WO2022097750A1 - キメラ抗原受容体 - Google Patents

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intracellular
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antigen
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精太郎 寺倉
ジャクラワデー ジュラマネー
仁 清井
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Definitions

  • the present invention relates to a chimeric antigen receptor and the like.
  • Chimeric Antigen Receptor (hereinafter also referred to as "CAR") binds to the antigen according to the specificity of the antibody, which can cause damage to target cells, cytokine release, and T cell division after stimulation. .. It is possible to impart specificity to T cells by gene transfer, and cell preparation is generally easier than when culturing and amplifying endogenous tumor-specific T cell receptor (TCR) -positive T cells.
  • the treatment method using CAR shows higher cytotoxic activity than antibody therapy, and multiple treatments are required to autonomously amplify by antigen stimulation with one infusion. It is excellent in that it does not.
  • TCR gene transfer targets the complex of HLA and the peptides presented on it, so it can only be treated if the patient has a specific HLA (HLA-restricted), but CAR is HLA-restricted. It is more advantageous in that it has no sex. That is, if the tumor cells are positive for the target antigen, all patients who are positive for the target antigen can be treated.
  • Chimeric antigen receptor gene-introduced T cell (CAR-T cell) therapy has been approved as a drug in the United States for CD19CAR-T. Its clinical effect is high, and it is expected to be clinically useful for various malignant tumors (for example, Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a novel chimeric antigen receptor.
  • it is an object to provide an antigen receptor having a higher preventive or therapeutic effect on cancer.
  • one embodiment includes an antigen-binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal domain including a CD79A intracellular domain and a CD40 intracellular domain, and (A) the antigen-binding domain.
  • the chimeric antigen receptor wherein the number of constituent amino acid residues between the transmembrane domain and the transmembrane domain is 100 or less, and / or (B) the target antigen of the antigen-binding domain is an antigen other than CD19, is described above. I found that I could solve the problem. As a result of further research based on this finding, the present invention was completed. That is, the present invention includes the following aspects.
  • the present invention includes the following aspects.
  • Item 1 Includes an antigen-binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal domain containing the CD79A intracellular domain and the CD40 intracellular domain, and (A) constituent amino acid residues between the antigen-binding domain and the transmembrane domain.
  • a chimeric antigen receptor having a number of 100 or less and / or (B) the target antigen of the antigen-binding domain is an antigen other than CD19.
  • Item 2. Item 2. The chimeric antigen receptor according to Item 1, wherein the intracellular signal domain comprises an intracellular activation domain.
  • Item 3. Item 2.
  • the chimeric antigen receptor according to Item 2 wherein the intracellular activation domain is at least one selected from the group consisting of the intracellular domain of CD3 ⁇ and the intracellular domain of Fc ⁇ RI ⁇ .
  • Item 4. Item 2. The chimeric antigen receptor according to Item 2 or 3, wherein the CD79A intracellular domain, the CD40 intracellular domain, and the intracellular activation domain are arranged in this order from the transmembrane domain side.
  • Item 6. Item 2.
  • Item 7. Item 6. The chimeric antigen receptor according to any one of Items 1 to 6, wherein the structure of the antigen-binding domain is a single-chain antibody structure.
  • Item 8. The target antigens of the antigen-binding domain are CD19, GD2, GD3, CD20, CD37, CEA, HER2, EGFR, type III mutant EGFR, CD38, BCMA, MUC-1, PSMA, WT1, cancer testis antigen, mutation peptide, hTERT.
  • Item 9. A polynucleotide encoding the antigen receptor according to any one of Items 1 to 8.
  • Item 10. A cell comprising the polynucleotide according to Item 9.
  • Item 11. Item 6.
  • the cell according to Item 10 which is a lymphocyte.
  • Item 3. A pharmaceutical composition containing the cells according to Item 10 or 11.
  • Item 13 Item 12.
  • a novel antigen receptor can be provided. By using this antigen receptor, cancer can be effectively treated or prevented.
  • the structural schematic diagram of a part of the CAR construct prepared in Test Example 1 is shown.
  • the results of bioluminescence imaging of Test Example 3 are shown.
  • the vertical axis shows the luminescence intensity (representing the degree of spread of the cancer).
  • the horizontal axis shows the number of days elapsed since the cancer cells were inoculated.
  • the survival curve of Test Example 3 is shown.
  • the vertical axis shows the survival rate of mice.
  • the horizontal axis shows the number of days elapsed since the cancer cells were inoculated. Wilcoxon test; * P ⁇ 0.05, **** P ⁇ 0.0001.
  • the results of bioluminescence imaging of Test Example 4 (in the case of a short hinge construct) are shown.
  • the vertical axis shows the luminescence intensity (representing the degree of spread of the cancer).
  • the horizontal axis shows the number of days elapsed since the cancer cells were inoculated. The data are shown as mean ⁇ SEM (bidirectional ANOVA; * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001, **** P ⁇ 0.0001) and three different donors (CD19CAR SHT).
  • the vertical axis shows the survival rate of mice.
  • the horizontal axis shows the number of days elapsed since the cancer cells were inoculated.
  • the survival curve of Test Example 4 (in the case of a long hinge construct) is shown.
  • the vertical axis shows the survival rate of mice.
  • the horizontal axis shows the number of days elapsed since the cancer cells were inoculated.
  • the results of measuring the number of living cells in Test Example 5 are shown.
  • the vertical axis shows the relative value of the viable cell number of CD19CAR-T cells, and the horizontal axis shows the number of days elapsed from the start of co-culture.
  • the figure on the left shows the result when IL-2 is not added, and the figure on the right shows the result when IL-2 is added.
  • the results of measuring the number of living cells of Test Example 6 are shown.
  • the vertical axis shows the relative value of the viable cell number of CD37CAR-T cells, and the horizontal axis shows the number of days elapsed from the start of co-culture.
  • the results of measuring the number of living cells in Test Example 7 are shown.
  • the vertical axis shows the relative value of the viable cell number of CD20CAR-T cells, and the horizontal axis shows the number of days elapsed from the start of co-culture.
  • Identity of amino acid sequences refers to the degree of coincidence of amino acid sequences with each other among two or more comparable amino acid sequences. Therefore, the higher the match between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences.
  • the level of amino acid sequence identity is determined, for example, using FASTA, a tool for sequence analysis, with default parameters.
  • FASTA a tool for sequence analysis, with default parameters.
  • the algorithm BLAST by Karlin and Altschul Karlin and Altschul (KarlinS, Altschul SF. “Methods for assessment the statistical signature of molecular sequence features” Proc Natl Acad Sci USA. 87: 2264-2268 (1990), K It can be determined using “Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences.” Proc Natl Acad Sci USA.
  • conservative substitution means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. For example, substitution between amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine is a conservative substitution.
  • amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues having non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine
  • Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine and tryptophan
  • amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine and isoleucine
  • aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan and histidine Substitutions between amino acid residues are also conservative substitutions.
  • CDR is an abbreviation for Complementarity Measuring Region and is also referred to as complementarity determining regions.
  • the CDR is a region existing in the variable region of the immunoglobulin or the T cell receptor, and is a region deeply involved in the specific binding of the antibody or the T cell receptor to the antigen.
  • the "light chain CDR” means a CDR existing in the light chain variable region of immunoglobulin
  • the “heavy chain CDR” means a CDR existing in the heavy chain variable region of immunoglobulin.
  • the T cell receptor also has an ⁇ chain, a ⁇ chain, a ⁇ chain, a ⁇ chain, and the like, and the same applies to these CDRs.
  • the "variable region” means an region including CDR1 to CDR3 (hereinafter, simply referred to as "CDRs1-3").
  • CDRs1-3 CDR1 to CDR3
  • the arrangement order of these CDRs1-3 is not particularly limited, but preferably, the frames are continuous or described later in the order of CDR1, CDR2, and CDR3 in the direction from the N-terminal side to the C-terminal side, or vice versa. It means a region arranged via another amino acid sequence called a work region (FR).
  • the "heavy chain variable region” is a region in which the above-mentioned heavy chain CDRs1-3 is arranged in the immunoglobulin, and the "light chain variable region” is the above-mentioned light chain CDRs1-3 in the immunoglobulin. Is the area where is placed.
  • the T cell receptor also has an ⁇ chain, a ⁇ chain, a ⁇ chain, a ⁇ chain, and the like, and the same applies to these CDRs.
  • FR framework areas
  • the region between the N-terminus of the variable region and the above CDR1 is FR1
  • the region between CDR1 and CDR2 is FR2
  • the region between CDR2 and CDR3 is FR3
  • the region between CDR3 and the C-terminus of the variable region is Defined as FR4 respectively.
  • the present invention comprises an antigen-binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal domain including a CD79A intracellular domain and a CD40 intracellular domain, and (A) the antigen-binding domain.
  • a chimeric antigen receptor having 100 or less constituent amino acid residues between and the transmembrane domain, and / or (B) the target antigen of the antigen-binding domain is an antigen other than CD19.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention it may be referred to as “the chimeric antigen receptor of the present invention”).
  • the chimeric antigen receptor of the present invention will be described.
  • the present invention also relates to a chimeric antigen receptor, which comprises, in one embodiment, an antigen-binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal domain including the CD79A intracellular domain and the CD40 intracellular domain.
  • a chimeric antigen receptor which comprises, in one embodiment, an antigen-binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal domain including the CD79A intracellular domain and the CD40 intracellular domain.
  • the description of the chimeric antigen receptor of the present invention is applied to the chimeric antigen receptor.
  • the antigen-binding domain is a domain that is arranged extracellularly when the chimeric antigen receptor of the present invention is placed on the cell membrane, as long as it is a domain that can recognize the antigen and bind to the antigen.
  • the antigen include CD19, GD2, GD3, CD20, CD37, CEA, HER2, EGFR, type III mutant EGFR, CD38, BCMA, MUC-1, PSMA, WT1, cancer testis antigen (eg NY-ESO).
  • CD19 is preferably mentioned.
  • antigens other than CD19 are preferable, and CD20, CD37 and the like are more preferable.
  • the antigen-binding domain is usually the CDR of the antibody or T cell receptor against the antigen (eg, for antibody CDRs, heavy chain CDR1, heavy chain CDR2, heavy chain CDR3, light chain CDR1, light chain CDR2, and light chain.
  • the antigen-binding region more preferably comprises a variable region of an antibody or T cell receptor against the antigen (for example, in the case of an antibody, for example, a heavy chain variable region and / or a light chain variable region).
  • the antigen-binding domain preferably has a single-chain antibody structure, and more preferably a scFv structure.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are usually linked via a linker.
  • the linker is not particularly limited and is optional as long as the antigen binding property is not significantly impaired.
  • the linker is preferably glycine or a linker composed of glycine and serine (GGS linker, GS linker, GGG linker, etc.).
  • the length of the linker is not particularly limited.
  • the number of amino acid residues of the linker is, for example, 5 to 30, preferably 10 to 25.
