WO2022153698A1 - キメラ標的因子受容体 - Google Patents

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吉則 直江
繁 松村
イブラヒム ラガブ ナシー エイッサ
モハメド モハメド アブドゥルモ アーメド アリ
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Definitions

  • the present invention relates to chimeric target factor receptors and the like.
  • the chimeric antigen receptor binds to the antigen according to the specificity of the antibody, which can cause damage to target cells, release of cytokines, and T cell division after stimulation. It is possible to impart specificity to T cells by gene transfer, and cell preparation is generally easier than in the case of culturing and amplifying endogenous tumor-specific T cell receptor-positive T cells.
  • a treatment method using a chimeric antigen receptor can exhibit higher cytotoxic activity than antibody therapy.
  • Dendritic cells are immune cells that recognize microorganism-specific antigens such as bacteria and viruses and are responsible for innate immune activation. Focusing on this immunostimulatory ability, "dendritic cell vaccine therapy” that returns dendritic cells that have recognized cancer antigens to the body has also been attempted.
  • An object of the present invention is to provide a chimeric target factor receptor capable of specifically activating antigen-presenting cells such as dendritic cells.
  • the present inventor has described the above if it is a chimeric target factor receptor containing an intracellular domain including a target factor binding domain, a transmembrane domain, and a TLR intracellular domain. I found that I could solve the problem. As a result of further research based on this finding, the present invention has been completed. That is, the present invention includes the following aspects.
  • Item 1 A chimeric target factor receptor that includes a target factor binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain that includes a TLR intracellular domain.
  • Item 2 The chimeric target factor receptor according to Item 1, wherein the TLR intracellular domain is at least one selected from the group consisting of the TLR2 intracellular domain, the TLR3 intracellular domain, and the TLR9 intracellular domain.
  • TLR intracellular domain is at least one selected from the group consisting of the TLR3 intracellular domain and the TLR9 intracellular domain.
  • Item 4 The chimeric target factor receptor according to any one of Items 1 to 3, wherein the intracellular domain further includes a CD40 intracellular domain.
  • Item 5 The chimeric target factor receptor according to any one of Items 1 to 4, wherein the structure of the target factor binding domain is a single chain antibody structure.
  • Item 6 The chimeric target factor receptor according to any one of Items 1 to 5, wherein the target factor is at least one selected from the group consisting of a cancer antigen, a cytokine receptor, and a cell growth factor receptor.
  • Item 7 A polynucleotide encoding the chimeric target factor receptor according to any one of Items 1 to 6.
  • Item 8 A cell containing the polynucleotide according to item 7.
  • Item 9. The cell according to Item 8, which is an antigen-presenting cell.
  • Item 10 The cell according to claim 8 or 9, which is a dendritic cell.
  • Item 11 A pharmaceutical composition containing the cells according to any one of Items 8 to 10.
  • Item 12. The pharmaceutical composition according to Item 11, which is for the treatment, prevention, or improvement of at least one selected from the group consisting of cancer, autoimmune disease, allergic disease, and infectious disease.
  • Item 12A The cell according to any one of Items 8 to 10 is administered to a subject or patient having at least one selected from the group consisting of cancer, autoimmune disease, allergic disease, and infectious disease. At least one method of treatment, prevention, or amelioration selected from the group consisting of cancer, autoimmune diseases, allergic diseases, and infectious diseases.
  • Item 12B Item 8. Cells.
  • Item 12C Item 8. Use of cells.
  • Item 13 The pharmaceutical composition according to Item 11 or 12, which is used for treating, preventing, or improving solid cancer.
  • Item 14 The pharmaceutical composition according to Item 13, wherein the TLR intracellular domain is at least one selected from the group consisting of the TLR3 intracellular domain and the TLR9 intracellular domain, and the cell is a dendritic cell.
  • Item 15 The pharmaceutical composition according to Item 13 or 14, wherein the intracellular domain further contains a CD40 intracellular domain, and the cell is a dendritic cell.
  • Item 16 The pharmaceutical composition according to any one of Items 11 to 15, which is used in combination with an immune checkpoint inhibitor.
  • a chimeric target factor receptor capable of specifically activating antigen-presenting cells such as dendritic cells. Furthermore, according to the present invention, it is also possible to provide a polynucleotide encoding the chimeric target factor receptor, a cell containing the polynucleotide, a pharmaceutical composition containing the cell, and the like.
  • the results of the in vitro dendritic cell activation test (Test Example 4, co-culture 5 hours, indicator factor CD80) are shown.
  • TLR is the result when the intracellular domain of TLR shown in the upper left of the graph is adopted as the intracellular domain, and without TLR is the result when there is no intracellular domain.
  • the horizontal axis shows the expression level of CD80, and the vertical axis shows the number of cells.
  • the results of the in vitro dendritic cell activation test (Test Example 4, co-culture 24 hours, indicator factor CD80) are shown. The description of each display is the same as that in FIG.
  • the results of the in vitro dendritic cell activation test (Test Example 4, co-culture 48 hours, indicator factor CD80) are shown.
  • each display is the same as that in FIG.
  • the results of the in vitro dendritic cell activation test (Test Example 4, co-culture 5 hours, indicator factor CD86) are shown.
  • the description of each display is the same as that in FIG.
  • the results of the in vitro dendritic cell activation test (Test Example 4, co-culture 24 hours, indicator factor CD86) are shown.
  • the presence of TLR shows the result when the intracellular domain of TLR shown in the upper left of the graph is adopted as the intracellular domain, and the case without TLR shows the result when there is no intracellular domain.
  • TLR + CD40 has the intracellular domain of TLR and the intracellular domain of CD40 shown in the upper left of the graph as intracellular domains (in display, the left side shows the cell membrane side). It is the result when adopted, and the result when TLR + CD40 is absent shows the result when there is no intracellular domain.
  • the description of the vertical axis and the horizontal axis is the same as that in FIG.
  • the results of the in vitro macrophage phagocytosis test (Test Example 5) are shown.
  • the horizontal axis indicates the intracellular domain, and ⁇ indicates the case where there is no intracellular domain.
  • the vertical axis shows the phagocytic ability of macrophages.
  • Test Example 6 When MSLN-expressing cell (Pan02 / MSLN) transplanted mice were used) are shown. Empty indicates the case where dendritic cells introduced with an empty vector (pMXs-GFP) are administered, and MSLN-TLR9 is a chimeric target factor receptor-expressing dendritic cell (Test Example 2: target is MSLN, intracellular domain is Indicates the case where the intracellular domain of TLR9) is administered, and Control indicates the case where the cells are not administered. The vertical axis shows the tumor size, and the horizontal axis shows the number of days since the first administration.
  • the results of the in vitro dendritic cell activation test (Test Example 8, index factor MHC class II) are shown. The description of each display is the same as that in FIG.
  • the results of an evaluation test of antitumor effect (Test Example 9, when MSLN-expressing cell (Pan02 / MSLN) transplanted mice were used) are shown. Control indicates the case where cells are not administered, and the others indicate the target (MSLN) of the chimeric target factor receptor and the intracellular domain (for example, "TLR9" indicates the intracellular domain of TLR9. " ⁇ " indicates no intracellular domain. Shows.).
  • the vertical axis shows the tumor size, and the horizontal axis shows the number of days since the first administration.
  • Identity of amino acid sequences refers to the degree of coincidence of amino acid sequences with each other among two or more comparable amino acid sequences. Therefore, the higher the match between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences.
  • the level of amino acid sequence identity is determined, for example, using FASTA, a sequence analysis tool, using default parameters.
  • FASTA a sequence analysis tool
  • the algorithm BLAST by Karlin and Altschul Karlin and Altschul (KarlinS, Altschul SF. “Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features” Proc Natl Acad Sci USA. 87: 2264-2268 (1990), K. It can be determined using “Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences.” Proc Natl Acad Sci USA.
  • BLASTX based on such a BLAST algorithm has been developed. Specific methods for these analysis methods are known, and the National Center for Biotechnology Information (NCBI) website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) can be referred to. In addition, the "identity" of the base sequence is also defined according to the above.
  • conservative substitution means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • substitution between amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine is a conservative substitution.
  • amino acid residues with acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues with non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine
  • Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine and tryptophan
  • amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine and isoleucine
  • aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan and histidine Substitution between amino acid residues is also a conservative substitution.
  • CDR is an abbreviation for Complementarity Measuring Region and is also referred to as a complementarity determining region.
  • the CDR is a region existing in the variable region of the immunoglobulin or T cell receptor, and is a region deeply involved in the specific binding of the antibody or T cell receptor to the antigen.
  • the "light chain CDR” means a CDR existing in the light chain variable region of immunoglobulin
  • the “heavy chain CDR” means a CDR existing in the heavy chain variable region of immunoglobulin.
  • the T cell receptor also has an ⁇ chain, a ⁇ chain, a ⁇ chain, a ⁇ chain, and the like, and the same applies to these CDRs.
  • the "variable region” means an region including CDR1 to CDR3 (hereinafter, simply referred to as "CDRs1-3").
  • CDRs1-3 CDR1 to CDR3
  • the arrangement order of these CDRs1-3 is not particularly limited, but preferably, the frames are continuous or described later in the order of CDR1, CDR2, and CDR3 in the direction from the N-terminal side to the C-terminal side, or vice versa. It means a region arranged via another amino acid sequence called a work region (FR).
  • the "heavy chain variable region” is a region in which the above-mentioned heavy chain CDRs1-3 is arranged in the immunoglobulin, and the "light chain variable region” is the above-mentioned light chain CDRs1-3 in the immunoglobulin. Is the area where is placed.
  • the T cell receptor also has an ⁇ chain, a ⁇ chain, a ⁇ chain, a ⁇ chain, and the like, and the same applies to these CDRs.
  • FR framework areas
  • the region between the N-terminal of the variable region and CDR1 is FR1
  • the region between CDR1 and CDR2 is FR2
  • the region between CDR2 and CDR3 is FR3
  • the region between CDR3 and the C-terminal of the variable region is Defined as FR4 respectively.
  • the chimeric target factor receptors include, in one embodiment, an intracellular domain including a target factor binding domain, a transmembrane domain, and a TLR intracellular domain. It may also be referred to as "the chimeric target factor receptor of the invention"). This will be described below.
  • the target factor-binding domain is a domain that is arranged extracellularly when the chimeric target factor receptor of the present invention is placed on the cell membrane, recognizes the target factor, and binds to the target factor (preferably). As long as it is a domain that can be specifically bound), it is not particularly limited.
  • the target factor include cancer antigens, various receptors (for example, cytokine receptors such as interleukin receptors, cell growth factor receptors, etc.), cell adhesion factors, bacterial / viral membrane proteins, and the like.
  • target factors include CD19, GD2, GD3, CD20, CD37, CEA, HER2, EGFR, type III mutant EGFR, CD38, BCMA, MUC-1, PSMA, WT1, cancer testis antigen (eg NY-ESO).
  • mutation peptide eg k-ras, h-ras, p53, etc.
  • hTERT PRAM, TYRP1, mesoterin, PMEL, mucin, IL-12R, IL-4R, IL-13R, IL -6R, IL-23R, CTLA4, EGFR806, PSCA, Claudin 18.2, EpCAM, VEGFR2, Nectin4 / FAP, LewisY, Glypican-3, IL-13R ⁇ 2, CD171, MUC16, AFP, AXL, CD80 / 86, c-MET, DLL-3, DR5, Epidermal, FR- ⁇ , gp100, MAGE-A1 / 3/4, LMP1 and the like can be mentioned.
