DE102019121022A1

DE102019121022A1 - Rekrutierungsagens, das zusätzlich ein MHC-Molekül bindet

Info

Publication number: DE102019121022A1
Application number: DE102019121022.4A
Authority: DE
Inventors: Gabriele Pszolla; Martin Hofmann; Felix Unverdorben; Meike Hutt; Dominik Maurer; Sebastian Bunk
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2021-02-25
Also published as: AR119549A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft bispezifische antigenbindende Proteine, die gegen MHC-präsentierte Zielantigene (TA) gerichtet sind. Die Erfindung stellt insbesondere bispezifische antigenbindende Proteine zur Verfügung, die mindestens zwei Antigenbindungsstellen (A und B) umfassen, wobei die Antigenbindungsstelle A an CD3 und die Antigenbindungsstelle B an einen Zielantigen-(TA)-Peptid-/MHC-Komplex bindet. Die bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung umfassen insbesondere die CDRs der VL- und VH-Domänen von neuartigen modifizierten Anti-CD3-Antikörpern mit einer reduzierten Affinität. Die bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung sind für die Diagnose, Behandlung und Prävention von TA-assoziierten Krankheiten, wie z. B. Krebserkrankungen, die tumorassoziiertes Antigen (TAA) exprimieren, von Nutzen. Weiterhin werden Nukleinsäuren bereitgestellt, die das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung kodieren, Vektoren, die diese Nukleinsäure umfassen, rekombinante Zellen, die das antigenbindende Protein exprimieren, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung umfassen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft bispezifische antigenbindende Proteine, die gegen MHC-präsentierte Zielantigene (TA) gerichtet sind. Die Erfindung stellt insbesondere bispezifische antigenbindende Proteine zur Verfügung, die mindestens zwei Antigenbindungsstellen (A und B) umfassen, wobei die Antigenbindungsstelle A an CD3 und die Antigenbindungsstelle B an einen Zielantigen-(TA)-Peptid-/MHC-Komplex bindet. Die bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung umfassen insbesondere die CDRs der VL- und VH-Domänen von neuartigen modifizierten Anti-CD3-Antikörpern mit einer reduzierten Affinität. Die bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung sind für die Diagnose, Behandlung und Prävention von TA-assoziierten Krankheiten, wie z. B. Krebserkrankungen, die tumorassoziiertes Antigen (TAA) exprimieren, von Nutzen. Weiterhin werden Nukleinsäuren bereitgestellt, die das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung kodieren, Vektoren, die diese Nukleinsäure umfassen, rekombinante Zellen, die das antigenbindende Protein exprimieren, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung umfassen.
Hintergrund der Erfindung
T-Zellen erkennen (Virus-)infizierte Zellen und Tumorzellen, indem sie das Vorhandensein krankheitsspezifischer Peptide feststellen, die auf der Zelloberfläche durch den Haupthistokompatibilitäts-(MHC-)Komplex mit ihrem klonspezifischen T-Zell-Rezeptor präsentiert werden. TCR-basierte Moleküle sind daher für die Entwicklung von krankheits- oder tumorspezifischen Immuntherapeutika von hohem Interesse. Obwohl in der Entwicklung von molekularen-zielgerichteten Arzneimitteln für die Krebstherapie Fortschritte gemacht wurden, besteht die Notwendigkeit, neue Krebsmittel, die spezifisch gegen Moleküle, die hochspezifisch für Krebszellen aber nicht für normale Zellen sind, gerichtet sind, zu entwickeln. Analog dazu sind Zielmoleküle, die hochspezifisch für die kranken Zellen, aber nicht für normale Zellen sind, auch für die Entwicklung von Medikamenten gegen Infektionskrankheiten wie HIV von großer Bedeutung.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden die Proteine, aus denen die antigenen (TA) Zielpeptide gewonnen werden, durch das Proteasom in kurze Peptide abgebaut, in das endoplasmatische Retikulum transportiert, in der Furche neu synthetisierter MHC-Moleküle verpackt und als Peptid-MHC (pMHC)-Komplexe an die Zellmembran (TA-Peptid/MHC) abgegeben. Das durch das TA induzierte Erkennungsmuster ermöglicht es dem Immunsystem, die kranke Zelle, wie z.B. transformierte neoplastische Zellen im Falle eines TAA-antigenen Peptids, von umgebenden normalen Gewebezellen zu unterscheiden und die Immunkaskade gegen diese auszulösen.
Für die Entwicklung solcher Medikamente, die TA als Target haben, wurden TCRs identifiziert, die spezifisch auf TAs abzielen, und die Domänen V_α und V_β wurden für die Entwicklung neuer auf TA abzielende Moleküle, insbesondere auf abzielende TAA Moleküle, verwendet.
In Bezug auf TAA-Targeting-Moleküle ist anzumerken, dass native T-Zell-Rezeptoren (TCRs), die spezifisch an MHC-präsentierte Krebsantigene binden, jedoch häufig von geringerer Affinität (K_D= 1-300 µM) im Vergleich zu TCRs, die spezifisch an MHC-präsentierte virale Antigene binden, sind. Ein Teil der Erklärung für dieses Phänomen scheint darin zu bestehen, dass T-Zellen, die sich im Thymus entwickeln, auf Selbst-PepMHC-Liganden negativ selektiert werden (Toleranzinduktion), so dass T-Zellen mit zu hoher Affinität zu solchen Selbst-PepMHCs beseitigt werden. Diese geringe Affinität könnte eine mögliche Erklärung für den Immun-Escape des Tumors sein (Aleksic et al. 2012, Eur J Immunol. 2012 Dec;42(12):3174-9). Daher erscheint es wünschenswert, TCR-Varianten zu entwickeln, die mit höherer Affinität an Krebsantigene binden, um sie als Antigen-erkennende Konstrukte in einer adoptiven Zelltherapie oder als Erkennungsmodul eines löslichen Ansatzes, d. h. unter Verwendung bispezifischer Moleküle, zu entwickeln (Hickman et al. 2016, J Biomol Screen. 2016 Sep;21(8):769-85).
Eine einfache Erhöhung der Affinität von TCRs kann jedoch auch das Risiko von Nebenwirkungen erhöhen. Wie bereits erwähnt, werden in der Natur hochaffine TCRs, die gegen tumorassoziierte Antigene, die Selbstproteine sind, gerichtet sind, durch die Thymusselektion ausgeschlossen, um die Erkennung von auf normalem Gewebe vorhandenen Selbstpeptiden durch Kreuzreaktivität zu vermeiden. Dementsprechend könnte eine einfache Erhöhung der TCR-Affinität für seine Zielsequenz auch die Affinität zu ähnlichen, nicht krebsspezifischen Peptiden erhöhen und somit das Risiko von Kreuzreaktivität und unerwünschten zytotoxischen Effekten auf normales Gewebe erhöhen. Dies ist nicht nur ein theoretisches Risiko, da dies schmerzhaft für die modifizierten TCRs, die auf MAGE-A3 abzielen, entdeckt wurde. Insbesondere haben bereits früher veröffentlichte Ergebnisse tödliche Toxizitäten bei zwei Patienten gezeigt, die mit T-Zellen infundiert wurden, die zur Expression eines auf MAGE-A3 zielenden TCRs entwickelt wurden, der mit einem Peptid aus dem Muskelprotein Titin kreuzreagiert, obwohl in den präklinischen Studien keine Kreuzreaktionen vorhergesagt wurden (Linette GP et al. Blood 2013;122:863-71, Cameron BJ, et al. Sci. Transl. Med. 2013; 5: 197ra103). Diese Patienten zeigten, dass TCRmodifizierte T-Zellen schwerwiegende und unvorhersehbare, nicht off-target und organspezifische Toxizitäten aufweisen können.
Trotz dem Fortschritt in der TCR-Technologie besteht nach wie vor Bedarf an zusätzlichen Therapeutika, insbesondere Krebstherapeutika, vor allem solchen, die effizient auf kranke Zellen, insbesondere Krebszellen, abzielen und diese zu töten, während gleichzeitig ein hohes Sicherheitsprofil beibehalten wird.
Wie vorstehend erwähnt, haben native TCRs oft eine recht geringe Affinität zu ihrem Ziel-TAA/MHC-Komplex, wobei die geringe Affinität die Erkennung von auf normalem Gewebe vorhandenen Selbstpeptiden durch Kreuzreaktivität vermeidet. Eine erhöhte Affinität zu ihrem TAA/MHC-Zielkomplex ist jedoch vorzuziehen, um wirksame Krebsmedikamente herzustellen.
Um dieses Problem zu lösen, kombinieren die Erfinder der vorliegenden Erfindung in einem Molekül affinitätsmaturierte variable TCR-Domänen, die einen interessierenden TA/MHC mit variablen Domänen der leichten und der schweren Kette binden, die auf CD3 mit einer geringeren Affinität als die variablen Domänen der schweren und der leichten Kette von Anti-CD3 aus dem Stand der Technik abzielen. Die resultierenden Moleküle haben den Vorteil, dass sie kranke Zellen, wie z. B. Krebszellen, erkennen, auch wenn der TA, wie z. B. der TAA, auf der Zelloberfläche nur in geringen Mengen präsentiert wird, während ein hohes Sicherheitsprofil erhalten bleibt. Insbesondere dank der recht geringen Affinität der CD3-Bindungsdomäne ahmt das resultierende Molekül eine natürliche T-Zell/Molekül (TCR)/TA-Beziehung nach, denn im Falle der bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung findet die Bindung mit geringer Affinität an der Schnittstelle zwischen der T-Zelle und der CD3-Bindungsdomäne des bispezifischen antigenbindenden Proteins statt und nicht an der Schnittstelle zwischen dem TCR und dem TA/MHC-Komplex, wie es bei einer nativen TCRexprimierenden T-Zelle der Fall ist, die an einen TA/MHC bindet.
Einer der technisch vorteilhaften Effekte der Verwendung von CD3-Bindungsdomänen mit niedriger Affinität besteht somit darin, dass die resultierenden bispezifischen antigenbindenden Proteine aufgrund der Verwendung von variablen Domänen des TCR mit hoher Affinität spezifisch für einen TA von Interesse sind, während sie gleichzeitig ein hohes Sicherheitsprofil aufweisen, d. h. ein Sicherheitsfenster, nach dem etwa die mehr als 1000-fache Dosis, die zur Behandlung einer TA-präsentierenden Zelle, wie z. B. einer Krebszelle, verwendet wird, erforderlich wäre, um Zellen normaler Gewebe, wie Zellen normaler Gewebe, die Off-Targets exprimieren, abzutöten.
Dementsprechend haben die bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung, die CD3-Bindungsdomänen mit geringer Affinität mit affinitätsmaturierten TA/MHC-Bindungsdomänen kombinieren, den Vorteil, dass die resultierenden bispezifischen antigenbindenden Proteine effizient auf die kranke Zelle abzielen und zudem eine gute Sicherheit oder sogar eine verbesserte Sicherheit aufweisen. Die resultierenden bispezifischen Antigenmoleküle weisen darüber hinaus eine erhöhte Stabilität und/oder eine erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu bispezifischen Molekülen mit bereits bekannten Anti-CD3-Domänen auf, was sie für eine medizinische Anwendung sehr geeignet macht.
Definitionen
Der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „antigenbindendes Protein“ bezieht sich auf Polypeptide oder Bindungsproteine, die in der Lage sind, an mindestens ein Antigen zu binden.
Der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „Antigen“ bezieht sich auf ein Molekül oder einen Teil eines Moleküls oder Komplexes, das durch mindestens eine Antigenbindungsstelle gebunden werden kann, wobei die eine Antigenbindungsstelle beispielsweise in einem herkömmlichen Antikörper, einer herkömmlichen TCR und/oder in den bispezifischen antigenbindenden Proteinen der vorliegenden Erfindung vorhanden ist.
Das „bispezifische antigenbindende Protein“ der vorliegenden Erfindung hat mindestens zwei Valenzen und Bindungsspezifitäten für zwei verschiedene Antigene, Antigenbindungsstelle A bindet an CD3 und Antigenbindungsstelle B bindet an einen Zielantigen (TA)-Peptid/MHC-Komplex. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird die für CD3 spezifische Antigenbindungsstelle A von einer neu humanisierten Version des monoklonalen Maus-Antikörpers UCHT1 abgeleitet, insbesondere von einer verbesserten humanisierten Version des monoklonalen Maus-Antikörpers UCHT1, und es wird bevorzugt, dass die Antigenbindungsstelle B von einem TCR abgeleitet wird. Die „bispezifischen antigenbindenden Proteine“ der vorliegenden Erfindung werden vorliegend auch als „antigenbindende Proteine der Erfindung“ bezeichnet und sie umfassen mindestens 6 CDRs, wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung definiert, mehr bevorzugt umfasst das antigenbindende Protein V_L und V_H-Domänen, insbesondere Varianten von V_L und V_H - Domänen, die von dem verbesserten humanisierten UCHT1-Antikörper abgeleitet sind. Die Antigenbindungsstelle B im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bindet an einen Zielantigen-(TA)-Peptid/MHC-Komplex, insbesondere an einen tumorassoziierten Antigen-(TAA)-Peptid/MHC-Komplex, und kann von einem Antikörper oder einem TCR, vorzugsweise von einem TCR, abgeleitet sein. Dementsprechend umfassen die antigenbindenden Proteine der Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform eine bispezifische Antigenbindungsstelle B, die an einen Zielantigen-(TA)-Peptid/MHC-Komplex bindet, wobei die Antigenbindungsstelle B vorzugsweise mindestens eine variable Alpha-Domäne (v_α) und mindestens eine variable Beta-Domäne (v_β) umfasst, die von einem TCR abgeleitet sind.
Das bispezifische antigenbindende Protein kann im vorliegenden Dokument auch als „bispezifisches Molekül“ bezeichnet werden.
Das „Zielantigen-(TA)-Peptid“, wie es im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf Peptide, die aus infiziertem oder tumorösem Material isoliert und identifiziert wurden, wie z. B. Material, das von Personen isoliert wurde, die an Tuberkulose oder an einer Infektion vom Epstein-Barr-Virus oder an Krebs erkrankt sind. Das Protein, von dem das TA-Peptid abgeleitet ist, wird in einer infizierten Zelle oder einer Tumorzelle einer Antigen-Prozessierung unterzogen, dann an der Zelloberfläche durch das MHC-Molekül und die Zelle präsentiert, insbesondere so dass der TA-Peptid/MHC-Komplex somit von Immuneffektorzellen des Wirtes, wie T-Zellen oder NKT-Zellen, erkannt werden kann. Das TA-Peptid im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst oder besteht aus 10, 12 oder 14, wie z. B. 8 bis 14, 8 bis 12, z. B. 9 bis 11 Aminosäuren. Wenn im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein bestimmtes TA-Peptid gemeint ist, wird es als TA-C bezeichnet. Beispiele für TA-Antigenpeptide, wie TA-C-Peptide, sind virale Antigenpeptide, bakterielle Antigenpeptide oder tumorassoziierte Antigenpeptide (TAA), vorzugsweise TAA-Antigenpeptide. Dementsprechend ist das TA-Antigenpeptid, insbesondere das TA-C, in einer Ausführungsform ein virales Peptid, ein bakterielles Peptid oder ein tumorassoziiertes Antigen (TAA)-Antigenpeptid, vorzugsweise ein TAA-Antigenpeptid.
Ein „virales Antigenpeptid“ im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein Antigenpeptid, das durch das MHC-Molekül auf der Oberfläche einer kranken Zelle präsentiert wird und viralen Ursprungs ist, d. h. die Zelle ist typischerweise mit dem genannten Virus infiziert. Solche viralen Antigenpeptide wurden im Zusammenhang mit Infektionen z. B. mit humanen Immunschwächeviren (HIV), humanen Cytomegalieviren (HCMV), Cytomegalievirus (CMV), humanen Papillomavirus (HPV), Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV), humanen Papillomaviren-Infektionen (HPV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Influenza-Virus entdeckt. Dementsprechend kann das virale Antigenpeptid im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein Antigenpeptid sein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HIV-Antigenpeptiden, HCMV-Antigenpeptid, CMV-Antigenpeptiden, HPV-Antigenpeptiden, HBV-Antigenpeptiden; HCV-Antigenpeptiden; EBV-Antigenpeptiden, Influenza-Antigenpeptiden, vorzugsweise Antigenpeptiden von HIV, HBV, Influenza und HCMV.
Zu den viralen Antigenpeptiden, die mit den vorliegend beschriebenen Verfahren und Ausführungsformen verwendet werden können, gehören zum Beispiel die in der nachstehenden Tabelle beschriebenen viralen Antigenpeptide. Virale Antigenpeptide, die zur Verwendung mit den vorliegend beschriebenen Verfahren und Ausführungsformen geeignet sind, umfassen in einem Aspekt mindestens ein virales Antigenpeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die aus den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 146 bis SEQ ID NO: 148 ausgewählt ist, wie vorliegend unten in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Liste der viralen Antigenpeptide

SEQ ID NO: Peptid Virus MHC

146 SLYNTVATL HIV HLA-A*02:01

147 GILGFVFTL Influenza A HLA-A*02:01

148 NLVPMVATV HCMV HLA-A*02:01
Ein „bakterielles Antigenpeptid“ im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein Antigenpeptid, das durch das MHC-Molekül auf der Oberfläche einer kranken Zelle präsentiert wird und bakteriellen Ursprungs ist, d. h. die Zelle wird typischerweise von den genannten Bakterien infiziert. Solche bakteriellen Antigenpeptide wurden im Zusammenhang mit Infektionen z. B. durch Mycobacterium tuberculosis entdeckt. Dementsprechend kann es sich bei dem bakteriellen Antigenpeptid im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung um ein Antigenpeptid von Mycobacterium tuberculosis handeln.
Als „tumorassoziierte Antigen (TAA)-Peptide“, vorliegend auch als „TAA-Peptide“ bezeichnet, werden Peptide bezeichnet, die aus Tumormaterial isoliert und identifiziert wurden und die in einer Tumorzelle einer Antigenprozessierung unterzogen wurden und somit von Immuneffektorzellen des Wirtes erkannt werden können. Die TAA-Peptide umfassen oder bestehen aus 10, 12 oder 14, wie z. B. 8 bis 14, 8 bis 12, z. B. 9 bis 11 Aminosäuren. Bei den TAA-Peptiden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann es sich zum Beispiel um ein Cancer/Testis (CT)-Antigenpeptid handeln. Beispiele für Cancer/Testis (CT)-Antigenpeptide sind das Antigenpeptid MAGE-A der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 und das Antigenpeptid PRAME der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9. Das TAA-Peptid im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst ein T-Zell-Epitop und kann im allgemeinen Zusammenhang auch als TAA-Peptid und im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung als TAA-Peptid C bezeichnet werden, wenn es sich auf ein spezifisches TAA-Peptid bezieht.
In einem Aspekt umfassen die tumorassoziierten Antigen (TAA)-Peptide, die in der Lage sind, mit den vorliegend beschriebenen Verfahren und Ausführungsformen verwendet zu werden, beispielsweise die in US-Veröffentlichung 20160187351 , US-Veröffentlichung 20170165335 , US-Veröffentlichung 20170035807 , US-Veröffentlichung 20160280759 , US-Veröffentlichung 20160287687 , US-Veröffentlichung 20160346371 , US-Veröffentlichung 20160368965 , US-Veröffentlichung 20170022251 , US-Veröffentlichung 20170002055 , US-Veröffentlichung 20170029486 , US-Veröffentlichung 20170037089 , US-Veröffentlichung 20170136108 , US-Veröffentlichung 20170101473 , US-Veröffentlichung 20170096461 , US-Veröffentlichung 20170165337 , US-Veröffentlichung 20170189505 , US-Veröffentlichung 20170173132 , US-Veröffentlichung 20170296640 , US-Veröffentlichung 20170253633 , US-Veröffentlichung 20170260249 , US-Veröffentlichung und US-Veröffentlichung 20180164315 beschriebenen TAA-Peptide, wobei die Inhalte von jeder dieser vorliegend beschriebenen Veröffentlichungen und Sequenzprotokollen in ihrer Gesamtheit durch Verweis vorliegend aufgenommen sind.

In einem Aspekt erkennen die vorliegend beschriebenen bispezifischen antigenbindenden Proteine, insbesondere die Antigenbindungsstelle B, im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung selektiv Zellen, die ein TAA-Peptid präsentieren, das in einem oder mehreren der oben beschriebenen Patente und Veröffentlichung beschrieben ist. In einem anderen Aspekt umfassen TAA, die mit den vorliegend beschriebenen Verfahren und Ausführungsformen verwendet werden können, mindestens ein TAA, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die aus den Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 52 bis 65, 67 bis 96, 98 bis 110, SEQ ID NO: 172 bis 182, 184 bis 268, SEQ ID NO: 9 und 10, vorzugsweise SEQ ID NO: 9 und 10, ausgewählt ist. In einem Aspekt erkennen die bispezifischen antigenbindenden Proteine, insbesondere die Antigenbindungsstelle B der bispezifischen antigenbindenden Proteine, selektiv Zellen, die einen TAA-Peptid/MHC-Komplex präsentieren, wobei das TAA-Peptid eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 52 bis 65, 67 bis 96, 98, SEQ ID NO: 172 bis 182, 184 bis 268, SEQ ID NO: 9 und 10, oder eine der Aminosäuresequenzen, die in den vorliegend beschriebenen Patenten oder Anmeldungen beschrieben sind, vorzugsweise SEQ ID NO: 9 und 10, umfasst oder aus diesen besteht. Tabelle 2: Liste von TAAs

SEQ ID NO:	Aminosäuresequenz	SEQ ID NO:	Aminosäuresequenz	SEQ ID NO:	Aminosäuresequenz
52	YLYDSETKNA	105	VLDGKVAVV	219	KMSELQTYV
53	HLMDQPLSV	106	GLLGKVTSV	220	ALLEQTGDMSL
54	GLLKKINSV	107	KMISAIPTL	221	VIIKGLEEITV
55	FLVDGSSAL	108	GLLETTGLLAT	222	KQFEGTVEI
56	FLFDGSANLV	109	TLNTLDINL	223	KLQEEIPVL
57	FLYKIIDEL	110	VIIKGLEEI	224	GLAEFQENV
58	FILDSAETTTL	172	YLEDGFAYV	225	NVAEIVIHI
59	SVDVSPPKV	173	KIWEELSVLEV	226	ALAGIVTNV
60	VADKIHSV	174	LLIPFTIFM	227	NLLIDDKGTIKL
61	IVDDLTINL	175	ISLDEVAVSL	228	VLMQDSRLYL
62	GLLEELVTV	176	KISDFGLATV	10	KVLEHVVRV
63	TLDGAAVNQV	177	KLIGNIHGNEV	229	LLWGNLPEI
64	SVLEKEIYSI	178	ILLSVLHQL	230	SLMEKNQSL
65	LLDPKTIFL	179	LDSEALLTL	231	KLLAVIHEL
67	YLMDDFSSL	180	VLQENSSDYQSNL	232	ALGDKFLLRV
68	KVWSDVTPL	181	HLLGEGAFAQV	233	FLMKNSDLYGA
69	LLWGHPRVALA	182	SLVENIHVL	234	KLIDHQGLYL
70	KIWEELSVLEV	184	SLSEKSPEV	235	GPGIFPPPPPQP
71	LLIPFTIFM	185	AMFPDTIPRV	236	ALNESLVEC
72	FLIENLLAA	186	FLlENLLAA	237	GLAALAVHL
73	LLWGHPRVALA	187	FTAEFLEKV	238	LLLEAVWHL
74	FLLEREQLL	188	ALYGNVQQV	239	SIIEYLPTL
75	SLAETIFIV	189	LFQSRIAGV	240	TLHDQVHLL
76	TLLEGISRA	190	ILAEEPIYIRV	241	SLLMWITQC
77	ILQDGQFLV	191	FLLEREQLL	242	FLLDKPQDLSI
78	VIFEGEPMYL	192	LLLPLELSLA	243	YLLDMPLWYL
79	SLFESLEYL	193	SLAETIFIV	244	GLLDCPIFL
80	SLLNQPKAV	194	AILNVDEKNQV	245	VLIEYNFSI
81	GLAEFQENV	195	RLFEEVLGV	246	TLYNPERTITV
82	KLLAVIHEL	196	YLDEVAFML	247	AVPPPPSSV
83	TLHDQVHLL	197	KLIDEDEPLFL	248	KLQEELNKV
84	TLYNPERTITV	198	KLFEKSTGL	249	KLMDPGSLPPL
85	KLQEKIQEL	199	SLLEVNEASSV	250	ALIVSLPYL
86	SVLEKEIYSI	200	GVYDGREHTV	251	FLLDGSANV
87	RVIDDSLVVGV	201	GLYPVTLVGV	252	ALDPSGNQLI
88	VLFGELPAL	202	ALLSSVAEA	253	ILIKHLVKV
89	GLVDIMVHL	203	TLLEGISRA	254	VLLDTILQL
90	FLNAIETAL	204	SLIEESEEL	255	HLIAEIHTA
91	ALLQALMEL	205	ALYVQAPTV	256	SMNGGVFAV
92	ALSSSQAEV	206	KLIYKDLVSV	257	MLAEKLLQA
93	SLITGQDLLSV	207	ILQDGQFLV	258	YMLDIFHEV
94	QLIEKNWLL	208	SLLDYEVSI	259	ALWLPTDSATV
95	LLDPKTIFL	209	LLGDSSFFL	260	GLASRILDA
96	RLHDENILL	210	VIFEGEPMYL	261	ALSVLRLAL
98	GLPSATTTV	211	ALSYILPYL	262	SYVKVLHHL
99	GLLPSAESIKL	212	FLFVDPELV	263	VYLPKIPSW
100	KTASINQNV	213	SEWGSPHAAVP	264	NYEDHFPLL
9	SLLQHLIGL	214	ALSELERVL	265	VYIAELEKI
101	YLMDDFSSL	215	SLFESLEYL	266	VHFEDTGKTLLF
102	LMYPYIYHV	216	KVLEYVIKV	267	VLSPFILTL
103	KVWSDVTPL	217	VLLNEILEQV	268	HLLEGSVGV
104	LLWGHPRVALA	218	SLLNQPKAV