  • the arrangement relationship between the heavy chain variable region and the light chain variable region is not particularly limited, and can be adopted in either the embodiment in which the N-terminal side is the light chain variable region or the case where the N-terminal side is the heavy chain variable region.
  • the arrangement relationship is preferably the former.
  • the transmembrane domain is a domain that is arranged in the cell membrane when the chimeric antigen receptor of the present invention is arranged on the cell membrane, and is not particularly limited as long as it can constitute the chimeric antigen receptor.
  • a transmembrane domain such as CD28, CD3 ⁇ , CD8 ⁇ , CD3, CD4, 4-1BB can be used.
  • the transmembrane domain of each factor is known or can be easily determined from known sequence information (eg, using a transmembrane domain prediction program or the like).
  • a transmembrane domain consisting of an artificially constructed polypeptide may be used. Mutations may be appropriately introduced into these transmembrane domains as long as they do not significantly inhibit the function of the chimeric antigen receptor.
  • the transmembrane region of CD28 can be preferably adopted.
  • Specific examples of the transmembrane domain of CD28 include the amino acid sequence described in (a) below or the amino acid sequence described in (b) below: (A) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or (b) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 has an identity of 85% or more, and the chimeric antigen receptor of the present invention is arranged on the cell membrane. Examples thereof include amino acid sequences that can be arranged in the cell membrane.
  • the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • amino acid sequence described in (b) above for example, (b') an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • amino acid sequence that can be arranged in the cell membrane when the chimeric antigen receptor of the present invention is arranged on the cell membrane can be mentioned.
  • the plurality is, for example, 2 to 5, preferably 2 to 3, and more preferably 2.
  • the antigen binding domain and the transmembrane domain are preferably linked directly or via a relatively short spacer.
  • the number of constituent amino acid residues between the antigen-binding domain and the transmembrane domain can be, for example, 400 or less, 300 or less, or 250 or less, and 100 or less. Especially preferred.
  • the number of constituent amino acid residues is preferably 0 to 60, more preferably 0 to 40, and even more preferably 0 to 30.
  • the number of amino acid residues is 1 or more, 4 or more, or 8 or more, and 25 or less, 20 or less, or 15 or less, and 1 to 25, 4 to 20, or. It is 8 to 15.
  • the sequence of the spacer is not particularly limited, but for example, an IgG, preferably a hinge portion or a part thereof of human IgG (for example, subtype IgG1 or IgG4), a hinge portion and a part of CH2, or a factor utilized for a transmembrane domain (for example).
  • An arrangement such as a part of CD28) can be used for the spacer.
  • the intracellular signal domain is a domain that is placed inside the cell when the chimeric antigen receptor of the present invention is placed on the cell membrane, and transmits a signal necessary for exerting the effector function of the immune cell, that is, When an antigen-binding domain binds to an antigen, it is a domain capable of transmitting a signal necessary for activation of immune cells.
  • the intracellular signal domain includes the intracellular domain of CD79A and the intracellular domain of CD40.
  • the intracellular domain of CD79A is a domain consisting of the amino acid sequence of the intracellular domain of the amino acid of CD79A, and is not particularly limited as long as this is the case.
  • CD79A for example, CD79A derived from various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits can be adopted. Of these, CD79A derived from a target organism (for example, human) is preferable.
  • amino acid sequences of the intracellular domain of CD79A derived from various species are known. Specific examples thereof include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the intracellular domain of CD79A may have mutations such as amino acid substitution, deletion, addition, and insertion as long as it has an NF ⁇ B signal activating effect.
  • mutations include substitution, more preferably conservative substitution, from the viewpoint that the above-mentioned action is less likely to be impaired.
  • amino acid sequence of the intracellular domain of CD79A include the amino acid sequence described in (c) below and the amino acid sequence described in (d) below: From (c) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and (d) the amino acid sequence constituting the protein having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having an NF ⁇ B signal activating effect. At least one species selected from the group of
  • the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • amino acid sequence described in (d) above for example, an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in (d') SEQ ID NO: 4.
  • amino acid sequence having an NF ⁇ B signal activating effect can be mentioned.
  • the plurality is, for example, 2 to 5, preferably 2 to 3, and more preferably 2.
  • the intracellular domain of CD40 is a domain consisting of the amino acid sequence of the intracellular domain of the amino acid of CD40, and is not particularly limited as long as this is the case.
  • CD40 for example, CD40s derived from various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits can be adopted. Of these, CD40 derived from a target organism (for example, human) is preferable.
  • amino acid sequences of the intracellular domains of CD40 derived from various species are known. Specific examples thereof include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the intracellular domain of CD40 may have mutations such as amino acid substitution, deletion, addition, and insertion as long as it has an NF ⁇ B signal activating effect.
  • mutations include substitution, more preferably conservative substitution, from the viewpoint that the above-mentioned action is less likely to be impaired.
  • amino acid sequence of the intracellular domain of CD40 include the amino acid sequence described in (e) below and the amino acid sequence described in (f) below: From (e) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and (f) the amino acid sequence constituting the protein having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and having an NF ⁇ B signal activating effect. At least one species selected from the group of
  • the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • amino acid sequence described in (f) above for example, (f') an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • amino acid sequence having an NF ⁇ B signal activating effect can be mentioned.
  • the plurality is, for example, 2 to 5, preferably 2 to 3, and more preferably 2.
  • the arrangement relationship between the CD79A intracellular domain and the CD40 intracellular domain is not particularly limited, and it can be adopted in either the embodiment in which the N-terminal side is the CD79A intracellular domain or the case where the N-terminal side is the CD40 intracellular domain.
  • the arrangement relationship is preferably the former. It is preferable that the intracellular domain of CD79A and the intracellular domain of CD40 are directly linked or linked via a linker.
  • the linker is not particularly limited and is optional as long as the NF ⁇ B signal activating effect is not significantly impaired.
  • the linker is preferably glycine or a linker composed of glycine and serine (GGS linker, GS linker, GGG linker, etc.).
  • the length of the linker is not particularly limited.
  • the number of amino acid residues of the linker is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 5.
  • the intracellular signal domain preferably contains an intracellular activation domain.
  • an intracellular domain such as Fc ⁇ RI ⁇ can be used.
  • CD3 ⁇ is used. Mutations may be appropriately introduced into CD3 as long as it does not inhibit the function of the antigen receptor. When introducing a mutation into CD3, it is preferable to include ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif).
  • intracellular activation domain examples include the amino acid sequence described in (g) below or the amino acid sequence described in (h) below: Examples thereof include the amino acid sequence shown in (g) SEQ ID NO: 6 or (h) the amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and having an effect of activating immune cells.
  • the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • amino acid sequence described in (h) above for example, an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in (h') SEQ ID NO: 6.
  • amino acid sequence having an effect of activating immune cells can be mentioned.
  • the plurality is, for example, 2 to 15, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5, and even more preferably 2 to 3.
  • the position of the intracellular activation domain is not particularly limited.
  • the intracellular activation domain is preferably located intracellularly (opposite the transmembrane domain) of the CD79A intracellular domain and the CD40 intracellular domain.
  • the CD79A intracellular domain, the CD40 intracellular domain, and the intracellular activation domain are arranged in this order from the transmembrane domain side.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention can include regions other than the above. Other regions include, for example, the intracellular domain of costimulatory factors, leader sequences (signal peptides) to facilitate transport of CAR onto the cell membrane (eg, leader sequences of GM-CSF receptors), spacers / linkers (eg transmembrane). Between the region and the intracellular signal domain, between each domain within the intracellular signal domain) and the like.
  • the intracellular domain of the co-stimulator is not particularly limited as long as it is an intracellular domain derived from the co-stimulator possessed by T cells or the like. For example, one or more selected from the group consisting of OX40, 4-1BB, GITR, CD27, CD278, CD28 and the like can be appropriately selected and used.
  • an antigen-binding domain, a transmembrane domain, a CD79A (CD40) intracellular domain and a CD40 (CD79A) intracellular domain, and an intracellular activation domain are arranged in this order.
  • chimeric antigen receptors that contain a core region that is made up of. In the core region, the antigen-binding domain and the transmembrane domain are linked via spacers, between the transmembrane domain and the CD79A (CD40) and CD40 (CD79A) intracellular domains, CD79A (CD40).
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may be a molecule composed of one kind of polypeptide or a molecule composed of a complex of two or more kinds of polypeptides. Further, the chimeric antigen receptor of the present invention may be a molecule composed of a polypeptide or a complex thereof, or other substances (for example, fluorescent substances, radioactive substances, inorganic particles, etc.) may be added to the polypeptide or the complex thereof. May be connected.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may be chemically modified.
  • the polypeptide constituting the chimeric antigen receptor of the present invention may have a C-terminal of either a carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO- ) , an amide (-CONH 2 ) or an ester (-COOR).
  • R in the ester is, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; for example, phenyl.
  • the polypeptide constituting the chimeric antigen receptor of the present invention may have a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue is a protective group (for example, C 1-6 such as C 1-6 alkanoyl such as formyl group and acetyl group).
  • an acyl group such as an acyl group
  • those obtained by pyroglutamine oxidation of the N-terminal glutamine residue that can be cleaved and produced in vivo, and substituents on the side chain of amino acids in the molecule are protected by a suitable protective group (eg, C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl group such as formyl group, acetyl group). What is included is also included.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may be added with a protein or peptide such as a known protein tag or signal sequence.
  • a protein or peptide such as a known protein tag or signal sequence.
  • the protein tag include biotin, His tag, FLAG tag, Halo tag, MBP tag, HA tag, Myc tag, V5 tag, PA tag, fluorescent protein tag and the like.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt with an acid or base.
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and either an acidic salt or a basic salt can be adopted.
  • acidic salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, and phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, and apple.
  • Organic acid salts such as acid salts, citrates, methane sulfonates and paratoluene sulfonates; amino acid salts such as asparagates and glutamates can be mentioned.
  • basic salts include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid and the like.
  • the present invention relates to a polynucleotide (which may also be referred to as "the polynucleotide of the present invention” in the present invention) encoding the chimeric antigen receptor of the present invention in one aspect thereof. This will be described below.
  • the polynucleotide of the present invention may contain other sequences in addition to the coding sequence of the chimeric antigen receptor of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention preferably contains the chimeric antigen receptor of the present invention in an expressible state.
  • Other sequences include promoter sequences, enhancer sequences, repressor sequences, insulator sequences, replication origins, reporter protein (eg, fluorescent protein, etc.) coding sequences, drug resistance gene coding sequences, and the like.
  • the polynucleotide of the present invention preferably contains an expression cassette of the chimeric antigen receptor of the present invention.
  • the expression cassette contains a promoter and the coding sequence of the chimeric antigen receptor of the invention under the control of the promoter.
  • the coding sequence is placed downstream of the promoter so that it is under the control of the promoter.
  • promoters that can be used for the CAR expression cassette include CMV-IE (cytomegalovirus early gene-derived promoter), SV40ori, retrovirus LTP, SR ⁇ , EF1 ⁇ , ⁇ -actin promoter and the like.
  • the promoter is operably linked to the coding sequence.
  • the promoter is operably linked to the coding sequence
  • the coding sequence is arranged under the control of the promoter", and is usually directly on the 3'end side of the promoter.
  • the code sequences will be concatenated via other sequences.
  • a poly A addition signal sequence is placed downstream of the coding sequence. Transcription is terminated by the use of the poly A addition signal sequence.
  • a poly A addition sequence of SV40, a poly A addition sequence of a bovine-derived growth hormone gene, or the like can be used as the poly A addition signal sequence.
  • the expression cassette may include a detection gene (reporter gene, cell or tissue-specific gene, selectable marker gene, etc.), enhancer sequence, WRPE sequence, and the like.
  • the detection gene is used for determining the success or failure and efficiency of the introduction of the expression cassette, detecting the expression of the CAR gene or determining the expression efficiency, and selecting and sorting the cells expressing the CAR gene. On the other hand, the expression efficiency can be improved by using the enhancer sequence.
  • the genes for detection include the neo gene that imparts resistance to neomycin, the npt gene (Herrera Estrella, EMBO J.
  • GUS ⁇ -Glucronidase
  • GFP GFP
  • EGFP epithelial growth factor receptor
  • IVS ribosome internal recognition sequence
  • An example of a self-cleaving peptide is, but is not limited to, a 2A peptide (T2A) derived from Thosea signa virus.
  • E2A horse rhinitis A virus
  • P2A porcine teschovirus
  • the polynucleotide of the present invention may be a linear polynucleotide or a cyclic polynucleotide (vector or the like).
  • the vector can be a plasmid vector or a viral vector.
  • the vector may be, for example, a cloning vector or an expression vector.
  • the expression vector include a vector for prokaryotic cells such as Escherichia coli and actinomycetes, and a vector for eukaryotic cells such as yeast cells, insect cells, and mammalian cells.
  • examples of the virus vector include a retrovirus vector, a lentivirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a herpesvirus vector, a Sendai virus vector
  • examples of the non-viral vector include various plasmid vectors. Lipstick vector, positively charged liposome vector (Felgner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 7413-7417, 1987), YAC vector, BAC vector. be able to.
  • the polynucleotide of the present invention includes not only DNA and RNA but also those to which known chemical modifications are applied, as exemplified below.
  • Substituting the phosphate residue (phosphate) of each nucleotide with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, or phosphorodithionate to prevent degradation by hydrolytic enzymes such as nucleases. can be done.
  • the hydroxyl group at the 2-position of the sugar (ribose) of each ribonucleotide is converted into -OR (R is, for example, CH3 (2'-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2'-O-MOE), CH.
  • the base moiety (pyrimidine, purine) may be chemically modified, for example, introduction of a methyl group or a cationic functional group at the 5-position of the pyrimidine base, or substitution of the carbonyl group at the 2-position with thiocarbonyl.
  • examples thereof include those in which the phosphoric acid moiety and the hydroxyl moiety are modified with biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the term "polynucleotide” includes not only natural nucleic acids but also BNA (Bridged Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), PNA (Peptide Nucleic Acid) and the like.
  • a cell having an anticancer effect can be obtained by a method including introducing the polynucleotide of the present invention into a cell.
  • the cell expresses the chimeric antigen receptor of the present invention.
  • CD4-positive CD8-negative T cells CD4-negative CD8-positive T cells
  • T cells prepared from iPS cells ⁇ -T cells, and ⁇ -T cells
  • NK cells NK cells, NKT cells and the like.
  • Various cell populations can be used as long as they contain lymphocytes or progenitor cells as described above.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells collected from peripheral blood is one of the preferred target cells. That is, in a preferred embodiment, a gene transfer operation is performed on PBMC.
  • PBMCs can be prepared according to or according to conventional methods.
  • the cells for CAR expression before introducing the polynucleotide of the present invention.
  • it can be stimulated with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody to activate cells for CAR expression.
  • stimulation with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody can be applied by culturing in a culture vessel (for example, a culture dish) whose culture surface is coated with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody.
  • a culture vessel for example, a culture dish
  • magnetic beads coated with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody for example, Dynabeads T-Activator CD3 / CD28 provided by VERITAS.
  • T cell growth factor In order to increase the survival rate / proliferation rate of cells, it is preferable to use a culture medium to which T cell growth factor has been added during the activation treatment.
  • IL-2, IL-15, IL-7 and the like can be used as the T cell growth factor.
  • T cell growth factors such as IL-2, IL-15 and IL-7 can be prepared according to conventional methods. In addition, commercially available products can also be used. Although the use of T cell growth factors in non-human animal species is not excluded, T cell growth factors are usually derived from humans (which may be recombinants).
  • the cells after introduction of the polynucleotide of the present invention are proliferated.
  • the polynucleotide-introduced lymphocytes of the present invention are cultured using a culture medium supplemented with a T cell proliferation factor (subculture if necessary).
  • the same treatment (reactivation) as in the case of activation of CAR expression cells may be performed.
  • a medium supplemented with serum may be used for culturing the cells for CAR expression and the polynucleotide-introduced lymphocyte of the present invention, but by adopting a serum-free medium, a serum-free medium may be used. It is possible to prepare cells having the advantages of high safety for clinical application and less difference in culture efficiency due to differences between serum lots.
  • serum it is preferable to use autologous serum, that is, serum collected from a patient receiving CAR transgenic lymphocytes.
  • the present invention relates, in one aspect, to cells containing the polynucleotides of the invention (sometimes referred to herein as "cells of the invention”). This will be described below.
  • the cell from which the cell of the present invention is derived is not particularly limited.
  • the derived cells include cells that can be used for protein expression (for example, insect cells, eukaryotic cells, mammalian cells, etc.). Can be mentioned.
  • the cells of the present invention are preferably lymphocyte cells (eg, T cells (eg, CD4-positive CD8-negative T cells, CD4-negative CD8-positive T cells, T cells prepared from iPS cells, ⁇ -T cells, ⁇ -T cells, etc.). ), NK cells, NKT cells, etc.).
  • T cells eg, CD4-positive CD8-negative T cells, CD4-negative CD8-positive T cells, T cells prepared from iPS cells, ⁇ -T cells, ⁇ -T cells, etc.
  • NK cells e.g, NK cells, etc.
  • These cells are preferably cells expressing the chimeric antigen receptor of the present invention, and in a more specific embodiment, these cells preferably express the antigen receptor of the present invention on the cell membrane. Expresses the antigen receptor of the present invention in a state where the antigen-binding domain is exposed outside the cell membrane.
  • T cells expressing the chimeric antigen receptor recognize the antigen in the antigen-binding region, the recognition signal is transmitted to the inside of the T cells, etc., and a signal that induces cytotoxic activity is activated, which is linked to this.
  • the cell can exert an aggression or cytotoxic activity against other cells or tissues expressing the antigen.
  • CAR-T cell When the cell that exerts such a function is CTL, it is called a chimeric antigen receptor T cell (CAR-T cell). Similar to chimeric antigen receptor T cells, cells having the potential to exert cytotoxic activity such as NK cells can also exert cytotoxic activity by binding the antigen-binding region to the antigen. Therefore, a host cell containing a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor of the present invention (particularly, a host cell having cytotoxic activity) is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition.
  • composition relates to, in one aspect, a pharmaceutical composition containing the cells of the present invention (in the present specification, it may be referred to as "the pharmaceutical composition of the present invention”). This will be described below.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be widely used as a cell preparation for the treatment, prevention, or improvement of tumors / cancers (target diseases) expressing target antigens in the antigen-binding domain.
  • Target diseases include solid tumors and hematological malignancies.
  • Target diseases include, for example, various B-cell malignant lymphomas (B-cell acute lymphoma, follicular lymphoma, diffuse lymphoma, mantle-cell lymphoma, MALT lymphoma, intravascular B-cell lymphoma, CD20-positive Hodgkin lymphoma, etc.).
  • Myeloid proliferative disease myelodystrophy / myeloid proliferative tumor (CMML, JMML, CML, MDS / MPN-UC), myelodystrophy syndrome, acute myeloid leukemia, multiple myeloma, lung cancer, colon cancer, ovary
  • CMML, JMML, CML, MDS / MPN-UC myelodystrophy syndrome
  • acute myeloid leukemia multiple myeloma
  • lung cancer colon cancer
  • ovary examples include breast cancer, brain tumor, stomach cancer, liver cancer, tongue cancer, thyroid cancer, kidney cancer, prostate cancer, uterine cancer, osteosarcoma, chondrosarcoma, and rhabdomyomyoma.
  • Treatment includes alleviating the symptom or associated symptom characteristic of the target disease (mitigation), preventing or delaying the exacerbation of the symptom, and the like.
  • Prevention means preventing or delaying the onset / delay of a disease (disorder) or its symptoms, or reducing the risk of onset / onset.
  • improvement means that the disease (disorder) or its symptom is alleviated (mild), improved, remitted, or cured (including partial cure).
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains a therapeutically effective amount of the cells of the present invention.
  • it can contain 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 10 cells for a single dose.
  • Various components for the purpose of cell activation, proliferation or differentiation induction, such as dimethylsulfoxide (DMSO) and serum albumin for the purpose of protecting cells, antibiotics for the purpose of preventing contamination with bacteria, etc. , Cytokines, growth factors, steroids, etc.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • serum albumin for the purpose of protecting cells
  • antibiotics for the purpose of preventing contamination with bacteria, etc.
  • Cytokines, growth factors, steroids, etc. can be contained in cell preparations.
  • the administration route of the CAR gene-introduced lymphocyte or cell preparation of the present invention is not particularly limited. For example, it is administered by intravenous injection, intraarterial injection, intramural injection, intradermal injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, or intraperitoneal injection. Local administration may be used instead of systemic administration. As local administration, direct injection into a target tissue / organ / organ can be exemplified.
  • the administration schedule may be prepared in consideration of the gender, age, body weight, pathological condition, etc. of the subject (patient). In addition to a single dose, multiple doses may be administered continuously or periodically.
  • Test example 1 Preparation of CAR construct ⁇ Test Example 1-1.
  • Example 1-6 Preparation of CD37.CD79a.40z.SH construct> Test Example 1-The same CAR construct as the CD19.CD79a.40z.SH construct except that the anti-CD37 scFv domain (amino acid sequence: SEQ ID NO: 25, base sequence: SEQ ID NO: 26) is adopted instead of the anti-CD19 scFv domain. It was produced in the same manner as in 1.
  • Test example 2 Preparation of CAR-T cells CAR-T cells were prepared using the CAR construct of Test Example 1. Specifically, it was carried out as follows.
  • Gammaretrovirus supernatants were prepared using the Phoenix-Ampho system (Orbigen). PBMCs were isolated from whole blood of healthy donors by centrifugation using Ficoll-Paque (GE Healthcare). CD3 + lymphocytes were then purified with immunomagnetic beads (Miltenyi Biotec) and activated with anti-CD3 / CD28 beads (Invitrogen) in a 1: 1 ratio. Retrovirus transfer was performed on days 3 and 4 using a recombinant human retronectin fragment-coated plate (Retronectin, Takara Bio), the retrovirus supernatant was added to the retronectin fragment-coated plate, and 1 at 32 ° C. at 2100 rpm.