  • Target factor binding domains include, for example, domains containing CDRs of antibodies or T cell receptors, domains containing all or part of cytokines or cell growth factors (cytokines or cell growth factor domains), all or one of cell adhesion factors. Examples include a domain containing a moiety (cell adhesion factor domain).
  • the domains containing the CDRs of an antibody or T cell receptor are usually the CDRs of the antibody or T cell receptor against the target factor (eg, for antibody CDRs, heavy chain CDR1, heavy chain CDR2, heavy chain CDR3, light chain. It has one or more of CDR1, light chain CDR2, and light chain CDR3), preferably two, three, four, five or more, and more preferably all six.
  • the domain containing the CDR more preferably comprises a variable region of the antibody or T cell receptor against the target factor (in the case of an antibody, for example, a heavy chain variable region and / or a light chain variable region).
  • the cytokine or cell growth factor domain include domains including domains having receptor binding properties such as IL-12, IL-4, IL-13, IL-6, IL-23, and GM-CSF. Be done.
  • the target factor binding domain is a domain containing CDR
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are usually linked via a linker.
  • the linker is not particularly limited and is optional as long as the target factor binding property is not significantly impaired.
  • the linker is preferably glycine or a linker composed of glycine and serine (GGS linker, GS linker, GGG linker, etc.).
  • the length of the linker is not particularly limited.
  • the number of amino acid residues of the linker is, for example, 5 to 30.
  • the arrangement relationship between the heavy chain variable region and the light chain variable region is not particularly limited, and can be adopted in either the embodiment in which the N-terminal side is the light chain variable region or the case where the N-terminal side is the heavy chain variable region.
  • the transmembrane domain is a domain that is arranged in the cell membrane when the chimeric target factor receptor of the present invention is arranged on the cell membrane, and is not particularly limited as long as it can constitute the chimeric target factor receptor. ..
  • a transmembrane domain such as CD28, CD3 ⁇ , CD8 ⁇ , CD3, CD4, 4-1BB can be used.
  • the transmembrane domain can be easily determined from known or known sequence information (eg, using a transmembrane domain prediction program or the like).
  • a transmembrane domain composed of an artificially constructed polypeptide may be used. Mutations may be appropriately introduced into these transmembrane domains as long as they do not significantly inhibit the function of the chimeric target factor receptor.
  • transmembrane domain a transmembrane region of CD28 can be preferably adopted.
  • Specific examples of the transmembrane domain of CD28 include the amino acid sequence described in (a) below or the amino acid sequence described in (b) below:
  • the chimeric target factor receptor of the present invention having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in (a) SEQ ID NO: 2 or (b) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is arranged on the cell membrane. Examples thereof include amino acid sequences that can be arranged in the cell membrane at the time.
  • the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • amino acid sequence described in (b) above for example, an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in (b') SEQ ID NO: 3.
  • examples thereof include amino acid sequences that can be arranged in the cell membrane when the chimeric target factor receptor of the present invention is arranged on the cell membrane.
  • the plurality is, for example, 2 to 5, preferably 2 to 3, and more preferably 2.
  • the target factor binding domain and the transmembrane domain are linked directly or via a spacer.
  • the sequence of the spacer is not particularly limited, but for example, an IgG, preferably a hinge part of human IgG (for example, subtype IgG1 or IgG4) or a part thereof, a hinge part and a part of CH2, or a factor used for a transmembrane domain (for example).
  • An arrangement such as a part of CD28) can be used for the spacer.
  • the intracellular domain is a domain that is arranged intracellularly when the chimeric target factor receptor of the present invention is arranged on the cell membrane, and is a domain capable of transmitting a signal necessary for activation of antigen-presenting cells. Is.
  • the intracellular domain includes the TLR intracellular domain.
  • the TLR intracellular domain is a domain consisting of the amino acid sequence of the intracellular domain of TLR (Toll-like receptor), and is not particularly limited as long as this.
  • TLR for example, TLRs derived from various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits can be adopted. Of these, TLRs derived from the target organism (for example, human) are preferable.
  • the amino acid sequences of the TLR intracellular domains from various species are known.
  • TLR examples include TLR1 (for example, the amino acid sequence of the intracellular domain is SEQ ID NO: 3), TLR2 (for example, the amino acid sequence of the intracellular domain is SEQ ID NO: 4), and TLR3 (for example, the amino acid sequence of the intracellular domain is SEQ ID NO: 5).
  • TLR4 for example, the amino acid sequence of the intracellular domain is SEQ ID NO: 6
  • TLR9 for example, the amino acid sequence of the intracellular domain is SEQ ID NO: 7 and the like.
  • TLR2, TLR3, TLR9 and the like are preferable from the viewpoint of the ability to activate antigen-presenting cells and the viewpoint of being able to activate antigen-presenting cells earlier and more sustainably in response to a target factor.
  • TLR3, TLR9 and the like are more preferable, and TLR3 is more preferable.
  • the TLR intracellular domain is at least one selected from the group consisting of the TLR2 intracellular domain, the TLR3 intracellular domain, and the TLR9 intracellular domain.
  • the TLR intracellular domain may have mutations such as amino acid substitution, deletion, addition, and insertion as long as it has an antigen-presenting cell activating effect.
  • mutations include substitution, more preferably conservative substitution, from the viewpoint that the above action is less likely to be impaired.
  • amino acid sequence of the TLR intracellular domain include the amino acid sequence described in (c) below and the amino acid sequence described in (d) below: It has 85% or more identity with the amino acid sequence shown in any of (c) SEQ ID NOs: 3 to 7 and (d) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 3 to 7, and has antigen-presenting cell activity. At least one selected from the group consisting of amino acid sequences constituting a protein having a chemical action can be mentioned.
  • the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • amino acid sequence described in (d) above for example, an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in (d') SEQ ID NO: 4.
  • amino acid sequence having an antigen-presenting cell activating effect can be mentioned.
  • the plurality is, for example, 2 to 5, preferably 2 to 3, and more preferably 2.
  • the intracellular domain preferably further contains the CD40 intracellular domain from the viewpoint of the ability to activate the antigen-presenting cell, the viewpoint of being able to activate the antigen-presenting cell earlier and more sustainably in response to the target factor, and the like. be able to.
  • the CD40 intracellular domain is a domain consisting of the amino acid sequence of the intracellular domain of the amino acid of CD40, and is not particularly limited as long as this.
  • CD40 for example, CD40 derived from various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits can be adopted. Of these, CD40 derived from a target organism (for example, human) is preferable.
  • amino acid sequences of the intracellular domains of CD40 derived from various species are known. Specifically, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 can be mentioned.
  • the intracellular domain of CD40 may have mutations such as amino acid substitution, deletion, addition, and insertion as long as it has an antigen-presenting cell activating effect.
  • mutations include substitution, more preferably conservative substitution, from the viewpoint that the above action is less likely to be impaired.
  • amino acid sequence of the intracellular domain of CD40 include the amino acid sequence described in (e) below and the amino acid sequence described in (f) below: (E) Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and (f) Amino acid sequence constituting a protein having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having an antigen-presenting cell activating effect. At least one species selected from the group consisting of.
  • the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • amino acid sequence described in (f) above for example, an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in (f') SEQ ID NO: 8.
  • amino acid sequence having an antigen-presenting cell activating effect can be mentioned.
  • the plurality is, for example, 2 to 5, preferably 2 to 3, and more preferably 2.
  • the arrangement relationship between the TLR intracellular domain and the CD40 intracellular domain is not particularly limited, and the embodiment in which the N-terminal side is the TLR intracellular domain and the N-terminal side is the CD40 intracellular domain. It can be adopted in any case.
  • the TLR intracellular domain and the CD40 intracellular domain are preferably directly linked or linked via a linker.
  • the linker is not particularly limited and is arbitrary.
  • the linker is preferably glycine or a linker composed of glycine and serine (GGS linker, GS linker, GGG linker, etc.).
  • the length of the linker is not particularly limited.
  • the number of amino acid residues of the linker is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 5.
  • the chimeric target factor receptor of the present invention can include regions other than the above.
  • Other regions include intracellular domains such as CD3 ⁇ and Fc ⁇ RI ⁇ , leader sequences (signal peptides) (eg, GM-CSF receptor leader sequences) to facilitate transport of CAR onto the cell membrane, spacers / linkers (eg, eg). Between the transmembrane region and the intracellular signal domain, between each domain in the intracellular domain) and the like.
  • the target factor binding domain, the transmembrane domain, and the intracellular domain are arranged in this order.
  • the chimeric target factor receptor of the present invention may be a molecule composed of one kind of polypeptide or a molecule composed of a complex of two or more kinds of polypeptides. Further, the chimeric target factor receptor of the present invention may be a molecule composed of a polypeptide or a complex thereof, and the polypeptide or the complex thereof may contain other substances (for example, fluorescent substances, radioactive substances, inorganic particles, etc.). ) May be concatenated.
  • the chimeric target factor receptor of the present invention may be chemically modified.
  • the polypeptide constituting the chimeric target factor receptor of the present invention has a C-terminal of either a carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO- ) , an amide (-CONH 2 ) or an ester (-COOR). May be good.
  • R in the ester is, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; for example, phenyl.
  • C 6-12 aryl groups such as ⁇ -naphthyl; for example, phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl, phenethyl; C 7- such as ⁇ -naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl. 14 Alkyl group; Pivaloyloxymethyl group etc. are used.
  • the polypeptide constituting the chimeric target factor receptor of the present invention may have a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal amidated or esterified. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue is a protective group (for example, C 1-6 such as formyl group and acetyl group, and C 1- such as alkanoyl.
  • a protective group for example, C 1-6 such as formyl group and acetyl group, and C 1- such as alkanoyl.
  • substituents on the side chain of amino acids in the molecule for example, -OH, -SH, amino group, imidazole group, indol group, guanidino group, etc. are protected by suitable protective groups (eg, C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl group such as formyl group, acetyl group). Is also included.
  • the chimeric target factor receptor of the present invention may be one to which a protein or peptide such as a known protein tag or signal sequence is added.
  • a protein or peptide such as a known protein tag or signal sequence
  • the protein tag include biotin, His tag, FLAG tag, Halo tag, MBP tag, HA tag, Myc tag, V5 tag, PA tag, fluorescent protein tag and the like.
  • the chimeric target factor receptor of the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt with an acid or base.
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and either an acidic salt or a basic salt can be adopted.
  • acidic salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, and phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, and apple.
  • Organic acid salts such as acid salts, citrates, methane sulfonates and paratoluene sulfonates; amino acid salts such as asparaginates and glutamates can be mentioned.
  • basic salts include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt.
  • the chimeric target factor receptor of the present invention may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid and the like.
  • the present invention relates to, in one aspect, a polynucleotide encoding a chimeric target factor receptor of the present invention (sometimes referred to herein as the "polynucleotide of the present invention"). This will be described below.
  • the polynucleotide of the present invention may contain other sequences in addition to the coding sequence of the chimeric target factor receptor of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention preferably contains the chimeric target factor receptor of the present invention in an expressible state.
  • Other sequences include promoter sequences, enhancer sequences, repressor sequences, insulator sequences, replication origins, reporter protein (eg, fluorescent protein, etc.) coding sequences, drug resistance gene coding sequences, and the like.
  • the polynucleotide of the present invention preferably comprises an expression cassette of the chimeric target factor receptor of the present invention.
  • the expression cassette contains a promoter and the coding sequence of the chimeric target factor receptor of the present invention under the control of the promoter.
  • the coding sequence is usually placed downstream of the promoter so that it is under the control of the promoter.