Darüber hinaus ist das TA-Antigenpeptid im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein spezifischer Ligand von MHC-Klasse-I-Molekülen oder MHC-Klasse-II-Molekülen, vorzugsweise von MHC-Klasse-I-Molekülen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist das TAA-Antigenpeptid C vorzugsweise aus der Gruppe der TAA-Antigenpeptide ausgewählt, die aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 52 bis 65, 67 bis 96, 98 bis 110, SEQ ID NO: 172 bis 182, 184 bis 268, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 besteht, vorzugsweise das PRAME-Antigenpeptid, das die Aminosäuresequenz „SLLQHLIGL“ von SEQ ID NO: 9 umfasst oder daraus besteht, oder das MAGE-A-Antigenpeptid, das die Aminosäuresequenz „KVLEHVVRV“ von SEQ ID NO: 10 umfasst oder daraus besteht, mehr bevorzugt SEQ ID NO: 10, wobei der MHC vorzugsweise ein HLA-A*02 ist.
„PRAME“ oder „präferentiell exprimiertes Antigen im Melanom“ wurde zunächst als ein Antigen identifiziert, das im Melanom überexprimiert wird (Ikeda et al Immunity. 1997 Feb;6(2): 199-208); es ist auch bekannt als CT130, MAPE, OIP-4 und hat die Uniprot Zugangsnummer P78395 (wie am 11. Januar 2019 verfügbar). Das Protein fungiert als Repressor der Retinsäure-Rezeptorsignalisierung (Epping et al., Cell. 2005 Sep 23; 122(6):835-47). PRAME gehört zur Familie der Keimbahn-kodierten Antigene, die als Cancer Testis Antigene bekannt sind. Cancer-Testis-Antigene sind attraktive Ziele für immuntherapeutische Interventionen, da sie typischerweise eine eingeschränkte oder gar keine Expression in normalem adultem Gewebe aufweisen. PRAME wird in einer Reihe von soliden Tumoren sowie in Leukämien und Lymphomen exprimiert (Doolan et al Breast Cancer Res Treat. 2008 May; 109(2):359-65; Epping et al Cancer Res. 2006 Nov 15;66(22): 10639-42; Ercolak et al Breast Cancer Res Treat. 2008 May; 109(2):359-65; Matsushita et al Leuk Lymphoma. 2003 Mar;44(3):439-44; Mitsuhashi et al Int. J Hematol. 2014; 100(1):88-95; Proto-Sequeire et al Leuk Res. 2006 Nov;30(11): 1333-9; Szczepanski et al Oral Oncol. 2013 Feb;49(2): 144-51; Van Baren et al Br J Haematol. 1998 Sep; 102(5): 1376-9). Auf PRAME abzielende erfindungsgemäße Therapien können für die Behandlung von Krebserkrankungen besonders geeignet sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Lungenkrebs, wie nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs, Leberkrebs, Krebs im Kopf-Hals-Bereich, Hautkrebs, Nierenzellkrebs, Hirnkrebs, Magenkrebs, Darmkrebs, Leberzellkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Leukämie, Brustkrebs, Merkelzellkarzinom, Melanom, Eierstockkrebs, Harnblasenkrebs, Gebärmutterkrebs, Gallenblasen- und Gallengangkrebs und Speiseröhrenkrebs.
Das „von PRAME abgeleitete Peptid“ umfasst oder besteht aus der Aminosäuresequenz SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 9), die den Aminosäuren 425-433 des PRAME-Volllängenproteins der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 entspricht, die unter der Uniprot Zugangsnummer P78395 (wie am 11. Januar 2019 verfügbar) zugänglich ist. Das von PRAME abgeleitete Peptid, das die Aminosäuresequenz SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 9) umfasst oder aus ihr besteht, wird im vorliegenden Kontext auch als PRAME-004 bezeichnet. Das Peptid PRAME-004 ist ein Peptidepitop, das von einem tumorassoziierten oder tumorspezifischen Protein stammt und auf der Zelloberfläche von Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) präsentiert wird. Insbesondere wird das von PRAME-004 abgeleitete Peptid auf der Zelloberfläche im Komplex mit HLA-A*02 präsentiert. Med. 2001 Jan 1;193(1):73-88). Im Rahmen der Erfindung werden das von „PRAME abgeleitete Peptid“ oder „PRAME-004“ austauschbar verwendet und beziehen sich somit auf das von PRAME abgeleitete Peptid, das die Aminosäuresequenz SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 9) umfasst oder aus ihr besteht.
Die Proteine der Unterfamilie „MAGE-A“ oder „Melanom-assoziiertes Antigen A“ waren die ersten auf molekularer Ebene identifizierten tumorassoziierten Antigene (van der Bruggen P, et al. Science. 1991; 254:1643-47). MAGE-A ist eine Unterfamilie von 12 Genen (MAGE-A1 bis -A12), die sich in der q28-Region des X-Chromosoms befinden. Die Mitglieder der MAGE-A-Unterfamilie werden normalerweise nur in Hoden oder Plazenta exprimiert und ihre eingeschränkte Expression lässt vermuten, dass sie bei der Entwicklung von Keimzellen Funktionen haben könnten. MAGE-A-Proteine wurden auch in der frühen Entwicklung des Zentralnervensystems und des Rückenmarks und des Hirnstamms peripherer Nerven nachgewiesen, was zeigt, dass MAGE-A-Proteine auch an der neuronalen Entwicklung beteiligt sein können. Die Mitglieder dieser Familie kodieren Proteine mit 50 bis 80% Sequenzidentität zueinander, und alle MAGE-Proteine teilen sich die gemeinsame MAGE-Homologie-Domäne (MHD), eine hochkonservierte Domäne, die aus etwa 170 Aminosäuren besteht. Die biologischen Funktionen und der zugrundeliegende Regulationsmechanismus der Expression von MAGE-A-Proteinen bei Krebs sind noch nicht vollständig verstanden.
Das Protein „MAGE-A4“ oder „Melanom-assoziiertes Antigen 4“ ist ein Mitglied der MAGE-A-Genfamilie und hat die Uniprot-Zugangsnummer P43358 von SEQ ID NO: 111 (wie am 8. Juli 2019 verfügbar). Die MAGE-A4-Lokalisierung wurde als zytoplasmatisch beschrieben. Es wurde jedoch auch eine MAGE-A4-Färbung in den Zellkernen mit einer unterschiedlichen Verteilung zwischen Kern und Zytoplasma bei gut differenzierten und weniger differenzierten Krebsarten festgestellt (Sarcevic B et. al., 2003, Oncology 64, 443-449). MAGE-A4 wird als Marker für männliche Keimzellen verwendet. Es wird nicht in Gonozyten, sondern in Präspermatogonien und reifen Keimzellen exprimiert (Mitchell et al., 2014, Mod. Pathol. 27, 1255-1266). Die Expression des MAGE-A4-Proteins und der mRNA wurde mit der Entwicklung und Prognose verschiedener Krebsarten in Verbindung gebracht.
Das Protein „MAGE-A8“ oder „Melanom-assoziiertes Antigen 8“ ist ein Mitglied der MAGE-A-Superfamilie und hat die Uniprot-Zugangsnummer P43361 von SEQ ID NO: 112 (wie am 8. Juli 2019 verfügbar).
Die „MAGE-A4“- und „MAGE-A8“-Proteine haben eine Sequenzidentität von 72%, die durch ein Proteinsequenz-Alignment unter Verwendung des BLASTP 2.9.0-Algorithmus bestimmt wurde (Stephen F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Darüber hinaus enthalten beide, „MAGE-A4“ und „MAGE-A8“, das Peptid MAG-003, d. h. KVLEHVVRV (SEQ ID NO: 10).
Der hier verwendete Begriff „Epitop“ umfasst die Begriffe „Strukturepitop“ und „funktionelles Epitop“. Das „Strukturepitop“ sind diejenigen Aminosäuren des Antigens, z. B. Peptid-MHC-Komplex, die vom antigenbindenden Protein abgedeckt werden, wenn sie an das Antigen gebunden sind. Typischerweise werden alle Aminosäuren des Antigens als abgedeckt angesehen, die innerhalb von 5 ̊Å von jedem Atom einer Aminosäure des antigenbindenden Proteins liegen. Das strukturelle Epitop eines Antigens kann mit den bekannten Verfahren wie Röntgenkristallographie oder NMR-Analyse bestimmt werden. Das Strukturepitop eines Antikörpers umfasst typischerweise 20 bis 30 Aminosäuren. Das Strukturepitop eines TCR umfasst typischerweise 20 bis 30 Aminosäuren. Das „funktionelle Epitop“ ist eine Untergruppe der Aminosäuren, die das Strukturepitop bilden, und umfasst die Aminosäuren des Antigens, die für die Bildung der Schnittstelle mit dem antigenbindenden Protein der Erfindung entscheidend sind, entweder durch direkte Bildung nicht-kovalenter Wechselwirkungen wie H-Bindungen, Salzbrücken, aromatische Stapelung oder hydrophobe Wechselwirkungen oder durch indirekte Stabilisierung der Bindungskonformation des Antigens, und wird beispielsweise durch Mutationsscanning bestimmt. Typischerweise umfasst das funktionelle Epitop eines durch einen Antikörper gebundenen Antigens zwischen 4 und 6 Aminosäuren. Typischerweise umfasst das funktionelle Epitop eines Peptid-MHC-Komplexes zwischen 2 bis 6 Aminosäuren des Peptids und 2 bis 7 Aminosäuren des MHC. Da die von MHC I präsentierenden Peptide typischerweise eine Länge zwischen 8 bis 10 Aminosäuren aufweisen, ist nur eine Untergruppe der Aminosäuren jedes gegebenen Peptids Teil des funktionellen Epitops eines Peptid-MHC-Komplexes. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst das Epitop, insbesondere das funktionelle Epitop, das von den bispezifischen antigenbindenden Proteinen der vorliegenden Erfindung gebunden wird, die Aminosäuren des Antigens, die für die Bildung der Bindungsschnittstelle erforderlich sind, oder besteht aus diesen, daher umfasst das funktionelle Epitop mindestens 3, vorzugsweise mindestens 4 Aminosäuren des MAGE-A-Antigenpeptids der SEQ ID NO: 10.
„CD3“ bezeichnet ein Antigen, das auf T-Zellen als Teil des multimolekularen T-Zell-Rezeptorkomplexes exprimiert wird und aus mindestens drei verschiedenen Ketten besteht: CD3s, CD3δ und CD3y. CD3δ und CD3γ haben eine geringe Sequenzidentität und/oder Ähnlichkeit mit dem menschlichen CD3ε (die Ähnlichkeit und Identität beträgt weniger als 20%). „CD3ε/δ-Komplex“ bezieht sich auf den Komplex, der von CD3ε und CDR3δ gebildet wird. CD3ε bildet auch mit CDR3y einen Komplex, den sogenannten „CD3ε/γ-Komplex“. Die Clusterbildung von CD3 auf T-Zellen, z. B. durch immobilisierte Anti-CD3-Antikörper, führt zu einer T-Zell-Aktivierung, die dem Einsatz des T-Zell-Rezeptors ähnlich ist, aber unabhängig von seiner klontypischen Spezifität. „CD3e“ umfasst drei Domänen, eine intrazelluläre Domäne, eine transmembrane Domäne und eine extrazelluläre Domäne.
Der monoklonale Antikörper „UCHT1“ bindet spezifisch an den Komplex aus der menschlichen CD3δ-Kette und der CD3ε-Kette, vorliegend als CD3ε/δ-Komplex bezeichnet, einer 36-kDa-Untereinheit des CD3/T-Zellantigenrezeptorkomplexes. Der monoklonale Maus-Antikörper UCHT-1 umfasst eine VL-Domäne, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 36 umfasst oder daraus besteht, und eine VH-Domäne, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 37 umfasst oder daraus besteht. Die Humanisierung von UCHT1 wurde z. B. von Shalaby et al. (J. Exp. Med. (1992); 175(1): 217-225) beschrieben, die dann weiter modifiziert wurde, was zu der humanisierten Variante 9 von UCHT1, bezeichnet als hUCHT1 (V9), führte, die von Zhu et al. (J. Immunol, 1995, 155, 1903-1910) beschrieben wurde. hUCHT1(V9) umfasst eine VL-Domäne, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 38 umfasst oder daraus besteht, und eine VH-Domäne, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 39 umfasst oder daraus besteht. Humanisierte UCHT-Varianten nach dem Stand der Technik leiden jedoch unter einer geringen Löslichkeit und sind im molekularen Kontext von löslichen Molekülen schwer zu verwenden. Außerdem haben diese Varianten nach dem Stand der Technik eine hohe Affinität zu CD3, was, wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung entdeckt, ein Nachteil sein könnte.
„BMA031“ bezeichnet den monoklonalen Antikörper (mAb) WT31, der spezifisch für humane alpha/beta-TCRs ist. Verschiedene humanisierte Varianten wurden im Stand der Technik offenbart, darunter z. B. der in Shearman et al. (J Immunol, 1991, 147, 4366-73) beschriebene alpha/beta TCR-spezifische humanisierte Antikörper BMA031. Der in Sherman et al. beschriebene humanisierte Antikörper (J Immunol, 1991, 147, 4366-73) umfasst eine V_L-Domäne, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 40 umfasst oder daraus besteht, und eine V_H-Domäne, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 41 umfasst oder daraus besteht.
Der „Haupthistokompatibilitätskomplex“ (MHC) ist ein Komplex von Zelloberflächenproteinen, die für das erworbene Immunsystem essentiell sind, um Fremdmoleküle in Wirbeltieren zu erkennen, was wiederum die Histokompatibilität bestimmt. Die Hauptfunktion von MHC-Molekülen besteht darin, an von Krankheitserregern abgeleitete Antigene zu binden und diese auf der Zelloberfläche zur Erkennung durch die entsprechenden T-Zellen anzuzeigen. Der menschliche MHC wird auch als HLA- (humanes Leukozytenantigen) Komplex (oft nur als HLA) bezeichnet. Die MHC-Genfamilie ist in drei Untergruppen unterteilt: Klasse I, Klasse II und Klasse III. Komplexe aus Peptid und MHC-Klasse-I werden von CD8-positiven T-Zellen erkannt, die den adäquaten T-Zellrezeptor (TCR) tragen, wobei Komplexe aus Peptid und MHC-Klasse-II-Molekülen von CD4-positiven T-Helferzellen, die den adäquaten TCR tragen, erkannt werden. Da beide Arten der Antwort, CD8- und CD4-abhängig, gemeinsam und synergistisch zu dem anti-Tumoreffekt beitragen, ist die Identifizierung und Charakterisierung von tumorassoziierten Antigenen und korrespondierender T-Zellrezeptoren für die Entwicklung von Krebsimmuntherapien wie z. B. Tumorvakzinen und Zelltherapien wichtig. Das HLA-A-Gen befindet sich auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 und kodiert die größere, α-Kette, einen Bestandteil von HLA-A. Die Variation der HLA-A α-Kette ist der Schlüssel zur HLA-Funktion. Diese Variation fördert die genetische Vielfalt in der Bevölkerung. Da jedes HLA eine unterschiedliche Affinität zu Peptiden bestimmter Strukturen hat, bedeutet eine größere Vielfalt an HLAs eine größere Vielfalt an Antigenen, die auf der Zelloberfläche „präsentiert“ werden. Jeder Einzelne kann bis zu zwei Arten von HLA-A exprimieren, eine von jedem seiner Eltern. Einige Individuen werden die gleiche HLA-A von beiden Elternteilen erben, was ihre individuelle HLA-Diversität verringert; die Mehrheit der Individuen wird jedoch zwei verschiedene Kopien von HLA-A erhalten. Das gleiche Muster folgt für alle HLA-Gruppen. Mit anderen Worten, jede einzelne Person kann nur entweder ein oder zwei der 2432 bekannten HLA-A-Allele exprimieren.
Das MHC-Klasse-I-HLA-Protein im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann ein HLA-A-, HLA-B- oder HLA-C-Protein sein, vorzugsweise ein HLA-A-Protein, mehr bevorzugt HLA-A*02.
„HLA-A*02“ bedeutet ein spezifisches HLA-Allel, wobei der Buchstabe A das Gen und das Suffix „*02“ den Serotyp A2 bezeichnet.
In einer MHC-Klasse-I-abhängigen Immunantwort müssen die Peptide nicht nur in der Lage sein, an spezifische MHC-Klasse-I-Moleküle, die von Tumorzellen exprimiert werden, zu binden, sie müssen anschließend auch noch von T-Zellen, die einen spezifischen T-Zellrezeptor (TCR) tragen, erkannt werden.
Ein „TCR“ ist ein heterodimeres Zelloberflächenprotein der Superfamilie der Immunglobuline, die mit den invariablen Proteinen des CD3-Komplexes, der in Vermittlung der Signaltransduktion involviert ist, assoziiert. TCRs existieren in αβ- und γδ-Formen, die strukturell ähnlich sind, aber ziemlich unterschiedliche anatomische Positionen und - vermutlich - Funktionen haben. Der extrazelluläre Anteil der nativen heterodimerischen αβ TCR und γδ TCR besteht aus je zwei Polypeptiden, von welchen beide eine membranproximale konstante Domäne und eine membrandistale variable Domäne besitzen. Alle konstanten und variablen Domänen enthalten eine Intraketten-Disulfidbindung. Die variablen Domänen enthalten hochgradig polymorphe Schleifen, analog zu den komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) von Antikörpern.
Der Begriff „TCR“ bezeichnet hier sowohl TCRs und Fragmente davon als auch Einzelketten-TCRs und Fragmente davon, insbesondere variable alpha- und beta-Domänen von Einzel-Domänen-TCRs, sowie chimäre, humanisierte, bispezifische oder multispezifische TCRs.
„Fragmente eines TCRs“ umfassen einen Teil eines intakten TCRs, insbesondere die Antigenbindungsregion oder die variable Region des intakten TCRs. Beispiele für TCR-Fragmente schließen Fragmente der Kette α, β, δ, γ, wie z. B V_α- C_a oder V_β- C_β oder Teile davon ein, solche Fragmente können auch weiterhin die entsprechende Gelenkregion oder einzelne variable Domänen umfassen, wie z. B. V_α, V_β, V_δ, V_γ, Einzelkettenfragmente VaVß oder bispezifische und multispezifische TCRs, die aus TCR-Fragmenten gebildet werden.
„Einzelketten-TCR (scTCR)“ bezeichnet im vorliegenden Kontext ein Protein, wobei die variablen Domänen des TCR, wie z. B.V_α und V_β oder V_δ und V_γ auf einem Polypeptid vorliegen. Typischerweise werden die variablen Domänen durch einen Linker getrennt, wobei dieser Linker typischerweise 5 bis 20, wie z. B. 5 bis 15 Aminosäuren, umfasst.
„Nativ“ wie es z. B. in der Formulierung „nativer TCR“ verwendet wird, bezieht sich auf einen Wildtyp-TCR.
Native alpha-beta heterodimere TCRs besitzen eine alpha-Kette und eine beta-Kette. Jede alpha-Kette umfasst variable, verbindende und konstante Segmente und die beta-Kette umfasst normalerweise auch ein kurzes Diversitätssegment zwischen dem variablen und verbindenden Segment, aber das Diversitätssegment wird oft als Teil des J-Segments gesehen. Die konstanten oder C-Regionen der TCR-Alpha- und Beta-Ketten werden als TRAC bzw. TRBC bezeichnet (Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1 : Appendix 10). Jede variable Region, im Folgenden als alpha-variable Domäne und beta-variable Domäne bezeichnet, umfasst drei CDRs (komplementaritätsbestimmende Regionen), die in eine Gerüstsequenz eingebettet sind, eine davon ist die hypervariable Region, genannt CDR3. Die Alpha-variablen-Domänen-CDRs werden im vorliegenden Kontext als CDRa1, CDRa2, CDRa3 und die Beta-variablen-Domänen-CDRs als CDRb1, CDRb2, CDRb3 bezeichnet. Es gibt verschiedene Arten von variablen Segmenten (Valpha) der alpha-Kette und verschiedene Arten von variablen Segmenten (Vbeta) der beta-Kette, die sich durch ihr Gerüst, CDR1- und CDR2-Sequenzen, und durch eine teilweise definierte CDR3-Sequenz auszeichnen. Die Valpha-Typen werden in der IMGT-Nomenklatur durch eine eindeutige TRAV-Nummer, Vbeta-Typen durch eine eindeutige TRBV-Nummer bezeichnet (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), „T cell Receptor Factsbook“, Academic Press). Für weitere Informationen über Immunglobulin-Antikörper und TCR-Gene siehe die International ImMunoGeneTics Information System®, Lefranc M-P et al (Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43 (Database issue) : D413-22; and http://www.imgt.org/). Eine herkömmliche TCR-Antigenbindungsstelle beinhaltet daher in der Regel sechs CDRs, die den CDR-Set aus jeweils einer variablen Region einer alpha- und einer beta-Kette umfassen, wobei CDR1- und CDR3-Sequenzen für die Erkennung und Bindung des an das HLA-Protein gebundenen Peptidantigens relevant sind und die CDR2-Sequenzen für die Erkennung und Bindung des HLA-Proteins relevant sind.
Analog zu Antikörpern beziehen sich „TCR Framework Regionen“ (FRs) auf Aminosäuresequenzen, die zwischen CDRs eingefügt sind, d. h. auf diejenigen Abschnitte der variablen TCR-alpha- und beta-Kettenregionen, die zwischen verschiedenen TCRs in einer einzelnen Spezies relativ konserviert sind. Die alpha- und beta-Ketten eines TCRs weisen jeweils vier FRs auf, die im vorliegenden Kontext als FR1-a, FR2-a, FR3-a, FR4-a bzw. FR1-b, FR2-b, FR3-b, FR4-b bezeichnet werden. Dementsprechend kann die variable Domäne der alpha-Kette somit als (FR1-a)-(CDRa1)-(FR2-a)-(CDRa2)-(FR3-a)-(CDRa3)-(FR4-a) und die variable Domäne der beta-Kette als (FR1-b)-(CDRb1)-(FR2-b)-(CDRb2)-(CDRb2)-(FR3-b)-(FR4-b) bezeichnet werden.
Im Rahmen der Erfindung ist die CDR/FR-Definition in einer α- oder β-Kette oder einer γ- oder δ-Kette anhand der IMGT-Definition zu bestimmen (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org). Dementsprechend werden CDR/FR-Aminosäurepositionen, wenn sie mit TCR oder von TCR abgeleiteten Domänen in Beziehung stehen, gemäß der genannten IMGT-Definition angegeben. In einem Beispiel wird die IMGT-Position der CDR/FR-Aminosäurepositionen der ersten variablen Domäne in Analogie zur IMGT-Nummerierung von TRAV5 angegeben und/oder die IMGT-Position der CDR/FR-Aminosäurepositionen der zweiten variablen Domäne wird in Analogie zur IMGT-Nummerierung von TRBV12-4 angegeben, dies ist z. B. der Fall für die variablen Domänen der Antigenbindungsstelle B, die gegen das antigene Peptid MAGE-A der SEQ ID NO: 10 gerichtet ist.
In einem „Antikörper“, auch „Immunalobulin“ genannt, sind zwei schwere Ketten durch Disulfidbindungen miteinander verbunden und jede schwere Kette ist durch eine Disulfidbindung mit einer leichten Kette verbunden. Es gibt zwei Arten von leichten Ketten, Lambda (I) und Kappa (k). Es gibt fünf Hauptklassen (oder Isotypen) von schweren Ketten, die die funktionelle Aktivität eines Antikörpermoleküls bestimmen: IgM, IgD, IgG, IgA und IgE. Jede Kette enthält unterschiedliche Sequenzdomänen. Die leichte Kette umfasst zwei Domänen oder Regionen, eine variable Domäne (VL) und eine konstante Domäne (C_L). Die schwere Kette umfasst vier Domänen, eine variable Domäne (V_H) und drei konstante Domänen (C_H1, C_H2 und C_H3, zusammen als C_H bezeichnet). Die variablen Regionen der leichten (VL) und schweren (V_H) Ketten bestimmen die Bindungserkennung und die Spezifität für das Antigen. Die konstanten Domänen der leichten (C_L) und schweren (C_H) Ketten verleihen wichtige biologische Eigenschaften wie Antikörperkettenassoziation, Sekretion, trans-plazentare Mobilität, Komplementbindung und Bindung an F_c-Rezeptoren (F_cR). Das Fv-Fragment ist der N-terminale Teil des Fab-Fragments eines Immunglobulins und besteht aus den variablen Abschnitten einer leichten Kette und einer schweren Kette. Die Spezifität des Antikörpers liegt in der strukturellen Komplementarität zwischen der Antikörperbindungsstelle und der antigenen Determinante. Antikörperbindungsstellen bestehen aus Resten, die hauptsächlich aus den hypervariablen oder Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs) stammen. Gelegentlich beeinflussen Rückstände aus nicht-hypervariablen oder Framework-Regionen (FR) die gesamte Domänenstruktur und damit die Bindungsstelle. Komplementarität bestimmende Regionen oder CDRs beziehen sich auf Aminosäuresequenzen, die zusammen die Bindungsaffinität und Spezifität der natürlichen Fv-Region einer nativen Immunglobulin-Bindungsstelle definieren. Die leichten und schweren Ketten eines Immunglobulins weisen jeweils drei CDRs auf, die als CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L bzw. CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H bezeichnet werden. Eine herkömmliche Antikörper-Antigen-Bindungsstelle beinhaltet daher sechs CDRs, die den CDR-Set aus jeweils einer V-Region einer schweren und einer leichten Kette umfassen.
Im Kontext der Erfindung ist der Antikörper oder das Immunglobulin ein IgM, IgD, IgG, IgA oder IgE.
„Framework-Regionen eines Antikörpers“ (FRs) beziehen sich auf Aminosäuresequenzen, die zwischen CDRs eingefügt sind, d. h. auf diejenigen Abschnitte von Immunglobulins variablen Regionen der leichten und schweren Kette, die relativ konserviert zwischen verschiedenen Immunglobulinen in einer einzigen Spezies sind. Die leichten und schweren Ketten eines Immunglobulins haben jeweils vier FRs, bezeichnet als FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L bzw. FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H. Dementsprechend kann die variable Domäne der leichten Kette als (FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L) und die variable Domäne der schweren Kette als (FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR3-H)-(FR4-H) bezeichnet werden.
Im Zusammenhang mit der Erfindung ist die CDR/FR-Definition in einer leichten oder schweren Immunglobulin-Kette, insbesondere in der leichten oder schweren Immunglobulin-Kette der Anti-CD3-Antikörpervarianten im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, auf der Grundlage von Kabat (Kabat EA, Te, Wu T, Foeller C, Perry HM, Gottesman KS. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest.) zu bestimmen. Die Positionsnummerierung der CDR/FR-Aminosäuren der leichten oder schweren Ketten des Immunglobulins, insbesondere der UCHT1-Varianten im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, ist jedoch fortlaufend. Dementsprechend liegt z. B. CDRH1, wie nach Kabat bestimmt, im Bereich von Aminosäureposition 31 bis 35, CDRH2, wie nach Kabat bestimmt, von Aminosäureposition 50 bis 66 und CDRH3, wie nach Kabat bestimmt, von Aminosäureposition 99 bis 111. Dementsprechend liegt z.B. CDRL1, wie nach Kabat bestimmt, im Bereich von Aminosäureposition 24 bis 34, CDRL2, wie nach Kabat bestimmt, im Bereich von Aminosäureposition 50 bis 56.
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, ist eine „menschliche Framework-Region“ eine Framework-Region, die mit der Framework-Region eines natürlich vorkommenden antigenbindenden Proteins, wie z. B. eines natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpers oder einer menschlichen TCR im Wesentlichen (etwa 85% oder mehr, insbesondere 90%, 95%, 97%, 99% oder 100%) identisch ist.
Der Begriff „Antikörper“ bezeichnet Antikörper und Fragmente davon sowie Einzeldomänenantikörper und ihre Fragmente, insbesondere variable schwere Kette von Einzeldomänenantikörpern, und chimäre, humanisierte, bispezifische oder multispezifische Antikörper.
Ein „konventioneller Antikörper“, wie vorliegend bezeichnet, ist ein Antikörper, der dieselben Domänen wie ein aus der Natur isolierter Antikörper hat und von Antikörpern abgeleitete CDRs und Framework-Regionen umfasst. In Analogie dazu ist ein „konventioneller TCR“, wie vorliegend bezeichnet, ein TCR, der die gleichen Domänen wie ein nativer TCR und von TCR abgeleitete CDRs und Framework-Regionen umfasst.
Der Begriff „humanisierter Antikörper“ bezieht sich auf einen Antikörper, der ganz oder teilweise nicht-menschlichen Ursprungs ist und der modifiziert wurde, um bestimmte Aminosäuren zu ersetzen, insbesondere in den Framework-Regionen der schweren und leichten Ketten des nicht-humanen monoklonalen Antikörpers, um eine Immunantwort beim Menschen zu vermeiden oder zu minimieren. Die konstanten Domänen eines humanisierten Antikörpers sind meist menschliche C_H und C_L Domänen.
Zahlreiche Verfahren zur Humanisierung einer Antikörpersequenz sind in der Technik bekannt; siehe z. B. die Übersicht von Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633. Ein häufig verwendetes Verfahren ist die CDR-Transplantation oder die Antikörperumformung, bei der die CDR-Sequenzen eines Spenderantikörpers, in der Regel eines Mausantikörpers, in das Framework-Scaffold eines menschlichen Antikörpers unterschiedlicher Spezifität transplantiert werden. Da die CDR-Transplantation die Bindungsspezifität und Affinität und damit die biologische Aktivität eines CDR-transplantierten nicht-menschlichen Antikörpers reduzieren kann, können an ausgewählten Positionen des CDR-transplantierten Antikörpers Rückmutationen eingeführt werden, um die Bindungsspezifität und Affinität des Ausgangsantikörpers zu erhalten. Die Identifizierung von Positionen für mögliche Rückenmutationen kann anhand von Informationen aus der Literatur und in Antikörperdatenbanken erfolgen. Eine alternative Humanisierungstechnik zur CDR-Transplantation und Rückmutation ist die Wiederherstellung der Oberfläche, bei der nicht oberflächenexponierte Reste nicht-menschlichen Ursprungs beibehalten werden, während Oberflächenreste in Reste menschlichen Ursprungs umgewandelt werden. Eine weitere alternative Technik ist die so genannte „Guided Selection“ (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12, 899) und kann beispielsweise aus einem Mausantikörper einen vollständig menschlichen Antikörper ableiten, der das Epitop konserviert und die Bindungseigenschaften des Ausgangsantikörpers aufweist. Ein weiteres Verfahren der Humanisierung ist die so genannte 4D-Humanisierung. Das 4D-Humanisierungsprotokoll ist in der Patentanmeldung US20110027266 A1 ( WO200909032661A1 ) beschrieben. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wurde der monoklonale Maus-Antikörper UCHT1, wie vorliegend in Beispiel 1 ausführlich beschrieben, humanisiert.
Für chimäre Antikörper beinhaltet die Humanisierung typischerweise eine Modifikation der Framework-Regionen der Sequenzen der variablen Region.
Aminosäurereste, die Teil einer CDR sind, werden typischerweise im Zusammenhang mit der Humanisierung nicht verändert, obwohl es in bestimmten Fällen wünschenswert sein kann, einzelne CDR-Aminosäurereste zu verändern, z. B. um eine Glykosylierungsstelle, eine Deamidierungsstelle, eine Isomerisierungsstelle oder einen unerwünschten Cysteinrest zu entfernen. Die N-verknüpfte Glykosylierung erfolgt durch Anlagerung einer Oligosaccharidkette an einen Asparaginrest in der Tripeptidsequenz Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr, in welcher X eine beliebige Aminosäure außer Pro sein kann. Die Entfernung einer N-Glykosylierungsstelle kann erreicht werden, indem entweder der Asn- oder der Ser/Thr-Rest zu einem anderen Rest mutiert wird, insbesondere durch konservative Substitution. Die Deamidierung von Asparagin- und Glutaminresten kann je nach Faktoren wie pH-Wert und Oberflächenbelastung erfolgen. Asparaginreste sind besonders anfällig für Deamidierung, vor allem wenn sie in der Sequenz Asn-Gly und in geringerem Maße in anderen Dipeptidsequenzen wie Asn-Ala vorkommen. Wenn eine solche Deamidierungsstelle, insbesondere Asn-Gly, in einer CDR-Sequenz vorhanden ist, kann es daher wünschenswert sein, die Stelle zu entfernen, typischerweise durch konservative Substitution, um eine der implizierten Reste zu entfernen. Die Substitution in einer CDR-Sequenz zur Entfernung eines der implizierten Reste soll ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst werden.
„Fragmente von Antikörpern“ umfassen einen Teil eines intakten Antikörpers, insbesondere die Antigenbindungsregion oder die variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele für Antikörperfragmente sind Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, Diabodies, bispezifische und multispezifische Antikörper aus Antikörperfragmenten. Ein Fragment eines Antikörpers kann auch ein Einzeldomänenantikörper sein, wie beispielsweise ein Schwerkettenantikörper oder VHH.
Der Begriff „Fab“ bezeichnet ein Antikörperfragment mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000 Dalton und Antigenbindungsaktivität, bei dem etwa die Hälfte der N-terminalen Seite der H-Kette und die gesamte L-Kette unter den Fragmenten, die durch die Behandlung von IgG mit einer Protease, Papain, erhalten wurden, über eine Disulfidbindung miteinander verbunden sind.
Der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „Format“ bezieht sich hier auf bispezifische antigenbindende Proteine, die eine bestimmte Anzahl und Art der Domänen, die in dem bispezifischen antigenbindenden Protein vorhanden sind, und deren räumliche Organisation umfasst.
Viele verschiedene Formate, wie z. B. bispezifische Formate, sind in der Technik beschrieben, typischerweise im Zusammenhang mit Antikörpern, solche Formate umfassen die nicht einschränkenden Beispiele, wie z. B. Diabodies, die Cross-Over-Dual-Variable-Domäne (CODV) und/oder in den Dual-Variable-Domäne (DVD) Proteinen. Ein Überblick über diese verschiedenen bispezifischen Antikörper und deren Herstellung ist beispielsweise in Brinkmann U. und Kontermann R.E. MAbs. 2017 Feb-Mar; 9(2): 182-212 offenbart. Insbesondere wird das DVD-Format beispielsweise in den folgenden wissenschaftlichen Artikeln offengelegt (Wu C et al. Nat Biotechnol 2007; 25:1290-7; PMID:17934452; Wu C. et al. MAbs 2009; 1:339-47; Lacy SE et al. MAbs 2015; 7:605-19; PMID:25764208; Craig RB et al. PLoS One 2012; 7:e46778; PMID:23056448; Piccione EC et al. MAbs 2015). Der CODV wird beispielsweise inOnuoha SC et al. Arthritis Rheumatol. 2015 Oct; 67(10):2661-72 oder zum Beispiel in WO2012/135345 , WO2016/116626 ) offenbart. Bispezifische Diabodies werden beispielsweise in Holliger P et al. Protein Eng 1996; 9:299-305; PMID:8736497; Atwell JL et al. Mol Immunol 1996; 33:1301-12; PMID:9171890; Kontermann RE, Nat Biotechnol 1997; 15:629-31; PMID:9219263; Kontermann RE et al. Immunotechnology 1997; 3:137-44; PMID:9237098; Cochlovius B et al. Cancer Res 2000; 60:4336-41; PMID:10969772; und DeNardo DG et al. Cancer Biother Radiopharm 2001; 16:525-35; PMID:11789029) beschrieben.
„Diabodies“, wie sie im Zusammenhang mit Antikörpern verwendet werden, beziehen sich normalerweise auf bivalente Moleküle, die aus zwei Ketten bestehen, die jeweils eine VH- und eine VL-Domäne umfassen, die entweder von demselben oder von verschiedenen Antikörpern stammen. Die beiden Ketten haben typischerweise die Konfiguration VHA-VLB und VHB-VLA (A und B repräsentieren zwei verschiedene Spezifitäten) oder VLA-VHB und VLB-VHA.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich „Diabodies (Db)“ oder das „Diabody-Format“ hier auf bivalente Moleküle, die aus zwei Polypeptidketten bestehen, die jeweils zwei variable Domänen umfassen, die durch einen Linker verbunden sind (L_Db1 und L_Lb2), wobei zwei der Domänen erste und zweite Domänen sind, wie sie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung definiert sind (V₁ und V₂) und die anderen beiden Domänen von TCR abgeleitete oder von Antikörpern abgeleitete variable Domänen (V_A,V_B) sein können. Die V₁ und V₂ Domänen befinden sich auf zwei verschiedenen Polypeptiden und die V_A und V_B Domänen befinden sich auf zwei verschiedenen Polypeptiden und die Domänen dimerisieren in einer Kopf-Schwanz-Orientierung. Dementsprechend kann die Orientierung V₁-L_Db1-V_A und V_B-L_Db2-V₂, V₂-L_Db1-V_a, und V_B-L_Db2-V₁, V₁-L_Db1-V_B und V_A-L_Db2-V₂ 'or V₂-L_Db1-V_B und V_A-L_ob2-V₁ sein. Damit die Domänen den Linker, d. h. L_Db1 und L_Db1, die gleich oder unterschiedlich sind, von Kopf zu Kopf dimerisieren können, sind kurze Linker, wobei ein kurzer Linker ein Linker ist, der typischerweise zwischen 2 bis 12, 3 bis 13, wie z. B. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, z. B. 4, 5, Aminosäuren lang ist (Brinkmann U. and Kontermann R.E. (MAbs. 2017 Feb-Mar; 9(2): 182-212) oder 8 Aminosäuren lang, wie z. B. ‚GGGS‘ von SEQ ID NO: 114, ‚GGGGS‘ von SEQ ID NO: 115 oder'GGGSGGGG' von SEQ ID NO: 118.
Das „Dual-Variable-Domain Immunoglobulin DVD-Ig™)‟ Format wurde erstmals 2007 von Wu C. et al. (Nat Biotechnol. 2007 Nov; 25(11):1290-7) beschrieben. In diesem Format sind die targetbindenden variablen Domänen eines, typischerweise zweiten monoklonalen Antikörpers (B) typischerweise mit einem konventionellen Antikörper (A) (umfassend die Domänen V_LA und V_HA), fusioniert, wobei die leichte Kette des konventionellen Antikörpers (A) somit eine zusätzliche variable Domäne der leichten Kette (V_LB) und die schwere Kette des konventionellen Antikörpers (A) eine zusätzliche variable Domäne der schweren Kette (V_HB) umfasst. Die DVD-Ig™, wie in der Technik beschrieben, ist daher typischerweise aus zwei Polypeptidketten zusammengesetzt, wobei eine schwere Kette V_HB-L-V_HA-C_H1-C_H2-C_H3 und eine leichte Kette V_LB-L-V_LA-C_L umfasst. Die Domänenpaare V_LA/V_HA und V_LA/ VLA paaren sich also parallel.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich das „Dual-Variable-Domain-Iq-Format“ auf ein Protein, das zwei Polypeptidketten umfasst, die jeweils zwei variable Domänen umfassen, die durch einen Linker (L₁, L₃), verbunden sind, wobei zwei der Domänen erste und zweite Domänen sind, wie sie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung definiert sind (V₁ und V₂) und die anderen beiden Domänen von Antikörpern abgeleitete variable Schwer- und Leichtketten-Domänen (V_HA und V_HB) sind. Im DVD-Ig-Format im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung haben die Polypeptidketten beispielsweise die Organisation V₁-L₁-V_HA-L_z-C_H1-C_Hz-C_H3 und V₂-L₃-V_LA-L₄-C_L oder V₂-L₁-V_HA-L₂-C_H1-C_H2-C_H3 und V₁-L₃-V_LA-L₄-C_L. Die verbindenden Linker L₁ und L₃ sind vorzugsweise zwischen 5 und 20 Reste, wie z. B. 5 bis 15 Aminosäuren, und/oder die verbindenden Linker L₂ und L₄ können vorhanden oder nicht vorhanden sein.
Die „Crossover-Doppelvariablen-Domänen-Ig-ähnliche Proteine“, wie sie in der Technik im Zusammenhang mit Antikörpern beschrieben werden, stellen ein Format dar, bei dem zwei V_H und zwei V_L Domänen so verbunden sind, dass eine Crossover-Paarung der variablen V_H-V_L Domänen möglich ist, die entweder (vom N- zum C-Terminus) in der Reihenfolge V_HA-V_HB und V_LB-V_LA, oder in der Reihenfolge V_HB-V_HA und V_LA-V_LB angeordnet sind.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beziehen sich die „Crossover-Doppelvariablen-Domänen-Ig-ähnliches Protein“ auf ein Protein, das zwei Polypeptidketten umfasst, die jeweils zwei variable Domänen umfassen, die durch einen Linker verbunden sind (L₁, L₂, L₃ und L₄), wobei zwei der Domänen erste und zweite Domänen sind, wie sie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung definiert sind (V₁ und V₂), und die anderen beiden Domänen von Antikörpern abgeleitete variable Schwer- und Leichtketten-Domänen (V_HA, V_HB) sind. Im CDVD-Ig-Format im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung haben die Polypeptidketten beispielsweise die Organisation V₁-L₁-V_HA-L₂-C_H1-C_H2-C_H3 und V_LA-L₃-V₂-L₄-C_L, V₂-L₁-V_HA-L₂-C_H1-C_H2-C_H3 und V_LA-L₃-V₁-L₄-C_L, V_HA-L₁-V₁-L_z-C_H1-C_Hz-C_H3 und V₂-L₃-V_LA-L_DvD3-C_L oder V_HA-L₁-V_z-L_z-C_H1-C_Hz-C_H3 und V₁-L₃-V_LA-L₄-C_L In diesem CDVD-Format sind die Linker (L₁ bis L₄) typischerweise von unterschiedlicher Länge, einschließlich All-Glycin-Linker und Linker, wie hier unten im Abschnitt Linker beschrieben. Zum Beispiel ist L₁ 3 bis 12 Aminosäurereste lang, L₂ ist 3 bis14 Aminosäurereste lang, L₃ ist 1 bis 8 Aminosäurereste lang und L₄ ist 1 bis 3 Aminosäurereste lang, oder
L₁ ist 5 bis 10 Aminosäurereste lang, L₂ ist 5 bis 8 Aminosäurereste lang, L₃ ist 1 bis 5 Aminosäurereste lang und L₄ ist 1 bis 2 Aminosäurereste lang, oder L₁ ist 7 Aminosäurereste lang, L₂ ist 5 Aminosäurereste lang, L₃ ist 1 Aminosäurerest lang, und L₄ ist 2 Aminosäurereste lang.
„Mindestens ein“ bezieht sich im vorliegenden Kontext auf ein oder mehrere der angegebenen Objekte, wie z. B. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 oder mehr angegebene Objekte. Zum Beispiel bezieht sich mindestens eine Bindungsstelle im vorliegenden Kontext auf 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 oder mehr Bindungsstellen.
Eine Sequenz „mindestens zu 85% identisch mit einer Referenzsequenz“ ist eine Sequenz, die auf ihrer gesamten Länge 85% oder mehr, insbesondere 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit der gesamten Länge der Referenzsequenz aufweist.
Im Kontext der vorliegenden Anwendung wird der „Prozentsatz der Identität“ mittels einer globalen paarweisen Ausrichtung berechnet (d. h. die beiden Sequenzen werden über ihre gesamte Länge verglichen). Verfahren zum Vergleich der Identität von zwei oder mehr Sequenzen sind in der Technik bekannt. Das Programm „Needle“, das den globalen Ausrichtalgorithmus Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453) verwendet, um die optimale Ausrichtung (einschließlich Lücken) zweier Sequenzen unter Berücksichtigung ihrer gesamten Länge zu finden, kann beispielsweise verwendet werden. Das Needle-Programm ist beispielsweise auf der Internet-Seite verfügbar und wird in der folgenden Publikation näher beschrieben (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp. 276-277). Der Prozentsatz der Identität zwischen zwei Polypeptiden wird gemäß der Erfindung mit dem Programm EMBOSS needle (global) mit einem „Gap Open“ Parameter gleich 10,0, einem „Gap Extend“ Parameter gleich 0,5 und einer Blosum62 Matrix berechnet.
Proteine, die aus einer Aminosäuresequenz bestehen, die „mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch“ zu einer Referenzsequenz ist, können Aminosäuremutationen wie Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen im Vergleich zur Referenzsequenz umfassen. Im Falle von Substitutionen kann das Protein, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die mindestens zu 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% einer Referenzsequenz identisch ist, einer homologen Sequenz entsprechen, die von einer anderen Spezies als der Referenzsequenz stammt.
„Aminosäuresubstitutionen“ können konservativ oder nicht-konservativ sein. Vorzugsweise sind Substitutionen konservative Substitutionen, bei denen eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften ersetzt wird.
In einer Ausführungsform können konservative Substitutionen diejenigen beinhalten, die von Dayhoff im „The Atlas of Protein Sequence and Structure. Vol. 5“, Natl. Biomedical Research beschrieben werden, deren Inhalt durch Verweis in seiner Gesamtheit übernommen wird. So können beispielsweise in einem Aspekt Aminosäuren, die zu einer der folgenden Gruppen gehören, gegeneinander ausgetauscht werden und bilden somit einen konservativen Austausch: Gruppe 1: Alanin (A), Prolin (P), Glycin (G), Asparagin (N), Serin (S), Threonin (T); Gruppe 2: Cystein (C), Serin (S), Tyrosin (Y), Threonin (T); Gruppe 3: Valin (V), Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Alanin (A), Phenylalanin (F); Gruppe 4: Lysin (K), Arginin (R), Histidin (H); Gruppe 5: Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W), Histidin (H); und Gruppe 6: Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E). In einem Aspekt kann eine konservative Aminosäuresubstitution aus T→A, G→A, A→I, T→V, A→M, T→I, A→V, T→G und/oder T→S ausgewählt werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine konservative Aminosäuresubstitution die Substitution einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure der gleichen Klasse beinhalten, zum Beispiel (1) unpolar: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp; (2) ungeladen polar: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln; (3) sauer: Asp, Glu; und (4) basisch: Lys, Arg, His. Andere konservative Aminosäuresubstitutionen können ebenfalls wie folgt vorgenommen werden: (1) aromatisch: Phe, Tyr, His; (2) Protonendonator: Asn, Gln, Lys, Arg, His, Trp; und (3) Protonenakzeptor: Glu, Asp, Thr, Ser, Tyr, Asn, Gln (siehe z. B. US-Patent Nr. 10 106 805 , dessen Inhalt durch Verweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird).

