JP2024505564A - 自己分極化免疫細胞 - Google Patents

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デイビッド クリストファー スロース，
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Abstract

本開示は、融合タンパク質を含む修飾免疫細胞、ならびに融合タンパク質を含む免疫細胞の使用方法及び作製方法に関する。本開示はまた、外因性サイトカイン及びキメラ抗原受容体を含む修飾免疫細胞、ならびに上記免疫細胞の使用方法及び作製方法にも関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年２月２日に出願の米国仮出願第６３／１４４，８６０号に対する優先権及び利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に援用される。
［００００］
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。上記ＡＳＣＩＩのコピーは、２０２２年１月２７日に作成されたものであり、名称は「２０１２８５１－０１２４＿ＳＬ．ｔｘｔ」、サイズは、５６９，７９２バイトである。
マクロファージは、免疫応答の強力なモジュレーターであり、一般的に炎症誘発性（Ｍ１）表現型または抗炎症性（Ｍ２）表現型の形をとることができる。Ｍ１／Ｍ２マクロファージの精密なバランスは、疾患及び損傷に対する身体の応答を解決する上で重要であり、様々な疾患は、調節不全のＭ１／Ｍ２表現型を含む。例えば、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるマクロファージは、腫瘍を保護するＭ２表現型に偏っていることが多いが、その一方で、アテローム硬化性組織におけるＭ１マクロファージは、プラークの進行を促進する。
したがって、細胞療法向けに操作された免疫細胞のＭ１／Ｍ２分極化を遺伝学的に制御及び／または維持する方法を確立することが必要とされている。
本開示は、とりわけ、外因性サイトカインを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、及び／または樹状細胞）を含む組成物、ならびに該組成物を製造する方法を包含する。本開示はまた、とりわけ、融合タンパク質を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、及び／または樹状細胞）を含む組成物、ならびに該組成物を製造する方法も包含する。
本開示は、サイトカインベースのシグナル伝達を使用した、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、及び／または樹状細胞）表現型に対する遺伝学的制御を確立するためのシステムを提供する。本開示は、とりわけ、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、及び／または樹状細胞）での炎症誘発性（Ｍ１）または抗炎症性（Ｍ２）促進外因性サイトカインとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）との共発現を提供するが、この共発現により、免疫細胞が大量に発現外因性サイトカインを産生することが可能になる。加えて、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、及び／または樹状細胞）での炎症誘発性（Ｍ１）促進外因性サイトカインとＣＡＲとの共発現により、免疫細胞がＭ１表現型に「自己分極化」することが可能になる。同様に、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、及び／または樹状細胞）での抗炎症性（Ｍ２）促進外因性サイトカインとＣＡＲとの共発現により、免疫細胞がＭ２表現型に「自己分極化」することが可能になる。
本開示はまた、とりわけ、サイトカインがそのテザー受容体に分子内で結合して下流シグナル伝達を誘導することができるように、炎症誘発性（Ｍ１）または抗炎症性（Ｍ２）促進サイトカインがその対応する受容体サブユニットのうち１つに直接融合される融合タンパク質を提供する。天然に存在する可溶性サイトカインとは異なり、本開示のテザーサイトカインは、修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、及び／または樹状細胞）のみを刺激するように設計されたものであり、受容体への直接的な融合により、細胞膜からのサイトカインの拡散を防ぐことができ、かつ高局部濃度に起因する急速な結合反応速度を促すことができる。そのため、このテザーサイトカイン－サイトカイン受容体の融合タンパク質設計は、周辺の細胞に対する細胞傷害効果のリスクを最小限に抑えながら、修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、及び／または樹状細胞）に対して構成的な炎症誘発性（Ｍ１）または抗炎症性（Ｍ２）促進シグナルを発生させることができる。
一態様では、本開示は、サイトカイン、リンカー、及びサイトカイン受容体を含む融合タンパク質を含む修飾免疫細胞であって、該修飾免疫細胞は、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞であり、かつ該サイトカインはサイトカイン受容体に結合する、修飾免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、膜結合している。いくつかの実施形態では、リンカーは、可動性リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、サイトカイン、リンカー、及びサイトカイン受容体を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、表２ａ、表２ｂ、表３ａ、表３ｂ、表６、表８、または表９から選択される配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、サイトカイン、リンカー、及びサイトカイン受容体を含む融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む修飾免疫細胞であって、該修飾免疫細胞は、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞であり、かつ該サイトカインはサイトカイン受容体に結合する、修飾免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、膜結合している。いくつかの実施形態では、リンカーは、可動性リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、サイトカイン、リンカー、及びサイトカイン受容体を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸は、表１０から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸は、表１１ａまたは表１１ｂから選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸は、表４ａ、表４ｂ、または表７から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸は、表５ａまたは表５ｂから選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも８０％同一である配列を含む。
いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８ａ、ＩｇＧκ、ＰＤＧＦＲ－β、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、もしくはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、もしくはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－β、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１Ｒ３、ＩＬ－６Ｒα、ｇｐ１３０、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＩＬ－１７ＲＡ、ＩＬ－１７ＲＢ、ＩＬ－１７ＲＣ、ＩＬ－２３Ｒ、ＣＳＦ２－Ｒα、ＣＳＦ２－Ｒβ、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－４Ｒα１、ＩＬ－２Ｒγｃ、ＩＬ－１０Ｒ１、ＩＬ－１０Ｒ２、ＩＬ－１３Ｒα１、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ、ＣＳＦ１－Ｒ、ＴＧＦ－βＲ１、またはＴＧＦ－βＲ２シグナルペプチドであるか、またはそれらを含む。
いくつかの実施形態では、サイトカインは、炎症誘発性サイトカインであるか、または炎症誘発性サイトカインを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、抗炎症性サイトカインであるか、または抗炎症性サイトカインを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、もしくはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、もしくはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、またはＧＭ－ＣＳＦであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、またはＴＧＦ－βであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、もしくはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、もしくはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、またはＴＧＦ－βであるか、またはそれらを含む。
いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、炎症誘発性サイトカイン受容体であるか、または炎症誘発性サイトカイン受容体を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、抗炎症性サイトカイン受容体であるか、または抗炎症性サイトカイン受容体を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１Ｒ３、ＩＬ－６Ｒα、ｇｐ１３０、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＩＬ－１７ＲＡ、ＩＬ－１７ＲＢ、ＩＬ－１７ＲＣ、ＩＬ－２３Ｒ、ＣＳＦ２－Ｒα、またはＣＳＦ２－Ｒβであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－４Ｒα１、ＩＬ－２Ｒγｃ、ＩＬ－１０Ｒ１、ＩＬ－１０Ｒ２、ＩＬ－１３Ｒα１、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ、ＣＳＦ１－Ｒ、ＴＧＦ－βＲ１、またはＴＧＦ－βＲ２であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１Ｒ３、ＩＬ－６Ｒα、ｇｐ１３０、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＩＬ－１７ＲＡ、ＩＬ－１７ＲＢ、ＩＬ－１７ＲＣ、ＩＬ－２３Ｒ、ＣＳＦ２－Ｒα、ＣＳＦ２－Ｒβ、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－４Ｒα１、ＩＬ－２Ｒγｃ、ＩＬ－１０Ｒ１、ＩＬ－１０Ｒ２、ＩＬ－１３Ｒα１、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ、ＣＳＦ１－Ｒ、ＴＧＦ－βＲ１、またはＴＧＦ－βＲ２であるか、またはそれらを含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（ここで、ｎ＝１～５である（配列番号１７０））、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー、及びリンカー２６からなる群から選択されるリンカーであるか、またはそれらを含む。
別の態様では、本開示は、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、リンカー、及びインターロイキン－１０受容体（ＩＬ１０Ｒ）を含む融合タンパク質を含む修飾免疫細胞を提供する。別の態様では、本開示は、インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）、リンカー、及びインターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）を含む融合タンパク質を含む修飾免疫細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、膜結合している。いくつかの実施形態では、リンカーは、可動性リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む。
別の態様では、本開示は、本開示の修飾免疫細胞を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
別の態様では、本開示は、サイトカイン及びサイトカイン受容体を含む融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む核酸コンストラクトを提供する。いくつかの実施形態では、核酸コンストラクトは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上の核酸をさらに含む。
別の態様では、本開示は、本開示の核酸コンストラクトを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
別の態様では、本開示は、対象の疾患または障害を治療または予防する方法であって、治療有効量の本開示の医薬組成物を対象に送達することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、免疫細胞を修飾する方法であって、免疫細胞にサイトカイン、リンカー、及びサイトカイン受容体を含む融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む核酸コンストラクトを導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、リンカーは、可動性リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態では、核酸コンストラクトは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、導入は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または化学的に修飾されたｍＲＮＡのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションを含む。いくつかの実施形態では、導入は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｖｐｘタンパク質とともにパッケージングされる。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２ベクターまたはＡｄ５ベクターを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ５ベクターは、Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、導入は、トランスポゾンに基づく導入またはＣＲＩＳＰＲに基づく標的組み込みを含む。