  • promoters that can be used in the expression cassette include CMV-IE (cytomegalovirus early gene-derived promoter), SV40ori, retrovirus LTP, SR ⁇ , EF1 ⁇ , ⁇ -actin promoter and the like.
  • the promoter is operably linked to the coding sequence.
  • the promoter is operably linked to the coding sequence
  • the coding sequence is arranged under the control of the promoter", and is usually directly on the 3'end side of the promoter.
  • the code sequences will be concatenated via other sequences.
  • a poly A addition signal sequence is placed downstream of the coding sequence. Transcription is terminated by the use of the poly A addition signal sequence.
  • a poly A addition sequence of SV40, a poly A addition sequence of a bovine growth hormone gene, or the like can be used as the poly A addition signal sequence.
  • a detection gene (reporter gene, cell or tissue-specific gene, selectable marker gene, etc.), enhancer sequence, WRPE sequence, etc. may be included in the expression cassette.
  • the detection gene is used for determining the success or failure and efficiency of the introduction of the expression cassette, detecting the expression of the CAR gene or determining the expression efficiency, selecting and sorting the cells expressing the CAR gene, and the like. On the other hand, the expression efficiency can be improved by using the enhancer sequence.
  • the genes for detection include the neo gene that imparts resistance to neomycin, the npt gene (Herrera Estrella, EMBO J.
  • GUS ⁇ -Glucronidase
  • genes for fluorescent proteins such as GFP (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) and their variants (EGFP, d2EGFP, etc.
  • GFP Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) and their variants (EGFP, d2EGFP, etc.
  • intracellular domains Genes such as the missing epithelial growth factor receptor (EGFR) gene can be used.
  • the detection gene is linked to the chimeric target factor receptor gene via, for example, a bicistronic control sequence (eg, ribosome internal recognition sequence (IRES)) or a sequence encoding a self-cleaving peptide.
  • a bicistronic control sequence eg, ribosome internal recognition sequence (IRES)
  • IRS ribosome internal recognition sequence
  • An example of a self-cleaving peptide is, but is not limited to, a 2A peptide (T2A) derived from Thosea signa virus.
  • E2A horse rhinitis A virus
  • P2A porcine teschovirus
  • the polynucleotide of the present invention may be a linear polynucleotide or a cyclic polynucleotide (vector or the like).
  • the vector can be a plasmid vector or a viral vector.
  • the vector can be, for example, a cloning vector or an expression vector.
  • Examples of the expression vector include a vector for prokaryotic cells such as Escherichia coli and actinomycetes, and a vector for eukaryotic cells such as yeast cells, insect cells, and mammalian cells.
  • virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpesvirus vectors, Sendaivirus vectors, and examples of non-viral vectors include various plasmid vectors.
  • Lipstick vector positively charged liposome vector (Felgner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 7413-7417, 1987), YAC vector, BAC vector. be able to.
  • the polynucleotide of the present invention includes not only DNA and RNA, but also those to which known chemical modifications are applied, as illustrated below.
  • PS phosphorothioate
  • methylphosphonate methylphosphonate
  • phosphorodithionate to prevent degradation by hydrolytic enzymes such as nucleases.
  • the hydroxyl group at the 2-position of the sugar (ribose) of each ribonucleotide is changed to -OR (R is, for example, CH3 (2'-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2'-O-MOE), CH.
  • the base moiety (pyrimidine, purine) may be chemically modified, for example, introduction of a methyl group or a cationic functional group at the 5-position of the pyrimidine base, or substitution of the carbonyl group at the 2-position with thiocarbonyl.
  • examples thereof include those in which the phosphoric acid moiety and the hydroxyl moiety are modified with a biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • polynucleotide includes not only natural nucleic acids but also any of BNA (Bridged Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), PNA (Peptide Nucleic Acid) and the like.
  • an antigen-presenting cell that is activated in response to a target factor can be obtained by a method including introducing the polynucleotide of the present invention into an antigen-presenting cell.
  • the cell expresses the chimeric target factor receptor of the present invention.
  • antigen-presenting cells into which the polynucleotide of the present invention is introduced include dendritic cells, macrophages, and progenitor cells thereof. Various cell populations can be used as long as they contain these cells.
  • the present invention relates, in one aspect, to cells containing the polynucleotides of the invention (sometimes referred to herein as "cells of the invention”). This will be described below.
  • the cell from which the cell of the present invention is derived is not particularly limited.
  • the derived cells include cells that can be used for protein expression (for example, insect cells, eukaryotic cells, mammalian cells, etc.). Can be mentioned.
  • the cells of the present invention are preferably antigen-presenting cells (eg, dendritic cells, macrophages, etc., particularly preferably dendritic cells).
  • the cell of the present invention can be a stem cell capable of inducing differentiation into an antigen-presenting cell such as an ES cell or an iPS cell.
  • These cells are preferably cells that express the chimeric target factor receptor of the present invention, and in a more specific embodiment, these cells have the target factor receptor of the present invention expressed on the cell membrane.
  • the target factor receptor of the present invention is expressed in a state where the target factor binding domain is exposed outside the cell membrane.
  • Antigen-presenting cells expressing the chimeric target factor receptor recognize the target factor in the target factor-binding domain, and then transmit the recognition signal inside the cell to activate the cell itself.
  • T cells for example, Th1 cells, Th2 cells, Th17 cells, cytotoxic T cells, etc.
  • B cells, etc. can be regulated to exert anticancer activity, immunomodulatory activity, and the like. Therefore, cells containing the polynucleotide encoding the chimeric target factor receptor of the present invention (particularly, antigen-presenting cells) are useful as active ingredients in pharmaceutical compositions.
  • composition relates to, in one aspect, a pharmaceutical composition containing the cells of the present invention (in the present specification, it may be referred to as "the pharmaceutical composition of the present invention”). This will be described below.
  • the pharmaceutical composition of the present invention treats, prevents or improves tumors / cancers expressing target factors, treats, prevents or improves autoimmune diseases, allergic diseases, etc., and treats infectious diseases. , Prevention, improvement, etc. can be widely used.
  • Cancers include solid cancers and hematological malignancies. Examples of cancer include various B-cell malignant lymphomas (B-cell acute lymphoma, follicular lymphoma, diffuse lymphoma, mantle-cell lymphoma, MALT lymphoma, intravascular B-cell lymphoma, CD20-positive hodgkin lymphoma, etc.).
  • Myeloproliferative disorders myelodystrophy / myeloid proliferative tumors (CMML, JMML, CML, MDS / MPN-UC), myelopathy syndrome, acute myeloid leukemia, multiple myeloma, lung cancer, colon cancer, ovary
  • CMML, JMML, CML, MDS / MPN-UC myelopathy syndrome
  • acute myeloid leukemia multiple myeloma
  • lung cancer colon cancer
  • ovary examples include breast cancer, brain tumor, gastric cancer, liver cancer, tongue cancer, thyroid cancer, kidney cancer, prostate cancer, uterine cancer, osteosarcoma, chondrosarcoma, and horizontal print myoma.
  • Treatment includes alleviating (mitigating) the symptom or associated symptom characteristic of the target disease, preventing or delaying the exacerbation of the symptom, and the like.
  • Prevention means preventing or delaying the onset / delay of a disease (disorder) or its symptoms, or reducing the risk of onset / onset.
  • improvement means that the disease (disorder) or its symptom is alleviated (mild), improved, remitted, or cured (including partial cure).
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains a therapeutically effective amount of the cells of the present invention.
  • it can contain 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 10 cells for a single dose.
  • Various components for the purpose of cell activation, growth or differentiation induction, such as dimethylsulfoxide (DMSO) and serum albumin for the purpose of protecting cells, antibiotics for the purpose of preventing bacterial contamination, etc. , Cytokines, growth factors, steroids, etc.) can be contained in cell preparations.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited. For example, it is administered by intravenous injection, intraarterial injection, intraportal injection, intradermal injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, or intraperitoneal injection.
  • Local administration may be used instead of systemic administration.
  • direct injection into a target tissue / organ / organ can be exemplified.
  • the administration schedule may be prepared in consideration of the gender, age, body weight, pathological condition, etc. of the subject (patient). In addition to a single dose, multiple doses may be administered continuously or periodically.
  • the pharmaceutical composition of the present invention and the cells of the present invention can be used in combination with other drugs.
  • the pharmaceutical compositions of the invention, the cells of the invention are in particular immune checkpoint inhibitors (eg, anti-PD-1 antibodies (eg, nivolumab, pembrolizumab, etc.), anti-PD-L1 antibodies (eg, tecentriq, durvalumab, avelumab, etc.), etc. ), Anti-CTLA-4 antibody (for example, ipilimumab, etc.), etc.), the antitumor effect and the like can be improved.
  • immune checkpoint inhibitors eg, anti-PD-1 antibodies (eg, nivolumab, pembrolizumab, etc.), anti-PD-L1 antibodies (eg, tecentriq, durvalumab, avelumab, etc.), etc.
  • Anti-CTLA-4 antibody for example, ipilimumab, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention and the cells of the present invention can be used in combination with an immune checkpoint inhibitor, and the pharmaceutical composition of the present invention may contain an immune checkpoint inhibitor.
  • the timing of concomitant use is not particularly limited, and for example, the pharmaceutical composition of the present invention, the cells of the present invention and the immune checkpoint inhibitor may be administered simultaneously or on the same day, or one or more on one administration day. The other may be administered before or after the day (for example, 2 to 14 days).
  • Test example 1 Preparation of chimeric target factor receptor construct From the N-terminal side, -GMCSFR signal peptide (amino acid sequence: SEQ ID NO: 19, base sequence: SEQ ID NO: 20), -Anti-Her2 scFv domain (amino acid sequence: SEQ ID NO: 1, base sequence: SEQ ID NO: 9), -CD28 transmembrane domain (amino acid sequence: SEQ ID NO: 2, base sequence: SEQ ID NO: 10), ⁇ Intracellular domain: (A) TLR1 intracellular domain (amino acid sequence: SEQ ID NO: 3, base sequence: SEQ ID NO: 11) (B) TLR2 intracellular domain (amino acid sequence: SEQ ID NO: 4, base sequence: SEQ ID NO: 12) (C) TLR3 intracellular domain (amino acid sequence: SEQ ID NO: 5, base sequence: SEQ ID NO: 13) (D) TLR4 intracellular domain (amino acid sequence: SEQ ID NO: 6, base sequence: SEQ ID NO
  • -GMCSFR signal peptide amino acid sequence: SEQ ID NO: 19, base sequence: SEQ ID NO: 20
  • -Anti-mesocerin (MSLN) scFv domain amino acid sequence: SEQ ID NO: 17, base sequence: SEQ ID NO: 18
  • CD28 transmembrane domain ⁇ Intracellular domain: (A) TLR1 intracellular domain (B) TLR2 intracellular domain (C) TLR3 intracellular domain (D) TLR4 intracellular domain (E) TLR9 intracellular domain (F) TLR2 intracellular domain-CD40 intracellular domain, (G) TLR9 intracellular domain-CD40 intracellular domain (H) CD40 intracellular domain (I) CD40 intracellular domain-TLR9 intracellular domain (J)
  • A TLR1 intracellular domain
  • B TLR2 intracellular domain
  • C TLR3 intracellular domain
  • D TLR4 intracellular domain
  • E TLR9 intracellular domain
  • F TLR2 intracellular domain-CD40 intracellular domain
  • G TLR9 intra
  • the coding sequence of the chimeric target factor receptor and the chimeric target factor receptor lacking the intracellular domain in the chimeric target factor receptor is inserted into the pMXs-GFP vector (Cosmo Bio), and pMXs-CAR- A GFP vector was obtained.