In einer weiteren Ausführungsform können konservative Substitutionen gemäß Tabelle 3 vorgenommen werden. Verfahren zur Vorhersage der Toleranz gegenüber Proteinmodifikationen finden sich beispielsweise bei Guo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 101 (25):9205-9210 (2004), deren Inhalt durch Verweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird. Tabelle 3: Konservative Aminosäuresubstitution

Konservative Aminosäuresubstitution
Aminosäure	Substitutionen (andere sind im Stand der Technik bekannt)
Ala	Ser, Gly, Cys
Arg	Lys, Gln, His
Asn	Gln, His, Glu, Asp
Asp	Glu, Asn, Gln
Cys	Ser, Met, Thr
Gln	Asn, Lys, Glu, Asp, Arg
Glu	Asp, Asn, Gln
Gly	Pro, Ala, Ser
His	Asn, Gln, Lys
Ile	Leu, Val, Met, Ala
Leu	Ile, Val, Met, Ala
Lys	Arg, Gln, His
Met	Leu, Ile, Val, Ala, Phe
Phe	Met, Leu, Tyr, Trp, His
Ser	Thr, Cys, Ala
Thr	Ser, Val, Ala
Trp	Tyr, Phe
Tyr	Trp, Phe, His
Val	Ile, Leu, Met, Ala, Thr

In einer weiteren Ausführungsform können konservative Substitutionen die in der Tabelle 3 unter der Überschrift „konservative Substitutionen“ aufgeführten sein. Wenn solche Substitutionen zu einer Änderung der biologischen Aktivität führen, können wesentlichere Änderungen, die in der Tabelle 4 als „exemplarische Substitutionen“ bezeichnet werden, eingeführt und die Produkte bei Bedarf überprüft werden. Tabelle 4: Aminosäuresubstitution

Aminosäuresubstitutionen
Ursprünglicher Rest (natürlich vorkommende Aminosäure)	Konservative Substitutionen	Exemplarische Substitutionen
Ala (A)	Val	Val; Leu; Ile
Arg (R)	Lys	Lys; Gln; Asn
Asn (N)	Gln	Gln; His; Asp, Lys; Arg
Asp (D)	Glu	Glu; Asn
Cys (C)	Ser	Ser; Ala
Gln (Q)	Asn	Asn; Glu
Glu (E)	Asp	Asp; Gl_n
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Arg	Asn; Gln; Lys; Arg
Ile (I)	Leu	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucin
Leu (L)	Ile	Norleucin; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K)	Arg	Arg; Gln; Asn
Met (M)	Leu	Leu; Phe; Ile
Phe (F)	Tyr	Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr	Tyr; Phe
Tyr (Y)	Phe	Trp; Phe; Thr; Ser
Val (V)	Leu	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucin

In einigen Ausführungsformen kann das bispezifische antigenbindende Protein eine antigenbindende Proteinvariante beinhalten, wobei die bispezifische antigenbindende Proteinvariante eine erste Polypeptidkette (wie eine α-Kette) und eine zweite Polypeptidkette (wie eine β-Kette) beinhaltet, die bis zu 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr Aminosäuresubstitutionen umfasst, vorzugsweise in den CDR-Regionen der ersten variablen Domäne (z. B. einer Valpha-Domäne) und der zweiten variablen Domäne (z. B. einer Vbeta-Domäne) im Vergleich zu dem bispezifischen antigenbindenden Protein, von dem die Variante abgeleitet ist. In diesem Zusammenhang können 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr Aminosäuresubstitutionen in den CDR-Regionen des bispezifischen antigenbindenden Proteins vorhanden sein. Substitutionen können in den CDRs entweder in den ersten und/oder zweiten variablen Domäne erfolgen.
In einer Ausführungsform ist die Variante eine funktionale Variante.
Der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „funktionelle Variante“ bezieht sich auf ein bispezifisches antigenbindendes Protein mit einer wesentlichen oder signifikanten Sequenzidentität oder Ähnlichkeit mit einem parentalen bispezifischen antigenbindenden Protein, wie beispielsweise solchen bispezifischen antigenbindenden Proteine, die konservative Aminosäuresubstitutionen enthalten, wobei die funktionelle Variante die biologische Aktivität des parentalen bispezifischen antigenbindenden Proteins beibehält. In einem Aspekt umfassen funktionelle Varianten beispielsweise die im vorliegenden Kontext beschriebenen Varianten von bispezifischen antigenbindenden Proteinen (die vorliegend beschriebenen antigenbindenden Proteine werden dann selbst als elterliche antigenbindende Proteine bezeichnet), die die Fähigkeit bewahren, Zielzellen in ähnlichem Umfang, im gleichen Umfang oder in höherem Maße zu erkennen wie die übergeordneten bispezifischen antigenbindenden Proteine. In Bezug auf das elterliche bispezifischen antigenbindende Protein kann die funktionelle Variante beispielsweise eine Aminosäuresequenz haben, die mindestens zu 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Aminosäuresequenz des elterlichen bispezifischen antigenbindenden Proteins identisch ist.
Die funktionelle Variante kann beispielsweise die Aminosäuresequenz des übergeordneten bispezifischen antigenbindenden Proteins mit mindestens einer konservativen Aminosäuresubstitution umfassen. Alternativ oder zusätzlich können die funktionellen Varianten die Aminosäuresequenz des übergeordneten bispezifischen antigenbindenden Proteins mit mindestens einer nicht-konservativen Aminosäuresubstitution umfassen. In diesem Fall ist es vorzuziehen, dass die nicht-konservative Aminosäuresubstitution die biologische Aktivität der funktionellen Variante nicht stört oder hemmt. Vorzugsweise erhöht die nicht-konservative Aminosäuresubstitution die biologische Aktivität der funktionellen Variante, so dass die biologische Aktivität der funktionellen Variante im Vergleich zum parentalen bispezifischen antigenbindenden Protein erhöht wird.
Die modifizierten TCRs, Polypeptide und Proteine der vorliegenden Offenbarung (einschließlich funktioneller Abschnitte und funktioneller Varianten) können beliebig lang sein, d. h. eine beliebige Anzahl von Aminosäuren umfassen, vorausgesetzt, dass die modifizierten TCRs, Polypeptide oder Proteine (oder funktionelle Abschnitte oder funktionelle Varianten davon) ihre biologische Aktivität beibehalten, z. B. die Fähigkeit, spezifisch an Antigen zu binden, krankhafte Zellen in einem Wirt nachzuweisen oder Krankheiten in einem Wirt zu behandeln oder zu verhindern, etc.
Die bispezifischen antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindungen (einschließlich funktioneller Abschnitte und funktioneller Varianten) können synthetische Aminosäuren anstelle einer oder mehrerer natürlich vorkommenden Aminosäuren umfassen. Solche synthetischen Aminosäuren sind in der Technik bekannt und können beispielsweise Aminocyclohexancarbonsäure, Norleucin, α-Amino n-Dekansäure, Homoserin, S-Acetylaminomethylcystein, trans-3- und trans-4-Hydroxyprolin, 4-Aminophenylalanin, 4-Nitrophenylalanin, 4-Chlorphenylalanin, 4-Carboxyphenylalanin, β-Phenylserin β-Hydroxyphenylalanin, Phenylglycin, α-Naphthylalanin, Cyclohexylalanin, Cyclohexylglycin, Indolin-2-Carbonsäure, 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-Carbonsäure, Aminomalonsäure, Aminomalonsäuremonoamid, N'-benzyl-N'-methyllysin, N',N'-dibenzyllysin, 6-Hydroxylysin, Ornithin, α-Aminocyclopentancarbonsäure, α-Aminocyclohexancarbonsäure, α-Aminocycloheptancarbonsäure, α-(2-Amino-2-norbornan)-Carbonsäure, α,γ-Diaminobuttersäure, α,β-Diaminopropionsäure, Homophenylalanin und α-tert-butylglycin beinhalten.
In einer Ausführungsform kann das bispezifische antigenbindende Protein der vorliegenden Erfindung (einschließlich funktioneller Abschnitte und funktioneller Varianten) glykosyliert, amidiert, carboxyliert, phosphoryliert, verestert, N-acyliert, zyklisiert, z. B. über eine Disulfidbrücke, oder in ein Säureadditionssalz und/oder gegebenenfalls dimerisiert oder polymerisiert oder konjugiert umgewandelt werden.
Das bispezifische antigenbindende Protein der vorliegenden Offenbarung kann synthetisch, rekombinant, isoliert und/oder gereinigt sein.
Eine „kovalente Verbindung“ bezieht sich im vorliegenden Kontext beispielsweise auf eine Disulfidbrücke oder eine Peptidbindung oder eine kovalente Verbindung über einen Linker, wie beispielsweise einen Polypeptidlinker.
Der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „Linker“ bezieht sich auf einen oder mehrere Aminosäurereste, die zwischen den Domänen eingefügt werden, um eine ausreichende Mobilität für die Domänen zu gewährleisten, beispielsweise in Einzelkettenkonstrukten, zwischen die erste variable Domäne und die zweite variable Domäne der bispezifischen antigenbindenden Proteinen der Erfindung und gegebenenfalls zwischen den variablen Domänen der variablen Domänen der leichten und schweren Kette, um richtig zu falten, um die Antigenbindungsstelle oder, im Fall von bispezifischen antigenbindenden Proteinen, um die Antigenbindungsstelle und die mindestens eine weitere Antigenbindungsstelle zu bilden, entweder in einer Crossover-Paarung (in einem CODV-Format oder in einigen der Diabody-Formate) oder in einer parallelen Paarungskonfiguration (z. B. in einem DVD-Format) der erfindungsgemäßen bispezifischen antigenbindenden Proteine.
In einigen Ausführungsformen besteht ein Linker aus 0 Aminosäuren, was bedeutet, dass der Linker fehlt. Ein Linker wird am Übergang zwischen variablen Domänen oder zwischen variablen Domänen bzw. konstanten Domänen auf der Ebene der Aminosäuresequenz eingefügt. Der Übergang zwischen den Domänen kann identifiziert werden, da die ungefähre Größe der Immunglobulindomänen sowie der TCR-Domänen hinreichend bekannt ist. Dem Fachmann ist es bekannt, dass die genaue Position eines Domänenübergangs bestimmt werden kann, indem Peptidfragmente lokalisiert werden, die keine sekundären Strukturelemente wie beta-Blätter oder alpha-Helices bilden, wie durch experimentelle Daten gezeigt oder wie durch Verwendung von Techniken der Modellierung oder sekundären Strukturvorhersage identifiziert oder angenommen werden kann. Der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff Linker bezieht sich auf die als L₁, L₂, L₃, L₄, L₅ und L₆ bezeichneten Linker, ist aber nicht darauf beschränkt.
Ein Linker kann, sofern er im jeweiligen Kontext nicht anders spezifiziert ist, wie z. B. L₁, L₂, L₃, L₄, L₅ und L₆, eine Länge von mindestens 1 bis 30 Aminosäuren aufweisen. In einigen Ausführungsformen kann ein Linker, wie z. B. L₁, L₂, L₃, L₄, L₅ und L₆, 2-25, 2-20, oder 3-18 Aminosäuren lang sein. In einigen Ausführungsformen kann ein Linker, wie z. B. L₁, L₂, L₃, L₅ und L₆, ein Peptid mit einer Länge von nicht mehr als 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, oder 5 Aminosäuren sein. In anderen Ausführungsformen kann ein Linker, wie L₁, L₂, L₃, L₄, L₅ und L₆,5-25, 5-15, 4-11, 10-20, oder 20-30 Aminosäuren lang sein. In anderen Ausführungsformen kann ein Linker, wie L₁, L₂, L₃, L₄, L₅ und L₆, etwa 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30 Aminosäuren lang sein. In einer bestimmten Ausführungsform können Linker, wie L₁, L₂, L₃, L₄, L₅ und L₆, weniger als 24, weniger als 20, weniger als 16, weniger als 12, weniger als 10, z. B. 5 bis 24, 10 bis 24 oder 5-10 Aminosäurereste lang sein. In einigen Ausführungsformen ist der Linker gleich 1 oder weist mehr Aminosäureresten in der Länge auf, wie beispielsweise mehr als 1, mehr als 2, mehr als 5, mehr als 10, mehr als 20 Aminosäurereste, mehr als 22 Aminosäurereste in der Länge. Beispielhafte Linker, wie z. B. L₁, L₂, L₃, L₄, L₅ und L₆, enthalten oder bestehen aus der Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäuren, bestehend aus den Aminosäuresequenzen TVAAP (SEQ ID NO: 113), GGGS (SEQ ID NO: 114), GGSGG (SEQ ID NO: 28), GGGGS (SEQ ID NO: 115), TVLRT (SEQ ID NO: 116), TVSSAS (SEQ ID NO: 117), GGGSGGGG (SEQ ID NO: 118), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 119), GGGGSAAA (SEQ ID NO: 120), GGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 29), GGSGGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 32), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 121) GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGS (SEQ ID NO: 122), GGSGGGGSGGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 123), GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 66), GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO: 97), GGQGSGGTGSGGQGSGGTGSGGQGS (SEQ ID NO: 143), TVLSSAS (SEQ ID NO: 124), GGGGSGT (SEQ ID NO: 183) and GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 125), insbesondere GGGSGGGG (SEQ ID NO:118), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 125) und GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 123).
Der Begriff „F_c-Domäne“ wie er im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst native F_c-Domänen und F_c-Domänvarianten und Sequenzen, wie sie hier im Folgenden definiert sind. Wie bei F_c-Varianten und nativen F_c-Molekülen schließt der Begriff „F_c-Domäne“ Moleküle in monomerer oder multimerer Form ein, entweder aus dem ganzen Antikörper verdaut oder auf andere Weise hergestellt.
Der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „nativer _E_c“ bezieht sich auf ein Molekül, das die Sequenz eines nicht antigenbindenden Fragments umfasst, das durch den Verdau eines Antikörpers entsteht oder auf andere Weise hergestellt wird, entweder in monomerer oder multimerer Form, und das die Gelenkregion enthalten kann. Die ursprüngliche Immunglobulinquelle des nativen F_c ist insbesondere menschlichen Ursprungs und kann jedes der Immunglobuline sein, vorzugsweise IgG1 oder IgG2, am meisten bevorzugt - IgG1. Native Fc-Moleküle bestehen aus monomeren Polypeptiden, die durch kovalente (d. h. disulfidische Bindungen) und nicht kovalente Assoziationen in dimere oder multimere Formen verknüpft werden können. Die Anzahl der intermolekularen Disulfidbindungen zwischen monomeren Untereinheiten nativer Fc-Moleküle reicht von 1 bis 4 je nach Klasse (z. B. IgG, IgA und IgE) oder Unterklasse (z. B. IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 und IgGA2). Ein Beispiel für ein natives F_c ist ein disulfidgebundenes Dimer, das durch den Papainverdauung eines IgG entsteht. Der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „nativer F_c“ ist generisch für die monomeren, dimeren und multimeren Formen. Ein Beispiel für eine native F_c-Aminosäuresequenz ist die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 126, die die native F_c-Aminosäuresequenz von IGHG1*01 ist.
„Gelenk“ oder die „Gelenkregion“ oder die „Gelenkdomäne“ bezieht sich typischerweise auf den flexiblen Teil einer schweren Kette, die sich zwischen der C_H1-Domäne und der C_H2-Domäne befindet. Sie ist ungefähr 25 Aminosäuren lang und ist in ein „oberes Gelenk“, ein „mittleres Gelenk“ oder ein „Kerngelenk“ und ein „unteres Gelenk“ unterteilt. Eine „Gelenkunterdomäne“ bezieht sich auf das obere Gelenk, das mittlere (oder Kern-) Gelenk oder das untere Gelenk. Die Aminosäuresequenzen der Gelenke eines IgG1-, IgG2-, IgG3- und IgG4-Moleküls sind im Folgenden angegeben:

IgG1: E₂₁₆PKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID No. 127)
IgG2: E₂₁₆RKCCVECPPCPAPPVAGP (SEQ ID No. 128)
IgG3: ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPE₂₁₆PKSCDTPPPCPRCP APELL
G (SEQ ID No. 129)
IgG4: E₂₁₆SKYGPPCPSCPAPEFLG (SEQ ID No. 130).

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird auf Aminosäurepositionen in der Fc-Domäne Bezug genommen, diese Aminosäurepositionen bzw. -reste werden nach dem EU-Nummerierungssystem angegeben, wie es z. B. in Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969) beschrieben ist.
Der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „F_c-Variante“ bezieht sich auf ein Molekül oder eine Sequenz, das/die von einem nativen F_c modifiziert wird, aber immer noch eine Bindungsstelle für den Salvage-Rezeptor F_cRn (neonataler F_c-Rezeptor) umfasst. Exemplarische F_c-Varianten und ihre Interaktion mit dem Salvage-Rezeptor sind in der Technik bekannt. So kann der Begriff „F_c-Variante“ ein Molekül oder eine Sequenz umfassen, das von einem nicht-menschlichen nativen F_c humanisiert wird. Darüber hinaus umfasst ein nativer F_c Bereiche, die entfernt werden können, weil sie strukturelle Merkmale oder biologische Aktivität aufweisen, die für die bispezifischen antigenbindende Proteine der Erfindung nicht erforderlich sind. So umfasst der Begriff „F_c-Variante“ ein Molekül oder eine Sequenz, der/die eine oder mehrere native F_c-Stellen oder -Reste fehlen oder in der eine oder mehrere F_c-Stellen oder -Reste modifiziert werden müssen, die beeinflussen oder daran beteiligt sind: (1) Disulfidbindungsbildung, (2) Inkompatibilität mit einer ausgewählten Wirtszelle, (3) N-terminale Heterogenität bei Expression in einer ausgewählten Wirtszelle, (4) Glykosylierung, (5) Interaktion mit Komplement, (6) Bindung an einen anderen Fc-Rezeptor als einen Salvage-Rezeptor oder (7) antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC).
Dementsprechend umfasst die Fc-Domäne, wie z. B. F_c1 und/oder F_c2, in einer Ausführungsform eine Gelenkdomäne.
In einer Ausführungsform ist die Fc-Domäne eine humane IgG Fc-Domäne, vorzugsweise abgeleitet von humanem IgG1, IgG2, IgG3 oder IgG4, vorzugsweise IgG1 oder IgG2, mehr bevorzugt - IgG1.
In einigen Ausführungsformen, insbesondere wenn das bispezifische antigenbindende Protein zwei Fc-Domänen umfasst, d. h. im hier nachfolgend beschriebenen TCER®-Format (wie F_c1 und F_c2), können die beiden Fc-Domänen vom gleichen Immunglobulin-Isotyp oder einer Isotyp-Unterklasse oder von verschiedenen Immunglobulin-Isotypen oder Isotyp-Unterklassen, vorzugsweise von der gleichen, sein. Dementsprechend gehören F_c1 und F_c2 in einigen Ausführungsformen zur Unterklasse IgG1 oder zur Unterklasse IgG2 oder zur Unterklasse IgG3 oder zur Unterklasse IgG4, vorzugsweise zur Unterklasse IgG1, oder zur Unterklasse IgG2, mehr bevorzugt zur Unterklasse IgG1.
In einigen Ausführungsformen ist die F_c-Domäne eine F_c-Domäne-Variante und umfasst daher eine oder mehrere der hier im Folgenden beschriebenen Aminosäuresubstitutionen.
In einigen Ausführungsformen umfasst die F_c-Domäne oder umfasst des Weiteren die RF- und/oder „Knob-into-hole“-Mutation, vorzugsweise die „Knob-into-hole“.
Die „RF-Mutation“ bezieht sich im Allgemeinen auf die Aminosäurensubstitutionen der Aminosäuren HY zu RF in der C_H3-Domäne von F_c-Domänen, wie die Aminosäurensubstitution H435R und Y436F in der C_H3-Domäne, wie sie von Jendeberg, L. et al. (1997, J. Immunological Meth., 201: 25-34) beschrieben wird, und sie wird für Reinigungszwecke als vorteilhaft beschrieben, da sie die Bindung an Protein A aufhebt. Falls das bispezifische antigenbindende Protein zwei F_C-Domänen umfasst, kann die RF-Mutation in einer oder beiden, vorzugsweise in einer F_c-Domäne, liegen.
Die „Knob-into-Hole“ oder auch „Knob-into-Hole“ Technologie bezieht sich auf die Aminosäuresubstitutionen T366S, L368A und Y407V (Hole) und T366W (Knob), beide an der C_H3-C_H3 Grenzfläche zur Förderung der Heteromultimerbildung. Diese Knob-into-Hole-Mutation kann durch die Einführung zusätzlicher Cystein-Aminosäuresubstitutionen Y349C und S354C weiter stabilisiert werden. Die „Knob-into-Hole“-Technologie zusammen mit den stabilisierenden Cystein-Aminosäuresubstitutionen wurde in den Patenten US5731168 und US8216805 beschrieben.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist die „Knob“-Mutation zusammen mit der Cystein-Aminosäuresubstitution S354C z. B. in der F_c-Domäne vorhanden, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 131 umfasst oder aus dieser besteht und die „Hole“-Mutation zusammen mit den Cystein-Aminosäuresubstitutionen Y349C in der F_c-Domäne vorhanden ist, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:132 umfasst oder daraus besteht.
In einigen Ausführungsformen umfasst die Fc-Domäne eines der Polypeptide, z.B. F_c1, die Aminosäuresubstitution T366W (Knob) in seiner C_H3-Domäne und die Fc-Domäne des anderen Polypeptids, z. B. F_c2, die Aminosäuresubstitution T366S, L368A und Y407V (Hole) in seiner C_H3-Domäne, oder vice versa.
In einigen Ausführungsformen umfasst oder umfasst des Weiteren die F_c-Domäne eines der Polypeptide, z. B. F_c1, die Aminosäuresubstitution S354C in seiner CH3-Domäne und die F_c-Domäne des anderen Polypeptids, z. B. F_c2, umfasst oder umfasst des Weiteren die Aminosäuresubstitution Y349C in seiner C_H3-Domäne, oder vice versa.
Dementsprechend umfasst in einigen Ausführungsformen die F_c-Domäne eines der Polypeptide, z. B. F_c1, die Aminosäuresubstitutionen S354C und T366W (Knob) in seiner C_H3-Domäne und die Fc-Domäne des anderen Polypeptids, z. B. F_c2, die Aminosäuresubstitution Y349C, T366S, L368A und Y407V (Hole) in seiner C_H3-Domäne, oder vice versa.
Dieser Satz von Aminosäuresubstitutionen kann durch das Einbeziehen der Aminosäuresubstitutionen K409A auf einem Polypeptid und F405K in dem anderen Polypeptid, wie durch Wei et al. (Structural basis of a novel heterodimeric F_c for bispecific antibody production, Oncotarget. 2017) beschrieben, erweitert werden. Dementsprechend umfasst oder umfasst des Weiteren die F_c-Domäne eines der Polypeptide, z. B. F_c1, in einigen Ausführungsformen die Aminosäuresubstitution K409A in seiner C_H3-Domäne und die F_c-Domäne des anderen Polypeptids, z. B. F_c2, umfasst oder umfasst des Weiteren die Aminosäuresubstitution F405K in seiner C_H3-Domäne, oder vice versa.
In einigen Fällen können künstlich eingeführte Cysteinbrücken die Stabilität der bispezifischen antigenbindenden Proteine verbessern, optimalerweise ohne die Bindungseigenschaften der bispezifischen antigenbindenden Proteine zu beeinträchtigen. Solche Cysteinbrücken können die Heterodimerisierung weiter verbessern.
Weitere Aminosäuresubstitutionen, wie z. B. Ladungspaar-Substitutionen, wurden in der Fachliteratur beschrieben, z. B. in EP 2 970 484 , um die Heterodimerisierung der resultierenden Proteine zu verbessern.
Dementsprechend umfasst oder umfasst des Weiteren die F_c-Domäne eines der Polypeptide, zum Beispiel F_c1, in einer Ausführungsform die Ladungspaar-Substitutionen E356K, E356R, D356R oder D356K und D399K oder D399R, und die F_c-Domäne des anderen Polypeptids, zum Beispiel F_c2, die Ladungspaar-Substitutionen R409D, R409E, K409E oder K409D und N392D, N392E, K392E oder K392D oder vice versa umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform kann die F_c-Domäne auf einer oder beiden, vorzugsweise beiden Polypeptidketten, eine oder mehrere Veränderungen umfassen, die die F_c-Gammarezeptor (FcyR)-Bindung hemmen. Solche Veränderungen können L234A, L235A umfassen.
Mit der Einbeziehung von Fc-Teilen, die aus Gelenken [Hinges], C_H2- und C_H3-Domänen oder Teilen davon bestehen, in antigenbindende Proteine, spezifischer in antigenbindende bispezifische Proteine, trat das Problem der unspezifischen Immobilisierung dieser Moleküle auf, hervorgerufen durch Fc:Fc-Gamma-Rezeptor (FcgR)-Interaktionen. FcgRs bestehen aus verschiedenen Zelloberflächenmolekülen (FcgRI, FcgRlla, FcgRllb, FcgRIII), welche mit unterschiedlichen Affinitäten an Epitope binden, die durch Fc-Teile von IgG-Molekülen angezeigt werden. Da diese unspezifische (d. h. eine nicht durch eine der zwei bindenden Domänen eines bispezifischen Moleküls ausgelöste) Immobilisierung aus folgenden Gründen unvorteilhaft ist: i) ihrer Auswirkung auf die pharmakokinetischen Eigenschaften eines Moleküls und ii) der „Off-Target“-Aktivierung von Immuneffektorzellen, wurden verschiedenen Fc-Varianten und Mutationen entdeckt, um eine FcgR-Bindung aufzulösen. In diesem Zusammenhang offenbaren Morgan et al. 1995, Immunology (The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q, FcyRI and FcyRIII binding) den Austausch der Reste 233-236 von humanem IgG1 mit der entsprechenden Sequenz, die von humanem IgG2, d. h. die Reste 233P, 234V und 235A und wobei keine Aminosäure an Position 236 vorhanden ist, stammt, was zu einer aufgelösten FcgRI-Bindung, aufgelösten C1q-Bindung und einer verminderten FcgRIII-Bindung führt. EP1075496 offenbart Antikörper und andere Fc-enthaltende Moleküle, die Variationen in der Fc-Region aufweisen (so wie eine oder mehrere von 233P, 234V, 235A und keinen Rest oder G an der Position 236 und 327G, 330S und 331S), wobei der rekombinante Antikörper in der Lage ist, das Zielmolekül zu binden, ohne eine signifikant komplementabhängige Lyse oder die zellvermittelte Zerstörung des Ziels auszulösen.
Dementsprechend umfasst die Fc-Region in einigen Ausführungsformen oder umfasst des Weiteren eine oder mehrere der Aminosäuren oder Deletionen, die aus der Gruppe bestehend aus 233P, 234V, 235A, 236 (kein Rest) oder G, 327G, 330S, 331S ausgewählt sind, vorzugsweise umfasst oder umfasst des Weiteren die Fc-Region die Aminosäuren 233P, 234V, 235A, 236 (kein Rückstand) oder G und eine oder mehrere Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 327G, 330S, 331S, wobei der Fc-Bereich am meisten bevorzugt die Aminosäuren 233P, 234V, 235A, 236 (kein Rest) und 331S umfasst oder des Weiteren umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst oder umfasst des Weiteren die Fc-Domäne zusätzlich die Aminosäuresubstitution N297Q, N297G oder N297A, vorzugsweise N297Q.
Die Aminosäuresubstitution „N297Q“, „N297G“ oder „N297A“ bezieht sich auf Aminosäuresubstitutionen an Position 297, die die native N-Glykosylierungsstelle innerhalb der Fc-Domäne aufheben. Diese Aminosäuresubstitution verhindert weiterhin die Fc-gamma-Rezeptor-Interaktion und verringert die Variabilität der endgültigen Proteinprodukte, d. h. der bispezifischen antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung, aufgrund von Zuckerresten, wie sie z. B. in Tao, MH and Morrison, SL (J Immunol. 1989 Oct 15;143(8):2595-601.) beschrieben sind.
In einer weiteren Ausführungsform, insbesondere wenn keine leichte Kette vorhanden ist, umfasst die Fc-Domäne oder umfasst des weiteren die Aminosäuresubstitution C220S. Die Aminosäuresubstitution „C220S“ delitiert das Cystein, das die C_HrCL-Disulfid-Brücke bildet.
In einigen Ausführungsformen umfasst oder umfasst des Weiteren die F_c-Domäne zusätzlich mindestens zwei zusätzliche Cysteinreste, zum Beispiel S354C und Y349C oder L242C und K334C, wobei S354C sich in der Fc-Domäne eines Polypeptids, wie F_c1, befindet, und Y349C sich in der Fc-Domäne des anderen Polypeptids, wie z. B. F_c2, befindet, um ein Heterodimer zu bilden, und/oder wobei L242C und K334C sich in derselben Fc-Domäne befinden, entweder in der F_c1 oder F_c2 eines oder beider Polypeptide, um eine C-C-Brücke innerhalb der Domäne zu bilden.
Mit „gereinigt“ und „isoliert“ ist gemeint, wenn man sich auf ein Polypeptid (d. h. das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung) oder eine Nukleotidsequenz bezieht, dass das angegebene Molekül in der wesentlichen Abwesenheit anderer biologischer Makromoleküle des gleichen Typs vorliegt. Der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „gereinigt“ bedeutet insbesondere, dass mindestens zu 75, 85, 95 oder 98 Gew.-% biologische Makromoleküle des gleichen Typs vorhanden sind.
Ein „isoliertes“ Nukleinsäuremolekül, das für ein bestimmtes Polypeptid kodiert, bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuremolekülen ist, die nicht für das betreffende Polypeptid kodieren; das Molekül kann jedoch einige zusätzliche Basen oder Einheiten beinhalten, die die grundlegenden Eigenschaften der Zusammensetzung nicht negativ beeinflussen.
Eine „Domäne“ kann jede Region eines Proteins sein, die im Allgemeinen auf der Grundlage von Sequenzhomologien definiert ist und sich oft auf eine bestimmte strukturelle oder funktionelle Einheit bezieht.
Ein „rekombinantes“ Molekül ist ein Molekül, das mit rekombinanten Mitteln hergestellt, exprimiert, erzeugt oder isoliert wurde.
Der Begriff „Gen“ bezeichnet eine DNA-Sequenz, die für eine bestimmte Aminosäuresequenz kodiert oder ihr entspricht, die ein oder mehrere Proteine oder Enzyme ganz oder teilweise umfasst und regulatorische DNA-Sequenzen, wie beispielsweise Promotorsequenzen, beinhalten kann oder auch nicht, die beispielsweise die Bedingungen bestimmen, unter denen das Gen exprimiert wird. Einige Gene, die keine strukturellen Gene sind, können von der DNA in die RNA transkribiert werden, werden aber nicht in eine Aminosäuresequenz translatiert. Andere Gene können als Regulatoren von Strukturgenen oder als Regulatoren der DNA-Transkription fungieren. Insbesondere kann der Begriff Gen für die genomische Sequenz bestimmt sein, die für ein Protein kodiert, d. h. eine Sequenz, die Regulator-, Promotor-, Intron- und Exonsequenzen umfasst.
„Affinität“ ist theoretisch durch die Gleichgewichtsbindung zwischen dem gesamten bispezifischen antigenbindenden Protein und dem Antigen definiert, im Kontext der vorliegenden Erfindung durch die Gleichgewichtsbindung zwischen dem gesamten bispezifischen antigenbindenden Protein und seinem Antigen TA/MHC oder TA-C/MHC oder CD3. Die Affinität kann beispielsweise in der halbmaximalen effektiven Konzentration (EC₅₀) (manchmal auch als halbmaximale Bindungskonzentration (EC₅₀) bezeichnet) oder der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K_D) ausgedrückt werden.
„K_D“ ist die Gleichgewichtsdissoziationskonstante, ein Verhältnis von k_off/k_on, zwischen dem bispezifischen antigenbindenden Protein und seinem Antigen. K_D und Affinität stehen im umgekehrten Verhältnis zueinander. Der K_D Wert bezieht sich auf die Konzentration des bispezifischen antigenbindenden Proteins, und je niedriger der K_D-Wert, desto höher die Affinität des bispezifischen antigenbindenden Proteins. Die Affinität kann experimentell mit einer Vielzahl bekannter Verfahren bestimmt werden, wie z. B. die Messung der Assoziations- und Dissoziationsraten mit der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) oder der Biolayer-Interferometrie (BLI), wie im Folgenden im Abschnitt „Bispezifische antigenbindende Proteine“ ausführlicher beschrieben wird.
Die „halbmaximale effektive Konzentration“, auch „EC₅₀“ genannt, bezieht sich üblicherweise auf die Konzentration eines Moleküls, die nach einer bestimmten Expositionszeit eine Reaktion auf halbem Wege zwischen der Basislinie und dem Maximum induziert. EC₅₀ und Affinität stehen im umgekehrten Verhältnis zueinander, je niedriger der EC₅₀-Wert, desto höher die Affinität des Moleküls. In einem Beispiel bezieht sich der „EC₅₀“-Wert auf die Konzentration des erfindungsgemäßen bispezifischen antigenbindenden Proteins, das nach einer bestimmten Expositionszeit eine Reaktion auf halbem Wege zwischen der Basislinie und dem Maximum auslöst, insbesondere auf die Konzentration des erfindungsgemäßen bispezifischen antigenbindenden Proteins, das nach einer bestimmten Expositionszeit eine Reaktion auf halbem Wege zwischen der Basislinie und dem Maximum auslöst. EC₅₀-Werte können experimentell mit einer Vielzahl bekannter Verfahren bewertet werden, z. B. mit einem IFN-Gamma-Freisetzungstest oder einem LDH-Freisetzungstest, wie im Experimentalteil in den Beispielen 2 und 5 ausführlicher beschrieben. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der EC₅₀-Wert vorzugsweise durch einen LDH-Freisetzungstest bestimmt und bezieht sich somit auf die induzierte Zytotoxizität.
Ein „Diagnostikum“ bezieht sich im vorliegenden Kontext auf ein nachweisbares Molekül oder eine Substanz, wie beispielsweise ein fluoreszierendes Molekül, ein radioaktives Molekül oder jede andere in der Technik bekannte Markierung, die (entweder direkt oder indirekt) ein Signal liefert.
Zu den „fluoreszierenden Molekülen“, die im Stand der Technik bekannt sind, gehören Fluoreszenzisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Fluorophore für den Einsatz im blauen Laser (z. B. PerCP, PE-Cy7, PE-Cy5, PE-Cy5, FL3 und APC oder Cy5, FL4), Fluorophore für den Einsatz im roten, violetten oder UV-Laser (z. B. Pazifikblau, Pazifikorange).
„Radioaktive Moleküle“ beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf radioaktive Atome für szintigraphische Studien wie I¹²³, I¹²⁴ In¹¹¹, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, TC⁹⁹. Bispezifische antigenbindende Proteine der Erfindung können auch ein Spin-Label für die Kernspinresonanztomographie (NMR) (auch bekannt als Magnetresonanztomographie, MRT) umfassen, wie beispielsweise Jod 123, Indium-111, Fluor-19, Kohlenstoff-13, Stickstoff-15, Sauerstoff-17, Gadolinium, Mangan oder Eisen.
Solche Diagnostika können entweder direkt mit dem bispezifischen antigenbindenden Protein gekoppelt (d. h. physikalisch verknüpft) oder indirekt verknüpft sein.
Ein „therapeutisches Mittel“ bezieht sich vorliegend auf ein Mittel, das eine therapeutische Wirkung hat. In einer Ausführungsform kann ein solches therapeutisches Mittel ein wachstumshemmendes Mittel sein, wie beispielsweise ein zytotoxisches Mittel oder ein radioaktives Isotop.
Ein „wachstumshemmendes Mittel“ oder „antiproliferatives Mittel“, das gleichgültig verwendet werden kann, bezieht sich auf eine Verbindung oder Zusammensetzung, die das Wachstum einer Zelle, insbesondere einer Tumorzelle, entweder in vitro oder in vivo hemmt.
Der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „zytotoxisches Mittel“ bezieht sich auf eine Substanz, die die Funktion von Zellen hemmt oder verhindert und/oder die Zerstörung von Zellen bewirkt. Der Begriff „zytotoxisches Mittel“ soll Chemotherapeutika, Enzyme, Antibiotika und Toxine wie niedermolekulare Toxine oder enzymatisch aktive Toxine bakterieller, pilzlicher, pflanzlicher oder tierischer Herkunft, einschließlich Fragmente und/oder Varianten davon, sowie die verschiedenen unten aufgeführten Tumor- oder Krebsmittel umfassen. In einigen Ausführungsformen ist das zytotoxische Mittel ein Taxoid, Vincas, Taxane, ein Maytansinoid oder Maytansinoid-Analogon wie DM1 oder DM4, ein kleines Medikament, ein Tomaymycin- oder Pyrrolobenzodiazepinderivat, ein Kryptophycin-Derivat, ein Leptomycin-Derivat, ein Auristatin- oder Dolastatin-Analogon, ein Prodrug, Topoisomerase-II-Inhibitoren, ein DNA-Alkylierungsmittel, ein Anti-Tubulin-Mittel, ein CC-1065 oder CC-1065-Analogon.
Der Begriff „radioaktives Isotop“ soll radioaktive Isotope, die zur Behandlung von Krebs geeignet sind, wie At²¹¹, Bi²¹², Er¹⁶⁹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, I_n ¹¹¹, P³², Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Sr⁸⁹ und radioaktive Isotope von Lu umfassen. Solche Radioisotope emittieren in der Regel hauptsächlich beta-Strahlung. In einer Ausführungsform ist das radioaktive Isotop ein alpha-Strahlungs-Isotop, genauer gesagt Thorium²²⁷, das Alpha-Strahlung abgibt.
Eine „PK-modifizierende Einheit“ bezieht sich im vorliegenden Kontext auf eine Einheit, die die Pharmakokinetik (PK) des bispezifischen antigenbindenden Proteins der Erfindung modifiziert. Dementsprechend modifiziert die Einheit insbesondere die in vivo Halbwertszeit und Verteilung des bispezifischen antigenbindenden Proteins der Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform erhöht die PK-modifizierende Einheit die Halbwertszeit des bispezifischen antigenbindenden Proteins. Beispiele für PK-modifizierende Einheiten sind unter anderem PEG (Dozier et al., (2015) Int J Mol Sci. Oct 28;16(10):25831-64 und Jevsevar et al., (2010) Biotechnol J.Jan;5(1):113-28), PASylierung (Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel. Aug;26(8):489-501), Albumin (Dennis et al., (2002) J Biol Chem. 20. September; 277(38):35035-43), der F_c-Teil eines Antikörpers und/oder unstrukturierter Polypeptide (Schellenberger et al., (2009) Nat Biotechnol. Dez; 27(12):1186-90).
Bispezifische antigenbindende Proteine
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung humanisierten den monoklonalen Maus-Antikörper Anti-CD3-Antikörper UCHT1 wie in Beispiel 1 offenbart und erhielten den humanisierten monoklonalen Antikörper UCHT1 (V17). Der resultierende humanisierte monoklonale Antikörper UCHT1 (V17) hat eine erhöhte Stabilität und/oder eine erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu dem im Stand der Technik bereits bekannten UCHT1 (V9).
Die Erfinder zeigten dann in Beispiel 2 in einem Experiment zum Grundsatznachweis, dass bei Verwendung variabler Domänen eines T-Zell-rekrutierenden Antikörpers mit mäßiger Affinität für sein Ziel (wie BMA31, der auf TCRαβ abzielt) in Kombination mit maturierten variablen TCR-Domänen das resultierende bispezifische antigenbindende Protein ein viel breiteres Sicherheitsfenster als ein antigenbindendes Protein unter Verwendung eines hochaffinen Anti-CD3-Antikörper (wie UCHT1(V17)) in Verbindung mit denselben variablen TCR-Domänen hat.
Diese neuen antigenbindenden Proteine zeigen, insbesondere in Form von TCER^®-Molekülen, eine hohe Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen. So liegt z. B. bei den neuen antigenbindenden Proteinen in Form von TCER®-Molekülen die halbe maximal wirksame Konzentration (EC₅₀) gegen NCI-H1755, Hs695T-Zellen und U2OS insbesondere im Bereich von 1 pM bis 100 pM, spezifischer zwischen 1 pM und 20 pM für Zellen und die EC₅₀ der antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung für kranke Zellen ist somit mehr als 1000-mal niedriger im Vergleich zu der EC₅₀, die für Zellen normaler Gewebezellen, wie z. B. der Tumorzelllinie Hs695T, im Vergleich zu Primärzellen erhalten wird, was eine hohe Sicherheit beweist.
Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein bispezifisches antigenbindendes Protein, das mindestens zwei Antigenbindungsstellen (A und B) umfasst, wobei die Antigenbindungsstelle A an CD3 bindet, vorzugsweise an den CD3ε/δ-Komplex, und wobei die Antigenbindungsstelle B an einen Zielantigen-(TA)-Peptid/MHC-Komplex bindet, vorzugsweise an den TAA-Antigen-Peptid/MHC-Komplex, und wobei die Antigenbindungsstelle A eine variable Domäne der schweren Kette (V_H) und eine variable Domäne der leichten Kette (V_L) umfasst, und

a) wobei die V_L drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) CDRL1, CDRL2 und CDRL3 umfasst, wobei
- - CDRL1 die Aminosäuresequenz „RASQDIRNYLN“ der SEQ ID NO: 1 umfasst oder daraus besteht
- - CDRL2 die Aminosäuresequenz „YTSRLHS“ der SEQ ID NO: 2 umfasst oder daraus besteht, und
- - CDRL3 die Aminosäuresequenz „QQGQTLPWT“ der SEQ ID NO: 3 umfasst oder daraus besteht, und
b) wobei die V_H drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) CDRH1, CDRH2 und CDRH3 umfasst, wobei
- - CDRH1 die Aminosäuresequenz „X_1YTMN“ der SEQ ID NO: 4 umfasst oder daraus besteht, wobei X₁ G oder E, vorzugsweise G, ist,
- - CDRH2 die Aminosäuresequenz von „LlNPX₂X₃GVX₄TYAQKX_sQX₆“ SEQ ID NO: 5 umfasst oder daraus besteht, wobei X₂ eine beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise Q, Y oder E, mehr bevorzugt Q oder Y, wie z. B. Q, und X₃ eine beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise R, K oder E, mehr bevorzugt R oder K, wie z. B. K, und X₄ eine beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise S oder T, mehr bevorzugt S, und X₅ eine beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise F oder V, mehr bevorzugt F, und X₆ eine beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise G oder D, mehr bevorzugt D und
- - CDRH3 die Aminosäuresequenz „SGYYGX₇SWYFDV“ von SEQ ID NO: 6 umfasst oder daraus besteht, wobei X₇ eine beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise E oder D, mehr bevorzugt D.

