JPWO2020004337A1 - Cd37特異的キメラ抗原レセプター - Google Patents
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Abstract
Description
[1]CD37特異的な抗原認識領域を含む細胞外ドメインと、
前記抗原認識領域に直接、又は1〜30個のアミノ酸からなる直鎖状スペーサーを介して連結した膜貫通領域と、
前記膜貫通領域に連結した、免疫細胞のエフェクター機能のための細胞内シグナルドメインと、を含む、CD37特異的キメラ抗原レセプター。
[2]前記抗原認識領域が、抗CD37抗体の軽鎖可変領域(VL)と重鎖可変領域(VH)がリンカーで連結した構造の単鎖抗体である、[1]に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプター。
[3]前記スペーサーがヒトIgGのヒンジ部又はその一部からなる、[1]又は[2]に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプター。
[4]前記軽鎖可変領域が配列番号1のアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が配列番号2のアミノ酸配列を含む、[1]〜[3]のいずれか一項に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプター。
[5]前記細胞内シグナルドメインがCD3ζと共刺激分子の細胞内ドメインとを含む、[1]〜[4]のいずれか一項に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプター。
[6]前記共刺激分子がCD28又は4-1BBである、[5]に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプター。
[7]前記膜貫通領域がCD28の膜貫通領域である、[1]〜[6]のいずれか一項に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプター。
[8][1]〜[7]のいずれか一項に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプターをコードする遺伝子。
[9][8]に記載の遺伝子を発現可能に保持する組換え発現ベクター。
[10][1]〜[7]のいずれか一項に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプターを細胞表面上に発現した遺伝子改変リンパ球。
[11]リンパ球がT細胞である、[10]に記載の遺伝子改変リンパ球。
[12][10]又は[11]に記載の遺伝子改変リンパ球を治療上有効量含む、細胞製剤。
[13]以下の(1)〜(3)のステップを含む、標的認識能力が調節されたキメラ抗原レセプターの構造を決定する方法:
(1)抗原認識領域と膜貫通領域の間の距離が異なる複数のキメラ抗原レセプターを設計し、各々について、それを発現した遺伝子改変リンパ球を用意するステップ、
(2)各遺伝子改変リンパ球の標的認識レベルをin vitroで評価するステップ、
(3)最適な認識レベルを示した遺伝子改変リンパ球が発現するキメラ抗原レセプターの構造を選択するステップ。
[14]以下のステップ(4)を更に含む、[13]に記載の方法:
(4)選択された構造を基準とし、抗原認識領域と膜貫通領域の間の距離を最適化するステップ。
[15][13]又は[14]に記載の方法によって決定された構造を備える、標的認識能力が調節されたキメラ抗原レセプター。
[16][15]に記載のキメラ抗原レセプターをコードする遺伝子。
本発明の第1の局面はCD37特異的キメラ抗原レセプター(慣例に従い、キメラ抗原受容体を「CAR」と呼称することがある)に関する。CD37特異的キメラ抗原レセプターとは、CD37に特異的結合能(結合特異性)を示す細胞外ドメイン、膜貫通領域、及び免疫細胞のエフェクター機能のための細胞内シグナルドメインを含む構造体である。以下、各ドメインについて説明する。
本発明において細胞外ドメインはCD37特異的な結合性を示す。細胞外ドメインは、抗原の認識を担う抗原認識領域とスペーサー・ドメインに大別される。以下、抗原認識領域の詳細を説明するが、スペーサー・ドメインについては、便宜上、次の「(b)膜貫通領域」の項目の中で説明する。
膜貫通領域は、細胞外ドメインと細胞内シグナルドメインの間に介在する。膜貫通領域としては、CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4又は4-1BBなどの膜貫通領域を用いることができる。人工的に構築したポリペプチドからなる膜貫通領域を用いることにしてもよい。尚、膜貫通領域の具体例は後述の実施例に示される。実施例に示したものと機能的に同等のものを用いることもできる。