  • Test example 2 Preparation of chimeric target factor receptor-expressing dendritic cells Retrovirus preparation cells Introduced pMXs-CAR-GFP vector (Test Example 1) into Plat-A cells (Cell Biolabs Inc) using TransIT-293 Reagent (Mirus). did. After 48 hours, the culture supernatant was collected. Culture supernatant was added to THP-1 cells (obtained from JCRB cell bank) and infected with virus. 48 hours after infection, GFP-positive cells were collected by BD FACS Aria. Human GM-CSF (BioLegend) and human IL-4 (BioLegend) were added to the obtained cells and cultured for 5 days to differentiate them into dendritic cells to obtain chimeric target factor receptor-expressing dendritic cells.
  • Human GM-CSF BioLegend
  • human IL-4 BioLegend
  • Test example 3 Preparation of chimeric target factor receptor-expressing macrophages
  • a pMXs-CAR-GFP vector (Test Example 1) was introduced into retrovirus-prepared cells Plat-A cells (Cell Biolabs Inc.) using TransIT-293 Reagent (Mirus). After 48 hours, the culture supernatant was collected. Culture supernatant was added to U937 cells (obtained from JCRB cell bank) and infected with virus. 48 hours after infection, GFP-positive cells were collected by BD FACS Aria to obtain chimeric target factor receptor-expressing macrophages.
  • Test example 4 In vitro dendritic cell activation test 1 Chimeric target factor receptor-expressing dendritic cells (Test Example 2: Target factor is Her2) are added to Her2-expressing cells (SKOV3 cells: obtained from ATCC), cultured for 5, 24, and 48 hours, and used as an index of dendritic cell activation. The expression of factors (CD80 and CD86) was examined by FACS.
  • FIGS. 1 to 3 it was found that the expression of CD80 can be increased in response to the target factor by adopting the intracellular domain of TLR as the intracellular domain.
  • the expression of CD80 can be increased at a relatively early stage (5 hours, FIG. 1), and the intracellular domains of TLR2, 3 and 9 are adopted. It was found that the expression of CD80 could be increased more continuously (48 hours, Fig. 3). It was also found that by adopting the intracellular domain of TLR as the intracellular domain, as shown in FIG. 4, the expression of CD86 can be increased in response to the target factor.
  • the use of the intracellular domain of CD40 in addition to the intracellular domain of TLR as the intracellular domain can increase the expression of CD86 more continuously (24 hours, FIG. 5).
  • Test example 5 In vitro macrophage phagocytosis test Chimeric target factor receptor-expressing macrophages (Test Example 2: Target factor is Her2) were added to Her2-expressing cells (SKOV3 cells: obtained from ATCC), cultured for 48 hours, and the phagocytosis assay kit (Cayman) was used. The phagocytosis was examined using.
  • Fig. 6 As shown in FIG. 6, it was found that by adopting the intracellular domain of TLR as the intracellular domain, macrophages can also be activated in response to the target factor.
  • Test example 6 Evaluation test of antitumor effect 1 ⁇ Test Example 6-1.
  • the obtained vector and pCL-Eco vector (Addgene) were introduced into G3T-hi cells (Takara Bio) using TransIT-293 Reagent (Mirus).
  • the culture supernatant was collected. Culture supernatant was added to mouse pancreatic cancer cells Pan02 cells and infected with the virus. 48 hours after infection, GFP-positive cells were collected by BD FACS Aria.
  • Test Example 6-2 Evaluation of antitumor effect> Pan02 or Pan02 / MSLN (Test Example 6-1) was transplanted subcutaneously into mice, and dendritic cells (Empty: pMXs-GFP introduced) or chimeric target factor receptor-expressing dendritic cells (Test Example 2: target was MSLN and intracellular domain were administered (E) in Test Example 1 and their antitumor effects were examined using tumor growth suppression as an index. A tumor shredded into 2 mm squares was transplanted subcutaneously into the flank of the mouse with a tumor transplant needle. When the tumor reached a size of 100 mm 3 , grouping was performed and cell administration was started.
  • dendritic cells Empty: pMXs-GFP introduced
  • Test Example 2 target was MSLN and intracellular domain were administered (E) in Test Example 1 and their antitumor effects were examined using tumor growth suppression as an index.
  • a tumor shredded into 2 mm squares was transplanted subcutaneously into the flank
  • FIGS. 7 and 8 As shown in FIGS. 7 and 8, it was found that by adopting the intracellular domain of TLR as the intracellular domain, an antitumor effect can be exerted in response to the target factor (MSLN).
  • MSLN target factor
  • Test example 7 In vitro dendritic cell activation test 2 Chimera target factor receptor-expressing dendritic cells (Test Example 2: Target factor is Her2) were added to Her2-expressing cells (SKOV3 cells: obtained from ATCC), cultured for 24 hours, and used as an indicator factor for dendritic cell activation (MHC class). The expression of I and MHC class II) was examined by FACS.
  • Test example 8 In vitro dendritic cell activation test 3 ⁇ Test Example 8-1. Preparation of MSLN-expressing mouse tumor cells Panc-1 / MSLN> The human MSLN gene was introduced into the pMXs-rCD2 vector. The obtained vector was introduced into Plat-A cells (Cell Biolabs Inc.) using TransIT-293 Reagent (Mirus). After 48 hours, the culture supernatant was collected. Culture supernatant was added to human pancreatic cancer cells Panc-1 cells (obtained from ATCC) and infected with the virus. 48 hours after infection, rCD2-positive cells were collected by BD FACS Aria.
  • Test Example 8-2 Evaluation test for activation> Chimeric target factor receptor-expressing dendritic cells (Test Example 2: target factor is MSLN) were added to Panc-1 / MSLN (Test Example 8-1), cultured for 24 hours, and an indicator factor for dendritic cell activation (CD86). And MHC class II) expression was examined by FACS.
  • target factor is MSLN
  • FIGS. 11-12 The results are shown in FIGS. 11-12. It was found that by adopting the intracellular domain of TLR as the intracellular domain, the expression of CD86 and MHCclas II can be increased even when a target factor different from that of Test Examples 4 and 8 is adopted. rice field. Also in this test example, it was found that the degree / persistence of dendritic cell activation can be increased by using the intracellular domain of CD40 in addition to the intracellular domain of TLR as the intracellular domain. ..
  • Test example 9 Evaluation test of antitumor effect 2 Pan02 or Pan02 / MSLN (Test Example 6-1) was transplanted subcutaneously into mice, and dendritic cells (Empty: pMXs-GFP introduced) or chimeric target factor receptor-expressing dendritic cells were administered to suppress tumor growth. The antitumor effect of each was examined using the above as an index.
  • the target of the administered chimeric target factor receptor-expressing dendritic cells is MSLN, and the intracellular domains of the chimeric target factor receptor are (A) to (E), (H), and (H) of Test Example 1. It is one of (J).
  • a tumor shredded into 2 mm squares was transplanted subcutaneously into the flank of the mouse with a tumor transplant needle. Seven days after transplantation, grouping was performed and cell administration was started. 1 x 10 5 cells (dendritic cells (Empty) or chimeric target factor receptor-expressing dendritic cells) were administered once (Day 0) into the tumor. Tumor size was measured twice a week to assess antitumor efficacy.
  • Test example 10 Evaluation test of antitumor effect 3 Pan02 or Pan02 / MSLN (Test Example 6-1) was transplanted subcutaneously into mice, and dendritic cells (Empty: pMXs-GFP introduced) or chimeric target factor receptor-expressing dendritic cells were administered to suppress tumor growth. The antitumor effect of each was examined using the above as an index.
  • the target of the administered chimeric target factor receptor-expressing dendritic cell is MSLN, and the intracellular domain of the chimeric target factor receptor is (C) or (E) of Test Example 1.
  • a tumor shredded into 2 mm squares was transplanted subcutaneously into the flank of the mouse with a tumor transplant needle.
  • PD-1 antibody chimeric target factor receptor-expressing dendritic cells
  • Table 1 shows the results when the intracellular domain of the chimeric target factor receptor is the intracellular domain of TLR-3
  • Table 2 shows the results when the intracellular domain of the chimeric target factor receptor is the intracellular domain of TLR-9. The result when is.
  • the "Day" column indicates the number of days elapsed when 7 days have passed since the transplantation as Day 0.
  • Test example 11 Evaluation test of antitumor effect 4 Pan02 or Pan02 / MSLN (Test Example 6-1) was transplanted subcutaneously into mice, and dendritic cells (Empty: pMXs-GFP introduced) or chimeric target factor receptor-expressing dendritic cells were administered to suppress tumor growth. The antitumor effect of each was examined using the above as an index.
  • the target of the administered chimeric target factor receptor-expressing dendritic cells is MSLN, and the intracellular domain of the chimeric target factor receptor is (E), (F), or (I) of Test Example 1. be.
  • a tumor shredded into 2 mm squares was transplanted subcutaneously into the flank of the mouse with a tumor transplant needle.

