CN115397515A

CN115397515A - 人抗cd33抗体和其用途

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Publication number: CN115397515A
Application number: CN202180025735.8A
Authority: CN
Inventors: R·B·沃尔特; G·S·拉斯洛
Original assignee: Fred Hutchinson Cancer Research Center
Current assignee: Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2022-11-25
Also published as: WO2021202770A2; CA3173205A1; US20230144405A1; WO2021202770A3; JP2023520399A; EP4126248A2

Abstract

描述了一套新颖的人抗CD33抗体。提供的抗体是在CD33的V型Ig样结构域存在或不存在下均结合C2型Ig样结构域的泛结合剂；或是结合CD33的V型Ig样结构域的V型结合剂。这些抗体提供了针对如急性骨髓性白血病(AML)之类CD33相关病症的新颖治疗和诊断工具。

Description

人抗CD33抗体和其用途

相关申请的交叉参考

本申请要求2020年3月31日提交的美国临时专利申请号63/003,203的优先权，该案以引用的方式整体并入本文，就如同在本文中完整阐述一般。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明是根据美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的CA234203和CA223409在政府资助下作出。政府拥有本发明的某些权利。

关于序列表的引用

与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且特此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是2GU2844_ST25.txt。该文本文件是196KB，于2021年3月31日创建，并且通过EFS-Web以电子方式提交。

技术领域

描述了一套新颖的抗CD33抗体。提供的抗体是在CD33的V型Ig样结构域存在或不存在下结合C2型Ig样结构域的泛结合剂；或是结合CD33的V型Ig样结构域的V型结合剂。这些抗体提供了针对如急性骨髓性白血病(AML)之类CD33相关病症的新颖治疗和诊断工具。

背景技术

根据世界卫生组织的数据，癌症是全球第二大死亡原因，并且在2018年估计有960万人因此而死亡。急性骨髓性白血病(AML)是由克隆性增殖性成髓细胞的恶变引起的一类癌症。美国每年有20,000例新增AML病例，并且每年有11,000例AML死亡病例(Siegel等人,2021,CA Cancer J Clin.71(1):7-33)。尽管在年轻AML患者中利用常规化学疗法可以达到60％至80％的较高完全缓解率(

等人,2017.Blood.129(4):424-447)，但对于65岁或以上的老年患者的治疗结果仍然不令人满意，多达70％的患者在诊断后一年内死于其疾病(Meyers等人,Appl Health Econ Health Policy,11:275-286,2013)。不幸的是，由于白血病干细胞的化疗难治性，常规疗法后复发很常见(Eppert等人,2011.Nat.Med.17(9):1086-1093)，而且当前的复发/难治性(R/R)AML的治疗选择并不乐观，导致12个月的总生存率低于30％。

CD33是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(sialic acid binding,immunoglobulin-like lectin，SIGLEC)蛋白质家族的成员。它是一种67-kDa的糖基化跨膜蛋白。CD33(又称为SIGLEC-3)是一种髓系分化抗原，至少见于几乎所有AML患者的某些白血病细胞，而且在一些情况下，也可能见于AML干细胞。基于这种广泛的表达模式，CD33已被广泛用作AML的治疗靶标。近期由若干随机化研究得到的数据表明，CD33抗体-药物缀合物吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin，GO)当添加至确定的患有新诊断的AML患者的亚群的化学疗法中时可提高生存率。这一数据证实CD33是AML免疫疗法的首个(也是迄今为止唯一的)靶标。在开发新的、更有效的CD33定向治疗剂(例如抗体-药物缀合物、放射免疫缀合物、双特异性抗体、嵌合抗原受体[CAR]修饰的细胞)以克服所观察到的GO的缺点的同时，人们对于CD33作为其他恶性和非恶性病症的药物靶标的兴趣日益浓厚。这些努力包括靶向GO不识别的CD33剪接变体以及靶向其他血液系统恶性病中的CD33+肿瘤细胞、多种疾病中的CD33+骨髓源性抑制细胞(MDSC)以及阿尔茨海默氏病中的正常CD33+小胶质细胞(Walter,Expert Opin Biol Ther.2020,20(9):955-958)。

全长CD33蛋白质(CD33^FL)的特征在于在其细胞外部分中具有氨基末端、膜远端V型免疫球蛋白(Ig)样结构域和膜近端C2型Ig样结构域(图1)。存在CD33的较短同种型。CD33的较短同种型包括一个缺少外显子2的变体，该变体编码V型结构域(CD33^ΔE2)。至少在mRNA水平上，CD33^ΔE2在AML患者骨髓和外周血中的骨髓细胞中广泛表达。然而，目前几乎所有商业和临床上可用的CD33抗体都识别免疫显性V型Ig样结构域。这意味着这些抗体将不识别缺少V型结构域的较短形式的CD33，例如CD33^ΔE2。这可以解释在一项儿科AML临床试验中得到的观察结果，即，在CD33基因中具有单核苷酸多态性导致CD33^ΔE2优先转录和CD33^FL翻译减少的患者不会受益于强化化学疗法中GO(该药剂也结合至CD33的V型结构域)的添加。

发明内容

本公开提供了抗体，该抗体无论是否存在V型Ig样结构域均结合/识别CD33蛋白质中的C2型Ig样结构域(图1)。这些抗体被称为泛结合剂(CD33^PAN抗体)。泛结合剂可以靶向大量的CD33表达细胞，因为它们可以结合表达CD33^FL以及较短同种型如CD33^ΔE2变体的靶标细胞。本文所公开的CD33^PAN抗体包括：1H10、1A9、1E6、1D2和1B9。

本公开还提供了新开发的结合CD33的V型Ig样结构域的抗CD33抗体。这些V型结合剂包括1H8、2D3和2E3，并且为表达CD33^FL的患者提供额外的诊断和治疗选择。

本文所公开的抗体可以工程改造为多种形式，例如抗CD33抗体缀合物。抗CD33抗体缀合物是包括与基于CD33抗体的结合结构域缀合的分子的人工分子。抗CD33抗体缀合物包括抗CD33免疫毒素、抗体-药物缀合物(ADC)和放射性同位素缀合物。本文所公开的抗体还可以工程改造为抗CD33多特异性抗体(例如抗CD33双特异性抗体、抗CD33三特异性抗体、抗CD33四特异性抗体等)。当呈多特异性形式时，经过工程改造的分子可以结合CD33，以及例如免疫细胞上的免疫活化表位，如CD3、CD16、CD28、CD64和/或4-1BB。这些实施方案用于将活化的免疫细胞带到CD33表达细胞以破坏CD33表达细胞。

附图说明

本文提交的一些附图在彩色情况下更好理解。申请人将附图的彩色版本视为原始提交文件的一部分，并且保留在以后的诉讼中呈递附图的彩色图像的权利。

图1.全长CD33(CD33^FL)和缺失外显子2使得V型结构域缺失的CD33(CD33^ΔE2)的图解。描绘了仅结合CD33^FL(抗CD33^FL)、仅结合CD33^ΔE2(抗CD33^ΔE2)或结合CD33^FL和CD33^ΔE2(抗CD33^FL+ΔE2或抗CD33^PAN)的抗体。

图2.CD33^FL以及人工CD33分子的示意图，所述人工分子缺失外显子3和4使得V型结构域在膜近端重定位(CD33^ΔE3-4)或者插入CD22的2个C2型结构域(“CD33^FL+CD22 2D”)或CD22的4个C2型结构域(“CD33^FL+CD22 4D”)。CD33^ΔE3-4使用定点诱变进行工程改造以剪接掉人CD33^FL细胞外结构域(ECD)的CD33氨基酸(aa)140-232。CD33^FL+CD22 4D是使用内源性CD33信号肽(aa 1-17)、6-组氨酸标签、3x甘氨酸连接子、人CD33 ECD(aa 18-259)、包括C2型结构域3-6在内的人CD22 ECD的一部分(aa 331-683)、CD33跨膜结构域和CD33细胞内结构域(aa 260-364)产生的。从CD33^FL+CD22 24中去除CD22 aa 331-504(C2型结构域3和4)以产生CD33^FL+CD22 2D。

图3A-3C.减小与细胞膜的结合距离将增强CD33/CD3 BsAb针对人骨髓性白血病细胞的抗肿瘤功效。通过慢病毒基因转移将经历CRISPR/Cas9介导的内源性CD33基因座缺失的人CD33+骨髓性白血病细胞系((3A)ML-1、(3B)HL-60、(3C)K562)工程改造成过表达CD33^FL或CD33^ΔE3-4。通过流式细胞术，利用V型结构域CD33抗体P67.6对靶标蛋白的相对表达量进行评估，并且代表性直方图示于右下图中。然后，将细胞用浓度为1000pg/mL的靶向V型结构域的CD33/CD3 BsAb和所示效应:靶标(E:T)细胞比率的健康供体T细胞处理(顶图)，所述供体T细胞是从健康成年志愿者收集的未刺激的外周血单核细胞富集。骨髓细胞也用所示浓度的吉妥珠单抗奥唑米星(GO)处理(左下图)。2天(对于BsAb)或3天(对于GO)后，通过流式细胞术，以利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色所测量的死亡细胞百分比的变化对细胞毒性进行定量。抗V型结构域定向的CD33/CD3 BsAb是使用在本文中称为RC1或A3的构建体以scFv-scFv形式构建，该构建体利用如SEQ ID NO:259中所示并且描述于美国专利申请公布US 2016/0317657 A1中的序列。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图4.减小与细胞膜的结合距离将增强CD33/CD3 BsAb针对工程改造成表达CD33蛋白质的人急性淋巴母细胞性白血病细胞的抗肿瘤功效。通过慢病毒基因转移将人CD33^neg急性淋巴母细胞性白血病(ALL)细胞系RS4；11工程改造成过表达CD33^FL或CD33^ΔE3-4。通过流式细胞术，利用V型结构域CD33抗体P67.6对靶标蛋白的相对表达量进行评估，并且代表性直方图示于下图中。然后，将细胞用浓度为1000pg/mL的靶向V型结构域的CD33/CD3 BsAb和所示效应:靶标(E:T)细胞比率的健康供体T细胞处理(顶图)，所述供体T细胞是从健康成年志愿者收集的未刺激的外周血单核细胞富集。2天后，通过流式细胞术，以利用DAPI染色所测量的死亡细胞百分比的变化对细胞毒性进行定量。抗V型结构域定向的CD33/CD3 BsAb是使用在本文中称为RC1或A3的构建体以scFv-scFv形式构建，该构建体利用如SEQ ID NO:259中所示并且描述于美国专利申请公布US 2016/0317657 A1中的序列。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图5.增加与细胞膜的结合距离会降低CD33/CD3 BsAb的抗肿瘤功效。通过慢病毒基因转移将经历CRISPR/Cas9介导的内源性CD33基因座缺失的人骨髓性白血病细胞系(ML-1[上图]、K562[下图])工程改造成过表达CD33FL、CD33FL+CD22 2D或CD33FL+CD22 4D。通过流式细胞术，使用V型结构域CD33抗体P67.6对CD33构建体的相对表达量进行评估(右图)。然后，将细胞用所示浓度(以pg/mL表示)的靶向V型结构域的CD33/CD3 BsAb和1:1的E:T细胞比率的健康供体T细胞处理，所述供体T细胞是从未刺激的外周健康供体血液单核细胞中富集。2天后，通过流式细胞术，以利用DAPI染色所测量的死细胞百分比的变化对细胞毒性进行定量。抗V型结构域定向的CD33/CD3 BsAb是使用在本文中称为RC1或A3的构建体以scFv-scFv形式构建，该构建体利用如SEQ ID NO:259中所示并且描述于美国专利申请公布US 2016/0317657 A1中的序列。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图6A、6B.如所示，通过流式细胞术，针对CD33+亲本ML-1细胞和经历CRISPR/Cas9介导的CD33缺失的ML-1细胞(“CD33 KO”)以及针对被工程改造成表达CD33^FL或CD33^ΔE2的REH亚系测试(6A)人CD33^PAN抗体克隆(克隆1A9、1H10、1B9、1E6和1D2)和(6B)人CD33^V型抗体克隆(克隆2E3、2D3和1H8)。包括没有一次抗体的对照。

图7A、7B.(7A)由使用来自Carterra instrument的表面等离子共振技术(SPR)纯化的抗CD33抗体产生动力学曲线。SPR是估计结合相互作用的动力学速率常数的一种好方法，它可以拟合至1:1朗缪尔结合模型(Langmuir binding model)以确定缔合速率(ka)和解离速率(kd)。这两个速率参数允许计算解离速率常数(kD)，称为结合亲和力。将抗体克隆以阵列形式捕获于固定在HC30M芯片上的蛋白质A/G条上。第一项动力学实验使用全长CD33(CD33^FL)抗原，该抗原以2μM浓度开始，经4倍调定达到2nM。在10个HBSTE缓冲液空白之后，随后使从低浓度到高浓度的6种注射液流过阵列，以评估印到该阵列上的每个克隆的动力学：1分钟基线、5分钟缔合、10分钟解离。然后，用pH 1.7的0.85％磷酸使芯片再生，以将相同克隆阵列新鲜再印至蛋白质A/G条上，以防任何残留的抗原与阵列保持结合，由此防止与第二个感兴趣抗原相互作用，其中CD33^ΔE2流过抗体阵列。对于注射至阵列上的每种浓度的抗原，使用Carterra动力学软件处理数据以将原始数据拟合到动力学曲线上。(7B)有关从与捕获的1H10和2D3结合的CD33^FL或CD33^ΔE2纯化的ECD的SPR评估。实验在25℃下在带有S系列CM4芯片的Biacore T100仪器上执行。使用标准胺偶合化学将在10mM乙酸钠pH 4.0中60μg/mL的蛋白质A/G固定于2个流槽(1000RU)上。捕获动力学实验在10mM HEPES pH 7.4、150mMNaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20和0.1mg/mL不含IgG的牛血清白蛋白缓冲液。将0.5μg/mL抗人CD33抗体以10μL/min注射于固定的蛋白质A/G的第二个流槽上，在CD33^FL结合实验中保持30-40秒以捕获40至58RU的抗体，或在CD33^ΔE2结合实验中保持45-80秒以捕获75至95RU的抗体。使系列浓度的CD33^FL和CD33^ΔE2的纯化的胞外结构域以50μL/min流过捕获抗体的表面和单独蛋白质A/G(参考)表面。对于2D3和1H10，CD33^FL系列以160nM的高浓度开始；CD33^ΔE2系列对于1H10是以40nM开始并且对于2D3是一300nM开始。对于大多数对，注射CD33，保持7分钟并使其解离20或30分钟。一式两份，操作胞外结构域浓度的连续2倍稀释，随机化并且每到第4次注射包括一个缓冲液空白。通过2次以50μL/min经30秒注射0.85％H₃PO₄使CM4芯片再生，并在每次CD33注射之前，重新捕获抗体。数据在BiaEval 2.0.4软件中，利用1:1结合模型，使用局部Rmax进行双参考和分析。

图8.1E6和P67.6的内化。将AML细胞系与CD33抗体一起在37℃°培育指定时间。然后，添加荧光标记的二次抗体以对细胞表面上残留的CD33抗体定量。结果以在时间0时存在的荧光信号的百分比表示。

图9.具有人IgG1框架的重组完全人CD33^V型抗体1H8与被工程改造成表达人CD33^FL的REH细胞(人急性淋巴母细胞性白血病细胞系，内源性CD33^neg)的结合。

图10.人CD33^PAN/CD3 BsAb重定向T细胞介导的针对人CD33+AML细胞的细胞毒性。将亲本AML细胞系用所示效应物:靶标(E:T)细胞比率的健康供体T细胞和各种剂量的1E6/CD3 BsAb处理。2天后，通过流式细胞术，以利用DAPI染色所测量的死亡细胞百分比的变化对细胞毒性进行定量。CD33 rs12459419基因型在括号中指示。

图11.人CD33^PAN/CD3 BsAb以CD33特异性方式重定向T细胞介导的针对AML细胞的细胞毒性。将亲本ML-1细胞和经历CRISPR/Cas9介导的CD33敲除(KO)的亚系用指定浓度的1E6 BsAb和E:T为1:1的健康供体T细胞处理。48小时后，通过流式细胞术对死亡的白血病细胞计数，并显示出相较于无BsAb处理的死亡细胞变化。示出了3次独立实验的平均值±SEM。***p<0.001；****p<0.0001。

图12.人CD33^PAN/CD3 BsAb以CD33特异性和表位特异性方式重定向T细胞介导的针对人急性白血病细胞的细胞毒性。将亲本CD33^negREH细胞和工程改造成过表达CD33^FL或CD33^ΔE2的亚系用1000pg/mL剂量和E:T为3:1的抗V型CD33/CD3 BsAb或1E6 BsAb处理。48小时后，通过流式细胞术对死亡的白血病细胞计数，并显示出相较于无BsAb处理的死亡细胞变化。示出了三次独立实验的平均值±SEM。

图13.人CD33^PAN/CD3 BsAb重定向T细胞介导的针对原发性人AML细胞的细胞毒性。将一组11份原发性AML患者样本用1E6/CD3BsAb和所示E:T比率的健康供体T细胞处理。2天后，通过流式细胞术对死亡细胞(使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚[DAPI]染色)和总细胞数目计数来确定细胞毒性。示出了全部11份患者样本的平均细胞毒性±SEM。

图14.证实本公开的序列：具有小鼠Fc结构域的人全长(FL)CD33，用作人FL CD33的免疫原(hsCD33-mmFc；SEQ ID NO:2)；具有小鼠Fc结构域的人CD33的ΔΕ2型式(CD33^ΔE2)，用作人CD33^ΔE2的免疫原(hsCD33_ΔE2-mmFc，SEQ ID NO:3)；小鼠CD33的ECD蛋白质(SEQ ID NO:4)和编码序列(SEQ ID NO:5)，其中来自小鼠的C2型Ig样结构域被来自人CD33的C2型Ig样结构域置换，并与来自人lgG1的Fc区组合，用作免疫原以产生针对人CD33的C2型结构域的抗体(mmCD33_Vset-mmCD33_C2set-hsCD33_Fc_hslgG1)；小鼠CD33的ECD蛋白质(SEQ ID NO:6)和编码序列(SEQ ID NO:7)，其中来自小鼠的C2型Ig样结构域被来自人CD33的C2型Ig样结构域置换，并与来源于人CD33的跨膜结构域和截短的细胞内结构域组合，用作免疫原以产生针对人CD33的C2型结构域的抗体；以及全长人CD33蛋白质(SEQ ID NO:8)和编码序列(SEQ ID NO:9，人CD33的免疫原；人CD33ΔΕ2蛋白质(SEQ ID NO:10)和编码序列(SEQ ID NO:11)(CD33^ΔE2)，人CD33^ΔΕ2的免疫原)；CD33:CD22 4D蛋白质(SEQ ID NO:1)和编码序列(SEQ ID NO:135)；CD33:CD22 2D蛋白质(SEQ ID NO:136)和编码序列(SEQ IDNO:137)；CD33 V型构建体(缺失外显子3和4)蛋白质(SEQ ID NO:138)和编码序列(SEQ IDNO:139)；CD33信号肽(SEQ ID NO:140)和编码序列(SEQ ID NO:141)；6-组氨酸标签(SEQID NO:142)和编码序列(SEQ ID NO:143)；3x甘氨酸连接子和编码序列；CD33 ECD(SEQ IDNO:145)和编码序列(SEQ ID NO:146)；缺少CD33氨基酸140-232的CD33 ECD(SEQ ID NO:147)和编码序列(SEQ ID NO:148)；CD33跨膜结构域(SEQ ID NO:149)和编码序列(SEQ IDNO:150)；CD33细胞内结构域(SEQ ID NO:151)和编码序列(SEQ ID NO:152)；CD22 ECD中含有定义为Ig样C2型3、Ig样C2型4、Ig样C2型5、Ig样C2型6的CD22结构域的部分(SEQ ID NO:153)和编码序列(SEQ ID NO:154)；CD22 ECD中含有定义为Ig样C2型5、Ig样C2型6的CD22结构域的部分(SEQ ID NO:155)和编码序列(SEQ ID NO:156)；1E6/CD3双特异性分子(SEQ IDNO:157)；IgK信号肽(SEQ ID NO:158)；1H10 scFv VH-VL取向(SEQ ID NO:230)；1H10 scFvVL-VH取向(SEQ ID NO:231)；1A9 scFv VH-VL取向(SEQ ID NO:232)；1A9 scFv VL-VH取向(SEQ ID NO:233)；1E6scFv VH-VL取向(SEQ ID NO:234)；1E6 scFv VL-VH取向(SEQ IDNO:235)；2D3 scFv VH-VL取向(SEQ ID NO:236)；2D3 scFv VL-VH取向(SEQ ID NO:237)；1H10 scFv VH-VL取向，双特异性抗体CD33/CD3接合物(SEQ ID NO:238)；1H10 scFv VL-VH取向，双特异性抗体CD33/CD3(SEQ ID NO:239)；1A9 scFv VH-VL取向，双特异性抗体CD33/CD3接合物(SEQ ID NO:240)；1A9 scFv VL-VH取向，双特异性抗体CD33/CD3接合物(SEQ IDNO:241)；1E6 scFv VH-VL取向，双特异性抗体CD33/CD3接合物(SEQ ID NO:242)；1E6 scFvVL-VH取向，双特异性抗体CD33/CD3接合物(SEQ ID NO:243)；2D3 scFv VH-VL取向，双特异性抗体CD33/CD3接合物(SEQ ID NO:244)；2D3 scFv VL-VH取向，双特异性抗体CD33/CD3接合物(SEQ ID NO:245)；人CD33全长DNA编码序列(用于基于细胞的免疫原；CD33信号肽编码序列呈粗体)(SEQ ID NO:246)；人CD33全长蛋白质(SEQ ID NO:247)；以及1H10、1A9、1E6和/或1B9轻链信号肽(SEQ ID NO:248)；1D2轻链信号肽(SEQ ID NO:249)；1H8轻链信号肽(SEQ ID NO:250)；2D3轻链信号肽(SEQ ID NO:251)；1H10重链信号肽(SEQ ID NO:252)；1A9重链信号肽(SEQ ID NO:253)；1E6和/或2E3重链信号肽(SEQ ID NO:254)；1D2重链信号肽(SEQ ID NO:255)；1B9重链信号肽(SEQ ID NO:256)；1H8重链信号肽(SEQ ID NO:257)；2D3重链信号肽(SEQ ID NO:258)；V型定向的CD33/CD3 BsAb(RC1)(SEQ ID NO:259)；以及不含前导序列或His标签的V型定向的CD33/CD3 BsAb(RC1)(SEQ ID NO:260)。

具体实施方式

根据世界卫生组织的数据，癌症是全球第二大死亡原因，并且在2018年估计有960万人因此而死亡。急性骨髓性白血病(AML)是一种克隆性增殖性成髓细胞的恶性病。AML又称为急性髓细胞白血病、急性髓细胞性白血病、急性粒细胞性白血病和急性非淋巴细胞性白血病。

AML患者可以通过常规化学疗法达到较高的完全缓解率，对于年轻人来说，缓解率是60％至80％，而对于60岁以上的成年人来说，缓解率是40％至60％(

等人,2017.Blood.129(4):424-447)。不幸的是，由于白血病干细胞的化疗难治性，常规疗法后复发很常见(Eppert等人,2011.Nat.Med.17(9):1086-1093)，而且当前的复发/难治性(R/R)AML的治疗选择并不乐观，导致12个月的总生存率低于30％。

全长CD33蛋白质(CD33^FL)是一种跨膜糖蛋白，其特征在于在其细胞外部分中具有氨基末端的膜远端V型免疫球蛋白(Ig)样结构域和膜近端C2型Ig样结构域(图1)。

CD33^FL主要展示于正在成熟和成熟的髓系细胞上，并且最初在专能骨髓前体上表达。它不存在于造血系统之外，并且被认为不在多能造血干细胞上表达。与CD33^FL作为骨髓分化抗原的作用一致，它在骨髓赘瘤患者的恶性细胞上广泛表达；例如，在AML中，它可见于几乎所有病例中的至少一部分AML母细胞，并且在一些病例中可见于白血病干细胞。由于存在这种表达模式，CD33^FL已被广泛用作AML靶向疗法的抗原。(Walter等人,Blood 119(26):6198-6208,2012；Cowan等人,Front.Biosci.(Landmark Ed)18:1311-1334,2013；Laszlo等人,Blood Ref.28(4):143-153,2014；及Walter,Expert Opin Investig Drugs 27(4):339-348,2018)虽然未缀合的单克隆CD33抗体在临床上被证实无效，但最近的几项利用CD33抗体-药物缀合物(ADC)吉妥珠单抗奥唑米星(GO)进行的随机化试验表明，AML患者亚群的生存率有所提高，由此确定了抗体在这种疾病中的价值并验证了CD33^FL是AML免疫疗法的第一个并且也是迄今为止的唯一治疗靶标(Laszlo等人,Blood Rev.28(4):143-153,2014；Godwin等人,Leukemia 31(9)31(9):1855-1868,2017)。在开发新的、更有效的CD33定向治疗剂(例如抗体-药物缀合物、放射免疫缀合物、双特异性抗体、嵌合抗原受体[CAR]修饰的细胞)以克服所观察到的GO的缺点的同时，人们对于CD33作为其他恶性和非恶性病症的药物靶标的兴趣日益浓厚。这些努力包括靶向GO不识别的CD33剪接变体以及靶向其他血液系统恶性病中的CD33+肿瘤细胞、多种疾病中的CD33+骨髓源性抑制细胞(MDSC)以及阿尔茨海默氏病中的正常CD33+小胶质细胞(Walter,Expert Opin Biol Ther.2020,20(9):955-958)。

然而，一些患者表达CD33的截短的剪接变体形式，该变体缺少外显子2并且被称为CD33^ΔE2。已在mRNA水平上，在正常造血细胞和白血病细胞中鉴别出CD33^ΔE2。关于白血病细胞，在29份测试的AML患者试样中全部鉴别出CD33^ΔE2mRNA，表明它在人AML中普遍表达。CD33^ΔE2含有C2型Ig样结构域，但不包含CD33的V型Ig样结构域(图1)。在mRNA水平上鉴别的其他剪接变体包括CD33^E7a和CD33^ΔE2/E7a。CD33^E7a使用了替代外显子7(E7a)，导致CD33的细胞内结构域截短。CD33^ΔE2/E7a缺乏外显子2，并且也存在CD33细胞内结构域的截短。

然而，目前几乎所有商业诊断性CD33抗体和目前临床上可用的基于CD33抗体的治疗剂都识别由外显子2编码的免疫显性V型Ig样结构域(图1)。也就是说，CD33^ΔE2和其他缺乏V型Ig样结构域的CD33蛋白质几乎都不被任何商业上和临床上可用的CD33抗体识别。这意味着这些抗体不识别缺少V型结构域的较短形式的CD33，例如CD33^ΔE2。这可以解释在一项儿科AML临床试验中得到的观察结果，即，在CD33基因中具有单核苷酸多态性导致CD33^ΔE2优先转录和CD33^FL翻译减少的患者不会受益于强化化学疗法中GO(该药剂也结合至CD33的V型结构域)的添加。

无论存在/不存在V型Ig样结构域都识别和结合CD33蛋白质的C2型Ig样结构域的抗体(例如结合CD33^ΔE2和CD33^FL同种型的抗体，称为CD33^PAN抗体)将在靶向所有CD33同种型方面取得巨大进步，从而提供更广泛的治疗功效。这些泛结合抗体也将提供优势，因为它们更近地结合细胞膜(图1)。对于若干治疗靶标，经显示，靶标表位的特性对基于抗体的疗法至关重要，其中膜近端表位引起的抗肿瘤作用要比膜远端表位强效，如关于CD20、CD22、CD25和EpCAM所示。参见例如Cleary等人,J Immunol.2017；198(10):3999-4011；Lin,Pharmgenomics Pers Med.2010；3:51-59；Haso等人,Blood.2013；121(7):1165-1174；以及Bluemel等人,Cancer Immunol Immunother.2010；59(8):1197-1209。

本公开提供了不管是否存在V型Ig样结构域都结合CD33的C2型Ig样结构域的新颖泛结合抗体。这些CD33^PAN结合抗体包括：1H10、1A9、1E6、1D2和1B9。

在特定实施方案中，本文所公开的抗体结合至CD33并具有以下特征中的一者或多者：(a)与重组人CD33结合；(b)与人外周血单核细胞(PBMC)或其他骨髓或非骨髓人体细胞表面上的内源性CD33结合；(c)与癌细胞表面上的内源性CD33结合；(d)与AML癌细胞表面上的内源性CD33结合；(e)在V型Ig样结构域存在下与CD33 C2型Ig样结构域内的表位结合(例如在CD33^FL中)；(f)在V型Ig样结构域不存在下与CD33 C2型Ig样结构域内的表位结合(例如在CD33^ΔE2中)；(g)与CD33的膜近端表位结合；(h)包括1H10的V_L链和V_H链；(i)包括1A9的V_L链和V_H链；(j)包括1E6的V_L链和V_H链；(k)包括1D2的V_L链和V_H链；(l)包括1B9的V_L链和V_H链；(m)包括1H8的V_L链和V_H链；(n)包括2D3的V_L链和V_H链；(o)包括2E3的V_L链和V_H链；(p)包括1H10的CDR集合；(q)包括1A9的CDR集合；(r)包括1E6的CDR集合；(s)包括1D2的CDR集合；(t)包括1B9的CDR集合；(u)包括1H8的CDR集合；(v)包括2D3的CDR集合；和/或(w)包括2E3的CDR集合。CDR集合可以通过IMGT、Kabat、North、Chothia或“Set 5”预测。

本文所描述的各种形式的抗体及其结合片段可在本文中称为CD33靶向剂。

已重点描述了本公开的关键方面，以下提供实施本公开的附加细节和选择如下：(i)CD33抗体；(ii)抗CD33抗体缀合物；(iii)抗CD33多特异性抗体；(iv)配制物；(v)免疫细胞样本采集和细胞富集；(vi)对细胞群体进行基因修饰以表达重组蛋白；(vii)细胞活化培养条件；(viii)离体制造的细胞配制物；(ix)使用方法；(x)由对照群体得到的参考水平；(xi)示例性实施方案；(xii)实验实施例；以及(xiii)结束段落。这些标题仅出于组织目的提供，并不限制本公开的范围或解释。

(i)CD33抗体.CD33是指由在细胞中处理CD33前体蛋白而产生的任何天然的、成熟的CD33。CD33阳性细胞是指在表面上表达CD33的任何细胞。CD33阳性癌症是指包括一个或多个在表面上表达CD33的细胞的癌症。CD33阳性癌症的实例包括白血病、骨髓肉瘤和淋巴瘤。此类癌症的更具体的实例包括急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性髓单核细胞性白血病(CMML)、急性早幼粒细胞性白血病(APL)、骨髓增生性赘瘤、巨核细胞性白血病、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、多发性骨髓瘤(MM)和其他浆细胞恶液质、肥大细胞病、肥大细胞白血病、肥大细胞肉瘤和骨髓肉瘤。

本公开提供了不管存在/不存在V型Ig样结构域均靶向CD33的C2型Ig样结构域的抗体，以及靶向CD33的V型Ig样结构域的抗体。在特定实施方案中，可以选择抗体的组合。例如，如果受试者表达V型结构域，则可以选择包括1A9、1H10、1B9、1E6和1D2中的一者或多者以及2E3、2D3和1H8中的一者或多者的组合疗法。如果受试者不表达V型结构域，则将不会施用2E3、2D3和1H8。

天然存在的抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体包括两对多肽链，每对具有一条轻链和一条重链。每条链的氨基末端部分都包括负责抗原识别和表位结合的可变区。可变区展现由三个高变区(又称为互补决定区(CDR))接合的相对保守的框架区(FR)的相同一般结构。来自每对两条链的CDR通过框架区对齐，使其能够与特定表位结合。从N末端至C末端，轻链和重链可变区均包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸分配通常根据以下定义：Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991)；或Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917,1987；Chothia等人,Nature,342:878-883,1989。

