WO2023171009A1 - Ｅｖａ１タンパク質に結合する、ヒト化抗体又はその機能的断片、抗体薬物複合体及びキメラ抗原受容体 - Google Patents

Ｅｖａ１タンパク質に結合する、ヒト化抗体又はその機能的断片、抗体薬物複合体及びキメラ抗原受容体 Download PDF

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acid sequence
antibody
seq
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眞弘 道下
亨 近藤
精太郎 寺倉
正英 尾▲崎▼
仁 清井
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株式会社Cured
国立大学法人北海道大学
国立大学法人東海国立大学機構
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a humanized antibody or a functional fragment thereof that binds to human-derived Eva1 protein (human Eva1).
  • the invention also relates to antibody-drug conjugates comprising the humanized antibodies or functional fragments thereof.
  • the present invention relates to chimeric antigen receptors comprising antibodies or functional fragments thereof that bind to human Eva1.
  • cancer stem cells have become important in the development of radical treatments for cancer. Although cancer stem cells exist in only a small portion of cancer tissues, they are thought to be the source of the creation of the majority of cancer cells by repeating self-renewal and further differentiation. . Furthermore, while having such strong tumor-forming ability, cancer stem cells have been suggested to have strong resistance to chemotherapy and radiotherapy. Therefore, even if most cancer cells in a cancer tissue can be killed by chemotherapy or radiotherapy, cancer stem cells remain, resulting in cancer recurrence, metastasis, etc. However, if cancer stem cells can be targeted and killed, it is expected that this will lead to the development of treatments that are useful in preventing cancer metastasis and recurrence.
  • Eva1 protein As a protein highly expressed in glioma and its cancer stem cells. Furthermore, the expression of this Eva1 protein is correlated with the malignancy of glioma, and it has been revealed that there is a strong correlation between the survival rate of glioma patients and the expression of the Eva1 gene in gliomas derived from that patient. . It has also been found that suppression of Eva1 gene function is effective in suppressing the proliferation, tumor formation and tissue invasion abilities of glioma cells, and the tumor mass forming ability of glioma stem cells (Patent Document 1).
  • glioblastoma multiforme GBM
  • temozolomide is used as a standard treatment for malignant glioma
  • the inventors have confirmed that glioma stem cells are insensitive even to temozolomide at several times the effective blood concentration.
  • cancer cells exposed to such chemotherapeutic agents develop resistance not only to glioma but also to other chemotherapeutic agents, and often develop cross-resistance to multiple other chemotherapeutic agents as well.
  • chemotherapeutic agents often cause cytotoxicity even to normal cells, and the dosage or usage of chemotherapeutic agents is often restricted in order to reduce such side effects.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • ADC antibody-drug conjugate
  • cancer-specific antigen has the activity of inducing cell death
  • administration of an antibody with agonistic activity may be effective.
  • cancer growth can be expected to stop or regress due to the accumulation of tumor-specific antibodies and antibody activity.
  • T cells CAR-T
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the cells can be used to target antigen-positive cancer cells in an HLA-independent manner. It is also expected to be activated and induce cell death.
  • An object of the present invention is to provide an antibody or a functional fragment thereof, or a complex containing the antibody or a functional fragment thereof, which is useful for the treatment of cancer.
  • the present inventors attempted to humanize an anti-human Eva1 mouse antibody (B2E5-48 mouse antibody described in Patent Document 2), and found that four types of humanized heavy chain variable regions (H1 to H4) and light chain Sixteen types of humanized antibodies were created by combining four types of variable regions (L1 to L4). As a result, we succeeded in obtaining humanized antibodies (combinations of H2-L2, H2-L4, H3-L4, etc.) that have high binding affinity for Eva1 protein and high production ability (antibody titer).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • an antibody-drug conjugate (ADC) containing the above humanized antibody was produced and its effectiveness was evaluated.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the antitumor activity of the ADC against various tumors such as glioma, pancreatic cancer, and gastric cancer was observed.
  • no adverse effects (decreased body weight, shortened survival period, etc.) on the administered organisms were observed.
  • the present invention is based on the above study results, and more specifically provides the following aspects.
  • a light chain variable region comprising complementarity determining regions 1 to 3 each containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence consisting of Val-Thr-Ser, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3,
  • a humanized antibody or a functional fragment thereof which has a heavy chain variable region comprising complementarity determining regions 1 to 3 each containing the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4 to 6, and which binds to human-derived Eva1 protein.
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 7 to 10, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 7 to 10, and a sequence. Contains one amino acid sequence selected from the amino acid sequences in which one or several amino acids are substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of the amino acid sequences set forth in numbers 7 to 10,
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 to 16, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 to 16, and SEQ ID NO: 13.
  • amino acid sequence according to ⁇ 1> comprising one amino acid sequence selected from the amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added, and/or inserted in at least one of the amino acid sequences described in Humanized antibody or functional fragment thereof.
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
  • the humanized antibody according to ⁇ 1> or its function which comprises one amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of the sequences. fragment.
  • ⁇ 4> An antibody-drug complex obtained by binding the antibody or functional fragment thereof according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> and a drug.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody-drug conjugate according to ⁇ 4>.
  • a chimeric antigen receptor comprising a region that binds to human-derived Eva1 protein, a transmembrane region, and an intracellular signal region.
  • ⁇ 7> The region according to ⁇ 6>, wherein the region that binds to the human-derived Eva1 protein is a region containing the antibody according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> or a functional fragment thereof. Chimeric antigen receptor.
  • the region that binds to the human-derived Eva1 protein includes a single chain variable region fragment formed by binding a light chain variable region, a linker, and a heavy chain variable region in order from the amino terminal side,
  • the light chain variable region is Complementarity determining regions 1 to 3 each containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence consisting of Val-Thr-Ser, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • the heavy chain variable region is Complementarity determining regions 1 to 3 containing the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4 to 6, respectively, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and 80% or more of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13. and an amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 13. containing the amino acid sequence of The chimeric antigen receptor according to ⁇ 6>.
  • ⁇ 9> Any of ⁇ 6> to ⁇ 8>, wherein the human-derived Eva1 protein-binding region and the transmembrane region are bonded via a spacer consisting of 10 to 300 amino acids.
  • ⁇ 10> The chimeric antigen receptor according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 9>, wherein the intracellular signal region includes a CD79A intracellular region and a CD40 intracellular region.
  • ⁇ 11> A nucleotide encoding the chimeric antigen receptor according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 10>.
  • ⁇ 12> A vector comprising the nucleotide according to ⁇ 11>.
  • ⁇ 13> A cell expressing the chimeric antigen receptor according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 10>.
  • ⁇ 14> The cell according to ⁇ 13>, which is an immune cell.
  • a pharmaceutical composition comprising the cell according to ⁇ 13> or ⁇ 14>.
  • SEQ ID NO: 2 is intended to be the amino acid sequence of CDR2 of Light Chain (Humanized B2E5-48) (amino acid sequence consisting of valine-threonine-serine in order from the N-terminus) ( (See also Table 7). However, since this sequence is a sequence of less than four (3) amino acids, it is treated as an "intentionally skipped sequence" in the sequence listing.
  • FIG. 2 is a diagram showing an overview of a chimeric antigen receptor (Eva1-CAR) using an anti-Eva1 antibody sequence.
  • FIG. 1 is a diagram showing an overview of the production schedule of Eva1-CAR-expressing T cells (Eva1-CAR-T).
  • FIG. 2 is a dot plot diagram showing the results of analyzing the efficiency of introduction of the Eva1-CAR gene before selection using tEGFR expression as an index (tEGFR selection).
  • FIG. 2 is a dot plot diagram showing the results of analyzing the efficiency of Eva1-CAR gene introduction before tEGFR selection.
  • each dot indicates the origin (5 healthy individuals) of the cells into which the Eva1-CAR gene was introduced.
  • the thick line indicates the mean value, and the whiskers indicate the standard error.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of analyzing cytokine (IFN- ⁇ ) production of Eva1-CAR-T against various tumor cells.
  • FIG. 1 cytokine
  • FIG. 2 is a diagram showing an overview of six types of spacers with different lengths in Eva1-CAR. Note that the notations "H00" to "H232" shown in FIG. 3F correspond to those in FIGS. 3G to 3M.
  • FIG. 2 is a dot plot diagram showing the results of analyzing the efficiency of Eva1-CAR gene introduction before tEGFR selection. In the figure, each dot indicates the origin (5 healthy individuals) of the cells into which the Eva1-CAR gene was introduced.
  • FIG. 3 is a dot plot diagram showing the results of analyzing the efficiency of Eva1-CAR gene introduction after tEGFR selection. In the figure, each dot indicates the origin (5 healthy individuals) of the cells into which the Eva1-CAR gene was introduced. The thick line indicates the mean value, and the whiskers indicate the standard error.
  • 1 is a graph showing the results of analyzing the cytokine production of Eva1-CAR-T in various tumor cells. In the figure, the graph on the left shows the results of analyzing IFN- ⁇ production, and the graph on the right shows the results of analyzing IL-2 production.
  • 1 is a graph showing the amplification efficiency of Eva1-CAR-T after antigen stimulation in the absence of IL-2.
  • the horizontal axis indicates the number of days after starting antigen stimulation (co-culture with Eva1-positive HuCCT-1).
  • the vertical axis shows the number of Eva1-CAR-T cells.
  • 1 is a graph showing the amplification efficiency of Eva1-CAR-T after antigen stimulation in the absence of IL-2.
  • the horizontal axis indicates the type of CAR introduced.
  • the vertical axis shows the number of Eva1-CAR-T cells.
  • 1 is a graph showing the amplification efficiency of Eva1-CAR-T after antigen stimulation in the presence of IL-2.
  • the horizontal axis indicates the number of days after starting antigen stimulation (co-culture with Eva1-positive HuCCT-1).
  • the vertical axis shows the number of Eva1-CAR-T cells.
  • 1 is a graph showing the amplification efficiency of Eva1-CAR-T after antigen stimulation in the presence of IL-2.
  • the horizontal axis indicates the type of CAR introduced.
  • the vertical axis shows the number of Eva1-CAR-T cells.
  • FIG. 2 is a dot plot diagram showing the results of analyzing the efficiency of Eva1-CAR (hEva1-CAR) gene introduction using an anti-Eva1 humanized antibody sequence before tEGFR selection.
  • each dot indicates the origin (four healthy individuals) of the cells into which the hEva1-CAR gene was introduced.
  • the whiskers indicate the standard error, and the line in the middle between the whiskers indicates the mean value.
  • It is a dot plot diagram showing the results of analyzing the amplification efficiency of hEva1-CAR-T after tEGFR selection.
  • each dot indicates the origin (four healthy individuals) of the cells into which the hEva1-CAR gene was introduced.
  • the whiskers indicate the standard error, and the line in the middle between the whiskers indicates the mean value.
  • 2 is a graph showing the results of analysis of IFN- ⁇ production of hEva1-CAR-T in various tumor cells. For each Eva1-CAR introduced, the results for HuCCT-1, CFPAC-1, HepG2, and OVTOKO are shown in order from the left. 1 is a graph showing the results of analyzing IL-2 production of hEva1-CAR-T in various tumor cells. For each Eva1-CAR introduced, the results for HuCCT-1, CFPAC-1, HepG2, and OVTOKO are shown in order from the left. It is a graph showing the amplification efficiency of hEva1-CAR-T after antigen stimulation.
  • FIG. 2 is a diagram showing an overview of six types of hEva1-CAR-T (antigen recognition site: L2H2) with different intracellular domains and spacer lengths. It is a dot plot diagram showing the results of analyzing the efficiency of hEva1-CAR gene introduction before tEGFR selection.
  • each dot indicates the origin (5 healthy individuals) of the cells into which the hEva1-CAR gene was introduced.
  • the middle line shows the average value.
  • "28", “41” and “79” on the horizontal axis indicate that the intracellular domains of each CAR are “CD28IC”, “4-1BBIC” and “CD79A/CD40IC”, respectively.
  • "-S” and “-L” indicate that the spacers are "H15” and "H232" shown in FIG. 4F, respectively.
  • 2 is a graph showing the results of analysis of IFN- ⁇ production of hEva1-CAR-T in various tumor cells.
  • the graph on the left shows the results in the absence of IL-2
  • the graph on the right shows the results in the presence of IL-2.
  • the horizontal axis indicates the number of days after starting antigen stimulation (co-culture with Eva1-positive HuCCT-1).
  • the vertical axis shows the number of hEva1-CAR-T cells.
  • “28", “41” and “79” in the legend indicate that the intracellular domains of each CAR are "CD28IC”, “4-1BBIC” and “CD79A/CD40IC”, respectively.
  • “-S” and “-L” indicate that the spacers are "H15” and "H232" shown in FIG. 4F, respectively.
  • FIG. 4F This is a graph showing the results of co-culturing hEva1-CAR-T and various tumor cell lines labeled with 51 Cr and analyzing the cytotoxic activity.
  • the vertical axis shows the percentage of injured cells based on the amount of 51 Cr released in the culture supernatant.
  • various tumor cell lines are shown together with whether Eva1 expression is negative or positive.
  • "41” and “79” in the legend indicate that the intracellular domains of each CAR are "4-1BBIC” and "CD79A/CD40IC", respectively.
  • 4L is a graph showing the results of analyzing the correlation between the expression level of human Eva1 in various tumor cell lines and the cytotoxic activity of hEva1-CAR-T against various tumor cell lines, based on the results shown in FIG. 4L.
  • the vertical axis shows the percentage of injured cells based on the amount of 51 Cr released in the culture supernatant.
  • the horizontal axis shows the mean fluorescence intensity (MFI) obtained by flow cytometry analysis using an anti-human Eva1 antibody in various tumor cell lines, which correlates with the expression level of Eva1.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • FIG. 4F A mouse carrying a human lung adenocarcinoma cell line (H1975) into which the firefly luciferase gene has been introduced with L2H2 hEva1-CAR-T produced from peripheral blood derived from two different donors (donor A and donor B).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of analyzing the antitumor activity of the CAR-T by bioluminescence imaging.
  • L2H2 hEva1-CAR the antigen recognition site (L2H2) and the transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) are combined with a short spacer (indicated by "short hinge” in the figure, Figure 4F “H15” shown in Figure 1) was used.
  • a short hinge in the figure, Figure 4F "H15" shown in Figure 1
  • tEGFR-introduced cells Mock CAR-T cells into which only tEGFR was introduced
  • Day indicates the number of days after administration of CAR-T.
  • FIGS. 4P and 4R A mouse carrying a human pancreatic cancer cell line (CFPAC1) into which the firefly luciferase gene has been introduced with L2H2 hEva1-CAR-T produced from peripheral blood derived from two different donors (donor A and donor B).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of analyzing the antitumor activity of the CAR-T by bioluminescence imaging.
  • L2H2 hEva1-CAR one in which an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR-T produced from peripheral blood derived from two different donors (donor A, donor B) was used in a human pancreatic cancer cell line (CFPAC1) or human lung gland into which the firefly luciferase gene has been introduced.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of analyzing the antitumor activity of CAR-T by introducing it into mice carrying a cancer cell line (H1975) and analyzing it by bioluminescence imaging.
  • L2H2 hEva1-CAR one in which an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR one in which an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR-T produced from peripheral blood derived from donor C was introduced into mice carrying a human cholangiocarcinoma cell line (HuCCT cells) into which the firefly luciferase gene had been introduced, and the CAR-T.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of analyzing antitumor activity by bioluminescence imaging.
  • L2H2 hEva1-CAR one in which an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR-T Shows the results of introducing and analyzing L2H2 hEva1-CAR-T produced from peripheral blood derived from donor C into mice carrying a human cholangiocarcinoma cell line (HuCCT cells) into which the firefly luciferase gene has been introduced. , is a diagram.
  • L2H2 hEva1-CAR one in which an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • an example of administration of tEGFR-transduced cells was also prepared and analyzed.
  • the graph on the left side of the figure shows the results (luminescence intensity) of the antitumor activity of the CAR-T analyzed over time by bioluminescence imaging.
  • the graph on the right shows the results of time-course analysis of tumor volume in cancer-bearing mice administered with the CAR-T.
  • B2E5-ADC antibody-drug conjugate
  • B2E5-ADC antibody-drug conjugate
  • hGIC E6, hGIC E16 results of a cytotoxicity experiment of B2E5-ADC against glioma
  • the vertical axis of each graph represents the survival rate of tumor cells
  • the horizontal axis represents the concentration of ADC or antibody added to the medium.
  • BxPC3 pancreatic cancer
  • the vertical axis of each graph indicates absorbance, which reflects the degree of damage in tumor cells.
  • the horizontal axis shows the concentration of ADC or drug (DM1) added to the medium. It is a graph showing the results of a cytotoxicity experiment of B2E5-ADC against gastric cancer (MKN74). In the figure, the vertical axis of each graph indicates the survival rate of tumor cells. The horizontal axis shows the concentration of ADC or antibody added to the medium. 1 is a graph showing the results of a toxicity test of B2E5-ADC on mice. More specifically, wild type (C57BL/6) or nude mice (SKN/slc) were injected with B2E5-ADC (100, 33, 10 ⁇ g) by intravenous injection or intrahecal injection. This is a graph showing changes in body weight over time in these mice after administration. In the figure, circles, triangles, and squares each represent data for one individual mouse.
  • the present invention relates to an antibody or a functional fragment thereof that binds to human-derived Eva1 protein (human Eva1).
  • Eva (Epithelial V-like antigen) 1 is a single-transmembrane cell membrane protein, and is a molecule involved in the cytoskeletal system, also called MPZL2 (Myelin protein Zero-like 2). If it is of human origin, it is typically a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54 (a protein encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 53). However, the DNA sequence of a gene is mutated in the natural world (ie, non-artificially) due to such mutations, and the amino acid sequence of the protein encoded by it is also modified accordingly. Therefore, the "Eva1 protein” according to the present invention is not limited to the protein consisting of the typical amino acid sequence, but also includes such natural variants.
  • Antibody in the present invention includes all classes and subclasses of immunoglobulins.
  • Antibody includes polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
  • a “polyclonal antibody” is an antibody preparation that includes different antibodies directed against different epitopes.
  • monoclonal antibody means an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies. In contrast to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies recognize a single determinant on an antigen.
  • the antibodies of the invention are preferably monoclonal antibodies.
  • Antibodies of the invention are antibodies that have been separated and/or recovered (ie, isolated) from components of their natural environment.
  • the reactivity of the antibody of the present invention to human Eva1 is preferably 10 ⁇ 6 or less, more preferably 6 ⁇ 10 ⁇ 7 or less in KD (dissociation constant) value.
  • "Reactivity” means binding affinity and/or specificity for the antigen human Eva1. Such reactivity can be evaluated by those skilled in the art by immunological techniques, and can be determined as a KD value by analysis using surface plasmon resonance, for example, as shown in the Examples below.
  • the antibody of the present invention can also be used to produce Eva1 proteins derived from other animals (for example, mouse Eva1 protein (typically a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 56, a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55). It may also be an antibody that binds to a protein encoded by the described nucleotide sequence.
  • mouse Eva1 protein typically a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 56, a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55. It may also be an antibody that binds to a protein encoded by the described nucleotide sequence.
  • the antibody of the present invention may have at least one cytotoxic activity selected from ADCC activity and CDC activity, or may have both ADCC activity and CDC activity.
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxic activity
  • effector cells immune cells such as NK cells and monocytes
  • CDC activity complement-dependent cytotoxic activity
  • CDC activity refers to an activity in which when an antibody binds to a target cell, the complement system is activated and, as a result, the target cell is lysed.
  • the antibody of the present invention is preferably an antibody that has ADCC activity against target cells expressing human Eva1 at 0.01 ⁇ g/mL. Whether or not the antibody of the present invention has such ADCC activity can be determined, for example, by the method described in the Example of Patent Document 2. More specifically, it can be determined by expressing human Eva1.
  • the ADCC activity when using 0.01 ⁇ g/mL of the antibody of the present invention is preferably such that the cell lysis rate is 30%. or more, more preferably 50% or more, still more preferably 70% or more.
  • the antibody of the present invention is an antibody that has CDC activity against target cells expressing human Eva1, preferably at 0.30 ⁇ g/mL, more preferably at 0.01 ⁇ g/mL. Whether or not the antibody of the present invention has such CDC activity can be determined, for example, by the method described in the Example of Patent Document 2. More specifically, it can be determined by expressing human Eva1.
  • the CDC activity when using the anti-Eva1 antibody of the present invention at 0.30 ⁇ g/mL is preferably such that the cell lysis rate is It is 20% or more, more preferably 40% or more, even more preferably 60% or more, and even more preferably 80% or more.
  • the antibodies of the present invention may also have antitumor activity.
  • antitumor activity refers to at least one of the following activities: suppressing cancer cell proliferation, inducing cancer cell death, and suppressing cancer cell metastasis. means.
  • Antitumor activity can be evaluated, for example, by analysis using a tumor-bearing model (such as a mouse inoculated with B16 melanoma cells) as described in Examples of Patent Document 2. More specifically, after B16 melanoma cells are intravenously administered to mice, anti-Eva1 antibodies are intravenously administered daily or every few days starting the next day or several weeks later.
  • the in vivo anticancer activity can be evaluated.
  • a control antibody having the same isotype may be administered, or PBS or the like may be administered. If the number of colonies formed in the anti-Eva1 antibody administration group is lower than that in the negative control administration group (when the number of colonies formed in the negative control administration group is taken as 100%, preferably 60% or less, more preferably 40%) (more preferably 20% or less, more preferably 10% or less), the anti-Eva1 antibody can be determined to have antitumor activity.
  • the antibody of the present invention only needs to have reactivity to human Eva1, and its origin, type, shape, etc. are not particularly limited. Specifically, antibodies derived from non-human animals (eg, mouse antibodies, rabbit antibodies, rat antibodies, camel antibodies), human-derived antibodies, chimeric antibodies, and humanized antibodies are included.
  • non-human animals eg, mouse antibodies, rabbit antibodies, rat antibodies, camel antibodies
  • human-derived antibodies e.g., human-derived antibodies, chimeric antibodies, and humanized antibodies are included.
  • the "antibody derived from a non-human animal” includes, for example, an antibody against human Eva1 that has the following variable region and is disclosed in Patent Document 2.
  • the present invention relates to an antibody against human Eva1, which carries, for example, the following CDRs.
  • CDRs Heavy chain CDRs 1 to 3 determined from the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27 and light chain determined from the light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 An antibody that retains CDR1-3.
  • Heavy chain CDRs 1 to 3 determined from the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 49 and light chain determined from the light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44.
  • an antibody against human Eva1 having the following CDR can be mentioned.
  • (a-2) Amino acid sequence and sequence that retain the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4 to 6 as heavy chain CDRs 1 to 3, respectively, and consist of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and Val-Thr-Ser.
  • antibodies that retain variable regions and/or CDRs consisting of such specific amino acid sequences but also antibodies that have modified amino acid sequences without reducing desired activities (antigen reactivity, etc.) Contains antibodies that have been tested.
  • Such amino acid sequence variants can be produced, for example, by introducing mutations into DNA encoding the above-mentioned variable regions, etc., or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, substitutions, deletions, additions and/or insertions of residues within the amino acid sequence of the antibody.
  • the site where the amino acid sequence of the antibody is modified may be the constant region of the heavy chain or light chain of the antibody, as long as it has an activity equivalent to that of the antibody before modification. ) and CDR).
  • the number of amino acids modified in the variable region is preferably 10 amino acids or less, more preferably 5 amino acids or less, and even more preferably 3 amino acids or less (for example, 2 amino acids or less, 1 amino acid). . Furthermore, all such modifications are preferably made in areas other than CDRs, that is, FRs, from the viewpoint of having little effect on reactivity with antigens. Further, the number of amino acids modified in a CDR is preferably 5 amino acids or less, more preferably 3 amino acids or less (for example, 2 amino acids or less, 1 amino acid).
  • Amino acid modifications are preferably conservative substitutions.
  • “conservative substitution” means substitution with another amino acid residue having a chemically similar side chain.
  • Groups of amino acid residues having chemically similar amino acid side chains are well known in the art to which this invention pertains.
  • acidic amino acids aspartic acid and glutamic acid
  • basic amino acids lysine, arginine, histidine
  • neutral amino acids include amino acids with hydrocarbon chains (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline), and hydroxy groups.
  • an antibody whose modified amino acid sequence has a variable region containing an amino acid sequence having 80% or more homology at the amino acid sequence level with a variable region consisting of the above-mentioned specific amino acid sequence is also an antibody before modification. It is included in the antibodies of the present invention as long as it has an activity equivalent to that of the antibody. Such homology may be at least 80%, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more (for example, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more). % or more). Furthermore, sequence homology can be determined using the BLASTP (amino acid level) program (Altschul et al. J. Mol.
  • "having the same activity” means, for example, that the reactivity to the antigen is equivalent (for example, 70% or more, preferably 70% or more) to that of the target antibody (for example, the B2E5-48 mouse antibody described in Patent Document 2). 80% or more, more preferably 90% or more).
  • modification of the antibody of the present invention may be modification of post-translational processes of the antibody, such as changing the number or position of glycosylation sites.
  • the ADCC activity of the antibody can be improved.
  • Glycosylation of antibodies is typically N-linked or O-linked. Glycosylation of antibodies is highly dependent on the host cell used to express the antibody. Modification of the glycosylation pattern can be performed by known methods such as introduction or deletion of specific enzymes involved in sugar production (Japanese Patent Application Laid-open No. 2008-113663, US Pat. No. 5,047,335, US Pat. No. 5,510,261, US Pat. No. 5,278,299, WO 99/54342).
  • deamidation can be suppressed by substituting the amino acid to be deamidated or the amino acid adjacent to the amino acid to be deamidated with another amino acid for the purpose of increasing the stability of the antibody. It's okay.
  • Glutamic acid can also be substituted with other amino acids to increase antibody stability.
  • the present invention also provides antibodies stabilized in this manner.
  • a "chimeric antibody” is an antibody in which the variable region of a certain type of antibody is linked to the constant region of a different type of antibody.
  • Chimeric antibodies are produced by, for example, immunizing a mouse with an antigen, cutting out the antibody variable region (variable region) that binds to the antigen from the mouse monoclonal antibody gene, and combining it with the antibody constant region (constant region) gene derived from human bone marrow.
  • the constant region of a chimeric antibody is usually that of a human-derived antibody.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4, C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ 1, C ⁇ 2, and C ⁇ can be used as constant regions.
  • C ⁇ and C ⁇ can be used as constant regions.
  • the amino acid sequences of these constant regions and the nucleotide sequences encoding them are known.
  • one or several amino acids in the human-derived antibody constant region may be substituted, deleted, added, and/or inserted. can.
  • a "humanized antibody” refers to an antibody in which the CDR gene sequence of an antibody derived from a non-human animal is grafted onto a human-derived antibody gene (CDR grafting), and its production method includes overlap extension PCR, etc. , are known (eg, EP 239,400, EP 125,023, WO 90/07861, WO 96/02576).
  • the variable region of an antibody is usually composed of three CDRs sandwiched between four FRs. CDRs are the regions that essentially determine the binding specificity of an antibody. While the amino acid sequences of CDRs are highly diverse, the amino acid sequences constituting FRs often show high homology even between antibodies with different binding specificities.
  • the binding specificity of one antibody can be transplanted to another antibody by transplanting CDRs.