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Abstract

樹状細胞等の抗原提示細胞を標的因子特異的に活性化することができる、キメラ標的因子受容体を提供すること。 標的因子結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、及びTLR細胞内ドメインを含む細胞内ドメインを含む、キメラ標的因子受容体。

Description

キメラ標的因子受容体
　本発明は、キメラ標的因子受容体等に関する。
　キメラ抗原受容体は、抗体の特異性に従って抗原に結合し、これにより標的細胞の傷害・サイトカイン放出・刺激後のT細胞分裂を起こすことができる。遺伝子導入によってT細胞に特異性を与えることが可能であり、細胞の調製は内在性の腫瘍特異的T細胞レセプター陽性T細胞を培養増幅する場合に比べて総じて容易である。また、キメラ抗原受容体を利用した治療法（CAR-T療法）は、抗体療法と比べて高い細胞傷害活性を示すことができる。
　樹状細胞は、細菌、ウイルスなどの微生物特異的抗原を認識し自然免疫活性化を担う免疫細胞である。この免疫活性化能に着目し、がん抗原を認識させた樹状細胞を体内に戻す「樹状細胞ワクチン療法」なども試みられている。
US 2017/0151281 A1
　キメラ抗原受容体を樹状細胞に組み込んだCAR-DCとしては、特許文献１で報告されている。しかしながら、細胞内ドメインの構成について詳細に検討された報告は無い。
　本発明は、樹状細胞等の抗原提示細胞を標的因子特異的に活性化することができる、キメラ標的因子受容体を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、標的因子結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、及びTLR細胞内ドメインを含む細胞内ドメインを含む、キメラ標的因子受容体、であれば、上記課題を解決できることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　標的因子結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、及びTLR細胞内ドメインを含む細胞内ドメインを含む、キメラ標的因子受容体。
　項２．　前記TLR細胞内ドメインが、TLR2細胞内ドメイン、TLR3細胞内ドメイン、及びTLR9細胞内ドメインからなる群より選択される少なくとも1種である、項１に記載のキメラ標的因子受容体。
　項３．　前記TLR細胞内ドメインが、TLR3細胞内ドメイン、及びTLR9細胞内ドメインからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１又は２に記載のキメラ標的因子受容体。
　項４．　前記細胞内ドメインがさらにCD40細胞内ドメインを含む、項１～３のいずれかに記載のキメラ標的因子受容体。
　項５．　前記標的因子結合性ドメインの構造が単鎖抗体構造である、項１～４のいずれかに記載のキメラ標的因子受容体。
　項６．　前記標的因子が、がん抗原、サイトカイン受容体、及び細胞増殖因子受容体からなる群より選択される少なくとも1種である、項１～５のいずれかに記載のキメラ標的因子受容体。
　項７．　項１～６のいずれかに記載のキメラ標的因子受容体をコードする、ポリヌクレオチド。
　項８．　項７に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
　項９．　抗原提示細胞である、項８に記載の細胞。
　項１０．　樹状細胞である、請求項８又は９に記載の細胞。
　項１１．　項８～１０のいずれかに記載の細胞を含有する、医薬組成物。
　項１２．　がん、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び感染症からなる群より選択される少なくとも1種の治療、予防、又は改善用である、項１１に記載の医薬組成物。
　項１２Ａ．　がん、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び感染症からなる群より選択される少なくとも1種を有する対象又は患者に対して、項８～１０のいずれかに記載の細胞を投与することを含む、がん、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び感染症からなる群より選択される少なくとも1種の治療、予防、又は改善方法。
　項１２Ｂ．　がん、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び感染症からなる群より選択される少なくとも1種の治療、予防、又は改善用医薬組成物としての使用のための、項８～１０のいずれかに記載の細胞。
　項１２Ｃ．　がん、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び感染症からなる群より選択される少なくとも1種の治療、予防、又は改善用医薬組成物の製造のための、項８～１０のいずれかに記載の細胞の使用。
　項１３．　固形がんの治療、予防、又は改善用である、項１１又は１２に記載の医薬組成物。
　項１４．　前記TLR細胞内ドメインが、TLR3細胞内ドメイン、及びTLR9細胞内ドメインからなる群より選択される少なくとも1種であり、且つ前記細胞が樹状細胞である、項１３に記載の医薬組成物。
　項１５．　前記細胞内ドメインがさらにCD40細胞内ドメインを含み、且つ前記細胞が樹状細胞である、項１３又は１４に記載の医薬組成物。
　項１６．　免疫チェックポイント阻害剤との併用に用いるための、項１１～１５のいずれかに記載の医薬組成物。
　本発明によれば、樹状細胞等の抗原提示細胞を標的因子特異的に活性化することができる、キメラ標的因子受容体を提供することができる。さらに、本発明によれば、当該キメラ標的因子受容体をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む細胞、当該細胞を含む医薬組成物等を提供することもできる。
In vitro樹状細胞活性化試験（試験例4、共培養5時間、指標因子CD80）の結果を示す。TLR有は、細胞内ドメインとしてグラフ左上に示されるTLRの細胞内ドメインを採用した場合の結果であり、TLR無は、細胞内ドメイン無しの場合の結果を示す。横軸は、CD80の発現量を示し、縦軸は細胞数を示す。 In vitro樹状細胞活性化試験（試験例4、共培養24時間、指標因子CD80）の結果を示す。各表示の説明は、図１と同じである。 In vitro樹状細胞活性化試験（試験例4、共培養48時間、指標因子CD80）の結果を示す。各表示の説明は、図１と同じである。 In vitro樹状細胞活性化試験（試験例4、共培養5時間、指標因子CD86）の結果を示す。各表示の説明は、図１と同様である。 In vitro樹状細胞活性化試験（試験例4、共培養24時間、指標因子CD86）の結果を示す。最左列のグラフについて、TLR有は、細胞内ドメインとしてグラフ左上に示されるTLRの細胞内ドメインを採用した場合の結果であり、TLR無は、細胞内ドメイン無しの場合の結果を示す。中央の列及び最右列のグラフについて、TLR+CD40有は、細胞内ドメインとしてグラフ左上に示されるTLRの細胞内ドメインとCD40の細胞内ドメイン（表示中、左側が細胞膜側を示す。）を採用した場合の結果であり、TLR+CD40無は、細胞内ドメイン無しの場合の結果を示す。縦軸と横軸の説明は、図１と同様である。 In vitroマクロファージ貪食試験（試験例5）の結果を示す。横軸は、細胞内ドメインを示し、Δは細胞内ドメイン無しの場合を示す。縦軸は、マクロファージの貪食能を示す。 抗腫瘍効果の評価試験（試験例6、MSLN発現細胞（Pan02/MSLN）移植マウスを使用した場合）の結果を示す。Emptyは、空ベクター（pMXs-GFP）を導入した樹状細胞を投与した場合を示し、MSLN-TLR9は、キメラ標的因子受容体発現樹状細胞（試験例2：標的はMSLN、細胞内ドメインはTLR9の細胞内ドメイン）を投与した場合を示し、Controlは細胞を投与しない場合を示す。縦軸は、腫瘍サイズを示し、横軸は初回投与からの経過日数を示す。 抗腫瘍効果の評価試験（試験例6、MSLN非発現細胞（Pan02）移植マウスを使用した場合）の結果を示す。各表示の説明は、図７と同じである。 In vitro樹状細胞活性化試験（試験例7、指標因子MHC class I）の結果を示す。各表示の説明は、図１と同じである。 In vitro樹状細胞活性化試験（試験例7、指標因子MHC class II）の結果を示す。各表示の説明は、図１と同じである。 In vitro樹状細胞活性化試験（試験例8、指標因子CD86）の結果を示す。各表示の説明は、図１と同じである。 In vitro樹状細胞活性化試験（試験例8、指標因子MHC class II）の結果を示す。各表示の説明は、図５と同様である。 抗腫瘍効果の評価試験（試験例9、MSLN発現細胞（Pan02/MSLN）移植マウスを使用した場合）の結果を示す。Controlは細胞を投与しない場合を示し、その他はキメラ標的因子受容体の標的（MSLN）及び細胞内ドメインを示す（例えば「TLR9」はTLR9の細胞内ドメインを示す。「Δ」は細胞内ドメイン無しを示す。）。縦軸は、腫瘍サイズを示し、横軸は初回投与からの経過日数を示す。 抗腫瘍効果の評価試験（試験例11、MSLN発現細胞（Pan02/MSLN）移植マウスを使用した場合）の結果を示す。Controlは細胞を投与しない場合を示し、その他はキメラ標的因子受容体の標的（MSLN）及び細胞内ドメインを示す（例えば「TLR9」はTLR9の細胞内ドメインを示す。）。縦軸は、腫瘍サイズを示し、横軸は初回投与からの経過日数を示す。
　1．定義
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
　本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　本明細書中において、「CDR」とは、Complementarity Determining Regionの略であり、相補性決定領域とも称される。CDRとは、イムノグロブリン又はT細胞受容体の可変領域に存在する領域であり、抗体又はT細胞受容体の抗原への特異的な結合に深く関与する領域である。なお、「軽鎖CDR」とはイムノグロブリンの軽鎖可変領域に存在するCDRであり、「重鎖CDR」とはイムノグロブリンの重鎖可変領域に存在するCDRのことを意味する。T細胞受容体においても、α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖等があり、これらのCDRについても同様である。
　本明細書中において、「可変領域」とは、CDR1～CDR3（以下、単に「CDRs1-3」という）を含む領域のことを意味する。これらのCDRs1-3の配置順序は特に限定はされないが、好ましくは、N末端側からC末端側の方向に、CDR1、CDR2、及びCDR3の順か、若しくはこの逆の順に、連続又は後述するフレームワーク領域（FR）と称される他のアミノ酸配列を介して、配置された領域を意味する。なお、「重鎖可変領域」とは、イムノグロブリンにおいて、上述の重鎖CDRs1-3が配置された領域であり、「軽鎖可変領域」とは、イムノグロブリンにおいて、上述の軽鎖CDRs1-3が配置された領域である。T細胞受容体においても、α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖等があり、これらのCDRについても同様である。
　各可変領域の上記CDR1-3以外の領域は、上述するようにフレームワーク領域（FR）と称される。特に可変領域のN末端と上記CDR1との間の領域をFR1、CDR1とCDR2との間の領域をFR2、CDR2とCDR3との間の領域をFR3、CDR3と可変領域のC末端との間をFR4とそれぞれ定義される。
　2．キメラ標的因子受容体
　本発明は、その一態様において、標的因子結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、及びTLR細胞内ドメインを含む細胞内ドメインを含む、キメラ標的因子受容体（本明細書において、「本発明のキメラ標的因子受容体」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　標的因子結合性ドメインは、本発明のキメラ標的因子受容体が細胞膜上に配置された際に細胞外に配置されるドメインであり、標的因子を認識して、当該標的因子に結合する（好ましくは特異的に結合する）ことができるドメインである限り、特に制限されない。標的因子としては、例えばがん抗原、各種受容体（例えば、インターロイキン受容体等のサイトカイン受容体、細胞増殖因子受容体等）、細胞接着因子、細菌・ウイルスの膜タンパク質等が挙げられる。標的因子の具体例としては、例えばCD19、GD2、GD3、CD20、CD37、CEA、HER2、EGFR、type III mutant EGFR、CD38、BCMA、MUC-1、PSMA、WT1、cancer testis antigen（例えばNY-ESO-1、MAGE-A4等）、mutation peptide（例えばk-ras、h-ras、p53等）、hTERT、PRAM、TYRP1、メソテリン、PMEL、ムチン、IL-12R、IL-4R、IL-13R、IL-6R、IL-23R、CTLA4、EGFR806、PSCA、Claudin 18.2、EpCAM、VEGFR2、Nectin4/FAP、LewisY、Glypican-3、IL-13Rα2、CD171、MUC16、AFP、AXL、CD80/86、c-MET、DLL-3、DR5、EpHA2、FR-α、gp100、MAGE-A1/3/4、LMP1等が挙げられる。標的因子結合性ドメインとしては、例えば抗体又はT細胞受容体のCDRを含むドメイン、サイトカイン又は細胞増殖因子の全部又は一部を含むドメイン（サイトカイン又は細胞増殖因子ドメイン）、細胞接着因子の全部又は一部を含むドメイン（細胞接着因子ドメイン）等が挙げられる。抗体又はT細胞受容体のCDRを含むドメインは、通常、標的因子に対する抗体又はT細胞受容体のCDR（例えば、抗体のCDRであれば、重鎖CDR1、重鎖CDR2、重鎖CDR3、軽鎖CDR1、軽鎖CDR2、及び軽鎖CDR3）の内の1つ以上、好ましくは2つ、3つ、4つ、5つ以上、より好ましくは6つ全てを有する。CDRを含むドメインは、より好ましくは標的因子に対する抗体又はT細胞受容体の可変領域（抗体の場合であれば、例えば重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域）を含む。サイトカイン又は細胞増殖因子ドメインとしては、例えばIL-12、IL-4、IL-13、IL-6、IL-23、GM-CSF等の、受容体との結合性を有するドメインを含むドメインが挙げられる。