別の態様では、本開示は、外因性サイトカイン及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む修飾免疫細胞であって、該修飾免疫細胞は、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞であり、かつ該外因性サイトカインは、炎症誘発性サイトカイン、抗炎症性サイトカイン、または化学走性誘因物質ケモカインであるか、またはそれらを含む、修飾免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインは、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインは、表２ａ、表２ｂ、表６、または表８から選択される配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、外因性サイトカイン及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上の核酸を含む修飾免疫細胞であって、該修飾免疫細胞は、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞であり、かつ該外因性サイトカインは、炎症誘発性サイトカイン、抗炎症性サイトカイン、または化学走性誘因物質ケモカインであるか、またはそれらを含む、修飾免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインは、シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸は、表４ａ、表４ｂ、表７、または表１１ｂから選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸は、表８から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸は、シグナルペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８ａ、ＩｇＧκ、ＰＤＧＦＲ－β、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、もしくはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、もしくはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－β、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１Ｒ３、ＩＬ－６Ｒα、ｇｐ１３０、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＩＬ－１７ＲＡ、ＩＬ－１７ＲＢ、ＩＬ－１７ＲＣ、ＩＬ－２３Ｒ、ＣＳＦ２－Ｒα、ＣＳＦ２－Ｒβ、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－４Ｒα１、ＩＬ－２Ｒγｃ、ＩＬ－１０Ｒ１、ＩＬ－１０Ｒ２、ＩＬ－１３Ｒα１、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ、ＣＳＦ１－Ｒ、ＴＧＦ－βＲ１、またはＴＧＦ－βＲ２シグナルペプチドであるか、またはそれらを含む。
いくつかの実施形態では、外因性サイトカインは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、もしくはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、もしくはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－β、ＣＣＬ１９またはＣＸＣＬ１２であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＣＣＬ１９、またはＣＸＣＬ１２であるか、またはそれらを含む。
別の態様では、本開示は、外因性サイトカイン及びＣＡＲを含む本開示の修飾免疫細胞を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
別の態様では、本開示は、外因性サイトカイン及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上の核酸を含む核酸コンストラクトを提供する。
別の態様では、本開示は、外因性サイトカイン及びＣＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む本開示の核酸コンストラクトを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
別の態様では、本開示は、対象の疾患または障害を治療または予防する方法であって、治療有効量の本開示の医薬組成物を対象に送達することを含み、ここで、該医薬組成物は、外因性サイトカイン及びＣＡＲを含む本開示の修飾免疫細胞、または外因性サイトカイン及びＣＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む本開示の核酸コンストラクトを含む、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、免疫細胞を修飾する方法であって、免疫細胞に外因性サイトカイン及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上の核酸を含む核酸コンストラクトを導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、導入は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または化学的に修飾されたｍＲＮＡのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションを含む。いくつかの実施形態では、導入は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｖｐｘタンパク質とともにパッケージングされる。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２ベクターまたはＡｄ５ベクターを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ５ベクターは、Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、導入は、トランスポゾンに基づく導入またはＣＲＩＳＰＲに基づく標的組み込みを含む。
図面は、例示のみを目的としており、限定を目的としていない。
ＩＦＮ－β及びＩＦＮＡＲ１／２ならびにＩＬ１０及びＩＬ１０ＲＡ／Ｂを含む例示的な融合タンパク質を示す。
シグナルペプチド、サイトカイン、リンカー、及びサイトカイン受容体を含む例示的な融合タンパク質設計を示す。ここで、サイトカインは、サイトカイン受容体に結合している。この図は、配列番号１７５として「（ＧＧＧＧＳ）ｘ」を開示している。
融合タンパク質をコードするコンストラクトの免疫細胞（例えば、マクロファージ）への遺伝子導入、融合タンパク質と内因性受容体との二量体化、ならびにマクロファージの炎症誘発性（すなわち、Ｍ１）状態への分極化を含む、本開示の例示的な方法を示す。 融合タンパク質（及び任意選択でＣＡＲ）をコードするコンストラクトの免疫細胞（例えば、マクロファージ）への遺伝子導入、融合タンパク質と内因性受容体との二量体化、ならびにマクロファージの炎症誘発性（すなわち、Ｍ１）状態への分極化を含む、本開示の例示的な方法を示す。
融合タンパク質をコードするコンストラクトの免疫細胞（例えば、マクロファージ）への遺伝子導入、融合タンパク質と内因性受容体との二量体化、ならびにマクロファージの抗炎症性（すなわち、Ｍ２）状態への分極化を含む、本開示の例示的な方法を示す。 融合タンパク質（及び任意選択でＣＡＲ）をコードするコンストラクトの免疫細胞（例えば、マクロファージ）への遺伝子導入、融合タンパク質と内因性受容体との二量体化、ならびにマクロファージの抗炎症性（すなわち、Ｍ２）状態への分極化を含む、本開示の例示的な方法を示す。
シグナルペプチド、ＦＬＡＧタグ、サイトカイン、リンカー、サイトカイン受容体、Ｐ２Ａペプチド及びｍＣｈｅｒｒｙを含む例示的なコンストラクトを示す。抗体は、ＦＬＡＧタグに結合している。 シグナルペプチド、ＦＬＡＧタグ、サイトカイン、リンカー、サイトカイン受容体、Ｐ２Ａペプチド及びｍＣｈｅｒｒｙを含む例示的なコンストラクトを示す。抗体は、サイトカインに結合している。
プラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生存率を示す例示的なグラフを示す。 プラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞での融合タンパク質の表面発現を示す例示的なグラフを示す。
抗体によるＦＬＡＧタグの検出と、ＩＦＮβ－ＩＦＮＡＲ１群及びＩＬ４－ＩＬ１３Ｒα群でのｍＣｈｅｒｒｙ発現との間の相関性を示す例示的なグラフを示す。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での融合タンパク質の発現を示す例示的なウェスタンブロットを示す。
シグナルペプチド、ＦＬＡＧタグ、サイトカイン、リンカー、サイトカイン受容体、Ｐ２Ａペプチド及びｍＣｈｅｒｒｙを含む例示的なコンストラクトを示す。この図はまた、ＦＬＡＧタグに結合する抗体も示している。
融合タンパク質を含むＶＰＸレンチウイルスで形質導入したマクロファージの生存率を示す例示的なグラフを示す。 融合タンパク質を含むＶＰＸレンチウイルスで形質導入したマクロファージでの融合タンパク質の表面発現を示す例示的なグラフを示す。
融合タンパク質を含むＶＰＸレンチウイルスで形質導入したマクロファージにおける、生存率、Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現、及び融合タンパク質の表面発現を示す例示的なグラフを示す。 融合タンパク質を含むＶＰＸレンチウイルスで形質導入したマクロファージにおける、生存率、Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現、及び融合タンパク質の表面発現を示す例示的なグラフを示す。
融合タンパク質を含むＶＰＸレンチウイルスで形質導入したマクロファージからの炎症誘発性（Ｍ１）マーカーの発現を示す例示的なグラフを示す。 融合タンパク質を含むＶＰＸレンチウイルスで形質導入したマクロファージからの抗炎症性（Ｍ２）マーカーの発現を示す例示的なグラフを示す。
サイトカイン及びＣＡＲをコードするｍＲＮＡのトランスフェクション後のマクロファージの生存率を示す例示的なグラフを示す。
サイトカイン及びＣＡＲをコードするｍＲＮＡのトランスフェクション後のマクロファージでのＣＡＲ発現を示す例示的なグラフを示す。
サイトカイン及びＣＡＲをコードするｍＲＮＡのトランスフェクション後のマクロファージからのＩＦＮ－γのレベルを示す例示的なグラフを示す。
サイトカイン及びＣＡＲをコードするｍＲＮＡのトランスフェクション後のマクロファージからのＩＬ－１０のレベルを示す例示的なグラフを示す。
サイトカイン及びＣＡＲをコードするｍＲＮＡのトランスフェクション後のマクロファージからのＣＣＬ１９のレベルを示す例示的なグラフを示す。
サイトカイン及びＣＡＲをコードするｍＲＮＡのトランスフェクション後のマクロファージからのＣＸＣＬ１２のレベルを示す例示的なグラフを示す。
サイトカイン及びＣＡＲをコードするｍＲＮＡのトランスフェクション後のマクロファージからの炎症誘発性（Ｍ１）マーカーＣＤ８０及びＣＤ８６のレベルを示す例示的なグラフを示す。
サイトカイン及びＣＡＲをコードするｍＲＮＡのトランスフェクション後のマクロファージからの抗炎症性（Ｍ２）マーカーＣＤ１６３及びＣＤ２０６のレベルを示す例示的なグラフを示す。
定義
本発明がより容易に理解されるために、特定の用語をまず以下に定義する。以下の用語及び他の用語の追加の定義についても、本明細書全体を通して記載する。本発明の背景を説明し、その実践に関するさらなる詳細を提供するために、本明細書で参照される刊行物及び他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すように使用している。例として、「１つの要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
およそまたは約：本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、目的の１つ以上の値に適用される場合、記載された基準値に類似した値を表す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または特に文脈から明らかでない限り、記載された基準値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内に収まる値の範囲を指す（ただし、そのような数値が、取り得る値の１００％を超える場合を除く）。
活性化：本明細書で使用される場合、「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激された、またはそのエフェクター機能を発揮するために刺激された、細胞、例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞の状態を指す。活性化は、誘導されたサイトカイン産生、食作用、細胞シグナル伝達、標的細胞殺傷、及び／または抗原プロセシング及び提示にも関連している可能性がある。
活性化単球／マクロファージ／樹状細胞：本明細書で使用される場合、「活性化単球／マクロファージ／樹状細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けているか、またはエフェクター機能を発揮している単球／マクロファージ／樹状細胞を指す。「活性化単球／マクロファージ／樹状細胞」という用語は、とりわけ、エフェクター機能を実行している細胞、または、食作用、サイトカイン分泌、増殖、遺伝子発現の変化、代謝の変化、及びその他の機能を含む、休止状態では見られない何らかの活性を発揮している細胞を指す。
薬剤：本明細書で使用される場合、「薬剤」（または「生物学的薬剤」もしくは「治療剤」）という用語は、本明細書に記載の修飾細胞によって発現、放出、分泌、または標的に送達され得る分子を指す。薬剤には、限定されないが、核酸、抗生物質、抗炎症剤、抗体またはその断片、抗体剤またはその断片、成長因子、サイトカイン、酵素、タンパク質（例えば、ＲＮＡｓｅ阻害剤）、ペプチド、融合タンパク質、合成分子、有機分子（例えば、低分子）、炭水化物、脂質、ホルモン、ミクロソーム、その誘導体または変異体、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。薬剤は、標的または標的細胞上に存在する受容体、抗原決定基、または他の結合部位などの任意の細胞部分に結合することができる。薬剤は細胞内に拡散または輸送され、細胞内で作用することがある。
