JP2022543387A - 修飾二特異性抗ｃｄ３抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＭＨＣ提示標的抗原（ＴＡ）に対して向けられた、二重特異性抗原結合タンパク質に関する。本発明は、特に、少なくとも２つの抗原結合部位（ＡおよびＢ）を含んでなる二重特異性抗原結合タンパク質を提供し、その中では、抗原結合部位ＡはＣＤ３に結合し、抗原結合部位Ｂは標的抗原性（ＴＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、特に、親和性が低下した新規の操作された抗ＣＤ３抗体のＶＬおよびＶＨドメインのＣＤＲを含んでなる。本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、がん性疾患を発現する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）などのＴＡ関連疾患の診断、治療、および予防に有用である。さらに、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質をコード化する核酸、これらの核酸を含んでなるベクター、抗原結合タンパク質を発現する組換え細胞、および本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を含んでなる、医薬組成物が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、主要組織適合遺伝子（ＭＨＣ）提示標的抗原（ＴＡ）に対して向けられた二重特異性抗原結合タンパク質に関する。本発明は、特に、少なくとも２つの抗原結合部位（ＡおよびＢ）を含んでなる二重特異性抗原結合タンパク質を提供し、その中では、抗原結合部位ＡはＣＤ３に結合し、抗原結合部位Ｂは標的抗原性（ＴＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、特に、親和性が低下した新規の操作された抗ＣＤ３抗体のＶＬおよびＶＨドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる。本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、がん性疾患を発現する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）などのＴＡ関連疾患の診断、治療、および予防に有用である。さらに、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質をコード化する核酸、これらの核酸を含んでなるベクター、抗原結合タンパク質を発現する組換え細胞、および本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を含んでなる、医薬組成物が提供される。
Ｔ細胞は、クローン特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）との主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって細胞表面上に提示される疾患特異的ペプチドの存在を検出することによって、（ウイルス）感染細胞および腫瘍細胞を認識する。したがって、ＴＣＲベースの分子は、疾患または腫瘍に特異的な免疫療法の開発において高い関心を集めている。がん治療のための分子標的薬の開発が進歩している一方で、当該技術分野において、がん細胞に高度に特異的であるが、正常細胞にはそうでない分子を特異的に標的化する、新たな抗がん剤を開発する必要性がなおもある。同様に、正常細胞ではなく罹患細胞に非常に特異的な標的分子もまた、ＨＩＶなどの感染症を標的化する薬剤の開発にとって非常に重要である。
本発明の文脈において、標的抗原性（ＴＡ）ペプチドがそれに由来するタンパク質は、プロテアソームによって短鎖ペプチドに分解され、小胞体に輸送され、新たに合成されたＭＨＣ分子の溝内にパッケージ化され、ペプチドーＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体（ＴＡペプチド／ＭＨＣ）として細胞膜へ送達される。ＴＡによって誘導される認識パターンにより、免疫系は、ＴＡＡ抗原性ペプチドの場合の形質転換腫瘍細胞などの罹患細胞が周囲の正常組織細胞から区別され、それらに対する免疫カスケードを誘発できるようになる。
このようなＴＡ標的化薬物薬の開発のために、ＴＡを特異的に標的化するＴＣＲが同定されており、新規ＴＡ標的分子、特にＴＡＡ標的化分子を遺伝子工学で作るために、Ｖαおよびｖβドメインが使用された。
ＴＡＡ標的化分子に関しては、ＭＨＣ提示がん抗原に特異的に結合する天然Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、ＭＨＣ提示ウイルス抗原に特異的に結合するＴＣＲと比較して、往々にしてより低親和性（ＫＤ＝１～３００μＭ）であることに留意すべきである。この現象の説明の一部は、胸腺で発達するＴ細胞が自己ペプチドＭＨＣリガンド上で負に選択され（耐性誘導）、このような自己ペプチドＭＨＣに対して高すぎる親和性を有するＴ細胞が消去されることであるように見える。この低親和性は、腫瘍免疫逃避の１つの可能な説明であってもよい（非特許文献１）。したがって、養子細胞療法（ＡＣＴ）の抗原認識コンストラクトとして、または可溶性アプローチの認識モジュールとして使用するために、すなわち二重特異性分子を使用するために、がん抗原に対してより高い親和性で結合するＴＣＲ変異型を設計することが望ましいようである（非特許文献２）。
しかし、単純にＴＣＲの親和性を高めることは、副作用のリスクもまた高めることがある。上述したように、自然界では、自己タンパク質である腫瘍関連抗原に対する高親和性ＴＣＲは、交差反応性を介した正常組織上に存在する自己ペプチドの認識を回避するために、胸腺選択によって排除される。したがって、その標的配列に対するＴＣＲ親和性を単純に増加させると、類似した非がん特異的ペプチドへの親和性もまた増加するかもしれず、したがって、交差反応性および正常組織に対する望ましくない細胞傷害性効果のリスクが増加する。これは単なる理論上のリスクではなく、黒色腫関連抗原Ａ３（ＭＡＧＥ－Ａ３）を標的化する人工ＴＣＲで痛切に発見されている。特に、これまでに発表された結果では、前臨床試験で交差反応が予測されていなかったにもかかわらず、筋肉タンパク質であるタイチンのペプチドと交差反応する、ＭＡＧＥ－Ａ３を標的化するＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞を注入された２人の患者において、致死的な毒性が示されている（非特許文献３）。これらの患者は、ＴＣＲで操作されたＴ細胞が重篤で予測不可能なオフターゲットおよび臓器特異的毒性を有し得ることを実証した。
Ａｌｅｋｓｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ｄｅｃ；４２（１２）：３１７４－９ Ｈｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．２０１６ Ｓｅｐ；２１（８）：７６９－８５ Ｌｉｎｅｔｔｅ ＧＰ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１３；１２２：８６３－７１，Ｃａｍｅｒｏｎ ＢＪ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１３；５：１９７－１０３
したがって、ＴＣＲ技術の進歩にもかかわらず、高い安全性プロファイルを維持しながら、追加的な治療薬、特にがん治療薬、特に罹患細胞、特にがん細胞を効率的に標的化し殺滅するものに対する必要性が依然として存在する。
本明細書で上に示されるように、天然ＴＣＲは、往々にしてそれらの標的ＴＡＡ／ＭＨＣ複合体に対してかなり低い親和性を有し、この低い親和性が、交差反応性を通じた正常組織上に存在する自己ペプチドの認識を回避する。しかしながら、標的ＴＡＡ／ＭＨＣ複合体に対する親和性を高めて、効率的な抗がん剤を作り出すことが好ましい。
この問題に対処するために、本発明の発明者らは、目的のＴＡ／ＭＨＣに結合する親和性成熟ＴＣＲ可変ドメインと、先行技術の抗ＣＤ３重鎖および軽鎖可変ドメインよりも低い親和性でＣＤ３を標的化する可変軽鎖および重鎖ドメインとを１分子に組み合わせている。結果として生じた分子は、高い安全性プロファイルを維持しながら、ＴＡＡなどのＴＡが細胞表面に少量しか存在しない場合でも、がん細胞などの罹患細胞を認識するという利点を有する。特に、ＣＤ３結合ドメインの親和性がかなり低いおかげで、結果として生じた分子は、天然Ｔ細胞／分子（ＴＣＲ）／ＴＡの関係性を模倣するが、これは、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質では、低親和性結合が、ＴＡ／ＭＨＣに結合するＴ細胞を発現する天然ＴＣＲの場合のようなＴＣＲとＴＡ／ＭＨＣ複合体との間の界面ではなく、Ｔ細胞と二重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインとの間の界面で起こるためである。
したがって、低親和性ＣＤ３結合ドメインを使用することの技術的に有利な効果の１つは、結果として生じた二重特異性抗原結合タンパク質が、高親和性ＴＣＲ可変ドメインの使用により、高い安全性プロファイル、すなわち、オフターゲットペプチドを発現する正常組織の細胞などの正常または健常組織の細胞を殺滅するためには、がん細胞などのＴＡ提示細胞を治療するために使用される用量の約１０００倍以上が必要となる安全域を有しながら、目的のＴＡに特異的であることである。したがって、高親和性抗原結合タンパク質と低親和性ＣＤ３結合ドメインとの組み合わせは、標的ペプチドへの特異的結合をもたらし、例えば、オフターゲットペプチドなどの健常組織上のオフターゲットペプチドの交差認識が減少するか、または皆無であり、ひいては、驚くほど大きな安全域が提供される。
したがって、低親和性ＣＤ３結合ドメインと親和性成熟ＴＡ／ＭＨＣ結合ドメインとを組み合わせた本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、結果として生じた二重特異性抗原結合タンパク質が、健常細胞ではなく罹患細胞を効率的に標的化し、また有益な安全性プロファイル、または改善された安全性プロファイルさえも有するという利点を有する。有利なことに、結果として生じた二重特異性抗原分子は、さらに、当該技術分野で既知の抗ＣＤ３ドメインを使用した二重特異性分子と比較して、増加した安定性、および／または増加した溶解性を有し、医療用途に適した有望な二重特異性分子を提供する。
要約すると、本発明のＣＤ３結合ドメインは、例えば、二重特異性形態で、ＴＣＲまたはそのＭＨＣ－ペプチド複合体結合断片または抗原結合タンパク質と組み合わせて使用される場合、とりわけ、当該技術分野に対して以下の利点を提供する。（ｉ）高い腫瘍選択性および／または特異性を維持しながら、所与のＴＣＲまたは抗原結合タンパク質と健常組織上の類似ペプチドとの交差反応性を低減する；（ｉｉ）ＴＣＲまたはそのＭＨＣ－ペプチド複合体結合断片、または抗原結合タンパク質の安全性プロファイルの向上；（ｉｉｉ）ＴＣＲまたはそのＭＨＣ－ペプチド複合体結合断片、または抗原結合タンパク質のオフターゲットおよび腫瘍外細胞傷害性の低下；および（ｉｖ）改善された特異的、選択的、および安全なＴＣＲまたはそのＭＨＣ－ペプチド複合体結合断片、または抗原結合タンパク質の供給。
定義
本明細書における「抗原結合タンパク質」という用語は、少なくとも１つの抗原に結合できるポリペプチドまたは結合タンパク質を指す。
「抗原」という用語は、本明細書の用法では、少なくとも１つの抗原結合部位によって結合され得る分子、または分子または複合体の一部を指し、その中では、前記１つの抗原結合部位は、例えば、従来の抗体、従来のＴＣＲ、および／または本発明の二重特異性抗原結合タンパク質に存在する。
本発明の「二重特異性抗原結合タンパク質」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して少なくとも２つの原子価と結合特異性とを有し、抗原結合部位ＡはＣＤ３に結合し、抗原結合部位Ｂは標的抗原（ＴＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。
本発明の文脈において、ＣＤ３に特異的な抗原結合部位Ａは、マウスモノクローナル抗体ＵＣＨＴ１の新規ヒト化バージョン、より具体的には、マウスモノクローナル抗体ＵＣＨＴ１の改良ヒト化バージョンに由来し、抗原結合部位ＢがＴＣＲに由来することが、好ましい。
本発明の「二重特異性抗原結合タンパク質」はまた、本明細書で「本発明の抗原結合タンパク質」とも称され、それらは、本発明の文脈で定義される少なくとも６つのＣＤＲを含んでなり、より好ましくは、改良ヒト化ＵＣＨＴ１抗体に由来する、抗原結合タンパク質ＶＬおよびＶＨドメイン、特にＶＬおよびＶＨドメイン変異型を含んでなる。本発明の文脈における抗原結合部位Ｂは、標的抗原（ＴＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体、特に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合し、抗体またはＴＣＲ、好ましくはＴＣＲに由来するものであってもよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、標的抗原（ＴＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する二重特異性抗原結合部位Ｂを含んでなり、その中では、前記抗原結合部位Ｂは、好ましくは、ＴＣＲに由来する、少なくとも１つの可変αドメイン（ｖα）と、少なくとも１つの可変βドメイン（ｖβ）とを含んでなる。
二重特異性抗原結合タンパク質はまた、本明細書で「二重特異性分子」と称されてもよい。
本発明の文脈で用いられる「標的抗原性（ＴＡ）ペプチド」は、結核に罹患した個体、エプスタイン・バー・ウイルスの感染から、またはがんから分離された材料など、感染したまたは腫瘍性の材料から分離され同定されているペプチドを指す。ＴＡペプチドがそれに由来するタンパク質は、感染細胞または腫瘍細胞において抗原プロセシングを受け、次にＭＨＣ分子および細胞、特にＴＡペプチド／ＭＨＣ複合体によって細胞表面に提示され、ひいてはＴ細胞またはＮＫＴ細胞などの宿主の免疫エフェクター細胞によって認識される。本発明の文脈におけるＴＡペプチドは、１０、１２または１４、例えば８～１４、８～１２、例えば９～１１個のアミノ酸を含んでなるかまたはそれからなる。本発明の文脈において、特定のＴＡペプチドに言及される場合、それはＴＡ－Ｃに言及される。ＴＡ－ＣペプチドなどのＴＡ抗原性ペプチドの例は、ウイルス抗原性ペプチド、細菌抗原性ペプチドまたは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗原性ペプチド、好ましくはＴＡＡ抗原性ペプチドである。したがって、一では、ＴＡ抗原性ペプチド、特にＴＡ－Ｃは、ウイルスペプチド、細菌ペプチドまたは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗原性ペプチド、好ましくはＴＡＡ抗原性ペプチドである。
本発明の文脈における「ウイルス抗原性ペプチド」は、罹患細胞の表面上のＭＨＣ分子によって提示される、ウイルス起源の抗原性ペプチドであり、すなわち、細胞は、典型的には、前記ウイルスに感染しているこのようなウイルス抗原性ペプチドは、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウイルスからの感染に関連して発見されている。したがって、本発明の文脈におけるウイルス抗原性ペプチドは、ＨＩＶ抗原性ペプチド、ＨＣＭＶ抗原性ペプチド、ＣＭＶ抗原性ペプチド、ＨＰＶ抗原性ペプチド、ＨＢＶ抗原性ペプチド；ＨＣＶ抗原性ペプチド；ＥＢＶ抗原性ペプチド、インフルエンザ抗原性ペプチド、好ましくはＨＩＶ、ＨＢＶ、インフルエンザ、およびＨＣＭＶ抗原性ペプチドからなる群から選択される抗原性ペプチドであってもよい。
本明細書に記載の方法および実施形態で使用できるウイルス抗原性ペプチドとしては、例えば、下の表に記載されているウイルス抗原性ペプチドが挙げられる。本明細書に記載の方法および実施形態で使用できるウイルス抗原性ペプチドとしては、配列番号１４６～配列番号１４８のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、下の表１に示される少なくとも１つのウイルス抗原性ペプチドが挙げられる。
表1：ウイルス抗原性ペプチドの一覧
Figure 2022543387000001
本発明の文脈における「細菌抗原性ペプチド」は、罹患細胞の表面上のＭＨＣ分子によって提示される、細菌起源の抗原性ペプチドであり、すなわち、細胞は、典型的には、前記細菌に感染しているこのような細菌抗原性ペプチドは、例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からの感染の状況で発見されている。したがって、本発明の文脈における細菌抗原性ペプチドは、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原性ペプチドであってもよい。
本明細書において「ＴＡＡペプチド」とも称される「腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチド」は、腫瘍性材料から単離され同定されており、腫瘍細胞で抗原プロセシングを受け、ひいては宿主の免疫エフェクター細胞によって認識され得る、ペプチドを意味する。ＴＡＡペプチドは、１０、１２または１４、例えば８～１４、８～１２、例えば９～１１個のアミノ酸を含んでなるかまたはそれからなる。本発明の文脈におけるＴＡＡペプチドは、例えばがん／精巣（ＣＴ）抗原性ペプチドであり得る。がん／精巣（ＣＴ）抗原性ペプチドの例は、配列番号１０のアミノ酸配列のＭＡＧＥ－Ａ抗原性ペプチドおよび配列番号９のアミノ酸配列のＰＲＡＭＥ抗原性ペプチドである。本発明の文脈におけるＴＡＡペプチドはＴ細胞エピトープを含んでなり、一般的な文脈ではＴＡＡペプチドとも称されてもよく、１つの特定のＴＡＡペプチドに言及する場合、本発明の文脈ではＴＡＡペプチドＣと称されてもよい。
一態様では、腫瘍関連抗原、本明細書に記載されている方法および実施形態で使用できる、ＴＡＡペプチドとしては、例えば、米国特許出願公開第２０１６０１８７３５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３５８０７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８０７５９号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８７６８７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３４６３７１号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３６８９６５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２２２５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０００２０５５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２９４８６号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３７０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１３６１０８号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１０１４７３号明細書、米国特許出願公開第２０１７００９６４６１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３７号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１８９５０５号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１７３１３２号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２９６６４０号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２５３６３３号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２６０２４９号明細書、米国特許出願公開第２０１８００５１０８０号明細書、および米国特許出願公開第２０１８０１６４３１５号明細書に記載されている腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドが挙げられ、これらの各出版物の内容およびその中に記載されている配列リストは、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
一態様では、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質、特に本発明の文脈における抗原結合部位Ｂは、上記の特許および刊行物の１つまたは複数に記載されているＴＡＡペプチドを提示する細胞を選択的に認識する。別の態様では、本明細書に記載の方法および実施形態で使用可能なＴＡＡとしては、配列番号５２～６５、６７～９６、９８～１１０、配列番号１７２～１８２、１８４～２６８、配列番号９および１０、好ましくは配列番号９および１０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＴＡＡが挙げられる。一態様では、二重特異性抗原結合タンパク質、特に二重特異性抗原結合タンパク質の抗原結合部位Ｂは、ＴＡＡペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する細胞を選択的に認識し、その中では、ＴＡＡペプチドは、配列番号５２～６５、６７～９６、９８、配列番号１７２～１８２、１８４～２６８、配列番号９および１０のアミノ酸配列、または本明細書に記載の特許または特許出願に記載のアミノ酸配列のいずれか、好ましくは配列番号９および１０を含んでなるかまたはそれからなる。
表2：TAAの一覧
Figure 2022543387000002
Figure 2022543387000003
さらに、本発明の文脈におけるＴＡＡ抗原性ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の特異的リガンドである。
本発明の文脈におけるＴＡＡ抗原性ペプチドＣは、好ましくは、配列番号５２～６５、６７～９６、９８～１１０、配列番号１７２～１８２、１８４～２６８、配列番号９および配列番号１０のアミノ酸配列、好ましくは、配列番号９のアミノ酸配列「ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ」を含んでなるかまたはそれからなるＰＲＡＭＥ抗原性ペプチド、または配列番号１０のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」、より好ましくは配列番号１０を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原性ペプチドからなるＴＡＡ抗原性ペプチドの群から選択され、その中では、前記ＭＨＣは、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２である。
「ＰＲＡＭＥ」または「黒色腫で優先的に発現される抗原」は、黒色腫で過剰発現される抗原として最初に同定され（Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１９９７ Ｆｅｂ；６（２）：１９９－２０８）；それは、ＣＴ１３０、ＭＡＰＥ、ＯＩＰ－４としても知られており、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入れ番号Ｐ７８３９５を有する（２０１９年１月１１日時点で利用可能）。このタンパク質は、レチノイン酸受容体シグナル伝達の抑制因子として機能する（Ｅｐｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００５ Ｓｅｐ ２３；１２２（６）：８３５－４７）。ＰＲＡＭＥは、がん精巣抗原として知られている生殖細胞系コード化抗原のファミリーに属する。がん精巣抗原は、典型的には、正常な成人組織では発現が制限されるかまたは発現しないため、免疫療法介入の魅力的な標的である。ＰＲＡＭＥは、いくつかの固形腫瘍で、ならびに白血病およびリンパ腫で発現される（Ｄｏｏｌａｎ ｅｔ ａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．２００８ Ｍａｙ；１０９（２）：３５９－６５；Ｅｐｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ｎｏｖ １５；６６（２２）：１０６３９－４２；Ｅｒｃｏｌａｋ ｅｔ ａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．２００８ Ｍａｙ；１０９（２）：３５９－６５；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２００３ Ｍａｒ；４４（３）：４３９－４４；Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ Ｉｎｔ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１４；１００（１）：８８－９５；Ｐｒｏｔｏ－Ｓｅｑｕｅｉｒｅ ｅｔ ａｌ Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ．２００６ Ｎｏｖ；３０（１１）：１３３３－９；Ｓｚｃｚｅｐａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１３ Ｆｅｂ；４９（２）：１４４－５１；Ｖａｎ Ｂａｒｅｎ ｅｔ ａｌ Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９８ Ｓｅｐ；１０２（５）：１３７６－９）。本発明のＰＲＡＭＥ標的化療法は、特に、非小細胞肺がんや小細胞肺がんなどの肺がん、肝臓がん、頭頸部がん、皮膚がん、腎細胞がん、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん腫、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんをはじめとするが、これらに限定されるものではない、がんの治療に特に適していてもよい。
本発明の文脈における「ＰＲＡＭＥ由来ペプチド」は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入れ番号Ｐ７８３９５の下でアクセス可能な配列番号７のアミノ酸配列の全長ＰＲＡＭＥタンパク質のアミノ酸４２５～４３３に対応する、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号９）を含んでなるかまたはそれからなる（２０１９年１月１１日の時点で利用可能）。アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号９）を含んでなるかまたはそれからなるＰＲＡＭＥ由来ペプチドは、本明細書ではＰＲＡＭＥ－００４とも称される。ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドは、腫瘍関連または腫瘍特異的タンパク質に由来するペプチドエピトープであり、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子によって細胞表面上に提示される。より具体的には、ＰＲＡＭＥ－００４由来のペプチドは、ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中の細胞表面上に提示される(Ｍｅｄ．２００１ Ｊａｎ １；１９３（１）：７３－８８）。本発明の文脈において、「ＰＲＡＭＥ由来ペプチド」または「ＰＲＡＭＥ－００４」は同義的に使用され、したがって、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号９）を含んでなるかまたはそれからなるＰＲＡＭ由来ペプチドを指す。
「ＭＡＧＥ－Ａ」または「黒色腫関連抗原Ａ」サブファミリータンパク質は、分子レベルで同定された最初の腫瘍関連抗原であった（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９１；２５４：１６４３－４７）。ＭＡＧＥ－Ａは、Ｘ染色体のｑ２８領域に位置する１２個の遺伝子（ＭＡＧＥ－Ａ１～Ａ１２）のサブファミリーである。ＭＡＧＥ－Ａサブファミリータンパク質のメンバーは通常、精巣または胎盤でのみ発現され、それらの制限された発現は、それらが胚細胞の発達において機能していてもよいことを示唆する。ＭＡＧＥ－Ａタンパク質は、中枢神経系、脊髄、および脳幹の初期発生でも検出され、ＭＡＧＥ－Ａタンパク質が神経発生にもまた関与していてもよいことが明らかにされた。このファミリーのメンバーは、互いに５０～８０％の配列同一性を有するタンパク質をコードし、全てのＭＡＧＥタンパク質は、およそ１７０個のアミノ酸からなる高度に保存されたドメインである、共通のＭＡＧＥ相同性ドメイン（ＭＨＤ）を共有する。がんにおけるＭＡＧＥ－Ａタンパク質発現の生物学的機能、および根底にある調節機序は、まだ完全には分かっていない。
「ＭＡＧＥ－Ａ４」または「黒色腫関連抗原４」タンパク質は、ＭＡＧＥ－Ａ遺伝子ファミリーのメンバーであり、配列番号１１１のＵｎｉｐｒｏｔ受入れ番号Ｐ４３３５８を有する（２０１９年７月８日時点で利用可能）。ＭＡＧＥ－Ａ４の局在は、細胞質性として記載されている。しかし、ＭＡＧＥ－Ａ４染色はまた核内でも検出されており、高分化型がんと低分化型ガンとの対比では、核と細胞質の間で示差的分布があった（Ｓａｒｃｅｖｉｃ Ｂ ｅｔ．ａｌ．，２００３，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ６４，４４３－４４９）。ＭＡＧＥ－Ａ４は、雄生殖細胞マーカーとして使用される。これは、精原細胞では発現されないが、前精原細胞および成熟胚細胞で発現される（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．２７，１２５５－１２６６）。ＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質およびｍＲＮＡの発現は、様々ながんの発症および予後に関連付けられている。
「ＭＡＧＥ－Ａ８」または「黒色腫関連抗原８」タンパク質は、ＭＡＧＥ－Ａスーパーファミリーのメンバーであり、配列番号１１２のＵｎｉｐｒｏｔ受入れ番号Ｐ４３３６１を有する（２０１９年７月２０１９日時点で利用可能）。
「ＭＡＧＥ－Ａ４」と「ＭＡＧＥ－Ａ８」タンパク質は、ＢＬＡＳＴＰ２．９．０アルゴリズムを用いたタンパク質配列アラインメントによる判定で、７２％の配列同一性を有する（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。さらに、「ＭＡＧＥ－Ａ４」と「ＭＡＧＥ－Ａ８」は、どちらもＭＡＧ－００３ペプチド、すなわち、ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１０）を含んでなる。
本発明の文脈で使用される「エピトープ」という用語は、「構造的エピトープ」および「機能的エピトープ」という用語を含んでなる。「構造的エピトープ」は、抗原に結合したときに抗原結合タンパク質によってカバーされる、例えば、ペプチド－ＭＨＣ複合体などの抗原のアミノ酸である。典型的には、抗原結合タンパク質のアミノ酸の任意の原子から５Å以内にある、抗原の全てのアミノ酸がカバーされていると見なされる。抗原の構造的エピトープは、Ｘ線結晶学またはＮＭＲ分析をはじめとする、当該技術分野で知られている方法によって判定されてもよい。抗体の構造的エピトープは、典型的には、２０～３０個のアミノ酸を含んでなる。ＴＣＲの構造的エピトープは、典型的には、２０～３０個のアミノ酸を含んでなる。「機能的エピトープ」は、構造的エピトープを形成するアミノ酸のサブセットであり、Ｈ結合、塩橋、芳香族スタッキングまたは疎水性相互作用などの非共有結合を直接形成することによって、または抗原の結合コンフォメーションを間接的に安定化させることによって、本発明の抗原結合タンパク質との界面形成に重要な抗原のアミノ酸を含んでなり、例えば、変異スキャンニングによって判定される。典型的には、抗体が結合する抗原の機能的エピトープは、４～６個のアミノ酸を含んでなる。典型的には、ペプチド－ＭＨＣ複合体の機能的エピトープは、ペプチドの２～６個のアミノ酸と、ＭＨＣ分子の２～７個のアミノ酸とを含んでなる。ＭＨＣＩ提示ペプチドは典型的には、８～１０アミノ酸長を有するので、各所与のペプチドのアミノ酸のサブセットのみが、ペプチド－ＭＨＣ複合体の機能的エピトープの一部である。本発明の文脈において、エピトープ、特に本発明の二重特異性抗原結合タンパク質によって結合される機能的エピトープは、結合界面の形成に必要とされる抗原のアミノ酸、したがって配列番号１０のＭＡＧＥ－Ａ抗原性ペプチドの少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つのアミノ酸を含んでなる、機能的エピトープを含んでなるかまたはそれからなる。
本発明の文脈における「ＣＤ３」とは、多分子Ｔ細胞受容体複合体の一部としてＴ細胞上で発現され、少なくとも３つの異なる鎖：ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、およびＣＤ３γからなる抗原を意味する。ＣＤ３δおよびＣＤ３γは、ヒトＣＤ３εとの配列同一性および／または類似性が低い（類似性および同一性は２０％未満）。「ＣＤ３ε／δ－複合体」は、ＣＤ３εとＣＤＲ３δによって形成される複合体を指す。ＣＤ３εはまた、ＣＤＲ３γと複合体、いわゆる「ＣＤ３ε／γ複合体」を形成する。例えば、固定化された抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞上のＣＤ３のクラスター化は、Ｔ細胞受容体の係合と同様のＴ細胞活性化をもたらすが、そのクローンの典型的な特異性とは独立している。「ＣＤ３ε」は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインの３つのドメインを含んでなる。
本発明の文脈における「ＵＣＨＴ１」モノクローナル抗体は、本明細書でＣＤ３ε／δ－複合体と称される、ＣＤ３／Ｔ細胞抗原受容体複合体の３６ｋＤａサブユニットであるヒトＣＤ３δ鎖とＣＤ３ε鎖の複合体に特異的に結合する。マウスモノクローナル抗体ＵＣＨＴ－１は、配列番号３６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＶＬドメインと、配列番号３７のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＶＨドメインとを含んでなる。ＵＣＨＴ１のヒト化は、例えば、Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）；１７５（１）：２１７－２２５）によって記載されており、これは、次にさらに修飾され、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５，１５５，１９０３－１９１０）によって記載されている、ｈＵＣＨＴ１（Ｖ９）と称されるＵＣＨＴ１のヒト化変異型９がもたらされる。ｈＵＣＨＴ１（Ｖ９）は、配列番号３８のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＶＬドメインと、配列番号３９のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＶＨドメインとを含んでなる。しかしながら、ヒト化ＵＣＨＴの先行技術の変異型は、溶解度が低く、可溶性分子の分子的状況で使用することは困難である。さらに、これらの先行技術の変異型は、ＣＤ３に対して高い親和性を有し、これは、本発明の文脈で発見されたように不利であるかもしれない。
本発明の文脈における「ＢＭＡ０３１」とは、ヒトα／βＴＣＲＲに特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＷＴ３１を意味する。例えば、Ｓｈｅａｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１，１４７，４３６６－７３）に記載されているα／β ＴＣＲ特異的ヒト化抗体ＢＭＡ０３１をはじめとする、異なるヒト化変異型が当該技術分野で開示されている。Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１，１４７，４３６６－７３）に記載されているヒト化抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＶＬドメインと、配列番号４１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＶＨドメインとを含んでなる。
本発明の文脈における「主要組織適合性複合体」（ＭＨＣ）は、獲得免疫系が脊椎動物において外来分子を認識するために不可欠な細胞表面タンパク質のセットであり、それは次に組織適合性を決定する。ＭＨＣ分子の主な機能は、病原体に由来する抗原に結合し、それらを細胞表面上に提示して適切なＴ細胞に認識させることである。ヒトＭＨＣは、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体（しばしば単にＨＬＡ）とも称される。ＭＨＣ遺伝子ファミリーは、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩの３つのサブグループに分けられる。ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を保有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを保有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。ＣＤ８依存性およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答が、抗腫瘍効果と共同して相乗的に寄与するので、腫瘍関連抗原および対応するＴ細胞受容体の同定および特性評価は、ワクチンおよび細胞療法などのがん免疫療法の開発において重要である。ＨＬＡ－Ａ遺伝子は第６染色体の短腕上に位置し、ＨＬＡ－Ａのより大きなα鎖の構成物をコード化する。ＨＬＡ－Ａα鎖の多様性は、ＨＬＡ機能の鍵である。この多様性は、集団の遺伝的多様性を促進する。各ＨＬＡは、特定の構造のペプチドに対して異なる親和性を有することから、ＨＬＡの種類が多いほど、細胞表面上に「提示」される抗原の種類も多くなる。各個人は、それぞれの親から１タイプずつの最大２タイプのＨＬＡ－Ａを発現し得る。一部の個人は、両親から同一のＨＬＡ－Ａを継承し、個々のＨＬＡの多様性が低下する；しかし、大多数の個人は、ＨＬＡ－Ａの２つの異なるコピーを受け継ぐ。これと同じパターンが、全てのＨＬＡグループで続く。換言すれば、各個人は、２４３２個の既知のＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうちの１つまたは２つのみを発現する。
本発明の文脈におけるＭＨＣクラスＩ ＨＬＡタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃタンパク質、好ましくはＨＬＡ－Ａタンパク質、より好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２であってもよい。
「ＨＬＡ－Ａ＊０２」は特定のＨＬＡ対立遺伝子を表し、その中では、文字Ａは遺伝子を表し、接尾辞「＊０２」はＡ２血清型を示す。
ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応においては、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、引き続いて特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を保有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。
本発明の文脈における「ＴＣＲ」は、免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質であり、これは、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体の不変タンパク質と関連している。ＴＣＲはαβおよびγδ形態で存在し、それらは構造的に類似しているが、かなり異なる解剖学的位置とおそらくは機能を有する。天然のヘテロ二量体αβＴＣＲおよびγδＴＣＲの細胞外部分は、それぞれ２つのポリペプチドを含有し、そのそれぞれは膜近位定常ドメインおよび膜遠位可変ドメインを有する。定常ドメインおよび可変ドメインのそれぞれは、鎖内ジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似した、高度に多型性のループを含有する。
本明細書における「ＴＣＲ」という用語は、ＴＣＲおよびそれらの断片、ならびに一本鎖ＴＣＲおよびそれらの断片、特に単一ドメインＴＣＲの可変αおよびβドメイン、ならびにキメラ、ヒト化、二重特異性または多重特異性ＴＣＲを示す。
「ＴＣＲの断片」は、無傷または天然のＴＣＲの一部、特に無傷または天然のＴＣＲの抗原結合領域または可変領域を含んでなる。ＴＣＲ断片の例としては、Ｖα－ＣａまたはＶβ－Ｃβなどのα、β、δ、γ鎖の断片またはその一部が挙げられ、このような断片は、対応するヒンジ領域；またはＶα、Ｖβ、Ｖδ、Ｖγなどの単一の可変ドメイン；一本鎖ＶαＶβ断片；ＴＣＲ断片から形成される二重特異性ＴＣＲおよび多重特異性ＴＣＲもさらに含んでなるかもしれない。ＴＣＲ断片は、天然に存在する完全長ＴＣＲと比較して同一の機能を発揮し、すなわち断片は、それらの標的ペプチドに選択的かつ特異的に結合する。
「一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）」は、本明細書ではタンパク質を示し、その中では、ＶαとＶβ、またはＶδとＶγなどのＴＣＲの可変ドメインが、１つのポリペプチド上に位置する。典型的には、可変ドメインはリンカーによって分離され、その中では、前記リンカーは、典型的には、例えば５～１５などの５～２０個のアミノ酸を含んでなる。
例えば、「天然ＴＣＲ」という文言で使用される「天然」は、野生型ＴＣＲを指す。天然α－βヘテロ二量体ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を有する。各α鎖は可変領域、連結領域、および定常領域を含んでなり、β鎖は通常、可変領域と連結領域の間の短い多様性領域もまた含有するが、この多様性領域はしばしば連結領域の一部と見なされる。ＴＣＲα鎖およびβ鎖の定常領域またはＣ領域は、それぞれＴＲＡＣおよびＴＲＢＣと称される（Ｌｅｆｒａｎｃ，（２００１），Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ａｐｐｅｎｄｉｘ １：Ａｐｐｅｎｄｉｘ １０）。本明細書におけるα可変ドメインおよびβ可変ドメインと称される各可変領域は、フレームワーク配列に埋め込まれた３つの「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を含んでなり、１つはＣＤＲ３と命名された超可変領域である。α可変ドメインＣＤＲは、本明細書においてＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、ＣＤＲａ３と称され、β可変ドメインＣＤＲは、本明細書においてＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、ＣＤＲｂ３と称される。それらのフレームワークによって、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列によって、ならびに部分的に定義されたＣＤＲ３配列によって区別される、数種類のα鎖可変（Ｖα）領域および数種類のβ鎖可変（Ｖβ）領域がある。Ｖαタイプは、ＩＭＧＴ命名法で一意のＴＲＡＶ番号によって参照され、Ｖβタイプは、ＩＭＧＴ命名法で一意のＴＲＢＶ番号によって参照される（Ｆｏｌｃｈ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，（２０００），Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ １７（１）：４２－５４；Ｓｃａｖｉｎｅｒ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，（２０００），Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ １７（２）：８３－９６；ＬｅＦｒａｎｃ ａｎｄ ＬｅＦｒａｎｃ，（２００１），”Ｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。免疫グロブリン遺伝子についてより詳しくは、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐｂｅｔ ａｌ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊａｎ；４３（データベース出版）：Ｄ４１３－２２；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を参照されたい。したがって、従来のＴＣＲ抗原結合部位には、αおよびβ鎖可変領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含んでなる、通常、６つのＣＤＲが含まれ、その中では、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３配列は、ＨＬＡタンパク質に結合するペプチド抗原の認識および結合に関連し、ＣＤＲ２配列は、ＨＬＡタンパク質の認識および結合に関連する。