  • a human FR that is highly homologous to the non-human animal-derived FR is selected.
  • amino acids in CDRs not only recognize antigens but also coordinate with amino acids in FRs near the CDRs and are involved in maintaining the loop structure of the CDRs. It is preferable to use a human FR consisting of an amino acid sequence highly homologous to the amino acid sequence of the FR.
  • Search for known human FRs that are highly homologous to FRs derived from non-human animals can be performed using, for example, a search system specialized for antibodies available on the Internet (http://www.bioinf.org.uk/abysis/). This can be done by using Mutations can be introduced into sequences other than the CDRs of an antibody derived from a non-human so as to match the sequence of the human FR thus obtained. Alternatively, if a gene (cDNA) encoding the amino acid sequence of human FR obtained through the search is available, non-human-derived CDRs may be introduced into the sequence. Introduction of mutations can be performed using techniques known in the art, such as nucleic acid synthesis and site-directed mutagenesis.
  • the CDRs form a good antigen-binding site when linked via the CDRs.
  • FRs of human-derived antibodies can be suitably selected. Sato, K. et al. , Cancer Res, 1993, 53, 851-856, etc., the amino acid residues of the FRs can be substituted so that the CDRs of the humanized antibody form a suitable antigen-binding site; By measuring and evaluating the antigen-binding activity of a mutant antibody with amino acid substitutions, a mutant FR sequence having desired properties can be selected.
  • the "humanized antibody” includes, for example, a light antibody comprising a CDR containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence consisting of Val-Thr-Ser, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • Examples include humanized antibodies that have a chain variable region and a heavy chain variable region that includes CDRs 1 to 3 each containing the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4 to 6, and that bind to human-derived Eva1 protein.
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 7 to 10, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 7 to 10, and SEQ ID NOs: 7 to 10.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 13 to 16, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 13 to 16, and SEQ ID NOs: 13 to 16.
  • Humanized antibodies include one amino acid sequence selected from the amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added, and/or inserted in at least one of the amino acid sequences described in No. 16.
  • the modification and homology of the variable region are as explained in "Antibodies derived from non-human animals," but in the humanized antibody of the present invention, the CDR sequences are not modified and the light chain variable region
  • the sequences of CDR1-3 and heavy chain variable region CDR1-3 are respectively the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1, the amino acid sequence consisting of Val-Thr-Ser, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:3, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:4.
  • the amino acid sequence is specified by the amino acid sequence set forth in .
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 7.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
  • a humanized antibody comprising one amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of (H1-L4)
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15.
  • a humanized antibody comprising one amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of (H2-L3)
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 10.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
  • a humanized antibody comprising one amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of (H2-L4)
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
  • a preferred example is a humanized antibody comprising an amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added, and/or inserted in at least one of the following.
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 7.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
  • a humanized antibody comprising one amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of (H2-L4)
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
  • a humanized antibody comprising one amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of (H3-L4)
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16.
  • a preferred example is a humanized antibody comprising an amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added, and/or inserted in at least one of the following.
  • the antibody of the present invention may also be an antibody that competes in binding to human Eva1 with an antibody that contains the above-mentioned specific amino acid sequence or a variant thereof and retains a variable region or CDR.
  • an embodiment of an antibody that binds to an epitope to which an antibody having a variable region or CDR containing the above-mentioned specific amino acid sequence or a variant thereof may be reactive.
  • the term "epitope" refers to an antigenic determinant present in an antigen, that is, a site on the antigen to which an antigen-binding domain in an antibody binds. Therefore, the epitope in the present invention may be a polypeptide (linear epitope) consisting of a plurality of consecutive amino acids in the primary sequence of amino acids, and amino acids that are not adjacent in the primary sequence of amino acids may be It may also be a polypeptide (discontinuous epitope, structural epitope) formed by coming into close proximity due to a three-dimensional structure such as folding. Such epitopes also typically consist of at least 3 (eg, 4), and most commonly at least 5 (eg, 6-20, 7-15, 8-10) amino acids. .
  • those skilled in the art can identify the peptide region (epitope) on the antigen to which the antibody is reactive and produce various antibodies that bind to that peptide region. Additionally, whether two antibodies bind to the same or sterically overlapping epitopes can be determined by competition assays.
  • the "functional fragment" of an antibody means a part (partial fragment) of an antibody that exhibits reactivity with human Eva1. Specifically, Fab, Fab', F(ab')2, variable region fragment (Fv), disulfide bond Fv, single chain variable region fragment (single chain Fv, scFv), sc(Fv)2, diabody , multispecific antibodies, and polymers thereof.
  • Fab refers to a monovalent antigen-binding fragment of an immunoglobulin consisting of one light chain and part of a heavy chain. It can be obtained by papain digestion of antibodies and also by recombinant methods. "Fab'” differs from Fab by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain, including one or more cysteines in the antibody's hinge region. "F(ab')2" means a bivalent antigen-binding fragment of an immunoglobulin consisting of portions of both light chains and both heavy chains.
  • a “variable region fragment (Fv)” is the smallest antibody fragment that has a complete antigen recognition and binding site.
  • Fv is a dimer in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are tightly linked by non-covalent bonds.
  • a “single chain variable region fragment (single chain Fv, scFv)” comprises the heavy and light chain variable regions of an antibody, which regions are present in a single polypeptide chain.
  • sc(Fv)2 is a single chain made by linking two heavy chain variable regions and two light chain variable regions with a linker or the like.
  • a “diabody” is a small antibody fragment with two antigen-binding sites, which contains a heavy chain variable region joined to a light chain variable region in the same polypeptide chain, each region having a distinct It forms a pair with the complementary region of the strand.
  • a “multispecific antibody” is a monoclonal antibody that has binding specificity for at least two different antigens. For example, two heavy chains can be prepared by co-expression of two immunoglobulin heavy/light chain pairs with different specificities.
  • the antibody of the present invention can be produced by the hybridoma method or by the recombinant DNA method.
  • a typical example of the hybridoma method is the method of Kohler and Milstein (Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)).
  • the antibody-producing cells used in the cell fusion step in this method are animals ( Examples include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood leukocytes of mice, rats, hamsters, rabbits, monkeys, and goats. It is also possible to use antibody-producing cells obtained by allowing an antigen to act in a medium on the above-mentioned cells or lymphocytes previously isolated from non-immunized animals.
  • Various known cell lines can be used as myeloma cells.
  • Antibody-producing cells and myeloma cells may originate from different animal species as long as they can fuse, but preferably they originate from the same animal species.
  • Hybridomas are produced, for example, by cell fusion between spleen cells obtained from mice immunized with an antigen and mouse myeloma cells, and then screened to identify hybridomas that produce monoclonal antibodies specific to human Eva1.
  • a monoclonal antibody against human Eva1 can be obtained by culturing a hybridoma or from the ascites of a mammal to which the hybridoma has been administered.
  • the recombinant DNA method involves cloning the DNA encoding the antibody of the present invention from a hybridoma, B cell, etc., inserting it into an appropriate vector, and injecting it into host cells (e.g., mammalian cell lines such as HEK cells, Escherichia coli, yeast cells, etc.). cells, insect cells, plant cells, etc.) and produce the antibody of the present invention as a recombinant antibody (for example, P. J. Delves, Antibody Production: Essential Techniques, 1997 WILEY, P. Shepherd and C. .Dean Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, Vandamme A.M.
  • host cells e.g., mammalian cell lines such as HEK cells, Escherichia coli, yeast cells, etc.
  • host cells e.g., mammalian cell lines such as HEK cells, Escherichia coli, yeast cells, etc.
  • cells insect cells,
  • the DNA encoding the heavy chain or light chain may be separately incorporated into an expression vector to transform host cells. It may be incorporated into a single expression vector to transform host cells (see WO 94/11523).
  • the antibody of the present invention can be obtained in a substantially pure and homogeneous form by culturing the above-mentioned host cells, separating and purifying the antibodies within the host cells or from the culture solution. For isolation and purification of antibodies, methods commonly used for purification of polypeptides can be used.
  • transgenic animal production technology to create a transgenic animal (cow, goat, sheep, pig, etc.) into which an antibody gene has been inserted, a large amount of monoclonal antibodies derived from the antibody gene can be produced from the milk of the transgenic animal. It is also possible to obtain
  • the present invention also provides a DNA encoding the antibody of the present invention, a vector containing the DNA, a host cell retaining the DNA, and a method for producing an antibody, which comprises culturing the host cell and recovering the antibody. can do.
  • ⁇ Antibody-drug conjugate> As shown in the Examples below, human Eva1, which is the target of the antibody of the present invention, is expressed in various cancers.
  • the antibodies of the present invention (particularly humanized antibodies) are also useful as ADCs. Therefore, the present invention may also take the form of an antibody-drug conjugate (ADC) in which the antibody of the present invention (particularly a humanized antibody) or a functional fragment thereof is bound to a drug.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the "drug” that can be bound to the antibody is not particularly limited, but includes, for example, cytotoxic substances known in the art.
  • Cytotoxic substances include anticancer drugs such as irinotecan (CPT-11), irinotecan metabolite SN-38 (10-hydroxy-7-ethylcamptothecin), adriamycin, taxol, 5-fluorouracil, nimustine.
  • alkylating agents such as laministine and temozolomide, antimetabolites such as gemcitabine and hydroxycarbamide, plant alkaloids such as etoposide and vincristine, anticancer antibiotics such as mitomycin and bleomycin, platinum preparations such as cisplatin, sorafenib, erlotinib, etc. molecular targeting agents, methotrexate, cytosine arabinoside, 6-thioguanine, 6-mercaptopurine, cyclophosphamide, ifosfamide, busulfan, MMAE (monomethyl auristatin E), DM1 (mertansine), and calichiamycin.
  • alkylating agents such as laministine and temozolomide, antimetabolites such as gemcitabine and hydroxycarbamide, plant alkaloids such as etoposide and vincristine, anticancer antibiotics such as mitomycin and bleomycin, platinum preparations such as c
  • Cytotoxic agents also include radioisotopes such as 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, 131 I, 186 Re, 188 Re , 10 B, 111 In, 90 Y.
  • Cytotoxic substances include photosensitizers that exhibit cytotoxic activity, and more specifically, substances that themselves change into a form that exhibits cytotoxicity (cytotoxicity) when activated by light irradiation. It may also be a substance that produces a cytotoxic substance (cytotoxic substance). Examples include chlorins, chlorin e6, porfimer sodium, talaporfin sodium, verteporfin, and precursors and derivatives thereof. Further, examples of cytotoxic substances include toxic peptides such as ribosome inactivating proteins (RIPs) such as saporin, ricin, and Shiga toxin.
  • RIPs ribosome inactivating proteins
  • the binding between the antibody and the cytotoxic substance can be performed by a method known in the art, and may be either direct binding or indirect binding.
  • a covalent bond can be used as a direct bond.
  • binding via a linker can be used.
  • the antibody and the cytotoxic substance are bonded via a linker.
  • a linker By binding two molecules via a linker, the antigenicity of the cytotoxic substance can be attenuated, which is preferable for administration to a subject.
  • linkers General techniques for linkers are described, for example, by Hermanson, G.; T. Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996; Harris, J. M. and Zalipsky, S. Ed., Poly (ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series, 1997; Veronese, F. and Harris, J. M. ed., Peptide and protein PEGylation. It is described in Advanced Drug Delivery Review 54(4), 2002.
  • the linker includes not only a linear linker (bivalent linker) but also a branched linker (trivalent or higher valent linker).
  • a linear linker has a cytotoxic agent at one end and an antibody at another end.
  • a branched linker typically has a cytotoxic agent on each branch (each chain) of the branch and an antibody on the other end.
  • Such linkers include, for example, N-succinimidyl-4-(maleimidomethyl)cyclohexanecarboxylate (SMCC), sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-l-carboxy-(6-amidocaproate) (LC-SMCC), N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate (SPDB), N -Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP), 4-maleimidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester (GMBS), 3-maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimidobenzoyl-N -
  • the bond between the antibody and the linker is a covalent bond or a non-covalent bond (ionic bond, hydrophobic bond, etc.), preferably a covalent bond.
  • This bond is preferably such that a cytotoxic substance is unlikely to be released in the blood when the complex of the present invention is administered to a subject.
  • bonds include a bond between a maleimide group and a thiol group, a bond obtained by reacting a haloester with a thiol, an amide bond between a carboxyl group and an amino group, a disulfide bond between a thiol group, and an amino bond.
  • Dehydration substitution bond with the amino group contained in the group for example, WO 2008/096760
  • dehydration condensation bond between the amino group present at one end of the linker and the carboxylic acid contained in aspartic acid or glutamic acid on the antibody for example, using WSCDI.
  • WO 2010/055950 For a specific method of binding an antibody and a linker, see, for example, WO 2010/055950.
  • the bond between the antibody or linker and the cytotoxic substance is a covalent bond or a non-covalent bond (ionic bond, hydrophobic bond, etc.), and preferably a covalent bond.
  • the bond is such that a cytotoxic substance is unlikely to be released in the blood when the complex of the present invention is administered to a subject.
  • the bond between the antibody or linker and the cytotoxic substance is preferably, but not limited to, an ester bond, carbamate bond, carbonate bond, or thiocarbamate bond, and more preferably an ester bond. be.
  • the number of cytotoxic substances bound per antibody molecule is determined by using raw materials and reagents to be reacted so that the number is a constant number, taking into account its effectiveness and safety.
  • the reaction is carried out by specifying the reaction conditions such as the amount of
  • a mixture of different numbers of drugs is usually obtained.
  • the number of drugs bound to one antibody molecule is specified and expressed as an average value, that is, the average number of drug bonds. Therefore, in this specification, unless otherwise specified, the number of drug bonds means the average value.
  • the number of drugs bound per antibody molecule can be controlled by adjusting the type and concentration of the reducing agent used, the concentration of the linker and drug relative to the antibody (molar excess, etc.), and the temperature or time in the binding reaction.
  • the "reducing agent” is not particularly limited as long as it can reductively cleave the disulfide bonds in the antibody to form a bond via the thiol group, but examples include dithiothreitol (DTT, DL- DTT), 2-mercaptoethylamine, mercaptoethanol, and TCEP.
  • the average number of drugs bound per antibody is not particularly limited, but is, for example, 1 to 10, preferably 3 to 8, and more preferably 3 to 5.
  • the number of drug binding per antibody molecule is determined by measuring the absorbance at the absorption peak of a cytotoxic substance (for example, DM1) and the absorbance at 280 nm, which is the absorption peak of the antibody, as shown in the Examples below.
  • the concentration of the antibody and the cytotoxic substance can be determined by calculating the simultaneous equations taking into account the effects of each on the absorption peak of the other, and determining the ratio of the number of molecules. It can also be determined using a reagent that colorimetrically measures thiol groups, such as DTNB.
  • the ADC of the present invention when left in the air or recrystallized, it may absorb water, have adsorbed water, or become a hydrate, and such water-containing compounds and Salts are also included in the invention.
  • One or more of the atoms comprising the ADCs of the invention may also contain unnatural proportions of atomic isotopes.
  • atomic isotopes include 2 H, 3 H, 125 I, and 14 C.
  • the ADC of the present invention can be detected using bioimaging techniques and the like. Therefore, a labeling substance may be bound.
  • the labeling substance is appropriately selected depending on the type of detection method used, and examples thereof include radioactive labeling substances, fluorescent labeling substances, paramagnetic labeling substances, superparamagnetic labeling substances, and enzyme labeling substances.
  • such a binding between the labeling substance and the ADC may be direct or indirect. Indirect binding includes binding via a secondary antibody bound to a labeling substance, or a polymer (protein A, protein B, etc.) bound to a labeling substance.
  • a positron-emitting nuclide can be used as the radioisotope that labels the ADC.
  • antibodies can be labeled with positron-emitting nuclides such as 64 Cu, 18 F, 55 Co, 66 Ga, 68 Ga, 76 Br, 89 Zr, and 124 I.
  • positron-emitting nuclides such as 64 Cu, 18 F, 55 Co, 66 Ga, 68 Ga, 76 Br, 89 Zr, and 124 I.
  • known methods Nucl Med Biol. 1999; 26 (8): 943-50., J Nucl Med. 2013; 54 (11): 1869-75., etc.
  • the radiation emitted from the radionuclide is measured from outside the body using a PET (positron emission tomography device) and converted into an image using computer tomography. Ru. In this way, it is possible to track the arrival, accumulation, etc. of the ADC administered to the subject at the target site.
  • PET positron emission tomography device
  • ⁇ Chimeric antigen receptor> As shown in the Examples below, human Eva1, which is the target of the antibody of the present invention, is expressed in various cancers. Furthermore, the variable region of the antibody of the present invention is useful in chimeric antigen receptors (CARs) and T cells expressing them (so-called CAR-T). Therefore, the present invention may also take the form of a CAR, which includes a region that binds to human-derived Eva1 protein, a transmembrane region, and an intracellular signal region.
  • a "Chimeric Antigen Receptor (CAR)” has an extracellular region that binds to human-derived Eva1 protein, a transmembrane region, and an intracellular signal region in that order. It refers to a chimeric protein that is arranged from the N-terminus and linked directly or indirectly.
  • the "region that binds to human-derived Eva1 protein (antigen-binding region)" can be, for example, the above-mentioned antibody or a functional fragment thereof, but scFv is usually used for CAR.
  • scFv is a structure in which the light chain variable region and heavy chain variable region of a monoclonal antibody (immunoglobulin) are linked via a linker, and retains the ability to bind to an antigen.
  • the N-terminal side of the scFv may be a light chain variable region, a linker, and a heavy chain variable region, or a heavy chain variable region, a linker, and a light chain variable region, but the former is preferable. be.
  • a peptide linker can be used as the "linker” in scFv.
  • the length of the linker is not particularly limited.
  • a linker having 5 to 25 amino acids can be used.
  • the length of the linker is preferably 8 to 25 amino acids, more preferably 15 to 20 amino acids.
  • Suitable examples of peptide linkers include glycine or glycine and serine (GGS linker, GS linker, GGG linker, etc.).
  • a suitable example also includes a linker consisting of 18 amino acids from positions 134 to 151 as set forth in SEQ ID NO: 58. Glycine and serine, which are amino acids constituting these linkers, have the advantage of being small in size and difficult to form a higher-order structure within the linker.
  • the monoclonal antibody that serves as the basis for scFv includes the above-mentioned antibodies derived from non-human animals, human antibodies, and humanized antibodies.
  • preferred examples are as described above, but as shown in Examples below, the combination (H2-L2) above is preferred from the viewpoint of activation and cell proliferation in response to human Eva1, and furthermore, N
  • the scFv is formed by connecting L2, linker, and H2 in this order from the terminal side.
  • the "transmembrane region” is not particularly limited as long as it is a polypeptide that has the function of penetrating the cell membrane and can anchor CAR to the cell membrane.
  • Proteins from which polypeptides responsible for transmembrane regions are derived include, for example, CD28, CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , 4-1BB, CD45, CD4, CD5, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, and CD80. , CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, GITR, ⁇ and ⁇ chains of T cell receptors.
  • the "intracellular signal region” is a region that is placed inside the cell when CAR is placed on the cell membrane, and is used to transmit signals necessary for the effector function of immune cells to be exerted, that is, to transmit antigens.
  • the binding region binds to an antigen (human Eva1), it is a region capable of transmitting a signal (so-called primary signal) necessary for activation of immune cells.
  • Such intracellular signal regions generally include those that have only activation signal transduction domains such as T cell receptor (TCR) and CD3 complex (first generation CAR), and those that have only activation signal transduction domains such as T cell receptor (TCR) and CD3 complex, and those that have only activation signal transduction domains such as T cell receptor (TCR) and CD3 complex.
  • TCR T cell receptor
  • TCR T cell receptor
  • CD3 complex first generation CAR
  • the "intracellular signal region” only needs to be capable of transmitting a primary signal, and an activation signal transduction domain of a protein involved in the signal can be used.
  • an activation signal transduction domain of a protein involved in the signal can be used.
  • ITAM immunoreceptor tyrosine-based activation motif
  • proteins having ITAM include CD3 ⁇ , FcR ⁇ , FcR ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, DAP10, and DAP12.
  • the positional relationship between the CD79A intracellular domain and the CD40 intracellular domain is not particularly limited, and either an embodiment where the N-terminal side is the CD79A intracellular region or a case where the N-terminal side is the CD40 intracellular region can be adopted. be.
  • the arrangement relationship is preferably the former.
  • the CD79A intracellular region and the CD40 intracellular region are preferably linked directly or via a linker.
  • the linker is not particularly limited and is arbitrary as long as the NF ⁇ B signal activation effect is not significantly impaired.
  • the linker is preferably a linker composed of glycine or glycine and serine (GGS linker, GS linker, GGG linker, etc.).
  • the length of the linker is not particularly limited, but is, for example, 1 to 20 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids, and more preferably 1 to 5 amino acids.
  • the number of intracellular signal regions included in a CAR is not limited to one, and may include a plurality of intracellular signal regions (for example, 1 to 5, 1 to 3, or 1 or 2). (can also contain multiple signaling factors). In this case, the plurality of intracellular signal regions contained may be the same or different.
  • the CAR of the present invention can also contain other domains.
  • other domains include, but are not limited to, costimulatory transduction regions, spacer sequences, signal peptides, and the like.
  • Costimulatory transduction region refers to an intracellular domain involved in costimulatory signal transduction of costimulatory molecules as described above.
  • costimulatory molecules include CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), ICOS, CD2, CD4, CD5, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD154, and the like.
  • CARs of the invention can include costimulatory transmission regions of these costimulatory molecules.
  • the number of costimulation transmission regions that can be included in the CAR of the present invention is not limited to one, and may be multiple.
  • the CAR of the invention can include, for example, 1 to 5, 1 to 3, or 1 or 2 costimulatory transmission regions.
  • the regions may be the same or different.
  • spacer refers to a sequence that connects each region, etc., and is not particularly limited as long as it does not inhibit the function of each region, and the number of amino acids is also not particularly limited, but usually 1 ⁇ 500 amino acids, preferably 5 to 300 amino acids, more preferably 10 to 100 amino acids.
  • the antigen-binding region and the transmembrane region are preferably linked directly or via a relatively short spacer.
  • the number of amino acids constituting the spacer between the antigen-binding region and the transmembrane region is, for example, 1 to 400, preferably 10 to 300.
  • the constituent amino acids are 150 to 300. More preferably, it is 200 to 250.
  • the number of constituent amino acids is more preferably 10 to 30.
  • the sequence of the spacer is not particularly limited, but may include, for example, the hinge region of IgG, preferably human IgG (e.g. subtype IgG1 or IgG4) or a part thereof, the hinge region and a part of CH2, or a factor used in the transmembrane domain (for example, a sequence such as a portion of CD28) can be used as a spacer.
  • a sequence such as a portion of CD28
  • spacers include spacers consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62, or 62 (positions 268 to 499 of SEQ ID NO: 58).
  • the "signal peptide” refers to a peptide for promoting the secretion of CAR or instructing its localization to the cell membrane, and is also referred to as a leader sequence.
  • a signal peptide can usually be attached directly or indirectly to the N-terminus of the antigen-binding region.
  • the signal peptide may also be cleaved from the antigen binding region during cell processing and localization of the CAR to the cell membrane.
  • signal peptides examples include the human GM-CSF receptor, the ⁇ and ⁇ chains of the T cell receptor, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD3 ⁇ , CD28, CD3 ⁇ , CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, Examples include signal peptides such as CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, and GITR.
  • each region in the CAR of the present invention has been described above, but those skilled in the art will know the specific amino acid sequences of these regions, etc. from known literature or from the NCBI (http://www.ncbi.nlm. It can be obtained as appropriate by searching a database such as nih.gov/guide/). Furthermore, as shown in Table 3 above, specific sequences are also disclosed in the sequence listing of the present application.
  • the regions according to the present invention are not limited to such typical amino acid sequences (e.g., NCBI reference sequence), but may be modified versions of these typical amino acid sequences as long as the functions of the regions are maintained. , may also include homologs.
  • such variants and homologs usually have high homology to the typical amino acid sequence. High homology is usually 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more (for example, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • the CAR of the present invention may be a molecule consisting of one type of polypeptide, or a molecule consisting of a complex of two or more types of polypeptides. Furthermore, the CAR of the present invention may be a molecule consisting of a polypeptide or a complex thereof, or other substances (e.g., fluorescent substances, radioactive substances, inorganic particles, etc.) are linked to the polypeptide or the complex. It may also be made by
  • the CAR of the present invention may be chemically modified.
  • the polypeptide constituting the CAR of the present invention may have a carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO-), an amide (-CONH 2 ), or an ester (-COOR) at the C-terminus.
  • R in the ester is, for example, a C1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; for example, phenyl, ⁇ -C6-12 aryl groups such as naphthyl; For example, phenyl-C1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl; C7-14 aralkyl groups such as ⁇ -naphthyl-C1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl; pivalo Yyloxymethyl group etc.
  • a C1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl
  • a C3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl,
  • carboxyl groups (or carboxylates) other than the C-terminus may be amidated or esterified.
  • ester for example, the above-mentioned C-terminal ester can be used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue is a protecting group (for example, a C1-6 acyl group such as a C1-6 alkanoyl such as a formyl group or an acetyl group).
  • pyroglutamic oxidation of the N-terminal glutamine residue that can be generated by cleavage in vivo substituents on the side chains of amino acids in the molecule (e.g. -OH, -SH, amino groups, Also included are those in which an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.) are protected with an appropriate protecting group (for example, a C1-6 acyl group such as a C1-6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group).
  • the CAR of the present invention may have other functional proteins.
  • Other functional proteins are not particularly limited and are appropriately selected depending on the function desired to be imparted to the CAR of the present invention.
  • functional proteins used to facilitate the purification and detection of CAR include Myc tag, His tag, HA tag, FLAG tag (registered trademark, Sigma-Aldrich), and fluorescent protein tags (such as GFP). Can be mentioned.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt with an acid or base.
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and both acidic salts and basic salts can be employed.
  • acidic salts include inorganic acid salts such as hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, nitrates, phosphates; acetates, propionates, tartrates, fumarates, maleates;
  • Examples include organic acid salts such as malate, citrate, methanesulfonate, and paratoluenesulfonate; amino acid salts such as aspartate and glutamate.
  • basic salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid, and the like.
  • the invention provides polynucleotides encoding the CARs of the invention.
  • a monoclonal antibody that recognizes the target antigen is prepared, and the amino acid sequence of the monoclonal antibody is determined by a known method such as the Edman method. It can also be obtained based on Note that the specific sequences of the above-mentioned humanized antibodies and the like are also disclosed in the sequence listing of the present application. It can also be obtained by analyzing the nucleotide sequence of a hybridoma that produces the monoclonal antibody.
  • nucleotide sequences encoding each region in the CAR of the present invention can be found in known documents or from NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih). It can also be obtained appropriately by searching a database such as .gov/guide/). Further, the nucleotide sequences encoding the above regions are not limited to known ones, and any nucleotide sequence encoding the above regions can be used. Due to the degeneracy of the genetic code, there are multiple codons that correspond to one amino acid. Therefore, there are many nucleotide sequences that encode the same amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide of the present invention may be any of a plurality of nucleotide sequences resulting from the degeneracy of the genetic code, as long as it encodes the CAR of the present invention. Furthermore, in order to optimize expression in cells expressing CAR, codons selected to encode amino acids in the nucleotide sequence encoding each region in the CAR of the present invention may be modified.
