (1) EP4025607A1 (zh)
JP (1) JP2022547491A (zh)
CN (1) CN114651012A (zh)
GB (1) GB201912681D0 (zh)
WO (1) WO2021044008A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102503349B1 (ko) 2019-05-14 2023-02-23 프로벤션 바이오, 인코포레이티드 제1형 당뇨병을 예방하기 위한 방법 및 조성물
US20230183344A1 (en) * 2020-03-16 2023-06-15 Magenta Therapeutics, Inc. T-cell bispecific binding proteins
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015050959A1 (en) * 2013-10-01 2015-04-09 Yale University Anti-kit antibodies and methods of use thereof
US20170298148A1 (en) * 2014-02-12 2017-10-19 Michael Uhlin Bispecific antibodies for use in stem cell transplantation
WO2019126576A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-27 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Release segments and binding compositions comprising same

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100508289B1 (ko) 1998-04-21 2005-08-17 마이크로메트 에이지 Ｃｄ１９×ｃｄ３ 특이 폴리펩티드 및 그의 용도
US8802091B2 (en) 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
BR112014001573B8 (pt) 2011-07-22 2022-11-08 Affimed Therapeutics Ag Molécula fv ao antígeno multivalente
CA2959171C (en) 2014-09-05 2023-11-14 Janssen Pharmaceutica Nv Cd123 binding agents and uses thereof
EP3464365A1 (en) 2016-06-01 2019-04-10 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind cd123 and cd3
TWI687227B (zh) * 2017-10-03 2020-03-11 生倍科技股份有限公司 用於t細胞免疫療法之組合及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015050959A1 (en) * 2013-10-01 2015-04-09 Yale University Anti-kit antibodies and methods of use thereof
US20170298148A1 (en) * 2014-02-12 2017-10-19 Michael Uhlin Bispecific antibodies for use in stem cell transplantation
WO2019126576A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-27 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Release segments and binding compositions comprising same

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022547491A (ja) 2022-11-14
WO2021044008A1 (en) 2021-03-11
GB201912681D0 (en) 2019-10-16
EP4025607A1 (en) 2022-07-13
US20220315653A1 (en) 2022-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240166755A1 (en) Chimeric antigen receptors targeting cancer
US10927184B2 (en) Treatment of cancer using humanized anti-CD19 chimeric antigen receptor
JP7011574B2 (ja) Ｆｌｔ３及びｃｄ３に対する抗体構築物
US20230212319A1 (en) Novel antigen binding domains and synthetic antigen receptors incorporating the same
CN109096396B (zh) 一种抗pd-l1人源化纳米抗体及其应用
US11028177B2 (en) Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
CN107406517B (zh) 包含cd19结合域的嵌合抗原受体(car)
US20180222996A1 (en) Bispecific scfv immunofusion (bif)
KR102366470B1 (ko) 골수성 백혈병의 치료에서 후성적 인자와 cd33 및 cd3을 표적화하는 이중특이적 화합물의 배합물
CN110066338B (zh) 作为T细胞衔接器的双特异性IgG抗体
JP6907124B2 (ja) Ｃｄｈ３及びｃｄ３に対する二重特異性抗体構築物
TW202018083A (zh) 用於細胞療法之多樣化抗原結合域、新穎平台及其他增強子
EP3875484A1 (en) Cll1-targeting antibody and application thereof
CN114651012A (zh) 与CD117/c-KIT和CD3结合的双特异性结合剂
CN115397515A (zh) 人抗cd33抗体和其用途
Nasiri et al. T-cells engineered with a novel VHH-based chimeric antigen receptor against CD19 exhibit comparable tumoricidal efficacy to their FMC63-based counterparts
JP2024514246A (ja) Ｃｌｄｎ１８．２抗原結合タンパク質およびその使用
JP2022538092A (ja) 抗－ｃｄ１２３抗体、抗－ｃｄ１２３キメラ抗原受容体および抗－ｃｄ１２３キメラ抗原受容体ｔ細胞
CN113368232B (zh) 多特异性抗原结合蛋白及其应用
EP4039703A1 (en) Chimeric antigen receptor comprising anti c-met antibody or antigen binding fragment thereof, and use thereof
Garcia-Sanz et al. OPEN ACCESS EDITED BY
WO2023114176A2 (en) Molecules that bind to cd94/nkg2a heterodimer polypeptides
WO2023200873A2 (en) Chimeric antigen receptor compositions and methods of using the same
TW202204419A (zh) 嵌合抗原受體
KR20220155588A (ko) Gpc3 car-t 세포 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination