KR20230047086A - 면역 세포의 mRNA 형질감염 - Google Patents

면역 세포의 mRNA 형질감염 Download PDF

Info

Publication number
KR20230047086A
KR20230047086A KR1020237002666A KR20237002666A KR20230047086A KR 20230047086 A KR20230047086 A KR 20230047086A KR 1020237002666 A KR1020237002666 A KR 1020237002666A KR 20237002666 A KR20237002666 A KR 20237002666A KR 20230047086 A KR20230047086 A KR 20230047086A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
car
mrna
macrophages
cells
immune cell
Prior art date
Application number
KR1020237002666A
Other languages
English (en)
Inventor
마이클 클리킨스키
유미 야시로-오타니
케일리 로스
Original Assignee
카리스마 테라퓨틱스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 카리스마 테라퓨틱스 인코포레이티드 filed Critical 카리스마 테라퓨틱스 인코포레이티드
Publication of KR20230047086A publication Critical patent/KR20230047086A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4614—Monocytes; Macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/49—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/65—MicroRNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Abstract

본 개시내용은 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 변형된 메신저 RNA(mRNA) 및 CAR을 포함하는 변형된 면역 세포를 전달함으로써 면역 세포를 변형시키는 방법에 관한 것이다.

Description

면역 세포의 mRNA 형질감염
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2020년 6월 26일에 제출된 미국 가특허 출원 제63/044,855호의 우선권 및 이익을 주장하고, 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
암, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증(ALS), 전신 아밀로이드증, 프리온병, 심혈관 질환, 죽상동맥경화증, 섬유증을 포함하는 많은 질환 및 장애에 대한 면역요법이 조사되었지만, 직면한 기능 제한은 여전히 해결해야 한다.
따라서 향상된 발현, 생존능 및 기능에 최적화된 치료 방식의 개발이 필요하다.
본 발명은 특히 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포를 포함하는 면역 세포를 변형시키기 위한 방법, 시스템 및 조성물을 포괄한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법, 시스템 및/또는 조성물은 변형된 면역 세포의 향상된 생산 및/또는 향상된 특성을 제공한다. 놀랍게도, 본 개시내용은 변형된 mRNA(예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 관심 이식유전자를 인코딩하는 5'-캡 또는 우리딘 변형된 mRNA)의 사용이 인간 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포의 상당히 증가된 수준의 발현, 발현의 지속성, 및 생존능을 초래할 수 있다는 인식을 포괄한다. 추가로, 본 개시내용은 인터페론 베타의 사용이 CAR 또는 다른 이식유전자를 인코딩하는 mRNA로 형질감염된 CAR 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포의 상당히 증가된 수준의 발현, 발현의 지속성, 및 기능을 초래할 수 있다는 인식을 포괄한다. 본 개시내용은 또한 RNAse 억제제(예를 들어, RNAseL 억제제)의 사용이 원하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드(예를 들어, 이식유전자)의 상당히 증가된 수준의 발현을 초래할 수 있다는 인식을 포괄한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 면역 세포를 변형시키는 방법을 제공하고, 방법은 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 메신저 RNA(mRNA)를 변형시키는 단계, mRNA를 정제하는 단계, 및 mRNA를 면역 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 면역 세포는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함하고, 그리고 변형된 면역 세포는 CAR을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형 단계는 mRNA가 변형된 뉴클레오티드, 5' 또는 3' 미번역 영역(UTR)에 대한 변경, 캡 구조 및/또는 폴리(A) 테일을 포함하도록 하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡 구조는 AGCap1, m6AGCap1 또는 역전 방지 캡 유사체 (ARCA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 슈도우리딘(PsU), 5-메톡시우리딘(5moU), 5-메틸시티딘/슈도우리딘(5meC PsU), N1-메틸-슈도우리딘(N1mPsU) 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 정제 단계는 실리카 막 정제 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 단계는 형질감염을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형 단계는 mRNA가 AGCap1 및 5moU를 포함하도록 하는 단계를 포함하고, 정제 단계는 실리카 막 정제를 포함하고, 그리고 전달 단계는 전기천공을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 단계는 mRNA가 AGCap1 및 PsU를 포함하도록 하는 단계를 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 그리고 전달 단계는 전기천공을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 단계는 mRNA가 AGCap1 및 N1mPsU를 포함하도록 하는 단계를 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 그리고 전달 단계는 전기천공을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 단계는 mRNA가 m6-AGCap1 및 N1mPsU를 포함하도록 하는 단계를 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 그리고 전달 단계는 전기천공을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 단계는 mRNA가 m6-AGCap1 및 PsU를 포함하도록 하는 단계를 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 그리고 전달 단계는 전기천공을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 단계는 AGCap1 및 PsU를 포함하도록 mRNA를 변형하는 것을 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 전달 단계는 형질감염을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 단계는 mRNA가 m6-AGCap1 및 PsU를 포함하도록 하는 것을 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 전달 단계는 형질감염을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 단계는 mRNA가 m6-AGCap1 및 N1mPsU를 포함하도록 하는 것을 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 전달 단계는 형질감염을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 단계는 mRNA가 AGCap1 및 5moU를 포함하도록 하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 단계는 mRNA가 m6AGCap1 및 5moU를 포함하도록 하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 면역 세포를 RNaseL 억제제로 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, RNaseL 억제제는 수니티닙을 포함한다. 일부 구현예에서, RNaseL 억제제는 ABCE1을 포함한다.
일부 구현예에서, 처리 단계는 전달 단계 전에 발생한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 면역 세포를 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNFα, IL-6, STNGL, LPS, CD40 효능제, 4-1BB 리간드, 재조합체 4-1BB 수용체, TLR 효능제, 베타-글루칸, IL-4, IL-13, IL-10, TGF-β, 글루코코르티코이드, 면역 복합체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN-β를 포함한다.
일부 구현예에서, 배양 단계는 전달 단계 후에 일어난다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 CAR을 발현하는 변형된 면역 세포를 생성한다. 일부 구현예에서, CAR 발현은 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA가 전달된 동일한 유형의 변형된 면역 세포에서 CAR 발현에 비해 증가된다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA가 전달된 동일한 유형의 변형된 면역 세포에서 효과기 활성에 비해 증가된 효과기 활성을 나타낸다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 발명의 방법에 의해 제조된 변형된 면역 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 증가된 생존능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 CAR을 인코딩하는 mRNA의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 증가된 CAR 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 CAR을 인코딩하는 mRNA의 증가된 수명을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 CAR의 증가된 수명을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 증가된 효과기 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 증가된 M1 분극화를 나타낸다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 변형된 뉴클레오티드, 5' 또는 3' 미번역된 영역 (UTR)에 대한 변경, 캡 구조, 폴리 A 테일, 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 변형된 mRNA, 및 하나 이상의 RNaseL 억제제를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 캡 구조는 AGCap1 또는 m6AGCap1을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 슈도우리딘(PsU), 5-메톡시우리딘(5moU), 5-메틸시티딘/슈도우리딘(5meC PsU), 또는 N1-메틸-슈도우리딘(N1mPsU)을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 RNaseL 억제제는 수니티닙을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 RNaseL 억제제는 ABCE1을 포함한다.
도면은 제한이 아닌 예시를 위한 것이다.
도 1a 내지 1c는 다양한 변형을 포함하는 mCherry mRNA로 전기천공 또는 형질감염 후 대식세포 생존능(도 1a), 평균 형광 강도(도 1b) 및 지속성(도 1c)을 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 2a 내지 도 2c는 다양한 변형을 포함하는 CAR mRNA로 전기천공 또는 형질감염 후 대식세포 생존능(도 2a) 및 CAR 발현(도 2b 및 도 2c)을 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 3a 내지 도 3d는 대식세포 기능에 대한 CAR mRNA 변형의 효과를 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다. 도 3a는 대식세포가 CAR mRNA로 전기천공된 후 2일에 종양 성장 곡선을 보여주고, 도 3b 내지 도 3d는 암 세포가 각각 4:1, 2:1 및 1:1의 효과기(CAR 대식세포) 대 표적(암 세포) 비율에서 CAR 대식세포와 공동 배양되었을 때의 종양 성장 곡선을 보여준다.
도 4a 내지 도 4f는 사이토카인으로 처리한 후 CAR 대식세포 생존능(도 4a 및 도 4c), 지시된 표면 마커 평균 형광 강도(도 4b, 도 4d, 도 4e 및 도 4f)를 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 5a 내지 도 5c는 인터페론 사이토카인으로 처리 및 다양한 변형을 포함하는 CAR mRNA로 형질감염 후 대식세포 생존능(도 5a), CAR 발현(도 5b) 및 평균 형광 강도(도 5c)를 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 6은 인터페론 사이토카인으로 처리된 대식세포에서 CAR 발현의 지속성을 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 7a 및 도 7b는 CAR mRNA로 형질감염시키고 다양한 IFN-β 농도로 처리한 후 CAR 대식세포 생존능, CAR 발현 및 평균 형광 강도(도 7a) 및 M1 마커의 유도(도 7b)를 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 8a 및 도 8b는 CAR mRNA로 전기천공하고 IFN-β로 처리한 후 2일(도 8a) 또는 7일(도 8b)에 CAR 대식세포 M2 및 M1 마커 평균 형광 강도를 나타내는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 9a 내지 도 9c는 CAR 대식세포의 항종양 기능을 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다. 도 9a는 다양한 농도의 IFN-β로 프라이밍하거나 프라이밍하지 않고 CAR mRNA로 형질감염된 대식세포로부터의 결과를 보여준다. 도 9b는 다양한 변형을 포함하는 CAR mRNA로 형질감염되고 IFN-β로 처리된 대식세포로부터의 결과를 보여준다. 도 9c는 CAR mRNA로 형질감염되고 인터페론 사이토카인으로 처리된 대식세포로부터의 결과를 보여준다.
도 10은 사이토카인 분비에 대한 인터페론으로 CAR 대식세포를 처리하는 효과를 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 11a 내지 도 11c는 대식세포에서의 CAR mRNA 지속성 및 CAR 대식세포 기능성의 지속 기간에 대한 인터페론 처리의 효과를 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다. 도 11a는 인터페론 사이토카인으로 처리된 CAR 대식세포에서의 생존능 및 CAR 발현의 테스트 결과를 보여준다. 도 11b 및 도 11c는 CAR mRNA로 전기천공되고 인터페론 사이토카인으로 처리된 대식세포와 함께 배양된 암세포로부터의 종양 성장 결과를 보여준다.
도 12a 내지 도 12c는 대식세포 생존능, CAR 발현, M1 마커 발현 및 CAR 대식세포 기능성에 대한 인터페론 처리 효과를 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다. 도 12a는 CAR mRNA로 형질감염되고 인터페론으로 처리된 대식세포의 생존능, CAR 발현 및 M1 마커 발현을 보여준다. 도 12b 및 도 12c는 CAR mRNA로 전기천공되고 인터페론 사이토카인으로 처리된 대식세포와 함께 배양된 암 세포로부터의 종양 사멸 결과를 보여준다.
도 13은 형질감염된 대식세포에 대한 IFN-γ의 효과를 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 14a 내지 도 14c는 CAR 대식세포에 대한 RNaseL 억제제의 효과를 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다. 도 14a는 IFN-γ 및 RNaseL 억제제 수니티닙으로 처리한 후 형질감염된 대식세포에서의 mCherry 발현을 보여준다. 도 14b는 수니티닙으로 처리된 CAR 대식세포와 함께 배양된 암 세포에 대한 종양 성장 곡선을 보여준다. 도 14c는 수니티닙으로 처리된 CAR 대식세포의 종양 사멸 활성을 보여준다.
도 15는 mCherry를 인코딩하는 mRNA 및 RNaseL 억제제 ABCE1을 인코딩하는 mRNA로 공동 형질감염된 대식세포의 대식세포 생존능 및 mCherry 발현을 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 16은 CAR을 인코딩하는 mRNA 및 RNaseL 억제제 NS1을 인코딩하는 mRNA로 공동 형질감염된 대식세포에서 CAR 발현을 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 17은 CAR을 인코딩하는 mRNA 및 RNaseL 억제제 ABCE1 또는 RNaseL 억제제 NS1을 인코딩하는 mRNA로 공동 형질감염된 대식세포에서 CAR mRNA 안정성을 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 18a 및 도 18b는 CD40 리간드(CD40L)와 함께 대식세포 및 CAR 대식세포의 인큐베이션 후 종양 사멸 능력(도 18a) 및 M1 및 M2 마커의 발현 유도(도 18b)를 보여주는 그래프이다.
도 19a 및 도 19b는 4-1BB와 함께 대식세포 및 CAR 대식세포의 인큐베이션 후 종양 사멸 능력(도 19a) 및 M1 및 M2 마커의 발현 유도(도 19b)를 보여주는 그래프이다.
도 20a 및 도 20b는 4-1BB 리간드 (4-1BBL)와 함께 대식세포 및 CAR 대식세포의 인큐베이션 후 종양 사멸 능력(도 20a) 및 M1 및 M2 마커의 발현 유도(도 20b)를 보여주는 그래프이다.
도 21은 CAR mRNA로 전기천공된 인간 단핵구에서의 CAR 발현을 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 22는 이종이식편 고형 종양 마우스 모델에서 IFN-β 프라이밍이 있거나 없는 mRNA 전기천공을 통해 생성된 CAR-대식세포의 효능을 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
도 23은 동계의 고형 종양 마우스 모델에서 IFN-β 프라이밍이 있거나 없는 mRNA 전기천공을 통해 생성된 CAR-대식세포의 효능을 설명하는 예시적인 그래프를 보여준다.
정의
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해, 먼저 특정 용어를 아래에 정의한다. 다음 용어 및 기타 용어에 대한 추가 정의는 본 명세서 전반에 걸쳐 제시된다. 본 발명의 배경을 설명하고 그 실시에 관한 추가 세부사항을 제공하기 위해 본 명세서에서 참조된 간행물 및 기타 참조 자료는 본 명세서에 참고로 포함된다.
관사 "a" 및 "an"은 본 명세서에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하는 데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
대략 또는 약: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "대략" 또는 "약"은 하나 이상의 관심 값에 적용되는 것으로서 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 언급된 참조 값의 어느 한 방향 (초과 또는 미만)에서 (이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외)에서 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
활성화: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "활성화"는 검출가능한 세포 증식을 유도하기에 충분히 자극되었거나 이의 효과기 기능을 발휘하도록 자극된 세포, 예를 들어 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 유도된 사이토카인 생산, 식균작용, 세포 신호전달, 표적 세포 사멸 및/또는 항원 처리 및 제시와 연관될 수 있다.
활성화된 단핵구/대식세포/수지상 세포: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "활성화된 단핵구/대식세포/수지상 세포"라는 용어는 특히 세포 분열을 겪거나 효과기 기능을 발휘하는 단핵구/대식세포/수지상 세포를 지칭한다. "활성화된 단핵구/대식세포/수지상 세포"라는 용어는 특히 효과기 기능을 수행하거나 식균작용, 사이토카인 분비, 증식, 유전자 발현 변화, 대사 변화 및 다른 기능을 포함하여 휴지 상태에서 볼 수 없는 활동을 발휘하는 세포를 지칭한다.
제제: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "제제"(또는 "생물 제제" 또는 "치료제")는 본 명세서에 기재된 변형된 세포에 의해 발현, 방출, 분비 또는 표적으로 전달될 수 있는 분자를 지칭한다. 제제는 핵산, 항생제, 항-염증제, 항체 또는 그의 단편, 항체 제제 또는 그의 단편, 성장 인자, 사이토카인, 효소, 단백질 (예를 들어, RNAse 억제제), 펩티드, 융합 단백질, 합성 분자, 유기 분자 (예를 들어, 소분자), 탄수화물, 지질, 호르몬, 마이크로솜, 그의 유도체 또는 변형, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 제제는 수용체, 항원 결정인자, 또는 표적 또는 표적 세포 상에 존재하는 다른 결합 부위와 같은 임의의 세포 모이어티에 결합할 수 있다. 제제는 세포 내로 작용할 수 있는 세포로 확산되거나 운반될 수 있다.
항체: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 특정 표적 항원에 대한 특이적 결합을 부여하기에 충분한 정규 면역글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 자연에서 생성된 온전한 항체는 일반적으로 "Y자형" 구조라고 하는 것으로 서로 연관된 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드(각각 약 50 kD) 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드(각각 약 25 kD)를 포함하는 약 150 kD 사량체 제제이다. 각 중쇄는 적어도 4개의 도메인(각각 약 110개 아미노산 길이), 즉 아미노 말단 가변(VH) 도메인(Y 구조의 끝에 위치)과 3개의 불변 도메인을 포함한다: CH1, CH2 및 카복시 말단 CH3(Y 줄기의 바닥에 위치). "스위치"로 알려진 짧은 영역은 중쇄 가변 영역과 불변 영역을 연결한다. "힌지"은 CH2 및 CH3 도메인을 항체의 나머지에 연결한다. 이 힌지 영역에 있는 2개의 디설파이드 결합은 온전한 항체에서 2개의 중쇄 폴리펩티드를 서로 연결한다. 각 경쇄는 2개의 도메인, 즉 아미노 말단 가변(VL) 도메인과 카복시 말단 불변(CL) 도메인을 포함하고 다른 "스위치"에 의해 서로 분리된다. 온전한 항체 사량체는 중쇄와 경쇄가 단일 디설파이드 결합에 의해 서로 연결되어 있는 2개의 중쇄-경쇄 이량체를 포함하고; 2개의 다른 디설파이드 결합이 중쇄 힌지 영역을 서로 연결하여 이량체가 서로 연결되어 사량체가 형성된다. 자연적으로 생성된 항체도 전형적으로 CH2 도메인에서 글리코실화된다. 천연 항체의 각 도메인은 압축된 역평행 베타 배럴에서 서로에 대해 포장된 2개의 베타 시트(예를 들어 3-, 4- 또는 5-가닥 시트)로 형성된 "면역글로불린 접힘"을 특징으로 하는 구조를 가지고 있다. 각 가변 도메인은 "상보성 결정 영역"(CDR1, CDR2 및 CDR3)으로 알려진 3개의 초가변 루프와 4개의 다소 불변인 "프레임워크" 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 함유한다. 천연 항체가 접힐 때, FR 영역은 도메인에 대한 구조적 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고 중쇄와 경쇄 모두의 CDR 루프 영역은 3차원 공간에서 결합되어 Y 구조의 끝에 위치한 단일 초가변 항원 결합 부위를 생성한다. 자연 발생 항체의 Fc 영역은 보체 시스템의 요소에 결합하고 또한 예를 들어 세포독성을 매개하는 효과기 세포를 포함하는 효과기 세포의 수용체에도 결합한다. Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 친화성 및/또는 다른 결합 속성은 글리코실화 또는 다른 변형을 통해 조절될 수 있다. 일부 구현예에서, (예를 들어, CAR의 성분으로서) 본 발명에 따라 생산 및/또는 이용되는 항체는 변형되거나 조작된 글리코실화를 갖는 Fc 도메인을 비롯한 글리코실화된 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 천연 항체에서 발견되는 바와 같은 충분한 면역글로불린 도메인 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는, 그러한 폴리펩티드가 자연적으로 생산되거나(예를 들어, 항체에 반응하는 유기체에 의해 생성되거나), 또는 재조합 조작, 화학적 합성, 또는 다른 인공 시스템 또는 방법에 의해 생산되는 지 여부에 관계없이 "항체"로 지칭 및/또는 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 다클론성이다. 일부 구현예에서, 항체는 단클론성이다. 일부 구현예에서, 항체는 마우스, 토끼, 영장류 또는 인간 항체의 특징인 불변 영역 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체 서열 요소는 당업계에 공지된 바와 같이 인간화, 영장류화, 키메라 등이다. 더욱이, 본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 (달리 언급되거나 문맥상 명백하지 않은 한) 적절한 구현예에서 항체를 구조적 및 기능적 특징을 대안적인 제시로 활용하기 위한 임의의 당업계에 공지되거나 개발된 작제물 또는 형식을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 이용되는 항체는 온전한 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 바이- 또는 다중- 특이적 항체 (예를 들어, Zybodies®, etc); 항체 단편 예컨대 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 CDR 또는 그의 세트; 단일 사슬 Fvs; 폴리펩티드-Fc 융합; 단일 도메인 항체 (예를 들어, 샤크 단일 도메인 항체 예컨대 IgNAR 또는 그의 단편); 카멜로이드 항체; 차폐된 항체 (예를 들어, Probodies®); Small Modular ImmunoPharmaceuticals ("SMIPsTM"); 단일 사슬 또는 탠덤 디아바디 (TandAb®); VHHs; Anticalins®; Nanobodies® minibodies; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®; Avimers®; DART; TCR 유사 항체; Adnectins®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; MicroProteins; Fynomers®, Centyrins®; 및 KALBITOR®로부터 선택되지만 이에 제한되지 않은 형식이다. 일부 구현예에서, 항체는 자연적으로 생성되는 경우 가질 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착, 페이로드[예를 들어, 검출가능한 분체, 치료적 모이어티, 촉매적 모이어티 등], 또는 다른 펜던트 기[예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 등]를 함유할 수 있다.
항체 제제: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 제제"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 제제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어는 특이적 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린 구조 요소를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 포괄한다. 예시적인 항체 제제는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 제제는 마우스, 토끼, 영장류 또는 인간 항체의 특징인 하나 이상의 불변 영역 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 제제는 당업계에 공지된 바와 같이 인간화, 영장류화, 키메라 등의 하나 이상의 서열 요소를 포함할 수 있다. 많은 구현예에서, 용어 "항체 제제"는 항체를 구조적 및 기능적 특징을 대안적인 제시로 활용하기 위한 임의의 당업계에 공지되거나 개발된 작제물 또는 형식 중 하나 이상을 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 이용되는 항체 제제는 온전한 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 바이- 또는 다중- 특이적 항체 (예를 들어, Zybodies®, etc); 항체 단편 예컨대 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 CDR 또는 그의 세트; 단일 사슬 Fvs; 폴리펩티드-Fc 융합; 단일 도메인 항체 (예를 들어, 샤크 단일 도메인 항체 예컨대 IgNAR 또는 그의 단편); 카멜로이드 항체; 차폐된 항체 (예를 들어, Probodies®); Small Modular ImmunoPharmaceuticals ("SMIPsTM"); 단일 사슬 또는 탠덤 디아바디 (TandAb®); VHHs; Anticalins®; Nanobodies® minibodies; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®; Avimers®; DART; TCR 유사 항체; Adnectins®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; MicroProteins; Fynomers®, Centyrins®; 및 KALBITOR®로부터 선택되지만 이에 제한되지 않은 형식이다. 일부 구현예에서, 항체 제제는 자연적으로 생성되는 경우 가질 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 제제는 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착, 페이로드[예를 들어, 검출가능한 분체, 치료적 모이어티, 촉매적 모이어티 등], 또는 다른 펜던트 기[예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 등]를 함유할 수 있다. 많은 구현예에서, 항체 제제는, 그의 아미노산 서열이 상보성 결정 영역(CDR)으로서 당업자에 의해 인식되는 하나 이상의 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 그를 포함하고; 일부 구현예에서 항체 제제는 그의 아미노산 서열이 참조 항체에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 적어도 하나의 CDR (예를 들어, 적어도 하나의 중쇄 CDR 및/또는 적어도 하나의 경쇄 CDR)을 포함하는 폴리펩티드이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 포함된 CDR은 참조 CDR과 비교하여 동일하거나 1-5개의 아미노산 치환을 함유한다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서 포함된 CDR은 참조 CDR과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서 포함된 CDR은 참조 CDR과 적어도 96%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 부가 또는 치환된다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하지만, 포함된 CDR은 다르게는 참조 CDR의 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 1-5개의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 부가 또는 치환된다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하지만, 포함된 CDR은 다르게는 참조 CDR의 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 치환된다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하지만, 포함된 CDR은 다르게는 참조 CDR의 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 1-5개의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 부가 또는 치환된다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하지만, 포함된 CDR은 다르게는 참조 CDR의 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체 제제는 그의 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 도메인으로서 당업자에 의해 인식되는 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 제제는 면역글로불린 결합 도메인과 상동성 또는 대체로 상동성인 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 단백질이다. 일부 구현예에서, 항체 제제는 그의 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 도메인으로서 당업자에 의해 인식되는 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드가 아니고/거나 그를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 제제는 면역글로불린 구조적 요소(예를 들어, 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 수용체 또는 다른 자연 발생 분자)를 포함하지 않는 분자 또는 조성물이거나 그를 포함할 수 있다.
항체 단편: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부를 지칭하고 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 및 그의 인간 및 인간화 버전을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
항체 중쇄: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체 중쇄"라는 용어는 모든 항체 분자에 자연적으로 발생하는 형태로 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 큰 것을 지칭한다.
항체 경쇄: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체 경쇄"라는 용어는 모든 항체 분자에 자연적으로 발생하는 형태로 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다.
합성 항체: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "합성 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 박테리오파지에 의해 발현되는 항체를 지칭한다. 이 용어는 또한 항체를 인코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 이용가능하고 당업계에 잘 알려진 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된다.
항원: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발할 수 있는 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생산, 특정 면역학적 적격 세포의 활성화 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 모든 거대분자가 항원으로 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA에서 유도될 수 있다. 당업자는 면역 반응을 유도하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원"을 인코딩한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 인코딩될 필요가 없음을 이해할 것이다. 본 발명이 하나 초과의 유전자의 부분적인 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않는다는 것과 이러한 뉴클레오티드 서열이 원하는 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 조합으로 배열된다는 것은 명백하다. 더욱이, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원이 합성되어 생성될 수 있거나 생물학적 샘플로부터 유도될 수 있다는 것은 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
항종양 효과: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항종양 효과"는 종양 부피 감소, 종양 세포 수 감소, 전이 수 감소, 기대 수명 증가, 또는 암성 상태와 연관된 다양한 생리적 증상의 개선으로 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항종양 효과"는 또한 종양 발생을 처음부터 예방하는 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.
자가: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "자가"라는 용어는 나중에 동일한 개체에게 재도입될 개체로부터 유도된 임의의 물질을 지칭한다.