抗体と同様に、「ＴＣＲフレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列、すなわち、単一生物種中の異なるＴＣＲ間である程度保存されているＴＣＲαおよびβ鎖可変領域の部分を指す。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、それぞれ４つのＦＲを有し、本明細書において、それぞれＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、ＦＲ４－ａ、およびＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、ＦＲ４－ｂと称される。したがって、α鎖可変ドメインは、このように（ＦＲ１－ａ）－（ＣＤＲａ１）－（ＦＲ２－ａ）－（ＣＤＲａ２）－（ＦＲ３－ａ）－（ＣＤＲａ３）－（ＦＲ４－ａ）と称されてもよく、β鎖可変ドメインは、このように（ＦＲ１－ｂ）－（ＣＤＲｂ１）－（ＦＲ２－ｂ）－（ＣＤＲｂ２）－（ＦＲ３－ｂ）－（ＣＤＲｂ３）－（ＦＲ４－ｂ）と称されてもよい。
本発明の文脈において、αまたはβ鎖またはγまたはδ鎖におけるＣＤＲ／ＦＲ定義は、ＩＭＧＴ定義に基づいて判定されることになっている（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，２７（１）：５５－７７；ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）。したがって、ＴＣＲまたはＴＣＲ由来ドメインに関連する場合のＣＤＲ／ＦＲアミノ酸位置は、前記のＩＭＧＴ定義に従って示される。一例では、第１の可変ドメインのＣＤＲ／ＦＲアミノ酸位置のＩＭＧＴ位置は、ＴＲＡＶ５のＩＭＧＴ番号付けとの類似性で示され、および／または第２の可変ドメインのＣＤＲ／ＦＲアミノ酸位置のＩＭＧＴ位置は、ＴＲＢＶ１２－４のＩＭＧＴ番号付けとの類似性で示され、これは、例えば、配列番号１０のＭＡＧＥ－Ａ抗原性ペプチドに対して向けられた抗原結合部位Ｂの可変ドメインの場合である。
γ／δＴＣＲに関して、「ＴＣＲγ可変ドメイン」という用語は、本明細書の用法ではリーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲγＶ（ＴＲＧＶ）領域とＴＣＲγＪ（ＴＲＧＪ）領域との連結を指し、ＴＣＲγ定常ドメインという用語は、細胞外ＴＲＧＣ領域を指し、またはＣ末端切断型ＴＲＧＣ配列を指す。同様に「ＴＣＲδ可変ドメイン」という用語は、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲδＶ（ＴＲＤＶ）領域とＴＣＲδＤ／Ｊ（ＴＲＤＤ／ＴＲＤＪ）領域との連結を指し、「ＴＣＲδ定常ドメイン」という用語は、細胞外ＴＲＤＣ領域を指し、またはＣ末端切断型ＴＲＤＣ配列を指す。
「免疫グロブリン」とも称される「抗体」では、２つの重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結され、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。軽鎖には、ラムダ（ｌ）およびカッパ（ｋ）の２タイプがある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ。それぞれの鎖は、異なる配列ドメインを含有する。軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）との２つのドメインまたは領域を含む。重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）と、３つの定常ドメイン（集合的にＣＨと称される、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）との４つのドメインを含む。軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）の双方の可変領域は、抗原への結合認識および特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）と重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の結合、分泌、胎盤通過性、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１つの軽鎖可変部分と１つの重鎖可変部分とからなる。抗体の特異性は、抗体組み合わせ部位（抗体結合部位の同義語）と抗原決定基の間の構造的相補性にある。抗体組み合わせ部位は、主に超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基で構成されている。時折、非超可変またはフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基は、全体的なドメイン構造に影響を与え、したがって結合組み合わせ部位に影響を与える。相補性決定領域またはＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－Ｌ、ＣＤＲ３－Ｌ、およびＣＤＲ１－Ｈ、ＣＤＲ２－Ｈ、ＣＤＲ３－Ｈと称される、３つのＣＤＲをそれぞれ有する。したがって、従来の抗体抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含んでなる６つのＣＤＲを含む。
本発明の文脈において、抗体または免疫グロブリンは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＥである。
「抗体フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列、すなわち、単一生物種の異なる免疫グロブリン間で比較的保存されている、免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の部分を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌ、およびＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと称される、４つのＦＲをそれぞれ有する。したがって、軽鎖可変ドメインは、ひいては（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と称されてもよく、重鎖可変ドメインは、ひいては（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）と称されてもよい。
本発明の文脈において、免疫グロブリン軽鎖または重鎖、特に本発明の文脈における抗ＣＤ３抗体変異型の免疫グロブリン軽鎖または重鎖におけるＣＤＲ／ＦＲの定義は、Ｋａｂａｔに基づいて決定される（Ｋａｂａｔ ＥＡ，Ｔｅ，Ｗｕ Ｔ，Ｆｏｅｌｌｅｒ Ｃ，Ｐｅｒｒｙ ＨＭ，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ ＫＳ．（１９９２）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．）。しかしながら、免疫グロブリン軽鎖または重鎖のＣＤＲ／ＦＲアミノ酸、特に本発明の文脈におけるＵＣＨＴ１変異型の位置番号付けは、順序である。したがって、例えば、Ｋａｂａｔに従って決定されるＣＤＲＨ１は、アミノ酸３１～３５位の範囲であり、Ｋａｂａｔに従って決定されるＣＤＲＨ２は、アミノ酸５０～６６位の範囲であり、Ｋａｂａｔに従って決定されるＣＤＲＨ３は、アミノ酸９９～１１１位の範囲である。したがって、例えば、Ｋａｂａｔに従って決定されるＣＤＲＬ１は、アミノ酸２４～３４位の範囲であり、Ｋａｂａｔに従って決定されるＣＤＲＬ２は、アミノ酸５０～５６位の範囲である。
本明細書の用法では、「ヒトフレームワーク領域」は、天然由来ヒト抗体またはヒトＴＣＲなどの天然由来抗原結合タンパク質のフレームワーク領域と実質的に（約８５％以上、特に９０％、９５％、９７％、９９％または１００％）同一のフレームワーク領域である。
「抗体」という用語は、抗体およびそれらの断片、ならびに単一ドメイン抗体およびそれらの断片、特に単一ドメイン抗体の可変重鎖、およびキメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性または多重特異性抗体を意味する。
本明細書の「従来の抗体」は、自然から単離された抗体と同じドメインを有し、抗体由来のＣＤＲおよびフレームワーク領域を含んでなる抗体である。同様に、本明細書で言及される「従来のＴＣＲ」は、天然ＴＣＲおよびＴＣＲ由来のＣＤＲおよびフレームワーク領域と同じドメインを含んでなる、ＴＣＲである。
「ヒト化抗体」という用語は、完全にまたは部分的に非ヒト起源であり、ヒトの免疫反応を回避するかまたは最小化するために、特に非ヒトモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のフレームワーク領域において特定のアミノ酸を置換するように修飾された抗体を指す。ヒト化抗体の定常ドメインは、主にヒトＣＨおよびＣＬドメインである。
抗体配列をヒト化するための多くの方法が当該技術分野で公知であり；例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ＆ Ｆｒａｎｓｓｏｎ（２００８）Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３によるレビューを参照されたい。一般的に使用される方法の１つは、ＣＤＲグラフト化、または抗体再形成であり、これは、通常はマウス抗体であるドナー抗体のＣＤＲ配列を異なる特異性のヒト抗体のフレームワークスキャフォールドにグラフト化することを伴う。ＣＤＲグラフト化は、ＣＤＲグラフト化非ヒト抗体の結合特異性および親和性、ひいては生物学的活性を低下させることもあるので、親抗体の結合特異性および親和性を保持するために、ＣＤＲグラフト化抗体の選択された位置に復帰変異が導入されてもよい。可能な復帰変異の位置の同定は、文献および抗体データベースで利用可能な情報を使用して実施され得る。ＣＤＲグラフト化および復帰変異の代替のヒト化技術は、表面再構成であり、その中では、非ヒト起源の非表面露出残基が保持される一方、表面残基はヒト残基に改変される。別の代替技術は「ガイド付き選択」（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，８９９）として知られ、例えばマウス抗体から、親抗体のエピトープおよび結合特性を維持する完全ヒト抗体を誘導するために使用され得る。ヒト化のさらなる方法は、いわゆる４Ｄヒト化である。４Ｄヒト化プロトコルは、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１１００２７２６６Ａ１号明細書（国際公開第２００９０３２６６１Ａ１号パンフレット）に記載されている。本発明の文脈におけるモノクローナルマウス抗体ＵＣＨＴ１は、本明細書において実施例１に詳細に記載されているようにヒト化されている。キメラ抗体では、ヒト化は典型的には、可変領域配列のフレームワーク領域の修飾を伴う。
本発明の文脈における「バーニアゾーン」は、ＣＤＲループのコンフォメーションおよび抗体の親和性に影響を与えることが実証されている、フレームワーク領域のマウス残基を指す。これらの残基は「バーニア残基」とも称され、ＣＤＲのすぐ下にあるβシートフレームワーク領域に位置し、抗原との直接的相互作用には関与せず、すなわちこれらの残基は「ヒト化」抗体中に保持されている。
ＣＤＲの一部であるアミノ酸残基は、典型的にはヒト化に関連して改変されないが、特定例では、例えば、グリコシル化部位、脱アミド化部位、異性化部位または望ましくないシステイン残基を除去するために、個々のＣＤＲアミノ酸残基を改変することが望ましい場合がある。Ｎ結合グリコシル化は、トリペプチド配列Ａｓｎ－Ｘ－ＳｅｒまたはＡｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ中のアスパラギン残基にオリゴ糖鎖が結合することによって起こり、式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であってもよい。Ｎグリコシル化部位の除去は、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のいずれかを異なる残基に変異させることによって、特に保存的置換を介して達成されてもよい。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面露出などの要因に応じて生じ得る。アスパラギン残基は、主にＡｓｎ－Ｇｌｙの配列で存在する場合に特に脱アミドの影響を受けやすく、Ａｓｎ－Ａｌａなどのその他のジペプチド配列ではその影響より少ない。したがって、このような脱アミド化部位、特にＡｓｎ－ＧｌｙがＣＤＲ配列中に存在する場合、典型的には保存的置換によって、関与する残基の１つを除去することによって、その部位を除去することが望ましくあってもよい。関与する残基の１つを除去するためのＣＤＲ配列中の置換もまた、本発明に包含されることが意図される。
本発明の文脈における「抗体の断片」は、無傷抗体の一部、特に無傷抗体の抗原結合領域または可変領域を含んでなる。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、二特異性抗体、および抗体断片から形成される二重特異性抗体および多重特異性抗体が挙げられる。抗体の断片はまた、重鎖抗体またはＶＨＨなどの単一ドメイン抗体であってもよい。
「Ｆａｂ」という用語は、約５０，０００ダルトンの分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を意味し、その中では、例えば、パパインなどのプロテアーゼでＩｇＧを処理して得られた断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側のほぼ半分とＬ鎖全体が、ジスルフィド結合を介して共に結合する。
本発明の文脈における「形態」という用語は、二重特異性抗原結合タンパク質およびその空間的構成中に存在する、特定の数およびタイプのドメインを含んでなる二重特異性抗原結合タンパク質を指す。
二重特異性形態などの多くの異なる形態は、抗体の文脈で当該技術分野で記載され、このような形態としては、典型的には、二特異性抗体、クロスオーバー二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）および／または二重可変ドメイン（ＤＶＤ）タンパク質が挙げられる。これらの異なる二重特異性抗体の概要およびそれらを生成する方法は、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．Ｅ．ＭＡｂｓ．２０１７ Ｆｅｂ－Ｍａｒ；９（２）：１８２－２１２で開示される。より具体的には、ＤＶＤ形態は、例えば、以下の科学論文で開示される（Ｗｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００７；２５：１２９０－７；ＰＭＩＤ：１７９３４４５２；Ｗｕ Ｃ．ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２００９；１：３３９－４７；Ｌａｃｙ ＳＥ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２０１５；７：６０５－１９；ＰＭＩＤ：２５７６４２０８；Ｃｒａｉｇ ＲＢ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１２；７：ｅ４６７７８；ＰＭＩＤ：２３０５６４４８；Ｐｉｃｃｉｏｎｅ ＥＣ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２０１５）。ＣＯＤＶは、例えば、Ｏｎｕｏｈａ ＳＣ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０１５ Ｏｃｔ；６７（１０）：２６６１－７２、または例えば、国際公開第２０１２／１３５３４５号パンフレット、国際公開第２０１６／１１６６２６号パンフレットで開示される。二重特異性二特異性抗体は、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９６；９：２９９－３０５；ＰＭＩＤ：８７３６４９７；Ａｔｗｅｌｌ ＪＬ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９６；３３：１３０１－１２；ＰＭＩＤ：９１７１８９０；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９７；１５：６２９－３１；ＰＭＩＤ：９２１９２６３；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９７；３：１３７－４４；ＰＭＩＤ：９２３７０９８；Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ Ｂ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００；６０：４３３６－４１；ＰＭＩＤ：１０９６９７７２；およびＤｅＮａｒｄｏ ＤＧ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ ２００１；１６：５２５－３５；ＰＭＩＤ：１１７８９０２９で説明される。
抗体の文脈で用いられる「二特異性抗体」は、典型的には、同じまたは異なる抗体からの、それぞれがＶＨおよびＶＬドメインを含んでなる２つの鎖から構成される二価の分子を指す。２つの鎖は典型的には、ＶＨＡ－ＶＬＢとＶＨＢ－ＶＬＡ（ＡとＢは２つの異なる特異性を表す）、またはＶＬＡ－ＶＨＢとＶＬＢ－ＶＨＡの構成を有する。
本発明の文脈における「二特異性抗体（Ｄｂ）」または「二特異性抗体形態」は、本明細書でそれぞれ、リンカー（ＬＤｂ１およびＬＤｂ２）によって連結された２つの可変ドメインを含んでなる２つのポリペプチド鎖から構成された二価の分子を指し、その中では、ドメインの２つは、本発明の文脈で定義される第１および第２のドメイン（Ｖ１およびＶ２）であって、その他の２つのドメインは、ＴＣＲ由来または抗体由来の可変ドメイン（ＶＡ、ＶＢ）であってもよい。Ｖ１Ｖ２ドメインは、２つの異なるポリペプチド上に位置し、ＶＡＶＢドメインは、２つの異なるポリペプチド上に位置し、ドメインは頭ー尾方向で二量体化する。したがって、配向は、Ｖ１－ＬＤｂ１－ＶＡとＶＢ－ＬＤｂ２－Ｖ２、Ｖ２－ＬＤｂ１－ＶＡとＶＢ－ＬＤｂ２－Ｖ１、Ｖ１－ＬＤｂ１－ＶＢとＶＡ－ＬＤｂ２－Ｖ２、またはＶ２－ＬＤｂ１－ＶＢとＶＡ－ＬＤｂ２－Ｖ１であってもよい。ドメインが頭－尾方向で二量体化できるようにするために、リンカー、すなわちＬＤｂ１およびＬＤｂ１は同一であるかまたは異なり得て、短いリンカーである。短いリンカーは、典型的には例えば、４、５など、例えば３、４、５、６、７、８、９アミノ酸長の２～１２、３～１３アミノ酸長の間のリンカーであり（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．Ｅ．（ＭＡｂｓ．２０１７ Ｆｅｂ－Ｍａｒ；９（２）：１８２－２１２）、または配列番号１１４の「ＧＧＧＳ」、配列番号１１５の「ＧＧＧＧＳ」、または配列番号１１８の「ＧＧＧＳＧＧＧＧ」などの８アミノ酸長である。
「二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））」形態は、２００７年に最初にＷｕ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ Ｎｏｖ；２５（１１）：１２９０－７によって記載された。この形態では、典型的には、第２のモノクローナル抗体（Ｂ）の標的結合可変ドメインは、典型的には従来の抗体（Ａ）（ドメインＶＬＡおよびＶＨＡを含んでなる）に融合し、その中では、従来の抗体（Ａ）の軽鎖は、したがって追加的な軽鎖可変ドメイン（ＶＬＢ）を含んでなり、従来の抗体（Ａ）の重鎖は、追加的な重鎖可変ドメイン（ＶＨＢ）を含んでなる。当該技術分野で記載されるようなＤＶＤ－Ｉｇ（商標）は、したがって典型的には、ＶＨＢ－Ｌ－ＶＨＡ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含んでなる１つの重鎖と、ＶＬＢ－Ｌ－ＶＬＡ－ＣＬを含んでなる１つの軽鎖との２つのポリペプチド鎖から構成される。ドメイン対ＶＬＡ／ＶＨＡおよびＶＬＡ／ＶＬＡは、したがって平行して対合する。
本発明の文脈における「二重可変ドメインＩｇ形態」は、それぞれ、リンカー（Ｌ１、Ｌ３）によって連結された、２つの可変ドメインを含んでなる２つのポリペプチド鎖を含んでなるタンパク質を指し、その中では、ドメインの２つは、本発明の文脈で定義される第１および第２のドメイン（Ｖ１およびＶ２）であり、その他の２つのドメインは、重鎖および軽鎖可変ドメイン（ＶＨＡおよびＶＨＢ）に由来する抗体である。本発明の文脈におけるＤＶＤ－Ｉｇ形態では、ポリペプチド鎖は、例えば、Ｖ１－Ｌ１－ＶＨＡ－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３とＶ２－Ｌ３－ＶＬＡ－Ｌ４－ＣＬ、またはＶ２－Ｌ１－ＶＨＡ－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３とＶ１－Ｌ３－ＶＬＡ－Ｌ４－ＣＬの構成を有する。接続リンカーＬ１およびＬ３は、好ましくは５～１５アミノ酸残基などの５～２０アミノ酸残基長の間であり、および／または接続リンカーＬ２およびＬ４は、存在してもまたは存在しなくてもよい。
抗体の文脈で当該技術分野で記載されているような「クロスオーバー二重可変ドメインＩｇ様タンパク質」は、２つのＶＨおよび２つのＶＬドメインが、可変ＶＨ－ＶＬドメインのクロスオーバー対合を可能にする様式で連結され、それらは、ＶＨＡ－ＶＨＢおよびＶＬＢ－ＶＬＡの順序、またはＶＨＢ－ＶＨＡおよびＶＬＡ－ＶＬＢの順序のいずれかで（ＮからＣ末端方向に）配列される形態に相当する。
本発明の文脈において、「クロスオーバー二重可変ドメインＩｇ様タンパク質」は、それぞれがリンカー（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４）によって連結された２つの可変ドメインを含んでなる、２つのポリペプチド鎖を含んでなるタンパク質を指し、その中では、２つのドメインは、本発明の文脈で定義される第１および第２のドメイン（Ｖ１およびＶ２）であり、その他の２つのドメインは、抗体由来の重鎖および軽鎖可変ドメイン（ＶＨＡ、ＶＨＢ）である。本発明の文脈におけるＣＤＶＤ－Ｉｇ形態では、ポリペプチド鎖は、例えば、Ｖ１－Ｌ１－ＶＨＡ－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３とＶＬＡ－Ｌ３－Ｖ２－Ｌ４－ＣＬ、Ｖ２－Ｌ１－ＶＨＡ－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３とＶＬＡ－Ｌ３－Ｖ１－Ｌ４－ＣＬ、ＶＨＡ－Ｌ１－Ｖ１－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３とＶ２－Ｌ３－ＶＬＡ－ＬＤＶＤ３－ＣＬ、またはＶＨＡ－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３とＶ１－Ｌ３－ＶＬＡ－Ｌ４－ＣＬの構成を有する。このＣＤＶＤ形態では、リンカー（Ｌ１～Ｌ４）は、典型的には、全グリシンリンカーおよび本明細書のリンカーの項で下に記載されるリンカーを含めて、異なる長さである。例えば、Ｌ１は３～１２アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は３～１４アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は１～８アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は１～３アミノ酸残基の長さであるか、またはＬ１は５～１０アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は５～８アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は１～５アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は１～２アミノ酸残基の長さであるか、またはＬ１は７アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は５アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は１アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は２アミノ酸残基の長さである。
本明細書における「少なくとも１つ」は、１、２、３、４、５または６つ以上の特定の物体などの１つ又は複数の特定の物体を指す。例えば、本明細書における少なくとも１つの結合部位は、１、２、３、４、５または６つ以上の結合部位を指す。
「参照配列と少なくとも８５％の同一性を有する」配列とは、その全長において、参照配列の全長と８５％以上、特に９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列である。
本出願の文脈では、「同一性の百分率」は、グローバルなペアワイズアラインメントを用いて計算される（すなわち、２つの配列が、それらの全長にわたって比較される）。２つ以上の配列の同一性を比較するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ大域アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を用いて、それらの全長を考慮した場合の２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見つける「ｎｅｅｄｌｅ」プログラムが、用いられてもよい。Ｎｅｅｄｌｅプログラムは、例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂサイトで利用でき、以下の出版物でさらに説明されている（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００）；Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）ｐｐ．２７６－２７７）。本発明による２つのポリペプチド間の同一性の百分率は、１０．０に等しい「Ｇａｐ Ｏｐｅｎ」パラメーター、０．５に等しい「Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ」パラメーター、およびＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスで、ＥＭＢＯＳＳ：ｎｅｅｄｌｅ（大域）プログラムを用いて計算される。
参照配列と「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一」のアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列と比較して、欠失、挿入および／または置換などのアミノ酸変異を含んでもよい。置換の場合、参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列とは別の種に由来する相同配列に対応してもよい。
「アミノ酸置換」は、保存的または非保存的であってもよい。好ましくは、置換は保存的置換であり、その中ではあるアミノ酸が類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸によって置換される。
一実施形態では、保存的置換としては、その内容全体が参照により援用される、Ｄａｙｈｏｆｆによって”Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｖｏｌ．５”，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈに記載されているものが挙げられてもよい。例えば、一態様では、以下のグループの１つに属するアミノ酸は、互いに交換され得て、したがって、保守的な交換を構成する：グループ１：アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；グループ２：システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、スレオニン（Ｔ）；グループ３：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）；グループ４：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）；グループ５：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）；およびグループ６：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）。一態様では、保存的アミノ酸置換は、Ｔ→Ａ、Ｇ→Ａ、Ａ→Ｉ、Ｔ→Ｖ、Ａ→Ｍ、Ｔ→Ｉ、Ａ→Ｖ、Ｔ→Ｇ、および／またはＴ→Ｓから選択されてもよい。
さらなる実施形態では、保存的アミノ酸置換としては、例えば、（１）非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；および（４）塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなど、同一クラスの別のアミノ酸によるアミノ酸の置換が挙げられてもよい。その他の保存的アミノ酸置換はまた、以下のように行われ得る：（１）芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ；（２）プロトン供与体：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ；および（３）プロトン受容体：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ（例えば、その内容全体が参照により援用される、米国特許第１０，１０６，８０５号明細書を参照されたい）。
別の実施形態では、表３に従って保存的置換が行なわれてもよい。タンパク質修飾に対する耐性を予測する方法は、例えば、その内容全体が参照により援用される、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１０１（２５）：９２０５－９２１０（２００４）にある。
表3：保存的アミノ酸置換
Figure 2022543387000004
別の実施形態では、保存的置換は、「保存的置換」の見出しの下で表３に示されるものであってもよい。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表４で「例示的な置換」と命名される、より実質的な変化が導入され、必要に応じて生成物がスクリーニングされてもよい。
表4：アミノ酸置換
Figure 2022543387000005
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は変異型抗原結合タンパク質を含んでもよく、その中では、前記変異型二重特異性抗原結合タンパク質は、変異型がそれに由来する二重特異性抗原結合タンパク質と比較して、好ましくは第１の可変ドメイン（Ｖαドメインなど）および第２の可変ドメイン（Ｖβドメインなど）のＣＤＲ領域にある、最大８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のアミノ酸置換を含んでなる、第１のポリペプチド鎖（α鎖など）および第２のポリペプチド鎖（β鎖など）を含む。この点において、二重特異性抗原結合タンパク質のＣＤＲ領域のそれぞれの中に、または第１および／または第２の可変ドメインのＣＤＲ領域の全ての中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上のアミノ酸置換があってもよい。置換は、第１および／または第２の可変ドメインのどちらかのＣＤＲ中にあってもよい。
一実施形態では、変異型は機能的変異型である。
「機能的変異型」という用語は、本明細書の用法では、保存的アミノ酸置換を含有する二重特異性抗原結合タンパク質などの親二重特異性抗原結合タンパク質と、実質的または有意な配列同一性または類似性を有する二重特異性抗原結合タンパク質を指し、その中では、前記機能的変異型は、親二重特異性抗原結合タンパク質の生物学的活性を保持する。一態様では、機能的変異型は、例えば、親二重特異性抗原結合タンパク質とほぼ同程度、同程度、またはより高い程度で標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質の変異型（本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質それ自体は、親抗原結合タンパク質と称される）を包含する。親二重特異性抗原結合タンパク質に関して、機能的変異型は、例えば、親二重特異性抗原結合タンパク質へのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列であるアミノ酸配列を有し得る。
機能的変異型は、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む親二重特異性抗原結合タンパク質のアミノ酸配列を含んでなり得る。代案としては、またはそれに加えて、機能的変異型は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する、親二重特異性抗原結合タンパク質のアミノ酸配列を含んでなり得る。この場合、非保存的アミノ酸置換が機能的変異型の生物学的活性を妨害または阻害しないことが好ましい。好ましくは、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異型の生物学的活性を増強し、その結果、機能的変異型の生物学的活性は、親二重特異性抗原結合タンパク質と比較して増加する。
本発明の修飾されたＴＣＲ、ポリペプチド、および抗原結合タンパク質（機能的部分、断片、および機能的変異型を含む）は、修飾されたＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質（またはその機能的部分または機能的変異型）が、例えば、抗原に特異的に結合する能力、宿主における罹患細胞を検出する能力、または宿主における疾患を治療または予防する能力などのそれらの生物学的活性を保持するという条件で、任意の長さであり得て、すなわち、任意の数のアミノ酸を含んでなり得る。
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質（機能的部分、断片、および機能的変異型を含む）は、１つまたは複数の天然アミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含んでなり得る。このような合成アミノ酸は、当該技術分野で公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－およびトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリンβ－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸酸、アミノマロン酸酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リジン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシリジン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、α－アミノシクロヘプタンカルボン酸、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが挙げられてもよい。
一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質（機能的部分および機能的変異型をはじめとする）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎアシル化され得て、例えば、ジスルフィド架橋を介して環化され得て、または酸付加塩に変換され得て、および／または任意選択的に、二量体化または重合、または抱合され得る。
本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、合成、組換え、単離、および／または精製され得る。
本明細書における「共有結合」とは、例えば、ポリペプチドリンカーなどのリンカーまたはリンカー配列を介した、ジスルフィド架橋またはペプチド結合、または共有結合を指す。
「リンカー」という用語は、本明細書の用法では、例えば、一本鎖コンストラクト中、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の第１の可変ドメインと第２の可変ドメインの間、および任意選択的に、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間などの２つのドメインの間に挿入されて、ドメインに十分な可動性を提供し、正しく折りたたまれて抗原結合部位を形成し、または二重特異性抗原結合タンパク質の場合は、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のクロスオーバー対合（ＣＯＤＶ形態の、または二特異性抗体形態のいくつかの）または平行対合構成（例えば、ＤＶＤ形態）のいずれかで、抗原結合部位と、少なくとも１つのさらなる抗原結合部位を形成する、１つまたは複数のアミノ酸残基を指す。
いくつかの実施形態では、リンカーは０個のアミノ酸からなり、すなわちリンカーは存在しない。リンカーは、アミノ酸配列レベルで、可変ドメイン間、または可変ドメインと定数ドメイン間の移行部にそれぞれ挿入される。免疫グロブリンドメインならびにＴＣＲドメインのおよそのサイズが良く理解されているため、ドメイン間の移行部が同定され得る。実験データによって実証されるように、またはモデル化または二次構造予測測の技術を使用して同定または想定され得るように、βシートまたはαらせんなどの二次構造要素を形成しないペプチドストレッチの位置を特定することによって、ドメイン移行部の正確な位置が判定され得ることは、当業者によって知られている。本発明の文脈で使用されるリンカーという用語は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６と称されるリンカーを指すが、これらに限定されるものではない。
それぞれの文脈で特に指定されていない限り、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６、などのリンカーは、少なくとも１～３０アミノ酸の長さであり得る。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６などのリンカーは、２～２５、２～２０、または３～１８アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ５、およびＬ６などのリンカーは、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸長以下のさペプチドであり得る。その他の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６などのリンカーは、５～２５、５～１５、４～１１、１０～２０、または２０～３０アミノ酸長であり得る。その他の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６などのリンカーは、約、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長であり得る。特定の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６などのリンカーは、２４未満、２０未満、１６未満、１２未満、１０未満、例えば５～２４、１０～２４または５～１０のアミノ酸残基の長さであってもよい。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、長さが、１を超え、２を超え、５を超え、１０を超え、２０を超えるアミノ酸残基、長さが２２を超えるアミノ酸残基などの長さが１以上のアミノ酸残基である。Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６などの例示的なリンカーは、ＴＶＡＡＰ（配列番号１１３）、ＧＧＧＳ（配列番号１１４）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２８）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１５）、ＴＶＬＲＴ（配列番号１１６）、ＴＶＳＳＡＳ（配列番号１１７）、ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１１８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１９）、ＧＧＧＧＳＡＡＡ（配列番号１２０）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号３２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２１）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号１２２）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２３）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号６６）、ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＧＫＳ（配列番号９７）、ＧＧＱＧＳＧＧＴＧＳＧＧＱＧＳＧＧＴＧＳＧＧＱＧＳ（配列番号１４３）、ＴＶＬＳＳＡＳ（配列番号１２４）、ＧＧＧＧＳＧＴ（配列番号１８３）、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２５）、特にＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１１８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２５）、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２３）のアミノ酸配列からなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
本発明の文脈で使用される「Ｆｃドメイン」という用語は、以下でさらに定義される天然ＦｃドメインおよびＦｃドメインの変異型および配列を包含する。Ｆｃ変異型および天然Ｆｃ分子と同様に、「Ｆｃドメイン」という用語には、抗体全体から分解されたか、またはその他の手段で生成されたかにかかわらず、単量体または多量体の形態の分子が含まれる。
「天然Ｆｃ」という用語は、本明細書の用法では、抗体の消化から得られるか、または単量体または多量体の形態であるかどうかにかかわらず、その他の手段によって生成された非抗原結合断片の配列を含んでなり、ヒンジ領域を含有してもよい分子を指す。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン源は、特にヒト由来であり、免疫グロブリンのいずれかであり、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２、最も好ましくはＩｇＧ１であり得る。天然Ｆｃ分子は、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合によって二量体または多量体形態に結合し得る単量体ポリペプチドで構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥなど）またはサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、およびＩｇＧＡ２など）に応じて、１～４の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から得られるジスルフィド結合二量体である。「天然Ｆｃ」という用語は、本明細書の用法では単量体、二量体、および多量体の形態に一般的である。天然Ｆｃアミノ酸配列の一例は、ＩＧＨＧ１＊０１の配天然Ｆｃアミノ酸配列である、列番号１２６のアミノ酸配列である。
「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」は、典型的には、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に位置する重鎖の柔軟な部分を指す。それは約２５アミノ酸長であり、「上部ヒンジ」、「中部ヒンジ」または「コアヒンジ」、および「下部ヒンジ」に分割される。「ヒンジサブドメイン」は、上部ヒンジ、中部（またはコア）ヒンジ、または下部ヒンジを指す。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４分子のヒンジのアミノ酸配列を以下に示す：
ＩｇＧ１：Ｅ２１６ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１２７）
ＩｇＧ２：Ｅ２１６ＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰ（配列番号１２８）
ＩｇＧ３：ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥ２１６ＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１２９）
ＩｇＧ４：Ｅ２１６ＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号１３０）。
本発明の文脈において、これはＦｃドメイン中のアミノ酸位置に言及し、これらのアミノ酸位置または残基は、例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８－８５（１９６９）に記載されているようなＥＵ番号付けシステムに従って示される。
