CN116033919A - 用于免疫细胞中衔接子的诱导型表达的系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于免疫细胞中衔接子的诱导型表达的系统，其包含a)诱导型基因表达系统，其包含I)第一核酸，其包含可操作地连接至第二核酸的诱导型启动子，II)所述第二核酸，其编码包含以下的衔接子i)第一(多)肽，其中所述第一(多)肽包含特异性结合抗原的抗原结合结构域，ii)第二(多)肽，其中所述第二(多)肽结合至嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，b)第三核酸，其编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR，其中所述CAR包含i)对所述衔接子的所述第二(多)肽具有特异性的所述抗原结合结构域，ii)跨膜结构域，iii)胞内信号转导结构域。基因表达系统可以是抗原激活的或药物诱导的。该系统可以是单细胞或双细胞方法。

Description

用于免疫细胞中衔接子的诱导型表达的系统
技术领域
本发明一般地涉及在免疫细胞上表达的嵌合抗原受体(CAR)领域，特别地涉及衔接子CAR(抗标签CAR)技术和相应标记的衔接子分子的调控表达的组合。
背景技术
CAR免疫细胞(如CAR T细胞)的过继转移已在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得显著成功。然而，缺乏对CAR免疫细胞功能的控制以及由此造成的患者过度炎症会导致严重的副作用，尤其是当靶向肿瘤相关抗原而非肿瘤特异性抗原时。因此，CAR活动的时间、可调谐和空间控制至关重要。
衔接子CAR免疫细胞(如衔接子CAR T细胞)基于靶抗原识别和激活结构域解离成两个互补部分，从而提供了增强CAR免疫细胞系统安全性和灵活性的进一步的策略。抗标签CAR免疫细胞不直接识别肿瘤抗原，但免疫细胞特异性地被赋予与抗原结合分子融合的标签，将其称为衔接子或衔接子分子。例如，在WO2012082841A2、WO2013044225A1和WO2016030414A1中描述了通过衔接子间接结合到靶细胞的这种“通用”CAR系统(或衔接子CAR(adCAR)系统)。抗原的识别严格取决于给予控制的衔接子分子的存在，以及通过减弱衔接子分子施用来暂时开启/关闭CAR介导的功能的可能性。此外，可以通过调整衔接子浓度来微调应答的程度。然而，由于功能性取决于衔接子分子的存在，患者接受衔接子分子的常规注射，这可能与副作用和患者的压力升高有关。此外，衔接子分子的符合GMP的集中生产、配制、储存和运输是时间和成本密集型的。限制衔接子CAR免疫细胞效力的最相关挑战是系统施用后衔接子分子在肿瘤中的组织渗透受限和异质分布。
Ambrose等开发了一种CAR-CD19 T细胞，其组成型地分泌CD19-抗Her2桥接蛋白。这种细胞治疗策略利用靶向CD19的CAR T细胞与正常B细胞上的CD19相互作用的能力来驱动扩增、持久性和适应性。分泌的桥接蛋白与Her2阳性肿瘤细胞有效结合，在体外和体内介导CAR-CD19 T细胞的细胞毒性(Doi:10.1101/2020.03.25.007658)。
WO2017075537A1公开了一种细胞，其包含编码融合蛋白的组成型表达构建体，所述融合蛋白包含(a)结合肿瘤抗原的抗原结合蛋白或片段；和(b)细胞治疗、抗体或抗体药物缀合物的多肽靶点。
WO2018156802A1公开了一种细胞，其包含编码融合蛋白的组成型表达构建体，所述融合蛋白包含(a)结合肿瘤抗原的抗原结合蛋白或片段；和(b)结合细胞治疗、抗体或抗体药物缀合物的抗原结合结构域的抗独特型抗体或片段或者抗独特型肽。
WO2019199689A1中，公开了包含单一病毒载体的工程化免疫细胞，所述单一病毒载体包含第一多核苷酸，所述第一多核苷酸包含与编码至少一种转基因(例如，CAR)的核酸可操作地连接的组成型启动子；和第二多核苷酸，所述第二多核苷酸包含可操作地连接至编码效应物的核酸的诱导型启动子。
本领域需要改进的或可替代的衔接子CAR免疫细胞系统，其包含衔接子CAR和由免疫细胞表达的衔接子。
发明内容
为了克服与符合GMP的集中生产以及向患者局部递送和注射衔接子分子相关的限制，将向肿瘤传递的免疫细胞如CAR T细胞或肿瘤浸润性T细胞(TIL)，工程化为以诱导剂依赖的方式表达适合于衔接子CAR的衔接子，从而用作衔接子原位递送的载体。诱导型基因表达系统可以是“抗原激活的诱导型基因表达系统”，即，当抗原/配体通过细胞受体(如CAR或TCR)直接结合或在MHC呈递时，诱导型表达系统可以在具有所述诱导型基因表达系统的细胞中被激活。抗原/配体与受体的所述结合可在细胞内诱导信号级联，随后可导致诱导引入的基因(或转基因)(本文指衔接子)的表达。可替代地，诱导型基因表达系统可以是药物诱导型基因表达系统，即，当药物例如合成药物(如他莫昔芬)可被引入细胞时，可在具有所述诱导型基因表达系统的细胞中激活诱导型基因表达系统。细胞中的所述药物可与合成转录因子结合，并且随后可导致转基因(本文指衔接子)表达的诱导。两种类型的诱导型基因表达系统可用于单细胞和/或双细胞系统。虽然细胞载体对衔接子的组成型表达不允许调节衔接子表达，从而控制患者中的衔接子CAR细胞功能，但“载体细胞”对衔接子分子的药物依赖性表达控制允许衔接子分子分泌的时间和可调谐控制，使得例如：
I)通过将CAR细胞免疫活性限制于衔接子的时间控制分泌来控制CAR免疫细胞活性的开启和关闭
ii)精确调节肿瘤部位的衔接子浓度，从而微调CAR免疫细胞活性。
此外，在局部受限抗原的情况下，“抗原激活的诱导型基因表达系统”提供了优势：即衔接子分泌仅限于抗原表达的区域(例如，实体瘤)，因为激活诱导的信号转导依赖于同源抗原的T细胞接合(依赖于TCR/CD3通路的信号转导)，从而提供衔接子浓度的改进的空间调节。相反，衔接子的组成型表达可导致全身释放，从而增加不希望的全身毒性的风险。
附图说明
图1：衔接子分泌的激活诱导系统的示意图
用激活诱导型表达盒，即基因表达系统(称为激活诱导型细胞)修饰免疫细胞，由此响应TCR/CAR介导的信号传导的启动子驱动衔接子分子的表达。这些细胞可根据其对肿瘤抗原、癌病毒抗原或针对肿瘤新抗原的反应性进行选择。或者，可以用对任何上述抗原类别具有特异性的CAR或TCR转导T细胞。在TCR/CAR识别TAA、癌病毒或肿瘤新抗原后，TCR反应性启动子驱动抗肿瘤衔接子分子的表达。这些标记的衔接子分子对肿瘤抗原具有特异性。衔接子分子的标签部分(在这种情况下，例如：6xHis标签)被衔接子CAR(在这种情况下，抗His6特异性CAR)的胞外识别结构域识别，其由第二免疫细胞表达。标记的衔接子分子构成一个桥接分子，其将衔接子CAR细胞重定向到肿瘤。因此，肿瘤细胞被衔接子CAR细胞裂解。
图2：衔接子分泌的药物诱导系统的示意图
用药物诱导型基因表达盒(称为药物诱导型细胞)修饰免疫细胞。在“关”状态下，这些可诱导细胞无法与未修饰的免疫细胞区分开来。在药物作为诱导剂施用后，诱导型表达盒被激活，标记的衔接子分子由免疫细胞表达和分泌。分泌的标记的衔接子分子的浓度可以通过诱导剂药物浓度来调节。这些标记的衔接子分子对肿瘤抗原具有特异性。衔接子分子的标签部分(在这种情况下：6xHis标签)被衔接子CAR(在这种情况下：抗His6特异性CAR)的胞外识别结构域识别，其由第二免疫细胞表达。标记的衔接子分子构成一个桥接分子，其将衔接子CAR细胞重定向到肿瘤。因此，肿瘤细胞被衔接子CAR细胞裂解。His-衔接子CAR T细胞的抗肿瘤活性取决于His标记的肿瘤特异性衔接子分子的存在。在肿瘤部位诱导后诱导型抗CD19 Fab T细胞产生衔接子分子。
图3：通过原代T细胞的抗CD19 Fab-His6分泌的诱导。
用诱导型抗CD19-Fab构建体诱导T细胞，并在不同浓度的4-OHT存在下培养48h。随后使用T细胞上清液和抗His-APC作为二抗对CD19+Raji细胞进行染色。通过从标准曲线外推，测定的平均荧光强度与Fab浓度相关。通过诱导型T细胞的His6标记的抗CD19-Fab分泌的诱导严格依赖于诱导剂药物4-OHT的存在。随着4-OHT浓度的升高，在T细胞培养物的上清液中检测到的His6标记的抗CD19-Fab的数量也增加。
图4：与Raji细胞共培养的抗His衔接子CAR T细胞的细胞裂解活性取决于诱导型抗CD19 Fab T细胞和诱导剂药物4-OHT的存在。
在1x104个抗CD19 Fab诱导型T细胞的存在下，在用诱导剂药物4-OHT诱导时，其分泌衔接子分子His标记的CD19 Fab，将抗His衔接子CAR T细胞与CD19+Raji细胞以2:1的E:T比例共培养(●符号)。CD19+Raji细胞的特异性裂解仅在至少1nM 4-OHT存在下的CD19+Raji细胞、衔接子CAR T细胞和诱导型T细胞的共培养物中被检测到。在添加至少10nM 4.OHT后获得了最大特异性裂解。将在抗CD19 Fab诱导型T细胞存在下的未转导T细胞和CD19+Raji的共培养物(■符号)以及诱导型抗CD19 Fab T细胞和CD19+Raji的共培养物(▲符号)被用作阴性对照，两者都表明肿瘤细胞的裂解不能由衔接子分子自身诱导，而是需要同时存在抗-His衔接子CAR T细胞。在测定开始后6天通过
Figure BDA0004106062420000051
分析仪对活Raji细胞进行定量，来测定肿瘤细胞的特异性裂解。
图5：在与Raji细胞共培养中的衔接子CAR T细胞的激活取决于诱导型抗CD19 FabT细胞和诱导剂药物4-OHT的存在。在1x104个诱导型T细胞的存在下，在用诱导剂药物4-OHT诱导时，其分泌衔接子分子His标记的CD19 Fab，将抗His衔接子CAR T细胞与CD19+Raji细胞以2:1的E:T比例共培养(●符号)。T细胞上的PD-1表达仅在至少10nM 4-OHT存在下的CD19+Raji细胞、衔接子CAR T细胞和诱导型T细胞的共培养物中被检测到，并且PD-1阳性T细胞的频率随着4-OHT浓度的升高而增加。在添加至少50nM 4.OHT后获得了PD-1阳性细胞的最大频率。在抗CD19 Fab诱导型T细胞存在下的未转导的T细胞和CD19+Raji的共培养物(■符号)以及诱导型抗CD19 Fab T细胞和CD19+Raji的共培养物(▲符号)被用作阴性对照，两者都表明T细胞的激活(如由PD-1表达所示)不能由衔接子分子自身诱导，而是需要同时存在抗-His衔接子CAR T细胞。在测定开始后第2天通过用抗PD-1-PE-Vio770染色共培养物来测定定PD-1表达T细胞的频率。
具体实施方式
