WO2023171009A1 - Eva1タンパク質に結合する、ヒト化抗体又はその機能的断片、抗体薬物複合体及びキメラ抗原受容体 - Google Patents

Eva1タンパク質に結合する、ヒト化抗体又はその機能的断片、抗体薬物複合体及びキメラ抗原受容体 Download PDF

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antibody
seq
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眞弘 道下
亨 近藤
精太郎 寺倉
正英 尾▲崎▼
仁 清井
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株式会社Cured
国立大学法人北海道大学
国立大学法人東海国立大学機構
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    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a humanized antibody or a functional fragment thereof that binds to human-derived Eva1 protein (human Eva1).
  • the invention also relates to antibody-drug conjugates comprising the humanized antibodies or functional fragments thereof.
  • the present invention relates to chimeric antigen receptors comprising antibodies or functional fragments thereof that bind to human Eva1.
  • cancer stem cells have become important in the development of radical treatments for cancer. Although cancer stem cells exist in only a small portion of cancer tissues, they are thought to be the source of the creation of the majority of cancer cells by repeating self-renewal and further differentiation. . Furthermore, while having such strong tumor-forming ability, cancer stem cells have been suggested to have strong resistance to chemotherapy and radiotherapy. Therefore, even if most cancer cells in a cancer tissue can be killed by chemotherapy or radiotherapy, cancer stem cells remain, resulting in cancer recurrence, metastasis, etc. However, if cancer stem cells can be targeted and killed, it is expected that this will lead to the development of treatments that are useful in preventing cancer metastasis and recurrence.
  • Eva1 protein As a protein highly expressed in glioma and its cancer stem cells. Furthermore, the expression of this Eva1 protein is correlated with the malignancy of glioma, and it has been revealed that there is a strong correlation between the survival rate of glioma patients and the expression of the Eva1 gene in gliomas derived from that patient. . It has also been found that suppression of Eva1 gene function is effective in suppressing the proliferation, tumor formation and tissue invasion abilities of glioma cells, and the tumor mass forming ability of glioma stem cells (Patent Document 1).
  • glioblastoma multiforme GBM
  • temozolomide is used as a standard treatment for malignant glioma
  • the inventors have confirmed that glioma stem cells are insensitive even to temozolomide at several times the effective blood concentration.
  • cancer cells exposed to such chemotherapeutic agents develop resistance not only to glioma but also to other chemotherapeutic agents, and often develop cross-resistance to multiple other chemotherapeutic agents as well.
  • chemotherapeutic agents often cause cytotoxicity even to normal cells, and the dosage or usage of chemotherapeutic agents is often restricted in order to reduce such side effects.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • ADC antibody-drug conjugate
  • cancer-specific antigen has the activity of inducing cell death
  • administration of an antibody with agonistic activity may be effective.
  • cancer growth can be expected to stop or regress due to the accumulation of tumor-specific antibodies and antibody activity.
  • T cells CAR-T
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the cells can be used to target antigen-positive cancer cells in an HLA-independent manner. It is also expected to be activated and induce cell death.
  • An object of the present invention is to provide an antibody or a functional fragment thereof, or a complex containing the antibody or a functional fragment thereof, which is useful for the treatment of cancer.
  • the present inventors attempted to humanize an anti-human Eva1 mouse antibody (B2E5-48 mouse antibody described in Patent Document 2), and found that four types of humanized heavy chain variable regions (H1 to H4) and light chain Sixteen types of humanized antibodies were created by combining four types of variable regions (L1 to L4). As a result, we succeeded in obtaining humanized antibodies (combinations of H2-L2, H2-L4, H3-L4, etc.) that have high binding affinity for Eva1 protein and high production ability (antibody titer).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • an antibody-drug conjugate (ADC) containing the above humanized antibody was produced and its effectiveness was evaluated.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the antitumor activity of the ADC against various tumors such as glioma, pancreatic cancer, and gastric cancer was observed.
  • no adverse effects (decreased body weight, shortened survival period, etc.) on the administered organisms were observed.
  • the present invention is based on the above study results, and more specifically provides the following aspects.
  • a light chain variable region comprising complementarity determining regions 1 to 3 each containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence consisting of Val-Thr-Ser, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3,
  • a humanized antibody or a functional fragment thereof which has a heavy chain variable region comprising complementarity determining regions 1 to 3 each containing the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4 to 6, and which binds to human-derived Eva1 protein.
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 7 to 10, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 7 to 10, and a sequence. Contains one amino acid sequence selected from the amino acid sequences in which one or several amino acids are substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of the amino acid sequences set forth in numbers 7 to 10,
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 to 16, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 to 16, and SEQ ID NO: 13.
  • amino acid sequence according to ⁇ 1> comprising one amino acid sequence selected from the amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added, and/or inserted in at least one of the amino acid sequences described in Humanized antibody or functional fragment thereof.
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
  • the humanized antibody according to ⁇ 1> or its function which comprises one amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of the sequences. fragment.
  • ⁇ 4> An antibody-drug complex obtained by binding the antibody or functional fragment thereof according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> and a drug.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody-drug conjugate according to ⁇ 4>.
  • a chimeric antigen receptor comprising a region that binds to human-derived Eva1 protein, a transmembrane region, and an intracellular signal region.
  • ⁇ 7> The region according to ⁇ 6>, wherein the region that binds to the human-derived Eva1 protein is a region containing the antibody according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> or a functional fragment thereof. Chimeric antigen receptor.
  • the region that binds to the human-derived Eva1 protein includes a single chain variable region fragment formed by binding a light chain variable region, a linker, and a heavy chain variable region in order from the amino terminal side,
  • the light chain variable region is Complementarity determining regions 1 to 3 each containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence consisting of Val-Thr-Ser, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • the heavy chain variable region is Complementarity determining regions 1 to 3 containing the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4 to 6, respectively, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and 80% or more of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13. and an amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 13. containing the amino acid sequence of The chimeric antigen receptor according to ⁇ 6>.
  • ⁇ 9> Any of ⁇ 6> to ⁇ 8>, wherein the human-derived Eva1 protein-binding region and the transmembrane region are bonded via a spacer consisting of 10 to 300 amino acids.
  • ⁇ 10> The chimeric antigen receptor according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 9>, wherein the intracellular signal region includes a CD79A intracellular region and a CD40 intracellular region.
  • ⁇ 11> A nucleotide encoding the chimeric antigen receptor according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 10>.
  • ⁇ 12> A vector comprising the nucleotide according to ⁇ 11>.
  • ⁇ 13> A cell expressing the chimeric antigen receptor according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 10>.
  • ⁇ 14> The cell according to ⁇ 13>, which is an immune cell.
  • a pharmaceutical composition comprising the cell according to ⁇ 13> or ⁇ 14>.
  • SEQ ID NO: 2 is intended to be the amino acid sequence of CDR2 of Light Chain (Humanized B2E5-48) (amino acid sequence consisting of valine-threonine-serine in order from the N-terminus) ( (See also Table 7). However, since this sequence is a sequence of less than four (3) amino acids, it is treated as an "intentionally skipped sequence" in the sequence listing.
  • FIG. 2 is a diagram showing an overview of a chimeric antigen receptor (Eva1-CAR) using an anti-Eva1 antibody sequence.
  • FIG. 1 is a diagram showing an overview of the production schedule of Eva1-CAR-expressing T cells (Eva1-CAR-T).
  • FIG. 2 is a dot plot diagram showing the results of analyzing the efficiency of introduction of the Eva1-CAR gene before selection using tEGFR expression as an index (tEGFR selection).
  • FIG. 2 is a dot plot diagram showing the results of analyzing the efficiency of Eva1-CAR gene introduction before tEGFR selection.
  • each dot indicates the origin (5 healthy individuals) of the cells into which the Eva1-CAR gene was introduced.
  • the thick line indicates the mean value, and the whiskers indicate the standard error.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of analyzing cytokine (IFN- ⁇ ) production of Eva1-CAR-T against various tumor cells.
  • FIG. 1 cytokine
  • FIG. 2 is a diagram showing an overview of six types of spacers with different lengths in Eva1-CAR. Note that the notations "H00" to "H232" shown in FIG. 3F correspond to those in FIGS. 3G to 3M.
  • FIG. 2 is a dot plot diagram showing the results of analyzing the efficiency of Eva1-CAR gene introduction before tEGFR selection. In the figure, each dot indicates the origin (5 healthy individuals) of the cells into which the Eva1-CAR gene was introduced.
  • FIG. 3 is a dot plot diagram showing the results of analyzing the efficiency of Eva1-CAR gene introduction after tEGFR selection. In the figure, each dot indicates the origin (5 healthy individuals) of the cells into which the Eva1-CAR gene was introduced. The thick line indicates the mean value, and the whiskers indicate the standard error.
  • 1 is a graph showing the results of analyzing the cytokine production of Eva1-CAR-T in various tumor cells. In the figure, the graph on the left shows the results of analyzing IFN- ⁇ production, and the graph on the right shows the results of analyzing IL-2 production.
  • 1 is a graph showing the amplification efficiency of Eva1-CAR-T after antigen stimulation in the absence of IL-2.
  • the horizontal axis indicates the number of days after starting antigen stimulation (co-culture with Eva1-positive HuCCT-1).
  • the vertical axis shows the number of Eva1-CAR-T cells.
  • 1 is a graph showing the amplification efficiency of Eva1-CAR-T after antigen stimulation in the absence of IL-2.
  • the horizontal axis indicates the type of CAR introduced.
  • the vertical axis shows the number of Eva1-CAR-T cells.
  • 1 is a graph showing the amplification efficiency of Eva1-CAR-T after antigen stimulation in the presence of IL-2.
  • the horizontal axis indicates the number of days after starting antigen stimulation (co-culture with Eva1-positive HuCCT-1).
  • the vertical axis shows the number of Eva1-CAR-T cells.
  • 1 is a graph showing the amplification efficiency of Eva1-CAR-T after antigen stimulation in the presence of IL-2.
  • the horizontal axis indicates the type of CAR introduced.
  • the vertical axis shows the number of Eva1-CAR-T cells.
  • FIG. 2 is a dot plot diagram showing the results of analyzing the efficiency of Eva1-CAR (hEva1-CAR) gene introduction using an anti-Eva1 humanized antibody sequence before tEGFR selection.
  • each dot indicates the origin (four healthy individuals) of the cells into which the hEva1-CAR gene was introduced.
  • the whiskers indicate the standard error, and the line in the middle between the whiskers indicates the mean value.
  • It is a dot plot diagram showing the results of analyzing the amplification efficiency of hEva1-CAR-T after tEGFR selection.
  • each dot indicates the origin (four healthy individuals) of the cells into which the hEva1-CAR gene was introduced.
  • the whiskers indicate the standard error, and the line in the middle between the whiskers indicates the mean value.
  • 2 is a graph showing the results of analysis of IFN- ⁇ production of hEva1-CAR-T in various tumor cells. For each Eva1-CAR introduced, the results for HuCCT-1, CFPAC-1, HepG2, and OVTOKO are shown in order from the left. 1 is a graph showing the results of analyzing IL-2 production of hEva1-CAR-T in various tumor cells. For each Eva1-CAR introduced, the results for HuCCT-1, CFPAC-1, HepG2, and OVTOKO are shown in order from the left. It is a graph showing the amplification efficiency of hEva1-CAR-T after antigen stimulation.
  • FIG. 2 is a diagram showing an overview of six types of hEva1-CAR-T (antigen recognition site: L2H2) with different intracellular domains and spacer lengths. It is a dot plot diagram showing the results of analyzing the efficiency of hEva1-CAR gene introduction before tEGFR selection.
  • each dot indicates the origin (5 healthy individuals) of the cells into which the hEva1-CAR gene was introduced.
  • the middle line shows the average value.
  • "28", “41” and “79” on the horizontal axis indicate that the intracellular domains of each CAR are “CD28IC”, “4-1BBIC” and “CD79A/CD40IC”, respectively.
  • "-S” and “-L” indicate that the spacers are "H15” and "H232" shown in FIG. 4F, respectively.
  • 2 is a graph showing the results of analysis of IFN- ⁇ production of hEva1-CAR-T in various tumor cells.
  • the graph on the left shows the results in the absence of IL-2
  • the graph on the right shows the results in the presence of IL-2.
  • the horizontal axis indicates the number of days after starting antigen stimulation (co-culture with Eva1-positive HuCCT-1).
  • the vertical axis shows the number of hEva1-CAR-T cells.
  • “28", “41” and “79” in the legend indicate that the intracellular domains of each CAR are "CD28IC”, “4-1BBIC” and “CD79A/CD40IC”, respectively.
  • “-S” and “-L” indicate that the spacers are "H15” and "H232" shown in FIG. 4F, respectively.
  • FIG. 4F This is a graph showing the results of co-culturing hEva1-CAR-T and various tumor cell lines labeled with 51 Cr and analyzing the cytotoxic activity.
  • the vertical axis shows the percentage of injured cells based on the amount of 51 Cr released in the culture supernatant.
  • various tumor cell lines are shown together with whether Eva1 expression is negative or positive.
  • "41” and “79” in the legend indicate that the intracellular domains of each CAR are "4-1BBIC” and "CD79A/CD40IC", respectively.
  • 4L is a graph showing the results of analyzing the correlation between the expression level of human Eva1 in various tumor cell lines and the cytotoxic activity of hEva1-CAR-T against various tumor cell lines, based on the results shown in FIG. 4L.
  • the vertical axis shows the percentage of injured cells based on the amount of 51 Cr released in the culture supernatant.
  • the horizontal axis shows the mean fluorescence intensity (MFI) obtained by flow cytometry analysis using an anti-human Eva1 antibody in various tumor cell lines, which correlates with the expression level of Eva1.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • FIG. 4F A mouse carrying a human lung adenocarcinoma cell line (H1975) into which the firefly luciferase gene has been introduced with L2H2 hEva1-CAR-T produced from peripheral blood derived from two different donors (donor A and donor B).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of analyzing the antitumor activity of the CAR-T by bioluminescence imaging.
  • L2H2 hEva1-CAR the antigen recognition site (L2H2) and the transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) are combined with a short spacer (indicated by "short hinge” in the figure, Figure 4F “H15” shown in Figure 1) was used.
  • a short hinge in the figure, Figure 4F "H15" shown in Figure 1
  • tEGFR-introduced cells Mock CAR-T cells into which only tEGFR was introduced
  • Day indicates the number of days after administration of CAR-T.
  • FIGS. 4P and 4R A mouse carrying a human pancreatic cancer cell line (CFPAC1) into which the firefly luciferase gene has been introduced with L2H2 hEva1-CAR-T produced from peripheral blood derived from two different donors (donor A and donor B).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of analyzing the antitumor activity of the CAR-T by bioluminescence imaging.
  • L2H2 hEva1-CAR one in which an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR-T produced from peripheral blood derived from two different donors (donor A, donor B) was used in a human pancreatic cancer cell line (CFPAC1) or human lung gland into which the firefly luciferase gene has been introduced.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of analyzing the antitumor activity of CAR-T by introducing it into mice carrying a cancer cell line (H1975) and analyzing it by bioluminescence imaging.
  • L2H2 hEva1-CAR one in which an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR one in which an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR-T produced from peripheral blood derived from donor C was introduced into mice carrying a human cholangiocarcinoma cell line (HuCCT cells) into which the firefly luciferase gene had been introduced, and the CAR-T.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of analyzing antitumor activity by bioluminescence imaging.
  • L2H2 hEva1-CAR one in which an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR-T Shows the results of introducing and analyzing L2H2 hEva1-CAR-T produced from peripheral blood derived from donor C into mice carrying a human cholangiocarcinoma cell line (HuCCT cells) into which the firefly luciferase gene has been introduced. , is a diagram.
  • L2H2 hEva1-CAR one in which an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • L2H2 hEva1-CAR an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain) were connected by a short hinge was used.
  • an example of administration of tEGFR-transduced cells was also prepared and analyzed.
  • the graph on the left side of the figure shows the results (luminescence intensity) of the antitumor activity of the CAR-T analyzed over time by bioluminescence imaging.
  • the graph on the right shows the results of time-course analysis of tumor volume in cancer-bearing mice administered with the CAR-T.
  • B2E5-ADC antibody-drug conjugate
  • B2E5-ADC antibody-drug conjugate
  • hGIC E6, hGIC E16 results of a cytotoxicity experiment of B2E5-ADC against glioma
  • the vertical axis of each graph represents the survival rate of tumor cells
  • the horizontal axis represents the concentration of ADC or antibody added to the medium.
  • BxPC3 pancreatic cancer
  • the vertical axis of each graph indicates absorbance, which reflects the degree of damage in tumor cells.
  • the horizontal axis shows the concentration of ADC or drug (DM1) added to the medium. It is a graph showing the results of a cytotoxicity experiment of B2E5-ADC against gastric cancer (MKN74). In the figure, the vertical axis of each graph indicates the survival rate of tumor cells. The horizontal axis shows the concentration of ADC or antibody added to the medium. 1 is a graph showing the results of a toxicity test of B2E5-ADC on mice. More specifically, wild type (C57BL/6) or nude mice (SKN/slc) were injected with B2E5-ADC (100, 33, 10 ⁇ g) by intravenous injection or intrahecal injection. This is a graph showing changes in body weight over time in these mice after administration. In the figure, circles, triangles, and squares each represent data for one individual mouse.
  • the present invention relates to an antibody or a functional fragment thereof that binds to human-derived Eva1 protein (human Eva1).
  • Eva (Epithelial V-like antigen) 1 is a single-transmembrane cell membrane protein, and is a molecule involved in the cytoskeletal system, also called MPZL2 (Myelin protein Zero-like 2). If it is of human origin, it is typically a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54 (a protein encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 53). However, the DNA sequence of a gene is mutated in the natural world (ie, non-artificially) due to such mutations, and the amino acid sequence of the protein encoded by it is also modified accordingly. Therefore, the "Eva1 protein” according to the present invention is not limited to the protein consisting of the typical amino acid sequence, but also includes such natural variants.
  • Antibody in the present invention includes all classes and subclasses of immunoglobulins.
  • Antibody includes polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
  • a “polyclonal antibody” is an antibody preparation that includes different antibodies directed against different epitopes.
  • monoclonal antibody means an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies. In contrast to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies recognize a single determinant on an antigen.
  • the antibodies of the invention are preferably monoclonal antibodies.
  • Antibodies of the invention are antibodies that have been separated and/or recovered (ie, isolated) from components of their natural environment.
  • the reactivity of the antibody of the present invention to human Eva1 is preferably 10 ⁇ 6 or less, more preferably 6 ⁇ 10 ⁇ 7 or less in KD (dissociation constant) value.
  • "Reactivity” means binding affinity and/or specificity for the antigen human Eva1. Such reactivity can be evaluated by those skilled in the art by immunological techniques, and can be determined as a KD value by analysis using surface plasmon resonance, for example, as shown in the Examples below.
  • the antibody of the present invention can also be used to produce Eva1 proteins derived from other animals (for example, mouse Eva1 protein (typically a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 56, a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55). It may also be an antibody that binds to a protein encoded by the described nucleotide sequence.
  • mouse Eva1 protein typically a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 56, a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55. It may also be an antibody that binds to a protein encoded by the described nucleotide sequence.
  • the antibody of the present invention may have at least one cytotoxic activity selected from ADCC activity and CDC activity, or may have both ADCC activity and CDC activity.
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxic activity
  • effector cells immune cells such as NK cells and monocytes
  • CDC activity complement-dependent cytotoxic activity
  • CDC activity refers to an activity in which when an antibody binds to a target cell, the complement system is activated and, as a result, the target cell is lysed.
  • the antibody of the present invention is preferably an antibody that has ADCC activity against target cells expressing human Eva1 at 0.01 ⁇ g/mL. Whether or not the antibody of the present invention has such ADCC activity can be determined, for example, by the method described in the Example of Patent Document 2. More specifically, it can be determined by expressing human Eva1.
  • the ADCC activity when using 0.01 ⁇ g/mL of the antibody of the present invention is preferably such that the cell lysis rate is 30%. or more, more preferably 50% or more, still more preferably 70% or more.
  • the antibody of the present invention is an antibody that has CDC activity against target cells expressing human Eva1, preferably at 0.30 ⁇ g/mL, more preferably at 0.01 ⁇ g/mL. Whether or not the antibody of the present invention has such CDC activity can be determined, for example, by the method described in the Example of Patent Document 2. More specifically, it can be determined by expressing human Eva1.
  • the CDC activity when using the anti-Eva1 antibody of the present invention at 0.30 ⁇ g/mL is preferably such that the cell lysis rate is It is 20% or more, more preferably 40% or more, even more preferably 60% or more, and even more preferably 80% or more.
  • the antibodies of the present invention may also have antitumor activity.
  • antitumor activity refers to at least one of the following activities: suppressing cancer cell proliferation, inducing cancer cell death, and suppressing cancer cell metastasis. means.
  • Antitumor activity can be evaluated, for example, by analysis using a tumor-bearing model (such as a mouse inoculated with B16 melanoma cells) as described in Examples of Patent Document 2. More specifically, after B16 melanoma cells are intravenously administered to mice, anti-Eva1 antibodies are intravenously administered daily or every few days starting the next day or several weeks later.
  • the in vivo anticancer activity can be evaluated.
  • a control antibody having the same isotype may be administered, or PBS or the like may be administered. If the number of colonies formed in the anti-Eva1 antibody administration group is lower than that in the negative control administration group (when the number of colonies formed in the negative control administration group is taken as 100%, preferably 60% or less, more preferably 40%) (more preferably 20% or less, more preferably 10% or less), the anti-Eva1 antibody can be determined to have antitumor activity.
  • the antibody of the present invention only needs to have reactivity to human Eva1, and its origin, type, shape, etc. are not particularly limited. Specifically, antibodies derived from non-human animals (eg, mouse antibodies, rabbit antibodies, rat antibodies, camel antibodies), human-derived antibodies, chimeric antibodies, and humanized antibodies are included.
  • non-human animals eg, mouse antibodies, rabbit antibodies, rat antibodies, camel antibodies
  • human-derived antibodies e.g., human-derived antibodies, chimeric antibodies, and humanized antibodies are included.
  • the "antibody derived from a non-human animal” includes, for example, an antibody against human Eva1 that has the following variable region and is disclosed in Patent Document 2.
  • the present invention relates to an antibody against human Eva1, which carries, for example, the following CDRs.
  • CDRs Heavy chain CDRs 1 to 3 determined from the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27 and light chain determined from the light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 An antibody that retains CDR1-3.
  • Heavy chain CDRs 1 to 3 determined from the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 49 and light chain determined from the light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44.
  • an antibody against human Eva1 having the following CDR can be mentioned.
  • (a-2) Amino acid sequence and sequence that retain the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4 to 6 as heavy chain CDRs 1 to 3, respectively, and consist of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and Val-Thr-Ser.
  • antibodies that retain variable regions and/or CDRs consisting of such specific amino acid sequences but also antibodies that have modified amino acid sequences without reducing desired activities (antigen reactivity, etc.) Contains antibodies that have been tested.
  • Such amino acid sequence variants can be produced, for example, by introducing mutations into DNA encoding the above-mentioned variable regions, etc., or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, substitutions, deletions, additions and/or insertions of residues within the amino acid sequence of the antibody.
  • the site where the amino acid sequence of the antibody is modified may be the constant region of the heavy chain or light chain of the antibody, as long as it has an activity equivalent to that of the antibody before modification. ) and CDR).
  • the number of amino acids modified in the variable region is preferably 10 amino acids or less, more preferably 5 amino acids or less, and even more preferably 3 amino acids or less (for example, 2 amino acids or less, 1 amino acid). . Furthermore, all such modifications are preferably made in areas other than CDRs, that is, FRs, from the viewpoint of having little effect on reactivity with antigens. Further, the number of amino acids modified in a CDR is preferably 5 amino acids or less, more preferably 3 amino acids or less (for example, 2 amino acids or less, 1 amino acid).
  • Amino acid modifications are preferably conservative substitutions.
  • “conservative substitution” means substitution with another amino acid residue having a chemically similar side chain.
  • Groups of amino acid residues having chemically similar amino acid side chains are well known in the art to which this invention pertains.
  • acidic amino acids aspartic acid and glutamic acid
  • basic amino acids lysine, arginine, histidine
  • neutral amino acids include amino acids with hydrocarbon chains (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline), and hydroxy groups.
  • an antibody whose modified amino acid sequence has a variable region containing an amino acid sequence having 80% or more homology at the amino acid sequence level with a variable region consisting of the above-mentioned specific amino acid sequence is also an antibody before modification. It is included in the antibodies of the present invention as long as it has an activity equivalent to that of the antibody. Such homology may be at least 80%, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more (for example, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more). % or more). Furthermore, sequence homology can be determined using the BLASTP (amino acid level) program (Altschul et al. J. Mol.
  • "having the same activity” means, for example, that the reactivity to the antigen is equivalent (for example, 70% or more, preferably 70% or more) to that of the target antibody (for example, the B2E5-48 mouse antibody described in Patent Document 2). 80% or more, more preferably 90% or more).
  • modification of the antibody of the present invention may be modification of post-translational processes of the antibody, such as changing the number or position of glycosylation sites.
  • the ADCC activity of the antibody can be improved.
  • Glycosylation of antibodies is typically N-linked or O-linked. Glycosylation of antibodies is highly dependent on the host cell used to express the antibody. Modification of the glycosylation pattern can be performed by known methods such as introduction or deletion of specific enzymes involved in sugar production (Japanese Patent Application Laid-open No. 2008-113663, US Pat. No. 5,047,335, US Pat. No. 5,510,261, US Pat. No. 5,278,299, WO 99/54342).
  • deamidation can be suppressed by substituting the amino acid to be deamidated or the amino acid adjacent to the amino acid to be deamidated with another amino acid for the purpose of increasing the stability of the antibody. It's okay.
  • Glutamic acid can also be substituted with other amino acids to increase antibody stability.
  • the present invention also provides antibodies stabilized in this manner.
  • a "chimeric antibody” is an antibody in which the variable region of a certain type of antibody is linked to the constant region of a different type of antibody.
  • Chimeric antibodies are produced by, for example, immunizing a mouse with an antigen, cutting out the antibody variable region (variable region) that binds to the antigen from the mouse monoclonal antibody gene, and combining it with the antibody constant region (constant region) gene derived from human bone marrow.
  • the constant region of a chimeric antibody is usually that of a human-derived antibody.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4, C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ 1, C ⁇ 2, and C ⁇ can be used as constant regions.