In einer Ausführungsform ist X₁ von CDRH1 E, wenn CDRH2 die Aminosäuresequenz „LINPYKGVSTYAQKFQD“ von SEQ ID NO: 7 umfasst oder daraus besteht und CDRH3 die Aminosäuresequenz „SGYYGDSDWYFDV“ von SEQ ID NO: 8 umfasst oder daraus besteht.
In einer bestimmten Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein bispezifisches antigenbindendes Protein, das mindestens zwei Antigenbindungsstellen (A und B) umfasst, wobei die Antigenbindungsstelle A an CD3 bindet, vorzugsweise an den CD3ε/δ-Komplex, und wobei die Antigenbindungsstelle B an einen Zielantigen-(TA)-Peptid/MHC-Komplex bindet, vorzugsweise an den TAA-Antigenpeptid/MHC-Komplex, und wobei die Antigenbindungsstelle A eine variable Domäne der schweren Kette (V_H) und eine variable Domäne der leichten Kette (VL) umfasst, und

a) wobei die V_L drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) CDRL1, CDRL2 und CDRL3 umfasst, wobei
- - CDRL1 die Aminosäuresequenz „RASQDIRNYLN“ von SEQ ID NO: 1 umfasst oder daraus besteht,
- - CDRL2 die Aminosäuresequenz „YTSRLHS“ von SEQ ID NO: 2 umfasst oder daraus besteht, und
- - CDRL3 die Aminosäuresequenz „QQGQTLPWT“ von SEQ ID NO: 3 umfasst oder daraus besteht, und
b) wobei die V_H drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) CDRH1, CDRH2 und CDRH3 umfasst, wobei CDRH1 die Aminosäuresequenz „GYTMN“ von SEQ ID NO: 133 oder „EYTMN“ von SEQ ID NO: 134 umfasst oder daraus besteht, vorzugsweise GYTMN von SEQ ID NO: 133, oder gegebenenfalls eine Aminosäuresequenz, die sich von SEQ ID NO: 133 oder 134 durch mindestens eine Aminosäuresubstitution, vorzugsweise durch eine oder zwei Aminosäuresubstitutionen, vorzugsweise durch eine Aminosäuresubstitution, unterscheidet, wobei vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die sich von SEQ ID NO: 133 oder 134 unterscheidet, 31G oder 31E umfasst, CDRH2 die Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 135 bis 142, oder gegebenenfalls eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die sich von SEQ ID NO: 133 oder 134 durch mindestens eine Aminosäuresubstitution, vorzugsweise durch eine, zwei, drei oder vier Aminosäuresubstitutionen, vorzugsweise durch eine oder zwei Aminosäuresubstitutionen, wie beispielsweise eine Aminosäuresubstitution unterscheidet, wobei vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die sich von SEQ ID NO: 133 oder 134 unterscheidet, die Aminosäure 61A und gegebenenfalls mindestens eine der Aminosäuren 54Q, 54E oder 54Y, 55R oder 55E, 58S oder 58T, 64F oder 64V, 65Q, 66D oder 66G, vorzugsweise 66D, umfasst, und CDRH3 die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 8 oder 144, oder gegebenenfalls eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die sich von SEQ ID NO: 8 oder 144 durch mindestens eine Aminosäuresubstitution, vorzugsweise durch eine, zwei, drei oder vier Aminosäuresubstitutionen, vorzugsweise durch eine oder zwei Aminosäuresubstitutionen, wie eine Aminosäuresubstitution, unterscheidet, wobei vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die sich von SEQ ID NO: 8 oder 134 unterscheidet, die Aminosäure 104E umfasst.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf antigenbindende Proteine, die Varianten der CDR-Aminosäuresequenzen umfassen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung offenbart werden, typischerweise Varianten von CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 und/oder CDRH3, wobei solche Varianten mindestens eine, wie vier, drei, zwei oder eine, vorzugsweise eine, zwei oder drei Aminosäuresubstitutionen umfassen können, wobei die bevorzugte Anzahl von Aminosäuresubstitutionen vorzugsweise von der Länge der jeweiligen CDR abhängt.
In einigen Ausführungsformen umfasst die CDRL1 eine Aminosäuresequenz oder besteht daraus, die sich von den hier offengelegten CDRL1-Aminosäuresequenzen durch mindestens eine Aminosäuresubstitution, vorzugsweise durch eine, zwei, drei oder vier Aminosäuresubstitutionen, vorzugsweise durch eine, zwei oder drei Aminosäuresubstitutionen, vorzugsweise durch eine oder zwei Aminosäuresubstitutionen, wie z. B. eine Aminosäuresubstitution, unterscheidet, wobei die Aminosäuresubstitution vorzugsweise an Position 27, 28, 30 und 31 vorliegt.
In einigen Ausführungsformen umfasst die CDRL2 eine Aminosäuresequenz oder besteht daraus, die sich von den hier offengelegten CDRL2-Aminosäuresequenzen durch mindestens eine Aminosäuresubstitution, vorzugsweise durch eine, zwei oder drei Aminosäuresubstitutionen, vorzugsweise durch eine oder zwei Aminosäuresubstitutionen, wie z. B. eine Aminosäuresubstitution, unterscheidet, wobei die Aminosäuresubstitution vorzugsweise an Position 51, 52 und 53 vorliegt.
In einigen Ausführungsformen umfasst die CDRL3 eine Aminosäuresequenz oder besteht daraus, die sich von den hier offengelegten CDRL3-Aminosäuresequenzen durch mindestens eine Aminosäuresubstitution, vorzugsweise durch eine, zwei, drei oder vier Aminosäuresubstitutionen, vorzugsweise durch eine oder zwei Aminosäuresubstitutionen, wie z. B. eine Aminosäuresubstitution, unterscheidet, wobei die Aminosäuresubstitution vorzugsweise an einer der Aminosäurepositionen 93, 94 und 95 vorliegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform können Mutationen in den CDRs der variablen Domäne der schweren Kette der Antigenbindungsstelle A auftreten.
Dementsprechend umfasst die CDRH1 in einigen Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz oder besteht daraus, die sich von den hier offengelegten CDRH1-Aminosäuresequenzen durch mindestens eine Aminosäuresubstitution, vorzugsweise durch eine oder zwei oder drei Aminosäuresubstitutionen, vorzugsweise durch eine Aminosäuresubstitution, unterscheidet, wobei die Aminosäuresubstitution vorzugsweise an einer der Aminosäurepositionen 31 bis 35 vorliegt.
In einigen Ausführungsformen umfasst die CDRH2 eine Aminosäuresequenz oder besteht daraus, die sich von den hier offengelegten CDRH2-Aminosäuresequenzen durch mindestens eine Aminosäuresubstitution, vorzugsweise durch eine, zwei, drei oder vier Aminosäuresubstitutionen, vorzugsweise durch eine, zwei oder drei Aminosäuresubstitutionen, vorzugsweise durch eine oder zwei Aminosäuresubstitutionen, wie z. B. eine Aminosäuresubstitution, unterscheidet, wobei die Aminosäuresubstitution vorzugsweise an einer der Aminosäurepositionen 54, 55 und 57 bis 59 vorliegt.
In einigen Ausführungsformen umfasst die CDRH3 eine Aminosäuresequenz oder besteht daraus, die sich von den hier offengelegten CDRH3-Aminosäuresequenzen durch mindestens eine Aminosäuresubstitution, vorzugsweise durch eine, zwei, drei oder vier Aminosäuresubstitutionen, vorzugsweise durch eine oder zwei Aminosäuresubstitutionen, wie z. B. eine Aminosäuresubstitution, unterscheidet, wobei die Aminosäuresubstitution vorzugsweise an einer der Aminosäurepositionen 105, 107 und 110 vorliegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die variable Domäne der leichten Kette und die variable Domäne der schweren Kette ferner die Framework-Regionen der leichten und schweren Kette.
In einer Ausführungsform umfasst die variable Domäne der leichten Kette ferner eine oder mehrere Framework-Regionen, vorzugsweise FR1-L, FR2-L, FR3-L und FR4-L, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FR1-L, FR2-L, FR3-L und FR4-L, wobei

- FR1-L die Aminosäuresequenz „DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC“ von SEQ ID NO: 11 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 11 identisch ist, wobei eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 11 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuren 6Q und/oder 23C umfasst,
- FR2-L die Aminosäuresequenz „WYQQKPGKAPKLLIY“ von SEQ ID NO: 12 oder „WYQQKPGKAVKLLIY“ von SEQ ID NO: 13, vorzugsweise SEQ ID NO: 12 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 12 oder 13 identisch ist, wobei eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 12 oder 13 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuren 35W, 36Y, 38Q, 44P, 46L und/oder 49Y umfasst,
- FR3-L die Aminosäuresequenz „GVPSRFSGSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFC“ von SEQ ID NO: 14 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 14 identisch ist, wobei eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 14 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuren 57G, 59P, 62F, 64G, 66G, 71Y, 82D, 86Y, 87F, 88C umfasst,
- FR4-L die Aminosäuresequenz „FGQGTKVEIKR“ von SEQ ID NO: 15 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 15 identisch ist, wobei eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 15 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäure 98F und/oder 101G umfasst,

- FR1-H die Aminosäuresequenz „EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT“ von SEQ ID NO: 16 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 16 identisch ist, wobei eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 16 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäure 6Q, 14P, 22C, 24A, 26G, 27Y, 28S, 29F und/oder 30T umfasst und gegebenenfalls mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen Q5V, P9A, L11V, V12K, M18V und/oder I20V umfasst,
- FR2-H die Aminosäuresequenz „WVRQAPGQGLEWMG“ von SEQ ID NO: 17 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 17 identisch ist, wobei eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 17 identisch ist, vorzugsweise 36W, 37V, 39Q, 45L, 46E und/oder 47W umfasst, gegebenenfalls mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen K38R, S40A, H41P, K43Q, N44G umfasst,
- FR3-H die Aminosäuresequenz „RVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR“ von SEQ ID NO: 18 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 18 identisch ist, wobei eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 18 identisch ist, vorzugsweise 70L, 72V, 79A, 90D, 94Y, 95Y, 96C, 97A und/oder 98R umfasst und gegebenenfalls mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen K67R, A68V, K74T, S76T, L84S, T87R und/oder S91T, umfasst, und
- FR4-H die Aminosäuresequenz „WGQGTLVTVSS“ von SEQ ID NO: 19 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 19 identisch ist, wobei eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 19 identisch ist, vorzugsweise 112W, 113G, 115G umfasst und gegebenenfalls mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen A114Q und/oder T117L umfasst.

Die Aminosäuren 35W, 36Y, 46L und 49Y von FR2-L und die Aminosäure 64G, 71Y von FR3-L wurden von den Erfindern so identifiziert, dass sie sich in der Vernier-Zone befinden und vorzugsweise nicht substituiert sind.
Die Aminosäuren 27Y, 28S, 29F und 30T von FR-1H, die Aminosäure 47W von FR2-H, die Aminosäuren 70L, 72V, 79A und 97A und 98R von FR3-H und 112W von FR4-H wurden von den Erfindern in der Vernier-Zone identifiziert und sind vorzugsweise nicht substituiert.
Varianten der vorliegend beschriebenen antigenbindenden Proteine werden in Betracht gezogen und explizit mit dem Wortlaut „mindestens zu 85% identisch mit einer Referenzsequenz“, wie vorliegend oben in dem Definitionsabschnitt definiert, bezeichnet. So kann beispielsweise die Sequenz FR1-L, FR2-L, FR3-L und FR4-L sowie FR1-H, FR2-H, FR3-H und FR4-H von den Referenzsequenzen SEQ ID NO: 11 bis SEQ ID NO: 19, soweit angemessen, durch mindestens eine Aminosäuresubstitution(en), insbesondere durch mindestens eine konservative Aminosäuresubstitution(en) und/oder Substitution(en) mit kanonischen Resten abweichen. Insbesondere können sich die Sequenzen FR1-L, FR2-L, FR3-L und FR4-L sowie FR1-H, FR2-H, FR3-H und FR4-H der variablen Domäne der leichten und schweren Kette nur durch konservative Aminosäuresubstitution(en) von den Referenzsequenzen SEQ ID NO: 11 bis SEQ ID NO: 19 unterscheiden.
Modifikationen und Änderungen können in der Aminosäuresequenz des antigenbindenden Proteins der vorliegenden Erfindung und in den dafür kodierenden DNA-Sequenzen vorgenommen werden und führen dennoch zu einem funktionellen antigenbindenden Protein oder Polypeptid mit gewünschten Eigenschaften.
Das bispezifische antigenbindende Protein, wobei die Aminosäuresequenz mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 12 oder 13 identisch ist, umfasst die Aminosäure 44P. Diese Aminosäure 44P (die in der Sequenz Vk1-018 der menschlichen Keimbahn nachgewiesen ist) hat den Vorteil der Deimmunisierung der humanisierten variablen Domänen, da Prolin an dieser Position in den 10 ähnlichsten menschlichen Keimbahnen häufig vorkommt.
„Deimmunisierung“ bezieht sich vorliegend auf die Reduzierung der Immunogenität, d. h. der Fähigkeit, bei einem Probanden eine Immunantwort zu induzieren. Dies geschieht durch Substitution von Aminosäuren durch die Aminosäuren, die in den menschlichen Keimbahnen am häufigsten vorkommen und daher vom Immunsystem nicht als fremd erkannt werden.
Dementsprechend umfasst in einer Ausführungsform die Antigenbindungsstelle A im Zusammenhang mit den bispezifischen antigenbindenden Proteinen der Erfindung eine variable Domäne der schweren Kette (V_H) und eine variable Domäne der leichten Kette (V_L), wobei die V_L die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 145
oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 145 identisch ist, und wobei die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 145 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von CDRL1 von SEQ ID NO: 1, CDRL2 von SEQ ID NO: 2 und CDRL3 von SEQ ID NO: 3 umfasst, und wobei die V_H eine Aminosäuresequenz umfasst oder aus dieser besteht, die aus der Gruppe von Aminosäuresequenzen ausgewählt ist, die aus den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 149 bis SEQ ID NO: 160 ausgewählt ist, oder einer Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz identisch ist, die aus der Gruppe von Aminosäuresequenzen, bestehend aus den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 149 bis SEQ ID NO: 160 ausgewählt ist, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 149 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRH1 von SEQ ID NO: 133, CDRH2 von SEQ ID NO: 138 und CDRH3 von SEQ ID NO: 8 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 150 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRH1 von SEQ ID NO: 133, CDRH2 von SEQ ID NO: 139 und CDRH3 von SEQ ID NO: 8 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 151 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRH1 von SEQ ID NO: 134, CDRH2 von SEQ ID NO: 138 und CDRH3 von SEQ ID NO: 8 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 152 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRH1 von SEQ ID NO: 133, CDRH2 von SEQ ID NO: 140 und CDRH3 von SEQ ID NO: 8 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 153 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRH1 der SEQ ID NO: 133, CDRH2 von SEQ ID NO: 141 und CDRH3 von SEQ ID NO: 8 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 154 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRH1 von SEQ ID NO: 133, CDRH2 von SEQ ID NO: 142 und CDRH3 von SEQ ID NO: 8 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 155 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRH1 von SEQ ID NO: 134, CDRH2 von SEQ ID NO: 142 und CDRH3 von SEQ ID NO: 8 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85 % mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 156 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRH1 von SEQ ID NO: 133, CDRH2 von SEQ ID NO: 7 und CDRH3 von SEQ ID NO: 144 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85 % mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRH1 von SEQ ID NO: 133, CDRH2 von SEQ ID NO: 138 und CDRH3 von SEQ ID NO: 144 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 158 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRH1 von SEQ ID NO: 134, CDRH2 von SEQ ID NO: 7 und CDRH3 von SEQ ID NO: 8 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 159 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRH1 von SEQ ID NO: 134, CDRH2 von SEQ ID NO: 7 und CDRH3 von SEQ ID NO: 144 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 160 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRH1 der SEQ ID NO: 134, CDRH2 von SEQ ID NO: 138 und CDRH3 von SEQ ID NO: 144 umfasst.
In einigen Ausführungsformen umfasst die Antigenbindungsstelle B der bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung einen Antikörper oder ein Fragment davon oder eine variable Domäne der alpha-Kette (v_α) und eine variable Domäne der beta-Kette (v_β) oder eine variable Domäne der gamma-Kette (v_γ) oder eine variable Domäne der delta-Kette (v_δ) oder besteht daraus. Antikörper und Fragmente davon sind wie oben im Abschnitt „Definitionen“ definiert.
In einigen Ausführungsformen umfasst die Antigenbindungsstelle B der bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung eine variable Domäne der alpha-Kette (v_α) und eine variable Domäne der beta-Kette (v_β) oder eine variable Domäne der gamma-Kette (v_γ) oder eine variable Domäne der delta-Kette (v_δ), vorzugsweise eine V_α und v_β-Domäne. Die variable Domäne der alpha-Kette (v_α) und eine variable Domäne der beta-Kette (v_β) oder eine variable Domäne der gamma-Kette (v_γ) oder eine variable Domäne der delta-Kette (v_δ) sind im Zusammenhang mit dem spezifischen TA, an das sie binden, und welches im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnte, zum Beispiel in WO2018172533 , WO2018033291 , WO2017158103 , WO2018104438 , WO2018104478 , WO2019002444 , WO2017158116 ausführlich beschrieben.
Dementsprechend umfassen oder bestehen die V_α und V_β bzw. V_γ und V_δ in einer Ausführungsform aus der Aminosäuresequenz, die in WO2018172533 , WO2018033291 , WO2017158103 , WO2018104438 , WO2018104478 , WO2019002444 , WO2017158116 offenbart ist, und die V_α und V_β bzw. V_γ und V_δ, die in dem zitierten Stand der Technik beschrieben sind, binden an das TA-Peptid, insbesondere das TAA-Peptid, das in derselben Patentanmeldung wie die zitierte offenbart ist.
In einer Ausführungsform umfasst das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung eine V_α- und V_β-Domäne oder V_γ und V_δ-Domäne, wobei i) V_α oder V_γ die Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ‚EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYL YWYKQEPGKGLQLL TYIYSSQDSKQDQRL T VLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP‘ SEQ ID NO: 20, ‚EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYL YWYKQEPGKGLQLL TYIYSSQDQKQDQRL T VLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP‘ 'SEQ ID NO: 21, ‚EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTESSSTYL YWYKQEPGKGLQLL TYIYSSQDQKQDQRL T VLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP‘ SEQ ID NO: 22 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 20, 21 und 22 identisch ist, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 20 identisch ist vorzugsweise die Aminosäuresequenz von CDRa1 von SEQ ID NO: 23, CDRa2 von SEQ ID NO: 24 und CDRa3 von SEQ ID NO: 25 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 21 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von CDRa1 von SEQ ID NO: 23, CDRa2 von SEQ ID NO: 26 und CDRa3 von SEQ ID NO: 25 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 22 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von CDRa1 von SEQ ID NO: 27, CDRa2 von SEQ ID NO: 26, und CDRa3 von SEQ ID NO: 25 umfasst, und wobei die Aminosäure der ersten variablen Domäne vorzugsweise die Aminosäuren 19V und/oder 48K umfasst, und die V_β oder V_δ die Aminosäuresequenz „DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSG MPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVL“ SEQ ID NO: 30 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit der aus SEQ ID NO: 30 bestehenden Aminosäuresequenz identisch ist, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 30 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von CDRb1 von SEQ ID NO: 31, CDRb2 von SEQ ID NO: 34 bzw. CDRb3 von SEQ ID NO: 35 umfasst und optional die Aminosäure 54F und/oder 66C umfasst, oder (ii) die V_α oder v_γ die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 48 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 48 identisch ist, umfasst oder daraus besteht, wobei vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 48 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRa1 von SEQ ID NO: 49, CDRa2 von SEQ ID NO: 50 und CDRa3 von SEQ ID NO: 51 umfasst, und die v_β oder v_δ die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 44 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 44 identisch ist, wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 44 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRb1 von SEQ ID NO: 45, CDRb2 von SEQ ID NO: 46 und CDRb3 von SEQ ID NO: 47 umfasst.
In einer Ausführungsform können die erste variable Domäne und die zweite variable Domäne, wie vorliegend im Zusammenhang mit den antigenbindenden Proteinen der Erfindung definiert, eine Aminosäuresubstitution an Position 44 gemäß der IMGT-Nummerierung umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Aminosäure an Position 44 durch eine andere geeignete Aminosäure substituiert, um die Paarung zu verbessern. In bestimmten Ausführungsformen, vorzugsweise in denen das antigenbindende Protein ein TCR ist, verbessert die Aminosäuresubstitution beispielsweise die Paarung der Ketten (d. h. Paarung der Ketten α und β oder Paarung von γ und δ. In einer bevorzugten Ausführungsform werden eine oder beide der Aminosäuren, die an Position 44 in der ersten variablen Domäne (v₁₄₄) und die Aminosäure, die an Position 44 in der zweiten variablen Domäne (v₂₄₄) vorhanden ist, in die Aminosäurepaare v₁₄₄/v₂44 substituiert, die aus der Gruppe der Aminosäurepaare ausgewählt sind, die aus v₁44D/v₂44R, _v144R/v₂44D, _v144E/v₂44K, v₁44K/v₂44E, v₁44D/v₂44K, v₁44K/v₂44D, v₁44R/v₂44E; v₁44E/v₂44R, _V144L/V₂44W, v₁44W/v₂44L, v₁44V/V₂44W, v₁44W/V₂44V besteht.
Dementsprechend kann das antigenbindende Protein in einer weiteren Ausführungsform weiterhin eines der bevorzugten Substitutionspaare (v₁44/v₂44) enthalten, die aus der Gruppe bestehend aus: _V1Q44D/_V2Q44R; _V1Q44R/_V2Q44D; _V1Q44E/_V2Q44K; v₁Q44K/v₂Q44E; v₁Q44D/v₂Q44K; v₁Q44K/v₂Q44D; v₁Q44E/v₂Q44R; v₁Q44R/v₂Q44E; V₁Q44L/V₂Q44W; V₁Q44W/V₂Q44L; v₁Q44V/V₂Q44W; und v₁Q44W/v₂Q44V; v₁W44D/v₂Q44R; v₁W44R/v₂Q44D; v₁W44E/v₂Q44K; v₁W44K/v₂Q44E; v₁W44D/v₂Q44K; v₁W44K/v₂Q44D; v₁W44E/v₂Q44R; v₁W44R/v₂Q44E; v₁W44L1V₂Q44W; v₁W44/v₂Q44L; v₁W44V/v₂Q44W; und v₁W44/v₂Q44V; v₁H44D/v₂Q44R; v₁H44R/v₂Q44D; v₁H44E/v₂Q44K; v₁H44K/v₂Q44E; _V-_I H44D/V₂Q44K; v₁H44K/v₂Q44D; v₁H44E/v₂Q44R; v₁H44R/v₂Q44E; v₁H44L1v₂Q44W; v₁H44W/v₂Q44L; v₁H44V/v₂Q44W; und v₁H44W/v₂Q44V; v₁K44D/v₂Q44R; v₁K44R/v₂Q44D; v₁K44E/v₂Q44K; v₁K44/v₂Q44E; v₁K44D/v₂Q44K; v₁K44/v₂Q44D; v₁K44E/v₂Q44R; v₁K44R/v₂Q44E; v₁K44L/v₂Q44W; v₁K44W/v₂Q44L; v₁K44V/v₂Q44W; und v₁K44W/v₂Q44V; v₁E44D/v₂Q44R; v₁E44R/v₂Q44D; v₁E44/v₂Q44K; v₁E44K/v₂Q44E; v₁E44D/v₂Q44K; v₁E44K/v₂Q44D; v₁E44/v₂Q44R; v₁E44R/v₂Q44E; v₁E44L/v₂Q44W; v₁E44W/v₂Q44L; v₁E44V/v₂Q44W; and v₁E44W/v₂Q44V; v₁Q44D/v₂R44; v₁Q44R/v₂R44D; v₁Q44E/v₂R44K; v₁Q44K/v₂R44E; v₁Q44D/v₂R44K; v₁Q44K/v₂R44D; v₁Q44E/v₂R44; v₁Q44R/v₂R44E; v₁Q44L/v₂R44W; v₁Q44W/v₂R44L; v₁Q44V/v₂R44W; und v₁Q44W/v₂R44V; v₁W44D/v₂R44; v₁W44R/v₂R44D; v₁W44E/v₂R44K; v₁W44K/v₂R44E; v₁W44D/v₂R44K; v₁W44K/v₂R44D; v₁W44E/v₂R44; v₁W44R/v₂R44E; v₁W44L/v₂R44W; v₁W44/v₂R44L; v₁W44V/v₂R44W; und v₁W44/v₂R44V; v₁H44D/v₂R44; V₁H44R/V₂R44D; v₁H44E/V₂R44K; v₁H44K/v₂R44E; v₁H44D/v₂R44K; v₁H44K/v₂R44D; v₁H44E/v₂R44; v₁H44R/v₂R44E; v₁H44L/v₂R44W; v₁H44W/v₂R44L; v₁H44V/v₂R44W; und v₁H44W/v₂R44V; v₁K44D/v₂R44; v₁K44R/v₂R44D; v₁K44E/v₂R44K; v₁K44/v₂R44E; v₁K44D/v₂R44K; v1 K44/V₂R44D; v₁K44E/v₂R44; v₁K44R/v₂R44E; v₁K44L/v₂R44W; v₁K44W/v₂R44L; v1K44V/v2R44W; und v₁K44W/v₂R44V; v₁E44D/v₂R44; v₁E44R/v₂R44D; v₁E44/v₂R44K; v₁E44K/v₂R44E; v₁E44D/v₂R44K; v₁E44K/v₂R44D; v₁E44R/v₂R44E; v₁E44L/v₂R44W; v₁E44W/v₂R44L; v₁E44V/v₂R44W; und v₁E44W/v₂R44V; v₁Q44D/v₂K44R; v₁Q44R/v₂K44D; v₁Q44E/v₂44K; v₁Q44K/v₂K44E; v₁Q44D/v₂44K; v₁Q44K/v₂K44D; v₁Q44E/v₂K44R; v₁Q44R/v₂K44E; v₁Q44L/v₂K44W; v₁Q44W/v₂K44L; v₁Q44V/_V2K44W; und v₁Q44W/v₂K44V; v₁W44D/v₂K44R; v₁W44R/v₂K44D; v₁W44E/v₂44K; v₁W44K/v₂K44E; v₁W44D/v₂44K; v₁W44K/v₂K44D; v₁W44E/v₂K44R; v₁W44R/v₂K44E; v₁W44L/v₂K44W; v₁W44/v₂K44L; v₁W44V/v₂K44W; und v₁W44/v₂K44V; v₁H44D/v₂K44R; v₁H44R/v₂K44D; v₁H44E/v₂44K; v₁H44K/v₂K44E; v₁H44D/v₂44K; v₁H44K/v₂K44D; v₁H44E/v₂K44R; v₁H44R/v₂K44E; v₁H44L/v₂K44W; v₁H44W/v₂K44L; v₁H44V/v₂K44W; und v₁H44W/v₂K44V; v₁K44D/v₂K44R; v₁K44R/v₂K44D; v₁K44E/v₂44K; v₁K44/v₂K44E; v₁K44D/v₂44K; v₁K44/v₂K44D; v₁K44E/v₂K44R; v₁K44R/v₂K44E; v₁K44L/V₂K44W; v₁K44W/v₂K44L; v₁K44V/V₂K44W; und v₁K44W/V₂K44V; v₁E44D/v₂K44R; v₁E44R/v₂K44D; _V1 E44/V₂44K; _V1 E44K/v₂K44E; v,E44D/V₂44K; _V-_I E44K/v₂K44D; _VTE44/V₂K44R; v₁E44R/v₂K44E; v₁E44L/v₂K44W; v₁E44W/v₂K44L; v₁E44V/v₂K44W; und v₁E44W/v₂Q44V ausgewählt sind.
Im obigen Sinne bedeutet z. B. „_V1Q44R/_V2Q44D“ beispielsweise, dass in der ersten variablen Domäne Q44 durch R ersetzt wird, während in der zweiten variablen Domäne Q44 durch D ersetzt wird. Zusätzliche Substitutionen und Beschreibungen können in der U.S. Patentanmeldung Nr. 2018-0162922 gefunden werden.
In einer Ausführungsform ist das bispezifische antigenbindende Protein ein bispezifischer Antikörper oder ein Fragment davon, ein bispezifischer T-Zell-Rezeptor (TCR) oder ein Fragment davon oder ein bispezifischer einkettiger TCR (scTCR) oder ein bispezifischer einkettiger Antikörper.
Der bispezifische Antikörper und der TCR und die entsprechenden Fragmente sind wie oben im Abschnitt „Definitionen“ definiert.
In einer Ausführungsform ist das antigenbindende Protein menschlichen Ursprungs, das als aus einem menschlichen Antigenlokus erzeugtes verstanden wird und daher menschliche Sequenzen, insbesondere menschliche TCR- oder Antikörpersequenzen, umfasst.
In einer Ausführungsform sind die variable Domäne der leichten Kette und die variable Domäne der schweren Kette miteinander verbunden und/oder die Domäne V_α und die Domäne V_β oder die Domäne und γ und die Domäne V_δ sind vorzugsweise über eine kovalente Verbindung miteinander verbunden.
In einer Ausführungsform umfasst das bispezifische antigenbindende Protein mindestens zwei Polypeptide.
In einer verwandten Ausführungsform befinden sich die variable Domäne der leichten Kette und die variable Domäne der schweren Kette auf demselben Polypeptid oder auf verschiedenen Polypeptiden, vorzugsweise auf verschiedenen Polypeptiden.
In der gleichen Ausführungsform befinden sich die variable Domäne der alpha-Kette (V_α) und die variable Domäne der beta-Kette (V_β) oder die variable Domäne der gamma-Kette (V_γ) und eine variable Domäne der delta-Kette (V_δ), vorzugsweise v_α und v_β, auf dem gleichen Polypeptid oder auf verschiedenen Polypeptiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das antigenbindende Protein ein lösliches Protein.
Ein „kovalenter Linker“, „Linkersequenz“ oder „Polypeptidlinker“ ist wie vorliegend oben in dem Definitionenabschnitt unter „Linker“ definiert.
In einer Ausführungsform umfasst das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung weiterhin ein oder mehrere der folgenden Elemente:

(i) ein Diagnostikum;
(ii) ein therapeutisches Mittel; oder
(iii) PK-modifizierende Einheit.

Das „Diagnostikum“, das „therapeutische Mittel“ und die „PK-modifizierende Einheit“ werden im vorliegenden Dokument oben im Abschnitt „Definitionen“ definiert.
In einigen Ausführungsformen sind die antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung kovalent, direkt oder über einen spaltbaren oder nicht spaltbaren Linker, an das mindestens eine wachstumshemmende Mittel gebunden. Ein antigenbindendes Protein, an das das mindestens eine wachstumshemmende Mittel gebunden ist, kann auch als Konjugat bezeichnet werden.
Die Herstellung solcher Konjugate, z. B. Immunkonjugate, ist in der Anmeldung WO2004/091668 oder in der Arbeit Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005) und Kirin et al., Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005) beschrieben und die durch den Fachmann auf die Herstellung von antigenbindenden Proteinen der vorliegenden Erfindung übertragen werden können, an die ein solches mindestens ein wachstumshemmendes Mittel gebunden ist.
„Linker“ im Zusammenhang mit der Bindung von mindestens einem wachstumshemmenden Mittel bedeutet eine chemische Einheit, die eine kovalente Bindung oder eine Kette von Atomen umfasst, die ein Polypeptid kovalent an eine Medikamentenkomponente bindet.
Die Konjugate können nach in vitro-Verfahren hergestellt werden. Um ein Medikament oder Prodrug an den Antikörper zu binden, wird eine Verknüpfungsgruppe verwendet. Geeignete Verknüpfungsgruppen sind in der Technik bekannt und umfassen Disulfidgruppen, Thioethergruppen, säurelabile Gruppen, photolabile Gruppen, Peptidase-labile Gruppen und Esterase-labile Gruppen. Die Konjugation eines antigenbindenden Proteins der Erfindung mit zytotoxischen Mitteln oder wachstumshemmenden Mitteln kann unter Verwendung einer Vielzahl von bifunktionellen Proteinkopplungsmitteln erfolgen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf N-Succinimidylpyridyldithiobutyrat (SPDB), Butansäure 4-[(5-Nitro-2-pyridinyl)dithio]-2,5-dioxo-1-Pyrrolidinylester (Nitro-SPDB), 4-(Pyridin-2-yldisulfanyl)-2-sulfo-Buttersäure (sulfo-SPDB), N-Succinimidyl (2-pyridyldithio) Propionat (SPDP), Succinimidyl (N-Maleimidomethyl) Cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), Iminothiolan (IT), bifunktionelle Derivate von Imidoestern (wie Dimethyladipimidat HCL), aktive Ester (wie Disuccinimidylsuberat), Aldehyde (wie Glutaraldehyd), Bis-Azidoverbindungen (wie Bis(p-azidobenzoyl)-hexandiamin), Bis-Diazoniumderivate (wie Bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylendiamin), Diisocyanate (wie Toluol 2,6-Diisocyanat) und bis-aktive Fluorverbindungen (wie 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol). So kann beispielsweise ein Ricin-Immunotoxin, wie in Vitetta et al (1987) beschrieben, hergestellt werden. Die mit Kohlenstoff markierte 1-Isothiocyanatobenzylmethyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein exemplarisches Chelatbildner zur Konjugation von Radionukleotid mit dem Antikörper ( WO 94/11026 ).
Der Linker kann ein „spaltbarer Linker“ sein, der die Freisetzung des zytotoxischen Mittels oder des wachstumshemmenden Mittels in der Zelle erleichtert. So kann beispielsweise ein säurelabiler Linker, ein Peptidase-empfindlicher Linker, ein Esterase-labiler Linker, ein photolabiler Linker oder ein disulfidhaltiger Linker (siehe z. B. US-Patent Nr. 5 208 020 ) verwendet werden. Der Linker kann auch ein „nicht spaltbarer Linker“ (z. B. SMCC-Linker) sein, der in einigen Fällen zu einer besseren Toleranz führen kann.
Alternativ kann ein Fusionsprotein, das das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung und ein zytotoxisches oder wachstumshemmendes Polypeptid umfasst, durch rekombinante Techniken oder Peptidsynthese hergestellt werden. Die Länge der DNA kann jeweilige Regionen umfassen, die für die beiden Abschnitte des Konjugats kodieren, entweder nebeneinander oder getrennt durch eine Region, die für ein Linkerpeptid kodiert, das die gewünschten Eigenschaften des Konjugats nicht zerstört.
Die antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung können auch in der abhängigen Enzym-vermittelten Prodrug-Therapie verwendet werden, indem das Polypeptid mit einem Prodrug-aktivierenden Enzym konjugiert wird, das ein Prodrug (z. B. ein Peptidyl-Chemotherapeutikum, siehe WO 81/01145 ) in ein aktives Krebsmittel umwandelt (siehe z. B. WO 88/07378 und US-Patent Nr. 4 975 278 ).
In einer Ausführungsform umfasst das antigenbindende Protein der Erfindung weiterhin ein oder mehrere der Folgenden: ein Enzym, ein Zytokin (wie das menschliche IL-2, IL-7 oder IL-15), einen Nanocarrier oder eine Nukleinsäure.
Verschiedene bispezifische Formate sind in der Fachliteratur beschrieben und werden vorliegend oben im Abschnitt „Definition“ unter „Formate“ beschrieben. Techniken zur Herstellung von Proteinen in den verschiedenen Formaten werden ebenfalls in dem im entsprechenden Abschnitt zitierten Verfahren offenbart, so dass der Fachmann die variablen Domänen, wie sie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung definiert sind, leicht in verschiedenen Formaten, insbesondere, den im vorliegenden Dokument offengelegten Formaten verwenden kann. Die Herstellung von antigenbindenden Proteinen, insbesondere löslichen bispezifischen Bindungsproteinen, wie z. B. die TCER®, werden ebenfalls in dem Abschnitt „Beispiele‟ offenbart. Es wird von den Fachleuten verstanden, dass in dem Fall, dass das antigenbindende Protein zwei Polypeptide umfasst, die variablen Domänen der leichten und schweren Kette zum Beispiel parallel ausgerichtet sein können und die variablen Domänen der alpha- und beta-Achse parallel ausgerichtet sein können, wie es im DVD-Format der Fall ist, oder dass die variablen Domänen der leichten und schweren Kette zum Beispiel quer ausgerichtet sein können und die variablen Domänen der alpha- und beta-Achse quer ausgerichtet sein können, wie es beispielsweise im CODV-Format der Fall ist.
Dementsprechend bezieht sich die Erfindung ferner auf ein bispezifisches antigenbindendes Protein, das zwei Polypeptidketten umfasst, die zwei Antigenbindungsstellen (A und B) bilden, wobei eine erste Polypeptidkette eine Struktur aufweist, die durch die Formel dargestellt wird: V₃-L₁-V₄-L₂-C_L [I] wobei V₃ eine dritte variable Domäne ist; V₄ eine vierte variable Domäne ist; L₁ und L₂ Linker sind; L₂ kann vorhanden oder nicht vorhanden sein; C_L eine konstante Domäne der leichten Kette oder ein Teil davon und vorhanden oder nicht vorhanden ist;
und wobei eine zweite Polypeptidkette eine Struktur aufweist, die durch die Formel dargestellt wird: V₅-L₃-V₆-L₄-C_H1 [II] wobei V₅ eine fünfte variable Domäne ist; V₆ eine sechste variable Domäne ist; L₃ und L₄ Linker sind; L₄ kann vorhanden oder nicht vorhanden sein; C_H1 eine konstante Domäne 1 der schweren Kette oder ein Teil davon und vorhanden oder nicht vorhanden ist; und wobei
V₃ die V_α oder V_γ variable Domäne und V₅ die V_β oder V_δ variable Domäne ist, wie vorstehend definiert, und V₄ eine variable Domäne der leichten Kette und V₆ eine variable Domäne der schweren Kette ist oder V₄ eine variable Domäne der schweren Kette und V₆ eine variable Domäne der leichten Kette ist, oder
V₃ die V_β oder V_δ variable Domäne und V₅ die V_α oder V_γ variable Domäne ist, wie vorstehend definiert, und V₄ eine variable Domäne der leichten Kette und V₆ eine variable Domäne der schweren Kette ist oder V₄ eine variable Domäne der schweren Kette und V₆ eine variable Domäne der leichten Kette ist, oder
V₃ die V_α oder V_γ variable Domäne und V₆ die V_β oder V_δ variable Domäne ist, wie vorstehend definiert, und V₄ eine variable Domäne der leichten Kette und V₅ eine variable Domäne der schweren Kette ist oder V₄ eine variable Domäne der schweren Kette und V₅ eine variable Domäne der leichten Kette ist, oder
V₃ die V_β oder V_δ variable Domäne und V₆ die V_α oder V_γ variable Domäne ist, wie vorstehend definiert, und V₄ eine variable Domäne der leichten Kette und V₅ eine variable Domäne der schweren Kette ist oder V₄ eine variable Domäne der schweren Kette und V₅ eine variable Domäne der leichten Kette ist,
V₄ die V_α oder V_γ variable Domäne und V₅ die V_β oder V_δ variable Domäne ist, wie vorstehend definiert, und V₃ eine variable Domäne der leichten Kette und V₆ eine variable Domäne der schweren Kette ist oder V₃ eine variable Domäne der schweren Kette und V₆ eine variable Domäne der leichten Kette ist, oder
V₄ die V_β oder V_δ variable Domäne und V₅ die V_α oder V_γ variable Domäne ist, wie vorstehend definiert, und V₃ eine variable Domäne der leichten Kette und V₆ eine variable Domäne der schweren Kette ist oder V₃ eine variable Domäne der schweren Kette und V₆ eine variable Domäne der leichten Kette ist,
und wobei die variable Domäne der leichten Kette und die variable Domäne der schweren Kette zusammen die Antigenbindungsstelle A bilden, und wobei die variable Domäne V_α und V_β oder V_γ und V_δ die Antigenbindungsstelle B bilden, und wobei die variable Domäne V_α oder V_γ vorzugsweise V_α ist, und V_β oder V₅ vorzugsweise V_β ist. Die Linker L_1, L₂, L₃, L₄ sind im vorliegenden Dokument im Abschnitt „Definitionen“ definiert. In einigen Ausführungsformen können jedoch einige Linkerlängen für ein bestimmtes Format vorzuziehen sein. Das Wissen über Linkerlängen und deren Aminosäuresequenzen gehört jedoch zum allgemeinen Wissen der Technik, und Linker sowie Linker- und Aminosäuresequenzen für die verschiedenen Formate gehören zum Stand der Technik und werden in den hier oben genannten Veröffentlichungen offengelegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist V₃ V_α, wie vorstehend definiert, und V₆ ist V_β, wie vorstehend definiert, und V₄ ist eine variable Domäne der leichten Kette, wie im Zusammenhang mit der Erfindung definiert, und V₅ ist eine variable Domäne der schweren Kette, wie im Zusammenhang mit der Erfindung definiert, oder
V₃ ist V_α, wie vorstehend definiert, und V₆ ist V_β wie vorstehend definiert, und V₄ ist eine variable Domäne der schweren Kette, wie im Zusammenhang mit der Erfindung definiert, und V₅ ist eine variable Domäne der leichten Kette, wie im Zusammenhang mit der Erfindung definiert.
In einer Ausführungsform umfasst das Polypeptid der Formel [I] ferner am C-Terminus das Polypeptid der Formel [I] einen Linker (L₅) und eine F_c-Domäne oder einen Teil davon und/oder wobei das Polypeptid der Formel [II] ferner am C-Terminus des Polypeptids der Formel [II] einen Linker (L₆) und eine F_c-Domäne oder einen Teil davon umfasst.
Die F_c-Domäne ist wie oben im Abschnitt „Definition“ definiert.
In einer Ausführungsform umfasst das antigenbindende Protein zwei Polypeptidketten, die zwei Antigenbindungsstellen (A und B) bilden,
wobei eine Polypeptidkette eine Struktur aufweist, die durch die Formel [III] dargestellt wird: V₃-L₁-V₄-L₂-C_L-L₅-F_c1 [III]
und eine Polypeptidkette eine Struktur aufweist, die durch die Formel [IV] dargestellt wird: V₅-L₃-V₆-L₄-C_H1-L₆-F_c2 [IV]
wobei V₃, L_1, V₄, L₂, C_L, V₅, L₃, V₆, L₄, C_H1, wie vorstehend definiert sind, und wobei L₅ und L₆ Linker sind, die vorhanden oder nicht vorhanden sind, und wobei F_c1, und F_c2 F_c-Domänen sind und wobei F_c1 und F_c2 gleich oder verschieden, bevorzugt verschieden sind. Die F_c-Domäne ist wie oben im Abschnitt „Definition“ definiert.
In einer Ausführungsform umfasst F_c1 die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 132 (Hole) oder besteht daraus und F_c2 umfasst die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 131 (Knob) oder besteht daraus, oder umgekehrt, mehr bevorzugt umfasst F_c1 die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 132 oder besteht daraus, wenn V₄ oder V₃ eine variable Domäne der schweren Kette ist und entsprechend umfasst F_c2 die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 131 oder besteht daraus, wenn V₅ oder V₆ eine variable Domäne der leichten Kette ist, oder F_c1 umfasst die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 131 oder besteht daraus, wenn V₄ oder V₃ eine variable Domäne der leichten Kette ist und entsprechend F_c2 die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 132 umfasst oder besteht daraus, wenn V₅ oder V₆ eine variable Domäne der schweren Kette ist.
Wie aus den Beispielen hervorgeht, hat der Erfinder der vorliegenden Erfindung als Grundsatznachweis die Verwendung von Rekrutierungsmitteln mit geringer Affinität (Antigenbindungsstelle A) in Kombination mit maturierten variablen TCR-Domänen in einem TCER®-Format (Beispiel 2) nachgewiesen.
Dementsprechend umfasst das antigenbindende Protein in einer bevorzugten Ausführungsform zwei Polypeptidketten, die zwei Antigenbindungsstellen (A und B) bilden, wobei eine Polypeptidkette eine Struktur aufweist, die durch die Formel [III] dargestellt wird: V₃-L₁-V₄-L₂-C_L-L₅-F_c1 [III]
und eine Polypeptidkette eine Struktur aufweist, die durch die Formel [IV] dargestellt wird: V₅-L₃-V₆-L₄-CH₁-L₆-F_c2 [IV]
wobei L₂, C_L, L₅ und L₄, C_H1, L₆ nicht vorhanden sind, und
wobei V₃, L_1, V₄, V₅, L₃, V₆ wie oben definiert sind,
vorzugsweise ist V₃ die Domäne V_α oder V_γ und V₆ die Domäne V_β oder V_δ, wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung definiert, und V₄ ist eine variable Domäne der leichten Kette und V₅ ist eine variable Domäne der schweren Kette, wie im Zusammenhang mit der Erfindung definiert, oder
vorzugsweise ist V₃ die variable Domäne V_α oder V_γ und V₆ die Domäne V_β oder V_δ, wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung definiert, und V₄ ist eine variable Domäne der schweren Kette und V₅ ist eine variable Domäne der leichten Kette, wie im Zusammenhang mit der Erfindung definiert, und
L₁ und L₃ vorzugsweise die Aminosäuresequenz „GGGSGGGG“ von (SEQ ID NO: 118) umfassen oder daraus bestehen, und
F_c1 vorzugsweise die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 132 umfasst oder daraus besteht und F_c2 die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 131 umfasst oder daraus besteht, oder umgekehrt, mehr bevorzugt umfasst F_c1 die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 132 oder aus dieser besteht, wenn V₄ eine variable Domäne der schweren Kette ist und entsprechend F_c2 die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 132 umfasst oder aus dieser besteht: 131, wenn V₅ eine variable Domäne der leichten Kette ist, oder, mehr bevorzugt umfasst F_c1 die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 131 oder aus dieser besteht, wenn V₄ eine variable Domäne der leichten Kette ist und entsprechend F_c2 die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 132 umfasst oder aus dieser besteht, wenn V₅ eine variable Domäne der schweren Kette ist, und die variable Domäne der leichten Kette und die variable Domäne der schweren Kette zusammen eine Antigenbindungsstelle A bilden, die an CD3 bindet,
und wobei die variablen Domänen V_α und V_β oder V_γ und V_δ eine Antigenbindungsstelle B bilden, die spezifisch an den TA-Antigenpeptid/MHC-Komplex, vorzugsweise den TAA-Antigenpeptid/MHC-Komplex, wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung definiert, bindet.
Das antigenbindende Protein dieser Ausführungsform kann auch als TCER® bezeichnet werden.
„TCER®“ sind bispezifische T-Zell-Rezeptoren (TCR) sind lösliche antigenbindende Proteine, die zwei antigenbindende Domänen umfassen, eine variable Domäne der schweren und leichten Kette, die CD3, wie im Zusammenhang mit der Erfindung definiert, und eine Domäne V_α und V_β oder V_γ und V_δ, wie im Zusammenhang mit der Erfindung definiert.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein antigenbindendes Protein, das ein erstes Polypeptid der Formel V₃-L₁-V₄-L₂-C_L-L₅-F_c1 [III] umfasst, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 165 bis 167 umfasst oder daraus besteht, und das zweite Polypeptid der Formel V₅-L₃-V₆-L₄-C_H1-L₆-F_c2 [IV], das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 163 oder 164 umfasst oder daraus besteht.
Es kann auch wünschenswert sein, das antigenbindende Protein der vorliegenden Erfindung in Bezug auf die Effektorfunktion zu modifizieren, z. B. um die antigenabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) und/oder die komplementabhängige Zytotoxizität (CDC) des antigenbindenden Proteins zu erhöhen oder zu reduzieren. Dies kann durch die Einführung einer oder mehrerer Aminosäuresubstitutionen in einer F_c-Region des antigenbindenden Proteins, vorliegend auch F_c-Varianten genannt, im Zusammenhang mit den antigenbindenden Proteinen der vorliegenden Erfindung erreicht werden. Alternativ oder zusätzlich können Cysteinreste in den F_c-Bereich eingeführt werden, wodurch die Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Ketten in diesem Bereich ermöglicht wird. Das somit erzeugte homodimere antigenbindende Protein kann eine verbesserte oder reduzierte Internalisierungsfähigkeit und/oder eine erhöhte komplementvermittelte Zelltötung und/oder antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) aufweisen (Caron PC. et al.1992; und Shopes B. 1992).
Eine weitere Art der Aminosäuremodifikation des antigenbindenden Proteins der Erfindung kann nützlich sein, um das ursprüngliche Glykosylierungsmuster des antigenbindenden Proteins zu verändern, d. h. durch Entfernen einer oder mehrerer Kohlenhydrateinheiten, die im antigenbindenden Protein vorkommen, und/oder Hinzufügen einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die nicht im antigenbindenden Protein vorhanden sind. Das Vorhandensein einer der Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Prolin ist, schafft eine potenzielle Glykosylierungsstelle. Die Addition oder Deletion von Glykosylierungsstellen an das antigenbindende Protein erfolgt bequem durch Ändern der Aminosäuresequenz, so dass sie eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen (für N-verknüpfte Glykosylierungsstellen) enthält.
Eine weitere Art der Modifikation beinhaltet die Entfernung von Sequenzen, die entweder in silico oder experimentell als potenziell zu Abbauprodukten oder zur Heterogenität von antigenbindenden Proteinpräparaten führen. So kann beispielsweise die Desamidierung von Asparagin- und Glutaminresten in Abhängigkeit von Faktoren wie pH-Wert und Oberflächenbelastung erfolgen. Asparaginreste sind besonders anfällig für Deamidierung, vor allem wenn sie in der Sequenz Asn-Gly und in geringerem Maße in anderen Dipeptidsequenzen wie Asn-Ala vorkommen. Wenn eine solche Desamidierungsstelle, insbesondere Asn-Gly, in einem antigenbindenden Protein der Erfindung vorhanden ist, kann es daher wünschenswert sein, die Stelle zu entfernen, typischerweise durch konservative Substitution, um einen der beteiligten Reste zu entfernen. Solche Substitutionen in einer Sequenz zur Entfernung eines oder mehrerer der implizierten Rückstände sollen auch von der vorliegenden Erfindung erfasst werden.
Eine weitere Art der kovalenten Modifikation beinhaltet die chemische oder enzymatische Kopplung von Glykosiden an das antigenbindende Protein. Diese Verfahren sind insofern von Vorteil, als sie keine Produktion von antigenbindendem Protein in einer Wirtszelle erfordern, die Glykosylierungsfähigkeiten für die N- oder O-verknüpfte Glykosylierung besitzt. Abhängig vom verwendeten Kupplungsmodus kann der/die Zucker(e) an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen, wie diejenigen von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen, wie diejenigen von Serin, Threonin, oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste, wie diejenigen von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan, oder (f) die Amidgruppe von Glutamin gebunden sein. Solche Verfahren sind beispielsweise in WO 87/05330 beschrieben.
Die Entfernung von Kohlenhydratresten, die auf dem antigenbindenden Protein vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch erfolgen. Die chemische Deglykosylierung erfordert die Exposition des antigenbindenden Proteins gegenüber der Verbindung Trifluormethansulfonsäure oder einer gleichwertigen Verbindung. Diese Behandlung führt zur Spaltung der meisten oder aller Zucker mit Ausnahme des verbindenden Zuckers (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin), während das antigenbindende Protein intakt bleibt. Die chemische Deglykosylierung wird durch Sojahr H. et al. (1987) und durch Edge, AS. et al. (1981) beschrieben. Die enzymatische Spaltung von Kohlenhydrateinheiten auf Antikörpern kann durch den Einsatz einer Vielzahl von Endo- und Exoglykosidasen erreicht werden, wie sie von Thotakura, NR. et al. (1987) beschrieben werden.
Eine weitere Art der kovalenten Modifikation des antigenbindenden Proteins umfasst die Verknüpfung des antigenbindenden Proteins mit einem aus einer Vielzahl von nichtproteinartigen Polymeren, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylenen, in der Weise, wie in den US-Patenten Nr. 4,640,835 ; 4,496,689 ; 4,301,144 ; 4,670,417 ; 4,791,192 oder 4,179,337 beschrieben.
Die Erfindung beinhaltet auch Partikel, die antigenbindende Proteine der Erfindung anzeigen, und die Aufnahme dieser Partikel in eine Partikelbibliothek. Zu diesen Partikeln gehören unter anderem Phagen, Heferibosomen oder Säugetierzellen. Verfahren zur Herstellung solcher Partikel und Bibliotheken sind in der Technik bekannt (z. B. Siehe WO2004/044004 ; WO01/48145 , Chervin et al. (2008) J. Immuno. Methods 339.2: 175-184).
Wie im vorliegenden Dokument offenbart, binden die antigenbindenden Proteine der Erfindung mit der Antigenbindungsstelle A an CD3 und mit der Antigenbindungsstelle B an einen Zielantigen-(TA)-Peptid-/MHC-Komplex. Das CD3-Molekül befindet sich typischerweise auf der Oberfläche einer CD3-präsentierenden Zelle, z. B. einer Effektorzelle, vorzugsweise einer T-Zelle. Der Zielantigen (TA) Peptid/MHC-Komplex ist typischerweise auf der Oberfläche einer Zielantigen (TA) Peptid/MHC-Komplex präsentierenden Zelle, wie z. B. einer kranken Zelle, wie z. B. einer Krebszelle, vorhanden. Die Bindung des antigenbindenden Proteins an CD3 und des Zielantigen-(TA)-Peptid-/MHC-Komplexes bringt die Effektorzelle und die Zielzelle in die Nähe zueinander, und die Bindung des bispezifischen antigenbindenden Proteins kann somit bei der Bindung eine Immunantwort auslösen. Entsprechend induziert das antigenbindende Protein der vorliegenden Erfindung eine Immunantwort in Effektorzellen.
Dementsprechend induziert das antigenbindende Protein der vorliegenden Erfindung in einer Ausführungsform eine Immunantwort in der CD3-präsentierenden Zelle, wie z. B. der Effektorzelle, wie z. B. vorzugsweise der T-Zelle oder der NK-Zelle, vorzugsweise, wobei die Immunantwort durch einen Anstieg der Interferon (IFN) γ-Werte gekennzeichnet ist. Dementsprechend könnte in einem Beispiel die Immunantwort durch einen EC₅₀-Wert charakterisiert werden, der vorzugsweise in einem IFN-Gamma-Freisetzungstest bestimmt wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bindet das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung an CD3 mit einer K_D(A) und die Antigenbindungsstelle B bindet an den TA-Antigenpeptid C (TA-C)/MHC-Komplex, vorzugsweise TAA-Antigenpeptid C (TAA-C)/MHC-Komplex, mit einer K_D(C) und das Verhältnis von K_D(A)/K_D(C) ist größer als 1, größer als 4, größer als 6, größer als 8, größer als 10, größer als 15, größer als 20, größer als 25, größer als 30, größer als 40, größer als 50, wie z. B. zwischen 1 und 150, zwischen 4 und 140, zwischen 6 und 100, zwischen 8 und 100, zwischen 10 und 100, vorzugsweise zwischen 10 und 100.
Die Begriffe „Affinität“ und „K_D“ sind vorstehend im Abschnitt „Definitionen“ definiert. Verfahren zur Messung der Affinität, wie z. B. des K_D-Wertes, sind dem Fachmann bekannt und umfassen z. B. die Oberflächenplasmonresonanz und die Biolayer-Interferometrie. Wie dem Fachmann bekannt ist, können die für diese Experimente verwendeten Versuchsbedingungen, wie z. B. verwendeter Puffer, Konzentration des Proteins, die Ergebnisse beeinflussen.
Dementsprechend werden in einem Beispiel die bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung beispielsweise als lösliches TCER®, wie vorstehend beschrieben, exprimiert und auf ihre Bindungsaffinität zu den HLA-A*02/MAG-003-Monomerkomplexen analysiert. Typischerweise werden Messungen z. B. auf einem Octet RED384-System mit den vom Hersteller empfohlenen Einstellungen durchgeführt. Zusammenfassend wurde die Bindungskinetik typischerweise bei 30°C und beispielsweise 1000 U/min Schüttelgeschwindigkeit gemessen, z. B. mit PBS, 0,05% Tween-20, 0,1% BSA als Puffer. Peptid-HLA-A:02-Komplexe wurden vor der Analyse der antigenbindenden Proteine, insbesondere des TCER®, auf Biosensoren, wie z.B. HIS1K, geladen. Dasselbe antigenbindende Protein wird dann in der Regel auf seine Bindungsaffinität gegenüber CD3 weiter analysiert. Dementsprechend wurde die Messung wie vorliegend oben für die CD3-Bindung beschrieben durchgeführt.
In einigen Ausführungsformen bindet die Antigenbindungsstelle A an CD3 mit einer K_D(A), welche ≥ 3 nM, ≥ 5 nM, ≥8 nM, ≥10 nM, ≥12 nM, ≥14 nM, ≥16 nM, ≥18 nM, ≥20 nM, ≥25 nM, ≥30 nM, ≥35 nM, ≥40 nM, ≥45 nM, und , ≤1000 nM, ≤800 nM, ≤600 nM, ≤500 nM, ≤400 nM, z.B. zwischen 3 nM und 1000 nM, 3 nM und 600 nM, zwischen 5 nM und 600 nM, 10 nM und 600 nM, 12 nM und 600 nM, 14 nM und 600 nM, 16 nM und 600 nM, 18 nM und 600 nM, 20 nM und 600 nM, vorzugsweise 5 nM und 100 nM beträgt, vorzugsweise wie mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) oder Biolayer-Interferometrie (BLI), vorzugsweise Biolayer-Interferometrie (BLI), bestimmt wurde.
In einigen Ausführungsformen das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Antigenbindungsstelle B an den TA-Antigenpeptid C(TA-C)/MHC-Komplex, vorzugsweise den TAA-Antigenpeptid C(TAA-C)/MHC-Komplex, mit einem K_D(C) bindet, der ≤ 100 µM, ≤ 1 µM ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 10 nM, beispielsweise 0,01 nM bis 150 nM, 0,05 nM bis 150 nM, 0,1 nM bis 150 nM, 0,1 nM bis 100 nM, 0,1 nM bis 50 nM, 0,1 nM bis 10 nM, 0,5 nM bis 10 nM, 0,5 nM bis 5 nM, 0,1 nM bis 5 nM, vorzugsweise 0,5 nM bis 5 nM beträgt, wie mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) oder Biolayer-Interferometrie (BLI), vorzugsweise Biolayer-Interferometrie (BLI), bestimmt wurde.
In einem Beispiel bindet das antigenbindende Protein an das Antigenpeptid MAGE-A, das die Aminosäuresequenz „KVLEHVVRV“ von SEQ ID NO: 10 umfasst oder aus dieser besteht, vorzugsweise HLA-A*02, oder mit einer K_D, die ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1nM, ≤ 1 nM, zum Beispiel 10pM bis 100 nM, 10 pM bis 50 nM, 10 pM bis 10 nM, insbesondere 50pM bis 100 nM, ist, 100 pM bis 50 nM, 100 pM bis 10 nM, 500 pM bis 10 nM, vorzugsweise 500 pM bis 10 nM, wie mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) oder Biolayer-Interferometrie (BLI), vorzugsweise Biolayer-Interferometrie (BLI) bestimmt wurde.
In einem Beispiel bindet das antigenbindende Protein an das PRAME-Peptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9 /MHC-Komplex umfasst oder aus dieser besteht, mit einer K_D, die ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 1 nM ist, beispielsweise 10 pM bis 100 nM, 10 pM bis 150 nM, 10 pM bis 100 nM, insbesondere 50 pM bis 100 nM, 100 pM bis 100 nM, 100 pM bis 50 nM, vorzugsweise, wie mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) oder Biolayer-Interferometrie (BLI), vorzugsweise Biolayer-Interferometrie (BLI) bestimmt wurde.
In einer Ausführungsform hat das bispezifische antigenbindende Protein einen EC₅₀-Wert für TA-C/MHC-präsentierende Zellen, vorzugsweise TAA-C/MHC-präsentierende Zellen, welcher ≥5-fach, ≥10-fach, ≥20-fach, ≥50-fach, ≥100fach, ≥ 500-fach, ≥ 1000-fach niedriger als der EC₅₀-Wert für Zellen des normalen Gewebes ist, wobei der EC₅₀-Wert vorzugsweise im Hinblick auf die induzierte Zytotoxizität bestimmt wird.
Die „TA-C/MHC-präsentierende Zelle“ oder „TA-präsentierende Zelle“ bezieht sich im vorliegenden Kontext auf eine Zelle, die auf ihrer Oberfläche das TA-Antigenpeptid, wie das bestimmte TA-C-Antigenpeptid, in Komplex mit einem MHC-Protein präsentiert, wobei die Kopienzahl des TA-Peptid/MHC-Komplexes, der auf der Zelloberfläche vorhanden ist, typischerweise mit Verfahren bestimmt werden kann, die dem Fachmann bekannt sind. In einer Ausführungsform ist die TA/MHC-präsentierende Zelle eine TA-C/MHC-präsentierende Zelle, vorzugsweise eine TAA/MHC-präsentierende Zelle. In einigen Beispielen ist das TA-Antigenpeptid ein virales oder bakterielles Peptid, in solchen Beispielen ist die TA/MHCpräsentierende Zelle typischerweise eine kranke Zelle oder eine infizierte Zelle, wobei die kranke Zelle mit dem entsprechenden Virus oder Bakterium infiziert ist. In einigen Beispielen ist das TA-Antigenpeptid ein TAA-Antigenpeptid, und in diesem Beispiel ist die TAA/MHCpräsentierende Zelle typischerweise eine Krebszelle.
In einer Ausführungsform hat die TA/MHC-präsentierende Zelle, vorzugsweise die TAA/MHC-präsentierende Zelle, wie z. B. eine TAA/MHC-präsentierende Krebszelle, eine TA/MHC-Kopienzahl bzw. TAA/MHC-Kopienzahl von mehr als 50, mehr als 100, mehr als 150, mehr als 200, mehr als 300, mehr als 600, mehr als 800, mehr als 1000, mehr als 1500, mehr als 2000, vorzugsweise eine TAA/MHC-Kopienzahl von 50 bis 5000.
Die „Kopienzahl“ bezieht sich hier auf die Anzahl der TA-Antigenpeptid/MHC-Komplexe, die auf der Zelloberfläche einer Zelle vorhanden sind, wie z. B. einer TA/MHC-präsentierenden Zelle, z. B. einer TAA/MHC-präsentierenden Zelle, wie z. B. einer Krebszelle, oder einer normalen gesunden Zelle.
Solche Kopienzahlen hängen z. B. von der spezifischen TA und vom Zelltyp ab und können mit Verfahren nachgewiesen werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie z. B. FACS-Analyse, Massenspektrometrie (MS) und RNA-Sequenzierung, vorzugsweise Massenspektrometrie (MS) und RNA-Sequenzierung
„Gesunde Zellen“ können auch als „normale Zellen“ bezeichnet werden, was sich vorliegend auf Zellen bezieht, die keine Krebszellen sind, vorzugsweise beziehen sich im vorliegenden Dokument gesunde Zellen auf Zellen des Gewebes, das die TA-präsentierenden Zellen umgibt. Wenn es sich bei der TA um ein virales oder bakterielles Antigenpeptid handelt, ist die gesunde Zelle vorzugsweise nicht erkrankt, d. h. sie leidet nicht an einer bakteriellen oder viralen Infektion des entsprechenden Virus oder der entsprechenden Bakterien. In einigen Fällen können jedoch auch gesunde Zellen den TA-Peptid/MHC-Komplex exprimieren und an ihrer Oberfläche präsentieren, z. B. den TAA-Peptid/MHC-Komplex, wie z. B. den TAA-C/MHC-Komplex. Typischerweise ist der TA/MHC-Komplex in gesunden Zellen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, wie es vom Fachmann verstanden wird, in geringeren Mengen (Kopienzahl) als in einer TA-präsentierenden Zelle, wie z. B. in einer Krebszelle vorhanden sein.
Dementsprechend haben die gesunden Zellen in einer Ausführungsform eine TA/MHC-Kopienzahl, vorzugsweise eine TAA/MHC-Kopienzahl, wie z. B. eine TAA-C/MHC-Kopienzahl, von weniger als 5000, von weniger als 1000, von weniger als 500, von weniger als 100, von weniger als 50, von weniger als 20, von weniger als 10, vorzugsweise weniger als 10 TAA/MHC-Kopienzahlen, vorzugsweise eine TAA/MHC-Kopienzahl zwischen 0 und 10, wie z. B. 0 bis 5.