可以通过解析抗体的结构和/或解析抗体-表位复合物的结构来实现对CDR的确定性描绘以及对包括抗体结合位点在内的残基的鉴别。在特定实施方案中，这可以通过如X射线结晶学之类方法来实现。或者，通过与已知抗体(线性序列)相比较来确定CDR，无需诉诸解析晶体结构。为了确定参与结合的残基，可以任选地确定与靶标结合的Fab(抗体片段)的共晶结构。也可以使用软件程序，如ABodyBuilder。

每条链的羧基末端部分都界定一个恒定区，该恒定区可负责效应功能，特别是重链(Fc)中的效应功能。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

在全长轻链和重链内，可变区和恒定区是由“J”区氨基酸接合，并且重链还包括“D”区氨基酸。参见例如Fundamental Immunology,第7章(Paul,W.编,第2版,Raven Press,N.Y.(1989))。

人轻链分类为κ轻链和λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体同型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有若干亚类，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM的亚类包括IgM1和IgM2。IgA以类似方式细分为包括IgA1和IgA2在内的亚类。

如所述，抗体结合抗原上的表位。术语抗原是指能够被抗体结合的分子或分子的一部分。表位是被抗体可变区结合的抗原区域。表位决定簇可包括分子的有化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。当抗原是蛋白质或肽时，表位包括该蛋白质或肽内与抗体可变区接触的特定氨基酸。

在特定实施方案中，表位表示CD33上被抗体的相应可变区结合的结合位点。可变区结合至线性表位(例如包括5至12个连续氨基酸的链段的表位)，或可变区结合至由蛋白质靶标的若干短链段的空间排列所形成的三维结构。被可变区，例如被抗体或抗体片段的表位识别位点或互补位识别的三维表位可以被认为是表位分子的三维表面特征。这些特征精确地配合至可变区的相应结合位点中，并由此促进可变区与其靶标蛋白(更一般来说，抗原)之间的结合。在特定实施方案中，表位可以被认为具有两个水平：(i)“被覆盖的补丁(covered patch)”，它可以被认为是抗体可变区将投射于它所结合的抗原上的阴影；和(ii)促进结合的各个参与侧链和主链残基。结合则是由于离子相互作用、氢键和疏水相互作用的集合引起。

在特定实施方案中，当前公开的抗体的表位(即，抗体所结合的表位)见于CD33的C2型Ig样结构域内。表位提供“泛结合”位点，这意味着无论CD33分子是另外包含V型Ig样结构域(如例如在CD33^FL中)或还是不包含(如例如在CD33^ΔE2中)，抗体都将结合(图1)。在特定实施方案中，C2型Ig样结构域上的表位是膜近端表位。在特定实施方案中，膜近端表位在跨膜区的115个残基内；在跨膜区100个残基内；在跨膜区的75个残基内；在跨膜区50个残基内；在跨膜区的25个残基内；或在跨膜区的15个残基内。在特定实施方案中，当前公开的抗体的表位见于CD33的V型Ig样结构域内。

在特定实施方案中，“结合”意思指可变区以10^-8M或更低，在特定实施方案中10^-5M至10^-13M，在特定实施方案中10^-5M至10^-10M，在特定实施方案中10^-5M至10^-7M，在特定实施方案中10^-8M至10^-13M或在特定实施方案中10^-9M至10^-13M的解离常数(Kd或KD)与其靶标表位缔合。该术语还可用于指示，可变区不结合至存在的其他生物分子(例如，该可变区以10^-4M或更高，在特定实施方案中10^-4M至1M的解离常数(Kd)结合至其他生物分子)。

在特定实施方案中，Kd可以使用BIAcore表征。例如，在特定实施方案中，Kd可以在25℃下使用表面等离子共振测定法，使用

-2000或

-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，用约10个反应单位(RU)的固定有抗原的CM5芯片测量。简单点说，可根据供应商的说明书，将羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。可将抗原用pH 4.8的10mM乙酸钠稀释至5μg/ml(0.2μM)，随后以5μl/min的流动速率注入以获得y 10个反应单位(RU)的偶合蛋白。在注入抗原之后，可注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下，以25μl/min的流动速率注入Fab于含有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。缔合速率(k_on)和解离速率(k_off)可使用简单的一对一朗缪尔结合模型(

评价软件，3.2版)，通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)来计算。平衡解离常数(Kd)可通过比率k_off/k_on计算。参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881,1999。如果通过上述表面等离子共振测定法测得缔合速率超过10⁶M^-1s^-1，则该缔合速率可以通过使用荧光猝灭技术确定，该技术测量了在25℃下，在递增浓度的抗原存在下于pH 7.2的PBS中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm；16nm带通)是增加还是减小，该荧光发射强度是在分光计中，如在配备停流(stop-flow)的分光光度计(AvivInstruments)或带有搅拌的比色杯的8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量。

除非另有指示，否则术语“抗体”(除如上文所描述的具有两条全长重链和两条全长轻链的抗体之外)还包括其变体、衍生物和片段，其实例如下所述。此外，除非明确地排除，否则抗体可包括单克隆抗体、人抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体、多特异性抗体、多克隆抗体、线性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体、嵌合抗体、抗体融合物及其各自的片段。在特定实施方案中，抗体可以包括抗体的寡聚物或多重复合形式。

单克隆抗体是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，所述基本上同质的抗体群体是构成该群体的个别抗体除可能的变体抗体，例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂制造期间产生的突变外，都是相同的和/或结合相同的表位，所述变体一般是以微量存在。与包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每一单克隆抗体都是针对抗原上的单一表位。因此，修饰语“单克隆”指示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特性并且不应解释为需要通过任何特殊方法制造该抗体。例如，单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法。

“人抗体”是这样一种抗体，该抗体包括对应于由人或人体细胞所产生的抗体的氨基酸序列或来源于利用人抗体组库或其他人抗体编码序列的非人来源的氨基酸序列。

“人共有框架”是表示在一系列人免疫球蛋白V_L或V_H框架序列中最常存在的氨基酸残基的框架。一般来说，该系列人免疫球蛋白V_L或V_H序列是来自可变结构域序列的亚组。序列亚组可以是如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIH Publication 91-3242,Bethesda Md.(1991),第1-3卷中的亚组。在特定实施方案中，对于V_L，所述亚组是如Kabat等人(同上)中所述的亚组κI。在特定实施方案中，对于V_H，所述亚组是如Kabat等人(同上)中所述的亚组III。

关于本文所提供的抗体，提供以下CDR集合。CDR集合是指3个轻链CDR和3个重链CDR，它们一起引起与CD33的结合。

表1：使用North的抗体CDR序列.

表2：使用IMGT的抗体CDR序列.

表3：使用Kabat的抗体CDR序列.

表4：使用Chothia的抗体CDR序列.

表5：抗体CDR序列–Set 5.

在特定实施方案中，1H10抗体包括：可变轻链，该可变轻链包括以下序列：

AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRIYLGWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNYPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:51)；和可变重链，该可变重链包括以下序列：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSGYIFTSYDMHWVRQAPGQGLEWMGIIDPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSMSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRDYSWSYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:52)。

在特定实施方案中，1A9抗体包括：可变轻链，该可变轻链包括以下序列：

AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNDLGWYQQKPGKAPKILIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCLQEYNYPCTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:53)；和可变重链，该可变重链包括以下序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYDMHWVRQATGKGLEWVSAIGTAGDTYYAGSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCAREYSGYYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:54)。

在特定实施方案中，1E6抗体包括：可变轻链，该可变轻链包括以下序列：

AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYSYPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:55)；和可变重链，该可变重链包括以下序列：

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSHNYYSDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYSGSYYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:56)。

在特定实施方案中，1D2抗体包括：可变轻链，该可变轻链包括以下序列：

AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPELLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLIISSLQPEDFATYYCLQDYSYPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:57)；和可变重链，该可变重链包括以下序列：

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSQKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYSGSYYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:58)。

在特定实施方案中，1B9抗体包括：可变轻链，该可变轻链包括以下序列：

AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNDLGWYLQRPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYSYPRTFGQGTTVEIK(SEQ ID NO:59)；和可变重链，该可变重链包括以下序列：

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSHNYYSDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYSGSYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:60)。

在特定实施方案中，CD33^V型抗体包括1H8。在特定实施方案中，1H8抗体包括：可变轻链，该可变轻链包括以下序列：

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQNIGGNLHWYQQKPDQSPKLLIRYATQPFSGVPSRFGGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHQSSSLPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:61)；和可变重链，该可变重链包括以下序列：

QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNEYYADSVKGRFTVSRDNSKHTLYLQMNRLRAEDTAVYYCARDLDYDSSGGDYWGQGILVLVSS(SEQ ID NO:62)。

在特定实施方案中，CD33^V型抗体包括2D3。在特定实施方案中，2D3抗体包括：可变轻链，该可变轻链包括以下序列：

EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSGSSSFLSWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQDYNLPFTFGPGTKVDIK(SEQ ID NO:63)；和可变重链，该可变重链包括以下序列：

EVQLLESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISDSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNMLYLEMNSLRAEDTAIYYCAKRTRYFNGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:64)。

在特定实施方案中，CD33^V型抗体包括2E3。在特定实施方案中，2E3抗体包括：可变轻链，该可变轻链包括以下序列：

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:65)；和可变重链，该可变重链包括以下序列：

QVCLVESGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYGGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGTGENYYYYVMDVWGQGTTVTVS(SEQ ID NO:66)。

本文所公开的抗体可用于制备各种形式的相关结合结构域分子。例如，特定实施方案可包括抗体的结合片段，例如Fv、Fab、Fab′、F(ab')₂和单链Fv片段(scFv)，或特异性结合至本文所描述的表位的免疫球蛋白的任何生物有效片段。

在特定实施方案中，使用抗体片段。“抗体片段”表示完整或全长抗体中保留结合至表位的能力的部分。如本文所描述，抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如哺乳动物悬浮细胞系、大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生。抗体片段可以通过与完整抗体相同的方式，针对它们的结合特性进行筛选。抗体片段的实例包括Fv、scFv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双功能抗体；和线性抗体。

单链可变片段(scFv)是用短连接子肽连接的免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区的融合蛋白。Fv片段包括抗体单一臂的V_L和V_H结构域。虽然Fv片段的两个结构域V_L和V_H是由独立基因编码，但它们可以使用例如重组方法，通过合成连接子接合，该合成连接子使其能够制备为单一蛋白质链形式，在该单一蛋白质链中，V_L区与V_H区配对形成单价分子(单链Fv(scFv))。有关Fv和scFv的额外信息，参见例如Bird等人,Science 242:423-426,1988；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988；Plueckthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编),Springer-Verlag,New York),(1994)269-315；WO 1993/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。

用于连接scFv的VL和VH的连接子序列一般是五至35个氨基酸长。在特定实施方案中，VL-VH连接子包括五至35个、十至30个氨基酸或15至25个氨基酸。连接子长度的变化可以保持或增强活性，由此在活性研究中产生卓越的功效。scFv的连接子序列通常是Gly-Ser连接子，在本文别处将更详细地描述。

基于抗体的结合结构域形式的额外实例包括基于scFv的grababody和可溶性VH结构域抗体。这些抗体仅使用重链可变区形成结合区。参见例如Jespers等人,Nat.Biotechnol.22:1161,2004；Cortez-Retamozo等人,Cancer Res.64:2853,2004；Baral等人,Nature Med.12:580,2006；和Barthelemy等人,J.Biol.Chem.283:3639,2008。

Fab片段是包括V_L、V_H、CL和CH1结构域的单价抗体片段。F(ab')₂片段是包括通过铰链区处的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段。关于具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')₂片段的讨论，参见美国专利5,869,046。双功能抗体包括可以是二价的两个表位结合位点。参见例如EP 0404097；WO1993/01161；和Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448,1993。也可使用双亲和力重靶向抗体(DART^TM；基于双功能抗体形式，但提供C末端二硫桥键以获得额外的稳定(Moore等人,Blood 117:4542-51,2011))。抗体片段也可包括分离的CDR。关于某些抗体片段的评述，参见Hudson等人,Nat.Med.9:129-134,2003。

在特定实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入抗体Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可以包括在一个或多个氨基酸位置处包括氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。许多Fc修饰是本领域已知的，并且本文描述了此类可能的修饰的代表性示例。

在特定实施方案中，变体(包括Fc变体)已由参考序列修饰而产生施用益处。示例性施用益处可以包括(1)降低对蛋白水解的敏感性；(2)降低对氧化的敏感性；(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力；(4)改变结合亲和力；(5)降低免疫原性；和/或(6)延长半衰期。尽管以下公开内容针对这些修饰在抗体中的应用来描述这些修饰，但当适用于另一种特定抗CD33结合结构域形式(例如scFv、双特异性抗体)时，这些修饰也可以应用于这些其他形式。

在特定实施方案中，抗体可以被突变以增加它们对Fc受体的亲和力。增加对Fc受体的亲和力的示例性突变包括：G236A/S239D/A330L/I332E(GASDALIE)。Smith等人,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,109(16),6181-6186,2012。在特定实施方案中，抗体变体包括具有改善ADCC的一个或多个氨基酸取代，例如具有在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处的取代的Fc区。在特定实施方案中，在Fc区中作出改变，以引起C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变，例如美国专利号6,194,551、WO 99/51642以及Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184,2000中所描述。

在特定实施方案中，可能期望产生经过半胱氨酸工程改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，被取代的残基存在于抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点处，并且可以用于将抗体与其他部分如药物部分或连接子-药物部分缀合，从而产生免疫缀合物，下文将进一步所描述。在特定实施方案中，选择重链Fc区的残基5400(EU编号)。经过半胱氨酸工程改造的抗体可以如例如美国专利号7,521,541中所描述产生。

提供了抗体变体，所述抗体变体具有缺乏连接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖量是通过相对于连接至Asn 297的所有糖结构(例如复合结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和计算在Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来确定，该量是通过MALDI-TOF质谱法测量，例如WO 2008/077546中所描述。Asn297是指位于Fc区中位置297(Fc区残基的Eu编号)处的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变化而位于位置297上游或下游±3个氨基酸处，即，在位置294与位置300之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如WO2000/61739；WO 2001/29246；WO2002/031140；US2002/0164328；WO2003/085119；WO2003/084570；US2003/0115614；US2003/0157108；US2004/0093621；US2004/0110704；US2004/0132140；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；和Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺少蛋白质岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545,1986)和基因敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614,2004；Kanda等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688,2006；和WO 2003/085107)。

在特定实施方案中，经过修饰的抗体包括一个或多个氨基酸被非氨基酸组分置换的抗体，或氨基酸与官能团缀合或官能团以其他方式与氨基酸缔合的抗体。经过修饰的氨基酸可以是例如糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸或与有机衍生化剂缀合的氨基酸。氨基酸可以在重组制造过程中，经历例如共翻译或翻译后修饰(例如在哺乳动物细胞中表达期间在N-X-S/T基序处进行的N-连接的糖基化)或通过合成手段进行修饰。经过修饰的氨基酸可以在序列内或在序列的末端。修饰还包括亚硝酸化构建体。

在特定实施方案中，变体包括糖基化变体，其中糖基化位点的数量和/或类型相较于参考序列的氨基酸序列发生了改变。在特定实施方案中，糖基化变体包括比参考序列要多或要少的N-连接的糖基化位点数量。N-连接的糖基化位点是以下述序列为特征：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸残基。氨基酸残基取代产生这一序列，为添加N-连接的碳水化合物链提供了一个潜在的新位点。或者，消除这一序列的取代将去除现有的N-连接的碳水化合物链。还提供了N-连接的碳水化合物链的重排，其中一个或多个N-连接的糖基化位点(例如天然存在的那些)被消除并且一个或多个新的N-连接位点产生。额外的抗体变体包括半胱氨酸变体，其中与参考序列相比，一个或多个半胱氨酸残基缺失或被另一个氨基酸(例如丝氨酸)取代。当抗体必须重新折叠成生物活性构象时，例如在分离不溶性包涵体之后，这些半胱氨酸变体可能很有用。这些半胱氨酸变体一般具有比参考序列要少的半胱氨酸残基，并且通常具有偶数个以最大限度地减少由未配对半胱氨酸引起的相互作用。

聚乙二醇化特别是聚乙二醇(PEG)聚合物链与其他分子(如蛋白质)共价缀合的过程。文献中已经报道几种使蛋白质聚乙二醇化的方法。例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-PEG被用于使赖氨酸残基和蛋白质N末端的游离胺基聚乙二醇化；带有醛基的PEG被用于在还原试剂存在下使蛋白质的氨基末端聚乙二醇化；具有顺丁烯二酰亚胺官能团的PEG被用于选择性使蛋白质中半胱氨酸残基的游离硫醇基聚乙二醇化；并且可以执行乙酰苯丙氨酸残基的位点特异性聚乙二醇化。

蛋白质与PEG的共价连接已被证明是一种增加体内蛋白质的半衰期的有用方法(Abuchowski,A.等人,Cancer Biochem.Biophys.,1984,7:175-186；Hershfield,M.S.等人,N.Engl.J.Medicine,1987,316:589-596；和Meyers,F.J.等人,Clin.Pharmacol.Ther.,49:307-313,1991)。PEG与蛋白质连接不仅可以保护分子免于酶降解，还可以降低它们的体内清除率。连接至蛋白质的PEG的大小对蛋白质的半衰期有显著影响。聚乙二醇化降低清除率的能力一般与蛋白质连接多少PEG基团无关，而是与被改变的蛋白质的总分子量有关。通常，PEG越大，则所连接的蛋白质的体内半衰期越长。此外，聚乙二醇化还可以减少蛋白质聚集(Suzuki等人,Biochem.Bioph.Acta 788:248,1984)；改变蛋白质免疫原性(Abuchowski等人,J.Biol.Chem.252:3582,1977)，以及增加蛋白质溶解度(如PCT公布号WO 92/16221中所述)。

几种大小的PEG是可商购的(Nektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006；和NOF DDS Catalogue Ver 7.1)，它们适于制造具有目标循环半衰期的蛋白质。已使用多种活性PEG，包括mPEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、mPEG琥珀酰亚胺基碳酸酯和PEG醛，例如mPEG-丙醛。

在特定实施方案中，抗体可以与包括氨基酸改变的Fc多肽融合或偶合，所述氨基酸改变使含有改变的Fc多肽的抗体的体内半衰期相较于含有相同Fc多肽但无氨基酸改变的类似抗体有所延长。在特定实施方案中，Fc多肽氨基酸改变可包括M252Y、S254T、T256E、M428L和/或N434S并且可以一起使用、分开使用或以任何组合形式使用。例如，如Zalevsky等人,Nature Biotechnology 28,157-159,2010中所述，M428L/N434S是增加抗体在血清中的半衰期的一对突变。可能有帮助的其他改变描述于美国专利号7,083,784、美国专利号7,670,600、美国公布号2010/0234575、PCT/US2012/070146以及Zwolak,Scientific Reports7:15521,2017中。在特定实施方案中，在Fc多肽中以下氨基酸位置之一处的任何取代均可被视为延长半衰期的Fc改变：250、251、252、259、307、308、332、378、380、428、430、434、436。这些改变中的每一个或这些改变的组合都可用于延长如本文所描述的双特异性抗体的半衰期。

在特定实施方案中，Fe修饰包括huIgG4 ProAlaAla、huIgG2m4和/或huIgG2σ突变。

在特定实施方案中，本文所公开的抗体是使用如Pechman等人(Am J Physiol294:R1234-R1239,2008)中所描述的Daedalus表达系统形成的。Daedalus系统利用了在转导载体中包括最小化的普遍存在的染色质开放元件来减少或防止基因组沉默并帮助维持分克级表达水平的稳定性。这一系统可以通过采用无血清适应性人悬浮细胞系(如293Freestyle)的分泌路径来避开其他蛋白质制造方法的繁琐且耗时的步骤。使用优化的慢病毒载体，可以通过常规、小规模(100ml)培养得到20-100mg/l产量的正确折叠并且经历翻译后修饰的至多70kDa大小的无内毒素蛋白质。在这些产量下，大多数蛋白质可以使用单一尺寸排阻色谱步骤进行纯化，直接适用于结构、生物物理学或治疗应用。Bandaranayake等人,Nucleic Acids Res.,39(21)2011。在一些情况下，由于根据本文所描述的方法的制造纯度很高，可能不需要通过色谱法纯化。

(ii)抗CD33抗体缀合物.抗CD33抗体缀合物包括抗CD33免疫毒素、抗体-药物缀合物(ADC)、荧光缀合物和放射性同位素缀合物。

抗CD33免疫毒素.在特定实施方案中，抗体也可以形成为免疫毒素形式。抗CD33免疫毒素包括与一种或多种细胞毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)缀合的本文所公开的抗CD33抗体。毒素可以是对细胞有害的任何剂。常用的植物毒素分为两类：(1)全毒素(或II类核糖体失活蛋白)，如蓖麻毒素、相思豆毒蛋白、槲寄生凝集素和蒴莲根毒素(modeccin)；以及(2)半毒素(I类核糖体失活蛋白)，如美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、皂草素、异株腹泻毒蛋白(Bryodin)1、三角梅核糖体失活蛋白(bouganin)和白树毒素(gelonin)。常用的细菌毒素包括白喉毒素(DT)和假单胞菌外毒素(PE)。Kreitman,Current Pharmaceutical Biotechnology 2:313-325(2001)。毒素可以从基本上任何来源获得并且可以是合成的或天然的产物。

每个结合结构域具有多个(例如四个)细胞毒素的免疫毒素可以通过以下方式制备：在37℃下，用过量的还原试剂，例如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)部分还原该结合结构域30分钟，然后可以通过SEPHADEX G-25树脂，用在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中的1mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)洗脱来交换缓冲液。洗脱液可再用DPBS稀释，并且结合结构域的硫醇浓度可使用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)[Ellman试剂]测量。可以在4℃添加过量的，例如5倍过量的连接子-细胞毒素缀合物，保持1小时，并且可以通过添加大量过量，例如20倍过量的半胱氨酸来淬灭缀合反应。所得到的免疫毒素混合物可以在用PBS平衡的SEPHADEX G-25上纯化以去除未反应的连接子-细胞毒素缀合物，必要时进行脱盐，并通过尺寸排阻色谱法纯化。所得到的免疫毒素接着可以进行无菌过滤，例如通过0.2μm过滤器过滤，并且必要时，可以将其冻干以进行储存。

抗体-药物缀合物(ADC)允许将药物部分靶向递送至CD33表达细胞，并且在特定实施方案中在细胞内积累，其中全身施用未缀合的药物可对正常细胞造成不可接受的水平的毒性(Polakis P.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5:382-387)。

在特定实施方案中，ADC是指组合了抗体和细胞毒性药物两者的特性的靶向化学治疗分子，它通过使强效的细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞(Teicher,B.A.(2009)Current Cancer Drug Targets 9:982-1004)，使功效最大化并使脱靶毒性减到最少，从而增强治疗指数(Carter,P.J.和Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107)。另参见Kamath和Iyer(Pharm Res.32(11):3470-3479,2015)，描述了关于开发ADC的注意事项。

ADC的药物部分(D)可以包括具有细胞毒性或细胞抑制作用的任何化合物、部分或基团。药物部分可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或嵌入以及抑制RNA聚合酶、蛋白质合成和/或拓扑异构酶在内的机制来发挥其细胞毒性和细胞抑制作用。示例性药物包括放线菌素D(actinomycin D)、蒽环霉素(anthracycline)、奥瑞他汀(auristatin)、卡奇霉素(calicheamicin)、喜树碱(camptothecin)、CC1065、秋水仙素(colchicin)、细胞松弛素B、柔红霉素(daunorubicin)、1-脱氢睾酮、二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracinedione)、海兔毒素(dolastatin)、多柔比星(doxorubicin)、多卡霉素(duocarmycin)、依利萘法德(elinafide)、依米汀(emetine)、溴化乙锭、依托泊苷(etoposide)、短杆菌肽D(gramicidinD)、糖皮质激素、利多卡因(lidocaine)、类美登素(maytansinoid)(包括单甲基奥瑞他汀E[MMAE]；维汀(vedotin))、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奈莫柔比星(nemorubicin)、PNU-159682、普鲁卡因(procaine)、普萘洛尔(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)、吡咯并苯并二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepine，PBD)、紫杉烷(taxane)、紫杉醇(taxol)、替诺泊苷(tenoposide)、丁卡因(tetracaine)、单端孢菌素(trichothecene)、长春碱(vinblastine)、长春花生物碱(vinca alkaloid)、长春新碱(vincristine)以及其具有细胞毒性活性的立体异构体、电子等排体、类似物和衍生物。

药物可以从基本上任何来源获得；它可以是合成的或是从选定的来源，例如从植物、细菌、昆虫、哺乳动物或真菌来源分离的天然产物。药物也可以是经过合成修饰的天然产物或是天然产物的类似物。

本公开的ADC化合物包括具有抗CD33活性的那些。在特定实施方案中，ADC化合物包含与药物部分缀合(即，共价连接)的抗体。在特定实施方案中，抗体通过连接子共价连接至药物部分。连接子可包括能够将抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或功能等效物连接至另一部分(例如药物部分)的任何化学部分。在使化合物或抗体保持活性的条件下，连接子可对裂解敏感(可裂解连接子)，例如酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解。或者，连接子可以基本上对裂解具有抗性(例如稳定连接子或不可裂解连接子)。在一些方面，连接子是预带电连接子(procharged linker)、亲水性连接子或基于二羧酸的连接子。ADC将有效剂量的药物选择性递送至癌细胞，由此可以实现较大的选择性，即较低的有效剂量，同时增加治疗指数(“治疗窗”)。

为了制备ADC，可以通过与Doronina等人(Bioconjugate Chem.17:114-124,2006)所描述的方法类似的常规方法制备连接子-细胞毒素缀合物。每个抗体具有多个(例如四个)药物的抗体-药物缀合物可以通过以下方式制备：在37℃下，用过量的还原试剂，例如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)部分还原该抗体30分钟，然后可以通过SEPHADEXG-25树脂，用在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中的1mM DTPA洗脱来交换缓冲液。洗脱液可再用DPBS稀释，并且抗体的硫醇浓度可使用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)[Ellman试剂]测量。可以在4℃添加过量的，例如5倍过量的连接子-细胞毒素缀合物，保持1小时，并且可以通过添加大量过量，例如20倍过量的半胱氨酸来淬灭缀合反应。所得到的ADC混合物可以在用PBS平衡的SEPHADEX G-25上纯化以去除未反应的连接子-细胞毒素缀合物，必要时进行脱盐，并通过尺寸排阻色谱法纯化。所得到的ADC接着可以进行无菌过滤，例如通过0.2μm过滤器过滤，并且必要时，可以将其冻干以进行储存。

抗CD33荧光缀合物包括与荧光标记连接的CD33结合结构域。荧光标记可包括可通过例如光学、光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何适合的标记或可检测基团。

荧光标记在细胞染色、鉴别和分离使用中特别有用。示例性荧光标记包括蓝色荧光蛋白(例如eBFP、eBFP2、Azurite、mKalama1、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)；青色荧光蛋白(例如eCFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl、Midoriishi-Cyan、mTurquoise)；绿色荧光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、EGFP、Emerald、Azami Gree n、Monomeric AzamiGreen(mAzamigreen))、CopGFP、AceGFP、avGFP、ZsGreenl、Oregon Green^TM(Thermo FisherScientific))；荧光素酶；橙色荧光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、MonomericKusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)；红色荧光蛋白(mKate、mKate2、mPlum、DsRedmonomer、mCherry、mRuby、mRFP1、Ds Red-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRedl、AsRed2、eqFP611、mRaspberry、mStrawberry、Jred、Texas Red^TM(Thermo FisherScientific))；远红色荧光蛋白(例如mPlum和mNeptune)；黄色荧光蛋白(例如YFP、eYFP、Citrine、SYFP2、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellowl)；和串联缀合物。

抗CD33-放射性同位素缀合物包括与放射性同位素连接的CD33结合结构域，被用于核医学。核医学是指通过向受试者施用有放射性的同位素(放射性同位素或放射性核素)来诊断和/或治疗疾患。治疗性核医学通常被称为放射疗法或放射免疫疗法(RIT)。

可与本公开的抗体缀合的放射性同位素的实例包括碘-131、砷-72、砷-74、碘-131、铟-111、钇-90和镥-177，以及发射α粒子的放射性核素，例如砹-211、锕-225、铋-212或铋-213。用于制备放射免疫缀合物的方法已于本领域中确立。放射免疫缀合物的实例是可商购的，包括Zevalin^TM(DEC Pharmaceuticals)，并且可以使用类似方法，使用本公开的抗体制备放射免疫缀合物。

可用于放射疗法的放射性核素的实例包括²²⁵Ac和²²⁷Th。²²⁵Ac是一种放射性核素，其半衰期为十天。随着²²⁵Ac衰变，形成子体同位素²²¹Fr、²¹³Bi和²⁰⁹Pb。²²⁷Th具有19天的半衰期并形成子体同位素²²³Ra。

有用放射性同位素的其他实例包括²²⁸Ac、¹¹¹Ag、¹²⁴Am、⁷⁴As、²¹¹At、²⁰⁹At、¹⁹⁴Au、¹²⁸Ba、⁷Be、²⁰⁶Bi、²⁴⁵Bk、²⁴⁶Bk、⁷⁶Br、¹¹C、⁴⁷Ca、²⁵⁴Cf、²⁴²Cm、⁵¹Cr、⁶⁷Cu、¹⁵³Dy、¹⁵⁷Dy、¹⁵⁹Dy、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Dy、¹⁷¹Er、²⁵⁰Es、²⁵⁴Es、¹⁴⁷Eu、¹⁵⁷Eu、⁵²Fe、⁵⁹Fe、²⁵¹Fm、²⁵²Fm、²⁵³Fm、⁶⁶Ga、⁷²Ga、¹⁴⁶Gd、¹⁵³Gd、⁶⁸Ge、¹⁷⁰Hf、¹⁷¹Hf、¹⁹³Hg、¹⁹³mHg、¹⁶⁰mHo、¹³⁰I、¹³¹I、¹³⁵I、¹¹⁴mIn、¹⁸⁵Ir、⁴²K、⁴³K、⁷⁶Kr、⁷⁹Kr、⁸¹mKr、¹³²La、²⁶²Lr、¹⁶⁹Lu、¹⁷⁴mLu、¹⁷⁶mLu、²⁵⁷Md、²⁶⁰Md、²⁸Mg、⁵²Mn、⁹⁰Mo、²⁴Na、⁹⁵Nb、¹³⁸Nd、⁵⁷Ni、⁶⁶Ni、²³⁴Np、¹⁵O、¹⁸²Os、¹⁸⁹mOs、¹⁹¹Os、³²P、²⁰¹Pb、¹⁰¹Pd、¹⁴³Pr、¹⁹¹Pt、²⁴³Pu、²²⁵Ra、⁸¹Rb、¹⁸⁸Re、¹⁰⁵Rh、²¹¹Rn、¹⁰³Ru、³⁵S、⁴⁴Sc、⁷²Se、¹⁵³Sm、¹²⁵Sn、⁹¹Sr、¹⁷³Ta、¹⁵⁴Tb、¹²⁷Te、²³⁴Th、⁴⁵Ti、¹⁶⁶Tm、²³⁰U、²³⁷U、²⁴⁰U、⁴⁸V、¹⁷⁸W、¹⁸¹W、¹⁸⁸W、¹²⁵Xe、¹²⁷Xe、¹³³Xe、¹³³mXe、¹³⁵Xe、⁸⁵mY、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁹³Y、¹⁶⁹Yb、¹⁷⁵Yb、⁶⁵Zn、⁷¹mZn、⁸⁶Zr、⁹⁵Zr和/或⁹⁷Zr。

(iii)抗CD33多特异性抗体.抗CD33双特异性抗体结合至少两个表位，其中至少一个表位是位于CD33上。抗CD33三特异性抗体结合至少3个表位，其中至少一个表位是位于CD33上，以此类推。

双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')₂双特异性抗体)形式。例如，WO 1996/016673描述了一种双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体；美国专利号5,837,234描述了一种双特异性抗ErbB2/抗FcγRI抗体；WO 1998/002463描述了一种双特异性抗ErbB2/Fcα抗体；并且US 5,821,337描述了一种双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。在特定实施方案中，双特异性抗体可以是双特异性T细胞接合

抗体形式。

一些额外的示例性双特异性抗体具有两条重链(各具有三个重链CDR，随后是(从N末端至C末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域)和两条免疫球蛋白轻链，它们通过与每条重链缔合而赋予抗原结合特异性。然而，如所述，设想了额外的架构，包括轻链与每条重链缔合但不(或在最低限度上)促成抗原结合特异性的双特异性抗体，或者可以结合一个或多个被重链抗原结合区结合的表位的双特异性抗体，或者可以与每条重链缔合并使一条或两条重链能够结合一个或两个表位的双特异性抗体。

可以使用scFv二聚体或双功能抗体，而不是全抗体。双功能抗体和scFv可以在没有Fc区的情况下，仅使用可变结构域(通常包括来自源抗体的轻链和重链的可变结构域组分)构建，这可能会降低抗独特型反应的作用。其他形式的双特异性抗体包括Traunecker等人(Embo Journal,10,3655-3659,1991)中所描述的单链“Janusins”。

具有延长的半衰期的双特异性抗体描述于例如美国专利号8,921,528和美国专利公布号2014/0308285中。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。例如，全长双特异性抗体的传统制造方法是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中该两条链具有不同的特异性(参见例如Millstein等人,Nature 305:37-39,1983)。类似程序公开于例如WO 1993/008829；Traunecker等人,EMBO J.10:3655-3659,1991；以及Holliger和Winter,CurrentOpinion Biotechnol.4,446-449(1993)。

在特定实施方案中，双特异性抗体可以使用化学键联来制备。例如，Brennan等人(Science 229:81,1985)描述了一种程序，其中完整抗体被蛋白水解裂解产生F(ab')2片段。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠存在下被还原，以使连位二硫醇稳定并防止分子间二硫化物的形成。然后，将产生的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，通过用巯基乙胺还原，将一种Fab'-TNB衍生物重新转化为Fab'-硫醇，并将其与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。

在特定实施方案中，本文所公开的结合结构域可用于产生双-三特异性(或更高特异性)免疫细胞接合抗体构建体。

在特定实施方案中，本文所公开的结合结构域可用于产生双-三特异性(或更高特异性)免疫细胞接合抗体构建体。免疫细胞接合抗体构建体可以接合例如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞、造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)和/或HSC与HPC的混合物(即HSPC)。在特定实施方案中，免疫细胞接合抗体构建体接合T细胞。

已经发现了若干不同的T细胞亚群，各亚群都有不同的功能。例如，大多数的T细胞都具有以若干蛋白质的复合物形式存在的T细胞受体(TCR)。实际的T细胞受体由两条独立的肽链构成，它们是由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并且被称为α-TCR和β-TCR链。

γδT细胞代表一小部分T细胞，在它们的表面具有独特的T细胞受体(TCR)。在γδT细胞中，TCR由一条γ链和一条δ链构成。这一组T细胞远不如αβT细胞常见(占总T细胞的2％)。

CD3在所有成熟T细胞上表达。活化的T细胞表达4-1BB(CD137)、CD69和CD25。CD5和转铁蛋白受体也在T细胞上表达。

T细胞可进一步分为辅助细胞(CD4+T细胞)和细胞毒性T细胞(CTL、CD8+T细胞)，其中包括溶细胞性T细胞。T辅助细胞在免疫过程中协助其他白细胞，包括使B细胞成熟为浆细胞和活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞等功能。这些细胞也被称为CD4+T细胞，因为它们在其表面上表达CD4。辅助T细胞当呈递肽抗原时被抗原呈递细胞(APC)表面表达的II类MHC分子活化。一旦被活化，它们会迅速分裂并分泌称为细胞因子的小蛋白质，这些蛋白质调控或帮助主动免疫反应。

细胞毒性T细胞会破坏感染病毒的细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排斥。这些细胞又被称为CD8+T细胞，因为它们在其表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合至与I类MHC缔合的抗原来识别它们的靶标，而I类MHC几乎存在于身体每个细胞的表面。

如本文所使用，“中央记忆”T细胞(或“TCM”)是指经历过抗原的CTL，它在其表面上表达CD62L或CCR7和CD45RO，并且相较于幼稚细胞，不表达或具有减少的CD45RA表达。在特定实施方案中，相较于幼稚细胞，中央记忆细胞对CD62L、CCR7、CD25、CD127、CD45RO和CD95的表达呈阳性，并且具有减少的CD45RA表达。

如本文所使用，“效应记忆”T细胞(或“TEM”)是指经历过抗原的T细胞，相较于中央记忆细胞，该细胞在其表面上不表达或具有减少的CD62L表达，并且相较于幼稚细胞，该细胞不表达或具有减少的CD45RA表达。在特定实施方案中，相较于幼稚细胞或中央记忆细胞，效应记忆细胞对CD62L和CCR7的表达呈阴性，并且具有可变的CD28和CD45RA表达。相较于记忆或幼稚T细胞，效应T细胞对颗粒酶B和穿孔素呈阳性。

如本文所使用，“幼稚”T细胞是指未经历过抗原的T细胞，相较于中央或效应记忆细胞，该细胞表达CD62L和CD45RA，但不表达CD45RO。在特定实施方案中，幼稚CD8+T淋巴细胞的特征在于表达幼稚T细胞的表型标记物，包括CD62L、CCR7、CD28、CD127和CD45RA。

自然杀伤细胞(又称为NK细胞、K细胞和杀伤细胞)响应于干扰素或巨噬细胞源性细胞因子而活化。它们用于控制病毒感染，而适应性免疫反应产生可以清除感染的抗原特异性细胞毒性T细胞。NK细胞表达CD8、CD16和CD56，但不表达CD3。

NK细胞包括NK-T细胞。NK-T细胞是一种特殊的T细胞群体，它们表达半不变T细胞受体(TCR ab)和通常与自然杀伤细胞相关联的表面抗原。NK-T细胞促成抗细菌和抗病毒免疫反应，并促进肿瘤相关免疫监督或免疫抑制。与自然杀伤细胞一样，NK-T细胞也可以诱导穿孔素相关、Fas相关和TNF相关的细胞毒性。活化的NK-T细胞能够产生IFN-γ和IL-4。在特定实施方案中，NK-T细胞是CD3+/CD56+的。

巨噬细胞(及其前体，单核细胞)驻留于身体的每个组织中(在某些情况下为小胶质细胞、库普弗细胞(Kupffer cell)和破骨细胞形式)，在那里，它们吞噬凋亡的细胞、病原体和其他非自身组分。单核细胞/巨噬细胞表达CD11b；F4/80；CD68；CD11c；IL-4Rα；和/或CD163。

未成熟的树突状细胞(即，预活化)吞噬周边的抗原和其他非自身组分，随后以活化的形式迁移至淋巴组织的T细胞区域，在那里，它们将抗原呈递给T细胞。树突状细胞表达CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD21、CD35、CD39、CD40、CD86、CD101、CD148、CD209和DEC-205。

造血干细胞/祖细胞或HSPC是指造血干细胞和造血祖细胞的组合。

造血干细胞是指未分化的造血细胞，它们能够在体内自我更新，在体外基本上无限制的增殖，并且能够分化成所有其他造血细胞类型。

造血祖细胞是来源于造血干细胞或胎儿组织的能够进一步分化为成熟细胞类型的细胞。在某些实施方案中，造血祖细胞是CD24^loLin^-CD117⁺造血祖细胞。HPC可以分化成(i)骨髓祖细胞，该细胞最终产生单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板，或树突状细胞；或(ii)淋巴祖细胞，该细胞最终产生T细胞、B细胞和NK细胞。

相对于其他类型的造血细胞，HSPC可以对在HSPC上以较高水平表达的特定标记物呈阳性。例如，此类标记物包括CD34、CD43、CD45RO、CD45RA、CD59、CD90、CD109、CD117、CD133、CD166、HLA DR或其组合。此外，相对于其他类型的造血细胞，HSPC可对表达的标记物呈阴性。例如，此类标记物包括Lin、CD38或其组合。优选地，HSPC是CD34⁺细胞。

细胞或细胞群体对特定标记物呈“阳性”或表达特定标记物的表述是指特定标记物在细胞上或细胞中的可检测存在。当提到表面标记物时，该术语可以指通过流式细胞术，例如通过用特异性结合至该标记物的抗体染色并检测所述抗体所检测的表面表达的存在，其中染色可通过流式细胞术检测，其染色水平基本上高于在其他方面相同的条件下使用同型匹配的对照进行相同程序所检测到的染色，和/或其染色水平基本上类似于已知对该标记物呈阳性的细胞的水平，和/或其染色水平基本上高于已知对该标记物呈阴性的细胞的水平。

细胞或细胞群体对特定标记物呈“阴性”或缺乏标记物的表达的表述是指特定标记物在细胞上或细胞中基本上没有可检测的存在。当提到表面标记物时，该术语可以指通过流式细胞术，例如通过用特异性结合至该标记物的抗体染色并检测所述抗体所检测的表面表达不存在，其中染色通过流式细胞术没有检测到，其染色水平基本上高于在其他方面相同的条件下使用同型匹配的对照进行相同程序所检测到的染色，和/或其染色水平基本上低于已知对该标记物呈阳性的细胞的水平，和/或其染色水平基本上类似于已知对该标记物呈阴性的细胞的水平。

多特异性免疫细胞接合抗体构建体的实例包括结合CD33和免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)活化表位的那些，其目的是将免疫细胞带到CD33表达细胞以破坏CD33表达细胞。参见例如US 2008/0145362。此类构建体在本文中称为免疫活化多特异性构建体或I-AMS)。

(Amgen,Thousand Oaks,CA)是I-AMS的一种形式。在本公开中，可作为I-AMS的靶标以进行局部活化的免疫细胞包括例如本文较详细论述的T细胞、自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞。

T细胞活化可由两种不同的信号介导：起始抗原依赖性初级活化并提供T细胞受体样信号(初级细胞质信号传导序列)的信号和以不依赖抗原的方式起作用以提供次级或共刺激信号(次级细胞质信号传导序列)的信号。本文所公开的I-AMS可以靶向在结合后诱导T细胞活化的任何T细胞活化表位。此类T细胞活化表位的实例是T细胞标记物，包括CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、4-1BB(CD 137)、OX40、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C和B7-H3。

在特定实施方案中，CD3结合结构域包括：可变轻链(LcFv)，该可变轻链包括以下序列：

QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:162)；和可变重链(HcFv)，该可变重链包括以下序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:161)。

在特定实施方案中，CD3结合结构域(例如scFv)来源于OKT3抗体(与博纳吐单抗(blinatumomab)中使用的相同)。OKT3抗体在美国专利号5,929,212中有详细描述。它包括可变轻链，该可变轻链包括含SASSSVSYMN(SEQ ID NO:67)的CDRL1序列、含RWIYDTSKLAS(SEQ ID NO:68)的CDRL2序列和含QQWSSNPFT(SEQ ID NO:69)的CDRL3序列。在特定实施方案中，CD3 T细胞活化表位结合结构域是人或人源化结合结构域(例如scfv)，该结构域包括可变重链，该可变重链包括含KASGYTFTRYTMH(SEQ ID NO:70)的CDRH1序列、含INPSRGYTNYNQKFKD(SEQ ID NO:71)的CDRH2序列和含YYDDHYCLDY(SEQ ID NO:72)的CDRH3序列。

以下序列是保持结合CD3的能力的来源于OKT3的scFv：QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR(SEQ IDNO:73)。它也可以用作CD3结合结构域。

在特定实施方案中，CD3 T细胞活化表位结合结构域是人或人源化结合结构域(例如scfv)，该结构域包括可变轻链，该可变轻链包括含QSLVHNNGNTY(SEQ ID NO:74)的CDRL1序列、含KVS的CDRL2序列和含GQGTQYPFT(SEQ ID NO:75)的CDRL3序列。在特定实施方案中，CD3 T细胞活化表位结合结构域是人或人源化结合结构域(例如scfv)，该结构域包括可变重链，该可变重链包括含GFTFTKAW(SEQ ID NO:76)的CDRH1序列、含IKDKSNSYAT(SEQ IDNO:77)的CDRH2序列和含RGVYYALSPFDY(SEQ ID NO:78)的CDRH3序列。这些反映20G6-F3抗体的CDR序列。

在特定实施方案中，CD3 T细胞活化表位结合结构域是人或人源化结合结构域(例如scfv)，该结构域包括可变轻链，该可变轻链包括含QSLVHDNGNTY(SEQ ID NO:79)的CDRL1序列、含KVS的CDRL2序列和含GQGTQYPFT(SEQ ID NO:75)的CDRL3序列。在特定实施方案中，CD3 T细胞活化表位结合结构域是人或人源化结合结构域(例如scfv)，该结构域包括可变重链，该可变重链包括含GFTFSNAW(SEQ ID NO:80)的CDRH1序列、含IKARSNNYAT(SEQ IDNO:81)的CDRH2序列和含RGTYYASKPFDY(SEQ ID NO:82)的CDRH3序列。这些反映4B4-D7抗体的CDR序列。

在特定实施方案中，CD3 T细胞活化表位结合结构域是人或人源化结合结构域(例如scfv)，该结构域包括可变轻链，该可变轻链包括含QSLEHNNGNTY(SEQ ID NO:83)的CDRL1序列、含KVS(未包括在序列表中)的CDRL2序列和含GQGTQYPFT(SEQ ID NO:75)的CDRL3序列。在特定实施方案中，CD3 T细胞活化表位结合结构域是人或人源化结合结构域(例如scfv)，该结构域包括可变重链，该可变重链包括含GFTFSNAW(SEQ ID NO:80)的CDRH1序列、含IKDKSNNYAT(SEQ ID NO:84)的CDRH2序列和含RYVHYGIGYAMDA(SEQ ID NO:85)的CDRH3序列。这些反映4E7-C9抗体的CDR序列。

在特定实施方案中，CD3 T细胞活化表位结合结构域是人或人源化结合结构域(例如scfv)，该结构域包括可变轻链，该可变轻链包括含QSLVHTNGNTY(SEQ ID NO:86)的CDRL1序列、含KVS的CDRL2序列和含GQGTHYPFT(SEQ ID NO:87)的CDRL3序列。在特定实施方案中，CD3 T细胞活化表位结合结构域是人或人源化结合结构域(例如scfv)，该结构域包括可变重链，该可变重链包括含GFTFTNAW(SEQ ID NO:88)的CDRH1序列、含KDKSNNYAT(SEQ ID NO:89)的CDRH2序列和含RYVHYRFAYALDA(SEQ ID NO:90)的CDRH3序列。这些反映18F5-H10抗体的CDR序列。

抗CD3抗体、结合结构域和CDR的额外实例可见于WO2016/116626。也可以使用TR66。

CD28是存在于人类80％的外周T细胞上的一种表面糖蛋白，并且存在于静息和活化T细胞上。CD28与B7-1(CD80)和B7-2(CD86)结合并且是已知共刺激分子中最强效的(June等人,Immunol.Today 15:321,1994；Linsley等人Ann.Rev.Immunol.11:191,1993)。在特定实施方案中，CD28结合结构域(例如scFv)来源于CD80、CD86或9D7抗体。结合CD28的额外抗体包括9.3、KOLT-2、15E8、248.23.2和EX5.3D10。此外，1YJD提供了与有丝分裂抗体(5.11A1)的Fab片段复合的人CD28的晶体结构。

在特定实施方案中，CD28结合结构域来源于TGN1412。在特定实施方案中，TGN1412的可变重链包括：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:91)，并且TGN1412的可变轻链包括：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:92)。

在特定实施方案中，CD28结合结构域包括：可变轻链，该可变轻链包括含HASQNIYVWLN(SEQ ID NO:93)的CDRL1序列、含KASNLHT(SEQ ID NO:94)的CDRL2序列和含QQGQTYPYT(SEQ ID NO:95)的CDRL3序列；可变重链，该可变轻链包括含GYTFTSYYIH(SEQ IDNO:96)的CDRH1序列、含CIYPGNVNTNYNEK(SEQ ID NO:97)的CDRH2序列和含SHYGLDWNFDV(SEQ ID NO:98)的CDRH3序列。

在特定实施方案中，CD28结合结构域包括：可变轻链，该可变轻链包括含HASQNIYVWLN(SEQ ID NO:93)的CDRL1序列、含KASNLHT(SEQ ID NO:94)的CDRL2序列和含QQGQTYPYT(SEQ ID NO:95)的CDRL3序列；和可变重链，该可变轻链包括含SYYIH(SEQ IDNO:99)的CDRH1序列、含CIYPGNVNTNYNEKFKD(SEQ ID NO:100)的CDRH2序列和含SHYGLDWNFDV(SEQ ID NO:98)的CDRH3序列。

活化的T细胞表达4-1BB(CD137)。在特定实施方案中，4-1BB结合结构域包括：可变轻链，该可变轻链包括含RASQSVS(SEQ ID NO:101)的CDRL1序列、含ASNRAT(SEQ ID NO:102)的CDRL2序列和含QRSNWPPALT(SEQ ID NO:103)的CDRL3序列；和可变重链，该可变重链包括含YYWS(SEQ ID NO:104)的CDRH1序列、含INH的CDRH2序列和含YGPGNYDWYFDL(SEQ IDNO:105)的CDRH3序列。

在特定实施方案中，4-1BB结合结构域包括：可变轻链，该可变轻链包括含SGDNIGDQYAH(SEQ ID NO:106)的CDRL1序列、含QDKNRPS(SEQ ID NO:107)的CDRL2序列和含ATYTGFGSLAV(SEQ ID NO:108)的CDRL3序列；和可变重链，该可变重链包括含GYSFSTYWIS(SEQ ID NO:109)的CDRH1序列、含KIYPGDSYTNYSPS(SEQ ID NO:110)的CDRH2序列和含GYGIFDY(SEQ ID NO:111)的CDRH3序列。

本文公开的具体实施方案包括结合CD8上的表位的结合结构域。在特定实施方案中，CD8结合结构域(例如scFv)来源于OKT8抗体。例如，在特定实施方案中，CD8 T细胞活化表位结合结构域是人或人源化结合结构域(例如scfv)，该结构域包括可变轻链，该可变轻链包括含RTSRSISQYLA(SEQ ID NO:112)的CDRL1序列、含SGSTLQS(SEQ ID NO:113)的CDRL2序列和含QQHNENPLT(SEQ ID NO:114)的CDRL3序列。在特定实施方案中，CD8 T细胞活化表位结合结构域是人或人源化结合结构域(例如scfv)，该结构域包括可变重链，该可变重链包括含GFNIKD(SEQ ID NO:115)的CDRH1序列、含RIDPANDNT(SEQ ID NO:116)的CDRH2序列和含GYGYYVFDH(SEQ ID NO:117)的CDRH3序列。这些反映OKT8抗体的CDR序列。

在特定实施方案中，自然杀伤细胞(又称为NK细胞、K细胞和杀伤细胞)作为I-AMS的靶标以进行局部活化。NK细胞可以通过释放破坏细胞膜的颗粒来诱导细胞凋亡或细胞溶解，并且可以分泌细胞因子来招募其他免疫细胞。

在NK细胞表面表达的活化蛋白的实例包括NKG2D、CD8、CD16、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR3DS1、NKG2C、NKG2E、NKG2D和天然细胞毒性受体(NCR)家族的若干成员。在配体结合时活化NK细胞的NCR的实例包括NKp30、NKp44、NKp46、NKp80和DNAM-1。

与NK细胞受体结合并诱导和/或增强NK细胞的活化的可商购的抗体的实例包括：结合并活化NKG2D的5C6和1D11(可从

San Diego,CA获得)；结合并活化KIR2DL4的mAb 33(可从

获得)；结合并活化NKp44的P44-8(可从

获得)；结合并活化CD8的SK1；以及结合并活化CD16的3G8。

在特定实施方案中，I-AMS可以结合并阻断NK细胞抑制性受体以增强NK细胞活化。可以被结合和阻断的NK细胞抑制性受体的实例包括KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR3DL1、NKG2A和KLRG1。在特定实施方案中，结合并阻断NK细胞抑制性受体KIR2DL1和KIR2DL2/3的结合结构域包括具有序列EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKRT(SEQ ID NO:118)的可变轻链区以及具有序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVS CKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:119)的可变重链区。额外的NK细胞活化抗体描述于WO/2005/0003172和美国专利号9,415,104中。

在特定实施方案中，I-AMS靶向巨噬细胞以进行局部活化。巨噬细胞是一种可以在称为吞噬作用的过程中吞噬和消化细胞、细胞碎片和/或外来物质的白细胞(或白血细胞)。

I-AMS可以设计成与巨噬细胞表面上表达的蛋白质结合。在巨噬细胞(及其前体，单核细胞)的表面上表达的活化蛋白的实例包括CD11b、CD11c、CD64、CD68、CD119、CD163、CD206、CD209、F4/80、IFGR2、Toll样受体(TLR)1-9、IL-4Rα和MARCO。与巨噬细胞表面上表达的蛋白质结合的可商购的抗体包括：结合并活化CD11b的M1/70(可从

获得)；结合并活化CD68的KP1(可从

Cambridge，United Kingdom获得)；和结合并活化CD163的ab87099(可从

获得)。

在特定实施方案中，I-AMS可以靶向病原体识别受体(PRR)。PRR是识别危险信号并活化和/或增强先天免疫反应的蛋白质或蛋白质复合物。PRR的实例包括：识别革兰氏阴性菌的TLR4/MD-2复合物；识别真菌和其他病原体上的甘露糖部分的树突状细胞相关C型凝集素(Dectin)-1和树突状细胞相关C型凝集素-2；识别革兰氏阳性菌的TLR2/TLR6或TLR2/TLR1异二聚体；识别鞭毛蛋白的TLR5；和识别DNA中的CpG基序的TLR9(CD289)。在特定实施方案中，I-AMS可以结合并活化TLR4/MD-2、树突状细胞相关C型凝集素-1、树突状细胞相关C型凝集素-2、TRL2/TLR6、TLR2/TLR1、TLR5和/或TLR9。

在特定实施方案中，I-AMS可以靶向补体系统。补体系统是指由抗原结合抗体诱导的免疫路径并且涉及补体蛋白的信号传导，引起抗体包覆的抗原的免疫识别和清除。

I-AMS的结合结构域和本文所描述的其他工程改造形式可以通过连接子接合。连接子是可为I-AM的结合结构域之间的构象移动提供柔性和空间的一种氨基酸序列。可使用任何适当的连接子。

连接子的实例可见于Chen等人,Adv Drug Deliv Rev.2013年10月15日；65(10):1357–1369。取决于对靶标的所需功能结构域呈递，连接子可以是柔性的、刚性的或半刚性的。

常用的柔性连接子包括具有氨基酸甘氨酸和丝氨酸的连接子序列(Gly-Ser连接子)。在特定实施方案中，连接子序列包括甘氨酸和丝氨酸重复序列集合，例如(Gly_xSer_y)_n(SEQ ID NO:120)的一个至十个重复序列，其中x和y独立地是从0至10的整数，条件是x和y不同时为0，并且其中n是整数1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。具体实例包括(Gly₄Ser)_n(SEQ IDNO:121)、(Gly₃Ser)_n(Gly₄Ser)_n(SEQ ID NO:122)、(Gl_y3Ser)_n(Gly₂Ser)_n(SEQ ID NO:123)和(Gly₃Ser)_n(Gly₄Ser)₁(SEQ ID NO:124)。在特定实施方案中，连接子是(Gly₄Ser)₄(SEQID NO:125)、(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO:126)、(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO:127)、(Gly₄Ser)₁(SEQID NO:128)、(Gly₃Ser)₂(SEQ ID NO:129)、(Gly₃Ser)₁(SEQ ID NO:130)、(Gly₂Ser)₂(SEQID NO:131)或(Gly₂Ser)₁、GGSGGGSGGSG(SEQ ID NO:132)、GGSGGGSGSG(SEQ ID NO:133)或GGSGGGSG(SEQ ID NO:134)。

也可使用包括一个或多个抗体铰链区和/或免疫球蛋白重链恒定区的连接子，如单独的CH3或CH2CH3序列。

在一些情况下，柔性连接子可能无法维持特定用途所需的结合结构域的距离或定位。在这些情况下，刚性或半刚性连接子可能是有用的。刚性或半刚性连接子的实例包括富含脯氨酸的连接子。在特定实施方案中，富含脯氨酸的连接子是具有比预期仅偶然出现的残基要多的脯氨酸残基的肽序列。在特定实施方案中，富含脯氨酸的连接子是具有至少30％、至少35％、至少36％、至少39％、至少40％、至少48％、至少50％或至少51％的脯氨酸残基的连接子。富含脯氨酸的连接子的具体实例包括富含脯氨酸的唾液蛋白(PRP)的片段。

I-AMS分子的细胞溶解特性可以在体外比较测定中得到证实。简单点说，对于细胞系实验，靶标癌细胞可以在存在/不存在健康供体T细胞(以1:1和3:1的E:T细胞比使用)的情况下，在含有递增浓度的各种I-AMS抗体(例如CD33/CD3 I-AMS，包括CD33-CD3双特异性抗体(BsAb))的96孔圆底板中以5-10,000个细胞/孔培育。48小时后，可以通过流式细胞术，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)检测无活力细胞来确定细胞数量和药物诱导的细胞毒性。在添加健康供体T细胞的实验中，可以通过CellVue勃艮第染料(Burgundy dye)的正向/侧向散射特性及阴性来鉴别癌细胞。实验可以包括技术重复。

在包括I-AMS构建体的特定实施方案中，当与已知TCR的V_α、V_β、C_α或C_β相比较时，T细胞活化表位结合结构域包括一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)或上述变化的组合。插入、缺失或取代可以在V_α、V_β、C_α或C_β区域中的任何位置，包括在这些区域的氨基末端或羧基末端或两端，条件是每个CDR包括零变化或至多一个、两个或三个变化并且包括经过修饰的V_α、V_β、C_α或C_β区域的结合结构域仍然可以按类似于野生型的亲和力特异性结合其靶标。

在特定实施方案中，使用由5'RACE(cDNA末端快速克隆)克隆得到的可变区CD33抗体序列和来自CD33-CD3 BsAb的CD3序列，可以用重叠Gibson组装相容末端，通过将每个scFv合成为DNA片段，来组装呈经典

抗体格式的双特异性分子。可以在配对的可变结构域之间使用原型插入区，例如(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO:126)连接子，以及在两个scFv之间使用短Gly₄Ser(SEQ ID NO:128)连接子。

抗CD33三特异性抗体是同时结合至三种不同类型的抗原的人工蛋白质，其中至少一种抗原是CD33。三特异性抗体描述于例如WO 2016/105450、WO 2010/028796、WO 2009/007124、WO 2002/083738、US 2002/0051780和WO 2000/018806中。

(iv)配制物.呈任何示例性形式的本文所描述的任何抗体都可以单独或组合配制成组合物以施用给受试者。抗体的盐和/或前药也可以使用。

药学上可接受的盐包括保留抗体活性并且可接受用于医药用途的任何盐。药学上可接受的盐还指可由于施用酸、另一种盐或转化为酸或盐的前药而在体内形成的任何盐。

适合的药学上可接受的酸加成盐可由无机酸或有机酸制备。所述无机酸的实例有盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。适合的有机酸可以选自脂肪族类、脂环族类、芳香族类、芳基脂肪族类、杂环类、羧酸类和磺酸类有机酸。

适合的药学上可接受的碱加成盐包括由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制得的金属盐或由N,N'-二苯甲基乙二胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、赖氨酸和普鲁卡因制得的有机盐。

前药包括在施用后例如通过裂解或通过生物不稳定基团的水解而转化为治疗活性化合物的活性成分。

在特定实施方案中，组合物包括占该组合物至少0.1％w/v或w/w；占该组合物至少1％w/v或w/w；占该组合物至少10％w/v或w/w；占该组合物至少20％w/v或w/w；占该组合物至少30％w/v或w/w；占该组合物至少40％w/v或w/w；占该组合物至少50％w/v或w/w；占该组合物至少60％w/v或w/w；占该组合物至少70％w/v或w/w；占该组合物至少80％w/v或w/w；占该组合物至少90％w/v或w/w；占该组合物至少95％w/v或w/w；或占该组合物至少99％w/v或w/w的抗体。

常用的示例性药学上可接受的载剂包括任何和所有吸收延迟剂、抗氧化剂、粘合剂、缓冲剂、增积剂或填充剂、螯合剂、包衣、崩解剂、分散介质、凝胶、等渗剂、润滑剂、防腐剂、盐、溶剂或助溶剂、稳定剂、表面活性剂和/或递送媒剂。

示例性抗氧化剂包括抗坏血酸、甲硫氨酸和维生素E。

示例性缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、反丁烯二酸盐缓冲剂、葡糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和/或三甲胺盐。

示例性螯合剂是乙二胺-四乙酸(EDTA)。

示例性等渗剂包括多元糖醇，包括三元或更高级糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。

示例性防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、苯扎卤铵(benzalkonium halides)、氯化六烃季铵(hexamethonium chloride)、对羟基苯甲酸烷酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。

稳定剂是指一类范围广泛的赋形剂，其功能范围从增积剂到溶解抗体或有助于防止变性或粘附到容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以包括多元糖醇；氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油和环醇，例如肌醇；PEG；氨基酸聚合物；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即，<10个残基)；蛋白质，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，例如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖，例如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖，例如棉子糖；以及多糖，例如葡聚糖。基于治疗剂重量，稳定剂通常以0.1至10,000重量份的范围存在。

本文所公开的组合物可配制成通过例如注射、吸入、输注、灌注、灌洗或摄入来施用。本文所公开的组合物还可被配制成用于静脉内、皮内、动脉内、结内、淋巴管内、腹膜内、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、表面、鞘内、肿瘤内、肌肉内、囊内、口服、舌下和/或皮下施用。

对于注射，可将组合物配制成水溶液形式，如在包括汉克斯氏溶液(Hanks'solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理盐水在内缓冲液中的水溶液。水溶液可包括配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，配制物可呈冻干和/或粉末形式，以便在使用前用适合的媒剂，例如无菌无热原水复原。

对于口服施用，组合物可被配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等形式。对于口服固体配制物，如粉剂、胶囊剂和片剂，适合的赋形剂包括粘合剂(黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶)；填充剂，如糖，例如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇；磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁；纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；造粒剂；以及粘合剂。必要时，可添加崩解或溶解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或褐藻酸或其盐，如褐藻酸钠。必要时，可以使用标准技术对固体剂型包覆糖衣或包覆肠溶衣。也可使用调味剂，如胡椒薄荷、冬青油、樱桃味调味剂、橙味调味剂等。

组合物可以配制成气雾剂形式。在特定实施方案中，气雾剂是作为无水、液体或干粉吸入剂的一部分提供。来自加压包装或雾化器的气雾剂喷雾也可以与适合的推进剂一起使用，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单元可通过提供阀以递送定计量的量来确定。还可以配制包括组合物与适合粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物的在吸入器或吹入器中使用的明胶胶囊和药筒。

组合物也可被配制成积存式制剂形式。积存式制剂可用适合的聚合或疏水性材料(例如配制为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制为微溶性衍生物，例如配制为微溶性盐。

另外，可利用包括至少一种类型抗体的半渗透性固体聚合物基质将组合物配制成持续释放系统形式。各种持续释放材料已被确定并且是本领域普通技术人员众所周知的。持续释放系统可取决于其化学性质而在施用后数周至超过100天内释放一种或多种抗体。积存式制剂可以通过注射；肠胃外注射；滴注；或植入软组织、体腔或有时通过细针注射到血管中来施用。

积存式制剂可以包括多种生物可蚀性聚合物，包括聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(己内酯)以及具有所希望的丙交酯:乙交酯比率、平均分子量、多分散性和末端基团化学性质的聚(丙交酯)-共(乙交酯)(PLG)。使用各种等级以不同比例共混合不同聚合物类型可得到来自各组成聚合物的特征。

使用不同的溶剂(例如二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、三醋精、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、苯酚或它们的组合)可以改变微粒的大小和结构以调节释放特征。其他有用的溶剂包括水、乙醇、二甲亚砜(DMSO)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、丙酮、甲醇、异丙醇(IPA)、苯甲酸乙酯和苯甲酸苯甲酯。