동종이형: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "동종이형"은 동일한 종의 상이한 동물로부터 유도된 임의의 물질(예를 들어, 세포 집단)을 지칭한다.
이종: 본 명세서에 사용된 바와 같이, "이종"이라는 용어는 상이한 종의 동물로부터 유도된 임의의 물질(예를 들어, 세포 집단)을 지칭한다.
암: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "암"이라는 용어는 비정상적인 세포의 신속하고 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류와 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 퍼질 수 있다. 다양한 암의 예는 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 특정 구현예에서, 암은 수질 갑상선 암종이다.
보존적 서열 변형: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 상당한 영향을 미치거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 그러한 보존적 변형에는 아미노산 치환, 첨가 및 결실이 포함된다. 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR 매개 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 다양한 구현예와 양립가능한 항체에 변형을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이들 계열은 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 무극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하여 당해 분야에 정의되었다. 따라서, 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 변경된 항체는 본 명세서에 기재된 기능적 검정을 사용하여 항원에 결합하는 능력에 대해 테스트될 수 있다.
공동자극 리간드: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공동자극 리간드"는 단핵구/대식세포/수지상 세포 상의 동족 공동자극 분자에 특이적으로 결합하여 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단핵구/대식세포/수지상 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포(예를 들어, APC, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 분자를 지칭한다. 공동자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공동자극 리간드 (ICOS-L), 세포간 부착 분자 (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림프독소 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, 톨 리간드 수용체에 결합하는 효능제 또는 항체 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 공동자극 리간드는 또한 특히 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 것과 같은 단핵구/대식세포/수지상 세포 상에 존재하는 공동자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 포괄한다.
세포독성: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포독성(cytotoxic)" 또는 "세포독성(cytotoxicity)"은 세포를 죽이거나 손상시키는 것을 지칭한다. 한 구현예에서, 대사적으로 향상된 세포의 세포독성, 예를 들어 대식세포의 증가된 세포용해 활이 개선된다.
유효량: 본 명세서에 사용된 바와 같이, "유효량" 및 "치료적 유효량"은 상호교환가능하며, 특정 생물학적 결과를 달성하거나 제조, 치료 또는 예방 이점을 제공하는 데 효과적인 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물, 제형, 물질 또는 조성물의 양을 의미한다. 이러한 결과는 당업계에 적합한 임의의 수단에 의해 측정된 바와 같은 항종양 활성을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
효과기 기능: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "효과기 기능" 또는 "효과기 활성"은 면역 세포의 자극에 반응하여 면역 세포에 의해 수행되는 특정 활성을 지칭한다. 예를 들어, 식균작용에 의해 세포 잔해, 이물질, 미생물, 암 세포 및 다른 건강에 해로운 세포를 삼키고 소화하는 대식 세포의 효과기 기능.
인코딩: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "인코딩(encoding)"는 뉴클레오티드의 한정된 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 아미노산의 한정된 서열을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA 또는 mRNA 내의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 유전자는 단백질을 인코딩한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다는 단백질 또는 그 유전자의 다른 생성물 또는 cDNA를 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
내인성: 본 명세서에 사용된 "내인성"은 특정 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 또는 내부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
외인성: 본원에 사용된 용어 "외인성"은 특정 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되거나 외부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
확장하다: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "확장하다"는 세포, 예를 들어 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포의 수의 증가에서와 같이 수의 증가를 지칭한다. 한 구현예에서, 생체 외에서 확장된 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포는 배양물에 원래 존재하는 수에 비해 수가 증가한다. 또 다른 구체예에서, 생체 외에서 확장된 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포는 배양물에서 다른 세포 유형에 비해 수가 증가한다. 일부 구현예에서, 확장은 생체 내에서 일어날 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "생체 외"는 살아있는 유기체(예를 들어, 인간)로부터 제거되고 유기체 외부에서(예를 들어, 배양 접시, 시험관 또는 생물반응기에서) 증식된 세포를 지칭한다.
발현: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"이라는 용어는 핵산 서열로부터 임의의 유전자 산물의 생성을 지칭한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 전사체일 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 서열의 발현은 다음 중 하나 이상을 수반한다: (1) (예를 들어, 전사에 의해) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생성; (2) (예를 들어 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성 및/또는 3' 말단 형성에 의해) RNA 전사체의 처리; (3) RNA를 폴리펩티드 또는 단백질로 번역; 및/또는 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역 후 변형.
발현 벡터: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스 작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관 내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 네이키드 또는 리포솜에 함유됨) 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스)와 같은 당업계에 공지된 모든 것들을 포함한다.
단편: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단편" 또는 "부분"은 전체의 개별 부분을 포함하지만 전체 구조에서 발견되는 하나 이상의 모이어티가 결여된 구조를 지칭한다. 일부 구현예에서, 단편은 이러한 별개의 부분으로 구성된다. 일부 구현예에서, 단편은 전체에서 발견되는 특징적인 구조적 요소 또는 모이어티로 구성되거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 단편은 전체 뉴클레오티드에서 발견되는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 또는 그 초과 개의 단량체성 단위 (예를 들어, 핵산)를 포함하거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 단편은 전체 뉴클레오티드에서 발견되는 단량체성 단위 (예를 들어, 잔기)의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과를 포함하거나 그로 구성된다. 전체 물질 또는 독립체는 일부 구현예에서 전체의 "모체"로 지칭될 수 있다.
상동성: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "상동성"은 중합체성 분자 사이, 예를 들어 핵산 분자(예를 들어 DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 일부 구현예에서, 중합체성 분자는 그 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 경우 서로 "상동성"인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 중합체성 분자는 그 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 유사한 경우 서로 "상동성"인 것으로 간주된다 (예를 들어 해당 위치에 관련된 화학적 특성을 가진 잔기를 함유함). 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 어떤 잔기가 서로 다른 서열에서 서로 "해당"하는지 고려할 때 다른 것에 비해 하나의 서열에서 지정된 길이의 갭을 허용하는 것을 포함하여 서열의 상동성 정도를 결정하기 위해 서열의 비교를 허용하는 다양한 알고리즘을 사용할 수 있다. 예를 들어, 2개의 핵산 서열 사이의 퍼센트 상동성의 계산은 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있고, 비-상응 서열은 비교 목적으로 무시할 수 있다). 특정 구현예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 실질적으로 100%이다. 그 다음 해당 뉴클레오티드 위치의 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 해당 위치와 동일한 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 분자는 그 위치에서 동일하고; 제1 서열의 위치가 제2 서열의 해당 위치와 유사한 뉴클레오티드에 의해 점유되면 분자는 그 위치에서 유사하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 상동성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일하고 유사한 위치의 수의 함수이다.
동일성: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "동일성"은 2개의 중합체성 분자 사이, 특히 2개의 아미노산 분자 사이, 예컨대 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 아미노산 서열이 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 경우; 예를 들어, 2개의 폴리펩티드 분자 각각의 위치가 아르기닌에 의해 점유된다면, 그 위치에서 동일하다. 2개의 아미노산 서열이 정렬에서 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 동일성 또는 정도는 종종 백분율로 표시된다. 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성은 일치하거나 동일한 위치의 수의 직접적인 함수이고; 예를 들어, 2개의 서열의 위치 중 절반(예를 들어, 길이가 10개 아미노산인 중합체의 5개 위치)이 동일한 경우, 2개의 서열은 50% 동일하고; 위치의 90%(예를 들어 10개 중 9개)가 일치하거나 동일한 경우, 두 아미노산 서열은 90% 동일하다.
실질적인 동일성: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적 동일성"은 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 비교를 지칭한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 2개의 서열은 일반적으로 해당 위치에 동일한 잔기를 함유하는 경우 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열에 대한 BLASTN 및 아미노산 서열에 대한 BLASTP, 갭핑된 BLAST 및 PSI-BLAST와 같은 상업적 컴퓨터 프로그램에서 이용 가능한 것을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 서열은, 해당 잔기의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 해당 잔기의 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과가 잔기의 관련 스트레치에 대해 동일한 경우 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 구현예에서 관련 스트레치는 완전한 서열이다. 일부 구현예에서, 관련 스트레치는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 또는 그 초과 개의 잔기이다. CDR의 맥락에서, "실질적인 동일성"에 대한 언급은 전형적으로 참조 CDR과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 지칭한다.
면역 세포: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역 세포"는 면역 반응, 예를 들어 면역 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 세포의 예는 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 호중구, 호산구, 비만 세포, 혈소판, 큰 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 자연 살해 (NK) 세포, T-림프구, 또는 B-림프구를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 면역 세포(예를 들어 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)의 공급원은 대상체로부터 얻을 수 있다.
면역 반응: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 림프구가 항원 분자를 이물질로 식별하고 항체 형성을 유도하고/하거나 림프구를 활성화하여 항원을 제거할 때 발생하는 항원에 대한 세포 및/또는 전신 반응을 지칭한다.
면역글로불린: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역글로불린" 또는 "Ig"는 항체로서 기능하는 단백질 부류를 지칭한다. B 세포에 의해 발현되는 항체는 때때로 BCR(B 세포 수용체) 또는 항원 수용체로 언급된다. 이 부류의 단백질에 포함된 다섯 가지 구성원은 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE이다. IgA는 타액, 눈물, 모유, 위장 분비물, 호흡기 및 비뇨생식관의 점액 분비물과 같은 체액 분비물에 존재하는 일차 항체이다. IgG는 가장 일반적인 순환 항체이다. IgM은 대부분의 대상체에서 일차 면역 반응에서 생산되는 주요 면역글로불린이다. 응집, 보체 고정 및 기타 항체 반응에서 가장 효율적인 면역글로불린이며 박테리아 및 바이러스에 대한 방어에 중요하다. IgD는 알려진 항체 기능이 없지만 항원 수용체 역할을 할 수 있는 면역글로불린이다. IgE는 알러지항원에 노출되면 비만 세포와 호염기구에서 매개체를 방출하여 즉각적인 과민성을 매개하는 면역글로불린이다.
단리된: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 자연 상태로부터 변경되거나 제거된 것을 지칭한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리"되지 않지만, 동일한 핵산 또는 펩티드는 자연적 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리되어 "단리"된다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
변형된: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된"은 본 발명의 분자 또는 세포의 변화된 상태 또는 구조를 지칭한다. 분자는 화학적, 구조적, 기능적 등 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 세포는 핵산 도입을 통해 변형될 수 있다.
조절하는: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "조절하는"은 치료 또는 화합물의 부재 하에 대상체에서 반응의 수준 및/또는 특성과 비교하고/하거나 동일하지만 치료되지 않은 피험자에서 반응의 수준 및/또는 특성과 비교된 대상체에서 반응 수준의 감지 가능한 증가 또는 감소 및/또는 반응 특성의 변화를 중재하는 것을 지칭한다. 이 용어는 자연 신호 또는 반응을 교란 및/또는 영향을 미침으로써 대상체, 바람직하게는 인간에서 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포괄한다.
핵산: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 적어도 3개의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 일부 구현예에서 핵산은 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 단일 가닥이다. 일부 구현예에서, 핵산은 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 핵산은 단일 및 이중 가닥 부분 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 포스포디에스테르 연결을 포함하는 백본을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 포스포디에스테르 및 비-포스포디에스테르 연결을 모두 포함하는 백본을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산은 예를 들어 "펩티드 핵산"에서와 같이 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 5'-N-포스포르아미다이트 연결 및/또는 하나 이상의 펩티드 결합을 포함하는 백본을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상 또는 모든 천연 잔기 (예를 들어, 아데닌, 시토신, 데옥시아데노신, 데옥시시티딘, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 구아닌, 티민, 우라실)를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상 또는 모든 비-천연 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-천연 잔기는 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3 -메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5 -프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, 0(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화된 염기, 삽입된 염기, 및 이들의 조합)을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-천연 잔기는 천연 잔기에 있는 것과 비교하여 하나 이상의 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노오스, 및 헥소스)을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 RNA 또는 폴리펩티드와 같은 기능적 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 공급원으로부터의 분리, 효소 합성(예를 들어, 상보적 주형에 기초한 중합, 예를 들어, 생체내 또는 시험관내, 재조합 세포 또는 시스템에서의 재생산에 의해), 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 그 잔기 길이는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 또는 그 초과이다.
작동 가능하게 연결된: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 예를 들어 조절 서열과 이종성 핵산 서열의 발현을 초래하는 이종성 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 일반적으로 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하고, 필요한 경우 동일한 해독틀에서 2개의 단백질 코딩 영역을 연결해야 한다.
과발현된 종양 항원: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "과발현된" 종양 항원 또는 종양항원의 "과발현"은 해당 조직 또는 기관에서 정상 세포의 발현 수준에 비해 환자의 특정 조직 또는 기관 내에서 고형종양과 같은 질환 부위의 세포에서 종양 항원의 비정상 수준의 발현을 지칭한다. 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양을 갖는 환자는 당업계에 공지된 표준 검정에 의해 결정될 수 있다.
폴리뉴클레오티드: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 사슬을 지칭한다. 또한 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본 명세서에 사용된 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호교환가능하다. 당업자는 핵산이 단량체 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드라는 일반적인 지식을 가지고 있다. 단량체 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본 명세서에 사용된 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 재조합 수단, 즉 통상의 클로닝 기술 및 PCRTM 등을 사용한 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터의 핵산 서열의 클로닝, 및 합성 수단을 포함한 관련 기술분야에서 이용가능한 임의의 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다.
폴리펩티드: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 전형적으로 펩티드 결합에 의해 연결된 잔기(예를 들어, 아미노산)의 임의의 중합체 사슬을 지칭한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 자연에서 발생하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 자연에서 발생하지 않은 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 사람의 손의 작용을 통해 설계 및/또는 생성된다는 점에서 조작된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 또는 둘 모두를 포함하거나 그로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 천연 아미노산만 또는 비-천연 아미노산만을 포함하거나 그로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 D-아미노산, L-아미노산, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 D-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 L-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 펜던트 기 또는 다른 변형, 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단, 폴리펩티드의 C-말단, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 아미노산 측쇄에 변형 또는 부착된 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 펜던트 기 또는 변형은 아세틸화, 아미드화, 지질화, 메틸화, 페길화 등 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 환형일 수 있고/있거나 환형 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 환형이 아니고/이거나 임의의 환형 부분을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 선형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 스테이플링된 폴리펩티드일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "폴리펩티드"는 참조 폴리펩티드, 활성 또는 구조의 명칭에 첨부될 수 있으며; 이러한 경우 관련 활성 또는 구조를 공유하는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용되며, 따라서 동일한 부류 또는 폴리펩티드 패밀리의 구성원으로 간주될 수 있다. 이러한 각각의 부류에 대해, 본 명세서는 아미노산 서열 및/또는 기능이 공지된 부류 내의 예시적인 폴리펩티드를 제공하고/하거나 당업자는 알고 있을 것이고; 일부 구현예에서, 이러한 예시적인 폴리펩티드는 폴리펩티드 부류 또는 패밀리에 대한 참조 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 부류 또는 패밀리의 구성원은 상당한 서열 상동성 또는 동일성을 나타내고, 공통 서열 모티프(예를 들어, 특징적인 서열 요소)를 공유하고/하거나 공통 활성(일부 구현예에서 필적할만한 수준 또는 지정된 범위 내에서)을 부류의 참조 폴리펩티드와; 일부 구현예에서 부류 내의 모든 폴리펩티드와 공유한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 구성원 폴리펩티드는 적어도 약 30-40%이고 종종 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과인 참조 폴리펩티드와의 서열 상동성 또는 동일성의 전체 정도를 나타내고/내거나 초고 서열 동일성, 종종 90% 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과를 나타내는 적어도 하나의 영역 (예를 들어, 일부 구현예에서 특징적인 서열 요소이거나 그를 포함할 수 있는 보존적 영역)을 포함한다. 이러한 보존된 영역은 일반적으로 적어도 3-4개, 종종 최대 20개 이상의 아미노산을 포함하고; 일부 구현예에서, 보존된 영역은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 초과 개의 인접 아미노산의 적어도 하나의 스트레치를 포괄한다. 일부 구현예에서, 유용한 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 단편을 포함하거나 그로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 유용한 폴리펩티드는 복수의 단편을 포함하거나 그로 구성될 수 있으며, 이들 각각은 관심 폴리펩티드에서 발견되는 것보다 서로에 대해 상이한 공간적 배열로 동일한 모 폴리펩티드에서 발견되어(예를 들어, 모체에서 직접 연결되는 단편은 관심 폴리펩티드에서 공간적으로 분리될 수 있거나 그 반대일 수 있고/있거나 단편은 모체와 관심 폴리펩티드에서 다른 순서로 존재할 수 있음), 관심 있는 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 유도체이다.
단백질: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단백질"은 폴리펩티드(즉, 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 아미노산의 스트링)을 지칭한다. 단백질은 아미노산 이외의 모이어티(예를 들어, 당단백질, 프로테오글리칸 등일 수 있음)를 포함할 수 있고/있거나 달리 처리되거나 변형될 수 있다. 당업자는 "단백질"이 세포에 의해 생성된 완전한 폴리펩티드 사슬(신호 서열을 갖거나 갖지 않음)이거나 그의 특징적인 부분일 수 있음을 인식할 것이다. 당업자는 단백질이 때때로 예를 들어 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 연결되거나 다른 수단에 의해 회합된 하나 초과의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 폴리펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 둘 모두를 함유할 수 있고 당업계에 공지된 임의의 다양한 아미노산 변형 또는 유사체를 함유할 수 있다. 유용한 변형은 예를 들어 말단 아세틸화, 아미드화, 메틸화 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 합성 아미노산 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "펩티드"는 일반적으로 약 100개 미만의 아미노산, 약 50개 미만의 아미노산, 20개 미만의 아미노산 또는 10개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체, 항체 단편, 그의 생물학적 활성 부분 및/또는 그의 특성 부분이다.
신호 전달 경로: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "신호 전달 경로"는 세포의 한 부분에서 세포의 다른 부분으로 신호를 전달하는 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. "세포 표면 수용체"라는 어구는 신호를 수신하고 세포의 원형질막을 가로질러 신호를 전달할 수 있는 분자 및 분자 복합체를 포함한다.
단일 사슬 항체: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일 사슬 항체"는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 단편이 조작된 아미노산 범위를 통해 Fv 영역에 연결되는 재조합 DNA 기술에 의해 형성된 항체를 지칭한다. 단일 사슬 항체를 생성하는 다양한 방법은 문헌[미국 특허 제4,694,778호; Bird (1988) Science 242:423-442; Huston 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Ward 등 (1989) Nature 334:54454; Skerra 등 (1988) Science 242:1038-1041]에 기재된 것을 포함하여 공지되어 있다.
특이적으로 결합한다: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항원 결합 도메인, 예컨대 항체 제제에 관한 "특이적으로 결합한다"는 용어는 특정 항원을 인식하지만 실질적으로 샘플에서 다른 분자를 인식하거나 결합하지 않는 항원 결합 도메인 또는 항체 제제를 지칭한다. 예를 들어, 한 종의 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체 제제는 하나 이상의 종의 항원에도 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차종 반응성은 항원 결합 도메인 또는 항체 제제의 분류를 특이적인 것으로 자체적으로 변경하지 않는다. 또 다른 예에서, 항원 결합 도메인 또는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 제제는 또한 항원의 상이한 대립유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성은 항원 결합 도메인 또는 항체 제제의 분류를 특이적인 것으로 자체적으로 변경하지 않는다. 일부 경우에, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 상호작용이 화학종에 대한 특정 구조(예를 들어 항원 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 것을 의미하기 위해 항원 결합 도메인 또는 항체 제제, 단백질 또는 펩티드와 제2의 화학종과의 상호작용과 관련하여 사용될 수 있고; 예를 들어, 항원 결합 도메인 또는 항체 제제는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 결합한다. 항원 결합 도메인 또는 항체 제제가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항원 결합 도메인 또는 항체 제제를 함유하는 반응에서 에피토프 A(또는 자유, 표지되지 않은 A)를 함유하는 분자의 존재는, 항체에 결합된 표지된 A의 양을 줄인다.
자극: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "자극"은 예를 들어 그의 동족 리간드와 함께 자극 분자(예를 들어, FcR 복합체, TLR 복합체, 또는 TCR/CD3 복합체)의 결합에 의해 유도되어, Fc 수용체 기구 또는 합성 CAR을 통한 신호 전달과 같으나 이에 제한되지 않는 신호 전달 이벤트를 매개하는 일차 반응을 의미한다 자극은 TGF-베타의 하향조절 및/또는 세포골격 구조의 재구성 등과 같은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "자극 분자"는 항원 제시 세포 상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 자극 분자는 CD64 (FcγRI), CD32a (FcγRIIa), CD32b (FcγRIIb), CD32c, CD16a (FcγRIIIa), CD16b (FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII, FcαRI (CD89) 또는 CD40 도메인을 포함하는 FcR 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 분자는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, 또는 TLR9 도메인을 포함하는 TLR 세포외 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "자극 리간드"는, 항원 제시 세포(예를 들어 aAPC, 대식세포, 수지상 세포, B-세포 등) 또는 종양 세포에 존재할 때, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 동족 결합 파트너(본 명세서에서 "자극 분자"라고 함)와 특이적으로 결합하여 활성화, 면역 반응의 개시, 증식 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역 세포에 의해 반응을 매개할 수 있는 리간드를 지칭한다. 자극 리간드는 당업계에 잘 알려져 있으며, 특히 톨 유사 수용체(TLR) 리간드, 항-톨 유사 수용체 항체, 효능제 및 단핵구/대식세포 수용체에 대한 항체를 포함한다. 또한 인터페론-감마와 같은 사이토카인은 대식세포의 강력한 자극제이다.
대상체: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 유기체, 예를 들어 포유동물(예를 들어, 인간, 비-인간 포유동물, 비-인간 영장류, 영장류, 실험실 동물, 마우스, 랫트, 햄스터, 게르빌, 고양이 또는 개)를 지칭한다. 일부 구현예에서 인간 대상체는 성인, 청소년 또는 소아 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어 본 명세서에 제공된 바와 같이 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어 본 명세서에 나열된 암 또는 종양으로 고통받고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉬우며; 일부 구현예에서, 민감한 대상체는 질환, 장애 또는 병태가 발병할 경향이 있고/있거나 증가된 위험(참조 대상체 또는 집단에서 관찰된 평균 위험과 비교하여)을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상체는 특정 증상(예를 들어, 질환의 임상 징후) 또는 질환, 장애 또는 병태의 특징을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 어떠한 증상이나 특징도 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 환자이다. 일부 구현예에서, 대상체는 진단 및/또는 요법이 투여되고/되거나 투여된 개체이다.
실질적으로 정제된: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 예를 들어 세포에 적용되는 "실질적으로 정제된"이라는 용어는 본질적으로 다른 세포 유형이 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 자연 발생 상태에서 일반적으로 연관되는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 다른 경우에, 이 용어는 단순히 자연 상태에서 자연적으로 회합된 세포로부터 분리된 세포를 의미한다. 일부 구현예에서, 세포는 시험관 내에서 배양된다. 다른 구체예에서, 세포는 시험관 내에서 배양되지 않는다.
표적: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적"은 제공된 방법, 시스템 및/또는 조성물의 대상인 신체 내의 세포, 조직, 기관 또는 부위, 예를 들어 치료가 필요하거나 예를 들어 항체(또는 이의 단편) 또는 CAR에 의해 우선적으로 결합되는 신체 내의 세포, 조직, 기관 또는 부위를 지칭한다.
표적 부위: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합이 일어나기에 충분한 조건 하에서 결합 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 핵산의 일부를 정의하는 게놈 핵산 서열을 지칭한다.
T 세포 수용체: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "T 세포 수용체" 또는 "TCR"이라는 용어는 항원의 제시에 반응하여 T 세포의 활성화에 참여하는 막 단백질의 복합체를 지칭한다. TCR은 주요 조직 적합성 복합 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 한다. TCR은 알파(a) 및 베타(β) 사슬의 이종이량체를 포함하지만 일부 세포에서는 TCR이 감마 및 델타(γ/δ) 사슬을 포함한다. TCR은 알파/베타 및 감마/델타 형태로 존재할 수 있으며 구조적으로 유사하지만 해부학적 위치와 기능이 다르다. 각 사슬은 2개의 세포외 도메인, 즉 가변 도메인과 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR은 예를 들어 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포 및 감마 델타 T 세포를 포함하는 TCR을 포함하는 임의의 세포 상에서 변형될 수 있다.
치료적: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료적(therapeutic)"는 치료 및/또는 예방을 지칭한다. 치료 효과는 질환 상태의 억제, 관해 또는 박멸에 의해 얻어진다.
형질감염: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 일차 대상 세포 및 그 자손을 포함한다.
치료하다: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 부분적 또는 완전한 완화, 개선, 발병 지연, 억제, 예방, 경감, 및/또는 발생률 및/또는 중증도 감소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 질환, 장애 및/또는 병태의 징후 또는 특징을 나타내지 않는 대상체에게 치료가 투여될 수 있다(예를 들어, 예방적일 수 있음). 일부 구현예에서, 치료는 예를 들어 질환, 장애 및/또는 병태와 연관된 병리가 발생할 위험을 줄이기 위한 목적으로 질환, 장애, 및/또는 병태의 초기 또는 경미한 징후 또는 특징만을 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 질환, 장애 또는 병태의 확립된, 중증 및/또는 말기 징후를 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 투여하거나 면역 세포를 시험관 내 전사된 mRNA에 의해 활성화된 경로의 조절제와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
종양: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "종양"은 세포 또는 조직의 비정상적 성장을 지칭한다. 일부 구현예에서, 종양은 전암성(예를 들어, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성 및/또는 비-전이성인 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양은 암과 연관되거나 암의 징후이다. 일부 구현예에서, 종양은 분산성 종양 또는 액상 종양일 수 있다. 일부 구현예에서, 종양은 고형 종양일 수 있다.