Gesunde Zellen werden vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Astrozyten, GABA-Neuronen, Kardiomyozyten, kardialen mikrovaskulären Endothelzellen, Chondrozyten, Endothelzellen der Koronararterie, dermalen mikrovaskulären Endothelzellen, mesenchymalen Stammzellen, nasalen Epithelzellen, mononukleären Zellen des peripheren Blutes, Pulmonalarterien-Glattmuskelzellen, vorzugsweise GABA-Neuronen, Kardiomyozyten, kardialen mikrovaskulären Endothelzellen, Chondrozyten, Koronararterien-Endothelzellen, nasalen Epithelzellen, mononukleären Zellen des peripheren Blutes, Pulmonalarterien-Glattmuskelzellen besteht.
In einer Ausführungsform weist das antigenbindende Protein einen EC₅₀-Wert für TA/MHC-Komplex-präsentierende Zellen, wie z. B. TA-C/MHC-Komplex-präsentierende Zellen, z. B. eine MAGE-A/MHC-Komplex-präsentierende Zellen auf, der ≥ 1000, ≥ 15000, ≥ 9000-fach niedriger als der EC₅₀-Wert für gesunde Zellen ist, vorzugsweise gesunde Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Astrozyten, GABA-Neuronen, Kardiomyozyten, kardialen mikrovaskulären Endothelzellen, Chondrozyten, Koronararterien-Endothelzellen, dermalen mikrovaskulären Endothelzellen, mesenchymalen Stammzellen, nasalen Epithelzellen, mononukleären Zellen des peripheren Blutes, Pulmonalarterien-Glattmuskelzellen, vorzugsweise GABA-Neuronen, Kardiomyozyten, kardialen mikrovaskulären Endothelzellen, Chondrozyten, Koronararterien-Endothelzellen, nasalen Epithelzellen, mononukleären Zellen des peripheren Blutes, Pulmonalarterien-Glattmuskelzellen.
Die bispezifischen antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung weisen ein hohes Sicherheitsprofil auf.
Das „Sicherheitsprofil“ bezieht sich vorliegend auf die Fähigkeit, Tumorzellen von Zellen des normalen gesunden Gewebes oder von Zellen, die ähnliche Peptide präsentieren, zu unterscheiden. In der Technik wird das Sicherheitsprofil mit Hilfe eines Sicherheitsfensters beschrieben.
Das „Sicherheitsfenster“ oder „therapeutische Fenster“ bezieht sich im vorliegenden Dokument auf einen Faktor, der die halbmaximale Konzentration einer Verbindung, die zur Induktion von 100% Zytotoxizität in einer Tumorzelllinie erforderlich ist, mit der halbmaximalen Konzentration einer Verbindung vergleicht, die zur Induktion von 100% Zytotoxizität der Zellen von normalem Gewebe erforderlich ist. Wenn für ein antigenbindendes Protein von Interesse der für eine Tumorzelllinie bestimmte EC₅₀-Wert 1 pM und der für z. B. Primärzellen bestimmte EC₅₀-Wert 1000 pM beträgt, dann ist das Sicherheitsfenster 1000, da der EC₅₀ für die Tumorzelllinie 1000-fach kleiner ist als der EC₅₀ für die Primärzellen.
In einer Ausführungsform hat das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung einen EC₅₀-Wert für TA/MHC-Komplex präsentierende Zellen, vorzugsweise TAA/MHC-Komplex präsentierende Zellen, wie z. B. TAA-C/MHC-Komplex präsentierende Zellen, der ≥ 100-fach, ≥ 500-fach, ≥ 1000-fach, ≥ 2000-fach, ≥ 3000-fach, ≥ 4000-fach, ≥ 5000-fach, ≥ 6000-fach niedriger als der EC₅₀-Wert für normale Gewebezellen, wie z. B. ein EC₅₀-Wert für TA/MHC-Komplex präsentierende Zellen, vorzugsweise TAA/MHC-Komplex präsentierende Zellen, wie z. B. TAA-C/MHC-Komplex präsentierende Zellen, der zwischen 500 und 12 000-fach, vorzugsweise 1000 und 10 000-fach niedriger als der EC₅₀-Wert für normale Gewebezellen ist.
In Fällen, in welchen kein EC₅₀-Wert berechnet werden kann, kann das Sicherheitsfenster auch durch Berechnung des Verhältnisses des „niedrigsten beobachteten Wirkungsniveaus“ (LOEL) eines TCER®-Moleküls auf Zielzellen bzw. Zellen von Normalgewebe bestimmt werden.
Der „LOEL“ wird vorliegend als die erste TCER®-Konzentration mit einer Reaktion über dem Cut-off-Wert definiert. Der Cut-off-Wert wurde als die Summe aus dem Assay-Hintergrund (Kokultur von Zellen des normalen Gewebes und PBMC ohne zugesetztes TCER®-Molekül) und der dreifachen Standardabweichung in allen Assay-Wells definiert.
In einer Ausführungsform weist das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung einen LOEL-Wert für TA/MHC-Komplex präsentierende Zellen, vorzugsweise TAA/MHC-Komplex präsentierende Zellen, wie z. B. TAA-C/MHC-Komplex präsentierende Zellen auf, der ≥ 100-fach, ≥ 500-fach, ≥ 1000-fach, ≥ 2000-fach, ≥ 3000-fach, ≥ 4000-fach, ≥ 5000-fach, ≥ 6000-fach niedriger als der LOEL für normale Zellen, wie z. B. ein LOEL für TA/MHC-Komplex präsentierende Zellen, vorzugsweise TAA/MHC-Komplex präsentierende Zellen, wie z.B. TAA-C/MHC-Komplex präsentierende Zellen ist, der zwischen 500 und 12 000-fach, vorzugsweise 1000 und 10 000-fach niedriger als der LOEL-Wert für normale Zellen ist.
In einer Ausführungsform weist das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung einen EC₅₀-Wert für TA/MHC-Komplex präsentierende Zellen, vorzugsweise TAA/MHC-Komplex präsentierende Zellen, TAA-C/MHC-Komplex präsentierende Zellen auf, der ≥ 5-fach, ≥ 10-fach, ≥ 20-fach, ≥ 50-fach, ≥ 100-fach, ≥ 500-fach, ≥ 1000-fach, ≥ 2000-fach, ≥ 3000-fach, ≥ 4000-fach, ≥ 5000-fach, ≥ 6000-fach niedriger als der EC₅₀-Wert für ähnliches Peptid/MHC-präsentierende Zellen ist, wobei der EC₅₀-Wert vorzugsweise im Hinblick auf die induzierte Zytotoxizität bestimmt wird, wie z. B. ein EC₅₀-Wert für TA/MHC-Komplex-präsentierende Zellen, vorzugsweise TAA/MHC-Komplex-präsentierende Zellen, der zwischen 500 und 12 000, vorzugsweise 1000 und 12 000 niedriger als der EC₅₀-Wert für ähnliches Peptid/MHC-präsentierende Zellen liegt.
„Ähnliche Peptide“ können im Zusammenhang mit dieser Erfindung auch als „Off-Targets“ bezeichnet werden und beziehen sich auf Peptide, die typischerweise 8 bis 16 Aminosäuren lang sind. Die ähnlichen Peptide im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden typischerweise durch MHC präsentiert. Darüber hinaus umfassen ähnliche Peptide im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz oder bestehen daraus, die der Aminosäuresequenz des TA-Antigenpeptids ähnlich ist, in einem bevorzugten Beispiel im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Peptide, die im Vergleich zum Epitop des TA-Antigenpeptids ein Epitop umfassen, bei dem mindestens eine Aminosäure, wie z. B. mindestens 1, 2 oder 3, vorzugsweise 1, 2 oder 3, mehr bevorzugt 1, des genannten Epitops im Vergleich zum Epitop des TA-Antigenpeptids, substituiert ist. Aufgrund dieser Sequenzähnlichkeit könnten ähnliche Peptide durch ein bispezifisches antigenbindendes Protein der Erfindung gebunden werden. In diesem Szenario, wenn z. B. das ähnliche Peptid durch ein MHC-Protein präsentiert und somit durch ein bispezifisches antigenbindendes Protein gebunden wird, führt die Fähigkeit eines gegebenen bispezifischen antigenbindenden Proteins, an ein ähnliches Peptid zu binden, nicht zu der gewünschten Effektorzellantwort, sondern kann zu unerwünschten Reaktionen führen. Solche unerwünschten Reaktionen können „Off-tumor“-Nebenwirkungen sein, wie z. B. die Kreuzreaktivität eines spezifischen TCR, der mit einem Peptid in normalen Geweben kreuzreagiert, wie in Lowdell et al., Cytotherapy, veröffentlicht am 4. Dezember 2018, Seite 7, berichtet wird. Ähnliche Peptide im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können aus einer Datenbank mit beispielsweise auf normalem Gewebe präsentierten HLA-A*02-Klasse-1 gebundenen Peptiden (XPRESIDENT-Datenbank) ausgewählt werden, wie zum Beispiel HLA-A*02-gebundene Peptide im Falle von MAGE-A, ausgehend z. B. von einer hohen Sequenzähnlichkeit (Ähnlichkeits-BLAST-Suche) mit dem TA-Antigenpeptid, wie zum Beispiel MAG-003. Aufgrund dieser unerwünschten Reaktionen sind die bispezifischen antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung so konstruiert, dass eine Zytotoxizität gegenüber Zellen normaler Gewebe, die ähnliche Peptide präsentieren, vermieden wird.
Im vorliegenden Dokument wird als eine „ähnliches Peptid/MHC-präsentierende Zelle“ eine Zelle bezeichnet, die auf ihrer Zelloberfläche einen Komplex aus ähnlichem Peptid und MHC-präsentiert.
In einer Ausführungsform haben die ähnliches Peptid/MHC-präsentierenden Zellen eine ähnliches Peptid-/MHC-Kopienzahl von mehr als 50, mehr als 100, mehr als 150, mehr als 200, mehr als 300, mehr als 600, mehr als 800, mehr als 1000, mehr als 1500, mehr als 2000, vorzugsweise eine TAA/MHC-Kopienzahl von 50 bis 5000.
In einer Ausführungsform ist die ähnliches Peptid/MHC präsentierende Zelle eine MAGE-A/MHC-Komplex präsentierende Zelle und weist eine MAGE-A/MHC-Komplex-Kopienzahl von mehr als 50, mehr als 80, mehr als 100, mehr als 120, mehr als 150, mehr als 300, mehr als 400, mehr als 600, mehr als 800, mehr als 1000, mehr als 1500, mehr als 2000, vorzugsweise eine MAGE-A/MHC-Kopienzahl von 50 bis 2000, wie z. B. 80 bis 2000, wie z. B. 100 bis 2000, wie z. B. 120 bis 2000 auf.
In einer Ausführungsform ist das TA-Antigenpeptid das Mage-A-Antigenepeptid, und die ähnlichen Peptide werden aus der Liste ausgewählt, die aus dem Peptid RABGAP1L-001, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 269, AXIN1-001, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 270, ANO5-001, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 271, TPX2-001, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 272, SYNE3-001, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO 273, MIA3-001 bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 274, HERC4-001 bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 275, PSME2-001 bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 276, HEATR5A-001 bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO 277, CNOT1-003, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 278, TEP1-003, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 279, ZFC-001 003, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 281 und PITPNM3-001, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 280, besteht.
Dementsprechend bindet in einer Ausführungsform das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung nicht oder nicht signifikant an mindestens ein ähnliches Peptid, wie z. B. mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, wie z. B. 1, 2, 3, 4, 5, vorzugsweise mindestens 3 oder 3 oder alle ähnlichen Peptide, ausgewählt aus der Gruppe der Peptide bestehend aus RABGAP1L-001, AXIN1-001, ANO5-001, TPX2-001, SYNE3-001, MIA3-001, HERC4-001, PSME2-001, HEATR5A-001, CNOT1-003, TEP1-003, PITPNM3-001, ZFC-001 vorzugsweise HEATR5A-001, HERC4-001 und ZFC-001, wenn das ähnliche Peptid in einem Komplex mit einem MHC-Protein, vorzugsweise in einem Komplex mit HLA-A*02, vorliegt.
„Bindet nicht signifikant“ im Zusammenhang mit ähnlichen Peptiden und im Zusammenhang mit den vorliegenden bispezifischen antigenbindenden Proteinen ist durch niedrigere Bindungssignale und/oder höhere K_D-Werte gekennzeichnet. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung hat das bispezifische antigenbindende Protein beispielsweise eine Bindungsreaktion für den mindestens einen ähnlichen Peptid/MHC-Komplex, die weniger als 50%, weniger als 45%, weniger als 40%, weniger als 30%, weniger als 20%, weniger als 20%, weniger als 10%, weniger als 5%, weniger als 4%, weniger als 3%, weniger als 3 % der Bindungsreaktion desselben bispezifische antigenbindenden Proteins an den MAGE-A-Antigenpeptid/MHC-Komplex in derselben experimentellen Umgebung und bei derselben bispezifische antigenbindenden Proteinkonzentration beträgt und/oder z. B. im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bindet das bispezifische antigenbindende Protein an den mindestens einen ähnlichen Peptid/MHC-Komplex mit einer Affinität, die im Vergleich zur Affinität für das spezifische Antigen, d. h. den MAGE-A-Antigenpeptid/MHC-Komplex, wie vorliegend beschrieben, vermindert ist, und wobei der jeweilige K_D-Wert für das jeweilige ähnliche Peptid um den Faktor 5, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, vorzugsweise 20 bis 100, mehr bevorzugt 30 bis 100, wie z. B. 40 bis 100, typischerweise 40 bis 50, erhöht ist. Bindet beispielsweise das bispezifische antigenbindende Protein an den Komplex MAG-003/MHC mit einem K_D-Wert von 1 nM und das bispezifische antigenbindende Protein an den Komplex von z. B. RABGAP1L-001 MHC mit einem K_D-Wert von 100 nM, dann bindet das bispezifische antigenbindende Protein an den RABGAP1L-001/ MHC mit einem K_D-Wert, welcher um den Faktor 100 erhöht ist und damit mit einer um den Faktor 100 verminderten Affinität. In diesen Beispielen werden die Bindungsreaktion, die Dissoziationskonstanten und die Bindungsaffinitäten vorzugsweise mittels Biolayer-Interferometrie gemessen, wie z. B. in den Beispielen 4 und 5 beschrieben.
Wie aus den Beispielen, insbesondere Beispiel 1 und , weiter ersichtlich ist, sind die bispezifischen antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung nicht nur löslich, sondern können auch in CHO-Zellen in einer transienten Expression in Mengen von > 10 mg/L (Zellkultur), > 20 mg/l oder sogar 40 mg/l exprimiert werden. Dementsprechend kann in einer Ausführungsform das bispezifische antigenbindende Protein der vorliegenden Erfindung in einer Wirtszelle mit hohen Ausbeuten exprimiert werden, wobei die Wirtszelle vorzugsweise eine CHO-Zelle ist und wobei die Ausbeute vorzugsweise mehr als 10, mehr als 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45 mg/l (Zellkultur) beträgt, wie z. B. 5 bis 50, 5, bis 45, 5 bis 40, 5 bis 35, 10 bis 35, 10 bis 30, 10 bis 25, 10 bis 20 mg/l (Zellkultur). In einem Beispiel wurde das antigenbindende Protein in transient transfizierten CHO-S-Zellen exprimiert, wobei die Zellen bei T=0 in einer Dichte von 4×10⁶/ml bei 37°C in einem Medium von GE Healthcare™ in einem Gesamtvolumen von 320 ml kultiviert werden. Nach einem Tag wurde Feed-Lösung (CellBoost 7a und b) zugegeben und die Temperatur auf 32°C gesenkt. Die Zellen und damit das antigenbindende Protein wurden nach einer gesamten Kultivierungsdauer von 12 Tagen und insgesamt drei Feeds geerntet.
Wie aus den Beispielen weiter ersichtlich ist, zeigten die Erfinder, dass die bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung eine vergleichbare oder sogar verbesserte Stabilität im Vergleich zu einem Referenzprotein aufweisen, z. B. im Vergleich zu einem antigenbindenden Protein, das die VH-Domäne umfasst, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 39 umfasst oder daraus besteht, und die VL-Domäne, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 38 umfasst oder daraus besteht, oder die VH-Domäne, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 137 umfasst oder daraus besteht, und die VL-Domäne, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 145 umfasst oder daraus besteht, vorzugsweise die VH-Domäne, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 137 umfasst oder daraus besteht, und die VL-Domäne, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 145 umfasst oder daraus besteht.
Dementsprechend weisen die antigenbindenden Proteine der Erfindung in einer Ausführungsform eine vergleichbare oder verbesserte Stabilität auf, gegebenenfalls im Vergleich zu einem Referenzprotein. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich eine vergleichbare oder verbesserte Stabilität beispielsweise auf eine vergleichbare oder erhöhte physikalische Stabilität bei thermischer Belastung. Die neu entwickelten antigenbindenden Proteine der Erfindung können somit den Stressbedingungen, insbesondere dem thermischen Stress, vergleichbar oder besser standhalten als das antigenbindende Referenzprotein, wobei das antigenbindende Protein vorzugsweise im gleichen Format vorliegt.
Der Begriff „Stabilität“ im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die physikalische Stabilität und kann qualitativ und/oder quantitativ mit verschiedenen analytischen Techniken bewertet werden, die in der Fachliteratur beschrieben und zusammengefasst werden, z. B. Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beziehen sich diese Verfahren insbesondere auf die Bewertung der Aggregatbildung (z. B. durch Größenausschlusschromatographie, durch Trübungsmessung und/oder durch Sichtkontrolle). Um die Stabilität zu messen, kann eine Probe, die das antigenbindende Protein der Erfindung umfasst, in einer Stabilitätsstudie getestet werden, wobei eine Probe für einen ausgewählten Zeitraum einem Belastungszustand ausgesetzt wird, gefolgt von einer quantitativen und optional qualitativen Analyse der chemischen und physikalischen Stabilität unter Verwendung einer geeigneten Analysetechnik.
In einer Ausführungsform sind die antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung physikalisch stabil, beispielsweise wenn sie für einen bestimmten Zeitraum einer Stressbelastung ausgesetzt sind, wie beispielsweise für 14 Tage einer Temperatur von 40°C.
„Physikalische Stabilität“ bezieht sich im Wesentlichen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf ein antigenbindendes Protein, das keine Anzeichen von Aggregation, Fällung und/oder Denaturierung aufweist.
Verfahren zum Zugriff auf die physikalische Stabilität sind beispielsweise Größenausschlusschromatographie (SEC), dynamische Lichtstreuung (DLS), Lichtverschleierung (LO) sowie Farbe und Klarheit.
„Keine Anzeichen einer Aggregation“ bedeutet beispielsweise, dass eine Probe, die das antigenbindende Protein umfasst, nachdem sie einer Stressbedingung, wie beispielsweise einer Temperatur von 40°C für 14 Tage in einem Puffer, wie beispielsweise PBS, ausgesetzt wurde, einen Monomergehalt von mehr als 80%, mehr als 86%, mehr als 88%, mehr als 90%, mehr als 92%, mehr als 94%, mehr als 96%, mehr als 97%, mehr als 98%, mehr als 99%, wie ein Monomergehalt von 94% bis 99%, 95% bis 99%, 96% bis 99%, 97% bis 99%, Monomergehalt, wenn sie von SEC, wie SEC-HPLC, in einem Puffer, wie PBS, gemessen werden, aufweist.
Dementsprechend weisen die antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung in einer Ausführungsform eine gleiche oder reduzierte Aggregation auf, beispielsweise im Vergleich zu einem Referenzprotein.
Für die Größenausschlusschromatographie (SEC) wird eine Differenz von 1%, 2%, 3%, 4%, vorzugsweise 1 oder 2%, mehr bevorzugt 2%, des Monomergehalts im Kontext der Erfindung unter den untersuchten Bedingungen in Abhängigkeit von der verwendeten Säule, dem Betriebsdruck und der Geschwindigkeit des Puffers als signifikant unterschiedlich angesehen.
Das bedeutet, wenn das antigenbindende Referenzprotein einen Monomergehalt von 96% und das antigenbindende Protein der Erfindung einen Monomergehalt von 98% aufweist, ist der Monomergehalt des antigenbindenden Proteins der Erfindung signifikant unterschiedlich und damit signifikant erhöht im Vergleich zum antigenbindenden Referenzprotein, gemessen unter den gleichen Bedingungen.
Nukleinsäuren, Vektoren und rekombinante Wirtszellen
Eine weitere Aufgabe der Erfindung bezieht sich auf eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die eine Sequenz umfasst oder aus dieser besteht, die für ein bispezifisches antigenbindendes Protein der Erfindung kodiert, wie es vorstehend definiert ist.
Typischerweise ist die Nukleinsäure ein DNA- oder RNA-Molekül, das in jedem geeigneten Vektor enthalten sein kann, wie beispielsweise einem Plasmid, Cosmid, Episom, künstlichem Chromosom, Phagen oder einem viralen Vektor.
Die Begriffe „Vektor“, „Klonierungsvektor“ und „Expressionsvektor“ bezeichnen das Vehikel, mit dem eine DNA- oder RNA-Sequenz (z.B. ein Fremdgen) in eine Wirtszelle eingebracht werden kann, um den Wirt zu transformieren und die Expression (z.B. Transkription und Translation) der eingeführten Sequenz zu fördern.
Somit bezieht sich eine weitere Aufgabe der Erfindung auf einen Vektor, der eine Nukleinsäure der Erfindung umfasst.
Diese Vektoren können regulatorische Elemente wie einen Promotor, Verstärker, Terminator und dergleichen umfassen, um die Expression des Polypeptids bei der Verabreichung an ein Individuum zu bewirken oder zu steuern. Beispiele für Promotoren und Verstärker, die im Expressionsvektor für tierische Zellen verwendet werden, sind Early-Promoter und -Enhancer von SV40 (Mizukami T. et al. 1987), LTR-Promoter und -Enhancer von Moloney Mausleukämievirus (Kuwana Y et al. 1987), Promoter (Mason JO et al. 1985) und Enhancer (Gillies SD et al. 1983) von Immunglobulin-H-Kette und dergleichen.
Jeder Expressionsvektor für tierische Zellen kann verwendet werden, solange ein Gen, das für die C-Region des menschlichen Antikörpers kodiert, inseriert und exprimiert werden kann. Beispiele für geeignete Vektoren sind pAGE107 pAGE107 (Miyaji H et al. 1990), pAGE103 (Mizukami T et al. 1987), pHSG274 (Brady G et al. 1984), pKCR (O'Hare K et al. 1981), pSG1 beta d2-4-(Miyaji H et al. 1990) und dergleichen. Andere Beispiele für Plasmide sind replizierende Plasmide, die einen Replikationsursprung aufweisen, oder integrative Plasmide, wie zum Beispiel pUC, pcDNA, pBR und dergleichen.
Weitere Beispiele für virale Vektoren sind adenovirale, retrovirale, herpesvirale und AAV-Vektoren. Solche rekombinanten Viren können durch in der Technik bekannte Techniken hergestellt werden, wie z. B. durch Transfektion von Verpackungszellen oder durch transiente Transfektion mit Helferplasmiden oder Viren. Typische Beispiele für Virusverpackungszellen sind PA317-Zellen, PsiCRIP-Zellen, GPenv+-Zellen, 293 Zellen, etc. Detaillierte Protokolle zur Herstellung solcher replikationsfehlerhafter rekombinanter Viren finden sich beispielsweise in WO WO 95/14785 , WO 96/22378 , US 5,882,877 , US 6,013,516 , US 4,861,719 , US 5,278,056 und WO 94/19478 .
Der Begriff „viraler Vektor“ bezieht sich auf ein Nukleinsäure-Vektorkonstrukt, das mindestens ein Element viralen Ursprungs enthält und die Fähigkeit besitzt, in ein virales Vektorpartikel verpackt zu werden, und das mindestens eine exogene Nukleinsäure kodiert. Der Vektor und/oder das Partikel können zum Zweck des Transfers beliebiger Nukleinsäuren in Zellen entweder in vitro oder in vivo verwendet werden. Zahlreiche Formen viraler Vektoren sind im Stand der Technik bekannt. Der Begriff „Virion“ bezieht sich auf ein einzelnes infektiöses Viruspartikel. „Viraler Vektor“, „virales Vektorpartikel“ und „Viruspartikel“ beziehen sich auch auf ein komplettes Viruspartikel mit seinem DNA- oder RNA-Kern und seiner Proteinhülle, wie sie außerhalb der Zelle existiert. Ein viraler Vektor kann zum Beispiel aus Adenoviren, Pockenviren, Alphaviren, Arenaviren, Flaviren, Rhabdoviren, Retroviren, Lentiviren, Herpesviren, Paramyxoviren oder Picornaviren ausgewählt werden.
Viren können sich sowohl auf natürlich vorkommende als auch auf künstliche Viren beziehen. Bei den Viren kann es sich nach einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung entweder um ein umhülltes oder um ein unumhülltes Virus handeln. Parvoviren (wie z. B. AAVs) sind Beispiele für unumhüllte Viren. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Viren umhüllte Viren sein. In bevorzugten Ausführungsformen können die Viren Retroviren und insbesondere Lentiviren sein. Zu den viralen Hüllproteinen, die eine Virusinfektion eukaryotischer Zellen fördern können, gehören möglicherweise von HIV-1 abgeleitete lentivirale Vektoren (LVs), die mit Hüllglykoproteinen (GPs) aus dem vesikulären Stomatitis-Virus (VSV-G), dem modifizierten endogenen Retrovirus der Katze (RD114TR) und dem modifizierten Gibbon-Affen-Leukämievirus (GALVTR) pseudotypisiert sind. Diese Hüllproteine können den Eintritt anderer Viren, wie Parvoviren, einschließlich adenoassoziierter Viren (AAV), effizient fördern und damit ihre breite Wirksamkeit unter Beweis stellen. Zum Beispiel können andere virale Hüllproteine verwendet werden, einschließlich des Moloney-Maus-Leukämievirus (MLV) 4070 env (wie in Merten et al., J. Virol. 79:834-840, 2005 beschrieben; deren Inhalt durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), RD114 env, das chimäre Hüllprotein RD114pro oder RDpro (das eine RD114-HIV-Chimäre ist, die durch Ersetzen der R-Peptid-Spaltsequenz von RD114 durch die HIV-1-Matrix/Capsid (MA/CA)-Spaltsequenz modifiziert wurde, wie in Bell et al. In Experimental Biology and Medicine 2010; 235: 1269-1276 beschrieben; deren Inhalt durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), Baculovirus GP64 env (wie in Wang et al. J. Virol. 81:10869-10878, 2007 beschrieben; deren Inhalt durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), oder GALV env (wie in Merten et al. J. Virol. 79:834-840, 2005; beschrieben; deren Inhalt durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), oder Derivate davon.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Wirtszelle, die gemäß der Erfindung mit einer Nukleinsäure und/oder einem Vektor transformiert, transduziert oder transfiziert wurde.
Der Begriff „Transformation“ bezieht sich ursprünglich auf einen natürlich vorkommenden Prozess des Gentransfers in eine Wirtszelle, bei dem das genetische Material, wie z. B. Nukleinsäuren, z. B. DNA oder RNA, von einer Zelle durch die Zellmembran aufgenommen wird, so dass die Wirtszelle das eingeführte Gen oder die eingeführte Sequenz exprimiert, um eine gewünschte Substanz zu produzieren, typischerweise ein Protein oder ein Enzym, das von dem eingeführten Gen oder der eingeführten Sequenz kodiert wird. Es gibt zwei Arten, die als natürliche Transformation und als künstliche oder induzierte Transformation bezeichnet werden. Das Verfahren der künstlichen oder induzierten Transformation wird unter Laborbedingungen durchgeführt.
Eine Wirtszelle, die fremde Nukleinsäuren, wie DNA oder RNA, durch den Prozess einer Transformation erhält und exprimiert, ist „transformiert“ worden.
Der Begriff „Transfektion“ bezieht sich auf eine Art des Gentransfers, bei dem auf der Zellmembran der Wirtszelle Poren geschaffen werden, die es der Wirtszelle ermöglichen, das fremde genetische Material aufzunehmen. Typischerweise bezieht sich der Begriff Transfektion auf eine Transformation von eukaryotischen Zellen, wie z. B. Insekten- oder Säugetierzellen. Bei der chemisch vermittelten Transfektion werden z. B. Kalziumphosphat oder kationische Polymere oder Liposomen verwendet. Nicht-chemisch vermittelte Transfektionsverfahren sind typischerweise Elektroporation, Sonoporation, Impalefektion, optische Transfektion oder hydrodynamische Abgabe. Bei der partikelbasierten Transfektion wird die Genkanonentechnik verwendet, bei der ein Nanopartikel zur Übertragung der Nukleinsäure auf die Wirtszelle verwendet wird, oder ein anderes Verfahren, das als Magnetofektion bezeichnet wird. Die Nukleofektion und der Einsatz von Hitzeschock sind die anderen entwickelten Verfahren für eine erfolgreiche Transfektion. Eine Wirtszelle, die über ein Transfektionsverfahren Nukleinsäuren empfängt, wurde „transfiziert“.
Unter dem Begriff „Transduktion“ versteht man im Allgemeinen den Transfer fremder Nukleinsäuren, wie z. B. DNA oder RNA, in eine Zelle durch ein Virus oder einen viralen Vektor. Eine Wirtszelle, die fremde Nukleinsäuren, wie z. B. DNA oder RNA, durch ein Virus oder einen viralen Vektor erhält und exprimiert, wurde „transduziert“.
In einigen Ausführungsformen können Zellen mit den in US20190216852 , beschriebenen Verfahren transduziert werden, deren Inhalt hiermit durch Referenz vollständig aufgenommen wird.
Die Nukleinsäuren der Erfindung können verwendet werden, um ein rekombinantes antigenbindendes Protein der Erfindung in einem geeigneten Expressionssystem herzustellen.
Der Begriff „Expressionssystem“ bezeichnet eine Wirtszelle und einen kompatiblen Vektor unter geeigneten Bedingungen, z. B. für die Expression eines Proteins, das durch Fremd-DNA kodiert wird, die vom Vektor getragen und in die Wirtszelle eingebracht wird.
Zu den gängigen Expressionssystemen gehören E. coli-Wirtszellen und Plasmidvektoren, Insektenwirtszellen und Baculovirus-Vektoren sowie Säugetierwirtszellen und -vektoren. Weitere Beispiele für Wirtszellen sind, ohne Einschränkung darauf, prokaryotische Zellen (z. B. Bakterien) und eukaryotische Zellen (z. B. Hefezellen, Säugetierzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, etc.). Konkrete Beispiele sind E. coli, Hefearten Kluyveromyces oder Saccharomyces, Säugetierzelllinien (z. B. Vero-Zellen, CHO-Zellen, 3T3-Zellen, COS-Zellen, etc.) sowie primäre oder etablierte Säugetierzellkulturen (z. B. aus Lymphoblasten, Fibroblasten, Embryonalzellen, Epithelzellen, Nervenzellen, Fettzellen, etc.). Beispiele sind auch murine SP2/0-Ag14-Zelle (ATCC CRL1581), murine P3X63-Ag8.653-Zelle (ATCC CRL1580), CHO-Zelle, in der ein Dihydrofolatreduktase-Gen (nachfolgend „DHFR-Gen“ genannt) defekt ist (Urlaub G et al; 1980), YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20-Zelle der Ratte (ATCC CRL1662, nachfolgend „YB2/0-Zelle“ genannt) und dergleichen. In einigen Ausführungsformen kann die YB2/0-Zelle bevorzugt werden, da die ADCC-Aktivität von chimären oder humanisierten Antikörpern erhöht ist, wenn sie in dieser Zelle exprimiert wird.
Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die ein bispezifisches Antigen-erkennendes Konstrukt gemäß der Erfindung umfasst. Im Speziellen umfasst die erfindungsgemäße Wirtszelle eine Nukleinsäure oder einen Vektor, wie oben beschrieben. Die Wirtszelle kann eine eukaryotische Zelle, z. B. Pflanze, Tier, Pilze oder Algen oder sie kann eine prokaryotische Zelle z. B. Bakterien oder Protozoen sein. Die Wirtszelle kann eine kultivierte Zelle oder eine primäre Zelle sein, d.h. direkt aus einem Organismus, z. B. einem Menschen, isoliert werden. Die Wirtszelle kann eine adhärente Zelle oder eine suspendierte Zelle sein, d.h. eine Zelle, die in Suspension wächst. Zur Herstellung eines bispezifischen antigenbindenden Proteins, wie z. B. eines bispezifischen TCRs, Polypeptids oder Proteins ist die Wirtszelle vorzugsweise eine Säugetierzelle.
In einer bestimmten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Stammzelle, vorzugsweise eine mesenchymale Stammzelle.
Gemäß dem Vorstehenden bezieht sich die Erfindung in einer Ausführungsform auf eine Wirtszelle, die das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung, das vorliegend definiert ist, oder die Nukleinsäure oder den Vektor der Erfindung umfasst, wobei die Wirtszelle vorzugsweise a) mesenchymale Stammzelle oder b) eine Zelle für rekombinante Expression, wie z. B. eine CHO (aus Ovarien des chinesischen Zwerghamsters)-Zelle ist.
Insbesondere für die Expression einiger der bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung kann der Expressionsvektor entweder von einem Typ sein, bei dem ein für das erste Polypeptid kodierendes Gen, wie z. B. eine schwere Kette oder eine alpha-Kette des Antikörpers, und ein für ein zweites Polypeptid kodierendes Gen, wie z. B. eine leichte Kette des Antikörpers oder eine beta-Kette, auf getrennten Vektoren vorhanden ist, oder von einem Typ, bei dem beide Gene auf demselben Vektor vorhanden sind (Tandem-Typ). In Bezug auf die Einfachheit der Konstruktion des bispezifischen antigenbindenden Proteinexpressionsvektors, die Einfachheit der Einführung in tierische Zellen und das Gleichgewicht zwischen den Expressionsebenen der Antikörper H- und L-Ketten in tierischen Zellen wird der humanisierte Antikörperexpressionsvektor vom Tandemtyp bevorzugt (Shitara K et al. J Immunol Methods. 1994 Jan. 3;167(1-2):271-8). Beispiele für einen humanisierten Antikörperexpressionsvektor des Tandemtyps sind pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18 und dergleichen.
In einer Ausführungsform können solche rekombinanten Wirtszellen zur Herstellung von mindestens einem antigenbindenden Protein der Erfindung verwendet werden.
Verfahren zur Herstellung des bispezifischen antigenbindenden Proteins der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung des antigenbindenden Proteins, wie vorstehend definiert, umfassend