  • nucleotide sequence information Based on such nucleotide sequence information, those skilled in the art can use known techniques such as chemical synthesis methods (phosphoramidite method, etc.) and PCR amplification methods to generate polynucleotides encoding each region, etc. Nucleotides can be made. Furthermore, a polynucleotide encoding the CAR of the present invention can be obtained by linking the polynucleotides encoding each region obtained in this way directly or via a spacer. The polynucleotides encoding each region can be linked using a known method such as, for example, overlap extension PCR, as shown in Examples below.
  • Vectors of the present invention may be linear or circular, and include, for example, viral vectors, plasmid vectors, episomal vectors, artificial chromosome vectors, and transposon vectors.
  • viral vectors examples include retrovirus vectors such as lentiviruses, Sendai virus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, pox virus vectors, polio virus vectors, sylvis virus vectors, and rhabdovirus vectors.
  • retrovirus vectors such as lentiviruses, Sendai virus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, pox virus vectors, polio virus vectors, sylvis virus vectors, and rhabdovirus vectors.
  • retrovirus vectors such as lentiviruses, Sendai virus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, pox virus vectors, polio virus vectors, sylvis virus vectors,
  • plasmid vectors include plasmid vectors for expression in animal cells, such as pcDNA3.1, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, and pcDNAI/Neo.
  • Episomal vectors are vectors that can autonomously replicate outside the chromosome. Specific means for using episomal vectors are known (see Yu et al., Science, 2009, pp. 324, 797-801). Examples of episomal vectors include vectors containing sequences necessary for autonomous replication derived from EBV, SV40, etc. as vector elements. Specifically, the vector elements necessary for autonomous replication include a replication origin and a gene encoding a protein that binds to the replication origin and controls replication. For example, in EBV, the replication origin oriP and the EBNA-1 gene, and in the case of SV40, the replication origin ori and the SV40LT gene.
  • artificial chromosome vectors examples include YAC (Yeast artificial chromosome) vector, BAC (Bacterial artificial chromosome) vector, and PAC (P1-derived artificial chromosome) vector.
  • YAC yeast artificial chromosome
  • BAC Bacillus chromosome
  • PAC P1-derived artificial chromosome
  • retrovirus vectors are preferred from the viewpoints that genes can be easily introduced with high efficiency even into cells that proliferate slowly, and that stable expression strains can be easily established.
  • the vector of the present invention includes expression control sequences such as promoters, enhancers, polyA addition signals, and terminators, and replication origins that bind to and control replication. It may contain nucleotide sequences encoding proteins, nucleotides encoding other proteins, and the like.
  • each polynucleotide By operably arranging the polynucleotide encoding the above-mentioned CAR and the nucleotide encoding the other protein described later downstream of the promoter, each polynucleotide can be efficiently transcribed.
  • promoters include CMV (cytomegalovirus) promoter, SR ⁇ promoter, SV40 early promoter, retrovirus LTR, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter, and EF1 ⁇ .
  • promoters include promoters, metallothionein promoters, heat shock promoters, and the like.
  • nucleotides encoding other proteins include fluorescent protein genes, reporter genes, marker genes such as drug resistance genes, and genes encoding molecules involved in T cell activation such as cytokines. .
  • IRES DNA encoding a 2A peptide sequence (for example, 2A peptide (T2A) derived from Thosea asigna), the other proteins can be polycistronicly expressed together with the above-mentioned CAR. becomes.
  • the present invention uses the suicide gene as a "nucleotide encoding another protein".
  • the vector may include.
  • suicide genes include herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) and inducible caspase 9 (iCasp9).
  • examples of drugs that activate the function of such genes include ganciclovir for HSV-TK and AP1903, a chemical induction of dimerization (CID) for iCasp9. (Cooper LJ. et al., Cytotherapy.
  • the invention provides cells that express the CAR of the invention.
  • the cells of the present invention can be obtained by introducing the polynucleotide or vector encoding the CAR of the present invention described above into the cells.
  • the "cell” into which the polynucleotide or vector of the present invention is introduced is preferably a cell derived from a mammal, such as a cell derived from a human, a rodent (mouse, rat, etc.), a cow, a sheep, a horse, etc.
  • Cells derived from non-human mammals such as , dogs, pigs, and monkeys can be used.
  • the type of cells is not particularly limited, and cells collected from body fluids such as blood and bone marrow fluid, tissues such as spleen, thymus, and lymph nodes, tumors, cancerous ascites, etc. can be used.
  • a preferable example of the CAR-expressing cells is an immune cell.
  • immunosens examples include CD4-positive CD8-negative T cells, CD4-negative CD8-positive T cells, T cells prepared from iPS cells, ⁇ -T cells, ⁇ -T cells, NK cells, NKT cells, etc. can.
  • Various cell populations can be used as long as they contain lymphocytes or progenitor cells as described above.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells collected from peripheral blood are one of the preferred immune cells. That is, in one preferred embodiment, gene introduction operation is performed on PBMC.
  • PBMC can be prepared according to or analogously to a conventional method.
  • CAR-expressing cells can be activated by stimulation with anti-CD3 antibodies and anti-CD28 antibodies. More specifically, stimulation with anti-CD3 antibodies and anti-CD28 antibodies can be applied by culturing in a culture container (eg, a culture dish) whose culture surface is coated with anti-CD3 antibodies and anti-CD28 antibodies. The stimulation can also be performed using magnetic beads coated with anti-CD3 antibodies and anti-CD28 antibodies (for example, Dynabeads T-Activator CD3/CD28 provided by VERITAS).
  • a culture container eg, a culture dish
  • the stimulation can also be performed using magnetic beads coated with anti-CD3 antibodies and anti-CD28 antibodies (for example, Dynabeads T-Activator CD3/CD28 provided by VERITAS).
  • T cell growth factors In order to increase the survival rate/proliferation rate of cells, it is preferable to use a culture medium to which T cell growth factors are added during the activation treatment.
  • IL-2, IL-15, IL-7, etc. can be used as T cell growth factors.
  • T cell growth factors such as IL-2, IL-15, and IL-7 can be prepared according to conventional methods. Moreover, commercially available products can also be used. Although this does not exclude the use of T cell growth factors from animal species other than humans, human-derived T cell growth factors (which may be recombinant) are usually used.
  • lymphocytes introduced with the polynucleotide of the present invention are proliferated.
  • the polynucleotide-introduced lymphocytes of the present invention are cultured using a culture medium to which a T cell growth factor has been added (subcultured if necessary).
  • the same treatment (reactivation) as in the case of activating CAR-expressing cells may be performed.
  • a medium supplemented with serum human serum, fetal bovine serum, etc.
  • serum-free medium is highly safe for clinical application. , and it becomes possible to prepare cells that have the advantage that differences in culture efficiency due to differences between serum lots are unlikely to occur.
  • autologous serum ie, serum collected from a subject receiving the cells of the present invention.
  • the cells of the present invention may be cells in which the function of proteins (immune checkpoint substances, etc.) that suppress excessive immune reactions, etc. is suppressed.
  • proteins include Programmed Death 1 (PD1), PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, etc.), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT,
  • PD1 Programmed Death 1
  • the cells of the present invention may be cells in which the functions of endogenous proteins such as TCR and HLA are suppressed in order to facilitate allotransplantation.
  • Methods for suppressing the function of a protein include a knockout method that targets the gene encoding the protein, a method that uses dsRNA (double-stranded RNA, e.g. siRNA) complementary to the transcription product of the gene, and a method that uses the transcription product of the gene and Examples include a method using complementary antisense RNA and a method using RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product.
  • dsRNA double-stranded RNA, e.g. siRNA
  • Examples include a method using complementary antisense RNA and a method using RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product.
  • ZFNs zinc finger nucleases
  • TALENs transcription activation-like effector nucleases
  • CRISPR-Cas9 DNA double-strand cleaving enzymes
  • Methods for introducing the polynucleotide or vector of the present invention into cells include lipofection method, microinjection method, calcium phosphate method, DEAE-dextran method, electroporation method, particle gun method, and the like.
  • the vector of the present invention is a retrovirus vector
  • appropriate packaging cells are selected based on the LTR sequence and packaging signal sequence possessed by the vector, and retrovirus particles are prepared using this. It's okay.
  • packaging cells include PG13, PA317, GP+E-86, GP+envAm-12, and Psi-Crip.
  • 293 cells and 293T cells which have high transfection efficiency, can also be used as packaging cells.
  • the expression of CAR in the cells is confirmed by known methods such as flow cytometry, RT-PCR, Northern blotting, Western blotting, ELISA, and fluorescent immunostaining. can do.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition (e.g., an anticancer drug) containing a cell expressing the antibody, ADC, or CAR of the present invention (hereinafter also simply referred to as "the antibody of the present invention, etc.") as an active ingredient, and the present invention
  • a pharmaceutical composition e.g., an anticancer drug
  • the present invention also provides a method for treating or preventing a disease (e.g., cancer) associated with Eva1 protein, comprising the step of administering to a subject a therapeutically or prophylactically effective amount of an antibody or the like.
  • the disease associated with the Eva1 protein targeted by the antibody of the present invention may be any disease in which the expression of the Eva1 protein is involved in its onset, progression of symptoms, deterioration, etc., such as cancer.
  • the "cancer” targeted by the antibody of the present invention only needs to express at least human Eva1, and as long as the protein is expressed, it may be a solid tumor, such as leukemia, lymphoma, etc. There may be. More specifically, gliomas (tumors arising from neural stem cells, nervous system progenitor cells and glial cells, such as glioblastoma multiforme (GBM), astrocytoma, parablastoma, brain Supraventricular tumor, oligodendroglioma, choroid plexus papilloma, especially anaplastic astrocytoma, anaplastic oligodendroastrocytoma, anaplastic oligodendroglioma), pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, bile duct Cancer, hepatocellular carcinoma, breast cancer, lung cancer, kidney cancer, urothelial cancer, testicular cancer, prostate cancer, head and neck cancer, thyroid cancer,
  • the "pharmaceutical composition" of the present invention can contain, in addition to the antibody of the present invention, other pharmacologically acceptable components.
  • Such other ingredients include, for example, carriers, emulsifiers, wetting agents, pH buffering agents, media, excipients, disintegrants, buffers, tonicity agents, suspending agents, solubilizing agents, and soothing agents. agents, stabilizers, preservatives, and preservatives.
  • other pharmacologically acceptable ingredients include, in the case of liquid preparations such as injections, aqueous solutions (physiological saline, water for injection, phosphate buffer, glucose aqueous solution, glycerol aqueous solution, etc.) , aluminum hydroxide, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the invention may be in the form of a kit, such that the components described above can be mixed prior to administration. Furthermore, when used as an injection, it may be introduced into a syringe.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain only the antibody, etc. of the present invention as an active ingredient, or may contain the antibody, etc. and at least one other anticancer agent. Furthermore, the antibodies and the like of the present invention can also be administered together with other anticancer drugs, thereby enhancing the antitumor effect. Other anticancer drugs used for this purpose may be administered to the subject simultaneously with the antibody of the present invention, etc., separately or consecutively, or may be administered at different intervals. Good too.
  • anticancer drugs include immune checkpoint inhibitors (anti-PD-1 antibodies, etc.), gemcitabine, S-1, erlotinib, 5-FU, temozolomide, leucovorin, irinotecan (CPT-11), Oxaliplatin, Abraxane, carboplatin, paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinblastine, LH-RH analogs (leuprorelin, goserelin, etc.), estramustine phosphate, estrogen antagonists (tamoxifen, raloxifene, etc.), aromatase inhibitors (ana (strozole, letrozole, exemestane, etc.) and the drugs described in WO 2003/038043, but the drug is not limited as long as it has antitumor activity.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • serum albumin for the purpose of protecting the cells, and antibiotics and the like for the purpose of preventing bacterial contamination. It's okay to stay.
  • cytokines growth factors
  • T cell activators such as steroids, vitamins, immunostimulants, and immune checkpoint inhibitors for the purpose of inducing cell activation, proliferation, or differentiation, and The cells of the present invention and these other components may be used in combination.
  • the administration method of the pharmaceutical composition varies depending on the type of substance to be administered, the aspect of the composition, the age, weight, sex, health condition of the subject, etc., but includes parenteral administration (e.g., intravenous administration, arterial administration, local administration), Administration can be by any route of administration, including oral administration.
  • a preferred method of administration is parenteral administration, more preferably intravenous administration.
  • local administration may be performed instead of systemic administration. Local administration can include direct injection into the targeted tissue, organ, or organ.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the subject's age, weight, sex, health condition, degree of progression of symptoms, and components of the pharmaceutical composition to be administered.
  • the administration schedule may be adjusted as appropriate depending on these conditions, and in addition to single administration, it may be administered multiple times continuously or periodically.
  • the amount is 0.1 to 1000 mg per kg per day, preferably 1 to 100 mg.
  • the amount of drug contained is 0.001 to 1000 mg per kg of body weight per day for adults, preferably 0.01 to 100 mg.
  • the frequency of administration of these antibodies or ADCs is, for example, once, or at intervals of once a day to once a year (e.g., every week, every 10 to 30 days, every month, every 3 to 6 months, every 6 months). , every year) may be administered multiple times.
  • the dosage of cells is 1x10 3 to 1x10 10 cells (preferably 1x10 4 to 1x10 9 cells, more preferably 1x10 5 to 1x10 cells per kg of body weight for adults). 8 ).
  • the administration interval can be, for example, every week, every 10 to 30 days, every month, every 3 to 6 months, every year, etc.
  • the cells of the present invention can autonomously proliferate within the body of the recipient, they can be administered only once.
  • the number of cells of the present invention in the body may be monitored after administration, and the timing of administration may be determined according to the results.
  • BBB blood-brain barrier
  • the antibody of the present invention can be administered while bypassing it.
  • a method of inserting a cannula or the like using a stereotactic neurosurgery method and directly administering the drug to a glioma or the like through the cannula can be mentioned.
  • Another example is a method of implanting a drug delivery system containing the antibody of the present invention into the brain (Gill et al., Nature Med. 9:589-595 (2003), etc.).
  • Further examples include transfection of neurons spanning the BBB with a vector containing a gene encoding the antibody of the present invention (eg, US Patent Application Publication No. 2003/0083299).
  • Brain barrier permeable substances include, for example, liposomes bound to antibody-binding fragments that bind to receptors on the vascular endothelium of the BBB (such as U.S. Patent Application Publication No. 20020025313), and low-density lipoprotein particles (such as U.S. Patent Application Publication No. 20020025313).
  • Publication No. 20040204354, etc. apolipoprotein E (US Patent Application Publication No. 20040131692, etc.), transferrin (US Patent Application Publication No. 2003/0129186, etc.), glycoprotein consisting of 29 amino acids derived from rabies virus (Kumar et al., Nature , July 5, 2007, volume 448, pages 39-43).
  • the antibody can be delivered to gliomas and the like through the BBB.
  • Such methods include, for example, increasing the permeability of the blood-brain barrier using glucocorticoid blockers (U.S. Pat. 2005/0124533, etc.), activating potassium channels (US Patent Application Publication No. 2005/0089473, etc.), inhibiting ABC drug transporters (US Patent Application Publication No. 2003/0073713, etc.), the present invention (U.S. Pat. No. 5,004,697, etc.).
  • the method of administering the antibody of the present invention for such diseases is not limited thereto.
  • the method for administering the antibody of the present invention for such diseases is as follows: Those skilled in the art can apply the antibody of the present invention to the affected area by appropriately selecting a known method suitable for the disease.
  • “subjects” to which the antibodies, etc. of the present invention are administered include, for example, humans suffering from the above-mentioned cancers, humans who are at risk of recurrence of the above-mentioned cancers, etc. These include humans who are at risk of contracting the disease.
  • “treatment” includes alleviating symptoms or accompanying symptoms characteristic of a target disease such as cancer (alleviating symptoms), preventing or delaying worsening of symptoms, and the like.
  • "Prevention” refers to preventing or delaying the onset, expression, or recurrence of a disease (disorder) or its symptoms, or reducing the risk of onset, expression, or recurrence.
  • the DNA sequences encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region have appropriate restriction enzyme recognition sites at the 5' and 3' ends so that they can be cloned into Absolute Antibody cloning vectors and expression vectors. Added and designed. Furthermore, the codons of these DNA sequences were optimized in consideration of expression in human cells. Based on these sequences, they were chemically synthesized and then cloned into Absolute Antibody vectors of appropriate species and types. The accuracy of the sequence was confirmed by analyzing raw data using DNASTAR Lasergene software and by Sanger sequencing. After making this confirmation, plasmid DNA of an appropriate size was prepared to prepare a sufficient amount of high-quality DNA necessary for transfection.
  • HEK293T cells were passaged to an optimal stage for transient transfection.
  • the heavy chain and light chain expression vectors were introduced into the cells and cultured for 6 days.
  • the cultures were centrifuged at 4000 rpm, and the culture supernatants were collected and filtered through a 0.22M filter.
  • the first step of purification was performed by protein A affinity chromatography, eluted with citric acid pH 3.0 buffer, and then neutralized with 0.5 M Tris, pH 9.0.
  • the eluted protein was buffer exchanged into PBS using a desalting column.
  • Antibody concentration was determined by UV spectroscopy and concentrated if necessary.
  • the chimeric human IgG1 was expressed and prepared not only in HEK293T cells but also in CHO cells.
  • Antibody Analytics Antibody purity was determined using SDS-PAGE and HPLC.
  • SEC-HPLC was performed on an Agilent 1100 series instrument using an appropriate size exclusion column (SEC).
  • Antibody expression titer was determined by protein A HPLC.
  • a human IgG capture antibody was immobilized on a CM5 chip by an amine coupling method. The immobilization was performed in both the reference cell and the active cell. Then, kinetic analysis of the anti-Eva1 antibody and hEva1 was performed by a single cycle method using the following measurement conditions.
  • Measurement conditions/Sample compartment temperature 10°C ⁇ Running buffer: HBS-EP+buffer, pH7.4 ⁇ Capturing molecule: Human IgG antibody, reference & active cell ⁇ Ligand: Various antibodies 5nM, active cell only ⁇ Analyte: hEva1-mouse Fc1, 5, 25, 125, 250nM, reference & active cell ⁇ Regeneration buffer: 3M M gCl2 , reference &Active cell blank (Analyte zero concentration) for 3 cycles. The cycle conditions are as shown in the table below.
  • CDR Grafting Polymerization The VH and VL sequences were analyzed using a CDR grafting algorithm, and the CDRs of the B2E5-48 mouse antibody were grafted into selected human germline cells.
  • CDRs are defined as primarily involved in binding to antigens, but amino acids outside the framework region may be directly involved in binding or may play a role in correctly arranging CDRs. be. Therefore, in order to maintain binding, we used a structural guidance method to determine which amino acids in the framework region should be left as mouse-derived (original) amino acids.
  • Table 7 shows an overview of the sequences generated as a result. In addition, in the table, the underlined sequences represent CDRs in each variable region.
  • the glycosylation motif and free cysteine which are the sequences with the highest risk among those shown in Table 4, were not detected in either the mouse antibody or the humanized antibody.
  • deamidation and isomerization motifs were found to exist in these antibodies. However, these motifs are commonly found in normal antibodies, although they are considered high risk as shown in Table 4. Furthermore, although modifications based on these motifs may cause confusion during production, in many cases they can be overcome by appropriate management methods. Furthermore, if necessary, these motifs can be removed by mutagenesis.
  • medium-risk and low-risk sequences were detected from the perspective of obtaining more complete antibodies, but it has rarely been reported that they cause problems in the antibody manufacturing process. Therefore, it was determined that there were no particular problems with the sequences of the mouse antibody and humanized antibody.
  • the average dissociation constant (K D ) was on the order of 10 ⁇ 7 in all cases.
  • H2-L2, H1-L4, H2-L3, and H2-L4 were at the same level as the chimeric antibody (produced by HEK293T cells).
  • H2-L2, H2-L4, and H3-L4 are useful in the antibody applications described below.
  • BD FACS Lysing Solution healthy human peripheral blood was hemolyzed (BD FACS Lysing Solution), and then stained with CD4, CD8, CD19, neutrophils (gate from scatter plot), and monocytes (gate from scatter plot), and at the same time.
  • the cells were stained with mouse anti-human Eva1 antibody and secondary antibody and analyzed by flow cytometry.
  • Example 2 Chimeric antigen receptor using mouse anti-Eva1 antibody sequence (Preparation of Eva1-CAR using anti-human Eva1 mouse antibody sequence) Next, in order to analyze the utility of chimeric antigen receptors (CARs) that target the Eva1 protein, such CARs were created. Specifically, as shown in FIG. 3A, a single chain antibody was constructed using the VL and VH of the anti-human Eva1 mouse antibody (the above B2E5-48 mouse antibody).
  • VL-linker-VH and VH-linker-VL were created, each having a short spacer domain of 15 aa (consisting of the amino acid sequence of positions 268 to 282 of SEQ ID NO: 58 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59).
  • CD28TM CD28 transmembrane region
  • CD28IC CD28 intracellular domain
  • CD3zeta CD3zeta
  • EGFR truncated EGFR, tEGFR
  • tEGFR truncated EGFR
  • CAR and tEGFR molecules at the T2A sequence after translation, and they are distributed in a 1:1 ratio.
  • tEGFR can be used as a gene transfer marker and for selection of transfected cells.
  • Eva1-CAR (having the variable regions VL and VH from the N-terminal side and having the long spacer domain) has the configuration shown in Table 9 below.
  • a retrovirus was loaded onto a retronectin coated plate and spun at 2100 rpm for 120 min. Thereafter, the plate was washed with PBS, and then stimulated CD8+ T cells were seeded and spun at 800 rpm for 2 min. On Day 4, the cells were moved from the retention coated plate to a normal culture dish. Cells were collected on Day 7, a biotinylated EGFR antibody (Erbitax) was added, and then tEGFR-positive cells were purified using MACS anti-biotin beads. The purified cells were continued to be cultured from Day 7 to Day 10. Cells were counted and stored on Day 10. Some of them were stimulated again using CD3/CD28 beads on Day 10, and experiments were conducted on Days 17-20.
  • FIGS. 3C and 3D The gene transfer efficiency on Day 7 performed in this manner is shown in FIGS. 3C and 3D.
  • LH-S CAR using VL-VH with short spacer
  • HL-S CAR using VH-VL with short spacer
  • LH-L CAR using VL-VH CAR with a short spacer
  • HL-L CAR with VH-VL with a long spacer
  • representative plots EGFR on the vertical axis were first stained with biotinylated erbitax, then secondarily stained with streptavidin-PE). stained (indicating cells into which the gene has been introduced).
  • FIG. 3D the results of a similar experiment using cells derived from five healthy donors are shown. As shown in FIGS. 3C and 3D, the longer the spacer, the higher the gene transfer efficiency.
  • IFN-gamma production was not observed in mock T cells into which only EGFR was introduced, but IFN-gamma production was observed in Eva1-CAR-T.
  • IFN-gamma production was not observed against Eva1-negative cell lines, and IFN-gamma production was observed against Eva1-positive cell lines, indicating that the Eva1-CAR-T antigen Specificity was confirmed. Stronger IFN-gamma production was observed with longer spacers than with shorter spacers.
  • FIG. 3F mouse antibody-derived Eva1-CAR-T having spacer regions of six different lengths was produced.
  • the spacer lengths were 0aa, 15aa (SEQ ID NO: 59), 30aa (SEQ ID NO: 60), 60aa (SEQ ID NO: 61), 125aa (SEQ ID NO: 62), and 232aa (SEQ ID NO: 63).
  • 15aa is the same as the short version in the previous experiment
  • 232aa is the same as the long version. This was incorporated into a plasmid to similarly produce a retrovirus, and the gene was introduced into CD8-positive cells in the same manner as above.
  • FIG. 3J shows the amplification efficiency in time series.
  • FIG. 3K the amplification factor on Day 4 is plotted.
  • FIG. 3L shows the amplification efficiency in time series.
  • FIG. 3M the amplification factor on Day 18 is plotted.
  • Example 3 Chimeric antigen receptor using anti-human Eva1 humanized antibody sequence (Preparation of humanized Eva1-CAR-T (hEva1CAR-T) using anti-Eva1 humanized antibody sequence) Next, a total of six types of Eva1CAR-T were created using the humanized antibody sequences described above. Specifically, L2-linker-H (L2H2), H2-linker-L2 (H2L2), L4-linker-H (L4H2), H2-linker-L4 (H2L4), L4-linker-H3 (L4H3), For six types of H3-linker-L4 (H3L4), CARs each having a 232 aa spacer were designed. Then, each of the DNAs encoding these CARs was incorporated into a plasmid, a retrovirus was produced in the same manner as above, and gene introduction was performed.
  • Example 2 (Examination of intracellular domain of L2H2 hEva1-CAR-T) As described above, regarding CAR using humanized antibodies, CAR-T using L2H2 was superior in antigen specificity and cell proliferation. Furthermore, as shown in Example 2, regarding CAR using a mouse-derived antibody, CAR-T with a spacer length of 232 aa was the best in terms of cell proliferation and cytokine production when cultured in the absence of IL-2. On the other hand, when cultured in the presence of IL-2, CAR-T with a 15 aa spacer had the best cell proliferation.
  • CFPAC1 cells human pancreatic cancer cell line
  • H1975 human lung adenocarcinoma cell line
  • 1x10 6 firefly luciferase genes have been introduced into 7-week-old NOG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/ShiJic).
  • tEGFR-transduced cells Two weeks later, 2 ⁇ 10 6 tEGFR-transduced cells (Mock CAR-T cells transfected with only tEGFR, control) or L2H2 hEva1-CAR-T were intravenously administered via the tail vein to transform the CAR.
  • the antitumor activity of -T was evaluated.
  • bioluminescence imaging (BLI) was performed to assess tumor progression using the IVIS Spectrum system. The obtained results are shown in FIGS. 4N to 4Q.
  • weight measurements were performed in parallel.
  • the anticancer effect against bile duct cancer was also evaluated using L2H2 hEva1-CAR-T produced from peripheral blood derived from a different donor than the two used above.
  • HuCCT cells human cholangiocarcinoma cell line
  • HuCCT cells human cholangiocarcinoma cell line
  • the tumor diameter and body weight were measured, and 2 ⁇ 10 6 or 5 ⁇ 10 6 tEGFR-transduced cells (control) or L2H2 hEva1-CAR-T were intravenously administered via the tail vein.
  • the antitumor activity of the CAR-T was evaluated using BLI as an index.
  • the tumor volume was calculated by measuring the major axis and minor axis of the subcutaneous tumor using a caliper and calculating the following formula: "Tumor major axis x short axis x short axis x 1/2". The results obtained are shown in Figures 4R and 4S. Weight measurements were also taken in parallel.
  • L2H2 hEva1-CAR has an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain).
  • L2H2 hEva1-CAR has an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain).
  • L2H2 hEva1-CAR has an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain).