抗体：本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の標的抗原への特異的結合をもたらすのに十分であるカノニカルな免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当技術分野において知られているように、天然に産生されるようなインタクト抗体は、互いに会合して「Ｙ字型」構造と一般的に称されるものとなる、２個の同一の重鎖ポリペプチド（各約５０ｋＤ）、及び２個の同一の軽鎖ポリペプチド（各約２５ｋＤ）から構成されている、約１５０ｋＤの四量体薬剤である。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（各々約１１０アミノ酸長）から構成されている。すなわち、アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）の後に、３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、及びカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙの基部の先端に位置する）が続いている。「スイッチ」として知られている、短い領域は、重鎖可変領域及び定常領域を接続する。「ヒンジ」は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを抗体の残りに接続する。このヒンジ領域中の２箇所のジスルフィド結合は、インタクト抗体中で２個の重鎖ポリペプチドを互いに接合する。各軽鎖は２つのドメインから構成されている。すなわち、アミノ末端可変（ＶＬ）ドメインの後にカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインが続き、これらは、別の「スイッチ」によって互いから分離している。インタクト抗体四量体は、２つの重鎖－軽鎖二量体から構成されており、これらの二量体において、重鎖及び軽鎖が１つのジスルフィド結合によって互いに結合し、２つの他のジスルフィド結合が重鎖ヒンジ領域を互いに接続することにより、二量体同士が接続され、四量体が形成される。また、天然に産生された抗体は、典型的にはＣＨ２ドメインでグリコシル化されている。自然抗体の各ドメインは、２つのベータシート（例えば、３本鎖、４本鎖、または５本鎖のシート）同士がまとまって固まった逆平行ベータバレルになることから形成された「免疫グロブリンフォールド」によって特徴付けられる構造を有する。各可変ドメインは、「相補性決定領域」として知られる３つの超可変ループ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び４つの若干不変な「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含む。自然抗体がフォールドするとき、ＦＲ領域がベータシートを形成してドメインの構造フレームワークとなり、重鎖と軽鎖の両方のＣＤＲループ領域が三次元空間で結合する結果、Ｙ構造の先端に位置する１つの超可変抗原結合部位を作出する。天然に存在する抗体のＦｃ領域は、補体系の要素に結合し、例えば細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞などのエフェクター細胞の受容体にも結合する。Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性及び／または他の結合特性は、グリコシル化または他の修飾を介して調節することができる。いくつかの実施形態では、（例えば、ＣＡＲの成分として）本発明に従い産生及び／または利用される抗体は、グリコシル化されたＦｃドメイン、例えば修飾または操作されたグリコシル化を伴うＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、自然抗体中に見出されるものとして、十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む、いずれかのポリペプチド、またはポリペプチドの複合体は、このようなポリペプチドが自然に産生される（例えば、抗原に反応する動物によって生成される）か、遺伝子組換え工学、化学合成、または他の人工システムもしくは方法論によって産生されるかどうかにかかわらず、「抗体」と称される、及び／または「抗体」として使用されることが可能である。いくつかの実施形態では、抗体はポリクローナルである。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナルである。いくつかの実施形態では、抗体は、マウス抗体、ウサギ抗体、霊長類抗体、またはヒト抗体に特徴的な定常領域配列を有する。いくつかの実施形態では、抗体配列要素は、当技術分野で公知であるように、ヒト化されたもの、霊長類化されたもの、キメラなどである。さらに、本明細書で使用される「抗体」という用語は、適切な実施形態（別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り）において、代替的な実施態様において抗体の構造及び機能的特徴を利用するための当技術分野において公知である、または開発されたコンストラクトまたはフォーマットのいずれかを意味し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明に従い利用される抗体は、限定するものではないが、インタクトＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体、二重特異性抗体または多特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、抗体断片、例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離されたＣＤＲまたはそれらのセット、一本鎖Ｆｖ、ポリペプチド－Ｆｃ融合物、単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片などのサメ単一ドメイン抗体）、ラクダ科抗体、マスク抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰｓ（商標）」）、一本鎖ダイアボディまたはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮｓ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）、ならびにＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるフォーマットである。いくつかの実施形態では、抗体は、天然に産生された場合には有しているはずの共有結合的修飾（例えば、グリカンの結合）を欠いている場合がある。いくつかの実施形態では、抗体は、共有結合的修飾（例えば、グリカンの結合、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療的な部分、触媒部分など］、または他のペンダント基［例えば、ポリエチレングリコールなど］を含むことができる。
抗体剤：本明細書で使用される場合、「抗体剤」という用語は、特定の抗原に特異的に結合する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、用語は、特異的結合を付与するのに十分な免疫グロブリン構造的要素を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチド複合体を包含する。例示的な抗体剤には、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体剤は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体に特徴的な１つ以上の定常領域配列を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体剤は、当技術分野で公知であるように、ヒト化されたもの、霊長類化されたもの、キメラなどである１つ以上の抗体配列要素を含むことができる。多くの実施形態では、「抗体剤」という用語は、代替的な実施態様において抗体の構造的及び機能的特徴を利用するための、当技術分野で公知のもしくは開発されたコンストラクトまたはフォーマットの１つ以上を指すために使用される。例えば、いくつかの実施形態では、本発明に従い利用される抗体剤は、限定するものではないが、インタクトＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体、二重特異性抗体または多特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、抗体断片、例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離されたＣＤＲまたはそれらのセット、一本鎖Ｆｖ、ポリペプチド－Ｆｃ融合物、単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片などのサメ単一ドメイン抗体）、ラクダ科抗体、マスク抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰｓ（商標）」）、一本鎖ダイアボディまたはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮｓ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）、ならびにＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるフォーマットである。いくつかの実施形態では、抗体剤は、天然に産生された場合には有しているはずの共有結合的修飾（例えば、グリカンの結合）を欠いている場合がある。いくつかの実施形態では、抗体剤は、共有結合的修飾（例えば、グリカンの結合、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療的な部分、触媒部分など］、または他のペンダント基［例えば、ポリエチレングリコールなど］を含むことができる。多くの実施形態では、抗体剤は、アミノ酸配列が相補性決定領域（ＣＤＲ）として当業者に認識された１つ以上の構造的要素を含むポリペプチドであるか、アミノ酸配列が相補性決定領域（ＣＤＲ）として当業者に認識された１つ以上の構造的要素を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体剤は、アミノ酸配列が参照抗体で見られるものに実質的に同一である少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ及び／または少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含むポリペプチドであるか、またはアミノ酸配列が参照抗体で見られるものに実質的に同一である少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ及び／または少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、配列が同一であるか、または参照ＣＤＲと比較した場合１～５のアミノ酸置換を含むかのいずれかであるという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、参照ＣＤＲとの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を示すという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、参照ＣＤＲとの少なくとも９６％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を示すという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、含まれたＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が参照ＣＤＲと比較した場合欠失、付加、または置換されるが、含まれたＣＤＲが参照ＣＤＲのものと他の点では同一であるアミノ酸配列を有するという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、含まれたＣＤＲ内の１～５のアミノ酸が参照ＣＤＲと比較した場合欠失、付加、または置換されるが、含まれたＣＤＲが参照ＣＤＲと他の点では同一であるアミノ酸配列を有するという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、含まれたＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が参照ＣＤＲと比較した場合置換されるが、含まれたＣＤＲが参照ＣＤＲのものと他の点では同一であるアミノ酸配列を有するという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、含まれたＣＤＲ内の１～５のアミノ酸が参照ＣＤＲと比較した場合欠失、付加、または置換されるが、含まれたＣＤＲが参照ＣＤＲと他の点では同一であるアミノ酸配列を有するという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、抗体剤は、アミノ酸配列が免疫グロブリン可変ドメインとして当業者に認識された構造的要素を含むポリペプチドであるか、またはアミノ酸配列が免疫グロブリン可変ドメインとして当業者に認識された構造的要素を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体剤は、免疫グロブリン結合ドメインに対して相同であるか、または大部分は相同である結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質である。いくつかの実施形態では、抗体剤は、アミノ酸配列が免疫グロブリン可変ドメインとして当業者に認識された構造的要素を含むポリペプチドではない、及び／またはアミノ酸配列が免疫グロブリン可変ドメインとして当業者に認識された構造的要素を含むポリペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、抗体剤は、免疫グロブリン構造的要素を含まない分子または組成物（例えば、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む受容体または他の天然に存在する分子）であり得るか、またはそれらを含み得る。
抗体断片：本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクト抗体の一部を指し、インタクト抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体、及びそれらのヒト及びヒト化バージョンが挙げられる。
抗体重鎖：本明細書で使用される場合、「抗体重鎖」という用語は、天然に存在する立体配座にある全抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち大きい方を指す。
抗体軽鎖：本明細書で使用される場合、「抗体軽鎖」という用語は、天然に存在する立体配座にある全抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち小さい方を指す。
合成抗体：本明細書で使用される場合、「合成抗体」という用語は、例えば、本明細書に記載のバクテリオファージによって発現する抗体など、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成された抗体、及びそのＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現する抗体、または抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、ここでＤＮＡまたはアミノ酸配列は、利用可能かつ当技術分野で周知である合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られる。