示例性的释放调节剂可以包括表面活性剂、洗涤剂、内相增粘剂、络合剂、表面活性分子、助溶剂、螯合剂、稳定剂、纤维素衍生物、(羟丙基)甲基纤维素(HPMC)、乙酸(羟丙基)甲基纤维素、乙酸纤维素、普朗尼克(pluronics)(例如F68/F127)、聚山梨醇酯、

(Croda Americas,Wilmington,Delaware)、聚乙烯醇(PVA)、

(Croda Americas,Wilmington,Delaware)、蔗糖乙酸异丁酸酯(SAIB)、盐和缓冲剂。

分配至微粒的外相边界的赋形剂，例如表面活性剂，包括聚山梨醇酯、二辛基磺基琥珀酸酯、泊洛沙姆(poloxamers)、PVA，也可以通过有利的方式改变特性，包括粒子稳定性和侵蚀速率、水合作用和通道结构、界面传输和动力学。

所公开的持续释放积存式配制物的额外处理可以使用在如Tris、柠檬酸盐或组氨酸等缓冲剂中的稳定赋形剂，包括甘露糖醇、蔗糖、海藻糖和甘氨酸，以及其他组分如聚山梨醇酯、PVA和磺基琥珀酸二辛酯。冷冻-干燥循环也可用于制造水分含量极低的粉末，这些粉末可复原为与原始悬浮液类似的大小和性能特征。

本文所公开的任何组合物可有利地包括任何其他药学上可接受的载剂，所述载剂包括不会产生明显不良反应、过敏或其他超过施用益处的不合宜反应的那些载剂。示例性药学上可接受的载剂和配制物公开于Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Printing Company,1990中。此外，可根据美国FDA生物标准处(U.S.FDA Office ofBiological Standards)和/或其他相关外国监管机构的要求，制备满足无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准的配制物。

(v)免疫细胞样本收集和细胞富集.以上描述了免疫细胞的类型。本公开描述了被基因修饰成表达重组蛋白如双特异性抗体的细胞。根据本公开的教导进行基因修饰的细胞可以是患者来源的细胞(自体细胞)，或者在适当时可以是同种异体细胞。

样本收集和富集方法是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，细胞来源于细胞系。在一些实施方案中，细胞是获自异种来源，例如获自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或猪。在特定实施方案中，细胞来源于人。

在一些实施方案中，T细胞来源于或分离自样本，例如全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检样本、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由此得到的细胞。在特定实施方案中，来自受试者的循环血液的细胞是例如通过单采血液成分法或白细胞去除术获得。在特定实施方案中，样本含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、HSC、HPC、HSPC、红细胞和/或血小板，并且在某些方面，含有除红细胞和血小板以外的细胞，并需要进一步处理。

在一些实施方案中，对从受试者收集的血细胞进行洗涤，例如以去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在特定实施方案中，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一些实施方案中，洗涤溶液不含钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。根据制造商的说明，可以使用半自动“流通”离心机(例如Cobe2991细胞处理器，Baxter)完成洗涤。也可以执行切向流过滤(TFF)。在特定实施方案中，细胞可以在洗涤后再悬浮于多种生物相容性缓冲液中，例如不含Ca++/Mg++的PBS。

分离可以包括各种细胞制备和分离步骤中的一者或多者，包括基于一种或多种特性，如大小、密度、敏感性或对特定试剂的抗性和/或对抗体或其他结合搭配物的亲和力，例如免疫亲和力进行的分离。在特定实施方案中，使用相同的装置或设备在单一工艺流中依序和/或同时进行分离。在特定实施方案中，不同群体的分离、培养和/或工程改造是由相同的起始组合物或材料，例如由相同的样本进行的。

在特定实施方案中，可以通过使用基于密度的细胞分离方法和相关方法来富集样本中的T细胞。例如，通过溶解红细胞并用Percoll或Ficoll梯度离心样本，可以将白细胞与外周血中的其他细胞类型分离。

在特定实施方案中，可以使用未富集特定T细胞类型的整体T细胞群体。在特定实施方案中，选定的T细胞类型可以根据基于细胞标记物进行的正选择和/或负选择进行富集和/或分离。在正选择中，结合有细胞标记物的细胞被保留下来以供进一步使用。在负选择中，未被捕获剂结合的细胞，例如针对细胞标记物的抗体被保留下来以供进一步使用。在一些实例中，两个部分可以被保留下来以供进一步使用。

分离不需要引起特定细胞群体或表达特定标记物的细胞的100％富集或去除。例如，特定类型细胞的正选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要完全不存在不表达标记物的细胞。同样，特定类型细胞的负选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要所有此类细胞的完全去除。

在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的经历正选择或负选择的部分经历另一个分离步骤，例如随后的正选择或负选择。

在一些实施方案中，针对细胞标记物的抗体或结合结构域与固体支撑物或基质如磁珠或顺磁珠结合，以允许分离细胞用于正选择和/或负选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术分开或分离细胞和细胞群体(评述于Methods inMolecular Medicine,第58卷:Metastasis Research Protocols,第2卷:Cell BehaviorIn Vitro and In Vivo,第17-25页,编辑:S.A.Brooks和U.Schumacher

Humana PressInc.,Totowa,NJ中)；另参见US 4,452,773、US 4,795,698、US 5,200,084和EP 452342。

在一些实施方案中，基于亲和力的选择是通过磁活化细胞分选(MACS)进行(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)。MACS系统能够高纯度选择附着有磁化粒子的细胞。在某些实施方案中，MACS以在施加外部磁场后依序洗脱非靶标物质和靶标物质的模式操作。也就是说，附着于磁化粒子上的细胞保持在适当的位置，而未附着的物质被洗脱。然后，在完成此第一洗脱步骤后，被截留在磁场中并被阻止洗脱的物质以某种方式释放，由此使它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，非靶标细胞被标记并从异质细胞群体中耗尽。

在一些实施方案中，本文所描述的细胞群体是通过流式细胞术进行收集和富集(或耗尽)，其中针对多种细胞表面标记物染色的细胞被携带于流体流中。在一些实施方案中，本文所描述的细胞群体是通过制备规模的(FACS)-分选进行收集和富集(或耗尽)。在某些实施方案中，本文所描述的细胞群体是通过使用微机电系统(MEMS)芯片与基于FACS的检测系统进行收集和富集(耗尽)(参见例如WO 2010/033140；Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355—376)。在这两种情况下，细胞可以用多种标记物进行标记，由此允许以高纯度分离充分确定的细胞亚群。

以上描述了用于不同T细胞亚群的细胞标记物。在特定实施方案中，T细胞的特定亚群，例如对一种或多种表面标记物呈阳性或高水平表达一种或多种表面标记物的细胞是通过正选择或负选择技术分离，所述表面标记物例如为CCR7、CD45RO、CD8、CD27、CD28、CD62L、CD127、CD4和/或CD45RA T细胞。

CD3+,CD28+T细胞可以通过抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如

M-450CD3/CD28T细胞扩增剂)进行正选择和扩增。

在特定实施方案中，使用了CD8+或CD4+选择步骤来分离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。此类CD8+和CD4+群体可通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高的程度表达的标记物进行正选择或负选择而进一步分选成亚群。

在一些实施方案中，进行中央记忆T(TCM)细胞的富集。在特定实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的两个CD62L亚群中。PBMC可以例如通过使用抗CD8和抗CD62L抗体富集或耗尽CD62L、CD8和/或CD62L+CD8+部分。

在一些实施方案中，中央记忆T(TCM)细胞的富集是基于CCR7、CD45RO、CD27、CD62L、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达量；在某些方面，它是基于对表达或高水平表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的负选择。在一些方面，富集TCM细胞的CD8+群体的分离是通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞以及对表达CCR7、CD45RO和/或CD62L的细胞进行阳性选择或富集来进行。在一方面，中央记忆T(TCM)细胞的富集是以基于CD4表达选择的阴性细胞部分开始进行，所述细胞经历基于CD14和CD45RA表达进行的负选择和基于CD62L进行的正选择。这种选择在一些方面是同时进行的，而在其他方面是按任一次序依序进行的。在一些方面，用于制备CD8+细胞群体或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也被用于产生CD4+细胞群体或亚群，由此使得由基于CD4的分离得到阳性和阴性部分两者任选地在一个或多个另外的正选择或负选择步骤之后被保留下来。

在一个特定实例中，PBMC样本或其他白细胞样本经历CD4+细胞的选择，其中阴性和阳性部分都被保留。然后，基于CD14和CD45RA或RORl的表达对阴性部分进行负选择，并根据中央记忆T细胞的标记物特征如CCR7、CD45RO和/或CD62L进行正选择，其中正选择和负选择以任一次序进行。

在特定实施方案中，细胞富集得到大量经历CD8+FAC分选的细胞群体。

其他细胞类型可以基于已知的标记物谱和技术进行富集。例如，CD34+HSC、HSP和HSPC可以使用与磁性粒子直接或间接缀合的抗CD34抗体以及磁性细胞分离器(例如

细胞分离系统(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany))进行富集。

(vi)对细胞群体进行基因修饰以表达重组蛋白.可通过本领域已知的任何方法将编码本文所公开的重组蛋白的所希望基因引入细胞中，包括转染、电穿孔、显微注射、脂转染、磷酸钙介导的转染、用包括该基因序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合、体内纳米粒子介导的递送等。本领域已知许多用于将外来基因引入细胞中的技术(参见例如Loeffler和Behr,1993,Meth.Enzymol.217:599-618；Cohen等人,1993,Meth.Enzymol.217:618-644；Cline,1985,Pharmac.Ther.29:69-92)并且这些技术都可以使用，条件是受体细胞的必要发育和生理功能没有被过度破坏。所述技术可以将基因稳定地转移至细胞中，由此使基因可以被细胞表达，并且在某些情况下，优选地可以被其细胞后代遗传和表达。

术语“基因”是指编码本文所公开的重组蛋白的核酸序列(可与多核苷酸或核苷酸序列互换使用)。这一定义包括各种序列多态性、突变和/或序列变体，其中此类改变基本上不会影响所编码的CAR的功能。术语“基因”不仅可以包括编码序列，而且还可以包括调控区，如启动子、增强子和终止区。所述术语还可包括从mRNA转录物剪接的所有内含子和其他DNA序列，以及由替代性剪接位点产生的变体。编码分子的基因序列可以是指导嵌合分子表达的DNA或RNA。这些核酸序列可以是转录成RNA的DNA链序列或翻译成蛋白质的RNA序列。核苷酸序列包括全长核苷酸序列以及来源于全长蛋白质的非全长序列两者。所述序列还可包括天然序列的简并密码子或可被引入以在特定免疫细胞中提供密码子偏好的序列。正如本领域普通技术人员所理解的，本公开通篇参考了完整基因序列的部分。

本文提供了编码重组蛋白的基因序列，并且还可以通过合成或重组方法，由相关氨基酸序列和本文所提供的其他描述容易地制备。在实施方案中，编码这些序列中任一者的基因序列也可以在编码序列的5'和/或3'端具有一个或多个限制酶位点，以便能将编码该序列的基因序列容易地切除以及用编码不同序列的另一个基因序列置换。在实施方案中，可以对编码序列的基因序列进行密码子优化以使其在哺乳动物细胞中表达。

“编码”是指基因中的特定核苷酸序列(如cDNA或mRNA)用作合成其他大分子(如确定的氨基酸序列)的模板的特性。因此，如果转录和翻译对应于该基因的mRNA在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。“编码蛋白质的基因序列”包括彼此互为简并形式并且编码相同的氨基酸序列或具有基本上类似的形式和功能的氨基酸序列的所有核苷酸序列。

“载体”是能够转运另一个核酸的核酸分子。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒或噬菌体。“表达载体”是当存在于适当环境中时能够指导由该载体所携带的一个或多个基因编码的蛋白质的表达的载体。

“慢病毒”是指能够感染分裂细胞和非分裂细胞的逆转录病毒属。慢病毒的几个实例包括HIV(人免疫缺陷病毒：包括HIV 1型和HIV 2型)；马感染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。

“逆转录病毒”是具有RNA基因组的病毒。“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科的一个属。示例性γ逆转录病毒包括小鼠干细胞病毒、鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮组织增生病毒。

可使用逆转录病毒载体(参见Miller等人,1993,Meth.Enzymol.217:581-599)。在此类实施方案中，将待表达的基因克隆至逆转录病毒载体中以将其递送至细胞中。在特定实施方案中，逆转录病毒载体包括病毒基因组包装和整合所必需的所有顺式作用序列，即，(a)在载体两端的长末端重复序列(LTR)或其部分；(b)用于负链和正链DNA合成的引物结合位点；以及(c)将基因组RNA并入病毒粒子所必需的包装信号。关于逆转录病毒载体的更多细节可见于Boesen等人,1994,Biotherapy 6:291-302；Clowes等人,1994,J.Clin.Invest.93:644-651；Kiem等人,1994,Blood 83:1467-1473；Salmons和Gunzberg,1993,Human Gene Therapy 4:129-141；以及Grossman和Wilson,1993,Curr.Opin.inGenetics and Devel.3:110-114。腺病毒、腺相关病毒(AAV)和甲病毒也可以使用。参见Kozarsky和Wilson,1993,Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503；Rosenfeld等人,1991,Science 252:431-434；Rosenfeld等人,1992,Cell 68:143-155；Mastrangeli等人,1993,J.Clin.Invest.91:225-234；Walsh等人,1993,Proc.Soc.Exp.Bioi.Med.204:289-300；和Lundstrom,1999,J.Recept.SignalTransduct.Res.19:673-686。其他基因递送方法包括使用哺乳动物人工染色体(Vos,1998,Curr.Op.Genet.Dev.8:351-359)；脂质体(Tarahovsky和Ivanitsky,1998,Biochemistry(Mosc)63:607-618)；核酶(Branch and Klotman,1998,Exp.Nephrol.6:78-83)；和三联体DNA(Chan和Glazer,1997,J.Mol.Med.75:267-282)。

有大量可用病毒载体适合本公开，包括那些被鉴别用于人基因疗法应用的病毒载体(参见Pfeifer和Verma,2001,Ann.Rev.Genomics Hum.Genet.2:177)。使用逆转录病毒和慢病毒病毒载体的方法以及用包括转基因的病毒粒子转导哺乳动物宿主细胞的包装细胞描述于例如US 8,119,772；Walchli等人,2011,PLoS One 6:327930；Zhao等人,2005,J.Immunol.174:4415；Engels等人,2003,Hum.Gene Ther.14:1155；Frecha等人,2010,Mol.Ther.18:1748；和Verhoeyen等人,2009,Methods Mol.Biol.506:97。逆转录病毒和慢病毒载体构建体和表达系统也为可商购的。

也可以使用靶向基因工程改造方法。CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关蛋白)核酸酶系统是一种用于基因工程改造的经过工程改造的核酸酶系统，该系统是基于细菌系统。关于CRISPR-Cas系统及其组分的信息描述于例如US8697359、US8771945、US8795965、US8865406、US8871445、US8889356、US8889418、US8895308、US8906616、US8932814、US8945839、US8993233和US8999641以及其相关申请；以及WO2014/018423、WO2014/093595、WO2014/093622、WO2014/093635、WO2014/093655、WO2014/093661、WO2014/093694、WO2014/093701、WO2014/093709、WO2014/093712、WO2014/093718、WO2014/145599、WO2014/204723、WO2014/204724、WO2014/204725,WO2014/204726、WO2014/204727、WO2014/204728、WO2014/204729、WO2015/065964、WO2015/089351、WO2015/089354、WO2015/089364、WO2015/089419、WO2015/089427、WO2015/089462、WO2015/089465、WO2015/089473和WO2015/089486、WO2016205711、WO2017/106657、WO2017/127807以及其相关申请。

特定实施方案利用锌指核酸酶(ZFN)作为基因编辑剂。ZFN是一类被工程改造成在特定位置处结合并裂解DNA的位点特异性核酸酶。ZFN被用于在DNA序列的特定位点处引入双链断裂(DSB)，由此使得ZFN能够靶向多种不同细胞中的基因组内的独特序列。有关ZFN和在本公开的教导内有用的ZFN的附加信息，参见例如US 6,534,261；US 6,607,882；US 6,746,838；US 6,794,136；US 6,824,978；6,866,997；US 6,933,113；6,979,539；US 7,013,219；US 7,030,215；US 7,220,719；US 7,241,573；US 7,241,574；US 7,585,849；US 7,595,376；US 6,903,185；US 6,479,626；US 2003/0232410和US 2009/0203140，以及Gaj等人,Nat Methods,2012,9(8):805-7；Ramirez等人,Nucl Acids Res,2012,40(12):5560-8；Kim等人,Genome Res,2012,22(7):1327-33；Urnov等人,Nature Reviews Genetics,2010,11:636-646；Miller等人,Nature biotechnology 25,778-785(2007)；Bibikova等人,Science 300,764(2003)；Bibikova等人,Genetics 161,1169-1175(2002)；Wolfe等人,Annual review of biophysics and biomolecular structure 29,183-212(2000)；Kim等人,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 93,1156-1160(1996)；和Miller等人,The EMBO journal 4,1609-1614(1985)。

特定实施方案可使用转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)作为基因编辑剂。TALEN是指包括转录活化因子样效应物(TALE)DNA结合蛋白和DNA裂解结构域的融合蛋白。TALEN被用于通过在DNA中诱导双重DSB，由此诱导细胞中的修复机制来编辑基因和基因组。一般来说，两个TALEN必须结合并侧接在DNA裂解结构域的靶标DNA位点的两侧以进行二聚化并诱导DSB。有关TALEN的更多信息，参见US 8,440,431、US 8,440,432、US 8,450,471、US8,586,363和US 8,697,853；以及Joung和Sander,Nat Rev Mol Cell Biol,2013,14(l):49-55；Beurdeley等人,Nat Commun,2013,4:1762；Scharenberg等人,Curr Gene Ther,2013,13(4):291-303；Gaj等人,Nat Methods,2012,9(8):805-7；Miller等人,Naturebiotechnology 29,143-148(2011)；Christian等人,Genetics 186,757-761(2010)；Boch等人,Science 326,1509-1512(2009)；以及Moscou和Bogdanove,Science 326,1501(2009)。

特定实施方案可利用MegaTAL作为基因编辑剂。MegaTAL具有单链稀有裂解核酸酶结构，其中TALE与大范围核酸酶的DNA裂解结构域融合。大范围核酸酶，又称为归巢核酸内切酶，是在同一结构域中同时具有DNA识别和核酸酶功能的单肽链。与TALEN相比，megaTAL只需要递送单一肽链来获得功能活性。

已经描述了对靶标细胞类型进行选择性体内基因修饰的纳米粒子并且这些纳米粒子可以在本公开的教导中使用。在特定实施方案中，纳米粒子可以是在WO2014153114、WO2017181110和WO201822672中描述的那些。

(vii)细胞活化培养条件.细胞群体可以在培养起始组合物中培育，以扩增经过基因修饰的细胞群体。培育可以在培养容器中进行，如袋子、细胞培养板、烧瓶、腔室、色谱柱、交联凝胶、交联聚合物、柱、培养皿、中空纤维、微量滴定板、涂有二氧化硅的玻璃板、试管、管组、孔、小瓶或其他用于培养或栽培细胞的容器。

培养条件可以包括以下中的一者或多者：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂，例如营养物、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，如细胞因子、趋化因子、抗原、结合搭配物、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他被设计用于活化细胞的试剂。

在一些方面，培育是根据如以下中所描述的技术进行：US 6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。

用于培养T细胞的示例性培养基包括(i)补充有非必需氨基酸、丙酮酸钠和青霉素/链霉素的RPMI；(ii)含HEPES、5-15％人血清、1-3％L-谷氨酰胺、0.5-1.5％青霉素/链霉素和0.25×10-4-0.75×10-4Mβ-巯基乙醇的RPMI；(iii)补充有10％胎牛血清(FBS)、2mML-谷氨酰胺、10mM HEPES、100U/ml青霉素和100m/mL链霉素的RPMI-1640；(iv)补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、100U/ml青霉素和100m/mL链霉素的DMEM培养基；(v)补充有5％人AB血清(Gemcell,West Sacramento,CA)、1％HEPES(Gibco,Grand Island,NY)、1％青霉素-链霉素(Gibco)、1％GlutaMax(Gibco)、和2％N-乙酰半胱氨酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的X-Vivo 15培养基(Lonza,Walkersville,MD)。T细胞培养基也可从Hyclone(Logan,UT)商购。下文更详细地描述了可以添加至这些培养基中的其他T细胞活化组分。

在一些实施方案中，通过向培养起始组合物中添加饲养细胞，如非分裂外周血单核细胞(PBMC)(例如以使所得到的细胞群体含有待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞至少5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；并培育培养物(例如保持足以扩增T细胞的数量的时间)来扩增T细胞。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包括经过γ照射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，将PBMC用3000至3600rad范围内的γ射线照射以防止细胞分裂。在一些方面，饲养细胞是在添加T细胞群体之前添加至培养基中。

任选地，培育还可包括添加经过EBV转化的非分裂类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。LCL可以用6000至10,000rad范围内的γ射线照射。在一些方面，LCL饲养细胞是以任何适合的量提供，如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少10:1。

在一些实施方案中，刺激条件包括适于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少25℃、至少30℃或37℃。

在特定实施方案中，T细胞活化培养条件可以包括T细胞刺激表位。T细胞刺激表位包括CD3、CD27、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8、CD28、CD30、CD40、CD56、CD83、CD90、CD95、4-1BB(CD137)、B7-H3、CTLA-4、卷曲-1(FZD1)、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、HVEM、ICOS、IL-1R、LAT、LFA-1、LIGHT、MHCI、MHCII、NKG2D、OX40、ROR2和RTK。

CD3是T细胞受体的主要信号转导元件。如先前所述，CD3在所有成熟T细胞上都有表达。在特定实施方案中，CD3刺激分子(即，CD3结合结构域)可以来源于OKT3抗体(参见US5,929,212；US 4,361,549；

CRL-8001^TM；和Arakawa等人,J.Biochem.120,657-662(1996))、20G6-F3抗体、4B4-D7抗体、4E7-C9或18F5-H10抗体。

在特定实施方案中，CD3刺激分子可以至少0.25或0.5ng/ml的浓度或以2.5–10μg/ml的浓度包括在培养基中。特定实施方案利用了5μg/ml的CD3刺激分子(例如OKT3)。

在特定实施方案中，与avi标签缔合的活化分子可以被生物素化并结合至链霉抗生物素蛋白珠粒。这一方法可用于产生例如可去除的T细胞表位刺激活化系统。

CD28的示例性结合结构域可以包括或来源于TGN1412、CD80、CD86或9D7抗体。结合CD28的额外抗体包括9.3、KOLT-2、15E8、248.23.2、EX5.3D10和CD28.3(以合成单链Fv构建体形式保藏，GenBank登录号AF451974.1；另参见Vanhove等人,BLOOD,2003年7月15日,第102卷,第2号,第564-570页)。此外，1YJD提供了与有丝分裂抗体(5.11A1)的Fab片段复合的人CD28的晶体结构。在特定实施方案中，选择不与9D7竞争的抗体。

4-1BB结合结构域可以来源于LOB12、IgG2a、LOB12.3或IgG1，如Taraban等人,EurJ Immunol.2002年12月；32(12):3617-27所描述。在特定实施方案中，4-1BB结合结构域来源于US 9,382,328中所描述的单克隆抗体。额外的4-1BB结合结构域描述于US 6,569,997；US 6,303,121；和Mittler等人,Immunol Res.2004；29(1-3):197-208中。

OX40(CD134)和/或ICOS活化也可以使用。OX40结合结构域描述于US20100196359、US 20150307617、WO 2015/153513、WO2013/038191；以及Melero等人,Clin CancerRes.2013年3月1日；19(5):1044-53中。可以结合和活化ICOS的示例性结合结构域描述于例如US20080279851；Deng等人,Hybrid Hybridomics.2004年6月；23(3):176-82中。

当呈可溶形式时，T细胞活化剂可以与另一个分子，例如与聚乙二醇(PEG)分子偶合。可以使用任何适合的PEG分子。通常，分子量是至多1000Da的PEG分子可溶于水或培养基中。在一些情况下，此类基于PEG的试剂可以使用可商购的活化PEG分子(例如可从NOFNorth America Corporation,Irvine,Calif.,USA获得的PEG-NHS衍生物或可从CreativePEGWorks,Chapel Hills,N.C.,USA获得的活化PEG衍生物)制备。

在特定实施方案中，细胞刺激剂被固定于固相上，在培养基内。在特定实施方案中，固相是培养容器(例如袋子、细胞培养板、腔室、色谱柱、交联凝胶、交联聚合物、柱、培养皿、中空纤维、微量滴定板、涂有二氧化硅的玻璃板、试管、管组、孔、小瓶、用于培养或栽培细胞的其他结构或容器)的表面。

在特定实施方案中，可以将固相添加至培养基中。此类固相可以包括例如珠粒、中空纤维、树脂、膜和聚合物。

示例性珠粒包括磁珠、聚合物珠粒和树脂珠粒(例如Strep-

Sepharose、Strep-

Superflow和Strep-

MacroPrep IBA GmbH,Gottingen))。抗CD3/抗CD28珠粒是用于T细胞扩增的可商购的试剂(Invitrogen)。这些珠粒是均一的、4.5μm超顺磁性、无菌、无热原质聚苯乙烯珠粒，涂有针对人T细胞上的CD3和CD28细胞表面分子的亲和纯化的单克隆抗体混合物。中空纤维可从TerumoBCT Inc.(Lakewood,Colo.,USA)获得。树脂包括金属亲和色谱(IMAC)树脂(例如

树脂(Westburg,Leusden))。膜包括纸以及色谱基质的膜基底(例如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜)。

示例性聚合物包括多糖，例如多糖基质。此类基质包括琼脂糖凝胶(例如可商购的Superflow^TM琼脂糖或

材料，例如Superflow^TM

具有不同的珠粒和孔径)或交联葡聚糖凝胶。另一个说明性实例是一种颗粒状交联琼脂糖基质，有葡聚糖共价键合至该基质上，可以

或

商购(呈各种珠粒大小和各种孔径)，均得自GE Healthcare。

可以使用的合成聚合物包括聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、多糖和琼脂糖的共聚物(例如聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物)或多糖和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺。葡聚糖和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物的一个实例是

(Pharmacia Fine Chemicals,Inc.,Piscataway,NJ)系列材料。

特定实施方案可以利用与合成或天然聚合物偶合的二氧化硅粒子，如多糖接枝的二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮接枝的二氧化硅、聚氧化乙烯接枝的二氧化硅、聚(2-羟乙基天冬酰胺)二氧化硅和聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝的二氧化硅。

细胞活化剂可以通过共价键固定于固相上或可以通过非共价连接可逆地固定。

在特定实施方案中，T细胞活化培养基包括在具有HEPES、5-15％人血清、1-3％L-谷氨酰胺、0.5-1.5％青霉素/链霉素、0.25×10-4-0.75×10^-4Mβ-巯基乙醇并且个别地包括5-15ng/μl(例如10ng/μl)的IL-7、IL-15和IL-21的RPMI中培养的经过FACS分选的T细胞群体。培养是在平底孔板上进行，其中每孔平板接种0.1-0.5×10e6个细胞。在活化后第3天，将细胞转移至TC处理的板上。

在特定实施方案中，T细胞活化培养基包括在具有HEPES、10％人血清、2％L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、0.5×10^-4Mβ-巯基乙醇并且个别地包括5-15ng/μl(例如10ng/μl)的IL-7、IL-15和IL-21的RPMI中培养的经过FACS分选的CD8+T细胞群体。培养是在平底非组织培养物(TC)处理的96/48孔板上进行，其中每孔平板接种0.1-0.5×10e6个细胞。在活化后第3天，将细胞转移至TC处理的板上。

HSC/HSP的培养条件可以包括用Notch激动剂进行扩增(参见例如US 7,399,633；US 5,780,300；US 5,648,464；US 5,849,869；和US 5,856,441)，并且培养条件中存在的生长因子如下：25-300ng/ml SCF、25-300ng/ml Flt-3L、25-100ng/ml TPO、25-100ng/ml IL-6和10ng/ml IL-3。在更具体的实施方案中，可以使用50、100或200ng/ml的SCF；50、100或200ng/ml Flt-3L；50或100ng/ml TPO；50或100ng/ml IL-6；以及10ng/ml IL-3。

(viii)离体制造的细胞配制物.在特定实施方案中，经过基因修饰的细胞可以从培养基中收集并洗涤，并且以治疗有效量浓缩到载剂中。示例性载剂包括盐水、缓冲盐水、生理盐水、水、汉克斯氏溶液、林格氏溶液、Nonnosol-R(Abbott Labs)、PLASMA-LYTE

(Baxter Laboratories,Inc.,Morton Grove,IL)、甘油、乙醇及其组合。

在特定实施方案中，载剂可以补充有人血清白蛋白(HSA)或其他人血清成分或胎牛血清。在特定实施方案中，用于输注的载剂包括含5％HAS或右旋糖的缓冲盐水。额外等渗剂包括多元糖醇，包括三元或更高级糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。

载剂可包括缓冲剂，例如柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、反丁烯二酸盐缓冲剂、葡萄糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和/或三甲胺盐。

稳定剂是指一类范围广泛的赋形剂，其功能范围可从增积剂到有助于防止细胞粘附到容器壁上的添加剂。典型的稳定剂可以包括多元糖醇；氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油和环醇，例如肌醇；PEG；氨基酸聚合物；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即，<10个残基)；蛋白质，例如HSA、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，例如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖，例如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖，例如棉子糖；以及多糖，例如葡聚糖。

在必要或有益的情况下，组合物或配制物可以包括局部麻醉剂，例如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。

示例性防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、苯扎卤铵、氯化六烃季铵、对羟基苯甲酸烷酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。

组合物或配制物中细胞的治疗有效量可以大于10²个细胞、大于10³个细胞、大于10⁴个细胞、大于10⁵个细胞、大于10⁶个细胞、大于10⁷个细胞、大于10⁸个细胞、大于10⁹个细胞、大于10¹⁰个细胞或大于10¹¹个细胞。

在本文所公开的组合物和配制物中，细胞的体积一般是一升或更少、500ml或更少、250ml或更少或者100ml或更少。因此，施用的细胞的密度通常大于10⁴个细胞/毫升、10⁷个细，胞/毫升或10⁸个细胞/毫升。

如所指出的，组合物包括至少一种经过基因修饰的细胞类型(例如经过修饰的T细胞、NK细胞或干细胞)。配制物可以包括不同类型的经过基因修饰的细胞(例如T细胞、NK细胞和/或干细胞组合)。

不同类型的经过基因修饰的细胞或细胞亚群(例如经过修饰的T细胞、NK细胞和/或干细胞)可以不同的比率提供，例如1:1:1比率、2:1:1比率、1:2:1比率、1:1:2比率、5:1:1比率、1:5:1比率、1:1:5比率、10:1:1比率、1:10:1比率、1:1:10比率、2:2:1比率、1:2:2比率、2:1:2比率、5:5:1比率、1:5:5比率、5:1:5比率、10:10:1比率、1:10:10比率、10:1:10比率等。这些比率也适用于表达相同或不同重组蛋白的细胞数量。如果在配制物内仅组合两种细胞类型或仅包括2个重组蛋白组合，则所述比率可以包括可由以上所提供的3个数字的组合产生的任何2个数字的组合。在实施方案中，测试组合的细胞群体的体外、体内和/或离体功效和/或细胞增殖情况，并选出提供细胞功效和/或增殖的细胞比率。特定实施方案包括1:1的CD4 T细胞与CD8 T细胞比率。

可制备本文所公开的基于细胞的组合物以例如通过注射、输注、灌注或灌洗施用。组合物和配制物还可以被配制用于骨髓、静脉内、皮内、动脉内、结内、淋巴管内、腹膜内、病灶内、肿瘤内、囊内和/或皮下注射。

(ix)使用方法.本文所公开的方法包括用本文所公开的组合物治疗受试者(人、兽医动物(狗、猫、爬行动物、鸟类等)、牲畜(马、牛、山羊、猪、绵羊、鸡等)和研究动物(猴、大鼠、小鼠、鱼类等))。治疗受试者包括递送治疗有效量。治疗有效量包括提供有效量、防治性治疗和/或治疗性治疗的那些。