  • T cells expressing such CAR were produced by the same method as above, and on the 10th day in FIG. 3B, the medium was replaced with a cell preservation solution (Cell banker) without restimulation with beads. Stored in liquid nitrogen. After the frozen CAR-T was thawed and cultured overnight, it was restimulated with beads, and one week after the bead stimulation, it was administered to
  • ADC antibody-drug conjugate containing humanized anti-human Eva1 antibody
  • B2E5-H2-L2 humanized B2E5-48 antibody H2-L2
  • B2E5-L2 expression vector TPG986 and B2E5-H2 expression vector TPG987 were created using pcDNA3.4. Each E. The vector was introduced into E.coli JM109, expressed, and purified using NucleoBond Xtra Midi Kit (MACHEREY-NAGEL).
  • B2E5-H2-L2 was transiently expressed in ExpiCHO cells using the vector and ExpiFectamine CHO Transfection System. Then, the obtained culture supernatant was passed through a Protein A column to adsorb antibodies. Neutralization was performed after elution at low pH, followed by purification with Captoadhere, followed by ultrafiltration. The molecular weight, sequence, and ability to bind Eva1 of the obtained antibodies were confirmed.
  • B2E5-H2-L2 was reacted with a linker (SMCC) to introduce an MCC group into the antibody. Then, the linker and DM1 were reacted.
  • SMCC linker
  • DAR drug-antibody ratio
  • Anti-tumor activity of antibody-drug conjugate The anti-tumor activity of the ADC (B2E5-ADC) containing the anti-human Eva1 humanized antibody prepared above was evaluated as follows.
  • a pancreatic cancer cell line (BxPC3) recovered from a culture dish by trypsin treatment was diluted to 5 ⁇ 10 cells/mL, seeded in a 96-well plate with 100 ⁇ L per well, and incubated in a CO 2 incubator (37 °C, CO 2 (concentration: 5%) for 24 hours.
  • the medium (RPMI-1640, Wako187-02705, 10% FBS) was aspirated using an aspirator, and 900 ⁇ L of fresh medium was added to each well.
  • DM1 and B2E5-ADC were diluted with PBS (DM1: 3800 nM to 0.93 nM, B2E5-ADC: 1000 nM to 0.24 nM), and 10 ⁇ L each was added to BxPC3. After culturing in a CO 2 incubator for 48 hours, LDH released from the dead cells was measured using Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST (Dojindo Chemical). The obtained results are shown in FIG. 6B.
  • B2E5-ADC single dose mouse toxicity test B2E5-ADC single dose mouse toxicity test (B2E5-ADC single dose mouse toxicity test) B2E5-ADC (100, 33, 10 ⁇ g) was administered to 9-10 week old C57BL/6 male mice (CLEA Japan) or 10 week old male nude mice (SKN/slc, Japan SLC) by tail vein or lumbar puncture. was administered once (3 animals were prepared for each dose concentration), and body weights were measured over time. The obtained results are shown in FIG.
  • B2E5-ADC exhibited cytotoxic activity against hGIC in a concentration-dependent manner.
  • B2E5-H2-L2 and Kadcyla were not found to have any cytotoxic activity against hGIC.
  • antitumor activity of B2E5-ADC was observed not only against the glioma but also against pancreatic cancer and gastric cancer.
  • the present invention by targeting human Eva1, it is possible to exhibit high antitumor activity. Therefore, the present invention is useful as a drug for treating or preventing cancer.

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Abstract

ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合するヒト化抗体若しくはその機能的断片、当該ヒト化抗体若しくはその機能的断片を含む抗体薬物複合体、又は、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する抗体若しくはその機能的断片を含むキメラ抗原受容体。

Description

Ｅｖａ１タンパク質に結合する、ヒト化抗体又はその機能的断片、抗体薬物複合体及びキメラ抗原受容体
　本発明は、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質（ヒトＥｖａ１）に結合する、ヒト化抗体又はその機能的断片に関する。本発明はまた、当該ヒト化抗体又はその機能的断片を含む、抗体薬物複合体に関する。さらに、本発明は、ヒトＥｖａ１に結合する抗体又はその機能的断片を含む、キメラ抗原受容体に関する。
　がんは、冠状動脈疾患と共に、先進国における主たる死因であり、その割合も年々増加の一途を辿っている。そのため、がんの根絶療法の早急な開発が希求されている。がんの根治療法の開発において、がん幹細胞の存在が近年重要視されている。がん幹細胞は、がんの組織のごく一部にしか存在していないものの、自己複製を繰り返し、さらに分化することによって大多数のがん細胞を創出する元になっていると考えられている。また、このような強い腫瘍形成能を有する一方で、がん幹細胞は、化学療法、放射線療法に対して強い耐性能を有していることが示唆されている。そのため、化学療法、放射線療法によって、がん組織における大部分のがん細胞が死滅し得たとしても、がん幹細胞が残存することにより、がんの再発、転移等が生じることとなる。然るに、がん幹細胞を標的として、それも死滅させることができれば、がんの転移や再発等の防止にも有用な治療法の開発につながることが期待されている。
　かかる状況を鑑み、本発明者らは、グリオーマ及びそのがん幹細胞において高発現しているタンパク質としてＥｖａ１タンパク質を同定することに成功している。さらに、このＥｖａ１タンパク質の発現は、グリオーマの悪性度と相関しており、グリオーマ患者の生存率とその患者由来のグリオーマにおけるＥｖａ１遺伝子の発現との間には強い相関があることを明らかにしている。また、Ｅｖａ１遺伝子の機能の抑制が、グリオーマ細胞の増殖能、腫瘍形成能及び組織浸潤能、並びにグリオーマ幹細胞の腫瘍塊形成能の抑制において有効であることも見出している（特許文献１）。
　また、がんにおいて、このグリオーマは、この数十年間、手術を基本として放射線治療及び化学療法を補助療法とする治療がほとんど変わっておらず、特に中枢神経系組織における悪性グリオーマのうち最も悪性度の高い多形神経膠芽腫（ＧＢＭ、ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）に対して、有効な治療法は未だ見出されていない。さらに、悪性グリオーマに対する標準治療薬としてテモゾロミドが用いられているが、有効血中濃度の数倍のテモゾロミドに対しても、グリオーマ幹細胞は非感受性であることを発明者らは確認している。また、このような化学療法剤に曝露されたがん細胞は、グリオーマに限らず、それに対する耐性が生じ、他の複数の化学療法剤に対しても同様に交差耐性が生じることも多い。さらに、化学療法剤は正常細胞に対しても細胞傷害をもたらすことが多々あり、そのような副作用を低減するため、化学療法剤の用量又は用法は多くの場合制約される。
　かかる現状から、近年、抗がん剤としての抗体の利用が注目され、その重要性が認められつつある。例えば、がん特異的な抗原を標的とした抗体であれば、投与した抗体はがん組織に集積することが推定されるため、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性や補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性による、免疫システムを介したがん細胞への攻撃が期待できる。
　また、抗体に細胞毒性物質や放射性核種等の薬剤を結合しておくこと（所謂、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の態様をとること）により、結合した薬剤を効率よく腫瘍部位に送達することが可能となる。これにより、他組織への薬剤到達量を減少させ、ひいては副作用の軽減を見込むことができる。
　また、がん特異的抗原に細胞死を誘導する活性がある場合は、アゴニスティックな活性を持つ抗体を投与することで、また、がん特異的抗原が細胞の増殖及び生存に関与する場合は、中和活性を持つ抗体を投与することで、腫瘍特異的な抗体の集積と抗体の活性によって、がんの増殖停止または退縮が期待できる。
　さらに、抗体の可変領域を組み込んだキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させたＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）を投与することによって、当該細胞は、標的抗原陽性がん細胞に対してＨＬＡ非依存的に活性化し、細胞死を誘導することも期待されている。
　このような特性から、抗体は抗がん剤としての適用に好適であると考えられており、本発明者らも、上述のＥｖａ１を標的とする抗体医薬の創出を目的として高親和性抗ヒトＥｖａ１マウス抗体を作製し、その有効性を示している（特許文献２）。
国際公開第２０１２／０４３７４７号 国際公開第２０１７／０２２６６８号
　本発明は、がんの治療等に有用な、抗体若しくはその機能的断片、又は当該抗体若しくはその機能的断片を含む複合体を提供することを目的とする。
　本発明者らは、抗ヒトＥｖａ１マウス抗体（特許文献２に記載の、Ｂ２Ｅ５－４８マウス抗体）をヒト化することを試み、ヒト化した重鎖可変領域４種（Ｈ１～Ｈ４）及び軽鎖可変領域４種（Ｌ１～Ｌ４）を組み合わせ、１６種類のヒト化抗体を作製した。その結果、Ｅｖａ１タンパク質に対する結合親和性が高く、また産生能（抗体価）が高い、ヒト化抗体（Ｈ２－Ｌ２、Ｈ２－Ｌ４、Ｈ３－Ｌ４等の組み合わせ）を得ることに成功した。
　また、抗ヒトＥｖａ１抗体の可変領域を組み込んだキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製し、その有効性を評価した。その結果、かかるＣＡＲを発現させたＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）は、ヒトＥｖａ１に応じた活性化（サイトカイン産生）及び細胞増殖を示した。さらに、Ｅｖａ１タンパク質発現腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示すことが明らかになった。
　また、Ｂ２Ｅ５－４８マウス抗体の可変領域を組み込んだＣＡＲにおいて、当該可変領域を含む抗原結合性領域と膜貫通領域との間のスペーサー長を変更して評価した結果、かかるＣＡＲを発現するＴ細胞を、ＩＬ－２非存在下で培養した場合には、前記スペーサー長を２３２アミノ酸とするＣＡＲ－Ｔが、細胞増殖及びサイトカイン産生において最も優れていることが明らかになった。一方、ＩＬ－２存在下で培養した場合には、１５アミノ酸からなるスペーサーを持つＣＡＲ－Ｔの細胞増殖が最も良かった。
　さらにまた、上記ヒト化抗体の可変領域を組み込んだＣＡＲにおいて、ヒトＥｖａ１に応じた活性化及び細胞増殖等の観点から、Ｌ２－Ｈ２の組み合わせが最も有用であることも見出した。さらに、抗原認識部位をＬ２－Ｈ２とするＣＡＲ－Ｔに関し、種々の細胞内ドメインを試し、それらの差による反応性の違いを評価した結果、細胞増殖において４－１ＢＢ、ＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０の細胞内ドメインを持つＣＡＲが優れていることが明らかになった。また、担がんモデルに、前記ＣＡＲ－Ｔ（Ｌ２－Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔ）を投与し、その抗腫瘍活性及び安全性を確認した。
　また、上記ヒト化抗体を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製し、その有効性を評価した。その結果、当該ＡＤＣの、グリオーマ、膵がん、胃がんといった様々な腫瘍に対する抗腫瘍活性が認められた。一方、投与した生体への悪影響（体重の減少、生存期間の短縮等）は認められなかった。
　本発明は、上記検討結果に基づくものであり、より具体的には以下の態様を提供するものである。
　＜１＞　配列番号：１に記載のアミノ酸配列、Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒからなるアミノ酸配列及び配列番号：３に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４～６に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域とを有し、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する、ヒト化抗体又はその機能的断片。
　＜２＞　前記軽鎖可変領域が、配列番号：７～１０に記載のアミノ酸配列、配列番号：７～１０に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：７～１０に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
　前記重鎖可変領域が、配列番号：１３～１６に記載のアミノ酸配列、配列番号：１３～１６に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１３～１６に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、＜１＞に記載のヒト化抗体又はその機能的断片。
　＜３＞　前記軽鎖可変領域が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列、配列番号：７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：７に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
　前記重鎖可変領域が、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、＜１＞に記載のヒト化抗体又はその機能的断片。
　＜４＞　＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片と、薬物とを結合させてなる、抗体薬物複合体。
　＜５＞　＜４＞に記載の抗体薬物複合体を含む、医薬組成物。
　＜６＞　ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル領域とを含む、キメラ抗原受容体。
　＜７＞　前記ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する領域が、＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片を含む領域である、＜６＞に記載のキメラ抗原受容体。
　＜８＞　前記ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する領域が、アミノ末端側から順に、軽鎖可変領域と、リンカーと、重鎖可変領域とが結合してなる、単鎖可変領域断片を含み、
　前記軽鎖可変領域が、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列、Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒからなるアミノ酸配列及び配列番号：３に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含み、かつ
配列番号：７に記載のアミノ酸配列、配列番号：７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：７に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
　前記重鎖可変領域が、
配列番号：４～６に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含み、かつ
配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、
＜６＞に記載のキメラ抗原受容体。
　＜９＞　前記ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する領域と、前記膜貫通領域とが、１０～３００個のアミノ酸からなるスペーサーを介して結合している、＜６＞～＜８＞のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
　＜１０＞　前記細胞内シグナル領域が、ＣＤ７９Ａ細胞内領域及びＣＤ４０細胞内領域を含む、＜６＞～＜９＞のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
　＜１１＞　＜６＞～＜１０＞のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド。
　＜１２＞　＜１１＞に記載のヌクレオチドを含むベクター。
　＜１３＞　＜６＞～＜１０＞のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
　＜１４＞　免疫細胞である、＜１３＞に記載の細胞。
　＜１５＞　＜１３＞又は＜１４＞に記載の細胞を含む、医薬組成物。
　なお、各配列番号に記載の配列は、以下のとおりである。
　なお、表１に示すとおり、配列番号：２は、ＣＤＲ２　ｏｆ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　Ｂ２Ｅ５－４８）のアミノ酸配列（Ｎ末から順に、バリン－スレオニン－セリンからなるアミノ酸配列）を意図したものである（表７も参照のほど）。しかしながら、当該配列は４個未満（３個）のアミノ酸の配列となるため、配列表においては「意図的にスキップされた配列」として取り扱われている。
　本発明によれば、ヒトＥｖａ１を標的とすることにより、がん等を治療又は予防することが可能となる。
正常ヒト血液細胞におけるヒトＥｖａ１の発現を解析した結果を示す、ヒストグラムである。 各種腫瘍細胞におけるヒトＥｖａ１の発現を解析した結果を示す、ヒストグラムである。 肝内胆管がん症例（検体１～３）におけるヒトＥｖａ１の発現を解析した結果を示す、ヒストグラムである。 抗Ｅｖａ１抗体配列を用いたキメラ抗原受容体（Ｅｖａ１－ＣＡＲ）の概要を示す、図である。 Ｅｖａ１－ＣＡＲ発現Ｔ細胞（Ｅｖａ１－ＣＡＲ－Ｔ）の作製スケジュールの概要を示す、図である。 ｔＥＧＦＲの発現を指標とした選抜（ｔＥＧＦＲ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）前のＥｖａ１－ＣＡＲ遺伝子の導入効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。 ｔＥＧＦＲ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ前のＥｖａ１－ＣＡＲ遺伝子の導入効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。図中、ドットは、前記Ｅｖａ１－ＣＡＲ遺伝子を導入した細胞の由来（５人の健常人）を各々示す。太線は平均値を示し、ひげは標準誤差を示す。 Ｅｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの各種腫瘍細胞に対するサイトカイン（ＩＦＮ－γ）産生を解析した結果を示す、グラフである。図中、横軸において、導入したＥｖａ１－ＣＡＲ毎に、左から順にＣＦＰＡＣ－１、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＨｕＣＣＴ－１、ＭＣＦ７、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、ＯＶＴＯＫＯ、Ｔ９８Ｇ、ＰＡ１に対する結果を示す。 Ｅｖａ１－ＣＡＲにおける６種類の長さの異なるスペーサーの概要を示す、図である。なお、図３Ｆに示す「Ｈ００」～「Ｈ２３２」の表記は、図３Ｇ～３Ｍにおけるそれらに対応する。 ｔＥＧＦＲ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ前のＥｖａ１－ＣＡＲ遺伝子の導入効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。図中、ドットは、前記Ｅｖａ１－ＣＡＲ遺伝子を導入した細胞の由来（５人の健常人）を各々示す。太線は平均値を示し、ひげは標準誤差を示す。 ｔＥＧＦＲ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ後のＥｖａ１－ＣＡＲ遺伝子の導入効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。図中、ドットは、前記Ｅｖａ１－ＣＡＲ遺伝子を導入した細胞の由来（５人の健常人）を各々示す。太線は平均値を示し、ひげは標準誤差を示す。 Ｅｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの各種腫瘍細胞に対するサイトカイン産生を解析した結果を示す、グラフである。図中、左側のグラフにおいてＩＦＮ－γ産生を解析した結果を示し、右側のグラフにおいてＩＬ－２産生を解析した結果を示す。導入したＥｖａ１－ＣＡＲ毎に、左から順にＨｕＣＣＴ－１、ＣＦＰＡＣ－１、ＨｅｐＧ２、ＯＶＴＯＫＯに対する結果を示す。 ＩＬ－２非存在下、抗原刺激後のＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの増幅効率を示す、グラフである。図中、横軸に、抗原刺激（Ｅｖａ１陽性であるＨｕＣＣＴ－１との共培養）を開始してからの日数を示す。縦軸に、Ｅｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの細胞数を示す。 ＩＬ－２非存在下、抗原刺激後のＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの増幅効率を示す、グラフである。図中、横軸に、導入したＣＡＲの種類を示す。縦軸に、Ｅｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの細胞数を示す。 ＩＬ－２存在下、抗原刺激後のＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの増幅効率を示す、グラフである。図中、横軸に、抗原刺激（Ｅｖａ１陽性であるＨｕＣＣＴ－１との共培養）を開始してからの日数を示す。縦軸に、Ｅｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの細胞数を示す。 ＩＬ－２存在下、抗原刺激後のＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの増幅効率を示す、グラフである。図中、横軸に、導入したＣＡＲの種類を示す。縦軸に、Ｅｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの細胞数を示す。 ｔＥＧＦＲ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ前の、抗Ｅｖａ１ヒト化抗体配列を用いたＥｖａ１－ＣＡＲ（ｈＥｖａ１－ＣＡＲ）遺伝子の導入効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。図中、ドットは、前記ｈＥｖａ１－ＣＡＲ遺伝子を導入した細胞の由来（４人の健常人）を各々示す。ひげは標準誤差を示し、ひげに挟まれた真ん中の線は平均値を示す。 ｔＥＧＦＲ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ後の、ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの増幅効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。図中、ドットは、前記ｈＥｖａ１－ＣＡＲ遺伝子を導入した細胞の由来（４人の健常人）を各々示す。ひげは標準誤差を示し、ひげに挟まれた真ん中の線は平均値を示す。 ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの各種腫瘍細胞に対するＩＦＮ－γ産生を解析した結果を示す、グラフである。導入したＥｖａ１－ＣＡＲ毎に、左から順にＨｕＣＣＴ－１、ＣＦＰＡＣ－１、ＨｅｐＧ２、ＯＶＴＯＫＯに対する結果を示す。 ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの各種腫瘍細胞に対するＩＬ－２産生を解析した結果を示す、グラフである。導入したＥｖａ１－ＣＡＲ毎に、左から順にＨｕＣＣＴ－１、ＣＦＰＡＣ－１、ＨｅｐＧ２、ＯＶＴＯＫＯに対する結果を示す。 抗原刺激後のｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの増幅効率を示す、グラフである。図中、左側にＩＬ－２非存在下における結果を示し、右側にＩＬ－２存在下における結果を示す。各グラフにおいて、横軸に、抗原刺激（Ｅｖａ１陽性であるＨｕＣＣＴ－１との共培養）を開始してからの日数を示す。縦軸に、ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの細胞数を示す。 細胞内ドメイン及びスペーサー長の異なる６種類の、ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔ（抗原認識部位：Ｌ２Ｈ２）の概要を示す、図である。 ｔＥＧＦＲ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ前の、ｈＥｖａ１－ＣＡＲ遺伝子の導入効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。図中、ドットは、前記ｈＥｖａ１－ＣＡＲ遺伝子を導入した細胞の由来（５人の健常人）を各々示す。真ん中の線は平均値を示す。横軸における「２８」、「４１」及び「７９」は、各ＣＡＲが有する細胞内ドメインが各々「ＣＤ２８ＩＣ」、「４－１ＢＢＩＣ」及び「ＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０ＩＣ」であることを示す。また、「－Ｓ」及び「－Ｌ」は各々、スペーサーが、図４Ｆに示す「Ｈ１５」及び「Ｈ２３２」であることを示す。 ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの各種腫瘍細胞に対するＩＦＮ－γ産生を解析した結果を示す、グラフである。導入したＥｖａ１－ＣＡＲ毎に、左から順にＯＶＴＯＫＯ、ＣＦＰＡＣ－１、ＨｅｐＧ２、ＨｕＣＣＴ、ＭＣＦ７に対する結果を示す。横軸における「２８」、「４１」及び「７９」は、各ＣＡＲが有する細胞内ドメインが各々「ＣＤ２８ＩＣ」、「４－１ＢＢＩＣ」及び「ＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０ＩＣ」であることを示す。また、「－Ｓ」及び「－Ｌ」は各々、スペーサーが、図４Ｆに示す「Ｈ１５」及び「Ｈ２３２」であることを示す。 ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの各種腫瘍細胞に対するＩＬ－２産生を解析した結果を示す、グラフである。導入したＥｖａ１－ＣＡＲ毎に、左から順にＯＶＴＯＫＯ、ＣＦＰＡＣ－１、ＨｅｐＧ２、ＨｕＣＣＴ、ＭＣＦ７に対する結果を示す。横軸における「２８」、「４１」及び「７９」は、各ＣＡＲが有する細胞内ドメインが各々「ＣＤ２８ＩＣ」、「４－１ＢＢＩＣ」及び「ＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０ＩＣ」であることを示す。また、「－Ｓ」及び「－Ｌ」は各々、スペーサーが、図４Ｆに示す「Ｈ１５」及び「Ｈ２３２」であることを示す。 抗原刺激後のｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの増幅効率を示す、グラフである。図中、左側のグラフに、ＩＬ－２非存在下における結果を示し、右側のグラフに、ＩＬ－２存在下における結果を示す。各グラフにおいて、横軸に、抗原刺激（Ｅｖａ１陽性であるＨｕＣＣＴ－１との共培養）を開始してからの日数を示す。縦軸に、ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの細胞数を示す。また、凡例における「２８」、「４１」及び「７９」は、各ＣＡＲが有する細胞内ドメインが各々「ＣＤ２８ＩＣ」、「４－１ＢＢＩＣ」及び「ＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０ＩＣ」であることを示す。また、「－Ｓ」及び「－Ｌ」は各々、スペーサーが、図４Ｆに示す「Ｈ１５」及び「Ｈ２３２」であることを示す。 ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－ＴとＥｖａ１陽性骨髄腫細胞（ＲＰＭＩ－８２２６）との共培養試験の結果を示す、グラフである。図中、左側のグラフにおいて、ドナー２の末梢血から作製したｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの結果を示し、右側のグラフにおいて、ドナー３の末梢血から作製したｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの結果を示す。各グラフの縦軸において、全細胞に占める腫瘍細胞の割合を示す。横軸において、共培養を開始してからの時間を示す。また、凡例における「２８」、「４１」及び「７９」は、各ＣＡＲが有する細胞内ドメインが各々「ＣＤ２８ＩＣ」、「４－１ＢＢＩＣ」及び「ＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０ＩＣ」であることを示す。また、「ｓ」及び「Ｌ」は各々、スペーサーが、図４Ｆに示す「Ｈ１５」及び「Ｈ２３２」であることを示す。 ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔと５１Ｃｒで標識した各種腫瘍細胞株とを共培養し、細胞傷害活性を解析した結果を示すグラフである。図中、縦軸において、培養上清中５１Ｃｒ放出量に基づく傷害された細胞の割合を示す。横軸において、各種腫瘍細胞株を、Ｅｖａ１の発現が陰性であるか、陽性であるかとを併せて示す。また、凡例における「４１」及び「７９」は、各ＣＡＲが有する細胞内ドメインが各々「４－１ＢＢＩＣ」及び「ＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０ＩＣ」であることを示す。また、「Ｓ」及び「Ｌ」は各々、スペーサーが、図４Ｆに示す「Ｈ１５」及び「Ｈ２３２」であることを示す。 図４Ｌに示した結果に基づき、各種腫瘍細胞株におけるヒトＥｖａ１の発現量と、各種腫瘍細胞株に対するｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの細胞傷害活性との相関性を、解析した結果を示す、グラフである。図中、縦軸において、培養上清中５１Ｃｒ放出量に基づく傷害された細胞の割合を示す。横軸において、各種腫瘍細胞株における抗ヒトＥｖａ１抗体を用いたフローサイトメトリー解析によって得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示しており、これはＥｖａ１発現量と相関する。また、凡例における「４１」及び「７９」は、各ＣＡＲが有する細胞内ドメインが各々「４－１ＢＢＩＣ」及び「ＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０ＩＣ」であることを示す。また、「Ｓ」及び「Ｌ」は各々、スペーサーが、図４Ｆに示す「Ｈ１５」及び「Ｈ２３２」であることを示す。 異なる２人のドナー（ドナーＡ、ドナーＢ）に由来する末梢血から作製したＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が導入してあるヒト肺腺癌細胞株（Ｈ１９７５）を担持するマウスに導入し、当該ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍活性を、生物発光イメージングにより分析した結果を示す、図である。Ｌ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲとして、抗原認識部位（Ｌ２Ｈ２）と、膜貫通・細胞内ドメイン（４－１ＢＢ又はＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０を含むドメイン）とを、短いスペーサー（図中「ｓｈｏｒｔ　ｈｉｎｇｅ」にて表記、図４Ｆに示す「Ｈ１５」）で繋いだものを用いた。コントロールとして、ｔＥＧＦＲ導入細胞（ｔＥＧＦＲだけを遺伝子導入したＭｏｃｋ　ＣＡＲ－Ｔ細胞）の投与例も作製して分析した。また、図中の「Ｄａｙ」は、ＣＡＲ－Ｔを投与してからの日数を示す。なお、４－１ＢＢを膜貫通・細胞内ドメインに含むＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの投与例の「Ｄａｙ　１４」において、２匹少なくなっているが、実験手技の問題によって死亡したことによる。また、発光スペクトルは、図４Ｐ及び４Ｒにおいても適用される。 異なる２人のドナー（ドナーＡ、ドナーＢ）に由来する末梢血から作製したＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が導入してあるヒト膵がん細胞株（ＣＦＰＡＣ１）を担持するマウスに導入し、当該ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍活性を、生物発光イメージングにより分析した結果を示す、図である。