벡터: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 벡터가 당업계에 알려져 있다. 따라서, "벡터"라는 용어는 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 예를 들어 폴리라이신 화합물, 리포솜 등과 같이 핵산을 세포로 전달하는 것을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 개시 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의와 간결함을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 따라서 범위의 설명은 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 수치 값을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1에서 6과 같은 범위의 설명은 구체적으로 개시된 하위범위 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
상세한 설명
면역 세포
특히, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 변형된 면역 세포 (예를 들어, 대식세포, 단핵구, 또는 수지상 세포)를 제공한다. 따라서, 일부 구현예에서, 적어도 하나의 CAR을 포함하는 면역 세포는 다음을 포함한다: (a) 세포외 도메인 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포외 도메인), (b) 막횡단 도메인 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 막횡단 도메인), 및 (c) 세포내 도메인 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포내 도메인).
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포 집단은 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 및/또는 그의 전구체를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포 집단은 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포, 또는 세포주의 정제된 집단을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 활성화되고, 예를 들어 면역 세포는 예를 들어 불활성 세포에 비해 증가된 사이토카인 생산, 케모카인 생산, 식균작용, 세포 신호전달, 표적 세포 사멸, 및/또는 항원 제시를 나타낸다. 일부 구현예에서, 활성화된 면역 세포는 예를 들어 불활성 세포에 비해 유전자 발현의 변화, 예를 들어, 염증유발 유전자 발현의 유도 (예를 들어, TNF, IL-12, IFN, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 또는 IL-1 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개)를 나타낸다. 특정 구현예에서, 활성화된 면역 세포는 세포 분열을 겪는다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 표적화된 효과기 활성은 CD47 및/또는 SIRPα 활성의 억제에 의해 향상된다. CD47 및/또는 SIRPα 활성은 면역 세포를 항-CD47 또는 항-SIRPα 항체로 처리하거나 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)는 대상체로부터 수득(예를 들어, 단리)된다. 면역 세포는 자가 조직이거나 동종이형 또는 보편적 공여자로부터 공급받을 수 있다. 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 비장 조직, 제대, 종양, 및/또는 유도 다분화능 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 세포 (ESC)를 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 피콜(Ficoll) 분리와 같이 당업자에게 공지된 임의의 수의 분리 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 얻어진다. 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하기 위해 세척되고 다양한 완충액 (예를 들어, 인산염 완충 식염수 (PBS)) 또는 배양 배지)에 재현탁될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포(예를 들어, 단핵구)의 풍부화는 가소성 부착을 포함한다. 일부 구현예에서, 풍부화 후, 면역 세포(예를 들어 단핵구)의 분화는 GM-CSF로 자극을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈액 세포(예를 들어, 단핵구, 림프구, 혈소판, 혈장 및/또는 적혈구)를 포함하는 조성물, 예를 들어 백혈구성분채집술 조성물(예를 들어, 류코팩)이 풍부화를 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 백혈구성분채집술 조성물(예를 들어, 류코팩)은 건강한 인간 공여자로부터의 샘플을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 세포(예를 들어, 단핵구)의 성분채집술 후 GM-CSF로 동원된다. 특정 구현예에서, 면역 세포(예를 들어, 단핵구)의 선택은 마이크로비드(예를 들어, CliniMACS Prodigy 장치 상의 MACS® MicroBeads)를 사용하는 CD14 양성 선택을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포 전구체(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 대한 전구체)는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용된다. 면역 세포 전구체는 생체 내 또는 생체 외에서 면역 세포로 분화될 수 있다. 전구체 면역 세포의 비-제한적 예는 조혈 줄기 세포, 공통 골수 전구세포, 골수아세포, 모노아세포, 전단핵구, 또는 그의 중간체를 포함한다. 예를 들어, 유도 다분화능 줄기 세포는 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. 유도 다분화능 줄기 세포(iPSC)는 정상 인간 조직, 예컨대 말초 혈액, 섬유아세포, 피부, 각질형성세포, 또는 신장 상피 세포에서 유도할 수 있다. 자가, 동종이형 또는 보편적 공여자 iPSC는 골수 계통(예를 들어 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 그의 전구체)으로 분화될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)는 예를 들어 적혈구를 용해시키고 림프구 및 적혈구를 고갈시킴으로써, 예컨대 PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리에 의해 말초 혈액으로부터 단리리될 수 있다. 대안적으로, 면역 세포는 제대 조직으로부터 단리될 수 있다. 면역 세포의 특정 하위 집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CD34, CD3, CD4, CD8, CD56, CD66b, CD19 또는 CD20을 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 항원을 발현하는 세포가 고갈될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 음성 선택에 의한 면역 세포 집단의 풍보화는 음성 선택 세포에 독특한 표면 마커에 대한 항체의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 비-제한적 예로서, 세포 선택은 또한 음성으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단클론성 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유동 세포측정을 포함할 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의해 본 명세서에 기재된 바와 같이 면역 세포 집단(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)의 원하는 집단을 분리하는 동안, 면역 세포 농도 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)이 변할 수 있다. 세포와 비드의 최대 접촉 면적을 보장하기 위해 비드와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 줄이는 것이 바람직할 수 있다.
일부 구현예에서, 투여 전에, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구, 또는 수지상 세포)(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR을 포함함)는 염증유발제로 처리된다. 일부 구현예에서, 염증유발제에 의한 치료는 본 명세서에 기재된 면역 세포의 항종양 활성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 염증유발제에 의한 치료는 본 명세서에 기재된 면역 세포에서 M1 표현형(예를 들어, M2에서 M1 표현형으로의 전환)을 촉진한다. 일부 구현예에서, 염증유발제는 CD40 작용제(예를 들어, CD40L)를 포함하거나 그 작용제이다. 일부 구현예에서, 염증유발제는 41BB-리간드 작용제(예를 들어, 4-1BB)를 포함하거나 그 작용제이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR을 포함함)는 염증유발제와 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR을 포함함)는 염증유발제의 전 또는 후에 실질적으로 동시에 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 염증유발제에 의한 투여는 본 명세서에 기재된 면역 세포의 항종양 활성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 염증유발제에 의한 투여는 본 명세서에 기재된 면역 세포에서 M1 표현형(예를 들어, M2에서 M1 표현형으로의 전환)을 촉진한다. 일부 구현예에서, 염증유발제는 CD40 작용제(예를 들어, CD40L)를 포함하거나 그 작용제이다. 일부 구현예에서, 염증유발제는 41BB-리간드 작용제(예를 들어, 4-1BB)를 포함하거나 그 작용제이다.
대식세포
대식세포는 병원체나 종양 세포와 같은 표적 세포의 검출, 식균작용 및 파괴에 특화된 면역 세포이다. 대식세포는 선천 면역계의 강력한 효과기이며 적어도 세 가지의 뚜렷한 항종양 기능을 할 수 있다: 죽고 죽어가는 세포, 미생물, 암세포, 세포 잔해 또는 기타 이물질의 식균작용; 종양 세포에 대한 세포독성; 및 적응형 항종양 면역 반응을 조율하기 위한 종양 항원의 제시.
축적된 증거에 따르면, 대식세포는 수많은 암의 종양 미세환경에 풍부하며 총체적으로 종양 연관 대식세포(TAM)라고 하는 여러 가지 표현형을 채택할 수 있다. 종양 미세환경의 면역억제 특성은 전형적으로 더 많은 M2 유사 TAM을 생성하며, 이는 항종양 면역 반응의 일반적인 억제에 추가로 기여한다. 그러나 최근 연구에서는 TAM이 염증 유발 신호를 통해 "재프로그래밍"될 수 있고 M2 표현형에서 더 많은 M1 표현형으로의 전환이 생산적인 항종양 면역 반응과 연관이 있음을 확인하였다. 내인성 TAM을 M1 유형 세포로 전환하도록 유도하고 M2로 전복될 수 없는 대식세포를 조작하면 항종양 면역요법이 크게 향상되고 해당 분야에서 상당한 발전을 나타낼 것이다.
일부 구현예에서, 대식세포는 미분화 또는 M0 대식세포를 포함하거나 그것이다. 특정 구현예에서, 대식세포는 CD14, CD16, CD64, CD68, CD71 또는 CCR5 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함하거나 발현한다. 다양한 자극에 대한 노출은 M0 대식세포가 몇 가지 뚜렷한 집단으로 분극화하도록 유도할 수 있으며, 이는 대식세포 표현형 마커, 사이토카인 생산 및/또는 케모카인 분비에 의해 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 대식세포는 분극화된 대식세포를 포함하거나 그러한 대식세포이다. 전통적 활성화 조건 하에, M0 대식세포는 LPS, IFNγ 및 GM-CSF와 같은 염증유발 신호에 노출될 수 있으며 M1 대식세포로 분극화된다. 일반적으로 M1 대식세포는 Th1 및 Th17 T 세포 반응과 같은 염증유발 면역 반응과 관련이 있다. 다른 자극에 대한 노출은 대식세포를 "대체적으로 활성화된" 또는 M2 대식세포의 다양한 그룹으로 분극화할 수 있다.
일부 구현예에서, 대식세포는 M1 대식세포를 포함하거나 M1 대식세포이다. 일부 구현예에서, 대식세포는 M1 대식세포의 하나 이상의 마커(예를 들어, CD86, CD80, MHC II, IL-1R, TLR2, TLR4, iNOS, SOCS3, CD83, PD-L1, CD69, MHC I, CD64, CD32, CD16, IL1R, IFIT 패밀리 구성원, 또는 ISG 패밀리 구성원 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 비교적 높은 수준의 하나 이상의 염증성 사이토카인 (예를 들어, IL-1, TNF, IL-12, IL-18, IL-23, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-2, IL-6, IL-8, 또는 IL33 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개) 또는 케모카인 (예를 들어, CC 또는 CXC 케모카인 중 하나 또는 둘 다) (예를 들어, CXC 케모카인 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개; 예를 들어, CC 케모카인 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28; 예를 들어, CX3C 케모카인 중 하나, 예를 들어, C 케모카인 중 하나 또는 둘 다)를 분비한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 면역 반응 및/또는 염증을 자극한다. 일부 구현예에서, 대식세포는 M2 대식세포(예를 들어, M2a, M2b, M2c 및 M2d 대식세포)를 포함하거나 그 대식세포이다. M2a 대식세포는 IL-4, IL-13 및/또는 진균 감염에 의해 유도될 수 있다. M2b 대식세포는 IL-1R 리간드, 면역 복합체 및/또는 LPS에 의해 유도될 수 있다. M2c 대식세포는 IL-10 및/또는 TGFβ에 의해 유도될 수 있다. M2d 대식세포는 IL-6 및/또는 아데노신에 의해 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 대상체에서 면역 반응을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 대식세포는 M2 대식세포의 하나 이상의 마커(예를 들어, CD206, CD163 또는 CD209 중 1개, 2개 또는 3개)를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 하나 이상의 항-염증성 사이토카인 (예를 들어, IL-10 또는 TGFβ 중 하나 또는 둘 다)의 증가된 분비를 나타낸다.
일부 구현예에서, 대식세포는 적어도 하나의 상향조절된 M1 마커 및/또는 적어도 하나의 하향조절된 M2 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 M1 마커 (예를 들어, HLA DR, CD86, CD80, PD-L1, CD83, CD69, MHC I, CD64, CD32, CD16, IL1R, IFIT 패밀리 구성원, 및/또는 ISG 패밀리 구성원)는 대식세포에서 상향 조절된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 M2 마커(예를 들어, CD206, CD163 및/또는 CD209)는 대식세포에서 하향조절된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 증가된 식균작용을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 종양 세포에 대한 증가된 세포독성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 증가된 종양 항원 제시 (예를 들어, 후-식균작용 제시) 및/또는 증가된 항원 처리를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 (예를 들어, 식균작용, 용해, 세포자멸사, 또는 종양 사멸 사이토카인(예를 들어, TNFα)의 생산에 의해) 증가된 종양 사멸을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 유리한 유전자 (예를 들어, CD80, CD86, MHC-I, MHC-II, CD40, 41BBL, TNF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL2, IL12, IL6, IL8, IL1b, 및/또는 CXCL12)의 발현 증가 또는 이롭지 않은 유전자 (예를 들어, CD163, CD206, TGFβ, IL10, 및/또는 IL4)의 발현 감소 중 하나 또는 둘 다를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 ROS의 생산 증가를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 (예를 들어, 인터페론 신호전달 경로, TH1 경로, PTEN 신호전달, PI3K 신호전달, MTOR 신호전달, TLR 신호전달, CD40 신호전달, 41BB 신호전달, 41BBL 신호전달, 대식세포 성숙 신호전달, 수지상 세포 성숙 신호전달, CD3-제타 신호전달, FcR γ 신호전달, CD64 신호전달, CD32a 신호전달, CD32c 신호전달, CD16a 신호전달, TLR1 신호전달, TLR2 신호전달, TLR3 신호전달, TLR4 신호전달, TLR5 신호전달, TLR6 신호전달, TLR7 신호전달, TLR8 신호전달, TLR9 신호전달, ALK 신호전달, AXL 신호전달, DDR2 신호전달, EGFR 신호전달, EphA1 신호전달, INSR 신호전달, cMET 신호전달, MUSK 신호전달, PDGFR 신호전달, PTK7 신호전달, RET 신호전달, ROR1 신호전달, ROS1 신호전달, RYK 신호전달, TIE2 신호전달, TRK 신호전달, VEGFR 신호전달, CD40 신호전달, CD19 신호전달, CD20 신호전달, 41BB 신호전달, CD28 신호전달, OX40 신호전달, GITR 신호전달, TREM-1 신호전달, TREM-2 신호전달, DAP12 신호전달, MR 신호전달, ICOS 신호전달, MyD88 신호전달, V/I/LxYxxL/V 신호전달, SIRPα 신호전달, CD45 신호전달, Siglec-10 신호전달, PD1 신호전달, SHP-1 신호전달, SHP-2 신호전달, KIR-2DL 신호전달, KIR-3DL 신호전달, NKG2A 신호전달, CD170 신호전달, CD33 신호전달, BTLA 신호전달, CD32b 신호전달, SIRPβ 신호전달, CD22 신호전달, PIR-B 신호전달, 및/또는 LILRB1 신호전달의) 대사 재프로그래밍을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 세포 생존 기전의 유도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 세포 사멸 기전의 유도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR가 없는 대식세포에 비해 식세포 체크포인트에 대한 내성 증가, 트래피킹을 돕기 위해 케모카인 수용체의 발현 증가, 다른 면역 세포를 모집하기 위해 케모카인의 발현 증가, ECM 분해 효소(예를 들어, 종양 ECM을 분해하고/하거나 항섬유화 활성을 나타내는 MMP)의 발현 증가, 또는 증식 증가 중 1, 2, 3, 4 또는 5개를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR가 없는 대식세포에 비해 CAR 발현의 개선된 지속 기간, 세포 표면에서 CAR의 개선된 안정성, 증가된 수준의 CAR 발현, 또는 CAR의 감소된 배경 활성 중 1, 2, 3 또는 4개를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해 대상체에서 (예를 들어, 감염원의) 감염을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 감염원은 바이러스, 원생동물 (예를 들어, 트리파노솜, 말라리아, 또는 톡소플라스마), 박테리아 (예를 들어, 마이코박테리움, 살모넬라, 또는 리스테리아), 진균 (예를 들어, 칸디다), 또는 이들의 조합을 포함하거나 이들이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 간염 바이러스(예를 들어, A형 간염, B형 간염, C형 간염 또는 E형 간염), 레트로바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (예를 들어, HIV1 또는 HIV2), T 세포 백혈병 바이러스, 림프친화성 바이러스 (예를 들어, HTLV1 또는 HTLV2), 단순 포진 바이러스 (예를 들어, 단순 포진 바이러스 1형 또는 유형 2), 엡슈타인-바르 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 수두-대상포진 바이러스, 폴리오바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 볼거리 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 에테로바이러스, 리노바이러스, 코로나바이러스 (예를 들어, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 바이러스, 중동호흡기 증후군 (MERS) 바이러스, 또는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV2)), 에볼라 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 또는 변이체 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR가 없는 대식세포에 비해 대상체 (예를 들어, 신경퇴행성 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환, 섬유성 질환, 아밀로이드증, 또는 이들의 조합이 있는 대상체)에서 형성을 감소시키고/시키거나 적어도 하나의 단백질 응집체의 식균작용을 통해 기존 응집체를 분해한다 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 타우병증, a-시누클레인병증, 초로기 치매, 노인성 치매, 알츠하이머병, 진행성 핵상 마비 (PSP), 피크병, 원발 진행 실어증, 전두측두 치매, 피질기저 치매, 파킨슨병, 루이스체가 있는 치매, 다운 증후군, 다계통 위축, 근위축 측삭 경화증 (ALS), 할러포르덴-슈파츠 증후군, 폴리글루타민 질환, 트리뉴클레오티드 반복 질환, 및 프리온병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염증성 질환은 전신 홍반성 낭창, 혈관염, 류마티스성 관절염, 치주염, 궤양성 대장염, 부비강염, 천식, 결핵, 크론병, 만성 감염, 선천성 주기적인 발열, 악성종양, 전신 혈관염, 낭포성 섬유증, 기관지 확장증, 수포성 표피박리증, 사이클릭 호중구감소증, 면역결핍, 머클-웰스 (MWS) 질환, 및 가족성 지중해 열병 (FMF) 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 아밀로이드증은 원발성 아밀로이드증 (AL), 이차 아밀로이드증 (AA), 가족성 아밀로이드증 (ATTR), 베타-2 마이크로글로불린 아밀로이드증, 국소화된 아밀로이드증, 중쇄 아밀로이드증 (AH), 경쇄 아밀로이드증 (AL), 원발성 전신 아밀로이드증, ApoAI 아밀로이드증, ApoAII 아밀로이드증, ApoAIV 아밀로이드증, 아포지질단백질 C2 아밀로이드증, 아포지질단백질 C3 아밀로이드증, 각막 락토페린 아밀로이드증, 트랜스티레틴 관련 아밀로이드증, 투석 아밀로이드증, 피브리노겐 아밀로이드증, Lect2 아밀로이드증 (ALECT2), 및 리소자임 아밀로이드증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 심혈관 질환은 죽상동맥경화증, 관상 동맥 질환, 주변 동맥 질환, 고혈압 심장 질환, 대사 증후군, 고혈압, 뇌혈관 질환, 및 심부전으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, [0001] 섬유성 질환은 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 간경변, 낭포성 섬유증, 경피증, 심장 섬유증, 방사선 유도 폐 손상, 지방간염, 사구체경화증, 사이질 폐 질환, 간 섬유증, 종격 섬유증, 후복강 섬유증, 골수 섬유증, 및 피부 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
단핵구
단핵구는 혈액, 골수 및 비장에서 순환하는 다능성 세포이며 일반적으로 정상 상태에서는 증식하지 않는다. 단핵구는 직경이 약 10-30 μm 범위에서 크기가 상당히 다양할 수 있다. 단핵구에 대한 핵 대 세포질의 비율은 약 2:1 내지 약 1:1 범위일 수 있다. 전형적으로, 단핵구는 감염 동안과 같이 혈액에서 조직으로의 이동을 매개하는 케모카인 수용체 및 병원체 인식 수용체를 포함한다. 단핵구는 염증성 사이토카인을 생성하고, 세포 및/또는 독성 분자를 흡수하고, 수지상 세포 또는 대식세포로 분화할 수 있다.
일부 구현예에서, 단핵구는 하나 이상의 표현형 마커를 포함하거나 발현한다. 인간 단핵구 세포에 대한 표현형 마커의 예는 CD9, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD14, CD15, CDw17, CD31, CD32, CD33, CD35, CD36, CD38, CD43, CD49b, CD49e, CD49f, CD63, CD64, CD65s, CD68, CD84, CD85, CD86, CD87, CD89, CD91, CDw92, CD93, CD98, CD101, CD102, CD111, CD112, CD115, CD116, CD119, CDwl2lb, CDw123, CD127, CDw128, CDw131, CD147, CD155, CD156a, CD157, CD162 CD163, CD164, CD168, CD171, CD172a, CD180, CD206, CD131a1, CD213 2, CDw210, CD226, CD281, CD282, CD284, 및 CD286을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 마우스 단핵구 세포에 대한 예시적인 표현형 마커는 CD11a, CD11b, CD16, CD18, CD29, CD31, CD32, CD44, CD45, CD49d, CD115, CD116, Cdw131, CD281, CD282, CD284, CD286, F4/80, 및 CD49b를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서 단핵구는 CD11b, CD14 또는 CD16 중 1개, 2개 또는 3개를 포함한다. 특정 구현예에서, 단핵구는 CD14+ CD16- 단핵구, CD14+ CD16+ 단핵구, 또는 CD14- CD16+ 단핵구를 포함한다.
일부 구현예에서, 단핵구는 대식세포로 분화된다. 일부 구현예에서, 단핵구는 수지상 세포(DC)로 분화된다. 단핵구는 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 대식세포 또는 DC로 분화될 수 있다. 예를 들어, 단핵구의 대식세포로의 분화는 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)에 의해 유도될 수 있다. 단핵구의 DC로의 분화는 IL-4와 함께 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)에 의해 유도될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해 하나 이상의 사이토카인 (예를 들어, TNF, IL-12, IFN, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 또는 IL-1 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개)의 증가된 분비를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해 증가된 식균작용을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해 생존 향상을 나타낸다. 일부 구현예에서, 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해 대식세포 (예를 들어, M1 또는 M2 대식세포)로의 향상된 분화를 나타낸다. 일부 구현예에서, 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해 DC(예를 들어, 상주 또는 이동하는 DC 및/또는 림프양 및 비-림프양 조직에서)로의 향상된 분화를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해 종양 세포에 대한 증가된 세포독성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR가 없는 단핵구에 비해 증가된 종양 항원 제시 (예를 들어, 후-식균작용 제시) 및/또는 증가된 항원 처리를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR가 없는 단핵구에 비해 (예를 들어, 식균작용, 용해, 세포자멸사, 또는 종양 사멸 사이토카인(예를 들어, TNFα)의 생산에 의해) 증가된 종양 사멸을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해 유리한 유전자의 증가된 발현 또는 이롭지 않은 유전자의 감소된 발현 중 하나 또는 둘 모두를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해 ROS의 생산 증가를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해 대사 재프로그래밍을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해 세포 생존 기전의 유도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해 세포 사멸 기전의 유도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR가 없는 단핵구에 비해 식세포 체크포인트에 대한 내성 증가, 트래피킹을 돕기 위해 케모카인 수용체의 발현 증가, 다른 면역 세포를 모집하기 위해 케모카인의 발현 증가, ECM 분해 효소(예를 들어, 종양 ECM을 분해하고/하거나 항섬유화 활성을 나타내는 MMP)의 발현 증가, 또는 증식 증가 중 1, 2, 3, 4 또는 5개를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR가 없는 단핵구에 비해 CAR 발현의 개선된 지속 기간, 세포 표면에서 CAR의 개선된 안정성, 증가된 수준의 CAR 발현, 또는 CAR의 감소된 배경 활성 중 1, 2, 3 또는 4개를 나타낸다.
수지상 세포
수지상 세포(DC)는 면역 반응을 시작하고 자가 항원에 대한 면역계의 내성을 유지하는 데 관여하는 골수 유도 특화 항원 제시 세포이다. 수지상 세포는 림프양 및 비-림프양 기관 모두에서 발견될 수 있으며 일반적으로 림프양 또는 골수 계통에서 발생하는 것으로 생각된다.
일부 구현예에서, DC는 하나 이상의 표현형 마커를 포함하거나 발현한다. DC에 대한 예시적인 표현형 마커는 CD11c, CD83, CD1a, CD1c, CD141, CD207, CLEC9a, CD123, CD85, CD180, CD187, CD205, CD281, CD282, CD284, CD286 및 부분적으로 CD206, CD207, CD208 및 CD209를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
미성숙 DC는 항원 포획 능력이 높지만 T 세포 자극 능력이 상대적으로 낮다는 것을 특징으로 할 수 있다. 염증 매개체는 DC 성숙을 촉진한다. DC가 성숙 단계에 도달하면, 미성숙 DC에 비해 항원 포획 능력의 감소 및/또는 T 세포를 자극하는 능력의 증가와 같은 특성의 극적인 변화가 있다. 일부 구현예에서, DC는 미성숙 DC를 포함하거나 미성숙 DC이다. 다른 실시예에서, DC는 성숙한 DC를 포함하거나 성숙한 DC이다.
이론에 구애됨이 없이, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하도록 DC 세포를 변형하면 성숙한 DC가 예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR이 없는 DC에 비해 증가된 항원 포획 능력 및 T 세포 자극을 동시에 나타내도록 할 수 있다고 여겨진다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해 종양 항원 제시, 예를 들어 증가된 종양 항원 제시를 매개한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해 종양 T 세포 자극, 예를 들어 증가된 종양 T 세포 자극을 매개한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해 하나 이상의 사이토카인 (예를 들어, TNF, IL-12, IFN, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 또는 IL-1 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개)의 증가된 분비를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해 증가된 식균작용을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해 증가된 종양 항원 제시 (예를 들어, 후-식균작용 제시), 증가된 항원 처리, 증가된 항원 교차 제시, 증가된 T 세포 초회감작, 및/또는 T 세포이 자극를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해 유리한 유전자의 증가된 발현 또는 이롭지 않은 유전자의 감소된 발현 중 하나 또는 둘 모두를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해 ROS의 생산 증가를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해 대사 재프로그래밍을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해 세포 생존 기전의 유도를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해 세포 사멸 기전의 유도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR가 없는 DC에 비해 식세포 체크포인트에 대한 내성 증가, 트래피킹을 돕기 위해 케모카인 수용체의 발현 증가, 다른 면역 세포를 모집하기 위해 케모카인의 발현 증가, ECM 분해 효소(예를 들어, 종양 ECM을 분해하고/하거나 항섬유화 활성을 나타내는 MMP)의 발현 증가, 또는 증식 증가 중 1, 2, 3, 4 또는 5개를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR가 없는 DC에 비해 CAR 발현의 개선된 지속 기간, 세포 표면에서 CAR의 개선된 안정성, 증가된 수준의 CAR 발현, 또는 CAR의 감소된 배경 활성 중 1, 2, 3 또는 4개를 나타낸다.