「Ｆｃ変異型」という用語は、本明細書の用法では、天然Ｆｃから修飾されているが、サルベージ受容体であるＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に対する結合部位をなおも含んでなる、分子または配列を指す。例示的なＦｃ変異型、およびそれらとサルベージ受容体との相互作用は、当該技術分野で公知である。したがって、「Ｆｃ変異型」という用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子または配列を含んでなり得る。さらに、天然Ｆｃは、二重特異性本発明の二重特異性抗原結合タンパク質に必要でない構造的特徴または生物学的活性を提供するので、除去され得る領域を含んでなる。したがって、「Ｆｃ変異型」という用語は、１つまたは複数の天然Ｆｃ部位または残基を欠く分子または配列を含んでなり、またはその中では、１つまたは複数のＦｃ部位または残基が修飾されて、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との非適合性、（３）選択された宿主細胞での発現時のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に影響を与えまたは関与している。
したがって、一実施形態では、Ｆｃ１および／またはＦｃ２などのＦｃドメインは、ヒンジドメインを含んでなる。
一実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧＦｃドメインであり、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２、より好ましくはＩｇＧ１由来のものである。
いくつかの実施形態では、特に、二重特異性抗原結合タンパク質が、２つのＦｃドメイン、すなわち本明細書で以下に記載されているＴＣＥＲ（登録商標）形態（Ｆｃ１およびＦｃ２など）を含んでなる場合に、２つのＦｃドメインは、同じ免疫グロブリンイソタイプまたはイソタイプサブクラスであっても、または異なる免疫グロブリンイソタイプまたはイソタイプサブクラスであってもよく、好ましくは同じものである。したがって、いくつかの実施形態では、Ｆｃ１およびＦｃ２は、ＩｇＧ１サブクラス、またはＩｇＧ２サブクラス、またはＩｇＧ３サブクラス、またはＩｇＧ４サブクラスであり、好ましくはＩｇＧ１サブクラス、またはＩｇＧ２サブクラス、より好ましくはＩｇＧ１サブクラスである。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは変異型Ｆｃドメインであり、したがって、本明細書で以下に記載されている１つまたは複数のアミノ酸置換を含んでなる。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、「ＲＦ」および／または「ノブ・インツー・ホール」変異、好ましくは「ノブ・インツー・ホール」を含んでなるかまたはさらに含んでなる。
「ＲＦ変異」は、Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈ．，２０１：２５－３４）によって記載されたようなＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆなどの、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸ＨＹのＲＦへのアミノ酸置換を一般に指し、プロテインＡへの結合を無効にすることから、精製目的に有利であると記載されている。二重特異性抗原結合タンパク質が２つのＦｃドメインを含んでなる場合、ＲＦ変異は片方または双方の、好ましくは片方のＦｃドメインにあってもよい。
「ノブ・インツー・ホール」技術とも称される「ノブ・インツー・ホール」は、どちらもＣＨ３－ＣＨ３界面でヘテロ多量体形成を促進する、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（ホール）と、Ｔ３６６Ｗ（ノブ）とを指す。これらの「ノブ・インツー・ホール」変異は、追加的なシステインアミノ酸置換であるＹ３４９ＣおよびＳ３５４Ｃの導入によってさらに安定化され得る。「ノブ・インツー・ホール」技術は、安定化システインアミノ酸置換と一緒に、米国特許第５７３１１６８号明細書および米国特許第８２１６８０５号明細書に記載されている。
本発明の文脈において、「ノブ」変異は、システインのアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃと一緒に、例えば、配列番号１３１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、Ｆｃドメインに存在し、「ホール」変異は、システインアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃと一緒に、配列番号１３２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、Ｆｃドメインに存在する。
いくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃ１などのポリペプチドの１つのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ（ノブ）を含んでなり、例えば、Ｆｃ２などのその他のポリペプチドのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（ホール）を含んでなり、逆もまた同様である。
いくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃ１などのポリペプチドの１つのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含んでなるかまたはさらに含んでなり、例えば、Ｆｃ２などのその他のポリペプチドのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ含んでなるかまたはさらに含んでなり、逆もまた同様である。
したがって、いくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃ１などのポリペプチドの１つのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（ノブ）を含んでなり、例えば、Ｆｃ２などのその他のポリペプチドのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３４９Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（ホール）を含んでなり、逆もまた同様である。
この一連のアミノ酸置換は、Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７）によって記載されたように、一方のポリペプチドにアミノ酸置換Ｋ４０９Ａを含め、もう一方のポリペプチドにＦ４０５Ｋを含めることによって、さらに拡張され得る。したがって、いくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃ１などのポリペプチドの１つのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｋ４０９Ａを含んでなるかまたはさらに含んでなり、例えば、Ｆｃ２などのその他のポリペプチドのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｆ４０５Ｋを含んでなるかまたはさらに含んでなり、逆もまた同様である。
場合によっては、人為的に導入されたシステイン架橋は、最適には二重特異性抗原結合タンパク質の結合特性を妨げることなく、二重特異性抗原結合タンパク質の安定性を改善してもよい。このようなシステイン架橋は、ヘテロ二量体化をさらに改善し得る。
得られたタンパク質のヘテロ二量体化を改善するための、荷電対置換などのさらなるアミノ酸置換が、例えば、欧州特許第２９７０４８４号明細書など、当該技術分野で記載されている。
したがって一実施形態では、例えば、Ｆｃ１などのポリペプチドの１つのＦｃドメインは、電荷対置換Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５６Ｒ、Ｄ３５６Ｒ、またはＤ３５６ＫおよびＤ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含んでなるかまたはさらに含んでなり、例えば、Ｆｃ２などのその他のポリペプチドのＦｃドメインは、電荷対置換Ｒ４０９Ｄ、Ｒ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｅ、またはＫ４０９ＤおよびＮ３９２Ｄ、Ｎ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｅ、またはＫ３９２Ｄを含んでなるかまたはさらに含んでなり、逆もまた同様である。
さらなる実施形態では、ポリペプチド鎖の片方または双方、好ましくは双方の上のＦｃドメインは、Ｆｃγ受容体（ＦｃｙＲ）結合を阻害する、１つまたは複数の改変を含んでなり得る。このような改変としては、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａが挙げられ得る。
ヒンジ、Ｈ２、およびＣＨ３ドメインからなるＦｃ部分、またはその一部を抗原結合タンパク質に、より具体的には二重特異性抗原結合タンパク質に含めることにより、Ｆｃ：Ｆｃ－γ受容体（ＦｃｇＲ）相互作用によって誘発される、これらの分子の非特異的固定化という問題が発生した。ＦｃｇＲは、ＩｇＧ分子のＦｃ部分によって提示されるエピトープに異なる親和性で結合する、異なる細胞表面分子（ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩｂ、ＦｃｇＲＩＩＩ）から構成されている。このような非特異的（すなわち、二重特異性分子の２つの結合ドメインのいずれによっても誘導されない）固定化は、ｉ）分子の薬物動態への影響、およびｉｉ）免疫エフェクター細胞のオフターゲット活性化の理由から好ましくなく、ＦｃｇＲ結合を除去するための様々なＦｃ変異型および変異が同定されている。これに関連して、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｔｈｅ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ＣＨ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ａｎｔｉ－ＨＬＡ－ＤＲ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ Ｃ１ｑ，ＦｃｙＲＩ ａｎｄ ＦｃｙＲＩＩＩ ｂｉｎｄｉｎｇ）は、ヒトＩｇＧ１の残基２３３～２３６のヒトＩｇＧ２に由来する対応する配列、すなわち残基２３３Ｐ、２３４Ｖ、および２３５Ａとの交換を開示し、その中では、２３６位にアミノ酸が存在しないため、ＦｃｇＲＩ結合が消失し、Ｃ１ｑ結合が消失し、ＦｃｇＲＩＩＩ結合が減少している。欧州特許第１０７５４９６号明細書は、Ｆｃ領域に変動がある抗体およびその他のＦｃ含有分子（２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ、２３６位にＧがない、３２７Ｇ、３３０Ｓ、および３３１Ｓの１つまたは複数）を開示し、その中では、組換え抗体は、有意な補体依存性溶解、または標的の細胞媒介性破壊を誘発することなく、標的分子に結合できる。
したがって、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ、２３６（残基なし）またはＧと；３２７Ｇ、３３０Ｓ、３３１Ｓからなる群から選択されるアミノ酸の１つまたは複数または欠失とを含んでなるかまたはさらに含んでなり、好ましくは、Ｆｃ領域は、アミノ酸２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ、２３６（残基なし）またはＧと、３２７Ｇ、３３０Ｓ、３３１Ｓからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸とを含んでなるかまたはさらに含んでなり、最も好ましくは、Ｆｃ領域は、アミノ酸２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ、２３６（残基なし）および３３１Ｓを含んでなるかまたはさらに含んでなる。
さらなる一実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７ＧまたはＮ２９７Ａ、好ましくはＮ２９７Ｑを含んでなるかまたはさらに含んでなる。
アミノ酸置換「Ｎ２９７Ｑ」、「Ｎ２９７Ｇ」、または「Ｎ２９７Ａ」は、Ｆｃドメイン内の天然Ｎグリコシル化部位を抑制する２９７位でのアミノ酸置換を指す。このアミノ酸置換は、Ｆｃ－γ－受容体相互作用をさらに防ぎ、例えば、Ｔａｏ，ＭＨ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ＳＬ（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９ Ｏｃｔ １５；１４３（８）：２５９５－６０１）に記載されているような糖残基に起因する、最終タンパク質産物、すなわち本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の変動性を減少させる。
さらなる一実施形態では、特に軽鎖がない場合、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｃ２２０Ｓを含んでなるかまたはさらに含んでなるむ。アミノ酸置換「Ｃ２２０Ｓ」は、ＣＨ１ＣＬジスルフィド架橋を形成するシステインを欠失させる。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、例えば、Ｓ３５４ＣとＹ３４９ＣまたはＬ２４２ＣとＫ３３４Ｃなどの少なくとも２つの追加的なシステイン残基を含んでなるかまたはさらに含んでなり、その中では、Ｓ３５４Ｃは、Ｆｃ１などの１つのポリペプチドのＦｃドメイン中にあり、Ｙ３４９Ｃは、Ｆｃ２などのその他のポリペプチドのＦｃドメイン中にあって、ヘテロ二量体を形成し、および／またはその中では、Ｌ２４２ＣおよびＫ３３４Ｃは、ポリペプチドの片方または双方のＦｃ１またはＦｃ２のいずれかの同じＦｃドメインに位置して、ドメイン内Ｃ－Ｃ橋を形成する。
「精製された」および「単離された」とは、ポリペプチド（すなわち、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質）またはヌクレオチド配列を指す場合、示された分子が、同じタイプのその他の生物学的巨大分子の実質的な不在下で、存在することを意味する。「精製された」という用語は、本明細書の用法では、特に、同じタイプの生物学的巨大分子の少なくとも７５重量％、８５重量％、９５重量％、または９８重量％が存在することを意味する。
特定のポリペプチドをコード化する「単離された」核酸分子は、対象ポリペプチドをコード化しないその他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指す；しかし、分子は、組成物の基本的特性に悪影響を及ぼさないいくつかの追加的な塩基または部分を含んでもよい。
「ドメイン」は、タンパク質の任意の領域であってもよく、一般に配列相同性に基づいて定義され、しばしば特定の構造的または機能的実体に関連している。
「組換え」分子は、組換え手段によって調製、発現、生成、または単離された分子である。
「遺伝子」という用語は、１つまたは複数のタンパク質または酵素の全部または一部を含んでなるアミノ酸の特定の配列をコードするか、またはそれに対応するＤＮＡ配列を意味し、例えば、遺伝子が発現される条件を判定するプロモーター配列などの調節ＤＮＡ配列を含んでも含まなくてもよい。構造遺伝子ではないいくつかの遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡに転写されてもよいが、アミノ酸配列には翻訳されまない。その他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子またはＤＮＡ転写の調節因子として機能してもよい。特に、遺伝子という用語は、タンパク質をコード化するゲノム配列、すなわち、調節因子、プロモーター、イントロン、およびエクソン配列を含んでなる配列を意図してもよい。
「親和性」は、理論的には、二重特異性抗原結合タンパク質と抗原との平衡結合によって定義され、本発明の文脈では、二重特異性抗原結合タンパク質とその抗原ＴＡ／ＭＨＣ、またはＴＡ－Ｃ／ＭＨＣまたはＣＤ３との間の平衡結合によって定義される。親和性は、例えば、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）（最大半量結合濃度（ＥＣ５０）と称されることもある）または平衡解離定数（ＫＤ）で表されてもよい。
「ＫＤ」は、抗原結合タンパク質とその抗原の間の平衡解離定数、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率である。ＫＤおよび親和性は、反比例の関係にある。ＫＤ値は、二重特異性抗原結合タンパク質の濃度に関係し、ＫＤ値が低いほど、二重特異性抗原結合タンパク質の親和性がより高くなる。親和性、すなわちＫＤ値は、本明細書で下に「二重特異性抗原結合タンパク質」の項で詳細に説明されるように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて会合および解離の速度を測定するなど、様々な既知の方法によって実験的に評価され得る。
「ＥＣ５０」とも称される「最大半量有効濃度」は、通常、指定された曝露時間後に、ベースラインと最大値の中間の応答を誘発する分子の濃度を指す。ＥＣ５０と親和性は反比例の関係にあり、ＥＣ５０値が低いほど、分子の親和性がより高くなる。一例では、「ＥＣ５０」は、指定された曝露時間後に、ベースラインと最大値の中間の反応を誘発する本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の濃度を指し、より具体的には、指定された曝露時間後に、ベースラインと最大値の中間の反応を誘発する本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の濃度を指す。ＥＣ５０値は、実施例２および５の実験の項でより詳細に記載されているように、例えば、ＩＦＮ－γ放出アッセイまたはＬＤＨ放出アッセイを用いて、様々な既知の方法によって、実験的に評価され得る。本発明の文脈におけるＥＣ５０値は、好ましくはＬＤＨ放出アッセイによって判定され、したがって、誘導された細胞傷害性を指す。
本明細書における「診断薬」は、（直接的または間接的に）シグナルを提供する、蛍光分子、放射性分子、または当該技術分野で公知の任意のその他の標識などの検出可能な分子または物質を指す。
当該技術分野で公知の「蛍光分子」としては、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、青色レーザーで使用するためのフルオロフォア（例えば、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ－Ｃｙ７、ＰＥ－Ｃｙ５、ＦＬ３およびＡＰＣまたはＣｙ５、ＦＬ４）、赤色、紫色、またはＵＶレーザーで使用するためのフルオロフォア（例えば、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ）が挙げられる。
「放射性分子」としては、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｔｃ９９などのシンチグラフィー研究用の放射性原子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の二重特異性結合タンパク質はまた、ヨウ素１２３、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などの、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られている）のためのスピン標識を含んでもよい。
このような診断薬は、二重特異性抗原結合タンパク質に直接結合（すなわち、物理的に結合）されるか、または間接的に結合されてもよい。
本明細書における「治療薬」は、治療効果を有する薬剤を指す。一実施形態では、このような治療薬は、細胞傷害剤または放射性同位体などの増殖阻害剤であってもよい。
無差別に使用され得る「増殖阻害剤」または「抗増殖剤」は、生体外または生体内のどちらかで、細胞、特に腫瘍細胞の増殖を阻害する化合物または組成物を指す。
「細胞傷害剤」という用語は、本明細書の用法では、細胞の機能を阻害しまたは妨げる、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。「細胞傷害剤」という用語は、化学療法剤、酵素、抗生物質、および細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素活性毒素などの毒素（それらの断片および／または変異型を含む）、ならびに以下に開示される様々な抗腫瘍剤または抗がん剤を含むことが意図される。いくつかの実施形態では、細胞傷害剤は、タキソイド、ビンカ、タキサン、メイタンシノイドまたはＤＭ１もしくはＤＭ４などのメイタンシノイド類似体、小型薬剤、トマイマイシンまたはピロロベンゾジアゼピン誘導体、クリプトフィシン誘導体、レプトマイシン誘導体、オーリスタチンまたはドラスタチン類似体、プロドラッグ、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、抗チューブリン剤、ＣＣ－１０６５またはＣＣ－１０６５類似体である。
「放射性同位体」という用語は、Ａｔ２１１、Ｂｉ２１２、Ｅｒ１６９、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｉｎ１１１、Ｐ３２、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｓｒ８９、およびＬｕの放射性同位体などのがん治療に適する放射性同位体を含むことが意図される。このような放射性同位元素は、一般的に主にβ線を放出する。一実施形態では、放射性同位体は、α放射性同位体、より正確には、α線を放出するトリウム２２７である。
本明細書における「ＰＫ修飾部分」は、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の薬物動態（ＰＫ）を修飾する部分を指す。したがって、この部分は、特に、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の生体内半減期および分布を改変する。好ましい実施形態では、ＰＫ修飾部分は、二重特異性抗原結合タンパク質の半減期を延長する。ＰＫ修飾部分の例としては、ＰＥＧ（Ｄｏｚｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．Ｏｃｔ ２８；１６（１０）：２５８３１－６４、およびＪｅｖｓｅｖａｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．Ｊａｎ；５（１）：１１３－２８）、Ｐａｓ化（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．Ａｕｇ；２６（８）：４８９－５０１）、アルブミン（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｅｐ ２０；２７７（３８）：３５０３５－４３）、抗体および／または非構造化ポリペプチドのＦｃ部分（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｄｅｃ；２７（１２）：１１８６－９０）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
二重特異性抗原結合タンパク質
本発明の発明者らは、実施例１で開示されるように、マウスモノクローナル抗体抗ＣＤ３抗体ＵＣＨＴ１をヒト化して、ヒト化モノクローナル抗体ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）を得た。結果として得られたヒト化モノクローナル抗体ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）は、当該技術分野で既知のＵＣＨＴ１（Ｖ９）と比較して、安定性が向上し、および／または溶解性が向上している。
次に、本発明者らは、成熟ＴＣＲ可変ドメインと組み合わせて、その標的に対して中程度の親和性を有するＴ細胞動員抗体（ＴＣＲαβを標的とするＢＭＡ３１など）の可変ドメインを使用した場合、結果として得られた二重特異性抗原結合タンパク質は、同じＴＣＲ可変ドメインに関連して高親和性抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）など）を使用する抗原結合タンパク質よりも、はるかにより広い安全域を有することを原理実証実験において実施例２で実証した。
さらに、これらの新規抗原結合タンパク質は、特にＴＣＥＲ（登録商標）分子の形態で、腫瘍細胞に対する高い細胞傷害性を示す。例えば、ＴＣＥＲ（登録商標）分子の形態にある新規抗原結合タンパク質では、ＮＣＩ－Ｈ１７５５、Ｈｓ６９５Ｔ細胞、およびＵ２ＯＳに対する最大半量有効濃度（ＥＣ５０）は、細胞に対して１ｐＭ～１００ｐＭの範囲、より具体的には、１ｐＭ～２０ｐＭの間であり、したがって、本発明の抗原結合タンパク質の罹患細胞に対するＥＣ５０は、腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔ対初代細胞などのように、正常組織細胞で得られたＥＣ５０と比較して１０００倍を超えて低く、高い安全性が実証されている。
したがって、本発明者らは、高親和性抗ＣＤ３抗体ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）の中程度の親和性変異型（Ｖ２０、Ｖ２１、Ｖ２３、Ｖ１７ｏｐｔ、Ｖ２０ｏｐｔ、Ｖ２１ｏｐｔ、およびＶ２３ｏｐｔ）を作製し、ひいては、ＴＣＲ可変ドメインと組み合わせて使用するのに適したさ様々なＴ細胞動員可変ドメインを作製し、有益な安全域がある二重特異性抗体を得る。
したがって、本発明は、少なくとも２つの抗原結合部位（ＡおよびＢ）を含んでなる二重特異性抗原結合タンパク質に言及し、その中では、抗原結合部位Ａは、ＣＤ３、好ましくはｔＣＤ３ε／δ－複合体に結合し、その中では、抗原結合部位Ｂは、標的抗原性（ＴＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体、好ましくはＴＡＡ抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合し、その中では、抗原結合部位Ａは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなり、
ａ）式中、前記ＶＬは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり、式中、
－ＣＤＲＬ１は、配列番号１のアミノ酸配列「ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ」を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲＬ２は、配列番号２のアミノ酸配列「ＹＴＳＲＬＨＳ」を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲＬ３は、配列番号３のアミノ酸配列「ＱＱＧＱＴＬＰＷＴ」を含んでなるかまたはそれからなり、
ｂ）式中、前記ＶＨは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり、式中、
－ＣＤＲＨ１は、配列番号４のアミノ酸配列「Ｘ１ＹＴＭＮ」を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１は、ＧまたはＥ、好ましくはＧであり、
－ＣＤＲＨ２は、配列番号５の「ＬＩＮＰＸ２Ｘ３ＧＶＸ４ＴＹＡＱＫＸ５ＱＸ６」のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ２は、任意のアミノ酸、好ましくはＱ、ＹまたはＥ、より好ましくはＱなどＱまたはＹであり、Ｘ３は、任意のアミノ酸、好ましくはＲ、ＫまたはＥ、より好ましくはＫなどＲまたはＫであり、Ｘ４は任意のアミノ酸、好ましくはＳまたはＴ、より好ましくはＳであり、Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＦまたはＶ、より好ましくはＦであり、Ｘ６は、任意のアミノ酸、好ましくはＧまたはＤ、より好ましくはＤであり、
－ＣＤＲＨ３は、配列番号６のアミノ酸配列「ＳＧＹＹＧＸ７ＳＷＹＦＤ」を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ７は、任意のアミノ酸、好ましくはＥまたはＤ、より好ましくはＤである。
一実施形態では、ＣＤＲＨ２が、配列番号７のアミノ酸配列「ＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＡＱＫＦＱＤ」を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲＨ３が、配列番号８のアミノ酸配列「ＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶ」を含んでなるかまたはそれからなる場合、ＣＤＲＨ１のＸ１はＥである。
一実施形態では、前記ＶＨは、配列番号４に記載のＣＤＲＨ１、配列番号５に記載のＣＤＲＨ２、および配列番号７に記載のＣＤＲＨ３を含んでなるが、ただしＣＤＲＨ１は配列番号１３３を含まずまたはそれから構成されず、ＣＤＲＨ２は配列番号７を含まずまたはそれから構成されず、ＣＤＲＨ３は配列番号８を含まずまたはそれから構成されない。
特定の一実施形態では、本発明は、少なくとも２つの抗原結合部位（ＡおよびＢ）を含んでなる二重特異性抗原結合タンパク質に言及し、その中では、抗原結合部位Ａは、ＣＤ３、好ましくはｔＣＤ３ε／δ－複合体に結合し、その中では、抗原結合部位Ｂは、標的抗原性（ＴＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体、好ましくはＴＡＡ抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合し、その中では、抗原結合部位Ａは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなり、
ａ）式中、前記ＶＬは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり、式中、
－ＣＤＲＬ１は、配列番号１のアミノ酸配列「ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ」を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲＬ２は、配列番号２のアミノ酸配列「ＹＴＳＲＬＨＳ」を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲＬ３は、配列番号３のアミノ酸配列「ＱＱＧＱＴＬＰＷＴ」を含んでなるかまたはそれからなり、
ｂ）式中、前記ＶＨは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり、式中、
－ＣＤＲＨ１は、配列番号１３３の「ＧＹＴＭＮ」または配列番号１３４の「ＥＹＴＭＮ」、好ましくは配列番号１３３のＧＹＴＭＮのアミノ酸配列、または任意選択的に、少なくとも１つのアミノ酸置換によって、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換、または１つのみのアミノ酸置換によって、配列番号１３３または１３４とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは配列番号１３３または１３４とは異なるアミノ酸配列は、３１Ｇまたは３１Ｅを含んでなり、
－ＣＤＲＨ２は、配列番号１３５～１４２のアミノ酸配列、または任意選択的に、少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは１、２、３または４つのアミノ酸置換によって、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換、または１つのみのアミノ酸置換によって、配列番号１３３または１３４とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは配列番号１３３または１３４とは異なるアミノ酸配列は、アミノ酸６１Ａと、任意選択的に、５４Ｑ、５４Ｅまたは５４Ｙ、５５Ｒまたは５５Ｅ、５８Ｓまたは５８Ｔ、６４Ｆまたは６４Ｖ、６５Ｑ、６６Ｄまたは６６Ｇ、好ましくは６６Ｄの少なくとも１つのアミノ酸を含んでなり、
－ＣＤＲＨ３は、配列番号８または１４４のアミノ酸配列、または任意選択的に、少なくとも１つのアミノ酸置換によって、好ましくは１、２、３または４つのアミノ酸置換によって、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換、または１つのみのアミノ酸置換によって、配列番号８または１４４とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは配列番号８または１３４とは異なるアミノ酸配列は、アミノ酸１０４Ｅを含んでなる。
本発明は、本発明の文脈で開示されるＣＤＲアミノ酸配列の変異型、典型的には、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２および／またはＣＤＲＨ３の変異型を含んでなる抗原結合タンパク質にさらに言及し、このような変異型は、少なくとも１つの、４、３、２または１つなど、好ましくは１、２または３つのアミノ酸置換を含んでもよく、その中では、アミノ酸の好ましい置換数は、好ましくはそれぞれのＣＤＲの長さに依存する。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１は、少なくとも１つのアミノ酸置換によって、好ましくは１、２、３または４つのアミノ酸置換によって、好ましくは１、２または３つのアミノ酸置換によって、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換によって、本明細書で開示されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、前記アミノ酸置換は、好ましくは２７、２８、３０、および３１位にある。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ２は、少なくとも１つのアミノ酸置換によって、好ましくは１、２または３つのアミノ酸置換によって、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換によって、本明細書で開示されるＣＤＲＬ２アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、前記アミノ酸置換は、好ましくは５１、５２、および５３位にある。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ３は、少なくとも１つのアミノ酸置換によって、好ましくは１、２、３または４つのアミノ酸置換によって、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換によって、本明細書で開示されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、前記アミノ酸置換は、好ましくはアミノ酸９３、９４、および９５位のいずれかにある。
好ましい実施形態では、抗原結合部位Ａの重鎖可変ドメインのＣＤＲに変異が生じてもよい。
したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１は、少なくとも１つのアミノ酸置換によって、好ましくは１または２または３つのアミノ酸置換によって、好ましくは１つのアミノ酸置換によって、本明細書で開示されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは前記アミノ酸置換は、アミノ酸３１～３５位のいずれかにある。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ２は、少なくとも１つのアミノ酸置換によって、好ましくは１、２、３または４つのアミノ酸置換によって、好ましくは１、２または３つのアミノ酸置換、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換によって、本明細書で開示されるＣＤＲＨ２アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、前記アミノ酸置換は、好ましくはアミノ酸５４、５５、および５７～５９位のいずれかにある。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３は、少なくとも１つのアミノ酸置換によって、好ましくは１、２、３または４つのアミノ酸置換によって、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換によって、本明細書で開示されるＣＤＲＨ３アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、前記アミノ酸置換は、好ましくはアミノ酸１０５、１０７、および１１０位のいずれかにある。
好ましい実施形態では、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖フレームワーク領域をさらに含んでなる。
一実施形態では、前記軽鎖可変ドメインは、ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、およびＦＲ４－Ｌからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくはＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－ＬおよびＦＲ４－Ｌをさらに含んでなり、その中では、
－ＦＲ１－Ｌは、配列番号１１の「ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ」のアミノ酸配列、または配列番号１１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸６Ｑおよび／または２３Ｃを含んでなり、
－ＦＲ２－Ｌは、配列番号１２の「ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ」、または配列番号１３の「ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩ」、好ましくは配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２または１３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１２または１３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸３５Ｗ、３６Ｙ、３８Ｑ、４４Ｐ、４６Ｌおよび／または４９Ｙを含んでなり、
－ＦＲ３－Ｌは、配列番号１４の「ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣ」のアミノ酸配列、または配列番号１４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸５７Ｇ、５９Ｐ、６２Ｆ、６４Ｇ、６６Ｇ、７１Ｙ、８２Ｄ、８６Ｙ、８７Ｆ、８８Ｃを含んでなり、
－ＦＲ４－Ｌは、配列番号１５の「ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ」のアミノ酸配列、または配列番号１５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸９８Ｆおよび／または１０１Ｇを含んでなり、
式中、ＶＨは、ＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、およびＦＲ４－Ｈからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域をさらに含んでなり、式中、
－ＦＲ１－Ｈは、配列番号１６の「ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴ」のアミノ酸配列、または配列番号１６と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１６と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸６Ｑ、１４Ｐ、２２Ｃ、２４Ａ、２６Ｇ、２７Ｙ、２８Ｓ、２９Ｆおよび／または３０Ｔを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ｑ５Ｖ、Ｐ９Ａ、Ｌ１１Ｖ、Ｖ１２Ｋ、Ｍ１８Ｖおよび／またはＩ２０Ｖの少なくとも１つを含んでなり、
－ＦＲ２－Ｈは、配列番号１７の「ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ」のアミノ酸配列、または配列番号１７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは３６Ｗ、３７Ｖ、３９Ｑ、４５Ｌ、４６Ｅおよび／または４７Ｗを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ｋ３８Ｒ、Ｓ４０Ａ、Ｈ４１Ｐ、Ｋ４３Ｑ、Ｎ４４Ｇの少なくとも１つを含んでなり、
－ＦＲ３－Ｈは、配列番号１８の「ＲＶＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ」のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１８と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは７０Ｌ、７２Ｖ、７９Ａ、９０Ｄ、９４Ｙ、９５Ｙ、９６Ｃ、９７Ａ、および／または９８Ｒを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ｋ６７Ｒ、Ａ６８Ｖ、Ｋ７４Ｔ、Ｓ７６Ｔ、Ｌ８４Ｓ、Ｔ８７Ｒおよび／またはＳ９１Ｔの少なくとも１つを含んでなり、
－ＦＲ４－Ｈは、配列番号１９の「ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ」のアミノ酸配列、または配列番号１９と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１９と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは１１２Ｗ、１１３Ｇ、１１５Ｇを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ａ１１４Ｑおよび／またはＴ１１７Ｌの少なくとも１つを含んでなる。
別の実施形態では、前記軽鎖可変ドメインは、ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、およびＦＲ４－Ｌからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくはＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－ＬおよびＦＲ４－Ｌをさらに含んでなり、その中では、
－ＦＲ１－Ｌは、配列番号１１の「ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ」のアミノ酸配列、または配列番号１１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸６Ｑおよび／または２３Ｃを含んでなり、
－ＦＲ２－Ｌは、配列番号１２の「ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ」、または配列番号１３の「ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩ」、好ましくは配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２または１３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１２または１３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸３５Ｗ、３６Ｙ、３８Ｑ、４４Ｐ、４６Ｌおよび／または４９Ｙを含んでなり、
－ＦＲ３－Ｌは、配列番号１４の「ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣ」のアミノ酸配列、または配列番号１４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸５７Ｇ、５９Ｐ、６２Ｆ、６４Ｇ、６６Ｇ、７１Ｙ、８２Ｄ、８６Ｙ、８７Ｆ、８８Ｃを含んでなり、
－ＦＲ４－Ｌは、配列番号２８５の「ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ」のアミノ酸配列、または配列番号１５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸９８Ｆおよび／または１０１Ｇを含んでなり、
式中、ＶＨは、ＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、およびＦＲ４－Ｈからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域をさらに含んでなり、式中、
－ＦＲ１－Ｈは、配列番号１６の「ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴ」のアミノ酸配列、または配列番号１６と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１６と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸６Ｑ、１４Ｐ、２２Ｃ、２４Ａ、２６Ｇ、２７Ｙ、２８Ｓ、２９Ｆおよび／または３０Ｔを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ｑ５Ｖ、Ｐ９Ａ、Ｌ１１Ｖ、Ｖ１２Ｋ、Ｍ１８Ｖおよび／またはＩ２０Ｖの少なくとも１つを含んでなり、
－ＦＲ２－Ｈは、配列番号１７の「ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ」のアミノ酸配列、または配列番号１７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは３６Ｗ、３７Ｖ、３９Ｑ、４５Ｌ、４６Ｅおよび／または４７Ｗを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ｋ３８Ｒ、Ｓ４０Ａ、Ｈ４１Ｐ、Ｋ４３Ｑ、Ｎ４４Ｇの少なくとも１つを含んでなり、