Ｌ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲとして、抗原認識部位（Ｌ２Ｈ２）と、膜貫通・細胞内ドメイン（４－１ＢＢ又はＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０を含むドメイン）とを、ｓｈｏｒｔ　ｈｉｎｇｅで繋いだものを用いた。コントロールとして、ｔＥＧＦＲ導入細胞の投与例も作製して分析した。また、図中の「Ｄａｙ」は、ＣＡＲ－Ｔを投与してからの日数を示す。発光スペクトルは、図４Ｐ及び４Ｒにおいても適用される。 異なる２人のドナー（ドナーＡ、ドナーＢ）に由来する末梢血から作製したＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が導入してあるヒト膵がん細胞株（ＣＦＰＡＣ１）又はヒト肺腺癌細胞株（Ｈ１９７５）を担持するマウスに導入し、当該ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍活性を、生物発光イメージングにより分析した結果を示す、図である。Ｌ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲとして、抗原認識部位（Ｌ２Ｈ２）と、膜貫通・細胞内ドメイン（４－１ＢＢ又はＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０を含むドメイン）とを、ｓｈｏｒｔ　ｈｉｎｇｅで繋いだものを用いた。コントロールとして、ｔＥＧＦＲ導入細胞の投与例も作製して分析した。また、図中の「Ｄａｙ」は、ＣＡＲ－Ｔを投与してからの日数を示す。発光スペクトルは、図４Ｐ及び４Ｒにおいても適用される。 異なる２人のドナー（ドナーＡ、ドナーＢ）に由来する末梢血から作製したＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が導入してあるヒト膵がん細胞株（ＣＦＰＡＣ１）又はヒト肺腺癌細胞株（Ｈ１９７５）を担持するマウスに導入し、当該ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍活性を、生物発光イメージングにより経時的に分析した結果（発光強度）を示す、グラフである。Ｌ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲとして、抗原認識部位（Ｌ２Ｈ２）と、膜貫通・細胞内ドメイン（４－１ＢＢ又はＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０を含むドメイン）とを、ｓｈｏｒｔ　ｈｉｎｇｅで繋いだものを用いた。コントロールとして、ｔＥＧＦＲ導入細胞の投与例も作製して分析した。 ドナーＣに由来する末梢血から作製したＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が導入してあるヒト胆管がん細胞株（ＨｕＣＣＴ細胞）を担持するマウスに導入し、当該ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍活性を、生物発光イメージングにより分析した結果を示す、図である。Ｌ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲとして、抗原認識部位（Ｌ２Ｈ２）と、膜貫通・細胞内ドメイン（４－１ＢＢ又はＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０を含むドメイン）とを、ｓｈｏｒｔ　ｈｉｎｇｅで繋いだものを用いた。コントロールとして、ｔＥＧＦＲ導入細胞の投与例も作製して分析した。また、図中の「Ｄａｙ」は、ＣＡＲ－Ｔを投与してからの日数を示す。 ドナーＣに由来する末梢血から作製したＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が導入してあるヒト胆管がん細胞株（ＨｕＣＣＴ細胞）を担持するマウスに導入して分析した結果を示す、図である。Ｌ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲとして、抗原認識部位（Ｌ２Ｈ２）と、膜貫通・細胞内ドメイン（４－１ＢＢ又はＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０を含むドメイン）とを、ｓｈｏｒｔ　ｈｉｎｇｅで繋いだものを用いた。コントロールとして、ｔＥＧＦＲ導入細胞の投与例も作製して分析した。また、図中、左側のグラフは、前記ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍活性を、生物発光イメージングにより経時的に分析した結果（発光強度）を示す。右側のグラフは、前記ＣＡＲ－Ｔを投与した担がんマウスにおける腫瘍体積を経時的に分析した結果を示す。 抗ヒトＥｖａ１ヒト化抗体を含む、抗体薬物複合体（Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣ）の製造工程の概要を示す、図である。 Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣのグリオーマ（ｈＧＩＣ　Ｅ６，ｈＧＩＣ　Ｅ１６）に対する細胞傷害実験の結果を示す、グラフである。図中、各グラフの縦軸は腫瘍細胞の生存率を示し、横軸はＡＤＣ又は抗体の培地への添加濃度を示す。 Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣの膵がん（ＢｘＰＣ３）に対する細胞傷害実験の結果を示す、グラフである。図中、各グラフの縦軸は腫瘍細胞における傷害の程度を反映する吸光度を示す。横軸はＡＤＣ又は薬剤（ＤＭ１）の培地への添加濃度を示す。 Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣの胃がん（ＭＫＮ７４）に対する細胞傷害実験の結果を示す、グラフである。図中、各グラフの縦軸は腫瘍細胞の生存率を示す。横軸はＡＤＣ又は抗体の培地への添加濃度を示す。 Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣのマウスに対する毒性試験の結果を示すグラフである。より具体的には、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）又はヌードマウス（ＳＫＮ／ｓｌｃ）に、尾静脈（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）又は腰椎穿刺（ｉｎｔｒａｈｅｃａｌ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって、Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣ（１００、３３、１０μｇ）を単回投与し、これらマウスにおける体重の経時的変化を示すグラフである。図中、丸、三角、四角は、各々マウス１個体のデータを表す。
　＜抗Ｅｖａ１抗体＞
　本発明は、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質（ヒトＥｖａ１）に結合する、抗体又はその機能的断片に関する。
　本発明において、「Ｅｖａ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｖ－ｌｉｋｅ　ａｎｔｉｇｅｎ）１」は、一回膜貫通型の細胞膜タンパク質であり、ＭＰＺＬ２（Ｍｙｅｌｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｚｅｒｏ－ｌｉｋｅ　２）とも称される細胞骨格系に関わる分子である。ヒト由来のものであれば典型的には配列番号：５４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号：５３に記載のヌクレオチド配列がコードするタンパク質）である。しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し、それにコードされるタンパク質のアミノ酸配列もそれに伴い改変される。したがって、本発明に係る「Ｅｖａ１タンパク質」は、前記典型的なアミノ酸配列からなるタンパク質に特定されることなく、このような天然の変異体も含まれる。
　本発明における「抗体」は、免疫グロブリンの全てのクラス及びサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれる。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、及び／又は回収された（即ち、単離された）抗体である。
　本発明の抗体のヒトＥｖａ１に対する反応性は、ＫＤ（解離定数）値として１０－６以下であることが好ましく、６×１０－７以下であることがより好ましい。「反応性」とは、抗原であるヒトＥｖａ１に対する結合親和性及び／又は特異性を意味する。かかる反応性は、当業者であれば、免疫学的手法により評価することができ、例えば、後述の実施例において示すように、表面プラズモン共鳴法による解析によってＫＤ値として求めることができる。また、本発明の抗体は、ヒトＥｖａ１タンパク質以外に、他の動物由来のＥｖａ１タンパク質（例えば、マウスＥｖａ１タンパク質（典型的には配列番号：５６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：５５に記載のヌクレオチド配列がコードするタンパク質））に結合する抗体であってもよい。
　本発明の抗体は、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性から選択される少なくとも１つの細胞傷害活性を有していてもよく、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性の双方を有していてもよい。
　本発明において「ＡＤＣＣ活性（抗体依存性細胞傷害活性）」とは、標的細胞の細胞表面抗原に抗体が結合した際、その抗体のＦｃ領域にエフェクター細胞（ＮＫ細胞、単球等の免疫細胞）がさらに結合することにより、当該細胞が活性化され、それに伴い、因子を放出して標的細胞を殺傷する活性を意味する。他方、「ＣＤＣ活性（補体依存性細胞傷害活性）」とは、抗体が標的細胞に結合すると補体系が活性化し、その結果、標的細胞を溶解する活性を意味する。
　また、本発明の抗体は、好ましくは、０．０１μｇ／ｍＬにてヒトＥｖａ１を発現する標的細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する抗体である。本発明の抗体がこのようなＡＤＣＣ活性を有しているか否かは、例えば、特許文献２の実施例に記載の方法にて測定することができ、より具体的には、ヒトＥｖａ１を発現させたＤａｕｄｉ細胞を標的細胞とし、その細胞溶解率にてＡＤＣＣ活性を評価した場合において、０．０１μｇ／ｍＬの本発明の抗体を用いた場合のＡＤＣＣ活性は、好ましくは、細胞溶解率が３０％以上であり、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上である。
　また、本発明の抗体は、好ましくは０．３０μｇ／ｍＬにて、より好ましくは０．０１μｇ／ｍＬにて、ヒトＥｖａ１を発現する標的細胞に対してＣＤＣ活性を有する抗体である。本発明の抗体がこのようなＣＤＣ活性を有しているか否かは、例えば、特許文献２の実施例に記載の方法にて測定することができ、より具体的には、ヒトＥｖａ１を発現させたＤａｕｄｉ細胞を標的細胞とし、その細胞溶解率にてＣＤＣ活性を評価した場合において、０．３０μｇ／ｍＬの本発明の抗Ｅｖａ１抗体を用いた場合のＣＤＣ活性は、好ましくは、細胞溶解率が２０％以上であり、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは６０以上、より好ましくは８０％以上である。
　本発明の抗体はまた、抗腫瘍活性を有していてもよい。本発明において「抗腫瘍活性」とは、がん細胞の増殖を抑制する活性、がん細胞の死を誘導する活性及びがん細胞の転移を抑制する活性のうちの少なくともいずれか一つの活性を意味する。抗腫瘍活性は、例えば、特許文献２の実施例に記載のような担がんモデル（Ｂ１６メラノーマ細胞を接種したマウス等）を用いた分析により評価することができる。より具体的には、Ｂ１６メラノーマ細胞をマウスに静脈内投与等した後、その翌日又は数週間後から、毎日又は数日おきに、抗Ｅｖａ１抗体を静脈内投与等する。そして、肺に形成されたＢ１６メラノーマ細胞のコロニー数を計測することにより、インビボでの抗がん活性を評価することができる。陰性対照として、同一のアイソタイプを有するコントロール抗体を投与してもよく、またＰＢＳ等を投与してもよい。そして、抗Ｅｖａ１抗体投与群におけるコロニー形成数が陰性対照投与群におけるそれよりも少ない場合（陰性対照投与群におけるコロニー形成数を１００％とした際に、好ましくは６０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下）に、当該抗Ｅｖａ１抗体は抗腫瘍活性を有すると判定し得る。
　本発明の抗体は、ヒトＥｖａ１に対する反応性を有していればよく、その由来、種類、形状等は特に限定されない。具体的には、非ヒト動物由来の抗体（例えば、マウス抗体、ウサギ抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体が含まれる。
　本発明において「非ヒト動物由来の抗体」としては、例えば、特許文献２に開示されている、以下のような可変領域を保持するヒトＥｖａ１に対する抗体を挙げることができる。
（ａ）配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
（ｂ）配列番号：３９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
（ｃ）配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：４４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
　さらに、本発明は、例えば、以下のようなＣＤＲを保持するヒトＥｖａ１に対する抗体に関する。
（ａ）配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖ＣＤＲ１～３と、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖ＣＤＲ１～３とを保持する抗体。
（ｂ）配列番号：３９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖ＣＤＲ１～３と、配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖ＣＤＲ１～３とを保持する抗体。
（ｃ）配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖ＣＤＲ１～３と、配列番号：４４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖ＣＤＲ１～３とを保持する抗体。
　なお、かかる抗体に関し、可変領域のアミノ酸配列に基づきＣＤＲを決定する方法としては特に制限はないが、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、Ａｈｏ等の公知のナンバリングスキームが挙げられ、より具体的に、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング法によって決定された例として、以下のようなＣＤＲを保持するヒトＥｖａ１に対する抗体を挙げることができる。
（ａ－１）配列番号：２８～３０に記載のアミノ酸配列を各々重鎖ＣＤＲ１～３として保持し、かつ、配列番号：２２～２４に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖ＣＤＲ１～３として保持する抗体。
（ｂ）配列番号：４０～４２に記載のアミノ酸配列を各々重鎖ＣＤＲ１～３として保持し、かつ、配列番号：３４～３６に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖ＣＤＲ１～３として保持する、抗体。
（ｃ）配列番号：５０～５２に記載のアミノ酸配列を各々重鎖ＣＤＲ１～３として保持し、かつ、配列番号：４５～４７に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖ＣＤＲ１～３として保持する、抗体。
　また、ＩＭＧＴナンバリング法によって決定された例として、以下のようなＣＤＲを保持するヒトＥｖａ１に対する抗体を挙げることができる。
（ａ－２）配列番号：４～６に記載のアミノ酸配列を各々重鎖ＣＤＲ１～３として保持し、かつ、配列番号：１に記載のアミノ酸配列、Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒからなるアミノ酸配列及び配列番号：３に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖ＣＤＲ１～３として保持する抗体。
　また、本発明においては、このような特定のアミノ酸配列からなる可変領域及び／又はＣＤＲを保持する抗体のみならず、望ましい活性（抗原に対する反応性等）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。このようなアミノ酸配列変異体は、例えば、上述の可変領域等をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレーム領域（ＦＲ）及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との反応性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６－８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５－４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０－２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５－３５１（２００８）、ＭＡｂｓ．Ｍａｒ－Ａｐｒ；６（２）：４３７－４５（２０１４））。また、現在では、統合計算化学システム等（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ、カナダＣＣＧ社製）を利用することにより、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をモデリングすることもできる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｓｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｋａｇａｋｕ／ｃｓ／ｃｃｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ　参照）。さらに、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ　Ｄｅｓ　Ｓｅｌ．２０１０　Ａｕｇ；２３（８）：６４３－５１に記載の通り、抗原へのアフィニティーにおいて、重鎖可変領域のＣＤＲ１及び軽鎖可変領域のＣＤＲ３は関与していない例が知られている。また同様に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　４４：１０７５－１０８４（２００７）には、大抵の抗体においては、軽鎖可変領域のＣＤＲ２は抗原へのアフィニティーに関与していないということが報告されている。このように、抗体の抗原へのアフィニティーにおいては、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域各々のＣＤＲ１～３の全てを要せずとも、同等の活性を発揮し得る。実際に、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．２００３　Ｊｕｌ　１８；３０７（１）：１９８－２０５、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００４　Ｊｕｌ　９；３４０（３）：５２５－４２、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００３　Ａｕｇ　２９；３３１（５）：１１０９－２０においては、元の抗体の少なくとも１のＣＤＲを保持することによって、抗原へのアフィニティーが維持された例が報告されている。
　また、本発明の抗体に関し、可変領域において改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、さらに好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。さらに、かかる改変は全て、抗原との反応性への影響が少ないという観点から、ＣＤＲ以外、すなわちＦＲに施されていることが好ましい。また、ＣＤＲにおいて改変されるアミノ酸数は、好ましくは５アミノ酸以内、より好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
　アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。
　また、改変後のアミノ酸配列が、上述の特定のアミノ酸配列からなる可変領域とアミノ酸配列レベルで８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む可変領域を保持する抗体も、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、本発明の抗体に含まれる。かかる相同性としては、少なくとも８０％であればよいが、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。また、配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＰによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　また、「同等の活性を有する」とは、例えば、抗原への反応性が、対象抗体（例えば、特許文献２に記載の、Ｂ２Ｅ５－４８マウス抗体）と同等（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）であることを意味する。
　また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる等の抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のＡＤＣＣ活性を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ－結合又はＯ－結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失等の公知の方法で行うことができる（特開２００８－１１３６６３号公報、米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号、米国特許第５２７８２９９号、国際公開第９９／５４３４２号）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
　本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８－２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。
　キメラ抗体の定常領域には、通常、ヒト由来の抗体のものが使用される。例えば重鎖においては、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、及びＣεを定常領域として利用することができる。また軽鎖においてはＣκやＣλを定常領域として使用できる。これらの定常領域のアミノ酸配列、並びにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体自体の安定性、又は抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト由来の抗体定常領域中の１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加及び／又は挿入をすることができる。
　本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来の抗体のＣＤＲの遺伝子配列をヒト由来の抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、オーバーラップエクステンションＰＣＲ等、公知である（例えば、欧州特許出願公開第２３９４００号明細書、欧州特許出願公開第１２５０２３号明細書、国際公開第９０／０７８６１号、国際公開第９６／０２５７６号）。抗体の可変領域は、通常、４つのＦＲにはさまれた３つのＣＤＲで構成されている。ＣＤＲは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。ＣＤＲのアミノ酸配列は多様性に富む一方、ＦＲを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、ＣＤＲの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。また、ＣＤＲの機能の維持の観点から、非ヒト由来ＣＤＲのヒトＦＲへの移植においては、その非ヒト動物由来のＦＲと相同性の高いヒトＦＲが選択される。すなわち、ＣＤＲ内のアミノ酸は、抗原を認識するばかりでなく、ＣＤＲの近傍にあるＦＲのアミノ酸と配位し、ＣＤＲのループ構造の維持にも関与しているため、移植すべきＣＤＲに隣接しているＦＲのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトＦＲを利用することが好ましい。
　非ヒト動物由来のＦＲと相同性の高い公知のヒトＦＲの検索を、例えば、インターネットで利用可能な抗体に特化した検索システム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）を利用して行うことができる。このようにして得られたヒトＦＲの配列と一致するように、非ヒト由来の抗体のＣＤＲ以外の配列に変異を導入することができる。あるいは、検索によって得られたヒトＦＲのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）が入手可能な場合は、その配列中に非ヒト由来ＣＤＲを導入してもよい。変異の導入等は核酸合成、部位特異的変異誘発などの当該分野で公知の技術を用いて行うことができる。
　このようにして作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、ＣＤＲを介して連結されたときに該ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト由来の抗体のＦＲが好適に選択できる。また必要に応じ、Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１－８５６等に記載の方法に沿って、ヒト化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するようにＦＲのアミノ酸残基を置換することもでき、さらに当該アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を測定して評価することによって、所望の性質を有する変異ＦＲ配列を選択することができる。
　本発明において、「ヒト化抗体」としては、例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列、Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒからなるアミノ酸配列及び配列番号：３に記載のアミノ酸配列を各々含むＣＤＲを含む軽鎖可変領域と、配列番号：４～６に記載のアミノ酸配列を各々含むＣＤＲ１～３を含む重鎖可変領域とを有し、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する、ヒト化抗体が挙げられる。
　より具体的には、後述の実施例に示すように、
　軽鎖可変領域が、配列番号：７～１０に記載のアミノ酸配列、配列番号：７～１０に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：７～１０に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
　重鎖可変領域が、配列番号：１３～１６に記載のアミノ酸配列、配列番号：１３～１６に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１３～１６に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体が挙げられる。
　なお、可変領域の改変及び相同性等については、「非ヒト動物由来の抗体」において説明したとおりであるが、本発明のヒト化抗体において、ＣＤＲの配列は改変されずに、軽鎖可変領域ＣＤＲ１～３並びに重鎖可変領域ＣＤＲ１～３の配列は各々、配列番号：１に記載のアミノ酸配列、Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒからなるアミノ酸配列及び配列番号：３に記載のアミノ酸配列並びに配列番号：４～６に記載のアミノ酸配列に特定されていることが好ましい。
　また、かかるヒト化抗体において、後述の実施例に示すとおり、抗原への反応性がより高いという観点から、
（Ｈ２－Ｌ２）　軽鎖可変領域が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列、配列番号：７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：７に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
　重鎖可変領域が、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体、
（Ｈ１－Ｌ４）　軽鎖可変領域が、配列番号：８に記載のアミノ酸配列、配列番号：８に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：８に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
　重鎖可変領域が、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体、
（Ｈ２－Ｌ３）　軽鎖可変領域が、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
　重鎖可変領域が、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体、
（Ｈ２－Ｌ４）　軽鎖可変領域が、配列番号：８に記載のアミノ酸配列、配列番号：８に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：８に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
　重鎖可変領域が、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体が、好適な例として挙げられる。
　また、産生能の高さも考慮するに、
（Ｈ２－Ｌ２）　軽鎖可変領域が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列、配列番号：７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：７に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
　重鎖可変領域が、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体、
（Ｈ２－Ｌ４）　軽鎖可変領域が、配列番号：８に記載のアミノ酸配列、配列番号：８に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：８に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
　重鎖可変領域が、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体、
（Ｈ３－Ｌ４）　軽鎖可変領域が、配列番号：８に記載のアミノ酸配列、配列番号：８に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：８に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
　重鎖可変領域が、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体が、好適な例として挙げられる。
　さらに、本発明の抗体としては、上述の特定のアミノ酸配列又はその改変体を含む、可変領域又はＣＤＲを保持する抗体に対し、ヒトＥｖａ１への結合において競合する抗体の態様もとり得る。言い換えれば、上述の特定のアミノ酸配列又はその改変体を含む、可変領域又はＣＤＲを保持する抗体が反応性を示すエピトープに結合する抗体の態様もとり得る。
　本発明において「エピトープ」とは、抗原中に存在する抗原決定基、すなわち抗体中の抗原結合ドメインが結合する抗原上の部位を意味する。したがって、本発明におけるエピトープは、アミノ酸の一次配列中において連続する複数のアミノ酸からなるポリペプチド（線状エピトープ）であってもよく、アミノ酸の一次配列中において隣接していないアミノ酸が、ペプチド又はタンパク質の折り畳み等の三次元構造によって近傍にくることにより形成されるポリペプチド（不連続エピトープ、構造的エピトープ）であってもよい。また、かかるエピトープとしては、典型的には、少なくとも３つ（例えば４つ）、最も普通には少なくとも５つ（例えば、６～２０個、７～１５個、８～１０個）のアミノ酸からなる。
　また、抗体が得られた場合、当業者であれば、その抗体が反応性を示す抗原上のペプチド領域（エピトープ）を特定して、そのペプチド領域に結合する種々の抗体を作製し得る。さらに、二つの抗体が同一又は立体的に重なり合ったエピトープと結合するかどうかは、競合アッセイ法により決定することができる。
　本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、ヒトＥｖａ１に反応性を示すものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、単鎖可変領域断片（一本鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。
　ここで「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖及び重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Ｆａｂ’」は、抗体のヒンジ領域の１つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。
　「可変領域断片（Ｆｖ）」は、完全な抗原認識及び結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「単鎖可変領域断片（一本鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ）」は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ダイアボディー」とは、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。「多特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例えば、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現により調製することができる。
　本発明の抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができ、また組換えＤＮＡ法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（ヒトＥｖａ１、その部分ペプチド、それらにＦｃタンパク質等が融合してあるタンパク質、またはこれらを発現する細胞等）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等である。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ヒトＥｖａ１に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ヒトＥｖａ１に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