  • C ⁇ and C ⁇ can be used as constant regions.
  • the amino acid sequences of these constant regions and the nucleotide sequences encoding them are known.
  • one or several amino acids in the human-derived antibody constant region may be substituted, deleted, added, and/or inserted. can.
  • a "humanized antibody” refers to an antibody in which the CDR gene sequence of an antibody derived from a non-human animal is grafted onto a human-derived antibody gene (CDR grafting), and its production method includes overlap extension PCR, etc. , are known (eg, EP 239,400, EP 125,023, WO 90/07861, WO 96/02576).
  • the variable region of an antibody is usually composed of three CDRs sandwiched between four FRs. CDRs are the regions that essentially determine the binding specificity of an antibody. While the amino acid sequences of CDRs are highly diverse, the amino acid sequences constituting FRs often show high homology even between antibodies with different binding specificities.
  • the binding specificity of one antibody can be transplanted to another antibody by transplanting CDRs.
  • a human FR that is highly homologous to the non-human animal-derived FR is selected.
  • amino acids in CDRs not only recognize antigens but also coordinate with amino acids in FRs near the CDRs and are involved in maintaining the loop structure of the CDRs. It is preferable to use a human FR consisting of an amino acid sequence highly homologous to the amino acid sequence of the FR.
  • Search for known human FRs that are highly homologous to FRs derived from non-human animals can be performed using, for example, a search system specialized for antibodies available on the Internet (http://www.bioinf.org.uk/abysis/). This can be done by using Mutations can be introduced into sequences other than the CDRs of an antibody derived from a non-human so as to match the sequence of the human FR thus obtained. Alternatively, if a gene (cDNA) encoding the amino acid sequence of human FR obtained through the search is available, non-human-derived CDRs may be introduced into the sequence. Introduction of mutations can be performed using techniques known in the art, such as nucleic acid synthesis and site-directed mutagenesis.
  • the CDRs form a good antigen-binding site when linked via the CDRs.
  • FRs of human-derived antibodies can be suitably selected. Sato, K. et al. , Cancer Res, 1993, 53, 851-856, etc., the amino acid residues of the FRs can be substituted so that the CDRs of the humanized antibody form a suitable antigen-binding site; By measuring and evaluating the antigen-binding activity of a mutant antibody with amino acid substitutions, a mutant FR sequence having desired properties can be selected.
  • the "humanized antibody” includes, for example, a light antibody comprising a CDR containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence consisting of Val-Thr-Ser, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • Examples include humanized antibodies that have a chain variable region and a heavy chain variable region that includes CDRs 1 to 3 each containing the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4 to 6, and that bind to human-derived Eva1 protein.
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 7 to 10, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 7 to 10, and SEQ ID NOs: 7 to 10.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 13 to 16, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 13 to 16, and SEQ ID NOs: 13 to 16.
  • Humanized antibodies include one amino acid sequence selected from the amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added, and/or inserted in at least one of the amino acid sequences described in No. 16.
  • the modification and homology of the variable region are as explained in "Antibodies derived from non-human animals," but in the humanized antibody of the present invention, the CDR sequences are not modified and the light chain variable region
  • the sequences of CDR1-3 and heavy chain variable region CDR1-3 are respectively the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1, the amino acid sequence consisting of Val-Thr-Ser, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:3, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:4.
  • the amino acid sequence is specified by the amino acid sequence set forth in .
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 7.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
  • a humanized antibody comprising one amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of (H1-L4)
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15.
  • a humanized antibody comprising one amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of (H2-L3)
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 10.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
  • a humanized antibody comprising one amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of (H2-L4)
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
  • a preferred example is a humanized antibody comprising an amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added, and/or inserted in at least one of the following.
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 7.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
  • a humanized antibody comprising one amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of (H2-L4)
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
  • a humanized antibody comprising one amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added and/or inserted in at least one of (H3-L4)
  • the light chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain variable region has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, and an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16.
  • a preferred example is a humanized antibody comprising an amino acid sequence selected from amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, deleted, added, and/or inserted in at least one of the following.
  • the antibody of the present invention may also be an antibody that competes in binding to human Eva1 with an antibody that contains the above-mentioned specific amino acid sequence or a variant thereof and retains a variable region or CDR.
  • an embodiment of an antibody that binds to an epitope to which an antibody having a variable region or CDR containing the above-mentioned specific amino acid sequence or a variant thereof may be reactive.
  • the term "epitope" refers to an antigenic determinant present in an antigen, that is, a site on the antigen to which an antigen-binding domain in an antibody binds. Therefore, the epitope in the present invention may be a polypeptide (linear epitope) consisting of a plurality of consecutive amino acids in the primary sequence of amino acids, and amino acids that are not adjacent in the primary sequence of amino acids may be It may also be a polypeptide (discontinuous epitope, structural epitope) formed by coming into close proximity due to a three-dimensional structure such as folding. Such epitopes also typically consist of at least 3 (eg, 4), and most commonly at least 5 (eg, 6-20, 7-15, 8-10) amino acids. .
  • those skilled in the art can identify the peptide region (epitope) on the antigen to which the antibody is reactive and produce various antibodies that bind to that peptide region. Additionally, whether two antibodies bind to the same or sterically overlapping epitopes can be determined by competition assays.
  • the "functional fragment" of an antibody means a part (partial fragment) of an antibody that exhibits reactivity with human Eva1. Specifically, Fab, Fab', F(ab')2, variable region fragment (Fv), disulfide bond Fv, single chain variable region fragment (single chain Fv, scFv), sc(Fv)2, diabody , multispecific antibodies, and polymers thereof.
  • Fab refers to a monovalent antigen-binding fragment of an immunoglobulin consisting of one light chain and part of a heavy chain. It can be obtained by papain digestion of antibodies and also by recombinant methods. "Fab'” differs from Fab by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain, including one or more cysteines in the antibody's hinge region. "F(ab')2" means a bivalent antigen-binding fragment of an immunoglobulin consisting of portions of both light chains and both heavy chains.
  • a “variable region fragment (Fv)” is the smallest antibody fragment that has a complete antigen recognition and binding site.
  • Fv is a dimer in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are tightly linked by non-covalent bonds.
  • a “single chain variable region fragment (single chain Fv, scFv)” comprises the heavy and light chain variable regions of an antibody, which regions are present in a single polypeptide chain.
  • sc(Fv)2 is a single chain made by linking two heavy chain variable regions and two light chain variable regions with a linker or the like.
  • a “diabody” is a small antibody fragment with two antigen-binding sites, which contains a heavy chain variable region joined to a light chain variable region in the same polypeptide chain, each region having a distinct It forms a pair with the complementary region of the strand.
  • a “multispecific antibody” is a monoclonal antibody that has binding specificity for at least two different antigens. For example, two heavy chains can be prepared by co-expression of two immunoglobulin heavy/light chain pairs with different specificities.
  • the antibody of the present invention can be produced by the hybridoma method or by the recombinant DNA method.
  • a typical example of the hybridoma method is the method of Kohler and Milstein (Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)).
  • the antibody-producing cells used in the cell fusion step in this method are animals ( Examples include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood leukocytes of mice, rats, hamsters, rabbits, monkeys, and goats. It is also possible to use antibody-producing cells obtained by allowing an antigen to act in a medium on the above-mentioned cells or lymphocytes previously isolated from non-immunized animals.
  • Various known cell lines can be used as myeloma cells.
  • Antibody-producing cells and myeloma cells may originate from different animal species as long as they can fuse, but preferably they originate from the same animal species.
  • Hybridomas are produced, for example, by cell fusion between spleen cells obtained from mice immunized with an antigen and mouse myeloma cells, and then screened to identify hybridomas that produce monoclonal antibodies specific to human Eva1.
  • a monoclonal antibody against human Eva1 can be obtained by culturing a hybridoma or from the ascites of a mammal to which the hybridoma has been administered.
  • the recombinant DNA method involves cloning the DNA encoding the antibody of the present invention from a hybridoma, B cell, etc., inserting it into an appropriate vector, and injecting it into host cells (e.g., mammalian cell lines such as HEK cells, Escherichia coli, yeast cells, etc.). cells, insect cells, plant cells, etc.) and produce the antibody of the present invention as a recombinant antibody (for example, P. J. Delves, Antibody Production: Essential Techniques, 1997 WILEY, P. Shepherd and C. .Dean Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, Vandamme A.M.
  • host cells e.g., mammalian cell lines such as HEK cells, Escherichia coli, yeast cells, etc.
  • host cells e.g., mammalian cell lines such as HEK cells, Escherichia coli, yeast cells, etc.
  • cells insect cells,
  • the DNA encoding the heavy chain or light chain may be separately incorporated into an expression vector to transform host cells. It may be incorporated into a single expression vector to transform host cells (see WO 94/11523).
  • the antibody of the present invention can be obtained in a substantially pure and homogeneous form by culturing the above-mentioned host cells, separating and purifying the antibodies within the host cells or from the culture solution. For isolation and purification of antibodies, methods commonly used for purification of polypeptides can be used.
  • transgenic animal production technology to create a transgenic animal (cow, goat, sheep, pig, etc.) into which an antibody gene has been inserted, a large amount of monoclonal antibodies derived from the antibody gene can be produced from the milk of the transgenic animal. It is also possible to obtain
  • the present invention also provides a DNA encoding the antibody of the present invention, a vector containing the DNA, a host cell retaining the DNA, and a method for producing an antibody, which comprises culturing the host cell and recovering the antibody. can do.
  • ⁇ Antibody-drug conjugate> As shown in the Examples below, human Eva1, which is the target of the antibody of the present invention, is expressed in various cancers.
  • the antibodies of the present invention (particularly humanized antibodies) are also useful as ADCs. Therefore, the present invention may also take the form of an antibody-drug conjugate (ADC) in which the antibody of the present invention (particularly a humanized antibody) or a functional fragment thereof is bound to a drug.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the "drug” that can be bound to the antibody is not particularly limited, but includes, for example, cytotoxic substances known in the art.
  • Cytotoxic substances include anticancer drugs such as irinotecan (CPT-11), irinotecan metabolite SN-38 (10-hydroxy-7-ethylcamptothecin), adriamycin, taxol, 5-fluorouracil, nimustine.
  • alkylating agents such as laministine and temozolomide, antimetabolites such as gemcitabine and hydroxycarbamide, plant alkaloids such as etoposide and vincristine, anticancer antibiotics such as mitomycin and bleomycin, platinum preparations such as cisplatin, sorafenib, erlotinib, etc. molecular targeting agents, methotrexate, cytosine arabinoside, 6-thioguanine, 6-mercaptopurine, cyclophosphamide, ifosfamide, busulfan, MMAE (monomethyl auristatin E), DM1 (mertansine), and calichiamycin.
  • alkylating agents such as laministine and temozolomide, antimetabolites such as gemcitabine and hydroxycarbamide, plant alkaloids such as etoposide and vincristine, anticancer antibiotics such as mitomycin and bleomycin, platinum preparations such as c
  • Cytotoxic agents also include radioisotopes such as 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, 131 I, 186 Re, 188 Re , 10 B, 111 In, 90 Y.
  • Cytotoxic substances include photosensitizers that exhibit cytotoxic activity, and more specifically, substances that themselves change into a form that exhibits cytotoxicity (cytotoxicity) when activated by light irradiation. It may also be a substance that produces a cytotoxic substance (cytotoxic substance). Examples include chlorins, chlorin e6, porfimer sodium, talaporfin sodium, verteporfin, and precursors and derivatives thereof. Further, examples of cytotoxic substances include toxic peptides such as ribosome inactivating proteins (RIPs) such as saporin, ricin, and Shiga toxin.
  • RIPs ribosome inactivating proteins
  • the binding between the antibody and the cytotoxic substance can be performed by a method known in the art, and may be either direct binding or indirect binding.
  • a covalent bond can be used as a direct bond.
  • binding via a linker can be used.
  • the antibody and the cytotoxic substance are bonded via a linker.
  • a linker By binding two molecules via a linker, the antigenicity of the cytotoxic substance can be attenuated, which is preferable for administration to a subject.
  • linkers General techniques for linkers are described, for example, by Hermanson, G.; T. Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996; Harris, J. M. and Zalipsky, S. Ed., Poly (ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series, 1997; Veronese, F. and Harris, J. M. ed., Peptide and protein PEGylation. It is described in Advanced Drug Delivery Review 54(4), 2002.
  • the linker includes not only a linear linker (bivalent linker) but also a branched linker (trivalent or higher valent linker).
  • a linear linker has a cytotoxic agent at one end and an antibody at another end.
  • a branched linker typically has a cytotoxic agent on each branch (each chain) of the branch and an antibody on the other end.
  • Such linkers include, for example, N-succinimidyl-4-(maleimidomethyl)cyclohexanecarboxylate (SMCC), sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-l-carboxy-(6-amidocaproate) (LC-SMCC), N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate (SPDB), N -Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP), 4-maleimidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester (GMBS), 3-maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimidobenzoyl-N -
  • the bond between the antibody and the linker is a covalent bond or a non-covalent bond (ionic bond, hydrophobic bond, etc.), preferably a covalent bond.
  • This bond is preferably such that a cytotoxic substance is unlikely to be released in the blood when the complex of the present invention is administered to a subject.
  • bonds include a bond between a maleimide group and a thiol group, a bond obtained by reacting a haloester with a thiol, an amide bond between a carboxyl group and an amino group, a disulfide bond between a thiol group, and an amino bond.
  • Dehydration substitution bond with the amino group contained in the group for example, WO 2008/096760
  • dehydration condensation bond between the amino group present at one end of the linker and the carboxylic acid contained in aspartic acid or glutamic acid on the antibody for example, using WSCDI.
  • WO 2010/055950 For a specific method of binding an antibody and a linker, see, for example, WO 2010/055950.
  • the bond between the antibody or linker and the cytotoxic substance is a covalent bond or a non-covalent bond (ionic bond, hydrophobic bond, etc.), and preferably a covalent bond.
  • the bond is such that a cytotoxic substance is unlikely to be released in the blood when the complex of the present invention is administered to a subject.
  • the bond between the antibody or linker and the cytotoxic substance is preferably, but not limited to, an ester bond, carbamate bond, carbonate bond, or thiocarbamate bond, and more preferably an ester bond. be.
  • the number of cytotoxic substances bound per antibody molecule is determined by using raw materials and reagents to be reacted so that the number is a constant number, taking into account its effectiveness and safety.
  • the reaction is carried out by specifying the reaction conditions such as the amount of
  • a mixture of different numbers of drugs is usually obtained.
  • the number of drugs bound to one antibody molecule is specified and expressed as an average value, that is, the average number of drug bonds. Therefore, in this specification, unless otherwise specified, the number of drug bonds means the average value.
  • the number of drugs bound per antibody molecule can be controlled by adjusting the type and concentration of the reducing agent used, the concentration of the linker and drug relative to the antibody (molar excess, etc.), and the temperature or time in the binding reaction.
  • the "reducing agent” is not particularly limited as long as it can reductively cleave the disulfide bonds in the antibody to form a bond via the thiol group, but examples include dithiothreitol (DTT, DL- DTT), 2-mercaptoethylamine, mercaptoethanol, and TCEP.
  • the average number of drugs bound per antibody is not particularly limited, but is, for example, 1 to 10, preferably 3 to 8, and more preferably 3 to 5.
  • the number of drug binding per antibody molecule is determined by measuring the absorbance at the absorption peak of a cytotoxic substance (for example, DM1) and the absorbance at 280 nm, which is the absorption peak of the antibody, as shown in the Examples below.
  • the concentration of the antibody and the cytotoxic substance can be determined by calculating the simultaneous equations taking into account the effects of each on the absorption peak of the other, and determining the ratio of the number of molecules. It can also be determined using a reagent that colorimetrically measures thiol groups, such as DTNB.
  • the ADC of the present invention when left in the air or recrystallized, it may absorb water, have adsorbed water, or become a hydrate, and such water-containing compounds and Salts are also included in the invention.
  • One or more of the atoms comprising the ADCs of the invention may also contain unnatural proportions of atomic isotopes.
  • atomic isotopes include 2 H, 3 H, 125 I, and 14 C.
  • the ADC of the present invention can be detected using bioimaging techniques and the like. Therefore, a labeling substance may be bound.
  • the labeling substance is appropriately selected depending on the type of detection method used, and examples thereof include radioactive labeling substances, fluorescent labeling substances, paramagnetic labeling substances, superparamagnetic labeling substances, and enzyme labeling substances.
  • such a binding between the labeling substance and the ADC may be direct or indirect. Indirect binding includes binding via a secondary antibody bound to a labeling substance, or a polymer (protein A, protein B, etc.) bound to a labeling substance.
  • a positron-emitting nuclide can be used as the radioisotope that labels the ADC.
  • antibodies can be labeled with positron-emitting nuclides such as 64 Cu, 18 F, 55 Co, 66 Ga, 68 Ga, 76 Br, 89 Zr, and 124 I.
  • positron-emitting nuclides such as 64 Cu, 18 F, 55 Co, 66 Ga, 68 Ga, 76 Br, 89 Zr, and 124 I.
  • known methods Nucl Med Biol. 1999; 26 (8): 943-50., J Nucl Med. 2013; 54 (11): 1869-75., etc.
  • the radiation emitted from the radionuclide is measured from outside the body using a PET (positron emission tomography device) and converted into an image using computer tomography. Ru. In this way, it is possible to track the arrival, accumulation, etc. of the ADC administered to the subject at the target site.
  • PET positron emission tomography device
  • ⁇ Chimeric antigen receptor> As shown in the Examples below, human Eva1, which is the target of the antibody of the present invention, is expressed in various cancers. Furthermore, the variable region of the antibody of the present invention is useful in chimeric antigen receptors (CARs) and T cells expressing them (so-called CAR-T). Therefore, the present invention may also take the form of a CAR, which includes a region that binds to human-derived Eva1 protein, a transmembrane region, and an intracellular signal region.
  • a "Chimeric Antigen Receptor (CAR)” has an extracellular region that binds to human-derived Eva1 protein, a transmembrane region, and an intracellular signal region in that order. It refers to a chimeric protein that is arranged from the N-terminus and linked directly or indirectly.
  • the "region that binds to human-derived Eva1 protein (antigen-binding region)" can be, for example, the above-mentioned antibody or a functional fragment thereof, but scFv is usually used for CAR.
  • scFv is a structure in which the light chain variable region and heavy chain variable region of a monoclonal antibody (immunoglobulin) are linked via a linker, and retains the ability to bind to an antigen.
  • the N-terminal side of the scFv may be a light chain variable region, a linker, and a heavy chain variable region, or a heavy chain variable region, a linker, and a light chain variable region, but the former is preferable. be.
  • a peptide linker can be used as the "linker” in scFv.
  • the length of the linker is not particularly limited.
  • a linker having 5 to 25 amino acids can be used.
  • the length of the linker is preferably 8 to 25 amino acids, more preferably 15 to 20 amino acids.
  • Suitable examples of peptide linkers include glycine or glycine and serine (GGS linker, GS linker, GGG linker, etc.).
  • a suitable example also includes a linker consisting of 18 amino acids from positions 134 to 151 as set forth in SEQ ID NO: 58. Glycine and serine, which are amino acids constituting these linkers, have the advantage of being small in size and difficult to form a higher-order structure within the linker.
  • the monoclonal antibody that serves as the basis for scFv includes the above-mentioned antibodies derived from non-human animals, human antibodies, and humanized antibodies.
  • preferred examples are as described above, but as shown in Examples below, the combination (H2-L2) above is preferred from the viewpoint of activation and cell proliferation in response to human Eva1, and furthermore, N
  • the scFv is formed by connecting L2, linker, and H2 in this order from the terminal side.
  • the "transmembrane region” is not particularly limited as long as it is a polypeptide that has the function of penetrating the cell membrane and can anchor CAR to the cell membrane.
  • Proteins from which polypeptides responsible for transmembrane regions are derived include, for example, CD28, CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , 4-1BB, CD45, CD4, CD5, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, and CD80. , CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, GITR, ⁇ and ⁇ chains of T cell receptors.
  • the "intracellular signal region” is a region that is placed inside the cell when CAR is placed on the cell membrane, and is used to transmit signals necessary for the effector function of immune cells to be exerted, that is, to transmit antigens.
  • the binding region binds to an antigen (human Eva1), it is a region capable of transmitting a signal (so-called primary signal) necessary for activation of immune cells.
  • Such intracellular signal regions generally include those that have only activation signal transduction domains such as T cell receptor (TCR) and CD3 complex (first generation CAR), and those that have only activation signal transduction domains such as T cell receptor (TCR) and CD3 complex, and those that have only activation signal transduction domains such as T cell receptor (TCR) and CD3 complex.
  • TCR T cell receptor
  • TCR T cell receptor
  • CD3 complex first generation CAR
  • the "intracellular signal region” only needs to be capable of transmitting a primary signal, and an activation signal transduction domain of a protein involved in the signal can be used.
  • an activation signal transduction domain of a protein involved in the signal can be used.
  • ITAM immunoreceptor tyrosine-based activation motif
  • proteins having ITAM include CD3 ⁇ , FcR ⁇ , FcR ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, DAP10, and DAP12.
  • the positional relationship between the CD79A intracellular domain and the CD40 intracellular domain is not particularly limited, and either an embodiment where the N-terminal side is the CD79A intracellular region or a case where the N-terminal side is the CD40 intracellular region can be adopted. be.
  • the arrangement relationship is preferably the former.
  • the CD79A intracellular region and the CD40 intracellular region are preferably linked directly or via a linker.
  • the linker is not particularly limited and is arbitrary as long as the NF ⁇ B signal activation effect is not significantly impaired.
  • the linker is preferably a linker composed of glycine or glycine and serine (GGS linker, GS linker, GGG linker, etc.).
  • the length of the linker is not particularly limited, but is, for example, 1 to 20 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids, and more preferably 1 to 5 amino acids.
  • the number of intracellular signal regions included in a CAR is not limited to one, and may include a plurality of intracellular signal regions (for example, 1 to 5, 1 to 3, or 1 or 2). (can also contain multiple signaling factors). In this case, the plurality of intracellular signal regions contained may be the same or different.
  • the CAR of the present invention can also contain other domains.
  • other domains include, but are not limited to, costimulatory transduction regions, spacer sequences, signal peptides, and the like.
  • Costimulatory transduction region refers to an intracellular domain involved in costimulatory signal transduction of costimulatory molecules as described above.
  • costimulatory molecules include CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), ICOS, CD2, CD4, CD5, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD154, and the like.
  • CARs of the invention can include costimulatory transmission regions of these costimulatory molecules.
  • the number of costimulation transmission regions that can be included in the CAR of the present invention is not limited to one, and may be multiple.
  • the CAR of the invention can include, for example, 1 to 5, 1 to 3, or 1 or 2 costimulatory transmission regions.
  • the regions may be the same or different.
  • spacer refers to a sequence that connects each region, etc., and is not particularly limited as long as it does not inhibit the function of each region, and the number of amino acids is also not particularly limited, but usually 1 ⁇ 500 amino acids, preferably 5 to 300 amino acids, more preferably 10 to 100 amino acids.
  • the antigen-binding region and the transmembrane region are preferably linked directly or via a relatively short spacer.
  • the number of amino acids constituting the spacer between the antigen-binding region and the transmembrane region is, for example, 1 to 400, preferably 10 to 300.
  • the constituent amino acids are 150 to 300. More preferably, it is 200 to 250.
  • the number of constituent amino acids is more preferably 10 to 30.
  • the sequence of the spacer is not particularly limited, but may include, for example, the hinge region of IgG, preferably human IgG (e.g. subtype IgG1 or IgG4) or a part thereof, the hinge region and a part of CH2, or a factor used in the transmembrane domain (for example, a sequence such as a portion of CD28) can be used as a spacer.
  • a sequence such as a portion of CD28
  • spacers include spacers consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62, or 62 (positions 268 to 499 of SEQ ID NO: 58).
  • the "signal peptide” refers to a peptide for promoting the secretion of CAR or instructing its localization to the cell membrane, and is also referred to as a leader sequence.
  • a signal peptide can usually be attached directly or indirectly to the N-terminus of the antigen-binding region.
  • the signal peptide may also be cleaved from the antigen binding region during cell processing and localization of the CAR to the cell membrane.
  • signal peptides examples include the human GM-CSF receptor, the ⁇ and ⁇ chains of the T cell receptor, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD3 ⁇ , CD28, CD3 ⁇ , CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, Examples include signal peptides such as CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, and GITR.
  • each region in the CAR of the present invention has been described above, but those skilled in the art will know the specific amino acid sequences of these regions, etc. from known literature or from the NCBI (http://www.ncbi.nlm. It can be obtained as appropriate by searching a database such as nih.gov/guide/). Furthermore, as shown in Table 3 above, specific sequences are also disclosed in the sequence listing of the present application.
  • the regions according to the present invention are not limited to such typical amino acid sequences (e.g., NCBI reference sequence), but may be modified versions of these typical amino acid sequences as long as the functions of the regions are maintained. , may also include homologs.
  • such variants and homologs usually have high homology to the typical amino acid sequence. High homology is usually 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more (for example, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • the CAR of the present invention may be a molecule consisting of one type of polypeptide, or a molecule consisting of a complex of two or more types of polypeptides. Furthermore, the CAR of the present invention may be a molecule consisting of a polypeptide or a complex thereof, or other substances (e.g., fluorescent substances, radioactive substances, inorganic particles, etc.) are linked to the polypeptide or the complex. It may also be made by
  • the CAR of the present invention may be chemically modified.
  • the polypeptide constituting the CAR of the present invention may have a carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO-), an amide (-CONH 2 ), or an ester (-COOR) at the C-terminus.
  • R in the ester is, for example, a C1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; for example, phenyl, ⁇ -C6-12 aryl groups such as naphthyl; For example, phenyl-C1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl; C7-14 aralkyl groups such as ⁇ -naphthyl-C1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl; pivalo Yyloxymethyl group etc.
  • a C1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl
  • a C3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl,
  • carboxyl groups (or carboxylates) other than the C-terminus may be amidated or esterified.
  • ester for example, the above-mentioned C-terminal ester can be used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue is a protecting group (for example, a C1-6 acyl group such as a C1-6 alkanoyl such as a formyl group or an acetyl group).