　標的因子結合性ドメインがCDRを含むドメインである場合は、単鎖抗体構造を採ることが好ましく、scFv構造を採ることがより好ましい。scFv構造のように重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む場合、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とは、通常、リンカーを介して連結されている。リンカーは、標的因子結合性が著しく損なわれない限り特に制限されず、任意である。リンカーとしては、好ましくはグリシン或いはグリシンとセリンから構成されるリンカー（GGSリンカー、GSリンカー、GGGリンカー等）である。リンカーの長さは特に限定されない。リンカーのアミノ酸残基数は、例えば5～30である。重鎖可変領域と軽鎖可変領域との配置関係は特に制限されず、N末端側が軽鎖可変領域である態様と、N末端側が重鎖可変領域である場合のいずれでも採用可能である。
　膜貫通ドメインは、本発明のキメラ標的因子受容体が細胞膜上に配置された際に細胞膜内に配置されるドメインであり、キメラ標的因子受容体を構成し得るものである限りにおいて、特に制限されない。膜貫通ドメインとしては、例えば、CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4、4-1BB等の膜貫通領域を用いることができる。膜貫通領域は、公知であるか、或いは公知の配列情報から（例えば膜貫通領域の予測プログラム等を利用して）容易に決定することができる。また、人工的に構築したポリペプチドからなる膜貫通ドメインを用いることにしてもよい。これらの膜貫通ドメインは、キメラ標的因子受容体の機能を著しく阻害しない限り、適宜変異が導入されていてもよい。
　膜貫通ドメインとしては、好ましくはCD28の膜貫通領域を採用することができる。CD28の膜貫通領域の具体例としては、下記（a）に記載するアミノ酸配列又は下記（b）に記載するアミノ酸配列：
　（a）配列番号2に示されるアミノ酸配列、又は
　（b）配列番号2に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有し、且つ本発明のキメラ標的因子受容体が細胞膜上に配置された際に細胞膜内に配置され得るアミノ酸配列
が挙げられる。
　上記（b）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上である。
　上記（b）に記載するアミノ酸配列の一例としては、例えば
（b’）配列番号3に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列であって、且つ本発明のキメラ標的因子受容体が細胞膜上に配置された際に細胞膜内に配置され得るアミノ酸配列
が挙げられる。
　上記（b’）において、複数個とは、例えば2～5個であり、好ましくは2～3個であり、より好ましくは2個である。
　標的因子結合性ドメインと膜貫通ドメインとは、直接又はスペーサーを介して連結される。スペーサーの配列は特に限定されないが、例えばIgG、好ましくはヒトIgG（例えばサブタイプIgG1やIgG4）のヒンジ部又はその一部、ヒンジ部とCH2の一部、或いは膜貫通ドメインに利用する因子（例えばCD28）の一部等の配列をスペーサーに用いることができる。なお、ヒンジ部又はその一部の配列を利用することにより、柔軟性に富むスペーサーが構成されることを期待できる。
　細胞内ドメインは、本発明のキメラ標的因子受容体が細胞膜上に配置された際に細胞内に配置されるドメインであり、抗原提示細胞の活性化に必要なシグナルを伝達することが可能なドメインである。本発明のキメラ標的因子受容体は、細胞内ドメインがTLR細胞内ドメインを含む。
　TLR細胞内ドメインは、TLR（Toll-like receptor）の細胞内ドメインのアミノ酸配列からなるドメインであり、この限りにおいて特に制限されない。
　TLRとしては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類由来のTLRを採用することができる。中でも、対象生物（例えばヒト）由来のTLRが好ましい。種々の生物種由来TLR細胞内ドメインのアミノ酸配列は公知である。
　TLRとしては、例えば、TLR1（細胞内ドメインのアミノ酸配列は例えば配列番号3）、TLR2（細胞内ドメインのアミノ酸配列は例えば配列番号4）、TLR3（細胞内ドメインのアミノ酸配列は例えば配列番号5）、TLR4（細胞内ドメインのアミノ酸配列は例えば配列番号6）、TLR9（細胞内ドメインのアミノ酸配列は例えば配列番号7）等が挙げられる。これらの中でも、抗原提示細胞活性化能の観点、標的因子に応答して抗原提示細胞をより早期に、またより持続的に活性化できるという観点等から、好ましくはTLR2、TLR3、TLR9等が挙げられ、より好ましくはTLR3、TLR9等が挙げられ、さらに好ましくはTLR3が挙げられる。本発明の好ましい一態様においては、TLR細胞内ドメインは、TLR2細胞内ドメイン、TLR3細胞内ドメイン、及びTLR9細胞内ドメインからなる群より選択される少なくとも1種である。
　TLR細胞内ドメインは、抗原提示細胞活性化作用を有する限りにおいて、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を有していてもよい。変異としては、上記作用がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。
　TLR細胞内ドメインのアミノ酸配列の好ましい具体例としては、下記（c）に記載するアミノ酸配列及び下記（d）に記載するアミノ酸配列：
　（c）配列番号3～7のいずれかに示されるアミノ酸配列、及び
　（d）配列番号3～7のいずれかに示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有し、且つ抗原提示細胞活性化作用を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
　上記（d）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上である。
　上記（d）に記載するアミノ酸配列の一例としては、例えば
（d’）配列番号4に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列であって、且つ抗原提示細胞活性化作用を有するアミノ酸配列
が挙げられる。
　上記（d’）において、複数個とは、例えば2～5個であり、好ましくは2～3個であり、より好ましくは2個である。
　細胞内ドメインは、抗原提示細胞活性化能の観点、標的因子に応答して抗原提示細胞をより早期に、またより持続的に活性化できるという観点等から、好ましくはさらにCD40細胞内ドメインを含むことができる。
　CD40細胞内ドメインは、CD40のアミノ酸の細胞内ドメインのアミノ酸配列からなるドメインであり、この限りにおいて特に制限されない。
　CD40としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類由来のCD40を採用することができる。中でも、対象生物（例えばヒト）由来のCD40が好ましい。
　種々の生物種由来CD40細胞内ドメインのアミノ酸配列は公知である。具体的には、例えば、配列番号8に示されるアミノ酸配列等が挙げられる。
　CD40細胞内ドメインは、抗原提示細胞活性化作用を有する限りにおいて、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を有していてもよい。変異としては、上記作用がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。
　CD40細胞内ドメインのアミノ酸配列の好ましい具体例としては、下記（e）に記載するアミノ酸配列及び下記（f）に記載するアミノ酸配列：
　（e）配列番号8に示されるアミノ酸配列、及び
　（f）配列番号8に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有し、且つ抗原提示細胞活性化作用を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
　上記（f）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上である。
　上記（f）に記載するアミノ酸配列の一例としては、例えば
（f’）配列番号8に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列であって、且つ抗原提示細胞活性化作用を有するアミノ酸配列
が挙げられる。
　上記（f’）において、複数個とは、例えば2～5個であり、好ましくは2～3個であり、より好ましくは2個である。
　細胞内ドメインがCD40細胞内ドメインを含む場合、TLR細胞内ドメインとCD40細胞内ドメインとの配置関係は特に制限されず、N末端側がTLR細胞内ドメインである態様と、N末端側がCD40細胞内ドメインである場合のいずれでも採用可能である。TLR細胞内ドメイン及びCD40細胞内ドメインは、直接連結している、或いはリンカーを介して連結していることが好ましい。リンカーは、特に制限されず、任意である。リンカーとしては、好ましくはグリシン或いはグリシンとセリンから構成されるリンカー（GGSリンカー、GSリンカー、GGGリンカー等）である。リンカーの長さは特に限定されない。リンカーのアミノ酸残基数は、例えば1～20、好ましくは1～10、より好ましくは1～5である。
　本発明のキメラ標的因子受容体は、上記以外の他の領域を含むことができる。他の領域としては、例えばCD3ζ、FcεRIγ等の細胞内ドメイン、CARの細胞膜上への輸送を促すためにリーダー配列（シグナルペプチド）（例えば、GM-CSFレセプターのリーダー配列）、スペーサー／リンカー（例えば膜貫通領域と細胞内シグナルドメインの間、細胞内ドメイン内の各ドメイン間）等が挙げられる。
　本発明のキメラ標的因子受容体は、標的因子結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインが、この順に配置されている。
　本発明のキメラ標的因子受容体は、1種のポリペプチドからなる分子であってもよいし、2種以上のポリペプチドの複合体からなる分子であってもよい。また、本発明のキメラ標的因子受容体は、ポリペプチド又はその複合体からなる分子であってもよいし、ポリペプチド又はその複合体に、他の物質（例えば蛍光物質、放射性物質、無機粒子等）が連結してなるものであってもよい。
　本発明のキメラ標的因子受容体は、化学修飾されたものであってもよい。本発明のキメラ標的因子受容体を構成するポリペプチドは、C末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO－）、アミド（－CONH2）またはエステル（－COOR）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明のキメラ標的因子受容体を構成するポリペプチドは、C末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明のキメラ標的因子受容体を構成するポリペプチドには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－OH、－SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイル基などのC1－6アシル基など）で保護されているものも包含される。
　本発明のキメラ標的因子受容体は、公知のタンパク質タグ、シグナル配列等のタンパク質又はペプチドが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ、蛍光タンパク質タグ等が挙げられる。
　本発明のキメラ標的因子受容体は、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；　酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；　アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；　カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
　本発明のキメラ標的因子受容体は、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
　キメラ標的因子受容体及びそれを発現する細胞を製造する技術は公知である。これらは、公知の方法に従って又は準じて、製造することができる。
　3．ポリヌクレオチド及びその利用
　本発明は、その一態様において、本発明のキメラ標的因子受容体をコードする、ポリヌクレオチド（本明細書において、「本発明のポリヌクレオチド」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　本発明のポリヌクレオチドは、本発明のキメラ標的因子受容体のコード配列以外に、他の配列を含んでいてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のキメラ標的因子受容体を発現可能な状態で含むことが好ましい。他の配列としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列、複製基点、レポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質等）コード配列、薬剤耐性遺伝子コード配列などが挙げられる。