“有效量”是在受试者体内引起所希望的生理变化所需的组合物的量。出于研究目的，通常施用有效量。本文所公开的有效量可在与评估CD33相关病症的发展或进展有关的动物模型或体外测定中引起统计上显著的作用。

“防治性治疗”包括如下治疗，该治疗被施用给未展示CD33相关(例如表达CD33的)病症的病征或症状或者仅展示CD33相关病症的早期病征或症状的受试者，以使得施用治疗是为了减轻CD33相关病症或进一步降低发展该病症的风险。因此，防治性治疗用作针对CD33相关病症的预防性治疗。

“治疗性治疗”可包括这样一种治疗，该治疗被施用给展示CD33相关病症的症状或病征的受试者并且被施用给受试者是为了减轻或消除CD33相关病症的那些病征或症状。治疗性治疗可以减少、控制或消除CD33相关病症的存在或活性和/或减少、控制或消除CD33相关病症的副作用。

“治疗性治疗”还可以包括施用给需要成像的受试者的治疗。受试者可能需要成像以帮助诊断；定位治疗干预的位置；评估身体部位的功能；和/或评估存在还是不存在某种疾患。治疗性成像治疗的有效性可以基于捕获足够用于其预期目的的图像来确认。示例性成像类型包括：正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描、放射性同位素肾造影和闪烁显像。

作为有效量的功能，防治性治疗和治疗性治疗并不相互排斥，并且在特定实施方案中，所施用的剂量可实现多种治疗类型。

在特定实施方案中，治疗有效量提供抗癌作用。抗癌作用是指减少癌细胞数量、减少癌转移数量、预防或减少癌转移、肿瘤体积减小、抑制肿瘤生长、增加预期寿命、延长受试者生命、诱导癌细胞的化学敏感性或放射敏感性、抑制癌细胞增殖、减轻癌症相关的疼痛和/或减少治疗后癌症的复发或重现。

“肿瘤”是由细胞(称为赘生性细胞或肿瘤细胞)的异常生长形成的肿胀或病变。“肿瘤细胞”是通过快速、不受控制的细胞增殖来生长并在引发新生长的刺激停止后仍继续生长的异常细胞。肿瘤显示出部分或完全缺乏正常组织的结构组构和与正常组织的功能协调，并且通常形成明显的组织块，它可以是良性、恶变前或恶性的。

在特定实施方案中，有治疗作用的量诱导免疫反应。免疫反应可以针对癌细胞。

CD33相关病症的实例包括血液癌症，例如白血病和淋巴瘤，以及其他骨髓或淋巴增生性病症。

示例性白血病包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性髓单核细胞性白血病(CML)、肥大细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)和巨核细胞白血病。

AML的示例性亚型包括：急性嗜碱性粒细胞性白血病、急性红白血病(AML-M6)、急性成巨核细胞性白血病(AML-M7)、急性单核白血病(AML-M5a)、急性成单核细胞性白血病(AML-M5b)、急性成髓细胞性白血病伴粒细胞成熟、急性成髓细胞性白血病不伴成熟、急性髓单核细胞性白血病(AML-M4)、急性全髓增殖症伴骨髓纤维化、急性早幼粒细胞性白血病(APL)、红白血病(AML-M6a)、微分化型急性成髓细胞性白血病、髓单核细胞性白血病伴骨髓嗜酸性粒细胞增多和纯红白血病(AML-M6b)。

示例性淋巴瘤包括多发性骨髓瘤。

本文所公开的组合物也可用于治疗与上述淋巴增生性疾病和血液癌症相关的并发症或疾病。例如，与AML相关的并发症可包括先前的骨髓增生异常综合征(MDS，以前称为“白血病前期”)；继发性白血病，特别是继发性AML；高白细胞计数和缺乏奥氏小体(Auerrods)。其中，白细胞淤滞和中枢神经系统(CNS)受累、白细胞增多、残留疾病也被认为是与AML相关的并发症或疾病。

本文所公开的组合物可用于靶向骨髓源性抑制细胞(MDSC)。MDSC是免疫抑制性肿瘤微环境中的主要参与者，并且已被发现可抑制T细胞和NK细胞的抗肿瘤反应性。特定的MDSC具有高CD33表达并且可以作为抗CD33治疗的靶标，包括单核细胞性MDSC和未成熟的MDSC。

本文所公开的组合物还可用于治疗与AML风险相关的其他病理疾患或遗传综合征，例如唐氏综合征(Down syndrome)、三体症、范可尼氏贫血(Fanconi anemia)、布鲁姆氏综合征(Bloom syndrome)、共济失调-毛细血管扩张症、戴-布二氏贫血(Diamond-Blackfananemia)、施-戴二氏综合征(Schwachman-Diamond syndrome)、李-法美尼氏综合征(Li-Fraumeni syndrome)、1型神经纤维瘤病、重症先天性粒细胞缺乏症(又称为柯氏综合征(Kostmann syndrome))。

本文所公开的组合物还可用于治疗阿尔茨海默氏病。

对于施用，可基于体外测定和/或动物模型研究的结果初步估计治疗有效量(本文中又称为剂量)。此类信息可用于更准确地确定关注受试者的有用剂量。施用给特定受试者的实际剂量的量可由医师、兽医或研究人员在考虑如包括靶标、体重、疾患的严重程度、CD33相关病症的类型、CD33相关病症的分期、先前或同时进行的治疗干预、受试者的特发病和施用途径在内的身体和生理因素等参数的情况下确定。

有用的剂量可在0.1至5μg/kg或0.5至1μg/kg的范围内。在其他实例中，剂量可包括1μg/kg、15μg/kg、30μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、70μg/kg、90μg/kg、150μg/kg、350μg/kg、500μg/kg、750μg/kg、1000μg/kg、0.1至5mg/kg或0.5至1mg/kg。在其他实例中，剂量可包括1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、70mg/kg、100mg/kg、300mg/kg、500mg/kg、700mg/kg、1000mg/kg或更高。

基于细胞的组合物的治疗有效量可包括10⁴至10⁹个细胞/公斤体重，或10³至10¹¹个细胞/公斤体重。施用的治疗有效量可包括大于10²个细胞、大于10³个细胞、大于10⁴个细胞、大于10⁵个细胞、大于10⁶个细胞、大于10⁷个细胞、大于10⁸个细胞、大于10⁹个细胞、大于10¹⁰个细胞或大于10¹¹个细胞。

治疗有效量可通过在治疗方案的过程期间(例如每天、每隔一天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每2周、每3周、每月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月或每年)施用单次或多次剂量来实现。在特定实施方案中，治疗方案可以由临床试验方案或FDA批准的治疗方案决定。

本文所描述的药物组合物可通过注射、吸入、输注、灌注、灌洗或摄入来施用。施用途径可包括静脉内、皮内、动脉内、肠胃外、鼻内、结内、淋巴管内、腹膜内、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、表面、鞘内、肿瘤内、肌肉内、囊内、口服、皮下和/或舌下施用，并且更具体点说，通过静脉内、皮内、动脉内、肠胃外、鼻内、结内、淋巴管内、腹膜内、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、表面、鞘内、肿瘤内、肌肉内、囊内、口服、皮下和/或舌下施用。

使用方法还包括在基于图像的诊断中使用本文所描述的抗体，例如当抗体呈放射性同位素缀合物形式时。

(x)由对照群体得到的参考水平.获得的与本文所描述的疗法相关的参数值可与由对照群体的参考水平相比较，并且这一比较可指示本文所描述的疗法是否对有需要的受试者有效。参考水平可以从来自对照群体的一个或多个相关数据集获得。如本文所使用，“数据集”是在期望条件下评价样本(或样本群体)得到的一组数值。数据集的值可以通过例如利用实验从样本获得测量值并由这些测量值构建数据集来获得。本领域普通技术人员应理解，参考水平可以基于例如在本领域中有用和已知的用于从个别数据点的集合获得有意义的总参考水平的任何数学或统计公式；例如平均值、中值、平均值的中值等。或者，可以从如实验室之类服务提供者，或从存储有数据集的数据库或服务器获得参考水平或用于建立参考水平的数据集。

数据集的参考水平可以从先前由对照群体得出的测量值得到。“对照群体”是具有类似特定特征的受试者或样本的任何分组。分组可以根据例如临床参数、临床评估、治疗方案、疾病状态、疾患的严重程度等。在特定实施方案中，分组是基于年龄范围(例如60-65岁)和非免疫受损状态。在特定实施方案中，正常对照群体包括与测试受试者年龄匹配且未免疫受损的个体。在特定实施方案中，视临床相关情况而定，年龄匹配包括例如0-10岁、30-40岁、60-65岁、70-85岁等。在特定实施方案中，对照群体可以包括患有CD33相关病症并且尚未被施用治疗有效量的组合物或配制物的群体。

在特定实施方案中，与本文所描述的疗法相关的特定参数的值的相关参考水平是基于在对照群体中与疗法相关的特定对应参数的值来获得，以确定本文所公开的疗法对有需要的受试者是否具有治疗有效性。

在特定实施方案中，基于样本值与参考水平在统计上有显著差异还是在统计上没有显著差异来得出结论。如果所述差异是在预期仅偶然发生的水平之内，则测量在统计上没有显著差异。相反，统计上显著的差异或增加是大于预期仅偶然发生的差异或增加。统计显著性或其缺乏可以通过本领域众所周知的各种方法中的任一者来确定。常用的统计显著性度量的一个实例是p值。p值表示获得与特定数据点相等的给定结果的概率，其中该数据点仅为随机机率的结果。当p值小于或等于0.05时，结果通常被认为是显著的(不是随机机率)。在特定实施方案中，如果样本值和参考水平在统计学上没有显著差异，则样本值与由正常对照群体得到的参考水平“相当”。

包括以下示例性实施方案和实施例以展示本公开的特定、非限制性实施方案。本领域普通技术人员依据本公开将认识到，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可对本文所公开的具体实施方案作出许多改变并且仍获得相同或类似的结果。

(xi)示例性实施方案.

1.一种抗体或其抗原结合片段，根据North、IMGT、Kabat、Chothia或Set 5，所述抗体或其抗原结合片段包括1H10、1A9、1E6、1D2、1B9、1H8、2D3或2E3的互补决定区(CDR)集合。

2.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括

1H10、1A9、1E6、1D2、1B9、1H8、2D3或2E3的可变轻链和可变重链，或

与所述1H10、1A9、1E6、1D2、1B9、1H8、2D3或2E3的可变轻链具有至少90％序列同一性的可变轻链和与1H10、1A9、1E6、1D2、1B9、1H8、2D3或2E3的相应可变重链具有至少90％序列同一性的可变重链。

3.如实施方案1或2所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包括Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或呈VH-VL或VL-VH取向的单链Fv片段(scFv)(参见例如图14中的SEQ IDNO:230-237)。

4.如实施方案1至3中任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是聚乙二醇化的。

5.如实施方案1至4中任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括Fc修饰。

6.如实施方案5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc修饰包括M428L/N434S、G236A/S239D/A330L/I332E(GASDALIE)、huIgG4 ProAlaAla、huIgG2m4和/或huIgG2σ突变。

7.如实施方案1至6中任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体不管V型结构域的存在与否均在跨膜区的115个残基内结合CD33的C2型Ig样结构域，或仅在所述V型结构域不存在下结合所述C2型Ig样结构域。

8.一种CD33靶向剂，所述靶向剂包括结合结构域，根据North、IMGT、Kabat、Chothia或Set 5，所述结合结构域包括1H10、1A9、1E6、1D2、1B9、1H8、2D3或2E3的互补决定区(CDR)集合作为抗CD33免疫毒素、抗CD33抗体-药物缀合物、抗CD33抗体-荧光团缀合物、抗CD33抗体-放射性同位素缀合物、抗CD33双特异性抗体、抗CD33双特异性免疫细胞接合抗体、抗CD33三特异性抗体和/或抗CD33四特异性抗体的一部分。

9.一种CD33靶向剂，所述靶向剂包括结合结构域，所述结合结构域包括

1H10、1A9、1E6、1D2、1B9、1H8、2D3或2E3的可变重链和可变轻链作为抗CD33免疫毒素、抗CD33抗体-药物缀合物、抗CD33抗体-荧光团缀合物、抗CD33抗CD33抗体-放射性同位素缀合物、抗CD33双特异性抗体、抗CD33双特异性免疫细胞接合抗体、抗CD33三特异性抗体和/或抗CD33四特异性抗体的一部分；或

与1H10、1A9、1E6、1D2、1B9、1H8、2D3或2E3的相应可变重链和轻链具有至少90％序列同一性的可变重链和可变轻链作为抗CD33免疫毒素、抗CD33抗体-药物缀合物、抗CD33抗CD33抗体-放射性同位素缀合物、抗CD33双特异性抗体、抗CD33双特异性免疫细胞接合抗体、抗CD33三特异性抗体和/或抗CD33四特异性抗体的一部分。

10.如实施方案8或9所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂包括抗CD33免疫毒素，其中所述毒素包括全毒素或半毒素。

11.如实施方案8至10中任一实施方案所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂包括抗CD33免疫毒素，其中所述毒素包括相思豆毒素、三角梅核糖体失活蛋白、异株腹泻毒蛋白1、白喉毒素(DT)、白树毒素、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、假单胞菌外毒素(PE)、蓖麻毒素和/或皂草素。

12.如实施方案8至11中任一实施方案所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂包括抗CD33抗体-药物缀合物，其中所述药物包括单甲基奥瑞他汀E[MMAE]、维汀、海兔毒素、奥瑞他汀、卡奇霉素、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、奈莫柔比星、PNU-159682、蒽环霉素、柔红霉素、长春花生物碱、紫杉烷、单端孢菌素、CC1065、喜树碱、依利奈法德、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米汀、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因和/或普萘洛尔。

13.如实施方案8至12中任一实施方案所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂包括抗CD33抗体-放射性同位素缀合物，其中所述放射性同位素包括砷-72、砷-74、碘-131、铟-111、钇-90、镥-177、砹-211、锕-225或铋-212和/或铋-213。

14.如实施方案8至13中任一实施方案所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂包括抗CD33抗体-放射性同位素缀合物，其中所述放射性同位素包括²²⁵Ac、²²⁸Ac、¹¹¹Ag、¹²⁴Am、⁷⁴As、²¹¹At、²⁰⁹At、¹⁹⁴Au、¹²⁸Ba、⁷Be、²⁰⁶Bi、²⁴⁵Bk、²⁴⁶Bk、⁷⁶Br、¹¹C、⁴⁷Ca、²⁵⁴Cf、²⁴²Cm、⁵¹Cr、⁶⁷Cu、¹⁵³Dy、¹⁵⁷Dy、¹⁵⁹Dy、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Dy、¹⁷¹Er、²⁵⁰Es、²⁵⁴Es、¹⁴⁷Eu、¹⁵⁷Eu、⁵²Fe、⁵⁹Fe、²⁵¹Fm、²⁵²Fm、²⁵³Fm、⁶⁶Ga、⁷²Ga、¹⁴⁶Gd、¹⁵³Gd、⁶⁸Ge、¹⁷⁰Hf、¹⁷¹Hf、¹⁹³Hg、¹⁹³mHg、¹⁶⁰mHo、¹³⁰I、¹³¹I、¹³⁵I、¹¹⁴mIn、¹⁸⁵Ir、⁴²K、⁴³K、⁷⁶Kr、⁷⁹Kr、⁸¹mKr、¹³²La、²⁶²Lr、¹⁶⁹Lu、¹⁷⁴mLu、¹⁷⁶mLu、²⁵⁷Md、²⁶⁰Md、²⁸Mg、⁵²Mn、⁹⁰Mo、²⁴Na、⁹⁵Nb、¹³⁸Nd、⁵⁷Ni、⁶⁶Ni、²³⁴Np、¹⁵O、¹⁸²Os、¹⁸⁹mOs、¹⁹¹Os、³²P、²⁰¹Pb、¹⁰¹Pd、¹⁴³Pr、¹⁹¹Pt、²⁴³Pu、²²⁵Ra、⁸¹Rb、¹⁸⁸Re、¹⁰⁵Rh、²¹¹Rn、¹⁰³Ru、³⁵S、⁴⁴Sc、⁷²Se、¹⁵³Sm、¹²⁵Sn、⁹¹Sr、¹⁷³Ta、¹⁵⁴Tb、¹²⁷Te、²³⁴Th、⁴⁵Ti、¹⁶⁶Tm、²³⁰U、²³⁷U、²⁴⁰U、⁴⁸V、¹⁷⁸W、¹⁸¹W、¹⁸⁸W、¹²⁵Xe、¹²⁷Xe、¹³³Xe、¹³³mXe、¹³⁵Xe、⁸⁵mY、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁹³Y、¹⁶⁹Yb、¹⁷⁵Yb、⁶⁵Zn、⁷¹mZn、⁸⁶Zr、⁹⁵Zr和/或⁹⁷Zr。

15.如实施方案8至14中任一实施方案所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂包括多特异性抗体。

16.如实施方案15所述的CD33靶向剂，其中所述多特异性抗体包括双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。

17.如实施方案15或16所述的CD33靶向剂，其中所述多特异性抗体包括活化免疫细胞的结合结构域(参见例如图14中的SEQ ID NO:157和238-245)。

18.如实施方案17所述的CD33靶向剂，其中所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞或巨噬细胞。

19.如实施方案18所述的CD33靶向剂，其中所述T细胞是CD3T细胞、CD4 T细胞、CD8T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和/或初始T细胞。

20.如实施方案17至19中任一实施方案所述的CD33靶向剂，其中所述活化免疫细胞的结合结构域结合CD3、CD28、CD8、NKG2D、CD8、CD16、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR3DS1、NKG2C、NKG2E、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、DNAM-1、CD11b、CD11c、CD64、CD68、CD119、CD163、CD206、CD209、F4/80、IFGR2、Toll样受体1-9、IL-4Rα或MARCO。

21.如实施方案17至20中任一实施方案所述的CD33靶向剂，其中所述结合结构域活化T细胞并且包括OKT3抗体、4B4-D7抗体、4E7-C9抗体、18F5-H10抗体的CDR，或包括如SEQID No.161和162中所示的CD3HcFv和CD3 LcFv。

22.如实施方案17至21中任一实施方案所述的CD33靶向剂，其中所述结合结构域活化T细胞并且包括TGN1412抗体的CDR。

23.如实施方案17至22中任一实施方案所述的CD33靶向剂，其中所述结合结构域活化T细胞并且包括OKT8抗体的CDR。

24.如实施方案17至23中任一实施方案所述的CD33靶向剂，其中所述结合结构域活化T细胞并且包括TCR。

25.如实施方案17至24中任一实施方案所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂具有

1H10的CDR集合以及具有如SEQ ID NO:161中所示的序列的CD3 HcFv和具有如SEQID NO:162中所示的序列的CD3 LcFv；

1A9的CDR集合以及具有如SEQ ID NO:161中所示的序列的CD3 HcFv和具有如SEQID NO:162中所示的序列的CD3 LcFv；

1E6的CDR集合以及具有如SEQ ID NO:161中所示的序列的CD3 HcFv和具有如SEQID NO:162中所示的序列的CD3 LcFv；

1D2的CDR集合以及具有如SEQ ID NO:161中所示的序列的CD3 HcFv和具有如SEQID NO:162中所示的序列的CD3 LcFv；

1B9的CDR集合以及具有如SEQ ID NO:161中所示的序列的CD3 HcFv和具有如SEQID NO:162中所示的序列的CD3 LcFv；

1H8的CDR集合以及具有如SEQ ID NO:161中所示的序列的CD3 HcFv和具有如SEQID NO:162中所示的序列的CD3 LcFv；

2D3的CDR集合以及具有如SEQ ID NO:161中所示的序列的CD3 HcFv和具有如SEQID NO:162中所示的序列的CD3 LcFv；或

2E3的CDR集合以及具有如SEQ ID NO:161中所示的序列的CD3 HcFv和具有如SEQID NO:162中所示的序列的CD3 LcFv。

26.如实施方案17至25中任一实施方案所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂具有如SEQ ID NO:234或235中所示的序列。

27.如实施方案8至26中任一实施方案所述的CD33靶向剂，所述靶向剂包括1H10、1A9、1E6、1D2、1B9、1H8、2D3或2E3的Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或单链Fv片段(scFv)，其中所述scFv可以呈VH-VL取向或VL-VH取向(参见例如图14中的SEQ ID NO:230-237)。

28.如实施方案1至7中任一实施方案所述的抗体或其抗原片段或如实施方案8至27中任一实施方案所述的CD33靶向剂，它们还包括连接子。

29.如实施方案28所述的CD33靶向剂，其中所述连接子是Gly-Ser连接子。

30.如实施方案29所述的CD33靶向剂，其中所述Gly-Ser连接子包括(Gly_xSer_y)_n，其中x和y独立地是0至10的整数，条件是x和y不同时是0并且其中n是整数1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

31.如实施方案30所述的CD33靶向剂，其中所述Gly-Ser连接子包括(Gly₄Ser)₄(SEQ ID NO:125)、(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO:126)、(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO:127)、(Gly₄Ser)₁(SEQ ID NO:128)、(Gly₃Ser)₂(SEQ ID NO:129)、(Gly₃Ser)₁(SEQ ID NO:130)、(Gly₂Ser)₂(SEQ ID NO:131)、(Gly₂Ser)₁、GGSGGGSGGSG(SEQ ID NO:132)、GGSGGGSGSG(SEQ ID NO:133)或GGSGGGSG(SEQ ID NO:134)。

32.一种被配制用于施用给受试者的组合物，所述组合物包括实施方案1至7或28中任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段和/或实施方案8至31中任一实施方案所述的CD33靶向剂。

33.一种被配制用于施用给受试者的细胞，所述细胞被基因修饰成表达实施方案1至7中任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案8、9或15至31中任一实施方案所述的CD33靶向剂。

34.如实施方案33所述的细胞，其中所述细胞是在体内或离体的。

35.如实施方案33或34所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、单核细胞/巨噬细胞、造血干细胞(HSC)或造血祖细胞(HPC)。

36.如实施方案33至35中任一实施方案所述的细胞，其中所述细胞是选自以下的T细胞：CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和/或初始T细胞。

37.如实施方案33至36中任一实施方案所述的细胞，其中所述细胞是CD8+T细胞。

38.一种配制物，所述配制物包括实施方案33至37中任一实施方案所述的细胞的群体和药学上可接受的载剂。

39.一种治疗有需要的受试者的CD33相关病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的实施方案32所述的组合物和/或实施方案38所述的配制物，由此治疗有需要的受试者的所述CD33相关病症。

40.如实施方案39所述的方法，其中所述CD33相关病症包括急性骨髓性白血病(AML)。

41.如实施方案39所述的方法，其中所述CD33相关病症包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性髓单核细胞性白血病(CML)、肥大细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)或巨核细胞白血病。

42.如实施方案39至41中任一实施方案所述的方法，其中所述配制物中的细胞群体对于所述受试者是自体的或同种异体的。

43.如实施方案39至42中任一实施方案所述的方法，所述方法还包括确定所述受试者是表达还是缺乏CD33的V型结构域，并且

如果所述受试者表达所述CD33的V型结构域，则选择包括以下的组合疗法：

组合物，所述组合物包括1H10、1A9、1E6、1D2和1B9中的一者或多者的结合结构域，以及

1H8、2D3和2E3中的一者或多者中的一者或多者的结合结构域。

44.如实施方案39至42中任一实施方案所述的方法，所述方法还包括确定所述受试者是表达还是缺乏所述CD33的V型结构域，并且

如果所述受试者不表达所述CD33的V型结构域，则选择包括以下的疗法：

包括6H9、9G2、3A5、7D5、1H7和2D5中的一者或多者的结合结构域的组合物。

45.一种活化有需要的受试者的针对CD33表达细胞的免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的实施方案32所述的组合物和/或实施方案38所述的配制物，由此活化所述有需要的受试者的针对CD33表达细胞的免疫反应。

46.如实施方案45所述的方法，其中所述CD33表达细胞包括急性骨髓性白血病(AML)细胞。

47.如实施方案45所述的方法，其中所述CD33表达细胞包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性髓单核细胞性白血病(CML)、肥大细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)或巨核细胞白血病细胞。

48.如实施方案45至47中任一实施方案所述的方法，其中所述配制物中的细胞群体对于所述受试者是自体的或同种异体的。

49.如实施方案45至48中任一实施方案所述的方法，所述方法还包括确定所述受试者是表达还是缺乏CD33的V型结构域，并且

1H8、2D3和2E3中的一者或多者中的一者或多者的结合结构域。

50.如实施方案45至48中任一实施方案所述的方法，所述方法还包括确定所述受试者是表达还是缺乏所述CD33的V型结构域，并且

51.一种试剂盒，所述试剂盒包括组合物，所述组合物包括1H10、1A9、1E6、1D2和1B9中的一者或多者的结合结构域；以及1H8、2D3和2E3中的一者或多者中的一者或多者的结合结构域。

52.一种试剂盒，所述试剂盒包括：包括1H10、1A9、1E6、1D2和1B9中的一者或多者的结合结构域的组合物；以及包括1H8、2D3和2E3中的一者或多者中的一者或多者的结合结构域的组合物。

53.前述实施方案中任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段或前述实施方案中任一实施方案所述的CD33靶向剂在体内成像中和/或在体外或体内富集、分离和/或检测CD33表达细胞的用途。

(xii)实验性实施例.摘要.靶向恶性和非恶性疾病中的CD33引起了越来越多地关注。在急性髓细胞性白血病中，利用CD33抗体-药物缀合物吉妥珠单抗奥唑米星(GO)引起的较长生存期验证了这一策略。尽管如此，GO仅对部分患者有益，促使人们努力开发更强效的CD33定向治疗剂。作为一个局限，CD33抗体通常识别膜远端V型结构域。使用这一结构域定位于分子细胞外部分不同位置的各种人工CD33蛋白质，测试了靶向膜近端靶向表位是否增强基于CD33抗体的治疗剂的效应功能。与这个想法一致，相较于表达全长CD33的细胞，CD33^V型/CD3双特异性抗体(BsAb)引起针对表达缺乏完整C2型结构域的CD33变体的细胞的明显较大的细胞毒性，而GO诱导的细胞毒性作用与V型结构域的位置无关。因此，针对人CD33的C2型结构域产生了鼠和人抗体，并鉴别出不管存在/不存在V型结构域均结合CD33的抗体(“CD33^PAN抗体”)。这些抗体在与CD33结合时内化，并且作为CD33^PAN/CD3 BsAb，对CD33⁺细胞具有强效的细胞溶解作用。这些数据为进一步开发基于CD33^PAN抗体的治疗剂提供了依据。

引言.CD33(Siglec-3)是一种分化抗原，主要展示于正在成熟和成熟的骨髓细胞及其赘生性细胞对应物上(Walter等人,Blood.119(26):6198-6208,2012；和Duan等人,Annu Rev Immunol.38:365-395,2020)。利用这种表达模式，在治疗性靶向CD33+细胞，首要的是急性骨髓性白血病(AML)(Walter等人,Blood.119(26):6198-6208,2012；Grossbard等人,Blood.80(4):863-878,1992；和Laszlo等人,Blood Rev.28(4):143-153,2014)以及其他恶性疾病中的CD33+肿瘤细胞、CD33+髓源性抑制细胞和正常CD33+小胶质细胞(Walter,Expert Opin Biol Ther.20(9):955-958,2020)方面付出了长期的努力。在AML中，使用抗体-药物缀合物GO治疗的一些患者的生存期延长验证了CD33是药物靶标(Godwin等人,Leukemia.31(9):1855-1868,2017)。

GO的成功和局限性推动了开发更有效的CD33定向疗法的持续工作。然而，经证实，靶向CD33是很难的，而且由于缺乏功效，一些药物在临床上失败了。因此，尝试集中在开发更强效的抗CD33治疗模式上，包括T细胞接合双特异性抗体(BsAb)。作为这些研究的一个重要缺点，包括GO在内的现有和研究性治疗剂几乎仅仅识别在CD33的外显子2编码的膜远端V型结构域内的免疫显性表位(图1)(Walter,Expert Opin Investig Drugs.27(4):339-348,2018)。由于抗体的膜近端结合可以增加它们的效应功能(Bluemel等人,CancerImmunol Immunother.59(8):1197-1209,2010；Lin,Pharmgenomics Pers Med.3:51-59,2010；Haso等人,Blood.121(7):1165-1174,2013；Cleary等人,J Immunol.198(10):3999-4011,2017)，用针对膜近端C2型结构域的抗体靶向CD33应当优化与免疫效应细胞接合的CD33定向疗法。此处，对这一概念进行了实验测试，并描述了一系列C2型结构域定向CD33抗体和衍生治疗剂的产生。

结果.距细胞膜的结合距离与CD33抗体的免疫效应功能相关。为了检查靶标表位与细胞膜之间的距离是否影响T细胞接合免疫疗法的功效，产生了一系列人造蛋白质，在这些蛋白质中，人CD33的V型结构域与细胞膜保持不同的距离，以允许用基于V型结构域定向CD33抗体的治疗剂，如CD33^V型/CD3 BsAb进行靶向(图2)。具体而言，为了使CD33靶标表位更接近细胞膜，通过去除外显子3和4产生一种缺少完整C2型结构域的人造CD33蛋白质(CD33^ΔE3-4)。使用内源性CD33通过CRISPR/Cas9缺失的经过工程改造的人CD33⁺AML细胞系(Humbert等人,Leukemia.33(3):762-808,2019)表达CD33^FL或CD33^ΔE3-4。在第一系列实验中，将健康供体T细胞作为免疫效应细胞，用不同剂量的CD33^V型/CD3 BsAb对表达水平相对类似的靶标分子的亚系进行短期体外细胞毒性测定。作为比较物，使用了GO，这完全取决于为实现抗肿瘤作用而由卡奇霉素-γ₁有效负载诱导的毒性作用(Walter等人,Blood.119(26):6198-6208,2012；Laszlo等人,Blood Rev.28(4):143-153,2014；及Godwin等人,Leukemia.31(9):1855-1868,2017)。如图3A-3C中所示，CD33^V型/CD3BsAb对表达CD33^ΔE3-4的AML和ALL细胞的细胞毒性比对表达CD33^FL的细胞要大，而GO诱导的细胞毒性作用是类似的。当用CD33^V型/CD3BsAb处理时，在表达这些相同CD33构建体的REH和RS4；11细胞(人CD33^-B型急性淋巴母细胞性白血病[B-ALL]细胞系)中观察到类似的作用(关于RS4；11的数据示于图4中)。为了进一步展示靶标表位膜距离对于CD33定向疗法接合T细胞的功效的重要性，使用人CD22的不同部分产生嵌合蛋白以延伸CD33靶标表位与细胞膜之间的距离(图2)。如图5中所概述，CD33^V型/CD3BsAb对表达CD22/CD33^FL嵌合蛋白的AML细胞的细胞毒性作用比表达CD33^FL的成对细胞的作用要低。总之，这些数据展示，改变CD33抗体结合表位的位置会改变CD33抗体衍生疗法的效应功能，并表明通过C2型结构域特异性治疗剂近膜靶向CD33可以改善靶向CD33的T细胞免疫疗法的功效。

第二代CD33^PAN抗体具有完全人可变结构域序列和衍生疗法。由于目前不存在识别人CD33的C2型结构域的充分表征的抗体，故在注射了免疫原的BALB/c、CD1和F1小鼠中产生具有这一特异性的抗体，所述抗体包括与人CD33^FL的整个ECD或人CD33^ΔE2的整个ECD连接的鼠IgG1 Fc结构域。最近报导了一系列鼠抗人CD33^PAN抗体的数据(Godwin等人,Leukemia.2021,DOI:10.1038/s41375-021-01160-1)。由于鼠氨基酸序列的免疫原性是一个潜在的临床问题，故进行了第二次免疫接种活动，在这次活动中，在人源化小鼠中使用相同的CD33免疫原以产生具有完全人可变结构域序列的抗体。如图6A和6B所示，鉴别出仅识别CD33^FL的杂交瘤以及若干与CD33^ΔE2和CD33^FL(即，CD33^PAN抗体特异性)结合的杂交瘤。利用CD33+ML-1细胞和通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑去除CD33的ML-1亚系进行的实验证实了这些抗体与人CD33的结合特异性。通过Carterra进行的生物物理表征研究的总结描绘于图7A、7B中。为进行进一步表征，对1E6进行了抗体内化实验。如图8所示，1E6确实在人AML细胞中内化，其动力学与P67.6相似，P67.6是GO中使用的亲本鼠CD33^V型抗体。由于来源于Trianni小鼠的杂交瘤分泌嵌合抗体(人可变结合序列、鼠恒定区)，故使用物种转换方法来产生重组完全人CD33^PAN抗体。图9显示一个实例(具有人IgG1框架的1E6抗体)。