在第一个方面中，本发明提供了一种用于免疫细胞中衔接子(或者衔接子分子或标记多肽)的诱导型表达的系统(或者核酸的组合)，其包含
a)诱导型基因表达系统，其包含I)第一核酸，其包含可操作地连接至第二核酸的诱导型启动子
II)所述第二核酸，其编码包含以下的衔接子
i)第一(多)肽，其中所述第一(多)肽包含特异性结合抗原的抗原结合结构域，
ii)第二(多)肽，其中所述第二(多)肽结合至嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，
b)第三核酸，其编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR，
其中所述CAR包含
i)对所述衔接子的所述第二(多)肽具有特异性的所述抗原结合结构域
ii)跨膜结构域
iii)胞内信号转导结构域。
对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR可以在细胞中组成型表达，或者所述表达可以在细胞中诱导。
所述抗原可以是在靶细胞表面上表达的抗原。
所述抗原可以是肿瘤相关抗原(TAA)且所述靶细胞可以是肿瘤细胞。
所述抗原可以由肿瘤微环境的细胞表达。
所述抗原可以是感染性病原体相关抗原(例如，来自人免疫缺陷病毒或其他病毒)且所述靶细胞可以是病原体感染的细胞。
可与嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域结合的衔接子的所述第二(多)肽也可以称为“标签”，且对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR也可以称为抗标签CAR或衔接子CAR(adCAR)或通用CAR。
标签可以是包含至少4个氨基酸的(多)肽。
标签可以是包含至少4个氨基酸并且不超过8、10、15、20、25或30个氨基酸的肽。
标签可以包含蛋白的表位。
标签可以包含在受试者中或在受试者的循环系统中天然存在的蛋白的表位。
标签可以包含新抗原的表位，其中所述表位包含抗原突变。
标签可以包含肿瘤发生中可能出现的新抗原的表位，其中所述表位包含抗原突变。
标签可以包含新抗原的表位，其中所述表位包含抗原突变，其中所述抗原可以是在受试者中或在受试者的循环系统中天然存在的蛋白。
标签可以是不在受试者中天然存在的(多)肽。
标签可以是不在受试者的循环系统中天然存在的(多)肽。
标签可以是不在健康受试者的循环系统中天然存在的(多)肽。
标签可以是例如以下肽之一：c-Myc-标签、Strep-标签II、Flag-标签、多组氨酸-标签、Avi-标签、钙调蛋白结合蛋白-标签、Yol-标签(源自α微管蛋白)、E-标签、HA-标签、S-标签、SBP-标签或V5标签。
c-Myc-标签可以包含SEQ ID NO:1。
Strep-标签II可以包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
Flag-标签可以包含SEQ ID NO:4。
多组氨酸-标签可以包含SEQ ID NO:5。
多组氨酸-标签可以包含SEQ ID NO:5。
Avi-标签可以包含SEQ ID NO:6。
钙调蛋白结合蛋白-标签可以包含SEQ ID NO:7。
E-标签可以包含SEQ ID NO:8。
HA-标签可以包含SEQ ID NO:9。
S-标签可以包含SEQ ID NO:10。
SBP-标签可以包含SEQ ID NO:11。
V5-标签可以包含SEQ ID NO:12。
标签可以是Yol-标签(源自α微管蛋白)。Yol标签可以包含SEQ ID NO:13。
用于衔接子的诱导型表达的所述系统，其中所述诱导型基因表达系统是抗原激活的诱导型基因表达系统，其中当具有所述诱导型基因表达系统的细胞可以被所述抗原激活时，所述诱导型启动子可以是能够驱动所述衔接子表达的抗原激活的诱导型启动子。
诱导抗原激活的诱导型基因表达系统的所述抗原/抗原激活的诱导型启动子不是结合至所述衔接子的第一(多)肽的相同抗原。与结合至所述衔接子的第一(多)肽相比，诱导抗原激活的诱导型基因表达系统的所述抗原/抗原激活的诱导型启动子可以是不同的抗原。
用于衔接子的诱导型表达的所述系统，其中结合至所述衔接子的第一(多)肽的所述抗原和诱导抗原激活的诱导型启动子的所述抗原是不同的。
通过抗原的细胞的所述激活可以是所述细胞受体的信号转导结构域的激活，例如，CAR或TCR的胞内信号转导结构域的激活，所述抗原可以是细胞表面上的抗原、可溶性抗原或MHC呈递的抗原。
被细胞信号转导通路/级联激活/诱导的所述抗原激活的诱导型启动子可以是细胞表面蛋白启动子(例如，CD69启动子)、细胞因子启动子(例如，TNF启动子、IL-2启动子)、细胞激活蛋白启动子(例如，CTLA4、OX40、CD40L)或细胞表面粘附蛋白启动子，或这些启动子的功能部分。
可与编码所述衔接子的所述第二核酸可操作地连接的抗原激活的诱导型启动子(包含诱导型启动子的第一核酸)可以是任何启动子，其激活响应于当免疫细胞被特异性激活时增加的转录因子，例如SP1、BATF、AP-1、IRF4、RUNX、NFAT、NF-κB、STAT5或STAT3传感启动子和可操作地连接到诱导型增强子的最小启动子，如例如WO2019199689A1中所述。NFAT诱导型启动子可以与特异性结合特定转录因子的任何诱导型启动子交换。不希望受到理论的束缚，如果NFAT应答元件存在，其需要诱导NFAT信号转导的来自TCR/CAR或其他免疫受体的信号。
抗原激活的诱导型启动子可以包含最小启动子(PMIN)。可以使用替代的最小启动子，例如最小TATA盒启动子、最小CMV启动子或最小IL-2启动子。在一些实施方式中，可以针对所需的转录水平或速率对最小启动子进行优化。
用于衔接子的诱导型表达的所述系统，其中所述诱导型基因表达系统是药物诱导型表达系统且所述诱导型启动子是药物诱导型启动子，其中所述诱导型基因表达系统还包含编码用于所述药物诱导型启动子的合成转录因子的核酸，其中当向具有所述诱导型基因表达系统的细胞施用药物时，基因表达系统被诱导且衔接子被表达。
所述药物可以是合成药物。
所述合成转录因子可以包含DNA结合结构域和药物结合结构域和激活结构域，其中所述合成转录因子可以通过与所述药物结合而被激活。
编码所述合成转录因子的所述核酸可以与组成型启动子可操作地连接。
例如，组成型启动子可以是EF-lα启动子或驱动免疫细胞中组成型表达的任何其他组成型启动子(例如MSCV、PGK-l、UBC、CMV、CAGG、SV40或泛造血启动子，如vav)。
所述合成转录因子可以例如包含转录因子的DNA结合蛋白或DNA结合结构域(野生型或工程化的结构域，例如，锌指蛋白或POU蛋白)、核受体和激活结构域，并且其中所述药物可以是所述核受体的配体。
所述核受体可以是例如雌激素受体(ER)、孕激素(PR)受体、视黄醇X受体或果蝇蜕皮激素受体。
优选地，所述合成转录因子可以包含锌指蛋白、核受体和激活结构域，并且其中所述药物可以是所述核受体的配体。
所述合成转录因子可以包含锌指蛋白、雌激素受体(ER)和激活结构域，并且其中所述药物可以是他莫昔芬或他莫昔芬代谢产物。
所述激活结构域可以是例如单纯疱疹病毒蛋白VP16、VP16的最小激活结构域VP64的四聚体重复序列、其来源于人内源性转录因子NFκB的p65结构域，或者是包含人内源性转录因子NF-κB的p65结构域的序列部分和人热休克因子1的序列部分的融合蛋白。
所述他莫昔芬代谢产物可以是因多昔芬(endoxifen)或4-羟基他莫昔芬(4-OHT)。
所述ER可以是具有点突变的ER，例如鼠ER(G525R或G521R)、人ER(G400V、M543A、L540A)或人ER(G400V、M543A、L544A)。
所述药物诱导型启动子可以是包含锌指结合基序和最小启动子的杂合启动子，所述最小启动子包括例如选自下组的最小启动子：E1b、TK、IL2、CMV、SV40或者任何最小TATA盒启动子。
用于衔接子的诱导型表达的所述系统，其中所述合成转录因子是锌指蛋白。
用于衔接子的诱导型表达的所述系统，其中所述合成转录因子是锌指蛋白，并且其中衔接子的表达水平取决于施用至所述细胞的药物的量和/或用于药物诱导型启动子内的合成转录因子的DNA结合的结合位点(锌指结合基序)的数量，从而允许对衔接子的表达进行可调谐控制。
用于衔接子的诱导型表达的所述系统，其中所述诱导型基因表达系统和编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR的所述核酸可以存在于一个(或相同的)免疫细胞中。
用于衔接子的诱导型表达的所述系统，其中所述诱导型基因表达系统可以存在于第一免疫细胞中，并且编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR的所述核酸可以存在于第二免疫细胞中(在不同的免疫细胞中)。
用于衔接子的诱导型表达的所述系统，其中所述诱导型基因表达系统是如本文所公开的抗原激活的诱导型基因表达系统，并且其中所述抗原激活的诱导型基因表达系统可以存在于第一免疫细胞中且其中所述第一免疫细胞可以包含对其他抗原具有特异性的CAR，其中所述CAR可以包含
i)对所述其他抗原具有特异性的所述抗原结合结构域
ii)跨膜结构域
iii)胞内信号转导结构域，和/或
其中所述第一免疫细胞可包含对其他抗原具有特异性的TCR；
并且其中编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR的所述核酸可以存在于第二免疫细胞中(在不同的免疫细胞中)，
所述其他抗原可以是在其他靶细胞的表面上或在所述(第一)靶细胞上表达的其他抗原，或者可以是可溶性抗原。
所述可溶性抗原可以是
I)肿瘤微环境(TME)的可溶性抗原，或
II)与自身免疫性疾病特异性相关的可溶性抗原，或
III)与过敏性疾病特异性相关的可溶性抗原，或
IV)与感染性疾病特异性相关的可溶性抗原，或
V)与受试者中移植物排斥特异性相关的可溶性抗原。
所述其他抗原可以是其他TAA且所述靶细胞可以是所述肿瘤细胞。
所述其他抗原可以由肿瘤微环境的细胞例如肿瘤相关成纤维细胞表达。
所述其他抗原可以是与肿瘤细胞相关的，或者更一般地在感染性疾病(例如，人免疫缺陷病毒)中的人感染性病原体来源的抗原(例如，来自Epstein-Barr病毒、人乳头瘤病毒、人巨细胞病毒或其他病毒的癌病毒抗原)。
所述第一免疫细胞和所述第二免疫细胞可以是相同类型的免疫细胞，例如，T细胞(例如，CD4 T细胞和/或CD8 T细胞)或NK细胞。
所述第一免疫细胞和所述第二免疫细胞可以是不同类型的免疫细胞，例如，第一免疫细胞可以是T细胞且第二免疫细胞可以是NK细胞，或者