면역 세포 변형 방법
일부 구현예에서, 본 개시내용은 면역 세포를 변형시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 (a) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산을 변형시키는 단계, (b) 핵산을 정제하는 단계, 및 (c) 핵산을 면역 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 면역 세포는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함하고, 그리고 변형된 면역 세포는 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 면역 세포를 변형시키는 방법을 제공하고, 방법은 (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 메신저 RNA(mRNA)를 변형시키는 단계, (b) mRNA를 정제하는 단계, 및 (c) mRNA를 면역 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 면역 세포는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함하고, 그리고 변형된 면역 세포는 CAR을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 변형된 mRNA를 면역 세포에 전달하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 mRNA는 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 선택적으로 전달 단계 전에 면역 세포를 RNaseL 억제제로 처리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 면역 세포를 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질 (예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNFα, IL-6, STNGL, LPS, CD40 효능제, 4-1BB 리간드, 재조합체 4-1BB 수용체, TLR 효능제, 베타-글루칸, IL-4, IL-13, IL-10, TGF-β, 글루코코르티코이드, 면역 복합체, 또는 이들의 조합)와 함께 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN-β를 포함한다.
핵산 변형
본 개시내용의 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 mRNA이거나 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 mRNA는 비변형 mRNA 또는 변형된 mRNA로 합성될 수 있다. 전형적으로 mRNA는 안정성을 향상시키기 위해 변형된다. mRNA의 변형은 예를 들어 RNA의 뉴클레오티드의 변형을 포함할 수 있다. 따라서 본 개시내용에 따른 변형된 mRNA는 예를 들어 백본 변형, 당 변형 또는 염기 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 변형시키는 단계는 mRNA가 변형된 뉴클레오티드, 5' 또는 3' 미번역 영역(UTR)에 대한 변경, 캡 구조 및/또는 폴리(A) 테일을 포함하도록 하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 퓨린 (아데닌 (A), 구아닌 (G)) 또는 피리미딘 (티민 (T), 시토신 (C), 우라실 (U))을 포함하지만 이에 제한되지 않는 자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체 (변형된 뉴클레오티드)로부터, 그리고 예를 들어, 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-디메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 슈도우라실 (5-우라실), 디하이드로-우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카복시하이드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-우라실, 5'-메톡시카보닐메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 1-메틸-슈도우라실, 쿠에오신, β-D-만노실-쿠에오신, 와이부톡소신, 및 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 펩티드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신 및 이노신과 같은 퓨린 및 피리미딘의 변형된 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체로서 합성될 수 있다. 이러한 유사체의 제조는 예를 들어 미국 특허 제4,373,071호, 미국 특허 제4,401,796호, 미국 특허 제4,415,732호, 미국 특허 제4,458,066호, 미국 특허 제4,500,707호, 미국 특허 제4,668,777호, 미국 특허 제4,973,679호, 미국 특허 제5,047,524호, 미국 특허 제5,132,418호, 미국 특허 제5,153,319호, 미국 특허 제5,262,530호 및 미국 특허 제5,700,642호로부터 당업자게에 알려져 있고, 그의 개시내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA(예를 들어, CAR을 인코딩하는 mRNA)는 RNA 백본 변형을 함유할 수 있다. 전형적으로 백본 변형은 RNA에 함유된 뉴클레오티드의 백본의 인산염이 화학적으로 변형된 변형이다. 예시적인 백본 변형은 전형적으로, 포스포디에스테르 연결을 다른 음이온성, 양이온성 또는 중성 기로 대체하는 것을 포함하는 메틸포스포네이트, 메틸포스포르아미데이트, 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트 (예를 들어 시티딘 5'-O-(1-티오포스페이트)), 보라노포스페이트, 양으로 하전된 구아니디늄 기 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA(예를 들어, CAR을 인코딩하는 mRNA)는 당 변형을 함유할 수 있다. 전형적인 당 변형은 뉴클레오티드의 당의 화학적 변형이고, 2'-데옥시-2'-플루오로-올리고리보뉴클레오티드 (2'-플루오로-2'-데옥시시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트), 2'-데옥시-2'-데아민-올리고리보뉴클레오티드 (2'-아미노-2'-데옥시시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트), 2'-O-알킬올리고리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-C-알킬올리고리보뉴클레오티드 (2'-O-메틸시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-메틸우리딘 5'-트리포스페이트), 2'-C-알킬올리고리보뉴클레오티드, 및 그의 이성질체 (2'-아라시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-아라우리딘 5'-트리포스페이트), 또는 아지도트리포스페이트 (2'-아지도-2'-데옥시시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-아지도-2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트)로 이루어진 군으로부터 선택된 당 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA(예를 들어, CAR을 인코딩하는 mRNA)는 뉴클레오티드 염기의 변형(염기 변형)을 함유할 수 있다. 염기 변형을 함유하는 변형 뉴클레오티드는 염기 변형 뉴클레오티드라고도 한다. 이러한 염기 변형 뉴클레오티드의 예는 2-아미노-6-클로로퓨린 리보사이드 5'-트리포스페이트, 2-아미노아데노신 5'-트리포스페이트, 2-티오시티딘 5'-트리포스페이트, 2-티오우리딘 5'-트리포스페이트, 4-티오우리딘 5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴시티딘 5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴우리딘 5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘 5'-트리포스페이트, 5-브로모우리딘 5'-트리포스페이트, 5-요오도시티딘 5'-트리포스페이트, 5-요오도우리딘 5'-트리포스페이트, 5-메틸시티딘 5'-트리포스페이트, 5-메틸우리딘 5'-트리포스페이트, 6-아자시티딘 5'-트리포스페이트, 6-아자우리딘 5'-트리포스페이트, 6-클로로퓨린 리보사이드 5'-트리포스페이트, 7-데아자아데노신 5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신 5'-트리포스페이트, 8-아자아데노신 5'-트리포스페이트, 8-아지도아데노신 5'-트리포스페이트, 벤즈이미다졸 리보사이드 5'-트리포스페이트, N1-메틸아데노신 5'-트리포스페이트, N1-메틸구아노신 5'-트리포스페이트, N6-메틸아데노신 5'-트리포스페이트, O6-메틸구아노신 5'-트리포스페이트, 슈도우리딘 5'-트리포스페이트, 퓨로마이신 5'-트리포스페이트 또는 크산토신 5'-트리포스페이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 슈도우리딘(PsU), 5-메톡시우리딘(5moU), 5-메틸시티딘/슈도우리딘(5meC PsU), N1-메틸-슈도우리딘(N1mPsU) 또는 이들의 조합을 포함한다.
전형적으로 mRNA 합성에는 N-말단(5') 끝에 "캡"을 추가하고 C-말단(3') 끝에 "테일"을 추가하는 것이 포함된다. 캡의 존재는 대부분의 진핵 세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 저항성을 제공하는 데 중요하다. "테일"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA(예를 들어, CAR을 인코딩하는 mRNA)는 5' 캡 구조를 포함한다. 5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 추가된다: 첫째, RNA 말단 포스파타아제가 5' 뉴클레오티드에서 말단 인산염 기 중 하나를 제거하여 2개의 말단 인산염을 남기고; 그 다음 구아노신 트리포스페이트(GTP)이 구아닐릴 트랜스퍼라제를 통해 말단 인산염에 추가되어 5' 트리포스페이트 연결을 생성한 다음; 구아닌의 7-질소는 메틸트랜스퍼라제에 의해 메틸화된다. 캡 구조의 예는 m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A 및 G(5')ppp(5')G를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 캡은 Cap0 구조를 포함한다. cap0 구조는 염기 1과 2에 부착된 리보스의 2'-O-메틸 잔기가 부족하다. 일부 구현예에서, 캡은 AGCap1 구조를 포함한다. AGCap1 구조는 염기 2에 2'-O-메틸 잔기를 가지고 있다. 일부 구현예에서, 캡은 Cap2 구조를 포함한다. Cap2 구조는 염기 2와 3 모두에 2'-O-메틸 잔기가 부착되어 있다. 일부 구현예에서, 캡 구조는 AGCap1, m6AGCap1 또는 역전 방지 캡 유사체 (ARCA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변형된 mRNA는 m6AGCap1 및 슈도우리딘(PsU)을 포함하는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA(예를 들어, CAR을 인코딩하는 mRNA)는 3' 폴리(A) 테일 구조를 포함한다. mRNA의 3' 말단 상의 폴리(A) 테일은 전형적으로 약 10 내지 400개의 아데노신 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 100 내지 400개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 10 내지 200개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 10 내지 150개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 10 내지 100개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 20 내지 70개의 아데노신 뉴클레오티드, 또는 약 20 내지 60개의 아데노신 뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 3' 폴리(C) 테일 구조를 포함한다. mRNA의 3' 말단 상의 적합한 폴리(C) 테일은 전형적으로 약 10 내지 200개의 시토신 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 10 내지 150개의 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 100개의 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 70개의 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 60개의 시토신 뉴클레오티드, 또는 약 10 내지 40개의 시토신 뉴클레오티드)를 포함한다. 폴리(C) 테일은 폴리(A) 테일에 추가되거나 폴리(A) 테일의 대체물이 될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA(예를 들어, CAR을 인코딩하는 mRNA)는 5' 및/또는 3' 미번역 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 미번역 영역은 mRNA의 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소, 예를 들어 철 반응 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 미번역 영역은 길이가 약 50 내지 500개 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 3' 미번역 영역은 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상, 세포 내 mRNA의 위치 안정성에 영향을 미치는 단백질에 대한 결합 부위, 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 미번역 영역은 길이가 50 내지 500개 뉴클레오티드 이상일 수 있다.
핵산 전달
본 개시내용은 특히 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 변형시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 그의 단편을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 면역 세포로 전달하는 것을 포함한다. 방법은 면역 세포가 (a)-(c)를 포함하는 CAR을 포함하도록 면역 세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포, 또는 수지상 세포)에, (a) 세포외 도메인 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포외 도메인), (b) 막횡단 도메인 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 막횡단 도메인), 및 (c) 세포내 도메인 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포내 도메인)을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 전달하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 (d) 세포외 리더 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포외 리더 도메인), (e) 세포외 힌지 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포외 힌지 도메인), 또는 (f) 세포내 공동자극 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포내 공동자극 도메인) 중 1개, 2개 또는 3개를 추가로 인코딩한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 CAR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 전달의 하나 이상의 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법을 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 CAR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 도입하고 CAR을 인코딩하지 않는 하나 이상의 핵산 서열을 도입할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 작제물을 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)에 도입하기 위한 물리적 방법은 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포펙션, 바이로머(Viromer) 매개 형질감염, 입자 폭격, 미세주입, 기계적 형질도입(예를 들어, 압착형 기술) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 핵산 작제물은 전기천공(Amaxa Nucleofector-II® (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany), ECM 830 BTX (Harvard Instruments, Boston, Mass.), Gene Pulser II® (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator® (Eppendort, Hamburg Germany)), Maxcyte STX (Maxcyte), Maxcyte VLX (Maxcyte), Maxcyte GT (Maxcyte), CliniMacs Electroporator (Miltenyi Biotec), 또는 Neon 형질감염 시스템 (Thermo Fisher)을 포함하여 상업적으로 입수가능한 방법을 사용하여 면역 세포에 도입될 수 있다. 핵산 작제물은 또한 mRNA 형질감염, 예를 들어, 양이온성 리포솜 매개 형질감염, 리포펙션, 폴리머 캡슐화, 펩티드 매개 형질감염, 또는 바이오리스틱 입자 전달 시스템, 예컨대 "유전자 건(gun)"을 사용하여 면역 세포에 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Nishikawa, 등 Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)]를 참조하고, 전체 내용이 참고로 포함됨).
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 작제물을 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)에 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 세포)에 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 바이러스 벡터는 또한 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 (예를 들어 Adf535), 또는 아데노 연관 바이러스 (참고, 예를 들어, U.S. 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨)로부터 유도될 수 있다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스 벡터는 이식유전자의 장기적이고 안정적인 통합과 딸 세포에서의 증식을 허용하는 장기 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 Vpx 단백질과 함께 패키징된다(예를 들어, 국제 공개 번호 WO 2017/044487에 기술된 바와 같이, 이는 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다). 일부 구현예에서, Vpx는 비리온 연관 단백질(예를 들어, 바이러스 복제를 위한 부속 단백질)을 포함한다. 일부 구현예에서, Vpx 단백질은 인간 면역결핍 바이러스 2형(HIV-2)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, Vpx 단백질은 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)는 Vpx 단백질로 패키징된 렌티바이러스 벡터로 형질감염된다. 일부 구현예에서, Vpx는 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)의 적어도 하나의 항바이러스 인자를 억제한다. 일부 구현예에서, Vpx 단백질로 패키징된 렌티바이러스 벡터는 예를 들어 Vpx 단백질로 패키징되지 않은 렌티바이러스 벡터에 비해 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)의 증가된 형질감염 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)는 전기천공되거나 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 예를 들어, Ad2 벡터 또는 Ad5 벡터(예를 들어, Ad5f35 아데노바이러스 벡터, 예를 들어, 헬퍼 의존성 Ad5F35 아데노바이러스 벡터))로 형질감염되기 전에 적어도 하나의 Vpx mRNA로 형질감염된 것 중 하나 또는 둘 다이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 작제물을 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)에 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구형체, 비드, 및 지질 기반 시스템 (예를 들어, 수중유 에멀젼, 마이셀, 혼합된 마이셀, 나노입자, 리포솜, 및 리포펙타민-핵산 복합체)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 작제물의 전달을 위한 시스템은 지질 기반 시스템이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 작제물은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되고, 지질 이중층 내에 산재되어 있으며, 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되고, 리포좀에 포획되고, 리포좀과 복합체를 이루고, 지질을 포함하는 용액 또는 현탁액에 분산되고,
지질과 혼합되고, 마이셀과 복합체를 형성하거나 달리 지질과 회합될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있다. 지질은 상업적 공급원에서도 얻을 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린은 Sigma(St. Louis, MO)로부터 입수할 수 있으며; 디세틸 포스페이트는 K & K Laboratories(Plainview, NY)로부터 입수할 수 있고; 콜레스테롤은 Calbiochem-Behring에서 얻을 수 있으며; 그리고 디미리스틸 포스파티딜글리세롤은 Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL.)로부터 입수할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올의 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 보관할 수 있다.
핵산 정제
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 핵산(예를 들어, CAR을 인코딩하는 mRNA)을 정제하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산(예를 들어, CAR을 인코딩하는 mRNA)을 정제하는 단계는 당업계에 공지된 임의의 표준 정제 방법의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산(예를 들어, CAR을 인코딩하는 mRNA)을 정제하는 단계는 실리카 막 정제, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), Dynabeads, LiCl 침전, 페놀-클로로포름 추출, 수지 기반 정제, 폴리A 단리, RNeasy, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산(예를 들어, CAR을 인코딩하는 mRNA)을 정제하는 단계는 실리카 막 정제를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산(예를 들어, CAR을 인코딩하는 mRNA)을 정제하는 단계는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 포함한다.
변형 동안 면역 세포의 처리 및 배양
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 면역 세포를 변형시키는 과정 동안 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 처리하는 하나 이상의 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 시험관 내 전사된 mRNA에 의해 활성화된 경로의 조절제로 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 처리하는 단계를 포함한다. 시험관 내 전사(IVT) mRNA는 다양한 엔도좀 선천성 면역 수용체 (톨(Toll) 유사 수용체 3 (TLR3), TLR7 및 TLR8) 및 세포질 선천성 면역 수용체 (단백질 키나제 RNA 활성화 (PKR), 레틴산 유도성 유전자 I 단백질 (RIG-I), 흑색종 분화 연관 단백질 5 (MDA5) 및 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 (OAS))에 의해 인식된다. 이러한 다양한 경로를 통한 신호전달은 1형 인터페론(IFN), 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨-6(IL-6), IL-12 및 전사 프로그램 캐스케이드의 활성화와 연관된 염증를 초래한다. 전반적으로 이들은 특정 면역 반응을 유도할 수 있는 염증 유발 미세환경을 만든다. 또한 진핵생물 번역 개시 인자 2α (eIF2α) 인산화에 의한 번역의 둔화, 리보뉴클레아제 L (RNaseL)에 의한 향상된 RNA 분해, 및 자가 증폭 mRNA의 과발현 및 복제 억제와 같은 다운스트림 효과는 IVT mRNA의 약동학 및 약력학과 관련이 있다.
일부 구현예에서, 시험관 내 전사된 mRNA에 의해 활성화된 경로의 조절제는 RNase 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 시험관 내 전사된 mRNA에 의해 활성화된 경로의 조절제는 RNaseL, RNase T2 또는 RNase1 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 시험관 내 전사된 mRNA에 의해 활성화된 경로의 조절제는 RNaseL 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, RNaseL 억제제는 수니티닙을 포함한다. 일부 구현예에서, RNaseL 억제제는 ABCE1을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 RNaseL 억제제로 처리하는 것은, RNaseL 억제제로 처리되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에서의 mRNA 안정성에 비해 변형된 면역 세포에서의 mRNA 안정성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 RNaseL 억제제로 처리하는 것은, RNaseL 억제제로 처리되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에서의 CAR 발현에 비해 변형된 면역 세포에서의 CAR 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 RNaseL 억제제로 처리하는 것은, RNaseL 억제제로 처리되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에서의 효과기 활성에 비해 변형된 면역 세포에서의 효과기 활성을 증가시킨다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 면역 세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 처리하는 단계는 면역 세포에 mRNA를 전달하는 단계 전에 일어난다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNFα, IL-6, STNGL, LPS, CD40 효능제, 4-1BB 리간드, 재조합체 4-1BB, CD19 효능제, TLR 효능제 (예를 들어, TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8 또는 TLR-9), TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF- β2, 또는 TGF-β3), 글루코코르티코이드, 면역 복합체, 인터류킨-1 알파 (IL-1α), IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-20, 과립구-대식세포 집락-자극 인자 (GM-CSF), 과립구 집락-자극 인자 (G-CSF), 백혈병 억제 인자 (LIF), 온코스타틴 M (OSM), TNF-β, CD154, 림프독소 베타 (LT-β), A 증식 유도 리간드 (APRIL), CD70, CD153, 글루코코르티코이드 유도 TNF 수용체 리간드 (GITRL), 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14 (TNFSF14), OX40L (CD252), TALL-1 (종양 괴사 인자 리간드 슈퍼패밀리 구성원 13B - TNFSF13B), TNF 관련 세포자멸사 유도 리간드 (TRAIL), 세포자멸사의 TNF 관련 약한 유도제 (TWEAK), TNF 관련 활성화 유도 사이토카인 (TRANCE), 에리트로포이에틴 (Epo), 갑상선 과산화효소 전구체 (Tpo), FMS 관련 티로신 키나제 3 리간드 (FLT-3L), 줄기 세포 인자 (SCF), 대식세포 집락-자극 인자 (M-CSF), 메로조이트 표면 단백질 (MSP), 뉴클레오티드 결합 올리고머화 도메인-함유 단백질 (NOD) 리간드 (예를 들어, NOD1, NOD2, 또는 NOD1/2 효능제), RIG-I 유사 수용체 (RLR) 리간드 (예를 들어, 5'ppp-dsRNA, 3p-hpRNA, 폴리(I:C), 또는 폴리(dA:dT)), C-유형 렉틴 수용체 (CLR) 리간드 (예를 들어, 커들란, β-글루칸, HKCA, 라미나린, 푸스툴란, 스클레로글루칸, WGP 분산제, WGP 가용화제, 자이모산, 자이모산 고갈된, 푸르푸르만, b-GlcCer, GlcC14C18, HKMT, TDB, TDB-HS15, 또는 TDM), 사이클릭 디뉴클레오티드 센서 리간드 (예를 들어, 인터페론 유전자 (STING) 리간드의 C-Gas 효능제 또는 자극제), 인플라마좀 유도제 (예를 들어, 명반, ATP, CPPD 결정, 헤모조인, MSU 결정, Nano-SiO2, 리제리신, 또는 TDB), 아릴 탄화수소 (AhR) 리간드 (예를 들어, FICZ, 인디루빈, ITE, 또는 L-키뉴레닌), 알파-단백질 키나제 1 (ALPK1) 리간드, 다중-PRR 리간드, NFKB/NFAT 활성화제 (예를 들어, 콘카발린 A, 이오노마이신, PHA-P, 또는 PMA) 또는 이들의 조합을 포함한다 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN-β를 포함한다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 면역 세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 단계는 면역 세포에 mRNA를 전달하는 단계 후에 일어난다.
일부 구현예에서, 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 변형된 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 것은 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 배양되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 변형된 면역 세포의 생존능을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 변형된 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 것은 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 배양되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 변형된 면역 세포의 단백질 (예를 들어, CAR) 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 변형된 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 것은 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 배양되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 단백질 (예를 들어, CAR) 발현의 수명을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 변형된 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 것은 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 배양되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 변형된 면역 세포의 효과기 활성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 변형된 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 것은 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 배양되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 변형된 면역 세포의 M1 분극화를 증가시킨다.
변형된 면역 세포
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 본 개시내용의 방법에 의해 제조된다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 증가된 생존능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 증가된 생존능을 나타낸다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 CAR을 인코딩하는 mRNA의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 적어도 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1500%, 또는 2000%의, CAR을 인코딩하는 mRNA의 발현 증가를 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 적어도 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 또는 20x의, CAR을 인코딩하는 mRNA의 발현 증가를 나타낸다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 증가된 CAR 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 적어도 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1500%, 또는 2000%의 증가된 CAR 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 적어도 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 또는 20x의 증가된 CAR 발현을 나타낸다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 CAR을 인코딩하는 mRNA의 증가된 수명을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 적어도 12 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 3 주, 또는 1 개월의, CAR을 인코딩하는 mRNA의 수명 증가를 나타낸다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 CAR의 증가된 수명을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 적어도 12 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 3 주, 또는 1 개월의, CAR의 수명 증가를 나타낸다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 증가된 효과기 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000%의 증가된 효과기 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 증가된 효과기 활성은 증가된 사이토카인 생산, 케모카인 생산, 식균작용, 세포 신호전달, 표적 세포 사멸 및/또는 항원 제시를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 증가된 M1 분극화를 나타낸다. 일부 구현예에서, 증가된 M1 분극화는 CD86, CD80, MHC II, IL-1R, TLR2, TLR4, iNOS, SOCS3, CD83, PD-L1, CD69, MHC I, CD64, CD32, CD16, IL1R, IFIT 패밀리 구성원, 또는 ISG 패밀리 구성원을 포함하는 M1 마커의 증가된 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000%의 증가된 M1 분극화를 나타낸다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 감소된 M2 분극화를 나타낸다. 일부 구현예에서, 감소된 M2 분극화는 CD206, CD163, 또는 CD209를 포함하는 M2 마커의 감소된 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000%의 감소된 M2 분극화를 나타낸다.
검정
면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 작제물의 존재를 확인하기 위해 다양한 검정이 수행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 검정은 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 분석; 및 "생화학적" 검정, 예를 들어 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의한 특정 펩티드의 존재 또는 부재 검출을 포함한다. 본 개시내용의 다른 검정은 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 면역형광 현미경검사, MSD 사이토카인 분석, 질량 분광분석 (MS), RNA-Seq 및 기능적 검정을 포함한다.
다양한 검정은 면역 세포 생존능, 핵산 (예를 들어, mRNA) 발현, 핵산 (예를 들어, mRNA) 수명, 단백질 (예를 들어, CAR) 발현, 단백질 (예를 들어, CAR) 수명, 효과기 활성, 및 M1 분극으로 제한되지 않는 것과 같은 변형된 면역 세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포, 또는 수지상 세포)의 다양한 특징을 결정하기 위해 수행될 수 있다.
GenBank 기탁 번호를 포함하여 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 또한, 물질, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 본 명세서에 기재되어 있다.
키메라 항원 수용체(CAR)
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역 효과기 세포 상에서 발현되도록 조작되고 세포를 특이적으로 표적화하고/하거나 항원에 결합하는 인공 세포 표면 수용체를 지칭한다. CAR은 예를 들어 입양 세포 전달을 통한 요법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포는 환자로부터(예를 들어, 혈액, 종양 또는 복수액으로부터) 제거되고 이들이 특정 형태의 항원에 특이적인 수용체를 발현하도록 변형된다. 일부 구현예에서, CAR은 항원, 예를 들어 종양 연관 항원에 특이적으로 발현되었다. 일부 구현예에서, CAR은 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포, 예를 들어 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 그 안에 CAR을 발현함으로써 생성된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 포함하고, 여기서 면역 세포는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 세포외 리더 도메인, 하나 이상의 세포외 힌지 도메인 및 하나 이상의 세포내 공동자극 도메인 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 세포외 도메인과 막횡단 도메인(예를 들어, CD8 또는 CD28 힌지 도메인) 사이에 스페이서 도메인 또는 힌지를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포내 도메인과 막횡단 도메인 사이에 스페이서 도메인 또는 힌지를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "스페이서 도메인" 또는 "힌지"는 막횡단 도메인을 세포외 도메인 또는 폴리펩티드 사슬의 세포내 도메인에 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 스페이서 도메인 또는 힌지는 최대 300개의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바람직하게는 2 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 막횡단 도메인과 CAR의 세포내 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 링커의 예는 글리신-세린 이중체를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR을 포함하는 면역 세포는 안전 스위치(예를 들어, 온 스위치 및 오프 스위치, 자살 스위치), 로직 게이트, 예를 들어 AND 게이트(예를 들어, 2개 이상의 CAR, 각각은 완전한 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포) 활성화 또는 기능을 위해 두/모든 CAR의 활성화가 필요하도록 하나 이상의 신호 도메인이 없음), OR 게이트(예를 들어, 각각 CD3ξ과 같은 세포내 도메인 및 공동자극 도메인을 갖는 2개 이상의 CAR), 및/또는 NOT 게이트(예를 들어, 2개 이상의 CAR, 이들 중 하나는 다른 CAR[들]의 기능을 길항하는 억제 도메인을 포함함)을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 CAR을 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 단리된 핵산 서열)을 포함하는 면역 세포를 제공하고, 여기서 핵산 서열은 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열, 막횡단 도메인을 인코딩하는 핵산 서열 및 세포내 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 세포는 CAR을 발현하는 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포이다.