a. Bereitstellung einer geeigneten Wirtszelle,
b. Bereitstellung eines genetischen Konstrukts, umfassend eine kodierende Sequenz, die das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung kodiert,
c. Einführung, bevorzugt in vitro oder ex vivo, des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle und
d. Expression des genetischen Konstrukts durch die geeignete Wirtszelle und optional
e. Auswählen der Zellen, die den Antikörper exprimieren und/oder absondern.

Das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung ist wie vorstehend, im entsprechenden Abschnitt definiert.
„Genetisches Konstrukt“ bezeichnet im vorliegenden Dokument Nukleinsäuren, die die Expression der kodierenden Region in einem Wirt ermöglichen, und bezieht sich somit auf Nukleinsäuren, wie z. B. Vektoren, die vorstehend beschrieben sind, oder auf RNA.
In einer spezifischen Ausführungsform kann das Verfahren ferner einen Schritt der Zelloberflächenpräsentation des bispezifischen Antigen-erkennenden Konstrukts auf der geeigneten Wirtszelle umfassen.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das genetische Konstrukt in b) eine Nukleinsäure, die für die bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung kodiert. Solche Nukleinsäuren sind wie vorstehend im Abschnitt „Nukleinsäure, Vektoren und rekombinante Wirtszellen“ definiert.
In einer verwandten Ausführungsform ist das genetische Konstrukt ein Expressionskonstrukt, das eine Promotorsequenz umfasst, die operativ mit der kodierenden Sequenz verknüpft ist.
In einer verwandten Ausführungsform werden die genetischen Konstrukte mittels Transformation, Transduktion oder Transfektion in den geeigneten Wirt eingebracht. Transformation, Transduktion oder Transfektion sind wie im obigen Abschnitt definiert.
Das Transduktionssystem für die Einführung des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle ist in wünschenswerter Weise ein retrovirales oder lentivirales Vektorsystem, wie es vorstehend im Abschnitt Nukleinsäure, Vektoren und rekombinante Wirtszellen beschrieben ist. Solche Systeme sind dem Fachmann gut bekannt.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner die Isolierung und Reinigung des bispezifischen antigenbindenden Proteins aus der Wirtszelle und gegebenenfalls die Rekonstitution des bispezifischen antigenbindenden Proteins in einer T-Zelle.
Ein bispezifisches antigenbindendes Protein der Erfindung kann durch jede in der Technik bekannte Technik hergestellt werden, wie beispielsweise durch jede chemische, biologische, genetische oder enzymatische Technik, entweder allein oder in Kombination.
Standardtechniken zur Herstellung von Polypeptiden, wie z. B. Antikörper oder Fragmente davon und TCRs oder Fragmente davon, sind im Stand der Technik bekannt, und diese Techniken können vom Fachmann, um die bispezifischen antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung herzustellen, benutzt werden. So können sie beispielsweise mit der bekannten Festphasenmethode, insbesondere mit einem handelsüblichen Peptidsynthesegerät (z. B. von Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien) und nach den Anweisungen des Herstellers synthetisiert werden. Alternativ können erfindungsgemäße bispezifische antigenbindende Proteine, wie z. B. Antikörper oder Fragmente davon und TCRs oder Fragmente davon, durch rekombinante DNA-Techniken synthetisiert werden, wie es im Stand der Technik bekannt ist. So können beispielsweise Fragmente als DNA-Expressionsprodukte erhalten werden, nachdem DNA-Sequenzen, die das gewünschte (Poly)peptid kodieren, in Expressionsvektoren eingebaut und in geeignete eukaryotische oder prokaryotische Wirte eingebracht wurden, die das gewünschte Polypeptid exprimieren, aus denen sie später mit bekannten Techniken isoliert werden können.
In einem Beispiel, d. h. bei bispezifischen Molekülen TCER®, können DNA-Sequenzen, die für verschiedene Kombinationen von V_H und V_L und variablen alpha (Valpha) und variablen beta (Vbeta) kodieren, sowie Sequenzen, die Linker kodieren, beispielsweise durch Gensynthese erhalten werden. Resultierende DNA-Sequenzen können rastermäßig in Expressionsvektoren kloniert werden, die für die Gelenkregion, C_H2- und C_H3-Domäne kodieren, die sich beispielsweise von humanem IgG4 [Zugangs-Nr.: K01316] bzw. IgG1 [Zugangs-Nr.: P01857] ableiten, und weiterentwickelt werden können. Die Modifikationen können ausgeführt werden, um Knob-into-Hole-Mutationen in C_H3-Domänen mit und ohne zusätzliche Stabilisierung durch Disulfidbindungen zwischen den Ketten einzufügen, um eine N-Glykosilierungsstelle in C_H2 (z. B. N297Q Mutation) zu entfernen, oder um F_c-Stilllegung-Mutationen einzuführen, um jeweils in V_L und V_H eine Stabilisierung durch zusätzliche Disulfidbindungen einzuführen gemäß den durch Reiter u. a. beschriebenen Verfahren (Stabilization of the F_v Fragments in Recombinant Immunotoxins by Disulfide Bonds Engineered into Conserved Framework Regions. Biochemistry, 1994, 33, 5451 - 5459).
Bispezifische antigenbindende Proteine der Erfindung werden durch Immunglobulin-Reinigungsverfahren wie z. B. Protein A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie vom Kulturmedium getrennt.
In einer Ausführungsform bezieht sich die Gewinnung der exprimierten bispezifischen antigenbindenden Proteine oder Polypeptide im vorliegenden Kontext auf die Durchführung einer Protein-A-Chromatographie, einer Kappa-Select-Chromatographie und/oder einer Größenausschlusschromatographie, vorzugsweise einer Protein-A-Chromatographie und/oder einer Größenausschlusschromatographie, bevorzugter einer Protein-A-Chromatographie und einer Größenausschlusschromatographie.
Verfahren zur Herstellung von bispezifischen antigenbindenden Proteinen der Erfindung beinhalten rekombinante DNA und Gentransfektionstechniken sind in der Technik bekannt (siehe Morrison SL. et al. (1984) und Patentdokumente US 5,202,238 ; und US 5,204,244 ).Darüber hinaus sind Verfahren zur Herstellung humanisierter Antikörper auf der Basis konventioneller rekombinanter DNA- und Gentransfektionstechniken in der Technik bekannt (siehe z. B. Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985) und können leicht auf die Herstellung von erfindungsgemäßen bispezifischen antigenbindenden Proteinen angewendet werden.
In einem Beispiel wurden Vektoren für die Expression der rekombinanten antigenbindenden Proteine der Erfindung als monocistronisch konzipiert, z. B. gesteuert durch HCMV-basierte Promoterelemente, pUC19-Derivate. Plasmid-DNA wurde, zum Beispiel, in E.coli gemäß Standardkulturverfahren amplifiziert und anschließend unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits aufgereinigt (Macherey & Nagel). Aufgereinigte Plasmid-DNA wurde für die vorübergehende Transfektion, zum Beispiel, von CHO-S-Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers (ExpiCHO™ System; Thermo Fisher Scientific) oder unter Verwendung eines Elektroporationssystems (MaxCyte STX) verwendet. Transfizierte CHO-Zellen wurden, zum Beispiel, 6-14 Tage, zum Beispiel, bei 32°C bis 37°C kultiviert und erhielten ein bis zwei Feeds von ExpiCHOTM Feed-Lösung oder Cellboost 7a und 7b (GE Healthcare™).
Der konditionierte Zellüberstand wurde z. B. durch Filtration (0,22 µm) unter Verwendung von Sartoclear Dynamics® Lab Filter Aid (Sartorius) gereinigt. Bispezifische antigenbindende Proteine wurden unter Verwendung, zum Beispiel, eines Äkta Pure 25 L FPLC-Systems (GE Lifesciences) aufgereinigt, das dafür ausgerüstet ist, parallel Affinitäts- und Größenausschlusschromatografie durchzuführen. Affinitätschromatographie wurde, zum Beispiel, auf Protein-A- oder Protein-L-Säulen (GE Lifesciences) unter Befolgung von Standardprotokollen für die Affinitätschromatographie ausgeführt. Direkt nach der Elution (pH 2,8) von der Affinitätssäule, um hochreine monomere Proteine zu erhalten, wurde die Größenausschlusschromatografie unter Verwendung von zum Beispiel Superdex 200 pg 16/600 Säulen (GE Lifesciences) unter Befolgung von Standardprotokollen, durchgeführt. Zum Beispiel wurden auf einem NanoDrop System (Thermo Scientific) Proteinkonzentrationen bestimmt, wobei berechnete Extinktionskoeffizienten gemäß den vorhergesagten Proteinsequenzen verwendet wurden. Die Konzentration wurde bei Bedarf mit Hilfe von Vivaspin-Geräten (Sartorius) angepasst. Schließlich wurden aufgereinigte Moleküle, zum Beispiel, in phosphatgepufferter Salzlösung bei Konzentrationen von ungefähr 1 mg/ml bei Temperaturen von 2-8°C gelagert.
Die Qualität der gereinigten bispezifischen antigenbindenden Proteine wurde beispielsweise durch HPLC-SEC auf MabPac SEC-1-Säulen (5 µm, 4×300 mm) bestimmt, die beispielsweise in 50 mM Natriumphosphat pH 6,8 mit 300 mM NaCI innerhalb eines Vanquish uHPLC-Systems laufen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung, die Nukleinsäuren der Erfindung, den Vektor der Erfindung oder die Wirtszelle der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein bispezifisches antigenbindendes Protein gemäß der Erfindung zur Verwendung als Medikament. Die Erfindung bezieht sich auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur Verwendung als Medikament.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung eines gemäß der Erfindung oder/und auf eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung in der Herstellung eines Medikaments.
Die vorliegend verwendeten Begriffe „pharmazeutische Zusammensetzung“ oder „therapeutische Zusammensetzung“ beziehen sich auf eine Verbindung oder Zusammensetzung, die bei ordnungsgemäßer Verabreichung an ein Subjekt einen gewünschten therapeutischen Effekt erzielen kann.
In einigen Ausführungsformen kann das Subjekt auch als Patient bezeichnet werden.
Solche therapeutischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen können eine therapeutisch wirksame Menge eines bispezifischen antigenbindenden Proteins der Erfindung oder, das ferner ein therapeutisches Mittel umfasst, in Mischung mit einem pharmazeutisch oder physiologisch akzeptablen Formulierungsmittel umfassen, das für die Eignung für die Art der Verabreichung ausgewählt ist.
Das bispezifische antigenbindende Protein der vorliegenden Erfindung wird in der Regel als Teil einer sterilen, pharmazeutischen Zusammensetzung geliefert, die normalerweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger beinhaltet.
„Pharmazeutisch“ oder „pharmazeutisch akzeptabel“ bezieht sich auf molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die bei Verabreichung an ein Säugetier, insbesondere an einen Menschen, keine unerwünschte, allergische oder andere unerwünschte Reaktion hervorrufen. Ein pharmazeutisch akzeptabler Träger oder Hilfsstoff bezieht sich auf einen nicht toxischen festen, halbfesten oder flüssigen Füllstoff, Verdünnungsmittel, Verkapselungsmaterial oder Formulierungshilfsmittel jeglicher Art.
Ein „pharmazeutisch akzeptabler Träger“ kann auch als „pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel“ oder „pharmazeutisch akzeptables Vehikel“ bezeichnet werden und kann beispielsweise Lösungsmittel, Füllstoffe, Stabilisierungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und antimykotische Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und dergleichen beinhalten, die physiologisch kompatibel sind. Dementsprechend ist der Träger in einer Ausführungsform ein wässriger Träger.
In einem weiteren Aspekt ist der wässrige Träger in der Lage, in Kombination mit einem bispezifischen antigenbindenden Protein oder einem anderen vorliegend beschriebenen Molekül verbesserte Eigenschaften zu verleihen, z. B. verbesserte Löslichkeit, Wirksamkeit und/oder verbesserte Immuntherapie.
Die Form der pharmazeutischen Zusammensetzungen, der Verabreichungsweg, die Dosierung und das Schema hängen natürlich von der zu behandelnden Erkrankung, der Schwere der Krankheit, dem Alter, Gewicht und Geschlecht des Patienten, der gewünschten Behandlungsdauer usw. ab. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann in jeder geeigneten Form vorliegen (abhängig von der gewünschten Verabreichungsart an einen Patienten). Es kann in Dosierungseinheitsform bereitgestellt werden und wird im Allgemeinen in einem versiegelten Behälter bereitgestellt und kann als Teil eines Kits bereitgestellt werden. Dieser Kit würde normalerweise (aber nicht notwendigerweise) Gebrauchsanweisungen umfassen. Er kann eine Vielzahl dieser Dosierungseinheitsformen enthalten.
Empirische Überlegungen, wie z. B. die biologische Halbwertszeit, werden im Allgemeinen zur Bestimmung der Dosierung beitragen. Die Häufigkeit der Verabreichung kann im Laufe der Therapie bestimmt und angepasst werden und basiert auf der Reduzierung der Anzahl der Krebszellen, der Aufrechterhaltung der Reduktion von Krebszellen, der Reduzierung der Proliferation von Krebszellen oder der Abtötung der Krebszellen. Alternativ können Formulierungen mit verzögerter kontinuierlicher Freisetzung des bispezifischen antigenbindenden Proteins geeignet sein. Verschiedene Formulierungen und Vorrichtungen zur Erreichung einer verzögerten Freisetzung sind in der Technik bekannt.
In einer Ausführungsform können die Dosierungen für die antigenbindenden Proteine empirisch bei Personen bestimmt werden, die eine oder mehrere Verabreichung(en) erhalten haben. Den Individuen werden inkrementelle Dosierungen des antigenbindenden Proteins gegeben. Um die Wirksamkeit des antigenbindenden Proteins zu beurteilen, kann ein Marker für den Zustand der Krebszellen verfolgt werden. Dazu gehören direkte Messungen der Proliferation von Krebszellen und des Zelltods durch FACS, andere bildgebende Verfahren; eine Verbesserung der Gesundheit, wie sie durch solche Messungen bewertet wird, oder eine Steigerung der Lebensqualität, wie sie durch anerkannte Tests oder eine Verlängerung des Überlebens gemessen wird. Es wird für den Fachmann offensichtlich sein, dass die Dosierung je nach Individuum, Krankheitsstadium und den bisherigen und gleichzeitigen Behandlungen variieren wird.
Insbesondere enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen Vehikel, die für eine injizierbare Formulierung pharmazeutisch akzeptabel sind. Dabei kann es sich insbesondere um isotonische, sterile, salzhaltige Lösungen (Mononatrium- oder Dinatriumphosphat, Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumchlorid und dergleichen oder Mischungen dieser Salze) oder um trockene, insbesondere gefriergetrocknete Zusammensetzungen handeln, die nach Zusatz von sterilisiertem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung je nach Fall den Zubereitung injizierbarer Lösungen ermöglichen.
Zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen kann eine wirksame Menge des bispezifischen antigenbindenden Proteins der Erfindung in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder wässrigen Medium gelöst oder dispergiert werden.
Die pharmazeutischen Formen, die für die injizierbare Verwendung geeignet sind, schließen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen, Formulierungen einschließlich Sesamöl, Erdnussöl oder wässriges Propylenglykol; und sterile Pulver für die extemporane Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen ein. In allen Fällen muss die Form steril und bis zu dem Maße flüssig sein, dass eine leichte Injizierbarkeit gegeben ist. Sie muss unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie etwa Bakterien und Pilzen, geschützt werden.
Lösungen der Wirkstoffe als freie Base oder pharmakologisch akzeptable Salze können in Wasser in geeigneter Weise mit einem Tensid, wie beispielsweise Hydroxypropylcellulose, vermischt werden. Dispersionen können auch in Glycerol, flüssigen Polyethylenglykolen und Gemischen hiervon und in Ölen hergestellt werden. Unter gewöhnlichen Bedingungen der Lagerung und Verwendung enthalten diese Präparationen einen Konservierungsstoff, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Ein antigenbindendes Protein der Erfindung kann unter Verwendung pharmazeutisch akzeptabler Salze in eine Zusammensetzung in neutraler oder salziger Form formuliert werden.
Sterile, injizierbare Lösungen werden hergestellt durch Einbringen des Wirkstoffs in die benötigte Menge eines geeigneten Lösungsmittels zusammen mit verschiedenen der oben aufgezählten anderen Inhaltsstoffe, so wie benötigt, gefolgt von Sterilfiltration. Dispersionen werden im allgemeinen hergestellt, indem die verschiedenen sterilisierten Wirkstoffe in ein steriles Vehikel eingebracht wird, das das basale Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Inhaltsstoffe aus der obigen Aufzählung enthält. Im Fall der sterilen Pulver für die Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren die Vakuumtrocknung und die Gefriertrocknungstechnik, die ein Pulver des Wirkstoffs, sowie einen beliebigen zusätzlichen gewünschten Inhaltsstoff aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon ergeben.
Auch die Herstellung von mehr oder hochkonzentrierten Lösungen für die Direkteinspritzung ist vorgesehen, wobei die Verwendung von DMSO als Lösungsmittel zu einer extrem schnellen Penetration führen soll, die hohe Konzentrationen der Wirkstoffe in einen kleinen Tumorbereich liefert.
Nach der Formulierung werden die Lösungen in einer mit der Dosierungsformel kompatiblen Weise und in einer Menge verabreicht, die therapeutisch wirksam ist. Die Formulierungen lassen sich leicht in einer Vielzahl von Darreichungsformen verabreichen, wie beispielsweise der oben beschriebenen Art von injizierbaren Lösungen, aber auch Wirkstofffreisetzungskapseln und dergleichen können eingesetzt werden.
Therapeutische Verfahren und Anwendungen
Die Erfinder haben in Beispiel 2 des experimentellen Abschnitts in vitro für auf das MAG-003 abzielende antigenbindende Proteine in Kombination mit entweder BMA031 (V36) oder UCHT1 (V17) als Rekrutierer, insbesondere im TCER®-Format, die zytotoxische Aktivität dieser Moleküle für verschiedene MAG-003-positive Krebszelllinien gezeigt. Die Erfinder haben außerdem gezeigt, dass die zytotoxische Aktivität für die TAA-positiven Zellen, wie z. B.MAG-003-positive Zellen hochspezifisch ist und darauf beschränkt, da nur eine marginale Lyse durch die bispezifischen antigenbindenden Proteine in Zelllinien, die HLA-A*02 exprimieren, aber das TAA Peptid, wie beispielsweise MAG-003, nicht präsentieren, induziert wurde. Die Beispiele zeigen daher den technischen Vorteil der Kombination der gegen CD3 gerichteten Bindungsdomäne mit niedriger Affinität, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung offenbart wird, mit einer variablen TCR-Domäne mit hoher Affinität. In den Beispielen bindet eine solche variable TCR-Domäne spezifisch an das TAA MAGE-A. Der Fachmann wird jedoch verstehen, dass die Vorteile, die für bispezifische antigenbindende Proteine beobachtet wurden, die im Zusammenhang mit einem TAA als Target beispielhaft dargestellt werden, auch auf bispezifische antigenbindende Proteine übertragbar sind, die auf ein anderes TA zielen, wie z. B. ein virales Antigenpeptid oder ein bakterielles Antigenpeptid, anstelle eines TAA. Der Fachmann wird verstehen, dass in verschiedenen Ausführungsformen das antigenbindende Protein, sobald es der Versuchsperson verabreicht wird, an die Zielzelle bindet, wie z. B. eine TA/MHC-Komplex präsentierende Zelle, und endogene Effektorzellen rekrutiert, sie über CD3 bindet, sie aktiviert und somit diese Effektorzellen in der Nähe der Zielzelle lokalisiert, insbesondere die anvisierten Krebszellen, um eine Abtötung dieser Zielzelle, insbesondere eine Anti-Krebs-Aktivität zu erreichen.
In einem Aspekt löst die Bindung des antigenbindenden Proteins an eine Zielzelle und an CD3 einer Effektorzelle eine Immunantwort aus, eine solche Antwort kann sich auf die Proliferation und Aktivierung von Effektorfunktionen in vitro oder in vivo beziehen. Für die MHC-Klasse-I-restringierte zytotoxische T-Zellen, zum Beispiel, können die Effektorfunktionen der Lysis von Peptid-gepulsten, Peptid-Vorläufer-gepulsten oder natürlichen Peptid-präsentierenden Zielzellen, die Sekretion von Zytokinen, bevorzugt Interferon-gamma, TNF-alpha oder IL-2 induziert durch Peptide, die Sekretion von Effektormolekülen, zum Beispiel Granzyme oder Perforine induziert durch Peptide oder Degranulation, sein.
Dementsprechend können die bispezifischen antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung, insbesondere TCER®-Moleküle, zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen eingesetzt werden, darunter z. B. verschiedene Formen von Krebs und/oder Infektionskrankheiten. Die bispezifischen antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung können zu therapeutischen Zwecken beim Menschen und/oder bei nichtmenschlichen Säugetieren, insbesondere beim Menschen, verwendet werden.
In einer Ausführungsform können die bispezifischen antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung an erkrankte Zellen binden und das Wachstum der Tumorzellen reduzieren und/oder die erkrankten Zellen abtöten, die den TA Peptid/MHC-Komplex auf ihrer Zelloberfläche präsentieren. In einer bevorzugten Ausführungsform können die bispezifischen antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung an Tumorzellen binden und das Wachstum der Tumorzellen reduzieren und/oder die Tumorzellen abtöten, die den TAA Peptid/MHC-Komplex auf ihrer Zelloberfläche präsentieren. Es versteht sich, dass das bispezifische antigenbindende Protein in einer Konzentration verabreicht wird, die die Bindung bei physiologischen (z. B. in vivo) Bedingungen fördert.
Dementsprechend können die bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung in einer Ausführungsform zur Immuntherapie gegen Tumorzellen verschiedener Gewebe wie Dickdarm, Lunge, Brust, Prostata, Eierstock, Bauchspeicheldrüse, Niere usw. verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform können die antigenbindenden Proteine der Erfindung allein an Tumorzellen binden und deren Wachstum reduzieren und/oder sie abtöten.
Daher bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer proliferativen Erkrankung oder Störung, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des bispezifischen antigenbindenden Proteins, der Nukleinsäure oder des Vektors, der Wirtszelle oder der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung, wie sie vorliegend im Abschnitt „Bispezifisches antigenbindendes Protein“ „Nukleinsäuren“ oder „Pharmazeutische Zusammensetzungen“ definiert ist, an ein Subjekt, das diese benötigt.
In einer bestimmten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts, das an einer Erkrankung leidet, umfassend die Verabreichung des bispezifischen antigenbindenden Proteins der Erfindung, an dieses Subjekt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auslösen einer Immunantwort bei einem Subjekt, das an einer Erkrankung leidet, umfassend die Verabreichung einer Zusammensetzung an das Subjekt, die das Antigen-erkennende Konstrukt der Erfindung Konstrukt der Erfindung enthält, das gegebenenfalls in einer Wirtszelle exprimiert wird.
In einer Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung des bispezifischen antigenbindenden Proteins, der Nukleinsäure oder des Vektors, der Wirtszelle oder der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit bei einem Subjekt.
In einer Ausführungsform ist die Immunantwort, auf die sich das Verfahren bezieht, eine zytotoxische T-Zell-Antwort. Diese zytotoxische T-Zell-Antwort wird durch die Bindung des Antigens, das an das auf einer Effektorzelle vorhandene CD3 bindet, und durch die Bindung an den TA-Antigenpeptid/MHC-Komplex und somit durch die Annäherung der Effektorzelle und der Zielzelle induziert.
Die Erfindung betrifft ferner bispezifische antigenbindende Proteine der Erfindung, die Nukleinsäure der Erfindung oder der Vektor der Erfindung, die Wirtszelle der Erfindung oder die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur Verwendung in der Diagnose, Vorbeugung und/oder Behandlung einer Erkrankung.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der bispezifischen antigenbindenden Proteine der Erfindung, der Nukleinsäure der Erfindung oder des Vektors der Erfindung, der Wirtszelle der Erfindung oder der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für die Diagnose, Vorbeugung und/oder Behandlung einer Erkrankung.
Der Begriff „Subjekt“ oder „Individuum“ wird austauschbar verwendet und kann beispielsweise ein Mensch oder ein nicht-menschliches Säugetier, vorzugsweise ein Mensch, sein.
Im Zusammenhang mit der Erfindung bezieht sich der Begriff „behandeln“ oder „Behandlung“ auf eine therapeutische Verwendung (d. h. bei einem Patienten mit einer bestimmten Krankheit) und bedeutet Umkehrung, Linderung und Hemmung des Fortschritts eines oder mehrerer Symptome einer solchen Störung oder eines solchen Zustands. Daher bezieht sich die Behandlung nicht nur auf eine Behandlung, die zu einer vollständigen Heilung der Krankheit führt, sondern auch auf Behandlungen, die das Fortschreiten der Krankheit verlangsamen und/oder das Überleben des Subjekts verlängern.
Unter „Vorbeugung“ versteht man eine prophylaktische Anwendung (d. h. bei einem Subjekt, das anfällig für die Entwicklung einer bestimmten Krankheit ist).
Der Begriff „behandlungsbedürftig“ bezieht sich auf ein Subjekt, das bereits die Störung hat, sowie auf diejenigen, bei denen die Störung vorgebeugt werden soll. Dementsprechend ist das Subjekt in einer Ausführungsform ein Patient.
In einer Ausführungsform ist eine „Krankheit“ oder „Störung“ jede Bedingung, die von einer Behandlung mit dem antigenbindenden Protein der Erfindung profitieren würde. In einer Ausführungsform umfasst dies chronische und akute Störungen oder Krankheiten, einschließlich derjenigen pathologischen Bedingungen, die das Subjekt der betreffenden Störung prädisponieren. Insbesondere kann es sich bei der Krankheit, auf die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, um eine proliferative Krankheit oder um eine durch einen Virus oder ein Bakterium verursachte Krankheit handeln. Eine durch einen Virus oder ein Bakterium verursachte Krankheit kann auch als virale oder bakterielle Infektion bezeichnet werden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann das Virus, das die Krankheit verursacht, aus der Gruppe ausgewählt werden, die z. B. aus humanen Immunschwächeviren (HIV), humanem Cytomegalieviren (HCMV), Cytomegalievirus (CMV), humanem Papillomavirus (HPV), Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV), Infektion mit humanem Papillomavirus (HPV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Influenzavirus, vorzugsweise humanen Immunschwächeviren (HIV) besteht. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Bakterien, die die Krankheit verursachen, wie z. B. Mycobacterium tuberculosis. Einem Fachmann wird es verständlich sein, dass, wenn das bispezifische antigenbindende Protein auf ein virales Antigenpeptid, z. B. von HIV, abzielt, das bispezifische antigenbindende Protein zur Behandlung von HIV verwendet werden soll. Dementsprechend ist ein bispezifisches antigenbindendes Protein, das auf das virale oder bakterielle Antigenpeptid TA-C abzielt, zur Verwendung bei der Behandlung von Viren oder Bakterien bestimmt, von denen das virale oder bakterielle Antigenpeptid abgeleitet wurde.
„Proliferative Erkrankungen“, wie z. B. Krebs, beinhalten die unregulierte und/oder unangemessene Proliferation von Zellen.
In einer Ausführungsform ist die proliferative Störung oder Erkrankung z. B. eine Tumorerkrankung, die durch die Expression der TA, spezieller der TAA, in einer Krebs- oder Tumorzelle dieser Tumorerkrankung gekennzeichnet ist.
Dementsprechend ist eine besonders bevorzugte Krebsart ein TA-positiver Krebs, insbesondere ein TAA-positiver Krebs.
In einer weiteren Ausführungsform ist die proliferative Störung oder Erkrankung z. B. eine Tumorerkrankung, die durch die Expression von MAGEA4 und/oder MAGEA8 in einer Krebs- oder Tumorzelle dieser Tumorerkrankung gekennzeichnet ist.
Entsprechend ist eine besonders bevorzugte Krebsart ein MAGEA4- und/oder MAGEA8-positiver Krebs.
In einer weiteren Ausführungsform ist die proliferative Störung oder Erkrankung z. B. eine Tumorerkrankung, die durch die Expression von PRAME in einer Krebs- oder Tumorzelle dieser Tumorerkrankung gekennzeichnet ist.
Entsprechend ist eine besonders bevorzugte Krebsart ein PRAME-positiver Krebs.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gilt ein Krebs als „TAA-positiv“, wie zum Beispiel „MAGEA4- und/oder MAGEA8-positiv“ oder „PRAME-positiv“, wenn das verwandte TAA-Peptid, wie z. B. eines der vorstehend im Abschnitt „Definitionen“ definierten TAA-Peptide, z. B. das MAG-003-Peptid oder PRAME-004, das in > 98% aller Krebsarten nach den Richtlinien des NCI präsentiert wird. Bei allen anderen hier genannten Indikationen kann eine Biopsie durchgeführt werden, wie es bei der Behandlung dieser Krebsarten üblich ist, und das Peptid kann nach dem XPRESIDENT® und verwandten Verfahren identifiziert werden (gemäß WO 03/100432 ; WO 2005/076009 ; WO 2011/128448 ; WO 2016/107740 , US 7,811,828 , US 9,791,444 und US 2016/0187351 deren Inhalte hiermit durch Verweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden). In einer Ausführungsform wird der Krebs leicht getestet (d. h. diagnostiziert), z. B. durch Verwendung eines bispezifischen antigenbindenden Proteins der Erfindung. Verfahren zur Identifizierung eines Antigens, das Krebs exprimiert, unter Verwendung eines antigenbindenden Proteins sind dem Fachmann bekannt.
In einer Ausführungsform wird der Krebs aus der Liste ausgewählt, die aus Lungenkrebs, wie nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs, Leberkrebs, Kopf- und Halskrebs, Hautkrebs, Nierenzellkrebs, Hirnkrebs, Magenkrebs, Darmkrebs, Leberzellkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Leukämie, Brustkrebs, Merkelzellkarzinom, Melanom, Eierstockkrebs, Harnblasenkrebs, Gebärmutterkrebs, Gallenblasen- und Gallengangkrebs, Osteosarkom und Speiseröhrenkrebs besteht.
Zu den Texten, die Leitlinien für die Krebstherapie bieten, gehören Cancer, Principles and Practice of Oncology, 4th Edition, DeVita et al, Eds. J. B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa. (1993). Je nach Krebsart und anderen Faktoren, wie z. B. dem Allgemeinzustand des Patienten, wird ein geeigneter Therapieansatz gewählt, wie er im entsprechenden Bereich anerkannt wird. Die bispezifischen antigenbindenden Proteine der vorliegenden Erfindung können allein verwendet oder einem Therapieschema mit anderen anti-Krebs Mitteln, die typischerweise zur Behandlung eines Krebspatienten verwendet werden, zugesetzt werden.
Dementsprechend kann in einigen Ausführungsformen das bispezifische antigenbindendes Protein der Erfindung gleichzeitig mit, vor oder nach einer Mehrzahl von Arzneimitteln und Behandlungen verabreicht werden, die in der Krebstherapie weit verbreitet sind, wie beispielsweise Chemotherapeutika, nicht-chemotherapeutische, anti-neoplastische Mittel und/oder Bestrahlung, vorzugsweise Chemotherapeutika.
In weiteren Ausführungsformen können die bispezifischen antigenbindenden Proteine auch zur Behandlung von Infektionskrankheiten, wie z. B. infektiösen viralen oder bakteriellen Erkrankungen, verwendet werden, wobei die virale Erkrankung z. B. aus der Gruppe bestehend aus humanen Immunschwächeviren (HIV), humanem Cytomegalievirus (HCMV), Cytomegalievirus (CMV), humanem Papillomavirus (HPV), Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV), humaner Papillomavirus-Infektion (HPV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Influenzavirus, vorzugsweise HIV, HBV, Influenza und HCMV und vielen anderen ausgewählt wird, und wobei die bakterielle Erkrankung zum Beispiel Tuberkulose ist.
Ein antigenbindendes Protein der Erfindung oder die pharmazeutische Zusammensetzung davon kann allein oder gleichzeitig mit, vor oder nach der Verabreichung anderer Therapeutika zur Behandlung solcher Infektionskrankheiten verabreicht werden.
„Diagnose“ bezieht sich im vorliegenden Kontext auf eine medizinische Diagnose und bezieht sich auf das Bestimmen, welche Krankheit oder welcher Zustand die Symptome und Zeichen einer Person erklärt.
Mit einer „therapeutisch wirksamen Menge“ des bispezifischen antigenbindenden Proteins oder der pharmazeutischen Zusammensetzung ist eine ausreichende Menge des bispezifischen antigenbindenden Proteins zur Behandlung der proliferativen Erkrankung gemeint, wobei ein angemessenes Nutzen-Risiko-Verhältnis für jede medizinische Behandlung gilt. Es versteht sich jedoch, dass der gesamte tägliche oder monatliche Gebrauch der antigenbindenden Proteine, der Nukleinsäure oder des Vektors, der Wirtszelle oder der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung vom behandelnden Arzt im Rahmen einer gesunden medizinischen Beurteilung festgelegt wird. Die spezifische therapeutisch wirksame Dosierung für einen bestimmten Patienten hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich der zu behandelnden Störung oder Erkrankung und der Schwere der Störung; der Aktivität des verwendeten spezifischen bispezifischen antigenbindenden Proteins; der verwendeten spezifischen Zusammensetzung, dem Alter, dem Körpergewicht, der allgemeinen Gesundheit, dem Geschlecht und der Ernährung des Patienten; dem Zeitpunkt der Verabreichung, dem Verabreichungsweg und der Ausscheidungsrate des verwendeten spezifischen Polypeptids; der Dauer der Behandlung; Medikamenten, die in Kombination oder gleichzeitig mit dem verwendeten spezifischen Polypeptid verwendet werden; und ähnlichen Faktoren, die im medizinischen Bereich gut bekannt sind. Zum Beispiel ist es dem Fachmann bekannt, die Dosierung der Verbindung auf einem niedrigeren Niveau als dem, das erforderlich ist, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen, zu beginnen und die Dosierung allmählich zu erhöhen, bis die gewünschte Wirkung erreicht ist.
In einer Ausführungsform wird die Wirksamkeit der Behandlung mit einem bispezifischen antigenbindenden Protein der Erfindung in vivo untersucht, beispielsweise in einem Mausmodell von Krebs und durch Messung von beispielsweise Veränderungen des Tumorvolumens zwischen behandelten und Kontrollgruppen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, Vektoren, Nukleinsäuren und Zellen der Erfindung können in einer im Wesentlichen reinen Form bereitgestellt werden, zum Beispiel, wobei mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% in Bezug auf das Gewicht des bispezifischen antigenbindenden Proteins desselben Typs vorhanden sind.
Das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung, die Nukleinsäure der Erfindung oder der Vektor der Erfindung, die Wirtszelle der Erfindung oder die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung können nach jedem praktikablen Verfahren verabreicht werden.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Abtöten von Zielzellen in einem Patienten bereit, wobei das Verfahren die Verabreichung eines antigenbindenden Proteins an den Patienten umfasst. Im Zusammenhang mit diesem Verfahren bindet das antigenbindende Protein, sobald es dem Patienten verabreicht wird, an die Zielzelle und eine CD3-exprimierende Effektorzelle und löst vorzugsweise eine Immunantwort aus.
In einem spezifischen Ansatz kann die Wirtszelle eine Stammzelle sein, wie beispielsweise eine mesenchymale Stammzelle, die so konstruiert ist, dass sie das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung exprimiert. In diesem Beispiel ist das bispezifische antigenbindende Protein ein TCER® wie vorliegend beschrieben.
Dementsprechend kann die Wirtszelle der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise eine Stammzelle wie vorstehend definiert, als Wirkstoff einer therapeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Somit stellt die Erfindung auch ein Verfahren zum Abtöten von Zielzellen in einem Patienten bereit, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Anzahl von Wirtszellen, wie vorstehend definiert, vorzugsweise einer mesenchymalen Stammzelle, an den Patienten umfasst.
Für die Zwecke der erfindungsgemäßen Verfahren, bei denen dem Subjekt Wirtszellen oder Zellpopulationen verabreicht werden, können die Wirtszellen allogene (von einem anderen Subjekt) oder autologe Zellen in Bezug auf das Subjekt sein. Es ist bevorzugt, dass die Zellen für das Subjekt autolog sind.
Wenn die Wirtszellen allogen sind und somit von einem anderen Subjekt stammen, ist dieses andere Subjekt gesund.
Mit „gesund“ wird gemeint, dass das Subject im Allgemeinen bei guter Gesundheit ist, bevorzugt ein kompetentes Immunsystem besitzt und, weiter bevorzugt, unter keiner Krankheit leidet, auf die einfach getestet und die einfach entdeckt werden kann.
Dementsprechend wurde die Wirtszelle mit einer Nukleinsäure und/oder einem Vektor gemäß der Erfindung transformiert, transduziert oder transfiziert, wie vorliegend im Abschnitt „Nukleinsäuren, Vektoren und rekombinante Wirtszellen“ beschrieben.
Wenn die Wirtszelle transformiert, transduziert oder transfiziert wird, um das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung zu exprimieren, umfasst die Zelle vorzugsweise einen Expressionsvektor, der das antigenbindende Protein exprimieren kann. Sobald die Wirtszelle das bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung exprimiert, kann die Wirtszelle als aktivierte Wirtszelle bezeichnet werden.
In einem Aspekt kann sich die TCR-ausgelöste Immunantwort oder T-Zellantwort auf die Proliferation und Aktivierung von Effektorfunktionen beziehen, die durch die Bindung der bispezifischen Antigenbindung an die T-Zelle und an den TA-Antigenpeptid/MHC-Komplex, wie z. B. den TA-C/MHC-Komplex, in vitro oder in vivo induziert werden. Für die MHC-Klasse-I-restringierte zytotoxische T-Zellen, zum Beispiel, können die Effektorfunktionen der Lysis von Peptid-gepulsten, Peptid-Vorläufer-gepulsten oder natürlichen Peptid-präsentierenden Zielzellen, die Sekretion von Zytokinen, bevorzugt Interferon-gamma, TNF-alpha oder IL-2 induziert durch Peptide, die Sekretion von Effektormolekülen, zum Beispiel Granzyme oder Perforine induziert durch Peptide oder Degranulation, sein.
Somit betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung aktivierte Wirtszellen, die nach den vorher beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zu erhalten sind.
Aktivierte Wirtszellen, die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden, können selektiv eine Zielzelle erkennen.
Eine „Zielzelle“ bezieht sich im vorliegenden Dokument auf TA-C/MHC-präsentierende Zelle oder eine TA-präsentierende Zelle, wie vorstehend im Abschnitt „bispezifische antigenbindende Proteine“ definiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform, d. h. wenn der TA/MHC-Komplex ein TAA/MHC-Komplex ist, ist die Zielzelle eine Krebszelle, wobei der Krebs wie vorliegend oben definiert ist.
In vivo können die Zielzellen für die CD3-positiven Effektorzellen gemäß der vorliegenden Erfindung Zellen des Tumors (die manchmal MHC-Klasse-II exprimieren) und/oder Stromazellen in der Umgebung des Tumors (Tumorzellen) (die manchmal auch MHC-Klasse-II exprimieren; (Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170) sein.
Kits
Schließlich stellt die Erfindung auch Kits zur Verfügung, die mindestens ein bispezifisches antigenbindendes Protein der Erfindung umfassen.
In einer Ausführungsform umfasst das Kit Folgendes

a) mindestens ein bispezifisches antigenbindendes Protein der Erfindung, wie vorstehend im Abschnitt „bispezifische antigenbindende Proteine“ definiert,
b) optional Verpackungsmaterial und
c) optional ein Etikett oder eine Packungsbeilage, die in dem Verpackungsmaterial enthalten ist und anzeigt, dass das bispezifische antigenbindende Protein zur Behandlung einer Krankheit, vorzugsweise Krebs, oder zur Verwendung für die Behandlung einer Krankheit, vorzugsweise Krebs, wirksam ist.

In einer verwandten Ausführungsform ist das mindestens eine antigenbindende Protein der Erfindung in einer oder mehreren Ein- und/oder Mehrkammer-Fertigspritzen (z. B. Flüssigkeitsspritzen und Lyospritzen) enthalten.
In einer Ausführungsform umfasst die Erfindung Kits zur Herstellung einer Einzeldosis-Verabreichungseinheit.
Dementsprechend ist in einer Ausführungsform das mindestens eine bispezifische antigenbindende Protein der Erfindung, wie unter a) des erfindungsgemäßen Kits erwähnt, ein getrocknetes bispezifisches antigenbindendes Protein der Erfindung, das in einem ersten Behälter enthalten ist. Das Kit enthält dann des Weiteren einen zweiten Behälter mit einer wässrigen Formulierung.
Dementsprechend umfasst das Kit in einer Ausführungsform Folgendes

a) einen ersten Behälter, der mindestens ein getrocknetes bispezifisches antigenbindendes Protein der Erfindung, wie vorstehend im Abschnitt „antigenbindende Proteine“ definiert,
b) einen zweiten Behälter, der eine wässrige Formulierung umfasst;
c) optional Verpackungsmaterial und
d) optional ein Etikett oder eine Packungsbeilage, die in dem Verpackungsmaterial enthalten ist und anzeigt, dass das bispezifische antigenbindende Protein zur Behandlung einer Krankheit, vorzugsweise Krebs, oder zur Verwendung für die Behandlung einer Krankheit, vorzugsweise Krebs, wirksam ist.

Die wässrige Formulierung ist typischerweise eine wässrige Lösung, die pharmazeutisch akzeptable Träger umfasst, wie sie vorstehend im Abschnitt „Pharmazeutische Zusammensetzungen“ definiert sind.
In einer verwandten Ausführungsform beziehen sich der „erste Behälter“ und der „zweite“ Behälter auf die Kammern einer Mehrkammer-Fertigspritze (z. B. Lyospritzen).
Der Krebs ist wie vorstehend im Zusammenhang mit der Erfindung definiert.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf die vorliegend im Folgenden zitierten Punkte und Aspekte.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein bispezifisches antigenbindendes Protein, das mindestens zwei Antigenbindungsstellen (D und B) umfasst, wobei die Antigenbindungsstelle D an TCRα/β bindet und wobei die Antigenbindungsstelle B an einen Zielantigen-(TA)-Peptid/MHC-Komplex bindet, und wobei die Antigenbindungsstelle D eine variable Domäne der schweren Kette (V_H) und eine variable Domäne der leichten Kette (V_L) umfasst, und wobei die V_L die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 42 umfasst oder aus dieser besteht, und wobei die V_H die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 43 umfasst oder aus dieser besteht.
In einem verwandten Gegenstand des genannten Aspekts bindet die Antigenbindungsstelle D des bispezifischen Antigenbindendes Proteins des genannten Aspekts an TCRα/β mit einem K_D(D)-Wert und die Antigenbindungsstelle B bindet an den Ziel-Antigenpeptid C (TA-C)/MHC-Komplex mit einem K_D(C)-Wert und wobei das Verhältnis von K_D(D)/K_D(C) mehr als 1, mehr als 4, mehr als 6, mehr als 8, mehr als 10, mehr als 15, mehr als 20, mehr als 25, mehr als 30, mehr als 40, mehr als 50 beträgt, wie z. B. zwischen 1 und 150, zwischen 4 und 140, zwischen 6 und 100, zwischen 8 und 100, zwischen 10 und 100, vorzugsweise zwischen 10 und 100.
In einem weiteren verwandten Gegenstand des genannten Aspekts bindet die Antigenbindungsstelle D an TCRα/β mit einem K_D(D), der ≥ 3 nM, ≥ 5 nM, ≥ 8 nM, ≥10 nM, ≥12 nM, ≥14 nM, ≥16 nM, ≥18 nM, ≥20 nM, ≥25 nM, ≥30 nM, ≥35 nM, ≥40 nM, ≥45 nM, und vorzugsweise ≤1000 nM, ≤800 nM, ≤600 nM, ≤500 nM, ≤400 nM ist, wie z. B. zwischen 3 nM und 1000 nM, 3 nM und 600 nM, zwischen 5 nM und 600 nM, 10 nM und 600 nM, 12 nM und 600 nM, 14 nM und 600 nM, 16 nM und 600 nM, 18 nM und 600 nM, 20 nM und 600 nM, vorzugsweise 5 nM und 100 nM, wie mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) oder Biolayer-Interferometrie (BLI), vorzugsweise Biolayer-Interferometrie (BLI) bestimmt.
In einem weiteren verwandten Gegenstand dieses Aspekts bindet die Antigenbindungsstelle B an den Ziel-Antigenpeptid C (TA-C)/MHC-Komplex mit einem K_D(C), der ≤ 100 µM, ≤ 1 µM ≤ 100 nM,≤ 50 nM, ≤ 10 nM, z. B. 0,01 nM bis 150 nM, 0,05 nM bis 150 nM, 0,1 nM bis 150 nM, 0,1 nM bis 100 nM, 0,1 nM bis 50 nM, 0,1 nM bis 10 nM, 0,5 nM bis 10 nM, 0,5 nM bis 5 nM, vorzugsweise 0,5 nM bis 5 nM beträgt, wie mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) oder Biolayer-Interferometrie (BLI), vorzugsweise Biolayer-Interferometrie (BLI) bestimmt.
In einem weiteren verwandten Gegenstand dieses Aspekts weist das antigenbindende Protein einen EC₅₀-Wert für TA-C/MHC präsentierende Zellen auf, der ≥100, ≥ 500, ≥ 1000 niedriger als der EC₅₀-Wert für Zellen von normalem Gewebe ist.
In einem weiteren verwandten Gegenstand dieses Aspekts ist das TA-Antigenpeptid C ein virales Peptid, ein bakterielles Peptid oder ein tumorassoziiertes Antigen (TAA)-Peptid, vorzugsweise ein tumorassoziiertes Antigen (TAA)-Peptid.
In einem weiteren verwandten Element dieses Aspekts weist das antigenbindende Protein einen EC₅₀-Wert für TA-C/MHC-Komplex präsentierende Zellen auf, der ≥5-fach, ≥10-fach, ≥20-fach, ≥50-fach, ≥-100-fach, ≥-500-fach, ≥-1000-fach niedriger als der EC₅₀-Wert für Zellen von normalem Gewebe ist.
In einem weiteren verwandten Gegenstand dieses Aspekts ist das TA-Antigenpeptid C ein tumorassoziiertes Antigen (TAA) Peptid C, und wobei das TAA-C aus der Gruppe der TAA-Antigenpeptide ausgewählt ist, die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 162 bis 317 umfassen oder aus diesen bestehen, SEQ ID NO: 9 und 10, wie z. B. das Antigenpeptid PRAME, das die Aminosäuresequenz „SLLQHLIGL“ von SEQ ID NO: 9 umfasst oder aus dieser besteht, oder das Antigenpeptid MAGE-A, das die Aminosäuresequenz „KVLEHVVRV“ von SEQ ID NO: 10 umfasst oder aus dieser besteht, wobei der MHC vorzugsweise ein HLA-A*02 ist.
In einem weiteren verwandten Gegenstand dieses Aspekts ist das TA-Antigenpeptid C das MAGE-A-Antigenpeptid, das die Aminosäuresequenz „KVLEHVVRV“ von SEQ ID NO: 10 umfasst oder aus dieser besteht, und wobei das ähnliche Peptid aus der Liste bestehend aus RABGAP1L-001, AXIN1-001, ANO5-001, TPX2-001, SYNE3-001, MIA3-001, HERC4-001, PSME2-001, HEATR5A-001, CNOT1-003, TEP1-003, PITPNM3-001, ZFC-001, vorzugsweise HEATR5A-001, HERC4-001 und CNOT1-003 ausgewählt ist.
Bei einem weiteren verwandten Gegenstand dieses Aspekts ist das bispezifische antigenbindende Protein ein bispezifischer Antikörper oder ein Fragment davon, ein bispezifischer T-Zell-Rezeptor (TCR) oder ein Fragment davon oder ein bispezifischer einkettiger TCR (scTCR) oder ein bispezifischer einkettiger Antikörper.
In einem weiteren verwandten Gegenstand dieses Aspekts umfasst die Antigenbindungsstelle B einen Antikörper oder ein Fragment davon oder eine variable Domäne der alpha-Kette (V_α) und eine variable Domäne der beta-Kette (V_β) oder eine variable Domäne der gamma-Kette (V_γ) oder eine variable Domäne der delta-Ketten-(V_δ), vorzugsweise eine variable Domäne der alpha-Kette (V_α) und eine variable Domäne der beta-Kette (V_β) oder eine variable Domäne der gamma-Kette (V_γ) und eine variable Domäne der delta-Kette (V_δ), vorzugsweise eine V_α und V_β.
In einem weiteren verwandten Gegenstand dieses Aspekts,

i) umfasst die V_α eine Aminosäuresequenz oder besteht daraus, welche aus der Gruppe, bestehend aus ‚EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDSKQDQRLT VLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP‘ SEQ ID NO: 20, ‚EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLT VLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP‘ 'SEQ ID NO: 21, ‚EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTESSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLT VLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP‘ SEQ ID NO: 22 ausgewählt wird oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz identisch ist, welche aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 20, 21 und 22 ausgewählt wird, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 20 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von CDRa1 von SEQ ID NO: 23, CDRa2 von SEQ ID NO: 24 und CDRa3 von SEQ ID NO: 25 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO 21 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von CDRa1 von SEQ ID NO: 23, CDRa2 von SEQ ID NO: 26 und CDRa3 von SEQ ID NO: 25 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 22 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von CDRa1 von SEQ ID NO: 27, CDRa2 von SEQ ID NO: 26 und CDRa3 von SEQ ID NO: 25 umfasst, und wobei die Aminosäure der ersten variablen Domäne vorzugsweise die Aminosäuren 19V und/oder 48K umfasst, und V_β eine Aminosäuresequenz ‚DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGM PEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVL‘ SEQ ID NO: 30 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz identisch ist, welche aus SEQ ID NO: 30 besteht, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 30 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von CDRb1 von SEQ ID NO: 31, CDRb2 von SEQ ID NO: 34 bzw. CDRb3 von SEQ ID NO: 35 umfasst und optional die Aminosäure 54F und/oder 66C umfasst, oder
(ii) die V_α oder V_γ die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 48 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 48 identisch ist, umfasst oder daraus besteht, wobei vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 48 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRa1 von SEQ ID NO: 49, CDRa2 von SEQ ID NO: 50 und CDRa3 von SEQ ID NO: 51 umfasst, und V_β oder V_δ die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 44 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 44 identisch ist, umfasst oder daraus besteht, wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 44 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRb1 von SEQ ID NO: 45, CDRb2 von SEQ ID NO: 46 und CDRb3 von SEQ ID NO: 47 umfasst.

In einem Gegenstand dieses Aspekts umfasst das antigenbindende Protein ein erstes Polypeptid der Formel V₃-L₁-V₄-L₂-C_L-L₅-F_c1 [III], das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 282 oder 284 umfasst oder daraus besteht, und das zweite Polypeptid der Formel V₅-L₃-V₆-L₄-C_H1-L₆-F_c2 [IV], das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 283 umfasst oder daraus besteht.
In einem weiteren verwandten Gegenstand des genannten Aspekts umfasst das bispezifische antigenbindende Protein ferner eines oder mehrere der folgenden:

(i) ein Diagnostikum;
(ii) ein therapeutisches Mittel; oder
(iii) eine pharmakokinetisch (PK) modifizierende Einheit.

In einem weiteren verwandten Gegenstand dieses Aspekts umfasst eine isolierte Nukleinsäure eine Sequenz, die für ein bispezifisches antigenbindendes Protein, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, kodiert, oder ein Nukleinsäurevektor umfasst diese Nukleinsäure.
In einem weiteren verwandten Gegenstand dieses Aspekts umfasst eine rekombinante Wirtszelle ein bispezifisches antigenbindendes Protein, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, oder eine Nukleinsäure oder einen Vektor, wie im oben genannten Gegenstand definiert, wobei die genannte Wirtszelle vorzugsweise a) eine Stammzelle, vorzugsweise eine mesenchymale Stammzelle oder b) eine Zelle für rekombinante Expression, wie eine Zelle aus Ovarien des Chinesischen Hamsters (CHO), ist.
In einem weiteren verwandten Gegenstand dieses Aspekts bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein bispezifisches antigenbindendes Protein, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, die Nukleinsäure oder den Vektor, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, oder die Wirtszelle, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel, Stabilisator und/oder Hilfsstoff umfasst.
In einem weiteren verwandten Gegenstand dieses Aspekts bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des bispezifischen antigenbindenden Proteins, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, umfassend

a. Bereitstellung einer geeigneten Wirtszelle,
b. Bereitstellung eines genetischen Konstrukts umfassend eine kodierende Sequenz, die für das bispezifische antigenbindende Protein kodiert, wie es in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert ist,
c. Einführung des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle und
d. Expression des genetischen Konstrukts durch die geeignete Wirtszelle.

In einem weiteren verwandten Gegenstand umfasst das Verfahren, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, ferner die Isolierung und Reinigung des bispezifischen antigenbindenden Proteins aus der geeigneten Wirtszelle.
In einem weiteren verwandten Gegenstand das bispezifische antigenbindende Protein, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, die Nukleinsäure oder Vektor, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, die Wirtszelle, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, oder die pharmazeutische Zusammensetzung, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, zur Verwendung in der Medizin.
In einem weiteren verwandten Gegenstand die bispezifische Antigenbindung, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, die Nukleinsäure oder Vektor, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, die Wirtszelle, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, oder die pharmazeutische Zusammensetzung, wie in den oben genannten Aspekten und Gegenständen definiert, zur Verwendung in der Diagnose, Prävention und/oder Behandlung einer Krankheit, wie z. B. einer viralen oder bakteriellen Infektion oder einer proliferativen Erkrankung, vorzugsweise Krebses, mehr bevorzugt eines TAA/MHC-positiven Krebses.
Die in der vorliegenden Patentanmeldung verwendeten Definitionen und Ausführungsformen gelten mutatis mutandis für die oben genannten Aspekte und Gegenstände.
In der gesamten vorliegenden Anmeldung ist der Begriff „und/oder“ eine grammatikalische Konjunktion, die als umfassende zu interpretieren ist, so dass einer oder mehrere der von ihr verbundenen Fälle auftreten können. Beispielsweise weist die Formulierung „solche Proteine mit nativer Sequenz können mit rekombinanten und/oder synthetischen Standardverfahren hergestellt werden“ darauf hin, dass Proteine mit nativer Sequenz mit rekombinanten und synthetischen Standardverfahren hergestellt werden können oder dass Proteine mit nativer Sequenz mit rekombinanten Standardverfahren hergestellt werden können oder dass Proteine mit nativer Sequenz mit synthetischen Verfahren hergestellt werden können.
Darüber hinaus ist der Begriff „umfassend“ in der gesamten vorliegenden Anmeldung so zu interpretieren, dass er alle spezifisch erwähnten Merkmale sowie optionale, zusätzliche, nicht spezifizierte Merkmale umfasst. Die Verwendung des Begriffs „umfassend“, wie er hier verwendet wird, legt auch die Ausführungsform offen, in der keine anderen als die spezifisch erwähnten Merkmale vorhanden sind (d.h. „bestehend aus“).
Darüber hinaus schließt der unbestimmte Artikel „ein“ oder „eine“ eine Pluralität nicht aus. Die bloße Tatsache, dass bestimmte Maßnahmen in voneinander abweichenden abhängigen Ansprüchen wiedergegeben werden, spricht nicht dafür, dass eine Kombination dieser Maßnahmen nicht zu ihrem Vorteil genutzt werden kann.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Abbildungen und Beispiele näher beschrieben. Alle hier zitierten Literatur- und Patentdokumente werden hiermit durch Verweis in ihrer Gesamtheit einbezogen. Während die Erfindung in der vorstehenden Beschreibung ausführlich dargestellt und beschrieben wurde, sind die Beispiele als illustrativ oder exemplarisch und nicht restriktiv zu betrachten.
Figurenliste

zeigt das Alignment der UCHT1-VL-Domäne an dem identifizierten menschlichen Akzeptor-Framework. Die in der Abbildung identifizierten CDRs sind gemäß den Cothia-Definitionen identifiziert.
zeigt das Alignment der UCHT1-VH-Domäne an dem identifizierten menschlichen Akzeptor-Framework. Die in der Abbildung identifizierten CDRs sind gemäß den Cothia-Definitionen identifiziert.
zeigt die konzentrationsabhängige Bindung von PRAME-004-spezifischen TCER®-Molekülen an Jurkat-Zellen, gemessen mittels Durchflusszytometrie.
zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen LDH-Freisetzungstests mit PBMC eines gesunden HLA-A*02-positiven Spenders. MAG-003-spezifische TCER®-Moleküle unter Verwendung von UCHT1(V17) oder BMA031(V36) wurden an MAG-003-positiven und MAG-003-negativen sowie Off-Target-positiven Tumorzelllinien getestet. Getestete Zelllinien (von links nach rechts): H695T, A375, T98G, BV173. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen innerhalb der Triplikate dar.
zeigt die Ergebnisse von LDH-Freisetzungstests an gesunden Zellen, die mit MAG-003-spezifischem TCER® auf der Basis von UCHT1(V17) inkubiert wurden. Jedes Zytotoxizitätsdiagramm zeigt die LDH-Freisetzung eines primären gesunden Zelltyps (leere Kreise) im Vergleich zur Kontroll-Tumorzelllinie Hs695T (gefüllte Kreise) in der gleichen Mediumskombination nach Ko-Inkubation mit PBMCs und steigenden Konzentrationen des TCER-Moleküls. Berechnete Sicherheitsfenster basierend auf EC₅₀-Werten sind ebenfalls dargestellt.
zeigt die Ergebnisse von LDH-Freisetzungstests an gesunden Zellen, die mit MAG-003-spezifischem TCER® auf der Basis von BMA031(V36) inkubiert wurden. Jedes Zytotoxizitätsdiagramm zeigt die LDH-Freisetzung eines primären gesunden Zelltyps (leere Kreise) im Vergleich zur Kontroll-Tumorzelllinie Hs695T (gefüllte Kreise) in der gleichen Mediumskombination nach Ko-Inkubation mit PBMCs und steigenden Konzentrationen des TCER-Moleküls. Berechnete Sicherheitsfenster, die entweder auf EC₅₀-Werten oder auf LOEL basieren, sind ebenfalls dargestellt.
zeigt die Visualisierung der eingeführten Punktmutationen. Schaubild A zeigt die neu eingeführte Asp-Seitenkette an Position 31 der schweren Kette von UCHT1 und die negativ geladenen Seitenketten von CD3ε, die sich in ihrer räumlichen Nähe befinden. Schaubild B zeigt sowohl das wt Tyr als auch das ersetzende Gin in Position 54 der schweren Kette von UCHT1. Die Ersetzung der aromatischen Seitenkette durch eine kleinere, polare Aminosäure entfernt die hydrophobe Wechselwirkung mit dem apolaren Stamm der Asp in Position 48 von CD3ε. Schaubild C zeigt den Ersatz desselben Tyr in Position 54 der schweren Kette von UCHT1 durch Glu und die negativ geladenen Seitenketten auf CD3ε (48D, 49E, 50D, 51D), die sich in räumlicher Nähe befinden und wahrscheinlich eine elektrostatische Abstoßung des neu eingeführten Glu auf UCHT1 verursachen. Schaubild D zeigt das wt Lys in der Position 55 der schweren Kette von UCHT1, die eine Wasserstoffbindung (gestrichelte Linie) mit dem Rückgrat eines Ser in der Position 56 von CD3ε (links) bildet. Die Ersetzung des genannten Lys durch Arg entfernt die polare Wechselwirkung und führt weitere Masse ein, wodurch die Arg-Seitenkette in einen gespannten Rotamer gedrückt wird (rechts). Ausschnitt E zeigt dasselbe Lys in Position 55 der schweren Kette von UCHT1 und seine Ersetzung durch Glu; diese Mutation entfernt auch die H-Bindung, die zwischen Lys und dem Ser in Position 56 von CD3ε gebildet wurde. Zusätzlich führt sie eine negativ geladene Seitenkette in räumlicher Nähe eines negativ geladenen Flecks auf der Oberfläche von CD3ε ein, der von Asp 48, Glu 49, Asp 50 und Asp 51 gebildet wird.
zeigt eine Zusammenfassung der Produktionsausbeuten und Stabilitätseigenschaften von TCER®-Molekülen auf der Basis humanisierter UCHT1-Varianten. (na) nicht anwendbar, (nd) nicht durchgeführt.
zeigt durch Biolayer-Interferometrie gemessene Bindungskurven von TCER®antigenbindenden Proteinen, die verschiedene UCHT1-Varianten für MAG-003 im Komplex mit HLA-A*02 umfassen. Steigende Konzentrationen von TCER®-Molekülen in Lösung wurden verwendet und sind in nM angegeben.
zeigt durch Biolayer-Interferometrie gemessene Bindungskurven von TCER®antigenbindenden Proteinen, die verschiedene UCHT1-Varianten für CD3δε-Fc umfassen. Steigende Konzentrationen von TCER®-Molekülen in Lösung wurden verwendet und sind in nM angegeben.
zeigt die Ergebnisse von zwei unabhängigen LDH-Freisetzungstests mit PBMC von zwei gesunden HLA-A*02-positiven Spendern (HBC-982 und HBC-720). MAG-003-spezifische TCER®-Moleküle unter Verwendung von UCHT1-Varianten mit verschiedenen Affinitäten wurden an MAG-003-positiven Tumorzelllinien getestet. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen innerhalb der Triplikate dar.