　組換えＤＮＡ法は、上記本発明の抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば、ＨＥＫ細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７　ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　ａｎｄ　Ｃ．Ｄｅａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００　ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ　Ａ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７－７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（国際公開第９４／１１５２３号公報　参照）。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
　本発明は、上記本発明の抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ＤＮＡを保持する宿主細胞、及び該宿主細胞を培養し、抗体を回収することを含む抗体の生産方法をも提供することができる。
　＜抗体薬物複合体＞
　後述の実施例に示すとおり、本発明の抗体の標的であるヒトＥｖａ１は、様々ながんにおいて発現している。また、本発明の抗体（特にヒト化抗体）は、ＡＤＣとしても有用である。よって、本発明は、本発明の抗体（特にヒト化抗体）又はその機能的断片と、薬物とを結合させてなる、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の態様もとり得る。
　本発明のＡＤＣにおいて、抗体と結合させることができる「薬物」は、特に制限されるものではないが、例えば、当技術分野で公知の細胞傷害性物質が挙げられる。「細胞傷害性物質」としては、抗がん剤、例えば、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、イリノテカンの代謝産物ＳＮ－３８（１０－ヒドロキシ－７－エチルカンプトテシン）、アドリアマイシン、タキソール、５－フルオロウラシル、ニムスチン、ラミニスチン、テモゾロミド等のアルキル化剤、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド等の代謝拮抗剤、エトポシド、ビンクリスチン等の植物アルカロイド、マイトマイシン、ブレオマイシン等の抗がん性抗生物質、シスプラチン等の白金製剤、ソラフェニブ、エルロチニブ等の分子標的剤、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、６－チオグアニン、６－メルカプトプリン、シクロフォスファミド、イフォスファミド、ブスルファン、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）、ＤＭ１（メルタンシン）、カリキアマイシンが挙げられる。細胞傷害性物質としては、放射性同位体、例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１０Ｂ、１１１Ｉｎ、９０Ｙも挙げられる。細胞傷害性物質としては、細胞傷害活性を機能させる光感受性物質、より具体的には、光照射により活性化されることにより、それ自体が細胞傷害性（細胞毒性）を示す形態に変化する物質であってもよく、また細胞傷害性物質（細胞毒性物質）を生じさせる物質であってもよい。例えば、クロリン（ｃｈｌｏｒｉｎｓ）、クロリンｅ６、ポルフィマーナトリウム、タラポルフィンナトリウム、ベルテポルフィン、及びこれらの前駆体及び誘導体が挙げられる。また、細胞傷害性物質としては、毒性ペプチド、例えば、サポリン、リシン、志賀毒等のリボソーム不活化タンパク質（ＲＩＰ）が挙げられる。
　また、抗体と細胞傷害性物質との結合も、当該技術分野で公知の方法により行うことができ、直接的結合及び間接的結合のいずれでもよい。例えば、直接的な結合として、共有結合を利用することができる。間接的な結合としては、リンカーを介した結合を利用することができる。
　本発明においては、抗体と細胞傷害性物質とがリンカーを介して結合していることが好ましい。リンカーを介して２つの分子が結合することにより、細胞傷害性物質の抗原性を減弱することができ、対象への投与に好ましい。リンカーについての一般的な技術は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９９６；Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．　ａｎｄ　Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．編，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡＣＳ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ，１９９７；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．　ａｎｄ　Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．編，Ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗ　５４（４），２００２に記載されている。
　また、リンカーは、直鎖状のリンカー（２価のリンカー）のみならず、分枝状のリンカー（３価以上のリンカー）も含まれる。直鎖状リンカーは、その一端に細胞傷害性物質を有し、別の一端に抗体を有する。分枝状リンカーは、通常、その各分枝（各鎖）に細胞傷害性物質を有し、別の一端に抗体を有する。かかるリンカーとしては、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）（ＬＣ－ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、４－マレイミドブチル酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、３－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）－スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル－６－（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）－ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ－（ｐ－マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）及びアラニン－フェニルアラニン（ａｌａ－ｐｈｅ）等のペプチドリンカーが挙げられる。
　リンカーを介して抗体と細胞傷害性物質とを結合する技術は、当技術分野において公知である。例えば、抗体とリンカーとの結合は、共有結合又は非共有結合（イオン結合、疎水性結合等）であり、好ましくは共有結合である。この結合は、本発明の複合体を対象に投与した場合に、血液中では細胞傷害性物質が遊離しにくい結合であることが好ましい。そのような結合としては、マレイミド基とチオール基との結合、ハロエステルとチオールとを反応させて得られる結合、カルボキシル基とアミノ基とのアミド結合、チオール基とチオール基とのジスルフィド結合、アミノ基とアルデヒド基によるシッフ塩基、チオール基とカルボン酸とのチオエステル結合、水酸基とカルボキシル基とのエステル結合、アミノ基とスクアリン酸誘導体（例えばジメチルスクアリン酸）による結合、ジエニルアルデヒド基とアミノ基との結合等が挙げられる。このような結合の具体例としては、リンカーの一端に存在するマレイミド基と、抗体上のシステイン残基に含まれるチオール基との結合、リンカーの一端に存在するスクシンイミド基と、抗体上のリジン残基に含まれるアミノ基との脱水置換結合（例えば、国際公開第２００８／０９６７６０号）、リンカーの一端に存在するアミノ基と、抗体上のアスパラギン酸又はグルタミン酸に含まれるカルボン酸との脱水縮合結合（例えばＷＳＣＤＩを使用する）等が挙げられる。抗体とリンカーとの結合の具体的な方法については、例えば、国際公開第２０１０／０５５９５０号を参照されたい。
　一方、抗体又はリンカーと細胞傷害性物質との結合は、共有結合又は非共有結合（イオン結合、疎水結合等）であり、好ましくは共有結合である。特に、該結合は、本発明の複合体を対象へ投与した場合に、血液中では細胞傷害性物質が遊離しにくい結合であることが好ましい。このような観点から、抗体又はリンカーと細胞傷害性物質との結合は、限定されるものではないが、好ましくはエステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、チオカルバメート結合であり、より好ましくはエステル結合である。
　本発明のＡＤＣにおいて、抗体１分子あたりの細胞傷害性物質の結合数（薬物結合数）は、その有効性、安全性を考慮し、その数が一定の数となるよう、反応させる原料・試薬の使用量等の反応条件を規定して実施される。しかしながら、低分子化合物の化学反応とは異なり、異なる数の薬物が結合した混合物として得られるのが通常である。抗体１分子への薬物の結合数は平均値、すなわち、平均薬物結合数として特定され、表記される。したがって、本願明細書においても特に断りのない限り、薬物の結合数は平均値を意味する。
　抗体１分子あたりの薬物結合数は、用いる還元剤の種類及びその濃度、抗体に対するリンカー及び薬物の濃度（モル過剰率等）、並びに結合反応における温度又は時間を調整することにより、コントロール可能である。「還元剤」としては、抗体中のジスルフィド結合を還元的に開裂させて上記チオール基を介した結合を生じさせ得るものであれば特に制限はないが、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、ＤＬ－ＤＴＴ）、２－メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ＴＣＥＰが挙げられる。
　本発明において、１抗体あたりの薬物平均結合数は、特に制限されるものではないが、例えば１～１０個であり、好ましくは３～８個であり、より好ましくは３～５個である。なお、抗体１分子あたりの薬物結合数は、後述の実施例に示すように、細胞傷害性物質（例えば、ＤＭ１）の吸収のピークにおける吸光度と抗体の吸収のピークである２８０ｎｍの吸光度を測定し、それぞれがお互いの吸収ピークに与える影響を加味して連立方程式を立て計算することで、抗体と細胞傷害性物質の濃度を求め、分子数の比を決定することにより求めることができる。また、ＤＴＮＢ等のチオール基を比色定量する試薬を用い、求めることもできる。
　また、本発明のＡＤＣは、大気中に放置したり、又は再結晶することにより、水分を吸収し、吸着水がついたり、水和物になる場合があり、そのような水を含む化合物及び塩も、本発明に含まれる。
　本発明のＡＤＣを構成する原子の１以上に、原子同位体の非天然割合も含有し得る。原子同位体としては、例えば、２Ｈ、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃが挙げられる。また、本発明のＡＤＣは、バイオイメージング技術等において検出し得る。そのため、標識物質が結合されていてもよい。標識物質は、用いる検出方法等の種類に合せて適宜選択されるが、例えば、放射性標識物質、蛍光性標識物質、常磁性標識物質、超常磁性標識物質、酵素標識物質が挙げられる。また、このような標識物質とＡＤＣとの結合は直接的なものであってもよく、間接的なものであってもよい。間接的な結合としては、標識物質を結合させた二次抗体、標識物質を結合させたポリマー（プロテインＡ、プロテインＢ等）を介した結合が挙げられる。
　より具体的には、ＡＤＣを標識する放射性同位元素として、陽電子放出核種を利用することができる。例えば、６４Ｃｕ、１８Ｆ、５５Ｃｏ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、７６Ｂｒ、８９Ｚｒ及び１２４Ｉのような陽電子放出核種で抗体を標識することができる。これらの陽電子放出核種によるＡＤＣの標識には、公知の方法（Ｎｕｃｌ　Ｍｅｄ　Ｂｉｏｌ．１９９９；２６（８）：９４３－５０．、Ｊ　Ｎｕｃｌ　Ｍｅｄ．２０１３；５４（１１）：１８６９－７５．等）を利用することができる。また、陽電子放出核種で標識されたＡＤＣが対象に投与された後に、ＰＥＴ（ポジトロン断層撮影装置）により、その放射性核種から放射される放射線を体外から計測し、コンピュータートモグラフィーの手法で画像に変換される。このようにして、対象に投与したＡＤＣの標的部位への到達、集積等を追跡することができる。
　＜キメラ抗原受容体＞
　後述の実施例に示すとおり、本発明の抗体の標的であるヒトＥｖａ１は、様々ながんにおいて発現している。また、本発明の抗体の可変領域は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれを発現するＴ細胞（所謂ＣＡＲ－Ｔ）において有用である。よって、本発明は、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル領域とを含む、ＣＡＲの態様もとり得る。
　本発明において、「キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）」は、細胞外領域となるヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル領域とが、その順にてＮ末端側から配置され、直接又は間接的に連結されてなる、キメラタンパク質を意味する。
　本発明において、「ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する領域（抗原結合性領域）」は、例えば、上述の抗体又はその機能的断片を用いることができるが、通常ＣＡＲには、ｓｃＦｖが用いられる。
　「ｓｃＦｖ」は、上述のとおり、モノクローナル抗体（免疫グロブリン）の軽鎖可変領域と重鎖可変領域がリンカーを介して連結された構造体であり、抗原との結合能を保持している。ｓｃＦｖにおけるＮ末端側の順としては、軽鎖可変領域、リンカー、重鎖可変領域であってもよく、また重鎖可変領域、リンカー、軽鎖可変領域であってもよいが、好ましくは前者である。
　ｓｃＦｖにおける「リンカー」としては、例えばペプチドリンカーを用いることができる。リンカーの長さは特に限定されない。例えば、アミノ酸数が５～２５個のリンカーを用いることができる。リンカーの長さは好ましくは８～２５アミノ酸、さらに好ましくは１５～２０アミノ酸である。ペプチドリンカーの好適な例として、グリシン又はグリシンとセリンから（ＧＧＳリンカー、ＧＳリンカー、ＧＧＧリンカー等）が挙げられる。また、配列番号：５８に記載の１３４～１５１位の１８アミノ酸からなるリンカーも、好適な例として挙げられる。これらリンカーを構成するアミノ酸であるグリシンとセリンは、それ自体のサイズが小さく、リンカー内で高次構造が形成されにくいという利点を有する。
　ｓｃＦｖの基となるモノクローナル抗体としては、特に制限はないが、例えば、上述の非ヒト動物由来の抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体が挙げられる。また、好適な例としても上述のとおりであるが、後述の実施例に示すとおり、ヒトＥｖａ１に応じた活性化及び細胞増殖等の観点から、上記（Ｈ２－Ｌ２）の組み合わせが好ましく、さらにＮ末側から順にＬ２、リンカー、Ｈ２と連結されてなるｓｃＦｖが好ましい。
　本発明において「膜貫通領域」は、細胞膜を貫通する機能を有し、ＣＡＲを細胞膜に繋留し得るポリペプチドであれば特に制限はない。膜貫通領域を担うポリペプチドの由来となるタンパク質としては、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、４－１ＢＢ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ、Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖が挙げられる。
　本発明において「細胞内シグナル領域」は、ＣＡＲが細胞膜上に配置された際に細胞内に配置される領域であり、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達すること、すなわち、抗原結合性領域が抗原（ヒトＥｖａ１）と結合した際、免疫細胞の活性化に必要なシグナル（所謂一次シグナル）を伝達することが可能な領域である。このような細胞内シグナル領域としては、一般的に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ３複合体といった活性化シグナル伝達ドメインのみを有するもの（第１世代ＣＡＲ）、活性化シグナル伝達ドメインに加えて共刺激分子由来の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８又は４－ＩＢＢの細胞内ドメイン）を有するもの（第２世代ＣＡＲ）、活性化シグナル伝達ドメインに加えて複数の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８及び４－ＩＢＢの細胞内ドメイン）を有するもの（第３世代ＣＡＲ）がある。また、本発明者らが従前開発したＣＤ７９Ａ細胞内領域及びＣＤ４０細胞内領域を含むものも挙げられる（Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　２０２１　Ｓｅｐ　１；２９（９）：２６７７－２６９０．参照）。
　「細胞内シグナル領域」は、前記のように、一次シグナルを伝達することが出来ればよく、当該シグナルに関与するタンパク質の活性化シグナル伝達ドメインを用いることができる。一次シグナル伝達には、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍｏｔｉｆ：ＩＴＡＭ）が関与することが知られている。ＩＴＡＭを有するタンパク質としては、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２が挙げられる。
　また、上記のとおり、また後述の実施例に示すとおり、「ＣＤ７９Ａ細胞内領域及びＣＤ４０細胞内領域を含むもの」も、本発明にかかる細胞内シグナル領域として好適に用いられる。かかる場合、ＣＤ７９Ａ細胞内ドメインとＣＤ４０細胞内ドメインとの配置関係は特に制限されず、Ｎ末端側がＣＤ７９Ａ細胞内領域である態様と、Ｎ末端側がＣＤ４０細胞内領域である場合のいずれでも採用可能である。該配置関係は、好ましくは前者である。ＣＤ７９Ａ細胞内領域及びＣＤ４０細胞内領域は、直接連結している、あるいはリンカーを介して連結していることが好ましい。リンカーは、ＮＦκＢシグナル活性化作用が著しく損なわれない限り特に制限されず、任意である。リンカーとしては、好ましくはグリシン又はグリシンとセリンから構成されるリンカー（ＧＧＳリンカー、ＧＳリンカー、ＧＧＧリンカー等）である。リンカーの長さは特に限定されないが、例えば１～２０アミノ酸、好ましくは１～１０アミノ酸、より好ましくは１～５アミノ酸である。
　本発明においてＣＡＲが含む細胞内シグナル領域の数は、１つに限定されず、複数の細胞内シグナル領域を含むこともできる（例えば、１～５個、１～３個、又は１個若しくは２個のシグナル伝達因子を含むこともできる）。この場合、含む複数の細胞内シグナル領域は、同じものであってもよいし、異なるものであってもよい。
　本発明のＣＡＲは、上述の抗原結合領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域に加えて、他のドメインを含むこともできる。他のドメインの例としては、共刺激伝達領域、スペーサー配列、シグナルペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。
　Ｔ細胞上に発現する共刺激分子は、抗原提示細胞上に発現する各共刺激分子に特異的なリガンドとの結合により、細胞内に共刺激シグナルを伝達し、Ｔ細胞の活性化を補助することが知られている（二次シグナル伝達）。本発明において「共刺激伝達領域」とは、前記のような共刺激分子の共刺激シグナル伝達に関与する細胞内ドメインを意味する。共刺激分子の例としては、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ１５４等が挙げられる。本発明のＣＡＲは、これら共刺激分子の共刺激伝達領域を含むことができる。
　本発明のＣＡＲが含み得る共刺激伝達領域の数は、１つに限定されず、複数であってもよい。本発明のＣＡＲは、共刺激伝達領域を、例えば、１～５個、１～３個、又は１個若しくは２個含むことができる。本発明のＣＡＲが、複数の共刺激シグナル伝達域を含む場合、当該域は、同じものであってもよく、また異なるものであってもよい。
　本発明において「スペーサー」は、各領域等の間を連結する配列を意味し、各領域の機能を抑制しない限り特に制限はなく、またそのアミノ酸数も特に制限されるものではないが、通常１～５００アミノ酸、好ましく５～３００アミノ酸であり、さらに好ましくは１０～１００アミノ酸である。
　特に、本発明のＣＡＲにおいて、抗原結合性領域と膜貫通領域とは、直接又は比較的短いスペーサーを介して連結されることが好ましい。抗原結合性領域と膜貫通領域との間のスペーサーの構成アミノ酸数は、例えば１～４００であり、好ましくは１０～３００である。また、後述の実施例に示すとおり、本発明のＣＡＲを発現する細胞を、ＩＬ－２非存在下で培養する場合には、細胞増殖及びサイトカイン産生の観点から、前記構成アミノ酸は、１５０～３００であることがより好ましく、２００～２５０であることがさらに好ましい。一方、本発明のＣＡＲを発現する細胞を、ＩＬ－２存在下で培養する場合には、前記構成アミノ酸は、１０～３０であることがより好ましい。
　スペーサーの配列は特に限定されないが、例えば、ＩｇＧ、好ましくはヒトＩｇＧ（例えばサブタイプＩｇＧ１やＩｇＧ４）のヒンジ部又はその一部、ヒンジ部とＣＨ２の一部、或いは膜貫通ドメインに利用する因子（例えばＣＤ２８）の一部等の配列をスペーサーに用いることができる。なお、ヒンジ部又はその一部の配列を利用することにより、柔軟性に富むスペーサーが構成されることを期待できる。かかるスペーサーとしては、具体的に、配列番号：５９、６０、６１、６２又は６２（配列番号：５８に記載の２６８～４９９位）に記載のアミノ酸配列からなるスペーサーが挙げられる。
　本発明において「シグナルペプチド」は、ＣＡＲの分泌を促すため、または細胞膜への局在化を指示するためのペプチドを意味し、リーダー配列とも称される。シグナルペプチドは、通常、抗原結合領域のＮ末端に直接又は間接的に結合され得る。また任意で、細胞プロセシング及び細胞膜へのＣＡＲの局在化中に抗原結合領域から、シグナルペプチドは切断されてもよい。かかるシグナルペプチドの例としては、ヒトＧＭ－ＣＳＦ受容体、Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ等のシグナルペプチドが挙げられる。
　以上、本発明のＣＡＲにおける各領域等の例について説明したが、これら領域等に関する具体的なアミノ酸配列は、当業者であれば、公知の文献やＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅ／）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。さらに、上記表３等に示すとおり、本願の配列表において具体的な配列も開示してある。また、このような典型的なアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ　レファレンスシークエンス）に限らず、本発明に係る領域等は、当該領域が担う機能を維持している限り、それら典型的なアミノ酸配列に対する改変体、相同体も含み得る。また、かかる改変体、相同体は、典型的なアミノ酸配列に対し、通常高い相同性を有する。高い相同性は、通常６０％以上であり、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。
　また、本発明のＣＡＲは、１種のポリペプチドからなる分子であってもよいし、２種以上のポリペプチドの複合体からなる分子であってもよい。また、本発明のＣＡＲは、ポリペプチド又はその複合体からなる分子であってもよいし、ポリペプチド又はその複合体に、他の物質（例えば、蛍光物質、放射性物質、無機粒子等）が連結してなるものであってもよい。
　本発明のＣＡＲは、化学修飾されたものであってもよい。本発明のＣＡＲを構成するポリペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（－ＣＯＯ－）、アミド（－ＣＯＮＨ２）またはエステル（－ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル等のＣ１－６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３－８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチル等のＣ６－１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル－Ｃ１－２アルキル基；α－ナフチルメチル等のα－ナフチル－Ｃ１－２アルキル基等のＣ７－１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基等が用いられる。本発明のＣＡＲを構成するポリペプチドは、Ｃ末端以外のカルボキシル基（又はカルボキシレート）が、アミド化又はエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明のＣＡＲを構成するポリペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等のＣ１－６アルカノイル等のＣ１－６アシル基等）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－ＯＨ、－ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等のＣ１－６アルカノイル基などのＣ１－６アシル基等）で保護されているものも包含される。
　また、本発明のＣＡＲは、他の機能性タンパク質を有していてもよい。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、本発明のＣＡＲに付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、ＣＡＲの精製及び検出を容易にする目的で用いる機能性タンパク質としては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ（登録商標、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、蛍光タンパク質タグ（ＧＦＰ等）等が挙げられる。
　本発明のキメラ抗原受容体は、酸又は塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば、酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
　本発明のキメラ抗原受容体は、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
　なお、これまでにＣＡＲを利用した実験、臨床研究等の報告がいくつかあり（例えば、Ｒｏｓｓｉｇ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　１０：５－１８，２００４；Ｄｏｔｔｉ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　２０：１２２９－１２３９，２００９；Ｎｇｏ　ＭＣ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｕｍ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ　２０（Ｒ１）：Ｒ９３－９９，２０１１；Ａｈｍｅｄ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　１７：１７７９－１７８７，２００９；Ｐｕｌｅ　ＭＡ，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｍｅｄ　１４：１２６４－１２７０，２００８；Ｌｏｕｉｓ　ＣＵ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｌｏｏｄ　１１８：６０５０－６０５６，２０１１；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ　ＪＮ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｌｏｏｄ　１１６：４０９９－４１０２，２０１０；ＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒＪＮ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｌｏｏｄ　１１９：２７０９－２７２０，２０１２；　Ｐｏｒｔｅｒ　ＤＬ，ｅｔ　ａｌ．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ３６５：７２５－７３３，２０１１；Ｋａｌｏｓ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ　３：９５ｒａ７３，２０１１；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ　ＲＪ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｌｏｏｄ　１１８：４８１７－４８２８，２０１１；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ　ＲＪ，ｅｔ　ａｌ．ＳｃｉＴｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ　５：１７７　ｒａ３８，２０１３）、これらの報告を参考にして、本発明のＣＡＲを構築することができる。また、後述の実施例において、具体的な配列等も示しているため、これらを参考にして本発明のＣＡＲを構築することもできる。
　＜キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド＞
　本発明は、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。ｓｃＦＶ等の抗原結合領域をコードするヌクレオチド配列の情報については、標的とする抗原を認識するモノクローナル抗体を作製し、かかるモノクローナル抗体のアミノ酸配列をエドマン法等の公知の方法で決定し、かかるアミノ酸配列に基づいて入手することもできる。なお、上述のヒト化抗体等については、本願の配列表においても具体的な配列を開示している。また、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのヌクレオチド配列を解析することによっても入手することができる。
　また、抗原結合性領域を含め、本発明のＣＡＲにおける各領域等をコードする具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば、公知の文献やＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅ／）等のデータベースを検索しても適宜入手することができる。さらに、上記領域等をコードするヌクレオチド配列は、公知のものに限定されず、上記各領域等をコードするヌクレオチド配列であれば用いることができる。遺伝子コードの縮重により、１つのアミノ酸に対応するコドンは複数存在する。したがって、同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は多数存在する。本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、本発明のＣＡＲをコードする限り、遺伝子コードの縮重によって生じる複数のヌクレオチド配列のいずれであってもよい。さらにまた、ＣＡＲを発現する細胞における発現を最適化するために、本発明のＣＡＲにおける各領域等をコードするヌクレオチド配列において、アミノ酸をコードするために選択されるコドンは改変されてもよい。
　そして、当業者であれば、このようなヌクレオチド配列情報に基づき、化学合成する方法（ホスホロアミダイト法等）や、ＰＣＲによって増幅する方法等の公知の技術を用い、各領域等をコードするポリヌクレオチドを作製することができる。さらに、このようにして得られた各領域等をコードするポリヌクレオチドを、直接又はスペーサー介して連結することにより、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。なお、各領域等をコードするポリヌクレオチドの連結は、後述の実施例において示すように、例えば、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法（ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ＰＣＲ）等の公知の方法を用いて行うことができる。
　＜キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター＞
　本発明は、上述のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明のベクターとしては直鎖状でも環状でもよく、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、人工染色体ベクター、トランスポゾンベクターが挙げられる。
　ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルス等のレトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクターが挙げられる。
　プラスミドベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等の、動物細胞発現用プラスミドベクターが挙げられる。
　エピソーマルベクターは、染色体外で自律複製可能なベクターである。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、公知である（Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９年、３２４，７９７－８０１ページ、　参照）。エピソーマルベクターとしては、例えば、ＥＢＶ、ＳＶ４０等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、ＥＢＶにあっては複製開始点ｏｒｉＰとＥＢＮＡ－１遺伝子、ＳＶ４０にあっては複製開始点ｏｒｉとＳＶ４０ＬＴ遺伝子が挙げられる。
　人工染色体ベクターとしては、例えば、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＰＡＣ（Ｐ１－ｄｅｒｉｖｅｄ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターが挙げられる。
　これらベクターにおいて、増殖が緩やかな細胞であっても高効率に遺伝子を導入し易く、また安定発現株の樹立が容易であるという観点から、レトロウイルスベクターが好ましい。
　本発明のベクターには、上述のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドの他に、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター等の発現制御配列、複製開始点や複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、他のタンパク質をコードするヌクレオチド等を含んでいてもよい。
　上述のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドや後述の他のタンパク質をコードするヌクレオチドは、プロモーターの下流に作動可能に配置することで、各ポリヌクレオチドを効率よく転写することが可能となる。かかる「プロモーター」としては、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。
　「他のタンパク質をコードするヌクレオチド」としては、例えば、蛍光タンパク質遺伝子、レポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子、サイトカイン等のＴ細胞活性化に関与する分子をコードする遺伝子等を挙げることができる。また、例えば、ＩＲＥＳ、２Ａペプチド配列（例えば、Ｔｈｏｓｅａ　ａｓｉｇｎａ由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ））をコードするＤＮＡ等を用いることにより、前記他のタンパク質は上述のＣＡＲと共にポリシストロニックに発現させることが可能となる。