所述第一细胞可以是例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)且所述第二免疫细胞可以是T细胞或NK细胞。
在另一个方面中，本发明提供了一种免疫细胞，其包含
a)诱导型基因表达系统，其包含
I)第一核酸，其包含可操作地连接至第二核酸的诱导型启动子
II)所述第二核酸，其编码包含以下的衔接子
i)第一(多)肽，其中所述第一(多)肽包含特异性结合抗原的抗原结合结构域，
ii)第二(多)肽，其中所述第二(多)肽结合至嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，
b)第三核酸，其编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR，
其中所述CAR包含
i)对所述衔接子的所述第二(多)肽具有特异性的所述抗原结合结构域
ii)跨膜结构域
iii)胞内信号转导结构域。
所述衔接子可以是分泌型衔接子。
所述衔接子可以由所述免疫细胞分泌。
所述衔接子可以包含用于分泌的信号肽。
所述免疫细胞可以是T细胞或NK细胞。
所述免疫细胞，其中所述诱导型表达系统是抗原激活的诱导型表达系统，其中所述诱导型启动子可以是，当具有所述诱导型基因表达系统的细胞可以被所述抗原激活时，能够驱动所述衔接子表达的抗原调节的诱导型启动子。
所述免疫细胞，其中所述诱导型基因表达系统可以是药物诱导型表达系统且所述诱导型启动子可以是药物诱导型启动子，其中所述诱导型基因表达系统还可以包含编码用于所述药物诱导型启动子的合成转录因子的核酸，其中当药物可施用于所述免疫细胞时，基因表达系统可以被激活/诱导，并且衔接子可以被表达。
所述免疫细胞，其中所述合成转录因子可以包含DNA结合结构域和药物结合结构域和激活结构域，其中所述合成转录因子可以通过与所述药物结合而被激活。
如本文所公开的所述免疫细胞用于医疗。
所述免疫细胞用于治疗癌症。
所述免疫细胞用于治疗白血病。
所述免疫细胞用于治疗实体瘤。
所述实体瘤可以是肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、儿童或成人中的脑/CNS肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤因家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌、喉和下咽癌、白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性粒单核细胞白血病、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺类癌瘤、淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔或口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体肿瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌、肉瘤、基底皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、黑素瘤、默克尔细胞皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症或维尔姆斯瘤。
所述免疫细胞用于治疗感染性疾病。
在另一个方面中，本发明提供了一种组合物，其包含
a)第一免疫细胞，其包含诱导型基因表达系统，其包含
I)第一核酸，其包含可操作地连接至第二核酸的诱导型启动子
II)所述第二核酸，其编码包含以下的衔接子
i)第一(多)肽，其中所述第一(多)肽包含特异性结合抗原的抗原结合结构域，
ii)第二(多)肽，其中所述第二(多)肽结合至嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，
b)第二免疫细胞，其包含编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR的核酸，
其中所述CAR包含
i)对所述衔接子的所述第二(多)肽具有特异性的所述抗原结合结构域
ii)跨膜结构域
iii)胞内信号转导结构域。
所述组合物，其中所述诱导型基因表达系统可以是药物诱导型基因表达系统且所述诱导型启动子可以是药物诱导型启动子，其中所述诱导型基因表达系统还可以包含编码用于所述药物诱导型启动子的合成转录因子的核酸，其中当可以向所述免疫细胞施用药物时，基因表达细胞可以被激活/诱导并且衔接子可以被表达，并且其中所述组合物可以包含c)所述药物。
如本文所公开的所述组合物，其中所述合成转录因子可以包含DNA结合结构域和药物结合结构域和激活结构域，其中所述合成转录因子可以通过与所述药物结合而被激活。
在本发明的一个实施方式中，组合物可以包含
a)第一免疫细胞，其包含诱导型基因表达系统，其包含
I)第一核酸，其包含可操作地连接至第二核酸的诱导型启动子
II)所述第二核酸，其编码包含以下的衔接子
i)第一(多)肽，其中所述第一(多)肽包含特异性结合抗原的抗原结合结构域，
ii)第二(多)肽，其中所述第二(多)肽结合至嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，
b)第二免疫细胞，其包含编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR的核酸，
其中所述CAR包含
i)对所述衔接子的所述第二(多)肽具有特异性的所述抗原结合结构域
ii)跨膜结构域
iii)胞内信号转导结构域
其中所述第一免疫细胞可以包含对其他抗原具有特异性的CAR，对所述其他抗原具有特异性的所述CAR可以包含
i)对所述其他抗原具有特异性的抗原结合结构域
ii)跨膜结构域
iii)胞内信号转导结构域，
其中所述诱导型启动子可以是，当对所述其他抗原具有特异性的所述CAR的抗原结合结构域结合至所述其他抗原时，能够驱动所述衔接子的表达的抗原激活的诱导型启动子，从而激活所述第一免疫细胞。
在本发明的另一个实施方式中，组合物可以包含
a)第一免疫细胞，其包含诱导型基因表达系统，其包含
I)第一核酸，其包含可操作地连接至第二核酸的诱导型启动子
II)所述第二核酸，其编码包含以下的衔接子
i)第一(多)肽，其中所述第一(多)肽包含特异性结合抗原的抗原结合结构域，
ii)第二(多)肽，其中所述第二(多)肽结合至嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，
b)第二免疫细胞，其包含编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR的核酸，
其中所述CAR包含
i)对所述衔接子的所述第二(多)肽具有特异性的所述抗原结合结构域
ii)跨膜结构域
iii)胞内信号转导结构域
其中所述第一免疫细胞可以包含对其他抗原具有特异性的TCR，
其中所述诱导型启动子可以是，当对所述其他抗原具有特异性的所述TCR结合至所述其他抗原时，能够驱动所述衔接子的表达的抗原激活的诱导型启动子，从而激活所述第一免疫细胞。
如本文所公开的所述组合物用于医疗。
所述组合物用于治疗癌症。
所述组合物用于治疗白血病。
所述组合物用于治疗实体瘤。
所述组合物用于治疗感染性疾病。
在一个其他方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文所公开的组合物和任选的药学上可接受的载体。
药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂可以包括缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。
在一个其他方面中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括
A)向所述受试者施用免疫细胞，所述免疫细胞包含
a)诱导型基因表达系统，其包含
I)第一核酸，其包含可操作地连接至第二核酸的诱导型启动子
II)所述第二核酸，其编码包含以下的衔接子
i)第一(多)肽，其中所述第一(多)肽包含特异性结合抗原的抗原结合结构域，
ii)第二(多)肽，其中所述第二(多)肽结合至嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，
b)核酸，其编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR，
其中所述CAR包含
i)对所述衔接子的所述第二(多)肽具有特异性的所述抗原结合结构域
ii)跨膜结构域
iii)胞内信号转导结构域。
所述方法，其中所述诱导型启动子是，当所述免疫细胞被所述抗原激活时，能够驱动所述衔接子的表达的抗原激活的诱导型启动子。
所述方法，其中所述方法包括
B)向所述受试者施用药物，
其中所述诱导型基因表达系统是药物诱导型表达系统且所述诱导型启动子是药物诱导型启动子，其中所述诱导型基因表达系统还包含编码用于所述药物诱导型启动子的合成转录因子的核酸，其中当向所述免疫细胞施用所述药物时，基因表达系统被诱导且衔接子被表达。
所述方法，其中所述合成转录因子包含DNA结合结构域和药物结合结构域和激活结构域，其中所述合成转录因子通过与所述药物结合而被激活。
所述方法，其中所述药物可以在施用所述免疫细胞的同时、之前或之后施用。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括
A)向所述受试者施用第一免疫细胞，所述免疫细胞包含
a)诱导型基因表达系统，其包含
I)第一核酸，其包含可操作地连接至第二核酸的诱导型启动子
II)所述第二核酸，其编码包含以下的衔接子
i)第一(多)肽，其中所述第一(多)肽包含特异性结合抗原的抗原结合结构域，
ii)第二(多)肽，其中所述第二(多)肽结合至嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，
B)向所述受试者施用第二免疫细胞，其包含编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR的核酸，
其中所述CAR包含
i)对所述衔接子的所述第二(多)肽具有特异性的所述抗原结合结构域
ii)跨膜结构域
iii)胞内信号转导结构域。
所述方法，其中所述方法包括
C)向所述受试者施用药物，