抗原：本明細書で使用される場合、「抗原」または「Ａｇ」という用語は、免疫応答を誘発することができる分子を指す。この免疫応答には、抗体産生、特異的免疫学的適格細胞の活性化のいずれか、またはその両方が含まれる場合がある。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として機能することができることを理解するであろう。さらに、抗原は組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来することができる。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、本明細書で使用される用語「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要がないことを理解するであろう。本発明は、２つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これらに限定されないこと、及びこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を誘発するために種々の組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要がまったくないことを理解するであろう。抗原を、合成して生成することができるか、または生体試料に由来することができることは容易に明らかである。そのような生体試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞または体液が含まれるが、これらに限定されない。
抗腫瘍効果：本明細書で使用される場合、「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の延伸、またはがん状態に関連する種々の生理学的症状の改善によって明らかになりうる生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、及び抗体の、最初の腫瘍の発生の予防における能力によっても明らかにすることができる。
自己由来：本明細書で使用される場合、「自己由来」という用語は、後に個体に再導入される同じ個体に由来する任意の材料を指す。
同種異系：本明細書で使用される場合、「同種異系」という用語は、同じ種の異なる動物に由来する任意の物質（例えば、細胞の集団）を指す。
異種：本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、異なる種の動物に由来する任意の物質（例えば、細胞の集団）を指す。
がん：本明細書で使用される「がん」という用語は、異常細胞の急速かつ制御不能な増殖を特徴とする疾患を指す。がん細胞は、局所的に、または血流やリンパ系を介して体の他の部分に広がる可能性がある。種々のがんの例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、がんは、甲状腺髄様癌である。
保存的配列修飾：本明細書で使用される場合、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意に影響または変化を与えないアミノ酸修飾を指す。そのような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加及び欠失が含まれる。修飾は、部位特異的変異導入及びＰＣＲ媒介変異導入などの当技術分野で知られている標準的な技術によって、種々の実施形態に適合する抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変化した抗体を、本明細書に記載の機能アッセイを使用して抗原に結合する能力について試験することができる。
共刺激リガンド：本明細書で使用される場合、「共刺激リガンド」という用語は、単球／マクロファージ／樹状細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それにより、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されない、単球／マクロファージ／樹状細胞応答を媒介するシグナルを提供する、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上の分子を指す。共刺激リガンドには、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、及びＢ７－Ｈ３に特異的に結合するリガンドを含めることができるが、これらに限定されるものではない。共刺激リガンドはまた、とりわけ、単球／マクロファージ／樹状細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体、例として、限定されるものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドも包含する。
細胞毒性の：本明細書で使用される場合、「細胞毒性の」または「細胞毒性」という用語は、細胞を殺傷するまたは損傷することを指す。一実施形態では、代謝的に増強された細胞の細胞傷害性が改善され、例えば、マクロファージの細胞溶解活性が増加する。
有効量：本明細書で使用される場合、「有効量」及び「治療有効量」は交換可能であり、特定の生物学的結果を達成するのに有効であるか、または製造、治療もしくは予防上の利点を提供する、本明細書において記載される化合物、製剤、材料もしくは組成物の量を指す。このような結果には、当技術分野で好適な任意の手段によって判定される抗腫瘍活性が含まれるが、これらに限定されない。
エフェクター機能：本明細書で使用される場合、「エフェクター機能」または「エフェクター活性」は、免疫細胞の刺激に応答して免疫細胞によって実行される特異的活性を指す。例えば、マクロファージのエフェクター機能は、食作用によって、細胞片、異物、微生物、がん細胞、及びその他の不健康な細胞を飲み込んで消化するものである。
コードする：本明細書で使用される場合、「コードする」とは、定義されたヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）配列または定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの、ポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性ならびにそれに起因する生物学的特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって細胞または他の生体系においてタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり通常は配列表に示されるヌクレオチド配列であるコード鎖も、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖もともに、タンパク質、またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードするということができる。
内因性：本明細書で使用される場合、「内因性」とは、特定の生物、細胞、組織もしくは系の内部に由来するか、またはそれらの内部で産生される任意の物質を指す。
外因性：本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、特定の生物、細胞、組織もしくは系の外部から導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の物質を指す。
拡大：本明細書で使用される場合、「拡大」という用語は、細胞、例えば、単球、マクロファージ、及び／または樹状細胞の数の増加におけるように、数が増加することを指す。一実施形態では、エクスビボで拡大した単球、マクロファージ、または樹状細胞は、培養物中に最初に存在している数と比較して数が増加する。別の実施形態では、エクスビボで拡大した単球、マクロファージ、または樹状細胞は、培養物中の他の細胞型と比較して数が増加する。いくつかの実施形態では、拡大はインビボで起こり得る。本明細書で使用される「エクスビボ」という用語は、生きている生物（例えば、ヒト）から取り出され、生物の外側で（例えば、培養皿、試験管、またはバイオリアクター内で）増殖された細胞を指す。
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」という用語は、核酸配列からの任意の遺伝子産物の生成を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は転写物であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列の発現は、以下のうちの１つ以上を含む：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写産物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端形成による）、（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳、及び／または（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
発現ベクター：本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、発現するヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、コスミド、プラスミド（例えば、裸のものまたはリポソーム中に含まれるもの）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）など、当技術分野で公知のすべてのベクターが含まれる。
断片：本明細書で使用される場合、「断片」または「部分」という用語は、全体のうちの別個の部分を含むが、構造全体に見出される１つ以上の部分を欠いている構造を指す。いくつかの実施形態では、断片は、そのような別個の部分からなる。いくつかの実施形態では、断片は、全体に見出される特徴的な構造要素または部分からなるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド断片は、ヌクレオチド全体に見出される少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００もしくはそれ以上のモノマー単位（例えば、核酸）を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド断片は、ヌクレオチド全体に見出されるモノマー単位（例えば、残基）の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を含むか、またはそれらからなる。物質または実体の全体は、いくつかの実施形態では、全体の「親」と称される場合がある。
相同性：本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合に互いに「相同」であると考えられる。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％類似している（例えば、関連する化学的性質を持つ残基を対応する位置に含む）場合に互いに「相同」であると考えられる。当業者に理解されるように、相同性の程度を決定するために配列の比較を可能にする様々なアルゴリズムが利用可能であり、これは、例えば、異なる配列でどの残基が互いに「対応する」かを検討する際に、ある配列で指定された長さの、別の配列に対するギャップの許容によることを含む。２つの核酸配列間の相同性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のための２つの配列を整列させることにより実行され得る（例えば、最適なアラインメントのための第１及び第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のためには非対応配列を無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較目的のための整列した配列の長さは、参照配列の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置でのヌクレオチドが比較される。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と同じヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で同一であり、第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と類似のヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置で類似している。２つの配列間の相同性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列に共通する同一及び類似の位置の数の関数である。
同一性：本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、２つのポリマー分子間、特に２つのアミノ酸分子間、例えば２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性を指す。２つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する場合、例えば、２つのポリペプチド分子のそれぞれの位置がアルギニンによって占められている場合、それらはその位置で同一である。２つのアミノ酸配列が、アラインメントにおいて同じ位置に同じ残基を有する同一性または程度は、多くの場合パーセンテージとして表される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、一致している位置または同一である位置の数の一次関数であり、例えば、２つの配列中の位置の半分（例えば、１０アミノ酸長のポリマー中の５つの位置）が同一である場合、２つの配列は５０％同一であり、位置の９０％（例えば、１０のうち９つ）が一致しているかまたは同一である場合、２つのアミノ酸配列は９０％同一である。
実質的同一性：本明細書で使用される場合、「実質的同一性」という用語は、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を指す。当業者には理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置に同一の残基を含有する場合、一般に「実質的に同一」であると考えられる。当技術分野において周知であるように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ギャップＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータープログラムで利用可能なものを含む様々なアルゴリズムのいずれかを使用して比較することができる。いくつかの実施形態では、対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が、関連する一続きの残基にわたって同一である場合、２つの配列は実質的に同一であると考えられる。いくつかの実施形態では、関連する一続きは完全な配列である。いくつかの実施形態では、関連する一続きは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００またはそれ以上の残基である。ＣＤＲとの関係において、「実質的な同一性」への言及は、通常、参照ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。