对于人CD33^PAN抗体治疗价值的原理验证研究，以scFv-scFv格式建构1E6/CD3BsAb。类似于发现的鼠CD33^PAN/CD3 BsAb(Godwin等人,Leukemia.2021,DOI:10.1038/s41375-021-01160-1)，1E6/CD3BsAb对CD33⁺人急性白血病细胞非常强效(图10)，但对CD33敲除细胞没有活性(图11)。1E6/CD3 BsAb还强效杀死过表达CD33^FL和CD33^ΔE2的REH细胞，而CD33^V型/CD3 BsAb仅对表达CD33^FL的细胞具有活性(图12)。最后，确定1E6/CD3 BsAb在体外对多种原发性AML患者试样也具有稳健的活性(图13)。

(xiii)结束段落.本文提供的核酸和氨基酸序列是使用核苷酸碱基和氨基酸残基的字母缩写示出的，该字母缩写如在37CFR§1.822中所定义以及在WIPO标准ST.25(1998)附录2表1和表3中的表格中所列出。仅示出每个核酸序列的一条链，但互补链应被理解为包括在合适的实施方案中。

就本文未明确提供的内容来说，本领域普通技术人员可以容易地得到本文所公开的蛋白质的编码序列和本文所公开的编码序列的蛋白质序列。

给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可使用许多众所周知的方案中的任一者容易地确定，包括以下描述的那些：Kabat等人(1991)"Sequences of Proteins ofImmunological Interest,"第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(Kabat编号方案)；Al-Lazikani等人(1997)J Mol Biol 273:927-948(Chothia编号方案)；Maccallum等人(1996)J Mol Biol 262:732-745(Contact编号方案)；Martin等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.,86:9268-9272(AbM编号方案)；Lefranc M P等人(2003)Dev Comp Immunol 27(1):55-77(IMGT编号方案)；以及Honegger和Pluckthun(2001)J Mol Biol 309(3):657-670("Aho"编号方案)。给定CDR或FR的边界可取决于用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案两者的编号都是基于最常见的抗体区域序列长度，并且在一些抗体中可见利用插入字母提供的插入(例如“30a”)以及缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，由此产生不同的编号。Contact方案是基于复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案类似。在特定实施方案中，本文所公开的抗体CDR序列是根据Kabat编号。

还包括本文公开和引用的序列的变体。可以使用本领域众所周知的计算机程序，例如DNASTAR^TM(Madison,Wisconsin)软件来发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不会消除生物活性的指导。优选地，本文所公开的蛋白质变体中的氨基酸变化是保守氨基酸变化，即，类似带电荷或不带电氨基酸的取代。保守氨基酸变化涉及取代用侧链相关的氨基酸家族中的一者进行的取代。

抗体的变体可包括具有一个或多个保守氨基酸取代或者一个或多个非保守取代列的变体，所述取代不会不利地影响蛋白质的结合。

在特定实施方案中，V_L区可以来源于或基于所公开的V_L并且当与所公开的V_L相比较时，可以包括一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)或上述变化的组合。插入、缺失或取代可以位于V_L区的任何地方，包括位于这一区的氨基末端或羧基末端或两端，只要每个CDR均包括零个变化或最多一个、两个或三个变化并且包括经过修饰的V_L区的抗体仍然能够以与野生型结合结构域类似的亲和力特异性结合其靶标表位即可。

在特定实施方案中，V_H区可以来源于或基于所公开的V_H并且当与本文所公开的V_H相比较时，可以包括一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、一个或多个多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)或上述变化的组合。插入、缺失或取代可以位于V_H区的任何地方，包括位于这一区的氨基末端或羧基末端或两端，只要每个CDR均包括零个变化或最多一个、两个或三个变化并且包括经过修饰的V_H区的抗体仍然能够以与野生型结合结构域类似的亲和力特异性结合其靶标表位即可。

在特定实施方案中，保守氨基酸取代可能不会显著改变参考序列的结构特征(例如替代氨基酸往往不会破坏参考序列中出现的螺旋或破坏表征参考序列的其他类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins,Structures andMolecular Principles(Creighton编,W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编,Garland Publishing,NewYork,N.Y.(1991))；和Thornton等人,Nature,354:105(1991)中。

在肽或蛋白质中，适合的氨基酸保守取代是本领域技术人员已知的，并且一般可在不改变所得分子的生物活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，一般来说，多肽非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物活性(参见例如Watson等人,MolecularBiology of the Gene,第4版,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页)。天然存在的氨基酸一般分为以下保守性取代家族：第1组：丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)；第2组：(酸性)：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)；第3组：(酸性；也分类为极性带负电残基及其酰胺)：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、Asp和Glu；第4组：Gln和Asn；第5组：(碱性；也分类为极性带正电残基)：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；第6组(大的脂肪族非极性残基)：异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)和半胱氨酸(Cys)；第7组(不带电的极性残基)：酪氨酸(Tyr)、Gly、Asn、Gln、Cys、Ser和Thr、第8组(大的芳香族残基)：苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和Tyr；第9组(非极性)：脯氨酸(Pro)、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met和Trp；第11组(脂肪族)：Gly、Ala、Val、Leu和Ile；第10组(小的脂肪族非极性或弱极性残基)：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；以及第12组(含硫残基)：Met和Cys。额外信息可见于Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman and Company。

在进行此类变化时，可考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用生物功能方面的重要性是本领域中大体了解的(Kyte和Doolittle,1982,J.Mol.Biol.157(1),105-32)。各氨基酸已基于其疏水性和电荷特征而指定亲水指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些值是：Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；谷氨酰胺(-3.5)；Gln(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)；和Arg(-4.5)。

本领域中已知，某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或分数的其他氨基酸取代并且仍然产生具有类似生物活性的蛋白质，即，仍然获得生物功能等效的蛋白质。在进行此类变化时，优选亲水指数在±2内的氨基酸，特别优选亲水指数在±1内的氨基酸，并且甚至更优选亲水指数在±0.5内的氨基酸。本领域中还应了解，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取代。

如美国专利号4,554,101中所详述，以下亲水性值已被指定给氨基酸残基：Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Thr(-0.4)；Pro(-0.5±1)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；Trp(-3.4)。应理解，氨基酸可被取代为具有类似亲水性值的另一个氨基酸，并且仍然获得生物学上等效的且特别是免疫学上等效的蛋白质。在这些变化中，优选亲水性值在±2内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在±1内的氨基酸的取代，并且甚至更优选亲水性值在±0.5内的氨基酸的取代。

如上所概述，氨基酸取代可以基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。

如别处所示，基因序列的变体可以包括密码子优化的变体、序列多态性、剪接变体和/或对编码产物的功能没有统计学显著的影响的突变。

本文所公开的蛋白质、核酸和基因序列的变体还包括与本文所公开的蛋白质、核酸和基因序列具有至少70％序列同一性、80％序列同一性、85％序列、90％序列同一性、95％序列同一性、96％序列同一性、97％序列同一性、98％序列同一性或99％序列同一性的序列。

在特定实施方案中，变体包括或是与本文所公开的抗体序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％序列同一性的序列。在特定实施方案中，变体包括或是与轻链可变区(V_L)和/或与重链可变区(V_H)或两者具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％的序列，其中相对于本文所公开的参考抗体或其在无论存在还是不存在V型Ig样结构域情况下均特异性结合至C2型Ig样CD33表位或根据如本文所描述的抗体的表位特异性而结合V型Ig样结构域的片段或衍生物，每个CDR包括零个变化或最多一个、两个或三个变化。

“序列同一性百分比”是指通过比较序列所确定的两个或更多个序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还指通过此类序列串之间的匹配所确定的蛋白质、核酸或基因序列之间的序列相关性程度。“同一性”(通常称为“相似性”)可通过已知方法容易地计算，所述方法包括但不限于以下中描述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press,NY(1988)；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects(Smith,D.W.编辑)Academic Press,NY(1994)；Computer Analysis of SequenceData,Part I(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press,NJ(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology(Von Heijne,G.编辑)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Oxford UniversityPress,NY(1992)。确定同一性的优选方法被设计用于得到测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法被编写于可公开获得的计算机程序中。序列比对和同一性百分比计算可使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR,Inc.,Madison,Wisconsin)中的Megalign程序来执行。序列的多重比对还可使用Clustal比对方法(Higgins和SharpCABIOS,5,151-153(1989)以默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)来执行。相关程序还包括GCG程序套件(Wisconsin软件包版本9.0，Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wisconsin)；BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；DNASTAR(DNASTAR,Inc.,Madison,Wisconsin)；以及纳入Smith-Waterman算法的FASTA程序(Pearson,Comput.Methods Genome Res.,[Proc.Int.Symp.](1994),MeetingDate 1992,111-20.编辑:Suhai,Sandor.出版社:Plenum,New York,N.Y。在本公开的上下文内，应理解，在使用序列分析软件进行分析的情况下，分析的结果是基于所引用的程序的“默认值”。如本文所使用，“默认值”将意指在首次初始化时最初软件装载的值或参数的任何集合。

变体还包括在严格杂交条件下与本文所公开的序列杂交并提供与参考序列相同功能的核酸分子。示例性严格杂交条件包括：在42℃下在包括50％甲酰胺、5XSSC(750mMNaCl、75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5XDenhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中培育过夜，随后在50℃下用0.1XSSC洗涤。杂交和信号检测的严格度的变化主要通过控制甲酰胺浓度(较低的甲酰胺百分比引起严格性降低)、盐条件或温度来实现。例如，中等严格度条件包括：在37℃下在包括6XSSPE(20XSSPE＝3M NaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA，pH 7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鲑鱼精封闭DNA的溶液中培育过夜，随后在50℃下用1XSSPE、0.1％SDS洗涤。另外，为了获得甚至更低的严格度，在严格杂交后，可在较高盐浓度(例如5XSSC)下执行洗涤。上述条件的变化可以通过包括和/或取代用于抑制杂交实验中的背景的替代封闭试剂来实现。典型的封闭试剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑鱼精DNA和可商购的专有配制物。由于相容性问题，包括特定封闭试剂可能需要改变上述杂交条件。

“特异性结合”是指结合结构域(例如双特异性抗体结合结构域或纳米粒子选择的细胞靶向配体)与其同源结合分子以等于或大于10⁵M^-1的亲和力或K_a(即，特定结合相互作用的平衡缔合常数，单位是1/M)缔合，而与相关环境样本中的任何其他分子或组分无显著缔合。结合结构域可以分为“高亲和力”或“低亲和力”的。在特定实施方案中，“高亲和力”结合结构域是指K_a为至少10⁷M^-1、至少10⁸M^-1、至少10⁹M^-1、至少10¹⁰M^-1、至少10¹¹M^-1、至少10¹²M^-1或至少10¹³M^-1的结合结构域。在特定实施方案中，“低亲和力”结合结构域是指K_a是至多10⁷M^-1、至多10⁶M^-1、至多10⁵M^-1的结合结构域。或者，亲和力可以定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(K_d)，并且单位是M(例如10^-5M至10^-13M)。在某些实施方案中，结合结构域可具有“增强的亲和力”，意思指选择的或经过工程改造的结合结构域与同源结合分子的结合比野生型(或亲本)结合结构域要强。例如，增强的亲和力可能是由于同源结合分子的K_a(平衡缔合常数)高于参考结合结构域或由于同源结合分子的K_d(解离常数)低于参考结合结构域或由于同源结合分子的解离速率(K_off)低于参考结合结构域的解离速率。用于检测特异性结合特定同源结合分子的结合结构域以及确定结合亲和力的多种测定是已知的，例如蛋白质印迹、ELISA和

分析(另参见例如Scatchard等人,1949,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；以及美国专利号5,283,173、5,468,614或同等专利)。

除非另有指示，否则本公开的实践可以采用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。这些方法在以下出版物中有描述。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989)；F.M.Ausubel等人编,CurrentProtocols in Molecular Biology,(1987)；the series Methods IN Enzymology(Academic Press,Inc.)；M.MacPherson等人,PCR:A Practical Approach,IRL Press,Oxford University Press(1991)；MacPherson等人编,PCR 2:Practical Approach,(1995)；Harlow和Lane编,Antibodies,A Laboratory Manual,(1988)；以及R.I.Freshney编,Animal Cell Culture(1987)。

本领域普通技术人员应理解，本文所公开的每个实施方案都可包含其特别陈述的要素、步骤、成分或组分，基本上其由或由其组成。因此，“包括(include/including)”应解释为叙述：“包含、由……组成或基本上由……组成”。过渡性术语“包含/包括(comprise/comprises)”意思指具有、但不限于以及允许包括未说明的要素、步骤、成分或组分，即使是呈较大量也是如此。过渡性短语“由……组成”不包括未说明的任何要素、步骤、成分或组分。过渡性短语“基本上由……组成”将实施方案的范围局限于所说明的要素、步骤、成分或组分以及不会实质上影响该实施方案的那些。实质影响会导致抗体与抗原之间的结合的统计上显著的降低。

除非另外指示，否则说明书和权利要求书中所使用的表示成分的数量、特性如分子量、反应条件等的所有数字应当理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求中所陈述的数值参数都是近似值，所述近似值可根据本发明寻求获得的所希望的特性而变化。在最低限度上，并且不试图将等同原则的应用局限于权利要求的范围，每个数值参数均应当至少根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通四舍五入技术来解释。更确切地说，当与所陈述的数值或范围结合使用时，术语“约”具有本领域技术人员合理地归于它的含义，即，表示略大于或略小于所陈述的值或范围，在所陈述值的±20％范围内；在所陈述值的±19％范围内；在所陈述值的±18％范围内；在所陈述值的±17％范围内；在所陈述值的±16％范围内；在所陈述值的±15％范围内；在所陈述值的±14％范围内；在所陈述值的±13％范围内；在所陈述值的±12％范围内；在所陈述值的±11％范围内；在所陈述值的±10％范围内；在所陈述值的±9％范围内；在所陈述值的±8％范围内；在所陈述值的±7％范围内；在所陈述值的±6％范围内；在所陈述值的±5％范围内；在所陈述值的±4％范围内；在所陈述值的±3％范围内；在所陈述值的±2％范围内；或在所陈述值的±1％范围内。

尽管陈述本发明的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中所陈述的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地含有由在其各自的测试测量中所发现的标准偏差而必然引起的一定误差。

除非本文另外指示或者与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求书的上下文中)使用的术语“一个/种”、“所述”以及类似指代语应解读为涵盖单数和复数指代语。本文中列举的值的范围仅意图充当个别地提到在该范围内的每个独立值的速记方法。除非本文另外指出，否则每一个别值都被并入本说明书中，就如同在本文中个别地叙述该值一样。除非本文中另外指出或另外明显与上下文矛盾，否则本文中所描述的所有方法都可以按任何适合的次序执行。本文所提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不会对原本要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解读为指示任何未要求保护的要素是实施本发明所必需的。

本文所公开的本发明的替代性要素或实施方案的分组不应解读为是限制性的。每个群组成员都可个别地或与该群组其他成员或本文中发现的其他要素以任何组合形式被提到和要求保护。可预见的是，出于简便和/或可专利性的原因，一个群组的一个或多个成员可包括在所述组内，或从所述组中删除。当出现任何这种包括或删除时，认为本说明书含有如此修改的组，因此满足关于所附权利要求中使用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。

本文描述了本发明的某些实施方案，包括本发明人所知的用于实施本发明的最佳模式。当然，本领域普通技术人员在阅读前面的描述后将容易了解这些所描述的实施方案的变化形式。发明人希望熟练的技术人员在适当时可使用这些变化形式，而且发明人意图以除本文具体描述的方式以外的方式实践本发明。因此，本发明包括适用法律所容许的对所附权利要求中所述主题的所有修改和等效内容。此外，除非本文另外指示或另外明显与上下文矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能变化形式的任何组合。

此外，在本说明书通篇，参考了众多的专利、印刷的出版物、期刊文章和其他书面文本(本文中的参考材料)。每一参考材料中提到的教义都个别地以引用的方式整体并入本文。

最后，应当理解，本文所公开的本发明的实施方案是对本发明原理的说明。可采用的其他修改也在本发明的范围内。因此，例如但不限于，可根据本文的教义利用本发明的替代配置。因而，本发明不限于明确显示和描述的实施方案。

本文示出的细节是作为举例并且仅出于说明性讨论本发明的优选实施方案的目的，并且呈现这些细节旨在提供被认为是本发明各个实施方案的原理和概念方面的最有用和最易理解的描述的内容。就这一点而言，除对于基本理解本发明所必需的内容之外，没有企图更详细地示出本发明的结构细节，而是结合附图和/或实施例进行描述，以使本领域技术人员易于了解如何能在实践中体现本发明的若干形式。

除非在以下实施例中清晰地且明确地作出修改或是当含义的应用使得任何构建无意义或基本上无意义，否则在本公开中使用的定义和解释意图并且旨在控制任何未来的构建。在术语的构建将使它无意义或基本上无意义的情况下，定义应该从韦氏字典(Webster's Dictionary)第3版或本领域普通技术人员已知的字典如生物化学和分子生物学牛津字典(Attwood T等人编辑,Oxford University Press,Oxford,2006)中取得。

序列表

<110> 弗雷德哈钦森癌症中心(Fred Hutchinson Cancer Center)

<120> 人抗CD33抗体和其用途

<130> F053-0123PCT / 20-160-WO-PCT

<150> US 63/003,203

<151> 2020-03-31

<160> 260

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 726

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33:CD22 4D蛋白质

<400> 1

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Met His His His His His His Gly Gly Gly Asp Pro Asn Phe Trp Leu

20 25 30

Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln Glu Gly Leu Cys Val Leu Val

35 40 45

Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro Tyr Tyr Asp Lys Asn Ser Pro

50 55 60

Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly Ala Ile Ile Ser Arg Asp Ser

65 70 75 80

Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln

85 90 95

Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro Ser Arg Asn Asn Cys Ser Leu

100 105 110

Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp Asn Gly Ser Tyr Phe Phe Arg

115 120 125

Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Tyr Lys Ser Pro Gln Leu Ser

130 135 140

Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly

145 150 155 160

Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp

165 170 175

Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala

180 185 190

Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr His Ser Ser Val Leu Ile Ile

195 200 205

Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys

210 215 220

Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val

225 230 235 240

Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly

245 250 255

Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly Val Val His Pro Glu Pro Ser

260 265 270

Thr Val Gln Ile Leu His Ser Pro Ala Val Glu Gly Ser Gln Val Glu

275 280 285

Phe Leu Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Trp

290 295 300

Tyr His Asn Gly Lys Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu Glu Lys Val His

305 310 315 320

Ile Pro Lys Ile Leu Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala

325 330 335

Glu Asn Ile Leu Gly Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp

340 345 350

Val Gln Tyr Pro Pro Lys Lys Val Thr Thr Val Ile Gln Asn Pro Met

355 360 365

Pro Ile Arg Glu Gly Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser

370 375 380

Ser Asn Pro Ser Val Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp

385 390 395 400

Glu Glu Pro Ser Leu Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn Val Gly Trp Asp

405 410 415

Asn Thr Thr Ile Ala Cys Ala Ala Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala

420 425 430

Ser Pro Val Ala Leu Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val

435 440 445

Arg Lys Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser Val Ser

450 455 460

Leu Gln Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln Phe Phe

465 470 475 480

Trp Glu Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu Asn Phe

485 490 495

Asp Ser Ile Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp Val Asn

500 505 510

Asn Ser Ile Gly Gln Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr Leu Glu Val Leu

515 520 525

Tyr Ala Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met Ser Pro Gly Asp Gln Val

530 535 540

Met Glu Gly Lys Ser Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser Asp Ala Asn Pro

545 550 555 560

Pro Val Ser His Tyr Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn Gln Ser Leu Pro

565 570 575

Tyr His Ser Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys Val Gln His Ser

580 585 590

Gly Ala Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly Arg Ser

595 600 605

Pro Leu Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr Gly Ala Ile

610 615 620

Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala Leu Cys Leu Cys Leu Ile

625 630 635 640

Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys Ala Ala Arg Thr Ala Val

645 650 655

Gly Arg Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly Ser Ala Ser Pro Lys His

660 665 670

Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Pro Thr Glu Thr Ser Ser Cys Ser

675 680 685

Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu Glu Leu His Tyr Ala Ser

690 695 700

Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys Asp Thr Ser Thr Glu Tyr

705 710 715 720

Ser Glu Val Arg Thr Gln

725

<210> 2

<211> 481

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有小鼠Fc结构域的人全长 (FL)CD33，用作人FL CD33的免疫原

<400> 2

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Met Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln

20 25 30

Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro

35 40 45

Tyr Tyr Asp Lys Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly

50 55 60

Ala Ile Ile Ser Arg Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln

65 70 75 80

Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro

85 90 95

Ser Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp

100 105 110

Asn Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser

115 120 125

Tyr Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg

130 135 140

Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn

145 150 155 160

Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile

165 170 175

Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr

180 185 190

His Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr

195 200 205

Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu

210 215 220

Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr

225 230 235 240

Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser

260 265 270

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr

275 280 285

Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp

290 295 300

Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr

305 310 315 320

Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser

325 330 335

Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

340 345 350

Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys

355 360 365

Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr

370 375 380

Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr

385 390 395 400

Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln

405 410 415

Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met

420 425 430

Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys

435 440 445

Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu

450 455 460

Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly

465 470 475 480

Lys

<210> 3

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有小鼠Fc结构域的人CD33的ΔΕ2型式(CD33ΔE2)，用作人CD33 ΔE2的免疫原

<400> 3

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Asp Leu Thr His

1 5 10 15

Arg Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys

20 25 30

Asn Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro

35 40 45

Ile Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr

50 55 60

Thr His Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly

65 70 75 80

Thr Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr

85 90 95

Glu Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr

100 105 110

Thr Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val

130 135 140

Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile

145 150 155 160

Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp

165 170 175

Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His

180 185 190

Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg

195 200 205

Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

210 215 220

Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu

225 230 235 240

Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr

245 250 255

Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu

260 265 270

Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp

275 280 285

Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile

290 295 300

Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln

305 310 315 320

Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His

325 330 335

Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro

340 345 350

Gly Lys

<210> 4

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 小鼠CD33的细胞外结构域，其中来自小鼠的C2型Ig样结构域被来自人CD33的C2型Ig样结构域置换，与来自人lgG1的Fc区组合，用作免疫原以产生针对人C2型结构域的抗体

<400> 4

Met Leu Trp Pro Leu Pro Leu Phe Leu Leu Cys Ala Gly Ser Leu Ala

1 5 10 15

Gln Asp Leu Glu Phe Gln Leu Val Ala Pro Glu Ser Val Thr Val Glu

20 25 30

Glu Gly Leu Cys Val His Val Pro Cys Ser Val Phe Tyr Pro Ser Ile

35 40 45

Lys Leu Thr Leu Gly Pro Val Thr Gly Ser Trp Leu Arg Lys Gly Val

50 55 60

Ser Leu His Glu Asp Ser Pro Val Ala Thr Ser Asp Pro Arg Gln Leu

65 70 75 80

Val Gln Lys Ala Thr Gln Gly Arg Phe Gln Leu Leu Gly Asp Pro Gln

85 90 95

Lys His Asp Cys Ser Leu Phe Ile Arg Asp Ala Gln Lys Asn Asp Thr

100 105 110

Gly Met Tyr Phe Phe Arg Val Val Arg Glu Pro Phe Val Arg Tyr Ser

115 120 125

Tyr Lys Lys Ser Gln Leu Ser Leu His Val Thr Asp Leu Thr His Arg

130 135 140

Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn

145 150 155 160

Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile

165 170 175

Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr

180 185 190

His Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr

195 200 205

Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu

210 215 220

Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr

225 230 235 240

Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly

245 250 255

Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

260 265 270

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

275 280 285

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

290 295 300

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

305 310 315 320

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

325 330 335

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

340 345 350

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

355 360 365

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

370 375 380

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

385 390 395 400

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

405 410 415

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

420 425 430

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

435 440 445

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

450 455 460

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

465 470 475 480

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485

<210> 5

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 小鼠CD33的细胞外结构域(经过密码子优化)，其中来自小鼠的C2型Ig样结构域被来自人CD33的C2型Ig样结构域置换并与来自人IgG1的Fc区组合

<400> 5

atgctgtggc ctctgcctct gtttctgctg tgcgctggaa gtctggctca ggatctggaa 60

tttcagctgg tggctcccga atcagtcacc gtggaggagg gcctgtgcgt gcacgtgcct 120

tgtagcgtgt tctacccaag catcaagctg accctgggcc ctgtgacagg ctcctggctg 180

aggaagggcg tgtccctgca cgaggactct ccagtggcca ccagcgatcc taggcagctg 240

gtgcagaagg ccacacaggg cagattccag ctgctgggcg accctcagaa gcacgattgc 300

agcctgttta tccgcgacgc ccagaagaac gataccggca tgtatttctt tcgggtggtg 360

agagagccat tcgtgaggta ctcctataag aagtctcagc tgagcctgca cgtgaccgac 420

ctgacacacc gcccaaagat cctgatccca ggcaccctgg agcctggaca ctctaagaac 480

ctgacatgct ccgtgtcttg ggcatgtgag cagggaaccc cacctatctt ttcctggctg 540

tctgccgcac caacaagcct gggaccaagg accacacaca gctccgtgct gatcatcacc 600

cctagaccac aggatcacgg caccaatctg acatgccagg tgaagttcgc aggagcagga 660

gtgaccacag agaggaccat ccagctgaac gtgacatacg tgcctcagaa tccaaccaca 720

ggcatctttc caggcgacgg ctccggcaag caggagacac gggccggatc cgagcccaag 780

tctagcgata agacccacac atgcccacca tgtccagcac ctgagctgct gggaggacca 840

agcgtgttcc tgtttcctcc aaagcccaag gacacactga tgatctctcg gacccccgag 900

gtgacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt taactggtac 960

gtggatggcg tggaggtgca caatgccaag accaagccca gggaggagca gtacaactcc 1020

acctatcgcg tggtgtctgt gctgacagtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1080

tataagtgca aggtgtccaa taaggccctg ccagccccca tcgagaagac catctctaag 1140

gcaaagggac agcccaggga gcctcaggtg tacacactgc cccctagccg cgacgagctg 1200

accaagaacc aggtgtccct gacatgtctg gtgaagggct tctatccttc tgatatcgcc 1260

gtggagtggg agagcaatgg ccagccagag aacaattaca agaccacacc acccgtgctg 1320

gacagcgatg gctccttctt tctgtatagc aagctgaccg tggataagtc caggtggcag 1380

cagggcaacg tgttcagctg ttccgtgatg cacgaagcac tgcacaacca ctacactcag 1440

aaatcactgt cactgtcccc aggaaagtaa 1470

<210> 6

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 小鼠CD33的ECD；人CD33的C2型Ig样结构域与来源于人CD33的跨膜结构域和截短的细胞内结构域组合

<400> 6

Met Leu Trp Pro Leu Pro Leu Phe Leu Leu Cys Ala Gly Ser Leu Ala

1 5 10 15

Gln Asp Leu Glu Phe Gln Leu Val Ala Pro Glu Ser Val Thr Val Glu

20 25 30

Glu Gly Leu Cys Val His Val Pro Cys Ser Val Phe Tyr Pro Ser Ile

35 40 45

Lys Leu Thr Leu Gly Pro Val Thr Gly Ser Trp Leu Arg Lys Gly Val

50 55 60

Ser Leu His Glu Asp Ser Pro Val Ala Thr Ser Asp Pro Arg Gln Leu

65 70 75 80

Val Gln Lys Ala Thr Gln Gly Arg Phe Gln Leu Leu Gly Asp Pro Gln

85 90 95

Lys His Asp Cys Ser Leu Phe Ile Arg Asp Ala Gln Lys Asn Asp Thr

100 105 110

Gly Met Tyr Phe Phe Arg Val Val Arg Glu Pro Phe Val Arg Tyr Ser

115 120 125

Tyr Lys Lys Ser Gln Leu Ser Leu His Val Thr Asp Leu Thr His Arg

130 135 140

Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn

145 150 155 160

Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile

165 170 175

Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr

180 185 190

His Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr

195 200 205

Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu

210 215 220

Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr

225 230 235 240

Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly

245 250 255

Val Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala

260 265 270

Leu Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr

275 280

<210> 7

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 小鼠CD33的细胞外结构域，其中来自小鼠的C2型Ig样结构域被来自人CD33的C2型Ig样结构域置换并与来源于人CD33的跨膜结构域和截短的细胞内结构域组合

<400> 7

atgctgtggc ctctgcctct gtttctgctg tgcgctggaa gtctggctca ggatctggaa 60

tttcagctgg tggctcccga atcagtcacc gtggaggagg gcctgtgcgt gcacgtgcct 120

tgtagcgtgt tctacccaag catcaagctg accctgggcc ctgtgacagg ctcctggctg 180

aggaagggcg tgtccctgca cgaggactct ccagtggcca ccagcgatcc taggcagctg 240

gtgcagaagg ccacacaggg cagattccag ctgctgggcg accctcagaa gcacgattgc 300

agcctgttta tccgcgacgc ccagaagaac gataccggca tgtatttctt tcgggtggtg 360

agagagccat tcgtgaggta ctcctataag aagtctcagc tgagcctgca cgtgaccgac 420

ctgacacacc gcccaaagat cctgatccca ggcaccctgg agcctggaca ctctaagaac 480

ctgacatgct ccgtgtcttg ggcatgtgag cagggaaccc cacctatctt ttcctggctg 540

tctgccgcac caacaagcct gggaccaagg accacacaca gctccgtgct gatcatcacc 600

cctagaccac aggatcacgg caccaatctg acatgccagg tgaagttcgc aggagcagga 660

gtgaccacag agaggaccat ccagctgaac gtgacatacg tgcctcagaa tccaaccaca 720

ggcatctttc caggcgacgg ctccggcaag caggagacac gggccggagt ggttcatggg 780

gccattggag gagctggtgt tacagccctg ctcgctcttt gtctctgcct catcttcttc 840

atagtgaaga cctga 855

<210> 8

<211> 364

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Met Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln

20 25 30

Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro

35 40 45

Tyr Tyr Asp Lys Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly

50 55 60

Ala Ile Ile Ser Arg Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln

65 70 75 80

Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro

85 90 95

Ser Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp

100 105 110

Asn Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser

115 120 125

Tyr Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg

130 135 140

Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn

145 150 155 160

Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile

165 170 175

Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr

180 185 190

His Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr

195 200 205

Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu

210 215 220

Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr

225 230 235 240

Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly

245 250 255

Leu Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala

260 265 270

Leu Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys

275 280 285

Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Ser Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly

290 295 300

Ser Ala Ser Pro Lys His Gln Lys Asn Ser Lys Leu His Gly Pro Thr

305 310 315 320

Glu Thr Ser Ser Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu

325 330 335

Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys

340 345 350

Asp Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln

355 360

<210> 9

<211> 1095

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcagggg ccctggctat ggatccaaat 60

ttctggctgc aagtgcagga gtcagtgacg gtacaggagg gtttgtgcgt cctcgtgccc 120

tgcactttct tccatcccat accctactac gacaagaact ccccagttca tggttactgg 180

ttccgggaag gagccattat atccagggac tctccagtgg ccacaaacaa gctagatcaa 240

gaagtacagg aggagactca gggcagattc cgcctccttg gggatcccag taggaacaac 300

tgctccctga gcatcgtaga cgccaggagg agggataatg gttcatactt ctttcggatg 360

gagagaggaa gtaccaaata cagttacaaa tctccccagc tctctgtgca tgtgacagac 420

ttgacccaca ggcccaaaat cctcatccct ggcactctag aacccggcca ctccaaaaac 480

cttacctgct ctgtgtcctg ggcctgtgag cagggaacac ccccgatctt ctcctggttg 540

tcagctgccc ccacctccct gggccccagg actactcact cctcggtgct cataatcacc 600

ccacggcccc aggaccacgg caccaacctg acctgtcagg tgaagttcgc tggagctggt 660

gtgactacgg agagaaccat ccagctcaac gtcacctatg ttccacagaa cccaacaact 720

ggtatctttc caggagatgg ctcagggaaa caagagacca gagcaggact ggttcatggg 780

gccattggag gagctggtgt tacagccctg ctcgctcttt gtctctgcct catcttcttc 840

atagtgaaga cccacaggag gaaagcagcc aggacagcag tgggcagcaa tgacacccac 900

cctaccacag ggtcagcctc cccgaaacac cagaagaact ccaagttaca tggccccact 960

gaaacctcaa gctgttcagg tgccgcccct actgtggaga tggatgagga gctgcattat 1020

gcttccctca actttcatgg gatgaatcct tccaaggaca cctccaccga atactcagag 1080

gtcaggaccc agtga 1095

<210> 10

<211> 237

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Asp Leu Thr His

1 5 10 15

Arg Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys

20 25 30

Asn Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro

35 40 45

Ile Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr

50 55 60

Thr His Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly

65 70 75 80

Thr Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr

85 90 95

Glu Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr

100 105 110

Thr Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala

115 120 125

Gly Leu Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu

130 135 140

Ala Leu Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg

145 150 155 160

Lys Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Ser Asn Asp Thr His Pro Thr Thr

165 170 175

Gly Ser Ala Ser Pro Lys His Gln Lys Asn Ser Lys Leu His Gly Pro

180 185 190

Thr Glu Thr Ser Ser Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp

195 200 205

Glu Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser

210 215 220

Lys Asp Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln

225 230 235

<210> 11

<211> 714

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcagact tgacccacag gcccaaaatc 60

ctcatccctg gcactctaga acccggccac tccaaaaacc ttacctgctc tgtgtcctgg 120

gcctgtgagc agggaacacc cccgatcttc tcctggttgt cagctgcccc cacctccctg 180

ggccccagga ctactcactc ctcggtgctc ataatcaccc cacggcccca ggaccacggc 240

accaacctga cctgtcaggt gaagttcgct ggagctggtg tgactacgga gagaaccatc 300

cagctcaacg tcacctatgt tccacagaac ccaacaactg gtatctttcc aggagatggc 360

tcagggaaac aagagaccag agcaggactg gttcatgggg ccattggagg agctggtgtt 420

acagccctgc tcgctctttg tctctgcctc atcttcttca tagtgaagac ccacaggagg 480

aaagcagcca ggacagcagt gggcagcaat gacacccacc ctaccacagg gtcagcctcc 540

ccgaaacacc agaagaactc caagttacat ggccccactg aaacctcaag ctgttcaggt 600

gccgccccta ctgtggagat ggatgaggag ctgcattatg cttccctcaa ctttcatggg 660

atgaatcctt ccaaggacac ctccaccgaa tactcagagg tcaggaccca gtga 714

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10的CDRL1

<400> 12

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ile Tyr Leu Gly

1 5 10

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10和/或1D2的CDRL2

<400> 13

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10的CDRL3

<400> 14

Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10的CDRH1

<400> 15

Lys Gly Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Asp Met His

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10的CDRH2

<400> 16

Ile Ile Asp Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser

1 5 10

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10的CDRH3

<400> 17

Thr Arg Asp Tyr Ser Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9和/或1B9 的CDRL1

<400> 18

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp Leu Gly

1 5 10

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9的CDRL2

<400> 19

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9的CDRL3

<400> 20

Leu Gln Glu Tyr Asn Tyr Pro Cys Thr

1 5

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9的CDRH1

<400> 21

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Asp Met His

1 5 10

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9的CDRH2

<400> 22

Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr

1 5

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9的CDRH3

<400> 23

Ala Arg Glu Tyr Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6和/或1D2的CDRL1

<400> 24

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly

1 5 10

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6的CDRL2

<400> 25

Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6、1D2和/或1B9的CDRL3

<400> 26

Leu Gln Asp Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr

1 5

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6和/或1D2的CDRH1

<400> 27

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Ile His

1 5 10

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6和/或1D2的CDRH2

<400> 28

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Asn Tyr

1 5 10

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6和/或1D2 的CDRH3

<400> 29

Ala Arg Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1D2的CDRH2

<400> 30

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Gln Lys Tyr

1 5 10

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1B9的CDRL2

<400> 31

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 32

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1B9的CDRH1

<400> 32

Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Asp Ile His

1 5 10

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1B9的CDRH3

<400> 33

Ala Arg Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRL1

<400> 34

Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Gly Asn Leu His

1 5 10

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRL2

<400> 35

Tyr Ala Thr Gln Pro Phe Ser

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRL3

<400> 36

His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8和/或2E3的CDRH1

<400> 37

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 38

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRH2

<400> 38

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRH3

<400> 39

Asp Leu Asp Tyr Asp Ser Ser Gly

1 5

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRL1

<400> 40

Gln Ser Gly Ser Ser Ser Phe Leu Ser

1 5

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRL2

<400> 41

Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3 的CDRL3

<400> 42

Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Pro Phe Thr

1 5

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRH1

<400> 43

Ile Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 44

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRH2

<400> 44

Ile Ser Asp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRH3

<400> 45

Arg Thr Arg Tyr Phe Asn Gly

1 5

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRL1

<400> 46

Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRL2

<400> 47

Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRL3

<400> 48

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Thr

1 5

<210> 49

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRH2

<400> 49

Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 50

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRH3

<400> 50

Asp Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Val

1 5 10

<210> 51

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10可变轻链

<400> 51

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ile Tyr

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 52

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10可变重链

<400> 52

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Met Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asp Tyr Ser Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 53

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9可变轻链

<400> 53

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Glu Tyr Asn Tyr Pro Cys

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 54

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9可变重链

<400> 54

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr

20 25 30

Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Tyr Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 55

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6可变轻链

<400> 55

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ser Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 56

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6可变重链

<400> 56

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Asn Tyr Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 57

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1D2可变轻链

<400> 57

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ser Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 58

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1D2可变重链

<400> 58

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Gln Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 59

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1B9可变轻链

<400> 59

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ser Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 60

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1B9可变重链

<400> 60

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Asn Tyr Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 61

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8可变轻链

<400> 61

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Gly Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Arg Tyr Ala Thr Gln Pro Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Gly Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 62

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8可变重链

<400> 62

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys His Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Asp Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ile Leu Val Leu Val Ser Ser

115 120

<210> 63

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3可变轻链

<400> 63

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Gly Ser Ser Ser

20 25 30

Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 64

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3可变重链

<400> 64

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Arg Thr Arg Tyr Phe Asn Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 65

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3可变轻链

<400> 65

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 66

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3可变重链

<400> 66

Gln Val Cys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120

<210> 67

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OKT3的CDRL1

<400> 67

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn

1 5 10

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OKT3的CDRL2

<400> 68

Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5 10

<210> 69

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OKT3的CDRL3

<400> 69

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

1 5

<210> 70

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OKT3的CDRH1

<400> 70

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His

1 5 10

<210> 71

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OKT3的CDRH2

<400> 71

Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp

1 5 10 15

<210> 72

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OKT3的CDRH3

<400> 72

Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 73

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OKT3 scFv

<400> 73

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala

130 135 140

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala

145 150 155 160

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr

165 170 175

Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val

180 185 190

Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

195 200 205

Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

210 215 220

Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

225 230 235 240

Asn Arg

<210> 74

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 20G6-F3的CDRL1

<400> 74

Gln Ser Leu Val His Asn Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 75

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 20G6-F3、4B4-D7和/或4E7-C9的CDRL3

<400> 75

Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 20G6-F3 的CDRH1

<400> 76

Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp

1 5

<210> 77

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 20G6-F3的CDRH2

<400> 77

Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr

1 5 10

<210> 78

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 20G6-F3的CDRH3

<400> 78

Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 79

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4B4-D7的CDRL1

<400> 79

Gln Ser Leu Val His Asp Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 80

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4B4-D7和/或4E7-C9的CDRH1

<400> 80

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp

1 5

<210> 81

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4B4-D7的CDRH2

<400> 81

Ile Lys Ala Arg Ser Asn Asn Tyr Ala Thr

1 5 10

<210> 82

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4B4-D7的CDRH3

<400> 82

Arg Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Lys Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 83

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4E7-C9的CDRL1

<400> 83

Gln Ser Leu Glu His Asn Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 84

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4E7-C9的CDRH2

<400> 84

Ile Lys Asp Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr

1 5 10

<210> 85

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4E7-C9的CDRH3

<400> 85

Arg Tyr Val His Tyr Gly Ile Gly Tyr Ala Met Asp Ala

1 5 10

<210> 86

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18F5-H10的CDRL1

<400> 86

Gln Ser Leu Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 87

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18F5-H10的CDRL3

<400> 87

Gly Gln Gly Thr His Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 88

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18F5-H10的CDRH1

<400> 88

Gly Phe Thr Phe Thr Asn Ala Trp

1 5

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18F5-H10的CDRH2

<400> 89

Lys Asp Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr

1 5

<210> 90

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18F5-H10的CDRH3

<400> 90

Arg Tyr Val His Tyr Arg Phe Ala Tyr Ala Leu Asp Ala

1 5 10

<210> 91

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TGN1412可变重链

<400> 91

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 92

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TGN1412可变轻链

<400> 92

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 93

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD28 CDRL1

<400> 93

His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp Leu Asn

1 5 10

<210> 94

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD28 CDRL2

<400> 94

Lys Ala Ser Asn Leu His Thr

1 5

<210> 95

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD28 CDRL3

<400> 95

Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 96

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD28 CDRH1

<400> 96

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His

1 5 10

<210> 97

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD28 CDRH2

<400> 97

Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys

1 5 10

<210> 98

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD28 CDRH3

<400> 98

Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val

1 5 10

<210> 99

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD28 CDRH1

<400> 99

Ser Tyr Tyr Ile His

1 5

<210> 100

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD28 CDRH2

<400> 100

Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 101

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗4-1BB CDRL1

<400> 101

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser

1 5

<210> 102

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗4-1BB CDRL2

<400> 102

Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 103

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗4-1BB CDRL3

<400> 103

Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Ala Leu Thr

1 5 10

<210> 104

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗4-1BB CDRH1

<400> 104

Tyr Tyr Trp Ser

1

<210> 105

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗4-1BB CDRH3

<400> 105

Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 106

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗4-1BB CDRL1

<400> 106

Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala His

1 5 10

<210> 107

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗4-1BB CDRL2

<400> 107

Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 108

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗4-1BB CDRL3

<400> 108

Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu Ala Val

1 5 10

<210> 109

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗4-1BB CDRH1

<400> 109

Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr Trp Ile Ser

1 5 10

<210> 110

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗4-1BB CDRH2

<400> 110

Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser

1 5 10

<210> 111

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗4-1BB CDRH3

<400> 111

Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr

1 5

<210> 112

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OKT8的CDRL1

<400> 112

Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 113

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OKT8的CDRL2

<400> 113

Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 114

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OKT8的CDRL3

<400> 114

Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu Thr

1 5

<210> 115

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OKT8的CDRH1

<400> 115

Gly Phe Asn Ile Lys Asp

1 5

<210> 116

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OKT8的CDRLH2

<400> 116

Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr

1 5

<210> 117

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OKT8的CDRH3

<400> 117

Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His

1 5

<210> 118

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> KIR2DL1和KIR2DL2/3的可变轻链

<400> 118

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Met Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 119

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> KIR2DL1和KIR2DL2/3的可变重链

<400> 119

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Ile Pro Ile Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Pro Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Asp Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 120

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(20)

<223> Any of residues 1 to 20 can be present or absent

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(20)

<223> Entire sequence can be repeated n times wherein n is an integer

of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10).

<400> 120

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser

1 5 10 15

Ser Ser Ser Ser

20

<210> 121

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(5)

<223> (GlyGlyGlyGlySer)可重复n次，其中n是整数1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

<400> 121

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 122

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(4)

<223> (GlyGlyGlySer)可重复n次，其中n是整数1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(9)

<400> 122

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 123

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(4)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(7)

<223> (GlyGlySer)可重复n次，其中n是整数1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

<400> 123

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 124

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(4)

<400> 124

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 125

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<400> 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 126

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<400> 126

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 127

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<400> 127

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 128

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<400> 128

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 129

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<400> 129

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 130

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<400> 130

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 131

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<400> 131

Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 132

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<400> 132

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 133

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<400> 133

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 134

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlySer连接子

<400> 134

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 135

<211> 2178

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33:CD22 4D核苷酸

<400> 135

atgcctctgc tgctactgct acctctgctg tgggctggag ccctggctat gcatcatcac 60

caccatcacg gcggcggcga tccaaatttc tggctgcaag tgcaggagtc agtgacggta 120

caggagggtt tgtgcgtcct cgtgccctgc actttcttcc atcccatacc ctactacgac 180

aagaactccc cagttcatgg ttactggttc cgggaaggag ccattatatc cagggactct 240

ccagtggcca caaacaagct agatcaagaa gtacaggagg agactcaggg cagattccgc 300

ctccttgggg atcccagtag gaacaactgc tccctgagca tcgtagacgc caggaggagg 360

gataatggtt catacttctt tcggatggag agaggaagta ccaaatacag ttacaaatct 420

ccccagctct ctgtgcatgt gacagacttg acccacaggc ccaaaatcct catccctggc 480

actctagaac ccggccactc caaaaacctg acctgctctg tgtcctgggc ctgtgagcag 540

ggaacacccc cgatcttctc ctggttgtca gctgccccca cctccctggg ccccaggact 600

actcactcct cggtgctcat aatcacccca cggccccagg accacggcac caacctgacc 660

tgtcaggtga agttcgctgg agctggtgtg actacggaga gaaccatcca gctgaacgtc 720

acctatgttc cacagaaccc aacaactggt atctttccag gagatggctc agggaaacaa 780

gagaccagag caggagtggt tcatccggaa ccttccacgg ttcagatcct ccactcaccg 840

gctgtggagg gaagtcaagt cgagtttctt tgcatgtcac tggccaatcc tcttccaaca 900

aattacacgt ggtaccacaa tgggaaagaa atgcagggaa ggacagagga gaaagtccac 960

atcccaaaga tcctcccttg gcacgctggg acttattcct gtgtggcaga aaacattctt 1020

ggtactggac agaggggccc tggagctgag ctggatgtcc agtatcctcc caagaaggtg 1080

accacagtga ttcaaaaccc catgccgatt cgagaaggag acacagtgac cctttcctgt 1140

aactacaatt ccagtaaccc cagtgttacc cggtatgaat ggaaacccca tggcgcctgg 1200

gaggagccat cgcttggggt gctgaagatc caaaacgttg gctgggacaa cacaaccatc 1260

gcctgcgcag cttgtaatag ttggtgctcg tgggcctccc ctgtcgccct gaatgtccag 1320

tatgcccccc gagacgtgag ggtccggaaa atcaagcccc tttccgagat tcactctgga 1380

aactcggtca gcctccaatg tgacttctca agcagccacc ccaaagaagt ccagttcttc 1440

tgggagaaaa atggcaggct tctggggaaa gaaagccagc tgaattttga ctccatctcc 1500

ccagaagatg ctgggagtta cagctgctgg gtgaacaact ccataggaca gacagcgtcc 1560

aaggcctgga cacttgaagt gctgtatgca cccaggaggc tgcgtgtgtc catgagccca 1620

ggggaccaag tgatggaggg gaagagtgca accctgacct gtgagagcga cgccaaccct 1680

cccgtctccc actacacctg gtttgactgg aataaccaaa gcctccccta ccacagccag 1740

aagctgagat tggagccggt gaaggtccag cactcgggtg cctactggtg ccaggggacc 1800

aacagtgtgg gcaagggccg ttcgcctctc agcaccctca ccgtctacta tagcccggag 1860

accggggcca ttggaggagc tggtgttaca gccctgctcg ctctttgtct ctgcctcatc 1920

ttcttcatag tgaagaccca caggaggaaa gcagccagga cagcagtggg caggaatgac 1980

acccacccta ccacagggtc agcctccccg aaacaccaga agaagtccaa gttacatggc 2040

cccactgaaa cctcaagctg ttcaggtgcc gcccctactg tggagatgga tgaggagctg 2100

cattatgctt ccctcaactt tcatgggatg aatccttcca aggacacctc caccgaatac 2160

tcagaggtca ggacccag 2178

<210> 136

<211> 552

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33:CD22 2D蛋白质

<400> 136

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Met His His His His His His Gly Gly Gly Asp Pro Asn Phe Trp Leu

20 25 30

Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln Glu Gly Leu Cys Val Leu Val

35 40 45

Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro Tyr Tyr Asp Lys Asn Ser Pro

50 55 60

Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly Ala Ile Ile Ser Arg Asp Ser

65 70 75 80

Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln

85 90 95

Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro Ser Arg Asn Asn Cys Ser Leu

100 105 110

Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp Asn Gly Ser Tyr Phe Phe Arg

115 120 125

Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Tyr Lys Ser Pro Gln Leu Ser

130 135 140

Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly

145 150 155 160

Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp

165 170 175

Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala

180 185 190

Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr His Ser Ser Val Leu Ile Ile

195 200 205

Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys

210 215 220

Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val

225 230 235 240

Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly

245 250 255

Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly Val Val His Pro Arg Asp Val

260 265 270

Arg Val Arg Lys Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser

275 280 285

Val Ser Leu Gln Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln

290 295 300

Phe Phe Trp Glu Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu

305 310 315 320

Asn Phe Asp Ser Ile Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp

325 330 335

Val Asn Asn Ser Ile Gly Gln Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr Leu Glu

340 345 350

Val Leu Tyr Ala Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met Ser Pro Gly Asp

355 360 365

Gln Val Met Glu Gly Lys Ser Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser Asp Ala

370 375 380

Asn Pro Pro Val Ser His Tyr Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn Gln Ser

385 390 395 400

Leu Pro Tyr His Ser Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys Val Gln

405 410 415

His Ser Gly Ala Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly

420 425 430

Arg Ser Pro Leu Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr Gly

435 440 445

Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala Leu Cys Leu Cys

450 455 460

Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys Ala Ala Arg Thr

465 470 475 480

Ala Val Gly Arg Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly Ser Ala Ser Pro

485 490 495

Lys His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Pro Thr Glu Thr Ser Ser

500 505 510

Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu Glu Leu His Tyr

515 520 525

Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys Asp Thr Ser Thr

530 535 540

Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln

545 550

<210> 137

<211> 1656

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33:CD22 2D核苷酸

<400> 137

atgcctctgc tgctactgct acctctgctg tgggctggag ccctggctat gcatcatcac 60

caccatcacg gcggcggcga tccaaatttc tggctgcaag tgcaggagtc agtgacggta 120

caggagggtt tgtgcgtcct cgtgccctgc actttcttcc atcccatacc ctactacgac 180

aagaactccc cagttcatgg ttactggttc cgggaaggag ccattatatc cagggactct 240

ccagtggcca caaacaagct agatcaagaa gtacaggagg agactcaggg cagattccgc 300

ctccttgggg atcccagtag gaacaactgc tccctgagca tcgtagacgc caggaggagg 360

gataatggtt catacttctt tcggatggag agaggaagta ccaaatacag ttacaaatct 420

ccccagctct ctgtgcatgt gacagacttg acccacaggc ccaaaatcct catccctggc 480

actctagaac ccggccactc caaaaacctg acctgctctg tgtcctgggc ctgtgagcag 540

ggaacacccc cgatcttctc ctggttgtca gctgccccca cctccctggg ccccaggact 600

actcactcct cggtgctcat aatcacccca cggccccagg accacggcac caacctgacc 660

tgtcaggtga agttcgctgg agctggtgtg actacggaga gaaccatcca gctgaacgtc 720

acctatgttc cacagaaccc aacaactggt atctttccag gagatggctc agggaaacaa 780

gagaccagag caggagtggt tcatccccga gacgtgaggg tccggaaaat caagcccctt 840

tccgagattc actctggaaa ctcggtcagc ctccaatgtg acttctcaag cagccacccc 900

aaagaagtcc agttcttctg ggagaaaaat ggcaggcttc tggggaaaga aagccagctg 960

aattttgact ccatctcccc agaagatgct gggagttaca gctgctgggt gaacaactcc 1020

ataggacaga cagcgtccaa ggcctggaca cttgaagtgc tgtatgcacc caggaggctg 1080

cgtgtgtcca tgagcccagg ggaccaagtg atggagggga agagtgcaac cctgacctgt 1140

gagagcgacg ccaaccctcc cgtctcccac tacacctggt ttgactggaa taaccaaagc 1200

ctcccctacc acagccagaa gctgagattg gagccggtga aggtccagca ctcgggtgcc 1260

tactggtgcc aggggaccaa cagtgtgggc aagggccgtt cgcctctcag caccctcacc 1320

gtctactata gcccggagac cggggccatt ggaggagctg gtgttacagc cctgctcgct 1380

ctttgtctct gcctcatctt cttcatagtg aagacccaca ggaggaaagc agccaggaca 1440

gcagtgggca ggaatgacac ccaccctacc acagggtcag cctccccgaa acaccagaag 1500

aagtccaagt tacatggccc cactgaaacc tcaagctgtt caggtgccgc ccctactgtg 1560

gagatggatg aggagctgca ttatgcttcc ctcaactttc atgggatgaa tccttccaag 1620

gacacctcca ccgaatactc agaggtcagg acccag 1656

<210> 138

<211> 280

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33 V型构建体(缺失外显子3和4)蛋白质

<400> 138

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Met His His His His His His Gly Gly Gly Asp Pro Asn Phe Trp Leu

20 25 30

Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln Glu Gly Leu Cys Val Leu Val

35 40 45

Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro Tyr Tyr Asp Lys Asn Ser Pro

50 55 60

Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly Ala Ile Ile Ser Arg Asp Ser

65 70 75 80

Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln

85 90 95

Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro Ser Arg Asn Asn Cys Ser Leu

100 105 110

Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp Asn Gly Ser Tyr Phe Phe Arg

115 120 125

Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Tyr Lys Ser Pro Gln Leu Ser

130 135 140

Val His Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr Gly Ile Phe Pro

145 150 155 160

Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly Val Val His Gly

165 170 175

Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala Leu Cys Leu Cys

180 185 190

Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys Ala Ala Arg Thr

195 200 205

Ala Val Gly Arg Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly Ser Ala Ser Pro

210 215 220

Lys His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Pro Thr Glu Thr Ser Ser

225 230 235 240

Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu Glu Leu His Tyr

245 250 255

Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys Asp Thr Ser Thr

260 265 270

Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln

275 280

<210> 139

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33 V型构建体(缺失外显子3和4)核苷酸

<400> 139

atgcctctgc tgctactgct acctctgctg tgggctggag ccctggctat gcatcatcac 60

caccatcacg gcggcggcga tccaaatttc tggctgcaag tgcaggagtc agtgacggta 120

caggagggtt tgtgcgtcct cgtgccctgc actttcttcc atcccatacc ctactacgac 180

aagaactccc cagttcatgg ttactggttc cgggaaggag ccattatatc cagggactct 240

ccagtggcca caaacaagct agatcaagaa gtacaggagg agactcaggg cagattccgc 300

ctccttgggg atcccagtag gaacaactgc tccctgagca tcgtagacgc caggaggagg 360

gataatggtt catacttctt tcggatggag agaggaagta ccaaatacag ttacaaatct 420

ccccagctct ctgtgcatgt gacatatgtt ccacagaacc caacaactgg tatctttcca 480

ggagatggct cagggaaaca agagaccaga gcaggagtgg ttcatggggc cattggagga 540

gctggtgtta cagccctgct cgctctttgt ctctgcctca tcttcttcat agtgaagacc 600

cacaggagga aagcagccag gacagcagtg ggcaggaatg acacccaccc taccacaggg 660

tcagcctccc cgaaacacca gaagaagtcc aagttacatg gccccactga aacctcaagc 720

tgttcaggtg ccgcccctac tgtggagatg gatgaggagc tgcattatgc ttccctcaac 780

tttcatggga tgaatccttc caaggacacc tccaccgaat actcagaggt caggacccag 840

<210> 140

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33信号肽

<400> 140

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Met

<210> 141

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33信号肽编码序列

<400> 141

atgcctctgc tgctactgct acctctgctg tgggctggag ccctggctat g 51

<210> 142

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> His标签

<400> 142

His His His His His His

1 5

<210> 143

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> His标签编码序列

<400> 143

catcatcacc accatcac 18

<210> 144

<400> 144

000

<210> 145

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33细胞外结构域

<400> 145

Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln Glu

1 5 10 15

Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro Tyr

20 25 30

Tyr Asp Lys Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly Ala

35 40 45

Ile Ile Ser Arg Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln Glu

50 55 60

Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro Ser

65 70 75 80

Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp Asn

85 90 95

Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Tyr

100 105 110

Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg Pro

115 120 125

Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn Leu

130 135 140

Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile Phe

145 150 155 160

Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr His

165 170 175

Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr Asn

180 185 190

Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu Arg

195 200 205

Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr Gly

210 215 220

Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly Val

225 230 235 240

Val His

<210> 146

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33细胞外结构域编码序列

<400> 146

gatccaaatt tctggctgca agtgcaggag tcagtgacgg tacaggaggg tttgtgcgtc 60

ctcgtgccct gcactttctt ccatcccata ccctactacg acaagaactc cccagttcat 120

ggttactggt tccgggaagg agccattata tccagggact ctccagtggc cacaaacaag 180

ctagatcaag aagtacagga ggagactcag ggcagattcc gcctccttgg ggatcccagt 240

aggaacaact gctccctgag catcgtagac gccaggagga gggataatgg ttcatacttc 300

tttcggatgg agagaggaag taccaaatac agttacaaat ctccccagct ctctgtgcat 360

gtgacagact tgacccacag gcccaaaatc ctcatccctg gcactctaga acccggccac 420

tccaaaaacc tgacctgctc tgtgtcctgg gcctgtgagc agggaacacc cccgatcttc 480

tcctggttgt cagctgcccc cacctccctg ggccccagga ctactcactc ctcggtgctc 540

ataatcaccc cacggcccca ggaccacggc accaacctga cctgtcaggt gaagttcgct 600

ggagctggtg tgactacgga gagaaccatc cagctgaacg tcacctatgt tccacagaac 660

ccaacaactg gtatctttcc aggagatggc tcagggaaac aagagaccag agcaggagtg 720

gttcat 726

<210> 147

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 缺少CD33氨基酸140-232的CD33细胞外结构域

<400> 147

Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln Glu

1 5 10 15

Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro Tyr

20 25 30

Tyr Asp Lys Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly Ala

35 40 45

Ile Ile Ser Arg Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln Glu

50 55 60

Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro Ser

65 70 75 80

Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp Asn

85 90 95

Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Tyr

100 105 110

Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro

115 120 125

Thr Thr Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg

130 135 140

Ala Gly Val Val His

145

<210> 148

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 缺少CD33氨基酸140-232的CD33细胞外结构域的编码序列

<400> 148

gatccaaatt tctggctgca agtgcaggag tcagtgacgg tacaggaggg tttgtgcgtc 60

ctcgtgccct gcactttctt ccatcccata ccctactacg acaagaactc cccagttcat 120

ggttactggt tccgggaagg agccattata tccagggact ctccagtggc cacaaacaag 180

ctagatcaag aagtacagga ggagactcag ggcagattcc gcctccttgg ggatcccagt 240

aggaacaact gctccctgag catcgtagac gccaggagga gggataatgg ttcatacttc 300

tttcggatgg agagaggaag taccaaatac agttacaaat ctccccagct ctctgtgcat 360

gtgacatatg ttccacagaa cccaacaact ggtatctttc caggagatgg ctcagggaaa 420

caagagacca gagcaggagt ggttcat 447

<210> 149

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33跨膜结构域

<400> 149

Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala Leu Cys Leu

1 5 10 15

Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val

20

<210> 150

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33跨膜结构域编码序列

<400> 150

ggggccattg gaggagctgg tgttacagcc ctgctcgctc tttgtctctg cctcatcttc 60

ttcatagtg 69

<210> 151

<211> 82

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33细胞内结构域

<400> 151

Lys Thr His Arg Arg Lys Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Arg Asn Asp

1 5 10 15

Thr His Pro Thr Thr Gly Ser Ala Ser Pro Lys His Gln Lys Lys Ser

20 25 30

Lys Leu His Gly Pro Thr Glu Thr Ser Ser Cys Ser Gly Ala Ala Pro

35 40 45

Thr Val Glu Met Asp Glu Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Asn Phe His

50 55 60

Gly Met Asn Pro Ser Lys Asp Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Val Arg

65 70 75 80

Thr Gln

<210> 152

<211> 246

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD33细胞内结构域编码序列

<400> 152

aagacccaca ggaggaaagc agccaggaca gcagtgggca ggaatgacac ccaccctacc 60

acagggtcag cctccccgaa acaccagaag aagtccaagt tacatggccc cactgaaacc 120

tcaagctgtt caggtgccgc ccctactgtg gagatggatg aggagctgca ttatgcttcc 180

ctcaactttc atgggatgaa tccttccaag gacacctcca ccgaatactc agaggtcagg 240

acccag 246

<210> 153

<211> 353

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD22细胞外结构域中含有定义为Ig样C2型3、Ig样C2型4、Ig样C2型5、Ig样C2型6的CD22结构域的部分

<400> 153

Pro Glu Pro Ser Thr Val Gln Ile Leu His Ser Pro Ala Val Glu Gly

1 5 10 15

Ser Gln Val Glu Phe Leu Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr

20 25 30

Asn Tyr Thr Trp Tyr His Asn Gly Lys Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu

35 40 45

Glu Lys Val His Ile Pro Lys Ile Leu Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr

50 55 60

Ser Cys Val Ala Glu Asn Ile Leu Gly Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly

65 70 75 80

Ala Glu Leu Asp Val Gln Tyr Pro Pro Lys Lys Val Thr Thr Val Ile

85 90 95

Gln Asn Pro Met Pro Ile Arg Glu Gly Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys

100 105 110

Asn Tyr Asn Ser Ser Asn Pro Ser Val Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro

115 120 125

His Gly Ala Trp Glu Glu Pro Ser Leu Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn

130 135 140

Val Gly Trp Asp Asn Thr Thr Ile Ala Cys Ala Ala Cys Asn Ser Trp

145 150 155 160

Cys Ser Trp Ala Ser Pro Val Ala Leu Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg

165 170 175

Asp Val Arg Val Arg Lys Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His Ser Gly

180 185 190

Asn Ser Val Ser Leu Gln Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro Lys Glu

195 200 205

Val Gln Phe Phe Trp Glu Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser

210 215 220

Gln Leu Asn Phe Asp Ser Ile Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser

225 230 235 240

Cys Trp Val Asn Asn Ser Ile Gly Gln Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr

245 250 255

Leu Glu Val Leu Tyr Ala Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met Ser Pro

260 265 270

Gly Asp Gln Val Met Glu Gly Lys Ser Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser

275 280 285

Asp Ala Asn Pro Pro Val Ser His Tyr Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn

290 295 300

Gln Ser Leu Pro Tyr His Ser Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys

305 310 315 320

Val Gln His Ser Gly Ala Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly

325 330 335

Lys Gly Arg Ser Pro Leu Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu

340 345 350

Thr

<210> 154

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD22细胞外结构域中含有定义为Ig样C2型3、Ig样C2型4、Ig样C2型5、Ig样C2型6的CD22结构域的部分的编码序列