일부 구현예에서, CAR은 면역 세포에서의 발현을 위해 막횡단 도메인 또는 세포내 도메인과 같은 CAR의 또 다른 도메인에 작동 가능하게 연결된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산은 막횡단 도메인을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되고 막횡단 도메인을 인코딩하는 핵산은 세포내 도메인을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, CAR을 포함하는 면역 세포의 효과기 활성은 CAR의 항원 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항원을 포함하는 표적 세포에 대해 지시된다. 일부 구현예에서, 표적 세포에 대한 표적화된 효과기 활성은 식균작용, 표적화된 세포 세포독성, 항원 제시 또는 사이토카인 분비이거나 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 본 명세서에 기재된 면역 세포 (예를 들어, 대식세포, 단핵구, 또는 수지상 세포)에서 항-식세포 신호전달을 억제하는 적어도 하나의 도메인 (예를 들어, 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및/또는 세포내 도메인)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 예를 들어 CD47 및/또는 SIRPα 활성의 억제를 향상시킴으로써 본 명세서에 기재된 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)의 효과기 활성을 개선한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 CD47에 결합하고, 예를 들어 SIRPα 활성을 억제하는 우성 음성 수용체로서 작용한다(예를 들어, CD47 싱크). 일부 구현예에서, SIRPα에 결합하는 본 명세서에 기재된 CAR은 예를 들어 활성화 수용체를 포함한다(예를 들어 CD3z 세포내 도메인을 포함한다). 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 CD47과 SIRPα의 적어도 하나의 상호작용을 억제한다. 일부 구현예에서, CAR은 식세포 로직 게이트이거나 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 면역 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR을 포함하거나 발현함)는 하기의 적어도 하나의 변이체 또는 단편을 포함하거나 발현한다: SIRPα (예를 들어, 우성 음성 SIRPα 또는 SIRPα의 고-친화성 조작된 변이체 (예를 들어, CV1)), 5F9 scFv, B6H12 scFv (예를 들어, 인간화 B6H12 scFv), PD1 (예를 들어, 우성 음성 PD1 또는 HAC-I), 항-PD1 scFv (예를 들어, E27 또는 더발루맙), Siglec-10, Siglec-9, Siglec-11, 및/또는 SHP-1. 일부 구현예에서, 변이체 또는 단편은 돌연변이된 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 또는 단편은 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함하거나 발현하지 않는다(예를 들어, 면역 세포는 항-CD47 scFv, CD8 힌지 도메인 및 CD8 막횡단을 포함하거나 발현한다). 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 면역 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR을 포함하거나 발현함)는 우성 음성 수용체, 예를 들어 억제 체크포인트를 차단하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 절단 펩티드(예를 들어, P2A, F2A, E2A 및/또는 T2A 펩티드) 및 항-식세포 신호전달의 적어도 하나의 억제 도메인을 포함하는 적어도 하나의 제2 CAR을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 제2 CAR은 SIRPα(예를 들어, SIRPα의 고친화도 조작된 변이체(예를 들어, CV1)), 5F9 scFv, B6H12 scFv(예를 들어, 인간화 B6H12 scFv), 또는 CD47 결합 세포외 도메인 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 제2 CAR은 SIRPα 막횡단 도메인 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 CAR은 힌지 도메인(예를 들어, CD8 힌지 도메인)을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 제2 CAR은 다음을 포함한다: (i) 리더 서열 (예를 들어, CD8 리더); ii) 세포외 도메인 (예를 들어, SIRPα, CV1, 5F9 scFv, 또는 B6H12 scFv (예를 들어, 인간화 B6H12 scFv) 세포외 도메인); 및 ii) 막횡단 도메인 (예를 들어, SIRPα 막횡단 도메인). 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 절단 펩티드 (예를 들어, P2A 펩티드) 및 적어도 하나의 마커 단백질 (예를 들어, CD20 또는 그의 단편, CD19 또는 그의 단편, NGFR 또는 그의 단편, 합성 펩티드, 및/또는 형광 단백질)을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 면역 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR을 포함하거나 발현함)는 하나 이상의 포스파타제 사멸 도메인 (예를 들어 포스파타제 사멸 Shp1, 포스파타제 사멸 72-5ptase (INPP5E), 포스파타제 사멸 Shp2, 및/또는 포스파타제 사멸 SHIP-1 도메인) 및/또는 구성적 활성 키나제 도메인 (예를 들어, 구성적 활성 LYN 도메인)를 포함하거나 발현한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 절단 펩티드 (예를 들어, P2A, F2A, E2A 및/또는 T2A 펩티드) 및 하나 이상의 포스파타제 사멸 도메인 (예를 들어 포스파타제 사멸 Shp1, 포스파타제 사멸 72-5ptase (INPP5E), 포스파타제 사멸 Shp2, 및/또는 포스파타제 사멸 SHIP-1 도메인) 및/또는 구성적 활성 키나제 도메인 (예를 들어, 구성적 활성 LYN 도메인)을 추가로 포함한다.
세포외 도메인
본 개시내용은 세포외 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 Fc 수용체(FcR) 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 톨 유사 수용체(TLR) 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 리더 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 힌지 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 FcR 세포외 도메인, TLR 세포외 도메인, 리더 도메인, 항원 결합 도메인 및 힌지 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다.
FcR 세포외 도메인
일부 구현예에서, FcR 세포외 도메인은 전장 FcR 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 세포외 도메인은 전장 FcR 세포외 도메인의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 세포외 도메인(또는 그의 일부)은 인간 FcR 세포외 도메인이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 세포외 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, FcR 세포외 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, FcR 세포외 도메인은 CD64 (FcγRI), CD32a (FcγRIIa), CD32b (FcγRIIb), CD32c, CD16a (FcγRIIIa), CD16b (FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII, 또는 FcαRI (CD89) 도메인을 포함한다.
TLR 세포외 도메인
일부 구현예에서, TLR 세포외 도메인은 전장 TLR 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 세포외 도메인은 전장 TLR 세포외 도메인의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 세포외 도메인(또는 그의 일부)은 인간 TLR세포외 도메인이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 세포외 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, TLR 세포외 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, TLR 세포외 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함한다.
리더 도메인
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 세포외 리더 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산은 세포외 리더 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지만, 세포외 리더 도메인은 CAR이 면역 세포에서 발현되기 전에 CAR로부터 절단된다. 일부 구현예에서, 세포외 리더 도메인은 인간 세포외 리더 도메인이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리더 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 리더 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 리더 도메인은 CD8 세포외 리더 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리더 도메인은 자극 또는 공동자극 도메인 (예를 들어, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, ALK, AXL, DDR2, EGFR, EphA1, INSR, cMET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR1, ROS1, RYK, TIE2, TRK, VEGFR, CD40, CD19, CD20, 41BB, CD28, OX40, GITR, TREM-1, TREM-2, DAP12, MR, ICOS, MyD88 도메인)으로부터의 리더 도메인을 포함한다.
항원 결합 도메인
일부 구현예에서, CAR은 예를 들어 표적 세포 상의 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 기생충 감염, 자가면역 질환 및/또는 암 세포와 연련된 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 특정 질환 상태와 연관된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로서 작용하는 항원을 인식한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 관심 종양 또는 암에 특이적인 항원과 같은 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서 종양 항원은 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1　(CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24라고도 함); C-유형 렉틴 유사 분자-1　(CLL-1 또는 CLECL1); CD33;　표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer);　TNF 수용체 계열 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선 특이적 멤브레인 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양 연관 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 암종배아 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터류킨 11 수용체 알파 (IL-11Ra); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Lewis)(Y) 항원; CD24; 혈소판 유도 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 병기 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 연관된 (MUC1); 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산 포스파타제 (PAP); 신장 인자 2 돌연변이된 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산탈수효소 IX (CAIX); 프로테아솜 (Prosome, Macropain) 서브유닛, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gp100); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 뮤린 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체 1 (Abl) (bcr-abl)로 이루어진 군으로부터 선택된 종양유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 접착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); 트랜스루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종 연관 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드 (OAcGD2); 폴레이트 수용체 베타; 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7 관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 열린 해독틀 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반 특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라미드 (GloboH)의 헥사사카리이드 부분; 유선 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); 간염 A 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 아넥신 3 (PANX3); G 단백질-커플링된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대시키다 해독틀 단백질 (TARP); 윌름스 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종 연관 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p (ETV6-AML)에 위치하는 ETS 전위-변이체 유전자 6; 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 계열, 구성원 1A (XAGE1); 안지오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 생존; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCTA-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1 (MelanA 또는 MART1)에 의해 인식된 흑색종 항원; 랫트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 중단점; 세포자멸사의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막횡단 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코스아미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 종양유전자 신경교세포종 유도된 동족체 (MYCN); Ras 동족체 계열 구성원 C (RhoC); 티로시나제 관련 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 1B1 (CYP1B1); CCCTC 결합 인자 (아연 핑거 단백질) 유사 (BORIS 또는 각인된 부위의 조절제의 브라더), T 세포 3 (SART3)에 의해 인식된 편평 세포 암종 항원; 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TES1); 림프구-특이 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 앵커 단백질 4 (AKAP-4); 활막 육종, X 중단점 2 (SSX2); 고급 당화 최종 산물용 수용체 (RAGE-1); 신장 편재성 1 (RU1); 신장 편재성 2 (RU2); 레구마인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장 카복실 에스테라제; 열 충격 단백질 70-2 돌연변이된 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 연관 면역글로불린 유사 수용체 1 (LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자 유사 계열 구성원 f (CD300LF); C-유형 렉틴 도메인 계열 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF 유사 모듈 함유 뮤신 유사 호르몬 수용체 유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체 유사 5 (FCRL5); 또는 면역글로불린 람다 유사 폴리펩티드 1 (IGLL1)를 포함한다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 ERBB2(Her2/neu)를 포함한다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 PSMA를 포함한다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 미스폴딩 단백질 항원 또는 관심 질환/질환에 특이적인 단백질과 같은 단백질 응집체의 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 질환/장애는 신경퇴행성 질환/장애, 염증성 질환/장애, 심혈관 질환/장애, 섬유성 질환/장애, 또는 아밀로이드증(예를 들어, 면역글로불린 경쇄 또는 트랜스티레틴의 단백질 응집체에 의해 매개됨)이다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환/장애는 타우병증, 시누클레인병증, 초로기 치매, 노인성 치매, 알츠하이머병 (베타-아밀로이드의 단백질 응집체에 의해 매개됨), 염색체 17에 연결된 파킨슨증 (FTDP-17), 진행성 핵상 마비 (PSP), 픽병(Pick's disease), 원발 진행 실어증, 전두측두 치매, 피질기저 치매, 파킨슨병, 치매 동반 파킨슨병, 루이스체가 있는 치매, 다운 증후군, 다계통 위축, 근위축 측삭 경화증 (ALS), 할러포르덴-슈파츠 증후군, 폴리글루타민 질환, 트리뉴클레오티드 반복 질환, 가족성 영국 치매, 치명적 가족성 불면증, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커 증후군, 아밀로이드증 (아이슬란드) (HCHW A-I)가 있는 선천성 대뇌 출혈, 산발성 치명적 불면증 (sFI), 가변적으로 프로테아제-민감한 프리온병증 (VPSPr), 가족성 덴마크 치매, 및 프리온병 (예컨대 크로이펠츠-야콥병, CJD 및 변이체 크로이펠츠-야콥병 (vCJD))로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항원에 결합하는 임의의 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 단클론성 항체, 다클론성 항체, 합성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 비-인간 항체, 또는 임의의 그의 단편, 예를 들어 scFv이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 압타머, 다르핀, 센타이린, 자연 발생 또는 합성 수용체, 아피바디, 또는 다른 조작된 단백질 인식 분자이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 포유동물 항체 또는 그의 단편이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 전체적으로 또는 부분적으로 CAR이 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유도된다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해 CAR의 항원 결합 도메인은 인간 항체, 인간화 항체 또는 그의 단편(예를 들어 scFv)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 이중특이성 CAR이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 상이한 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이성 CAR을 포함하고/하거나 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 상이한 CAR을 포함하는 면역 세포는 2개의 항원이 존재하도록 요구함으로써 표적외 및/또는 표적내 조직외 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 이중특이성 CAR을 포함하고/하거나 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 상이한 CAR을 포함하며, 여기서 CAR은 단독으로 변형된 세포의 활성화를 중재하기에 불충분하지만 함께 시너지 효과가 있어 변형된 세포의 활성화를 자극하는 별개의 신호를 제공한다. 일부 구현예에서, 그러한 작제물은 'AND' 로직 게이트로 지칭될 수 있다.
일부 구현예에서, 이중특이성 CAR을 포함하고/하거나 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 상이한 CAR을 포함하는 면역 세포는 도메인은 세포 활동이 자극되기 전에 하나의 항원이 존재하고 제2 정상 단백질 항원이 존재하지 않도록 요구함으로써 표적외 및/또는 표적내 조직외 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 그러한 작제물은 'NOT' 로직 게이트로 지칭될 수 있다. AND 게이트와 달리 NOT 게이트 CAR 변형 세포는 단일 항원에 결합하여 활성화된다. 그러나, 제2 항원에 대한 제2 수용체의 결합은 CAR을 통해 영속되는 활성화 신호를 무시하는 기능을 한다. 전형적으로, 이러한 억제 수용체는 정상 조직에서는 풍부하게 발현되지만 종양 조직에는 없는 항원에 대해 표적이 될 것이다.
힌지 도메인
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 세포외 힌지 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 힌지 도메인은 인간 세포외 힌지 도메인이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 힌지 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 힌지 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포외 힌지 도메인은 CD8a 세포외 힌지 도메인 또는 IgG4 또는 CD28 세포외 힌지 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 힌지 도메인은 CAR의 물리화학적 파라미터, 예를 들어 종양 항원에 대한 최적의 크기(예를 들어, 억제 분자의 배제를 허용함), 최적의 유연성, 최적의 단백질 폴딩, 최적의 단백질 안정성, 최적의 결합, 최적의 동종이량체화, 및/또는 동종이량체화의 결여를 최적화한다.
막횡단 도메인
일부 구현예에서, CAR은 예를 들어 세포외 도메인을 세포내 도메인에 연결하는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 자연적으로 CAR의 하나 이상의 다른 도메인(들)과 회합된다. 일부 구현예에서, 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해, 다른 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 대한 결합을 피하도록 막횡단 도메인을 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 자연 발생 또는 합성 공급원으로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 자연 발생 막 결합 또는 막횡단 단백질로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 인간 막횡단 도메인이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD8a, CD64, CD32a, CD32c, CD16a, TRL1, TLR2, TLR3, TRL4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, ALK, AXL, DDR2, EGFR, EphA1, INSR, cMET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR1, ROS1, RYK, TIE2, TRK, VEGFR, CD40, CD19, CD20, 41BB, CD28, OX40, GITR, TREM-1, TREM-2, DAP12, MR, ICOS, MyD88, CD3-제타, FcR γ, V/I/LxYxxL/V, SIRPα, CD45, Siglec-10, PD1, SHP-1, SHP-2, KIR-2DL, KIR-3DL, NKG2A, CD170, CD33, BTLA, CD32b, SIRPβ, CD22, PIR-B, LILRB1, CD36, 또는 Syk 막횡단 도메인을 포함한다.
FcR 막횡단 도메인
일부 구현예에서, FcR 막횡단 도메인은 전장 FcR 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 막횡단 도메인은 전장 FcR 막횡단 도메인의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 막횡단 도메인은 인간 FcR 막횡단 도메인, 또는 그의 일부이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 막횡단 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, FcR 막횡단 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, FcR 막횡단 도메인은 CD64 (FcγRI), CD32a (FcγRIIa), CD32b (FcγRIIb), CD32c, CD16a (FcγRIIIa), CD16b (FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII, 또는 FcαRI (CD89) 도메인을 포함한다.
TLR막횡단 도메인
일부 구현예에서, TLR 막횡단 도메인은 전장 TLR 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 막횡단 도메인은 전장 TLR 막횡단 도메인의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 막횡단 도메인은 인간 TLR 막횡단 도메인 또는 그의 일부이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 막횡단 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, TLR 막횡단 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, TLR 막횡단 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함한다.
세포내 도메인
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 인간 세포내 도메인 또는 그의 일부이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 도메인 및/또는 다른 세포질 도메인은 CAR이 발현되는 세포(예를 들어, 면역 세포)의 활성화를 담당한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 상기 CAR을 포함하는 면역 세포에서 신호 활성화 및/또는 형질도입을 담당한다.
일부 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 신호 활성화 및/또는 형질도입을 담당하는 적어도 하나의 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 공동자극 분자 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 이중 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 2개 초과의 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포내 도메인은 표면 수용체의 세포질 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 공동자극 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 면역 세포에서 신호 전달을 개시하도록 작용하는 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 CD3, Fc 엡실론 RI 감마 사슬, 임의의 유도체 또는 그의 변이체, 동일한 기능적 능력을 갖는 그의 임의의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합으로부터의 적어도 하나의 신호전달 도메인과 같은 하나 이상의 공동자극 분자의 임의의 부분을 포함한다.
FcR 세포내 도메인
일부 구현예에서, FcR 세포내 도메인은 전장 FcR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 세포내 도메인은 전장 FcR 세포내 도메인의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 세포내 도메인은 인간 FcR 세포내 도메인, 또는 그의 일부이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 세포내 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, FcR 세포내 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, FcR 세포내 도메인은 CD64 (FcγRI), CD32a (FcγRIIa), CD32b (FcγRIIb), CD32c, CD16a (FcγRIIIa), CD16b (FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII, 또는 FcαRI (CD89) 도메인을 포함한다.
TLR 세포내 도메인
일부 구현예에서, TLR 세포내 도메인은 전장 TLR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 세포내 도메인은 전장 TLR 세포내 도메인의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 세포내 도메인은 인간 TLR 세포내 도메인 또는 그의 일부이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 세포내 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, TLR 세포내 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, TLR 세포내 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함한다.
신호전달 도메인
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 인간 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 일부이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타, FcR γ, CD64, CD32a, CD32c, CD16a, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, ALK, AXL, DDR2, EGFR, EphA1, INSR, cMET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR1, ROS1, RYK, TIE2, TRK, VEGFR, CD40, CD19, CD20, 41BB, CD28, OX40, GITR, TREM-1, TREM-2, DAP12, MR, ICOS, MyD88, V/I/LxYxxL/V, SIRPα, CD45, Siglec-10, PD1, SHP-1, SHP-2, KIR-2DL, KIR-3DL, NKG2A, CD170, CD33, BTLA, CD32b, SIRPβ, CD22, PIR-B, LILRB1,Syk, 41BB 리간드 (41BBL; TNFSF9), CD27, OX40L, CD32b, CD11b, ITGAM, SLAMF7, CD206, CD163, CD209, 덱틴-2, 또는 하나 이상의 사이토카인 수용체 신호전달 도메인 (예를 들어, IL1R, IL2R, IL3R, IL4R, IL5R, IL6R, IL7R, IL8R, IL9R, IL10R, IL11R, IL12R, IL13R, IL14R, IL15R, IL17R, IFNaR, IFNgR, TNFR, CSF1R, CSF2R, Dap10, CD36, 덱틴-1, 또는 ICOSL 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 임의의 조합으로 위 단락에 나열된 신호전달 도메인 중 하나와 함께 이중 신호전달 도메인, 예컨대 41BB, CD28, ICOS, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, CD116 수용체 베타 사슬, CSF1-R, LRP1/CD91, SR-A1, SR-A2, MARCO, SR-CL1, SR-CL2, SR-C, SR-E, CR1, CR3, CR4, 덱틴 1, 데크-205, DC-징후, CD14, CD36, LOX-1, CD11b를 포함한다.
공동자극 도메인
본 명세서에서 사용되는 "공동자극 분자" 또는 "공동자극 도메인"은 초기 자극을 높이거나 약화시키는 데 사용되는 면역 세포의 분자를 지칭한다. 예를 들어, TLR 또는 CD47/SIRPα 축과 같은 병원체 연관 패턴 인식 수용체는 각각 초기 자극을 높이거나 약화시키는 면역 세포의 분자이다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 TCR, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD86, 공통 FcR 감마, FcR 베타 (Fc 엡실론 R1b), CD79a, CD79b, Fc감마 RIIa, DAP10, DAP12, T 세포 수용체 (TCR), CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (촉각), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D와 특이적으로 결합하는 리간드, 본 명세서에 기재된 다른 공동자극 분자, 그의 임의의 유도체, 변이체, 또는 단편, 동일한 기능적 능력을 갖는 공동자극 분자의 임의의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 내인성이 아닌 도메인일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "공동자극 신호"는 면역 세포 상의 CAR의 활성화와 같은 일차 신호와 조합되어 면역 세포의 활성화를 유도하는 신호를 지칭한다.
절단 펩티드
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 절단 펩티드는 세포에서 재조합 단백질의 절단을 유도할 수 있는 펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 절단 펩티드는 2A 펩티드이다. 일부 구현예에서, 절단 펩티드는 P2A, F2A, E2A 또는 T2A 펩티드이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산은 하나 이상의 절단 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산은 또한 하나 이상의 세포내 도메인을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열 및 하나 이상의 펩티드 제제를 포함하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하며, 여기서 핵산의 번역은 절단 펩티드에 의해 하나 이상의 펩티드 제제로부터 분리된 하나 이상의 세포내 도메인을 포함하는 단백질을 생성한다. 일부 구현예에서, 제1 프로모터는 CAR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산에 작동 가능하게 연결되고 제2 프로모터는 펩티드 제제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, CAR 및 선택적으로 하나 이상의 펩티드 제제를 포함하는 핵산 서열은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 추가로 포함한다. IRES 서열은 번역의 개시를 용이하게 하는 mRNA에 대한 캡-독립적 리보솜 결합을 개시하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다.
펩티드 제제
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 펩티드 제제는 면역 세포에서 CAR과 공동 발현되는 펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 펩티드 제제는 화학양론적 균형 및 CAR의 최적 신호전달을 보장하기 위해 CAR과 공동 발현된다. 일부 구현예에서, 펩티드 제제는 동일한 펩티드 제제와 동종이량체를 형성한다. 일부 구현예에서, 펩티드 제제는 상이한 펩티드 제제와 함께 이종이량체를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산은 하나 이상의 펩티드 제제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 제제는 FcR 감마 사슬이거나 FcR 감마 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, 펩티드 제제는 임의의 펩티드, 단백질, 수용체, 분비 항체 또는 그의 단편(예를 들어, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fc 또는 나노바디)을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 제제는 하나 이상의 사이토카인 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, IFNa, IFNb, IFN-y, GMCSF, 또는 MCSF 중 하나 이상), CD40-L, 우성 음성 SIRPα, 우성 음성 PD1, 우성 음성 CD45, 우성 음성 SIGLEC 10, 또는 우성 음성 LILRB를 포함한다.
Fc 수용체(FcR)
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 FcR 세포외 도메인을 포함하고/하거나 CAR의 막횡단 도메인은 FcR 막횡단 도메인을 포함하고/하거나 CAR의 세포내 도메인은 FcR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 N-말단에서 C-말단까지 하나 이상의 세포외 결합 도메인, FcR 세포외 도메인, FcR 막횡단 도메인 및 FcR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 세포외 도메인, FcR 막횡단 도메인 및 FcR 세포내 도메인 중 하나 이상은 인간 FcR 도메인이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 세포외 도메인, FcR 막횡단 도메인 및 FcR 세포내 도메인은 함께 전장 FcR을 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 세포외 도메인, FcR 막횡단 도메인 및 FcR 세포내 도메인은 함께 전장 FcR의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 세포외 도메인은 전장 FcR 세포외 도메인의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 막횡단 도메인은 전장 FcR 막횡단 도메인의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, FcR 세포내 도메인은 전장 FcR 세포내 도메인의 일부를 포함한다.
톨(Toll) 유사 항원 수용체(TLR)
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 톨 유사 수용체(TLR) 세포외 도메인을 포함하고/하거나 CAR의 막횡단 도메인은 TLR 막횡단 도메인을 포함하고/하거나 CAR의 세포내 도메인은 TLR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 N-말단에서 C-말단까지, 하나 이상의 세포외 결합 도메인, TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인 중 하나 이상은 인간 TLR 도메인이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인은 함께 전장 TLR을 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인은 함께 전장 TLR의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 세포외 도메인은 전장 TLR 세포외 도메인의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 막횡단 도메인은 전장 TLR 막횡단 도메인의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, TLR 세포내 도메인은 전장 TLR 세포내 도메인의 일부를 포함한다.
핵산 작제물
본 개시내용은 특히 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 면역 세포는 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 외인성 핵산 분자)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 CAR을 인코딩하는 핵산 분자는 다음을 포함한다: (a) 세포외 도메인 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포외 도메인), (b) 막횡단 도메인 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 막횡단 도메인), 및 (c) 세포내 도메인 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포내 도메인).
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다. 용어 "인코딩(encoding)"는 뉴클레오티드의 한정된 서열 (예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 아미노산의 한정된 서열을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA 또는 mRNA 내의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 유전자, cDNA, 또는 RNA,는 단백질을 인코딩한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다는 단백질 또는 그 유전자의 다른 생성물 또는 cDNA를 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
"작동 가능하게 연결된" 또는 "전사 제어"라는 용어는 조절 서열과 이종성 핵산 서열의 발현을 초래하는 이종성 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 서로 인접할 수 있고, 예를 들어, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 데 필요한 경우 동일한 열린 해독틀에 있다.