免疫細胞：本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、免疫応答、例えば免疫応答の促進に関与する細胞を指す。免疫細胞の例には、マクロファージ、単球、樹状細胞、好中球、好酸球、マスト細胞、血小板、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球、またはＢ－リンパ球が含まれるが、これらに限定されない。免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）の供給源は、対象から得ることができる。
免疫応答：本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、リンパ球が抗原分子を異物と同定し、抗体の形成を誘導し、及び／またはリンパ球を活性化して抗原を除去する場合に起こる抗原に対する細胞応答及び／または全身応答を指す。
免疫グロブリン：本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスを指す。Ｂ細胞によって発現する抗体は、ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）または抗原受容体と称されることがある。このクラスのタンパク質に含まれる５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。ＩｇＡは、唾液、涙、母乳、胃腸分泌物、気道及び尿生殖路の粘液分泌物などの体分泌物に存在する一次抗体である。ＩｇＧは、最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの対照の一次免疫応答で産生される主要な免疫グロブリンである。これは、凝集、補体結合、及びその他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌及びウイルスに対する防御に重要である。ＩｇＤは抗体機能が判明していない免疫グロブリンであるが、抗原受容体として機能している場合がある。ＩｇＥは、アレルゲンに対する曝露時にマスト細胞及び好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことによって即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、天然状態から修飾または除去されたものを指す。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または例えば宿主細胞などの非天然環境で存在することができる。
修飾：本明細書で使用される場合、「修飾」という用語は、本発明の分子または細胞の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的など、多くの方法で修飾することができる。細胞は、核酸の導入によって修飾することができる。
調節する：本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、治療もしくは化合物の非存在下での対象における応答のレベル及び／または性質と比較して、及び／または他の点では同一であるが治療を受けていない対象における応答のレベル及び／または性質と比較して、対象における応答のレベルの検出可能な増加もしくは低下、及び／または応答の性質の変化を媒介することを指す。この用語は対象、好ましくはヒトにおいて、天然のシグナルもしくは応答を撹乱させ、及び／またはそれに影響を与え、それにより有益な治療応答を媒介することを包含する。
核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、少なくとも３つのヌクレオチドのポリマーを指す。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は一本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のホスホジエステル結合を含む骨格を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合及び非ホスホジエステル結合の両方を含む骨格を含む。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のホスホロチオエートまたは５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合及び／または、例えば「ペプチド核酸」におけるような、１つ以上のペプチド結合を含む骨格を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の、またはすべての天然残基（例えば、アデニン、シトシン、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、グアニン、チミン、ウラシル）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の、またはすべての非天然残基を含む。いくつかの実施形態では、非天然残基は、ヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレート塩基、及びそれらの組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態では、非天然残基は、天然残基のものと比較して、１つ以上の修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはポリペプチドなどの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のイントロンを含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、酵素合成（例えば、相補的鋳型に基づく重合、例えば、インビボまたはインビトロでの、組換え細胞もしくは系における複製、または化学合成による）によって調製され得る。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００以上の残基長である。
作動可能に連結した：本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」という用語は、例えば調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を意味し、後者の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、同じリーディングフレームにおいて、隣接しており、必要な場合、２つのタンパク質コード領域を繋げるためのものである。
過剰発現腫瘍抗原：本明細書で使用される場合、「過剰発現」腫瘍抗原または腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、患者の特定の組織または臓器の内部にある固形腫瘍のような疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の発現が、その組織または臓器からの正常細胞における発現のレベルと比べて異常なレベルであることを指す。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野で知られている標準的なアッセイによって判定することができる。
ポリヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖を指す。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される場合、核酸及びポリヌクレオチドは交換可能である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、加水分解されて単量体の「ヌクレオチド」になり得るという一般的な知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドには、非限定的に、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術及びＰＣＲ（商標）などを用いた組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含む、当技術分野において利用可能な任意の手段により、ならびに合成手段により得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、典型的にはペプチド結合によって連結される残基（例えば、アミノ酸）の任意のポリマー鎖を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、人工的に設計及び／または作製されるという点で、操作されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはその両方を含むか、またはそれらからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸のみまたは非天然アミノ酸のみを含むか、またはそれらからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸、Ｌ－アミノ酸、または両方を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸のみを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸のみを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端、またはそれらの任意の組み合わせで、１つ以上のペンダント基または他の修飾、例えば、１つ以上のアミノ酸側鎖の修飾またはそれへの結合を含み得る。いくつかの実施形態では、そのようなペンダント基または修飾は、アセチル化、アミド化、脂質化、メチル化、ペグ化など、例えばそれらの組み合わせ、からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは環状であってもよく、及び／または環状部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは環状ではなく、及び／または環状部分を含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは直鎖状である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ステープルポリペプチドであるか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、「ポリペプチド」という用語は、参照ポリペプチド、活性、または構造の名称に付加され得、そのような場合、これは、関連する活性または構造を共有し、したがってポリペプチドの同じクラスまたはファミリーのメンバーであると考えることができるポリペプチドを指すために本明細書で使用される。そのようなクラスごとに、アミノ酸配列及び／または機能が知られているクラス内の例示的なポリペプチドを本明細書が提供し、及び／または当業者はそれに気付くであろう。いくつかの実施形態では、そのような例示的なポリペプチドは、ポリペプチドのクラスまたはファミリーの参照ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドクラスまたはファミリーのメンバーは、クラスの参照ポリペプチドと、いくつかの実施形態では、クラス内のすべてのポリペプチドと）、有意な配列相同性または同一性を示し、共通の配列モチーフ（例えば、特徴的な配列要素）を共有し、及び／または共通の活性を共有する（いくつかの実施形態では、同等のレベルで、または指定範囲内で）。例えば、いくつかの実施形態では、メンバーポリペプチドは、少なくとも約３０～４０％であり、多くの場合、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を超える参照ポリペプチドとの全体的な程度の配列相同性または同一性を示し、及び／または、多くの場合９０％、またはさらに９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える非常に高い配列同一性を示す少なくとも１つの領域（例えば、いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素であるか、またはそれを含み得る保存領域）を含む。このような保存領域は、通常、少なくとも３～４個、多くの場合最大２０個以上のアミノ酸を包含し、いくつかの実施形態では、保存領域は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の連続アミノ酸の少なくとも１つの一続きを包含する。いくつかの実施形態では、有用なポリペプチドは、親ポリペプチドの断片を含むか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態では、有用なポリペプチドは、複数の断片を含むか、または複数の断片からなり得、そのそれぞれは、目的のポリペプチドに見られるものとは互いに対し異なる空間配置で、同じ親ポリペプチドに見られ（例えば、親に直接連結された断片は、目的のポリペプチドでは空間的に分離されているか、またはその逆である場合があり、及び／または断片は、親とは異なる順序で目的のポリペプチドに存在する場合がある）、したがって、目的のポリペプチドは、その親ポリペプチドの誘導体である。
タンパク質：本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合によって互いに連結された一連の少なくとも２つのアミノ酸）を指す。タンパク質は、アミノ酸以外の部分を含むことができる（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカンなどであり得る）、及び／または別途加工あるいは修飾され得る。当業者は、「タンパク質」が、細胞によって産生される完全なポリペプチド鎖（シグナル配列有りまたは無し）であっても、またはその特徴的部分であってもよいことを理解するであろう。当業者は、タンパク質が、例えば、１つ以上のジスルフィド結合によって連結されるか、または他の手段によって会合される２つ以上のポリペプチド鎖を含み得る場合があることを理解するであろう。ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、または両方を含有することができ、かつ当業者に既知の種々のアミノ酸修飾またはアナログのいずれも含有することができる。有用な修飾は、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びそれらの組み合わせを含むことができる。「ペプチド」という用語は、一般的に、約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、または１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指すように使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体断片、その生物学的に活性な部分、及び／またはその特徴的部分である。
シグナル伝達経路：本明細書で使用される場合、「シグナル伝達経路」という用語は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体」という語句には、シグナルを受け取り、細胞の原形質膜を介してシグナルを伝達することができる分子及び分子の複合体が含まれる。
単鎖抗体：本明細書で使用される場合、「単鎖抗体」という用語は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖断片が、操作されたアミノ酸の長さを介してＦｖ領域に連結される組換えＤＮＡ技術によって形成された抗体を指す。単鎖抗体を生成する種々の方法が知られており、これには、米国特許第４，６９４，７７８号、Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４４２、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４５４、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８－１０４１に記載されているものが含まれる。