  • pyroglutamic oxidation of the N-terminal glutamine residue that can be generated by cleavage in vivo substituents on the side chains of amino acids in the molecule (e.g. -OH, -SH, amino groups, Also included are those in which an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.) are protected with an appropriate protecting group (for example, a C1-6 acyl group such as a C1-6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group).
  • the CAR of the present invention may have other functional proteins.
  • Other functional proteins are not particularly limited and are appropriately selected depending on the function desired to be imparted to the CAR of the present invention.
  • functional proteins used to facilitate the purification and detection of CAR include Myc tag, His tag, HA tag, FLAG tag (registered trademark, Sigma-Aldrich), and fluorescent protein tags (such as GFP). Can be mentioned.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt with an acid or base.
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and both acidic salts and basic salts can be employed.
  • acidic salts include inorganic acid salts such as hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, nitrates, phosphates; acetates, propionates, tartrates, fumarates, maleates;
  • Examples include organic acid salts such as malate, citrate, methanesulfonate, and paratoluenesulfonate; amino acid salts such as aspartate and glutamate.
  • basic salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid, and the like.
  • the invention provides polynucleotides encoding the CARs of the invention.
  • a monoclonal antibody that recognizes the target antigen is prepared, and the amino acid sequence of the monoclonal antibody is determined by a known method such as the Edman method. It can also be obtained based on Note that the specific sequences of the above-mentioned humanized antibodies and the like are also disclosed in the sequence listing of the present application. It can also be obtained by analyzing the nucleotide sequence of a hybridoma that produces the monoclonal antibody.
  • nucleotide sequences encoding each region in the CAR of the present invention can be found in known documents or from NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih). It can also be obtained appropriately by searching a database such as .gov/guide/). Further, the nucleotide sequences encoding the above regions are not limited to known ones, and any nucleotide sequence encoding the above regions can be used. Due to the degeneracy of the genetic code, there are multiple codons that correspond to one amino acid. Therefore, there are many nucleotide sequences that encode the same amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide of the present invention may be any of a plurality of nucleotide sequences resulting from the degeneracy of the genetic code, as long as it encodes the CAR of the present invention. Furthermore, in order to optimize expression in cells expressing CAR, codons selected to encode amino acids in the nucleotide sequence encoding each region in the CAR of the present invention may be modified.
  • nucleotide sequence information Based on such nucleotide sequence information, those skilled in the art can use known techniques such as chemical synthesis methods (phosphoramidite method, etc.) and PCR amplification methods to generate polynucleotides encoding each region, etc. Nucleotides can be made. Furthermore, a polynucleotide encoding the CAR of the present invention can be obtained by linking the polynucleotides encoding each region obtained in this way directly or via a spacer. The polynucleotides encoding each region can be linked using a known method such as, for example, overlap extension PCR, as shown in Examples below.
  • Vectors of the present invention may be linear or circular, and include, for example, viral vectors, plasmid vectors, episomal vectors, artificial chromosome vectors, and transposon vectors.
  • viral vectors examples include retrovirus vectors such as lentiviruses, Sendai virus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, pox virus vectors, polio virus vectors, sylvis virus vectors, and rhabdovirus vectors.
  • retrovirus vectors such as lentiviruses, Sendai virus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, pox virus vectors, polio virus vectors, sylvis virus vectors, and rhabdovirus vectors.
  • retrovirus vectors such as lentiviruses, Sendai virus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, pox virus vectors, polio virus vectors, sylvis virus vectors,
  • plasmid vectors include plasmid vectors for expression in animal cells, such as pcDNA3.1, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, and pcDNAI/Neo.
  • Episomal vectors are vectors that can autonomously replicate outside the chromosome. Specific means for using episomal vectors are known (see Yu et al., Science, 2009, pp. 324, 797-801). Examples of episomal vectors include vectors containing sequences necessary for autonomous replication derived from EBV, SV40, etc. as vector elements. Specifically, the vector elements necessary for autonomous replication include a replication origin and a gene encoding a protein that binds to the replication origin and controls replication. For example, in EBV, the replication origin oriP and the EBNA-1 gene, and in the case of SV40, the replication origin ori and the SV40LT gene.
  • artificial chromosome vectors examples include YAC (Yeast artificial chromosome) vector, BAC (Bacterial artificial chromosome) vector, and PAC (P1-derived artificial chromosome) vector.
  • YAC yeast artificial chromosome
  • BAC Bacillus chromosome
  • PAC P1-derived artificial chromosome
  • retrovirus vectors are preferred from the viewpoints that genes can be easily introduced with high efficiency even into cells that proliferate slowly, and that stable expression strains can be easily established.
  • the vector of the present invention includes expression control sequences such as promoters, enhancers, polyA addition signals, and terminators, and replication origins that bind to and control replication. It may contain nucleotide sequences encoding proteins, nucleotides encoding other proteins, and the like.
  • each polynucleotide By operably arranging the polynucleotide encoding the above-mentioned CAR and the nucleotide encoding the other protein described later downstream of the promoter, each polynucleotide can be efficiently transcribed.
  • promoters include CMV (cytomegalovirus) promoter, SR ⁇ promoter, SV40 early promoter, retrovirus LTR, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter, and EF1 ⁇ .
  • promoters include promoters, metallothionein promoters, heat shock promoters, and the like.
  • nucleotides encoding other proteins include fluorescent protein genes, reporter genes, marker genes such as drug resistance genes, and genes encoding molecules involved in T cell activation such as cytokines. .
  • IRES DNA encoding a 2A peptide sequence (for example, 2A peptide (T2A) derived from Thosea asigna), the other proteins can be polycistronicly expressed together with the above-mentioned CAR. becomes.
  • the present invention uses the suicide gene as a "nucleotide encoding another protein".
  • the vector may include.
  • suicide genes include herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) and inducible caspase 9 (iCasp9).
  • examples of drugs that activate the function of such genes include ganciclovir for HSV-TK and AP1903, a chemical induction of dimerization (CID) for iCasp9. (Cooper LJ. et al., Cytotherapy.
  • the invention provides cells that express the CAR of the invention.
  • the cells of the present invention can be obtained by introducing the polynucleotide or vector encoding the CAR of the present invention described above into the cells.
  • the "cell” into which the polynucleotide or vector of the present invention is introduced is preferably a cell derived from a mammal, such as a cell derived from a human, a rodent (mouse, rat, etc.), a cow, a sheep, a horse, etc.
  • Cells derived from non-human mammals such as , dogs, pigs, and monkeys can be used.
  • the type of cells is not particularly limited, and cells collected from body fluids such as blood and bone marrow fluid, tissues such as spleen, thymus, and lymph nodes, tumors, cancerous ascites, etc. can be used.
  • a preferable example of the CAR-expressing cells is an immune cell.
  • immunosens examples include CD4-positive CD8-negative T cells, CD4-negative CD8-positive T cells, T cells prepared from iPS cells, ⁇ -T cells, ⁇ -T cells, NK cells, NKT cells, etc. can.
  • Various cell populations can be used as long as they contain lymphocytes or progenitor cells as described above.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells collected from peripheral blood are one of the preferred immune cells. That is, in one preferred embodiment, gene introduction operation is performed on PBMC.
  • PBMC can be prepared according to or analogously to a conventional method.
  • CAR-expressing cells can be activated by stimulation with anti-CD3 antibodies and anti-CD28 antibodies. More specifically, stimulation with anti-CD3 antibodies and anti-CD28 antibodies can be applied by culturing in a culture container (eg, a culture dish) whose culture surface is coated with anti-CD3 antibodies and anti-CD28 antibodies. The stimulation can also be performed using magnetic beads coated with anti-CD3 antibodies and anti-CD28 antibodies (for example, Dynabeads T-Activator CD3/CD28 provided by VERITAS).
  • a culture container eg, a culture dish
  • the stimulation can also be performed using magnetic beads coated with anti-CD3 antibodies and anti-CD28 antibodies (for example, Dynabeads T-Activator CD3/CD28 provided by VERITAS).
  • T cell growth factors In order to increase the survival rate/proliferation rate of cells, it is preferable to use a culture medium to which T cell growth factors are added during the activation treatment.
  • IL-2, IL-15, IL-7, etc. can be used as T cell growth factors.
  • T cell growth factors such as IL-2, IL-15, and IL-7 can be prepared according to conventional methods. Moreover, commercially available products can also be used. Although this does not exclude the use of T cell growth factors from animal species other than humans, human-derived T cell growth factors (which may be recombinant) are usually used.
  • lymphocytes introduced with the polynucleotide of the present invention are proliferated.
  • the polynucleotide-introduced lymphocytes of the present invention are cultured using a culture medium to which a T cell growth factor has been added (subcultured if necessary).
  • the same treatment (reactivation) as in the case of activating CAR-expressing cells may be performed.
  • a medium supplemented with serum human serum, fetal bovine serum, etc.
  • serum-free medium is highly safe for clinical application. , and it becomes possible to prepare cells that have the advantage that differences in culture efficiency due to differences between serum lots are unlikely to occur.
  • autologous serum ie, serum collected from a subject receiving the cells of the present invention.
  • the cells of the present invention may be cells in which the function of proteins (immune checkpoint substances, etc.) that suppress excessive immune reactions, etc. is suppressed.
  • proteins include Programmed Death 1 (PD1), PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, etc.), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT,
  • PD1 Programmed Death 1
  • the cells of the present invention may be cells in which the functions of endogenous proteins such as TCR and HLA are suppressed in order to facilitate allotransplantation.
  • Methods for suppressing the function of a protein include a knockout method that targets the gene encoding the protein, a method that uses dsRNA (double-stranded RNA, e.g. siRNA) complementary to the transcription product of the gene, and a method that uses the transcription product of the gene and Examples include a method using complementary antisense RNA and a method using RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product.
  • dsRNA double-stranded RNA, e.g. siRNA
  • Examples include a method using complementary antisense RNA and a method using RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product.
  • ZFNs zinc finger nucleases
  • TALENs transcription activation-like effector nucleases
  • CRISPR-Cas9 DNA double-strand cleaving enzymes
  • Methods for introducing the polynucleotide or vector of the present invention into cells include lipofection method, microinjection method, calcium phosphate method, DEAE-dextran method, electroporation method, particle gun method, and the like.
  • the vector of the present invention is a retrovirus vector
  • appropriate packaging cells are selected based on the LTR sequence and packaging signal sequence possessed by the vector, and retrovirus particles are prepared using this. It's okay.
  • packaging cells include PG13, PA317, GP+E-86, GP+envAm-12, and Psi-Crip.
  • 293 cells and 293T cells which have high transfection efficiency, can also be used as packaging cells.
  • the expression of CAR in the cells is confirmed by known methods such as flow cytometry, RT-PCR, Northern blotting, Western blotting, ELISA, and fluorescent immunostaining. can do.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition (e.g., an anticancer drug) containing a cell expressing the antibody, ADC, or CAR of the present invention (hereinafter also simply referred to as "the antibody of the present invention, etc.") as an active ingredient, and the present invention
  • a pharmaceutical composition e.g., an anticancer drug
  • the present invention also provides a method for treating or preventing a disease (e.g., cancer) associated with Eva1 protein, comprising the step of administering to a subject a therapeutically or prophylactically effective amount of an antibody or the like.
  • the disease associated with the Eva1 protein targeted by the antibody of the present invention may be any disease in which the expression of the Eva1 protein is involved in its onset, progression of symptoms, deterioration, etc., such as cancer.
  • the "cancer” targeted by the antibody of the present invention only needs to express at least human Eva1, and as long as the protein is expressed, it may be a solid tumor, such as leukemia, lymphoma, etc. There may be. More specifically, gliomas (tumors arising from neural stem cells, nervous system progenitor cells and glial cells, such as glioblastoma multiforme (GBM), astrocytoma, parablastoma, brain Supraventricular tumor, oligodendroglioma, choroid plexus papilloma, especially anaplastic astrocytoma, anaplastic oligodendroastrocytoma, anaplastic oligodendroglioma), pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, bile duct Cancer, hepatocellular carcinoma, breast cancer, lung cancer, kidney cancer, urothelial cancer, testicular cancer, prostate cancer, head and neck cancer, thyroid cancer,
  • the "pharmaceutical composition" of the present invention can contain, in addition to the antibody of the present invention, other pharmacologically acceptable components.
  • Such other ingredients include, for example, carriers, emulsifiers, wetting agents, pH buffering agents, media, excipients, disintegrants, buffers, tonicity agents, suspending agents, solubilizing agents, and soothing agents. agents, stabilizers, preservatives, and preservatives.
  • other pharmacologically acceptable ingredients include, in the case of liquid preparations such as injections, aqueous solutions (physiological saline, water for injection, phosphate buffer, glucose aqueous solution, glycerol aqueous solution, etc.) , aluminum hydroxide, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the invention may be in the form of a kit, such that the components described above can be mixed prior to administration. Furthermore, when used as an injection, it may be introduced into a syringe.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain only the antibody, etc. of the present invention as an active ingredient, or may contain the antibody, etc. and at least one other anticancer agent. Furthermore, the antibodies and the like of the present invention can also be administered together with other anticancer drugs, thereby enhancing the antitumor effect. Other anticancer drugs used for this purpose may be administered to the subject simultaneously with the antibody of the present invention, etc., separately or consecutively, or may be administered at different intervals. Good too.
  • anticancer drugs include immune checkpoint inhibitors (anti-PD-1 antibodies, etc.), gemcitabine, S-1, erlotinib, 5-FU, temozolomide, leucovorin, irinotecan (CPT-11), Oxaliplatin, Abraxane, carboplatin, paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinblastine, LH-RH analogs (leuprorelin, goserelin, etc.), estramustine phosphate, estrogen antagonists (tamoxifen, raloxifene, etc.), aromatase inhibitors (ana (strozole, letrozole, exemestane, etc.) and the drugs described in WO 2003/038043, but the drug is not limited as long as it has antitumor activity.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • serum albumin for the purpose of protecting the cells, and antibiotics and the like for the purpose of preventing bacterial contamination. It's okay to stay.
  • cytokines growth factors
  • T cell activators such as steroids, vitamins, immunostimulants, and immune checkpoint inhibitors for the purpose of inducing cell activation, proliferation, or differentiation, and The cells of the present invention and these other components may be used in combination.
  • the administration method of the pharmaceutical composition varies depending on the type of substance to be administered, the aspect of the composition, the age, weight, sex, health condition of the subject, etc., but includes parenteral administration (e.g., intravenous administration, arterial administration, local administration), Administration can be by any route of administration, including oral administration.
  • a preferred method of administration is parenteral administration, more preferably intravenous administration.
  • local administration may be performed instead of systemic administration. Local administration can include direct injection into the targeted tissue, organ, or organ.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the subject's age, weight, sex, health condition, degree of progression of symptoms, and components of the pharmaceutical composition to be administered.
  • the administration schedule may be adjusted as appropriate depending on these conditions, and in addition to single administration, it may be administered multiple times continuously or periodically.
  • the amount is 0.1 to 1000 mg per kg per day, preferably 1 to 100 mg.
  • the amount of drug contained is 0.001 to 1000 mg per kg of body weight per day for adults, preferably 0.01 to 100 mg.
  • the frequency of administration of these antibodies or ADCs is, for example, once, or at intervals of once a day to once a year (e.g., every week, every 10 to 30 days, every month, every 3 to 6 months, every 6 months). , every year) may be administered multiple times.
  • the dosage of cells is 1x10 3 to 1x10 10 cells (preferably 1x10 4 to 1x10 9 cells, more preferably 1x10 5 to 1x10 cells per kg of body weight for adults). 8 ).
  • the administration interval can be, for example, every week, every 10 to 30 days, every month, every 3 to 6 months, every year, etc.
  • the cells of the present invention can autonomously proliferate within the body of the recipient, they can be administered only once.
  • the number of cells of the present invention in the body may be monitored after administration, and the timing of administration may be determined according to the results.
  • BBB blood-brain barrier
  • the antibody of the present invention can be administered while bypassing it.
  • a method of inserting a cannula or the like using a stereotactic neurosurgery method and directly administering the drug to a glioma or the like through the cannula can be mentioned.
  • Another example is a method of implanting a drug delivery system containing the antibody of the present invention into the brain (Gill et al., Nature Med. 9:589-595 (2003), etc.).
  • Further examples include transfection of neurons spanning the BBB with a vector containing a gene encoding the antibody of the present invention (eg, US Patent Application Publication No. 2003/0083299).
  • Brain barrier permeable substances include, for example, liposomes bound to antibody-binding fragments that bind to receptors on the vascular endothelium of the BBB (such as U.S. Patent Application Publication No. 20020025313), and low-density lipoprotein particles (such as U.S. Patent Application Publication No. 20020025313).
  • Publication No. 20040204354, etc. apolipoprotein E (US Patent Application Publication No. 20040131692, etc.), transferrin (US Patent Application Publication No. 2003/0129186, etc.), glycoprotein consisting of 29 amino acids derived from rabies virus (Kumar et al., Nature , July 5, 2007, volume 448, pages 39-43).
  • the antibody can be delivered to gliomas and the like through the BBB.
  • Such methods include, for example, increasing the permeability of the blood-brain barrier using glucocorticoid blockers (U.S. Pat. 2005/0124533, etc.), activating potassium channels (US Patent Application Publication No. 2005/0089473, etc.), inhibiting ABC drug transporters (US Patent Application Publication No. 2003/0073713, etc.), the present invention (U.S. Pat. No. 5,004,697, etc.).
  • the method of administering the antibody of the present invention for such diseases is not limited thereto.
  • the method for administering the antibody of the present invention for such diseases is as follows: Those skilled in the art can apply the antibody of the present invention to the affected area by appropriately selecting a known method suitable for the disease.
  • “subjects” to which the antibodies, etc. of the present invention are administered include, for example, humans suffering from the above-mentioned cancers, humans who are at risk of recurrence of the above-mentioned cancers, etc. These include humans who are at risk of contracting the disease.
  • “treatment” includes alleviating symptoms or accompanying symptoms characteristic of a target disease such as cancer (alleviating symptoms), preventing or delaying worsening of symptoms, and the like.
  • "Prevention” refers to preventing or delaying the onset, expression, or recurrence of a disease (disorder) or its symptoms, or reducing the risk of onset, expression, or recurrence.
  • the DNA sequences encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region have appropriate restriction enzyme recognition sites at the 5' and 3' ends so that they can be cloned into Absolute Antibody cloning vectors and expression vectors. Added and designed. Furthermore, the codons of these DNA sequences were optimized in consideration of expression in human cells. Based on these sequences, they were chemically synthesized and then cloned into Absolute Antibody vectors of appropriate species and types. The accuracy of the sequence was confirmed by analyzing raw data using DNASTAR Lasergene software and by Sanger sequencing. After making this confirmation, plasmid DNA of an appropriate size was prepared to prepare a sufficient amount of high-quality DNA necessary for transfection.
  • HEK293T cells were passaged to an optimal stage for transient transfection.
  • the heavy chain and light chain expression vectors were introduced into the cells and cultured for 6 days.
  • the cultures were centrifuged at 4000 rpm, and the culture supernatants were collected and filtered through a 0.22M filter.
  • the first step of purification was performed by protein A affinity chromatography, eluted with citric acid pH 3.0 buffer, and then neutralized with 0.5 M Tris, pH 9.0.
  • the eluted protein was buffer exchanged into PBS using a desalting column.
  • Antibody concentration was determined by UV spectroscopy and concentrated if necessary.
  • the chimeric human IgG1 was expressed and prepared not only in HEK293T cells but also in CHO cells.
  • Antibody Analytics Antibody purity was determined using SDS-PAGE and HPLC.
  • SEC-HPLC was performed on an Agilent 1100 series instrument using an appropriate size exclusion column (SEC).
  • Antibody expression titer was determined by protein A HPLC.
  • a human IgG capture antibody was immobilized on a CM5 chip by an amine coupling method. The immobilization was performed in both the reference cell and the active cell. Then, kinetic analysis of the anti-Eva1 antibody and hEva1 was performed by a single cycle method using the following measurement conditions.
  • Measurement conditions/Sample compartment temperature 10°C ⁇ Running buffer: HBS-EP+buffer, pH7.4 ⁇ Capturing molecule: Human IgG antibody, reference & active cell ⁇ Ligand: Various antibodies 5nM, active cell only ⁇ Analyte: hEva1-mouse Fc1, 5, 25, 125, 250nM, reference & active cell ⁇ Regeneration buffer: 3M M gCl2 , reference &Active cell blank (Analyte zero concentration) for 3 cycles. The cycle conditions are as shown in the table below.
  • CDR Grafting Polymerization The VH and VL sequences were analyzed using a CDR grafting algorithm, and the CDRs of the B2E5-48 mouse antibody were grafted into selected human germline cells.
  • CDRs are defined as primarily involved in binding to antigens, but amino acids outside the framework region may be directly involved in binding or may play a role in correctly arranging CDRs. be. Therefore, in order to maintain binding, we used a structural guidance method to determine which amino acids in the framework region should be left as mouse-derived (original) amino acids.
  • Table 7 shows an overview of the sequences generated as a result. In addition, in the table, the underlined sequences represent CDRs in each variable region.
  • the glycosylation motif and free cysteine which are the sequences with the highest risk among those shown in Table 4, were not detected in either the mouse antibody or the humanized antibody.
  • deamidation and isomerization motifs were found to exist in these antibodies. However, these motifs are commonly found in normal antibodies, although they are considered high risk as shown in Table 4. Furthermore, although modifications based on these motifs may cause confusion during production, in many cases they can be overcome by appropriate management methods. Furthermore, if necessary, these motifs can be removed by mutagenesis.
  • medium-risk and low-risk sequences were detected from the perspective of obtaining more complete antibodies, but it has rarely been reported that they cause problems in the antibody manufacturing process. Therefore, it was determined that there were no particular problems with the sequences of the mouse antibody and humanized antibody.
  • the average dissociation constant (K D ) was on the order of 10 ⁇ 7 in all cases.
  • H2-L2, H1-L4, H2-L3, and H2-L4 were at the same level as the chimeric antibody (produced by HEK293T cells).
  • H2-L2, H2-L4, and H3-L4 are useful in the antibody applications described below.
  • BD FACS Lysing Solution healthy human peripheral blood was hemolyzed (BD FACS Lysing Solution), and then stained with CD4, CD8, CD19, neutrophils (gate from scatter plot), and monocytes (gate from scatter plot), and at the same time.
  • the cells were stained with mouse anti-human Eva1 antibody and secondary antibody and analyzed by flow cytometry.
  • Example 2 Chimeric antigen receptor using mouse anti-Eva1 antibody sequence (Preparation of Eva1-CAR using anti-human Eva1 mouse antibody sequence) Next, in order to analyze the utility of chimeric antigen receptors (CARs) that target the Eva1 protein, such CARs were created. Specifically, as shown in FIG. 3A, a single chain antibody was constructed using the VL and VH of the anti-human Eva1 mouse antibody (the above B2E5-48 mouse antibody).
  • VL-linker-VH and VH-linker-VL were created, each having a short spacer domain of 15 aa (consisting of the amino acid sequence of positions 268 to 282 of SEQ ID NO: 58 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59).
  • CD28TM CD28 transmembrane region
  • CD28IC CD28 intracellular domain
  • CD3zeta CD3zeta
  • EGFR truncated EGFR, tEGFR
  • tEGFR truncated EGFR
  • CAR and tEGFR molecules at the T2A sequence after translation, and they are distributed in a 1:1 ratio.
  • tEGFR can be used as a gene transfer marker and for selection of transfected cells.
  • Eva1-CAR (having the variable regions VL and VH from the N-terminal side and having the long spacer domain) has the configuration shown in Table 9 below.
  • a retrovirus was loaded onto a retronectin coated plate and spun at 2100 rpm for 120 min. Thereafter, the plate was washed with PBS, and then stimulated CD8+ T cells were seeded and spun at 800 rpm for 2 min. On Day 4, the cells were moved from the retention coated plate to a normal culture dish. Cells were collected on Day 7, a biotinylated EGFR antibody (Erbitax) was added, and then tEGFR-positive cells were purified using MACS anti-biotin beads. The purified cells were continued to be cultured from Day 7 to Day 10. Cells were counted and stored on Day 10. Some of them were stimulated again using CD3/CD28 beads on Day 10, and experiments were conducted on Days 17-20.
  • FIGS. 3C and 3D The gene transfer efficiency on Day 7 performed in this manner is shown in FIGS. 3C and 3D.
  • LH-S CAR using VL-VH with short spacer
  • HL-S CAR using VH-VL with short spacer
  • LH-L CAR using VL-VH CAR with a short spacer
  • HL-L CAR with VH-VL with a long spacer
  • representative plots EGFR on the vertical axis were first stained with biotinylated erbitax, then secondarily stained with streptavidin-PE). stained (indicating cells into which the gene has been introduced).
  • FIG. 3D the results of a similar experiment using cells derived from five healthy donors are shown. As shown in FIGS. 3C and 3D, the longer the spacer, the higher the gene transfer efficiency.
  • IFN-gamma production was not observed in mock T cells into which only EGFR was introduced, but IFN-gamma production was observed in Eva1-CAR-T.
  • IFN-gamma production was not observed against Eva1-negative cell lines, and IFN-gamma production was observed against Eva1-positive cell lines, indicating that the Eva1-CAR-T antigen Specificity was confirmed. Stronger IFN-gamma production was observed with longer spacers than with shorter spacers.
  • FIG. 3F mouse antibody-derived Eva1-CAR-T having spacer regions of six different lengths was produced.
  • the spacer lengths were 0aa, 15aa (SEQ ID NO: 59), 30aa (SEQ ID NO: 60), 60aa (SEQ ID NO: 61), 125aa (SEQ ID NO: 62), and 232aa (SEQ ID NO: 63).
  • 15aa is the same as the short version in the previous experiment
  • 232aa is the same as the long version. This was incorporated into a plasmid to similarly produce a retrovirus, and the gene was introduced into CD8-positive cells in the same manner as above.
  • FIG. 3J shows the amplification efficiency in time series.
  • FIG. 3K the amplification factor on Day 4 is plotted.
  • FIG. 3L shows the amplification efficiency in time series.
  • FIG. 3M the amplification factor on Day 18 is plotted.
  • Example 3 Chimeric antigen receptor using anti-human Eva1 humanized antibody sequence (Preparation of humanized Eva1-CAR-T (hEva1CAR-T) using anti-Eva1 humanized antibody sequence) Next, a total of six types of Eva1CAR-T were created using the humanized antibody sequences described above. Specifically, L2-linker-H (L2H2), H2-linker-L2 (H2L2), L4-linker-H (L4H2), H2-linker-L4 (H2L4), L4-linker-H3 (L4H3), For six types of H3-linker-L4 (H3L4), CARs each having a 232 aa spacer were designed. Then, each of the DNAs encoding these CARs was incorporated into a plasmid, a retrovirus was produced in the same manner as above, and gene introduction was performed.