  • Transformed T cells were cultured in RPMI 1640 medium (culture medium, CM) containing 10% human serum, 0.8 mM L-glutamine, 1% penicillin-streptomycin, 0.5 ⁇ M 2-mercaptoethanol and 50 IU / mL. Recombinant human IL-2 was added. On day 10, CAR-positive T cells were enriched with biotin-labeled anti-EGFR mAb and streptavidin beads (Miltenyi Biotec).
  • EBV-LCL expanded CAR-T cells were stimulated with ⁇ -ray irradiated CD19-K562 cells at a ratio of 1: 1 for 4 consecutive weeks.
  • concentrated CAR-positive cells were second-stimulated with anti-CD3 / CD28 beads in a 1: 1 ratio for 7-10 days prior to use.
  • Unintroduced T cells were cultured in parallel according to the same procedure used for introduced T cells, except for the addition of virus.
  • Test example 3 Evaluation of anti-cancer effect 1
  • the anticancer effect of CAR-T cells prepared in Test Example 2 (introduced with the construct of Test Example 1-1, Test Example 1-2, or Test Example 1-3) was evaluated. Specifically, it was carried out as follows.
  • mice Male NSG (NOD-SCID-common gamma chain-knock out) mice aged 6 to 8 weeks were intravenously inoculated with 0.5 ⁇ 10 6 Raji-ffluc cells via the tail vein. One week later, mice were treated with 1 ⁇ 10 6 tEGFR-introduced cells or CD19CAR-T cells (Test Example 2) by intravenous administration via the tail vein. Bioluminescence imaging (BLI) was performed to assess tumor progression using the IVIS spectrum system. The BLI results are shown in FIG. 2 and the survival curve is shown in FIG.
  • BLI Bioluminescence imaging
  • the anticancer effect of CD19.CD79a.40z.SH-introduced CAR-T cells is as follows: the anticancer effect of CD19.28z.SH-introduced CAR-T cells and CD19.BBz.SH-introduced CAR-T cells. It was higher than the effect.
  • Test example 4 Evaluation of anti-cancer effect 2
  • Anti-cancer of CAR-T cells prepared in Test Example 2 (introduced the construct of Test Example 1-1, Test Example 1-2, Test Example 1-3, Test Example 1-4, or Test Example 1-5)
  • the effect was evaluated. Specifically, it was carried out as follows. Male NSG mice 6-8 weeks old were intravenously inoculated with 5x10 5 firefly luciferase transgenic NALM6 cells via the tail vein. One week later, mice were treated with 2 ⁇ 10 6 tEGFR-introduced cells or CD19CAR-T cells (Test Example 2) by intravenous administration via the tail vein. Bioluminescence imaging (BLI) was performed to assess tumor progression using the IVIS spectrum system.
  • BBI Bioluminescence imaging
  • FIGS. 4 and 5 The BLI results are shown in FIGS. 4 and 5, and the survival curves are shown in FIGS. 6 and 7.
  • 4 and 6 are the results of CAR-T cells introduced with short hinge constructs (Constructs of Test Example 1-1, Test Example 1-2, Test Example 1-3), and FIGS. 5 and 7 are long. It is the result of CAR-T cells introduced with hinge constructs (constructs of Test Examples 1-4 and 1-5).
  • Test example 5 Evaluation of anti-cancer effect 3
  • CAR-T cells prepared in Test Example 2 (introduced with the construct of Test Example 1-1, Test Example 1-2, or Test Example 1-3) was evaluated. Specifically, CAR-T cells and CD37 gene-introduced K562 (irradiated antigen-positive cells) were mixed so as to be 1: 1 (CAR-T cells; K562 cells) and co-cultured. Cultures were performed with or without IL-2 50U / ml on Days 1,4,7,11 and the number of viable cells was counted. The results are shown in FIG.
  • Test example 6 Evaluation of anti-cancer effect 4
  • CAR-T cells prepared in Test Example 2 (introduced with the construct of Test Example 1-6, Test Example 1-7, or Test Example 1-8) was evaluated. Specifically, CAR-T cells and CD37 gene-introduced K562 (irradiated antigen-positive cells) were mixed so as to be 1: 1 (CAR-T cells; K562 cells) and co-cultured. IL-2 50U / ml was added to Days 1,4,7,11 and cultured, and the number of living cells was counted. The results are shown in FIG.
  • the CAR-T cell proliferation after antigen stimulation of the CD37.CD79a.40z.SH-introduced CAR-T cells was that of the CD37.28z.SH-introduced CAR-T cells and the CD37.BBz.SH-introduced CAR-T cells. It was higher than CAR-T cell proliferation after antigen stimulation.
  • Test example 7 Evaluation of anti-cancer effect 5
  • CAR-T cells prepared in Test Example 2 (introduced with the construct of Test Example 1-9, Test Example 1-10, or Test Example 1-11) was evaluated.
  • CAR-T cells and CD20 gene-introduced K562 irradiated antigen-positive cells
  • K562 cells irradiated antigen-positive cells
  • IL-2 IL-2
  • the CAR-T cell proliferation after antigen stimulation of the CD20.CD79a.40z.SH-introduced CAR-T cells was that of the CD20.28z.SH-introduced CAR-T cells and the CD20.BBz.SH-introduced CAR-T cells. It was higher than CAR-T cell proliferation after antigen stimulation.

Abstract

新規なキメラ抗原受容体を提供することを課題とし、当該課題を、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、並びにCD79A細胞内ドメイン及びCD40細胞内ドメインを含む細胞内シグナルドメインを含み、且つ（A）前記抗原結合性ドメインと前記膜貫通ドメインとの間の構成アミノ酸残基数が100以下である、及び／又は（B）前記抗原結合性ドメインの標的抗原がCD19以外の抗原である、キメラ抗原受容体、により解決する。

Description

キメラ抗原受容体
　本発明は、キメラ抗原受容体等に関する。
　キメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor。以下、「CAR」とも呼ぶ）は、抗体の特異性に従って抗原に結合し、これにより標的細胞の傷害・サイトカイン放出・刺激後のT細胞分裂を起こすことができる。遺伝子導入によってT細胞に特異性を与えることが可能であり、細胞の調製は内在性の腫瘍特異的T細胞レセプター（TCR）陽性T細胞を培養増幅する場合に比べて総じて容易である。また、CARを利用した治療法（CAR-T療法）は、抗体療法と比べて高い細胞傷害活性を示すこと、1回の輸注で抗原刺激によって自律的に増幅するために複数回の治療が必要ない点において優れている。TCR遺伝子導入では、HLAとその上に提示されるペプチドの複合体を標的としているために、患者が特定のHLAを持つ場合にのみ治療可能であるが（HLA拘束性）、CARにはHLA拘束性がない点においてより有利である。即ち、腫瘍細胞に標的抗原が陽性であれば、標的抗原陽性の全ての患者を対象として治療が可能である。 
　キメラ抗原レセプター遺伝子導入T細胞（CAR-T細胞）療法はCD19CAR-Tにおいて、米国にて薬品として承認されるに至っている。その臨床効果は高く、種々の悪性腫瘍に対して臨床的有用性が期待されている（例えば、特許文献１）。
特許第5312721号公報
　本発明は、新規なキメラ抗原受容体を提供することを課題とする。好ましくは、がんの予防又は治療効果がより高い抗原受容体を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、CD79A細胞内ドメイン及びCD40細胞内ドメインを含む細胞内シグナルドメインを採用することが好適であることを見出した。そして、さらに研究を進めた結果、一態様として、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、並びにCD79A細胞内ドメイン及びCD40細胞内ドメインを含む細胞内シグナルドメインを含み、且つ（A）前記抗原結合性ドメインと前記膜貫通ドメインとの間の構成アミノ酸残基数が100以下である、及び／又は（B）前記抗原結合性ドメインの標的抗原がCD19以外の抗原である、キメラ抗原受容体、が、上記課題を解決できることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、並びにCD79A細胞内ドメイン及びCD40細胞内ドメインを含む細胞内シグナルドメインを含み、且つ（A）前記抗原結合性ドメインと前記膜貫通ドメインとの間の構成アミノ酸残基数が100以下である、及び／又は（B）前記抗原結合性ドメインの標的抗原がCD19以外の抗原である、キメラ抗原受容体。