特異的に結合する：本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、抗体剤などの抗原結合ドメインに関して、特異的抗原を認識するが、試料内の他の分子を実質的には認識しないまたはそれに結合しない抗原結合ドメインまたは抗体剤を指す。例えば、ある種由来の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインまたは抗体剤はまた、１つ以上の種由来の抗原に結合し得る。しかし、そのような種間反応性自体は、抗原結合ドメインまたは抗体剤の特異的なものとしての分類を変更するものではない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインまたは抗体剤は、抗原の異なる対立遺伝子型にも結合し得る。しかし、そのような交差反応性自体は、抗原結合ドメインまたは抗体剤の特異的なものとしての分類を変更するものではない。場合によっては、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語を、抗原結合ドメインまたは抗体剤、タンパク質、またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関連して使用することができ、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味してもよい。例えば、抗原結合ドメインまたは抗体剤は、タンパク質全体ではなく特定のタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗原結合ドメインまたは抗体剤がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識化「Ａ」及び抗原結合ドメインまたは抗体剤を含む反応において、エピトープＡ（または遊離した非標識化Ａ）を含有する分子の存在によって、抗体に結合した標識化Ａの量が減少する。
刺激：本明細書で使用される場合、「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、ＦｃＲ複合体、ＴＬＲ複合体、またはＴＣＲ／ＣＤ３複合体）が、例えば、その同族リガンドと結合し、これにより、限定されないが、Ｆｃ受容体機構または合成ＣＡＲを介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介することによって誘導される一次応答を指す。刺激は、ＴＧＦ－ベータのダウンレギュレーション、及び／または細胞骨格構造の再編成など、ある特定の分子の発現の変化を媒介することができる。本明細書で使用される場合、「刺激分子」という用語は、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合する単球、マクロファージ、または樹状細胞の分子を指す。いくつかの実施形態では、刺激分子は、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）またはＣＤ４０ドメインを含むＦｃＲ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、刺激分子は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９ドメインを含むＴＬＲ細胞外ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「刺激性リガンド」という用語は、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞など）または腫瘍細胞上に存在する場合、単球、マクロファージ、または樹状細胞上の同族結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と呼ばれる）と特異的に結合し、それによって、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含むがこれらに限定されない免疫細胞による応答を媒介するリガンドを指す。刺激性リガンドは当技術分野で周知であり、とりわけ、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、抗ｔｏｌｌ様受容体抗体、アゴニスト、及び、単球／マクロファージ受容体に対する抗体を包含する。加えて、インターフェロン－ガンマなどのサイトカインは、マクロファージに対する強力な刺激物質である。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、生物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類、霊長類、実験動物、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、ネコ、またはイヌ）を指す。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、成人、青年、または小児対象である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または状態、例えば、本明細書で提供されるように治療することができる疾患、障害または状態、例えば、本明細書に列挙されるがんまたは腫瘍に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態に罹患しやすく、いくつかの実施形態では、罹患しやすい対象は、疾患、障害、または状態を発症する素因がある、及び／または（基準対象または基準集団で観察される平均リスクと比較して）リスクの増加を示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または状態の１つ以上の症状を示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の特定の症状（例えば、疾患の臨床症状）または特徴を示さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または状態のいずれの症状または特徴も示さない。いくつかの実施形態では、対象は患者である。いくつかの実施形態では、対象は、診断及び／または療法が施される及び／または施された個体である。
実質的に精製された：本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」という用語は、例えば細胞に適用される場合、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞はまた、天然に存在する状態で通常関連する他の細胞型から分離された細胞を指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞集団を指す。他の例では、この用語は、天然状態で天然に会合している細胞から分離された細胞を単に指す。いくつかの実施形態では、細胞をインビトロで培養する。他の実施形態では、細胞はインビトロで培養されない。
標的：本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、提供される方法、システム、及び／または組成物の対象である体内の細胞、組織、器官、または部位、例えば、治療を必要とするか、または、例えば抗体（もしくはその断片）もしくはＣＡＲによって優先的に結合される体内の細胞、組織、器官、または部位を指す。
標的部位：本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、結合が起こるのに十分な条件下で結合分子が特異的に結合し得る核酸の部分を定義するゲノム核酸配列を指す。
Ｔ細胞受容体：本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」という用語は、抗原の提示に応答してＴ細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体を指す。ＴＣＲは、主要組織適合性複合体分子に結合した抗原を認識する役割を担う。ＴＣＲは、アルファ（α）及びベータ（β）鎖のヘテロ二量体から構成されるが、一部の細胞ではＴＣＲはガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖から構成される。ＴＣＲは、構造的に類似しているが、異なる解剖学的位置及び機能を有するアルファ／ベータ及びガンマ／デルタ形態で存在しうる。各鎖は、可変ドメインと定常ドメインの２つの細胞外ドメインで構成されている。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲを含む任意の細胞、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及びγδＴ細胞を含む任意の細胞上で修飾することができる。
治療的：本明細書で使用される場合、「治療的」という用語は、治療及び／または予防を指す。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解、または根絶によって得られる。
トランスフェクトされた：本明細書で使用される場合、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクト」または「形質転換」または「形質導入」細胞は、外因性核酸をトランスフェクト、形質転換、または形質導入した細胞である。この細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
治療する：本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状または特徴の部分的または完全な緩和、改善、発症の遅延、阻害、予防、緩和、及び／または発生率及び／または重症度の低下を指す。いくつかの実施形態では、治療は、疾患、障害、及び／または状態の徴候または特徴を示さない対象に施すことができる（例えば、予防的であり得る）。いくつかの実施形態では、治療は、例えば、疾患、障害、及び／または状態に関連する病態を生じるリスクを減少させる目的で、疾患、障害、及び／または状態の初期または軽度の徴候または特徴のみを呈する対象に施行されてもよい。いくつかの実施形態では、治療は、疾患、障害、または状態の確立された、重度の、及び／または後期の徴候を示す対象に施すことができる。いくつかの実施形態では、治療は、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）に施すこと、または免疫細胞を、インビトロで転写されたｍＲＮＡによって活性化される経路のモジュレーターと接触させることを含み得る。
腫瘍：本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、細胞または組織の異常増殖を指す。いくつかの実施形態では、腫瘍は、前がん性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性、及び／または非転移性の細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、腫瘍は、がんに関連しているか、またはがんの徴候である。いくつかの実施形態では、腫瘍は分散性腫瘍または液状腫瘍であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍であり得る。
ベクター：本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に導入するために使用することができる物質の組成物を指す。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが当技術分野において公知である。したがって、「ベクター」という用語には、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスが含まれる。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性及び非ウイルス性の化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の全体を通じて、本発明の種々の態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記述は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲を具体的に開示したと考えるべきである。例えば、１から６までなどの範囲の記述は、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６などの、その範囲内の個々の数だけでなく、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどの、具体的に開示された部分範囲を有すると考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
マクロファージは、免疫応答の強力なモジュレーターであり、一般的に炎症誘発性（Ｍ１）表現型または抗炎症性（Ｍ２）表現型の形をとることができる。Ｍ１／Ｍ２マクロファージの精密なバランスは、疾患及び損傷に対する身体の応答において重要であり、様々な疾患は、調節不全のＭ１／Ｍ２表現型を含む。例えば、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるマクロファージは、腫瘍を保護するＭ２表現型に偏っていることが多いが、その一方で、アテローム硬化性組織におけるＭ１マクロファージは、典型的には、プラークの進行を促進する。したがって、マクロファージ表現型に対して外部的制御を可能にする方法は、既存のマクロファージを再分極化させるか、または所望の表現型のマクロファージを導入する（例えば、ＴＭＥへのＭ１マクロファージの導入またはアテローム硬化性組織へのＭ２マクロファージの導入）ことによる、有望な治療戦略である。
自然分類系は、Ｍ１／Ｍ２表現型の強力な調節因子としてサイトカインを用いるため、操作されたサイトカインシグナル伝達ネットワークは、マクロファージを操作する場合の魅力的な系となる。しかし、サイトカインは、種々の免疫細胞に対して多面的に影響を及ぼすため、オフターゲットシグナル伝達を回避し、かつ目的のマクロファージのみを活性化するといった課題が生じる。さらに、制御されていないサイトカイン発現により、サイトカイン放出症候群及びその他の有害な副作用をもたらす可能性がある。内因性サイトカインシグナル伝達経路を利用して免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）表現型を制御するための理想的な技術は、（ｉ）望ましいＭ１／Ｍ２表現型を特定し、（ｉｉ）疾患の微小環境でこの表現型を維持し、かつ（ｉｉｉ）細胞傷害性オフターゲット効果を最小限に抑えるものである。本開示は、とりわけ、そのような技術を提供する。
免疫細胞
本発明は、とりわけ、本明細書に記載の外因性サイトカイン及び本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＡＲは、（ａ）細胞外ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞外ドメイン）、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン）、及び（ｃ）細胞内ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞内ドメイン）を含む。