  • Example 2 (Examination of intracellular domain of L2H2 hEva1-CAR-T) As described above, regarding CAR using humanized antibodies, CAR-T using L2H2 was superior in antigen specificity and cell proliferation. Furthermore, as shown in Example 2, regarding CAR using a mouse-derived antibody, CAR-T with a spacer length of 232 aa was the best in terms of cell proliferation and cytokine production when cultured in the absence of IL-2. On the other hand, when cultured in the presence of IL-2, CAR-T with a 15 aa spacer had the best cell proliferation.
  • CFPAC1 cells human pancreatic cancer cell line
  • H1975 human lung adenocarcinoma cell line
  • 1x10 6 firefly luciferase genes have been introduced into 7-week-old NOG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/ShiJic).
  • tEGFR-transduced cells Two weeks later, 2 ⁇ 10 6 tEGFR-transduced cells (Mock CAR-T cells transfected with only tEGFR, control) or L2H2 hEva1-CAR-T were intravenously administered via the tail vein to transform the CAR.
  • the antitumor activity of -T was evaluated.
  • bioluminescence imaging (BLI) was performed to assess tumor progression using the IVIS Spectrum system. The obtained results are shown in FIGS. 4N to 4Q.
  • weight measurements were performed in parallel.
  • the anticancer effect against bile duct cancer was also evaluated using L2H2 hEva1-CAR-T produced from peripheral blood derived from a different donor than the two used above.
  • HuCCT cells human cholangiocarcinoma cell line
  • HuCCT cells human cholangiocarcinoma cell line
  • the tumor diameter and body weight were measured, and 2 ⁇ 10 6 or 5 ⁇ 10 6 tEGFR-transduced cells (control) or L2H2 hEva1-CAR-T were intravenously administered via the tail vein.
  • the antitumor activity of the CAR-T was evaluated using BLI as an index.
  • the tumor volume was calculated by measuring the major axis and minor axis of the subcutaneous tumor using a caliper and calculating the following formula: "Tumor major axis x short axis x short axis x 1/2". The results obtained are shown in Figures 4R and 4S. Weight measurements were also taken in parallel.
  • L2H2 hEva1-CAR has an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain).
  • L2H2 hEva1-CAR has an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain).
  • L2H2 hEva1-CAR has an antigen recognition site (L2H2) and a transmembrane/intracellular domain (4-1BB or CD79A/CD40-containing domain).
  • T cells expressing such CAR were produced by the same method as above, and on the 10th day in FIG. 3B, the medium was replaced with a cell preservation solution (Cell banker) without restimulation with beads. Stored in liquid nitrogen. After the frozen CAR-T was thawed and cultured overnight, it was restimulated with beads, and one week after the bead stimulation, it was administered to
  • ADC antibody-drug conjugate containing humanized anti-human Eva1 antibody
  • B2E5-H2-L2 humanized B2E5-48 antibody H2-L2
  • B2E5-L2 expression vector TPG986 and B2E5-H2 expression vector TPG987 were created using pcDNA3.4. Each E. The vector was introduced into E.coli JM109, expressed, and purified using NucleoBond Xtra Midi Kit (MACHEREY-NAGEL).
  • B2E5-H2-L2 was transiently expressed in ExpiCHO cells using the vector and ExpiFectamine CHO Transfection System. Then, the obtained culture supernatant was passed through a Protein A column to adsorb antibodies. Neutralization was performed after elution at low pH, followed by purification with Captoadhere, followed by ultrafiltration. The molecular weight, sequence, and ability to bind Eva1 of the obtained antibodies were confirmed.
  • B2E5-H2-L2 was reacted with a linker (SMCC) to introduce an MCC group into the antibody. Then, the linker and DM1 were reacted.
  • SMCC linker
  • DAR drug-antibody ratio
  • Anti-tumor activity of antibody-drug conjugate The anti-tumor activity of the ADC (B2E5-ADC) containing the anti-human Eva1 humanized antibody prepared above was evaluated as follows.
  • a pancreatic cancer cell line (BxPC3) recovered from a culture dish by trypsin treatment was diluted to 5 ⁇ 10 cells/mL, seeded in a 96-well plate with 100 ⁇ L per well, and incubated in a CO 2 incubator (37 °C, CO 2 (concentration: 5%) for 24 hours.
  • the medium (RPMI-1640, Wako187-02705, 10% FBS) was aspirated using an aspirator, and 900 ⁇ L of fresh medium was added to each well.
  • DM1 and B2E5-ADC were diluted with PBS (DM1: 3800 nM to 0.93 nM, B2E5-ADC: 1000 nM to 0.24 nM), and 10 ⁇ L each was added to BxPC3. After culturing in a CO 2 incubator for 48 hours, LDH released from the dead cells was measured using Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST (Dojindo Chemical). The obtained results are shown in FIG. 6B.
  • B2E5-ADC single dose mouse toxicity test B2E5-ADC single dose mouse toxicity test (B2E5-ADC single dose mouse toxicity test) B2E5-ADC (100, 33, 10 ⁇ g) was administered to 9-10 week old C57BL/6 male mice (CLEA Japan) or 10 week old male nude mice (SKN/slc, Japan SLC) by tail vein or lumbar puncture. was administered once (3 animals were prepared for each dose concentration), and body weights were measured over time. The obtained results are shown in FIG.
  • B2E5-ADC exhibited cytotoxic activity against hGIC in a concentration-dependent manner.
  • B2E5-H2-L2 and Kadcyla were not found to have any cytotoxic activity against hGIC.
  • antitumor activity of B2E5-ADC was observed not only against the glioma but also against pancreatic cancer and gastric cancer.
  • the present invention by targeting human Eva1, it is possible to exhibit high antitumor activity. Therefore, the present invention is useful as a drug for treating or preventing cancer.

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Abstract

ヒト由来のEva1タンパク質に結合するヒト化抗体若しくはその機能的断片、当該ヒト化抗体若しくはその機能的断片を含む抗体薬物複合体、又は、ヒト由来のEva1タンパク質に結合する抗体若しくはその機能的断片を含むキメラ抗原受容体。

Description

Eva1タンパク質に結合する、ヒト化抗体又はその機能的断片、抗体薬物複合体及びキメラ抗原受容体
 本発明は、ヒト由来のEva1タンパク質(ヒトEva1)に結合する、ヒト化抗体又はその機能的断片に関する。本発明はまた、当該ヒト化抗体又はその機能的断片を含む、抗体薬物複合体に関する。さらに、本発明は、ヒトEva1に結合する抗体又はその機能的断片を含む、キメラ抗原受容体に関する。
 がんは、冠状動脈疾患と共に、先進国における主たる死因であり、その割合も年々増加の一途を辿っている。そのため、がんの根絶療法の早急な開発が希求されている。がんの根治療法の開発において、がん幹細胞の存在が近年重要視されている。がん幹細胞は、がんの組織のごく一部にしか存在していないものの、自己複製を繰り返し、さらに分化することによって大多数のがん細胞を創出する元になっていると考えられている。また、このような強い腫瘍形成能を有する一方で、がん幹細胞は、化学療法、放射線療法に対して強い耐性能を有していることが示唆されている。そのため、化学療法、放射線療法によって、がん組織における大部分のがん細胞が死滅し得たとしても、がん幹細胞が残存することにより、がんの再発、転移等が生じることとなる。然るに、がん幹細胞を標的として、それも死滅させることができれば、がんの転移や再発等の防止にも有用な治療法の開発につながることが期待されている。
 かかる状況を鑑み、本発明者らは、グリオーマ及びそのがん幹細胞において高発現しているタンパク質としてEva1タンパク質を同定することに成功している。さらに、このEva1タンパク質の発現は、グリオーマの悪性度と相関しており、グリオーマ患者の生存率とその患者由来のグリオーマにおけるEva1遺伝子の発現との間には強い相関があることを明らかにしている。また、Eva1遺伝子の機能の抑制が、グリオーマ細胞の増殖能、腫瘍形成能及び組織浸潤能、並びにグリオーマ幹細胞の腫瘍塊形成能の抑制において有効であることも見出している(特許文献1)。
 また、がんにおいて、このグリオーマは、この数十年間、手術を基本として放射線治療及び化学療法を補助療法とする治療がほとんど変わっておらず、特に中枢神経系組織における悪性グリオーマのうち最も悪性度の高い多形神経膠芽腫(GBM、glioblastoma multiforme)に対して、有効な治療法は未だ見出されていない。さらに、悪性グリオーマに対する標準治療薬としてテモゾロミドが用いられているが、有効血中濃度の数倍のテモゾロミドに対しても、グリオーマ幹細胞は非感受性であることを発明者らは確認している。また、このような化学療法剤に曝露されたがん細胞は、グリオーマに限らず、それに対する耐性が生じ、他の複数の化学療法剤に対しても同様に交差耐性が生じることも多い。さらに、化学療法剤は正常細胞に対しても細胞傷害をもたらすことが多々あり、そのような副作用を低減するため、化学療法剤の用量又は用法は多くの場合制約される。
 かかる現状から、近年、抗がん剤としての抗体の利用が注目され、その重要性が認められつつある。例えば、がん特異的な抗原を標的とした抗体であれば、投与した抗体はがん組織に集積することが推定されるため、抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性や補体依存性細胞傷害(CDC)活性による、免疫システムを介したがん細胞への攻撃が期待できる。
 また、抗体に細胞毒性物質や放射性核種等の薬剤を結合しておくこと(所謂、抗体薬物複合体(ADC)の態様をとること)により、結合した薬剤を効率よく腫瘍部位に送達することが可能となる。これにより、他組織への薬剤到達量を減少させ、ひいては副作用の軽減を見込むことができる。
 また、がん特異的抗原に細胞死を誘導する活性がある場合は、アゴニスティックな活性を持つ抗体を投与することで、また、がん特異的抗原が細胞の増殖及び生存に関与する場合は、中和活性を持つ抗体を投与することで、腫瘍特異的な抗体の集積と抗体の活性によって、がんの増殖停止または退縮が期待できる。
 さらに、抗体の可変領域を組み込んだキメラ抗原受容体(CAR)を発現させたT細胞(CAR-T)を投与することによって、当該細胞は、標的抗原陽性がん細胞に対してHLA非依存的に活性化し、細胞死を誘導することも期待されている。
 このような特性から、抗体は抗がん剤としての適用に好適であると考えられており、本発明者らも、上述のEva1を標的とする抗体医薬の創出を目的として高親和性抗ヒトEva1マウス抗体を作製し、その有効性を示している(特許文献2)。
国際公開第2012/043747号 国際公開第2017/022668号
 本発明は、がんの治療等に有用な、抗体若しくはその機能的断片、又は当該抗体若しくはその機能的断片を含む複合体を提供することを目的とする。
 本発明者らは、抗ヒトEva1マウス抗体(特許文献2に記載の、B2E5-48マウス抗体)をヒト化することを試み、ヒト化した重鎖可変領域4種(H1~H4)及び軽鎖可変領域4種(L1~L4)を組み合わせ、16種類のヒト化抗体を作製した。その結果、Eva1タンパク質に対する結合親和性が高く、また産生能(抗体価)が高い、ヒト化抗体(H2-L2、H2-L4、H3-L4等の組み合わせ)を得ることに成功した。
 また、抗ヒトEva1抗体の可変領域を組み込んだキメラ抗原受容体(CAR)を作製し、その有効性を評価した。その結果、かかるCARを発現させたT細胞(CAR-T)は、ヒトEva1に応じた活性化(サイトカイン産生)及び細胞増殖を示した。さらに、Eva1タンパク質発現腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示すことが明らかになった。
 また、B2E5-48マウス抗体の可変領域を組み込んだCARにおいて、当該可変領域を含む抗原結合性領域と膜貫通領域との間のスペーサー長を変更して評価した結果、かかるCARを発現するT細胞を、IL-2非存在下で培養した場合には、前記スペーサー長を232アミノ酸とするCAR-Tが、細胞増殖及びサイトカイン産生において最も優れていることが明らかになった。一方、IL-2存在下で培養した場合には、15アミノ酸からなるスペーサーを持つCAR-Tの細胞増殖が最も良かった。
 さらにまた、上記ヒト化抗体の可変領域を組み込んだCARにおいて、ヒトEva1に応じた活性化及び細胞増殖等の観点から、L2-H2の組み合わせが最も有用であることも見出した。さらに、抗原認識部位をL2-H2とするCAR-Tに関し、種々の細胞内ドメインを試し、それらの差による反応性の違いを評価した結果、細胞増殖において4-1BB、CD79A/CD40の細胞内ドメインを持つCARが優れていることが明らかになった。また、担がんモデルに、前記CAR-T(L2-H2 hEva1-CAR-T)を投与し、その抗腫瘍活性及び安全性を確認した。
 また、上記ヒト化抗体を含む抗体薬物複合体(ADC)を作製し、その有効性を評価した。その結果、当該ADCの、グリオーマ、膵がん、胃がんといった様々な腫瘍に対する抗腫瘍活性が認められた。一方、投与した生体への悪影響(体重の減少、生存期間の短縮等)は認められなかった。
 本発明は、上記検討結果に基づくものであり、より具体的には以下の態様を提供するものである。
 <1> 配列番号:1に記載のアミノ酸配列、Val-Thr-Serからなるアミノ酸配列及び配列番号:3に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域1~3を含む軽鎖可変領域と、配列番号:4~6に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域1~3を含む重鎖可変領域とを有し、ヒト由来のEva1タンパク質に結合する、ヒト化抗体又はその機能的断片。
 <2> 前記軽鎖可変領域が、配列番号:7~10に記載のアミノ酸配列、配列番号:7~10に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:7~10に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
 前記重鎖可変領域が、配列番号:13~16に記載のアミノ酸配列、配列番号:13~16に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:13~16に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、<1>に記載のヒト化抗体又はその機能的断片。
 <3> 前記軽鎖可変領域が、配列番号:7に記載のアミノ酸配列、配列番号:7に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:7に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
 前記重鎖可変領域が、配列番号:13に記載のアミノ酸配列、配列番号:13に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:13に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、<1>に記載のヒト化抗体又はその機能的断片。
 <4> <1>~<3>のうちのいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片と、薬物とを結合させてなる、抗体薬物複合体。
 <5> <4>に記載の抗体薬物複合体を含む、医薬組成物。
 <6> ヒト由来のEva1タンパク質に結合する領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル領域とを含む、キメラ抗原受容体。
 <7> 前記ヒト由来のEva1タンパク質に結合する領域が、<1>~<3>のうちのいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片を含む領域である、<6>に記載のキメラ抗原受容体。
 <8> 前記ヒト由来のEva1タンパク質に結合する領域が、アミノ末端側から順に、軽鎖可変領域と、リンカーと、重鎖可変領域とが結合してなる、単鎖可変領域断片を含み、
 前記軽鎖可変領域が、
配列番号:1に記載のアミノ酸配列、Val-Thr-Serからなるアミノ酸配列及び配列番号:3に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域1~3を含み、かつ
配列番号:7に記載のアミノ酸配列、配列番号:7に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:7に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
 前記重鎖可変領域が、
配列番号:4~6に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域1~3を含み、かつ
配列番号:13に記載のアミノ酸配列、配列番号:13に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:13に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、
<6>に記載のキメラ抗原受容体。
 <9> 前記ヒト由来のEva1タンパク質に結合する領域と、前記膜貫通領域とが、10~300個のアミノ酸からなるスペーサーを介して結合している、<6>~<8>のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
 <10> 前記細胞内シグナル領域が、CD79A細胞内領域及びCD40細胞内領域を含む、<6>~<9>のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
 <11> <6>~<10>のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド。
 <12> <11>に記載のヌクレオチドを含むベクター。
 <13> <6>~<10>のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
 <14> 免疫細胞である、<13>に記載の細胞。
 <15> <13>又は<14>に記載の細胞を含む、医薬組成物。
 なお、各配列番号に記載の配列は、以下のとおりである。
 なお、表1に示すとおり、配列番号:2は、CDR2 of Light Chain(Humanized B2E5-48)のアミノ酸配列(N末から順に、バリン-スレオニン-セリンからなるアミノ酸配列)を意図したものである(表7も参照のほど)。しかしながら、当該配列は4個未満(3個)のアミノ酸の配列となるため、配列表においては「意図的にスキップされた配列」として取り扱われている。
 本発明によれば、ヒトEva1を標的とすることにより、がん等を治療又は予防することが可能となる。
正常ヒト血液細胞におけるヒトEva1の発現を解析した結果を示す、ヒストグラムである。 各種腫瘍細胞におけるヒトEva1の発現を解析した結果を示す、ヒストグラムである。 肝内胆管がん症例(検体1~3)におけるヒトEva1の発現を解析した結果を示す、ヒストグラムである。 抗Eva1抗体配列を用いたキメラ抗原受容体(Eva1-CAR)の概要を示す、図である。 Eva1-CAR発現T細胞(Eva1-CAR-T)の作製スケジュールの概要を示す、図である。 tEGFRの発現を指標とした選抜(tEGFR selection)前のEva1-CAR遺伝子の導入効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。 tEGFR selection前のEva1-CAR遺伝子の導入効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。図中、ドットは、前記Eva1-CAR遺伝子を導入した細胞の由来(5人の健常人)を各々示す。太線は平均値を示し、ひげは標準誤差を示す。 Eva1-CAR-Tの各種腫瘍細胞に対するサイトカイン(IFN-γ)産生を解析した結果を示す、グラフである。図中、横軸において、導入したEva1-CAR毎に、左から順にCFPAC-1、NCI-H1975、HuCCT-1、MCF7、HepG2、Huh7、OVTOKO、T98G、PA1に対する結果を示す。 Eva1-CARにおける6種類の長さの異なるスペーサーの概要を示す、図である。なお、図3Fに示す「H00」~「H232」の表記は、図3G~3Mにおけるそれらに対応する。 tEGFR selection前のEva1-CAR遺伝子の導入効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。図中、ドットは、前記Eva1-CAR遺伝子を導入した細胞の由来(5人の健常人)を各々示す。太線は平均値を示し、ひげは標準誤差を示す。 tEGFR selection後のEva1-CAR遺伝子の導入効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。図中、ドットは、前記Eva1-CAR遺伝子を導入した細胞の由来(5人の健常人)を各々示す。太線は平均値を示し、ひげは標準誤差を示す。 Eva1-CAR-Tの各種腫瘍細胞に対するサイトカイン産生を解析した結果を示す、グラフである。図中、左側のグラフにおいてIFN-γ産生を解析した結果を示し、右側のグラフにおいてIL-2産生を解析した結果を示す。導入したEva1-CAR毎に、左から順にHuCCT-1、CFPAC-1、HepG2、OVTOKOに対する結果を示す。 IL-2非存在下、抗原刺激後のEva1-CAR-Tの増幅効率を示す、グラフである。図中、横軸に、抗原刺激(Eva1陽性であるHuCCT-1との共培養)を開始してからの日数を示す。縦軸に、Eva1-CAR-Tの細胞数を示す。 IL-2非存在下、抗原刺激後のEva1-CAR-Tの増幅効率を示す、グラフである。図中、横軸に、導入したCARの種類を示す。縦軸に、Eva1-CAR-Tの細胞数を示す。 IL-2存在下、抗原刺激後のEva1-CAR-Tの増幅効率を示す、グラフである。図中、横軸に、抗原刺激(Eva1陽性であるHuCCT-1との共培養)を開始してからの日数を示す。縦軸に、Eva1-CAR-Tの細胞数を示す。 IL-2存在下、抗原刺激後のEva1-CAR-Tの増幅効率を示す、グラフである。図中、横軸に、導入したCARの種類を示す。縦軸に、Eva1-CAR-Tの細胞数を示す。 tEGFR selection前の、抗Eva1ヒト化抗体配列を用いたEva1-CAR(hEva1-CAR)遺伝子の導入効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。図中、ドットは、前記hEva1-CAR遺伝子を導入した細胞の由来(4人の健常人)を各々示す。ひげは標準誤差を示し、ひげに挟まれた真ん中の線は平均値を示す。 tEGFR selection後の、hEva1-CAR-Tの増幅効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。図中、ドットは、前記hEva1-CAR遺伝子を導入した細胞の由来(4人の健常人)を各々示す。ひげは標準誤差を示し、ひげに挟まれた真ん中の線は平均値を示す。 hEva1-CAR-Tの各種腫瘍細胞に対するIFN-γ産生を解析した結果を示す、グラフである。導入したEva1-CAR毎に、左から順にHuCCT-1、CFPAC-1、HepG2、OVTOKOに対する結果を示す。 hEva1-CAR-Tの各種腫瘍細胞に対するIL-2産生を解析した結果を示す、グラフである。導入したEva1-CAR毎に、左から順にHuCCT-1、CFPAC-1、HepG2、OVTOKOに対する結果を示す。 抗原刺激後のhEva1-CAR-Tの増幅効率を示す、グラフである。図中、左側にIL-2非存在下における結果を示し、右側にIL-2存在下における結果を示す。各グラフにおいて、横軸に、抗原刺激(Eva1陽性であるHuCCT-1との共培養)を開始してからの日数を示す。縦軸に、hEva1-CAR-Tの細胞数を示す。 細胞内ドメイン及びスペーサー長の異なる6種類の、hEva1-CAR-T(抗原認識部位:L2H2)の概要を示す、図である。 tEGFR selection前の、hEva1-CAR遺伝子の導入効率を解析した結果を示す、ドットプロット図である。図中、ドットは、前記hEva1-CAR遺伝子を導入した細胞の由来(5人の健常人)を各々示す。真ん中の線は平均値を示す。横軸における「28」、「41」及び「79」は、各CARが有する細胞内ドメインが各々「CD28IC」、「4-1BBIC」及び「CD79A/CD40IC」であることを示す。また、「-S」及び「-L」は各々、スペーサーが、図4Fに示す「H15」及び「H232」であることを示す。 hEva1-CAR-Tの各種腫瘍細胞に対するIFN-γ産生を解析した結果を示す、グラフである。導入したEva1-CAR毎に、左から順にOVTOKO、CFPAC-1、HepG2、HuCCT、MCF7に対する結果を示す。横軸における「28」、「41」及び「79」は、各CARが有する細胞内ドメインが各々「CD28IC」、「4-1BBIC」及び「CD79A/CD40IC」であることを示す。また、「-S」及び「-L」は各々、スペーサーが、図4Fに示す「H15」及び「H232」であることを示す。 hEva1-CAR-Tの各種腫瘍細胞に対するIL-2産生を解析した結果を示す、グラフである。導入したEva1-CAR毎に、左から順にOVTOKO、CFPAC-1、HepG2、HuCCT、MCF7に対する結果を示す。横軸における「28」、「41」及び「79」は、各CARが有する細胞内ドメインが各々「CD28IC」、「4-1BBIC」及び「CD79A/CD40IC」であることを示す。また、「-S」及び「-L」は各々、スペーサーが、図4Fに示す「H15」及び「H232」であることを示す。 抗原刺激後のhEva1-CAR-Tの増幅効率を示す、グラフである。図中、左側のグラフに、IL-2非存在下における結果を示し、右側のグラフに、IL-2存在下における結果を示す。各グラフにおいて、横軸に、抗原刺激(Eva1陽性であるHuCCT-1との共培養)を開始してからの日数を示す。縦軸に、hEva1-CAR-Tの細胞数を示す。また、凡例における「28」、「41」及び「79」は、各CARが有する細胞内ドメインが各々「CD28IC」、「4-1BBIC」及び「CD79A/CD40IC」であることを示す。また、「-S」及び「-L」は各々、スペーサーが、図4Fに示す「H15」及び「H232」であることを示す。 hEva1-CAR-TとEva1陽性骨髄腫細胞(RPMI-8226)との共培養試験の結果を示す、グラフである。図中、左側のグラフにおいて、ドナー2の末梢血から作製したhEva1-CAR-Tの結果を示し、右側のグラフにおいて、ドナー3の末梢血から作製したhEva1-CAR-Tの結果を示す。各グラフの縦軸において、全細胞に占める腫瘍細胞の割合を示す。横軸において、共培養を開始してからの時間を示す。