BEISPIELE
Beispiel 1: Humanisierung von murinem monoklonalem Ab UCHT1
Die Humanisierung des murinen monoklonalen Antikörpers UCHT1 wurde durch CDR-Transplantation gemäß den veröffentlichten Methoden durchgeführt. Daher wurden CDRs von VH und VL gemäß den Cothia-Definitionen identifiziert. Sequenz-Alignments, die die variablen Domänen von UCHT1 mit den menschlichen Keimbahnen verglichen, wurden generiert. Basierend auf der allgemeinen Sequenzidentität, übereinstimmenden Schnittstellenpositionen und ähnlich klassifizierten kanonischen CDR-Positionen wurde für jede der leichten und schweren Ketten eine Keimbahn als die vielversprechendsten Akzeptor-Frameworks identifiziert, VK1-O18 für die leichte Kette und VH-1-46 für die schwere Kette. Die J-Segment-Gene wurden mit der parentalen Sequenz über FR4 verglichen, und die J-Segmente JK1 und JH4 wurden für die leichte bzw. schwere Kette ausgewählt.
Es wurde eine Liste aller Positionen mit unterschiedlichen Resten zwischen dem Ursprungs- und dem Akzeptor-Framework erstellt. Alle Positionen wurden analysiert und sowohl isoliert als auch im Zusammenhang mit anderen möglichen Substitutionen betrachtet. Jede Position wurde als neutral, kritisch oder beitragend eingestuft, und es wurde ein Vorschlag gemacht, welche Rückstände in humanisierten Varianten ersetzt und bewertet werden sollten. Potenzielle humanisierte Variantensequenzen wurden mit Hilfe von Epibase™ (Lonza) gescreent. Jedes Epitop oder Cluster von Epitopen wurde auf Substitutionen analysiert, die entweder das Epitop entfernen oder die vorhergesagte Immunogenität weiter reduzieren würden. Darüber hinaus wurden potenzielle Stellen für posttranslationale Modifikationen innerhalb der CDRs identifiziert und entsprechende Abhilfemaßnahmen vorgeschlagen. Insgesamt resultierte dies in der Generierung von vier verschiedenen VH- und fünf verschiedenen VL-Domänen. Daher wurden 17 Humanisierungsvarianten von UCHT1 generiert. Alle Varianten wurden in CHO-Zellen als Fab-Moleküle exprimiert. Die exprimierten Proteine wurden gereinigt und nach Expressionstiter, Aggregatniveaus und EC₅₀-Werten der Bindung an Jurkat-Zellen eingestuft. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde das humanisierte UCHT1(V17), definiert durch SEQ ID Nr.: 137 und SEQ ID Nr.: 145, für die Etablierung der TCER®-Moleküle der Erfinder ausgewählt.PRAME-004 (SEQ ID Nr.: 9), die auf TCER®-Moleküle abzielen, wurden unter Verwendung entweder der Rekrutierungsdomänen von humanisiertem UCHT1 (V17), was zu Molekülen mit SEQ ID Nr.: 171 und SEQ ID Nr. 170 führte, bzw. von humanisiertem BMA031(V10), was zu SEQ ID Nr.: 168 und SEQ ID Nr.: 169 führte, konstruiert.
Vektoren für die Expression von rekombinanten Proteinen wurden als monocistronische pUC19-Derivative erschaffen, die durch Promotorelemente gesteuert werden, die von HCMV stammen. Plasmid-DNA wurde in E.coli gemäß Standardkulturverfahren amplifiziert und anschließend unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits aufgereinigt (Macherey & Nagel). Aufgereinigte Plasmid-DNA wurde für die vorübergehende Transfektion von CHO-S-Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet (ExpiCHO™ system; Thermo Fisher Scientific). Transfizierte CHO-Zellen wurden 6-14 Tage bei 32°C bis 37°C kultiviert und erhielten ein bis zwei Feeds von ExpiCHOTM Feed-Solution.
Der konditionierte Zellüberstand wurde durch Zentrifugation (4000 × g, 30 Minuten) geerntet und durch Filtration (0,22 µm) gereinigt. Bispezifische Moleküle wurden unter Verwendung eines Äkta Pure 25 L FPLC-Systems (GE Lifesciences) aufgereinigt, das dafür ausgerüstet ist, parallel Affinitäts- und Größenausschlusschromatografie durchzuführen. Affinitätschromatografie wurde auf Protein-A-Säulen (GE Lifesciences) unter Befolgung von Standardprotokollen für die Affinitätschromatografie ausgeführt. Direkt nach der Elution (pH 2,8) von der Affinitätssäule, um hochreine monomere Proteine zu erhalten, wobei unter Verwendung von Standardprotokollen Superdex 200 pg 16/600 Säulen (GE Lifesciences) verwendet wurden, wurde die Größenausschlusschromatografie durchgeführt. Auf einem NanoDrop System (Thermo Scientific) wurden Proteinkonzentrationen bestimmt, wobei berechnete Extinktionskoeffizienten gemäß den vorhergesagten Proteinsequenzen verwendet wurden. Falls notwendig, wurde die Aufkonzentration und der Austausch des Puffers unter Verwendung von Vivaspin-Geräten (Sartorius) durchgeführt. Schließlich wurden aufgereinigte Moleküle in phosphat-gepufferter Salzlösung bei Konzentrationen von ungefähr 1 mg/ml bei Temperaturen von 2-8°C gelagert.
Die Bindungsaffinität dieser TCER®-Moleküle gegenüber Effektorzellen wurde durchflusszytometrisch bestimmt. Daher wurden Jurkat-Zellen (CD3+ und TCRab+) mit steigenden Konzentrationen von TCER® inkubiert. Nach dem Waschen der Zellen wurden die gebundenen TCER®-Moleküle mit einem PE-markierten Sekundärreagenz (#709-116-098, Jackson ImmunoResearch) angefärbt. Die Zellen wurden schließlich mit einem Intellicyt® iQue Cell Screener analysiert. Die Ergebnisse eines von vier unabhängigen Experimenten sind in dargestellt, die die konzentrationsabhängige Bindung von PRAME-004-spezifischen TCER®-Molekülen an Jurkat-Zellen zeigen. Es ist offensichtlich, dass das UCHT1-basierte TCER®-Molekül eine EC₅₀-Bindung von etwa 2-3 nM zeigt, während BMA031-basierte TCER®-Moleküle eine mindestens 50-100-fach schwächere Bindung an die Jurkat-Zellen aufweisen.
Beispiel 2: Zytotoxizität als Grundsatznachweis unter Verwendung von Rekrutierern mit unterschiedlicher Affinität
Antigenbindende Proteine, die auf das Peptid MAG-003 (SEQ ID No: 10) abzielen, wurden durch die Kombination von modifizierten variablen Domänen eines T-Zell-Rezeptors (SEQ ID No: 20 und SEQ ID Nr.: 30) mit den variablen Domänen von entweder UCHT1(V17) (SEQ ID No: 137 und SEQ ID No: 145) oder BMA031(V36) (SEQ ID No: 42 und SEQ ID No: 43) innerhalb des TCER®-Konstrukts erzeugt.
Vektoren für die Expression der jeweiligen TCER®-Moleküle wurden als monocistronische pUC19-Derivative erschaffen, die durch Promotorelemente gesteuert werden, die von HCMV stammen. Plasmid-DNA wurde in E.coli gemäß Standardkulturverfahren amplifiziert und anschließend unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits aufgereinigt (Macherey & Nagel). Gereinigte Plasmid-DNA wurde für die transiente Transfektion von CHO-S-Zellen unter Verwendung eines Elektroporationssystems (MaxCyte STX) verwendet. Transfizierte CHO-Zellen wurden 10-12 Tage bei 32°C bis 37°C kultiviert und erhielten ein bis drei Feeds von der Lösung Cellboost 7a und 7b (GE Healthcare™).
Der konditionierte Zellüberstand wurde durch Filtration (0,22 µm) mit Sartoclear Dynamics® Lab Filter Aid (Sartorius) gereinigt. Bispezifische antigenbindende Proteine wurden unter Verwendung eines Äkta Pure 25 L FPLC-Systems (GE Lifesciences) aufgereinigt, das dafür ausgerüstet ist, parallel Affinitäts- und Größenausschlusschromatografie durchzuführen. Affinitätschromatografie wurde auf MAbSelect SuRE oder Protein-L-Säulen (GE Lifesciences) unter Befolgung von Standardprotokollen für die Affinitätschromatografie ausgeführt. Direkt nach der Elution (pH 2,8) von der Affinitätssäule, um hochreine monomere Proteine zu erhalten, wobei unter Verwendung von Standardprotokollen Superdex 200 pg 26/600 Säulen (GE Lifesciences) verwendet wurden, wurde die Größenausschlusschromatografie durchgeführt. Auf einem NanoDrop System (Thermo Scientific) wurden Proteinkonzentrationen bestimmt, wobei berechnete Extinktionskoeffizienten gemäß den vorhergesagten Proteinsequenzen verwendet wurden. Die Konzentration wurde bei Bedarf mit Hilfe von Vivaspin-Geräten (Sartorius) angepasst. Schließlich wurden aufgereinigte Moleküle in phosphat-gepufferter Salzlösung bei Konzentrationen von ungefähr 1 mg/ml bei Temperaturen von 2-8°C gelagert.
Die zytotoxische Aktivität der bispezifischen Moleküle gegen MAG-positive bzw. MAGnegative Tumorzelllinien wurde mittels LDH-Freisetzungstest analysiert. Daher wurden Tumorzelllinien, die auf der Zelloberfläche variable Mengen von HLA-A*02/MAG-003 präsentieren, mit von gesunden Spendern isolierten PBMC (HLA-A*02+) in Gegenwart steigender Konzentrationen von TCER®-Molekülen koinkubiert. Nach 48 Stunden wurde die Lyse der Zielzelllinien mit CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kits (PROMEGA) gemessen.
Beispielhafte Ergebnisse solcher Assays sind in Abbildung (Beispiel 2) dargestellt. Die resultierenden EC₅₀-Werte werden in der Tabelle 5 zusammengefasst. Tabelle 5: Zusammenfassung der EC₅₀-Werte von Killing-Assays beim Vergleich verschiedener rekrutierender Antikörper.

Rekrutierer EC₅₀ auf Target Hoch EC₅₀ auf Target niedrig EC₅₀ auf Off-Target positiv EC₅₀ auf Negativ

UCHT1 (V17) 3 pM 4 pM 146 pM 11559 pM

BMA031(V36) 69 pM 383 pM 21555 pM n/a
Diese Ergebnisse zeigen die reduzierte Wirksamkeit des TCER®-Moleküls auf BMA031(V36)-Basis im Vergleich zu dem Molekül auf UCHT1 (V17)-Basis (23-fach bei hoch exprimierenden Zielzelllinien und 96-fach bei niedrig exprimierenden Zielzelllinien). Basierend auf den EC₅₀-Werten kann das Sicherheitsfenster wie oben im Definitionen-Abschnitt beschrieben berechnet werden. Zusammenfassend sind Sicherheitsfenster als Verhältnis von EC₅₀ der Tötung von Off-Target-exprimierenden Zellen und EC₅₀ der Tötung von Ziel-(TAA)-exprimierenden Zellen definiert. Dies impliziert, dass der TCER® auf UCHT1 (V17)-Basis ein Sicherheitsfenster von ca. 49-fachem aufweist, während der TCER® auf BMA031(V36)-Basis ein erhöhtes Sicherheitsfenster von ca. 312-fachem aufweist (Vergleich von Off-Targetexprimierender Tumorzelllinie mit Target (TAA)-hochexprimierender Tumorzelllinie).
Diese Ergebnisse legen nahe, dass im Allgemeinen die Verwendung von Rekrutierungsdomänen mit geringer Affinität die Unterscheidung zwischen Target und Off-Target verbessern und damit das Sicherheitsfenster vergrößern kann. Zur weiteren Verifizierung dieser Hypothese wurde die zytotoxische Aktivität der MAG-003-spezifischen TCER®-Moleküle gegenüber primären gesunden Gewebezellen (HLA-A*02+) untersucht. Zu diesem Zweck wurde LDH in Kokulturen von primären Zellen von elf verschiedenen gesunden Geweben (HLA-A*02+) mit PBMC-Effektorzellen von gesunden HLA-A*02+-Spendern bei einem E:T-Verhältnis von 10:1 und steigenden TCER®-Konzentrationen bestimmt. Die Zellen wurden in einer 50%igen Mischung aus einem für primäre Zellen des Gewebes spezifischen Medium und optimalem T-Zell-Medium koinkubiert. Zur Bestimmung eines Sicherheitsfensters wurden die TCER®-Moleküle in einem identischen Setup mit der MAG-003-positiven Tumorzelllinie Hs695T in der jeweiligen Mediumskombination der Primärzellen sowie in 100% optimalem T-Zell-Medium koinkubiert, um eine durch die verschiedenen Medien verursachte Verzerrung auszuschließen. Nach 48 Stunden Kokultivierung wurden Überstände geerntet und die Zelllyse durch Messung der LDH-Freisetzung mit dem LDH-Glo™ Kit (Promega) analysiert.
In und zeigt jedes Zytotoxizitätsdiagramm die LDH-Freisetzung eines primären gesunden Zelltyps (leere Kreise) im Vergleich zur Kontroll-Tumorzelllinie Hs695T (gefüllte Kreise) in der gleichen Medienkombination nach Koinkubation mit PBMCs und steigenden Konzentrationen des TCER-Moleküls. fasst die Ergebnisse des UCHT1(V17)-basierten MAG-003-spezifischen TCER®-Moleküls auf UCHT1(V17)-Basis zusammen. Für alle getesteten Zelltypen, mit Ausnahme von Nasenepithelzellen und PBMC, waren starke Reaktivitäten nachweisbar und entsprechende EC₅₀-Werte konnten bestimmt werden. Auf der Basis der EC₅₀-Werte wurden Sicherheitsfenster wie oben im Abschnitt Definitionen beschrieben berechnet. Sicherheitsfenster in x-fach sind in der Abbildung vermerkt. Für den UCHT1(V17)-basierten TCER®. Die kritischsten Sicherheitsfenster wurden für iAstrozyten (48-fach), dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (94-fach) und mesenchymale Stammzellen (170-fach) bestimmt.
Im Falle des BMA031(V36)-basierten TCER®-Moleküls waren alle Reaktionen gegen gesunde Primärzellen zu gering, um einen EC₅₀ zu berechnen. Stattdessen definierten wir das Sicherheitsfenster auf der Grundlage des niedrigsten beobachteten Wirkungsniveaus (LOEL), das als erste TCER®-Konzentration mit einer Reaktion über dem Cut-off-Wert bestimmt wurde. Der Cut-off-Wert wurde definiert als $([Standardabweichung von allen Triplikaten \times 3] + [ohne TCER-Kontrolle])$
(ohne TCER-Kontrolle wird in jedem Zytotoxizitätsplot als gepunktete Linie angezeigt) wurde als Schwellenwert zur Bestimmung der LOEL und des Sicherheitsfensters zwischen Zellen des gesunden Gewebes und der Tumorkontrollzelllinie verwendet. Alle ermittelten Sicherheitsfenster des BMA031(V36)-basierten TCER® waren größer als das 1000-Fache. Aus dem Vergleich von und wird deutlich, dass die Verwendung des Rekrutierers BMA031(V36) mit niedrigerer Affinität im Kontext des MAG-003-spezifischen TCER®-Moleküls zu signifikant erweiterten Sicherheitsfenstern führt.
Beispiel 3: Erzeugung von affinitätsreduzierten humanisierten UCHT1-Varianten
Um Varianten mit geringerer Affinität des CD3-spezifischen humanisierten Antikörpers UCHT1(V17) zu erhalten, wurde ein strukturgeführtes Design der Varianten durchgeführt. Basierend auf der aufgeklärten Struktur von UCHT1 im Komplex mit seinem Zielmolekül CD3δ/ε (PDB ID: 1xiw) wurden Punktmutationen auf dem Antikörper eingeführt, von denen angenommen wurde, dass sie die Affinität senken, ohne das Protein selbst zu destabilisieren. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden vor allem Positionen innerhalb der CDRs ausgewählt; wie aus der gelösten Struktur zu entnehmen ist, bildet sich die Schnittstelle zwischen den beiden Proteinen vor allem zwischen CD3 ε und der schweren Kette des Antikörpers, weshalb nur Positionen innerhalb der schweren Kette für Mutationen in Frage kommen.
Zur Verdeutlichung sind die Positionen auf CD3ε wie im PDB-Eintrag mit ID 1xiw, Ketten-ID: A, fortlaufend nummeriert.
G31E führt eine negative Ladung auf der Oberfläche des Antikörpers ein, die einem negativ geladenen Oberflächenfleck gegenübersteht, der von CD3ε48D, CD3ε49E, CD3ε50D und CD3e51D gebildet wird und vermutlich eine elektrostatische Abstoßung verursacht und dadurch die Affinität verringert.
Y54Q verändert die Formkomplementarität der Bindungsoberflächen und entfernt die hydrophobe Wechselwirkung zwischen dem aromatischen Ring von Y54 und dem apolaren Stamm von CD3ε48D.
Y54E verändert die Formkomplementarität der Bindungsoberflächen und entfernt die hydrophobe Wechselwirkung zwischen dem aromatischen Ring von Y54 und dem apolaren Stamm von CD3ε48D und führt zusätzlich eine negative Ladung gegenüber dem negativ geladenen Fleck ein, der durch CD3ε48D, CD3ε49E, CD3ε50D und CD3ε51D gebildet wird. K55R führt eine voluminösere Seitenkette mit ähnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften ein, die die zwischen den 55K's Nζ und dem Rückgrat von CD3ε56S gebildete H-Bindung entfernt. Die erhöhte Größe der Seitenkette könnte auch eine geringfügige Änderung der Bindungsgeometrie bewirken.
K55E ersetzt eine positive Ladung durch eine negative Ladung und entfernt die H-Bindung, die sich zwischen den 55K's Nζ und dem Rückgrat von CD3ε36S gebildet hat. Zusätzlich bewirkt die Einführung der negativen Ladung eine elektrostatische Abstoßung von dem negativ geladenen Fleck, der durch CD3ε57D, CD3ε58E und CD3ε59D gebildet wird.
Basierend auf diesen Befunden wurden Sequenzen generiert, die für UCHT1(V20) bis UCHT1(V27) kodieren, wie in Tabelle 6 zusammengefasst.

In einem weiteren Versuch, die humanisierten UCHT1-Sequenzen zu optimieren, wurde eine potenzielle posttranslationale Modifikationsstelle (Asp-Isomerisierung, 106D107S) innerhalb der CDR-H3 durch Einführung von 106E entfernt. Diese Modifikation wurde in UCHT1(V17), UCHT1(20), UCHT1(V21) und UCHT1(V23) eingeführt, was zu den Varianten UCHT1 (V17opt), UCHT1 (V20opt), UCHT1 (V21 opt) bzw. UCHT1 (V23opt) führte. Tabelle 6: Kombination von Sequenzen, die zu humanisierten UCHT1-Varianten führen.

UCHT-Variante	SEQ ID No. [VH]	SEQ ID No. [VL]
V20	158	145
V21	149	145
V22	150	145
V23	151	145
V24	152	145
V25	153	145
V26	154	145
V27	155	145
V17opt	156	145
V20opt	159	145
V21opt	157	145
V23opt	161	145

Unter Verwendung der humanisierten UCHT1-Varianten, die in Tabelle 6 PRAME-004-spezifisch (Va: SEQ ID Nr.: 48, Vß: SEQ ID Nr.: 44) bzw. MAG-003-spezifisch (Va: SEQ ID Nr.: 21, Vß: SEQ ID Nr.: 30) beschrieben sind, wurden TCER®-Moleküle wie oben beschrieben generiert, produziert und gereinigt.
Beispiel 4: Affinitätsbestimmung von konstruierten UCHT1-Varianten
Zur Affinitätsbestimmung mittels Biolayer-Interferometrie wurde das Molekül CD3δε-Fc generiert. Dazu wurden die extrazellulären Domänen des Menschen CD35 und CD3ε mit dem N-Terminus der Fc-Domänen fusioniert, wie sie in den TCER®-Konstrukten (die Knob-into-Hole-Mutationen und einen zusätzlichen C-terminalen His-Tag enthalten) verwendet werden, was SEQ ID NO.: 161 bzw. SEQ ID Nr. 162 ergab.
CD3δε-Fc-Moleküle wurden in ExpiCHO-Zellen exprimiert und mittels Protein-A-Affinitätschromatographie und anschließender Größenausschlusschromatographie, wie oben beschrieben, aufgereinigt.
Unter Verwendung der Biolayer-Interferometrie wurden bispezifische TCER®antigenbindende Proteine, die verschiedene UCHT1-Varianten (wie in Tabelle 6 gezeigt) umfassen, hinsichtlich ihrer Bindungsaffinität zum MAGE-A-Antigenpeptid (SEQ ID Nr. 10) im Komplex mit HLA-A*02 ( , Tabelle 7) und CD3δε-Fc ( , Tabelle 7) charakterisiert. Die Messungen wurden auf einem Octet RED384-System unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Einstellungen durchgeführt. Zusammenfassend wurde die Bindungskinetik bei 30°C und 1000 U/min Schüttelgeschwindigkeit mit PBS, 0,05% Tween-20, 0,1% BSA als Puffer gemessen. Peptid-HLA-A*02-Komplex oder CD3δε-Fc wurden vor der Analyse der seriellen Verdünnungen der bispezifischen TCER®-Moleküle auf Biosensoren (HIS1K) geladen. Alle TCER®-Moleküle zeigten eine ähnliche Bindung an HLA-A*02/MAG-003 mit K_D-Werten von ~2 nM. Die CD3δε-Affinitäten deckten ein mehr als 200-faches Fenster mit K_D-Werten von 3 bis 750 nM ab. Tabelle 7: Affinitätsanalyse von TCER®-Molekülen mit verschiedenen UCHT1-Varianten gemäß Tabelle 6. K_D-Werte wurden mittels Biolayer-Interferometrie gemessen.

UCHT-Variante K_D HLA-A*02/MAG-003 [nM] K_D CD3δε-Fc [nM]

V17 1,9 3,4

V20 2,0 17,8

V21 2,3 7,9

V23 2,1 46,1

V17opt 2,0 22,6

V20opt 1,7 373,0

V21opt 2,1 106,4

V23opt 2,4 747,1
Beispiel 5: Reduzierte Aktivität von humanisierten UCHT1-Varianten mit geringer Affinität
Die Aktivität in Bezug auf die Zytotoxizität der MAG-003-spezifischen TCER®-Moleküle wurde in LDH-Freisetzungstests wie oben in Beispiel 2 beschrieben bewertet. Die Ergebnisse repräsentativer Assays sind in dargestellt. Wie erwartet, zeigten die neu entwickelten Varianten (UCHT1 (V17opt), UCHT1 (V20), UCHT1 (V21), UCHT1 (V23)) eine reduzierte Aktivität im Vergleich zu den TCERⓇ, die hochaffine Rekrutierungsdomänen von UCHT1 (V17) enthielten. Die Einstufung der TCER®-Moleküle nach ihren Aktivitätsniveaus spiegelt auch die Affinitäten der jeweiligen Rekrutierungsvarianten (höchste Aktivität: UCHT1(V17) < UCHT1(V21) < UCHT1(V20) < UCHT1(V17opt) < UCHT1V23). Diese Auswirkungen auf die Aktivität konnten ausschließlich den Rekrutierungsdomänen zugeschrieben werden, da die Affinitäten der TCR-Domänen zu MAG-003 im Komplex mit HLA-A*02 vergleichbar sind ( ).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Bispezifisches antigenbindendes Protein, umfassend mindestens zwei Antigenbindungsstellen (A und B), wobei die Antigenbindungsstelle A an CD3 bindet und wobei die Antigenbindungsstelle B an einen Zielantigen-(TA)-Peptid-/MHC-Komplex bindet und wobei die Antigenbindungsstelle A eine variable Domäne der schweren Kette (V_H) und eine variable Domäne der leichten Kette (V_L) umfasst, und a) wobei die V_L drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) CDRL1, CDRL2 und CDRL3 umfasst, wobei - CDRL1 die Aminosäuresequenz „RASQDIRNYLN“ von SEQ ID NO: 1 umfasst oder daraus besteht, - CDRL2 die Aminosäuresequenz „YTSRLHS“ der SEQ ID NO: 2 umfasst oder daraus besteht, und - CDRL3 die Aminosäuresequenz „QQGQTLPWT“ der SEQ ID NO: 3 umfasst oder daraus besteht, und b) wobei die V_H drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) CDRH1, CDRH2 und CDRH3 umfasst, wobei - CDRH1 die Aminosäuresequenz „X₁YTMN“ der SEQ ID NO: 4 umfasst oder daraus besteht, wobei X₁ G oder E, vorzugsweise G, ist, - CDRH2 die Aminosäuresequenz von „LINPX₂X₃GVX₄TYAQKX₅QX₆“ SEQ ID NO: 5 umfasst oder daraus besteht, wobei X₂ Q, Y oder E, X₃ R, K oder E, X₄ S oder T, X₅ F oder V und X₆ G oder D ist und - die CDRH3 die Aminosäuresequenz „SGYYGX₇SWYFDV“ von SEQ ID NO: 6 umfasst oder daraus besteht, wobei X₇ E oder D ist.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach Anspruch 1, wobei die Antigenbindungsstelle A an CD3 mit einem K_D(A)-Wert bindet und die Antigenbindungsstelle B an den Ziel-Antigenpeptid C (TA-C)/MHC-Komplex mit einem K_D(C)-Wert bindet, und wobei das Verhältnis von K_D(A)/K_D(C) mehr als 1, mehr als 4, mehr als 6, mehr als 8, mehr als 10, mehr als 15, mehr als 20, mehr als 25, mehr als 30, mehr als 40, mehr als 50, wie z. B. zwischen 1 und 150, zwischen 4 und 140, zwischen 6 und 100, zwischen 8 und 100, zwischen 10 und 100, vorzugsweise zwischen 10 und 100 beträgt.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Antigenbindungsstelle A an CD3 mit einem K_D(A)-Wert bindet, der ≥ 3 nM, ≥ 5 nM, ≥8 nM, ≥10 nM, ≥12 nM, ≥14 nM, ≥16 nM, ≥18 nM, ≥20 nM, ≥25 nM, ≥30 nM, ≥35 nM, ≥40 nM, ≥45 nM, und ≤1000 nM, ≤800 nM, ≤600 nM, ≤500 nM, ≤400 nM ist, wie z. B. zwischen 3 nM und 1000 nM, 3 nM und 600 nM, zwischen 5 nM und 600 nM, 10 nM und 600 nM, 12 nM und 600 nM, 14 nM und 600 nM, 16 nM und 600 nM, 18 nM und 600 nM, 20 nM und 600 nM, vorzugsweise 5 nM und 100 nM, wie mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) oder Biolayer-Interferometrie (BLI), vorzugsweise Biolayer-Interferometrie (BLI) bestimmt.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Antigenbindungsstelle B an den Ziel-Antigenpeptid C (TA-C)/MHC-Komplex mit einem K_D(C)-Wert bindet, der ≤ 100 µM, ≤ 1 µM ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 10 nM, z. B. 0,01 nM bis 150 nM, 0,05 nM bis 150 nM, 0,1 nM bis 150 nM, 0,1 nM bis 100 nM, 0,1 nM bis 50 nM, 0,1 nM bis 10 nM, 0,5 nM bis 10 nM, 0,5 nM bis 5 nM, vorzugsweise 0,5 nM bis 5 nM beträgt, wie mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) oder Biolayer-Interferometrie (BLI), vorzugsweise Biolayer-Interferometrie (BLI) bestimmt.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das antigenbindende Protein einen EC₅₀-Wert für TA-C/MHC präsentierende Zellen aufweist, der ≥100, ≥ 500, ≥ 1000 niedriger als der EC₅₀-Wert für Zellen des normalen Gewebes ist.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das TA-Antigenpeptid C ein virales Peptid, ein bakterielles Peptid oder ein Peptid des tumorassoziierten Antigens (TAA), vorzugsweise ein Peptid des tumorassoziierten Antigens (TAA), ist.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das antigenbindende Protein einen EC₅₀-Wert für TA-C/MHC-Komplex-präsentierende Zellen aufweist, der ≥5-fach, ≥10-fach, ≥20-fach, ≥50-fach, ≥ 100-fach, ≥ 500-fach, ≥1000-fach niedriger als der EC₅₀-Wert für Zellen des normalen Gewebes ist.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das TA-Antigenpeptid C ein tumorassoziiertes Antigen (TAA)-Peptid C ist und wobei das TAA-C aus der Gruppe der TAA-Antigenpeptide ausgewählt ist, die die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 52 bis 65, 67 bis 96, 98, SEQ ID NO: 172 bis 182, 184 bis 268, SEQ ID NO: 9 und 10, wie z. B. das PRAME-Antigenpeptid, das die Aminosäuresequenz „SLLQHLIGL“ von SEQ ID NO: 9 umfasst oder daraus besteht, oder das MAGE-A-Antigenpeptid, das die Aminosäuresequenz „KVLEHVVRV“ von SEQ ID NO: 10 umfasst oder daraus besteht, wobei der MHC vorzugsweise ein HLA-A*02 ist.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach Anspruch 8, wobei das TA-Antigenpeptid C das MAGE-A-Antigenpeptid ist, das die Aminosäuresequenz „KVLEHVVRV“ von SEQ ID NO: 10 umfasst oder daraus besteht, und wobei das ähnliche Peptid aus der Liste bestehend aus RABGAP1L-001, AXIN1-001, ANO5-001, TPX2-001, SYNE3-001, MIA3-001, HERC4-001, PSME2-001, HEATR5A-001, CNOT1-003, TEP1-003, PITPNM3-001, ZFC-001, vorzugsweise HEATR5A-001, HERC4-001 und CNOT1-003 ausgewählt ist.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das bispezifische antigenbindende Protein ein bispezifischer Antikörper oder ein Fragment davon, ein bispezifischer T-Zell-Rezeptor (TCR) oder ein Fragment davon oder ein bispezifischer einkettiger TCR (scTCR) oder ein bispezifischer einkettiger Antikörper ist.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die VL-Domäne ferner einen oder mehrere Framework-Regionen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FR1-L, FR2-L, FR3-L und FR4-L, wobei - FR1-L die Aminosäuresequenz „DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC“ von SEQ ID NO: 11 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 11 identisch ist, umfasst oder daraus besteht, - FR2-L die Aminosäuresequenz „WYQQKPGKAPKLLIY“ von SEQ ID NO: 12 oder „WYQQKPGKAVKLLIY“ von SEQ ID NO: 13, vorzugsweise SEQ ID NO: 12 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 12 oder 13 identisch ist, umfasst oder daraus besteht, - FR3-L die Aminosäuresequenz „GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFC“ von SEQ ID NO: 14 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 14 identisch ist, umfasst oder daraus besteht, - FR4-L die Aminosäuresequenz „FGQGTKVEIKR“ von SEQ ID NO: 15 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 15 identisch ist, umfasst oder daraus besteht, und wobei VH ferner einen oder mehrere Framework-Regionen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus FR1-H, FR2-H, FR3-H und FR4-H besteht, und wobei - FR1-H die Aminosäuresequenz von „EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT“ von SEQ ID NO: 16 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 16 identisch ist, umfasst oder daraus besteht, - FR2-H die Aminosäuresequenz von „WVRQAPGQGLEWMG“ von SEQ ID NO: 17 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 17 identisch ist, umfasst oder daraus besteht, - FR3-H die Aminosäuresequenz „RVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR“ von SEQ ID NO: 18 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 18 identisch ist, umfasst oder daraus besteht, oder - FR4-H die Aminosäuresequenz von „WGQGTLVTVSS“ von SEQ ID NO: 19 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 19 identisch ist, umfasst oder daraus besteht.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Antigenbindungsstelle B einen Antikörper oder ein Fragment davon oder eine variable Domäne der alpha-Kette (v_α) und eine variable Domäne der beta-Kette (v_β) oder eine variable Domäne der gamma-Kette (v_γ) oder eine variable Domäne der delta-Ketten-(v_δ), vorzugsweise eine variable Domäne der alpha-Kette (v_α) und eine variable Domäne der beta-Kette (v_β) oder eine variable Domäne der gamma-Kette (_Vγ) und eine variable Domäne der delta-Kette (v_δ), vorzugsweise eine v_α und v_β umfasst.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei i) v_α die Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ‚EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDSKQD QRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP‘ SEQ ID NO: 20, ‚EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYL YWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQD QRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP‘ 'SEQ ID NO: 21, ‚EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTESSSTYL YWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQD QRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP‘ SEQ ID NO: 22 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz identisch ist, welche aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 20, 21 und 22 ausgewählt ist, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 20 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von CDRa1 von SEQ ID NO: 23, CDRa2 von SEQ ID NO: 24 und CDRa3 von SEQ ID NO: 25 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO 21 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von CDRa1 von SEQ ID NO: 23, CDRa2 von SEQ ID NO: 26 und CDRa3 von SEQ ID NO: 25 umfasst, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 22 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von CDRa1 von SEQ ID NO: 27, CDRa2 von SEQ ID NO: 26 und CDRa3 von SEQ ID NO: 25 umfasst, und wobei die Aminosäure der ersten variablen Domäne vorzugsweise die Aminosäuren 19V und/oder 48K umfasst, und die v_β die Aminosäuresequenz „DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCD DSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRL TVL“ SEQ ID NO: 30 oder eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz identisch ist, die aus SEQ ID NO: 30 besteht, und wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 30 identisch ist, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von CDRb1 von SEQ ID NO: 31, CDRb2 der SEQ ID NO: 34 bzw. CDRb3 von SEQ ID NO: 35 umfasst und optional die Aminosäure 54F und/oder 66C umfasst, oder (ii) die v_α oder V_γ die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 48 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 48 identisch ist, umfasst oder daraus besteht, wobei vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 48 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRa1 von SEQ ID NO: 49, CDRa2 von SEQ ID NO: 50 und CDRa3 von SEQ ID NO: 51 umfasst, und V_β oder V_δ die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 44 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit SEQ ID NO: 44 identisch ist, umfasst oder daraus besteht, wobei vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die mindestens zu 85% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 44 identisch ist, die Aminosäuresequenz von CDRb1 von SEQ ID NO: 45, CDRb2 von SEQ ID NO: 46 und CDRb3 von SEQ ID NO: 47 umfasst.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 13, ferner umfassend eines oder mehrere der Folgenden: (i) ein Diagnostikum; (ii) ein therapeutisches Mittel; oder (iii) eine pharmakokinetisch (PK) modifizierende Einheit.
Isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz, die für ein bispezifisches antigenbindendes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 14 kodiert, oder einen Nukleinsäurevektor, der diese Nukleinsäure umfasst.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend ein bispezifisches antigenbindendes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder eine Nukleinsäure oder einen Vektor nach Anspruch 15, wobei die Wirtszelle vorzugsweise a) eine Stammzelle, vorzugsweise eine mesenchymale Stammzelle oder b) eine Zelle für rekombinante Expression, wie eine Zelle aus Ovarien des Chinesischen Hamsters (CHO), ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein bispezifisches antigenbindendes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 14, die Nukleinsäure oder den Vektor nach Anspruch 15 oder die Wirtszelle nach Anspruch 16 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel Stabilisator und/oder Hilfsstoff.
Verfahren zur Herstellung des bispezifischen antigenbindenden Proteins wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 definiert, umfassend a) Bereitstellung einer geeigneten Wirtszelle, b) Bereitstellung eines genetischen Konstrukts umfassend eine kodierende Sequenz, die das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 14 kodiert, c) Einführung des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle und d) Expression des genetischen Konstrukts durch die geeignete Wirtszelle.
Verfahren nach Anspruch 18, das weiterhin die Isolierung und Reinigung des bispezifischen antigenbindenden Proteins aus der geeigneten Wirtszelle umfasst.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 14, die Nukleinsäure oder der Vektor nach Anspruch 15, die Wirtszelle nach Anspruch 16 oder die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Verwendung in der Medizin.
Das bispezifische antigenbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 14, die Nukleinsäure oder der Vektor nach Anspruch 15, die Wirtszelle nach Anspruch 16 oder die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Verwendung in der Diagnose, Vorbeugung und/oder Behandlung einer Krankheit, wie z. B. einer viralen oder bakteriellen Infektion oder einer proliferativen Erkrankung, vorzugsweise des Krebses, mehr bevorzugt eines TAA/MHC-positiven Krebses.