本発明は、とりわけ、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）も提供する。したがって、いくつかの実施形態では、融合タンパク質を含む免疫細胞は、サイトカイン（例えば、本明細書に記載のサイトカイン）、リンカー（例えば、本明細書に記載のリンカー）、及びサイトカイン受容体（例えば、本明細書に記載のサイトカイン受容体）を含み、ここで、サイトカインは、サイトカイン受容体に結合する（図３Ａ及び図４Ａを参照されたい）。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む（図３Ｂ及び４Ｂを参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＡＲは、（ａ）細胞外ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞外ドメイン）、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン）、及び（ｃ）細胞内ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞内ドメイン）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞集団は、幹細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、及び／またはそれらの前駆体を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は、幹細胞、単球、マクロファージ、もしくは樹状細胞の実質的に精製された集団、または細胞株を含む。
いくつかの実施形態では、免疫細胞が活性化され、例えば、免疫細胞は、例えば不活性細胞と比較して、サイトカイン産生、ケモカイン産生、食作用、細胞シグナル伝達、標的細胞殺傷、及び／または抗原提示の増加を示す。いくつかの実施形態では、活性化免疫細胞は、例えば、不活性細胞と比較して、遺伝子発現の変化、例えば、炎症誘発性遺伝子（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１２、ＩＦＮ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、またはＩＬ－１のうちの１、２、３、４、５、６、または７つ）発現の誘導を示す。いくつかの実施形態では、活性化免疫細胞は、例えば、不活性細胞と比較して、遺伝子発現の変化、例えば、抗炎症性遺伝子発現の誘導を示す。ある特定の実施形態では、活性化免疫細胞は細胞分裂を受けている。いくつかの実施形態では、免疫細胞の標的エフェクター活性は、ＣＤ４７及び／またはＳＩＲＰα活性の阻害によって増強される。ＣＤ４７及び／またはＳＩＲＰα活性は、免疫細胞を抗ＣＤ４７もしくは抗ＳＩＲＰα抗体で処理することによって、または当業者に公知の任意の方法によって阻害することができる。
いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、対象から得られる（例えば、単離される）。免疫細胞は自己由来であっても、同種異系または万能ドナーから供給されてもよい。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯、腫瘍、及び／または胚性幹細胞（ＥＳＣ）などの人工多能性幹細胞を含む多くの供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ分離などの当業者に公知の任意の数の分離技術を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる。いくつかの実施形態では、対象の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄して血漿画分を除去し、様々な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））または培養培地）に再懸濁することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、単球）の濃縮は、プラスチック接着を含む。いくつかの実施形態では、濃縮後の免疫細胞（例えば、単球）の分化は、ＧＭ－ＣＳＦによる刺激を含む。いくつかの実施形態では、白血球アフェレーシス組成物（例えば、ロイコパック）などの血球（例えば、単球、リンパ球、血小板、血漿、及び／または赤血球）を含む組成物を、濃縮のために使用する。いくつかの実施形態では、白血球アフェレーシス組成物（例えば、ロイコパック）は、健康なヒトドナー由来の試料を含む。ある特定の実施形態では、免疫細胞（例えば、単球）のアフェレーシスに続いて、ＧＭ－ＣＳＦによる動員が行われる。ある特定の実施形態では、免疫細胞（例えば、単球）の選択は、マイクロビーズ（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙデバイス上のＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）を使用するＣＤ１４陽性選択を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞前駆体（例えば、誘導多能性幹細胞、すなわちｉＰＳＣを含むがこれらに限定されない、マクロファージ、単球、または樹状細胞の前駆体）を、本明細書に記載の組成物及び方法で使用する。免疫細胞前駆体は、インビボまたはエクスビボで免疫細胞に分化させることができる。免疫前駆細胞の非限定的な例には、造血幹細胞、骨髄系共通前駆細胞、骨髄芽球、単芽球、前単球、またはそれらの中間体が含まれる。例えば、人工多能性幹細胞を使用して、単球、マクロファージ、及び／または樹状細胞を生成することができる。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、末梢血、線維芽細胞、皮膚、角化細胞、腎上皮細胞などの正常なヒト組織に由来する場合がある。自己由来、同種異系、または万能ドナーのｉＰＳＣは、骨髄系統（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの前駆体）に分化する可能性がある。
本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、末梢血から、例えば、赤血球を溶解し、リンパ球及び赤血球を枯渇させることにより、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離により単離することができる。代替的には、免疫細胞は、臍帯組織から分離することができる。免疫細胞の特定の下位集団は、陽性または陰性選択技術によってさらに分離することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１９、またはＣＤ２０を含むがこれらに限定されないある特定の抗原を発現する細胞を枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、例えば陰性選択による免疫細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーを指向する抗体の組み合わせを使用して達成することができる。非限定的な例として、細胞選択はまた、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫接着またはフローサイトメトリーを含み得る。
陽性または陰性選択による、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）の所望の集団の単離中に、免疫細胞の濃度及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変化させることができる。細胞及びビーズの最大接触面積を確保するために、ビーズと細胞とが一緒に混合される体積を大幅に減少させることが望ましい場合がある。
いくつかの実施形態では、投与前に、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）（例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含む）を炎症促進剤で処理する。いくつかの実施形態では、炎症促進剤による処理は、本明細書に記載の免疫細胞の抗腫瘍活性を増加させる。いくつかの実施形態では、炎症促進剤による処理は、本明細書に記載の免疫細胞における炎症誘発性（すなわち、Ｍ１）表現型を促進する（例えば、抗炎症性（Ｍ２）表現型から炎症誘発性（Ｍ１）表現型へのスイッチ）。いくつかの実施形態では、炎症促進剤は、ＣＤ４０アゴニスト（例えば、ＣＤ４０Ｌ）を含むか、またはＣＤ４０アゴニストである。いくつかの実施形態では、炎症促進剤は、４１ＢＢリガンドアゴニスト（例えば、４－１ＢＢ）を含むか、または４１ＢＢリガンドアゴニストである。
いくつかの実施形態では、投与前に、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）（例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含む）を抗炎症剤で処理する。いくつかの実施形態では、抗炎症剤による処理は、本明細書に記載の免疫細胞の抗炎症性活性を増加させる。いくつかの実施形態では、抗炎症剤による処理は、本明細書に記載の免疫細胞における抗炎症性（すなわち、Ｍ２）表現型を促進する（例えば、炎症誘発性（Ｍ１）表現型から抗炎症性（Ｍ２）表現型へのスイッチ）。いくつかの実施形態では、抗炎症剤は、ＩＬ－１０アゴニストを含むか、またはＩＬ－１０アゴニストである。いくつかの実施形態では、抗炎症剤は、ＴＧＦβアゴニストを含むか、またはＴＧＦβアゴニストである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）（例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含む）を、炎症促進剤と組み合わせて対象に投与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）（例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含む）を、炎症促進剤と実質的に同時に、その前に、またはその後に対象に投与する。いくつかの実施形態では、炎症促進剤を伴う投与は、本明細書に記載の免疫細胞の抗腫瘍活性を増加させる。いくつかの実施形態では、炎症促進剤を伴う投与は、本明細書に記載の免疫細胞における炎症誘発性（すなわち、Ｍ１）表現型を促進する（例えば、抗炎症性（Ｍ２）表現型から炎症誘発性（Ｍ１）表現型へのスイッチ）。いくつかの実施形態では、炎症促進剤は、ＣＤ４０アゴニスト（例えば、ＣＤ４０Ｌ）を含むか、またはＣＤ４０アゴニストである。いくつかの実施形態では、炎症促進剤は、４１ＢＢリガンドアゴニスト（例えば、４－１ＢＢ）を含むか、または４１ＢＢリガンドアゴニストである。
マクロファージ
マクロファージは、病原体または腫瘍細胞などの標的細胞の検出、食作用、及び破壊に特化した免疫細胞である。マクロファージは自然免疫系の強力なエフェクターであり、少なくとも３つの異なる抗腫瘍機能：１）死細胞、死にかけている細胞、微生物、がん細胞、細胞残屑、またはその他の異物の食作用、２）腫瘍細胞に対する細胞傷害性、及び３）適応抗腫瘍免疫応答を調整するための腫瘍抗原の提示、を行うことができる。
蓄積された証拠は、マクロファージが多数のがんの腫瘍微小環境に豊富に存在し、集合的に腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）と呼ばれる多くの表現型をとり得ることを示唆している。腫瘍微小環境の免疫抑制性によって、通常、より多くのＭ２様ＴＡＭがもたらされ、これは、抗腫瘍免疫応答の一般的な抑制にさらに寄与する。しかし、最近の研究では、ＴＡＭは、炎症誘発性シグナルを介して「再プログラム」されることが可能であること、及びＭ２表現型からよりＭ１表現型へのスイッチが生産的抗腫瘍免疫応答と関連していることが確認されている。内因性ＴＡＭを誘導してＭ１型細胞にスイッチを行い、Ｍ２に覆す（ｓｕｂｖｅｒｔｅｄ）ことができないマクロファージを操作することにより、抗腫瘍免疫療法を大幅に向上させ、このことは、この分野における重要な進歩となる。
いくつかの実施形態では、マクロファージは、未分化もしくはＭ０マクロファージを含むか、または未分化もしくはＭ０マクロファージである。ある特定の実施形態では、マクロファージは、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ７１、もしくはＣＣＲ５のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つを含むか、または発現する。種々の刺激にさらされると、Ｍ０マクロファージは、マクロファージ表現型マーカー、サイトカイン産生、及び／またはケモカイン分泌によって同定され得るいくつかの異なる集団に分極化するように誘導される。
いくつかの実施形態では、マクロファージは、分極化マクロファージを含むか、または分極化マクロファージである。活性化の古典的な条件下では、Ｍ０マクロファージは、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦなどの炎症誘発性シグナルにさらされ、炎症誘発性（すなわち、Ｍ１）マクロファージに分極化する可能性がある。一般に、炎症誘発性（Ｍ１）マクロファージは、Ｔｈ１及びＴｈ１７Ｔ細胞応答などの炎症誘発性免疫応答に関連している。他の刺激にさらされると、マクロファージが多様な「代替的に活性化された」マクロファージの群または抗炎症性（すなわち、Ｍ２）マクロファージの群に分極化する可能性がある。
いくつかの実施形態では、マクロファージは、炎症誘発性（Ｍ１）マクロファージを含むか、または炎症誘発性（Ｍ１）マクロファージである。いくつかの実施形態では、マクロファージは、炎症誘発性（Ｍ１）マクロファージの１つ以上のマーカー（例えば、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＭＨＣ ＩＩ、ＩＬ－１Ｒ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ｉＮＯＳ、ＳＯＣＳ３、ＣＤ８３、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ６９、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６、ＩＬ１Ｒ、ＩＦＩＴファミリーメンバー、またはＩＳＧファミリーメンバーのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）を発現する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、比較的高レベルの１つ以上の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＴＮＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、またはＩＬ３３のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２）またはケモカイン（例えば、ＣＣもしくはＣＸＣケモカインの一方または両方）（例えば、ＣＸＣケモカインのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６、例えば、ＣＣケモカインのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８、例えば、ＣＸ３Ｃケモカインのうちの１つ、例えば、Ｃケモカインの１つまたは両方）を分泌する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、免疫応答及び／または炎症を刺激する。