<400> 154

ccggaacctt ccacggttca gatcctccac tcaccggctg tggagggaag tcaagtcgag 60

tttctttgca tgtcactggc caatcctctt ccaacaaatt acacgtggta ccacaatggg 120

aaagaaatgc agggaaggac agaggagaaa gtccacatcc caaagatcct cccttggcac 180

gctgggactt attcctgtgt ggcagaaaac attcttggta ctggacagag gggccctgga 240

gctgagctgg atgtccagta tcctcccaag aaggtgacca cagtgattca aaaccccatg 300

ccgattcgag aaggagacac agtgaccctt tcctgtaact acaattccag taaccccagt 360

gttacccggt atgaatggaa accccatggc gcctgggagg agccatcgct tggggtgctg 420

aagatccaaa acgttggctg ggacaacaca accatcgcct gcgcagcttg taatagttgg 480

tgctcgtggg cctcccctgt cgccctgaat gtccagtatg ccccccgaga cgtgagggtc 540

cggaaaatca agcccctttc cgagattcac tctggaaact cggtcagcct ccaatgtgac 600

ttctcaagca gccaccccaa agaagtccag ttcttctggg agaaaaatgg caggcttctg 660

gggaaagaaa gccagctgaa ttttgactcc atctccccag aagatgctgg gagttacagc 720

tgctgggtga acaactccat aggacagaca gcgtccaagg cctggacact tgaagtgctg 780

tatgcaccca ggaggctgcg tgtgtccatg agcccagggg accaagtgat ggaggggaag 840

agtgcaaccc tgacctgtga gagcgacgcc aaccctcccg tctcccacta cacctggttt 900

gactggaata accaaagcct cccctaccac agccagaagc tgagattgga gccggtgaag 960

gtccagcact cgggtgccta ctggtgccag gggaccaaca gtgtgggcaa gggccgttcg 1020

cctctcagca ccctcaccgt ctactatagc ccggagacc 1059

<210> 155

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD22细胞外结构域中含有定义为Ig样C2型5、Ig样C2型6的CD22结构域的部分

<400> 155

Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His

1 5 10 15

Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro

20 25 30

Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys

35 40 45

Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser Ile Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser

50 55 60

Tyr Ser Cys Trp Val Asn Asn Ser Ile Gly Gln Thr Ala Ser Lys Ala

65 70 75 80

Trp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met

85 90 95

Ser Pro Gly Asp Gln Val Met Glu Gly Lys Ser Ala Thr Leu Thr Cys

100 105 110

Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val Ser His Tyr Thr Trp Phe Asp Trp

115 120 125

Asn Asn Gln Ser Leu Pro Tyr His Ser Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro

130 135 140

Val Lys Val Gln His Ser Gly Ala Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser

145 150 155 160

Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser

165 170 175

Pro Glu Thr

<210> 156

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD22细胞外结构域中含有定义为Ig样C2型5、Ig样C2型6的CD22结构域的部分的编码序列

<400> 156

ccccgagacg tgagggtccg gaaaatcaag cccctttccg agattcactc tggaaactcg 60

gtcagcctcc aatgtgactt ctcaagcagc caccccaaag aagtccagtt cttctgggag 120

aaaaatggca ggcttctggg gaaagaaagc cagctgaatt ttgactccat ctccccagaa 180

gatgctggga gttacagctg ctgggtgaac aactccatag gacagacagc gtccaaggcc 240

tggacacttg aagtgctgta tgcacccagg aggctgcgtg tgtccatgag cccaggggac 300

caagtgatgg aggggaagag tgcaaccctg acctgtgaga gcgacgccaa ccctcccgtc 360

tcccactaca cctggtttga ctggaataac caaagcctcc cctaccacag ccagaagctg 420

agattggagc cggtgaaggt ccagcactcg ggtgcctact ggtgccaggg gaccaacagt 480

gtgggcaagg gccgttcgcc tctcagcacc ctcaccgtct actatagccc ggagacc 537

<210> 157

<211> 520

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6/CD3双特异性分子

<400> 157

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val

20 25 30

Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

Phe Ser Ser Tyr Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Asn Tyr Tyr

65 70 75 80

Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

85 90 95

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser

145 150 155 160

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

165 170 175

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys

180 185 190

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln

195 200 205

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

210 215 220

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Leu Gln Asp Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

245 250 255

Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

260 265 270

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala

275 280 285

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln

290 295 300

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr

305 310 315 320

Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr

325 330 335

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn

340 345 350

Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn

355 360 365

Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

370 375 380

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr

405 410 415

Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly

420 425 430

Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly

435 440 445

Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly

450 455 460

Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu

465 470 475 480

Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val

485 490 495

Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

500 505 510

Val Leu His His His His His His

515 520

<210> 158

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IgK信号肽

<400> 158

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 159

<400> 159

000

<210> 160

<400> 160

000

<210> 161

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD3的可变重链

<400> 161

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 162

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗CD3的可变轻链

<400> 162

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly

20 25 30

Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 163

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRL2

<400> 163

Arg Tyr Ala Thr Gln Pro Phe Ser

1 5

<210> 164

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRH1

<400> 164

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr Gly Met His

1 5 10

<210> 165

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRH2

<400> 165

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Tyr

1 5 10

<210> 166

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRH3

<400> 166

Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Asp Ser Ser Gly Gly Asp Tyr

1 5 10

<210> 167

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRL1

<400> 167

Arg Ala Ser Gln Ser Gly Ser Ser Ser Phe Leu Ser

1 5 10

<210> 168

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRL2

<400> 168

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 169

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRH1

<400> 169

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210> 170

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRH2

<400> 170

Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr

1 5 10

<210> 171

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRH3

<400> 171

Ala Lys Arg Thr Arg Tyr Phe Asn Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 172

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRL1

<400> 172

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 173

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRL2

<400> 173

Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 174

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRH1

<400> 174

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His

1 5 10

<210> 175

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRH2

<400> 175

Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Tyr

1 5 10

<210> 176

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRH3

<400> 176

Ala Arg Asp Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 177

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10的CDRL1

<400> 177

Gln Gly Ile Arg Ile Tyr

1 5

<210> 178

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10的CDRH1

<400> 178

Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Asp

1 5

<210> 179

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10的CDRH2

<400> 179

Ile Asp Pro Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 180

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9和/或1B9的CDRL1

<400> 180

Gln Asp Ile Arg Asn Asp

1 5

<210> 181

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 的CDRH11A9

<400> 181

Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Asp

1 5

<210> 182

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9的CDRH2

<400> 182

Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr

1 5

<210> 183

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6和/或1D2的CDRL1

<400> 183

Gln Gly Ile Arg Asn Asp

1 5

<210> 184

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6和/或1D2的CDRH1

<400> 184

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp

1 5

<210> 185

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6和/或1B9的CDRH2

<400> 185

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Asn

1 5

<210> 186

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1D2的CDRH2

<400> 186

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Gln Lys

1 5

<210> 187

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1B9 的CDRH1

<400> 187

Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Asp

1 5

<210> 188

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRL1

<400> 188

Gln Asn Ile Gly Gly Asn

1 5

<210> 189

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRH1

<400> 189

Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr Gly

1 5

<210> 190

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRH2

<400> 190

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu

1 5

<210> 191

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRL1

<400> 191

Gln Ser Gly Ser Ser Ser Phe

1 5

<210> 192

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRH1

<400> 192

Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Ala

1 5

<210> 193

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRH2

<400> 193

Ile Ser Asp Ser Gly Gly Thr Thr

1 5

<210> 194

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRL1

<400> 194

Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr

1 5

<210> 195

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRH1

<400> 195

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly

1 5

<210> 196

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRH2

<400> 196

Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 197

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10的CDRH1

<400> 197

Ser Tyr Asp Met His

1 5

<210> 198

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10的CDRH2

<400> 198

Ile Ile Asp Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 199

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10的CDRH3

<400> 199

Asp Tyr Ser Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 200

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9的CDRL2

<400> 200

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 201

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9的CDRH1

<400> 201

Ile Tyr Asp Met His

1 5

<210> 202

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9的CDRH2

<400> 202

Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 203

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9的CDRH3

<400> 203

Glu Tyr Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 204

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6的CDRL2

<400> 204

Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser

1 5

<210> 205

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6、1D2和/或1B9 的CDRH1

<400> 205

Ser Tyr Asp Ile His

1 5

<210> 206

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6和/或1B9的CDRH2

<400> 206

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Asn Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 207

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6和/或1D2的CDRH3

<400> 207

Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr

1 5

<210> 208

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10和/或1D2的CDRL2

<400> 208

Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 209

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1D2的CDRH2

<400> 209

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Gln Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 210

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1B9的CDRL2

<400> 210

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 211

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1B9的CDRH3

<400> 211

Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 212

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRH2

<400> 212

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 213

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRH3

<400> 213

Asp Leu Asp Tyr Asp Ser Ser Gly Gly Asp Tyr

1 5 10

<210> 214

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRH2

<400> 214

Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 215

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRH3

<400> 215

Arg Thr Arg Tyr Phe Asn Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 216

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRH2

<400> 216

Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 217

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRH3

<400> 217

Asp Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Val

1 5 10

<210> 218

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10的CDRH1

<400> 218

Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr

1 5

<210> 219

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10的CDRH2

<400> 219

Asp Pro Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 220

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9和/或2D3的CDRH1

<400> 220

Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr

1 5

<210> 221

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9的CDRH2

<400> 221

Gly Thr Ala Gly Asp

1 5

<210> 222

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6、1D2和/或2E3的CDRH1

<400> 222

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 223

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6和/或1B9的CDRH2

<400> 223

Trp Tyr Asp Gly Ser His

1 5

<210> 224

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1D2的CDRH2

<400> 224

Trp Tyr Asp Gly Ser Gln

1 5

<210> 225

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1B9的CDRH1

<400> 225

Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 226

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRH1

<400> 226

Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr

1 5

<210> 227

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8的CDRH2

<400> 227

Trp Tyr Asp Gly Ser Asn

1 5

<210> 228

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3的CDRH2

<400> 228

Ser Asp Ser Gly Gly Thr

1 5

<210> 229

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2E3的CDRH2

<400> 229

Trp Tyr Gly Gly Ser Asn

1 5

<210> 230

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10 scFv VH-VL取向

<400> 230

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ile

35 40 45

Phe Thr Ser Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asp Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr

65 70 75 80

Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Met

85 90 95

Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Tyr Ser Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser

145 150 155 160

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

165 170 175

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ile Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys

180 185 190

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln

195 200 205

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

210 215 220

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

245 250 255

Val Glu Ile Lys

260

<210> 231

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10 scFv VL-VH取向

<400> 231

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly

35 40 45

Ile Arg Ile Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr

100 105 110

Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

130 135 140

Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val

145 150 155 160

Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Asp Met

165 170 175

His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile

180 185 190

Ile Asp Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly

195 200 205

Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Met Ser Thr Val Tyr Met Glu

210 215 220

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg

225 230 235 240

Asp Tyr Ser Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser

260

<210> 232

<211> 259

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9 scFv VH-VL取向

<400> 232

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

20 25 30

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

Phe Ser Ile Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

145 150 155 160

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

165 170 175

Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

180 185 190

Gly Lys Ala Pro Lys Ile Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

195 200 205

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

210 215 220

Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Leu Gln Glu Tyr Asn Tyr Pro Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

245 250 255

Glu Ile Lys

<210> 233

<211> 259

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9 scFv VL-VH取向

<400> 233

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp

35 40 45

Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Ile Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Glu Tyr

100 105 110

Asn Tyr Pro Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

130 135 140

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

145 150 155 160

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Asp Met

165 170 175

His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala

180 185 190

Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg

195 200 205

Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met

210 215 220

Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu

225 230 235 240

Tyr Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

245 250 255

Val Ser Ser

<210> 234

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6 scFv VH-VL取向

<400> 234

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val

20 25 30

Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

Phe Ser Ser Tyr Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Asn Tyr Tyr

65 70 75 80

Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

85 90 95

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser

145 150 155 160

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

165 170 175

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys

180 185 190

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln

195 200 205

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

210 215 220

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Leu Gln Asp Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

245 250 255

Val Glu Ile Lys

260

<210> 235

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6 scFv VL-VH取向

<400> 235

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly

35 40 45

Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr

100 105 110

Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

130 135 140

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu

145 150 155 160

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Ile

165 170 175

His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val

180 185 190

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Asn Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly

195 200 205

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

210 215 220

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

225 230 235 240

Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser

260

<210> 236

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3 scFv VH-VL取向

<400> 236

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

20 25 30

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

Phe Ser Ile Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

85 90 95

Asn Met Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg Thr Arg Tyr Phe Asn Gly Met Asp Val

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Gly Ser Ser Ser Phe Leu Ser Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr

195 200 205

Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly

245 250 255

Thr Lys Val Asp Ile Lys

260

<210> 237

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3 scFv VL-VH取向

<400> 237

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Gly Ser Ser Ser Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

50 55 60

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro

65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp

100 105 110

Tyr Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

145 150 155 160

Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Ala

165 170 175

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

180 185 190

Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

195 200 205

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr Leu

210 215 220

Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

225 230 235 240

Lys Arg Thr Arg Tyr Phe Asn Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Thr Val Thr Val Ser Ser

260

<210> 238

<211> 520

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10 scFv /CD3双特异性抗体

<400> 238

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

145 150 155 160

Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Ala

165 170 175

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

180 185 190

Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

195 200 205

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr Leu

210 215 220

Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

225 230 235 240

Lys Arg Thr Arg Tyr Phe Asn Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val

260 265 270

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser

275 280 285

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val

290 295 300

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser

305 310 315 320

Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg

325 330 335

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

340 345 350

Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His

355 360 365

Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln

370 375 380

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

385 390 395 400

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser

405 410 415

Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser

420 425 430

Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys

435 440 445

Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala

450 455 460

Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala

465 470 475 480

Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr

485 490 495

Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

500 505 510

Leu Thr Val Leu His His His His His His

515 520

<210> 246

<211> 1092

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 246

atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcagggg ccctggctat ggatccaaat 60

ttctggctgc aagtgcagga gtcagtgacg gtacaggagg gtttgtgcgt cctcgtgccc 120

tgcactttct tccatcccat accctactac gacaagaact ccccagttca tggttactgg 180

ttccgggaag gagccattat atccagggac tctccagtgg ccacaaacaa gctagatcaa 240

gaagtacagg aggagactca gggcagattc cgcctccttg gggatcccag taggaacaac 300

tgctccctga gcatcgtaga cgccaggagg agggataatg gttcatactt ctttcggatg 360

gagagaggaa gtaccaaata cagttacaaa tctccccagc tctctgtgca tgtgacagac 420

ttgacccaca ggcccaaaat cctcatccct ggcactctag aacccggcca ctccaaaaac 480

ctgacctgct ctgtgtcctg ggcctgtgag cagggaacac ccccgatctt ctcctggttg 540

tcagctgccc ccacctccct gggccccagg actactcact cctcggtgct cataatcacc 600

ccacggcccc aggaccacgg caccaacctg acctgtcagg tgaagttcgc tggagctggt 660

gtgactacgg agagaaccat ccagctcaac gtcacctatg ttccacagaa cccaacaact 720

ggtatctttc caggagatgg ctcagggaaa caagagacca gagcaggagt ggttcatggg 780

gccattggag gagctggtgt tacagccctg ctcgctcttt gtctctgcct catcttcttc 840

atagtgaaga cccacaggag gaaagcagcc aggacagcag tgggcaggaa tgacacccac 900

cctaccacag ggtcagcctc cccgaaacac cagaagaagt ccaagttaca tggccccact 960

gaaacctcaa gctgttcagg tgccgcccct actgtggaga tggatgagga gctgcattat 1020

gcttccctca actttcatgg gatgaatcct tccaaggaca cctccaccga atactcagag 1080

gtcaggaccc ag 1092

<210> 247

<211> 364

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 247

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Met Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln

20 25 30

Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro

35 40 45

Tyr Tyr Asp Lys Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly

50 55 60

Ala Ile Ile Ser Arg Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln

65 70 75 80

Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro

85 90 95

Ser Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp

100 105 110

Asn Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser

115 120 125

Tyr Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg

130 135 140

Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn

145 150 155 160

Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile

165 170 175

Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr

180 185 190

His Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr

195 200 205

Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu

210 215 220

Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr

225 230 235 240

Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly

245 250 255

Val Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala

260 265 270

Leu Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys

275 280 285

Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Arg Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly

290 295 300

Ser Ala Ser Pro Lys His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Pro Thr

305 310 315 320

Glu Thr Ser Ser Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu

325 330 335

Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys

340 345 350

Asp Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln

355 360

<210> 248

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10、1A9、1E6和/或1B9轻链信号肽

<400> 248

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Arg Cys

20

<210> 249

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1D2轻链信号肽

<400> 249

Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys

20

<210> 250

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8轻链信号肽

<400> 250

Met Asp Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp

1 5 10 15

Val Pro Ala Ser Arg Gly

20

<210> 251

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3轻链信号肽

<400> 251

Met Glu Pro Trp Lys Pro Gln His Ser Phe Phe Phe Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Asp Ser Thr Gly

20

<210> 252

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H10重链信号肽

<400> 252

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 253

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1A9重链信号肽

<400> 253

Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 254

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1E6和/或2E3重链信号肽

<400> 254

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 255

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1D2重链信号肽

<400> 255

Met Glu Ser Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 256

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1B9重链信号肽

<400> 256

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Ile Ala Leu Leu Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 257

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1H8重链信号肽

<400> 257

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 258

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2D3重链信号肽

<400> 258

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 259

<211> 531

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> V型定向的CD33/CD3 BsAb (RC1)

<400> 259

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

20 25 30

Lys Pro Gly Glu Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

35 40 45

Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr

65 70 75 80

Ala Asp Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr

85 90 95

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Glu Arg Thr

165 170 175

Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser Ser Thr Asn

180 185 190

Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

195 200 205

Leu Leu Leu Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg

210 215 220

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser

225 230 235 240

Pro Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala His

245 250 255

Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

275 280 285

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

290 295 300

Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

305 310 315 320

Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr

325 330 335

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp

340 345 350

Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp

355 360 365

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr

370 375 380

Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

385 390 395 400

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

405 410 415

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

420 425 430

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly

435 440 445

Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

450 455 460

Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

465 470 475 480

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

485 490 495

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn

500 505 510

Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu His His His

515 520 525

His His His

530

<210> 260

<211> 505

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 不含前导序列或His标签的V型定向的CD33/CD3 BsAb (RC1)

<400> 260

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser

130 135 140

Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Glu Arg Thr Thr Ile Asn Cys

145 150 155 160

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser Ser Thr Asn Lys Asn Ser Leu

165 170 175

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Leu Ser

180 185 190

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Pro Gln Pro Glu

210 215 220

Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala His Phe Pro Ile Thr

225 230 235 240

Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

260 265 270

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr

275 280 285

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

290 295 300

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

305 310 315 320

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

325 330 335

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

340 345 350

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp

355 360 365

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val

385 390 395 400

Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

405 410 415

Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn

420 425 430

Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly

435 440 445

Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu

450 455 460

Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp

465 470 475 480

Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe

485 490 495

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

500 505

Claims

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含一组互补决定区(CDR)，所述CDR具有

(i)具有如SEQ ID NO:24中所示的序列的CDRL1，

具有如SEQ ID NO:25中所示的序列的CDRL2，

具有如SEQ ID NO:26中所示的序列的CDRL3，

具有如SEQ ID NO:27中所示的序列的CDRH1，

具有如SEQ ID NO:28中所示的序列的CDRH2，以及

具有如SEQ ID NO:29中所示的序列的CDRH3；

(ii)具有如SEQ ID NO:183中所示的序列的CDR，

具有序列AAS的CDRL2，

具有如SEQ ID NO:26中所示的序列的CDRL3，

具有如SEQ ID NO:184中所示的序列的CDRH1，

具有如SEQ ID NO:185中所示的序列的CDRH2，以及

具有如SEQ ID NO:29中所示的序列的CDRH3；

(iii)具有如SEQ ID NO:24中所示的序列的CDRL1，

具有如SEQ ID NO:204中所示的序列的CDRL2，

具有如SEQ ID NO:26中所示的序列的CDRL3，

具有如SEQ ID NO:205中所示的序列的CDRH1，

具有如SEQ ID NO:206中所示的序列的CDRH2，以及

具有如SEQ ID NO:207中所示的序列的CDRH3；或

(iv)具有如SEQ ID NO:24中所示的序列的CDRL1，

具有如SEQ ID NO:204中所示的序列的CDRL2，

具有如SEQ ID NO:26中所示的序列的CDRL3，

具有如SEQ ID NO:222中所示的序列的CDRH1，

具有如SEQ ID NO:223中所示的序列的CDRH2，以及

具有如SEQ ID NO:207中所示的序列的CDRH3。

2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有

具有如SEQ ID NO:55中所示的序列的可变轻链和具有如SEQ ID NO:56中所示的序列的可变重链，或

与所述如SEQ ID NO:55中所示的序列具有至少90％序列同一性的可变轻链和与所述具有如SEQ ID NO:56中所示的序列的可变重链具有至少90％序列同一性的可变重链。

3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是呈VH-VL取向或VL-VH取向的单链可变片段(scFv)。

4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv具有如SEQ ID No.234或235中所示的序列。

5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段作为具有结合CD3的第二结合结构域的双特异性抗体的一部分。

6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二结合结构域具有

具有如SEQ ID NO:162中所示的序列的可变轻链和具有如SEQ ID NO:161中所示的序列的可变重链，或

与所述如SEQ ID NO:162中所示的序列具有至少90％序列同一性的可变轻链和与所述具有如SEQ ID NO:161中所示的序列的可变重链具有至少90％序列同一性的可变重链。

7.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体具有如SEQ IDNO:242或243中所示的序列。

8.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含根据IMGT、Kabat、North或Chothia所定义的1H10、1A9、1E6、1D2、1B9、1H8、2D3或2E3的互补决定区(CDR)集合。

9.一种CD33靶向剂，所述靶向剂包含结合结构域，根据IMGT、Kabat、North或Chothia所定义，所述结合结构域包含1H10、1A9、1E6、1D2、1B9、1H8、2D3或2E3的互补决定区(CDR)集合，作为抗CD33免疫毒素、抗CD33抗体-药物缀合物、抗CD33抗体-放射性同位素缀合物、抗CD33双特异性抗体、抗CD33双特异性免疫细胞接合抗体、抗CD33三特异性抗体和/或抗CD33四特异性抗体的一部分。

10.一种CD33靶向剂，所述靶向剂包含结合结构域，所述结合结构域包含

与所述1H10、1A9、1E6、1D2、1B9、1H8、2D3或2E3的可变轻链具有至少90％序列同一性的序列和与1H10、1A9、1E6、1D2、1B9、1H8、2D3或2E3的相应可变重链具有至少90％序列同一性的序列

作为抗CD33免疫毒素、抗CD33抗体-药物缀合物、抗CD33抗CD33抗体-放射性同位素缀合物、抗CD33双特异性抗体、抗CD33双特异性免疫细胞接合抗体、抗CD33三特异性抗体和/或抗CD33四特异性抗体的一部分。

11.如权利要求9或10所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂包含抗CD33免疫毒素，其中所述毒素包含全毒素或半毒素。

12.如权利要求9或10所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂包含抗CD33免疫毒素，其中所述毒素包含相思豆毒素、三角梅核糖体失活蛋白、异株腹泻毒蛋白1、白喉毒素(DT)、白树毒素、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、假单胞菌外毒素(PE)、蓖麻毒素和/或皂草素。

13.如权利要求9或10所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂包含抗CD33抗体-药物缀合物，其中所述药物包含单甲基奥瑞他汀E[MMAE]、维汀、海兔毒素、奥瑞他汀、卡奇霉素、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、奈莫柔比星、PNU-159682、蒽环霉素、柔红霉素、长春花生物碱、紫杉烷、单端孢菌素、CC1065、喜树碱、依利奈法德、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米汀、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因和/或普萘洛尔。

14.如权利要求9或10所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂包含抗CD33抗体-放射性同位素缀合物，其中所述放射性同位素包含砷-72、砷-74、碘-131、铟-111、钇-90、镥-177、砹-211、锕-225或铋-212和/或铋-213。

15.如权利要求9或10所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂包含抗CD33抗体-放射性同位素缀合物，其中所述放射性同位素包含²²⁵Ac、²²⁸Ac、¹¹¹Ag、¹²⁴Am、⁷⁴As、²¹¹At、²⁰⁹At、¹⁹⁴Au、¹²⁸Ba、⁷Be、²⁰⁶Bi、²⁴⁵Bk、²⁴⁶Bk、⁷⁶Br、¹¹C、⁴⁷Ca、²⁵⁴Cf、²⁴²Cm、⁵¹Cr、⁶⁷Cu、¹⁵³Dy、¹⁵⁷Dy、¹⁵⁹Dy、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Dy、¹⁷¹Er、²⁵⁰Es、²⁵⁴Es、¹⁴⁷Eu、¹⁵⁷Eu、⁵²Fe、⁵⁹Fe、²⁵¹Fm、²⁵²Fm、²⁵³Fm、⁶⁶Ga、⁷²Ga、¹⁴⁶Gd、¹⁵³Gd、⁶⁸Ge、¹⁷⁰Hf、¹⁷¹Hf、¹⁹³Hg、¹⁹³mHg、¹⁶⁰mHo、¹³⁰I、¹³¹I、¹³⁵I、¹¹⁴mIn、¹⁸⁵Ir、⁴²K、⁴³K、⁷⁶Kr、⁷⁹Kr、⁸¹mKr、¹³²La、²⁶²Lr、¹⁶⁹Lu、¹⁷⁴mLu、¹⁷⁶mLu、²⁵⁷Md、²⁶⁰Md、²⁸Mg、⁵²Mn、⁹⁰Mo、²⁴Na、⁹⁵Nb、¹³⁸Nd、⁵⁷Ni、⁶⁶Ni、²³⁴Np、¹⁵O、¹⁸²Os、¹⁸⁹mOs、¹⁹¹Os、³²P、²⁰¹Pb、¹⁰¹Pd、¹⁴³Pr、¹⁹¹Pt、²⁴³Pu、²²⁵Ra、⁸¹Rb、¹⁸⁸Re、¹⁰⁵Rh、²¹¹Rn、¹⁰³Ru、³⁵S、⁴⁴Sc、⁷²Se、¹⁵³Sm、¹²⁵Sn、⁹¹Sr、¹⁷³Ta、¹⁵⁴Tb、¹²⁷Te、²³⁴Th、⁴⁵Ti、¹⁶⁶Tm、²³⁰U、²³⁷U、²⁴⁰U、⁴⁸V、¹⁷⁸W、¹⁸¹W、¹⁸⁸W、¹²⁵Xe、¹²⁷Xe、¹³³Xe、¹³³mXe、¹³⁵Xe、⁸⁵mY、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁹³Y、¹⁶⁹Yb、¹⁷⁵Yb、⁶⁵Zn、⁷¹mZn、⁸⁶Zr、⁹⁵Zr和/或⁹⁷Zr。

16.如权利要求9或10所述的CD33靶向剂，其中所述CD33靶向剂包含多特异性抗体。

17.如权利要求16所述的CD33靶向剂，其中所述多特异性抗体包含双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。

18.如权利要求16所述的CD33靶向剂，其中所述多特异性抗体包含活化免疫细胞的结合结构域。

19.如权利要求18所述的CD33靶向剂，其中所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞。

20.如权利要求19所述的CD33靶向剂，其中所述T细胞是CD3T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和/或初始T细胞。

21.如权利要求18所述的CD33靶向剂，其中所述活化免疫细胞的结合结构域结合CD3、CD28、CD8、NKG2D、CD8、CD16、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR3DS1、NKG2C、NKG2E、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、DNAM-1、CD11b、CD11c、CD64、CD68、CD119、CD163、CD206、CD209、F4/80、IFGR2、Toll样受体1-9、IL-4Rα或MARCO。

22.如权利要求18所述的CD33靶向剂，所述靶向剂具有如SEQ ID NO:157或238-245中的任一者中所示的序列。

23.如权利要求18所述的CD33靶向剂，其中所述结合结构域活化T细胞并且包含OKT3抗体的CDR、4B4-D7抗体的CDR、4E7-C9抗体的CDR、18F5-H10抗体的CDR、TGN1412抗体的CDR、OKT8抗体的CDR、具有如SEQ ID NO:162中所示的序列的可变轻链以及具有SEQ ID NO:161中所示的序列的可变重链，或TCR。

24.如权利要求9或10所述的CD33靶向剂，所述靶向剂包含1H10、1A9、1E6、1D2、1B9、1H8、2D3或2E3的Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或单链Fv片段(scFv)。

25.如权利要求24所述的CD33靶向剂，其中所述scFv具有如SEQ ID NO:230-237中的任一者中所示的序列。

26.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段或如权利要求9或10所述的CD33靶向剂，它们还包含连接子。

27.如权利要求26所述的CD33靶向剂，其中所述连接子是Gly-Ser连接子。

28.如权利要求27所述的CD33靶向剂，其中所述Gly-Ser连接子包含(Gly_xSer_y)_n，其中x和y独立地是0至10的整数，条件是x和y不同时是0并且其中n是整数1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

29.如权利要求28所述的CD33靶向剂，其中所述Gly-Ser连接子包含(Gly₄Ser)₄(SEQ IDNO:125)、(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO:126)、(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO:127)、(Gly₄Ser)₁(SEQ IDNO:128)、(Gly₃Ser)₂(SEQ ID NO:129)、(Gly₃Ser)₁(SEQ ID NO:130)、(Gly₂Ser)₂(SEQ IDNO:131)、(Gly₂Ser)₁、GGSGGGSGGSG(SEQ ID NO:132)、GGSGGGSGSG(SEQ ID NO:133)或GGSGGGSG(SEQ ID NO:134)。

30.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是聚乙二醇化的。

31.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含Fc修饰。

32.如权利要求31所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc修饰包含M428L/N434S、G236A/S239D/A330L/I332E(GASDALIE)、huIgG4 ProAlaAla、huIgG2m4和/或huIgG2σ突变。

33.一种被配制用于施用给受试者的组合物，所述组合物包含权利要求1或8所述的抗体或其抗原结合片段和/或权利要求9或10所述的CD33靶向剂。

34.一种被配制用于施用给受试者的细胞，所述细胞被基因修饰成表达权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段和/或权利要求9或10所述的CD33靶向剂。

35.如权利要求34所述的细胞，其中所述细胞是在体内或离体的。

36.如权利要求34所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞、造血干细胞(HSC)或造血祖细胞(HPC)。

37.如权利要求34所述的细胞，其中所述细胞是选自以下的T细胞：CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和/或初始T细胞。

38.如权利要求34所述的细胞，其中所述细胞是CD8+T细胞。

39.一种配制物，所述配制物包含权利要求34所述的细胞的群体和药学上可接受的载剂。

40.一种治疗有需要的受试者的CD33相关病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求33所述的组合物和/或权利要求39所述的配制物，由此治疗有需要的受试者的所述CD33相关病症。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述CD33相关病症包含急性骨髓性白血病(AML)。

42.如权利要求40所述的方法，其中所述CD33相关病症包含急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性髓单核细胞性白血病(CML)、肥大细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)或巨核细胞白血病。

43.如权利要求40所述的方法，其中所述配制物中所述细胞的群体对于所述受试者是自体的或同种异体的。

44.如权利要求40所述的方法，所述方法还包括确定所述受试者是表达还是缺乏CD33的V型结构域，并且

如果所述受试者表达所述CD33的V型结构域，则选择包含以下的组合疗法：

组合物，所述组合物包含1H10、1A9、1E6、1D2和1B9中的一者或多者的结合结构域，以及

1H8、2D3和2E3中的一者或多者中的一者或多者的结合结构域。

45.如权利要求40所述的方法，所述方法还包括确定所述受试者是表达还是缺乏所述CD33的V型结构域，并且

如果所述受试者不表达所述CD33的V型结构域，则选择包含以下的疗法：

包含1H10、1A9、1E6、1D2和1B9中的一者或多者的结合结构域的组合物。

46.一种活化有需要的受试者针对CD33表达细胞的免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求33所述的组合物和/或权利要求39所述的配制物，由此活化所述有需要的受试者的针对CD33表达细胞的免疫反应。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述CD33表达细胞包含急性骨髓性白血病(AML)细胞。

48.如权利要求46所述的方法，其中所述CD33表达细胞包含急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性髓单核细胞性白血病(CML)、肥大细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)或巨核细胞白血病细胞。

49.如权利要求46所述的方法，其中所述配制物中所述细胞的群体对于所述受试者是自体的或同种异体的。

50.如权利要求46所述的方法，所述方法还包括确定所述受试者是表达还是缺乏CD33的V型结构域，并且

1H8、2D3和2E3中的一者或多者中的一者或多者的结合结构域。

51.如权利要求46所述的方法，所述方法还包括确定所述受试者是表达还是缺乏所述CD33的V型结构域，并且

52.一种试剂盒，所述试剂盒包含组合物，所述组合物包含1H10、1A9、1E6、1D2和1B9中的一者或多者的结合结构域以及1H8、2D3和2E3中的一者或多者中的一者或多者的结合结构域。

53.一种试剂盒，所述试剂盒包含：包含1H10、1A9、1E6、1D2和1B9中的一者或多者的结合结构域的组合物；以及包含1H8、2D3和2E3中的一者或多者中的一者或多者的结合结构域的组合物。