－ＦＲ３－Ｈは、配列番号１８の「ＲＶＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ」のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１８と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは７０Ｌ、７２Ｖ、７９Ａ、９０Ｄ、９４Ｙ、９５Ｙ、９６Ｃ、９７Ａ、および／または９８Ｒを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ｋ６７Ｒ、Ａ６８Ｖ、Ｋ７４Ｔ、Ｓ７６Ｔ、Ｌ８４Ｓ、Ｔ８７Ｒおよび／またはＳ９１Ｔの少なくとも１つを含んでなり、
－ＦＲ４－Ｈは、配列番号１９の「ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ」のアミノ酸配列、または配列番号１９と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１９と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは１１２Ｗ、１１３Ｇ、１１５Ｇを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ａ１１４Ｑおよび／またはＴ１１７Ｌの少なくとも１つを含んでなる。
別の実施形態では、前記軽鎖可変ドメインは、ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、およびＦＲ４－Ｌからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくはＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－ＬおよびＦＲ４－Ｌをさらに含んでなり、その中では、
－ＦＲ１－Ｌは、配列番号１１の「ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ」のアミノ酸配列、または配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸６Ｑおよび／または２３Ｃを含んでなり、
－ＦＲ２－Ｌは、配列番号１２の「ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ」、または配列番号１３の「ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩ」、好ましくは配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２または１３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１２または１３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸３５Ｗ、３６Ｙ、３８Ｑ、４４Ｐ、４６Ｌおよび／または４９Ｙを含んでなり、
－ＦＲ３－Ｌは、配列番号１４の「ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣ」のアミノ酸配列、または配列番号１４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸５７Ｇ、５９Ｐ、６２Ｆ、６４Ｇ、６６Ｇ、７１Ｙ、８２Ｄ、８６Ｙ、８７Ｆ、８８Ｃを含んでなり、
－ＦＲ４－Ｌは、配列番号２８５の「ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ」のアミノ酸配列、または配列番号１５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸９８Ｆおよび／または１０１Ｇを含んでなり、
式中、ＶＨは、ＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、およびＦＲ４－Ｈからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域をさらに含んでなり、式中、
－ＦＲ１－Ｈは、配列番号１６の「ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴ」のアミノ酸配列、または配列番号１６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸６Ｑ、１４Ｐ、２２Ｃ、２４Ａ、２６Ｇ、２７Ｙ、２８Ｓ、２９Ｆおよび／または３０Ｔを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ｑ５Ｖ、Ｐ９Ａ、Ｌ１１Ｖ、Ｖ１２Ｋ、Ｍ１８Ｖおよび／またはＩ２０Ｖの少なくとも１つを含んでなり、
－ＦＲ２－Ｈは、配列番号１７の「ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ」のアミノ酸配列、または配列番号１７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは３６Ｗ、３７Ｖ、３９Ｑ、４５Ｌ、４６Ｅおよび／または４７Ｗを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ｋ３８Ｒ、Ｓ４０Ａ、Ｈ４１Ｐ、Ｋ４３Ｑ、Ｎ４４Ｇの少なくとも１つを含んでなり、
－ＦＲ３－Ｈは、配列番号１８の「ＲＶＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ」のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは７０Ｌ、７２Ｖ、７９Ａ、９０Ｄ、９４Ｙ、９５Ｙ、９６Ｃ、９７Ａ、および／または９８Ｒを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ｋ６７Ｒ、Ａ６８Ｖ、Ｋ７４Ｔ、Ｓ７６Ｔ、Ｌ８４Ｓ、Ｔ８７Ｒおよび／またはＳ９１Ｔの少なくとも１つを含んでなり、
－ＦＲ４－Ｈは、配列番号１９の「ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ」のアミノ酸配列、または配列番号１９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは１１２Ｗ、１１３Ｇ、１１５Ｇを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ａ１１４Ｑおよび／またはＴ１１７Ｌの少なくとも１つを含んでなる。
別の実施形態では、前記軽鎖可変ドメインは、ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、およびＦＲ４－Ｌからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくはＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－ＬおよびＦＲ４－Ｌをさらに含んでなり、その中では、
－ＦＲ１－Ｌは、配列番号１１の「ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ」のアミノ酸配列、または配列番号１１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸６Ｑおよび／または２３Ｃを含んでなり、
－ＦＲ２－Ｌは、配列番号１２の「ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ」、または配列番号１３の「ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩ」、好ましくは配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２または１３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１２または１３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸３５Ｗ、３６Ｙ、３８Ｑ、４４Ｐ、４６Ｌおよび／または４９Ｙを含んでなり、
－ＦＲ３－Ｌは、配列番号１４の「ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣ」のアミノ酸配列、または配列番号１４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸５７Ｇ、５９Ｐ、６２Ｆ、６４Ｇ、６６Ｇ、７１Ｙ、８２Ｄ、８６Ｙ、８７Ｆ、８８Ｃを含んでなり、
－ＦＲ４－Ｌは、配列番号２８５の「ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ」のアミノ酸配列、または配列番号１５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸９８Ｆおよび／または１０１Ｇを含んでなり、
式中、ＶＨは、ＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、およびＦＲ４－Ｈからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域をさらに含んでなり、式中、
－ＦＲ１－Ｈは、配列番号１６の「ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴ」のアミノ酸配列、または配列番号１６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸６Ｑ、１４Ｐ、２２Ｃ、２４Ａ、２６Ｇ、２７Ｙ、２８Ｓ、２９Ｆおよび／または３０Ｔを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ｑ５Ｖ、Ｐ９Ａ、Ｌ１１Ｖ、Ｖ１２Ｋ、Ｍ１８Ｖおよび／またはＩ２０Ｖの少なくとも１つを含んでなり、
－ＦＲ２－Ｈは、配列番号１７の「ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ」のアミノ酸配列、または配列番号１７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは３６Ｗ、３７Ｖ、３９Ｑ、４５Ｌ、４６Ｅおよび／または４７Ｗを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ｋ３８Ｒ、Ｓ４０Ａ、Ｈ４１Ｐ、Ｋ４３Ｑ、Ｎ４４Ｇの少なくとも１つを含んでなり、
－ＦＲ３－Ｈは、配列番号１８の「ＲＶＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ」のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは７０Ｌ、７２Ｖ、７９Ａ、９０Ｄ、９４Ｙ、９５Ｙ、９６Ｃ、９７Ａ、および／または９８Ｒを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ｋ６７Ｒ、Ａ６８Ｖ、Ｋ７４Ｔ、Ｓ７６Ｔ、Ｌ８４Ｓ、Ｔ８７Ｒおよび／またはＳ９１Ｔの少なくとも１つを含んでなり、
－ＦＲ４－Ｈは、配列番号１９の「ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ」のアミノ酸配列、または配列番号１９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは１１２Ｗ、１１３Ｇ、１１５Ｇを含んでなり、任意選択的に、アミノ酸置換Ａ１１４Ｑおよび／またはＴ１１７Ｌの少なくとも１つを含んでなる。
ＦＲ２－Ｌのアミノ酸３５Ｗ、３６Ｙ、４６Ｌ、および４９Ｙ、およびＦＲ３－Ｌのアミノ酸６４Ｇ、７１Ｙは、本発明者らによってバーニアゾーンに位置することが同定され、好ましくは置換されていない。
ＦＲ－１Ｈのアミノ酸２７Ｙ、２８Ｓ、２９Ｆ、および３０Ｔ、ＦＲ２－Ｈのアミノ酸４７Ｗ、ＦＲ３－Ｈのアミノ酸７０Ｌ、７２Ｖ、７９Ａ、９７Ａ、および９８Ｒ、およびＦＲ４－Ｈの１１２Ｗは、本発明者らによってバーニアゾーンに位置することが同定され、好ましくは置換されていない。
本明細書に記載の抗原結合タンパク質の変異型が想定され、本明細書で上に「定義」の項で定義される「参照配列と少なくとも８５％同一である」という表現を用いて、明示的に言及される。例えば、配列ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、およびＦＲ４－Ｌ、ならびにＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、およびＦＲ４－Ｈは、必要に応じて、少なくとも１つのアミノ酸置換、特に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または標準的な残基による置換によって、配列番号１１～配列番号１９の参照配列と異なってもよい。特に，軽鎖および重鎖可変ドメインの配列ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、およびＦＲ４－Ｌ、ならびにＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、およびＦＲ４－Ｈは、保存的アミノ酸置換のみによって、配列番号１１～配列番号１９の参照配列と異なってもよい。
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のアミノ酸配列、および対応するＤＮＡ配列にそれぞれ修飾および変更が加えられてもよく、それでもなお、望ましい特性を有する機能的抗原結合タンパク質またはポリペプチドが帰結する。修飾は、抗原結合部位Ａの重鎖および軽鎖可変ドメイン、または抗原結合部位Ｂのαおよびβ、またはγおよびδ可変ドメインで、特にフレームワーク領域で、または各ＣＤＲで、または抗原結合部位Ａの重鎖および軽鎖可変ドメインに含まれる全てのＣＤＲで、またはフレームワーク領域で、または各ＣＤＲで、またはαおよびβ、またはγおよびδ可変ドメインに含まれる全てのＣＤＲで、なされてもよい。
二重特異性抗原結合タンパク質は、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでもよく、その中では、このＦＲ２－Ｌのアミノ酸配列は、配列番号１２または１３と少なくとも８５％同一であり、アミノ酸４４Ｐを含んでなる。このアミノ酸４４Ｐ（ヒト生殖細胞系配列Ｖｋ１－０１８に見られる）は、１０個の最も類似したヒト生殖細胞系のこの位置でプロリンが一般的であることから、ヒト化可変ドメインを脱免疫化するという利点を有する。
本明細書における「脱免疫化」は、免疫原性、すなわち対象における免疫応答を誘導する能力の低下を指す。これは、ヒトの生殖細胞系で最も一般的であることから、免疫系に異物として認識されないアミノ酸で、アミノ酸を置換することによって実施される。
したがって、一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質における抗原結合部位Ａは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびａ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、
その中では、前記ＶＬは、配列番号１４５のアミノ酸配列、または配列番号１４５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号１４５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、好ましくは配列番号１のＣＤＲＬ１、配列番号２のＣＤＲＬ２、および配列番号３のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、前記ＶＨは、配列番号１４９～配列番号１６０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１４９～配列番号１６０のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号１４９のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、または配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号１４０のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号１４１のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号１４２のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号１４２のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号７のＣＤＲＨ２、および配列番号１４４のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５７のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、および配列番号１４４のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５８のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号７のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５９のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号７のＣＤＲＨ２、および配列番号１４４のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１６０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、配列番号１４４のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなる。
したがって、一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質における抗原結合部位Ａは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびａ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、
その中では、前記ＶＬは、配列番号２８６のアミノ酸配列、または配列番号２８６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号２８６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、好ましくは配列番号１のＣＤＲＬ１、配列番号２のＣＤＲＬ２、および配列番号３のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、前記ＶＨは、配列番号１４９～配列番号１６０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１４９～配列番号１６０のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号１４９のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、または配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号１４０のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号１４１のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号１４２のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号１４２のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号７のＣＤＲＨ２、および配列番号１４４のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５７のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、および配列番号１４４のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５８のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号７のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１５９のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号７のＣＤＲＨ２、および配列番号１４４のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、好ましくは、配列番号１６０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、配列番号１４４のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなる。
好ましい一実施形態では、前記ＶＬは、配列番号２８６のアミノ酸配列、または配列番号２８６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号２８６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、好ましくは配列番号１のＣＤＲＬ１、配列番号２のＣＤＲＬ２、および配列番号３のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、前記ＶＨは、配列番号１５６のアミノ酸配列、または配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１５６のアミノ酸配列を含んでなり、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号７のＣＤＲＨ２、およびｆ配列番号１４４のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、前記ＶＨは、配列番号１４９のアミノ酸配列、または配列番号１４９のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号１４９のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、前記ＶＨは、配列番号１５１のアミノ酸配列、または配列番号１５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号１５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなる。
好ましい一実施形態では、前記ＶＬは、配列番号２８６のアミノ酸配列、または配列番号２８６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号２８６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である前記アミノ酸配列は、好ましくは配列番号１のＣＤＲＬ１、配列番号２のＣＤＲＬ２、および配列番号３のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、前記ＶＨは、配列番号１５６のアミノ酸配列、または配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１５６のアミノ酸配列を含んでなり、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号７のＣＤＲＨ２、およびｆ配列番号１４４のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、前記ＶＨは、配列番号１４９のアミノ酸配列、または配列番号１４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号１４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、前記ＶＨは、配列番号１５１のアミノ酸配列、または配列番号１５１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号１５１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなる。
好ましい一実施形態では、前記ＶＬは、配列番号２８６のアミノ酸配列、または配列番号２８６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、配列番号２８６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、好ましくは配列番号１のＣＤＲＬ１、配列番号２のＣＤＲＬ２、および配列番号３のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、前記ＶＨは、配列番号１５６のアミノ酸配列、または配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１５６のアミノ酸配列を含んでなり、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号７のＣＤＲＨ２、およびｆ配列番号１４４のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、前記ＶＨは、配列番号１４９のアミノ酸配列、または配列番号１４９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号１４９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３３のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、および配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなり、
その中では、前記ＶＨは、配列番号１５１のアミノ酸配列、または配列番号１５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号１５１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号１３４のＣＤＲＨ１、配列番号１３８のＣＤＲＨ２、配列番号８のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含んでなる。
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗原結合部位Ｂは、抗体またはその断片、またはα鎖可変ドメイン（ｖα）およびβ鎖可変ドメイン（ｖβ）またはγ鎖可変ドメイン（ｖγ）またはδ鎖可変ドメイン（ｖδ）を含んでなるかまたはそれからなる。抗体およびそれらの断片は、本明細書で上に「定義」の項で定義される通りである。
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗原結合部位Ｂは、α鎖可変ドメイン（ｖα）およびβ鎖可変ドメイン（ｖβ）またはγ鎖可変ドメイン（ｖγ）またはδ鎖可変ドメイン（ｖδ）、好ましくはｖαおよびｖβドメインを含んでなる。それらが結合する特定のＴＡの文脈において、本発明の文脈で使用されるかもしれない、α鎖可変ドメイン（ｖα）およびβ鎖可変ドメイン（ｖβ）またはγ鎖可変ドメイン（ｖγ）またはδ鎖可変ドメイン（ｖδ）は、例えば、国際公開第２０１８１７２５３３号パンフレット、国際公開第２０１８０３３２９１号パンフレット、国際公開第２０１７１５８１０３号パンフレット、国際公開第２０１８１０４４３８号パンフレット、国際公開第２０１８１０４４７８号パンフレット、国際公開第２０１９００２４４４号パンフレット、国際公開第２０１７１５８１１６号パンフレットに詳細に記載されている。
したがって、一実施形態では、ｖαとｖβまたはｖγとｖδは、国際公開第２０１８１７２５３３号パンフレット、国際公開第２０１８０３３２９１号パンフレット、国際公開第２０１７１５８１０３号パンフレット、国際公開第２０１８１０４４３８号パンフレット、国際公開第２０１８１０４４７８号パンフレット、国際公開第２０１９００２４４４号パンフレット、国際公開第２０１７１５８１１６号パンフレットで開示されるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれから構成され、引用される先行技術に記載されているｖαとｖβまたはｖγとｖδは、引用したものと同じ特許出願に開示されているＴＡペプチド、特にＴＡＡペプチドと結合する。
一実施形態では、二本発明の重特異性抗原結合タンパク質は、ｖαとｖβドメインまたはｖγとｖδドメインを含んでなり、その中では、
ｉ）ｖαまたはｖγは、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＳＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号２０、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＱＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号２１、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＥＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＱＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２０、２１、および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくはアミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であり、好ましくは配列番号２３のＣＤＲａ１、配列番号２４のＣＤＲａ２、および配列番号２５のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、その中では、好ましくはアミノ酸配列は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であり、好ましくは配列番号２３のＣＤＲａ１、配列番号２６のＣＤＲａ２、および配列番号２５のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、その中では、好ましくはアミノ酸配列は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であり、好ましくは配列番号２７のＣＤＲａ１、配列番号２６のＣＤＲａ２、および配列番号２５のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、前記第１の可変ドメインのアミノ酸は、好ましくはアミノ酸１９Ｖおよび／または４８Ｋを含んでなり、
ｖβまたはｖδは、アミノ酸配列’ＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩＰＧＨＤＹＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＦＹＦＣＹＧＴＰＣＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦＣＡＳＲＡＤＴＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬ」配列番号３０、または配列番号３０からなるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはそれぞれ、配列番号３１のＣＤＲｂ１のアミノ酸配列、配列番号３４のＣＤＲｂ２、配列番号３５のＣＤＲｂ３を含んでなり、任意選択的にアミノ酸５４Ｆおよび／または６６Ｃを含んでなり、または
（ｉｉ）ｖαまたはｖγは、配列番号４８のアミノ酸配列、または配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、配列番号４９のＣＤＲａ１、配列番号５０のＣＤＲａ２、および配列番号５１のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、
ｖβまたはｖδは、配列番号４４のアミノ酸配列、または配列番号４４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号４５のＣＤＲｂ１、配列番号４６のＣＤＲｂ２、および配列番号４７のＣＤＲｂ３のアミノ酸配列を含んでなる。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質の文脈で本明細書に定義される第１の可変ドメインおよび第２の可変ドメインは、ＩＭＧＴ番号付けによる４４位のアミノ酸置換を含んでもよい。好ましい実施形態では、対合を改善するために、４４位の前記アミノ酸が別の適切なアミノ酸で置換される。好ましくは前記抗原結合タンパク質がＴＣＲである特定の実施形態では、前記アミノ酸置換は、例えば鎖の対形成（すなわち、αとβ鎖の対形成またはγとδの対形成）を改善する。好ましい実施形態では、第１の可変ドメイン（ｖ１４４）中の４４位に存在するアミノ酸の片方または双方、および第２の可変ドメイン（ｖ２４４）中の４４位に存在するアミノ酸は、ｖ１４４Ｄ／ｖ２４４Ｒ、ｖ１４４Ｒ／ｖ２４４Ｄ、ｖ１４４Ｅ／ｖ２４４Ｋ、ｖ１４４Ｋ／ｖ２４４Ｅ、ｖ１４４Ｄ／ｖ２４４Ｋ、ｖ１４４Ｋ／ｖ２４４Ｄ、ｖ１４４Ｒ／ｖ２４４Ｅ；ｖ１４４Ｅ／ｖ２４４Ｒ、ｖ１４４Ｌ／ｖ２４４Ｗ、ｖ１４４Ｗ／ｖ２４４Ｌ、ｖ１４４Ｖ／ｖ２４４Ｗ、ｖ１４４Ｗ／ｖ２４４Ｖからなるアミノ酸対の群から選択されるアミノ酸対ｖ１４４／ｖ２４４に置換される。
したがって、さらなる実施形態では、抗原結合タンパク質は、ｖ１Ｑ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｑ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｑ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｑ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｑ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｑ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｑ４４Ｌ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；ｖ１Ｑ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｌ；ｖ１Ｑ４４Ｖ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；およびｖ１Ｑ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｖ；ｖ１Ｗ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｗ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｗ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｗ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｗ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｗ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｗ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｗ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｗ４４Ｌ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；ｖ１Ｗ４４／ｖ２Ｑ４４Ｌ；ｖ１Ｗ４４Ｖ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；およびｖ１Ｗ４４／ｖ２Ｑ４４Ｖ；ｖ１Ｈ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｈ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｈ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｈ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｈ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｈ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｈ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｈ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｈ４４Ｌ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；ｖ１Ｈ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｌ；ｖ１Ｈ４４Ｖ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；およびｖ１Ｈ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｖ；ｖ１Ｋ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｋ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｋ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｋ４４／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｋ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｋ４４／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｋ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｋ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｋ４４Ｌ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；ｖ１Ｋ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｌ；ｖ１Ｋ４４Ｖ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；およびｖ１Ｋ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｖ；ｖ１Ｅ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｅ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｅ４４／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｅ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｅ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｅ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｅ４４／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｅ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｅ４４Ｌ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；ｖ１Ｅ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｌ；ｖ１Ｅ４４Ｖ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；およびｖ１Ｅ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｖ；ｖ１Ｑ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｑ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｑ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｑ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｑ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｑ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｑ４４Ｌ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；ｖ１Ｑ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｌ；ｖ１Ｑ４４Ｖ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；およびｖ１Ｑ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｖ；ｖ１Ｗ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｗ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｗ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｗ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｗ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｗ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｗ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｗ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｗ４４Ｌ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；ｖ１Ｗ４４／ｖ２Ｒ４４Ｌ；ｖ１Ｗ４４Ｖ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；およびｖ１Ｗ４４／ｖ２Ｒ４４Ｖ；ｖ１Ｈ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｈ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｈ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｈ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｈ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｈ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｈ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｈ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｈ４４Ｌ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；ｖ１Ｈ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｌ；ｖ１Ｈ４４Ｖ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；およびｖ１Ｈ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｖ；ｖ１Ｋ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｋ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｋ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｋ４４／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｋ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｋ４４／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｋ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｋ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｋ４４Ｌ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；ｖ１Ｋ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｌ；ｖ１Ｋ４４Ｖ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；およびｖ１Ｋ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｖ；ｖ１Ｅ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｅ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｅ４４／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｅ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｅ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｅ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｅ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｅ４４Ｌ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；ｖ１Ｅ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｌ；ｖ１Ｅ４４Ｖ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；およびｖ１Ｅ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｖ；ｖ１Ｑ４４Ｄ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｑ４４Ｅ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｑ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｑ４４Ｄ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｑ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｑ４４Ｅ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｑ４４Ｌ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；ｖ１Ｑ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｌ；ｖ１Ｑ４４Ｖ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；およびｖ１Ｑ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｖ；ｖ１Ｗ４４Ｄ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｗ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｗ４４Ｅ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｗ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｗ４４Ｄ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｗ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｗ４４Ｅ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｗ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｗ４４Ｌ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；ｖ１Ｗ４４／ｖ２Ｋ４４Ｌ；ｖ１Ｗ４４Ｖ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；およびｖ１Ｗ４４／ｖ２Ｋ４４Ｖ；ｖ１Ｈ４４Ｄ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｈ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｈ４４Ｅ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｈ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｈ４４Ｄ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｈ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｈ４４Ｅ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｈ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｈ４４Ｌ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；ｖ１Ｈ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｌ；ｖ１Ｈ４４Ｖ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；およびｖ１Ｈ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｖ；ｖ１Ｋ４４Ｄ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｋ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｋ４４Ｅ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｋ４４／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｋ４４Ｄ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｋ４４／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｋ４４Ｅ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｋ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｋ４４Ｌ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；ｖ１Ｋ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｌ；ｖ１Ｋ４４Ｖ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；およびｖ１Ｋ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｖ；ｖ１Ｅ４４Ｄ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｅ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｅ４４／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｅ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｅ４４Ｄ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｅ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｅ４４／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｅ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｅ４４Ｌ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；ｖ１Ｅ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｌ；ｖ１Ｅ４４Ｖ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；およびｖ１Ｅ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｖからなる群から選択される、好ましい置換対（ｖ１４４／ｖ２４４）の１つをさらに含んでもよい。
上記において、例えば、「ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｄ」とは、第１の可変ドメインではＱ４４がＲで置換され、第２の可変ドメインではＱ４４がＤで置換されていることを意味するものとする。追加的な置換および説明は、米国特許出願第２０１８－０１６２９２２号明細書に記載される。
一実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、二重特異性抗体またはその断片、二重特異性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその断片、または二重特異性一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）または二重特異性一本鎖抗体である。
二重特異性抗体、ＴＣＲ、およびそれぞれの断片は、本明細書で上に「定義」の項で定義される。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒト起源であり、これは、ヒト抗原遺伝子座から生成され、したがって、ヒト配列、特にヒトＴＣＲまたは抗体配列を含んでなるものと理解される。
一実施形態では、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインは共に連結し、および／またはｖαとｖβまたはｖγとｖδドメインは、好ましくは共有結合を介して共に連結する。
一実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも２つのポリペプチドを含んでなる。
関連する実施形態では、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインは、同じかまたは異なるポリペプチド上、好ましくは異なるポリペプチド上に位置する。
同じ実施形態において、α鎖可変ドメイン（ｖα）とβ鎖可変ドメイン（ｖβ）またはγ鎖可変ドメイン（ｖγ）とδ鎖可変ドメイン（ｖδ）、好ましくはｖαとｖβは、同じかまたは異なるポリペプチド上に位置する。
好ましい一実施形態では、抗原結合タンパク質は、可溶性タンパク質である。
「共有結合」、「リンカー配列」または「ポリペプチドリンカー」は、本明細書で上に「定義」の項で「リンカー」の下に定義される。
一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、以下の１つまたは複数をさらに含んでなる：
（ｉ）診断薬；
（ｉｉ）治療薬；または
（ｉｉｉ）ＰＫ修飾部分。
「診断薬」、「治療薬」、および「ＰＫ修飾部分」は、本明細書で上に定義の項で定義される。
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、直接、または切断可能または切断不能なリンカーを介して、少なくとも１つの増殖阻害剤に共有結合する。このような少なくとも１つの増殖阻害剤が付着する抗原結合タンパク質はまた、コンジュゲートと称されることもある。
例えば、免疫コンジュゲートなどのこのようなコンジュゲートの調製は、国際公開第２００４／０９１６６８号パンフレット、またはＨｕｄｅｃｚ，Ｆ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９８：２０９－２２３（２００５）、およびＫｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ．４４（１５）：５４０５－５４１５（２００５）に記載され、当業者によって、このような少なくとも１つの増殖阻害剤が付着した本発明の抗原結合タンパク質の調製に移行されてもよい。
少なくとも１つの増殖阻害剤の付着の文脈における「リンカー」は、ポリペプチドを薬物部分に共有結合的に付着させる、共有結合または原子の鎖を含んでなる化学部分を意味する。
コンジュゲートは、インビトロ法によって調製されてもよい。結合基を使用して、薬物またはプロドラッグが抗体に結合される。適切な連結基は当該技術分野で周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基、およびエステラーゼ不安定基が挙げられる。本発明の抗原結合タンパク質と細胞傷害剤または増殖阻害剤との結合は、Ｎ－スクシンイミジルピリジルジチオブチレート（ＳＰＤＢ）、ブタン酸４－［（５－ニトロ－２－ピリジニル）ジチオ］－２，５－ジオキソ－１－ピロリジニルエステル（ニトロ－ＳＰＤＢ）、４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）－２－スルホ－酪酸（スルホ－ＳＰＤＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）；以下の二官能性誘導体：イミドエステル（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）－ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）をはじめとするが、これらに限定されるものではない、様々な二機能性タンパク質結合剤を使用して行われてもよい。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ（１９８７）に記載されたように調製され得る。炭素標識された１－イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合させるための例示的なキレート剤である（国際公開第９４／１１０２６号パンフレット）。
リンカーは、細胞内の細胞傷害剤または増殖阻害剤の放出を促進する「切断可なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、エステラーゼ不安定リンカー、光不安定リンカー、またはジスルフィド含有リンカー（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書を参照されたい）が使用されてもよい。リンカーはまた、場合によっては、より良好な耐性をもたらすかもしれない「切断不能リンカー」（例えばＳＭＣＣリンカー）であってもよい。
代案としては、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質および細胞傷害性または増殖阻害ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質は、組換え技術またはペプチド合成によって生成されてもよい。ＤＮＡの長さは、互いに隣接するか、またはコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコード化する領域によって分離されている、コンジュゲートの２つの部分をコードする、それぞれの領域を含んでもよい。
本発明の抗原結合タンパク質はまた、プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤、国際公開第８１／０１１４５号パンフレットを参照されたい）を活性抗がん剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に、ポリペプチドをコンジュゲートすることによって、依存性酵素媒介プロドラッグ療法で使用されてもよい（例えば、国際公開第８８／０７３７８号パンフレットおよび米国特許第４，９７５，２７８号明細書を参照されたい）。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、酵素、サイトカイン（ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－１５などの）、ナノキャリア、または核酸の１つまたは複数をさらに含んでなる。
異なる二重特異性形態が当該技術分野で記載され、本明細書で上に「定義」の下の「形態」の項に記載されている。異なる形態のタンパク質を生成するための技術もまた、対応する項で引用される当該技術分野で開示されており、したがって当業者は、本発明の文脈で定義される可変ドメインを異なる形態で、特に本明細書に開示される形態で容易に使用できる。抗原結合タンパク質、特にＴＣＥＲ（登録商標）などの可溶性二重特異性結合タンパク質の生成は、本明細書の実施例の項でも開示されている。抗原結合タンパク質が２つのポリペプチドから構成されている場合、例えばＤＶＤ形態の場合のように、軽鎖および重鎖可変ドメインが平行配向であってもよく、αおよびβ可変ドメインが平行配向であってもよく、またはＣＯＤＶ形態の場合のように、軽鎖および重鎖の可変ドメインが交差配向であってもよく、αおよびβ可変ドメインが交差配向であってもよいことは、当業者であれば理解できるであろう。
したがって、本発明は、２つの抗原結合部位（ＡおよびＢ）を形成する２つのポリペプチド鎖を含んでなる抗原結合タンパク質にさらに言及し、その中では、第１のポリペプチド鎖は、式、
Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
（式中、Ｖ３は第３の可変ドメインであり；Ｖ４は第４の可変ドメインであり；Ｌ１およびＬ２はリンカーであり；Ｌ２は存在してもまたは存在しなくてもよく；ＣＬ軽鎖定常ドメインまたはその一部であり、存在するかまたは存在しない）
によって表される構造を有し、
その中では、第２のポリペプチド鎖は、式、
Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１［ＩＩ］
（式中、Ｖ５は第５の可変ドメインであり；Ｖ６は第６の可変ドメインであり；Ｌ３およびＬ４はリンカーであり；Ｌ４は存在してもまたは存在しなくてもよく；ＣＨ１は重鎖定常ドメイン１またはその一部であり、存在するかまたは存在せず；その中では、本明細書で上に定義されるように、Ｖ３はＶαまたはＶγ可変ドメインであって、Ｖ５はＶβまたはＶδ可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ６は重鎖可変ドメインであり、またはＶ４は重鎖可変ドメインであってＶ６は軽鎖可変ドメインであり、または
本明細書で上に定義されるように、Ｖ３はＶβまたはＶδ可変ドメインであって、Ｖ５はＶαまたはＶγ可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ６は重鎖可変ドメインであり、またはＶ４は重鎖可変ドメインであってＶ６は軽鎖可変ドメインであり、または
本明細書で上に定義されるように、Ｖ３はＶαまたはＶγ可変ドメインであって、Ｖ６はＶβまたはＶδ可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ５は重鎖可変ドメインであり、またはＶ４は重鎖可変ドメインであってＶ５は軽鎖可変ドメインであり、または
本明細書で上に定義されるように、Ｖ３はＶβまたはＶδ可変ドメインであって、Ｖ６はＶαまたはＶγ可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ５は重鎖可変ドメインであり、またはＶ４は重鎖可変ドメインであってＶ５は軽鎖可変ドメインであり、
本明細書で上に定義されるように、Ｖ４はＶαまたはＶγ可変ドメインであって、Ｖ５はＶβまたはＶδ可変ドメインであり、Ｖ３は軽鎖可変ドメインであってＶ６は重鎖可変ドメインであり、またはＶ３は重鎖可変ドメインであってＶ６は軽鎖可変ドメインであり、または
本明細書で上に定義されるように、Ｖ４はＶβまたはＶδ可変ドメインであって、Ｖ５はＶαまたはＶγ可変ドメインであり、Ｖ３は軽鎖可変ドメインであってＶ６は重鎖可変ドメインであり、またはＶ３は重鎖可変ドメインであってＶ６は軽鎖可変ドメインであり、
その中では、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインは一緒に抗原結合部位Ａを形成し、その中では、ＶαとＶβ、またはＶγとＶδ可変ドメインは、抗原結合部位Ｂを形成し、その中では、ＶαまたはＶγ可変ドメインは、好ましくはＶαであって、ＶβまたはＶδは、好ましくはＶβである）
によって表わされる構造を有する。
リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、本明細書で上に「定義」の項に定義される。しかしいくつかの実施形態では、いくつかのリンカーの長さは、特定の形態にとって好ましいかもしれない。しかし、リンカーの長さおよびそれらのアミノ酸配列に関する知識は、当該技術分野の一般知識に属し、異なる形態のリンカー、ならびにリンカーおよびアミノ酸の配列は、最新技術の一部であり、本明細書で上記に引用した開示に開示される。
好ましい実施形態では、Ｖ３は本明細書で上に定義されるＶαであって、Ｖ６は本明細書で上に定義されるＶβであって、Ｖ４は本発明の文脈で定義される軽鎖可変ドメインであって、
Ｖ３は本明細書で上に定義されるＶαであって、Ｖ６は本明細書で上に定義されるＶβであって、Ｖ４は本発明の文脈で定義される重鎖可変ドメインであって、Ｖ５は本発明の文脈で定義される軽鎖可変ドメインである。
一実施形態では、式［Ｉ］のポリペプチドは、Ｃ末端に式［Ｉ］のポリペプチド、リンカー（Ｌ５）、およびＦｃドメインまたはその一部をさらに含んでなり、および／またはその中では、式［ＩＩ］のポリペプチドは、Ｃ末端に式［ＩＩ］のポリペプチド、リンカー（Ｌ６）、およびＦｃドメインまたはその一部をさらに含んでなる。
Ｆｃドメインは、本明細書で上に「定義」の項で定義される通りである。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、２つの抗原結合部位（ＡおよびＢ）を形成する２つのポリペプチド鎖を含んでなり、
その中では、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］、
Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］
によって表わされる構造を有し、
１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＶ］、
Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］
（式中、Ｖ３、Ｌ１、Ｖ４、Ｌ２、ＣＬ、Ｖ５、Ｌ３、Ｖ６、Ｌ４、ＣＨ１は、本明細書で上に定義される通りであり、その中では、Ｌ５およびＬ６は、存在するかまたは存在しないリンカーであり、その中では、Ｆｃ１、およびＦｃ２は、Ｆｃドメインであり、その中では、Ｆｃ１およびＦｃ２は、同一であるかまたは異なり、好ましくは異なる）
によって表わされる構造を有し、Ｆｃドメインは、本明細書で上に「定義」の項で定義される通りである。
一実施形態では、Ｆｃ１は、配列番号１３２（ホール）のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、Ｆｃ２は、配列番号１３１（ノブ）のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、逆もまた同様であり、
より好ましくはＶ４またはＶ３が重鎖可変ドメインである場合、Ｆｃ１は、配列番号１３２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、それに応じてＶ５またはＶ６が軽鎖可変ドメインである場合、Ｆｃ２は、配列番号１３１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または
Ｖ４またはＶ３が軽鎖可変ドメインである場合、Ｆｃ１は、配列番号１３１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、それに応じて、Ｖ５またはＶ６が重鎖可変ドメインである場合、Ｆｃ２は配列番号１３２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
実施例から分かるように、本発明の発明者は、原理の証明として、ＴＣＥＲ（登録商標）形態の成熟ＴＣＲ可変ドメインと組み合わせた低親和性リクルーター（抗原結合部位Ａ）の使用を実証した（実施例２）。
したがって、好ましい一実施形態では、抗原結合タンパク質は、２つの抗原結合部位（ＡおよびＢ）を形成する２つのポリペプチド鎖を含んでなり、その中では、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］、
Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］
によって表わされる構造を有し、
１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＶ］、
Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］
によって表わされる構造を有し、
（式中、Ｌ２、ＣＬ、Ｌ５およびＬ４、ＣＨ１、Ｌ６は存在せず、
その中では、Ｖ３、Ｌ１、Ｖ４、Ｖ５、Ｌ３、Ｖ６は本明細書で上に定義されるようであり、
好ましくは、本発明の文脈で定義されるように、Ｖ３はＶαまたはＶγドメインであり、Ｖ６はＶβまたはＶδドメインであり、本発明の文脈で定義されるように、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ５は重鎖可変ドメインであり、または
好ましくは、本発明の文脈で定義されるように、Ｖ３はＶαまたはＶγ可変ドメインであり、Ｖ６はＶβまたはＶδドメインであり、本発明の文脈で定義されるように、Ｖ４は重鎖可変ドメインであってＶ５は軽鎖可変ドメインであり、
好ましくは、Ｌ１およびＬ３は、（配列番号１１８）のアミノ酸配列「ＧＧＧＳＧＧＧＧ」を含んでなるかまたはそれからなり、
好ましくはＦｃ１は配列番号１３２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、Ｆｃ２は配列番号１３１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、逆もまた同様であり、
より好ましくは、Ｖ４が重鎖可変ドメインである場合、Ｆｃ１は配列番号１３２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、それに応じて、Ｖ５が軽鎖可変ドメインである場合、Ｆｃ２は配列番号１３１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または
より好ましくは、Ｖ４が軽鎖可変ドメインである場合、Ｆｃ１は配列番号１３１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、それに応じて、Ｖ５が重鎖可変ドメインである場合、Ｆｃ２は配列番号１３２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインは、ＣＤ３に結合する１つの抗原結合部位Ａを一緒に形成し、
その中では、ＶαとＶβまたはＶγとＶδ可変ドメインは、本発明の文脈で定義されるように、ＴＡ抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体、好ましくはＴＡＡ抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的に結合する１つの抗原結合部位Ｂを形成する。
この実施形態の抗原結合タンパク質はまた、ＴＣＥＲ（登録商標）と称されることもある。
「ＴＣＥＲ（登録商標）」は、二重特異性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、２つの抗原結合ドメイン、本発明の文脈で定義されるＣＤ３と結合する重鎖および軽鎖可変ドメイン、および本発明の文脈で定義されるＶαとＶβまたはＶγとＶδドメインを含んでなる可溶性抗原結合タンパク質である。
一実施形態では、本発明は、配列番号１６５～１６７のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式、Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチドと、配列番号１６３または１６４のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式、Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチドとを含んでなる、抗原結合タンパク質に言及する。
また、エフェクター機能に関して、例えば、抗原結合タンパク質の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強または低減するように、本発明の抗原結合タンパク質を修飾することが望ましくあってもよい。これは、本発明の抗原結合タンパク質との関連で、本明細書ではＦｃ変異型とも称される、抗原結合タンパク質のＦｃ領域に、１つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって達成されてもよい。代案としては、またはそれに加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基が導入されて、この領域での鎖間ジスルフィド結合の形成が可能になってもよい。このように生成されたホモ二量体抗原結合タンパク質は、内部移行能力の改善または減少、および／または補体媒介性細胞滅殺および／または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増加を有してもよい（Ｃａｒｏｎ ＰＣ．ｅｔ ａｌ．１９９２；ａｎｄ Ｓｈｏｐｅｓ Ｂ．１９９２）。
本発明の抗原結合タンパク質の別のタイプのアミノ酸修飾、すなわち抗原結合タンパク質に見られる１つまたは複数の炭水化物部分を削除すること、および／または抗原結合タンパク質中に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位を付加することによって、抗原結合タンパク質の元来のグリコシル化パターンを変化させるのに有用であってもよい。トリペプチド配列アスパラギン－Ｘ－セリン、およびアスパラギン－Ｘ－スレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）のどちらかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生じる。抗原結合タンパク質へのグリコシル化部位の付加または欠失は、好都合には、アミノ酸配列を改変して（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）、それが上記のトリペプチド配列の１つまたは複数を含有するようにすることによって達成される。
別のタイプの修飾は、潜在的に分解産物または抗原結合タンパク質調製物の不均一性をもたらすものとして、インシリコまたは実験的に同定された配列の除去を伴う。例として、アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面露出などの要因に応じて生じ得る。アスパラギン残基は、主にＡｓｎ－Ｇｌｙの配列で存在する場合に特に脱アミドの影響を受けやすく、Ａｓｎ－Ａｌａなどのその他のジペプチド配列ではその影響より少ない。したがって、このような脱アミド化部位、特にＡｓｎ－Ｇｌｙが、本発明の抗原結合タンパク質中に存在する場合、典型的には保存的置換によってその部位が除去され、関与する残基の１つを除去することが望ましくあってもよい。１つまたは複数の関与する残基を除去するための、配列中のこのような置換もまた、本発明に包含されることが意図される。
別のタイプの共有結合修飾は、グリコシドを抗原結合タンパク質に化学的または酵素的に共役させることを伴うこれらの手順は、Ｎ－またはＯ－結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞における、抗原結合タンパク質の産生を必要としないという点で有利である。使用されるカップリングモード次第で、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着してもよい。例えば、このような方法は、国際公開第８７／０５３３０号パンフレットに記載される。
抗原結合タンパク質上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成されてもよい。化学的脱グリコシル化には、抗原結合タンパク質を化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物に曝露させることが必要である。この処理は、結合糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖の切断をもたらすが、抗原結合タンパク質は無傷のままにする。化学的脱グリコシル化は、Ｓｏｊａｈｒ Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）；およびＥｄｇｅ，ＡＳ．ｅｔ ａｌ．（１９８１）によって記載される。抗体の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ，ＮＲ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）によって記載されたように、様々なエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
抗原結合タンパク質の別のタイプの共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；米国特許第４，４９６，６８９号明細書；米国特許第４，３０１，１４４号明細書；米国特許第４，６７０，４１７号明細書；米国特許第４，７９１，１９２号明細書；または米国特許第４，１７９，３３７号明細書に記載されているような様式で、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなどの様々な非タンパク質性ポリマーの１つに抗原結合タンパク質を結合させることを含んでなる。
本発明はまた、本発明の抗原結合タンパク質を提示する粒子、および前記粒子を粒子のライブラリ内に含めることを含む。このような粒子としては、ファージ、酵母、リボソーム、または哺乳類細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような粒子およびライブラリーを生成する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、国際公開第２００４／０４４００４号パンフレット；国際公開第０１／４８１４５号パンフレット；Ｃｈｅｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３９．２：１７５－１８４を参照されたい）。
本明細書で開示されているように、本発明の抗原結合タンパク質は、抗原結合部位ＡでＣＤ３に結合し、抗原結合部位Ｂで標的抗原（ＴＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。ＣＤ３分子は、典型的には、エフェクター細胞、好ましくはＴ細胞などのＣＤ３提示細胞の表面上に存在する。Ｔｈｅ標的抗原性（ＴＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体は、典型的には、がん細胞などの罹患細胞などの標的抗原性（ＴＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体提示細胞の表面上に存在する。抗原結合タンパク質のＣＤ３および標的抗原（ＴＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体への結合は、エフェクター細胞と標的細胞を互いに近接させ、ひいては、二重特異性抗原結合タンパク質の結合は、結合時に免疫応答を誘発してもよい。したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、エフェクター細胞において免疫応答を誘導する。
したがって、一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、好ましくは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などのエフェクター細胞などのＣＤ３提示細胞において免疫応答を誘導し、その中では、免疫応答は、インターフェロン（ＩＦＮ）γレベルの増加によって特徴付けられる。したがって、一例では、免疫応答は、好ましくはＩＦＮ－γ放出アッセイで判定されるＥＣ５０値によって特徴付けられるかもしれない。
本発明の文脈において、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＫＤ（Ａ）でＣＤ３に結合し、抗原結合部位Ｂは、ＫＤ（Ｃ）でＴＡ抗原性ペプチドＣ（ＴＡ－Ｃ）／ＭＨＣ複合体、好ましくはＴＡＡ抗原性ペプチドＣ（ＴＡＡ－Ｃ）／ＭＨＣ複合体に結合し、ＫＤ（Ａ）／ＫＤ（Ｃ）比は、１を超え、４を超え、６を超え、８を超え、１０を超え、１５を超え、２０を超え、２５を超え、３０を超え、４０を超え、５０を超え、１～１５０の間、４～１４０の間、６～１００の間、８～１００の間、１０～１００の間など、好ましくは１０～１００の間である。
「親和性」および「ＫＤ」という用語は、本明細書で上に「定義」の項で定義される。ＫＤなどの親和性を測定する方法は当業者に知られており、例えば、表面プラズモン共鳴およびバイオレイヤー干渉法が挙げられる。当業者に知られているように、使用される緩衝液、タンパク質の濃度または温度など、それらの実験に使用される実験条件は、結果に影響を与えてもよい。
したがって、一例では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、本明細書で上に記載されている可溶性ＴＣＥＲ（登録商標）として発現され、複合体ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３単量体に対するそれらの結合親和性について分析された。典型的には、測定は、例えば、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システムで、典型的には、製造業者によって推奨される設定を用いて実施される。簡潔に述べると、結合動態は、典型的には、例えば、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ＢＳＡを緩衝剤として使用して、３０℃で、例えば、１０００ｒｐｍの振盪速度で測定された。ペプチド－ＨＬＡ－Ａ：０２複合体は、抗原結合タンパク質、特にＴＣＥＲ（登録商標）を分析する前に、ＨＩＳ１Ｋなどのバイオセンサー上に負荷された。次に、同じ抗原結合タンパク質が、典型的には、ＣＤ３に対する結合親和性についてさらに分析される。したがって、測定は、ＣＤ３結合について本明細書で上に記載されているように実施された。
いくつかの実施形態では、抗原結合部位Ａは、好ましくは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、好ましくはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いた測定で、３ｎＭ以上、５ｎＭ以上、８ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１２ｎＭ以上、１４ｎＭ以上、１６ｎＭ以上、１８ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、２５ｎＭ以上、３０ｎＭ以上、３５ｎＭ以上、４０ｎＭ以上、４５ｎＭ以上で、１０００ｎＭ以下、８００ｎＭ以下、６００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３ｎＭ～１０００ｎＭ、３ｎＭ～６００ｎＭ、５ｎＭ～６００ｎＭ、１０ｎＭ～６００ｎＭ、１２ｎＭ～６００ｎＭ、１４ｎＭ～６００ｎＭ、１６ｎＭ～６００ｎＭ、１８ｎＭ～６００ｎＭ、２０ｎＭ～６００ｎＭの間など、好ましくは５ｎＭ～１００ｎＭのＫＤ（Ａ）でＣＤ３に結合する。
いくつかの実施形態では、抗原結合部位Ｂは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、好ましくはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いた測定で、１００μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、例えば０．０１ｎＭ～１５０ｎＭ、０．０５ｎＭ～１５０ｎＭ、０．１ｎＭ～１５０ｎＭ、０．１ｎＭ～１００ｎＭ、０．１ｎＭ～５０ｎＭ、０．１ｎＭ～１０ｎＭ、０．５ｎＭ～１０ｎＭ、０．５ｎＭ～５ｎＭ、０．１ｎＭ～５ｎＭ、好ましくは０．５ｎＭ～５ｎＭのＫＤ（Ａ）で、ＴＡ抗原性ペプチドＣ（ＴＡ－Ｃ）／ＭＨＣ複合体、好ましくはＴＡＡ抗原性ペプチドＣ（ＴＡＡ－Ｃ）／ＭＨＣ複合体に結合する。
一例では、抗原結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、好ましくはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いた測定で、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１ｎＭ以下、例えば１０ｐＭ～１００ｎＭ、１０ｐＭ～５０ｎＭ、１０ｐＭ～１０ｎＭ、特に５０ｐＭ～１００ｎＭ、１００ｐＭ～５０ｎＭ、１００ｐＭ～１０ｎＭ、５００ｐＭ～１０ｎＭ、好ましくは５００ｐＭ～１０ｎＭのＫＤで、配列番号１０のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原性ペプチド、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２に結合する。
一例では、抗原結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、好ましくはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いた測定で、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１ｎＭ以下、例えば１０ｐＭ～１００ｎＭ、１０ｐＭ～１５０ｎＭ、１０ｐＭ～１００ｎＭ、特に５０ｐＭ～１００ｎＭ、１００ｐＭ～１００ｎＭ、１００ｐＭ～５０ｎＭのＫＤで、配列番号９のアミノ酸配列／ＭＨＣ複合体を含んでなるかまたはそれからなるＰＲＡＭＥペプチドに結合する。
一実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、正常組織細胞に対するＥＣ５０値よりも５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上低い、ＴＡ－Ｃ／ＭＨＣ提示細胞、好ましくはＴＡＡ－Ｃ／ＭＨＣ提示細胞に対するＥＣ５０有し、その中では、ＥＣ５０は、好ましくは誘導された細胞傷害性に関して判定される。
本明細書における「ＴＡ－Ｃ／ＭＨＣ提示細胞」または「ＴＡ提示細胞」は、ＭＨＣタンパク質との複合体中の特定のＴＡ－Ｃ抗原性ペプチドなどのＴＡ抗原性ペプチドをその表面に提示する細胞を指し、その中では、細胞表面上に存在する前記ＴＡペプチド／ＭＨＣ複合体のコピー数は、典型的には、当業者に知られている方法で判定され得る。一実施形態では、ＴＡ／ＭＨＣ提示細胞は、ＴＡ－Ｃ／ＭＨＣ提示細胞、好ましくはＴＡＡ／ＭＨＣ提示細胞でえる。いくつかの例では、ＴＡ抗原性ペプチドは、ウイルスペプチドまたは細菌ペプチドであり、このような例では、ＴＡ／ＭＨＣ提示細胞は、典型的には、罹患細胞または感染細胞であり、その中では、前記罹患細胞は、それぞれのウイルスまたは細菌に感染している。いくつかの例では、ＴＡ抗原性ペプチドはＴＡＡ抗原性ペプチドであり、前記の例では、ＴＡＡ／ＭＨＣ提示細胞は典型的にはがん細胞である。
一実施形態では、ＴＡ／ＭＨＣ提示細胞、好ましくはＴＡＡ／ＭＨＣ提示細胞、例えばＴＡＡ／ＭＨＣ提示がん細胞は、５０を超え、１００を超え、１５０を超え、２００を超え、３００を超え、６００を超え、８００を超え、１０００を超え、１５００を超え、２０００を超える、ＴＡ／ＭＨＣコピー数、またはＴＡＡ／ＭＨＣコピー数、好ましくは５０～５０００のＴＡＡ／ＭＨＣコピー数を有する。
本明細書における「コピー数」とは、例えば、がん細胞などのまたは正常な形状細胞のようなＴＡ／ＭＨＣ提示細胞などの、ＴＡＡ／ＭＨＣ提示細胞などの細胞の細胞表面上に存在するＴＡ抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体の数を指す。
このようなコピー数は、例えば、特定のＴＡおよび細胞タイプに依存し、ＦＡＣＳ分析、質量分析法（ＭＳ）およびＲＮＡ配列決定、好ましくは質量分析法（ＭＳ）およびＲＮＡ配列決定などの当業者に公知の方法で検出され得る。
「健常細胞」はまた「正常細胞」と称されることもあり、本明細書ではがん細胞ではない細胞を指し、好ましくは本明細書における健常細胞は、ＴＡ提示細胞周囲の組織の細胞を指す。好ましくは、ＴＡがウイルスまたは細菌抗原性のペプチドである場合、健常細胞は、好ましくは罹患しておらず、すなわちそれぞれのウイルスまたは細菌の細菌感染またはウイルス感染を患っていない。しかしながら、場合によっては、健常細胞もまた、ＴＡペプチド／ＭＨＣ複合体、例えば、ＴＡＡ－Ｃ／ＭＨＣ複合体などのＴＡＡペプチド／ＭＨＣ複合体をそれらの表面に発現し提示するかもしれない。典型的には、本発明の文脈における健常細胞では、当業者であれば理解できるように、ＴＡペプチド／ＭＨＣ複合体は、がん細胞などのＴＡ提示細胞よりも少ない量（コピー数）で存在する。
したがって、一実施形態では、健常細胞は、Ａ／ＭＨＣＴコピー数、好ましくは５０００未満、１０００未満、５００未満、１００未満、５０未満、２０未満、１０未満、好ましくは１０未満のＴＡＡ／ＭＨＣコピー数、好ましくは０～５などの０～１０の間のＴＡＡ／ＭＨＣコピー数のＴＡＡ－Ｃ／ＭＨＣコピー数などのＴＡＡ／ＭＨＣコピー数を有する。