　さらに、ＣＡＲを発現する細胞を投与した対象（がん患者等）の体内で、投与したＣＡＲ発現細胞のアポトーシスを適宜誘導するため、自殺遺伝子を「他のタンパク質をコードするヌクレオチド」として、本発明のベクターは含み得る。自殺遺伝子としては、例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、誘導性カスパーゼ９（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｃａｓｐａｓｅ９：ｉＣａｓｐ９）が挙げられる。また、かかる遺伝子の機能を活性化する薬剤としては、ＨＳＶ－ＴＫに対してはガンシクロビル、ｉＣａｓｐ９に対しては二量体誘導化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＣＩＤ）であるＡＰ１９０３等を挙げることができる（Ｃｏｏｐｅｒ　ＬＪ．ら、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２００６；８（２）：１０５－１７ページ、Ｊｅｎｓｅｎ　Ｍ．Ｃ．ら．Ｂｉｏｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１０　Ｓｅｐ；１６（９）：１２４５－５６ページ、ＪｏｎｅｓＢＳ．、Ｆｒｏｎｔ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１４　Ｎｏｖ　２７；５：２５４．、Ｍｉｎａｇａｗａ　Ｋ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１５　Ｍａｙ　８；８（２）：２３０－４９ページ、Ｂｏｌｅ－Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｅ．、Ｆｒｏｎｔ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５　Ａｕｇ　２５；６：１７４　参照）。
　＜キメラ抗原受容体を発現する細胞＞
　本発明は、本発明のＣＡＲを発現する細胞を提供する。本発明の細胞は、上述の本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド又はベクターを、細胞に導入することにより得ることができる。
　本発明のポリヌクレオチド又はベクターが導入される「細胞」は、哺乳動物由来の細胞であることが好ましく、例えば、ヒト由来の細胞、又は齧歯類（マウス、ラット等）、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、サル等の非ヒト哺乳動物由来の細胞を用いることができる。細胞の種類は、特に限定されず、血液、骨髄液等の体液や、脾臓、胸腺、リンパ節等の組織、腫瘍やがん性腹水等から採取された細胞等を使用することができる。好ましい例としては、ＣＡＲ発現用細胞として、免疫細胞を挙げることができる。
　「免疫細胞」としては、ＣＤ４陽性ＣＤ８陰性Ｔ細胞、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ｉＰＳ細胞から調製されたＴ細胞、αβ－Ｔ細胞、γδ－Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞等を挙げることができる。上記の如きリンパ球又は前駆細胞を含むものであれば、様々な細胞集団を用いることができる。末梢血から採取されるＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）は好ましい免疫細胞の一つである。すなわち、好ましい一態様では、ＰＢＭＣに対して遺伝子導入操作を行う。ＰＢＭＣは常法に従って又は準じて調製することができる。
　本発明のポリヌクレオチドの導入の前にＣＡＲ発現用細胞を活性化させておくことが好ましい。例えば、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で刺激し、ＣＡＲ発現用細胞を活性化させることができる。より具体的には、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体で培養面をコートした培養容器（例えば培養皿）で培養することによって、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による刺激を加えることができる。抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体がコートされた磁気ビーズ（例えば、ＶＥＲＩＴＡＳ社が提供するＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８）を利用して当該刺激を行うことも可能である。
　細胞の生存率／増殖率を高めるために、活性化処理の際、Ｔ細胞増殖因子が添加された培養液を使用することが好ましい。Ｔ細胞増殖因子としてはＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７等を用いることができる。ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７等のＴ細胞増殖因子は常法に従って調製することができる。また、市販品を利用することもできる。ヒト以外の動物種のＴ細胞増殖因子の使用を排除するものではないが、通常、Ｔ細胞増殖因子はヒト由来のもの（組換え体であってもよい）を用いる。
　典型的には、その適用（対象への投与）のため、本発明のポリヌクレオチド導入後の細胞（本発明のポリヌクレオチド導入リンパ球）を増殖させる。例えば、Ｔ細胞増殖因子が添加された培養液を用いて本発明のポリヌクレオチド導入リンパ球を培養する（必要に応じて継代培養する）。この培養に加え、ＣＡＲ発現用細胞の活性化の場合と同様の処理（再活性化）を行うことにしてもよい。
　なお、本発明の細胞の培養には、血清（ヒト血清、ウシ胎仔血清等）を添加した培地を用いてもよいが、無血清培地を採用することにより、臨床応用する際の安全性が高く、かつ血清ロット間の差による培養効率の違いが出にくいという利点を有する細胞を調製することが可能になる。血清を用いる場合には、自己血清、すなわち、本発明の細胞の投与を受ける対象から採取した血清を用いることが好ましい。
　また、本発明の細胞は、過剰な免疫反応等を抑えるタンパク質（免疫チェックポイント物質等）の機能が抑制されている細胞であってもよい。かかるタンパク質としては、例えば、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　Ｄｅａｔｈ　１（ＰＤ１）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ－５等）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９が挙げられる。
　また、本発明の細胞は、他家移植をし易くするために、内在性のＴＣＲ、ＨＬＡ等のタンパク質の機能が抑制されている細胞であってもよい。
　タンパク質の機能を抑制する方法としては、前記タンパク質をコードする遺伝子を標的とするノックアウト法、前記遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ）を用いる方法、当該転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡを用いる方法、前記転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡを用いる方法が挙げられる。また、部位特異的なヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９等のＤＮＡ二本鎖切断酵素）を利用して、標的遺伝子を改変する方法であるゲノム編集法も、前記物質の機能を抑制するために好適に用いられる。
　本発明のポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入する方法としては、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等を挙げることができる。また、本発明のベクターがレトロウイルスベクターである場合、ベクターが有しているＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製してもよい。パッケージング細胞としては、例えば、ＰＧ１３、ＰＡ３１７、ＧＰ＋Ｅ－８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ－１２、Ｐｓｉ－Ｃｒｉｐが挙げられる。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞をパッケージング細胞として用いることもできる。
　また、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入した後、当該細胞のＣＡＲの発現は、フローサイトメトリー、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫染色等の公知の方法により確認することができる。
　＜医薬組成物＞
　本発明は、本発明の抗体、ＡＤＣ又はＣＡＲを発現する細胞（以下、単に「本発明の抗体等」とも称する）を有効成分とする医薬組成物（例えば、抗がん剤）、並びに本発明の抗体等の治療上又は予防上の有効量を、対象に投与する工程を含んでなる、Ｅｖａ１タンパク質に関連する疾患（例えば、がん）の治療又は予防の方法をも提供するものである。
　本発明の抗体の標的とするＥｖａ１タンパク質に関連する疾患は、Ｅｖａ１タンパク質の発現が、その発症、症状の進行、悪化等に関与する疾患であればよく、例えば、がんが挙げられる。
　また、本発明の抗体の標的とする「がん」としては、少なくともヒトＥｖａ１を発現していればよく、当該タンパク質が発現している限り、固形腫瘍であってもよく、白血病、リンパ腫等であってもよい。より具体的には、グリオーマ（神経幹細胞、神経系前駆細胞及び神経膠細胞から発生した腫瘍、例えば、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、星細胞腫（アストロサイトーマ）、随芽腫、脳室上位腫、オリゴデンドログリオーマ、脈絡叢乳頭腫、特に退形成アストロサイトーマ、退形成オリゴデンドロアストロサイトーマ、退形成オリゴデンドログリオーマ）、膵がん、胃がん、食道がん、大腸がん、胆管がん、肝細胞がん、乳がん、肺がん、腎臓がん、尿路上皮がん、精巣がん、前立腺がん、頭頸部がん、甲状腺がん、皮膚がん、子宮頚部がん、子宮体部がん、卵巣がん、血管腫、筋肉腫、骨髄腫、形質細胞がん、メラノーマ（黒色腫）が挙げられる。また、このようながんは原発性のものであってもよく、転移性のものであってもよい、さらに、本発明に係るがんには、がん幹細胞も含まれる。
　本発明の「医薬組成物」は、本発明の抗体等の他、薬理学上許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、乳化剤、湿潤剤、ｐＨ緩衝化剤、培地、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、懸濁剤、可溶化剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤が挙げられる。より具体的に、薬理学上許容される他の成分としては、注射剤等の液状製剤の場合には、水溶液（生理食塩水、注射用水、リン酸塩緩衝液、葡萄糖水溶液、グリセロール水溶液等）、水酸化アルミニウム等を例として挙げることができる。また、凍結乾燥した製剤の場合、糖（マンニトール、ラクトース、サッカロース等）、アルブミン等を例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明の医薬組成物は、上記成分が投与前に混合され得るような、キットの態様であってもよい。また、注射剤として用いる場合には、シリンジに導入された形態であり得る。
　本発明の医薬組成物は、有効成分として、本発明の抗体等のみを含むものであってもよいし、当該抗体等及び少なくとも一つの他の抗がん剤を含むものであってもよい。また、本発明の抗体等は、他の抗がん剤と共に投与することもでき、これによって抗腫瘍効果を増強させることができる。このような目的で使用される他の抗がん剤は、本発明の抗体等と同時に、別々に、あるいは連続して対象に投与されてもよいし、それぞれの投与間隔を変えて投与してもよい。このような「抗がん剤」として、例えば、免疫チェックポイント阻害薬（抗ＰＤ－１抗体等）、ゲムシタビン、Ｓ－１、エルロチニブ、５－ＦＵ、テモゾロミド、ロイコボリン、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、オキサリプラチン、アブラキサン、カルボプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ソラフェニブ、ビンブラスチン、ＬＨ－ＲＨアナログ（リュープロレリン、ゴセレリン等）、エストラムスチン・フォスフェイト、エストロジェン拮抗薬（タモキシフェン、ラロキシフェン等）、アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン等）、国際公開第２００３／０３８０４３号に記載の薬剤を挙げることができるが、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば限定されることはない。さらに、本発明の細胞を含む医薬組成物の場合には、他の成分として、細胞の保護を目的としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等、細菌の混入を阻止する目的で抗生物質等を含んでいてもよい。さらにまた、細胞の活性化、増殖又は分化誘導等を目的として、サイトカイン、成長因子、ステロイド等のＴ細胞活性化因子、ビタミン類、免疫賦活剤、免疫チェックポイント阻害剤を含んでもよく、また、本発明の細胞とこれら他の成分を併用してもよい。
　医薬組成物の投与方法は、投与する物質の種類、組成物の態様、対象の年齢、体重、性別、健康状態等により異なるが、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）、経口投与のいずれかの投与経路で投与することができる。好ましい投与方法は、非経口投与であり、より好ましくは静脈投与である。また、全身投与によらず、局所投与を行ってもよい。局所投与として、標的とする組織、臓器、器官への直接注入を例示することができる。
　医薬組成物の投与量は、対象の年齢、体重、性別、健康状態、症状の進行の程度及び投与する医薬組成物の成分により変動しうる。また、投与スケジュールも、これら条件によって適宜調整され、単回投与の他、連続的又は定期的に複数回投与してもよいが、一般的に、抗体を静脈内投与の場合、成人には体重１ｋｇ当たり１日０．１～１０００ｍｇ、好ましくは１～１００ｍｇである。また、ＡＤＣを投与する場合には、含有する薬物量換算にて、成人には体重１ｋｇ当たり１日０．００１～１０００ｍｇ、好ましくは０．０１～１００ｍｇである。これら抗体又はＡＤＣの投与回数としては、例えば、１回、又は１日～１年間に１回の間隔（例えば、１週毎、１０～３０日毎、１月毎、３～６月毎、半年毎、１年毎）で複数回投与してもよい。
　また、細胞の投与量としては、１回の投与において、成人には体重１ｋｇ当たり投与細胞の個数として、１ｘ１０３～１ｘ１０１０個（好ましくは１ｘ１０４～１ｘ１０９個、より好ましくは１ｘ１０５～１ｘ１０８個）とすることができる。投与間隔としては、例えば、１週毎、１０～３０日毎、１月毎、３～６月毎、１年毎等とすることができる。また、本発明の細胞は、投与対象の体内で自律的に増殖できるため、１回きりの投与とすることもできる。また、投与後に体内の本発明の細胞数をモニタリングし、その結果に応じて投与時期を決定するようにしてもよい。
　なお、治療対象が脳である場合には、血液脳関門（ＢＢＢ）の存在がしばし問題となる。しかしながら、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）等を罹患している者は、血管新生が生じた脳腫瘍内血管に正常な脳にあるＢＢＢが形成されていないことから、前記抗体を静脈注射等によってＧＢＭに送達することができる。
　また、ＢＢＢが機能している場合においても、それを回避して本発明の抗体を投与し得る。例えば、定位脳手術方法によってカニューレ等を挿入し、当該カニューレを通じてグリオーマ等に直接投与する方法が挙げられる。また、本発明の抗体を含むドラッグデリバリーシステムを脳内に埋め込む方法が挙げられ（Ｇｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．９：５８９－５９５（２００３）等）。さらには、本発明の抗体をコードする遺伝子を含むベクターによるＢＢＢにまたがるニューロンのトランスフェクションが含まれる（米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号等）。
　また、上記ＢＢＢを回避する方法の他、本発明の抗体を脳関門透過物質に含有又は結合させて投与する方法を利用することもできる。脳関門透過物質としては、例えば、ＢＢＢの血管内皮上の受容体に結合する抗体結合断片と結合しているリポソーム（米国特許出願公開第２００２００２５３１３号な等）、低密度リポタンパク質粒子（米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号等）、アポリポタンパク質Ｅ（米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号等）、トランスフェリン（米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号等）、狂犬病ウィルス由来の２９アミノ酸からなる糖タンパク質（Ｋｕｍａｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年７月５日、４４８巻、３９～４３ページ　参照）が挙げられる。
　さらに、受容体又はチャンネルの活性を制御して本発明の抗体を投与することにより、当該抗体がＢＢＢを通過してグリオーマ等に送達させることもできる。かかる方法としては、例えば、グルココルチコイド遮断薬を用いて血液脳関門の透過性を増加させること（米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、米国特許出願公開第２００３／０１６２６９５号、米国特許出願公開第２００５／０１２４５３３号等）、カリウムチャネルを活性化すること（米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号等）、ＡＢＣ薬物トランスポーターを阻害すること（米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号等）、本発明の抗体を陽イオン化すること（米国特許第５，００４，６９７号等）が挙げられる。
　以上、グリオーマ等の脳における疾患を対象として説明したが、当該疾患における本発明の抗体の投与方法はこれらに限定されるものではない、また、他の疾患に関しても、上記脳における疾患同様に、当業者であればその疾患に適した公知の方法を適宜選択し、本発明の抗体を患部に作用させることができる。
　本発明において、本発明の抗体等を投与される「対象」としては、例えば、上述のがん等に罹患しているヒト、上述のがん等が再発するおそれがあるヒト、上述のがん等を罹患するおそれがあるヒトが挙げられる。また本発明において、「治療」とは、がん等の標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。「予防」とは、疾病（障害）又はその症状の発症、発現、再発を防止又は遅延すること、あるいは発症、発現、再発の危険性を低下させることをいう。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　＜実施例１＞　抗ヒトＥｖａ１ヒト化抗体
　抗ヒトＥｖａ１マウス抗体（特許文献２に記載の、Ｂ２Ｅ５－４８マウス抗体）を、以下に示す材料及び方法を用いてヒト化することを試みた。なお、当該抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は各々、配列番号：２１及び２７に示すとおりである。
　（材料及び方法）
　１．１　可変領域の解析及びＣＤＲの同定
　ＩＭＧＴ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｇａｐ　Ａｌｉｇｎツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ．ｃｇｉ）を用い、Ｂ２Ｅ５－４８マウス抗体の可変領域における、ＣＤＲを特定し、最も一致する生殖細胞配列を分析した。
　１．２　分子モデリング
　ＶＬ及びＶＨについては、既知の抗体の結晶構造との相同性に基づき、Ａｂｓｏｌｕｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ社内のソフトウェアを用いて分子モデルを構築した。画像はＰｙＭｏｌを用いて作成した。
　１．３　リスクのある配列分析
　抗体の配列に関し、公表されているタンパク質のモチーフに基づいて特定のリスクを分析した。分析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌで構築したシステム（Ａｂｓｏｌｕｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｌｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｔｏｏｌ）を用いて行った。このソフトウェアでは、下記表に示すモチーフに基づきリスクを評価する。なお、下記表において、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸を表す。
　１．４　遺伝子合成とクローニング
　後記表６に示すように、合計４本のヒト化重鎖と４本のヒト化軽鎖を設計した。それぞれを別々に合成し、ヒトＩｇＧ１重鎖発現ベクターとヒトκ軽鎖発現ベクターにクローニングした。トランスフェクションの際には、ヒト化された配列の可能な限りの組み合わせを行い、合計１６種類のヒト化抗体を作製した。これらに加えて、対照としてキメラ型ヒトＩｇＧ１（Ｂ２Ｅ５－４８マウス抗体の定常領域をヒトＩｇＧ１型のそれに置換したもの）を作製した。
　より具体的に、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列は、Ａｂｓｏｌｕｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ社製クローニングベクターや発現ベクターにクローニングできるよう、５’末端と３’末端に適切な制限酵素認識部位を追加し、設計した。さらに、これらＤＮＡ配列は、ヒト細胞での発現を考慮しコドンを最適化した。これら配列に基づき、化学的に合成した後、適切な種及びタイプのＡｂｓｏｌｕｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ社製ベクターにクローニングした。なお、配列の正確性は、ＤＮＡＳＴＡＲ　Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアを使用して生データを分析し、サンガーシークエンスによって確認した。当該確認を行った後、適切なサイズのプラスミドＤＮＡプレップを行い、トランスフェクションに必要な十分な量の高品質なＤＮＡを調製した。
　１．５　発現と精製
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性のトランスフェクションに最適な段階まで継代した。重鎖及び軽鎖発現用ベクターを当該細胞に導入し、６日間培養した。培養物を４０００ｒｐｍで遠心分離して、それら培養上清を回収し、０．２２Ｍのフィルターでろ過した。第一段階の精製はプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで行い、クエン酸ｐＨ３．０の緩衝液で溶出した後、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ９．０で中和した。溶出したタンパク質は、脱塩カラムを用いてＰＢＳにバッファー交換した。抗体濃度はＵＶ分光法で測定し、必要に応じて濃縮した。また、前記キメラ型ヒトＩｇＧ１は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のみならず、ＣＨＯ細胞でも発現させ調製した。
　１．６　抗体アナリティクス
　抗体の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣを用いて決定した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ　１１００　シリーズの装置で、適切なサイズ排除カラム（ＳＥＣ）を用いて実施した。抗体の発現力価はプロテインＡ　ＨＰＬＣで測定した。
　１．７　表面プラズモン共鳴解析
　ヒト化抗体等の解離定数及び結合定数を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、製品名：ＢｉａＣｏｒｅ　Ｔ２００（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製））にて解析した。
　具体的には先ず、ＣＭ５チップにヒトＩｇＧキャプチャー抗体をアミンカップリング法により固定化した。当該固定化は、リファレンスセル及びアクティブセルの両方において行った。そして、以下の測定条件を用い、シングルサイクル法により、抗Ｅｖａ１抗体とｈＥｖａ１とのキネティクス解析を行った。
　測定条件
・Ｓａｍｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：１０℃
・Ｒｕｎｎｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ：ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ，　ｐＨ７．４
・Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＨｕｍａｎＩｇＧ抗体，リファレンス＆アクティブセル
・Ｌｉｇａｎｄ：各種抗体　５ｎＭ，アクティブセルのみ
・Ａｎａｌｙｔｅ：ｈＥｖａ１－ｍｏｕｓｅ　Ｆｃ１，５，２５，１２５，２５０ｎＭ，リファレンス＆アクティブセル
・Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ：３Ｍ　ＭｇＣｌ２，リファレンス＆アクティブセル
・ブランク（Ａｎａｌｙｔｅゼロ濃度）を３サイクル
また、サイクル条件は、下記表に示すとおりである。
　以上の材料及び方法を用いて得られた結果を以下に示す。
　（結果）
　２．１　シーケンス解析
　Ｂ２Ｅ５－４８マウス抗体のＶＨ及びＶＬの配列をＩＧＭＴ　Ｇａｐ　Ａｌｉｇｎツールで実行し、既知の全ての抗体生殖細胞の配列と比較して分析した。その結果、図には示さないが、これらの配列はマウス、特にＶＨではＩＧＨＶ１－５３ファミリー、ＶＬではＩＧＫＶ４－６８に最も近い配列であった。また、ＣＤＲはＩＭＧＴの定義を用いて割り当てられた。
　２．２　生殖細胞系列の選択
　ＶＨ及びＶＬの配列を、Ａｂｓｏｌｕｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ社のヒト生殖細胞系列に関するデータベースにアライメントして分析した。その結果、ヒト化のためのフレームワークとして選択された生殖細胞系列を、下記表６に示す。当該表において、ヒト化のフレームワークとして選択された重鎖及び軽鎖の生殖細胞系列と、オリジナルのマウスのＶＨ及びＶＬとの相同性（％）を各々示す。
　２．４　ＣＤＲグラフト重合
　ＶＨとＶＬの配列をＣＤＲグラフトアルゴリズムで解析し、Ｂ２Ｅ５－４８マウス抗体のＣＤＲを選択したヒト生殖細胞系列に移植した。ＣＤＲは主に抗原との結合に関与すると定義されているが、フレームワーク領域と呼ばれる領域の外側にあるアミノ酸が、結合に直接関与したり、ＣＤＲを正しく配置する役割を果たしたりする可能性がある。そこで、結合性を維持するために、フレームワーク領域のアミノ酸のうち、どのアミノ酸をマウス由来（オリジナル）のアミノ酸として残すかを、構造誘導法を用いて決定した。その結果、生成された配列の概要を表７に示す。なお、当該表中、配列において下線が引いている配列は、各可変領域中のＣＤＲであることを表す。
　２．５　リスクのある配列解析
　非常に望ましくない配列上のリスク（問題）が、ヒト化された配列に持ち込まれていないことを確認するために、オリジナルのマウス抗体の配列とヒト化された配列をＡｂｓｏｌｕｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｌｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｔｏｏｌにかけた。
　その結果、表４に示した中で最もリスクが高い配列である、グリコシル化モチーフ及び遊離システインは、前記マウス抗体及びヒト化抗体においていずれも検出されなかった。一方、脱アミド化や異性化のモチーフは、これら抗体において存在していることが認められた。しかしながら、これらモチーフは、表４に示すとおり高リスクとされているが、通常抗体においてよく見られる。また、これらモチーフに基づく修飾は、製造時に混乱を招く可能性があるものの、多くの場合管理方法如何によって解消することができる。さらに、必要であれば、変異導入によりこれらのモチーフを除去することも可能である。また、中リスク及び低リスクのある配列は、より完全な抗体を得るという観点から検出したが、抗体の製造工程で問題を起こすことは殆ど報告されていない。よって、前記マウス抗体及びヒト化抗体の配列は、特段問題がないものと判断した。
　３．抗体の製造と分析
　上記のとおり、１６種類のヒト化抗体の製造を試みた。その結果、内６種類は全く上清中に抗体が検出されず（Ｈ１－Ｌ１、Ｈ１－Ｌ２、Ｈ１－Ｌ３、Ｈ２－Ｌ１、Ｈ３－Ｌ１、Ｈ４－Ｌ１）、また、他３種類（Ｈ２－Ｌ３、Ｈ３－Ｌ３、Ｈ４－Ｌ２）も、上清中の抗体濃度（下記Ｔｉｔｅｒ（ｍｇ／Ｌ））が著しく低かった。これらは正常な抗体が形成されず培養上清中に十分に分泌されていないと考えられる。
　また、ＳＰＲ法によって、抗体の結合親和性を分析した結果、前記表に示すとおり、いずれも平均解離定数（ＫＤ）は１０－７オーダーであった。特に、ヒト化抗体において、Ｈ２－Ｌ２、Ｈ１－Ｌ４、Ｈ２－Ｌ３、Ｈ２－Ｌ４は、キメラ抗体（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞産）と同程度であった。また、上記抗体濃度も考慮するに、Ｈ２－Ｌ２、Ｈ２－Ｌ４、Ｈ３－Ｌ４が、後述の抗体用途において有用であることが示唆された。
　＜参考例＞　ヒトＥｖａ１タンパク質の発現
　（正常ヒト血液細胞におけるＥｖａ１タンパク質発現の分析）
　抗Ｅｖａ１抗体の医薬用途における有用性を分析すべく、先ず後述のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）における有用性を分析するために、ＣＡＲ発現の場となる各種血液細胞におけるＥｖａ１タンパク質の発現を評価した。
　具体的には、健常人末梢血を溶血させ（ＢＤ　ＦＡＣＳ　Ｌｙｓｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、その後ＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ１９，好中球（ｓｃａｔｔｅｒ　ｐｌｏｔよりｇａｔｅ），単球（ｓｃａｔｔｅｒ　ｐｌｏｔよりｇａｔｅ）にて染色し、同時にマウス抗ヒトＥｖａ１抗体及び二次抗体で染色してフローサイトメトリーで解析した。
　その結果、図１に示すとおり、ＣＤ４，ＣＤ８　Ｔリンパ球、ＣＤ１９Ｂリンパ球、好中球、単球の全てにおいてＥｖａ１タンパク質の発現は見られなかった。よって、Ｅｖａ１タンパク質を抗原とするＣＡＲを発現する血液細胞は、当該細胞を標的としない蓋然性が高いことが示唆された。
　（腫瘍におけるＥｖａ１タンパク質発現の分析）
　次に、各種腫瘍におけるＥｖａ１タンパク質の発現を評価した。具体的には先ず、各種腫瘍細胞株を培養フラスコから剥離し細胞浮遊液とした後、前記（正常ヒト血液細胞におけるＥｖａ１タンパク質発現の分析）に記載の方法と同様にして、Ｅｖａ１タンパク質を染色した。
　その結果、図２Ａに示すとおり、ＯＶＴＯＫＯ、ＰＡ－１及びＴ９８Ｇにおいては発現を認められなかったものの、それ以外の様々な腫瘍細胞株においてＥｖａ１タンパク質の発現が認められた。
　また、肝内胆管癌症例の手術標本分離細胞におけるＥｖａ１タンパク質発現の分析も行った。具体的には、肝内胆管癌の手術標本から、腫瘍部分を採取し細胞浮遊液を調製した（ＭＡＣＳ　Ｔｕｍｏｒ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ，　Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）。さらにＴｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ及びｈｕｍａｎ，　Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃを用いて腫瘍細胞を純化し、前記同様にＥｖａ１タンパク質を染色し、フローサイトメトリー解析を行った。
　その結果、図２Ｂに示すとおり、肝内胆管癌３例中３例においてＥｖａ１は陽性であった。
　＜実施例２＞　マウス抗Ｅｖａ１抗体配列を用いたキメラ抗原受容体
　（抗ヒトＥｖａ１マウス抗体配列を用いたＥｖａ１－ＣＡＲの作製）
　次に、Ｅｖａ１タンパク質を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の有用性を分析するため、このようなＣＡＲを作製した。具体的には、図３Ａに示すとおり、抗ヒトＥｖａ１マウス抗体（上記Ｂ２Ｅ５－４８マウス抗体）のＶＬ及びＶＨを用いて単鎖抗体を構築した。そして、ＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨとＶＨ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬを作製し、それぞれ１５ａａの短いスペーサードメイン（配列番号：５８に記載の２６８～２８２位のアミノ酸又は配列番号：５９に記載のアミノ酸配列からなる）あるいは２３２ａａの長いスペーサードメイン（配列番号：５８に記載の２６８～４９９位のアミノ酸又は配列番号：６３に記載のアミノ酸配列からなる）を介してＣＤ２８膜貫通領域（ＣＤ２８ＴＭ）、ＣＤ２８細胞内ドメイン（ＣＤ２８ＩＣ）、ＣＤ３ｚｅｔａを繋いでＣＡＲ分子を構築した。
　さらに、細胞内ドメインを持たないＥＧＦＲ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ＥＧＦＲ，ｔＥＧＦＲ）をＴ２Ａ配列の後に結合した。これは１本のｍＲＮＡとして転写された後、翻訳後にＴ２Ａ配列でＣＡＲとｔＥＧＦＲ分子に切り離され、１：１の数で分布する。ｔＥＧＦＲは遺伝子導入マーカー及び遺伝子導入された細胞の選択に用いることができる。
　具体的にＥｖａ１－ＣＡＲ（Ｎ末端側からの可変領域の順をＶＬ、ＶＨとし、前記長いスペーサードメインを有するもの）は、下記表９に示す構成をとる。
　なお、表９において「ｃＤＮＡ」の項目における数字は、配列番号：５７に記載のＤＮＡ配列中の位置（ｂｐ）を示し、「ポリペプチド」の項目における数字は、配列番号：５８に記載の配列中の位置（アミノ酸）を示す。
　（抗ヒトＥｖａ１マウス抗体配列を用いたＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの作製）
　次に、図３Ｂに示すとおり、Ｄａｙ０に健常人ドナーから採血を行い、ＣＤ８　ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ８陽性細胞に純化した。その後、ＣＤ３／ＣＤ２８　ｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＴ　ｃｅｌｌ：ｂｅａｄｓ＝１：３となる比率で混合し、Ｔ細胞を活性化させた。Ｄａｙ３に前記ＣＡＲ分子をコードする配列を遺伝子導入できるレトロウイルスを用いて遺伝子導入を行った（レトロウイルスの構築は、Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　２０２１　Ｓｅｐ　１；２９（９）：２６７７－２６９０．に記載の方法と同様にして行った）。具体的には、ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ　ｃｏａｔｅｄ　ｐｌａｔｅにレトロウイルスをロードし、２１００ｒｐｍ　１２０ｍｉｎ　ｓｐｉｎした。その後ｐｌａｔｅをＰＢＳで洗浄した後、刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞を播種し、８００ｒｐｍ　２ｍｉｎ　ｓｐｉｎした。Ｄａｙ４にはｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｏｎ　ｃｏａｔｅｄ　ｐｌａｔｅから通常の培養皿に移動させた。Ｄａｙ７に細胞を回収し、Ｂｉｏｔｉｎ化したＥＧＦＲ抗体（Ｅｒｂｉｔａｘ）を添加し、その後ＭＡＣＳ　ａｎｔｉ－ｂｉｏｔｉｎ　ｂｅａｄｓを用いてｔＥＧＦＲ陽性細胞を純化した。純化した細胞はＤａｙ７からＤａｙ１０まで引き続き培養を継続した。Ｄａｙ１０に細胞をカウントし、保存した。一部はＤａｙ１０に再度ＣＤ３／ＣＤ２８　ｂｅａｄｓを用いて刺激を行い、Ｄａｙ１７―２０に実験を行った。
　なお、以下において、遺伝子導入スキームは同一の方法を用いた。また、ヒト・リコンビナントＩＬ－２　５０Ｕ／ｍｌをＤａｙ１，４，７，１０，１３，１６，（１９）に加えて培養を行なった。
　（抗ヒトＥｖａ１マウス抗体配列を用いたＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔ遺伝子の導入効率）