　項２．　前記細胞内シグナルドメインが細胞内活性化ドメインを含む、項１に記載のキメラ抗原受容体。
　項３．　前記細胞内活性化ドメインがCD3ζ細胞内ドメイン及びFcεRIγ細胞内ドメインからなる群より選択される少なくとも1種である、項２に記載のキメラ抗原受容体。
　項４．　前記CD79A細胞内ドメイン、前記CD40細胞内ドメイン、及び前記細胞内活性化ドメインが、膜貫通ドメイン側からこの順に配置されている、項２又は３に記載のキメラ抗原受容体。
　項５．　前記抗原結合性ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にIgGのヒンジ部又はその一部を含む、項１～４のいずれかに記載のキメラ抗原受容体。
　項６．　前記構成アミノ酸残基数が1～30である、項１～５のいずれかに記載のキメラ抗原受容体。
　項７．　前記抗原結合性ドメインの構造が単鎖抗体構造である、項１～６のいずれかに記載のキメラ抗原受容体。
　項８．　前記抗原結合性ドメインの標的抗原がCD19、GD2、GD3、CD20、CD37、CEA、HER2、EGFR、type III mutant EGFR、CD38、BCMA、MUC-1、PSMA、WT1、cancer testis antigen、mutation peptide、hTERT、PRAM、TYRP1、メソテリン、PMEL、及びムチンからなる群より選択される少なくとも1種である、項１～７のいずれかに記載のキメラ抗原受容体。
　項９．　項１～８のいずれかに記載の抗原受容体をコードする、ポリヌクレオチド。
　項１０．　項９に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
　項１１．　リンパ球細胞である、項１０に記載の細胞。
　項１２．　項１０又は１１に記載の細胞を含有する、医薬組成物。
　項１３．　がんの治療、予防、又は改善用である、項１２に記載の医薬組成物。
　本発明によれば、新規な抗原受容体を提供することができる。この抗原受容体を使用することにより、効果的にがんを治療又は予防することができる。
試験例1で作製したCARコンストラクトの一部の構造模式図を示す。 試験例3の生物発光イメージングの結果を示す。縦軸は、発光強度（がんの広がりの程度を表す。）を示す。横軸は、がん細胞を接種してからの経過日数を示す。データは、平均値±SEM（双方向ANOVA；*P < 0.05、**P < 0.01）として示され、3つの異なるドナー（CD19CAR SH T細胞：グループあたりn = 8；tEGFR-T：n = 4）を使用した3つの独立した実験から算出した。 試験例3の生存曲線を示す。縦軸は、マウスの生存率を示す。横軸は、がん細胞を接種してからの経過日数を示す。Wilcoxon test；*P < 0.05、****P < 0.0001。 試験例4の生物発光イメージングの結果（ショートヒンジのコンストラクトの場合）を示す。縦軸は、発光強度（がんの広がりの程度を表す。）を示す。横軸は、がん細胞を接種してからの経過日数を示す。データは、平均値±SEM（双方向ANOVA；*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001）として示され、3つの異なるドナー（CD19CAR SH T細胞：グループあたりn = 13, tEGFR-T：n = 7）を使用した3つの独立した実験から算出した。 試験例4の生物発光イメージングの結果（ロングヒンジのコンストラクトの場合）を示す。縦軸は、発光強度（がんの広がりの程度を表す。）を示す。横軸は、がん細胞を接種してからの経過日数を示す。データは、平均値±SEM（双方向ANOVA；***P < 0.001）として示され、2つの異なるドナー（CD19CAR SH T細胞：グループあたりn = 8；tEGFR-T：n = 6）を使用した2つの独立した実験から算出した。 試験例4の生存曲線（ショートヒンジのコンストラクトの場合）を示す。縦軸は、マウスの生存率を示す。横軸は、がん細胞を接種してからの経過日数を示す。 試験例4の生存曲線（ロングヒンジのコンストラクトの場合）を示す。縦軸は、マウスの生存率を示す。横軸は、がん細胞を接種してからの経過日数を示す。 試験例5の生細胞数測定結果を示す。縦軸は、CD19CAR-T細胞の生細胞数の相対値を示し、横軸は共培養開始からの経過日数を示す。左側の図は、IL-2を添加しない場合の結果を示し、右側の図は、IL-2を添加した場合の結果を示す。 試験例6の生細胞数測定結果を示す。縦軸は、CD37CAR-T細胞の生細胞数の相対値を示し、横軸は共培養開始からの経過日数を示す。 試験例7の生細胞数測定結果を示す。縦軸は、CD20CAR-T細胞の生細胞数の相対値を示し、横軸は共培養開始からの経過日数を示す。
　1．定義
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
　本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　本明細書中において、「CDR」とは、Complementarity Determining Regionの略であり、相補性決定領域とも称される。CDRとは、イムノグロブリン又はT細胞受容体の可変領域に存在する領域であり、抗体又はT細胞受容体の抗原への特異的な結合に深く関与する領域である。なお、「軽鎖CDR」とはイムノグロブリンの軽鎖可変領域に存在するCDRであり、「重鎖CDR」とはイムノグロブリンの重鎖可変領域に存在するCDRのことを意味する。T細胞受容体においても、α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖等があり、これらのCDRについても同様である。
　本明細書中において、「可変領域」とは、CDR1～CDR3（以下、単に「CDRs1-3」という）を含む領域のことを意味する。これらのCDRs1-3の配置順序は特に限定はされないが、好ましくは、N末端側からC末端側の方向に、CDR1、CDR2、及びCDR3の順か、若しくはこの逆の順に、連続又は後述するフレームワーク領域（FR）と称される他のアミノ酸配列を介して、配置された領域を意味する。なお、「重鎖可変領域」とは、イムノグロブリンにおいて、上述の重鎖CDRs1-3が配置された領域であり、「軽鎖可変領域」とは、イムノグロブリンにおいて、上述の軽鎖CDRs1-3が配置された領域である。T細胞受容体においても、α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖等があり、これらのCDRについても同様である。
　各可変領域の上記CDR1-3以外の領域は、上述するようにフレームワーク領域（FR）と称される。特に可変領域のN末端と上記CDR1との間の領域をFR1、CDR1とCDR2との間の領域をFR2、CDR2とCDR3との間の領域をFR3、CDR3と可変領域のC末端との間をFR4とそれぞれ定義される。
　2．キメラ抗原受容体
　本発明は、その一態様において、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、並びにCD79A細胞内ドメイン及びCD40細胞内ドメインを含む細胞内シグナルドメインを含み、且つ（A）前記抗原結合性ドメインと前記膜貫通ドメインとの間の構成アミノ酸残基数が100以下である、及び／又は（B）前記抗原結合性ドメインの標的抗原がCD19以外の抗原である、キメラ抗原受容体（本明細書において、「本発明のキメラ抗原受容体」と示すこともある。）に関する。以下に、この本発明のキメラ抗原受容体について説明する。
　なお、本発明は、その一態様において、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、並びにCD79A細胞内ドメイン及びCD40細胞内ドメインを含む細胞内シグナルドメインを含む、キメラ抗原受容体にも関する。当該キメラ抗原受容体については、本発明のキメラ抗原受容体の説明に準じる。
　抗原結合性ドメインは、本発明のキメラ抗原受容体が細胞膜上に配置された際に細胞外に配置されるドメインであり、抗原を認識して、当該抗原に結合することができるドメインである限り、特に制限されない。抗原として、具体的には、例えばCD19、GD2、GD3、CD20、CD37、CEA、HER2、EGFR、type III mutant EGFR、CD38、BCMA、MUC-1、PSMA、WT1、cancer testis antigen（例えばNY-ESO-1、MAGE-A4等）、mutation peptide（例えばk-ras、h-ras、p53等）、hTERT、PRAM、TYRP1、メソテリン、PMEL、ムチン等、さらにはこれらの断片とMHCとの複合体（pMHC）等が挙げられる。これらの中でも、本発明の一態様において、好ましくはCD19が挙げられる。また、本発明の別の一態様において、好ましくはCD19以外の抗原、より好ましくはCD20、CD37等が挙げられる。抗原結合性ドメインは、通常、抗原に対する抗体又はT細胞受容体のCDR（例えば、抗体のCDRであれば、重鎖CDR1、重鎖CDR2、重鎖CDR3、軽鎖CDR1、軽鎖CDR2、及び軽鎖CDR3）の内の1つ以上、好ましくは2つ、3つ、4つ、5つ以上、より好ましくは6つ全てを有する。抗原結合性領域は、より好ましくは抗原に対する抗体又はT細胞受容体の可変領域（抗体の場合であれば、例えば重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域）を含む。
　抗原結合性ドメインは、単鎖抗体構造を採ることが好ましく、scFv構造を採ることがより好ましい。scFv構造のように重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む場合、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とは、通常、リンカーを介して連結されている。リンカーは、抗原結合性が著しく損なわれない限り特に制限されず、任意である。リンカーとしては、好ましくはグリシン或いはグリシンとセリンから構成されるリンカー（GGSリンカー、GSリンカー、GGGリンカー等）である。リンカーの長さは特に限定されない。リンカーのアミノ酸残基数は、例えば5～30、好ましくは10～25である。重鎖可変領域と軽鎖可変領域との配置関係は特に制限されず、N末端側が軽鎖可変領域である態様と、N末端側が重鎖可変領域である場合のいずれでも採用可能である。該配置関係は、好ましくは前者である。
　膜貫通ドメインは、本発明のキメラ抗原受容体が細胞膜上に配置された際に細胞膜内に配置されるドメインであり、キメラ抗原受容体を構成し得るものである限りにおいて、特に制限されない。膜貫通ドメインとしては、例えば、CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4、4-1BB等の膜貫通領域を用いることができる。各因子の膜貫通領域は、公知であるか、或いは公知の配列情報から（例えば膜貫通領域の予測プログラム等を利用して）容易に決定することができる。また、人工的に構築したポリペプチドからなる膜貫通ドメインを用いることにしてもよい。これらの膜貫通ドメインは、キメラ抗原受容体の機能を著しく阻害しない限り、適宜変異が導入されていてもよい。
　膜貫通ドメインとしては、好ましくはCD28の膜貫通領域を採用することができる。CD28の膜貫通領域の具体例としては、下記（a）に記載するアミノ酸配列又は下記（b）に記載するアミノ酸配列：
　（a）配列番号3に示されるアミノ酸配列、又は
　（b）配列番号3に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有し、且つ本発明のキメラ抗原受容体が細胞膜上に配置された際に細胞膜内に配置され得るアミノ酸配列
が挙げられる。
　上記（b）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上である。
　上記（b）に記載するアミノ酸配列の一例としては、例えば
（b’）配列番号3に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列であって、且つ本発明のキメラ抗原受容体が細胞膜上に配置された際に細胞膜内に配置され得るアミノ酸配列
が挙げられる。
　上記（b’）において、複数個とは、例えば2～5個であり、好ましくは2～3個であり、より好ましくは2個である。
　本発明の一態様において、抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインとは、直接又は比較的短いスペーサーを介して連結されることが好ましい。本発明のキメラ抗原受容体において、抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインとの間の構成アミノ酸残基数は、例えば400以下、300以下、又は250以下であることができ、100以下であることが特に好ましい。当該構成アミノ酸残基数は、好ましくは0～60、より好ましくは0～40、さらに好ましくは0～30である。本発明の特に好ましい態様において、当該アミノ酸残基数は、1以上、4以上、又は8以上であり、また25以下、20以下、又は15以下であり、また1～25、4～20、又は8～15である。スペーサーの配列は特に限定されないが、例えばIgG、好ましくはヒトIgG（例えばサブタイプIgG1やIgG4）のヒンジ部又はその一部、ヒンジ部とCH2の一部、或いは膜貫通ドメインに利用する因子（例えばCD28）の一部等の配列をスペーサーに用いることができる。なお、ヒンジ部又はその一部の配列を利用することにより、柔軟性に富むスペーサーが構成されることを期待できる。