また、凡例における「28」、「41」及び「79」は、各CARが有する細胞内ドメインが各々「CD28IC」、「4-1BBIC」及び「CD79A/CD40IC」であることを示す。また、「s」及び「L」は各々、スペーサーが、図4Fに示す「H15」及び「H232」であることを示す。 hEva1-CAR-Tと51Crで標識した各種腫瘍細胞株とを共培養し、細胞傷害活性を解析した結果を示すグラフである。図中、縦軸において、培養上清中51Cr放出量に基づく傷害された細胞の割合を示す。横軸において、各種腫瘍細胞株を、Eva1の発現が陰性であるか、陽性であるかとを併せて示す。また、凡例における「41」及び「79」は、各CARが有する細胞内ドメインが各々「4-1BBIC」及び「CD79A/CD40IC」であることを示す。また、「S」及び「L」は各々、スペーサーが、図4Fに示す「H15」及び「H232」であることを示す。 図4Lに示した結果に基づき、各種腫瘍細胞株におけるヒトEva1の発現量と、各種腫瘍細胞株に対するhEva1-CAR-Tの細胞傷害活性との相関性を、解析した結果を示す、グラフである。図中、縦軸において、培養上清中51Cr放出量に基づく傷害された細胞の割合を示す。横軸において、各種腫瘍細胞株における抗ヒトEva1抗体を用いたフローサイトメトリー解析によって得られた平均蛍光強度(MFI)を示しており、これはEva1発現量と相関する。また、凡例における「41」及び「79」は、各CARが有する細胞内ドメインが各々「4-1BBIC」及び「CD79A/CD40IC」であることを示す。また、「S」及び「L」は各々、スペーサーが、図4Fに示す「H15」及び「H232」であることを示す。 異なる2人のドナー(ドナーA、ドナーB)に由来する末梢血から作製したL2H2 hEva1-CAR-Tを、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が導入してあるヒト肺腺癌細胞株(H1975)を担持するマウスに導入し、当該CAR-Tの抗腫瘍活性を、生物発光イメージングにより分析した結果を示す、図である。L2H2 hEva1-CARとして、抗原認識部位(L2H2)と、膜貫通・細胞内ドメイン(4-1BB又はCD79A/CD40を含むドメイン)とを、短いスペーサー(図中「short hinge」にて表記、図4Fに示す「H15」)で繋いだものを用いた。コントロールとして、tEGFR導入細胞(tEGFRだけを遺伝子導入したMock CAR-T細胞)の投与例も作製して分析した。また、図中の「Day」は、CAR-Tを投与してからの日数を示す。なお、4-1BBを膜貫通・細胞内ドメインに含むL2H2 hEva1-CAR-Tの投与例の「Day 14」において、2匹少なくなっているが、実験手技の問題によって死亡したことによる。また、発光スペクトルは、図4P及び4Rにおいても適用される。 異なる2人のドナー(ドナーA、ドナーB)に由来する末梢血から作製したL2H2 hEva1-CAR-Tを、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が導入してあるヒト膵がん細胞株(CFPAC1)を担持するマウスに導入し、当該CAR-Tの抗腫瘍活性を、生物発光イメージングにより分析した結果を示す、図である。L2H2 hEva1-CARとして、抗原認識部位(L2H2)と、膜貫通・細胞内ドメイン(4-1BB又はCD79A/CD40を含むドメイン)とを、short hingeで繋いだものを用いた。コントロールとして、tEGFR導入細胞の投与例も作製して分析した。また、図中の「Day」は、CAR-Tを投与してからの日数を示す。発光スペクトルは、図4P及び4Rにおいても適用される。 異なる2人のドナー(ドナーA、ドナーB)に由来する末梢血から作製したL2H2 hEva1-CAR-Tを、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が導入してあるヒト膵がん細胞株(CFPAC1)又はヒト肺腺癌細胞株(H1975)を担持するマウスに導入し、当該CAR-Tの抗腫瘍活性を、生物発光イメージングにより分析した結果を示す、図である。L2H2 hEva1-CARとして、抗原認識部位(L2H2)と、膜貫通・細胞内ドメイン(4-1BB又はCD79A/CD40を含むドメイン)とを、short hingeで繋いだものを用いた。コントロールとして、tEGFR導入細胞の投与例も作製して分析した。また、図中の「Day」は、CAR-Tを投与してからの日数を示す。発光スペクトルは、図4P及び4Rにおいても適用される。 異なる2人のドナー(ドナーA、ドナーB)に由来する末梢血から作製したL2H2 hEva1-CAR-Tを、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が導入してあるヒト膵がん細胞株(CFPAC1)又はヒト肺腺癌細胞株(H1975)を担持するマウスに導入し、当該CAR-Tの抗腫瘍活性を、生物発光イメージングにより経時的に分析した結果(発光強度)を示す、グラフである。L2H2 hEva1-CARとして、抗原認識部位(L2H2)と、膜貫通・細胞内ドメイン(4-1BB又はCD79A/CD40を含むドメイン)とを、short hingeで繋いだものを用いた。コントロールとして、tEGFR導入細胞の投与例も作製して分析した。 ドナーCに由来する末梢血から作製したL2H2 hEva1-CAR-Tを、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が導入してあるヒト胆管がん細胞株(HuCCT細胞)を担持するマウスに導入し、当該CAR-Tの抗腫瘍活性を、生物発光イメージングにより分析した結果を示す、図である。L2H2 hEva1-CARとして、抗原認識部位(L2H2)と、膜貫通・細胞内ドメイン(4-1BB又はCD79A/CD40を含むドメイン)とを、short hingeで繋いだものを用いた。コントロールとして、tEGFR導入細胞の投与例も作製して分析した。また、図中の「Day」は、CAR-Tを投与してからの日数を示す。 ドナーCに由来する末梢血から作製したL2H2 hEva1-CAR-Tを、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が導入してあるヒト胆管がん細胞株(HuCCT細胞)を担持するマウスに導入して分析した結果を示す、図である。L2H2 hEva1-CARとして、抗原認識部位(L2H2)と、膜貫通・細胞内ドメイン(4-1BB又はCD79A/CD40を含むドメイン)とを、short hingeで繋いだものを用いた。コントロールとして、tEGFR導入細胞の投与例も作製して分析した。また、図中、左側のグラフは、前記CAR-Tの抗腫瘍活性を、生物発光イメージングにより経時的に分析した結果(発光強度)を示す。右側のグラフは、前記CAR-Tを投与した担がんマウスにおける腫瘍体積を経時的に分析した結果を示す。 抗ヒトEva1ヒト化抗体を含む、抗体薬物複合体(B2E5-ADC)の製造工程の概要を示す、図である。 B2E5-ADCのグリオーマ(hGIC E6,hGIC E16)に対する細胞傷害実験の結果を示す、グラフである。図中、各グラフの縦軸は腫瘍細胞の生存率を示し、横軸はADC又は抗体の培地への添加濃度を示す。 B2E5-ADCの膵がん(BxPC3)に対する細胞傷害実験の結果を示す、グラフである。図中、各グラフの縦軸は腫瘍細胞における傷害の程度を反映する吸光度を示す。横軸はADC又は薬剤(DM1)の培地への添加濃度を示す。 B2E5-ADCの胃がん(MKN74)に対する細胞傷害実験の結果を示す、グラフである。図中、各グラフの縦軸は腫瘍細胞の生存率を示す。横軸はADC又は抗体の培地への添加濃度を示す。 B2E5-ADCのマウスに対する毒性試験の結果を示すグラフである。より具体的には、野生型(C57BL/6)又はヌードマウス(SKN/slc)に、尾静脈(intravenous injection)又は腰椎穿刺(intrahecal injection)によって、B2E5-ADC(100、33、10μg)を単回投与し、これらマウスにおける体重の経時的変化を示すグラフである。図中、丸、三角、四角は、各々マウス1個体のデータを表す。
 <抗Eva1抗体>
 本発明は、ヒト由来のEva1タンパク質(ヒトEva1)に結合する、抗体又はその機能的断片に関する。
 本発明において、「Eva(Epithelial V-like antigen)1」は、一回膜貫通型の細胞膜タンパク質であり、MPZL2(Myelin protein Zero-like 2)とも称される細胞骨格系に関わる分子である。ヒト由来のものであれば典型的には配列番号:54に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質(配列番号:53に記載のヌクレオチド配列がコードするタンパク質)である。しかしながら、遺伝子のDNA配列は、その変異等により、自然界において(すなわち、非人工的に)変異し、それにコードされるタンパク質のアミノ酸配列もそれに伴い改変される。したがって、本発明に係る「Eva1タンパク質」は、前記典型的なアミノ酸配列からなるタンパク質に特定されることなく、このような天然の変異体も含まれる。
 本発明における「抗体」は、免疫グロブリンの全てのクラス及びサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれる。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、及び/又は回収された(即ち、単離された)抗体である。
 本発明の抗体のヒトEva1に対する反応性は、KD(解離定数)値として10-6以下であることが好ましく、6×10-7以下であることがより好ましい。「反応性」とは、抗原であるヒトEva1に対する結合親和性及び/又は特異性を意味する。かかる反応性は、当業者であれば、免疫学的手法により評価することができ、例えば、後述の実施例において示すように、表面プラズモン共鳴法による解析によってKD値として求めることができる。また、本発明の抗体は、ヒトEva1タンパク質以外に、他の動物由来のEva1タンパク質(例えば、マウスEva1タンパク質(典型的には配列番号:56に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号:55に記載のヌクレオチド配列がコードするタンパク質))に結合する抗体であってもよい。
 本発明の抗体は、ADCC活性及びCDC活性から選択される少なくとも1つの細胞傷害活性を有していてもよく、ADCC活性及びCDC活性の双方を有していてもよい。
 本発明において「ADCC活性(抗体依存性細胞傷害活性)」とは、標的細胞の細胞表面抗原に抗体が結合した際、その抗体のFc領域にエフェクター細胞(NK細胞、単球等の免疫細胞)がさらに結合することにより、当該細胞が活性化され、それに伴い、因子を放出して標的細胞を殺傷する活性を意味する。他方、「CDC活性(補体依存性細胞傷害活性)」とは、抗体が標的細胞に結合すると補体系が活性化し、その結果、標的細胞を溶解する活性を意味する。
 また、本発明の抗体は、好ましくは、0.01μg/mLにてヒトEva1を発現する標的細胞に対してADCC活性を有する抗体である。本発明の抗体がこのようなADCC活性を有しているか否かは、例えば、特許文献2の実施例に記載の方法にて測定することができ、より具体的には、ヒトEva1を発現させたDaudi細胞を標的細胞とし、その細胞溶解率にてADCC活性を評価した場合において、0.01μg/mLの本発明の抗体を用いた場合のADCC活性は、好ましくは、細胞溶解率が30%以上であり、より好ましくは50%以上、さらに好ましくは70%以上である。
 また、本発明の抗体は、好ましくは0.30μg/mLにて、より好ましくは0.01μg/mLにて、ヒトEva1を発現する標的細胞に対してCDC活性を有する抗体である。本発明の抗体がこのようなCDC活性を有しているか否かは、例えば、特許文献2の実施例に記載の方法にて測定することができ、より具体的には、ヒトEva1を発現させたDaudi細胞を標的細胞とし、その細胞溶解率にてCDC活性を評価した場合において、0.30μg/mLの本発明の抗Eva1抗体を用いた場合のCDC活性は、好ましくは、細胞溶解率が20%以上であり、より好ましくは40%以上、さらに好ましくは60以上、より好ましくは80%以上である。
 本発明の抗体はまた、抗腫瘍活性を有していてもよい。本発明において「抗腫瘍活性」とは、がん細胞の増殖を抑制する活性、がん細胞の死を誘導する活性及びがん細胞の転移を抑制する活性のうちの少なくともいずれか一つの活性を意味する。抗腫瘍活性は、例えば、特許文献2の実施例に記載のような担がんモデル(B16メラノーマ細胞を接種したマウス等)を用いた分析により評価することができる。より具体的には、B16メラノーマ細胞をマウスに静脈内投与等した後、その翌日又は数週間後から、毎日又は数日おきに、抗Eva1抗体を静脈内投与等する。そして、肺に形成されたB16メラノーマ細胞のコロニー数を計測することにより、インビボでの抗がん活性を評価することができる。陰性対照として、同一のアイソタイプを有するコントロール抗体を投与してもよく、またPBS等を投与してもよい。そして、抗Eva1抗体投与群におけるコロニー形成数が陰性対照投与群におけるそれよりも少ない場合(陰性対照投与群におけるコロニー形成数を100%とした際に、好ましくは60%以下、より好ましくは40%以下、さらに好ましくは20%以下、より好ましくは10%以下)に、当該抗Eva1抗体は抗腫瘍活性を有すると判定し得る。
 本発明の抗体は、ヒトEva1に対する反応性を有していればよく、その由来、種類、形状等は特に限定されない。具体的には、非ヒト動物由来の抗体(例えば、マウス抗体、ウサギ抗体、ラット抗体、ラクダ抗体)、ヒト由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体が含まれる。
 本発明において「非ヒト動物由来の抗体」としては、例えば、特許文献2に開示されている、以下のような可変領域を保持するヒトEva1に対する抗体を挙げることができる。
(a)配列番号:27に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号:21に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
(b)配列番号:39に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号:33に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
(c)配列番号:49に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号:44に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
 さらに、本発明は、例えば、以下のようなCDRを保持するヒトEva1に対する抗体に関する。
(a)配列番号:27に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖CDR1~3と、配列番号:21に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖CDR1~3とを保持する抗体。
(b)配列番号:39に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖CDR1~3と、配列番号:33に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖CDR1~3とを保持する抗体。
(c)配列番号:49に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖CDR1~3と、配列番号:44に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖CDR1~3とを保持する抗体。
 なお、かかる抗体に関し、可変領域のアミノ酸配列に基づきCDRを決定する方法としては特に制限はないが、例えば、Chothia、IMGT、Kabat、Aho等の公知のナンバリングスキームが挙げられ、より具体的に、Chothiaナンバリング法によって決定された例として、以下のようなCDRを保持するヒトEva1に対する抗体を挙げることができる。
(a-1)配列番号:28~30に記載のアミノ酸配列を各々重鎖CDR1~3として保持し、かつ、配列番号:22~24に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖CDR1~3として保持する抗体。
(b)配列番号:40~42に記載のアミノ酸配列を各々重鎖CDR1~3として保持し、かつ、配列番号:34~36に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖CDR1~3として保持する、抗体。
(c)配列番号:50~52に記載のアミノ酸配列を各々重鎖CDR1~3として保持し、かつ、配列番号:45~47に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖CDR1~3として保持する、抗体。
 また、IMGTナンバリング法によって決定された例として、以下のようなCDRを保持するヒトEva1に対する抗体を挙げることができる。
(a-2)配列番号:4~6に記載のアミノ酸配列を各々重鎖CDR1~3として保持し、かつ、配列番号:1に記載のアミノ酸配列、Val-Thr-Serからなるアミノ酸配列及び配列番号:3に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖CDR1~3として保持する抗体。
 また、本発明においては、このような特定のアミノ酸配列からなる可変領域及び/又はCDRを保持する抗体のみならず、望ましい活性(抗原に対する反応性等)を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。このようなアミノ酸配列変異体は、例えば、上述の可変領域等をコードするDNAへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び/又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域(フレーム領域(FR)及びCDR)であってもよい。CDR以外のアミノ酸の改変は、抗原との反応性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、CDRのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である(PNAS,102:8466-8471(2005)、Protein Engineering,Design&Selection,21:485-493(2008)、国際公開第2002/051870号、J.Biol.Chem.,280:24880-24887(2005)、Protein Engineering,Design&Selection,21:345-351(2008)、MAbs.Mar-Apr;6(2):437-45(2014))。また、現在では、統合計算化学システム等(例えば、Molecular Operating Enviroment、カナダCCG社製)を利用することにより、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をモデリングすることもできる(例えば、http://www.rsi.co.jp/kagaku/cs/ccg/products/application/protein.html 参照)。さらに、Protein Eng Des Sel.2010 Aug;23(8):643-51に記載の通り、抗原へのアフィニティーにおいて、重鎖可変領域のCDR1及び軽鎖可変領域のCDR3は関与していない例が知られている。また同様に、Molecular Immunology 44:1075-1084(2007)には、大抵の抗体においては、軽鎖可変領域のCDR2は抗原へのアフィニティーに関与していないということが報告されている。このように、抗体の抗原へのアフィニティーにおいては、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域各々のCDR1~3の全てを要せずとも、同等の活性を発揮し得る。実際に、Biochem Biophys Res Commun.2003 Jul 18;307(1):198-205、J Mol Biol.2004 Jul 9;340(3):525-42、J Mol Biol.2003 Aug 29;331(5):1109-20においては、元の抗体の少なくとも1のCDRを保持することによって、抗原へのアフィニティーが維持された例が報告されている。
 また、本発明の抗体に関し、可変領域において改変されるアミノ酸数は、好ましくは、10アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、さらに好ましくは3アミノ酸以内(例えば、2アミノ酸以内、1アミノ酸)である。さらに、かかる改変は全て、抗原との反応性への影響が少ないという観点から、CDR以外、すなわちFRに施されていることが好ましい。また、CDRにおいて改変されるアミノ酸数は、好ましくは5アミノ酸以内、より好ましくは3アミノ酸以内(例えば、2アミノ酸以内、1アミノ酸)である。
 アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸(アスパラギン酸及びグルタミン酸)、塩基性アミノ酸(リジン・アルギニン・ヒスチジン)、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸(グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン)、ヒドロキシ基を持つアミノ酸(セリン・トレオニン)、硫黄を含むアミノ酸(システイン・メチオニン)、アミド基を持つアミノ酸(アスパラギン・グルタミン)、イミノ基を持つアミノ酸(プロリン)、芳香族基を持つアミノ酸(フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン)で分類することができる。
 また、改変後のアミノ酸配列が、上述の特定のアミノ酸配列からなる可変領域とアミノ酸配列レベルで80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む可変領域を保持する抗体も、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、本発明の抗体に含まれる。かかる相同性としては、少なくとも80%であればよいが、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上(例えば、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)である。また、配列の相同性は、BLASTP(アミノ酸レベル)のプログラム(Altschul et al.J.Mol.Biol.,215:403-410,1990)を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264-2268,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877,1993)に基づいている。BLASTPによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばscore=50、wordlength=3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら(Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
 また、「同等の活性を有する」とは、例えば、抗原への反応性が、対象抗体(例えば、特許文献2に記載の、B2E5-48マウス抗体)と同等(例えば、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上)であることを意味する。
 また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる等の抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のADCC活性を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、N-結合又はO-結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失等の公知の方法で行うことができる(特開2008-113663号公報、米国特許第5047335号、米国特許第5510261号、米国特許第5278299号、国際公開第99/54342号)。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
 本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部(可変領域)を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部(定常領域)遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる(例えば、特開平8-280387号公報、米国特許第4816397号公報、米国特許第4816567号公報、米国特許第5807715号公報)。
 キメラ抗体の定常領域には、通常、ヒト由来の抗体のものが使用される。例えば重鎖においては、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、及びCεを定常領域として利用することができる。また軽鎖においてはCκやCλを定常領域として使用できる。これらの定常領域のアミノ酸配列、並びにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体自体の安定性、又は抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト由来の抗体定常領域中の1又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加及び/又は挿入をすることができる。
 本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来の抗体のCDRの遺伝子配列をヒト由来の抗体遺伝子に移植(CDRグラフティング)した抗体であり、その作製方法は、オーバーラップエクステンションPCR等、公知である(例えば、欧州特許出願公開第239400号明細書、欧州特許出願公開第125023号明細書、国際公開第90/07861号、国際公開第96/02576号)。抗体の可変領域は、通常、4つのFRにはさまれた3つのCDRで構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む一方、FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。また、CDRの機能の維持の観点から、非ヒト由来CDRのヒトFRへの移植においては、その非ヒト動物由来のFRと相同性の高いヒトFRが選択される。すなわち、CDR内のアミノ酸は、抗原を認識するばかりでなく、CDRの近傍にあるFRのアミノ酸と配位し、CDRのループ構造の維持にも関与しているため、移植すべきCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用することが好ましい。
 非ヒト動物由来のFRと相同性の高い公知のヒトFRの検索を、例えば、インターネットで利用可能な抗体に特化した検索システム(http://www.bioinf.org.uk/abysis/)を利用して行うことができる。このようにして得られたヒトFRの配列と一致するように、非ヒト由来の抗体のCDR以外の配列に変異を導入することができる。あるいは、検索によって得られたヒトFRのアミノ酸配列をコードする遺伝子(cDNA)が入手可能な場合は、その配列中に非ヒト由来CDRを導入してもよい。変異の導入等は核酸合成、部位特異的変異誘発などの当該分野で公知の技術を用いて行うことができる。
 このようにして作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト由来の抗体のFRが好適に選択できる。また必要に応じ、Sato,K.et al.,Cancer Res,1993,53,851-856等に記載の方法に沿って、ヒト化抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもでき、さらに当該アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を測定して評価することによって、所望の性質を有する変異FR配列を選択することができる。
 本発明において、「ヒト化抗体」としては、例えば、配列番号:1に記載のアミノ酸配列、Val-Thr-Serからなるアミノ酸配列及び配列番号:3に記載のアミノ酸配列を各々含むCDRを含む軽鎖可変領域と、配列番号:4~6に記載のアミノ酸配列を各々含むCDR1~3を含む重鎖可変領域とを有し、ヒト由来のEva1タンパク質に結合する、ヒト化抗体が挙げられる。
 より具体的には、後述の実施例に示すように、
 軽鎖可変領域が、配列番号:7~10に記載のアミノ酸配列、配列番号:7~10に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:7~10に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
 重鎖可変領域が、配列番号:13~16に記載のアミノ酸配列、配列番号:13~16に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:13~16に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体が挙げられる。
 なお、可変領域の改変及び相同性等については、「非ヒト動物由来の抗体」において説明したとおりであるが、本発明のヒト化抗体において、CDRの配列は改変されずに、軽鎖可変領域CDR1~3並びに重鎖可変領域CDR1~3の配列は各々、配列番号:1に記載のアミノ酸配列、Val-Thr-Serからなるアミノ酸配列及び配列番号:3に記載のアミノ酸配列並びに配列番号:4~6に記載のアミノ酸配列に特定されていることが好ましい。
 また、かかるヒト化抗体において、後述の実施例に示すとおり、抗原への反応性がより高いという観点から、
(H2-L2) 軽鎖可変領域が、配列番号:7に記載のアミノ酸配列、配列番号:7に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:7に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
 重鎖可変領域が、配列番号:13に記載のアミノ酸配列、配列番号:13に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:13に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体、
(H1-L4) 軽鎖可変領域が、配列番号:8に記載のアミノ酸配列、配列番号:8に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:8に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
 重鎖可変領域が、配列番号:15に記載のアミノ酸配列、配列番号:15に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:15に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体、
(H2-L3) 軽鎖可変領域が、配列番号:10に記載のアミノ酸配列、配列番号:10に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:10に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
 重鎖可変領域が、配列番号:13に記載のアミノ酸配列、配列番号:13に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:13に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体、
(H2-L4) 軽鎖可変領域が、配列番号:8に記載のアミノ酸配列、配列番号:8に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:8に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
 重鎖可変領域が、配列番号:13に記載のアミノ酸配列、配列番号:13に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:13に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体が、好適な例として挙げられる。
 また、産生能の高さも考慮するに、
(H2-L2) 軽鎖可変領域が、配列番号:7に記載のアミノ酸配列、配列番号:7に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:7に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
 重鎖可変領域が、配列番号:13に記載のアミノ酸配列、配列番号:13に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:13に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体、