본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산 분자은 DNA 분자, RNA 분자 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR 또는 그의 단편을 인코딩하는 메신저 RNA(mRNA) 전사체를 포함하거나 그 전사체이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR 또는 그의 단편을 인코딩하는 DNA 작제물을 포함하거나 그 작제물이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CAR의 전부 또는 단편은 예를 들어 세포(예를 들어 포유동물 세포)에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 다양한 코돈 최적화 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제5,786,464호 및 제6,114,148호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산의 발현은 CAR 폴리펩티드 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산을 발현 벡터 내의 프로모터에 작동 가능하게 연결함으로써 달성될 수 있다. 예시적인 프로모터(예를 들어, 구성적 프로모터)는 신장 인자-1α 프로모터 (EF-1α) 프로모터, 즉시 초기 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 포스포글리세로키나제 (PGK) 프로모터, 유인원 바이러스 40 (SV40) 조기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMuLV) 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡슈타인-바르 바이러스 즉시 초기 프로모터, 루 육종 바이러스 프로모터, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 또는 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 또한 전사 개시 빈도를 조절하기 위해 추가적인 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 CAR 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는 바이러스 벡터를 포함하거나 그 벡터이다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 기술되어 있다(예를 들어, Sambrook 등, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY). 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터(예를 들어, 미국 특허 제9,149,519호 또는 국제 공개 번호 WO 2017/044487에 기재된 바와 같음, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)를 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 아데노바이러스는 이중 가닥 DNA를 함유하는 대규모 바이러스 패밀리이다. 그들은 바이러스 RNA, DNA 및 단백질을 합성하기 위해 숙주의 세포 기구를 사용하여 숙주 세포의 핵 내에서 복제한다. 아데노바이러스는 복제 및 비-복제 세포 모두에 영향을 미치고, 큰 이식유전자를 수용하고, 숙주 세포 게놈에 통합되지 않고 단백질을 인코딩하는 것으로 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 Ad2 벡터 또는 Ad5 벡터 (예를 들어, Ad5f35 아데노바이러스 벡터, 예를 들어, 헬퍼 의존성 Ad5F35 아데노바이러스 벡터)를 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터이다. AAV 시스템은 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-17 (1994); Cotten 등, P.N.A.S. U.S.A., 89(13):6094-98 (1992); Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64 (1994); Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129 (1992); 및 Asokan A, 등, Mol. Ther., 20(4):699-708 (2012)] 참조). 재조합 AAV(rAAV) 벡터를 생성하고 사용하는 방법은 예를 들어 특허 제5,139,941호 및 제4,797,368호에 기재되어 있다.
AAV1, AAV2, AAV3 (예를 들어, AAV3B), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 및 AAV11, 뿐만 아니라 그의 변이체를 포함하는 여러 AAV 혈청형이 특성화되었다. 일반적으로, 임의의 AAV 혈청형은 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 혈청형은 특정 조직에 대한 향성을 갖는다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas9 시스템은 상동 재조합(HR) 동안 공여자 주형 DNA 역할을 하는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터를 사용하여 높은 수준의 정밀한 게놈 편집을 용이하게 하는 것으로 최근에 나타났다.
일부 구현예에서, 벡터는 감마레트로바이러스 벡터를 포함한다 (예를 들어, 문헌[Tobias Maetzig 등, "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713]에 기재됨, 이는 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨). 예시적인 감마레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV), 비장-초점 형성 바이러스 (SFFV), 및 골수증식성 육종 바이러스 (MPSV), 및 이들로부터 유도된 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 CAR, 예를 들어 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR, 및 제2 CAR, 예를 들어 본 명세서에 기재된 상이한 CAR을 인코딩하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 및 제2 CAR을 인코딩하는 2개 이상의 핵산 서열은 예를 들어 동일한 프레임에서 단일 폴리펩티드 사슬로서 단일 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 CAR은 1개 이상의 절단 펩티드 부위(예를 들어, 자동-절단 부위 또는 세포내 프로테아제에 대한 기질)에 의해 분리된다. 특정 구현예에서, 절단 펩티드는 돼지 테스코바이러스-l (P2A) 펩티드, 토세아 아시그나 바이러스 (T2A) 펩티드, 말과 비염 A 바이러스 (E2A) 펩티드, 구제역 바이러스 (F2A) 펩티드, 또는 그의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 CAR, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR, 및 CAR과 공동 발현된 적어도 하나의 유전자를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 사이토카인 (예를 들어, TNF, IL-12, IFN, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 및/또는 IL-1) 또는 본 명세서에 기재된 자극 리간드 (예를 들어, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, CD30L, CD40, CD40L, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림프독소 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, 톨 리간드 수용체에 결합하는 효능제 또는 항체, 및/또는 B7-H3 리간드)를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다.
약제학적 조성물
특히, 본 개시내용은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 변형된 뉴클레오티드, 5' 또는 3' 미번역된 영역 (UTR)에 대한 변경, 캡 구조, 폴리 A 테일, 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 변형된 mRNA, 및 하나 이상의 RNaseL 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 AGCap1 또는 m6AGCap1 캡 구조를 포함하는 하나 이상의 변형된 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 슈도우리딘 (PsU), 5-메톡시우리딘 (5moU), 5-메틸시티딘/슈도우리딘 (5meC PsU), 또는 N1-메틸-슈도우리딘 (N1mPsU)를 포함하는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 변형된 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 수니티닙을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 ABCE1을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 m6-AGCap1 및 PsU 변형을 포함하는 mRNA로 형질감염된 대식세포를 포함하고, 여기서 mRNA는 CAR을 인코딩하고, 여기서 대식세포는 IFN-β와 함께 배양되고 대식세포는 동일한 mRNA로 형질감염되었지만 IFN-β와 함께 배양되지 않은 대식세포에 대해 IFN-β 향상된 CAR 발현, CAR 지속성, CAR 대식세포 기능, M1 표현형, M2-유도 인자에 대한 내성, 또는 이들의 조합으로 배양된다.
"치료적 유효량", "면역학적 유효량", "항-면역 반응 유효량" 또는 "면역 반응-억제 유효량"이 표시되는 경우, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구, 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물의 정확한 양은 환자(대상체)의 연령, 체중, 면역 반응 및 병태의 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물은 완충액, 예컨대 중성 완충 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS); 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스, 덱스트란, 또는 만니톨; 단백질, 폴리펩티드, 또는 아미노산 (예를 들어, 글리신); 항산화제; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 보조제 (예를 들어, 알루미늄 수산화물); 혈청 및 보존제, 예컨대 동결보호제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 오염물이 실질적으로 없으며, 예를 들어 검출 가능한 수준의 오염물(예를 들어, 내독소)이 없다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 치료 또는 예방할 질환, 장애 또는 병태에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자의 상태, 환자의 질환, 장애 또는 병태의 유형 및 중증도와 같은 요인에 따라 결정되지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은 예를 들어, 액체, 반-고체 및 고체 복용 형태, 예컨대 액체 용액 (예를 들어, 주사가능 및 불용성 용액), 분산액 또는 현탁액, 리포솜, 및 좌약을 포함한다. 바람직한 조성물은 주사가능하거나 주입가능한 용액일 수 있다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 정맥내, 피하, 진피내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 동맥경유 또는 복강내 투여를 위해 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내 또는 근육내) 투여용으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 정맥내 주입 또는 주사용으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 근육내 또는 피하 주사용으로 제형화된다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 면역요법에서 일반적으로 알려진 주입 기술을 사용하여 투여하기 위해 제형화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Rosenberg 등, New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988]를 참조하고, 이는 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"은 일반적으로 주사 또는 주입에 의한 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로 주사를 의미하며, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 관절내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막밑, 지주막하, 척수내, 경막외, 종양내, 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 이들 범위 내의 모든 정수 값을 포함하여 약 104 내지 약 109 세포/kg 체중 (예를 들어, 약 105 내지 약 106 세포/kg 체중)의 투여량으로 투여될 수 있다 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)의 용량은 적어도 1 x 106, 약 1.1 x 106, 약 2 x 106, 약 3.6 x 106, 약 5 x 106, 약 1 x 107, 약 1.8 x 107, 약 2 x 107, 약 5 x 107, 약 1 x 108, 약 2 x 108, 약 5 x 108, 약 1 x 109, 약 2 x 109, 또는 약 5 x 109개의 세포를 포함한다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 또한 특정 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 레지멘은 질환, 장애 또는 병태의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여한 다음, 이어서 혈액을 다시 뽑고(또는 성분채집술을 수행하고), 수집된 면역 세포를 활성화하고, 대상체에게 활성화된 면역 세포를 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이 과정은 예를 들어 몇 주마다 여러 번 수행할 수 있다. 면역 세포(예를 들어 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)는 약 10 cc 내지 약 400 cc의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)는 약 20 cc, 약 30 cc, 약 40 cc, 약 50 cc, 약 60 cc, 약 70 cc, 약 80 cc, 약 90 cc, 또는 약 100 cc의 채혈로부터 활성화된다. 이론에 얽매이지 않고, 본 명세서에 기재된 다중 채혈 및 재주입을 포함하는 방법은 특정 면역 세포 집단을 선택할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물은 제2 요법과 조합하여(예를 들어, 전에, 동시에 또는 이후에) 투여된다. 예를 들어, 제2 요법은 항바이러스 요법 (예를 들어, 사이도포비르, 인터류킨-2, 사이타라빈 (ARA-C), 또는 나탈리주맙), 키메라 항원 수용체-T 세포 (CAR-T) 요법, T-세포 수용체 (TCR)-T 세포 요법, 화학요법, 방사선, 면역억제제 (예를 들어, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, FK506 항체, 또는 글루코코르티코이드), 길항제 (예를 들어, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA4 길항제, CD47 길항제, SIRPα 길항제, CD40 효능제, CSF1/CSF1R 길항제, 또는 STING 효능제 중 하나 이상), 또는 면역탈격 제제 (예를 들어, 항-CD52 항체 (예를 들어, 알렘투주맙), 항-CD3 항체, 사이톡신, 플루다리빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 또는 조사)을 포함하지만 이에 제한되지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물은 화학요법 제제 (예를 들어, 플루다라빈, 외부-빔 방사선 요법 (XRT), 사이클로포스파미드, 또는 리툭산)를 사용하는 골수 이식 또는 림프구 절제 요법과 조합하여(예를 들어, 전에, 동시에 또는 이후에) 투여된다. 특정 구현예에서, 대상체는 고용량 화학요법에 이어 말초 혈액 줄기 세포 이식으로 표준 치료를 받는다. 특정 구현예에서, 이식 후, 대상체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물의 주입을 받는다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 수술 전 또는 후에 투여될 수 있다.
대상체에게 투여될 전술한 임의의 요법의 투여량은 치료되는 질환, 장애 또는 병태에 따라 그리고 특정 대상체에 따라 달라질 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 스케일링은 당업계에서 허용되는 관행에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 알렘투주맙의 용량은 일반적으로 성인의 경우 약 1 mg 내지 약 100 mg일 것이며, 일반적으로 약 1일 내지 약 30일의 기간 동안 매일 투여되며, 예를 들어 1일당 약 1 mg 내지 약 10 mg의 1일 용량일 것이다 (예를 들어, 미국 특허 제6,120,766호에 기재됨, 이는 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨).
치료 방법
본 개시내용은 특히 대상체에서 질환 또는 장애(예를 들어, 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애)를 치료하는 방법을 제공하고, 이방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포 (예를 들어, 대식세포, 단핵구, 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물을 전달하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 치료적 유효량은 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여된다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 대상체에서 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법으로 치료될 대상체는 포유동물, 예를 들어 영장류, 예를 들어 인간(예를 들어, 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 환자)일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)는 대상체에 대해 자가, 동종이형 또는 이종일 수 있다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 치료제, 절차 또는 방식과 조합하여 본 명세서에 기재된 복용 레지멘에 따라 대상체에게 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물은 종양 또는 암과 연관된 질환, 신경퇴행성 질환 또는 장애, 염증성 질환 또는 장애, 심혈관 질환 또는 장애, 섬유성 질환 또는 장애, 아밀로이드증과 연관된 질환, 및 그의 조합을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물로 대상체에서 암 또는 종양을 치료(예를 들어, 진행을 감소, 억제 또는 지연시키는 것 중 하나 이상)하는 방법이 제공된다. 대상체는 성인 또는 소아 암 형태를 가질 수 있다. 암은 초기, 중간 또는 말기에 있거나 전이성 암일 수 있다. 암은 고형 종양, 혈액암(예를 들어, 백혈병, 림프종 또는 골수종, 예를 들어 다발성 골수종) 또는 전이성 병변을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 고형 종양의 예는 악성종양, 예를 들어, 육종 및 암종, 예를 들어, 폐, 유방, 난소, 림프양, 위장 (예를 들어, 결장), 항문, 생식기 및 비뇨생식관 (예를 들어, 신장, 요상피, 방광 세포, 전립선), 인두, CNS (예를 들어, 뇌, 신경 또는 신경교 세포), 두경부, 피부 (예를 들어, 흑색종, 예를 들어, 피부 흑색종), 췌장, 및 뼈 (예를 들어, 척색종)에 영향을 미치는 것들과 같은 다양한 혈관계의 선암종을 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC) (예를 들어, 편평상피 및/또는 비-편평상피 조직을 갖는 비-소세포 폐암 (NSCLC), 또는 NSCLC 선암종), 또는 소세포 폐암 (SCLC)), 피부암 (예를 들어, 머켈 세포 암종 또는 흑색종 (예를 들어, 진행된 흑색종)), 난소암, 중피종, 방광암, 연조직 육종 (예를 들어, 혈관주위세포종 (HPC)), 골암 (뼈 육종), 신장암 (예를 들어, 신장암 (예를 들어, 신장 세포 암종)), 간암 (예를 들어, 간세포 암종), 담관암종, 육종, 골수이형성 증후군 (MDS), 전립선암, 유방암 (예를 들어, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 또는 Her2/neu 중 하나, 둘 또는 모두를 발현하지 않는 유방암, 예를 들어, 삼중 음성 유방암), 결장직장암 (예를 들어, 재발한 결장직장암 또는 전이성 결장직장암, 예를 들어, 미세부수체 불안정한 결장직장암, 미세부수체 안정한 결장직장암, 불일치 복구 능숙한 결장직장암, 또는 불일치 복구 결핍된 결장직장암), 비인두 암, 십이지장 암, 자궁내막 암, 췌장암, 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)), 항문암, 위-식도암, 갑상선암 (예를 들어, 역형성 갑상선 암종), 자궁경부암 (예를 들어, 자궁경부의 편평 세포 암종), 신경내분비 종양 (NET) (예를 들어, 비전형 폐 유암종), 림프증식성 질환 (예를 들어, 이식후 림프증식성 질환), 림프종 (예를 들어, T-세포 림프종, B-세포 림프종, 또는 비-호지킨 림프종), 골수종 (예를 들어, 다발성 골수종), 또는 백혈병 (예를 들어, 골수성 백혈병 또는 림프양 백혈병)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 암은 뇌종양, 예를 들어, 교모세포종, 신경교육종, 또는 재발성 뇌종양이다. 일부 구현예에서, 암은 췌장암, 예를 들어 진행성 췌장암이다. 일부 구현예에서, 암은 피부암, 예를 들어, 흑색종 (예를 들어, II기 내지 IV기 흑색종, HLA-A2 양성 흑색종, 절제 불가능한 흑색종, 또는 전이성 흑색종), 또는 머켈 세포 암종이다. 일부 구현예에서, 암은 신장암, 예를 들어, 신장 세포 암종 (RCC) (예를 들어, 전이성 신장 세포 암종)이다. 일부 구현예에서, 암은 유방암, 예를 들어 전이성 유방암 또는 IV기 유방 암종, 예를 들어 삼중 음성 유방암(TNBC)이다. 일부 구현예에서, 암은 바이러스 연관 암이다. 일부 구현예에서, 암은 항문관 암(예를 들어, 항문관의 편평 세포 암종)이다. 일부 구현예에서, 암은 자궁경부암(예를 들어, 자궁경부의 편평 세포 암종)이다. 일부 구현예에서, 암은 위암 (예를 들어, 엡슈타인 바르 바이러스 (EBV) 양성 위암, 또는 위 또는 위-식도 접합부 암종)이다. 일부 구현예에서, 암은 두경부암(예를 들어, HPV 양성 및 음성 두경부의 편평 세포암(SCCHN))이다. 일부 구현예에서, 암은 비인두암(NPC)이다. 일부 구현예에서, 암은 결장직장암, 예를 들어, 재발한 결장직장암, 전이성 결장직장암, 예를 들어, 미세부수체 불안정한 결장직장암, 미세부수체 안정한 결장직장암, 불일치 복구 능숙한 결장직장암, 또는 불일치 복구 결핍된 결장직장암이다.
일부 구현예에서, 암은 혈액암이다. 일부 구현예에서, 암은 백혈병, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 백혈병, 또는 급성 백혈병이다. 일부 구현예에서, 암은 림프종, 예를 들어, 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종, 림프구성 림프종, 또는 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL) (예를 들어, 재발성 또는 불응성 HL 또는 DLBCL)이다. 일부 구현예에서, 암은 골수종, 예를 들어 다발성 골수종이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에서 면역 반응을 향상시키거나 조절하기 위해 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 대상체 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체)에서 면역 반응을 향상, 자극 또는 증가시킨다. 특정 구현예에서, 대상체는 면역저하되었거나 면역저하될 위험이 있다. 예를 들어, 대상체는 화학요법 치료 및/또는 방사선 요법을 받고 있거나 받았다.
일부 구현예에서, 대상체는 염증성 장애(예를 들어, 만성 또는 급성 염증성 장애)를 갖거나 발병할 위험이 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 자가면역 질환 또는 장애를 갖거나 발병할 위험이 있다. 본 명세서에 기재된 방법으로 치료될 수 있는 예시적인 자가면역 질환은 알츠하이머병, 천식 (예를 들어, 기관지 천식), 알러지 (예를 들어, 아토피 알러지), 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 죽상동맥경화증, 베체트병, 복강, 심근병증, 크론병, 간경변, 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 습진, 섬유근육통, 섬유근염염, 사구체신염, 이식편대숙주 질환 (GVHD), 길랑-바레 증후군, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 골관절염, 다연골염, 건선, 류마티스성 관절염, 패혈증, 뇌졸중, 혈관염, 벤틸레이터-유도된 폐 손상, 이식 거부, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 열, 유육종증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 또는 베게너 육아종증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 투여는 임의의 편리한 방식(예를 들어, 주사, 섭취, 수혈, 흡입, 이식(implantation) 또는 이식(transplantation))으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 주사 또는 주입에 의해 투여된다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 경동맥, 피하로, 정맥내로, 진피내로, 종양내로, 결절내로, 수질내, 근육내로, 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 비경구로 (예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내 또는 근육내) 투여된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 대상체의 염증 부위, 국소 질환 부위, 림프절, 기관, 종양 또는 감염 부위에 직접 주사될 수 있다.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 일예는 예시적인 목적으로만 제공된다. 어떤 식으로든 본 개시내용의 범위나 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
하기 실시예는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물을 만들고 사용하는 방법을 당업자에게 설명하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
방법
단핵구에서 대식세포로의 분화
본 개시내용의 예시적인 방법에서, 정상 공여자 성분채집술 유래 류코팩을 Elutra Cell Separation System(Terumo BCT)을 사용하여 용출하거나 CliniMACS Prodigy(Miltenyi Biotec) 또는 CliniMACS Plus(Miltenyi Biotec)를 사용하여 세포 분리를 수행하여 적혈구, 혈소판, 림프구 및 과립구를 감소시켰다. 제조자의 지침에 따라 용출을 사용하여 단핵구를 풍부하게 하거나 MACS CD14+ 선택(Miltenyi Biotec)을 사용하여 양성 선택하였다. 사전 선택 및 사후 선택(양성 및 음성 분획) 순도 및 생존능을 유동 세포측정을 사용하여 테스트하였다. 선택된 CD14+ 단핵구는 최대 7일 동안 대식세포로 분화되었다. 분화된 대식세포를 5-7일째 수확하고 냉동 배지에 냉동 보관하거나 실험을 위해 신선하게 사용하였다. 일부 경우에 세포는 단핵구 상태에서 선택 후 활용되었다.
전기천공
본 개시내용의 예시적인 방법에서, 신선하거나 해동된 인간 대식세포를 해동하고 전기천공 하루 전에 밤새 37℃에서 배양하였다. 대식세포를 수집하고 PBS로 세척하였다. 생존 가능 세포를 NC200으로 계수하였다. Neon 형질감염 시스템을 사용하여 형질감염된 대식세포의 경우, 1e+6 대식세포당 50nM-300nM의 mRNA를 전기천공 완충액에서 얼음 위에서 혼합하였다. 대식세포는 Neon 형질감염 시스템 또는 Maxcyte 전기천공 시스템으로 전기천공되었다. 전기천공 후 10분 동안 세포를 얼음에 보관하였다. 추가 사용을 위해 세포를 수집하고, 계수하고, 대식세포 배양 배지에서 배양하였다. 그 다음 세포를 플레이트로 옮기고 회수를 위해 15분 동안 37℃에 두었다. 추가 사용을 위해 세포를 대식세포 배양 배지와 함께 6웰 플레이트에 플레이팅하였다.
형광 활성화 세포 분류 (FACS)
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell Staining Kit(Thermo) 또는 유사한 시약을 사용하여 생존능을 평가하였다. 또한 NC-200(Chemometec)을 사용하여 세포 생존능을 평가하였다.
일차 인간 대식세포를 2-단계 염색 프로토콜을 사용하여 CAR-HER2 발현에 대해 테스트하였다: 인간 HER2/ ERBB2 단백질-His 태그(Sino Biological Inc, 10004-H08H-100) 1차 염색 후, Human TruStain FcX(Biolegend, 422302) 및 Anti-His Tag APC(R&D Systems, IC050A) 2차 염색. Fc 수용체를 발현하는 단핵구, 대식세포 또는 단핵구 세포주의 FACS 염색에 TruStain FcX(Biolegend, 422302)를 사용하였다. 다음 패널을 사용하여 대식세포 순도를 테스트하였다: 항-CD11b PE (Biolegend, 301306), 항-CD14 BV711 (Biolegend, 301838), 항-CD3 FITC (eBioscience, 11-0038-42), 항-CD19 PE-CY7 (eBioscience, 25-0198-42), 항-CD66b PerCP-CY5.5 (Biolegend, 305108), 항-CD56 BV605 (Biolegend, 318334), 및 살아있는/죽은 고정성 Aqua (L/D aqua) 죽은 세포 염색 키트 (ThermoFisher, L34957). 분화를 위한 시딩 전에 CD14 MACS 선택 후 단핵구 순도를 테스트하기 위해 동일한 패널을 사용하였다. 일차 인간 대식세포의 M1/M2 마커를 다음 패널로 검출하였다: 항-CD11B PE(Biolegend, 301306), 항-CD80 BV605(Biolegend, 305225), 항-CD86 BV711(Biolegend, 305440), 항-CD206 BV421(Biolegend, 321126), 항-CD163 APC-CY7(Biolegend, 333622), 항 HLA-DR BV785(Biolegend, 307642), 항 HLA ABC PE/CY7(Biolegend, 311430) 및 Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit.
기능 검정
표적 암 세포와 CAR 대식세포의 공동 배양
NucLight Green GFP(Sartorious #4475)를 안정적으로 발현하는 HER2+ 유방암 세포(CRL2351) 또는 HER2+ 난소암 세포와 같은 표적 세포를 사용하였다. 하기에 기재된 바와 같이 CAR에 의해 표적화된 동족 항원을 발현하는 추가 세포주를 평가하였다. CAR 대식세포를 표시된 기간 동안 표시된 비율로 표적 세포와 공동 배양하였다. 시험관 내에서 항종양 효과를 정량화하기 위해, 대략 1시간마다 배양된 웰의 녹색 형광 강도를 모니터링하는 Incucyte 라이브 이미징 현미경(Sartorius)을 사용하여 표적 암세포의 상대적 수를 측정하였다. CAR 대식세포의 항종양 활성을 대조군 대식세포 또는 표적 세포 단독과 비교하였다. Graphpad Prism은 데이터를 그래프화하고 통계 분석을 수행하는 데 사용되었다.
인터페론(IFN)을 사용한 CAR 대식세포의 치료
CAR mRNA의 형질감염 후, 지시된 바와 같이 대식세포를 10-300ng/mL의 재조합 인간 IFN-α, IFN-β 또는 IFN-γ(peprotech)와 함께 4-24시간 동안 대식세포 배양 배지에서 배양하였다. IFN 함유 배지를 지시된 시간 후에 세척하였다. IFN 프라이밍된 CAR 대식세포를 추가 분석에 사용하였다.
염증유발 인자를 사용한 CAR 대식세포의 치료
CAR mRNA의 형질감염 후, 2e+6 대식세포를 다양한 농도의 염증유발 매개체와 함께 대식세포 배양 배지에서 배양하였다. 예시적인 염증유발 매개자는 다음을 포함한다: TLR1/2 효능제 (예를 들어, Pam3CSK4), TLR3 효능제 (예를 들어, 폴리(I:C)), TLR4 효능제 (예를 들어, LPS-EK 표준 (에스케리치아 콜라이 K12로부터 지질다당류)), TLR5 효능제 (예를 들어, FLA-ST 표준 (S. 타이피뮤리움로부터의 플라젤린)), TLR6/2 효능제 (예를 들어, FSL-1), TLR7 효능제 (예를 들어, 이미퀴모드), TLR8 효능제 (예를 들어, ssRNA40/LyoVec), TLR9 효능제 (예를 들어, CpG 올리고뉴클레오티드), IFN-γ 20 ng/mL, TNF-α 20 ng/mL, β-글루칸, 재조합체 인간 CD40-리간드, 재조합체 인간 41BB-리간드, 재조합체 인간 41BB 수용체, TNFα, IL6, IL12, STING 효능제, cGAS 효능제, 및 다른 염증유발 매개체 (사이토카인, 효능제, 항체, 소분자, 펩티드), 4 내지 48 시간 동안. 지정된 시간 후에 배지를 세척하고 프라이밍된 CAR 대식세포를 추가 분석에 사용하였다.