其中所述诱导型基因表达系统是药物诱导型表达系统且所述诱导型启动子是药物诱导型启动子，其中所述诱导型基因表达系统还包含编码用于所述药物诱导型启动子的合成转录因子的核酸，其中当向所述免疫细胞施用所述药物时，基因表达系统被诱导且衔接子被表达。
所述方法，其中所述合成转录因子包含DNA结合结构域和药物结合结构域和激活结构域，其中所述合成转录因子通过与所述药物结合而被激活。
所述方法，其中所述药物可以在施用所述免疫细胞的同时、之前或之后施用。
所述方法，其中当所述第一免疫细胞激活时，所述诱导型启动子能够驱动所述衔接子的表达。
本文中关于本文所公开的本发明的第一个方面所定义的所有定义、特征和实施方式也在本文所公开本发明的其他方面的上下文中进行必要的修改。
定义
除非另有定义，否则此处使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”用于指组合物、方法及其各自的组分，其对于所述方法或组合物是必不可少的，但对于包括未指定的要素是开放的，无论其是否是必不可少的。
术语“用于免疫细胞中衔接子的诱导型表达的系统”指在如本文所公开的单细胞群或双细胞群中的核酸组合。在此背景下，术语“系统”可以与“核酸的组合”或“核酸的组合物”互换使用。
在通常情况下，CAR可以包含胞外域(胞外部分)，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号转导结构域(胞内信号转导结构域)。胞外域可以通过接头或间隔区连接至跨膜结构域。胞外域还可以包含信号肽。在本发明的一些实施方式中，CAR的抗原结合结构域结合与(多)肽偶联的标签(“标记的”多肽或衔接子包含如本文所公开的所述第一(多肽)和如本文所公开的所述第二(多)肽)，其中标记的多肽可以与疾病相关抗原结合，如可以在癌症细胞表面表达的肿瘤相关抗原(TAA)或由肿瘤微环境细胞表达的抗原或可以由病原感染细胞表达的感染相关抗原。
可以结合至如本文所公开的嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域的衔接子的所述第二(多)肽也可以称为(标记的多肽的)“标签”和对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR也可以称为抗-标签CAR或衔接子CAR(adCAR)或“通用CAR”。
此类抗-标签CAR是例如在US9233125B2中公开的。
通常，抗-标签CAR的标签可以直接或间接偶联至多肽(标记的多肽)，其中多肽可以结合至在靶点的(细胞)表面上表达的所述疾病相关抗原。通常标签可以是例如葡聚糖或半抗原，如生物素或荧光素异硫氰酸酯(FITC)或藻红蛋白(PE)或硫胺素。但是作为本发明的衔接子的一部分的标签通常可以是(多)肽(如本文所公开的衔接子的第二(多)多肽)，其可以通过引入所述免疫细胞的外源核酸序列的转录和翻译在免疫细胞中产生。
标签可以是包含至少4个氨基酸的(多)肽。
标签可以是(多肽)，其包含至少4个氨基酸且不超过8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或200个氨基酸。
相对于通常的(多)肽，该标签在人类中可能具有高蛋白水解稳定性和低免疫原性。
标签可以位于所述第一多肽的N末端或C末端处或在其附近。
标签可以进一步被整合在所述第一多肽的序列中，因此不位于所述第一肽的N末端或C末端处或在其附近。
标签可以包含蛋白的表位。
标签可以包含在受试者中或在受试者的循环系统中天然存在的蛋白的表位。
标签可以是例如激素、细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞粘附分子、信号转导肽、受体、细胞表面肽或其片段。标签可以是配体或其片段。配体可以是激素配体。配体可以是肽配体。标签可以是抗原、表位，其中包括线性和非线性表位。标签可以是肿瘤相关抗原。或者，标签可以不是肿瘤相关抗原。
标签可以包含新抗原的表位，其中所述表位包含抗原突变。
标签可以包含肿瘤发生中可能出现的新抗原的表位，其中所述表位包含抗原突变。
标签可以包含新抗原的表位，其中所述表位包含抗原突变，其中所述抗原可以是在受试者中或在受试者的循环系统中天然存在的蛋白。
标签可以是不在受试者中天然存在的(多)肽。
标签可以是不在受试者的循环系统中的(多)肽。
标签可以是不在健康受试者的循环系统中天然存在的(多)肽。
标签可以是例如下述肽之一：c-Myc-标签、Strep-标签II、Flag-标签、多组氨酸-标签、Avi-标签、钙调蛋白结合蛋白-标签、Yol-标签(源自α微管蛋白)、E-标签、HA-标签、S-标签、SBP-标签或V5标签。
“信号肽”是指指导细胞内的蛋白(例如，到特定的细胞器(如内质网)和/或细胞表面)的运输和定位的肽序列。
通常，“抗原结合结构域”指CAR中特异性结合抗原的区域，例如，肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。更具体地，抗-标签CAR的“抗原结合结构域”可以特异性地与标记多肽上的标签结合，其中多肽可以结合至在靶点的(细胞)表面上表达的所述疾病相关抗原。CAR可以包含一个或多个抗原结合结构域(例如，串联CAR)。通常，在CAR上的靶向区域是胞外的。抗原结合结构域可以包含抗体或其抗原结合片段。抗原结合结构域可以包含例如全长重链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双抗体。任何与给定抗原特异性结合的分子，如来自天然存在的受体的亲和体或配体结合域，都可用作抗原结合结构域。通常抗原结合结构域是scFv。通常，在scFv中，免疫球蛋白重链和轻链的可变区通过柔性接头融合以形成scFv。此类接头可以是例如“(G4/S)3-接头”。
在一些情况下，抗原结合结构域源自CAR将用于的相同物种是有利的。例如，当计划将其用于人类治疗时，CAR的抗原结合结构域包含人或人源化抗体或其抗原结合片段可能是有利的。人或人源化抗体或其抗原结合片段可以通过本领域公知的各种方法制备。
如本文所用，“间隔区”或“铰链”指位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水区。本发明的CAR可以包含胞外间隔结构域，但也可能省去这样的间隔区。间隔区可以包含例如抗体或其片段的Fc片段、抗体或其片段的铰链区、抗体的CH2或CH3区、辅助蛋白、人工间隔区序列或其组合。间隔区的一个突出的实例是CD8α铰链。
CAR的跨膜结构域可以来源于此类结构域的任何所需的天然或合成来源。当来源是天然的时，结构域可以来源于任何膜结合或跨膜蛋白。例如，跨膜结构域可以来源于CD8α或CD28。当关键信号转导和抗原识别模块(结构域)位于两个(或甚至更多个)多肽上时，然后CAR可以具有两个(或更多个)跨膜结构域。由于CAR的每个多肽中的小分子依赖性异二聚化结构域，分裂关键信号转导和抗原识别模块能够对CAR细胞表达进行小分子依赖性、可滴定和可逆的控制(例如，WO2014127261A1)。
如果相应的CAR是激活性CAR，则CAR的细胞质信号转导结构域(胞内信号转导结构域或激活内域)负责激活表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能(通常，如本文所述的CAR是指激活性CAR，除非明确表示为抑制性CAR(iCAR))。“效应功能”指细胞的特定功能，例如，在T细胞中，效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，其中包括细胞因子的分泌。胞内信号转导结构域是指转导效应功能信号并指导表达CAR的细胞执行特定功能的蛋白部分。胞内信号转导结构域可以包含给定蛋白的胞内信号转导结构域的任何完整的、突变的或截短的部分，其足以转导启动或阻断免疫细胞效应功能的信号。
在CAR中使用的胞内信号转导结构域的突出实例包括T细胞受体(TCR)的细胞质信号转导序列和在抗原受体接合后启动信号转导的共受体。
通常，T细胞激活可以由两类不同细胞质信号转导序列介导，首先是通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级细胞质信号转导序列，初级细胞质信号转导结构域)，其次是以抗原非依赖性方式发挥作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质信号转导序列，共刺激信号转导结构域)。因此，CAR的胞内信号转导结构域可以包含一个或多个初级细胞质信号转导结构域和/或一个或多个次级细胞质信号转导结构域。
以刺激方式发挥作用的初级细胞质信号转导结构域可以包含ITAM(免疫受体酪氨酸基激活基序)。
通常在CAR中使用的包含ITAM的初级细胞质信号转导结构域的实例是来源于TCRζ(CD3ζ)、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。最突出的是来源于CD3ζ的序列。
可以将CAR的细胞质结构域被设计为单独包含CD3ζ信号转导结构域或与任何其他所需的细胞质结构域组合。CAR的细胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号转导区(结构域)。共刺激信号转导区指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。共刺激分子的实例是CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3。
CAR的细胞质信号转导部分内的细胞质信号转导序列可以以随机或特定顺序在有或没有接头的情况下彼此连接。长度优选在2至10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头可以形成连接。突出的接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。
例如，细胞质结构域可以包含CD3ζ的信号转导结构域和CD28的信号转导结构域。在另一个实例中，细胞质结构域可以包含CD3ζ的信号转导结构域和CD137的信号转导结构域。在又一个实例中，细胞质结构域可以包含CD3ζ的信号转导结构域、CD28的信号转导结构域和CD137的信号转导结构域。
如上所述，CAR的胞外部分或跨膜结构域或细胞质结构域还可以包含异源二聚化结构域，其目的是分裂CAR的关键信号转导和抗原识别模块。