(H2-L4) 軽鎖可変領域が、配列番号:8に記載のアミノ酸配列、配列番号:8に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:8に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
 重鎖可変領域が、配列番号:13に記載のアミノ酸配列、配列番号:13に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:13に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体、
(H3-L4) 軽鎖可変領域が、配列番号:8に記載のアミノ酸配列、配列番号:8に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:8に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
 重鎖可変領域が、配列番号:16に記載のアミノ酸配列、配列番号:16に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:16に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体が、好適な例として挙げられる。
 さらに、本発明の抗体としては、上述の特定のアミノ酸配列又はその改変体を含む、可変領域又はCDRを保持する抗体に対し、ヒトEva1への結合において競合する抗体の態様もとり得る。言い換えれば、上述の特定のアミノ酸配列又はその改変体を含む、可変領域又はCDRを保持する抗体が反応性を示すエピトープに結合する抗体の態様もとり得る。
 本発明において「エピトープ」とは、抗原中に存在する抗原決定基、すなわち抗体中の抗原結合ドメインが結合する抗原上の部位を意味する。したがって、本発明におけるエピトープは、アミノ酸の一次配列中において連続する複数のアミノ酸からなるポリペプチド(線状エピトープ)であってもよく、アミノ酸の一次配列中において隣接していないアミノ酸が、ペプチド又はタンパク質の折り畳み等の三次元構造によって近傍にくることにより形成されるポリペプチド(不連続エピトープ、構造的エピトープ)であってもよい。また、かかるエピトープとしては、典型的には、少なくとも3つ(例えば4つ)、最も普通には少なくとも5つ(例えば、6~20個、7~15個、8~10個)のアミノ酸からなる。
 また、抗体が得られた場合、当業者であれば、その抗体が反応性を示す抗原上のペプチド領域(エピトープ)を特定して、そのペプチド領域に結合する種々の抗体を作製し得る。さらに、二つの抗体が同一又は立体的に重なり合ったエピトープと結合するかどうかは、競合アッセイ法により決定することができる。
 本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分(部分断片)であって、ヒトEva1に反応性を示すものを意味する。具体的には、Fab、Fab’、F(ab’)2、可変領域断片(Fv)、ジスルフィド結合Fv、単鎖可変領域断片(一本鎖Fv、scFv)、sc(Fv)2、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。
 ここで「Fab」とは、1つの軽鎖及び重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Fab’」は、抗体のヒンジ領域の1つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Fabとは異なる。「F(ab’)2」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。
 「可変領域断片(Fv)」は、完全な抗原認識及び結合部位を有する最少の抗体断片である。Fvは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「単鎖可変領域断片(一本鎖Fv、scFv)」は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「sc(Fv)2」は、2つの重鎖可変領域及び2つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ダイアボディー」とは、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。「多特異性抗体」は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例えば、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現により調製することができる。
 本発明の抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができ、また組換えDNA法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法(Kohler&Milstein,Nature,256:495(1975))が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原(ヒトEva1、その部分ペプチド、それらにFcタンパク質等が融合してあるタンパク質、またはこれらを発現する細胞等)で免疫された動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ)の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等である。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ヒトEva1に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ヒトEva1に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
 組換えDNA法は、上記本発明の抗体をコードするDNAをハイブリドーマやB細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞(例えば、HEK細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等)に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である(例えば、P.J.Delves,Antibody Production:Essential Techniques,1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean Monoclonal Antibodies,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS、Vandamme A.M.et al.,Eur.J.Biochem.192:767-775(1990))。本発明の抗体をコードするDNAの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい(国際公開第94/11523号公報 参照)。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物(ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等)を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
 本発明は、上記本発明の抗体をコードするDNA、該DNAを含むベクター、該DNAを保持する宿主細胞、及び該宿主細胞を培養し、抗体を回収することを含む抗体の生産方法をも提供することができる。
 <抗体薬物複合体>
 後述の実施例に示すとおり、本発明の抗体の標的であるヒトEva1は、様々ながんにおいて発現している。また、本発明の抗体(特にヒト化抗体)は、ADCとしても有用である。よって、本発明は、本発明の抗体(特にヒト化抗体)又はその機能的断片と、薬物とを結合させてなる、抗体薬物複合体(ADC)の態様もとり得る。
 本発明のADCにおいて、抗体と結合させることができる「薬物」は、特に制限されるものではないが、例えば、当技術分野で公知の細胞傷害性物質が挙げられる。「細胞傷害性物質」としては、抗がん剤、例えば、イリノテカン(CPT-11)、イリノテカンの代謝産物SN-38(10-ヒドロキシ-7-エチルカンプトテシン)、アドリアマイシン、タキソール、5-フルオロウラシル、ニムスチン、ラミニスチン、テモゾロミド等のアルキル化剤、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド等の代謝拮抗剤、エトポシド、ビンクリスチン等の植物アルカロイド、マイトマイシン、ブレオマイシン等の抗がん性抗生物質、シスプラチン等の白金製剤、ソラフェニブ、エルロチニブ等の分子標的剤、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、シクロフォスファミド、イフォスファミド、ブスルファン、MMAE(モノメチルアウリスタチンE)、DM1(メルタンシン)、カリキアマイシンが挙げられる。細胞傷害性物質としては、放射性同位体、例えば、32P、14C、125I、H、131I、186Re、188Re、10B、111In、90Yも挙げられる。細胞傷害性物質としては、細胞傷害活性を機能させる光感受性物質、より具体的には、光照射により活性化されることにより、それ自体が細胞傷害性(細胞毒性)を示す形態に変化する物質であってもよく、また細胞傷害性物質(細胞毒性物質)を生じさせる物質であってもよい。例えば、クロリン(chlorins)、クロリンe6、ポルフィマーナトリウム、タラポルフィンナトリウム、ベルテポルフィン、及びこれらの前駆体及び誘導体が挙げられる。また、細胞傷害性物質としては、毒性ペプチド、例えば、サポリン、リシン、志賀毒等のリボソーム不活化タンパク質(RIP)が挙げられる。
 また、抗体と細胞傷害性物質との結合も、当該技術分野で公知の方法により行うことができ、直接的結合及び間接的結合のいずれでもよい。例えば、直接的な結合として、共有結合を利用することができる。間接的な結合としては、リンカーを介した結合を利用することができる。
 本発明においては、抗体と細胞傷害性物質とがリンカーを介して結合していることが好ましい。リンカーを介して2つの分子が結合することにより、細胞傷害性物質の抗原性を減弱することができ、対象への投与に好ましい。リンカーについての一般的な技術は、例えば、Hermanson,G.T.Bioconjugate Techniques,Academic Press,1996;Harris,J.M. and Zalipsky,S.編,Poly(ethylene glycol),Chemistry and Biological Applications,ACS Symposium Series,1997;Veronese,F. and Harris,J.M.編,Peptide and protein PEGylation.Advanced Drug Delivery Review 54(4),2002に記載されている。
 また、リンカーは、直鎖状のリンカー(2価のリンカー)のみならず、分枝状のリンカー(3価以上のリンカー)も含まれる。直鎖状リンカーは、その一端に細胞傷害性物質を有し、別の一端に抗体を有する。分枝状リンカーは、通常、その各分枝(各鎖)に細胞傷害性物質を有し、別の一端に抗体を有する。かかるリンカーとしては、例えば、N-スクシンイミジル-4-(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC)、N-スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-l-カルボキシ-(6-アミドカプロエート)(LC-SMCC)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)ブチレート(SPDB)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、4-マレイミドブチル酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(GMBS)、3-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(EMCS)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、N-(α-マレイミドアセトキシ)-スクシンイミドエステル(AMAS)、スクシンイミジル-6-(β-マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH)、N-スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)-ブチレート(SMPB)、N-(p-マレイミドフェニル)イソシアネート(PMPI)、6-マレイミドカプロイル(MC)、マレイミドプロパノイル(MP)、p-アミノベンジルオキシカルボニル(PAB)、N-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(SPP)、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)、バリン-シトルリン(Val-Cit)及びアラニン-フェニルアラニン(ala-phe)等のペプチドリンカーが挙げられる。
 リンカーを介して抗体と細胞傷害性物質とを結合する技術は、当技術分野において公知である。例えば、抗体とリンカーとの結合は、共有結合又は非共有結合(イオン結合、疎水性結合等)であり、好ましくは共有結合である。この結合は、本発明の複合体を対象に投与した場合に、血液中では細胞傷害性物質が遊離しにくい結合であることが好ましい。そのような結合としては、マレイミド基とチオール基との結合、ハロエステルとチオールとを反応させて得られる結合、カルボキシル基とアミノ基とのアミド結合、チオール基とチオール基とのジスルフィド結合、アミノ基とアルデヒド基によるシッフ塩基、チオール基とカルボン酸とのチオエステル結合、水酸基とカルボキシル基とのエステル結合、アミノ基とスクアリン酸誘導体(例えばジメチルスクアリン酸)による結合、ジエニルアルデヒド基とアミノ基との結合等が挙げられる。このような結合の具体例としては、リンカーの一端に存在するマレイミド基と、抗体上のシステイン残基に含まれるチオール基との結合、リンカーの一端に存在するスクシンイミド基と、抗体上のリジン残基に含まれるアミノ基との脱水置換結合(例えば、国際公開第2008/096760号)、リンカーの一端に存在するアミノ基と、抗体上のアスパラギン酸又はグルタミン酸に含まれるカルボン酸との脱水縮合結合(例えばWSCDIを使用する)等が挙げられる。抗体とリンカーとの結合の具体的な方法については、例えば、国際公開第2010/055950号を参照されたい。
 一方、抗体又はリンカーと細胞傷害性物質との結合は、共有結合又は非共有結合(イオン結合、疎水結合等)であり、好ましくは共有結合である。特に、該結合は、本発明の複合体を対象へ投与した場合に、血液中では細胞傷害性物質が遊離しにくい結合であることが好ましい。このような観点から、抗体又はリンカーと細胞傷害性物質との結合は、限定されるものではないが、好ましくはエステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、チオカルバメート結合であり、より好ましくはエステル結合である。
 本発明のADCにおいて、抗体1分子あたりの細胞傷害性物質の結合数(薬物結合数)は、その有効性、安全性を考慮し、その数が一定の数となるよう、反応させる原料・試薬の使用量等の反応条件を規定して実施される。しかしながら、低分子化合物の化学反応とは異なり、異なる数の薬物が結合した混合物として得られるのが通常である。抗体1分子への薬物の結合数は平均値、すなわち、平均薬物結合数として特定され、表記される。したがって、本願明細書においても特に断りのない限り、薬物の結合数は平均値を意味する。
 抗体1分子あたりの薬物結合数は、用いる還元剤の種類及びその濃度、抗体に対するリンカー及び薬物の濃度(モル過剰率等)、並びに結合反応における温度又は時間を調整することにより、コントロール可能である。「還元剤」としては、抗体中のジスルフィド結合を還元的に開裂させて上記チオール基を介した結合を生じさせ得るものであれば特に制限はないが、例えば、ジチオスレイトール(DTT、DL-DTT)、2-メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、TCEPが挙げられる。
 本発明において、1抗体あたりの薬物平均結合数は、特に制限されるものではないが、例えば1~10個であり、好ましくは3~8個であり、より好ましくは3~5個である。なお、抗体1分子あたりの薬物結合数は、後述の実施例に示すように、細胞傷害性物質(例えば、DM1)の吸収のピークにおける吸光度と抗体の吸収のピークである280nmの吸光度を測定し、それぞれがお互いの吸収ピークに与える影響を加味して連立方程式を立て計算することで、抗体と細胞傷害性物質の濃度を求め、分子数の比を決定することにより求めることができる。また、DTNB等のチオール基を比色定量する試薬を用い、求めることもできる。
 また、本発明のADCは、大気中に放置したり、又は再結晶することにより、水分を吸収し、吸着水がついたり、水和物になる場合があり、そのような水を含む化合物及び塩も、本発明に含まれる。
 本発明のADCを構成する原子の1以上に、原子同位体の非天然割合も含有し得る。原子同位体としては、例えば、H、H、125I、14Cが挙げられる。また、本発明のADCは、バイオイメージング技術等において検出し得る。そのため、標識物質が結合されていてもよい。標識物質は、用いる検出方法等の種類に合せて適宜選択されるが、例えば、放射性標識物質、蛍光性標識物質、常磁性標識物質、超常磁性標識物質、酵素標識物質が挙げられる。また、このような標識物質とADCとの結合は直接的なものであってもよく、間接的なものであってもよい。間接的な結合としては、標識物質を結合させた二次抗体、標識物質を結合させたポリマー(プロテインA、プロテインB等)を介した結合が挙げられる。
 より具体的には、ADCを標識する放射性同位元素として、陽電子放出核種を利用することができる。例えば、64Cu、18F、55Co、66Ga、68Ga、76Br、89Zr及び124Iのような陽電子放出核種で抗体を標識することができる。これらの陽電子放出核種によるADCの標識には、公知の方法(Nucl Med Biol.1999;26(8):943-50.、J Nucl Med.2013;54(11):1869-75.等)を利用することができる。また、陽電子放出核種で標識されたADCが対象に投与された後に、PET(ポジトロン断層撮影装置)により、その放射性核種から放射される放射線を体外から計測し、コンピュータートモグラフィーの手法で画像に変換される。このようにして、対象に投与したADCの標的部位への到達、集積等を追跡することができる。
 <キメラ抗原受容体>
 後述の実施例に示すとおり、本発明の抗体の標的であるヒトEva1は、様々ながんにおいて発現している。また、本発明の抗体の可変領域は、キメラ抗原受容体(CAR)及びそれを発現するT細胞(所謂CAR-T)において有用である。よって、本発明は、ヒト由来のEva1タンパク質に結合する領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル領域とを含む、CARの態様もとり得る。
 本発明において、「キメラ抗原受容体(Chimeric Antigen Receptor:CAR)」は、細胞外領域となるヒト由来のEva1タンパク質に結合する領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル領域とが、その順にてN末端側から配置され、直接又は間接的に連結されてなる、キメラタンパク質を意味する。
 本発明において、「ヒト由来のEva1タンパク質に結合する領域(抗原結合性領域)」は、例えば、上述の抗体又はその機能的断片を用いることができるが、通常CARには、scFvが用いられる。
 「scFv」は、上述のとおり、モノクローナル抗体(免疫グロブリン)の軽鎖可変領域と重鎖可変領域がリンカーを介して連結された構造体であり、抗原との結合能を保持している。scFvにおけるN末端側の順としては、軽鎖可変領域、リンカー、重鎖可変領域であってもよく、また重鎖可変領域、リンカー、軽鎖可変領域であってもよいが、好ましくは前者である。
 scFvにおける「リンカー」としては、例えばペプチドリンカーを用いることができる。リンカーの長さは特に限定されない。例えば、アミノ酸数が5~25個のリンカーを用いることができる。リンカーの長さは好ましくは8~25アミノ酸、さらに好ましくは15~20アミノ酸である。ペプチドリンカーの好適な例として、グリシン又はグリシンとセリンから(GGSリンカー、GSリンカー、GGGリンカー等)が挙げられる。また、配列番号:58に記載の134~151位の18アミノ酸からなるリンカーも、好適な例として挙げられる。これらリンカーを構成するアミノ酸であるグリシンとセリンは、それ自体のサイズが小さく、リンカー内で高次構造が形成されにくいという利点を有する。
 scFvの基となるモノクローナル抗体としては、特に制限はないが、例えば、上述の非ヒト動物由来の抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体が挙げられる。また、好適な例としても上述のとおりであるが、後述の実施例に示すとおり、ヒトEva1に応じた活性化及び細胞増殖等の観点から、上記(H2-L2)の組み合わせが好ましく、さらにN末側から順にL2、リンカー、H2と連結されてなるscFvが好ましい。
 本発明において「膜貫通領域」は、細胞膜を貫通する機能を有し、CARを細胞膜に繋留し得るポリペプチドであれば特に制限はない。膜貫通領域を担うポリペプチドの由来となるタンパク質としては、例えば、CD28、CD3ζ、CD3ε、4-1BB、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR、T細胞受容体のα鎖及びβ鎖が挙げられる。
 本発明において「細胞内シグナル領域」は、CARが細胞膜上に配置された際に細胞内に配置される領域であり、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達すること、すなわち、抗原結合性領域が抗原(ヒトEva1)と結合した際、免疫細胞の活性化に必要なシグナル(所謂一次シグナル)を伝達することが可能な領域である。このような細胞内シグナル領域としては、一般的に、T細胞受容体(TCR)及びCD3複合体といった活性化シグナル伝達ドメインのみを有するもの(第1世代CAR)、活性化シグナル伝達ドメインに加えて共刺激分子由来の共刺激シグナル伝達ドメイン(例えば、CD28又は4-IBBの細胞内ドメイン)を有するもの(第2世代CAR)、活性化シグナル伝達ドメインに加えて複数の共刺激シグナル伝達ドメイン(例えば、CD28及び4-IBBの細胞内ドメイン)を有するもの(第3世代CAR)がある。また、本発明者らが従前開発したCD79A細胞内領域及びCD40細胞内領域を含むものも挙げられる(Mol Ther 2021 Sep 1;29(9):2677-2690.参照)。
 「細胞内シグナル領域」は、前記のように、一次シグナルを伝達することが出来ればよく、当該シグナルに関与するタンパク質の活性化シグナル伝達ドメインを用いることができる。一次シグナル伝達には、免疫受容体活性化チロシンモチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif:ITAM)が関与することが知られている。ITAMを有するタンパク質としては、例えば、CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、DAP10、DAP12が挙げられる。
 また、上記のとおり、また後述の実施例に示すとおり、「CD79A細胞内領域及びCD40細胞内領域を含むもの」も、本発明にかかる細胞内シグナル領域として好適に用いられる。かかる場合、CD79A細胞内ドメインとCD40細胞内ドメインとの配置関係は特に制限されず、N末端側がCD79A細胞内領域である態様と、N末端側がCD40細胞内領域である場合のいずれでも採用可能である。該配置関係は、好ましくは前者である。CD79A細胞内領域及びCD40細胞内領域は、直接連結している、あるいはリンカーを介して連結していることが好ましい。リンカーは、NFκBシグナル活性化作用が著しく損なわれない限り特に制限されず、任意である。リンカーとしては、好ましくはグリシン又はグリシンとセリンから構成されるリンカー(GGSリンカー、GSリンカー、GGGリンカー等)である。リンカーの長さは特に限定されないが、例えば1~20アミノ酸、好ましくは1~10アミノ酸、より好ましくは1~5アミノ酸である。
 本発明においてCARが含む細胞内シグナル領域の数は、1つに限定されず、複数の細胞内シグナル領域を含むこともできる(例えば、1~5個、1~3個、又は1個若しくは2個のシグナル伝達因子を含むこともできる)。この場合、含む複数の細胞内シグナル領域は、同じものであってもよいし、異なるものであってもよい。
 本発明のCARは、上述の抗原結合領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域に加えて、他のドメインを含むこともできる。他のドメインの例としては、共刺激伝達領域、スペーサー配列、シグナルペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。
 T細胞上に発現する共刺激分子は、抗原提示細胞上に発現する各共刺激分子に特異的なリガンドとの結合により、細胞内に共刺激シグナルを伝達し、T細胞の活性化を補助することが知られている(二次シグナル伝達)。本発明において「共刺激伝達領域」とは、前記のような共刺激分子の共刺激シグナル伝達に関与する細胞内ドメインを意味する。共刺激分子の例としては、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、ICOS、CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD154等が挙げられる。本発明のCARは、これら共刺激分子の共刺激伝達領域を含むことができる。
 本発明のCARが含み得る共刺激伝達領域の数は、1つに限定されず、複数であってもよい。本発明のCARは、共刺激伝達領域を、例えば、1~5個、1~3個、又は1個若しくは2個含むことができる。本発明のCARが、複数の共刺激シグナル伝達域を含む場合、当該域は、同じものであってもよく、また異なるものであってもよい。
 本発明において「スペーサー」は、各領域等の間を連結する配列を意味し、各領域の機能を抑制しない限り特に制限はなく、またそのアミノ酸数も特に制限されるものではないが、通常1~500アミノ酸、好ましく5~300アミノ酸であり、さらに好ましくは10~100アミノ酸である。
 特に、本発明のCARにおいて、抗原結合性領域と膜貫通領域とは、直接又は比較的短いスペーサーを介して連結されることが好ましい。抗原結合性領域と膜貫通領域との間のスペーサーの構成アミノ酸数は、例えば1~400であり、好ましくは10~300である。また、後述の実施例に示すとおり、本発明のCARを発現する細胞を、IL-2非存在下で培養する場合には、細胞増殖及びサイトカイン産生の観点から、前記構成アミノ酸は、150~300であることがより好ましく、200~250であることがさらに好ましい。一方、本発明のCARを発現する細胞を、IL-2存在下で培養する場合には、前記構成アミノ酸は、10~30であることがより好ましい。
 スペーサーの配列は特に限定されないが、例えば、IgG、好ましくはヒトIgG(例えばサブタイプIgG1やIgG4)のヒンジ部又はその一部、ヒンジ部とCH2の一部、或いは膜貫通ドメインに利用する因子(例えばCD28)の一部等の配列をスペーサーに用いることができる。なお、ヒンジ部又はその一部の配列を利用することにより、柔軟性に富むスペーサーが構成されることを期待できる。かかるスペーサーとしては、具体的に、配列番号:59、60、61、62又は62(配列番号:58に記載の268~499位)に記載のアミノ酸配列からなるスペーサーが挙げられる。
 本発明において「シグナルペプチド」は、CARの分泌を促すため、または細胞膜への局在化を指示するためのペプチドを意味し、リーダー配列とも称される。シグナルペプチドは、通常、抗原結合領域のN末端に直接又は間接的に結合され得る。また任意で、細胞プロセシング及び細胞膜へのCARの局在化中に抗原結合領域から、シグナルペプチドは切断されてもよい。かかるシグナルペプチドの例としては、ヒトGM-CSF受容体、T細胞受容体のα鎖及びβ鎖、CD8α、CD8β、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR等のシグナルペプチドが挙げられる。
 以上、本発明のCARにおける各領域等の例について説明したが、これら領域等に関する具体的なアミノ酸配列は、当業者であれば、公知の文献やNCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等のデータベースを検索して適宜入手することができる。さらに、上記表3等に示すとおり、本願の配列表において具体的な配列も開示してある。また、このような典型的なアミノ酸配列(例えば、NCBI レファレンスシークエンス)に限らず、本発明に係る領域等は、当該領域が担う機能を維持している限り、それら典型的なアミノ酸配列に対する改変体、相同体も含み得る。また、かかる改変体、相同体は、典型的なアミノ酸配列に対し、通常高い相同性を有する。高い相同性は、通常60%以上であり、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)である。
 また、本発明のCARは、1種のポリペプチドからなる分子であってもよいし、2種以上のポリペプチドの複合体からなる分子であってもよい。また、本発明のCARは、ポリペプチド又はその複合体からなる分子であってもよいし、ポリペプチド又はその複合体に、他の物質(例えば、蛍光物質、放射性物質、無機粒子等)が連結してなるものであってもよい。
 本発明のCARは、化学修飾されたものであってもよい。本発明のCARを構成するポリペプチドは、C末端がカルボキシル基(-COOH)、カルボキシレート(-COO-)、アミド(-CONH)またはエステル(-COOR)のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル等のC1-6アルキル基;例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のC3-8シクロアルキル基;例えば、フェニル、α-ナフチル等のC6-12アリール基;例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル-C1-2アルキル基;α-ナフチルメチル等のα-ナフチル-C1-2アルキル基等のC7-14アラルキル基;ピバロイルオキシメチル基等が用いられる。本発明のCARを構成するポリペプチドは、C末端以外のカルボキシル基(又はカルボキシレート)が、アミド化又はエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明のCARを構成するポリペプチドには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基等のC1-6アルカノイル等のC1-6アシル基等)で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基(例えば-OH、-SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等)が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基等のC1-6アルカノイル基などのC1-6アシル基等)で保護されているものも包含される。
 また、本発明のCARは、他の機能性タンパク質を有していてもよい。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、本発明のCARに付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、CARの精製及び検出を容易にする目的で用いる機能性タンパク質としては、Mycタグ、Hisタグ、HAタグ、FLAGタグ(登録商標、Sigma-Aldrich社)、蛍光タンパク質タグ(GFP等)等が挙げられる。
 本発明のキメラ抗原受容体は、酸又は塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば、酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩;酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩;アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩;カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
 本発明のキメラ抗原受容体は、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