대식세포 표현형 평가(M1/M2)
일차 인간 대식세포의 M1/M2 마커를 다음 패널로 검출하였다: 항-CD11B PE(Biolegend, 301306), 항-CD80 BV605(Biolegend, 305225), 항-CD86 BV711(Biolegend, 305440), 항-CD206 BV421(Biolegend, 321126), 항-CD163 APC-CY7(Biolegend, 333622), 항 HLA-DR BV785(Biolegend, 307642), 항 HLA ABC PE/CY7(Biolegend, 311430) 및 Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit. 사이토카인 생성(IL12, IFN-γ, TNF-α, IL6, IL8, IL1b, MCP-1, IL10, IL4, IL13, 및 기타 인간 사이토카인)은 제조자 권고(Meso Scale Discovery)에 따라 MSD 기기를 사용하여 아래에 기재된 바와 같이 처리된 대식세포(대조군 또는 CAR)로부터 수집된 상청액에서 평가되었다. 일부 경우에, 대식세포는 표시된 효과기 대 표적 비율로 항원 함유 표적 세포와 공동 배양되었다.
mCherry 발현의 검출
인간 단핵구 또는 대식세포에서 형광 리포터 유전자 mCherry의 형질감염 효율, 발현 지속성 및 발현 강도를 표시된 기간 동안 Incucyte(Sartorius)에서 실시간 라이브 현미경검사를 사용하여 평가하였다.
수니티닙을 사용한 대식세포의 치료
대식세포는 mRNA 전기천공 또는 형질감염 전에 2시간 동안 0-10μM 수니티닙(RNAse-L 억제제)으로 치료되었다. 상기 기재된 방법을 사용하여 인코딩된 이식유전자의 발현 수준 및 발현 지속성을 평가하였다.
실시간 PCR
인코딩된 이식유전자(예를 들어 CAR)의 실시간 PCR을 표준 방법을 사용하여 수행하였다. 간단히 말해서 Ambion RiboPure RNA Purification Kit(AM1924, Thermo Fisher)를 사용하여 RNA를 단리하고 RT-qPCR용 iScript RT Supermix(1708841, Bio-Rad)를 사용하여 역전사하였다. 정량적 PCR을 위해, 템플릿 cDNA, 프라이머, Taqman Gene Expression 프라이머/프로브 및 Taqman Gene Expression Master Mix(4369016, Applied Biosystems)를 제조자의 지침에 따라 사용하였다.
CAR 발현 기간의 결정
유동 세포측정
본 개시내용의 예시적인 방법에서, 50,000개의 CAR 대식세포를 96웰 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 항-HER2 CAR 발현을 측정하기 위해, BSA가 보충된 PBS와 같은 완충액과 함께 His-태깅된 재조합 HER2 단백질을 세포에 첨가하고 인큐베이션시켰다. 그 다음 세포를 300 x g에서 5분 동안 회전시킨 다음, 상청액을 제거하였다. 그 다음 PBS에서 5분 동안 Human TruStain FcX(BioLegend, Cat 422302)와 같은 Fc 차단 용액을 사용하여 Fc-수용체를 차단하였다. Fc 차단 후, 세포 생존능 및 기타 표면 마커에 대한 염색을 달성하였다. 예를 들어, LIVE/DEADTM Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit(Invitrogen, Cat L34957)를 사용하여 세포 생존능을 결정할 수 있다. 또한, His Tag APC-접합 항체(R&D Systems, Cat IC050A)와 같은 항-His 항체를 추가하였다. CAR의 발현은 먼저 단일 세포 집단에 게이팅한 후 살아있는 세포를 선택하고 마지막으로 세포의 APC 형광을 측정하는 유동 세포측정을 통해 결정되었다. CAR을 발현하는 세포는 항-His 항체에 노출되지 않은 대조군 세포보다 APC 채널에서 더 밝을 것이다. CAR 양성 세포의 밝기는 발현 정도를 결정하는 한편, 시간 경과에 따른 반복 측정은 시간 경과에 따른 CAR의 발현을 추적할 수 있도록 허용하였다.
면역형광(IF) 현미경검사
본 개시내용의 예시적인 방법에서, 세포를 유리 슬라이드 상에서 적절하게 배양하였다. 그 다음 배지를 제거하고 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 그 다음 세포를 4% 파라포름알데히드 또는 메탄올을 사용하여 고정하였다. 고정액의 인큐베이션 시간은 고정액의 동일성에 따라 다르다. 일정 시간이 지나면 고정액을 제거하고 세포를 다시 PBS로 3회 세척하였다. 세포내 염색이 필요한 경우, 세포를 PBS 중 1% Triton X-100(ThermoFisher, Cat BP151-100)에서 인큐베이션한 다음, PBS에서 3회 세척하였다. 그 다음 PBS 내의 BSA와 같은 차단 용액을 세포에 첨가하고 60분 동안 차단하였다. 그 다음 차단 용액을 제거하고 세포를 세척하였다. 형광색소 접합된 항체를 제조자의 지침에 따라 희석하고 밤새 세포에 결합하도록 허용하였다. 그 다음 항체 용액을 제거하고 세포를 세척하였다. 마지막으로 DAPI(Invitrogen, Cat P36966)가 있는 ProLongTM Diamond Antifade Mountant와 같은 마운팅 용액을 셀에 적용하고 커버슬립을 맨 위에 놓았다. 이미징 전에 24시간 동안 건조되도록 두었다. 이미징은 형광 현미경검사를 통해 수행되었다. CAR을 발현하는 세포는 형광단에 대한 적절한 채널에서 CAR을 발현하지 않는 세포보다 더 밝았다.
RT-PCR
본 발명의 예시적인 방법에서, 제조자의 지침에 따라 1단계 키트 RTPCR 키트(SuperScriptTM III PlatinumTM One-Step qRT-PCR Kit, Invitrogen Cat 11732-020)를 사용하여 대식세포를 용해시키고 RNA를 수집하였다. CAR에 특이적인 프라이머가 검정에 사용되었다. CAR에 대한 mRNA가 있는 대식세포는 RTPCR 검정에서 신호를 보인 반면, 형질도입되지 않은 대식세포는 신호를 보였다.
CAR 효과기 세포 기능의 결정
본 개시내용의 예시적인 방법에서, 핵산(예를 들어, DNA, mRNA 또는 화학적으로 변형된 mRNA)을 사용한 전기천공/형질감염을 통해 또는 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 대체 바이러스 벡터를 사용한 바이러스 형질도입을 통해 단핵구 또는 대식세포 내로 CAR 이식유전자를 도입하였다. CAR의 발현은 유동 세포측정, 실시간 PCR 또는 형광 현미경검사를 통한 항원 특이적 염색을 사용하여 확인된다. 이러한 기술은 또한 CAR 발현의 강도 및 동역학을 결정하는 데 사용될 수 있다. 대식세포의 표면에서 발현하는 CAR 작제물은 표적 양성 세포주에 대한 종양 식균작용 검정 및/또는 종양 사멸 검정에서 활성에 대해 테스트된다. 표적 세포의 식균작용 및/또는 사멸을 유발하는 작제물은 사이토카인 분비, 케모카인 분비, 면역 세포 동원 능력, 표현형 변경(즉, M1/M2에 대한 자가 분극) 및 T 세포 자극/항원 제시 기능을 테스트하였다.
식균작용 검정
유동 식균작용 검정(세포)
본 발명의 예시적인 방법에서, 표적 양성 및 표적 음성 종양 세포는 제조자의 지침에 따라 CellTraceTM CFSE 세포 증식 키트(Invitrogen, Cat C34554)로 표지되거나 세포가 조작되어 형광 단백질(예를 들어, GFP)을 발현하였다. CAR 발현 및 대조군 대식세포를 U-바닥 96 웰 플레이트에 1:1 대식세포:종양 세포 비율로 플레이팅하고 4시간 동안 배양하였다. 인큐베이션 종료 시, 세포를 웰에서 제거하고 유동 세포측정을 위해 염색하였다. 패널에는 생존능 염료와 CD11b와 같은 대식세포 특이적 마커가 포함되어 있다. 살아있는 세포에 대한 게이팅 시, CD11b/CFSE 이중 양성인 세포는 세포를 식균한 것으로 추정되는 대식세포였다. CAR 대식세포는 CAR이 없는 대식세포에 비해 표적 양성 종양 세포와 함께 배양할 때 이중 양성 세포의 백분율이 증가해야 한다. 표적 기반 식균작용의 특이성은 표적에 대해 음성인 세포와 함께 배양된 대식세포의 대조군을 사용하여 테스트하였다.
유동 식균작용 검정 (비드)
본 발명의 예시적인 방법에서, 폴리스티렌 비드는 CAR의 표적 또는 무관한 단백질로 기능화되었다. 또한, 이들 비드를 pH-반응성 염료인 pHrodoTM Red, SE(Invitrogen, Cat P36600)로 표지하였다. 산성화 시, 염료의 형광 수준이 증가하였다. 그 다음, 비드를 CAR 대식세포 및 형질도입되지 않은 대식세포와 함께 배양하였다. 일정 시간 후, 대식세포를 제거하고 생존 염료 및 CD11b와 같은 대식세포 특이적 마커를 사용하여 유동 세포측정을 위해 염색하였다. 살아있는 세포에 대한 게이팅 시, CD11b/pHrodo 이중 양성인 세포는 비드를 식균한 것으로 추정되는 대식세포로 간주되었다. CAR 대식세포는 CAR이 없는 대식세포에 비해 표적 양성 비드와 함께 배양할 때 이중 양성 세포의 백분율이 증가해야 한다. 표적 기반 식균작용의 특이성은 표적에 대해 음성인 비드와 함께 배양된 대식세포의 대조군을 사용하여 테스트하였다.
인큐사이트(Incucyte) (세포)
본 개시내용의 예시적인 방법에서, GFP와 같은 형광 단백질을 발현하는 표적-양성 종양 세포를 96웰 플레이트에서 CAR 대식세포 및 형질도입되지 않은 대식세포와 함께 배양하였다. 효과기 대식세포와 표적 종양 세포 사이의 비율은 0:1 E:T 표적 세포만 대조군과 함께 10:1 E:T에서 1:10 E:T로 다양하였다. 대식세포의 수는 웰당 10e3 대식세포로 일정하게 유지하였다. 4시간마다 측정된 시간 경과에 따른 형광의 변화를 측정하여 배양에서 발생하는 종양 세포 사멸의 양을 결정하였다. 또한 이미지 분석 기술을 사용하여 배양액에서 대식세포의 위치를 결정하고 종양 세포를 식균하는 대식세포의 수를 결정하였다.
인큐사이트(비드)
본 개시내용의 예시적인 방법에서, CAR에 대한 단백질 표적을 함유하는 pHrodo 기능화 비드를 96 웰 플레이트의 웰에서 CAR 대식세포 및 형질도입되지 않은 대식세포 모두에 첨가하였다. 대식세포를 웰당 20e3의 농도로 플레이팅하고 비드를 5:1 비드 대 대식세포 비율로 첨가하였다. pHrodo의 형광은 30분마다 측정하여 5시간 동안 측정되었다. 초기 시점과 1시간 시점 사이의 형광 증가 비율을 사용하여 식균작용이 일어나는 양을 결정하였다. CAR 대식세포는 형질도입되지 않은 대조군보다 높은 형광 변화를 가질 것으로 예상되었다.
마우스 모델
이종이식편 마우스 모델
본 개시내용의 예시적인 방법에서, NSGS(NSG-SGM3) 마우스는 복막 암종증을 모델링하기 위해 복강내 투여를 통해 HER2+ 인간 난소암인 SKOV3로 챌린지되었다. IFN-β 프라이밍(또는 음성 대조군)이 있거나 없는 mRNA 전기천공을 통해 생성된 인간 CAR 대식세포로 마우스를 처리하였다. 생물발광 이미징을 통해 종양 부담을 모니터링하였다.
동계 마우스 모델
BALB-C 면역적격 마우스에 HER2+ 결장직장 암종 모델인 CT26-HER2를 피하 주사를 통해 생착시켰다. 일단 종양이 생착되면, IFN-β 프라이밍(또는 음성 대조군)이 있거나 없는 mRNA 전기천공을 통해 생성된 CAR 대식세포로 마우스를 처리하였다. 종양 부담은 종양 덩어리의 캘리퍼스 측정을 통해 모니터링되었다.
실시예 1: 일차 인간 대식세포의 발현 및 생존능에 대한 mRNA 변형의 효과
공여자 대식세포(HC153444 및/또는 HC156308)는 CD14+ 단핵구와 구별되었고 mCherry mRNA는 전기천공 또는 형질감염되었다. mCherry mRNA는 AGCap1, m6AGCap1 또는 역전 방지 캡 유사체 (ARCA)를 포함하는 변이체 캡 구조 및 슈도우리딘(PsU), 5-메톡시우리딘(5moU) 또는 5-메틸시티딘/슈도우리딘(5meC PsU)을 포함하는 변형된 뉴클레오티드와 같은 예시적인 변형을 포함하였다. 형질감염 후 1일째 또는 15일째에 FACS에 의해 mRNA 발현 및 세포 생존능을 검출하였다.
mCherry mRNA 변이체는 전기천공 시 대식세포 생존능에 영향을 미치지 않았지만, mRNA로 형질감염된 대식세포는 변이체에 따라 생존능이 36%에서 70%까지 다양하였다(도 1a). mCherry 발현 세포의 백분율은 전기천공 세포에서 거의 100% 및 형질감염된 세포에서 70-90%였다(도시되지 않음). mCherry의 평균 형광 강도(세포당 발현된 mCherry 단백질의 수를 나타냄)는 mRNA 변형 및 형질감염 방법에 따라 달라졌다(도 1b). AGCap1은 전기천공 세포에서 더 큰 mCherry 강도를 생성한 반면, PsU 변형 및 HPLC 정제는 형질감염된 세포에서 더 큰 mCherry 강도를 생성하였다.
도 1c에 도시된 바와 같이, mCherry RNA의 지속성은 mRNA 변형과 사용된 mRNA 전달 방법에 따라 달라진다. mCherry mRNA는 전기천공 대식세포와 비교할 때 형질감염된 대식세포에서 더 오래 지속되었다. AGCap1을 포함하는 mRNA는 전기천공된 세포에서 m6AGCap1 mRNA보다 더 잘 지속되었다. HPLC 정제는 전기천공 세포보다 형질감염된 세포에 더 큰 영향을 미쳤다.
실시예 2: 대식세포의 생존능에 대한 CAR mRNA 변형의 효과
공여자 대식세포(HC153444)를 CD14+ 단핵구와 구별하고 대식세포를 전기천공 또는 형질감염을 사용하여 CAR을 인코딩하는 mRNA(CAR mRNA)로 형질감염시켰다. HER2 세포외 도메인 및 CD3제타 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 인코딩하는 mRNA를 사용하였다. CAR 발현 및 세포 생존능은 1일째에 FACS에 의해 검출되었다.
도 2a에 도시된 바와 같이, mRNA로 전기천공된 대식세포의 예시적인 생존능은 평가된 모든 mRNA 변형에 대해 >80%였다. Viromer mRNA로 형질감염된 대식세포는 대부분의 CAR-발현 대식세포 및 처리되지 않은 대식세포에 대해 >90%의 생존능을 가졌으나, m6AGCap1 및 PsU 변형을 포함하는 mRNA 및 5moU 변형을 포함하는 mRNA로 형질감염된 대식세포의 생존능은 65%였다. 또한, 도 2b에 도시된 바와 같이, 전기천공 대식세포의 경우, m6AGCap1 및 PsU 변형을 포함하는 CAR mRNA는 가장 높은 CAR 발현을 유도하였다. mRNA로 형질감염된 대식세포의 경우, m6AGCap1, N1mPsU 및/또는 PsU 변형을 포함하는 CAR mRNA는 가장 높은 CAR 발현을 유도하였다. 도 2c에 도시된 바와 같이, m6AGCap1에 대한 mRNA 5'Cap의 최적화 및 슈도우라실(PsU)에 대한 우라실의 변형은 인간 대식세포에서 CAR 발현을 약 3x 증가시켰다.
실시예 3: 대식세포 기능에 대한 CAR mRNA 변형의 효과
인간 대식세포는 CD14+ 단핵구로부터 분화되었고 대식세포는 HER2 CAR을 인코딩하는 mRNA(CAR mRNA)로 전기천공되었다. 형광 표지된 HER2+ 유방암 세포(CRL2351)는 5:1의 효과기(CAR 대식세포) 대 표적(암 세포) 비율에서 CAR mRNA로 형질감염된 지 2일 후에 CAR 대식세포와 공동 배양되었다. CRL2351 세포 성장은 형광에 의해 4시간마다 모니터링되었다.
도 3a에 도시된 바와 같이, m6AGCap1PsU 변형을 포함하는 HER2 CAR mRNA로 형질감염된 대식세포는 Ad5f35로 형질도입된 대식세포에 필적하는 강력한 사멸 활성을 나타냈다. m6AGCap1PsU 변형을 포함하는 HER2 CAR mRNA로 형질감염된 대식세포는 5moU 변형을 포함하는 HER2 CAR mRNA로 형질감염된 대식세포와 비교하여 최고의 표적 세포 사멸 활성을 보였다(도 3b 내지 도 3d). 이러한 결과는 또한 최적의 mRNA 변형으로 형질감염된 대식세포가 더 낮은 효과기(CAR-M) 대 표적(암 세포) 비율에서 더 큰 항종양 활성을 가짐을 보여준다.
실시예 4: M1 분극화는 mRNA 지속성과 대식세포/CAR-대식세포 기능을 향상시킨다
인간 대식세포를 m6AGCap1 및 PsU 변형을 포함하는 HER2 CAR mRNA로 전기천공하였다. 세포는 최대 48 시간 동안 M1 표현형 예컨대 IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, IFN-감마 플러스 지질다당류 (LPS), TNF-알파, IL-6 또는 STING 리간드 (STING-L)을 유도하는 사이토카인과 함께 배양되었고, 사이토카인을 세척하고 새 배지를 추가하였다. CAR 발현 및 M1 마커 발현을 형질감염 후 2일째 및 7일째에 측정하였다. 형광 표지된 HER2+ 유방암 세포(CRL2351)는 대식세포가 형질감염된 지 2일 후에 HER2 CAR 대식세포와 공동 배양되었다. 암 세포 성장은 4시간마다 Incucyte 라이브 이미징 현미경에서 형광을 통해 모니터링되었다. 효과기(CAR 대식세포) 대 표적(암 세포) 비율은 5:1이었다.
도 4a에 도시된 바와 같이, 테스트된 인터페론 사이토카인은 2일째에 CAR 형질감염된 대식세포의 생존능을 낮추지 않았다. 놀랍게도, IFN-β로 처리된 대식세포는 대조군 배지, IFN-α 또는 IFN-γ로 처리된 대식세포보다 더 높은 CAR 발현을 보였다(도 4b). 도 4c에 도시된 바와 같이, 인터페론 사이토카인을 사용한 대식세포의 처리는 7일째에 CAR 형질감염된 대식세포의 생존능을 저하시키지 않았다. 놀랍게도, IFN-β로 처리된 대식세포는 대조군 배지, IFN-α 또는 IFN-γ로 처리된 대식세포보다 더 높은 CAR 발현을 입증하였다 - 이는 IFN-β가 인간 대식세포에서 CAR과 같은 mRNA로 인코딩된 이식유전자의 발현 기간을 개선한다는 것을 입증한다(도 4d). 또한 IFN-α, IFN-β 또는 IFN-γ를 사용하여 mRNA 형질감염된 CAR 대식세포를 처리하면 M1 표현형(CD86 발현 기반; 도 4e) 및 M2 마커 감소(CD163 발현 기반; 도 4f)가 유도되었다. IFN-β는 평가된 인터페론의 가장 강한 M1 표현형을 유도하였고, M1 표현형은 치료 후 적어도 7일 동안 지속되었다(도 4e).
실시예 5: CAR 발현, CAR 대식세포 기능, M1 표현형 마커 및 사이토카인 생성에 대한 IFN 처리의 효과
인터페론 처리가 상이한 변형을 포함하는 mRNA로 형질감염된 대식세포에 차등적으로 영향을 미치는지를 결정하기 위해 5개의 상이한 mRNA 변형을 또한 테스트하였다. 인간 대식세포는 상이한 mRNA 변형을 포함하는 HER2 CAR mRNA로 전기천공되었다. CAR 발현 및 M1 마커는 전기천공 후 4일째에 Flow Cytometry(Attune)에 의해 검출되었다. 4일째에 CAR 대식세포 세포는 5:1의 효과기(CAR 대식세포) 대 표적(암 세포) 비율로 Nuc-Light 표지된 HER2+ 유방암 세포주(CRL2351)와 공동 배양되었다. 암 세포 성장은 4시간마다 Incucyte 라이브 이미징 현미경에서 형광을 통해 모니터링되었다.
도 5a에 도시된 바와 같이, IFN-β 처리 유무에 관계없이 평가된 모든 화학물질로 형질감염된 대식세포는 높은 생존능을 보였다. AGCap1 또는 m6AGCap1 및 PsU 또는 N1mPsU 변형 CAR mRNA로 형질감염된 대식세포는 최고 수준의 발현을 입증했으며, IFN-β는 4일째 모든 변형에 대해 CAR을 발현하는 세포의 비율을 약간 개선하였다(도 5b). 그러나 IFN-β 처리는 평가된 모든 mRNA 변형에 대해 CAR MFI를 기반으로 세포당 발현된 CAR의 수가 현저하게 증가했으며, m6AGCap1/PsU 공동 변형 mRNA는 가장 높은 발현을 유도하였다(도 5c).
CAR 지속성에 대한 IFN-β의 영향을 추가로 평가하기 위해, HER2 CAR을 인코딩하는 m6AGCap1/PsU mRNA로 전기천공된 인간 대식세포를 2일째 및 7일째에 평가하였다. IFN-β 처리는 IFN-β로 처리되지 않은 CAR 대식세포와 비교하여 7일째에 CAR 발현율이 상당히 개선되었다(도 6).
개선된 CAR 발현에 대한 IFN-β 처리의 효과를 검증하고 IFN-β 농도를 최적화하기 위해, M6AGCap1/PsU 변형 mRNA로 형질감염된 대식세포를 4시간 동안 0, 3, 10, 30 또는 100ng/mL IFN-β로 처리하고, 생존능, CAR 백분율 및 CAR MFI를 전기천공 후 4일째 및 7일째에 평가하였다. 인간 대식세포에 의한 CAR 발현에 대한 IFN-β의 용량 의존적 효과가 관찰되었다(도 7a). 실시예 4에 기재된 바와 같이, IFN-β를 사용하여 CAR 대식세포를 처리하면 M1 표현형이 유도되었고, 따라서 효과가 용량 의존적인지 결정하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 도 7b에 나타낸 바와 같이, M1 마커 CD80, CD86 및 HLA-DR의 유도는 IFN-β 용량 의존적이었다.
대식세포 표현형이 가소성으로 간주되고 IL-10과 같은 면역억제 사이토카인은 M2 표현형을 유도하는 것으로 알려져 있으므로, IFN-β 처리 또는 미처리 HER2 CAR mRNA 형질감염된 대식세포에 대한 IL-10 처리의 영향을 평가하였다. IFN-β 처리된 CAR 대식세포는 IL-10의 효과에 저항하고 M2 마커 CD163을 발현하지 않는 반면, 대신 M1 마커 CD86의 발현을 처리한 후 48시간(도 8a) 및 IL-10으로 처리한 후 7일 동안 유지하였다 (도 8b). IFN-β 프라이밍된 CAR 대식세포는 다른 M2 유도 인자에도 저항하였다.
IFN-β로 프라이밍하거나 프라이밍하지 않고 HER2 CAR을 인코딩하는 mRNA로 형질감염된 대식세포의 항종양 기능을 평가하기 위해, 형질도입되지 않은(UTD) 또는 CAR 대식세포를 0, 3, 10, 30 또는 100 ng/mL IFN-β로 4시간 또는 20시간 동안 프라이밍하였다. 그 다음, 이 효과기 세포를 3:1 또는 1.5:1의 효과기 대 표적 비율로 HER2+ 유방암 세포주 CRL2351-GFP와 함께 공동 배양하고 항종양 활성을 Incucyte 라이브 이미징 현미경을 사용하여 GFP 발현을 기준으로 측정하였다. IFN-β 프라이밍은 CAR 대식세포가 암세포를 죽이는 능력을 개선하였다(도 9a). IFN-β 처리가 변형을 포함하는 mRNA로 CAR 대식세포 항종양 활성을 개선했는지 여부를 평가하기 위해, IFN-β 처리 유무에 관계없이 독특한 변형을 포함하는 mRNA로 전기천공된 대식세포의 항종양 활성을 평가하였다. IFN-β 처리는 5moU mRNA로 형질감염된 것을 제외한 모든 CAR 대식세포에 대한 항종양 활성을 개선하였다(도 9b). 개선된 mRNA 형질감염된 CAR 대식세포 항종양 효과가 모든 인터페론에 보편적인지 또는 인터페론 베타에만 있는지를 평가하기 위해, M6AGCap1/PsU mRNA로 전기천공된 대식세포를 IFN-알파, 베타 또는 감마로 처리하고 암세포 사멸 능력을 평가하였다. IFN-β로 처리된 CAR 대식세포는 IFN-α 또는 IFN-γ보다 더 큰 효과로 최고의 암세포 사멸을 유도하였다(도 9c).
대식세포의 인터페론 처리가 다른 항종양 기능을 개선하는지 여부를 평가하기 위해, HER2+ 유방암 세포와의 공동 배양 후 인터페론 처리 또는 미처리 mRNA 형질감염된 HER2 CAR 대식세포의 사이토카인 분비를 평가하였다. 인간 대식세포를 m6AGCap1 및 PsU 변형을 포함하는 150nM HER2 CAR mRNA로 전기천공하였다. HER2+ 유방암 세포(CRL2351)는 3:1의 효과기(CAR 대식세포) 대 표적(암 세포) 비율에서 CAR mRNA로 대식세포를 형질감염한 후에 CAR 대식세포와 공동 배양되었다. 암세포와 대식세포를 공동 배양한 후 48시간에 상청액을 수집하고 MSD(Meso Scale Discovery) 기기를 사용하여 사이토카인 수준을 측정하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, IFN-α, IFN-β 또는 IFN-γ로 대식세포를 처리하면, 대식세포로부터 사이토카인 IL-6, IL-8 및 TNFα의 분비가 증가하였다.