　細胞内シグナルドメインは、本発明のキメラ抗原受容体が細胞膜上に配置された際に細胞内に配置されるドメインであり、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達すること、即ち、抗原結合性ドメインが抗原と結合した際、免疫細胞の活性化に必要なシグナルを伝達することが可能なドメインである。本発明のキメラ抗原受容体は、細胞内シグナルドメインがCD79A細胞内ドメイン及びCD40細胞内ドメインを含む。
　CD79A細胞内ドメインは、CD79Aのアミノ酸の細胞内ドメインのアミノ酸配列からなるドメインであり、この限りにおいて特に制限されない。
　CD79Aとしては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類由来のCD79Aを採用することができる。中でも、対象生物（例えばヒト）由来のCD79Aが好ましい。
　種々の生物種由来CD79A細胞内ドメインのアミノ酸配列は公知である。具体的には、例えば、配列番号4に示されるアミノ酸配列等が挙げられる。
　CD79A細胞内ドメインは、NFκBシグナル活性化作用を有する限りにおいて、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を有していてもよい。変異としては、上記作用がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。
　CD79A細胞内ドメインのアミノ酸配列の好ましい具体例としては、下記（c）に記載するアミノ酸配列及び下記（d）に記載するアミノ酸配列：
　（c）配列番号4に示されるアミノ酸配列、及び
　（d）配列番号4に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有し、且つNFκBシグナル活性化作用を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
　上記（d）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上である。
　上記（d）に記載するアミノ酸配列の一例としては、例えば
（d’）配列番号4に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列であって、且つNFκBシグナル活性化作用を有するアミノ酸配列
が挙げられる。
　上記（d’）において、複数個とは、例えば2～5個であり、好ましくは2～3個であり、より好ましくは2個である。
　CD40細胞内ドメインは、CD40のアミノ酸の細胞内ドメインのアミノ酸配列からなるドメインであり、この限りにおいて特に制限されない。
　CD40としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類由来のCD40を採用することができる。中でも、対象生物（例えばヒト）由来のCD40が好ましい。
　種々の生物種由来CD40細胞内ドメインのアミノ酸配列は公知である。具体的には、例えば、配列番号5に示されるアミノ酸配列等が挙げられる。
　CD40細胞内ドメインは、NFκBシグナル活性化作用を有する限りにおいて、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を有していてもよい。変異としては、上記作用がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。
　CD40細胞内ドメインのアミノ酸配列の好ましい具体例としては、下記（e）に記載するアミノ酸配列及び下記（f）に記載するアミノ酸配列：
　（e）配列番号5に示されるアミノ酸配列、及び
　（f）配列番号5に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有し、且つNFκBシグナル活性化作用を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
　上記（f）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上である。
　上記（f）に記載するアミノ酸配列の一例としては、例えば
（f’）配列番号5に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列であって、且つNFκBシグナル活性化作用を有するアミノ酸配列
が挙げられる。
　上記（f’）において、複数個とは、例えば2～5個であり、好ましくは2～3個であり、より好ましくは2個である。
　CD79A細胞内ドメインとCD40細胞内ドメインとの配置関係は特に制限されず、N末端側がCD79A細胞内ドメインである態様と、N末端側がCD40細胞内ドメインである場合のいずれでも採用可能である。該配置関係は、好ましくは前者である。CD79A細胞内ドメイン及びCD40細胞内ドメインは、直接連結している、或いはリンカーを介して連結していることが好ましい。リンカーは、NFκBシグナル活性化作用が著しく損なわれない限り特に制限されず、任意である。リンカーとしては、好ましくはグリシン或いはグリシンとセリンから構成されるリンカー（GGSリンカー、GSリンカー、GGGリンカー等）である。リンカーの長さは特に限定されない。リンカーのアミノ酸残基数は、例えば1～20、好ましくは1～10、より好ましくは1～5である。
　細胞内シグナルドメインは、好ましくは細胞内活性化ドメインを含む。細胞内活性化ドメインとしては、例えば、CD3ζの他、FcεRIγ等の細胞内ドメインを用いることができる。好ましくは、CD3ζが用いられる。CD3は、抗原受容体の機能を阻害しない限り、適宜変異が導入されていてもよい。CD3に変異を導入する場合は、ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)が含まれるよう行うことが好ましい。
　細胞内活性化ドメインの具体例としては、下記（g）に記載するアミノ酸配列又は下記（h）に記載するアミノ酸配列：
　（g）配列番号6に示されるアミノ酸配列、又は
　（h）配列番号6に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有し、且つ免疫細胞の活性化作用を有するアミノ酸配列
が挙げられる。
　上記（h）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上である。
　上記（h）に記載するアミノ酸配列の一例としては、例えば
（h’）配列番号6に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列であって、且つ免疫細胞の活性化作用を有するアミノ酸配列
が挙げられる。
　上記（h’）において、複数個とは、例えば2～15個であり、好ましくは2～10個であり、より好ましくは2～5個、さらに好ましくは2～3個である。
　細胞内活性化ドメインの位置は特に制限されない。細胞内活性化ドメインは、好ましくは、CD79A細胞内ドメイン及びCD40細胞内ドメインよりも細胞内側（膜貫通ドメインとは反対側）に配置される。本発明の特に好ましい一態様においては、CD79A細胞内ドメイン、CD40細胞内ドメイン、及び細胞内活性化ドメインが、膜貫通ドメイン側からこの順に配置されている。
　本発明のキメラ抗原受容体は、上記以外の他の領域を含むことができる。他の領域としては、例えば共刺激因子細胞内ドメイン、CARの細胞膜上への輸送を促すためにリーダー配列（シグナルペプチド）（例えば、GM-CSFレセプターのリーダー配列）、スペーサー／リンカー（例えば膜貫通領域と細胞内シグナルドメインの間、細胞内シグナルドメイン内の各ドメイン間）等が挙げられる。共刺激因子の細胞内ドメインは、T細胞などが有する共刺激因子に由来する細胞内ドメインであればよく特に限定はされない。例えば、OX40、4－1BB、GITR、CD27、CD278及びCD28等からなる群より選択される1種以上を適宜選択して使用することができる。
　尚、これまでにCARを利用した実験、臨床研究などの報告がいくつかあり（例えばRossig C, et al. Mol Ther 10:5-18, 2004; Dotti G, et al. Hum Gene Ther 20:1229-1239, 2009; Ngo MC, et al. Hum Mol Genet 20 (R1):R93-99, 2011; Ahmed N, et al. Mol Ther 17:1779-1787, 2009; Pule MA, et al. Nat Med 14:1264-1270, 2008; Louis CU, et al. Blood 118:6050-6056, 2011; Kochenderfer JN, et al. Blood 116:4099-4102, 2010; Kochenderfer JN, et al. Blood 119 :2709-2720, 2012; Porter DL, et al. N Engl J Med 365:725-733, 2011; Kalos M, et al. Sci Transl Med 3:95ra73,2011; Brentjens RJ, et al. Blood 118:4817-4828, 2011; Brentjens RJ, et al. Sci Transl Med 5:177 ra38, 2013）、これらの報告を参考にして本発明のキメラ抗原受容体を構築することができる。
　本発明のキメラ抗原受容体の特に好ましい一態様としては、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、CD79A（CD40）細胞内ドメイン及びCD40（CD79A）細胞内ドメイン、並びに細胞内活性化ドメインがこの順に配置されてなるコア領域を含むキメラ抗原受容体が挙げられる。当該コア領域において、抗原結合性ドメイン及び膜貫通ドメインはスペーサーを介して連結されており、膜貫通ドメインとCD79A（CD40）細胞内ドメイン及びCD40（CD79A）細胞内ドメインとの間、CD79A（CD40）細胞内ドメインとCD40（CD79A）細胞内ドメインとの間、CD79A（CD40）細胞内ドメイン及びCD40（CD79A）細胞内ドメインと細胞内活性化ドメインとの間は、直接又はスペーサー／リンカーを介して連結されている。スペーサー／リンカーについては上記の説明と同様である。
　本発明のキメラ抗原受容体は、1種のポリペプチドからなる分子であってもよいし、2種以上のポリペプチドの複合体からなる分子であってもよい。また、本発明のキメラ抗原受容体は、ポリペプチド又はその複合体からなる分子であってもよいし、ポリペプチド又はその複合体に、他の物質（例えば蛍光物質、放射性物質、無機粒子等）が連結してなるものであってもよい。
　本発明のキメラ抗原受容体は、化学修飾されたものであってもよい。本発明のキメラ抗原受容体を構成するポリペプチドは、C末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO－）、アミド（－CONH2）またはエステル（－COOR）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明のキメラ抗原受容体を構成するポリペプチドは、C末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明のキメラ抗原受容体を構成するポリペプチドには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－OH、－SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイル基などのC1－6アシル基など）で保護されているものも包含される。
　本発明のキメラ抗原受容体は、公知のタンパク質タグ、シグナル配列等のタンパク質又はペプチドが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ、蛍光タンパク質タグ等が挙げられる。
　本発明のキメラ抗原受容体は、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；　酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；　アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；　カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
　本発明のキメラ抗原受容体は、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
　キメラ抗原受容体及びそれを発現するCAR－T細胞を製造する技術は公知である。これらは、公知の方法に従って又は準じて、製造することができる。
　3．ポリヌクレオチド及びその利用
　本発明は、その一態様において、本発明のキメラ抗原受容体をコードする、ポリヌクレオチド（本明細書において、「本発明のポリヌクレオチド」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　本発明のポリヌクレオチドは、本発明のキメラ抗原受容体のコード配列以外に、他の配列を含んでいてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のキメラ抗原受容体を発現可能な状態で含むことが好ましい。他の配列としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列、複製基点、レポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質等）コード配列、薬剤耐性遺伝子コード配列などが挙げられる。