細胞内シグナルドメインは、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達する。即ち、細胞外ドメインがCD37と結合した際、免疫細胞の活性化に必要なシグナルを伝達することが可能な細胞内シグナルドメインが用いられる。細胞内シグナルドメインには、TCR複合体を介したシグナルを伝達するためのドメイン(便宜上、「第1ドメイン」と呼ぶ)と、共刺激シグナルを伝達するためのドメイン(便宜上、「第2ドメイン」と呼ぶ)が含まれる。第1ドメインとして、CD3ζの他、FcεRIγ等の細胞内ドメインを用いることができる。好ましくは、CD3ζが用いられる。また、第2ドメインとしては共刺激分子の細胞内ドメインが用いられる。共刺激分子としてCD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD4、CD5、CD134、OX-40又はICOSを例示することができる。好ましくは、CD28又は4-1BBの細胞内ドメインを採用する。
CARの細胞膜上への輸送を促すためにリーダー配列(シグナルペプチド)が用いられる。例えば、GM-CSFレセプターのリーダー配列を用いることができる。一方、膜貫通領域と細胞内シグナルドメインの間にスペーサー・ドメインを設けることにしてもよい。換言すれば、細胞内シグナルドメインを膜貫通領域に直接連結するのではなく、リンカー(通常はペプチドリンカー)を介して連結することにしてもよい。
本発明の第2の局面はCARをコードする遺伝子(以下、「CAR遺伝子」と呼称することがある)及びその利用(発現カセット、ベクター、CARを発現する遺伝子改変リンパ球の調製方法、CARを発現する遺伝子改変リンパ球及びその用途など)に関する。本発明のCAR遺伝子は上記構造のCARをコードする。従って、それを適当な細胞(CAR発現用細胞)に導入し、発現させることにより、本発明のCARを細胞表面に発現する遺伝子改変リンパ球(CAR遺伝子導入リンパ球)が得られる。CAR遺伝子導入リンパ球はCAR療法に利用することができる。CAR遺伝子の配列の具体例を配列番号3に示す。当該CAR遺伝子は、5'末端側から3'末端側に向かって、GM-CSFレセプターのリーダー配列(配列番号4)、VLをコードする領域(配列番号5)、リンカー配列(配列番号6)、VHをコードする領域(配列番号7)、抗CD37抗体由来の配列(gatcag)、ヒンジ部をコードする領域(スペーサー配列)(配列番号8)、CD28膜貫通領域をコードする領域(配列番号9)、CD28細胞内ドメインをコードする領域(配列番号10)、リンカー配列(GGCGGAGGG)及びCD3ζ細胞内ドメインをコードする領域(配列番号11)が直列的に並ぶ構造を備える。
本発明の更なる局面は、本発明の調製方法で得られた、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球(以下、「本発明のCAR遺伝子導入リンパ球」と呼ぶ)及びその用途に関する。本発明のCAR遺伝子導入リンパ球は、典型的には、CD37を高発現する腫瘍/がん(以下、「標的疾患」と呼ぶ)の治療、予防又は改善に広く利用され得る。標的疾患の例を挙げると、各種B細胞性悪性リンパ腫(B細胞性急性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、血管内B細胞性リンパ腫、CD20陽性ホジキンリンパ腫など)、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成/骨髄増殖性腫瘍(CMML,JMML,CML,MDS/MPN-UC)、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫等である。「治療」とは、標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること(軽症化)、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。「予防」とは、疾病(障害)又はその症状の発症/発現を防止又は遅延すること、或いは発症/発現の危険性を低下させることをいう。一方、「改善」とは、疾病(障害)又はその症状が緩和(軽症化)、好転、寛解、又は治癒(部分的な治癒を含む)することをいう。
本発明の別の局面はCARの設計技術に関する。具体的には、標的認識能力が調節されたCARの構造を決定する方法(以下、「CAR構造決定法」と呼ぶことがある)が提供される。本発明のCAR構造決定法は、正常細胞への反応性が抑えられた、安全性の高いCARの調製を可能とする。本発明のCAR構造決定法では以下の(1)〜(3)のステップが行われる。
(1)抗原認識領域と膜貫通領域の間の距離が異なる複数のキメラ抗原レセプターを設計し、各々について、それを発現した遺伝子改変リンパ球を用意するステップ
(2)各遺伝子改変リンパ球の標的認識レベルをin vitroで評価するステップ
(3)最適な認識レベルを示した遺伝子改変リンパ球が発現するキメラ抗原レセプターの構造を選択するステップ
各種腫瘍細胞株及び正常細胞におけるCD37の発現を調べた。CD37は主として分化したBリンパ球において高発現していることが報告されている。B細胞性悪性リンパ腫細胞株を含む各種腫瘍細胞株におけるCD37の発現をフローサイトメトリーで確認した。フローサイトメトリーの結果を図1に示す。B細胞性悪性リンパ腫株であるRaji、OCI-Ly1、SU-DHL10、Ramos、Daudi及びKARPAS1106Pでは強陽性である。多発性骨髄腫細胞株であるRPMI8226、KMS12BM及びMM1Sでは弱い発現が見られた(U266Hは多発性骨髄腫細胞株であるが発現が見られなかった)。一方で慢性骨髄性白血病由来細胞株であるK562やT細胞性白血病細胞株であるSUP-T1及びJurkatではほとんど発現が見られなかった(Molt-4では弱い発現が見られた)。B細胞性急性リンパ性白血病細胞株であるB-ALL1では発現は高かった。急性骨髄性白血病細胞株HL-60、Kasumi-1、MOLM-13、MV4-11、NOMO-1及びOCI-AML3では弱い発現が見られた。フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病細胞株であるNPhA1では発現は見られなかった。