 なお、これまでにCARを利用した実験、臨床研究等の報告がいくつかあり(例えば、Rossig C,et al.Mol Ther 10:5-18,2004;Dotti G,et al.Hum Gene Ther 20:1229-1239,2009;Ngo MC,et al.Hum Mol Genet 20(R1):R93-99,2011;Ahmed N,et al.Mol Ther 17:1779-1787,2009;Pule MA,et al.Nat Med 14:1264-1270,2008;Louis CU,et al.Blood 118:6050-6056,2011;Kochenderfer JN,et al.Blood 116:4099-4102,2010;KochenderferJN,et al.Blood 119:2709-2720,2012; Porter DL,et al.N Engl J Med365:725-733,2011;Kalos M,et al.Sci Transl Med 3:95ra73,2011;Brentjens RJ,et al.Blood 118:4817-4828,2011;Brentjens RJ,et al.SciTransl Med 5:177 ra38,2013)、これらの報告を参考にして、本発明のCARを構築することができる。また、後述の実施例において、具体的な配列等も示しているため、これらを参考にして本発明のCARを構築することもできる。
 <キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド>
 本発明は、本発明のCARをコードするポリヌクレオチドを提供する。scFV等の抗原結合領域をコードするヌクレオチド配列の情報については、標的とする抗原を認識するモノクローナル抗体を作製し、かかるモノクローナル抗体のアミノ酸配列をエドマン法等の公知の方法で決定し、かかるアミノ酸配列に基づいて入手することもできる。なお、上述のヒト化抗体等については、本願の配列表においても具体的な配列を開示している。また、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのヌクレオチド配列を解析することによっても入手することができる。
 また、抗原結合性領域を含め、本発明のCARにおける各領域等をコードする具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば、公知の文献やNCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等のデータベースを検索しても適宜入手することができる。さらに、上記領域等をコードするヌクレオチド配列は、公知のものに限定されず、上記各領域等をコードするヌクレオチド配列であれば用いることができる。遺伝子コードの縮重により、1つのアミノ酸に対応するコドンは複数存在する。したがって、同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は多数存在する。本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、本発明のCARをコードする限り、遺伝子コードの縮重によって生じる複数のヌクレオチド配列のいずれであってもよい。さらにまた、CARを発現する細胞における発現を最適化するために、本発明のCARにおける各領域等をコードするヌクレオチド配列において、アミノ酸をコードするために選択されるコドンは改変されてもよい。
 そして、当業者であれば、このようなヌクレオチド配列情報に基づき、化学合成する方法(ホスホロアミダイト法等)や、PCRによって増幅する方法等の公知の技術を用い、各領域等をコードするポリヌクレオチドを作製することができる。さらに、このようにして得られた各領域等をコードするポリヌクレオチドを、直接又はスペーサー介して連結することにより、本発明のCARをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。なお、各領域等をコードするポリヌクレオチドの連結は、後述の実施例において示すように、例えば、オーバーラップ伸長PCR法(overlap extension PCR)等の公知の方法を用いて行うことができる。
 <キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター>
 本発明は、上述のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明のベクターとしては直鎖状でも環状でもよく、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、人工染色体ベクター、トランスポゾンベクターが挙げられる。
 ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルス等のレトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクターが挙げられる。
 プラスミドベクターとしては、例えば、pcDNA3.1、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等の、動物細胞発現用プラスミドベクターが挙げられる。
 エピソーマルベクターは、染色体外で自律複製可能なベクターである。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、公知である(Yuら、Science、2009年、324,797-801ページ、 参照)。エピソーマルベクターとしては、例えば、EBV、SV40等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、EBVにあっては複製開始点oriPとEBNA-1遺伝子、SV40にあっては複製開始点oriとSV40LT遺伝子が挙げられる。
 人工染色体ベクターとしては、例えば、YAC(Yeast artificial chromosome)ベクター、BAC(Bacterial artificial chromosome)ベクター、PAC(P1-derived artificial chromosome)ベクターが挙げられる。
 これらベクターにおいて、増殖が緩やかな細胞であっても高効率に遺伝子を導入し易く、また安定発現株の樹立が容易であるという観点から、レトロウイルスベクターが好ましい。
 本発明のベクターには、上述のCARをコードするポリヌクレオチドの他に、プロモーター、エンハンサー、ポリA付加シグナル、ターミネーター等の発現制御配列、複製開始点や複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、他のタンパク質をコードするヌクレオチド等を含んでいてもよい。
 上述のCARをコードするポリヌクレオチドや後述の他のタンパク質をコードするヌクレオチドは、プロモーターの下流に作動可能に配置することで、各ポリヌクレオチドを効率よく転写することが可能となる。かかる「プロモーター」としては、例えば、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、SRαプロモーター、SV40初期プロモーター、レトロウイルスのLTR、RSV(ラウス肉腫ウイルス)プロモーター、HSV-TK(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)プロモーター、EF1αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。
 「他のタンパク質をコードするヌクレオチド」としては、例えば、蛍光タンパク質遺伝子、レポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子、サイトカイン等のT細胞活性化に関与する分子をコードする遺伝子等を挙げることができる。また、例えば、IRES、2Aペプチド配列(例えば、Thosea asigna由来の2Aペプチド(T2A))をコードするDNA等を用いることにより、前記他のタンパク質は上述のCARと共にポリシストロニックに発現させることが可能となる。
 さらに、CARを発現する細胞を投与した対象(がん患者等)の体内で、投与したCAR発現細胞のアポトーシスを適宜誘導するため、自殺遺伝子を「他のタンパク質をコードするヌクレオチド」として、本発明のベクターは含み得る。自殺遺伝子としては、例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSV-TK)、誘導性カスパーゼ9(inducible caspase9:iCasp9)が挙げられる。また、かかる遺伝子の機能を活性化する薬剤としては、HSV-TKに対してはガンシクロビル、iCasp9に対しては二量体誘導化合物(chemical induction of dimerization:CID)であるAP1903等を挙げることができる(Cooper LJ.ら、Cytotherapy.2006;8(2):105-17ページ、Jensen M.C.ら.Biol Blood Marrow Transplant.2010 Sep;16(9):1245-56ページ、JonesBS.、Front Pharmacol.2014 Nov 27;5:254.、Minagawa K.,Pharmaceuticals(Basel).2015 May 8;8(2):230-49ページ、Bole-Richard E.、Front Pharmacol.2015 Aug 25;6:174 参照)。
 <キメラ抗原受容体を発現する細胞>
 本発明は、本発明のCARを発現する細胞を提供する。本発明の細胞は、上述の本発明のCARをコードするポリヌクレオチド又はベクターを、細胞に導入することにより得ることができる。
 本発明のポリヌクレオチド又はベクターが導入される「細胞」は、哺乳動物由来の細胞であることが好ましく、例えば、ヒト由来の細胞、又は齧歯類(マウス、ラット等)、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、サル等の非ヒト哺乳動物由来の細胞を用いることができる。細胞の種類は、特に限定されず、血液、骨髄液等の体液や、脾臓、胸腺、リンパ節等の組織、腫瘍やがん性腹水等から採取された細胞等を使用することができる。好ましい例としては、CAR発現用細胞として、免疫細胞を挙げることができる。
 「免疫細胞」としては、CD4陽性CD8陰性T細胞、CD4陰性CD8陽性T細胞、iPS細胞から調製されたT細胞、αβ-T細胞、γδ-T細胞、NK細胞、NKT細胞等を挙げることができる。上記の如きリンパ球又は前駆細胞を含むものであれば、様々な細胞集団を用いることができる。末梢血から採取されるPBMC(末梢血単核細胞)は好ましい免疫細胞の一つである。すなわち、好ましい一態様では、PBMCに対して遺伝子導入操作を行う。PBMCは常法に従って又は準じて調製することができる。
 本発明のポリヌクレオチドの導入の前にCAR発現用細胞を活性化させておくことが好ましい。例えば、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激し、CAR発現用細胞を活性化させることができる。より具体的には、抗CD3抗体と抗CD28抗体で培養面をコートした培養容器(例えば培養皿)で培養することによって、抗CD3抗体及び抗CD28抗体による刺激を加えることができる。抗CD3抗体と抗CD28抗体がコートされた磁気ビーズ(例えば、VERITAS社が提供するDynabeads T-Activator CD3/CD28)を利用して当該刺激を行うことも可能である。
 細胞の生存率/増殖率を高めるために、活性化処理の際、T細胞増殖因子が添加された培養液を使用することが好ましい。T細胞増殖因子としてはIL-2、IL-15、IL-7等を用いることができる。IL-2、IL-15、IL-7等のT細胞増殖因子は常法に従って調製することができる。また、市販品を利用することもできる。ヒト以外の動物種のT細胞増殖因子の使用を排除するものではないが、通常、T細胞増殖因子はヒト由来のもの(組換え体であってもよい)を用いる。
 典型的には、その適用(対象への投与)のため、本発明のポリヌクレオチド導入後の細胞(本発明のポリヌクレオチド導入リンパ球)を増殖させる。例えば、T細胞増殖因子が添加された培養液を用いて本発明のポリヌクレオチド導入リンパ球を培養する(必要に応じて継代培養する)。この培養に加え、CAR発現用細胞の活性化の場合と同様の処理(再活性化)を行うことにしてもよい。
 なお、本発明の細胞の培養には、血清(ヒト血清、ウシ胎仔血清等)を添加した培地を用いてもよいが、無血清培地を採用することにより、臨床応用する際の安全性が高く、かつ血清ロット間の差による培養効率の違いが出にくいという利点を有する細胞を調製することが可能になる。血清を用いる場合には、自己血清、すなわち、本発明の細胞の投与を受ける対象から採取した血清を用いることが好ましい。
 また、本発明の細胞は、過剰な免疫反応等を抑えるタンパク質(免疫チェックポイント物質等)の機能が抑制されている細胞であってもよい。かかるタンパク質としては、例えば、Programmed Death 1(PD1)、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5等)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14またはCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9が挙げられる。
 また、本発明の細胞は、他家移植をし易くするために、内在性のTCR、HLA等のタンパク質の機能が抑制されている細胞であってもよい。
 タンパク質の機能を抑制する方法としては、前記タンパク質をコードする遺伝子を標的とするノックアウト法、前記遺伝子の転写産物と相補的なdsRNA(二重鎖RNA、例えばsiRNA)を用いる方法、当該転写産物と相補的なアンチセンスRNAを用いる方法、前記転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAを用いる方法が挙げられる。また、部位特異的なヌクレアーゼ(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR-Cas9等のDNA二本鎖切断酵素)を利用して、標的遺伝子を改変する方法であるゲノム編集法も、前記物質の機能を抑制するために好適に用いられる。
 本発明のポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入する方法としては、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等を挙げることができる。また、本発明のベクターがレトロウイルスベクターである場合、ベクターが有しているLTR配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製してもよい。パッケージング細胞としては、例えば、PG13、PA317、GP+E-86、GP+envAm-12、Psi-Cripが挙げられる。また、トランスフェクション効率の高い293細胞や293T細胞をパッケージング細胞として用いることもできる。
 また、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入した後、当該細胞のCARの発現は、フローサイトメトリー、RT-PCR、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ELISA、蛍光免疫染色等の公知の方法により確認することができる。
 <医薬組成物>
 本発明は、本発明の抗体、ADC又はCARを発現する細胞(以下、単に「本発明の抗体等」とも称する)を有効成分とする医薬組成物(例えば、抗がん剤)、並びに本発明の抗体等の治療上又は予防上の有効量を、対象に投与する工程を含んでなる、Eva1タンパク質に関連する疾患(例えば、がん)の治療又は予防の方法をも提供するものである。
 本発明の抗体の標的とするEva1タンパク質に関連する疾患は、Eva1タンパク質の発現が、その発症、症状の進行、悪化等に関与する疾患であればよく、例えば、がんが挙げられる。
 また、本発明の抗体の標的とする「がん」としては、少なくともヒトEva1を発現していればよく、当該タンパク質が発現している限り、固形腫瘍であってもよく、白血病、リンパ腫等であってもよい。より具体的には、グリオーマ(神経幹細胞、神経系前駆細胞及び神経膠細胞から発生した腫瘍、例えば、多形神経膠芽腫(GBM)、星細胞腫(アストロサイトーマ)、随芽腫、脳室上位腫、オリゴデンドログリオーマ、脈絡叢乳頭腫、特に退形成アストロサイトーマ、退形成オリゴデンドロアストロサイトーマ、退形成オリゴデンドログリオーマ)、膵がん、胃がん、食道がん、大腸がん、胆管がん、肝細胞がん、乳がん、肺がん、腎臓がん、尿路上皮がん、精巣がん、前立腺がん、頭頸部がん、甲状腺がん、皮膚がん、子宮頚部がん、子宮体部がん、卵巣がん、血管腫、筋肉腫、骨髄腫、形質細胞がん、メラノーマ(黒色腫)が挙げられる。また、このようながんは原発性のものであってもよく、転移性のものであってもよい、さらに、本発明に係るがんには、がん幹細胞も含まれる。
 本発明の「医薬組成物」は、本発明の抗体等の他、薬理学上許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、乳化剤、湿潤剤、pH緩衝化剤、培地、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、懸濁剤、可溶化剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤が挙げられる。より具体的に、薬理学上許容される他の成分としては、注射剤等の液状製剤の場合には、水溶液(生理食塩水、注射用水、リン酸塩緩衝液、葡萄糖水溶液、グリセロール水溶液等)、水酸化アルミニウム等を例として挙げることができる。また、凍結乾燥した製剤の場合、糖(マンニトール、ラクトース、サッカロース等)、アルブミン等を例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明の医薬組成物は、上記成分が投与前に混合され得るような、キットの態様であってもよい。また、注射剤として用いる場合には、シリンジに導入された形態であり得る。
 本発明の医薬組成物は、有効成分として、本発明の抗体等のみを含むものであってもよいし、当該抗体等及び少なくとも一つの他の抗がん剤を含むものであってもよい。また、本発明の抗体等は、他の抗がん剤と共に投与することもでき、これによって抗腫瘍効果を増強させることができる。このような目的で使用される他の抗がん剤は、本発明の抗体等と同時に、別々に、あるいは連続して対象に投与されてもよいし、それぞれの投与間隔を変えて投与してもよい。このような「抗がん剤」として、例えば、免疫チェックポイント阻害薬(抗PD-1抗体等)、ゲムシタビン、S-1、エルロチニブ、5-FU、テモゾロミド、ロイコボリン、イリノテカン(CPT-11)、オキサリプラチン、アブラキサン、カルボプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ソラフェニブ、ビンブラスチン、LH-RHアナログ(リュープロレリン、ゴセレリン等)、エストラムスチン・フォスフェイト、エストロジェン拮抗薬(タモキシフェン、ラロキシフェン等)、アロマターゼ阻害剤(アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン等)、国際公開第2003/038043号に記載の薬剤を挙げることができるが、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば限定されることはない。さらに、本発明の細胞を含む医薬組成物の場合には、他の成分として、細胞の保護を目的としてジメチルスルホキシド(DMSO)や血清アルブミン等、細菌の混入を阻止する目的で抗生物質等を含んでいてもよい。さらにまた、細胞の活性化、増殖又は分化誘導等を目的として、サイトカイン、成長因子、ステロイド等のT細胞活性化因子、ビタミン類、免疫賦活剤、免疫チェックポイント阻害剤を含んでもよく、また、本発明の細胞とこれら他の成分を併用してもよい。
 医薬組成物の投与方法は、投与する物質の種類、組成物の態様、対象の年齢、体重、性別、健康状態等により異なるが、非経口投与(例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与)、経口投与のいずれかの投与経路で投与することができる。好ましい投与方法は、非経口投与であり、より好ましくは静脈投与である。また、全身投与によらず、局所投与を行ってもよい。局所投与として、標的とする組織、臓器、器官への直接注入を例示することができる。
 医薬組成物の投与量は、対象の年齢、体重、性別、健康状態、症状の進行の程度及び投与する医薬組成物の成分により変動しうる。また、投与スケジュールも、これら条件によって適宜調整され、単回投与の他、連続的又は定期的に複数回投与してもよいが、一般的に、抗体を静脈内投与の場合、成人には体重1kg当たり1日0.1~1000mg、好ましくは1~100mgである。また、ADCを投与する場合には、含有する薬物量換算にて、成人には体重1kg当たり1日0.001~1000mg、好ましくは0.01~100mgである。これら抗体又はADCの投与回数としては、例えば、1回、又は1日~1年間に1回の間隔(例えば、1週毎、10~30日毎、1月毎、3~6月毎、半年毎、1年毎)で複数回投与してもよい。
 また、細胞の投与量としては、1回の投与において、成人には体重1kg当たり投与細胞の個数として、1x10~1x1010個(好ましくは1x10~1x10個、より好ましくは1x10~1x10個)とすることができる。投与間隔としては、例えば、1週毎、10~30日毎、1月毎、3~6月毎、1年毎等とすることができる。また、本発明の細胞は、投与対象の体内で自律的に増殖できるため、1回きりの投与とすることもできる。また、投与後に体内の本発明の細胞数をモニタリングし、その結果に応じて投与時期を決定するようにしてもよい。
 なお、治療対象が脳である場合には、血液脳関門(BBB)の存在がしばし問題となる。しかしながら、多形神経膠芽腫(GBM)等を罹患している者は、血管新生が生じた脳腫瘍内血管に正常な脳にあるBBBが形成されていないことから、前記抗体を静脈注射等によってGBMに送達することができる。
 また、BBBが機能している場合においても、それを回避して本発明の抗体を投与し得る。例えば、定位脳手術方法によってカニューレ等を挿入し、当該カニューレを通じてグリオーマ等に直接投与する方法が挙げられる。また、本発明の抗体を含むドラッグデリバリーシステムを脳内に埋め込む方法が挙げられ(Gill et al.,Nature Med.9:589-595(2003)等)。さらには、本発明の抗体をコードする遺伝子を含むベクターによるBBBにまたがるニューロンのトランスフェクションが含まれる(米国特許出願公開第2003/0083299号等)。
 また、上記BBBを回避する方法の他、本発明の抗体を脳関門透過物質に含有又は結合させて投与する方法を利用することもできる。脳関門透過物質としては、例えば、BBBの血管内皮上の受容体に結合する抗体結合断片と結合しているリポソーム(米国特許出願公開第20020025313号な等)、低密度リポタンパク質粒子(米国特許出願公開第20040204354号等)、アポリポタンパク質E(米国特許出願公開第20040131692号等)、トランスフェリン(米国特許出願公開第2003/0129186号等)、狂犬病ウィルス由来の29アミノ酸からなる糖タンパク質(Kumarら、Nature、2007年7月5日、448巻、39~43ページ 参照)が挙げられる。
 さらに、受容体又はチャンネルの活性を制御して本発明の抗体を投与することにより、当該抗体がBBBを通過してグリオーマ等に送達させることもできる。かかる方法としては、例えば、グルココルチコイド遮断薬を用いて血液脳関門の透過性を増加させること(米国特許出願公開第2002/0065259号、米国特許出願公開第2003/0162695号、米国特許出願公開第2005/0124533号等)、カリウムチャネルを活性化すること(米国特許出願公開第2005/0089473号等)、ABC薬物トランスポーターを阻害すること(米国特許出願公開第2003/0073713号等)、本発明の抗体を陽イオン化すること(米国特許第5,004,697号等)が挙げられる。
 以上、グリオーマ等の脳における疾患を対象として説明したが、当該疾患における本発明の抗体の投与方法はこれらに限定されるものではない、また、他の疾患に関しても、上記脳における疾患同様に、当業者であればその疾患に適した公知の方法を適宜選択し、本発明の抗体を患部に作用させることができる。
 本発明において、本発明の抗体等を投与される「対象」としては、例えば、上述のがん等に罹患しているヒト、上述のがん等が再発するおそれがあるヒト、上述のがん等を罹患するおそれがあるヒトが挙げられる。また本発明において、「治療」とは、がん等の標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること(軽症化)、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。「予防」とは、疾病(障害)又はその症状の発症、発現、再発を防止又は遅延すること、あるいは発症、発現、再発の危険性を低下させることをいう。
 以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
 <実施例1> 抗ヒトEva1ヒト化抗体
 抗ヒトEva1マウス抗体(特許文献2に記載の、B2E5-48マウス抗体)を、以下に示す材料及び方法を用いてヒト化することを試みた。なお、当該抗体の軽鎖可変領域(VL)及び重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列は各々、配列番号:21及び27に示すとおりである。
 (材料及び方法)
 1.1 可変領域の解析及びCDRの同定
 IMGT Domain Gap Alignツール(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)を用い、B2E5-48マウス抗体の可変領域における、CDRを特定し、最も一致する生殖細胞配列を分析した。
 1.2 分子モデリング
 VL及びVHについては、既知の抗体の結晶構造との相同性に基づき、Absolute Antibody社内のソフトウェアを用いて分子モデルを構築した。画像はPyMolを用いて作成した。
 1.3 リスクのある配列分析
 抗体の配列に関し、公表されているタンパク質のモチーフに基づいて特定のリスクを分析した。分析は、Microsoft Excelで構築したシステム(Absolute Antibody Sequence Liability Tool)を用いて行った。このソフトウェアでは、下記表に示すモチーフに基づきリスクを評価する。なお、下記表において、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸を表す。
 1.4 遺伝子合成とクローニング
 後記表6に示すように、合計4本のヒト化重鎖と4本のヒト化軽鎖を設計した。それぞれを別々に合成し、ヒトIgG1重鎖発現ベクターとヒトκ軽鎖発現ベクターにクローニングした。トランスフェクションの際には、ヒト化された配列の可能な限りの組み合わせを行い、合計16種類のヒト化抗体を作製した。これらに加えて、対照としてキメラ型ヒトIgG1(B2E5-48マウス抗体の定常領域をヒトIgG1型のそれに置換したもの)を作製した。
 より具体的に、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするDNA配列は、Absolute Antibody社製クローニングベクターや発現ベクターにクローニングできるよう、5’末端と3’末端に適切な制限酵素認識部位を追加し、設計した。さらに、これらDNA配列は、ヒト細胞での発現を考慮しコドンを最適化した。これら配列に基づき、化学的に合成した後、適切な種及びタイプのAbsolute Antibody社製ベクターにクローニングした。なお、配列の正確性は、DNASTAR Lasergeneソフトウェアを使用して生データを分析し、サンガーシークエンスによって確認した。当該確認を行った後、適切なサイズのプラスミドDNAプレップを行い、トランスフェクションに必要な十分な量の高品質なDNAを調製した。
 1.5 発現と精製
 HEK293T細胞を一過性のトランスフェクションに最適な段階まで継代した。重鎖及び軽鎖発現用ベクターを当該細胞に導入し、6日間培養した。培養物を4000rpmで遠心分離して、それら培養上清を回収し、0.22Mのフィルターでろ過した。第一段階の精製はプロテインAアフィニティークロマトグラフィーで行い、クエン酸pH3.0の緩衝液で溶出した後、0.5M Tris,pH9.0で中和した。溶出したタンパク質は、脱塩カラムを用いてPBSにバッファー交換した。抗体濃度はUV分光法で測定し、必要に応じて濃縮した。また、前記キメラ型ヒトIgG1は、HEK293T細胞のみならず、CHO細胞でも発現させ調製した。
 1.6 抗体アナリティクス
 抗体の純度は、SDS-PAGE及びHPLCを用いて決定した。SEC-HPLCは、Agilent 1100 シリーズの装置で、適切なサイズ排除カラム(SEC)を用いて実施した。抗体の発現力価はプロテインA HPLCで測定した。
 1.7 表面プラズモン共鳴解析
 ヒト化抗体等の解離定数及び結合定数を、表面プラズモン共鳴(SPR、製品名:BiaCore T200(GE healthcare社製))にて解析した。
 具体的には先ず、CM5チップにヒトIgGキャプチャー抗体をアミンカップリング法により固定化した。当該固定化は、リファレンスセル及びアクティブセルの両方において行った。そして、以下の測定条件を用い、シングルサイクル法により、抗Eva1抗体とhEva1とのキネティクス解析を行った。
 測定条件
・Sample compartment temperature:10℃
・Running buffer:HBS-EP+buffer, pH7.4
・Capturing molecule:HumanIgG抗体,リファレンス&アクティブセル
・Ligand:各種抗体 5nM,アクティブセルのみ
・Analyte:hEva1-mouse Fc1,5,25,125,250nM,リファレンス&アクティブセル
・Regeneration buffer:3M MgCl,リファレンス&アクティブセル
・ブランク(Analyteゼロ濃度)を3サイクル
また、サイクル条件は、下記表に示すとおりである。
 以上の材料及び方法を用いて得られた結果を以下に示す。
 (結果)
 2.1 シーケンス解析
 B2E5-48マウス抗体のVH及びVLの配列をIGMT Gap Alignツールで実行し、既知の全ての抗体生殖細胞の配列と比較して分析した。その結果、図には示さないが、これらの配列はマウス、特にVHではIGHV1-53ファミリー、VLではIGKV4-68に最も近い配列であった。また、CDRはIMGTの定義を用いて割り当てられた。
 2.2 生殖細胞系列の選択
 VH及びVLの配列を、Absolute Antibody社のヒト生殖細胞系列に関するデータベースにアライメントして分析した。その結果、ヒト化のためのフレームワークとして選択された生殖細胞系列を、下記表6に示す。当該表において、ヒト化のフレームワークとして選択された重鎖及び軽鎖の生殖細胞系列と、オリジナルのマウスのVH及びVLとの相同性(%)を各々示す。
 2.4 CDRグラフト重合
 VHとVLの配列をCDRグラフトアルゴリズムで解析し、B2E5-48マウス抗体のCDRを選択したヒト生殖細胞系列に移植した。CDRは主に抗原との結合に関与すると定義されているが、フレームワーク領域と呼ばれる領域の外側にあるアミノ酸が、結合に直接関与したり、CDRを正しく配置する役割を果たしたりする可能性がある。そこで、結合性を維持するために、フレームワーク領域のアミノ酸のうち、どのアミノ酸をマウス由来(オリジナル)のアミノ酸として残すかを、構造誘導法を用いて決定した。その結果、生成された配列の概要を表7に示す。なお、当該表中、配列において下線が引いている配列は、各可変領域中のCDRであることを表す。
 2.5 リスクのある配列解析
 非常に望ましくない配列上のリスク(問題)が、ヒト化された配列に持ち込まれていないことを確認するために、オリジナルのマウス抗体の配列とヒト化された配列をAbsolute Antibody Sequence Liability Toolにかけた。
 その結果、表4に示した中で最もリスクが高い配列である、グリコシル化モチーフ及び遊離システインは、前記マウス抗体及びヒト化抗体においていずれも検出されなかった。一方、脱アミド化や異性化のモチーフは、これら抗体において存在していることが認められた。しかしながら、これらモチーフは、表4に示すとおり高リスクとされているが、通常抗体においてよく見られる。また、これらモチーフに基づく修飾は、製造時に混乱を招く可能性があるものの、多くの場合管理方法如何によって解消することができる。さらに、必要であれば、変異導入によりこれらのモチーフを除去することも可能である。また、中リスク及び低リスクのある配列は、より完全な抗体を得るという観点から検出したが、抗体の製造工程で問題を起こすことは殆ど報告されていない。よって、前記マウス抗体及びヒト化抗体の配列は、特段問題がないものと判断した。
 3.抗体の製造と分析
 上記のとおり、16種類のヒト化抗体の製造を試みた。その結果、内6種類は全く上清中に抗体が検出されず(H1-L1、H1-L2、H1-L3、H2-L1、H3-L1、H4-L1)、また、他3種類(H2-L3、H3-L3、H4-L2)も、上清中の抗体濃度(下記Titer(mg/L))が著しく低かった。これらは正常な抗体が形成されず培養上清中に十分に分泌されていないと考えられる。
 また、SPR法によって、抗体の結合親和性を分析した結果、前記表に示すとおり、いずれも平均解離定数(K)は10-7オーダーであった。特に、ヒト化抗体において、H2-L2、H1-L4、H2-L3、H2-L4は、キメラ抗体(HEK293T細胞産)と同程度であった。また、上記抗体濃度も考慮するに、H2-L2、H2-L4、H3-L4が、後述の抗体用途において有用であることが示唆された。