　本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは本発明のキメラ抗原受容体の発現カセットを含む。発現カセットはプロモーターと、当該プロモーターの制御下にある本発明のキメラ抗原受容体のコード配列を含む。プロモーターの制御下となるように、通常、プロモーターの下流にコード配列を配置する。CAR発現カセットに利用可能なプロモーターとしては、例えばCMV-IE（サイトメガロウイルス初期遺伝子由来プロモーター）、SV40ori、レトロウイルスLTP、SRα、EF1α、βアクチンプロモーター等が挙げられる。プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。ここで、「プロモーターがコード配列に作動可能に連結している」とは、「プロモーターの制御下にコード配列が配置されている」ことと同義であり、通常、プロモーターの3'末端側に直接又は他の配列を介してコード配列が連結されることになる。コード配列の下流にはポリA付加シグナル配列を配置する。ポリA付加シグナル配列の使用によって転写を終了させる。ポリA付加シグナル配列としてはSV40のポリA付加配列、ウシ由来成長ホルモン遺伝子のポリA付加配列等を用いることができる。
　発現カセット内に検出用遺伝子（レポーター遺伝子、細胞又は組織特異的な遺伝子、選択マーカー遺伝子など）、エンハンサー配列、WRPE配列等を含めることにしてもよい。検出用遺伝子は、発現カセットの導入の成否や効率の判定、CAR遺伝子の発現の検出又は発現効率の判定、CAR遺伝子が発現した細胞の選択や分取等に利用される。一方、エンハンサー配列の使用によって発現効率の向上が図られる。検出用遺伝子としては、ネオマイシンに対する耐性を付与するneo遺伝子、カナマイシン等に対する耐性を付与するnpt遺伝子（Herrera Estrella、EMBO J. 2（1983）、987-995）やnptII遺伝子（Messing & Vierra．Gene 1 9:259-268(1982)）、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するhph遺伝子（Blochinger & Diggl mann，Mol Cell Bio 4:2929-2931）、メタトレキセートに対する耐性を付与するdhfr遺伝子（Bourouis et al.，EMBO J．2(7)）等（以上、マーカー遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子（Giacomin、P1. Sci. 116（1996）、59～72；Scikantha、J. Bact. 178（1996）、121）、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子、GFP（Gerdes、FEBS Lett. 389（1996）、44-47）やその改変体（EGFPやd2EGFPなど）等の蛍光タンパク質の遺伝子（以上、レポーター遺伝子）、細胞内ドメインを欠く上皮成長因子受容体（EGFR）遺伝子等の遺伝子を用いることができる。検出用遺伝子は、例えば、バイシストロニック性制御配列（例えば、リボソーム内部認識配列（IRES））や自己開裂ペプチドをコードする配列を介してCAR遺伝子に連結している。自己開裂ペプチドの例はThosea asigna virus由来の2Aペプチド（T2A）であるが、これに限定されるものではない。自己開裂ペプチドとして蹄疫ウイルス（FMDV）由来の2Aペプチド（F2A）、ウマ鼻炎Aウイルス（ERAV）由来の2Aペプチド（E2A）、porcine teschovirus（PTV-1）由来の2Aペプチド（P2A）等が知られている。
　本発明のポリヌクレオチドは、直鎖状のポリヌクレオチドであってもよいし、環状のポリヌクレオチド（ベクターなど）であってもよい。ベクターは、プラスミドベクター、又はウイルスベクターであり得る。また、ベクターは、例えば、クローニング用ベクター又は発現用ベクターであり得る。発現用ベクターとしては、大腸菌、又は放線菌等の原核細胞用のベクター、或いは、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞等の真核細胞用のベクターを挙げることができる。より具体的には、ウイルスベクターとしてレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられ、非ウイルスベクターの例としては、各種プラスミドベクター、リポソームベクター、正電荷型リポソームベクター（Felgner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413-7417, 1987）、YACベクター、BACベクターを挙げることができる。
　本発明のポリヌクレオチドは、DNA、RNAのみならず、これらに、次に例示するように、公知の化学修飾が施されたものも包含する。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、「ポリヌクレオチド」の語は、天然の核酸だけでなく、BNA（Bridged Nucleic Acid）、LNA（Locked Nucleic Acid）、PNA（Peptide Nucleic Acid）等の何れも包含する。
　本発明のポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む方法により抗がん作用を有する細胞を得ることができる。当該細胞は、本発明のキメラ抗原受容体を発現する。その一態様について以下に説明する。
　本発明のポリヌクレオチドが導入される細胞（CAR発現用細胞）として、CD4陽性CD8陰性T細胞、CD4陰性CD8陽性T細胞、iPS細胞から調製されたT細胞、αβ-T細胞、γδ-T細胞、NK細胞、NKT細胞等を挙げることができる。上記の如きリンパ球又は前駆細胞を含むものであれば、様々な細胞集団を用いることができる。末梢血から採取されるPBMC（末梢血単核細胞）は好ましい標的細胞の一つである。即ち、好ましい一態様では、PBMCに対して遺伝子導入操作を行う。PBMCは常法に従って又は準じて調製することができる。
　本発明のポリヌクレオチドの導入の前にCAR発現用細胞を活性化させておくことが好ましい。例えば、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激し、CAR発現用細胞を活性化させることができる。例えば、抗CD3抗体と抗CD28抗体で培養面をコートした培養容器（例えば培養皿）で培養することによって、抗CD3抗体及び抗CD28抗体による刺激を加えることができる。抗CD3抗体と抗CD28抗体がコートされた磁気ビーズ（例えば、VERITAS社が提供するDynabeads T-Activator CD3/CD28）を利用して当該刺激を行うことも可能である。 
　細胞の生存率／増殖率を高めるために、活性化処理の際、T細胞増殖因子が添加された培養液を使用することが好ましい。T細胞増殖因子としてはIL-2、IL-15、IL-7等を用いることができる。IL-2、IL-15、IL-7等のT細胞増殖因子は常法に従って調製することができる。また、市販品を利用することもできる。ヒト以外の動物種のT細胞増殖因子の使用を排除するものではないが、通常、T細胞増殖因子はヒト由来のもの（組換え体であってもよい）を用いる。
　典型的には、その適用（患者への投与）のため、本発明のポリヌクレオチド導入後の細胞（本発明のポリヌクレオチド導入リンパ球）を増殖させる。例えば、T細胞増殖因子が添加された培養液を用いて本発明のポリヌクレオチド導入リンパ球を培養する（必要に応じて継代培養する）。この培養に加え、CAR発現用細胞の活性化の場合と同様の処理（再活性化）を行うことにしてもよい。
　尚、CAR発現用細胞及び本発明のポリヌクレオチド導入リンパ球の培養には、血清（ヒト血清、ウシ胎仔血清など）を添加した培地を用いてもよいが、無血清培地を採用することにより、臨床応用する際の安全性が高く、且つ血清ロット間の差による培養効率の違いが出にくいという利点を有する細胞を調製することが可能になる。血清を用いる場合には、自己血清、即ち、CAR遺伝子導入リンパ球の投与を受ける患者から採取した血清を用いることが好ましい。
　4．細胞
　本発明は、その一態様において、本発明のポリヌクレオチドを含有する、細胞（本明細書において、「本発明の細胞」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　本発明の細胞の由来細胞は、特に制限されない。本発明の細胞を、本発明のキメラ抗原受容体の精製において使用する目的であれば、由来細胞としては、タンパク質発現に使用できる細胞（例えば、昆虫細胞、真核細胞、哺乳類細胞等）等が挙げられる。
　本発明の細胞は好ましくはリンパ球細胞（例えば、T細胞（例えばCD4陽性CD8陰性T細胞、CD4陰性CD8陽性T細胞、iPS細胞から調製されたT細胞、αβ-T細胞、γδ-T細胞等）、NK細胞、NKT細胞等）である。これらの細胞は、好ましくは本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞であり、より具体的な態様においては、これらの細胞は、本発明の抗原受容体が細胞膜上に発現しており、好ましくは本発明の抗原受容体が抗原結合性ドメインを細胞膜外に露出した状態で発現している。
　キメラ抗原受容体を発現するT細胞等は抗原結合性領域で抗原を認識した後、その認識シグナルをT細胞等の内部に伝達し、細胞傷害活性を惹起させるシグナルを作動させ、これに連動して該細胞が抗原を発現する他の細胞または組織に対して攻撃または細胞傷害活性を発揮することができる。
　このような機能を発揮する細胞がCTLである場合、キメラ抗原受容体T細胞（CAR－T細胞）と呼ばれる。NK細胞などの細胞傷害活性を発揮する可能性を有する細胞もキメラ抗原受容体T細胞と同様に、抗原結合性領域が抗原と結合することにより、細胞傷害活性を発揮できる。従って、本発明のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞（特に、細胞傷害活性を有する宿主細胞）は、医薬組成物の有効成分として有用である。
　5．医薬組成物
　本発明は、その一態様において、本発明の細胞を含有する、医薬組成物（本明細書において、「本発明の医薬組成物」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　本発明の医薬組成物は、細胞製剤として、抗原結合性ドメインの標的抗原を発現する腫瘍／がん（標的疾患）の治療、予防、又は改善に広く利用することができる。標的疾患は固形がん及び血液がんを含む。標的疾患としては、例えば各種B細胞性悪性リンパ腫（B細胞性急性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、血管内B細胞性リンパ腫、CD20陽性ホジキンリンパ腫など）、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍(CMML,JMML,CML,MDS/MPN-UC)、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、肺がん、大腸がん、卵巣がん、乳がん、脳腫瘍、胃がん、肝がん、舌がん、甲状腺がん、腎臓がん、前立腺がん、子宮がん、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫等が挙げられる。「治療」とは、標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。「予防」とは、疾病（障害）又はその症状の発症／発現を防止又は遅延すること、或いは発症／発現の危険性を低下させることをいう。一方、「改善」とは、疾病（障害）又はその症状が緩和（軽症化）、好転、寛解、又は治癒（部分的な治癒を含む）することをいう。
　本発明の医薬組成物には、本発明の細胞が治療上有効量含有される。例えば1回の投与用として、1×10 4個～1×10 10個の細胞を含有させることができる。細胞の保護を目的としてジメチルスルフォキシド（DMSO）や血清アルブミン等、細菌の混入を阻止する目的で抗生物質等、細胞の活性化、増殖又は分化誘導などを目的とした各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）等の成分を細胞製剤に含有させることができる。
　本発明のCAR遺伝子導入リンパ球又は細胞製剤の投与経路は特に限定されない。例えば、静脈内注射、動脈内注射、門脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、又は腹腔内注射によって投与する。全身投与によらず、局所投与することにしてもよい。局所投与として、目的の組織・臓器・器官への直接注入を例示することができる。投与スケジュールは、対象（患者）の性別、年齢、体重、病態などを考慮して作成すればよい。単回投与の他、連続的又は定期的に複数回投与することにしてもよい。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例1．CARコンストラクトの作製
　＜試験例1-1．CD19.CD79a.40z.SHコンストラクトの作製＞
　N末端側から、
抗CD19 scFvドメイン（アミノ酸配列：配列番号1、塩基配列：配列番号10）、IgG4ヒンジ部（アミノ酸配列：配列番号2、塩基配列：配列番号11）、
CD28膜貫通ドメイン（アミノ酸配列：配列番号3、塩基配列：配列番号12）、