健常細胞は、好ましくは星状細胞、ＧＡＢＡ神経細胞、心筋細胞、心臓微小血管内皮細胞、軟骨細胞、冠動脈内皮細胞、皮膚微小血管内皮細胞、間葉系幹細胞、鼻上皮細胞、末梢血単核細胞、肺動脈平滑筋細胞、好ましくはＧＡＢＡ神経細胞、心筋細胞、心臓微小血管内皮細胞、軟骨細胞、冠動脈内皮細胞、鼻上皮細胞、末梢血単核細胞、肺動脈平滑筋細胞からなる群から選択される。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、例えば、健常細胞、好ましくは星状細胞、ＧＡＢＡ神経細胞、心筋細胞、心臓微小血管内皮細胞、軟骨細胞、冠動脈内皮細胞、皮膚微小血管内皮細胞、間葉系幹細胞、鼻上皮細胞、末梢血単核細胞、肺動脈平滑筋細胞、好ましくはＧＡＢＡ神経細胞、心筋細胞、心臓微小血管内皮細胞、軟骨細胞、冠動脈内皮細胞、鼻上皮細胞、末梢血単核細胞、肺動脈平滑筋細胞からなる群から選択される健常細胞に対するＥＣ５０値よりも、１０００倍以上、１５０００倍以上、９０００倍以上低い、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞などのＴＡ－Ｃ／ＭＨＣ複合体提示細胞などのＴＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＥＣ５０を有する。
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、高い安全性プロファイルを有する。
本明細書における「安全性プロファイル」は、腫瘍細胞を正常な形状組織細胞または類似ペプチド提示細胞から区別する能力を指す。当該技術分野では、安全性プロファイルは、安全域を用いて記述される。
本明細書における「安全域」または「治療域」は、腫瘍細胞株に１００％の細胞傷害性を誘導するのに必要な化合物の最大半量濃度と、正常な組織細胞に１００％の細胞傷害性を誘導するのに必要な化合物の最大半量濃度とを比較した場合の係数を指す。目的の抗原結合タンパク質について、腫瘍細胞株について判定されたＥＣ５０が１ｐＭであり、例えば、初代細胞について判定されたＥＣ５０値が１０００ｐＭである場合、腫瘍細胞株に対するＥＣ５０は初代細胞に対するＥＣ５０の１０００倍小さいことから、安全域は１０００である。
一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、正常組織細胞に対するＥＣ５０値よりも５００～１２０００倍、好ましくは１０００～１００００倍低い、ＴＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞、好ましくはＴＡＡ－Ｃ／ＭＨＣ複合体提示細胞などのＴＡＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＥＣ５０など、正常組織細胞に対するＥＣ５０値よりも１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上、２０００倍以上、３０００倍以上、４０００倍以上、５０００倍以上、６０００倍以上低い、ＴＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞、好ましくはＴＡＡ－Ｃ／ＭＨＣ複合体提示細胞などのＴＡＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＥＣ５０を有する。
ＥＣ５０が計算され得ない場合はまた、ＴＣＥＲ（登録商標）分子のオンターゲット細胞と正常組織細胞に対する「最小影響量」（ＬＯＥＬ）の比率をそれぞれ計算することによっても、安全域が判定され得る。
「ＬＯＥＬ」は、本明細書では、カットオフ値を超える応答を伴う最初のＴＣＥＲ（登録商標）濃度として定義される。カットオフは、アッセイバックグラウンド（ＰＢＭＣ添加なしの健常組織細胞とＴＣＥＲ（登録商標）分子との共培養）と、全てのアッセイウェル内の標準偏差の３倍の合計として定義された。
一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、正常細胞に対するＬＯＥＬよりも、５００～１２，０００倍、好ましくは１，０００～１０，０００倍低いＴＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞、好ましくはＴＡＡ－Ｃ／ＭＨＣ複合体提示細胞などのＴＡＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＬＯＥＬなど、正常細胞に対するＬＯＥＬ値よりも１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上、２０００倍以上、３０００倍以上、４０００倍以上、５０００倍以上、６０００倍以上低い、ＴＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞、好ましくはＴＡＡ－Ｃ／ＭＨＣ複合体提示細胞などのＴＡＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＬＯＥＬを有する。
一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、類似ペプチド／ＭＨＣ提示細胞に対するＥＣ５０値よりも、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上、２，０００倍以上、３，０００倍以上、４，０００倍以上、５０００倍以上、６，０００倍以上低い、ＴＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞 、好ましくはＴＡＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞、ＴＡＡ－Ｃ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＥＣ５０を有し、その中では、ＥＣ５０は、好ましくは、類似ペプチド／ＭＨＣ提示細胞に対するＥＣ５０値よりも、５００～１２，０００、好ましくは１，０００～１２０００低い、ＴＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞、好ましくはＴＡＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＥＣ５０などの誘発性細胞傷害性と対比して判定される。
本発明の文脈における「類似ペプチド」はまた、「オフターゲット」と称されることもあり、典型的には８～１６アミノ酸長を含んでなるペプチドに関する。本発明の文脈における類似のペプチドは、典型的にはＭＨＣ提示である。さらに、本発明の文脈における類似ペプチドは、ＴＡ抗原性ペプチドのアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、本発明の文脈における１つの好ましい例では、ＴＡ抗原性ペプチドのエピトープとの比較で、エピトープを含んでなり、その中では、ＴＡ抗原性ペプチドのエピトープと比較して、前記エピトープの少なくとも１、２または３つ、好ましくは１、２または３つ、より好ましくは１つなどの少なくとも１つのアミノ酸が置換されている。この配列類似性のために、例えば、類似ペプチドがＭＨＣタンパク質によって提示される場合、このシナリオにおいて、類似ペプチドは、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質によって結合されるかもしれず、ひいては二重特異性抗原結合タンパク質によって結合され、所与の二重特異性抗原結合タンパク質が類似ペプチドに結合する能力は、所望のエフェクター細胞応答をもたらさず、有害反応をもたらすこともある。このような有害反応は、Ｌｏｗｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１８年１２月４日公開，７ページで報告されたように、正常組織でペプチドと交差反応する、特異的ＴＣＲの交差反応性などの「腫瘍外」の副作用であってもよい。本発明の文脈における類似ペプチドは、例えば、ＭＡＧ－００３などのＴＡ抗原性ペプチドとの高い配列類似性（類似性ＢＬＡＳＴ検索）に基づいて、例えば、ＭＡＧＥ－Ａの場合はＨＬＡ－Ａ＊０２結合ペプチドなどの正常組織提示ＨＬＡクラス１結合ペプチド（ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴデータベース）のデータベースから選択されてもよい。したがって、これらの有害反応のために、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、類似ペプチドを提示する正常組織の細胞に対する細胞傷害性を回避するように操作される。
本明細書における類似ペプチド／ＭＨＣ提示細胞は、その細胞表面上に類似ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する細胞を意味する。
一実施形態では、類似ペプチド／ＭＨＣ提示細胞は、５０を超え、１００を超え、１５０を超え、２００を超え、３００を超え、６００を超え、８００を超え、１０００を超え、１５００を超え、２０００を超える類似ペプチド／ＭＨＣコピー数、好ましくは５０～５０００のＴＡＡ／ＭＨＣコピー数を有する。
一実施形態では、類似ペプチド／ＭＨＣ提示細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞であり、５０を超え、８０を超え、１００を超え、１２０を超え、１５０を超え、３００を超え、４００を超え、６００を超え、８００を超え、１０００を超え、１５００を超え、２０００を超えるＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体コピー数、好ましくは５０～２０００の、８０～２０００など、１００～２０００など、例えば１２０～２０００のＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣコピー数を有する。
一実施形態では、ＴＡ抗原性ペプチドは、Ｍａｇｅ－Ａ抗原性ペプチドであり、類似ペプチドは、以下のペプチドからなるリストから選択される：配列番号２６９のアミノ酸配列からなるＲＡＢＧＡＰ１Ｌ－００１、配列番号２７０のアミノ酸配列からなるＡＸＩＮ１－００１、配列番号２７１のアミノ酸配列からなるＡＮＯ５－００１、配列番号２７２のアミノ酸配列からなるＴＰＸ２－００１、配列番号２７３のアミノ酸配列からなるＳＹＮＥ３－００１、配列番号２７４のアミノ酸配列からなるＭＩＡ３－００１、配列番号２７５のアミノ酸配列からなるＨＥＲＣ４－００１、配列番号２７６のアミノ酸配列からなるＰＳＭＥ２－００１、配列番号２７７のアミノ酸配列からなるＨＥＡＴＲ５Ａ－００１、配列番号２７８のアミノ酸配列からなるＣＮＯＴ１－００３、配列番号２７９のアミノ酸配列からなるＴＥＰ１－００３、配列番号２８１のアミノ酸配列からなるＺＦＣ－００１、および配列番号２８０のアミノ酸配列からなるＰＩＴＰＮＭ３－００１。
したがって、一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、前記類似ペプチドがＭＨＣタンパク質との複合体中にある場合、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中にある場合、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ－００１、ＡＸＩＮ１－００１、ＡＮＯ５－００１、ＴＰＸ２－００１、ＳＹＮＥ３－００１、ＭＩＡ３－００１、ＨＥＲＣ４－００１、ＰＳＭＥ２－００１、ＨＥＡＴＲ５Ａ－００１、ＣＮＯＴ１－００３、ＴＥＰ１－００３、ＰＩＴＰＮＭ３－００１、ＺＦＣ－００１好ましくはＨＥＡＴＲ５Ａ－００１、ＨＥＲＣ４－００１、およびＺＦＣ－００１からなるペプチドの群から選択される、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、１、２、３、４、５つなどの、好ましくは少なくとも３つのまたは全ての類似ペプチドなどの少なくとも１つの類似ペプチドに結合せずまたは有意に結合しない。
類似ペプチドの文脈における、および本明細書の二重特異性抗原結合タンパク質の文脈における、「有意に結合しない」は、より低い結合シグナルおよび／またはより高いＫＤ値によって特徴付けられる。例えば、本発明の文脈において、二重特異性抗原結合タンパク質は、同じ実験設定および同じ二重特異性抗原結合タンパク質濃度で、ＭＡＧＥ－Ａ抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する同じ二重特異性抗原結合タンパク質結合の応答の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、の少なくとも１つの類似ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合応答を有し、および／または、例えば、本発明の文脈において、二重特異性抗原結合タンパク質は、特異的抗原、すなわち本明細書に記載されているＭＡＧＥ－Ａ抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する親和性と比較して低下した親和性で、少なくとも１つの類似ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合し、その中では、それぞれの類似ペプチドに対するそれぞれのＫＤは、５、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００倍、好ましくは２０～１００倍、より好ましくは３０～１００倍、４０～１００倍など、典型的には４０～５０倍加している。例えば、二重特異性抗原結合タンパク質がＭＡＧ－００３／ＭＨＣの複合体に１ｎＭのＫＤで結合し、二重特異性抗原結合タンパク質が例えば、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ－００１／ＭＨＣの複合体に１００ｎＭのＫＤで結合する場合、二重特異性抗原結合タンパク質は１００倍に増加したＫＤで、したがって１００分の１に減少した親和性で、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ－００１／ＭＨＣに結合する。これらの例において、結合応答、解離定数、および結合親和性は、好ましくは、例えば、実施例４および５に記載されているように、バイオレイヤー干渉法を用いて測定される。
実施例、特に実施例１および図８からさらに分かるように、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は可溶性であるだけでなく、１０ｍｇ／Ｌ（細胞培養物）未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、またはに４０ｍｇ／Ｌにさえ至る量で、一過性発現でＣＨＯ細胞中でも発現され得る。したがって、一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、宿主細胞において高収率で発現され得て、その中では、好ましくは収率は、１０を超え、１５、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５ｍｇ／Ｌ（細胞培養物）を超え、５～５０、５，～４５、５～４０、５～３５、１０～３５、１０～３０、１０～２５、１０～２０ｍｇ／Ｌ（細胞培養物）などである。一例では、抗原結合タンパク質は一過性に形質移入されたＣＨＯ－Ｓ細胞で発現され、その中では、細胞は、Ｔ＝０において、４×１０６／ｍＬの密度で、３７℃で、総容量３２０ｍＬのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標）の培地中で培養される。１日後、供給液（ＣｅｌｌＢｏｏｓｔ ７ａおよびｂ）が添加され、温度が３２℃に低下された。細胞、すなわち抗原結合タンパク質は、合計１２日間の培養時間と合計３回の栄養供給後に収穫された。
実施例からさらに分かるように、本発明者らは、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質が、参照タンパク質と比較して、例えば、配列番号３９のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＶＨドメインと、配列番号３８のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＶＬドメイン、または配列番号１３７のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＶＨドメインと、配列番号１４５のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＶＬドメイン、好ましくは配列番号１３７のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＶＨドメインと、配列番号１４５のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＶＬドメインを含んでなる抗原結合タンパク質と比較して、同等のまたはさらに改善された安定性を有することを実証した。
したがって一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、任意選択的に、参照タンパク質と比較して同等のまたは改善された安定性を有する。本発明の文脈における同等のまたは改善された安定性は、例えば、温度ストレスに曝された場合の同等のまたは増加した物理的安定性を指す。したがって、本発明の新たに開発された抗原結合タンパク質は、参照抗原結合タンパク質よりもストレス条件、特に温度ストレスに同等にまたはより良く耐え得て、その中では、前記抗原結合タンパク質は、好ましくは同じ形態である。
本発明の文脈における「安定性」という用語は、物理的安定性を指し、当該技術分野で記載される様々な分析技術を使用して定性的および／または定量的に評価され得て、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）；およびＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０（１９９３）で概説される。本発明の文脈において、これらの方法は、特に、（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーの使用、濁度の測定、および／または目視検査による）凝集体形成の評価を指す。安定性を測定するために、本発明の抗原結合タンパク質を含んでなるサンプルは、安定性試験で試験されてもよく、その中では、サンプルは選択された期間ストレス条件に曝され、適切な分析技術を使用した化学的および物理的安定性の定量的および任意選択的に定性的な分析がそれに続いた。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、例えば、４０℃の温度に例えば、１４日間曝された場合など、特定の期間にわたりストレス条件に曝された場合に、物理的に安定している。
「物理的安定性」は、本発明の文脈において、実質的に、凝集、沈殿および／または変性の兆候を有さない抗原結合タンパク質を指す。
物理的安定性にアクセスする方法は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、光掩蔽（ＬＯ）、色および透明度である。
「凝集の兆候がない」とは、例えば、ＰＢＳなどの緩衝液中で１４日にわたる４０°Ｃの温度などのストレス条件に曝された後に、抗原結合タンパク質を含んでなるサンプルが、ＰＢＳなどの緩衝液中でＳＥＣ－ＨＰＬＣなどのＳＥＣによって測定された場合、単量体含有量の９４％～９９％、９５％～９９％、９６％～９９％、９７％～９９％の単量体含有量などの、８０％を超え、８６％を超え、８８％を超え、９０％を超え、９２％を超え、９４％を超え、９６％，を超える９７％を超え、９８％を超え、９９％を超える単量体含有量を有することを意味する。
したがって、一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、例えば、参照タンパク質と比較して、同じまたは低減された凝集を有する。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）では、使用されるカラム、操作圧力、および緩衝液の速度に応じて、試験された条件下で、単量体含量の１％、２％、３％、４％、好ましくは１または２％、より好ましくは２％の差が、本発明の文脈では有意差があると見なされる。
これは、参照抗原結合タンパク質が９６％の単量体含有量を有し、本発明の抗原結合タンパク質が９８％の単量体含有量を有する場合、本発明の抗原結合タンパク質の単量体含有量は、同じ条件で測定した場合、参照抗原結合タンパク質と比較して有意に異なり、したがって有意に増加していることを意味する。
核酸、ベクター、および組換え宿主細胞
本発明のさらなる目的は、本明細書で上に定義される本発明の二重特異性抗原結合タンパク質をコードする配列を含んでなるかまたはそれからなる、単離核酸配列に関する。
典型的には、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターなどの任意の適切なベクターに含まれてもよいＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」は、それによってＤＮＡやＲＮＡの配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入し、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写または翻訳）を促進するためのビヒクルを意味する。
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含んでなるベクターに関する。
このようなベクターは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの調節エレメントを含んでなり、対象への投与時に前記ポリペプチドの発現を引き起こしまたは指示してもよい。動物細胞のための発現ベクターで使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ Ｙ ｅｔ ａｌ．１９８７）、免疫グロブリンＨ鎖などのプロモーター（Ｍａｓｏｎ ＪＯ ｅｔ ａｌ．１９８５）およびエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ ｅｔ ａｌ．１９８３）が挙げられる。
ヒト抗体Ｃ領域をコード化する遺伝子を挿入して発現させることができる限り、動物細胞のための任意の発現ベクターが使用され得る。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９０），ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．１９８７），ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ Ｇ ｅｔ ａｌ．１９８４），ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．１９８１），ｐＳＧ１ β ｄ２－４－（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９０）などが挙げられる。プラスミドのその他の例としては、複製起点を含んでなる自己複製プラスミドド、または例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの統合プラスミドが挙げられる。
ウイルスベクターのその他の例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、およびＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、パッケージング細胞への形質移入によって、またはヘルパープラスミドまたはウイルスを用いた一過性形質移入によって、当該技術分野で公知の技術によって生成されてもよい。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損組換えウイルスを生成するための詳細なプロトコルは、例えば、国際公開第９５／１４７８５号パンフレット、国際公開第９６／２２３７８号パンフレット、米国特許第５，８８２，８７７号明細書、米国特許第６，０１３，５１６号明細書、米国特許第４，８６１，７１９号明細書、米国特許第５，２７８，０５６号明細書、および国際公開第９４／１９４７８号パンフレットにある。
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、ウイルスベクター粒子にパッケージ化される能力を有し、少なくとも外因性核酸をコード化する、核酸ベクターコンストラクトを指す。ベクターおよび／または粒子は、生体外または生体内のどちらかで、任意の核酸を細胞に移し入れる目的で用いられ得る。多数の形態のウイルスベクターが、当該技術分野で公知である。「ビリオン」という用語は、単一の感染性ウイルス粒子を指すために使用される。「ウイルスベクター」、「ウイルスベクター粒子」、および「ウイルス粒子」はまた、細胞の外側に存在するように、そのＤＮＡまたはＲＮＡコアおよびタンパク質コートを有する完全なウイルス粒子を指す。例えば、ウイルスベクターは、アデノウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、またはピコルナウイルスから選択されてもよい
ウイルスは、天然に存在するウイルスならびに人工ウイルスを指してもよい。本発明のいくつかの実施形態によるウイルスは、エンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスのどちらであってもよい。パルボウイルス（ＡＡＶなど）は、非エンベロープウイルスの例である。好ましい実施形態では、ウイルスは、エンベロープウイルスであってもよい。好ましい実施形態では、ウイルスは、レトロウイルス、特にレンチウイルスであってもよい。真核細胞のウイルス感染を促進し得るウイルス外被タンパク質としては、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）、改変ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４ＴＲ）、および修飾テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶＴＲ）からのエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）で偽型化されたＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクター（ＬＶ）が挙げられてもよい。これらのエンベロープタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をはじめとするパルボウイルスなどのその他のウイルスの侵入を効率的に促進し得て、それによってそれらの広範な効率を実証する。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）４０７０ ｅｎｖ（その内容が参照により本明細書に援用される、Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８３４－８４０，２００５に記載されているような）、ＲＤ１１４ ｅｎｖ、キメラエンベロープタンパク質ＲＤ１１４ｐｒｏまたはＲＤｐｒｏ（その内容が参照により本明細書に援用される、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１０；２３５：１２６９－１２７６に記載されているように、ＲＤ１１４のＲペプチド切断配列をＨＩＶ－１マトリックス／カプシド（ＭＡ／ＣＡ）切断配列で置換することによって構築されたＲＤ１１４－ＨＩＶキメラまたはバキュロウイルスＧＰ６４ ｅｎｖ（その内容が参照により本明細書に援用される、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１０８６９－１０８７８，２００７に記載されているような）、またはＧＡＬＶ ｅｎｖ（その内容が参照により本明細書に援用される、Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８３４－８４０，２００５に記載されているような）またはそれらの誘導体をはじめとする、その他のウイルスエンベロープタンパク質が使用されてもよい。
本発明のさらなる目的は、本発明による核酸および／またはベクターで形質転換、形質導入、または形質移入された宿主細胞に関する。
「形質転換」という用語は、元来、宿主細胞への遺伝子移入の自然発生プロセスを指し、これは、細胞による細胞膜を介した、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸などの遺伝物質の吸収を伴い、その結果、宿主細胞は、導入された遺伝子または配列を発現し、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子または配列によってコード化されるタンパク質または酵素を産生する。自然形質転換および人工または誘導形質転換と称される、２つのタイプがある。人工的または誘導的な形質転換方法は、実験室条件下で実行される。
形質転換の過程において、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの外来核酸を受け取って発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。
「形質移入」という用語は、宿主細胞が外来遺伝物質を受け取ることを可能にする、宿主細胞の細胞膜上の細孔の生成を伴う遺伝子移入の様式を指す。典型的には、形質移入は、昆虫または哺乳類の細胞などの真核細胞の形質転換を指す。化学薬品媒介形質移入は、例えば、リン酸カルシウムまたはカチオン性ポリマーまたはリポソームの使用を伴う。非化学薬品媒介形質移入法は、典型的には、電気穿孔、ソノポレーション、インペールフェクション、光形質移入、または流体力学的送達である。粒子ベースの形質移入には、ナノ粒子を使用して核酸を宿主細胞に移入する遺伝子銃技術、またはマグネトフェクションと称される別の方法が使用される。ヌクレオフェクションおよび熱ショックの使用は、形質移入を成功させるためのその他の進化した方法である。形質移入法を介して外来核酸を受け取る宿主細胞は、「形質移入」されている。
「形質導入」という用語は、一般に、ウイルスまたはウイルスベクターによる細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡなどの外来核酸の移入に関連すると理解される。ウイルスまたはウイルスベクターによって、ＤＮＡやＲＮＡなどの外来核酸を受け取って発現する宿主細胞は、「形質導入」されている。
いくつかの実施形態では、細胞は、その内容全体が本明細書に参照により援用される、米国特許第２０１９０２１６８５２号明細書に記載された方法を使用して形質導入されてもよい。
本発明の核酸を使用して、適切な発現系において本発明の組換え抗原結合タンパク質が生成されてもよい。
「発現系」という用語は、例えば、ベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによってコード化されるタンパク質の発現のための適切な条件下にある、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。
一般的な発現系としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞とバキュロウイルスベクター、および哺乳類宿主細胞とベクターが挙げられる。その他の宿主細胞の例としては、限定されることなく、原核生物細胞（細菌など）および真核細胞（酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる特定の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属またはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母、哺乳類細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、初代または確立された哺乳類細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚性細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから生成される）が挙げられる。例としてはまた、マウスＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、「ＤＨＦＲ遺伝子」と称される）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ Ｇ ｅｔ ａｌ；１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、以下、「ＹＢ２／０細胞」と称する）なども挙げられる。いくつかの実施形態では、キメラまたはヒト化抗体のＡＤＣＣ活性は、ＹＢ２／０細胞で発現させると増強されることから、この細胞が好ましくあってもよい。
本発明はまた、本発明による二重特異性抗原認識コンストラクトを含んでなる宿主細胞にも関する。具体的には、本発明の宿主細胞は、本明細書で上に記載されているような核酸またはベクターを含んでなる。宿主細胞は、例えば、植物、動物、真菌、または藻類などの真核細胞であり得て、または例えば、細菌または原虫など原核細胞であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞、すなわち、例えばヒトなどの生物から直接単離された細胞であり得る。宿主細胞は、接着細胞または懸濁細胞、すなわち、懸濁状態で増殖する細胞であり得る。二重特異性ＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質などの二重特異性抗原結合タンパク質を生成する目的のためには、宿主細胞は好ましくは哺乳類細胞である。
特定の一実施形態では、宿主細胞は、幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞である。
上記によれば、一実施形態では、本発明は、本明細書で上に定義される本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、または核酸、または本発明のベクターを含んでなる宿主細胞に言及し、その中では、前記宿主細胞は、好ましくはａ）間葉系幹細胞またはｂ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの組換え発現のための細胞である。
特に、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のいくつかの発現では、発現ベクターは、どちらのタイプであってもよく、その中では、抗体重鎖およびα鎖などの第１のポリペプチドをコードする遺伝子と、抗体軽鎖やβ鎖などの第２のポリペプチドをコードする遺伝子が別々のベクター上に存在するタイプと、双方の遺伝子が同じベクター上に存在するタイプ（タンデム型）がある。二重特異性抗原結合タンパク質発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、および動物細胞における抗体ＨとＬ鎖の発現レベル間のバランスに関して、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが好ましい（Ｓｈｉｔａｒａ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９４ Ｊａｎ．３；１６７（１－２）：２７１－８）。タンデム型ヒト化抗体発現ベクターとの例しては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号パンフレット）、ｐＥＥ１８などが挙げられる。
一実施形態では、このような組換え宿主細胞は、本発明の少なくとも１つの抗原結合タンパク質の生成に使用され得る。
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を生成する方法
本発明はまた、
ａ．適切な宿主細胞を提供するステップと、
ｂ．本発明の二重特異性抗原結合タンパク質をコード化するコード配列を含んでなる遺伝子コンストラクトを提供するステップと、
ｃ．前記遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に、好ましくは生体外または生体外で導入するステップと、
ｄ．前記適切な宿主細胞によって前記遺伝子コンストラクトを発現させるステップと、任意選択的に、
ｅ．前記抗体を発現および／または分泌する細胞を選択するステップと
を含んでなる本明細書で上に定義される抗原結合タンパク質を生成する方法にも関する。
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、本明細書で上に対応する項で定義される通りである。
本明細書における「遺伝子コンストラクト」は、宿主におけるコード領域の発現を可能にする核酸を意味、したがって、上記のベクターまたはＲＮＡなどの核酸を指す。
特定の一実施形態では、方法はさらに、前記適切な宿主細胞上で、前記二重特異性抗原認識コンストラクトを細胞表面提示させるステップをさらに含んでもよい。
その他の好ましい実施形態では、ｂ）の遺伝子コンストラクトは、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質をコード化する核酸を含んでなる。このような核酸は、本明細書で上に「核酸、ベクター、および組換え宿主細胞」の項で定義される通りである。
関連する実施形態では、遺伝子コンストラクトは、前記コード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含んでなる、発現コンストラクトである。
関連する実施形態では、遺伝子コンストラクトは、形質転換、形質導入または形質移入を用いて、適切な宿主中に導入される。形質転換、形質導入または形質移入は、本明細書で上の項に定義される。
望ましくは、遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するための形質導入システムは、本明細書で上に、核酸、ベクター、および組換え宿主細胞の項に記載されているレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターシステムである。このようなシステムは、当業者に周知である。
一実施形態では、方法は、宿主細胞からの二重特異性抗原結合タンパク質の単離と精製、および任意選択的に、Ｔ細胞における二重特異性抗原結合タンパク質の再構成をさらに含んでなる。
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、限定されることなく、化学的、生物学的、遺伝が的または酵素的技術のいずれか単独または組み合わせなど、当該技術分野で公知の任意の技術によって生成されてもよい。
抗体またはそれらの断片およびＴＣＲまたはそれらの断片などのポリペプチドを生成するための標準技術は当該技術分野で公知であり、これらの技術は、当業者によって本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を生成するために用いられ得る。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、特に市販のペプチド合成装置（カリフォルニア州フォスターシティーのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって製造されたものなど）を使用して、製造業者の指示に従って合成され得る。代案としては、二重特異性抗体またはそれらの断片およびＴＣＲまたはそれらの断片などの本発明の抗原結合タンパク質は、当該技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって合成され得る。例えば、所望の（ポリ）ペプチドをコード化するＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、このようなベクターを所望のポリペプチドを発現する適当な真核生物または原核生物の宿主に導入した後に、ＤＮＡ発現産物として断片を得ることができ、その後、周知の技術を用いてそれから断片が分離され得る。
一例では、すなわちＴＣＥＲ（登録商標）二重特異性分子の場合は、ＶＨとＶＬおよび可変α（Ｖα）と可変β（Ｖβ）の様々な組み合わせをコードするＤＮＡ配列、ならびにリンカーをコードする配列が、例えば、遺伝子合成によって得られてもよい。得られたＤＮＡ配列は、例えば、ヒトＩｇＧ４［受入番号：Ｋ０１３１６］およびＩｇＧ１［受入番号：Ｐ０１８５７］に由来するヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインをそれぞれコードする発現ベクターに、フレーム内でクローン化され、さらに操作されてもよい。Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｖ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ｂｙ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉｎｔｏ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３，５４５１ － ５４５９）によって記載された方法に従って、追加的な鎖間ジスルフィド結合の安定化ありまたはなしで、ＣＨ３ドメインに「ノブ・インツー・ホール」の変異を組み込むため；ＣＨ２のＮ－グリコシル化部位を除去する（例えば、Ｎ２９７Ｑ変異）ため；Ｆｃ－サイレンシング変異を導入するため；またはＶＬおよびＶＨに、それぞれ追加的なジスルフィド結合安定化を導入するために、遺伝子操作が実施されてもよい。
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーなどの免疫グロブリン精製手順によって、培養培地から適切に分離される。
一実施形態では、本明細書における発現した抗原結合タンパク質またはポリペプチドの回収は、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＬクロマトグラフィー、κ選択クロマトグラフィー、および／またはサイズ排除クロマトグラフィー、好ましくはプロテインＬクロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィー、より好ましくはプロテインＬ－クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを実施することを指す。
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を生成するための方法は、当該技術分野で周知の組換えＤＮＡおよび遺伝子形質移入技術を伴う（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）および特許文献米国特許第５，２０２，２３８号明細書；および米国特許第５，２０４、２４４号明細書を参照されたい）。
さらに、従来の組換えＤＮＡに基づいてヒト化抗体を生成するための方法、および遺伝子形質移入技術は、当該技術分野で周知であり（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ＭＳ．ｅｔ ａｌ．１９８５を参照されたい）、二重特異性本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の生成に容易に適用され得る。
一例では、本発明の組換え抗原結合タンパク質の発現のためのベクターは、例えば、ＨＣＭＶ由来のプロモーター要素であるｐＵＣ１９誘導体によって制御される、単シストロン性として設計された。プラスミドＤＮＡは、例えば、標準的な培養方法に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増幅され、引き続いて、市販のキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）を使用して精製された。精製されたプラスミドＤＮＡは、例えば、製造業者の指示に従って（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）システム；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、または電気穿孔システム（ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ）を使用して、ＣＨＯ－Ｓ細胞の一過性形質移入に使用された。形質移入されたＣＨＯ－細胞は、例えば、３２℃～３７℃で６～１４日間培養され、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）ＦｅｅｄまたはＣｅｌｌｂｏｏｓｔ ７ａおよび７ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標））溶液が１～２回供給された。
調整された細胞上清は、例えば、Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（登録商標）Ｌａｂ Ｆｉｌｔｅｒ Ａｉｄ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を使用した濾過（０．２２μｍ）によって清澄化された。二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、親和性およびサイズ排除クロマトグラフィーをインラインで実行するように装備された、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ ２５ Ｌ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製された。アフィニティークロマトグラフィーは、例えば、プロテインＡまたはＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、標準的なアフィニティークロマトグラフィープロトコルに従って実施された。例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ １６／６００カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、アフィニティカラムからの溶出（ｐＨ２．８）直後に、サイズ排除クロマトグラフィーが実施され、標準的なプロトコルに従って高純度の単量体タンパク質が得られた。タンパク質濃度は、例えば、ＮａｎｏＤｒｏｐシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、予測されたタンパク質配列に従って計算された吸光係数を用いて判定された。必要に応じて、Ｖｉｖａｓｐｉｎデバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、濃度が調節された。最後に、精製された分子は、例えば、２～８℃の温度で約１ｍｇ／ｍＬの濃度のリン酸緩衝生理食塩水中に保存された。