可以进一步修饰CAR以在编码CAR的核酸水平上包含一种或多种可操作元件，以通过自杀开关消除表达CAR的免疫细胞。自杀开关可以包括例如凋亡诱导信号转导级联或诱导细胞死亡的药物。在一个实施方式中，可以进一步修饰表达和编码CAR的核酸以表达例如胸苷激酶(TK)或胞嘧啶脱氨酶(CD)的酶。CAR也可以是允许在免疫细胞中CAR的受控表达的基因表达系统的一部分。此类基因表达系统可以是诱导型基因表达系统，并且其中当将诱导剂施用于用所述诱导型基因表达系统转导的细胞时，基因表达系统被诱导并且所述CAR在所述转导细胞的表面上被表达。
在一些实施方式中，内结构域可以包含初级细胞质信号转导结构域或共刺激区域，但不能同时包含这两者。
在本发明的一些实施方式中，CAR可以是“SUPRA”(分裂、通用和可编程)CAR，其中“zipCAR”结构域可以连接胞内共刺激结构域和胞外亮氨酸拉链(WO2017/091546)。该拉链可以被融合至例如scFv区域的互补拉链靶向，以赋予SUPRA CAR T细胞肿瘤特异性。这种方法对于针对各种肿瘤产生通用型CAR T细胞是特别有用的；可以针对肿瘤特异性对适体分子进行设计，并且将针对改变特异性后的过继转移提供选项，这是选择压力和抗原逃逸情况的关键。
可以将本发明的CAR设计成以任何顺序和/或组合包含如本文所述的上述结构域的任何一部分或部分，从而产生功能性CAR，即介导免疫效应细胞的免疫效应应答的CAR，所述免疫效应细胞表达如本文所公开的CAR。
如本文所用，术语“标记多肽”指具有与其直接或间接结合的至少一种附加组分(即，标签)的多肽。如本文所用，标记多肽能够结合靶细胞上表达的抗原。多肽可以是抗体或其抗原结合片段，其结合到靶细胞表面上表达的抗原，如癌细胞上的肿瘤相关抗原。标记多肽的多肽可替代地可以是细胞因子或生长因子或能够结合靶细胞抗原的另一种可溶性多肽。标记多肽的所述多肽可替代地可以是来自天然存在的受体的亲和体或配体结合结构域。
如本文所用，“T细胞受体”或“TCR”指存在于T细胞表面的抗原识别分子。在正常T细胞发育过程中，四个TCR基因α、β、γ、δ中的每一个都可以重新排列，导致高度多样的TCR蛋白。
如本文所用，术语“抗体”以最广泛的意义使用以涵盖各种形式的抗体结构，包括但不限于单克隆和多克隆抗体(包括全长抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、抗体片段(即，抗体的抗原结合片段)、免疫粘附素和抗体-免疫粘附素嵌合体，其特异性识别(即，结合)抗原。“抗原结合片段”包含全长抗体(优选其可变结构域)的一部分，或者至少是其抗原结合位点(“抗体的抗原结合片段”)。抗原结合片段的实例包括Fab(抗原结合片段)、scFv(单链可变片段)、单域抗体(纳米抗体)、双抗体、dsFv、Fab’、双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体或抗体片段可以是人的、全人的、人源化的、人工程化的、非人的和/或嵌合的。非人抗体或抗体片段可以是人源化的，以降低对人的免疫原性，同时保持亲代非人抗体的特异性和亲和力。嵌合抗体可以指通过两个或更多个抗体基因的结合产生的抗体，这些基因最初编码单独的抗体。
对于抗体的抗原结合结构域、其片段或CAR的术语“对......具有特异性”、“特异性结合”或“对......是特异性的”是指识别并结合特异性抗原的抗原结合结构域，但其基本上不识别或结合样品中的其他分子。与来自一个物种的抗原特异性结合的抗原结合结构域也可以与来自另一物种的抗原结合。这种跨物种反应性与该抗原结合结构域的特异性定义并不矛盾。与抗原特异性结合的抗原结合结构域也可以与抗原的不同等位基因形式(等位基因变体、剪接变体、亚型等)结合。这种交叉反应性与该抗原结合结构域的特异性定义并不矛盾。
如本文所用，术语“抗原”旨在包括与一种或多种抗体结合或引起产生一种或多种抗体的物质，并且可以包括但不限于蛋白、肽、多肽、寡肽、脂质、碳水化合物(如葡聚糖)、半抗原及其组合，例如，糖基化蛋白或糖脂。如本文所用，术语“抗原”指可以例如在靶细胞表面表达并可以通过适应性免疫系统(包括但不限于抗体或TCR)、或工程化分子(包括但不限于内源性或转基因TCR、CAR、scFv或其多聚体、Fab片段或其多聚体、抗体或其多聚体、单链抗体或其多聚体或者能够以高亲和性执行与结构的结合的任何其他分子)识别的分子实体。
如本文所用，术语“可溶性抗原”指未固化在表面(如小珠或细胞膜)上的抗原。
术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”可以互换使用，并且指可以是免疫系统的一部分并执行特定效应功能的细胞，如α-βT细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、先天淋巴细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、γ-δT细胞、调节性T细胞(Treg)、单核细胞或巨噬细胞。优选地，这些免疫细胞是人免疫细胞。优选的免疫细胞是具有细胞毒效应功能的细胞，如α-βT细胞、NK细胞、NKT细胞、ILC、CIK细胞、LAK细胞或γ-δT细胞。最优选的免疫效应细胞是T细胞和NK细胞。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是从受试者血液中转移到肿瘤中的T细胞。这些TIL可以通过本领域熟知的方法从患者的肿瘤中分离，例如，酶促和机械性肿瘤破坏，然后密度离心和/或细胞标记物特异性富集。如本文所公开的TIL是基因工程化的，然后将其回输给患者。“效应功能”指细胞的特定功能，例如，在T细胞中，效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
免疫疗法是一个医学术语，其定义为“通过诱导、增强或抑制免疫应答来治疗疾病”。设计为引发或放大免疫应答的免疫疗法被归类为激活免疫疗法，而减少或抑制的免疫疗法被归类为抑制免疫疗法。癌症免疫疗法作为一种激活免疫疗法，试图刺激免疫系统排斥和摧毁肿瘤。过继细胞转移使用基于细胞，优选基于T细胞或基于NK细胞的细胞毒性应答来攻击癌细胞。对患者的癌症具有天然或遗传工程反应性的T细胞在体外产生，然后转移回癌症患者体内。然后，将免疫疗法称为“CAR免疫疗法”或在仅使用T细胞的情况下将其称为“CAR T细胞疗法”或“CAR T细胞免疫疗法”。
如本文所用，术语“治疗”指降低疾病的至少一种体征或症状的频率或严重程度。
如本文所用，术语“自体的”指来源于其后来重新引入的同一受试者的任何物质。
如本文所用，术语“同种异体的”指来源于与物质被重新引入的受试者相同物种的不同受试者的任何物质。
术语“治疗有效量”或“治疗有效群”指在受试者中提供治疗益处的细胞群的量。
如本文所用，术语“受试者”指动物。优选地，受试者是哺乳动物，如小鼠、大鼠、牛、猪、山羊、鸡、犬、猴或人。更优选地，受试者是人。受试者可以是患有疾病，例如癌症(患者)、自身免疫性疾病、过敏性疾病或感染性疾病或移植排斥的受试者。
如本文所用，术语“表达”被定义为特定核苷酸序列在细胞中由其启动子驱动的转录和/或翻译。
如本文所用，术语“工程化的细胞”和“基因修饰的细胞”可以互换使用。该术语指包含和/或表达外来基因或核酸序列，其进而修饰细胞或其后代的基因型或表型。特别地，该术语指的是细胞(优选T细胞)可以通过本领域众所周知的重组方法操作以稳定或瞬时表达在这些细胞中以天然状态不表达的肽或蛋白的事实。例如，将T细胞(优选人T细胞)工程化以在其细胞表面上表达人工构建体(如嵌合抗原受体)。
术语“癌症”在医学上称为恶性肿瘤。癌症是涉及不受调节的细胞生长的一大类疾病，包括所有类型的白血病。在癌症中，细胞(癌细胞)不受控制地分裂和生长，形成恶性肿瘤，并侵入机体的附近部分。癌症也可通过淋巴系统或血流扩散到身体的更远部分。有超过200种不同的已知癌症影响人类。
本文可互换使用的术语“核酸”或“多核苷酸”是指核苷酸的聚合物。多核苷酸，其可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，术语“多核苷酸”包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，其包括但不限于重组手段(即使用普通克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列)以及合成手段。
肽是由2至50个氨基酸组成的短链，由肽键连接。少于10或15个氨基酸的链也可以称为寡肽。
多肽是长的、连续的、不分支的多至50个氨基酸或更多的肽链。含有超过50个氨基酸的多肽也可以称为蛋白。
术语“可操作地连接”是指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且当需要连接两个蛋白编码区时，在同一读码框中。
如本文所用，术语“启动子”或“调节序列”是指与该启动子/调节序列可操作地连接的基因产物的转录所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，而在其他情况下，该序列还可以包括增强子序列和基因产物的转录所需的其他调节元件。启动子/调节序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的序列。
如本文所用，术语“最小启动子(PMIN)”是指能够诱导位于所述最小启动子下游的基因的转录的最小遗传元件。蛋白编码基因的真核启动子具有该区域中三个保守序列(即TATA-盒、起始区和下游启动子元件)中的一个或多个。最小启动子使得在不存在特异性转录激活因子的情况下的低碱基渗漏(basal leakiness)和当转录激活因子在其特异性DNA结合位点结合在最小启动子的上游时的高表达成为可能。可以使用替代性的最小启动子，例如最小TATA盒启动子、最小CMV启动子或最小IL-2启动子。
最小启动子可以通过引入特定转录因子的结合位点(例如，药物诱导型系统所需的，但对于抗原激活的诱导型系统，启动子可以包含几个重复序列，例如，NFAT结合位点的)来工程化/修饰。
“组成型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或所有生理条件下在细胞中产生基因产物的核苷酸序列。
“诱导型”启动子是这样的核苷酸序列，基本上仅在某些条件(例如，如当细胞中存在诱导物(例如，诱导信号，或诱导剂如药物、金属离子、醇、氧等)时)存在或不存在下，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，才引起细胞中产生基因产物。诱导物可能是例如CAR的胞内信号转导结构域的激活。