正常B細胞およびB細胞性腫瘍に主として発現が見られるCD37に対するキメラ抗原レセプター(CAR)を設計・作成した。従来のCD19-CARの場合と同様に、抗CD37抗体の特異性に従ってCD37に結合することによりT細胞にシグナルが伝達され、標的細胞の傷害・サイトカイン放出・刺激後のT細胞分裂が起こることを期待した。前述の通り、CAR-T細胞療法には、細胞の調製が容易であること、抗体療法と比べて高い細胞傷害活性を示すこと、1回の治療でも十分な効果を期待できること、更には、HLA拘束性がないため、腫瘍細胞に標的抗原が陽性であれば、標的抗原陽性の全ての患者を対象として治療が可能であることなどの利点がある。
SUP-T1に対するロングスペーサータイプ(37L-HL、37L-LH)とショートスペーサータイプ(37S-HL、37S-LH)のそれぞれの遺伝子導入効率を検討した(図11の下二段)。いずれのタイプも1回の遺伝子導入で20〜35%の遺伝子導入効率が得られ、ロングスペーサーとショートスペーサーの間に遺伝子導入効率の差は見られなかった。一方で、健常人ドナー由来CD3への遺伝子導入効率(図11の上二段)は、CD37L-HL及びCD37L-LHのロングスペーサーを持つCD37-CARにおいて遺伝子導入効率が高かった。注目すべきことに、ロングスペーサータイプを遺伝子導入した細胞では培養中に死細胞が多数見られ、総細胞数も増えなかった(図12)。活性化したCD3上に発現する弱いCD37発現を認識してCD37CAR-T細胞同士の攻撃、いわゆる同士討ち(fractricide)が起こり、見かけ上遺伝子導入効率が高いものと考えられた。対照的にショートスペーサータイプ(CD37S-HL、CD37S-LH)に関しては死細胞はそれほど見られず、総細胞数の増加も良好であった(図12)。尚、ショートスペーサータイプについては、その後の検討によって(3日目及び4日目に遺伝子導入)、遺伝子導入効率50〜70%程度を達成している。
ショートスペーサータイプのCD37S-CAR-T細胞上に発現するCD37をQIFIKITを用いて定量化した(図16)。遺伝子導入マーカーのみを遺伝子導入した陰性コントロールでは1000-2000程度のCD37抗体の結合が見られたものの、CD37S-CAR-T細胞では約200程度のCD37抗体の結合に低下していた。このことは、CD37S-CAR-T細胞はこれ以上の発現のある細胞は認識してしまう可能性を示唆している。CD37L-CAR-T細胞では同士討ち現象が観察されていることから、標的抗原の認識の閾値はより低いものと予想された。
CD37S-CAR-T細胞を作成し、各種CD37陽性標的に対するサイトカイン産生能を評価した。腫瘍細胞株に関しては、CD37発現が低いもの(CD37抗体結合能で10000程度)であっても良好なサイトカイン産生能を示した(図17)。
健常ドナーの末梢血をCD37低発現分画とCD37高発現分画に分取した(図19)。分画した細胞(CD37高発現細胞、CD37低発現細胞)とCD37S-CAR-T細胞との反応性の検討を行なった(図20)。陽性コントロールはRamos細胞に対するサイトカイン産生を示すものである。陰性コントロールとして、遺伝子導入マーカー(tEGFR)のみを遺伝子導入した細胞とCD37低発現細胞分画との反応を3名のドナー由来細胞において示した。CD37S-CAR-T細胞はCD37低発現細胞分画との共培養ではサイトカインを産生しなかったが、CD37陽性分画との共培養では有意なサイトカイン産生を示した。図6に示したように正常ドナーのCD37低発現分画は3000-5000程度のCD37抗体結合部位を持っているため、図16に示したCD37S-CAR-T細胞上のCD37抗体結合部位よりは多い。認識が起こるか起こらないかは、単なるCD37抗体結合部位の多寡のみでは決定されない可能性が示唆された。
(1)CD37CAR-Tの構造を変化させることによって、標的の認識の閾値を変化させ得ることを示した。CD37のように、標的とする腫瘍細胞以外にも発現が見られる抗原をターゲットとしたCARの開発においてはCARの細胞外ドメインの構造を変化させることによって、必要とする程度の認識能力を得ることができる。従来、CD19-CARでも細胞外ドメインのスペーサーの長さを調節することで効果に差が出ることは知られていたが、長期的なin vivoでの効果の差を見ているにすぎず、直接的なin vitroでの効果の違いは検討されていなかった。今回、スペーサー・ドメインの長さの調節によって、in vitroでの認識できる抗原密度をコントロールし得ることを示した。このような制御は、他の標的に対するCARの開発にも利用でき、一般化し得ると考えられる。