　本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは本発明のキメラ標的因子受容体の発現カセットを含む。発現カセットはプロモーターと、当該プロモーターの制御下にある本発明のキメラ標的因子受容体のコード配列を含む。プロモーターの制御下となるように、通常、プロモーターの下流にコード配列を配置する。発現カセットに利用可能なプロモーターとしては、例えばCMV-IE（サイトメガロウイルス初期遺伝子由来プロモーター）、SV40ori、レトロウイルスLTP、SRα、EF1α、βアクチンプロモーター等が挙げられる。プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。ここで、「プロモーターがコード配列に作動可能に連結している」とは、「プロモーターの制御下にコード配列が配置されている」ことと同義であり、通常、プロモーターの3'末端側に直接又は他の配列を介してコード配列が連結されることになる。コード配列の下流にはポリA付加シグナル配列を配置する。ポリA付加シグナル配列の使用によって転写を終了させる。ポリA付加シグナル配列としてはSV40のポリA付加配列、ウシ由来成長ホルモン遺伝子のポリA付加配列等を用いることができる。
　発現カセット内に検出用遺伝子（レポーター遺伝子、細胞又は組織特異的な遺伝子、選択マーカー遺伝子など）、エンハンサー配列、WRPE配列等を含めることにしてもよい。検出用遺伝子は、発現カセットの導入の成否や効率の判定、CAR遺伝子の発現の検出又は発現効率の判定、CAR遺伝子が発現した細胞の選択や分取等に利用される。一方、エンハンサー配列の使用によって発現効率の向上が図られる。検出用遺伝子としては、ネオマイシンに対する耐性を付与するneo遺伝子、カナマイシン等に対する耐性を付与するnpt遺伝子（Herrera Estrella、EMBO J. 2（1983）、987-995）やnptII遺伝子（Messing & Vierra．Gene 1 9:259-268(1982)）、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するhph遺伝子（Blochinger & Diggl mann，Mol Cell Bio 4:2929-2931）、メタトレキセートに対する耐性を付与するdhfr遺伝子（Bourouis et al.，EMBO J．2(7)）等（以上、マーカー遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子（Giacomin、P1. Sci. 116（1996）、59～72；Scikantha、J. Bact. 178（1996）、121）、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子、GFP（Gerdes、FEBS Lett. 389（1996）、44-47）やその改変体（EGFPやd2EGFPなど）等の蛍光タンパク質の遺伝子（以上、レポーター遺伝子）、細胞内ドメインを欠く上皮成長因子受容体（EGFR）遺伝子等の遺伝子を用いることができる。検出用遺伝子は、例えば、バイシストロニック性制御配列（例えば、リボソーム内部認識配列（IRES））や自己開裂ペプチドをコードする配列を介してキメラ標的因子受容体遺伝子に連結している。自己開裂ペプチドの例はThosea asigna virus由来の2Aペプチド（T2A）であるが、これに限定されるものではない。自己開裂ペプチドとして蹄疫ウイルス（FMDV）由来の2Aペプチド（F2A）、ウマ鼻炎Aウイルス（ERAV）由来の2Aペプチド（E2A）、porcine teschovirus（PTV-1）由来の2Aペプチド（P2A）等が知られている。
　本発明のポリヌクレオチドは、直鎖状のポリヌクレオチドであってもよいし、環状のポリヌクレオチド（ベクターなど）であってもよい。ベクターは、プラスミドベクター、又はウイルスベクターであり得る。また、ベクターは、例えば、クローニング用ベクター又は発現用ベクターであり得る。発現用ベクターとしては、大腸菌、又は放線菌等の原核細胞用のベクター、或いは、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞等の真核細胞用のベクターを挙げることができる。より具体的には、ウイルスベクターとしてレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられ、非ウイルスベクターの例としては、各種プラスミドベクター、リポソームベクター、正電荷型リポソームベクター（Felgner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413-7417, 1987）、YACベクター、BACベクターを挙げることができる。
　本発明のポリヌクレオチドは、DNA、RNAのみならず、これらに、次に例示するように、公知の化学修飾が施されたものも包含する。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、「ポリヌクレオチド」の語は、天然の核酸だけでなく、BNA（Bridged Nucleic Acid）、LNA（Locked Nucleic Acid）、PNA（Peptide Nucleic Acid）等の何れも包含する。
　本発明の一態様においては、本発明のポリヌクレオチドを抗原提示細胞に導入することを含む方法により、標的因子に応答して活性化する抗原提示細胞を得ることができる。当該細胞は、本発明のキメラ標的因子受容体を発現する。本発明のポリヌクレオチドが導入される抗原提示細胞としては、例えば樹状細胞、マクロファージ、それらの前駆細胞等を挙げることができる。これらの細胞を含むものであれば、様々な細胞集団を用いることができる。 
　4．細胞
　本発明は、その一態様において、本発明のポリヌクレオチドを含有する、細胞（本明細書において、「本発明の細胞」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　本発明の細胞の由来細胞は、特に制限されない。本発明の細胞を、本発明のキメラ標的因子受容体の精製において使用する目的であれば、由来細胞としては、タンパク質発現に使用できる細胞（例えば、昆虫細胞、真核細胞、哺乳類細胞等）等が挙げられる。
　本発明の細胞は好ましくは抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ等、特に好ましくは樹状細胞）である。また、本発明の細胞は、一態様においては、ES細胞、iPS細胞等の、抗原提示細胞に分化誘導可能な幹細胞であることができる。これらの細胞は、好ましくは本発明のキメラ標的因子受容体を発現する細胞であり、より具体的な態様においては、これらの細胞は、本発明の標的因子受容体が細胞膜上に発現しており、好ましくは本発明の標的因子受容体が標的因子結合性ドメインを細胞膜外に露出した状態で発現している。
　キメラ標的因子受容体を発現する抗原提示細胞等は標的因子結合性ドメインで標的因子を認識した後、その認識シグナルを細胞内部に伝達し、その細胞自身が活性化する。それにより、T細胞（例えばTh1細胞、Th2細胞、Th17細胞、細胞障害性T細胞等）、B細胞等の活性を調節して、抗がん活性、免疫調節活性等を発揮することができる。したがって、本発明のキメラ標的因子受容体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞（特に、抗原提示細胞）は、医薬組成物の有効成分として有用である。
　5．医薬組成物
　本発明は、その一態様において、本発明の細胞を含有する、医薬組成物（本明細書において、「本発明の医薬組成物」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　本発明の医薬組成物は、細胞製剤として、標的因子を発現する腫瘍／がんの治療、予防、又は改善や、自己免疫疾患、アレルギー疾患等の治療、予防、又は改善や、感染症の治療、予防、又は改善等に広く利用することができる。がんは固形がん及び血液がんを含む。がんとしては、例えば各種B細胞性悪性リンパ腫（B細胞性急性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、血管内B細胞性リンパ腫、CD20陽性ホジキンリンパ腫など）、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍(CMML,JMML,CML,MDS/MPN-UC)、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、肺がん、大腸がん、卵巣がん、乳がん、脳腫瘍、胃がん、肝がん、舌がん、甲状腺がん、腎臓がん、前立腺がん、子宮がん、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫等が挙げられる。「治療」とは、標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。「予防」とは、疾病（障害）又はその症状の発症／発現を防止又は遅延すること、或いは発症／発現の危険性を低下させることをいう。一方、「改善」とは、疾病（障害）又はその症状が緩和（軽症化）、好転、寛解、又は治癒（部分的な治癒を含む）することをいう。
　本発明の医薬組成物には、本発明の細胞が治療上有効量含有される。例えば1回の投与用として、1×104個～1×1010個の細胞を含有させることができる。細胞の保護を目的としてジメチルスルフォキシド（DMSO）や血清アルブミン等、細菌の混入を阻止する目的で抗生物質等、細胞の活性化、増殖又は分化誘導などを目的とした各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）等の成分を細胞製剤に含有させることができる。
　本発明の医薬組成物の投与経路は特に限定されない。例えば、静脈内注射、動脈内注射、門脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、又は腹腔内注射によって投与する。全身投与によらず、局所投与することにしてもよい。局所投与として、目的の組織・臓器・器官への直接注入を例示することができる。投与スケジュールは、対象（患者）の性別、年齢、体重、病態などを考慮して作成すればよい。単回投与の他、連続的又は定期的に複数回投与することにしてもよい。
　本発明の医薬組成物、本発明の細胞は、他の薬剤と併用することができる。本発明の医薬組成物、本発明の細胞は、特に、免疫チェックポイント阻害剤（例えば抗PD-1抗体（例えば、ニボルマブやペムブロリズマブなど）、抗PD-L1抗体（例えば、テセントリクやデュルバルマブやアベルマブなど）、抗CTLA-4抗体（例えば、イピリムマブなど）等）と併用することにより、抗腫瘍効果等を向上させることができる。この観点から、本発明の医薬組成物、本発明の細胞は、免疫チェックポイント阻害剤と併用するために、用いることができ、また本発明の医薬組成物は免疫チェックポイント阻害剤を含むことができる。なお、併用のタイミングは特に制限されず、例えば本発明の医薬組成物、本発明の細胞と免疫チェックポイント阻害剤とが同時又は同日投与であってもよいし、一方の投与日の1又は複数日（例えば2～14日）前又は後にもう一方を投与する形態であってもよい。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例1．キメラ標的因子受容体コンストラクトの作製
　N末端側から、
・GMCSFRのシグナルペプチド（アミノ酸配列：配列番号19、塩基配列：配列番号20）、
・抗Her2 scFvドメイン（アミノ酸配列：配列番号1、塩基配列：配列番号9）、
・CD28膜貫通ドメイン（アミノ酸配列：配列番号2、塩基配列：配列番号10）、
・細胞内ドメイン：
　　（a）TLR1細胞内ドメイン（アミノ酸配列：配列番号3、塩基配列：配列番号11）
　　（b）TLR2細胞内ドメイン（アミノ酸配列：配列番号4、塩基配列：配列番号12）
　　（c）TLR3細胞内ドメイン（アミノ酸配列：配列番号5、塩基配列：配列番号13）
　　（d）TLR4細胞内ドメイン（アミノ酸配列：配列番号6、塩基配列：配列番号14）
　　（e）TLR9細胞内ドメイン（アミノ酸配列：配列番号7、塩基配列：配列番号15）
　　（f）TLR2細胞内ドメイン－CD40細胞内ドメイン（アミノ酸配列：配列番号8、塩基配列：配列番号16）
　　（g）TLR3細胞内ドメイン－CD40細胞内ドメイン
　　（h）TLR9細胞内ドメイン－CD40細胞内ドメイン
　　（i）CD40細胞内ドメイン－TLR2細胞内ドメイン
　　（j）CD40細胞内ドメイン－TLR3細胞内ドメイン、又は
　　（k）CD40細胞内ドメイン－TLR9細胞内ドメイン
の順に配置されてなるキメラ標的因子受容体コンストラクトをデザインした。
　さらに、N末端側から、
・GMCSFRのシグナルペプチド（アミノ酸配列：配列番号19、塩基配列：配列番号20）、
・抗メソセリン（MSLN） scFvドメイン（アミノ酸配列：配列番号17、塩基配列：配列番号18）、
・CD28膜貫通ドメイン、
・細胞内ドメイン：
　　（A）TLR1細胞内ドメイン
　　（B）TLR2細胞内ドメイン
　　（C）TLR3細胞内ドメイン
　　（D）TLR4細胞内ドメイン
　　（E）TLR9細胞内ドメイン
　　（F）TLR2細胞内ドメイン－CD40細胞内ドメイン、
　　（G）TLR9細胞内ドメイン－CD40細胞内ドメイン
　　（H）CD40細胞内ドメイン
　　（I）CD40細胞内ドメイン－TLR9細胞内ドメイン
　　（J）無し
の順に配置されてなるキメラ標的因子受容体コンストラクトをデザインした。