与转基因可操作地连接的组成型启动子可以是例如EF-1α启动子或在免疫细胞中驱动组成型表达的任何其他组成型启动子(如MSCV、PGK-1、UBC、CMV、CAGG、SV40或泛造血启动子如vav)。
可操作地连接至编码例如如本文所公开的衔接子的多核苷酸的诱导型启动子可以是响应于转录因子而激活的任何启动子，当免疫细胞被特异性激活或定位至给定微环境(可以是例如肿瘤微环境)时，所述转录因子增加，例如SP1、BATF、AP-1、IRF4、RUNX、NFAT、NF-κB、STAT5或STAT3感测启动子和可操作地连接至诱导型增强子的最小启动子，如WO2019199689A1中所描述的。诱导型启动子还可以包含可操作地连接到效应物的最小启动子。NFAT-诱导型启动子可与特异性结合特定转录因子的任何诱导型启动子交换。不希望受理论束缚，如果存在NFAT应答元件，则其需要来自TCR/CAR或其他免疫受体的诱导NFAT信号传导的信号。
诱导型启动子可以与最小启动子(PMIN)连接。可以使用替代性的最小启动子，如最小TATA盒启动子、最小CMV启动子或最小IL-2启动子。在一些实施方式中，可以针对期望的转录水平或转录速率优化最小启动子。
在特定变体中，诱导型启动子可以是药物诱导型启动子。
这样的系统可以包含含有可由药物(例如，合成药物)诱导的启动子的核酸。通过利用药物诱导型启动子，可以开启和关闭转基因表达以避免毒性副作用和/或允许细胞在缓解期间静息。这些系统中的许多使用嵌合转录调节子(例如，合成转录因子)。
在一个变体中，诱导型启动子可以是药物诱导型的，即药物诱导型启动子。基于安全性记录、良好的药代动力学谱、组织分布、胞外空间与细胞溶质之间的低分配系数、低免疫原性、低毒性和/或淋巴细胞中的高表达来选择药物。在一些替代方案中，诱导型启动子由与药物相互作用的转录激活因子(例如，合成转录因子)激活。转录激活因子在药物存在下被激活或能够结合并激活诱导型启动子。药物的一个具体替代方案是与转录激活因子的雌激素受体配体结合结构域结合的药物。在一些替代方案中，药物包括他莫昔芬、其代谢物、类似物、及其药学上可接受的盐和/或水合物或溶剂化物。
本文所用的术语“合成转录因子”可包含连接和/或融合的DNA结合结构域、药物诱导型结构域(药物结合结构域)和效应物(激活)结构域，由此各个结构域可以任何顺序排列。
合成转录因子的DNA结合结构域可以是特异性识别药物诱导型启动子的DNA结合基序并介导合成转录因子与该DNA序列结合的蛋白质或蛋白质的一部分。除了锌指蛋白之外，TALE(转录激活因子样效应物)和Cas9(规律间隔成簇短回文重复序列相关系统)可以被工程化以识别特定DNA序列。此外，可以使用天然存在的转录因子的DNA结合结构域(例如，POU同源结构域)。
所述DNA结合结构域可以是例如锌指蛋白(或其DNA结合结构域)或者包含POU结构域或由POU结构域组成的蛋白。
药物诱导型启动子的DNA结合基序是由合成转录因子的DNA结合结构域直接或间接(在Cas9的情况下)识别的特定DNA序列。例如，每个锌指结构域特异性识别3bp的DNA序列，因此三指锌指蛋白可被设计为识别9bp的序列。
合成转录因子的药物结合结构域是指与药物结合的蛋白质或蛋白质的一部分。当药物结合时，药物结合结构域能够使合成转录因子从无活性转变为有活性。这一转变可包括失活因子的释放和/或合成转录因子从细胞质到细胞核的易位。药物结合结构域的实例是核受体、受体的胞外结构域、抗原/物质结合蛋白(也是二聚体)和/或酶的活性位点。
合成转录因子的激活结构域是指自主促进转录机器的募集以启动mRNA转录的蛋白质或蛋白质的一部分。激活结构域的实例是VP16、VP64、NFκB p65的片段、热休克因子1及其组合。
例如，合成转录因子可以包含锌指蛋白、雌激素受体(ER)和激活结构域，并且其中所述药物可以是他莫昔芬或他莫昔芬代谢物。所述激活结构域可以是例如单纯疱疹病毒蛋白VP16、VP16的最小激活结构域VP64的四聚体重复、人内源性转录因子NFκB的p65结构域的部分或者包含人NFκB p65的片段和热休克因子1的融合蛋白。所述他莫昔芬代谢物可以是内昔芬或4-OHT。所述ER可以是具有点突变的ER，如鼠ER(G525R)或(G521R)、人ER(G400V、M543A、L540A)或人ER(G400V、M543A、L544A)。
药物诱导型启动子可以是包含合成转录因子的所述DNA结合结构域的DNA结合结基序和最小启动子的杂合启动子
所述药物诱导型启动子可以是包含锌指结合基序和最小启动子的杂合启动子，其包含选自下组的最小启动子：E1b、TK、IL2、CMV、SV40。
术语“诱导型(基因)表达系统”指在免疫细胞中表达外源多肽(转基因)，这里通常是本文公开的衔接子。诱导型(基因)表达系统可以是“抗原激活的诱导型基因表达系统”，即，当抗原/配体直接或在MHC呈递时由细胞的受体如CAR或TCR结合时，诱导型表达系统可在具有所述诱导型基因表达系统的细胞中被激活。抗原/配体与受体的所述结合可在细胞内诱导信号级联，随后可诱导引入的基因(或转基因)的表达，这里通常是衔接子。当与细胞的同源受体结合时，所述抗原/配体可在细胞内诱导信号级联，也可称为“诱导信号”。
或者，诱导型基因表达系统可以是药物诱导型基因表达系统，即，当药物(例如，合成药物如他莫昔芬)被引入细胞时，诱导型基因表达系统可在具有所述诱导型基因表达系统的细胞中被激活。细胞中的所述药物可与合成转录因子结合，并且随后可导致转基因(本文是指衔接子)表达的诱导。
所述药物也可以称为“诱导剂”。
这两种诱导型基因表达系统可用于本文所公开的单细胞和/或双细胞系统。
在存在诱导信号或诱导剂的情况下，诱导型表达系统驱动外源多肽的表达。在诱导系统中，诱导信号或诱导剂的撤走可减少和/或停止外源多肽的表达。在重新引入诱导信号或诱导剂后，然后可以重新诱导系统并重新启动外源多肽(即衔接子)的表达。诱导(基因)表达系统可以通过诱导信号诱导，例如，通过结合本文公开的抗原/配体激活CAR或TCR的胞内信号转导结构域(“激活”诱导)或通过诱导剂，如本文公开的(合成)药物(“药物诱导”)。
在一些实施方式中，如本文所公开的诱导型(基因)表达系统也可以提供对衔接子表达的可调控制。如本文所用，术语“可调控制”指如本文所公开的控制衔接子的表达水平的能力。例如，衔接子的诱导表达水平可以取决于存在的诱导剂或诱导信号的量。例如，与存在较低量诱导剂相比，较高量诱导剂(例如，合成药物)的存在可诱导更高水平的衔接子表达。因此，衔接子的可诱导或可调表达可以相对于存在的诱导剂的量呈剂量依赖性。
在一些实施方式中，除了诱导剂药物剂量之外，本文公开的诱导型(基因)表达系统还可以通过合成转录因子的响应元件的数量来提供对衔接子的表达的可调谐控制。如本文所用，术语“可调谐控制”是指如本文所公开的控制衔接子的表达水平的能力。例如，衔接的诱导表达水平可取决于应答原件的数量，换言之诱导型启动子内合成转录因子结合位点的数量。例如，当五个合成转录因子分子与包含五个结合位点的诱导型启动子结合时，与包含诱导型启动子内的两个应答元件的构建体相比，诱导转录输出，即衔接子的更高水平表达。因此，衔接子的诱导型或可调谐表达可取决于合成转录因子的应答元件的数量。
实施方式
在本发明的一个实施方式中，在本文所公开的同一细胞中表达衔接子CAR和诱导型衔接子的免疫细胞用于治疗患有癌症的患者的癌症。衔接子可以由衔接子CAR特异性结合，并且衔接子可以特异性结合至所述癌症的抗原。分离受试者的免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)。受试者可以患有所述癌症或者可以是健康受试者。这些细胞在体外或体内被基因修饰以表达所述CAR，并且以诱导型方式表达所述衔接子。这些工程化细胞可以在体外或体内被激活和扩增。在细胞疗法中，将这些工程化的细胞输注至有需要的受体。这些细胞可以是药物组合物(所述细胞加药学上可接受的载体)。当衔接子的表达被诱导时，输注的细胞能够杀死(或至少阻止生长)受体中的癌细胞。当诱导表达系统是本文公开的药物诱导系统时，可以通过应用合成药物如他莫昔芬来触发表达的诱导。受体可以是获得细胞的同一受试者(自体细胞疗法)，也可以来自同一物种的另一受试者。
工程化以表达所述CAR和所述衔接子的免疫细胞(优选T细胞或NK细胞)可以单独施用，或者与稀释剂和/或其他组分如IL-2或其他细胞因子或细胞群组合作为药物组合物施用。简言之，本发明的药物组合物可以包含如本文所述的基因修饰的细胞的细胞群，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。
优选地，本发明的组合物配制用于静脉内施用。向受试者施用细胞组合物可以本领域公知的任何方便的方式进行。
本发明的药物组合物可以适于待治疗疾病的方式施用。适宜剂量可以由临床试验确定。但是，施用的量和频率也将取决于患者的病情、患者疾病的类型和严重程度等因素并受其影响。
包含如本文所公开的免疫细胞(优选T细胞或NK细胞)的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重(优选105至106个细胞/kg体重)的剂量施用。细胞组合物也可以以这些剂量施用数次。细胞组合物可以直接注射到血流、肿瘤、淋巴结或感染部位。
用于诱导衔接子表达的药物可以以适合于待治疗疾病的方式施用。适宜剂量可以由临床试验确定。但是，施用的量和频率也将取决于患者的病情、患者疾病的类型和严重程度等因素并受其影响。药物可以直接注射到血流中，应用于皮肤或口服。药物也可以以可变剂量施用数次。药物将根据施用途径配制。
可以使用本领域公知的方法将细胞激活并扩增至治疗有效量。
本发明的细胞可以与例如化疗、辐射、免疫抑制剂、抗体或抗体疗法组合使用。
在本发明的另一个实施方式中，本文公开的免疫细胞组合物用于治疗患有癌症的受试者的癌症或用于治疗患者的病毒感染。组合物可以包含表达如本文所公开的诱导型衔接子的免疫细胞，免疫细胞可以是例如TIL，组合物可以包含表达如本文所公开衔接子CAR的免疫细胞。衔接子可以由衔接子CAR特异性结合，并且衔接子可以特异性结合到所述癌症的抗原或与病毒感染相关的病原体的抗原。分离受试者的免疫细胞(例如，T细胞、TIL或NK细胞)。免疫细胞可基于对癌病毒抗原或肿瘤新抗原的TCR反应性进一步分离(例如，通过PepTivatorTM CMV p65肽激活(Miltenyi Biotec)分离巨细胞病毒反应性T细胞，并通过CliniMACsTM细胞因子捕获系统(Miltenyi-Biotec)分离激活的T细胞)。受试者可以患有所述癌症或者可以是健康受试者。在体外或体内对这些细胞进行基因修饰，以在两种不同细胞中表达所述CAR。这些工程化的细胞可以在体外或体内被激活和扩增。在细胞疗法中，将这些工程化的细胞输注至有需要的受体。这些细胞可以是药物组合物(所述细胞加药学上可接受的载体)。当衔接子的表达被诱导时，输注的表达CAR的免疫细胞能够杀死(或至少阻止生长)受体中的癌细胞。当诱导表达系统是本文公开的药物诱导系统时，可以通过应用合成药物如他莫昔芬来触发表达的诱导。受体可以是获得细胞的同一受试者(自体细胞疗法)，也可以来自同一物种的另一受试者。