(2)今回の成果はCD37CARに限らず、他の抗原を標的としたCARに応用可能である。真にがん特異的な抗原はこれまで得られておらず、これからも得られる見込みは少ない。すなわち今後もCAR-T細胞療法の標的抗原は多少の標的細胞外の発現は見込まなければならないことが予想される。そういった状況において新規のCARの開発にあたって安全性を担保するために、今回の検討で実証した「スペーサー・ドメイン構造の調節による標的抗原の認識閾値のコントロール」は、所望の標的認識レベルを得る手法として極めて有用と考えられる。今後、当該手法を利用又は応用することにより、正常細胞上にもある程度の発現が認められる抗原に対するCAR-Tの開発が可能になると考えられる。
1.スペーサーの長さが異なるCARの設計
CD37-CARのスペーサーの長さが抗原認識に与える影響を詳細に検討するため、以下に示す、スペーサーの長さが異なる複数のCD37-CARを作成した(以下のa〜f。図21も参照)。スペーサーにはIgG4のFcヒンジとCH2領域及びCH3領域を利用した。Fc側から徐々に延長したものとしてスペーサーを設計し、FcヒンジからCH3領域の最後までを持つものを最長のスペーサーとした。
a. スペーサーなし: CD37_00
b. スペーサー=15アミノ酸(配列番号13)(Fcヒンジ):CD37_15(CD37S-LHと同一)
c. スペーサー=30アミノ酸(配列番号20)(FcヒンジとCH2の一部):CD37_30
d. スペーサー=60アミノ酸(配列番号21)(Fcヒンジ、CH2の一部):CD37_60
e. スペーサー=125アミノ酸(配列番号22)(Fcヒンジ、CH2):CD37_125
f. スペーサー=232アミノ酸(配列番号23)(Fcヒンジ、CH2、CH3):CD37_232(CD37L-LHと同一)
CD37_00:配列番号24
CD37_15:配列番号17
CD37_30:配列番号25
CD37_60:配列番号26
CD37_125:配列番号27
CD37_232:配列番号28
0日目にCD3/CD28ビーズで刺激後、3日目にレトロウイルスを用いて遺伝子導入し、7日目に遺伝子導入マーカーを利用してCAR陽性細胞を選択した。選択した細胞をRamosで刺激し、細胞を増殖させた。
Claims (16)
- CD37特異的な抗原認識領域を含む細胞外ドメインと、
前記抗原認識領域に直接、又は1〜30個のアミノ酸からなる直鎖状スペーサーを介して連結した膜貫通領域と、
前記膜貫通領域に連結した、免疫細胞のエフェクター機能のための細胞内シグナルドメインと、を含む、CD37特異的キメラ抗原レセプター。 - 前記抗原認識領域が、抗CD37抗体の軽鎖可変領域(VL)と重鎖可変領域(VH)がリンカーで連結した構造の単鎖抗体である、請求項1に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプター。
- 前記スペーサーがヒトIgGのヒンジ部又はその一部からなる、請求項1又は2に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプター。
- 前記軽鎖可変領域が配列番号1のアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプター。
- 前記細胞内シグナルドメインがCD3ζと共刺激分子の細胞内ドメインとを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプター。
- 前記共刺激分子がCD28又は4-1BBである、請求項5に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプター。
- 前記膜貫通領域がCD28の膜貫通領域である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプター。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプターをコードする遺伝子。
- 請求項8に記載の遺伝子を発現可能に保持する組換え発現ベクター。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のCD37特異的キメラ抗原レセプターを細胞表面上に発現した遺伝子改変リンパ球。
- リンパ球がT細胞である、請求項10に記載の遺伝子改変リンパ球。
- 請求項10又は11に記載の遺伝子改変リンパ球を治療上有効量含む、細胞製剤。
- 以下の(1)〜(3)のステップを含む、標的認識能力が調節されたキメラ抗原レセプターの構造を決定する方法:
(1)抗原認識領域と膜貫通領域の間の距離が異なる複数のキメラ抗原レセプターを設計し、各々について、それを発現した遺伝子改変リンパ球を用意するステップ、
(2)各遺伝子改変リンパ球の標的認識レベルをin vitroで評価するステップ、
(3)最適な認識レベルを示した遺伝子改変リンパ球が発現するキメラ抗原レセプターの構造を選択するステップ。 - 以下のステップ(4)を更に含む、請求項13に記載の方法:
(4)選択された構造を基準とし、抗原認識領域と膜貫通領域の間の距離を最適化するステップ。 - 請求項13又は14に記載の方法によって決定された構造を備える、標的認識能力が調節されたキメラ抗原レセプター。
- 請求項15に記載のキメラ抗原レセプターをコードする遺伝子。
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