CD79A細胞内ドメイン（アミノ酸配列：配列番号4、塩基配列：配列番号13）、GGGリンカー（アミノ酸配列：N末端－GGG、塩基配列：5’－GGCGGAGGG）、CD40細胞内ドメイン（アミノ酸配列：配列番号5、塩基配列：配列番号14）、
CD3ζ細胞内ドメイン（アミノ酸配列：配列番号6、塩基配列：配列番号15）、
T2A配列（アミノ酸配列：配列番号7、塩基配列：配列番号16）、
Truncated EGFRドメイン（アミノ酸配列：配列番号8、塩基配列：配列番号17）の順に配置されてなるCARコンストラクト（図１、アミノ酸配列：配列番号9、塩基配列：配列番号18）をデザインし、当該CARのコード配列（塩基配列：配列番号18）を、その両末端側に付加した制限酵素認識配列（5’側はHindIII、3’側はNotI）を利用して、LZRS-pBMN-Zベクターに組み込んだ。
　＜試験例1-2．CD19.28z.SHコンストラクトの作製＞
　CD79A細胞内ドメイン、GGGリンカー、及びCD40細胞内ドメインからなる細胞内シグナルドメインに代えて、CD28の細胞内ドメイン（アミノ酸配列：配列番号19、塩基配列：配列番号20）を採用する以外はCD79a.40z.SHコンストラクトと同じCARコンストラクト（図１）を、試験例1-1と同様にして作製した。
　＜試験例1-3．CD19.BBz.SHコンストラクトの作製＞
　CD79A細胞内ドメイン、GGGリンカー、及びCD40細胞内ドメインからなる細胞内シグナルドメインに代えて、4-1BBの細胞内ドメイン（アミノ酸配列：配列番号21、塩基配列：配列番号22）を採用する以外はCD79a.40z.SHコンストラクトと同じCARコンストラクト（図１）を、試験例1-1と同様にして作製した。
　＜試験例1-4．CD19.CD79a.40z.LHコンストラクトの作製＞
　IgG4ヒンジ部に代えて、免疫グロブリンヒンジ＋CH2-CH3部（アミノ酸配列：配列番号23、塩基配列：配列番号24）を採用する以外はCD19.CD79a.40z.SHコンストラクトと同じCARコンストラクトを、試験例1-1と同様にして作製した。
　＜試験例1-5．CD19.28z.LHコンストラクトの作製＞
　IgG4ヒンジ部に代えて、免疫グロブリンヒンジ＋CH2-CH3部（アミノ酸配列：配列番号23、塩基配列：配列番号24）を採用する以外はCD19.28z.SHコンストラクトと同じCARコンストラクトを、試験例1-1と同様にして作製した。
　＜試験例1-6．CD37.CD79a.40z.SHコンストラクトの作製＞
　抗CD19 scFvドメインに代えて、抗CD37 scFvドメイン（アミノ酸配列：配列番号25、塩基配列：配列番号26）を採用する以外はCD19.CD79a.40z.SHコンストラクトと同じCARコンストラクトを、試験例1-1と同様にして作製した。
　＜試験例1-7．CD37.28z.SHコンストラクトの作製＞
　抗CD19 scFvドメインに代えて、抗CD37 scFvドメイン（アミノ酸配列：配列番号25、塩基配列：配列番号26）を採用する以外はCD19.28z.SHコンストラクトと同じCARコンストラクトを、試験例1-1と同様にして作製した。
　＜試験例1-8．CD37.BBz.SHコンストラクトの作製＞
　抗CD19 scFvドメインに代えて、抗CD37 scFvドメイン（アミノ酸配列：配列番号25、塩基配列：配列番号26）を採用する以外はCD19.BBz.SHコンストラクトと同じCARコンストラクトを、試験例1-1と同様にして作製した。
　＜試験例1-9．CD20.CD79a.40z.SHコンストラクトの作製＞
　抗CD19 scFvドメインに代えて、抗CD20 scFvドメイン（アミノ酸配列：配列番号27、塩基配列：配列番号28）を採用する以外はCD19.CD79a.40z.SHコンストラクトと同じCARコンストラクトを、試験例1-1と同様にして作製した。
　＜試験例1-10．CD20.28z.SHコンストラクトの作製＞
　抗CD19 scFvドメインに代えて、抗CD20 scFvドメイン（アミノ酸配列：配列番号27、塩基配列：配列番号28）を採用する以外はCD19.28z.SHコンストラクトと同じCARコンストラクトを、試験例1-1と同様にして作製した。
　＜試験例1-11．CD20.BBz.SHコンストラクトの作製＞
　抗CD19 scFvドメインに代えて、抗CD20 scFvドメイン（アミノ酸配列：配列番号27、塩基配列：配列番号28）を採用する以外はCD19.BBz.SHコンストラクトと同じCARコンストラクトを、試験例1-1と同様にして作製した。
　試験例2．CAR-T細胞の調製
　試験例1のCARコンストラクトを用いて、CAR-T細胞を調製した。具体的には以下のようにして行った。
　ガンマレトロウイルス上清は、Phoenix-Amphoシステム（Orbigen）を用いて作製した。PBMCは、健康なドナーの全血を、Ficoll-Paque（GE Healthcare）を用いた遠心分離することにより単離した。次いで、CD3+リンパ球を免疫磁気ビーズ（Miltenyi Biotec）で精製し、抗CD3/CD28ビーズ（Invitrogen）で1:1の比率で活性化した。レトロウイルス導入は、組換えヒトレトロネクチン断片被覆プレート（レトロネクチン、タカラバイオ）を用いて3日目および4日目に行い、レトロウイルス上清をレトロネクチン断片被覆プレートに添加し、2100rpmで32℃で1時間遠心したのち、一旦プレートからウイルス液を除去し、その後前述のCD3+リンパ球をウェルに加えて遺伝子導入を行った。形質転換したT細胞を、10%ヒト血清、0.8mM L-グルタミン、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、0.5μM 2-メルカプトエタノールを含むRPMI 1640培地（培養液、CM）中で培養し、50 IU/mLの組換えヒトIL-2を添加した。10日目に、ビオチン標識抗EGFR mAbおよびストレプトアビジンビーズ（Miltenyi Biotec）を用いて、CAR陽性T細胞を濃縮した。濃縮されたCAR陽性T細胞は、γ線照射したEBV-LCLを1:7のレスポンダー/刺激因子比でCM中で培養し、1,4,7日目に50 IU/mL IL-2を添加して増殖させた。T細胞の表現型については、EBV-LCL拡張CAR-T細胞にγ線照射したCD19-K562細胞を1:1の割合で4週連続で刺激した。マウス実験のために、濃縮されたCAR陽性細胞は、使用前に7～10日間、1:1の比率で抗CD3/CD28ビーズで2回目の刺激を与えた。未導入のT細胞を、ウイルスの添加を除いて、導入されたT細胞に使用したのと同じ手順に従って並行して培養した。
　試験例3．抗がん効果の評価1
　試験例2で調製したCAR-T細胞（試験例1-1、試験例1-2、又は試験例1-3のコンストラクトを導入）の抗がん効果を評価した。具体的には以下のようにして行った。
　6～8週齢のオスNSG（NOD-SCID-common gamma chain-knock out）マウスに、0.5×106個のRaji-ffluc細胞を尾静脈経由で静脈内接種した。1週間後、マウスを1×106個のtEGFR導入細胞またはCD19CAR-T細胞（試験例2）を尾静脈経由で静脈内投与を行うことで治療した。生物発光イメージング（BLI）を、IVISスペクトラムシステムを用いて、腫瘍の進行を評価するために実施した。BLIの結果を図２に示し、生存曲線を図３に示す。
　図２及び３より、CD19.CD79a.40z.SH導入CAR-T細胞の抗がん効果は、CD19.28z.SH導入CAR-T細胞及びCD19.BBz.SH導入CAR-T細胞の抗がん効果よりも、高いものであった。
　試験例4．抗がん効果の評価2
　試験例2で調製したCAR-T細胞（試験例1-1、試験例1-2、試験例1-3、試験例1-4、又は試験例1-5のコンストラクトを導入）の抗がん効果を評価した。具体的には以下のようにして行った。
　6～8週齢のオスNSGマウスに、5x105個のホタル・ルシフェラーぜ遺伝子導入NALM6細胞を尾静脈経由で静脈内接種した。1週間後、マウスを2×106個のtEGFR導入細胞またはCD19CAR-T細胞（試験例2）を尾静脈経由で静脈内投与を行うことで治療した。生物発光イメージング（BLI）を、IVISスペクトラムシステムを用いて、腫瘍の進行を評価するために実施した。BLIの結果を図４及び５に示し、生存曲線を図６及び７に示す。図４及び６は、ショートヒンジのコンストラクト（試験例1-1、試験例1-2、試験例1-3のコンストラクト）を導入したCAR-T細胞の結果であり、図５及び７は、ロングヒンジのコンストラクト（試験例1-4、試験例1-5のコンストラクト）を導入したCAR-T細胞の結果である。
　図４～７より、ショートヒンジの場合の方が抗がん効果が高いことが分かった。また、中でも、CD79a.40z.SH導入CAR-T細胞の抗がん効果は、高いものであった。
　試験例5．抗がん効果の評価3
　試験例2で調製したCAR-T細胞（試験例1-1、試験例1-2、又は試験例1-3のコンストラクトを導入）の抗がん効果を評価した。具体的には、CAR-T細胞とCD37遺伝子導入K562(放射線照射した抗原陽性細胞)とを、1：1（CAR-T細胞；K562細胞）となるように混合し、共培養を行った。Day1,4,7,11にIL-2 50U/ml を加えて或いは加えずに培養を行い、生細胞数をカウントした。結果を図８に示す。
　図８より、IL-2を加えない場合及び加えた場合のいずれにおいても、CD19.CD79a.40z.SH導入CAR-T細胞の抗原刺激後のCAR-T細胞増殖は、CD19.28z.SH導入CAR-T細胞及びCD19.BBz.SH導入CAR-T細胞の抗原刺激後CAR-T細胞増殖よりも、高いものであった。
　試験例6．抗がん効果の評価4
　試験例2で調製したCAR-T細胞（試験例1-6、試験例1-7、又は試験例1-8のコンストラクトを導入）の抗がん効果を評価した。具体的には、CAR-T細胞とCD37遺伝子導入K562(放射線照射した抗原陽性細胞)とを、1：1（CAR-T細胞；K562細胞）となるように混合し、共培養を行った。Day1,4,7,11にIL-2 50U/ml を加えて培養を行い、生細胞数をカウントした。結果を図９に示す。
　図９より、CD37.CD79a.40z.SH導入CAR-T細胞の抗原刺激後のCAR-T細胞増殖は、CD37.28z.SH導入CAR-T細胞及びCD37.BBz.SH導入CAR-T細胞の抗原刺激後CAR-T細胞増殖よりも、高いものであった。
　試験例7．抗がん効果の評価5
　試験例2で調製したCAR-T細胞（試験例1-9、試験例1-10、又は試験例1-11のコンストラクトを導入）の抗がん効果を評価した。具体的には、CAR-T細胞とCD20遺伝子導入K562(放射線照射した抗原陽性細胞)とを、1：1（CAR-T細胞；K562細胞）となるように混合し、IL-2を添加せずに共培養を行い、生細胞数をカウントした。結果を図１０に示す。
　図１０より、CD20.CD79a.40z.SH導入CAR-T細胞の抗原刺激後のCAR-T細胞増殖は、CD20.28z.SH導入CAR-T細胞及びCD20.BBz.SH導入CAR-T細胞の抗原刺激後CAR-T細胞増殖よりも、高いものであった。

Claims (13)

  1. 抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、並びにCD79A細胞内ドメイン及びCD40細胞内ドメインを含む細胞内シグナルドメインを含み、且つ
    （A）前記抗原結合性ドメインと前記膜貫通ドメインとの間の構成アミノ酸残基数が100以下である、及び／又は
    （B）前記抗原結合性ドメインの標的抗原がCD19以外の抗原である、
    キメラ抗原受容体。
  2. 前記細胞内シグナルドメインが細胞内活性化ドメインを含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
  3. 前記細胞内活性化ドメインがCD3ζ細胞内ドメイン及びFcεRIγ細胞内ドメインからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
  4. 前記CD79A細胞内ドメイン、前記CD40細胞内ドメイン、及び前記細胞内活性化ドメインが、膜貫通ドメイン側からこの順に配置されている、請求項２又は３に記載のキメラ抗原受容体。
  5. 前記抗原結合性ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にIgGのヒンジ部又はその一部を含む、請求項１～４のいずれかに記載のキメラ抗原受容体。
  6. 前記構成アミノ酸残基数が1～30である、請求項１～５のいずれかに記載のキメラ抗原受容体。
  7. 前記抗原結合性ドメインの構造が単鎖抗体構造である、請求項１～６のいずれかに記載のキメラ抗原受容体。
  8. 前記抗原結合性ドメインの標的抗原がCD19、GD2、GD3、CD20、CD37、CEA、HER2、EGFR、type III mutant EGFR、CD38、BCMA、MUC-1、PSMA、WT1、cancer testis antigen、mutation peptide、hTERT、PRAM、TYRP1、メソテリン、PMEL、及びムチンからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１～７のいずれかに記載のキメラ抗原受容体。
  9. 請求項１～８のいずれかに記載の抗原受容体をコードする、ポリヌクレオチド。
  10. 請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
  11. リンパ球細胞である、請求項１０に記載の細胞。
  12. 請求項１０又は１１に記載の細胞を含有する、医薬組成物。
  13. がんの治療、予防、又は改善用である、請求項１２に記載の医薬組成物。
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