精製された二重特異性抗原結合タンパク質の品質は、例えば、Ｖａｎｑｕｉｓｈｕ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍ内で、３００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で実行される、例えば、ＭａｂＰａｃ ＳＥＣ－１カラム（５μｍ、４ｘ３００ｍｍ）上のＨＰＬＣ－ＳＥＣによって判定された。
医薬組成物
本発明は、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、または本発明の宿主細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物にさらに言及する。
本発明はまた、薬剤として使用するための本発明による二重特異性抗原結合タンパク質にも関する。本発明はまた、薬剤として使用するための本発明の医薬組成物にも関する。
本発明はまた、薬剤の製造における、本発明による二重特異性抗原結合タンパク質および／または本発明の医薬組成物の使用にも関する。
「医薬組成物「または「治療用組成物」という用語は、本明細書の用法では、対象に適切に投与され場合に、望ましい治療的効果誘導できる化合物または組成物を指す。
いくつかの実施形態では、対象はまた、患者と称されることもある。
このような治療薬または医薬組成物は、投与様式との適合性のために選択された薬学的または生理学的に許容される調合剤との混合物中に、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の治療的有効量を含んでもよく、または治療薬をさらに含んでもよい。
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、通常、無菌の医薬組成物の一部として供給され、これは、通常、薬学的に許容可能な担体を含む。
「薬学的に」または「薬学的に許容可能な」は、哺乳類、特にヒトに投与したときに、適宜、有害反応、アレルギー反応、その他の不都合な反応を生じない分子体および組成物に言及する。薬学的に許容可能な担体または賦形剤は、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、または任意のタイプの製剤助剤を指す。
「薬理的に許容可能な担体」はまた、「薬学的に許容可能な希釈剤」または「薬学的に許容可能なビヒクル」と称されることもあり、生理学的適合性である、溶剤、増量剤、安定剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれてもよい。したがって、一実施形態では担体は、水性担体である。
別の態様では、水性担体は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質と組み合わされた場合、例えば、改善された溶解性、効力、および／または改善された免疫療法などの、改善された特性を付与できる。
医薬組成物の形態、投与経路、投与量、およびレジメンは、必然的に、治療される病状、疾患の重症度、患者の年齢、体重、および性別、所望の治療期間などに依存する。この医薬組成物は、（それを患者に投与する所望の方法に応じて）任意の適切な形態であってもよい。それは、単位用量剤形で提供されてもよく、一般に密封容器内に提供され、キットの一部として提供されてもよい。このようなキットには、通常、（必ずしも必要ではないが）使用説明書が含まれる。それは、複数の前記単位用量剤形を含んでもよい。
生物学的半減期などの経験的考察事項は、一般的に投与量の決定に寄与する。投与の頻度は、治療の過程で判定および調整されてもよく、がん細胞の数を低減すること、がん細胞の減少を維持すること、がん細胞の増殖を低減すること、またはがん細胞を滅殺することに基づいている。代案としては、二重特異性抗原結合タンパク質の持続的な徐放性製剤が適切であってもよい。徐放を達成するための様々な製剤および装置が当該技術分野で公知である。
一実施形態では、抗原結合タンパク質の投与量は、１回または複数回の投与を受けた個人において経験的に決定され得る。個人には、抗原結合タンパク質の漸増投与量が与えられる。抗原結合タンパク質の有効性を評価するために、がん細胞の状態のマーカーが追跡され得る。これらとしては、ＦＡＣＳ、その他の画像技術によるがん細胞増殖および細胞死の直接測定；およびこのような測定によって評価される健康の改善、または認められた試験または生存期間の延長によって測定される生活の質の向上が挙げられる。投与量は、個人、疾患の病期、および使用されている過去および並行治療に応じて変動することが当業者には明らかであろう。
特に、医薬組成物は、注射できる製剤に薬学的に許容可能なビヒクルを含有する。これらは、特に等張性、滅菌、生理食塩水（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなど、またはこのような塩の混合物）、または乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であってもよく、これは滅菌水または生理食塩水の添加時に、注射液の構成が可能になる。
医薬組成物を調製するために、本発明の有効量の二重特異性抗原結合タンパク質は、薬学的に許容可能な担体または水性媒体に溶解または分散されてもよい。
注入用途に適した医薬品形態としては、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、落花生油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌の注射液または分散液の即時調合のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性でなければならない。それは、製造および保管の条件下で安定している必要があり、細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護されている必要がある。
遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で、調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、およびに油中で調製され得る。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐ保存料を含有する。
本発明の抗原結合タンパク質は、薬学的に許容可能な塩を使用して、中性または塩の形態の組成物に調合され得る。
滅菌注射液は、必要に応じて、上に列挙されるその他の様々な成分と共に、適切な溶媒に必要な量の活性化合物を組み込んだ後、濾過滅菌によって調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基礎的分散媒および上に列挙されたものからの必要なその他の成分を含有する、滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法としては、活性成分と、あらかじめ滅菌濾過された溶液からの任意の追加的な所望の成分との粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥技術が挙げられる。
直接注射のためのより濃縮された、または高度に濃縮された溶液の調製もまた想定され、その中では、溶媒としてのＤＭＳＯの使用は、非常に迅速な浸透をもたらし、小さな腫瘍領域に高濃度の活性剤を送達することが想定される。
製剤化されると、溶液は、投与剤形と適合性のある様式で、治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、上記の注射液のタイプなどの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた使用され得る。
治療法と使用法
本発明者らは、ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）またはＵＣＨＴ１（Ｖ１７）のいずれかをリクルーターとして組み合わせたＭＡＧ－００３標的抗原結合タンパク質について、特にＴＣＥＲ（登録商標）形態で、異なるＭＡＧ－００３陽性がん細胞株に対するそれらの分子の細胞傷害活性を、生体外で実験の項の実施例２に示している。さらに本発明者らは、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現するが、ＭＡＧ－００３などのＴＡＡペプチドを提示しない細胞株においては、二重抗原結合タンパク質によってわずかな溶解しか誘導されなかったことから、前記細胞傷害活性が高度に特異的であり、ＭＡＧ－００３陽性細胞などのＴＡＡ陽性細胞に限られることを実証している。したがって、実施例は、本発明の文脈で開示されるＣＤ３に対して向けられた低親和性結合ドメインを高親和性ＴＣＲ可変ドメインと組み合わせることの技術的利点を実証する。実施例では、このようなＴＣＲ可変ドメインはＴＡＡＭＡＧＥ－Ａに特異的に結合するが、標的としてのＴＡＡの文脈で例示された二重特異性抗原結合タンパク質について観察された利点が、ＴＡＡの代わりに、ウイルス抗原性ペプチドまたは細菌抗原性ペプチドなどの別のＴＡを標的化する二重特異性抗原結合タンパク質にも移転可能であることが、当業者であれば理解できるであろう。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は対象に投与されると、ＴＡ／ＭＨＣ複合体提示細胞などの標的細胞に結合して、内因性エフェクター細胞を動員し、ＣＤ３を介してそれらに結合して、それらを活性化し、したがってそれらのエフェクター細胞を標的細胞、特に標的がん細胞の近くに局在化させて、前記標的細胞の滅殺、特に抗がん活性を達成することが、当業者であれば理解できるであろう
一態様では、抗原結合タンパク質の標的細胞への結合、およびエフェクター細胞のＣＤ３への結合は、免疫応答を誘発し、このような応答は、生体外または生体内でのエフェクター機能の増殖および活性化を指してもよい。例えば、ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞では、エフェクター機能は、ペプチドパルスされた、ペプチド前駆体パルスされた、または天然にペプチドを提示する、標的細胞の溶解；好ましくはペプチドによって誘導されるインターフェロン－γ、ＴＮＦ－α、またはＩＬ－２であるサイトカインの分泌；例えば、ペプチドによって誘導されるグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌；または脱顆粒であってもよい。
したがって、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、特にＴＣＥＲ（登録商標）分子は、例えば、様々な形態のがんおよび／または感染症の状態をはじめとする多種多様な状態を治療するために使用されてもよい。本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトおよび／または非ヒト哺乳類の動物、特にヒトにおける治療目的で使用されてもよい。
一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、罹患細胞に結合し、それらの細胞表面にＴＡペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する罹患細胞の増殖を低減しおよび／または滅殺し得る。好ましい一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、腫瘍細胞に結合し、それらの細胞表面にＴＡＡペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する腫瘍細胞の増殖を低減しおよび／または滅殺し得る。二重特異性抗原結合タンパク質は、生理学的（例えば、生体内）条件での結合を促進する濃度で投与されることが理解される。
したがって、一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、結腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、膵臓、腎臓などの異なる組織の腫瘍細胞に対する免疫療法に使用され得る。別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、腫瘍細胞に結合し、その増殖を低減しおよび／または殺滅し得る。
したがって、本発明は、それを必要とする対象に、本発明に従って、本明細書で上に「二重特異性抗原結合タンパク質」、「核酸」または「医薬組成物」の項で定義される、治療有効量の二重特異性抗原結合タンパク質、核酸またはベクター、宿主細胞または医薬組成物を投与することを含んでなる、増殖性疾患または障害を治療または予防する方法に関する。
特定の実施形態では、本発明は、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を対象に投与することを含んでなる、疾患を有する対象を治療する方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、任意選択的に宿主細胞において発現される、本発明の抗原認識コンストラクトを含んでなる組成物を対象に投与することを含んでなる、疾患を有する対象において免疫応答を誘発する方法に言及する。
一実施形態では、本発明は、対象における疾患を治療または予防するための、本発明による二重特異性抗原結合タンパク質、核酸またはベクター、宿主細胞または医薬組成物の使用に言及する。
一実施形態では、前記方法で言及される免疫応答は、細胞傷害性Ｔ細胞応答である。前記細胞傷害性Ｔ細胞応答は、エフェクター細胞上に存在するＣＤ３への抗原結合タンパク質の結合によって、ＴＡ抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体への結合によって、ひいてはエフェクター細胞と標的細胞を近接させることによって誘導される。
本発明はさらに、疾患の診断、予防、および／または治療で使用するための、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、本発明の核酸または本発明のベクター、本発明の宿主細胞または本発明の医薬組成物に言及する。
本発明はさらに、疾患の診断、予防、および／または治療のための薬剤の製造のための、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の使用、本発明の核酸または本発明のベクター、本発明の宿主細胞、または本発明の医薬組成物の使用にさらに言及する。
「対象」または「個体」という用語は同義的に使用され、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳類、好ましくはヒトであってもよい。
本発明の文脈における「治療する」または「治療」という用語は、治療的使用（すなわち、所与の疾患を有する対象における）を指し、このような障害または病状の１つまたは複数の症状の進行を逆転させ、緩和し、阻害することを意味する。したがって、治療は、疾患の完全な治癒をもたらす治療だけでなく、疾患の進行を遅らせ、および／または対象の生存を延長する治療も指す。
「予防する」とは、予防的使用（すなわち、所与の疾患に罹り易い対象における）を意味する。
「治療を必要とする」という用語は、既に障害を有する対象、ならびに障害が予防されるべき対象を指す。したがって、一実施形態では、対象は患者である。
一実施形態では、「疾患」または「障害」は、本発明の抗原結合タンパク質による治療から利益を得るであろう任意の病状である。一実施形態では、これは、対象を問題の障害に罹り易くする病的状態も含めた、慢性および急性の障害または疾患を含む。特に、本発明の文脈で言及される疾患は、増殖性疾患、またはウイルスまたは細菌によって引き起こされる疾患であってもよい。「ウイルスまたは細菌によって引き起こされる疾患」はまた、ウイルスまたは細菌感染症と称されてもよい。本発明の文脈において、疾患を引き起こすウイルスは、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウイルス、好ましくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）から構成される群から選択されてもよい。本発明の文脈において、疾患を引き起こす細菌、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）など。二重特異性抗原結合タンパク質が、例えば、ＨＩＶなどのウイルス抗原性ペプチドを標的化する場合、二重特異性抗原結合タンパク質は、ＨＩＶの治療に使用するためのものであることが、当業者であれば理解できるであろう。したがって、ウイルスまたは細菌の抗原性ペプチドＴＡ－Ｃを標的化する二重特異性抗原結合タンパク質は、このように、前記抗原性のウイルスまたは細菌抗原性ペプチドがそれに由来する、ウイルスまたは細菌の治療に使用するためのものである。
がんなどの「増殖性疾患」は、細胞の無制御および／または不適切な増殖を伴う。
一実施形態では、増殖性障害または疾患は、例えば、腫瘍疾患のがん細胞または腫瘍細胞におけるＴＡ、より具体的にはＴＡＡの発現によって特徴付けられる腫瘍疾患である。
したがって、特に好ましいがんは、ＴＡ陽性がん、特にＴＡＡ陽性がんである。
さらなる実施形態では、増殖性障害または疾患は、例えば、前記腫瘍疾患のがんまたは腫瘍細胞における、ＭＡＧＥＡ４および／またはＭＡＧＥＡ８の発現によって特徴付けられる腫瘍疾患である。
したがって、特に好ましいがんは、ＭＡＧＥＡ４および／またはＭＡＧＥＡ８陽性がんである。
さらなる実施形態では、増殖性障害または疾患は、例えば、前記腫瘍疾患のがんまたは腫瘍細胞における、ＰＲＡＭＥの発現によって特徴付けられる腫瘍疾患である。
したがって、特に好ましいがんはＰＲＡＭＥ陽性がんである。
本発明の文脈において、例えば、本明細書で上に「定義」の項で定義されるＴＡＡペプチドの１つなどの関連ＴＡＡペプチド、例えば、ＭＡＧ－００３ペプチドまたはＰＲＡＭＥ－００４が、ＮＣＩによるガイドラインに従って全てのがんの９８％超で提示される場合、がんは、「ＭＡＧＥＡ４および／またはＭＡＧＥＡ８陽性」または「ＰＲＡＭＥ陽性」などの「ＴＡＡ陽性」であると見なされる。ここで挙げられているあらゆるその他の適応症では、これらのがんの治療における標準であることから生検が実施され得て、ペプチドはＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）および関連方法に従って同定され得る（それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第０３／１００４３２号パンフレット；国際公開第２００５／０７６００９号パンフレット；国際公開第２０１１／１２８４４８号パンフレット；国際公開第２０１６／１０７７４０号パンフレット、米国特許第７，８１１，８２８号明細書、米国特許第９，７９１，４４４号明細書、および米国特許第２０１６／０１８７３５１号明細書による）。一実施形態では、がんは、例えば、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を使用することによって、容易にアッセイされる（すなわち、診断される）。抗原結合タンパク質を使用してがんを発現する抗原を同定する方法は、当業者に知られている。
一実施形態では、がんは、非小細胞肺がんや小細胞肺がんなどの肺がん、肝臓がん、頭頸部がん、皮膚がん、腎細胞がん、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん腫、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、骨肉腫、および食道がんからなるリストから選択される。
がん治療の指針を提供するテキストとしては、Ｃａｎｃｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ，Ｅｄｓ．Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９９３）がある。適切な治療アプローチは、特定のタイプのがん、および関連分野で認識されているように、患者の全身状態などのその他の要因に応じて選択される。本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、それ自体で使用され得て、またはがん患者の治療に典型的に使用されるその他の抗がん剤を使用する治療レジメンに加え得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、化学療法剤、非化学療法剤、抗腫瘍剤、および／または放射線、好ましくは化学療法剤など、がん治療に広く使用されている様々な薬剤および治療法と同時に、その前に、またはその後に投与され得る。
さらなる実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質はまた、感染性ウイルス疾患または細菌疾患などの感染性疾患を治療するために使用され得て、その中では、ウイルス性疾患は、例えば、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス感染症（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウイルス、好ましくはＨＩＶ、ＨＢＶ、インフルエンザ、およびＨＣＭＶからなる群から選択され、その中では、細菌性疾患は、例えば結核である。
本発明の抗原結合タンパク質またはその医薬組成物は、それ自体で投与され得て、またはこのような感染症を治療するために使用される他の治療薬の投与と同時に、前に、または後に投与され得る。
本明細書における「診断」は、医学的診断を意味し、いずれの疾患または病状が人の症状および徴候を説明するかを判定することを指す。
二重特異性抗原結合タンパク質またはその医薬組成物の「治療有効量」とは、任意の医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で、前記増殖性疾患を治療するのに十分な量の二重特異性抗原結合タンパク質を意味する。しかし、本発明の抗原結合タンパク質、核酸またはベクター、宿主細胞または医薬組成物の毎日または毎月の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する特定の治療有効量レベルは、治療される障害または疾患、および障害の重症度；使用される特定の二重特異性抗原結合タンパク質の活性；用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食生活；投与時間、投与経路、および用いられる特定のポリペプチドの排泄速度；治療期間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医学分野で周知の同様の要因をはじめとする様々な要因に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、当業者の技術の範囲内で周知である。
一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質による治療の有効性は、例えば、がんのマウスモデルにおいて、生体内で、例えば、治療群と対照群との間の腫瘍体積の変化を測定することによってアッセイされる。
例えば、本発明の医薬組成物、ベクター、核酸、および細胞は、例えば、実質的に純粋な形態で提供されてもよく、その中では、重量比で少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一タイプの二重特異性抗原結合タンパク質が存在する。
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、本発明の核酸または本発明のベクター、本発明の宿主細胞または本発明の医薬組成物は、任意の実行可能な方法によって投与され得る。
本発明は、抗原結合タンパク質を患者に投与すること含んでなる、患者において標的細胞を殺滅する方法もまた提供する。この方法の文脈において、抗原結合タンパク質は、対象に投与されると、標的細胞およびＣＤ３発現エフェクター細胞に結合し、好ましくは免疫応答を誘発する。
特定の１つのアプローチでは、宿主細胞は、間葉系幹細胞などの幹細胞であってもよく、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を発現するように操作される。この例では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本明細書に記載のＴＣＥＲ（登録商標）である。
したがって、本発明の宿主細胞、好ましくは上記で定義される幹細胞は、治療用組成物の活性成分として使用されてもよい。したがって、本発明はまた、患者において標的細胞を滅殺する方法を提供し、方法は、上記で定義される有効数の宿主細胞、好ましくは間葉系幹細胞を患者に投与することを含んでなる。
宿主細胞または細胞の集団が対象に投与される本発明の方法の目的のために、宿主細胞は、（別の対象からの）同種異系であるか、または対象に対して自系である細胞であり得る。好ましくは、細胞は対象にとって自系である。
宿主細胞が同種異系であり、したがって別の対象からのものである場合、前記別の対象は健康である。
「健康」とは、対象が概して健康良好であり、好ましくは有能な免疫系を有して、より好ましくは容易に検査され検出され得るいかなる疾患にも罹患していないことを意味する。
したがって、宿主細胞は、本明細書で上に「核酸、ベクター、および組換え宿主細胞」の項に記載されるように、本発明による核酸および／またはベクターで形質転換、形質導入、または形質移入されている。
本発明の抗原結合タンパク質を発現するために宿主細胞が形質転換、形質導入または形質移入される場合、好ましくは、細胞は、二重特異性抗原結合タンパク質を発現できる発現ベクターを含んでなる。宿主細胞が本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を発現すると、宿主細胞は、活性化宿主細胞と称されてもよい。
一態様では、TCR誘発免疫応答またはT細胞応答は、生体外または生体内における、T細胞への二重抗原結合およびTA抗原性ペプチド／MHC複合体、例えばTA-C／MHC複合体への結合によって誘発される、エフェクター機能の増殖および活性化を指してもよい。例えば、ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞では、エフェクター機能は、ペプチドパルスされた、ペプチド前駆体パルスされた、または天然にペプチドを提示する、標的細胞の溶解；好ましくはペプチドによって誘導されるインターフェロン－γ、ＴＮＦ－α、またはＩＬ－２であるサイトカインの分泌；例えば、ペプチドによって誘導されるグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌；または脱顆粒であってもよい。
したがって、本発明のさらなる態様は、前述の本発明の方法によって入手可能な活性化宿主細胞を提供する。
上記方法によって生成される活性化宿主細胞は、標的細胞を選択的に認識してもよい。
本明細書における「標的細胞」は、本明細書で上に「二重特異性抗原結合タンパク質」の項で定義されるＴＡ－Ｃ／ＭＨＣ提示細胞またはＴＡ提示細胞を指す。
好ましい一実施形態、すなわちＴＡ／ＭＨＣ複合体がＴＡＡ／ＭＨＣ複合体である場合は、標的細胞はがん細胞であり、その中では、がんは本明細書で上に定義される通りである。
生体内で、本発明によるＣＤ３陽性エフェクター細胞の標的細胞は、（時にＭＨＣクラスＩＩを発現する）腫瘍細胞であり得て、および／または腫瘍（腫瘍細胞）周囲の間質細胞であり得る（時にＭＨＣクラスＩＩもまた発現する；（Ｄｅｎｇｊｅｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２（２００６）：４１６３－４１７０）。
キット
最後に、本発明はまた、本発明の少なくとも１つの二重特異性抗原結合タンパク質を含んでなるキットを提供する。
一実施形態では、キットは、
ａ）本明細書で上に「二重特異性抗原結合タンパク質」の項で定義される少なくとも１つの本発明の二重特異性抗原結合タンパク質；
ｂ）任意選択的に包装材料、および
ｃ）任意選択的に、前記包装材料内に含まれる、前記二重抗原結合タンパク質が疾患、好ましくはがんの治療に有効であること、または疾患、好ましくはがんの治療のために使用されることを示すラベルまたは包装挿入物
を含んでなる。
関連する実施形態では、本発明の少なくとも１つの抗原結合タンパク質は、単一および／または複数チャンバーのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよび溶解シリンジ）に含有されている。
一実施形態では、本発明は、単回投与投与ユニットを製造するためのキットを包含する。
したがって、一実施形態では、本発明のキットのａ）で言及される本発明の少なくとも１つの二重特異性抗原結合タンパク質は、第１の容器に含有される本発明の乾燥二重特異性抗原結合タンパク質である。次に、キットは、水性製剤を有する第２の容器をさらに含む。
したがって、キットは、
ａ）本明細書で上に「抗原結合タンパク質」の項で定義される本発明の少なくとも１つの乾燥二重特異性抗原結合タンパク質を含んでなる第１の容器、
ｂ）水性製剤を含んでなる第２の容器；
ｃ）任意選択的に包装材料、および
ｄ）任意選択的に、前記包装材料内に含まれる、前記二重抗原結合タンパク質が疾患、好ましくはがんの治療に有効であること、または疾患、好ましくはがんの治療のために使用されることを示すラベルまたは包装挿入物
を含んでなる。
水性製剤は、典型的には、本明細書で上に「医薬組成物」の項で定義される、薬理的に許容可能な担体を含んでなる水溶液である。
関連する実施形態では、「第１の容器」および「第２の」容器は、複数チャンバーのプレフィルドシリンジ（例えば、溶解シリンジ）のチャンバーを指す。
がんは、本発明の文脈において本明細書で上に定義される通りである。
本発明はさらに、本明細書で以下に引用される項目および態様に関する。
さらなる態様では、本発明は、少なくとも２つの抗原結合部位（ＤおよびＢ）を含んでなる二重特異性抗原結合タンパク質に関し、その中では、抗原結合部位ＤはＴＣＲα／βに結合し、その中では、抗原結合部位Ｂは標的抗原性（ＴＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合し、その中では、抗原結合部位Ｄは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなり、その中では、前記ＶＬは配列番号４２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、前記ＶＨは配列番号４３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
前記態様の１つの関連項目において、前記態様の二重特異性抗原結合タンパク質の抗原結合部位Ｄは、ＫＤ（Ｄ）でＴＣＲα／βに結合し、抗原結合部位Ｂは、ＫＤ（Ｃ）で標的抗原性ペプチドＣ（ＴＡ－Ｃ）／ＭＨＣ複合体に結合し、その中では、ＫＤ（Ｄ）／ＫＤ（Ｃ）比は、１を超え、４を超え、６を超え、８を超え、１０を超え、１５を超え、２０を超え、２５を超え、３０を超え、４０を超え、５０を超え、１～１５０の間、４～１４０の間、６～１００の間、８～１００の間、１０～１００の間など、好ましくは１０～１００の間である。
前記態様の１つのさらなる関連項目において、抗原結合部位Ｄは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、好ましくはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いた測定で、３ｎＭ以上、５ｎＭ以上、８ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１２ｎＭ以上、１４ｎＭ以上、１６ｎＭ以上、１８ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、２５ｎＭ以上、３０ｎＭ以上、３５ｎＭ以上、４０ｎＭ以上、４５ｎＭ以上で、好ましくは１０００ｎＭ以下、８００ｎＭ以下、６００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３ｎＭ～１０００ｎＭ、３ｎＭ～６００ｎＭ、５ｎＭ～６００ｎＭ、１０ｎＭ～６００ｎＭ、１２ｎＭ～６００ｎＭ、１４ｎＭ～６００ｎＭ、１６ｎＭ～６０ｎＭ、１８ｎＭ～６００ｎＭ、２０ｎＭ～６００ｎＭの間など、好ましくは５ｎＭ～１００ｎＭのＫＤ（Ａ）でＴＣＲα／βに結合する。
前記態様の１つのさらなる関連項目において、抗原結合部位Ｂは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、好ましくはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いた測定で、１００μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、例えば、０．０１ｎＭ～１５０ｎＭ、０．０５ｎＭ～１５０ｎＭ、０．１ｎＭ～１５０ｎＭ、０．１ｎＭ～１００ｎＭ、０．１ｎＭ～５０ｎＭ、０．１ｎＭ～１０ｎＭ、０．５ｎＭ～１０ｎＭ、０．５ｎＭ～５ｎＭ、好ましくは０．５ｎＭ～５ｎＭのＫＤ（Ｃ）で、標的抗原性ペプチドＣ（ＴＡ－Ｃ）／ＭＨＣ複合体に結合する。
前記態様の１つのさらなる関連項目において、前記抗原結合タンパク質は、正常組織の細胞に対するＥＣ５０値よりも、１００以上、５００以上、１０００以上低い、ＴＡ－Ｃ／ＭＨＣ提示細胞に対するＥＣ５０を有する。
前記態様の１つのさらなる関連項目において、ＴＡ抗原性ペプチドＣは、ウイルスペプチド、細菌ペプチドまたは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチド、好ましくは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドである。
前記態様の１つのさらなる関連項目において、前記抗原結合タンパク質は、正常組織の細胞に対するＥＣ５０値よりも、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上低い、ＴＡ－Ｃ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＥＣ５０を有する。
前記態様の１つのさらなる関連項目において、ＴＡ抗原性ペプチドＣは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドＣであり、その中では、前記ＴＡＡ－Ｃは、配列番号９のアミノ酸配列「ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ」を含んでなるかまたはそれからなるＰＲＡＭＥ抗原ペプチド、または配列番号１０のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチド（式中、ＭＨＣは、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２）などの、配列番号１６２～３１７、配列番号９および１０のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＴＡＡ抗原性ペプチドの群から選択される。
前記態様の１つのさらなる関連項目において、ＴＡ抗原性ペプチドＣは、配列番号１０のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原性ペプチドであり、その中では、類似ペプチドは、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ－００１、ＡＸＩＮ１－００１、ＡＮＯ５－００１、ＴＰＸ２－００１、ＳＹＮＥ３－００１、ＭＩＡ３－００１、ＨＥＲＣ４－００１、ＰＳＭＥ２－００１、ＨＥＡＴＲ５Ａ－００１、ＣＮＯＴ１－００３、ＴＥＰ１－００３、ＰＩＴＰＮＭ３－００１、ＺＦＣ－００１好ましくはＨＥＡＴＲ５Ａ－００１、ＨＥＲＣ４－００１、およびＣＮＯＴ１－００３からなるリストから選択される。
前記態様の１つのさらなる関連項目において、二重特異性抗原結合タンパク質は、二重特異性抗体またはその断片、二重特異性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその断片、または二重特異性一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）または二重特異性一本鎖抗体である。
前記態様の１つのさらなる関連項目において、抗原結合部位Ｂは、抗体またはその断片またはα鎖可変ドメイン（ｖα）およびβ鎖可変ドメイン（ｖβ）またはγ鎖可変ドメイン（ｖγ）またはδ鎖可変ドメイン（ｖδ）、好ましくはα鎖可変ドメイン（ｖα）およびβ鎖可変ドメイン（ｖβ）またはγ鎖可変ドメイン（ｖγ）およびδ鎖可変ドメイン（ｖδ）、好ましくはｖαおよびｖβを含んでなる。
前記態様の１つのさらなる関連項目において、
ｉ）ｖαは、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＳＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号２０、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＱＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号２１、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＥＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＱＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２０、２１、および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくはアミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であり、好ましくは配列番号２３のＣＤＲａ１、配列番号２４のＣＤＲａ２、および配列番号２５のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、その中では、好ましくはアミノ酸配列は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であり、好ましくは配列番号２３のＣＤＲａ１、配列番号２６のＣＤＲａ２、および配列番号２５のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、その中では、好ましくはアミノ酸配列は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であり、好ましくは配列番号２７のＣＤＲａ１、配列番号２６のＣＤＲａ２、および配列番号２５のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、前記第１の可変ドメインのアミノ酸は、好ましくはアミノ酸１９Ｖおよび／または４８Ｋを含んでなり、
ｖβは、アミノ酸配列「ＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩＰＧＨＤＹＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＦＹＦＣＹＧＴＰＣＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦＣＡＳＲＡＤＴＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬ」配列番号３０、または配列番号３０からなるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくはそれぞれ、配列番号３１のＣＤＲｂ１のアミノ酸配列、配列番号３４のＣＤＲｂ２、配列番号３５のＣＤＲｂ３を含んでなり、任意選択的にアミノ酸５４Ｆおよび／または６６Ｃを含んでなり、または
（ｉｉ）ｖαまたはｖγは、配列番号４８のアミノ酸配列、または配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、配列番号４９のＣＤＲａ１、配列番号５０のＣＤＲａ２、および配列番号５１のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、
ｖβまたはｖδは、配列番号４４のアミノ酸配列、または配列番号４４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号４５のＣＤＲｂ１、配列番号４６のＣＤＲｂ２、および配列番号４７のＣＤＲｂ３のアミノ酸配列を含んでなる。
前記態様の１つの項目において、抗原結合タンパ
ク質は、配列番号２８２または２８４のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチドおよび配列番号２８３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチドを含んでなる。
前記態様の１つのさらなる関連項目において、二重特異性抗原結合タンパク質は、
（ｉ）診断薬；
（ｉｉ）治療薬；または
（ｉｉｉ）薬物動態（ＰＫ）修飾部分
の１つまたは複数をさらに含んでなる。
前記態様の１つのさらなる関連項目において、単離核酸は、上記の態様および項目で定義される二重特異性抗原結合タンパク質をコード化する配列を含んでなるか、または核酸ベクターが前記核酸を含んでなる。
前記態様の１つのさらなる関連項目において、組換え宿主細胞は、上記の態様および項目で定義される二重特異性抗原結合タンパク質、または上記の項目で定義される核酸またはベクターを含んでなる。その中では、前記宿主細胞は、好ましくは、ａ）幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞またはｂ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの組換え発現のための細胞である。
前記態様の１つのさらなる関連項目は、上記の態様および項目で定義される二重特異性抗原結合タンパク質、上記の態様および項目で定義される核酸またはベクター、または上記の態様および項目で定義される宿主細胞、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、安定剤および／または賦形剤を含んでなる医薬組成物に言及する。
前記態様の１つのさらなる関連項目は、
ａ．適切な宿主細胞を提供するステップと、
ｂ．上記の態様および項目で定義される二重特異性抗原結合タンパク質をコード化するコード配列を含んでなる遺伝子コンストラクトを提供するステップと、
ｃ．前記遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するステップと、
ｄ．前記適切な宿主細胞によって前記遺伝子コンストラクトを発現させるステップと
を含んでなる、上記の態様および項目で定義される二重特異性抗原結合タンパク質を生成する方法に言及する。
１つのさらなる関連項目において、上記の態様および項目で定義される方法は、適切な宿主細胞からの二重特異性抗原結合タンパク質の単離および精製をさらに含んでなる。
前記態様のもう１つの関連項目は、医療で使用するための、上記の態様および項目で定義される二重特異性抗原結合タンパク質、上記の態様および項目で定義される核酸またはベクター、上記の態様および項目で定義される宿主細胞、または上記の態様および項目で定義される医薬組成物に関連している。
１つのさらなる関連項目において、ウイルスまたは細菌感染症または増殖性疾患、好ましくはがん、より好ましくはＴＡＡ／ＭＨＣ陽性がんなどの疾患の診断、予防、および／または治療で使用するための、上記の態様および項目で定義される二重特異性抗原結合、上記の態様および項目で定義される核酸またはベクター、上記の態様および項目で定義される宿主細胞、または上記の態様および項目で定義される医薬組成物。
本特許出願で使用される定義および実施形態は、変更すべきところは変更して、本明細書の上記の態様および項目に適用される。
本出願を通して、「および／または」という用語は、それが接続する１つまたは複数の状況が発生してもよいことを包含すると解釈されるべき文法的接続詞である。例えば、「このような天然配列タンパク質は、標準的な組換えおよび／または合成方法を使用して調製され得る」という表現は、天然配列タンパク質が、標準的な組換え法と合成法とを使用して調製され得ること、天然配列タンパク質が、標準組換え法を使用して調製され得ること、または天然配列タンパクが、質合成法を使用してが調製され得ることを示す。
さらに、本出願を通して、「含んでなる」という用語は、具体的に言及された全ての機能、ならびに任意選択的で、追加的な、特定されていない機能を包含すると解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、「含んでなる」という用語の使用はまた、具体的に言及された特徴以外の特徴が存在しない（すなわち、「からなる」）実施形態も開示する。
さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、複数を除外しない。特定の措置が相互に異なる従属請求項に記載されているという単なる事実は、これらの措置の組み合わせを有利に使用できないことを示すものではない。
次に、以下の図および実施例を参照して、本発明をより詳細に説明する。本明細書で引用される全ての資料および特許文献は、それらの内容全体が本明細書に参照により援用される。本発明を図示し、前述の説明で詳細に説明してきたが、実施例は例示的または模範的なものであり、制限的なものではないと見なされるべきである。