인터페론을 사용한 치료가 대식세포에서 CAR mRNA 지속성을 추가로 개선할 수 있는지 및 CAR 대식세포 기능이 확장될 수 있는지를 결정하기 위해 추가 연구가 수행되었다. 인간 대식세포를 m6AGCap1 및 PsU 변형을 포함하는 300nM CAR mRNA로 전기천공하였다. 세포를 20ng/mL IFN과 함께 24시간 동안 배양한 다음, 세포를 세척하여 사이토카인을 제거하였다. CAR 발현은 형질감염 후 2일째에 유동 세포측정 (Attune)에 의해 검출되었다. 그 다음, 세포를 Nuc-Light 표지된 HER2+ 유방암 세포주(CRL2351)와 3:1의 효과기 대 표적 비율로 공동 배양하였다. 암 세포 성장은 Incucyte 라이브 이미징 현미경에서 형광을 통해 모니터링되었다. 대식세포에서의 CAR 발현 및 M1 마커는 형질감염 후 7일째에 유동 세포측정(Attune)에 의해 검출되었다.
도 11a에 나타낸 바와 같이, CAR mRNA로 형질감염 2일 후, CAR 대식세포 생존능 및 CAR 발현은 IFN-γ로 처리된 대식세포를 제외하고는 매우 높았다. 추가로, 도 11b 및 도 11c에 나타낸 바와 같이, IFN 처리는 CAR 대식세포의 표적 세포 사멸 활성을 향상시켰다. 도 11c는 암세포와 대식세포가 72시간 동안 공동 배양된 후 표적 세포 사멸을 보여준다. IFN 처리는 또한 대식세포 생존능, CAR 발현, M1 마커 발현 및 CAR 대식세포 기능성에 영향을 미쳤다. 도 12a에 나타낸 바와 같이, 형질감염된 대식세포를 IFN-β로 처리하면, 나중에 7일 시점에 인터페론으로 처리되지 않은 대식세포에 비해 세포 생존능, HER2 CAR 발현 및 M1 마커 CD80, CD86 및 HLA-DR의 발현이 증가하게 된다. 도 12a는 모든 대식세포가 7일째에 높은 생존능을 가졌으나, IFN-β 처리된 대식세포가 상당한 차이로 가장 높은 수준의 CAR을 발현하였음을 보여준다. 도 12b는 전기천공 7일 후 암 세포 사멸 검정에서 테스트된 모든 CAR 대식세포 중에서 IFN-β로 처리된 것이 최고 수준의 암 사멸(종양 성장의 가장 큰 감소)을 초래했음을 보여준다. 대식세포를 전기천공한 지 7일 후에 표적 암세포와 72시간 동안 공동 배양하였다. 도 12c에 도시된 바와 같이, 모든 인터페론은 인터페론으로 처리되지 않은 CAR 대식세포와 비교하여 CAR 대식세포의 암세포 사멸 활성을 개선하였다.
실시예 6: 형질감염된 대식세포는 IFNγ에 민감하다
인간 대식세포를 m6AGCap1 및 PsU 또는 N1mPsU 변형을 포함하는 mCherry mRNA로 형질감염시킨 다음, 상이한 용량의 IFN-γ로 1일 동안 배양하였다. Incucyte 라이브 이미징 현미경에서 mCherry 발현을 모니터링하였다. 도 13a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ는 대식세포가 mRNA로 형질감염되었을 때 mCherry mRNA 발현을 감소시켰다.
시험관 내 전사 mRNA는 다양한 엔도좀 선천성 면역 수용체 (예를 들어, 톨(Toll) 유사 수용체 (TLR) 3, TLR7 및 TLR8) 및 세포질 선천성 면역 수용체 (단백질 키나제 RNA 활성화 (PKR), 레틴산 유도성 유전자 I 단백질 (RIG-I), 흑색종 분화 연관 단백질 5 (MDA5) 및 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 (OAS))에 의해 인식된다는 것이 이전에 밝혀졌다. 이러한 다양한 경로를 통한 신호전달은 1형 인터페론(IFN), 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨-6(IL-6), IL-12 및 전사 프로그램 캐스케이드의 활성화와 연관된 염증를 초래한다. 전반적으로 이들은 특정 면역 반응을 유도할 수 있는 염증 유발 미세 환경을 만든다. 또한 진핵생물 번역 개시 인자 2α (eIF2α) 인산화에 의한 번역의 감소, 리보뉴클레아제 L (RNaseL)에 의한 향상된 RNA 분해, 자가 증폭 mRNA 복제의 과발현 및 억제와 같은 다운스트림 효과는 IVT mRNA의 약동학 및 약력학과 관련이 있다.
TLR 경로를 통한 IFN-γ의 활성화는 2'-5'-올리고아데닐레이트 신타제(OAS)를 활성화할 수 있으며, 이는 2'-5'-올리고아데닐레이트(2-5A)를 생성하고, 이는 차례로 RNaseL을 활성화하여 RNA 분해 및 세포자멸사를 유도할 수 있다.
실시예 7: CAR 대식세포에 대한 RNaseL 억제제, 수니티닙 및 ABCE1의 효과
RNaseL 억제제는 형질감염된 mRNA의 IFN-γ 유도 불안정성을 구제할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, m6AGCap1 및 PsU 변형을 포함하는 mCherry mRNA의 형질감염 2시간 전에 인간 대식세포를 1μM 수니티닙(RNaseL 억제제)으로 처리하였다. 형질감염된 세포를 상이한 용량의 IFN-γ로 1일 동안 배양하였다. Incucyte 라이브 이미징 현미경에서 mCherry 발현을 모니터링하였다. 도 14a에 나타낸 바와 같이, 수니티닙은 mRNA의 IFN-γ 유도 분해를 구제하였다.
RNAse L 억제가 mRNA 형질감염된 CAR 대식세포의 항종양 기능을 개설할 수 있는지를 평가하기 위해, 대식세포를 변형을 포함하는 mRNA로 형질감염시키고 암 세포 사멸 검정에서 효과기 세포로서 평가하기 전에 수니티닙으로 전처리하였다. 1nM 수니티닙으로 전처리된 CAR 대식세포는 수니티닙으로 전처리되지 않은 CAR 대식세포 또는 수니티닙으로 처리되거나 처리되지 않은 형질감염되지 않은 대조군 대식세포보다 더 높은 암 세포 사멸을 초래하였다(도 14b). 48시간 CRL2351 유방암 세포 사멸 검정에서 수니티닙 프라이밍된 CAR 대식세포의 개선된 암 사멸 능력이 도 14c에 제시되어 있다.
다른 RNaseL 억제제(RLI 또는 ABCE1)의 효과도 테스트하여 개념을 추가로 검증하였다. 인간 대식세포는 m6AGCap 1 및 PsU 변형을 포함하는 mCherry를 인코딩하는 mRNA 및 ABCE1을 인코딩하는 mRNA로 공동 형질감염되었다.
도 15에 도시된 바와 같이, ABCE1 공동 발현은 전기천공 48시간 후 mRNA 인코딩된 관심 이식유전자의 발현을 상당히 개선시켰다. ABCE1로 공동 형질감염된 대식세포의 생존능은 영향을 받지 않았고 높게 유지되었다. ABCE1 공동 형질감염은 mCherry 발현을 약 2배 증가시켰고, 수니티닙로 전처리하면 이 효과가 더욱 향상되었다.
실시예 8: CAR 대식세포에 대한 유전적으로 인코딩된 RNaseL 억제제의 효과
다른 유전적으로 인코딩된 RNaseL 억제제가 CAR 발현을 개선시킬 수 있는지를 평가하기 위해, 변형을 포함하는 CAR mRNA 및 NS1을 인코딩하는 mRNA의 공동-형질감염을 평가하였다. NS1은 NS1A 단백질을 인코딩하는 인플루엔자 A에서 유래된 유전자이다. 도 16에 도시된 바와 같이, ABCE1에 의한 CAR mRNA 또는 NS1에 의한 CAR mRNA의 공동 형질감염은 대조군 유전자 mCherry에 의한 CAR의 공동-형질감염과 비교할 때 CAR 발현 수준을 증가시켰다. NS1 공동형질감염은 ABCE1 공동 형질감염보다 더 높은 CAR 발현을 유도하였다.
ABCE1 및/또는 NS1이 CAR 발현에 영향을 미치는 메커니즘을 평가하기 위해, 변형을 포함하는 HER2 CAR을 인코딩하는 전기천공된 mRNA의 붕괴를 RT-qPCR로 평가하였다. 8시간째에 CAR + mCherry, CAR + ABCE1, 또는 CAR + NS1 mRNA로 형질감염된 대식세포에서 CAR mRNA의 상대적 존재비를 2시간째의 CAR mRNA 존재비와 비교하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, mCherry(음성 대조군)로 공동 형질감염된 CAR mRNA의 수준은 6시간 내에 50% 초과 감소한 반면, ABCE1 또는 NS1 mRNA로 공동 형질감염된 CAR mRNA의 수준은 계속 상승하였다.
실시예 9: 대식세포의 프라이밍
Her2-제타 CAR 발현 대식세포를 생성하기 위해, 일차 인간 대식세포를 90x106개 세포/mL의 농도로 300nM mRNA(TriLink)를 함유하는 EP 완충액(MaxCyte)에 현탁시켰다. 100 μL의 세포 혼합물을 전기천공 카세트(OC100x2; MaxCyte)에 첨가하고 실험 T 세포 1 설정을 사용하여 전기천공하였다. 세포를 카세트에서 제거하고 UpCell 플레이트(Thermo Scientific)에 20% FBS(Gibco)를 함유하는 3mL의 TexMACS 배지(Miltenyi Biotech)에 플레이팅하고 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다.
재조합 CD40 리간드(Peprotech), 4-1BB 리간드(Enzo Life Sciences) 및 4-1BB 수용체(Peprotech)를 100μg/mL의 스톡 농도로 분자 등급의 물에 재현탁하였다. 그 다음 스톡 용액을 사용하여 2 - 0.002 μg/mL 범위의 PBS에서 작업 용액을 생성하였다. 100μL의 작업 용액를 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 실온에서 4시간 동안 두었다.
플레이트를 인큐베이터에서 제거하여 실온에서 30분 동안 두었다. 세포를 플레이트로부터 탈착하고 NC-200 자동 세포 계수기(Chemomtech)를 사용하여 계수하고 10% FBS가 있는 TexMACS 배지에 재현탁하였다. 단백질 코팅된 플레이트를 PBS로 2회 세척한 다음, 10% FBS가 있는 100μL TexMACS 배지의 최종 부피에 대식세포를 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 3시간 후, 핵 GFP를 발현하는 10,000개의 CRL-2351 세포를 각 웰에 첨가하였다. GM-CSF의 최종 농도는 모든 웰에서 10ng/mL였다. Incucyte(Essen Bioscience)를 사용하여 세포 용해를 검출하였다. 종양 세포 사멸은 시간 0에 대해 웰당 통합된 GFP 강도에 의해 계산되었다.
세포 표면 단백질 검출을 위해 대식세포를 최종 부피 200μL TexMACS 배지 + 10% FBS + 10ng/mL GM-CSF에서 효능제 분자로 코팅된 웰에 플레이팅하고 37℃ 및 5% CO2에서 3일 동안 배양하였다. 세포를 300 μL Accutase(Sigma)에서 30분 동안 인큐베이션하고 염색을 위해 96-웰 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다. 세포를 RT에서 20분 동안 20 μg/mL Her2-His를 함유하는 FACS 완충액에서 인큐베이션한 다음, RT에서 10분 동안 Human TruStain FcX에서 인큐베이션하였다. 표면 단백질 염색은 다음 패널을 사용하여 수행되었다: CD80-FITC, CD86-PE, CD163-APC-Cy7, CD206-BV421, 항-His-APC, Aqua Live/Dead. Attune NxT 유동 세포측정기(Thermo Fischer)를 사용하여 표면 단백질 발현의 검출을 완료하였다.
CD40L에 의한 CAR 대식세포의 처리는 대식세포 및 CAR 대식세포의 종양 사멸 능력을 상당히 개선시켰다(도 18a). CD40L에 의한 프라이밍은 또한 CAR mRNA로 형질감염된 대식세포에서 M1 표현형을 유도하였다(도 18b). 4-1BB 및 4-1BBL로의 처리는 CD40L보다 덜 강력하지만 유사한 결과를 야기하였다(도 19a 및 도19b 및 도 20a 및 도 20b). 이들 결과는 CD40 L과 같은 CD40 효능제로 CAR 대식세포를 전처리 또는 프라이밍하면 효능이 증가할 수 있고 CD40 효능제로 CAR 대식세포를 포함하는 병용 요법이 효능을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 10: 인간 단핵구에 대한 mRNA 변형의 효과
인간 단핵구에 대한 변형을 포함하는 CAR mRNA의 전달도 평가되었다. 구체적으로, M6AGCap1 및 PsU 변형을 포함하는 HER2 CAR을 인코딩하는 mRNA를 5명의 인간 공여자로부터 유도된 단핵구에 전기천공하였다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 높은 CAR 발현은 강도 및 백분율 모두에서 달성되었다.
실시예 11: 이종이식편 고형 종양 마우스 모델에서 mRNA 전기천공을 통해 생성된 CAR-대식세포의 효과
이종이식편 고형암 마우스 모델에서 mRNA 전기천공에 의해 생성된 CAR-대식세포의 효능을 평가하기 위해, 5개의 그룹을 사용하였다. 연구 그룹에는 미처리 그룹, 모의 처리 그룹, IFN-β가 있는 모의 처리 그룹, mRNA CAR-대식세포(mRNA-CAR) 처리 그룹 및 IFN-β (mRNA-CAR + IFNb) 처리 그룹이 있는 mRNA CAR-대식세포를 포함하였다.
NSGS 마우스에 6e5 SKOV3 세포를 주입하였다(그룹당 n=5 마우스). 이어서 도 22에서 화살표로 나타낸 바와 같이 마우스를 0일째, 4일째 및 8일째에 복강내 주사를 통해 8e6 대식세포로 처리하였다. IVIS 이미징 시스템(Perkin Elmer)을 사용하여 생물발광 이미징으로 종양 부담을 측정하였다. 마우스는 2-3일마다 이미지화되었다.
도 22에 도시된 바와 같이, mRNA CAR-대식세포 또는 IFN-β 프라이밍된 mRNA CAR-대식세포로 처리된 마우스는 대조군과 비교하여 억제된 종양 성장을 입증하였다.
실시예 12: 동계 고형 종양 마우스 모델에서 mRNA 전기천공을 통해 생성된 CAR-대식세포의 효과
동계 고형암 마우스 모델에서 mRNA 전기천공에 의해 생성된 CAR-대식세포의 효능을 평가하기 위해, 5개의 그룹을 사용하였다. 연구 그룹에는 미처리 그룹, 모의 처리 그룹, IFN-β가 있는 모의 처리 그룹, mRNA CAR-대식세포(mRNA-CAR) 처리 그룹 및 IFN-β (mRNA-CAR + IFNb) 처리 그룹이 있는 mRNA CAR-대식세포를 포함하였다.
BALB/c 마우스에 7.5e5 CT26-HER2 결장암 세포를 피하 주사하였다(그룹당 n=12-13마리의 마우스). 종양 주입 12일 후(평균 종양 덩어리는 50 mm3일 때) 대략 3e6 대식세포가 종양 내로 주사되었다. 추가 대식세포를 16일째 및 20일째에 주사하였다(주사당 마우스당 대략 3e6, 도 23에서 화살표로 나타냄). 격주로 캘리퍼스를 사용하여 종양 부피를 측정하고 다음 공식을 사용하여 종양 부피를 추정하였다: 종양 부피 = 길이 x 너비^2/2, 여기서 길이는 가장 큰 종양 직경을 나타내고 너비는 수직 종양 직경을 나타낸다.
도 23에 나타낸 바와 같이, IFN-β 처리된 mRNA CAR-대식세포를 받은 마우스의 거의 80%가 종양을 거부한 반면, 모의, IFN-β 처리된 모의 또는 mRNA CAR-대식세포가 있는 마우스의 약 60%는 종양을 거부하였다. IFN-β 프라이밍된 mRNA CAR-대식세포는 음성 대조군과 비교하여 종양 성장을 상당히 억제하였다. 특히, 면역적격 마우스 모델의 맥락에서, IFN-β 프라이밍된 mRNA CAR-대식세포는 mRNA CAR-대식세포 또는 IFN-β 프라이밍된 대조군 대식세포를 능가하여, CAR 조작과 IFN-β 프라이밍 사이의 시너지 효과를 입증하였다.
등가물
본 개시내용에 대한 다양한 변경, 수정 및 개선이 당업자에게 용이하게 일어날 것이라는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 이러한 변경, 수정 및 개선은 본 개시내용의 일부로 의도되고 본 발명의 사상 및 범위 내에 있도록 의도된다. 따라서, 전술한 설명 및 도면은 단지 예로서 제공되며, 임의의 발명은 다음 청구범위에 의해 더 상세히 기술된다면 본 개시내용에 기재된다.
당업자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 검정 또는 기타 공정에서 얻은 값에 기인하는 편차 또는 오류의 전형적인 표준을 인식할 것이다. 본 발명의 배경을 설명하고 그 실시에 관한 추가 세부사항을 제공하기 위해 본 명세서에서 참조된 간행물, 웹사이트 및 기타 참조 자료는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.

Claims (40)

  1. 면역 세포를 변형시키는 방법으로서,
    (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 메신저 RNA(mRNA)를 변형시키는 단계,
    (b) mRNA를 정제하는 단계, 및
    (c) mRNA를 면역 세포에 전달하는 단계를 포함하고,
    면역 세포는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함하고, 그리고
    변형된 면역 세포는 CAR을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 변형 단계는 mRNA가 변형된 뉴클레오티드, 5' 또는 3' 미번역 영역(UTR)에 대한 변경, 캡 구조 및/또는 폴리(A) 테일을 포함하도록 하는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 캡 구조는 AGCap1, m6AGCap1 또는 역전 방지 캡 유사체 (ARCA)를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드는 슈도우리딘(PsU), 5-메톡시우리딘(5moU), 5-메틸시티딘/슈도우리딘(5meC PsU), N1-메틸-슈도우리딘(N1mPsU) 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 단계는 실리카 막 정제 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 단계는 형질감염을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 단계는 mRNA가 AGCap1 및 5moU를 포함하도록 하는 단계를 포함하고, 정제 단계는 실리카 막 정제를 포함하고, 그리고 전달 단계는 전기천공을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 단계는 mRNA가 AGCap1 및 PsU를 포함하도록 하는 단계를 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 그리고 전달 단계는 전기천공을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 단계는 mRNA가 AGCap1 및 N1mPsU를 포함하도록 하는 단계를 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 그리고 전달 단계는 전기천공을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 단계는 mRNA가 m6-AGCap1 및 N1mPsU를 포함하도록 하는 단계를 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 그리고 전달 단계는 전기천공을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 단계는 mRNA가 m6-AGCap1 및 PsU를 포함하도록 하는 단계를 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 그리고 전달 단계는 전기천공을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 단계는 AGCap1 및 PsU를 포함하도록 mRNA를 변형시키는 것을 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 그리고 전달 단계는 형질감염을 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 단계는 mRNA가 m6-AGCap1 및 PsU를 포함하도록 하는 단계를 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 그리고 전달 단계는 형질감염을 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 단계는 mRNA가 m6-AGCap1 및 N1mPsU를 포함하도록 하는 단계를 포함하고, 정제 단계는 HPLC를 포함하고, 그리고 전달 단계는 형질감염을 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 단계는 mRNA가 AGCap1 및 5moU를 포함하도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 단계는 mRNA가 m6AGCap1 및 5moU를 포함하도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포를 RNaseL 억제제로 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, RNaseL 억제제는 수니티닙을 포함하는, 방법.
  19. 제17항에 있어서, RNaseL 억제제는 ABCE1을 포함하는, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 처리 단계는 전달 단계 전에 일어나는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포를 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 사이토카인은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNFα, IL-6, STNGL, LPS, CD40 효능제, 4-1BB 리간드, 재조합체 4-1BB 수용체, TLR 효능제, 베타-글루칸, IL-4, IL-13, IL-10, TGF-β, 글루코코르티코이드, 면역 복합체, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 사이토카인은 IFN-β를 포함하는, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 단계는 전달 단계 후에 일어나는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 면역 세포는 CAR을 발현하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, CAR 발현은 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA가 전달된 동일한 유형의 변형된 면역 세포에서 CAR 발현에 비해 증가되는, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA가 전달된 동일한 유형의 변형된 면역 세포에서 효과기 활성에 비해 증가된 효과기 활성을 나타내는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 변형된 면역 세포.
  29. 제28항에 있어서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 증가된 생존능을 나타내는, 변형된 면역 세포.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 CAR을 인코딩하는 mRNA의 증가된 발현을 나타내는, 변형된 면역 세포.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 증가된 CAR 발현을 나타내는, 변형된 면역 세포.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 CAR을 인코딩하는 mRNA의 증가된 수명을 나타내는, 변형된 면역 세포.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 CAR의 증가된 수명을 나타내는, 변형된 면역 세포.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 증가된 효과기 활성을 나타내는, 변형된 면역 세포.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 비변형 mRNA를 포함하는 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 증가된 M1 분극화을 나타내는, 변형된 면역 세포.
  36. 하기를 포함하는 조성물:
    하나 이상의 변형된 mRNA로서, 변형된 뉴클레오티드, 5' 또는 3' 미번역 영역(UTR)에 대한 변경, 캡 구조, 폴리 A 테일, 또는 이들의 조합을 포함하는, 하나 이상의 변형된 mRNA, 및
    하나 이상의 RNaseL 억제제.
  37. 제36항에 있어서, 캡 구조는 AGCap1 또는 m6AGCap1을 포함하는, 조성물.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드는 슈도우리딘(PsU), 5-메톡시우리딘(5moU), 5-메틸시티딘/슈도우리딘(5meC PsU), 또는 N1-메틸-슈도우리딘(N1mPsU)을 포함하는, 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 RNaseL 억제제는 수니티닙을 포함하는, 방법.
  40. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 RNaseL 억제제는 ABCE1을 포함하는, 방법.
KR1020237002666A 2020-06-26 2021-06-25 면역 세포의 mRNA 형질감염 KR20230047086A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063044855P 2020-06-26 2020-06-26
US63/044,855 2020-06-26
PCT/US2021/039168 WO2021263152A1 (en) 2020-06-26 2021-06-25 mRNA TRANSFECTION OF IMMUNE CELLS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230047086A true KR20230047086A (ko) 2023-04-06

Family

ID=79281947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237002666A KR20230047086A (ko) 2020-06-26 2021-06-25 면역 세포의 mRNA 형질감염

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230235286A1 (ko)
EP (1) EP4171584A1 (ko)
JP (1) JP2023532280A (ko)
KR (1) KR20230047086A (ko)
CN (1) CN116113422A (ko)
AU (1) AU2021296914A1 (ko)
BR (1) BR112022026469A2 (ko)
CA (1) CA3187138A1 (ko)
IL (1) IL299288A (ko)
MX (1) MX2022015888A (ko)
WO (1) WO2021263152A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
JP2023549140A (ja) 2020-11-04 2023-11-22 マイエロイド・セラピューティクス，インコーポレーテッド 操作されたキメラ融合タンパク質組成物およびその使用方法
WO2023107593A2 (en) * 2021-12-09 2023-06-15 Carisma Therapeutics Inc. In vivo delivery to immune cells

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016515216A (ja) * 2013-03-14 2016-05-26 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａのキャップ効率の定量的評価
CN107847524A (zh) * 2015-03-27 2018-03-27 哈佛学院校长同事会 经过修饰的t细胞及其制备和使用方法
JP7032304B2 (ja) * 2015-07-28 2022-03-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア キメラ抗原受容体を発現する改変された単球／マクロファージおよびその使用
AU2017350488B2 (en) * 2016-10-26 2022-06-23 Acuitas Therapeutics Inc. Lipid nanoparticle mRNA vaccines
WO2019152781A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified monocytes/macrophages/dendritic cells expressing chimeric antigen receptors and uses in diseases and disorders associated with protein aggregates
US20220119476A1 (en) * 2018-08-31 2022-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation of Antigen Presenting Cells and Methods for Using the Same

Also Published As

Publication number Publication date
BR112022026469A2 (pt) 2023-03-07
US20230235286A1 (en) 2023-07-27
EP4171584A1 (en) 2023-05-03
CN116113422A (zh) 2023-05-12
JP2023532280A (ja) 2023-07-27
IL299288A (en) 2023-02-01
MX2022015888A (es) 2023-03-28
CA3187138A1 (en) 2021-12-30
WO2021263152A1 (en) 2021-12-30
AU2021296914A1 (en) 2023-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11739297B2 (en) Method of increasing tumor killing activity of macrophages or monocytes comprising chimeric antigen receptor
KR102357004B1 (ko) 입양 세포 면역요법의 효능을 강화하기 위한 조성물 및 방법
AU2018355427A1 (en) Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US20230235286A1 (en) Mrna transfection of immune cells
CN112218651A (zh) 用于与嵌合抗原受体疗法组合的免疫增强rna
CN114656570B (zh) 包含nkg2d结构域的多特异性嵌合受体和其使用方法
WO2019152660A1 (en) Combination therapy using a chimeric antigen receptor
EP3844184A1 (en) Activation of antigen presenting cells and methods for using the same
WO2023107593A2 (en) In vivo delivery to immune cells
JP2024505564A (ja) 自己分極化免疫細胞
WO2024030583A2 (en) Novel constructs for chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2024076927A2 (en) Novel anti-mesothelin chimeric antigen receptors and modified immune cells
WO2024006281A2 (en) Switch receptors and modified immune cells
CA3231615A1 (en) Chimeric antigen receptors comprising interleukin-9 receptor signaling domain