 <参考例> ヒトEva1タンパク質の発現
 (正常ヒト血液細胞におけるEva1タンパク質発現の分析)
 抗Eva1抗体の医薬用途における有用性を分析すべく、先ず後述のキメラ抗原受容体(CAR)における有用性を分析するために、CAR発現の場となる各種血液細胞におけるEva1タンパク質の発現を評価した。
 具体的には、健常人末梢血を溶血させ(BD FACS Lysing Solution)、その後CD4,CD8,CD19,好中球(scatter plotよりgate),単球(scatter plotよりgate)にて染色し、同時にマウス抗ヒトEva1抗体及び二次抗体で染色してフローサイトメトリーで解析した。
 その結果、図1に示すとおり、CD4,CD8 Tリンパ球、CD19Bリンパ球、好中球、単球の全てにおいてEva1タンパク質の発現は見られなかった。よって、Eva1タンパク質を抗原とするCARを発現する血液細胞は、当該細胞を標的としない蓋然性が高いことが示唆された。
 (腫瘍におけるEva1タンパク質発現の分析)
 次に、各種腫瘍におけるEva1タンパク質の発現を評価した。具体的には先ず、各種腫瘍細胞株を培養フラスコから剥離し細胞浮遊液とした後、前記(正常ヒト血液細胞におけるEva1タンパク質発現の分析)に記載の方法と同様にして、Eva1タンパク質を染色した。
 その結果、図2Aに示すとおり、OVTOKO、PA-1及びT98Gにおいては発現を認められなかったものの、それ以外の様々な腫瘍細胞株においてEva1タンパク質の発現が認められた。
 また、肝内胆管癌症例の手術標本分離細胞におけるEva1タンパク質発現の分析も行った。具体的には、肝内胆管癌の手術標本から、腫瘍部分を採取し細胞浮遊液を調製した(MACS Tumor Dissociation Kit,human, Miltenyi Biotec)。さらにTumor cell isolation kit及びhuman, Miltenyi Biotecを用いて腫瘍細胞を純化し、前記同様にEva1タンパク質を染色し、フローサイトメトリー解析を行った。
 その結果、図2Bに示すとおり、肝内胆管癌3例中3例においてEva1は陽性であった。
 <実施例2> マウス抗Eva1抗体配列を用いたキメラ抗原受容体
 (抗ヒトEva1マウス抗体配列を用いたEva1-CARの作製)
 次に、Eva1タンパク質を標的とするキメラ抗原受容体(CAR)の有用性を分析するため、このようなCARを作製した。具体的には、図3Aに示すとおり、抗ヒトEva1マウス抗体(上記B2E5-48マウス抗体)のVL及びVHを用いて単鎖抗体を構築した。そして、VL-linker-VHとVH-linker-VLを作製し、それぞれ15aaの短いスペーサードメイン(配列番号:58に記載の268~282位のアミノ酸又は配列番号:59に記載のアミノ酸配列からなる)あるいは232aaの長いスペーサードメイン(配列番号:58に記載の268~499位のアミノ酸又は配列番号:63に記載のアミノ酸配列からなる)を介してCD28膜貫通領域(CD28TM)、CD28細胞内ドメイン(CD28IC)、CD3zetaを繋いでCAR分子を構築した。
 さらに、細胞内ドメインを持たないEGFR(truncated EGFR,tEGFR)をT2A配列の後に結合した。これは1本のmRNAとして転写された後、翻訳後にT2A配列でCARとtEGFR分子に切り離され、1:1の数で分布する。tEGFRは遺伝子導入マーカー及び遺伝子導入された細胞の選択に用いることができる。
 具体的にEva1-CAR(N末端側からの可変領域の順をVL、VHとし、前記長いスペーサードメインを有するもの)は、下記表9に示す構成をとる。
 なお、表9において「cDNA」の項目における数字は、配列番号:57に記載のDNA配列中の位置(bp)を示し、「ポリペプチド」の項目における数字は、配列番号:58に記載の配列中の位置(アミノ酸)を示す。
 (抗ヒトEva1マウス抗体配列を用いたEva1-CAR-Tの作製)
 次に、図3Bに示すとおり、Day0に健常人ドナーから採血を行い、CD8 microbeads(Miltenyi Biotec)を用いてCD8陽性細胞に純化した。その後、CD3/CD28 beads(Invitrogen)を用いてT cell:beads=1:3となる比率で混合し、T細胞を活性化させた。Day3に前記CAR分子をコードする配列を遺伝子導入できるレトロウイルスを用いて遺伝子導入を行った(レトロウイルスの構築は、Mol Ther 2021 Sep 1;29(9):2677-2690.に記載の方法と同様にして行った)。具体的には、retronectin coated plateにレトロウイルスをロードし、2100rpm 120min spinした。その後plateをPBSで洗浄した後、刺激したCD8+T細胞を播種し、800rpm 2min spinした。Day4にはretronection coated plateから通常の培養皿に移動させた。Day7に細胞を回収し、Biotin化したEGFR抗体(Erbitax)を添加し、その後MACS anti-biotin beadsを用いてtEGFR陽性細胞を純化した。純化した細胞はDay7からDay10まで引き続き培養を継続した。Day10に細胞をカウントし、保存した。一部はDay10に再度CD3/CD28 beadsを用いて刺激を行い、Day17―20に実験を行った。
 なお、以下において、遺伝子導入スキームは同一の方法を用いた。また、ヒト・リコンビナントIL-2 50U/mlをDay1,4,7,10,13,16,(19)に加えて培養を行なった。
 (抗ヒトEva1マウス抗体配列を用いたEva1-CAR-T遺伝子の導入効率)
 このようにして行った、Day7における遺伝子導入効率を図3C及び3Dに示す。図3Cにおいて、LH-S(VL-VHを用いたCARでスペーサーが短いもの)、HL-S(VH-VLを用いたCARでスペーサーが短いもの)及びLH-L(VL-VHを用いたCARでスペーサーが短いもの)及びHL-L(VH-VLを用いたCARでスペーサーが長いもの)に関し、representative plot(縦軸のEGFRはbiotin化erbitaxで一次染色し、その後streptavidin-PEで二次染色した。遺伝子導入された細胞を示す)を示す。また、図3Dにおいて、5人の健常人ドナー由来細胞を用いて同様の実験を行なった結果を示す。図3C及び3Dに示すとおり、スペーサーが長いものの方が遺伝子導入効率が高かった。
 (抗ヒトEva1マウス抗体配列を用いたEva1-CAR-Tのサイトカイン産生能)
 次に、抗ヒトEva1マウス抗体配列を用いたEva1-CAR-Tのサイトカイン産生能を分析した。具体的には、前記のとおり作製したCAR-Tをday17まで培養し、その細胞を各種主要細胞株と1:1で共培養し、6時間の共培養の後、固定・細胞内染色(BD cytofix/cytoperm buffer)を行なってIFN-gamma(IFN-γ)で染色した。得られた結果を図3Eに示す。
 図3Eに示すとおり、EGFRのみを遺伝子導入したmock T cellではIFN-gamma産生は見られないが、Eva1-CAR-TではIFN-gamma産生が見られた。いずれのEva1-CAR-TでもEva1陰性細胞株に対してはIFN-gamma産生は見られず、Eva1陽性細胞株に対してはIFN-gamma産生が見られており、Eva1-CAR-Tの抗原特異性が確認できた。スペーサーが長いもののほうが短いものよりも強いIFN-gamma産生が見られた。
 (Eva1-CAR-Tのスペーサー長の最適化)
 図3Fに示すとおり、6種類の異なる長さのスペーサー領域を持つマウス抗体由来Eva1-CAR-Tを作製した。スペーサー長は0aa,15aa(配列番号:59),30aa(配列番号:60),60aa(配列番号:61),125aa(配列番号:62),232aa(配列番号:63)とした。15aaは先の実験におけるshort versionと同じであり、232aaはlong versionと同じものである。これをプラスミドに組み込んで、同様にレトロウイルスを作製し、上記方法と同様にしてCD8陽性細胞に遺伝子導入を行った。
 (6種類の異なるスペーサー長のEva1-CAR-Tの作製における遺伝子導入効率)
 このようにして行った、Day7における遺伝子導入効率(EGFR染色)を図3Gに示す。その結果、スペーサー長が30aa,125aa,232aaであるCARの3つが他の3種類よりも遺伝子導入効率が高いことが明らかになった(n=5)。
 (6種類の異なるスペーサー長のEva1-CAR-Tの増幅効率(CD3/CD28 beads刺激))
 さらに、前記Eva1-CAR-Tに、引き続きCD3/CD28 beads刺激を施し、Day17まで培養継続した時の増幅倍率を、図3Hに示す。その結果、CD3/CD28 beads刺激による増幅効率に差はなかった(n=5)。
 (6種類の異なるスペーサー長のEva1-CAR-Tのサイトカイン産生能)
 前記Day17のEva1-CAR-Tを用いて実験を行なった。具体的には、腫瘍細胞株と1:1で共培養し、6時間後に上記同様の方法にて、細胞を固定・染色し、細胞内IFN-gamma,IL-2をフローサイトメトリーで評価した。得られた結果を図3Iに示す。当該図において、CD8陽性細胞のうち陽性であった割合を示す。
 図3Iに示すとおり、スペーサー長30aa,125aa,232aaを用いた3つが優れたサイトカイン産生を示したが、中でも232aaのスペーサーを持つEva1CAR-T細胞が最も優れたサイトカイン産生能を示した。
 (6種類の異なるスペーサー長のEva1-CAR-Tの増幅効率(Eva1刺激、IL-2なし))
 Eva1陽性であるHuCCT-1に100Gyの放射線照射を行い、CAR-Tと1:1で共培養を行い、それらの増幅効率を分析した。得られた結果を図3J及び3Kに示す。図3Jにおいてはそれぞれ時系列での増幅効率を示す。図3KにおいてはDay4における増幅倍率をプロットしている。図3J及び3Kに示すとおり、スペーサー長15aa,30aa,232aaを用いた場合、細胞増幅が良かった(n=5、異なる5人のドナー由来末梢血からCAR-Tを作製)。
 (6種類の異なるスペーサー長のEva1-CAR-Tの増幅効率(Eva1刺激、IL-2あり))
 前記同様にして、Eva1陽性であるHuCCT-1に100Gyの放射線照射を行い、CAR-T細胞と1:1で共培養を行った。そして、Day1,4,7と3日に1回IL-2 50U/mlを添加して培養した。得られた結果を図3L及び3Mに示す。図3Lにおいてはそれぞれ時系列での増幅効率を示す。図3MにおいてはDay18における増幅倍率をプロットしている。図3L及び3Mに示すとおり、スペーサー長15aa,30aa,232aaを用いた場合、細胞増幅が良い傾向が認められた(n=5、異なる5人のドナー由来末梢血からCAR-Tを作製)。
 <実施例3> 抗ヒトEva1ヒト化抗体配列を用いたキメラ抗原受容体
 (抗Eva1ヒト化抗体配列を用いたヒト化Eva1-CAR-T(hEva1CAR-T)の作製)
 次に、上述のヒト化抗体配列を用いて合計6種類のEva1CAR-Tを作製した。具体的には、L2-linker-H(L2H2), H2-linker-L2(H2L2),L4-linker-H(L4H2), H2-linker-L4(H2L4),L4-linker-H3(L4H3),H3-linker-L4(H3L4)の6種類に関し、それぞれ232aaのスペーサーを持つCARを設計した。そして、これらCARをコードするDNAを各々プラスミドに組み込み、上記同様にレトロウイルスを作製し、遺伝子導入を行った。
 (6種類の抗ヒトEva1ヒト化抗体を用いたhEva1-CAR-Tの作製における、遺伝子導入効率)
 このようにして行った、Day7における遺伝子導入効率(EGFR染色)を、図4Aに示す。当該図に示すとおり、L2H2,L4H3を用いた場合、他の4種類よりも遺伝子導入効率が高いことが明らかになった(n=4、異なる4人のドナー由来末梢血からCAR-Tを作製)。
 (6種類の抗Eva1ヒト化抗体を用いたhEva1-CAR-Tの増幅効率(CD3/CD28 beads刺激))
 前記にて作製したhEva1CAR-Tを、引き続きCD3/CD28 beads刺激下、Day17まで培養継続した時の増幅倍率を、図4Bに示す。当該図に示すとおり、CD3/CD28 beads刺激による増幅効率において、L2H2,H2L2,H2L4を用いた場合、他の3種類よりも良好であった(n=5、異なる5人のドナー由来末梢血からCAR-Tを作製)。
 (6種類の抗Eva1ヒト化抗体を用いたhEva1-CAR-Tのサイトカイン産生能)
 Day17のhEva1-CAR-Tを用いて実験を行なった。具体的には、腫瘍細胞株と1:1で共培養し、6時間後に上記同様に細胞を固定・染色し細胞内IFN-gamma,IL-2をフローサイトメトリーで評価した。得られた結果を図4C及び4Dに示す。これら図においては、CD8陽性細胞のうち各サイトカインが陽性であった割合を示している。図4C及び4Dに示すとおり、それぞれのhEva1-CAR-Tごとに大きな違いは見られなかったが、L2H2を用いたCAR-Tにおいて、Eva1陰性細胞株であるOVTOKOに対するサイトカイン産生がもっとも低かった。
 (6種類の抗Eva1ヒト化抗体を用いたhEva1-CAR-Tの増幅効率(Eva1刺激))
 上記同様にして、Eva1陽性であるHuCCT-1に100Gyの放射線照射を行い、hEva1CAR-T細胞と1:1で共培養を行った。得られた結果を図4Eに示す。当該図において、左側はIL-2非存在下での培養結果を示し、右側はDay1,4,7と3日に1回IL-2 50U/mlを添加して培養した結果を示す。図4Eに示すとおり、いずれもL2H2を用いたCAR-Tが最も良好な刺激後増幅を示した(n=5、異なる5人のドナー由来末梢血からCAR-Tを作製)。
 (L2H2 hEva1-CAR-Tの細胞内ドメインの検討)
 以上のとおり、ヒト化抗体を用いたCARに関し、L2H2を用いたCAR-Tが抗原特異性及び細胞増殖において優れていた。また、実施例2に示すとおり、マウス由来抗体を用いたCARに関し、IL-2非存在下での培養ではスペーサー長が232aaのCAR-Tが、細胞増殖及びサイトカイン産生において最も良かった。一方、IL-2存在下での培養では15aaのスペーサーを持つCAR-Tの細胞増殖が最も良かった。
 そこで次に、図4Fに示すとおり、L2H2からなる単鎖可変領域(scFv)と2つのスペーサー長のスペーサー(S:short spacer,L:long spacer)を介して3種類の細胞内ドメイン(CD28IC,4-1BBIC,CD79A/CD40IC)を繋いだ6種類のCAR-Tを作製した。
 (6種類のhEva1-CAR-Tの作製における遺伝子導入効率)
 前記6種類のCAR-T作製において、Day7における遺伝子導入効率(EGFR染色)を、図4Gに示す。当該図に示すとおり、4-1BB-L,CD79A/CD40-Lの場合、遺伝子導入効率が高かった。また上記同様、短いスペーサー(S)よりも長いスペーサー(L)をもつCARの方が遺伝子導入効率が高いことがここでも再現された(n=5、異なる5人のドナー由来末梢血からCAR-Tを作製)。
 (6種類のL2H2 hEva1-CAR-Tのサイトカイン産生能)
 前記Day17のhEva1-CAR-Tを用いて実験を行なった。具体的には、腫瘍細胞株と1:1で共培養し、4時間後に上記同様に細胞を固定・染色し、細胞内IFN-gamma,IL-2をフローサイトメトリーで評価した。得られた結果を図4H及び4Iに示す。これら図においては、CD8陽性細胞のうち各サイトカインが陽性であった割合を示している。図4H及び4Iに示すとおり、それぞれのhEva1-CAR-Tごとに大きな違いは見られなかったが、短いスペーサーよりも長いスペーサーをもつCARの方がサイトカイン産生能が高いことがここでも再現された(n=5、異なる5人のドナー由来末梢血からCAR-Tを作製)。
 (6種類のL2H2 Eva1-CAR-Tの刺激後増幅効率(Eva1刺激))
 上記同様にEva1陽性であるHuCCT-1に100Gyの放射線照射を行い、hEva1-CAR-Tと1:1で共培養を行った。得られた結果を図4Jに示す。当該図において、左側はIL-2非存在下での培養結果を示し、右側はDay1,4,7と3日に1回IL-2 50U/mlを添加して培養した結果を示す。図4Jに示すとおり、いずれも4-1BB,CD79A/CD40のshort,longどちらもほとんど同等に良い結果を示した(n=5、異なる5人のドナー由来末梢血からCAR-Tを作製)。
 (6種類のL2H2 hEva1-CAR-Tを用いた共培養試験)
 L2H2 hEva1-CAR-Tと放射線照射していないRPMI-8226(Myeloma cell line)をE:T比=1:16で共培養を行った。RPMI-8226をCellTrace Violetで標識してから培養を開始し、RPMI8226とCAR-Tを判別可能にした。培養開始から48時間、72時間、96時間後に一部を採取してフローサイトメトリーを用いて解析を行った。得られた結果を図4Kに示す。当該図において、全細胞に占める腫瘍細胞の割合を示す。なお、tEGFRはtEGFRだけを遺伝子導入したMock CAR-T細胞であるため、腫瘍細胞は増え続けている。細胞内ドメインごとの明らかな差は見られていない。
 (6種類のL2H2 hEva1CAR-Tを用いた細胞傷害試験(クロム放出試験))
 L2H2 hEva1-CAR-Tと51Crで標識した各種腫瘍細胞株とを4時間共培養して、上清中に放出された51Crを測定することで傷害された細胞の割合を調べた(クロム放出試験)。E:T比は10:1、3:1、1:1とした。得られた結果を図4L及び4Mに示す。図4Lに示すとおり、Eva1陽性と見られる細胞株に対しては、hEva1-CAR-Tによる有意な傷害活性が認められた。なお、それぞれの細胞内ドメインによる明確な差は認められなかった。また、図4Mに示すとおり、各細胞株のEva1-MFIを横軸にとると、MFIとの相関が見られた。
 以上のとおり、抗原認識部位をL2H2とするhEva1-CAR-Tに関し、細胞内ドメインの差による反応性の違いを評価した。in vitroで細胞増殖、サイトカイン放出、細胞傷害活性を確認した結果、細胞増殖において4-1BB、CD79A/CD40の細胞内ドメインを持つCARが優れることがわかった。
 (担がんモデルを用いた、hEva1-CAR-Tによる抗腫瘍活性の評価)
 異なる2人のドナー由来末梢血から作製したL2H2 hEva1-CAR-Tを用いて、抗がん効果を評価した。具体的には以下のようにして行った。
 7週齢のNOGマウス(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/ShiJic)に、1x10個のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が各々導入してあるCFPAC1細胞(ヒト膵がん細胞株)又はH1975(ヒト肺腺癌細胞株)を、腹腔内接種した。2週間後、2×10個のtEGFR導入細胞(tEGFRだけを遺伝子導入したMock CAR-T細胞、コントロール)又はL2H2 hEva1-CAR-Tを尾静脈経由で静脈内投与を行うことによって、当該CAR-Tの抗腫瘍活性を評価した。当該評価において、生物発光イメージング(BLI)を、IVISスペクトラムシステムを用いて、腫瘍の進行を評価するために実施した。得られた結果を図4N~4Qに示す。また並行して体重測定を実施した。
 また、上記で用いた2人とは異なる別のドナーに由来する末梢血から作製したL2H2 hEva1-CAR-Tを用い、胆管がんに対する抗がん効果も評価した。
 具体的には先ず、7週齢のNOGマウスに、2x10個のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子導入HuCCT細胞(ヒト胆管がん細胞株)を皮下移植した。2週間後、腫瘍径と体重を測定した上で、2×10個又は5×10個の、tEGFR導入細胞(コントロール)又はL2H2 hEva1-CAR-Tを、尾静脈経由で静脈内投与を行うことによって、上記同様、BLIを指標として、当該CAR-Tの抗腫瘍活性を評価した。腫瘍体積は、ノギスを用い皮下腫瘍の長径と短径を測定し、「腫瘍の長径×短径×短径×1/2」により算出した。得られた結果を図4R及び4Sに示す。また並行して体重測定も実施した。
 なお、上記いずれの担がんモデルへの投与例において、L2H2 hEva1-CARとして、抗原認識部位(L2H2)と、膜貫通・細胞内ドメイン(4-1BB又はCD79A/CD40を含むドメイン)とを、上記短いスペーサーで繋いだものを用いた。また、かかるCARを発現するT細胞は、上記と同様の方法にて作製し、図3Bにおける10日目に、ビーズによる再刺激を行わず、培地を細胞保存液(Cell banker)に置換し、液体窒素中で保存した。その凍結CAR-Tを融解して一晩培養した後、ビーズで再刺激を行い、ビーズ刺激から1週間後に、上記のとおり担がんマウスに投与した。
 図4N~4Sに示した結果から明らかなように、膵がん、肺がん、胆管がんのいずれに対しても、L2H2 hEva1-CAR-Tの抗がん効果が確認された。また、図には示していないが、投与期間中における各マウスの体重変化において、異常及び顕著な差はなく、投与対象における悪影響は認められなかった。
 <実施例3> 抗ヒトEva1ヒト化抗体を含む、抗体薬物複合体
 上述のヒト化B2E5-48抗体 H2‐L2(以下、B2E5-H2‐L2とも称する)を用い、抗体薬物複合体(ADC)を製造した。
 具体的には先ず、pcDNA3.4を用い、B2E5-L2発現用ベクター TPG986とB2E5-H2発現用ベクター TPG987を作製した。それぞれE.coli JM109に導入して発現させ、NucleoBond Xtra Midi Kit(MACHEREY-NAGEL)を用いて精製した。
 次に、前記ベクター及びExpiFectamine CHO Transfection Systemを用い、ExpiCHO細胞において、B2E5-H2‐L2を一過的に発現させた。そして、得られた培養上清を、ProteinAカラムに通し、抗体を吸着させた。低pHで溶出させた後中和し、続いてCapto adhereで精製した後、限外ろ過を行った。なお、得られた抗体につき、分子量、配列、Eva1に対する結合能を確認した。
 次に、図5に示すとおり、B2E5-H2‐L2にリンカー(SMCC)を反応させ、当該抗体にMCC基を導入した。そして、当該リンカーとDM1とを反応させた。
 具体的には先ず、前記にて調製したB2E5-H2‐L2の溶媒をPBS6.5/EDTAにバッファー交換した。次いでSMCC(1.84mg)のDMSO溶液(0.40mL;抗体一分子に対して約5.1当量相当)を室温で添加し、反応溶液の抗体濃度を20mg/mLに調整してチューブ・ローテーターを用いて室温で2時間反応させた。この反応液を精製し、SMCC誘導化された抗体を得た。
 次に、前記溶液に、PBS6.5/EDTA(2.56mL)及びN2-デアセチル-N2-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)-メイタンシン(4.67mg;DM1、Journal of Medicinal Chemistry、2006年、49巻、14号、4392項)のDMA(ジメチルアセトアミド)溶液(0.93mL;SMCC誘導化された抗体一分子に対して約5.8当量相当)を室温で添加し、反応溶液の抗体濃度を10mg/mLに調整してチューブ・ローテーターを用いて室温で16.5時間反応、精製し、目的の化合物を含有する溶液を得た。次いで、精製し余分な成分を除去した後、9.0g/Lの濃度で6% sucrose、0.02% Tween20、10mM sodium succinate溶液(pH5.0)中に保存した。
 そして、ADCの分子量、配列、Eva1に対する結合能、薬物抗体比(DAR)等を確認した。なお、DARは、DM1の吸収のピークである252nmの吸光度と抗体の吸収のピークである280nmの吸光度を測定し、それぞれがお互いの吸収ピークに与える影響を加味して連立方程式を立て計算することで、抗体とDM1の濃度を求め、分子数の比を決定することにより求めた。結果、上記にて作製したADCにおけるDARは3.8であった。
 <実施例4> 抗体薬物複合体の抗腫瘍活性
 前記にて調製した、抗ヒトEva1ヒト化抗体を含むADC(B2E5-ADC)の抗腫瘍活性を、以下のとおりにして評価した。
 (B2E5-ADCのグリオーマに対する細胞傷害実験)
 96-well dishに、1well当り1000細胞のヒトグリオーマ幹細胞(hGIC)を播種した。次に、2倍段階希釈したB2E5-H2‐L2、B2E5-ADC又はKadcyla(トラスツズマブーエムタンシン)を、100μl/well添加し。37℃のCOインキュベーター内で3日間培養した。そして、各wellに5μlのMTT(5mg/ml、和光純薬)を添加し、37℃のCOインキュベーター内で2時間培養した。培養液を廃棄後、90μlのDMSOを添加し、細胞を溶解後にベンチマーク(Bio-Rad)を用いて吸光度(570nm)を測定した。得られた結果を図6Aに示す。
 なお、ポジティブコントロール(100%)として、抗体非存在下のwellにおける測定値を用いた。また、ネガティブコントロール(0%)として、抗体非存在下のwellに5μlの1% TritonX100を添加して得られた測定値を用いた。
 (B2E5-ADCの膵がんに対する細胞傷害実験)
 トリプシン処理により培養ディッシュから回収した膵がん細胞株(BxPC3)を5× 10の4乗 cells/mLに希釈し、96穴プレートに各ウェル100μLずつ播種し、COインキュベーター内(37℃、CO濃度5%)で24時間培養した。培地(RPMI-1640、Wako187-02705、10%FBS)をアスピレーターで吸引し、新鮮な培地を各ウェル900μLずつ加えた。DM1及びB2E5-ADC各々を、PBSで希釈(DM1:3800nM~0.93nM、B2E5-ADC:1000nM~0.24nM)し、10μLずつBxPC3に加えた。COインキュベーター内で48時間培養した後、Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST(同仁化学)を使用し、死細胞から放出されたLDHを測定した。得られた結果を図6Bに示す。
 (B2E5-ADCの胃がんに対する細胞傷害実験)
 10cm細胞培養ディッシュにて培養した胃がん細胞株(MKN74)に、2.5g/L-トリプシン/1mmol/L-EDTA溶液,フェノールレッド含有[ナカライテスク 32777-15]を1mL加え、37℃に5分置いた後、培地を3mL加え、15mL遠沈管へと回収した。1200rpmで5分間遠心し、アスピレータで培地を吸引し、新しい培地を加えて再懸濁した。トリパンブルーを用いて1μLあたりの細胞数を数え、30000cells/mLになるよう調整した。
 96穴培養プレートに100μL(3000cells/well)ずつ播種し、COインキュベーター内で24時間培養した。アスピレータで培地を吸引し、新鮮な培地を各ウェル90μLずつ加えた。PBSを使って、B2E5-H2‐L2及びB2E5-ADCを各々段階希釈(6.5μg/mL~)し、各ウェルに10μLずつ加え、COインキュベーター内で72時間培養した。そして、生細胞測定試薬[ナカライテスク 07553-44]を各ウェル10μL加えCOインキュベーター内で3時間培養した後、450nmの吸光度を測定した。測定結果をもとにImageJでフィッティングを行いグラフを作成し、B2E5-ADCの胃がんに対する細胞傷害性を評価した。得られた結果を図6Cに示す。
 (B2E5-ADC単回投与マウス毒性試験)
 9~10週齢のC57BL/6雄マウス(日本クレア)又は10週齢の雄ヌードマウス(SKN/slc、日本SLC)に、尾静脈又は腰椎穿刺によって、B2E5-ADC(100、33、10μg)を単回投与した(各投与濃度につき3個体用意した)、経時的に体重を測定した。得られた結果を図7に示す。
 (B2E5-ADCを用いた実験結果のまとめ)
 図6Aに示すとおり、B2E5-ADCは濃度依存的にhGICに対して傷害活性を示した。一方、B2E5-H2‐L2及びKadcylaはhGICに対する傷害活性が認められなかった。さらに、図6B及び6Cに示すとおり、前記グリオーマのみならず、膵がん及び胃がんに対しても、B2E5-ADCの抗腫瘍活性が認められた。
 一方、B2E5-ADCのマウスに対する毒性試験を行った結果、図7に示すとおり、B2E5-ADC投与によるマウスへの影響は観察されず、投与後1ヶ月以上の生存が確認された。
 以上説明したように、本発明によれば、ヒトEva1を標的とすることによって、高い抗腫瘍活性を奏することが可能となる。よって、本発明は、がんを治療又は予防するための薬剤等として有用である。

Claims (15)

  1.  配列番号:1に記載のアミノ酸配列、Val-Thr-Serからなるアミノ酸配列及び配列番号:3に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域1~3を含む軽鎖可変領域と、配列番号:4~6に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域1~3を含む重鎖可変領域とを有し、ヒト由来のEva1タンパク質に結合する、ヒト化抗体又はその機能的断片。
  2.  前記軽鎖可変領域が、配列番号:7~10に記載のアミノ酸配列、配列番号:7~10に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:7~10に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
     前記重鎖可変領域が、配列番号:13~16に記載のアミノ酸配列、配列番号:13~16に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:13~16に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のヒト化抗体又はその機能的断片。
  3.  前記軽鎖可変領域が、配列番号:7に記載のアミノ酸配列、配列番号:7に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:7に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
     前記重鎖可変領域が、配列番号:13に記載のアミノ酸配列、配列番号:13に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:13に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のヒト化抗体又はその機能的断片。
  4.  請求項1~3のうちのいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片と、薬物とを結合させてなる、抗体薬物複合体。
  5.  請求項4に記載の抗体薬物複合体を含む、医薬組成物。
  6.  ヒト由来のEva1タンパク質に結合する領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル領域とを含む、キメラ抗原受容体。
  7.  前記ヒト由来のEva1タンパク質に結合する領域が、請求項1~3のうちのいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片を含む領域である、請求項6に記載のキメラ抗原受容体。
  8.  前記ヒト由来のEva1タンパク質に結合する領域が、アミノ末端側から順に、軽鎖可変領域と、リンカーと、重鎖可変領域とが結合してなる、単鎖可変領域断片を含み、
     前記軽鎖可変領域が、
    配列番号:1に記載のアミノ酸配列、Val-Thr-Serからなるアミノ酸配列及び配列番号:3に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域1~3を含み、かつ
    配列番号:7に記載のアミノ酸配列、配列番号:7に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:7に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含み、
     前記重鎖可変領域が、
    配列番号:4~6に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域1~3を含み、かつ
    配列番号:13に記載のアミノ酸配列、配列番号:13に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに、配列番号:13に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列から選択される1のアミノ酸配列を含む、
    請求項6に記載のキメラ抗原受容体。
  9.  前記ヒト由来のEva1タンパク質に結合する領域と、前記膜貫通領域とが、10~300個のアミノ酸からなるスペーサーを介して結合している、請求項6~8のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
  10.  前記細胞内シグナル領域が、CD79A細胞内領域及びCD40細胞内領域を含む、請求項6~9のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
  11.  請求項6~10のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド。
  12.  請求項11に記載のヌクレオチドを含むベクター。
  13.  請求項6~10のうちのいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
  14.  免疫細胞である、請求項13に記載の細胞。
  15.  請求項13又は14に記載の細胞を含む、医薬組成物。
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