ＵＣＨＴ１ ＶＬドメインと、同定されたヒトアクセプターフレームワークとのアラインメントを示す。図で同定されるＣＤＲは、Ｃｏｔｈｉａ定義に従って同定される。 ＵＣＨＴ１ ＶＨドメインと、同定されたヒトアクセプターフレームワークとのアラインメントを示す。図で同定されるＣＤＲは、Ｃｏｔｈｉａ定義に従って同定される。 フローサイトメトリーによって測定された、ＰＲＡＭＥ－００４特異的ＴＣＥＲ（登録商標）分子のＪｕｒｋａｔ細胞への濃度依存性結合を示す。 健常ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性ドナーのＰＢＭＣを使用した、代表的なＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）またはＢＭＡ０３１（Ｖ３６）を用いるＭＡＧ－００３特異的ＴＣＥＲ（登録商標）分子は、ＭＡＧ－００３陽性およびＭＡＧ－００３陰性、ならびにオフターゲット陽性腫瘍細胞株で試験された。試験された細胞株（左から右へ）：Ｈ６９５Ｔ、Ａ３７５、Ｔ９８Ｇ、ＢＶ１７３。誤差棒は、三連内の標準偏差を示す。 ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）に基づくＭＡＧ－００３特異的ＴＣＥＲ（登録商標）と共にインキュベートされた、健常細胞上のＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。各細胞傷害性プロットは、ＰＢＭＣとＴＣＥＲ分子の濃度を増加させながら同時インキュベーションした後の、同じ培地の組み合わせにおける初代健常細胞タイプ（白塗り円）のＬＤＨ放出を、対照腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔ（黒塗り円）と比較して示す。ＥＣ５０値に基づいて計算された安全域もまた、示される。 ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）に基づくＭＡＧ－００３特異的ＴＣＥＲ（登録商標）と共にインキュベートされた、健常細胞上のＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。各細胞傷害性プロットは、ＰＢＭＣとＴＣＥＲ分子の濃度を増加させながら同時インキュベーションした後の、同じ培地の組み合わせにおける初代健常細胞タイプ（白塗り円）のＬＤＨ放出を、対照腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔ（黒塗り円）と比較して示す。ＥＣ５０値またはＬＯＥＬのどちらかに基づいて計算された安全域もまた、示される。 導入された点変異の視覚化を示す。ペインＡは、ＵＣＨＴ１重鎖の３１位に新たに導入されたＡｓｐ側鎖と、その空間的に近接した位置にあるＣＤ３εの負電荷側鎖を示す。ペインＢは、ＵＣＨＴ１重鎖の５４位にある野生型Ｔｙｒと置換Ｇｌｎとの双方を示す。芳香族側鎖をより小さな極性アミノ酸で置換することで、ＣＤ３εの４８位にあるＡｓｐの無極性幹との疎水性相互作用が除去される。ペインＣは、ＵＣＨＴ１の重鎖の５４位にある同じＴｙｒをＧｌｕと空間的に近接しているＣＤ３ε（４８Ｄ、４９Ｅ、５０Ｄ、５１Ｄ）上の負に帯電した側鎖で置換することが、ＵＣＨＴ１に新しく導入されたＧｌｕの静電反発を引き起こす可能性が高いことを示す。ペインＤは、ＵＣＨＴ１重鎖の５５位にある野生型Ｌｙｓが、ＣＤ３εの５６位（左側）にあるＳｅｒの主鎖と水素結合（破線）を形成することを示す。前記ＬｙｓをＡｒｇで置換することで、極性相互作用が除去され、さらなる嵩高さが導入され、Ａｒｇ側鎖が歪んだ回転異性体になる（右側）。ペインＥは、ＵＣＨＴ１重鎖の５５位にある同じＬｙｓが、Ｇｌｕで置換されていることを示し；この変異はまた、ＣＤ３εの５６位にあるＬｙｓとＳｅｒの間に形成された水素結合を除去する。さらに、それは、Ａｓｐ４８、Ｇｌｕ４９、Ａｓｐ５０、およびＡｓｐ５１によって形成された、ＣＤ３εの表面上の負に帯電したパッチの空間的に近接して、負に帯電した側鎖を導入する。 ヒト化ＵＣＨＴ１変異型に基づくＴＣＥＲ（登録商標）分子の生産収率と安定性特性の概要を示す。（ｎａ）該当なし、（ｎｄ）実施せず。 図９Ａ：バイオレイヤー干渉法によって測定された、ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中のＭＡＧ－００３に対する、異なるＵＣＨＴ１変異型を含んでなるＴＣＥＲ（登録商標）抗原結合タンパク質の結合曲線を示す。溶液中のＴＣＥＲ（登録商標）分子が濃度を上げながら適用され、ｎＭで示される。図９Ｂ：バイオレイヤー干渉法によって測定された、ＣＤ３δε－Ｆｃの異なるＵＣＨＴ１変異型を含んでなるＴＣＥＲ（登録商標）抗原結合タンパク質の結合曲線を示す。溶液中のＴＣＥＲ（登録商標）分子が濃度を上げながら適用され、ｎＭで示される。 ２人の健常ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性ドナー（ＨＢＣ－９８２およびＨＢＣ－７２０）のＰＢＭＣを使用した、２つの独立したＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。様々な親和性を有するＵＣＨＴ１－変異型を用いて、ＭＡＧ－００３特異的ＴＣＥＲ（登録商標）分子が、ＭＡＧ－００３陽性腫瘍細胞株上で試験された。誤差棒は、三連内の標準偏差を示す。
実施例１：マウスモノクローナルＡｂ ＵＣＨＴ１のヒト化
公開されている方法に従ってＣＤＲ－グラフト化によって、マウスモノクローナル抗体ＵＣＨＴ１のヒト化を実施した。したがって、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲは、Ｃｏｔｈｉａの定義に従って同定した。ＵＣＨＴ１可変ドメインをヒト生殖細胞系列と比較する配列アラインメントを作成した。全体的な配列同一性、一致する界面位置、および同様に分類されたＣＤＲ標準位置に基づいて、軽鎖と重鎖のそれぞれに対する最も有望なアクセプターフレームワークとして生殖細胞系を同定し、軽鎖ではＶＫ１－Ｏ１８、重鎖ではＶＨ－１－４６であった。Ｊセグメント遺伝子をＦＲ４上の親配列と比較し、ＪセグメントＪＫ１とＪＨ４をそれぞれ軽鎖と重鎖のために選択した。
親フレームワークとアクセプターフレームワークとの間で残基が異なる、全ての位置のリストを作成した。全ての位置を分析し、単独で、およびその他の潜在的な置換の文脈で検討した。各位置を中性、重大、または貢献として格付けし、ヒト化変異型でどの残基を置換および評価するかについての提案を行った。潜在的なヒト化変異型配列は、Ｅｐｉｂａｓｅ（商標）（Ｌｏｎｚａ）を使用してスクリーニングした。各エピトープまたはエピトープのクラスターは、エピトープを除去するか、または予測される免疫原性をさらに低減するかどちらかの、置換について分析した。さらに、ＣＤＲ内の翻訳後修飾の潜在的な部位を同定し、それぞれの改善を提案した。合計すると、これにより、４つの異なるＶＨドメインと５つの異なるＶＬドメインを作製した。したがって、ＵＣＨＴ１の１７のヒト化変異型を作製した。全ての変異型は、ＣＨＯ細胞でＦａｂ分子として発現された。発現されたタンパク質を精製し、発現力価、凝集体レベル、およびＪｕｒｋａｔ細胞への結合のＥＣ５０値に従って格付けした。これらの結果に基づいて、配列番号１３７および配列番号１４５によって定義されるヒト化ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）を本発明者のＴＣＥＲ（登録商標）分子の確立のために選択した。
ヒト化ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）の動員ドメインを利用してＰＲＡＭＥ－００４（配列番号９）を構築し、配列番号１７１および配列番号１７０またはヒト化ＢＭＡ０３１（Ｖ１０）を含む分子を得て、それぞれ配列番号１６８および配列番号１６９が得られた。組換えタンパク質の発現のためのベクターは、ＨＣＭＶ由来のプロモーター要素であるｐＵＣ１９誘導体によって制御される単シストロン性として設計した。プラスミドＤＮＡを標準的な培養方法に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増幅し、引き続いて、市販のキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。精製されたプラスミドＤＮＡは、製造業者（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）システム；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指示に従って、ＣＨＯ－Ｓ細胞の一過性形質移入に使用した。形質移入されたＣＨＯ細胞を３２℃～３７℃で６～１４日間培養し、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）供給液を１～２回栄養供給した。
調整された細胞上清を遠心分離（４０００ｘｇ；３０分）によって回収し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。二重特異性抗原結合タンパク質は、親和性およびサイズ排除クロマトグラフィーをインラインで実行するように装備された、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ ２５ Ｌ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。アフィニティークロマトグラフィーは、標準的なアフィニティクロマトグラフィープロトコルに従って、プロテインＡカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で実施した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ １６／６００カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して、アフィニティカラムからの溶出（ｐＨ２．８）直後にサイズ排除クロマトグラフィーを実施し、標準的なプロトコルに従って高純度の単量体タンパク質を得た。タンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、予測されたタンパク質配列に従って計算された吸光係数を用いて判定した。必要に応じて濃縮し、Ｖｉｖａｓｐｉｎデバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用してバッファー交換を実施した。最後に、精製された分子を２～８℃の温度で約１ｍｇ／ｍＬの濃度のリン酸緩衝生理食塩水中に保存した。
エフェクター細胞に対するこれらのＴＣＥＲ（登録商標）分子の結合親和性をフローサイトメトリーによって評価した。したがって、ＴＣＥＲ（登録商標）の濃度を上げながら、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ３＋およびＴＣＲａｂ＋）をインキュベートした。洗浄後、ＴＣＥＲ（登録商標）分子に結合した細胞をＰＥ標識二次試薬を使用して染色した。（＃７０９－１１６－０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。細胞は、最終的にＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（登録商標）ｉＱｕｅ Ｃｅｌｌ Ｓｃｒｅｅｎｅｒで分析した。４つの独立した実験の１つの結果を図３に示し、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＰＲＡＭＥ－００４特異的ＴＣＥＲ（登録商標）分子の濃度依存的な結合が実証される。ＵＣＨＴ１ベースのＴＣＥＲ（登録商標）分子が約２～３ｎＭのＥＣ５０の結合を示す一方で、ＢＭＡ０３１ベースのＴＣＥＲ（登録商標）分子は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して少なくとも５０～１００倍弱い結合を示すことは明らかである。
実施例２：異なる親和性を有するリクルーターを使用した細胞傷害性原理の証明
Ｔ細胞受容体（配列番号２０および配列番号３０）の操作された可変ドメインと、それぞれ、ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）（配列番号１３７と配列番号１４５）またはＢＭＡ０３１（Ｖ３６）（配列番号４２と配列番号４３）とのどちらかの可変ドメインとをＴＣＥＲ（登録商標）コンストラクト内で組み合わせることによって、ペプチドＭＡＧ－００３を標的化する抗原結合タンパク質抗原結合タンパク質を作製した。
それぞれのＴＣＥＲ（登録商標）分子の発現のためのベクターは、ＨＣＭＶ由来のプロモーター要素であるｐＵＣ１９誘導体によって制御される単シストロン性として設計した。プラスミドＤＮＡを標準的な培養方法に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増幅し、引き続いて、市販のキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。電気穿孔システム（ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ）を使用するＣＨＯ－Ｓ細胞の一過性形質移入のために、精製したプラスミドＤＮＡを使用した。形質移入されたＣＨＯ細胞を３２℃～３７℃で１０～１２日間培養し、Ｃｅｌｌｂｏｏｓｔ ７ａおよび７ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標））溶液を１～３回供給した。
調整された細胞上清は、Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（登録商標）Ｌａｂ Ｆｉｌｔｅｒ Ａｉｄ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を利用した濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。二重特異性抗原結合タンパク質は、親和性およびサイズ排除クロマトグラフィーをインラインで実行するように装備された、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ ２５ Ｌ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。アフィニティークロマトグラフィーは、標準的なアフィニティクロマトグラフィープロトコルに従って、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲＥまたはプロテインＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で実施した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ ２６／６００カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して、アフィニティカラムからの溶出（ｐＨ２．８）直後にサイズ排除クロマトグラフィーを実施し、標準的なプロトコルに従って高純度の単量体タンパク質を得た。タンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、予測されたタンパク質配列に従って計算された吸光係数を用いて判定した。必要に応じて、Ｖｉｖａｓｐｉｎデバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、濃度が調節された。最後に、精製された分子を２～８℃の温度で約１ｍｇ／ｍＬの濃度のリン酸緩衝生理食塩水中に保存した。
ＭＡＧ陽性腫瘍細胞株とＭＡＧ陰性腫瘍細胞株に対する、二重特異性分子の細胞傷害活性をそれぞれＬＤＨ放出アッセイで分析した。したがって、ＴＣＥＲ（登録商標）分子の濃度を増加させながら、細胞表面上に可変量のＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３を提示する腫瘍細胞株を健常ドナーから単離したＰＢＭＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２＋）と同時インキュベートした。４８時間後、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用して、標的細胞株の溶解を測定した。
このようなアッセイの例示的な結果を図（実施例２）に示す。結果として得られたＥＣ５０値を表５に要約する。
表5：異なる動員抗体を比較する殺滅アッセイのEC50値の概要
Figure 2022543387000006
これらの結果は、ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）ベースの分子と比較してＢＭＡ０３１（Ｖ３６）ベースのＴＣＥＲ（登録商標）分子の効力が低下していることを示す（それぞれ、ターゲットの高発現細胞株上で２３倍、ターゲットの低発現細胞株で９６倍）。ＥＣ５０値に基づいて、安全域は、上の定義の項で説明したように計算され得る。簡潔に述べると、安全域は、オフターゲット発現細胞の殺滅のＥＣ５０と、標的（ＴＡＡ）発現細胞の殺滅のＥＣ５０の比率として定義される。これは、ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）ベースのＴＣＥＲ（登録商標）がおよそ４９倍の安全域を示すことを意味する一方で、ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）ベースのＴＣＥＲ（登録商標）は、およそ３１２倍の安全ウィンドウの増加を示す（オフターゲット発現腫瘍細胞株と標的（ＴＡＡ）高発現腫瘍細胞株との比較）。
これらの発見は、一般に、低親和性の動員ドメインの利用が、標的とオフターゲットとの間の識別を改善し、それによって安全域を増加させてもよいことを示唆した。この仮説のさらなる検証のために、初代健常組織細胞（ＨＬＡ－Ａ＊０２＋）に対するＭＡＧ－００３特異的ＴＣＥＲ（登録商標）分子の細胞傷害活性細胞を評価した。この目的を達成するために、１０：１のＥ：Ｔ比での、１１の異なる初代健常組織細胞（ＨＬＡ－Ａ＊０２＋）と健常ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナーからのＰＢＭＣエフェクター細胞との共培養中において、ＴＣＥＲ（登録商標）濃度を上げて、ＬＤＨを測定した。細胞は、初代組織細胞特異的培地と最適Ｔ細胞培地との５０％混合物中で同時インキュベートした。安全域を判定するために、初代細胞のそれぞれの培地の組み合わせ、および異なる培地によって引き起こされるバイアスを排除するための１００％最適なＴ細胞培地中で、ＴＣＥＲ（登録商標）分子を同一の設定で、ＭＡＧ－００３陽性腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔと共に同時インキュベートした。共培養の４８時間後、上清を採取し、ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＬＤＨ放出を測定することによって、細胞溶解を分析した。
図５および図６では、各細胞傷害性プロットは、ＰＢＭＣとＴＣＥＲ分子の濃度を増加させながら同時インキュベーションした後の、同じ培地の組み合わせにおける初代健常細胞タイプ（白塗り円）のＬＤＨ放出を、対照腫瘍細胞株Ｈｓ５Ｔ（黒塗り円）と比較して示す。図５は、ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）ベースのＭＡＧ－００３特異的ＴＣＥＲ（登録商標）分子の結果を要約する。鼻上皮細胞とＰＢＭＣを除いて、試験された全ての細胞タイプで強い反応性が検出可能であり、それぞれのＥＣ５０値が判定され得た。ＥＣ５０値に基づいて、安全域は、上で定義の項で説明されるように計算した。ｘ倍の安全域を図中に示す。ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）ベースのＴＣＥＲ（登録商標）の場合。星状細胞（４８倍）、皮膚微小血管内皮細胞（９４倍）、および間葉系幹細胞（１７０倍）について、最も重要な安全域を判定した。
ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）ベースのＴＣＥＲ（登録商標）分子の場合、健常初代細胞に対する全ての応答が低すぎて、ＥＣ５０は計算され得なかった。それに代えて、本発明者らは、カットオフ値を超える応答を伴う最初のＴＣＥＲ（登録商標）濃度として判定された最小影響量（ＬＯＥＬ）に基づいて、安全域を定義した。
（［全ての三つ組からの標準偏差×３］＋［ＴＣＥＲ制御なし］）
（ＴＣＥＲ制御なしは、各細胞傷害性プロットで点線として示される）として定義される、カットオフを閾値として使用し、健常組織細胞と腫瘍対照細胞株との間のＬＯＥＬおよび安全域を判定した。ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）ベースのＴＣＥＲ（登録商標）の判定された全ての安全域は、１０００倍を超えた。
図５と図６の比較から、ＭＡＧ－００３特異的ＴＣＥＲ１（登録商標）（Ｒｅｇ）分子の文脈で親和性の低いリクルーターＢＭＡ０３（Ｖ３６）を使用すると、安全域が大幅に拡張されることは明らかである。
実施例３：親和性が低下したヒト化ＵＣＨＴ１変異型の作製
ＣＤ３特異的ヒト化抗体ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）の低親和性変異型を得るために、変異型の構造誘導設計を実施した。その標的ＣＤ３δ／ε（ＰＤＢ ＩＤ：１ｘｉｗ）との複合体中のＵＣＨＴ１の解析された構造に基づいて、タンパク質自体を不安定化することなく親和性を低下させると想定される点変異を抗体上に導入した。
この目標を達成するために、位置は主にＣＤＲ内で選択され；解析された構造から推論され得るように、２つのタンパク質間の界面は、主にＣＤ３εと抗体重鎖との間で形成されるため、重鎖内の位置のみが変異と見なされる。
明確にするために、ＣＤ３εの位置は、ＩＤ １ｘｉｗ、鎖ＩＤ：ＡのＰＤＢエントリーのように順次番号付けされる。
Ｇ３１Ｅは、ＣＤ３ε４８Ｄ、ＣＤ３ε４９Ｅ、ＣＤ３ε５０Ｄ、およびＣＤ３ε５１Ｄによって形成される負に帯電した表面パッチに面する抗体の表面に負の電荷を導入し、おそらく静電反発を引き起こし、親和性を低下させる。
Ｙ５４Ｑは、結合表面の形状相補性を変化させ、Ｙ５４の芳香環とＣＤ３ε４８Ｄの無極性幹との間の疎水性相互作用を除去する。
Ｙ５４Ｅは、結合表面の形状相補性を変化させ、Ｙ５４の芳香族環とＣＤ３ε４８Ｄの無極性幹との間の疎水性相互作用除去し、さらに、ＣＤ３ε４８Ｄ、ＣＤ３ε４９Ｅ、ＣＤ３ε５０Ｄ、およびＣＤ３ε５１Ｄによって形成された負に帯電したパッチに面して負の電荷を導入する。
Ｋ５５Ｒは、同様の物理化学的特性を有するより嵩高い側鎖を導入し、５５ＫのＮζとＣＤ３ε５６Ｓのバックボーンとの間に形成されたＨ結合を除去する。側鎖のサイズの増加はまた、結合形状のわずかな変化を誘発するかもしれない。
Ｋ５５Ｅは正電荷を負電荷に置き換え、５５ＫのＮζとＣＤ３ε３６Ｓのバックボーンとの間に形成された水素結合を除去する。さらに、負電荷の導入は、ＣＤ３ε５７Ｄ、ＣＤ３ε５８Ｅ、およびＣＤ３ε５９Ｄによって形成された負に帯電したパッチからの静電反発を引き起こす。
これらの発見に基づいて、ＵＣＨＴ１（Ｖ２０）～ＵＣＨＴ１（Ｖ２７）をコードする配列を表６に要約されるように作製した。
ヒト化ＵＣＨＴ１配列を最適化するためのさらなる試みでは、ＣＤＲ－Ｈ３内の潜在的な翻訳後修飾部位（Ａｓｐ－異性化、１０６Ｄ１０７Ｓ）を１０６Ｅの導入によって除去した。この修飾をＵＣＨＴ１（Ｖ１７）、ＵＣＨＴ１（２０）、ＵＣＨＴ１（Ｖ２１）、およびＵＣＨＴ１（Ｖ２３）に導入し、それぞれ、変異型ＵＣＨＴ１（Ｖ１７ｏｐｔ）、ＵＣＨＴ１（Ｖ２０ｏｐｔ）、ＵＣＨＴ１（Ｖ２１ｏｐｔ）およびＵＣＨＴ１（Ｖ２３ｏｐｔ）を得た。
表6：ヒト化UCHT1変異型をもたらす配列の組み合わせ
Figure 2022543387000007
表６に記載されているヒト化ＵＣＨＴ１変異型、ＰＲＡＭＥ－００４特異的（Ｖα：配列番号４８、Ｖβ：配列番号４４）およびＭＡＧ－００３特異的（Ｖα：配列番号２１、Ｖβ：配列ＩＤＮｏ：３０）をそれぞれ使用して、ＴＣＥＲ（登録商標）分子を上記のように作製し、生成して精製した。
実施例４：設計されたＵＣＨＴ１変異型の親和性の判定
バイオレイヤー干渉法を用いた親和性判定のために、分子ＣＤ３δε－Ｆｃを作製した。ＴＣＥＲ（登録商標）コンストラク（ノブ・インツー・ホール変異および追加的なＣ末端Ｈｉｓ－タグを含有する）内で利用されているＦｃドメインのＮ末端に融合させ、それぞれ、配列番号１６１および配列番号１６２を得た。
ＣＤ３δε－Ｆｃ分子をＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現させ、上記のようにプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。
バイオレイヤー干渉法を用いて、ＨＬＡ－Ａ＊０２（図９Ａ、表７）およびＣＤ３δε－Ｆｃ（図９Ｂ、表７）との複合体中のＭＡＧＥ－Ａ抗原性ペプチド（配列番号１０）に対するそれらの結合親和性について、異なるＵＣＨＴ１変異型を含んでなる二重特異性ＴＣＥＲ（登録商標）抗原結合タンパク質（表６に示されるような）を特性決定した。製造業者によって推奨される設定を使用して、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システムで測定を実施した。簡潔に述べると、緩衝液としてＰＢＳ、０．０５％ツイーン－２０、０．１％ＢＳＡを使用し、３０℃、１０００ｒｐｍの振盪速度で結合動態を測定した。ペプチド－ＨＬＡ－Ａ＊０２複合体またはＣＤ３δε－Ｆｃは、二重特異性ＴＣＥＲ（登録商標）分子の連続希釈液を分析する前に、バイオセンサー（ＨＩＳ１Ｋ）上に負荷した。あらゆるＴＣＥＲ（登録商標）分子は、約２ｎＭのＫＤ値で、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３に対する類似した結合を示した。ＣＤ３δε親和性は、３～７５０ｎＭの範囲のＫＤ値で、２００倍を超える域をカバーした。
表7：表6に記載の異なるUCHT1変異型を含んでなるTCER®分子の親和性分析。KD 値 はバイオレイヤー干渉法によって測定された
Figure 2022543387000008
実施例５：低親和性ヒト化ＵＣＨＴ１変異型の効力の低下
ＭＡＧ－００３特異的ＴＣＥＲ（登録商標）分子の細胞傷害性に関する効力は、実施例２内で上記のようにＬＤＨ放出アッセイで評価した。代表的なアッセイの結果を図１０に示す。予想通り、新たに設計された変異型（ＵＣＨＴ１（Ｖ１７ｏｐｔ）、ＵＣＨＴ１（Ｖ２０）、ＵＣＨＴ１（Ｖ２１）、ＵＣＨＴ１（Ｖ２３））は、ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）の高親和性動員ドメインを含むＴＣＥＲ（登録商標）と比較して効力の減少を示した。ＴＣＥＲ（登録商標）分子をその効力に従ってランク付けすることも、それぞれのリクルーター変異型の親和性を密接に反映する。（最高効力：ＵＣＨＴ１（Ｖ１７）＜ＵＣＨＴ１（Ｖ２１）＜ＵＣＨＴ１（Ｖ２０）＜ＵＣＨＴ１（Ｖ１７ｏｐｔ）＜ＵＣＨＴ１Ｖ２３）。ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中のＭＡＧ－００３に対するＴＣＲドメインの親和性は同等であることから、効力に対するこれらの影響は、動員ドメインにのみ起因し得る（図９）。

Claims (21)

  1. 少なくとも２つの抗原結合部位（ＡおよびＢ）を含んでなる、二重特異性抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合部位Ａが、ＣＤ３に結合し、前記抗原結合部位Ｂが、標的抗原性（ＴＡ）ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合し、前記抗原結合部位Ａが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなり、
    ａ）前記ＶＬが、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり、式中、
    －ＣＤＲＬ１が、配列番号１のアミノ酸配列「ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ」を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＣＤＲＬ２が、配列番号２のアミノ酸配列「ＹＴＳＲＬＨＳ」を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＣＤＲＬ３が、配列番号３のアミノ酸配列「ＱＱＧＱＴＬＰＷＴ」を含んでなるかまたはそれからなり、
    ｂ）前記ＶＨが、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり、式中、
    －ＣＤＲＨ１が、配列番号４のアミノ酸配列「Ｘ１ＹＴＭＮ」を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１が、ＧまたはＥ、好ましくはＧであり、
    －ＣＤＲＨ２が、配列番号５のアミノ酸配列ＬＩＮＰＸ２Ｘ３ＧＶＸ４ＴＹＡＱＫＸ５ＱＸ６を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ２がＱ、ＹまたはＥであり、Ｘ３がＲ、ＫまたはＥであり、Ｘ４がＳまたはＴであり、Ｘ５がＦまたはＶであり、Ｘ６がＧまたはＤであり、
    －ＣＤＲＨ３が、配列番号６のアミノ酸配列「ＳＧＹＹＧＸ７ＳＷＹＦＤ」を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ７が、ＥまたはＤである、二重特異性抗原結合タンパク質。
  2. 請求項１に記載の二重特異性抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合部位Ａが、ＫＤ（Ａ）でＣＤ３に結合し、前記抗原結合部位Ｂが、ＫＤ（Ｃ）で前記標的抗原性ペプチドＣ（ＴＡ－Ｃ）／ＭＨＣ複合体に結合し、前記ＫＤ（Ａ）／ＫＤ（Ｃ）比が、１を超え、４を超え、６を超え、８を超え、１０を超え、１５を超え、２０を超え、２５を超え、３０を超え、４０を超え、５０を超え、１～１５０の間、４～１４０の間、６～１００の間、８～１００の間、１０～１００の間など、好ましくは１０～１００の間の二重特異性抗原結合タンパク質。
  3. 請求項１または２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合部位Ａが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、好ましくはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いた測定で、３ｎＭ以上、５ｎＭ以上、８ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１２ｎＭ以上、１４ｎＭ以上、１６ｎＭ以上、１８ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、２５ｎＭ以上、３０ｎＭ以上、３５ｎＭ以上、４０ｎＭ以上、４５ｎＭ以上で、１０００ｎＭ以下、８００ｎＭ以下、６００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３ｎＭ～１０００ｎＭ、３ｎＭ～６００ｎＭ、５ｎＭ～６００ｎＭ、１０ｎＭ～６００ｎＭ、１２ｎＭ～６００ｎＭ、１４ｎＭ～６００ｎＭ、１６ｎＭ～６００ｎＭ、１８ｎＭ～６００ｎＭ、２０ｎＭ～６００ｎＭの間など、好ましくは５ｎＭ～１００ｎＭのＫＤ（Ａ）でＣＤ３に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質。
  4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合部位Ｂが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、好ましくはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いた測定で、１００μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、例えば０．０１ｎＭ～１５０ｎＭ、０．０５ｎＭ～１５０ｎＭ、０．１ｎＭ～１５０ｎＭ、０．１ｎＭ～１００ｎＭ、０．１ｎＭ～５０ｎＭ、０．１ｎＭ～１０ｎＭ、０．５ｎＭ～１０ｎＭ、０．５ｎＭ～５ｎＭ、好ましくは０．５ｎＭ～５ｎＭのＫＤ（Ｃ）で、前記標的抗原性ペプチドＣ（ＴＡ－Ｃ）／ＭＨＣ複合体に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質。
  5. 前記抗原結合タンパク質が、正常組織細胞に対するＥＣ５０値よりも、１００以上、５００以上、１０００以上低いＴＡ－Ｃ／ＭＨＣ提示細胞に対するＥＣ５０を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  6. 前記ＴＡ抗原性ペプチドＣが、ウイルスペプチド、細菌ペプチドまたは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチド、好ましくは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドである、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  7. 前記抗原結合タンパク質が、正常組織細胞に対するＥＣ５０値よりも、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上低いＴＡ－Ｃ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＥＣ５０を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質であって、前記ＴＡ抗原性ペプチドＣが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドＣであり、前記ＴＡＡ－Ｃが、配列番号９のアミノ酸配列「ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ」を含んでなるかまたはそれからなるＰＲＡＭＥ抗原性ペプチド、または配列番号１０のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原性ペプチドなどの、配列番号５２～６５、６７～９６、９８、配列番号１７２～１８２、１８４～２６８、配列番号９および１０のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、ＴＡＡ抗原性ペプチドの群から選択され、前記ＭＨＣは、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２である。
  9. 請求項８に記載の二重特異性抗原結合タンパク質であって、前記ＴＡ抗原性ペプチドＣが、配列番号１０のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原性ペプチドであり、類似ペプチドが、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ－００１、ＡＸＩＮ１－００１、ＡＮＯ５－００１、ＴＰＸ２－００１、ＳＹＮＥ３－００１、ＭＩＡ３－００１、ＨＥＲＣ４－００１、ＰＳＭＥ２－００１、ＨＥＡＴＲ５Ａ－００１、ＣＮＯＴ１－００３、ＴＥＰ１－００３、ＰＩＴＰＮＭ３－００１、ＺＦＣ－００１好ましくはＨＥＡＴＲ５Ａ－００１、ＨＥＲＣ４－００１、およびＣＮＯＴ１－００３からなるリストから選択される、二重特異性抗原結合タンパク質。
  10. 前記二重特異性抗原結合タンパク質が、二重特異性抗体またはその断片、二重特異性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその断片、または二重特異性一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）または二重特異性一本鎖抗体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質であって、前記ＶＬドメインが、ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、およびＦＲ４－Ｌからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域をさらに含んでなり、式中、
    －ＦＲ１－Ｌが、配列番号１１の「ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ」のアミノ酸配列、または配列番号１１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＦＲ２－Ｌが、配列番号１２の「ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ」、または配列番号１３の「ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩ」、好ましくは配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２または１３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＦＲ３－Ｌが、配列番号１４の「ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣ」のアミノ酸配列、または配列番号１４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＦＲ４－Ｌが、配列番号１５の「ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ」のアミノ酸配列、または配列番号１５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    式中、ＶＨが、ＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、およびＦＲ４－Ｈからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域をさらに含んでなり、式中、
    －ＦＲ１－Ｈが、配列番号１６の「ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴ」のアミノ酸配列、または配列番号１６と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＦＲ２－Ｈが、配列番号１７の「ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ」のアミノ酸配列、または配列番号１７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＦＲ３－Ｈが、配列番号１８の「ＲＶＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ」のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または
    －ＦＲ４－Ｈが、配列番号１９の「ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ」のアミノ酸配列、または配列番号１９と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、二重特異性抗原結合タンパク質。
  12. 抗原結合部位Ｂが、抗体またはその断片またはα鎖可変ドメイン（ｖα）およびβ鎖可変ドメイン（ｖβ）またはγ鎖可変ドメイン（ｖγ）またはδ鎖可変ドメイン（ｖδ）、好ましくはα鎖可変ドメイン（ｖα）およびβ鎖可変ドメイン（ｖβ）またはγ鎖可変ドメイン（ｖγ）およびδ鎖可変ドメイン（ｖδ）、好ましくはｖαおよびｖβを含んでなる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    ｉ）ｖαが、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＳＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号２０、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＱＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号２１、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＥＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＱＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２０、２１、および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、好ましくは前記アミノ酸配列が、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であり、好ましくは配列番号２３のＣＤＲａ１、配列番号２４のＣＤＲａ２、および配列番号２５のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、好ましくは前記アミノ酸配列が、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であり、好ましくは配列番号２３のＣＤＲａ１、配列番号２６のＣＤＲａ２、および配列番号２５のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、好ましくは前記アミノ酸配列が、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であり、好ましくは配列番号２７のＣＤＲａ１、配列番号２６のＣＤＲａ２、および配列番号２５のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、前記第１の可変ドメインの前記アアミノ酸が、好ましくはアミノ酸１９Ｖおよび／または４８Ｋを含んでなり、
    前記ｖβが、アミノ酸配列「ＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩＰＧＨＤＹＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＦＹＦＣＹＧＴＰＣＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦＣＡＳＲＡＤＴＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬ」配列番号３０、または配列番号３０からなるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、好ましくは、前記配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列が、好ましくはそれぞれ、配列番号３１のＣＤＲｂ１のアミノ酸配列、配列番号３４のＣＤＲｂ２、配列番号３５のＣＤＲｂ３を含んでなり、任意選択的にアミノ酸５４Ｆ及び／又は６６Ｃを含んでなり、または
    （ｉｉ）前記ｖαまたはｖγが、配列番号４８のアミノ酸配列、または配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、好ましくは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列が、配列番号４９のＣＤＲａ１、配列番号５０のＣＤＲａ２、および配列番号５１のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、
    前記ｖβまたはｖδが、配列番号４４のアミノ酸配列、または配列番号４４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、好ましくは、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列が、配列番号４５のＣＤＲｂ１、配列番号４６のＣＤＲｂ２、および配列番号４７のＣＤＲｂ３のアミノ酸配列を含んでなる、
    二重特異性抗原結合タンパク質。
  14. （ｉ）診断薬；
    （ｉｉ）治療薬；または
    （ｉｉｉ）薬物動態（ＰＫ）修飾部分
    の１つまたは複数をさらに含んでなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質をコード化する配列を含んでなる単離核酸、または前記核酸を含んでなる核酸ベクター。
  16. 好ましくは、ａ）幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞、またはｂ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの組換え発現のための細胞である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質、または請求項１５に記載の核酸またはベクターを含んでなる、組換え宿主細胞。
  17. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質、または請求項１５に記載の核酸またはベクター、または請求項１６に記載の宿主細胞、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、安定剤および／または賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
  18. ａ）適切な宿主細胞を提供するステップと、
    ｂ）請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質をコードするコード配列を含んでなる、遺伝子コンストラクトを提供するステップと、
    ｃ）前記遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するステップと、
    ｄ）前記適切な宿主細胞によって前記遺伝子コンストラクトを発現させるステップと
    を含んでなる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質を生成する方法。
  19. 前記適切な宿主細胞から前記二重特異性抗原結合タンパク質を単離および精製するステップをさらに含んでなる、請求項１８に記載の方法。
  20. 医療で使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質、請求項１５に記載の核酸またはベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、または請求項１７に記載の医薬品組成物。
  21. ウイルスまたは細菌感染症または増殖性疾患、好ましくはがん、より好ましくはＴＡＡ／ＭＨＣ陽性がんなどの疾患の診断、予防、および／または治療で使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質、請求項１５に記載の核酸またはベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、または請求項１７に記載の医薬品組成物。
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