在两个不同细胞中工程化以表达所述CAR和所述衔接子的免疫细胞(优选T细胞、TIL或NK细胞)可以单独施用，或者与稀释剂和/或其他组分如IL-2或其他细胞因子或细胞群组合作为药物组合物被施用。简言之，本发明的药物组合物可以包含如本文所述的基因修饰的细胞的细胞群，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。
优选地，本发明的组合物配制用于静脉内施用。向受试者施用细胞组合物可以以本领域公知的任何方便的方式进行。
本发明的药物组合物可以适于待治疗疾病的方式施用。适宜剂量可以由临床试验确定。但是，施用的量和频率也将取决于患者的病情、患者疾病的类型和严重程度等因素并受其影响。
包含如本文所公开的免疫细胞(优选T细胞或NK细胞)的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重(优选105至106个细胞/kg体重)的剂量施用。细胞组合物也可以以这些剂量施用数次。细胞组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
用于诱导衔接子表达的药物可以以适合于待治疗疾病的方式施用。适宜剂量可以由临床试验确定。但是，施用的量和频率也将取决于患者的病情、患者疾病的类型和严重程度等因素并受其影响。
药物可以直接注射到血流中，应用于皮肤或口服。药物也可以以可变剂量施用数次。药物将根据施用途径配制。可使用本领域公知的方法将细胞激活并扩增至治疗有效量。
本发明的细胞可以与例如化疗、辐射、免疫抑制剂、抗体或抗体疗法组合使用。
表达CAR的免疫细胞和表达诱导型衔接子的免疫细胞可以同时施用，或者表达CAR的免疫细胞可以在表达诱导型衔接子的免疫细胞之前施用，反之亦然。用于诱导衔接子表达的药物可以与免疫细胞同时向患者施用，或在施用免疫细胞后施用。
在一个优选实施方式中，表达如本文所公开的诱导型衔接子的免疫细胞是向(实体)肿瘤运输的TIL。其可以作为原位递送衔接子的载剂。
在本发明的另一个实施方式中，可以对免疫细胞进行修饰以表达“激活诱导型”或“药物诱导型”衔接子，其靶向人类病原体感染细胞(例如，HIV-1感染细胞)。这些细胞可以例如基于其对病原体相关抗原或肿瘤新抗原的TCR反应性，通过使用病原体相关肽池来激活T细胞，随后例如通过CliniMACsTM细胞因子捕获系统(Miltenyi Biotec)或其他分离方式来分离激活的T细胞。这些免疫细胞在运输到感染部位并对病原体感染细胞进行TCR识别后，可通过“激活诱导型”启动子驱动对病原体的抗原具有特异性的衔接子的表达。或者，衔接子的药物诱导型表达可被用于可控地产生对病原体的抗原具有特异性的衔接子，特别是在感染部位。这些工程化免疫细胞还可以包含对与病原体的抗原结合的所述衔接子具有特异性的衔接子CAR，或者其他工程化免疫细胞可以包含不表达衔接子的CAR。
在本发明的一个实施方式中，免疫细胞用激活诱导型表达盒(称为激活诱导型细胞)修饰，由此应答TCR/CAR介导的信号转导的启动子驱动衔接子分子的表达。这些细胞可以通过从身体的特定区域分离的细胞(例如，从肿瘤部位分离的TIL)，或通过选择具有对癌病毒抗原(例如，CMV PepTivator激活的T细胞)，或对肿瘤新抗原(例如，肿瘤新抗原肽池激活的T淋巴细胞)反应的TCR的T细胞，基于其对肿瘤抗原的反应性来选择。或者，T细胞可以用对任何上述抗原类别具有特异性的CAR或TCR转导。在TCR/CAR识别TAA、癌病毒或肿瘤新抗原后，TCR反应性启动子驱动抗肿瘤衔接子分子的表达。这些标记的衔接子分子对肿瘤抗原具有特异性。衔接子分子的标签部分(在这种情况下：6xHis-标签)被衔接子CAR的胞外识别结构域(在这种情形下：抗His6特异性CAR)识别，其由第二免疫细胞表达。标记的衔接子分子构成一个桥接分子，将衔接子CAR细胞重定向到肿瘤。因此，肿瘤细胞被衔接子CAR细胞裂解。
在本发明的其他实施方式中，用药物诱导型表达盒修饰免疫细胞(称为药物诱导型细胞)。在“关闭”状态下，这些诱导型细胞无法与未修饰的免疫细胞区分开来。在施用诱导剂药物后，诱导型表达盒被激活，标记的衔接子分子被转录并由免疫细胞分泌。这些标记的衔接子分子对肿瘤抗原具有特异性。衔接子分子的标签部分(在这种情况下：6xHis-标签)被衔接子CAR的胞外识别结构域(在这种情形下：抗His6特异性CAR)识别，其由第二免疫细胞表达。标记的衔接子分子构成一个桥接分子，将衔接子CAR细胞重定向到肿瘤。因此，肿瘤细胞被衔接子CAR细胞裂解。
实施例
实施例1：抗标签CAR T细胞和药物诱导型T细胞的产生
1.1构建体设计
衔接子CAR T细胞包含作为结合部分的抗-His6 scFv。scFv通过hIgG4铰链结构域连接至人CD8跨膜结构域。信号转导结构域由4-1BB、CD28和CD3ζ组成。弗林蛋白酶P2A位点后接截短的LNGFR是CAR构建体的3’。将LNGFR作为转导标志物。
诱导型T细胞通过PGK启动子组成型地表达合成转录因子。合成转录因子由3-指锌指蛋白(称为N1)、鼠雌激素受体(G525R)和激活结构域VP64组成。合成转录因子的序列通过弗林蛋白酶P2A位点与LNGFR连接，其被作为转导标志物。诱导型基因表达盒还包含标记的衔接子分子的序列(在这种情况下：His6标记的抗CD19Fab)，由此标记的衔接子分子的转录由诱导型启动子调控。诱导型启动子由N1锌指(五个重复)的结合位点组成，该结合位点连接到E1b最小启动子。
1.2 LV颗粒的产生和滴定
通过瞬时转染HEK-293T细胞制备慢病毒载体颗粒。慢病毒载体颗粒用VSV-G进行假型化。为了转染，在转染前3天将HEK-293T细胞接种至含DMEM(Biowest)的T175培养瓶中，DMEM补充有2mM L-谷氨酰胺(Lonza)和10％FCS(Biochrom)。在转染当天，去除培养基并用补充有2mM L-谷氨酰胺(Lonza)的DMEM(Biowest)替换。用编码VSV-G、gag/pol/rev和psi阳性转移载体(抗标签CAR或诱导型表达盒)的三质粒系统转染细胞。48h后，收集上清液并以1000rpm离心10min以去除细胞碎片。此外，通过0.45μm过滤器过滤上清液。将沉淀物重新混悬在冰冷的PBS中，并在-80℃下储存。通过在Sup-T1细胞上滴定来测定VSV-G假型慢病毒载体颗粒的功能滴度。将2E5细胞接种在96孔圆底板中的补充有2mM L-谷氨酰胺(Lonza)的100μL RPMI(Biowest)中。为了进行转导，将100μL连续稀释的慢病毒载体颗粒添加到接种的细胞中。24h后添加补充有2mM L-谷氨酰胺(Lonza)和10％FCS(Biochrom)的90μL RPMI(Biowest)。96h后，使用LNGFR APC缀合物(Miltenyi Biotec)通过流式细胞术定量转导细胞的频率。根据LNGFR阳性细胞的频率、接种细胞的数量和用于转导的慢病毒颗粒的体积，计算滴度。滴度以每mL转导单位表示。
1.3抗-标签CAR T细胞和诱导型T细胞的转导、培养和分析
使用来自健康供体的原代T细胞制备抗-标签CAR T细胞和诱导型T细胞。根据生产厂商的方案，使用PAN T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从PBMC中分离T细胞。在转导之前，将2E6 T细胞接种在含2mL TexMACS培养基(Miltenyi Biotec)的24孔板中，该TexMACS培养基中补充有IL-7(Miltenyi Biotec)、IL-15(Miltenyi Biotec)和TransAct(MiltenyiBiotec)。24h后，通过加入相应体积的慢病毒载体颗粒以5MOI转导T细胞。在激活后第3天，去除培养基并用补充有IL-7(Miltenyi Biotec)和IL-15(Miltenyi Biotec)的TexMACS培养基(Miltenyi Biotec)替换。在转导后第6天，使用LNGFR APC缀合物(Miltenyi Biotec)通过LNGFR表达的流式细胞术测定来间接分析抗-标签CAR阳性T细胞以及诱导型T细胞的频率。在转导后第7天使用MACSelect LNGFR MicroBeads(Miltenyi Biotec)针对LNGFR阳性细胞对转导的T细胞进行富集。根据供应商的方案进行富集程序。在激活后第13天，将转导的T细胞用于功能测定。
实施例2：抗CD19 Fab-His6分泌的诱导和衔接子浓度的分析
如实施例1.2中所描述制备编码药物诱导型表达盒的慢病毒颗粒。如实施例1.3中所描述产生药物诱导型T细胞。将1E4 LNGFR阳性药物诱导型T细胞接种在含100μL TexMACS培养基(Miltenyi Biotec)的96孔圆底培养板中，该TexMACS培养基中补充有IL-7(Miltenyi Biotec)和IL-15(Miltenyi Biotec)。通过向每孔中添加在100μL TexMACS培养基(Miltenyi Biotec)中的不同浓度的4-OHT(0-500nM,Sigma-Aldrich)来诱导His6-标记的抗-CD19 Fab的分泌，该TexMACS培养基中补充有IL-7(Miltenyi Biotec)和IL-15(Miltenyi Biotec)。未转导的T细胞构成阴性对照。在37℃和5％CO2下孵育细胞。孵育后48h收获包含His6-标记的抗-CD19 Fab的上清液。随后使用T细胞上清液和抗His APC作为二抗对CD19+Raji细胞进行染色。因此，将1E5 CD19+Raji细胞接种在96孔圆底培养板中。将细胞以300g离心5min，并在4℃下用50μL收集的T细胞上清液染色10分钟。CD19+Raji细胞用补充有0.5％BSA(Miltenyi Biotec)的200μL CliniMACS缓冲液(Miltenyi-Biotec)(称为PEB)洗涤两次，在4℃下在50μL二次染色混合物中孵育10min，该混合物由在PEB中稀释的二抗抗His APC(Miltenyi Biotec)组成。用200μLPEB洗涤CD19+Raji细胞(300g，5min)。将细胞重悬在100μL PEB中，用于随后的流式细胞术分析。为排除死细胞，在