　上記キメラ標的因子受容体及び上記キメラ標的因子受容体において細胞内ドメインを欠失させたキメラ標的因子受容体のコード配列をpMXs-GFPベクター（コスモ・バイオ社）に挿入して、pMXs-CAR-GFPベクターを得た。
　試験例2．キメラ標的因子受容体発現樹状細胞の作製
　レトロウイルス調製細胞 Plat-A細胞（Cell Biolabs Inc社）にpMXs-CAR-GFPベクター（試験例1）をTransIT-293 Reagent（Mirus社）を用い、導入した。48時間後、培養上清を回収した。THP-1細胞（JCRB細胞バンクより入手）に培養上清を加え、ウイルスに感染させた。感染48時間後、BD FACS AriaにてGFP陽性細胞を回収した。得られた細胞にヒトGM-CSF（BioLegend社）及びヒトIL-4（BioLegend社を添加、5日間培養し、樹状細胞に分化させて、キメラ標的因子受容体発現樹状細胞を得た。
　試験例3．キメラ標的因子受容体発現マクロファージの作製
　レトロウイルス調製細胞 Plat-A細胞（Cell Biolabs Inc社）にpMXs-CAR-GFPベクター（試験例1）をTransIT-293 Reagent（Mirus社）を用い、導入した。48時間後、培養上清を回収した。U937細胞（JCRB細胞バンクより入手）に培養上清を加え、ウイルスに感染させた。感染48時間後、BD FACS AriaにてGFP陽性細胞を回収し、キメラ標的因子受容体発現マクロファージを得た。
　試験例4．In vitro樹状細胞活性化試験1
　Her2発現細胞（SKOV3細胞：ATCCより入手）にキメラ標的因子受容体発現樹状細胞（試験例2：標的因子はHer2）を加え、5、24、48時間培養し、樹状細胞活性化の指標因子（CD80及びCD86）の発現をFACSで調べた。
　結果を図１～５に示す。図１～３に示されるように、細胞内ドメインとしてTLRの細胞内ドメインを採用することにより、標的因子に応答して、CD80の発現を増加させることができることが分かった。中でも、TLR3及び9の細胞内ドメインを採用した場合は、比較的早い段階（5時間、図１）でCD80の発現を増加させることができ、また、TLR2、3及び9の細胞内ドメインを採用した場合は、より持続的に（48時間、図3）CD80の発現を増加させることができることが分かった。また、図４に示されるように、細胞内ドメインとしてTLRの細胞内ドメインを採用することにより、標的因子に応答して、CD86の発現も増加させることができることが分かった。また、細胞内ドメインとしてTLRの細胞内ドメインに加えてCD40の細胞内ドメインを使用することによって、より持続的に（24時間、図5）CD86の発現を増加させることができることが分かった。
　試験例5．In vitroマクロファージ貪食試験
　Her2発現細胞（SKOV3細胞：ATCCより入手）にキメラ標的因子受容体発現マクロファージ（試験例2：標的因子はHer2）を加え、48時間培養し、phagocytosis assay kit (Cayman社)を用いて、貪食能を調べた。
　結果を図６に示す。図６に示されるように、細胞内ドメインとしてTLRの細胞内ドメインを採用することにより、標的因子に応答して、マクロファージも活性化できることが分かった。
　試験例6．抗腫瘍効果の評価試験1
　＜試験例6-1．MSLN発現マウス腫瘍細胞Pan02/MSLNの作製＞
　pMXs-GFPベクターにヒトMSLN遺伝子を導入した。得られたベクターとpCL-Ecoベクター（Addgene）をG3T-hi細胞（Takara Bio社）にTransIT-293 Reagent（Mirus社）を用いて導入した。48時間後培養上清を回収した。マウス膵臓癌細胞Pan02細胞に培養上清を加え、ウイルスに感染させた。感染48時間後、BD FACS AriaにてGFP陽性細胞を回収した。
　＜試験例6-2．抗腫瘍効果の評価＞
　マウスの皮下にPan02または、Pan02/MSLN（試験例6-1）を移植し、樹状細胞（Empty: pMXs-GFP導入）または、キメラ標的因子受容体発現樹状細胞（試験例2：標的はMSLN、細胞内ドメインは試験例1の（E））を投与し、腫瘍増殖抑制を指標にそれぞれの抗腫瘍効果を検討した。2 mm角に細切した腫瘍をマウスの側腹部皮下に腫瘍移植針により移植した。腫瘍の大きさが100mm3の大きさに達した時点で群分けを行い、細胞の投与を開始した。細胞（樹状細胞（Empty）または、キメラ標的因子受容体発現樹状細胞（MSLN-TLR9））1 x 105個を腫瘍内に1回（Day 0）投与した。週2回、腫瘍サイズを測定し、抗腫瘍効果を評価した。
　結果を図７及び８に示す。図７及び８に示されるように、細胞内ドメインとしてTLRの細胞内ドメインを採用することにより、標的因子（MSLN）に応答して、抗腫瘍効果を発揮できることが分かった。
　試験例7．In vitro樹状細胞活性化試験2
　Her2発現細胞（SKOV3細胞：ATCCより入手）にキメラ標的因子受容体発現樹状細胞（試験例2：標的因子はHer2）を加え、24時間培養し、樹状細胞活性化の指標因子（MHC class I及びMHC class II）の発現をFACSで調べた。
　結果を図９～１０に示す。細胞内ドメインとしてTLRの細胞内ドメインを採用することにより、標的因子に応答して、MHC class I及びMHC class IIの発現を増加させることができることが分かった。中でも、TLR2, 3, 9を使用した場合は、活性化の程度が強いことが分かった（図９）。
　試験例8．In vitro樹状細胞活性化試験3
　＜試験例8-1．MSLN発現マウス腫瘍細胞Panc-1/MSLNの作製＞
　pMXs-rCD2ベクターにヒトMSLN遺伝子を導入した。得られたベクターをPlat-A細胞（Cell Biolabs Inc社）にTransIT-293 Reagent（Mirus社）を用いて導入した。48時間後培養上清を回収した。ヒト膵臓癌細胞Panc-1細胞(ATCCより入手)に培養上清を加え、ウイルスに感染させた。感染48時間後、BD FACS AriaにてrCD2陽性細胞を回収した。
　＜試験例8-2．活性可能の評価試験＞
　Panc-1/MSLN（試験例8-1）にキメラ標的因子受容体発現樹状細胞（試験例2：標的因子はMSLN）を加え、24時間培養し、樹状細胞活性化の指標因子（CD86及びMHC class II）の発現をFACSで調べた。
　結果を図１１～１２に示す。細胞内ドメインとしてTLRの細胞内ドメインを採用することにより、試験例4及び8とは異なる標的因子を採用した場合であっても、CD86,及びMHC clas IIの発現を増加させることができることが分かった。また、本試験例においても、細胞内ドメインとしてTLRの細胞内ドメインに加えてCD40の細胞内ドメインを使用することによって、樹状細胞の活性化の程度／持続性を高めることができることが分かった。
　試験例9．抗腫瘍効果の評価試験2
　マウスの皮下にPan02または、Pan02/MSLN（試験例6-1）を移植し、樹状細胞（Empty: pMXs-GFP導入）または、キメラ標的因子受容体発現樹状細胞を投与し、腫瘍増殖抑制を指標にそれぞれの抗腫瘍効果を検討した。投与したキメラ標的因子受容体発現樹状細胞（試験例2）の標的はMSLNであり、キメラ標的因子受容体の細胞内ドメインは試験例1の（A）～（E）、（H）、及び（J）のいずれかである。2 mm角に細切した腫瘍をマウスの側腹部皮下に腫瘍移植針により移植した。移植から7日経過後に群分けを行い、細胞の投与を開始した。細胞（樹状細胞（Empty）または、キメラ標的因子受容体発現樹状細胞）1 x 105個を腫瘍内に1回（Day 0）投与した。週2回、腫瘍サイズを測定し、抗腫瘍効果を評価した。
　結果を図１３に示す。細胞内ドメインとしてTLR3又はTLR9の細胞内ドメインを採用することにより、標的因子（MSLN）に応答して、他のTLRの細胞内ドメインを使用する場合よりも顕著に高い抗腫瘍効果を発揮できることが分かった。
　試験例10．抗腫瘍効果の評価試験3
　マウスの皮下にPan02または、Pan02/MSLN（試験例6-1）を移植し、樹状細胞（Empty: pMXs-GFP導入）または、キメラ標的因子受容体発現樹状細胞を投与し、腫瘍増殖抑制を指標にそれぞれの抗腫瘍効果を検討した。投与したキメラ標的因子受容体発現樹状細胞（試験例2）の標的はMSLNであり、キメラ標的因子受容体の細胞内ドメインは試験例1の（C）又は（E）である。2 mm角に細切した腫瘍をマウスの側腹部皮下に腫瘍移植針により移植した。移植から7日経過後に群分けを行い、細胞及び／又は薬剤（PD-1抗体）の投与を開始した。細胞投与群については、細胞（キメラ標的因子受容体発現樹状細胞（MSLN-TLR9））1 x 105個を腫瘍内に2回（Day 1及びDay 8）投与した。PD-1抗体投与群については、PD-1抗体250μgを腹腔内に2回（Day 0及びDay 7）投与した。週2回、腫瘍サイズを測定した。
　細胞のみを投与した群（TLR3群又はTLR9群）及びPD-1抗体のみを投与した群（αPD-1群）の腫瘍サイズの測定平均値、細胞及びPD-1抗体を併用投与した群の腫瘍サイズの測定平均値（O-FTV）、TLR3群又はTLR9群とαPD-1群の測定値から期待される、併用投与した場合の腫瘍サイズ（E-FTV（＝群1の測定平均値×群2の測定平均値））、及びE-FTVをO-FTVで除してなる値（E/O）を表１及び表２に示す。E/Oが1を超える場合は、細胞及びPD-1抗体を併用投与により相乗効果が発揮されたことを示す。表１は、キメラ標的因子受容体の細胞内ドメインがTLR-3の細胞内ドメインである場合の結果を示し、表２は、キメラ標的因子受容体の細胞内ドメインがTLR-9の細胞内ドメインである場合の結果を示す。表中、「Day」の欄は、移植から7日経過時をDay 0とした場合の経過日数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１及び表２に示される通り、TLR細胞内ドメインを有するキメラ標的因子受容体発現細胞とPD-1抗体を併用することにより、抗腫瘍効果が相乗的に向上することが分かった。　　　
　試験例11．抗腫瘍効果の評価試験4
　マウスの皮下にPan02または、Pan02/MSLN（試験例6-1）を移植し、樹状細胞（Empty: pMXs-GFP導入）または、キメラ標的因子受容体発現樹状細胞を投与し、腫瘍増殖抑制を指標にそれぞれの抗腫瘍効果を検討した。投与したキメラ標的因子受容体発現樹状細胞（試験例2）の標的はMSLNであり、キメラ標的因子受容体の細胞内ドメインは試験例1の（E）、（F）、又は（I）である。2 mm角に細切した腫瘍をマウスの側腹部皮下に腫瘍移植針により移植した。移植から7日経過後に群分けを行い、細胞の投与を開始した。細胞（樹状細胞（Empty）または、キメラ標的因子受容体発現樹状細胞）1 x 105個を腫瘍内に1回（Day 0）投与した。週2回、腫瘍サイズを測定し、抗腫瘍効果を評価した。
　結果を図１４に示す。細胞内ドメインとしてTLRの細胞内ドメインに加えてCD40の細胞内ドメインを使用することによって、抗腫瘍効果が向上することが分かった。

Claims (16)

  1. 標的因子結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、及びTLR細胞内ドメインを含む細胞内ドメインを含む、キメラ標的因子受容体。
  2. 前記TLR細胞内ドメインが、TLR2細胞内ドメイン、TLR3細胞内ドメイン、及びTLR9細胞内ドメインからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１に記載のキメラ標的因子受容体。
  3. 前記TLR細胞内ドメインが、TLR3細胞内ドメイン、及びTLR9細胞内ドメインからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１又は２に記載のキメラ標的因子受容体。
  4. 前記細胞内ドメインがさらにCD40細胞内ドメインを含む、請求項１～３のいずれかに記載のキメラ標的因子受容体。
  5. 前記標的因子結合性ドメインの構造が単鎖抗体構造である、請求項１～４のいずれかに記載のキメラ標的因子受容体。
  6. 前記標的因子が、がん抗原、サイトカイン受容体、及び細胞増殖因子受容体からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１～５のいずれかに記載のキメラ標的因子受容体。
  7. 請求項１～６のいずれかに記載のキメラ標的因子受容体をコードする、ポリヌクレオチド。
  8. 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
  9. 抗原提示細胞である、請求項８に記載の細胞。
  10. 樹状細胞である、請求項８又は９に記載の細胞。
  11. 請求項８～１０のいずれかに記載の細胞を含有する、医薬組成物。
  12. がん、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び感染症からなる群より選択される少なくとも1種の治療、予防、又は改善用である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 固形がんの治療、予防、又は改善用である、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
  14. 前記TLR細胞内ドメインが、TLR3細胞内ドメイン、及びTLR9細胞内ドメインからなる群より選択される少なくとも1種であり、且つ前記細胞が樹状細胞である、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 前記細胞内ドメインがさらにCD40細胞内ドメインを含み、且つ前記細胞が樹状細胞である、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
  16. 免疫チェックポイント阻害剤との併用に用いるための、請求項１１～１５のいずれかに記載の医薬組成物。
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