　このようにして行った、Ｄａｙ７における遺伝子導入効率を図３Ｃ及び３Ｄに示す。図３Ｃにおいて、ＬＨ－Ｓ（ＶＬ－ＶＨを用いたＣＡＲでスペーサーが短いもの）、ＨＬ－Ｓ（ＶＨ－ＶＬを用いたＣＡＲでスペーサーが短いもの）及びＬＨ－Ｌ（ＶＬ－ＶＨを用いたＣＡＲでスペーサーが短いもの）及びＨＬ－Ｌ（ＶＨ－ＶＬを用いたＣＡＲでスペーサーが長いもの）に関し、ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ　ｐｌｏｔ（縦軸のＥＧＦＲはｂｉｏｔｉｎ化ｅｒｂｉｔａｘで一次染色し、その後ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰＥで二次染色した。遺伝子導入された細胞を示す）を示す。また、図３Ｄにおいて、５人の健常人ドナー由来細胞を用いて同様の実験を行なった結果を示す。図３Ｃ及び３Ｄに示すとおり、スペーサーが長いものの方が遺伝子導入効率が高かった。
　（抗ヒトＥｖａ１マウス抗体配列を用いたＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔのサイトカイン産生能）
　次に、抗ヒトＥｖａ１マウス抗体配列を用いたＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔのサイトカイン産生能を分析した。具体的には、前記のとおり作製したＣＡＲ－Ｔをｄａｙ１７まで培養し、その細胞を各種主要細胞株と１：１で共培養し、６時間の共培養の後、固定・細胞内染色（ＢＤ　ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ　ｂｕｆｆｅｒ）を行なってＩＦＮ－ｇａｍｍａ（ＩＦＮ－γ）で染色した。得られた結果を図３Ｅに示す。
　図３Ｅに示すとおり、ＥＧＦＲのみを遺伝子導入したｍｏｃｋ　Ｔ　ｃｅｌｌではＩＦＮ－ｇａｍｍａ産生は見られないが、Ｅｖａ１－ＣＡＲ－ＴではＩＦＮ－ｇａｍｍａ産生が見られた。いずれのＥｖａ１－ＣＡＲ－ＴでもＥｖａ１陰性細胞株に対してはＩＦＮ－ｇａｍｍａ産生は見られず、Ｅｖａ１陽性細胞株に対してはＩＦＮ－ｇａｍｍａ産生が見られており、Ｅｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの抗原特異性が確認できた。スペーサーが長いもののほうが短いものよりも強いＩＦＮ－ｇａｍｍａ産生が見られた。
　（Ｅｖａ１－ＣＡＲ－Ｔのスペーサー長の最適化）
　図３Ｆに示すとおり、６種類の異なる長さのスペーサー領域を持つマウス抗体由来Ｅｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを作製した。スペーサー長は０ａａ，１５ａａ（配列番号：５９），３０ａａ（配列番号：６０），６０ａａ（配列番号：６１），１２５ａａ（配列番号：６２），２３２ａａ（配列番号：６３）とした。１５ａａは先の実験におけるｓｈｏｒｔ　ｖｅｒｓｉｏｎと同じであり、２３２ａａはｌｏｎｇ　ｖｅｒｓｉｏｎと同じものである。これをプラスミドに組み込んで、同様にレトロウイルスを作製し、上記方法と同様にしてＣＤ８陽性細胞に遺伝子導入を行った。
　（６種類の異なるスペーサー長のＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの作製における遺伝子導入効率）
　このようにして行った、Ｄａｙ７における遺伝子導入効率（ＥＧＦＲ染色）を図３Ｇに示す。その結果、スペーサー長が３０ａａ，１２５ａａ，２３２ａａであるＣＡＲの３つが他の３種類よりも遺伝子導入効率が高いことが明らかになった（ｎ＝５）。
　（６種類の異なるスペーサー長のＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの増幅効率（ＣＤ３／ＣＤ２８　ｂｅａｄｓ刺激））
　さらに、前記Ｅｖａ１－ＣＡＲ－Ｔに、引き続きＣＤ３／ＣＤ２８　ｂｅａｄｓ刺激を施し、Ｄａｙ１７まで培養継続した時の増幅倍率を、図３Ｈに示す。その結果、ＣＤ３／ＣＤ２８　ｂｅａｄｓ刺激による増幅効率に差はなかった（ｎ＝５）。
　（６種類の異なるスペーサー長のＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔのサイトカイン産生能）
　前記Ｄａｙ１７のＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを用いて実験を行なった。具体的には、腫瘍細胞株と１：１で共培養し、６時間後に上記同様の方法にて、細胞を固定・染色し、細胞内ＩＦＮ－ｇａｍｍａ，ＩＬ－２をフローサイトメトリーで評価した。得られた結果を図３Ｉに示す。当該図において、ＣＤ８陽性細胞のうち陽性であった割合を示す。
　図３Ｉに示すとおり、スペーサー長３０ａａ，１２５ａａ，２３２ａａを用いた３つが優れたサイトカイン産生を示したが、中でも２３２ａａのスペーサーを持つＥｖａ１ＣＡＲ－Ｔ細胞が最も優れたサイトカイン産生能を示した。
　（６種類の異なるスペーサー長のＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの増幅効率（Ｅｖａ１刺激、ＩＬ－２なし））
　Ｅｖａ１陽性であるＨｕＣＣＴ－１に１００Ｇｙの放射線照射を行い、ＣＡＲ－Ｔと１：１で共培養を行い、それらの増幅効率を分析した。得られた結果を図３Ｊ及び３Ｋに示す。図３Ｊにおいてはそれぞれ時系列での増幅効率を示す。図３ＫにおいてはＤａｙ４における増幅倍率をプロットしている。図３Ｊ及び３Ｋに示すとおり、スペーサー長１５ａａ，３０ａａ，２３２ａａを用いた場合、細胞増幅が良かった（ｎ＝５、異なる５人のドナー由来末梢血からＣＡＲ－Ｔを作製）。
　（６種類の異なるスペーサー長のＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの増幅効率（Ｅｖａ１刺激、ＩＬ－２あり））
　前記同様にして、Ｅｖａ１陽性であるＨｕＣＣＴ－１に１００Ｇｙの放射線照射を行い、ＣＡＲ－Ｔ細胞と１：１で共培養を行った。そして、Ｄａｙ１，４，７と３日に１回ＩＬ－２　５０Ｕ／ｍｌを添加して培養した。得られた結果を図３Ｌ及び３Ｍに示す。図３Ｌにおいてはそれぞれ時系列での増幅効率を示す。図３ＭにおいてはＤａｙ１８における増幅倍率をプロットしている。図３Ｌ及び３Ｍに示すとおり、スペーサー長１５ａａ，３０ａａ，２３２ａａを用いた場合、細胞増幅が良い傾向が認められた（ｎ＝５、異なる５人のドナー由来末梢血からＣＡＲ－Ｔを作製）。
　＜実施例３＞　抗ヒトＥｖａ１ヒト化抗体配列を用いたキメラ抗原受容体
　（抗Ｅｖａ１ヒト化抗体配列を用いたヒト化Ｅｖａ１－ＣＡＲ－Ｔ（ｈＥｖａ１ＣＡＲ－Ｔ）の作製）
　次に、上述のヒト化抗体配列を用いて合計６種類のＥｖａ１ＣＡＲ－Ｔを作製した。具体的には、Ｌ２－ｌｉｎｋｅｒ－Ｈ（Ｌ２Ｈ２），　Ｈ２－ｌｉｎｋｅｒ－Ｌ２（Ｈ２Ｌ２），Ｌ４－ｌｉｎｋｅｒ－Ｈ（Ｌ４Ｈ２），　Ｈ２－ｌｉｎｋｅｒ－Ｌ４（Ｈ２Ｌ４），Ｌ４－ｌｉｎｋｅｒ－Ｈ３（Ｌ４Ｈ３），Ｈ３－ｌｉｎｋｅｒ－Ｌ４（Ｈ３Ｌ４）の６種類に関し、それぞれ２３２ａａのスペーサーを持つＣＡＲを設計した。そして、これらＣＡＲをコードするＤＮＡを各々プラスミドに組み込み、上記同様にレトロウイルスを作製し、遺伝子導入を行った。
　（６種類の抗ヒトＥｖａ１ヒト化抗体を用いたｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの作製における、遺伝子導入効率）
　このようにして行った、Ｄａｙ７における遺伝子導入効率（ＥＧＦＲ染色）を、図４Ａに示す。当該図に示すとおり、Ｌ２Ｈ２，Ｌ４Ｈ３を用いた場合、他の４種類よりも遺伝子導入効率が高いことが明らかになった（ｎ＝４、異なる４人のドナー由来末梢血からＣＡＲ－Ｔを作製）。
　（６種類の抗Ｅｖａ１ヒト化抗体を用いたｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの増幅効率（ＣＤ３／ＣＤ２８　ｂｅａｄｓ刺激））
　前記にて作製したｈＥｖａ１ＣＡＲ－Ｔを、引き続きＣＤ３／ＣＤ２８　ｂｅａｄｓ刺激下、Ｄａｙ１７まで培養継続した時の増幅倍率を、図４Ｂに示す。当該図に示すとおり、ＣＤ３／ＣＤ２８　ｂｅａｄｓ刺激による増幅効率において、Ｌ２Ｈ２，Ｈ２Ｌ２，Ｈ２Ｌ４を用いた場合、他の３種類よりも良好であった（ｎ＝５、異なる５人のドナー由来末梢血からＣＡＲ－Ｔを作製）。
　（６種類の抗Ｅｖａ１ヒト化抗体を用いたｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔのサイトカイン産生能）
　Ｄａｙ１７のｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを用いて実験を行なった。具体的には、腫瘍細胞株と１：１で共培養し、６時間後に上記同様に細胞を固定・染色し細胞内ＩＦＮ－ｇａｍｍａ，ＩＬ－２をフローサイトメトリーで評価した。得られた結果を図４Ｃ及び４Ｄに示す。これら図においては、ＣＤ８陽性細胞のうち各サイトカインが陽性であった割合を示している。図４Ｃ及び４Ｄに示すとおり、それぞれのｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔごとに大きな違いは見られなかったが、Ｌ２Ｈ２を用いたＣＡＲ－Ｔにおいて、Ｅｖａ１陰性細胞株であるＯＶＴＯＫＯに対するサイトカイン産生がもっとも低かった。
　（６種類の抗Ｅｖａ１ヒト化抗体を用いたｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの増幅効率（Ｅｖａ１刺激））
　上記同様にして、Ｅｖａ１陽性であるＨｕＣＣＴ－１に１００Ｇｙの放射線照射を行い、ｈＥｖａ１ＣＡＲ－Ｔ細胞と１：１で共培養を行った。得られた結果を図４Ｅに示す。当該図において、左側はＩＬ－２非存在下での培養結果を示し、右側はＤａｙ１，４，７と３日に１回ＩＬ－２　５０Ｕ／ｍｌを添加して培養した結果を示す。図４Ｅに示すとおり、いずれもＬ２Ｈ２を用いたＣＡＲ－Ｔが最も良好な刺激後増幅を示した（ｎ＝５、異なる５人のドナー由来末梢血からＣＡＲ－Ｔを作製）。
　（Ｌ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの細胞内ドメインの検討）
　以上のとおり、ヒト化抗体を用いたＣＡＲに関し、Ｌ２Ｈ２を用いたＣＡＲ－Ｔが抗原特異性及び細胞増殖において優れていた。また、実施例２に示すとおり、マウス由来抗体を用いたＣＡＲに関し、ＩＬ－２非存在下での培養ではスペーサー長が２３２ａａのＣＡＲ－Ｔが、細胞増殖及びサイトカイン産生において最も良かった。一方、ＩＬ－２存在下での培養では１５ａａのスペーサーを持つＣＡＲ－Ｔの細胞増殖が最も良かった。
　そこで次に、図４Ｆに示すとおり、Ｌ２Ｈ２からなる単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）と２つのスペーサー長のスペーサー（Ｓ：ｓｈｏｒｔ　ｓｐａｃｅｒ，Ｌ：ｌｏｎｇ　ｓｐａｃｅｒ）を介して３種類の細胞内ドメイン（ＣＤ２８ＩＣ，４－１ＢＢＩＣ，ＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０ＩＣ）を繋いだ６種類のＣＡＲ－Ｔを作製した。
　（６種類のｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの作製における遺伝子導入効率）
　前記６種類のＣＡＲ－Ｔ作製において、Ｄａｙ７における遺伝子導入効率（ＥＧＦＲ染色）を、図４Ｇに示す。当該図に示すとおり、４－１ＢＢ－Ｌ，ＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０－Ｌの場合、遺伝子導入効率が高かった。また上記同様、短いスペーサー（Ｓ）よりも長いスペーサー（Ｌ）をもつＣＡＲの方が遺伝子導入効率が高いことがここでも再現された（ｎ＝５、異なる５人のドナー由来末梢血からＣＡＲ－Ｔを作製）。
　（６種類のＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔのサイトカイン産生能）
　前記Ｄａｙ１７のｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを用いて実験を行なった。具体的には、腫瘍細胞株と１：１で共培養し、４時間後に上記同様に細胞を固定・染色し、細胞内ＩＦＮ－ｇａｍｍａ，ＩＬ－２をフローサイトメトリーで評価した。得られた結果を図４Ｈ及び４Ｉに示す。これら図においては、ＣＤ８陽性細胞のうち各サイトカインが陽性であった割合を示している。図４Ｈ及び４Ｉに示すとおり、それぞれのｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔごとに大きな違いは見られなかったが、短いスペーサーよりも長いスペーサーをもつＣＡＲの方がサイトカイン産生能が高いことがここでも再現された（ｎ＝５、異なる５人のドナー由来末梢血からＣＡＲ－Ｔを作製）。
　（６種類のＬ２Ｈ２　Ｅｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの刺激後増幅効率（Ｅｖａ１刺激））
　上記同様にＥｖａ１陽性であるＨｕＣＣＴ－１に１００Ｇｙの放射線照射を行い、ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔと１：１で共培養を行った。得られた結果を図４Ｊに示す。当該図において、左側はＩＬ－２非存在下での培養結果を示し、右側はＤａｙ１，４，７と３日に１回ＩＬ－２　５０Ｕ／ｍｌを添加して培養した結果を示す。図４Ｊに示すとおり、いずれも４－１ＢＢ，ＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０のｓｈｏｒｔ，ｌｏｎｇどちらもほとんど同等に良い結果を示した（ｎ＝５、異なる５人のドナー由来末梢血からＣＡＲ－Ｔを作製）。
　（６種類のＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを用いた共培養試験）
　Ｌ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔと放射線照射していないＲＰＭＩ－８２２６（Ｍｙｅｌｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）をＥ：Ｔ比＝１：１６で共培養を行った。ＲＰＭＩ－８２２６をＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔで標識してから培養を開始し、ＲＰＭＩ８２２６とＣＡＲ－Ｔを判別可能にした。培養開始から４８時間、７２時間、９６時間後に一部を採取してフローサイトメトリーを用いて解析を行った。得られた結果を図４Ｋに示す。当該図において、全細胞に占める腫瘍細胞の割合を示す。なお、ｔＥＧＦＲはｔＥＧＦＲだけを遺伝子導入したＭｏｃｋ　ＣＡＲ－Ｔ細胞であるため、腫瘍細胞は増え続けている。細胞内ドメインごとの明らかな差は見られていない。
　（６種類のＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１ＣＡＲ－Ｔを用いた細胞傷害試験（クロム放出試験））
　Ｌ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔと５１Ｃｒで標識した各種腫瘍細胞株とを４時間共培養して、上清中に放出された５１Ｃｒを測定することで傷害された細胞の割合を調べた（クロム放出試験）。Ｅ：Ｔ比は１０：１、３：１、１：１とした。得られた結果を図４Ｌ及び４Ｍに示す。図４Ｌに示すとおり、Ｅｖａ１陽性と見られる細胞株に対しては、ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔによる有意な傷害活性が認められた。なお、それぞれの細胞内ドメインによる明確な差は認められなかった。また、図４Ｍに示すとおり、各細胞株のＥｖａ１－ＭＦＩを横軸にとると、ＭＦＩとの相関が見られた。
　以上のとおり、抗原認識部位をＬ２Ｈ２とするｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔに関し、細胞内ドメインの差による反応性の違いを評価した。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞増殖、サイトカイン放出、細胞傷害活性を確認した結果、細胞増殖において４－１ＢＢ、ＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０の細胞内ドメインを持つＣＡＲが優れることがわかった。
　（担がんモデルを用いた、ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔによる抗腫瘍活性の評価）
　異なる２人のドナー由来末梢血から作製したＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを用いて、抗がん効果を評価した。具体的には以下のようにして行った。
　７週齢のＮＯＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＳｈｉＪｉｃ）に、１ｘ１０６個のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が各々導入してあるＣＦＰＡＣ１細胞（ヒト膵がん細胞株）又はＨ１９７５（ヒト肺腺癌細胞株）を、腹腔内接種した。２週間後、２×１０６個のｔＥＧＦＲ導入細胞（ｔＥＧＦＲだけを遺伝子導入したＭｏｃｋ　ＣＡＲ－Ｔ細胞、コントロール）又はＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを尾静脈経由で静脈内投与を行うことによって、当該ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍活性を評価した。当該評価において、生物発光イメージング（ＢＬＩ）を、ＩＶＩＳスペクトラムシステムを用いて、腫瘍の進行を評価するために実施した。得られた結果を図４Ｎ～４Ｑに示す。また並行して体重測定を実施した。
　また、上記で用いた２人とは異なる別のドナーに由来する末梢血から作製したＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを用い、胆管がんに対する抗がん効果も評価した。
　具体的には先ず、７週齢のＮＯＧマウスに、２ｘ１０６個のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子導入ＨｕＣＣＴ細胞（ヒト胆管がん細胞株）を皮下移植した。２週間後、腫瘍径と体重を測定した上で、２×１０６個又は５×１０６個の、ｔＥＧＦＲ導入細胞（コントロール）又はＬ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔを、尾静脈経由で静脈内投与を行うことによって、上記同様、ＢＬＩを指標として、当該ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍活性を評価した。腫瘍体積は、ノギスを用い皮下腫瘍の長径と短径を測定し、「腫瘍の長径×短径×短径×１／２」により算出した。得られた結果を図４Ｒ及び４Ｓに示す。また並行して体重測定も実施した。
　なお、上記いずれの担がんモデルへの投与例において、Ｌ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲとして、抗原認識部位（Ｌ２Ｈ２）と、膜貫通・細胞内ドメイン（４－１ＢＢ又はＣＤ７９Ａ／ＣＤ４０を含むドメイン）とを、上記短いスペーサーで繋いだものを用いた。また、かかるＣＡＲを発現するT細胞は、上記と同様の方法にて作製し、図３Ｂにおける１０日目に、ビーズによる再刺激を行わず、培地を細胞保存液（Ｃｅｌｌ　ｂａｎｋｅｒ）に置換し、液体窒素中で保存した。その凍結ＣＡＲ－Ｔを融解して一晩培養した後、ビーズで再刺激を行い、ビーズ刺激から１週間後に、上記のとおり担がんマウスに投与した。
　図４Ｎ～４Ｓに示した結果から明らかなように、膵がん、肺がん、胆管がんのいずれに対しても、Ｌ２Ｈ２　ｈＥｖａ１－ＣＡＲ－Ｔの抗がん効果が確認された。また、図には示していないが、投与期間中における各マウスの体重変化において、異常及び顕著な差はなく、投与対象における悪影響は認められなかった。
　＜実施例３＞　抗ヒトＥｖａ１ヒト化抗体を含む、抗体薬物複合体
　上述のヒト化Ｂ２Ｅ５－４８抗体　Ｈ２‐Ｌ２（以下、Ｂ２Ｅ５－Ｈ２‐Ｌ２とも称する）を用い、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を製造した。
　具体的には先ず、ｐｃＤＮＡ３．４を用い、Ｂ２Ｅ５－Ｌ２発現用ベクター　ＴＰＧ９８６とＢ２Ｅ５－Ｈ２発現用ベクター　ＴＰＧ９８７を作製した。それぞれＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に導入して発現させ、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ　Ｘｔｒａ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ）を用いて精製した。
　次に、前記ベクター及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ　ＣＨＯ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍを用い、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞において、Ｂ２Ｅ５－Ｈ２‐Ｌ２を一過的に発現させた。そして、得られた培養上清を、ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムに通し、抗体を吸着させた。低ｐＨで溶出させた後中和し、続いてＣａｐｔｏ　ａｄｈｅｒｅで精製した後、限外ろ過を行った。なお、得られた抗体につき、分子量、配列、Ｅｖａ１に対する結合能を確認した。
　次に、図５に示すとおり、Ｂ２Ｅ５－Ｈ２‐Ｌ２にリンカー（ＳＭＣＣ）を反応させ、当該抗体にＭＣＣ基を導入した。そして、当該リンカーとＤＭ１とを反応させた。
　具体的には先ず、前記にて調製したＢ２Ｅ５－Ｈ２‐Ｌ２の溶媒をＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡにバッファー交換した。次いでＳＭＣＣ（１．８４ｍｇ）のＤＭＳＯ溶液（０．４０ｍＬ；抗体一分子に対して約５．１当量相当）を室温で添加し、反応溶液の抗体濃度を２０ｍｇ／ｍＬに調整してチューブ・ローテーターを用いて室温で２時間反応させた。この反応液を精製し、ＳＭＣＣ誘導化された抗体を得た。
　次に、前記溶液に、ＰＢＳ６．５／ＥＤＴＡ（２．５６ｍＬ）及びＮ２－デアセチル－Ｎ２－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）－メイタンシン（４．６７ｍｇ；ＤＭ１、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、４９巻、１４号、４３９２項）のＤＭＡ（ジメチルアセトアミド）溶液（０．９３ｍＬ；ＳＭＣＣ誘導化された抗体一分子に対して約５．８当量相当）を室温で添加し、反応溶液の抗体濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整してチューブ・ローテーターを用いて室温で１６．５時間反応、精製し、目的の化合物を含有する溶液を得た。次いで、精製し余分な成分を除去した後、９．０ｇ／Ｌの濃度で６％　ｓｕｃｒｏｓｅ、０．０２％　Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓｕｃｃｉｎａｔｅ溶液（ｐＨ５．０）中に保存した。
　そして、ＡＤＣの分子量、配列、Ｅｖａ１に対する結合能、薬物抗体比（ＤＡＲ）等を確認した。なお、ＤＡＲは、ＤＭ１の吸収のピークである２５２ｎｍの吸光度と抗体の吸収のピークである２８０ｎｍの吸光度を測定し、それぞれがお互いの吸収ピークに与える影響を加味して連立方程式を立て計算することで、抗体とＤＭ１の濃度を求め、分子数の比を決定することにより求めた。結果、上記にて作製したＡＤＣにおけるＤＡＲは３．８であった。
　＜実施例４＞　抗体薬物複合体の抗腫瘍活性
　前記にて調製した、抗ヒトＥｖａ１ヒト化抗体を含むＡＤＣ（Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣ）の抗腫瘍活性を、以下のとおりにして評価した。
　（Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣのグリオーマに対する細胞傷害実験）
　９６－ｗｅｌｌ　ｄｉｓｈに、１ｗｅｌｌ当り１０００細胞のヒトグリオーマ幹細胞（ｈＧＩＣ）を播種した。次に、２倍段階希釈したＢ２Ｅ５－Ｈ２‐Ｌ２、Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣ又はＫａｄｃｙｌａ（トラスツズマブーエムタンシン）を、１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し。３７℃のＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。そして、各ｗｅｌｌに５μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ、和光純薬）を添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で２時間培養した。培養液を廃棄後、９０μｌのＤＭＳＯを添加し、細胞を溶解後にベンチマーク（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて吸光度（５７０ｎｍ）を測定した。得られた結果を図６Ａに示す。
　なお、ポジティブコントロール（１００％）として、抗体非存在下のｗｅｌｌにおける測定値を用いた。また、ネガティブコントロール（０％）として、抗体非存在下のｗｅｌｌに５μｌの１％　ＴｒｉｔｏｎＸ１００を添加して得られた測定値を用いた。
　（Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣの膵がんに対する細胞傷害実験）
　トリプシン処理により培養ディッシュから回収した膵がん細胞株（ＢｘＰＣ３）を５× １０の４乗 ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈し、９６穴プレートに各ウェル１００μＬずつ播種し、ＣＯ２インキュベーター内（３７℃、ＣＯ２濃度５％）で２４時間培養した。培地（ＲＰＭＩ－１６４０、Ｗａｋｏ１８７－０２７０５、１０％ＦＢＳ）をアスピレーターで吸引し、新鮮な培地を各ウェル９００μＬずつ加えた。ＤＭ１及びＢ２Ｅ５－ＡＤＣ各々を、ＰＢＳで希釈（ＤＭ１：３８００ｎＭ～０．９３ｎＭ、Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣ：１０００ｎＭ～０．２４ｎＭ）し、１０μＬずつＢｘＰＣ３に加えた。ＣＯ２インキュベーター内で４８時間培養した後、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ＬＤＨ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ－ＷＳＴ（同仁化学）を使用し、死細胞から放出されたＬＤＨを測定した。得られた結果を図６Ｂに示す。
　（Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣの胃がんに対する細胞傷害実験）
　１０ｃｍ細胞培養ディッシュにて培養した胃がん細胞株（ＭＫＮ７４）に、２．５ｇ／Ｌ－トリプシン／１ｍｍｏｌ／Ｌ－ＥＤＴＡ溶液，フェノールレッド含有［ナカライテスク　３２７７７－１５］を１ｍＬ加え、３７℃に５分置いた後、培地を３ｍＬ加え、１５ｍＬ遠沈管へと回収した。１２００ｒｐｍで５分間遠心し、アスピレータで培地を吸引し、新しい培地を加えて再懸濁した。トリパンブルーを用いて１μＬあたりの細胞数を数え、３００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう調整した。
　９６穴培養プレートに１００μＬ（３０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）ずつ播種し、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。アスピレータで培地を吸引し、新鮮な培地を各ウェル９０μＬずつ加えた。ＰＢＳを使って、Ｂ２Ｅ５－Ｈ２‐Ｌ２及びＢ２Ｅ５－ＡＤＣを各々段階希釈（６．５μｇ／ｍＬ～）し、各ウェルに１０μＬずつ加え、ＣＯ２インキュベーター内で７２時間培養した。そして、生細胞測定試薬［ナカライテスク　０７５５３－４４］を各ウェル１０μＬ加えＣＯ２インキュベーター内で３時間培養した後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定結果をもとにＩｍａｇｅＪでフィッティングを行いグラフを作成し、Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣの胃がんに対する細胞傷害性を評価した。得られた結果を図６Ｃに示す。
　（Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣ単回投与マウス毒性試験）
　９～１０週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（日本クレア）又は１０週齢の雄ヌードマウス（ＳＫＮ／ｓｌｃ、日本ＳＬＣ）に、尾静脈又は腰椎穿刺によって、Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣ（１００、３３、１０μｇ）を単回投与した（各投与濃度につき３個体用意した）、経時的に体重を測定した。得られた結果を図７に示す。
　（Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣを用いた実験結果のまとめ）
　図６Ａに示すとおり、Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣは濃度依存的にｈＧＩＣに対して傷害活性を示した。一方、Ｂ２Ｅ５－Ｈ２‐Ｌ２及びＫａｄｃｙｌａはｈＧＩＣに対する傷害活性が認められなかった。さらに、図６Ｂ及び６Ｃに示すとおり、前記グリオーマのみならず、膵がん及び胃がんに対しても、Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣの抗腫瘍活性が認められた。
　一方、Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣのマウスに対する毒性試験を行った結果、図７に示すとおり、Ｂ２Ｅ５－ＡＤＣ投与によるマウスへの影響は観察されず、投与後１ヶ月以上の生存が確認された。
　以上説明したように、本発明によれば、ヒトＥｖａ１を標的とすることによって、高い抗腫瘍活性を奏することが可能となる。よって、本発明は、がんを治療又は予防するための薬剤等として有用である。

Claims (15)

  1. 　配列番号：１に記載のアミノ酸配列、Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒからなるアミノ酸配列及び配列番号：３に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４～６に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域とを有し、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する、ヒト化抗体又はその機能的断片。
  2. 　前記軽鎖可変領域が、配列番号：７～１０に記載のアミノ酸配列、配列番号：７～１０に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：７～１０に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
    　前記重鎖可変領域が、配列番号：１３～１６に記載のアミノ酸配列、配列番号：１３～１６に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１３～１６に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体又はその機能的断片。
  3. 　前記軽鎖可変領域が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列、配列番号：７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：７に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
    　前記重鎖可変領域が、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体又はその機能的断片。
  4. 　請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片と、薬物とを結合させてなる、抗体薬物複合体。
  5. 　請求項４に記載の抗体薬物複合体を含む、医薬組成物。
  6. 　ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル領域とを含む、キメラ抗原受容体。
  7. 　前記ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する領域が、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片を含む領域である、請求項６に記載のキメラ抗原受容体。
  8. 　前記ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する領域が、アミノ末端側から順に、軽鎖可変領域と、リンカーと、重鎖可変領域とが結合してなる、単鎖可変領域断片を含み、
    　前記軽鎖可変領域が、
    配列番号：１に記載のアミノ酸配列、Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒからなるアミノ酸配列及び配列番号：３に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含み、かつ
    配列番号：７に記載のアミノ酸配列、配列番号：７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：７に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含み、
    　前記重鎖可変領域が、
    配列番号：４～６に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含み、かつ
    配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列から選択される１のアミノ酸配列を含む、
    請求項６に記載のキメラ抗原受容体。
  9. 　前記ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する領域と、前記膜貫通領域とが、１０～３００個のアミノ酸からなるスペーサーを介して結合している、請求項６～８のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
  10. 　前記細胞内シグナル領域が、ＣＤ７９Ａ細胞内領域及びＣＤ４０細胞内領域を含む、請求項６～９のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
  11. 　請求項６～１０のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド。
  12. 　請求項１１に記載のヌクレオチドを含むベクター。
  13. 　請求項６～１０のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
  14. 　免疫細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  15. 　請求項１３又は１４に記載の細胞を含む、医薬組成物。
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JAKRAWADEE JULAMANEE, SEITARO TERAKURA, KOJI UMEMURA, YOSHITAKA ADACHI, KOTARO MIYAO, SHINGO OKUNO, ERINA TAKAGI, TOSHIYASU SAKAI,: "Composite CD79A/CD40 co-stimulatory endodomain enhances CD19CAR-T cell proliferation and survival", MOLECULAR THERAPY, ELSEVIER INC., US, vol. 29, no. 9, 1 September 2021 (2021-09-01), US , pages 2677 - 2690, XP009536484, ISSN: 1525-0016, DOI: 10.1016/j.ymthe.2021.04.038 *

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