Figure BDA0004106062420000401
分析仪10(Miltenyi Biotec)采集样本之前，直接向染色细胞中添加碘化丙啶(PI；Miltenyi Biotec)。通过从标准曲线外推，测定的APC通道中的平均荧光强度与Fab浓度相关。为了生成标准曲线，使用限定浓度的His6标记的抗CD19-Fab(Miltenyi Biotec)。
通过诱导型T细胞的His6标记的抗CD19-Fab分泌的诱导严格依赖于诱导剂药物4-OHT的存在(图3)。随着4-OHT浓度的升高，在T细胞培养物的上清液中检测到His6标记的抗CD19-Fab的量增加，如通过CD19+Raji细胞的染色和从标准曲线外推所确定的。
实施例3：在诱导型抗CD19 Fab T细胞和诱导剂药物4-OHT的存在下，抗His衔接子CAR T细胞与Raji细胞共培养时的细胞裂解活性
通过使用
Figure BDA0004106062420000402
分析仪10(Miltenyi Biotec)定量活靶细胞，来评估针对肿瘤细胞的抗-His衔接子CAR T细胞介导的细胞毒性。因此，将1E4 GFP+Raji细胞接种在含50μL TexMACS培养基(Miltenyi Biotec)的96孔圆底培养板中。随后在50μL TexMACS培养基(Miltenyi Biotec)中以2:1的E:T比例添加抗-His衔接子CAR T细胞。将T细胞数调整为LNGFR表达，其表明每个孔中转导的T细胞数和总T细胞数相等。将未转导的T细胞数调整为总细胞数。将1E4抗CD19 Fab诱导型T细胞，其在诱导时分泌衔接子分子His标记的抗CD19Fab，添加到相应的孔中。在测定开始时，通过添加在50μL TexMACS(Miltenyi Biotec)中的100nM 4-OHT(Sigma Aldrich)诱导His-标记的抗CD19 Fab分泌。将板在300g离心1min，并在37℃，5％CO2下孵育。在共培养建立后6天测定靶细胞的特异性裂解。因此，将板在4℃下孵育20min，以终止进一步的靶细胞裂解。接下来，通过流式细胞术定量活靶细胞。通过
Figure BDA0004106062420000403
的自动标记功能将碘化丙啶(PI；Miltenyi Biotec)自动添加到共培养物中，并使用高采集模式每个孔采集70μL。将活Raji肿瘤细胞定义为PI-、GFP+细胞，根据以下公式计算特异性裂解：特异性裂解％＝(1-(Raji细胞计数[样品]/Raji细胞计数[靶细胞]))·100％。
CD19+Raji细胞的特异性裂解仅在至少1nM 4-OHT存在下的CD19+Raji细胞、衔接子CAR T细胞和诱导型T细胞的共培养物中被检测到(●符号)(图4)。在添加至少10nM 4.OHT后获得了最大特异性裂解。在抗CD19 Fab诱导型T细胞存在下的未转导的T细胞和CD19+Raji的共培养物(■符号)以及诱导型抗CD19 Fab T细胞和CD19+Raji的共培养物(▲符号)被用作阴性对照，这两者都表明肿瘤细胞的裂解不能由衔接子分子自身诱导，而是需要同时存在抗-His衔接子CAR T细胞。
实施例4：在诱导型抗CD19 Fab T细胞和诱导剂药物4-OHT存在下与Raji细胞共培养后，抗His衔接子CAR T细胞的PD-1表达的分析
为建立共培养，将1E4 GFP+Raji细胞接种在含50μL TexMACS培养基(MiltenyiBiotec)的96孔圆底培养板中。随后在50μL体积TexMACS培养基(Miltenyi Biotec)中以2:1的E:T比例添加抗-His衔接子CAR T细胞。将T细胞数调整为LNGFR表达，其表明每个孔中转导的T细胞数和总T细胞数相等。将未转导的T细胞数调整为总细胞数。将1E4抗CD19 Fab诱导型T细胞，其在诱导时分泌衔接子分子His标记的抗CD19 Fab，添加到相应的孔中。在测定开始时，通过添加在50μL TexMACS(Miltenyi Biotec)中的100nM4-OHT(Sigma Aldrich)诱导His-标记的抗CD19 Fab分泌。将板在300g离心1min，并在37℃，5％CO2下孵育2天。通过用抗PD-1-PEVio770、CD3-VioBlue、CD8-VioGreen和LNGFR-APC缀合物(Miltenyi Biotec)对共培养物的细胞进行染色来分析T细胞的激活。因此，将共培养物板在300g下离心5min，用50μL染色混合物在4℃下对细胞染色10min，该染色混合物由在PEB中稀释的PD-1PE07缀合物(Miltenyi Biotec)组成。用200μL PEB(300g，5min)洗涤细胞两次。将细胞重悬在100μLPEB中用于随后的流式细胞术分析。为排除死细胞，在
Figure BDA0004106062420000421
分析仪10(MiltenyiBiotec)采集样本之前，直接向染色细胞中添加碘化丙啶(PI；Miltenyi Biotec)。
T细胞上的PD-1表达仅在至少10nM 4-OHT存在下的CD19+Raji细胞、衔接子CAR T细胞和诱导型T细胞的共培养物中被检测到，且PD-1阳性T细胞的频率随着4-OHT浓度的升高而增加(●符号)(图4)。在添加至少50nM 4.OHT后获得了PD-1阳性细胞的最大频率。在抗CD19 Fab诱导型T细胞存在下的未转导的T细胞和CD19+Raji的共培养物(■符号)以及诱导型抗CD19 Fab T细胞和CD19+Raji的共培养物(▲符号)被用作阴性对照，这两者都表明T细胞的激活(如由PD-1表达所示)不能由衔接子分子自身诱导，而是需要同时存在抗-His衔接子CAR T细胞。

Claims (10)

1.一种用于免疫细胞中衔接子的诱导型表达的系统，其包含
a)诱导型基因表达系统，其包含
I)第一核酸，其包含可操作地连接至第二核酸的诱导型启动子II)所述第二核酸，其编码包含以下的衔接子
i)第一(多)肽，其中所述第一(多)肽包含特异性结合抗原的抗原结合结构域，
ii)第二(多)肽，其中所述第二(多)肽结合至嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，
b)第三核酸，其编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR，
其中所述CAR包含
i)对所述衔接子的所述第二(多)肽具有特异性的所述抗原结合结构域
ii)跨膜结构域
iii)胞内信号转导结构域。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述诱导型基因表达系统是抗原激活的诱导型基因表达系统，并且所述抗原激活的诱导型启动子是当具有所述诱导型基因表达系统的细胞被所述抗原激活时能够驱动所述衔接子的表达的抗原激活启动子。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述诱导型基因表达系统是药物诱导型表达系统并且所述诱导型启动子是药物诱导型启动子，其中所述诱导型基因表达系统还包含编码用于所述药物诱导型启动子的合成转录因子的核酸，其中当向具有所述诱导型基因表达系统的细胞施用药物时，诱导所述基因表达系统并表达所述衔接子。
4.根据权利要求3所述的系统，其中所述合成转录因子包含DNA结合结构域和药物结合结构域和激活结构域，其中所述合成转录因子通过与所述药物结合而被激活。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的系统，其中所述衔接子的表达水平取决于向所述细胞施用的药物的量，从而允许所述衔接子的所述表达可调谐控制。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的系统，其中所述诱导型基因表达系统和编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR的所述核酸存在于一个免疫细胞中。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的系统，其中所述诱导型基因表达系统存在于第一免疫细胞中且编码对所述衔接子的所述第二多肽具有特异性的所述CAR的所述核酸存在于第二免疫细胞中。
8.根据权利要求7所述的系统，其中所述第一免疫细胞包含对其他抗原具有特异性的CAR，其中所述CAR包含
i)对所述其他抗原具有特异性的所述抗原结合结构域
ii)跨膜结构域
iii)胞内信号转导结构域，
和/或其中所述第一免疫细胞包含对其他抗原具有特异性的TCR。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的系统，其中所述第一免疫细胞和所述第二免疫细胞是相同类型的免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞。
10.根据权利要求7或权利要求8所述的系统，其中所述第一免疫细胞和所述第二免疫细胞是不同类型的免疫细胞，例如，所述第一免疫细胞是T细胞且所述第二免疫细胞是NK细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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ES2791716T3 (es) 2010-12-14 2020-11-05 Univ Maryland Células T que expresan al receptor de antígeno quimérico antietiqueta universal y métodos para el tratamiento del cáncer
US9708384B2 (en) 2011-09-22 2017-07-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Universal immune receptor expressed by T cells for the targeting of diverse and multiple antigens
JP6450690B2 (ja) 2013-02-15 2019-01-09 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア キメラ抗原受容体及びその使用方法
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