いくつかの実施形態では、マクロファージは、抗炎症性（Ｍ２）マクロファージ（例えば、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ、及びＭ２ｄマクロファージ）を含むか、または抗炎症性（Ｍ２）マクロファージである。Ｍ２ａマクロファージは、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、及び／または真菌感染によって誘導される可能性がある。Ｍ２ｂマクロファージは、ＩＬ－１Ｒリガンド、免疫複合体、及び／またはＬＰＳによって誘導される可能性がある。Ｍ２ｃマクロファージは、ＩＬ－１０及び／またはＴＧＦβによって誘導される可能性がある。Ｍ２ｄマクロファージは、ＩＬ－６及び／またはアデノシンによって誘導される可能性がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、対象における免疫応答を減少させる。いくつかの実施形態では、マクロファージは、抗炎症性（Ｍ２）マクロファージの１つ以上のマーカー（例えば、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、またはＣＤ２０９のうちの１つ、２つ、または３つ）を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、１つ以上の抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０またはＴＧＦβの１つまたは両方）の分泌の増加を示す。
いくつかの実施形態では、マクロファージは、本明細書で提供する外因性サイトカインまたは本明細書で提供する融合タンパク質を含まない対照マクロファージ、及び／または本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質の導入前の同じマクロファージと比較して、少なくとも１つのアップレギュレーションされる炎症誘発性（Ｍ１）マーカー及び／または少なくとも１つのダウンレギュレートされる抗炎症性（Ｍ２）マーカーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの炎症誘発性（Ｍ１）マーカー（例えば、ＨＬＡ ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ８３、ＣＤ６９、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６、ＩＬ１Ｒ、ＩＦＩＴファミリーメンバー、及び／またはＩＳＧファミリーメンバー）が、マクロファージでアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗炎症性（Ｍ２）マーカー（例えば、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、及び／またはＣＤ２０９）がマクロファージでダウンレギュレートされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、食作用の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、腫瘍細胞に対する細胞傷害性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、腫瘍抗原提示の増加（例えば、食作用後の提示）及び／または抗原プロセシングの増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、腫瘍殺傷の増加（例えば、食作用、溶解、アポトーシス、または腫瘍殺傷サイトカイン（例えば、ＴＮＦα）の産生による）を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、エフェクター機能（例えば、食作用、標的細胞傷害、抗原提示、またはサイトカイン分泌）の増加と典型的には関連する１つ以上の遺伝子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ４０、４１ＢＢＬ、ＴＮＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１ｂ、及び／またはＣＸＣＬ１２）の発現の増加か、またはエフェクター機能（例えば、食作用、標的細胞傷害、抗原提示、またはサイトカイン分泌）の減少と典型的には関連する１つ以上の遺伝子（例えば、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＴＧＦβ、ＩＬ－１０、及び／またはＩＬ４）の発現の減少のうち一方または両方を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、ＲＯＳの産生の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、代謝の再プログラミングを示す（例えば、インターフェロンシグナル伝達経路、ＴＨ１経路、ＰＴＥＮシグナル伝達、ＰＩ３Ｋシグナル伝達、ＭＴＯＲシグナル伝達、ＴＬＲシグナル伝達、ＣＤ４０シグナル伝達、４１ＢＢシグナル伝達、４１ＢＢＬシグナル伝達、マクロファージ成熟シグナル伝達、樹状細胞成熟シグナル伝達、ＣＤ３ゼータシグナル伝達、ＦｃＲγシグナル伝達、ＣＤ６４シグナル伝達、ＣＤ３２ａシグナル伝達、ＣＤ３２ｃシグナル伝達、ＣＤ１６ａシグナル伝達、ＴＬＲ１シグナル伝達、ＴＬＲ２シグナル伝達、ＴＬＲ３シグナル伝達、ＴＬＲ４シグナル伝達、ＴＬＲ５シグナル伝達、ＴＬＲ６シグナル伝達、ＴＬＲ７シグナル伝達、ＴＬＲ８シグナル伝達、ＴＬＲ９シグナル伝達、ＡＬＫシグナル伝達、ＡＸＬシグナル伝達、ＤＤＲ２シグナル伝達、ＥＧＦＲシグナル伝達、ＥｐｈＡ１シグナル伝達、ＩＮＳＲシグナル伝達、ｃＭＥＴシグナル伝達、ＭＵＳＫシグナル伝達、ＰＤＧＦＲシグナル伝達、ＰＴＫ７シグナル伝達、ＲＥＴシグナル伝達、ＲＯＲ１シグナル伝達、ＲＯＳ１シグナル伝達、ＲＹＫシグナル伝達、ＴＩＥ２シグナル伝達、ＴＲＫシグナル伝達、ＶＥＧＦＲシグナル伝達、ＣＤ４０シグナル伝達、ＣＤ１９シグナル伝達、ＣＤ２０シグナル伝達、４１ＢＢシグナル伝達、ＣＤ２８シグナル伝達、ＯＸ４０シグナル伝達、ＧＩＴＲシグナル伝達、ＴＲＥＭ－１シグナル伝達、ＴＲＥＭ－２シグナル伝達、ＤＡＰ１２シグナル伝達、ＭＲシグナル伝達、ＩＣＯＳシグナル伝達、ＭｙＤ８８シグナル伝達、Ｖ／Ｉ／ＬｘＹｘｘＬ／Ｖシグナル伝達、ＳＩＲＰαシグナル伝達、ＣＤ４５シグナル伝達、Ｓｉｇｌｅｃ－１０シグナル伝達、ＰＤ１シグナル伝達、ＳＨＰ－１シグナル伝達、ＳＨＰ－２シグナル伝達、ＫＩＲ－２ＤＬシグナル伝達、ＫＩＲ－３ＤＬシグナル伝達、ＮＫＧ２Ａシグナル伝達、ＣＤ１７０シグナル伝達、ＣＤ３３シグナル伝達、ＢＴＬＡシグナル伝達、ＣＤ３２ｂシグナル伝達、ＳＩＲＰβシグナル伝達、ＣＤ２２シグナル伝達、ＰＩＲ－Ｂシグナル伝達、及び／またはＬＩＬＲＢ１シグナル伝達）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、細胞生存メカニズムの誘導を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、細胞死メカニズムの誘導を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、食作用チェックポイントに対する耐性の増加、輸送を助けるためのケモカイン受容体の発現の増加、他の免疫細胞を動員するためのケモカインの発現の増加、ＥＣＭ分解酵素の発現の増加（例えば、腫瘍ＥＣＭを分解し、及び／または抗線維化活性を示すＭＭＰ）、及び／または増殖の増加、のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカイン及び本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインを含まないマクロファージと比較して、外因性サイトカイン発現の持続時間の改善、細胞表面上でのＣＡＲの安定性の改善、外因性サイトカイン発現レベルの増加、及び／または外因性サイトカインのバックグラウンド活性の低下のうち１つ、２つ、３つ、または４つを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、融合タンパク質発現の持続時間の改善、細胞表面上での融合タンパク質の安定性の改善、融合タンパク質発現レベルの増加、及び／または融合タンパク質のバックグラウンド活性の低下のうち１つ、２つ、３つ、または４つを示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、対象における感染（例えば、感染病原体の）の１つ以上の徴候及び／または症状を軽減する。いくつかの実施形態では、感染病原体は、ウイルス、原生動物（例えば、トリパノソーマ、マラリア、またはトキソプラズマ）、細菌（例えば、マイコバクテリウム、サルモネラ、またはリステリア）、真菌（例えば、カンジダ）、またはそれらの組み合わせを含むか、またはそれらである。いくつかの実施形態では、ウイルスには、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、またはＥ型肝炎）、レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例、ＨＩＶ１またはＨＩＶ２）、Ｔ細胞白血病ウイルス、リンパ向性ウイルス（例えば、ＨＴＬＶ１またはＨＴＬＶ２）、単純ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型または２型）、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２））、エボラウイルス、西ナイルウイルス、またはそれらのバリアントもしくは組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないマクロファージと比較して、対象（例えば、神経変性疾患、炎症性疾患、心血管疾患、線維性疾患、アミロイドーシス、またはそれらの組み合わせを有する対象）における少なくとも１つのタンパク質凝集体の形成を食作用を介して減少させ、及び／または既存の凝集体を分解する。いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、タウオパチー、シヌクレオパチー、初老期認知症、老人性認知症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ピック病、原発性進行性失語症、前頭側頭型認知症、皮質基底層型認知症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ダウン症候群、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハラーフォルデン・シュパッツ症候群、ポリグルタミン病、トリヌクレオチドリピート病、及びプリオン病、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、全身性エリテマトーデス、血管炎、関節リウマチ、歯周炎、潰瘍性大腸炎、副鼻腔炎、喘息、結核、クローン病、慢性感染、遺伝性周期熱、悪性腫瘍、全身性血管炎、嚢胞性線維症、気管支拡張症、表皮水疱症、循環性好中球減少症、免疫不全、マックルウェルズ（ＭＷＳ）病、及び家族性地中海熱（ＦＭＦ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは、原発性アミロイドーシス（ＡＬ）、続発性アミロイドーシス（ＡＡ）、家族性アミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、ベータ２ミクログロブリンアミロイドーシス、限局性アミロイドーシス、重鎖アミロイドーシス（ＡＨ）、軽鎖アミロイドーシス（ＡＬ）、原発性全身性アミロイドーシス、ＡｐｏＡＩアミロイドーシス、ＡｐｏＡＩＩアミロイドーシス、ＡｐｏＡＩＶアミロイドーシス、アポリポタンパク質Ｃ２アミロイドーシス、アポリポタンパク質Ｃ３アミロイドーシス、角膜ラクトフェリンアミロイドーシス、トランスサイレチン関連アミロイドーシス、透析アミロイドーシス、フィブリノーゲンアミロイドーシス、Ｌｅｃｔ２アミロイドーシス（ＡＬＥＣＴ２）、及びリゾチームアミロイドーシス、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、高血圧性心疾患、メタボリックシンドローム、高血圧症、脳血管疾患、及び心不全、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、線維性疾患は、肺線維症、特発性肺線維症、肝硬変、嚢胞性線維症、強皮症、心臓線維症、放射線誘発性肺損傷、脂肪性肝炎、糸球体硬化症、間質性肺疾患、肝線維症、縦隔線維症、後腹膜腔線維症、骨髄線維症、及び皮膚線維症、からなる群から選択される。
単球
単球は、血液、骨髄、及び脾臓内を循環する多能性細胞であり、一般に、定常状態では増殖しない。単球は、直径が約１０～３０μｍの範囲でサイズが大きく異なる。単球の細胞質に対する核の比率は、約２：１から約１：１までの範囲であり得る。通常、単球は、感染時などに血液から組織への移動を媒介するケモカイン受容体及び病原体認識受容体を含む。単球は、炎症性サイトカインを産生し、細胞及び／または毒性分子を取り込み、樹状細胞またはマクロファージに分化することができる。
いくつかの実施形態では、単球は、１つ以上の表現型マーカーを含むかまたは発現する。ヒト単球細胞の表現型マーカーの例としては、ＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤｗ１７、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６８、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８９、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９８、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１９、ＣＤｗｌ２ｌｂ、ＣＤｗ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１４７、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５７、ＣＤ１６２ ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１８０、ＣＤ２０６、ＣＤ１３１ａ１、ＣＤ２１３ ２、ＣＤｗ２１０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８４、及びＣＤ２８６、が挙げられるが、これらに限定されない。マウス単球細胞の表現型マーカーの例としては、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、Ｃｄｗ１３１、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、Ｆ４／８０、及びＣＤ４９ｂが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、単球は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、またはＣＤ１６のうちの１つ、２つ、または３つを含む。ある特定の実施形態では、単球は、ＣＤ１４＋ ＣＤ１６－単球、ＣＤ１４＋ ＣＤ１６＋単球、またはＣＤ１４－ ＣＤ１６＋単球を含む。
いくつかの実施形態では、単球はマクロファージに分化する。いくつかの実施形態では、単球は樹状細胞（ＤＣ）に分化する。単球は、当技術分野において公知の任意の技術によってマクロファージまたはＤＣに分化することができる。例えば、単球からマクロファージへの分化は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）によって誘導される。単球のＤＣへの分化は、ＩＬ－４と組み合わせた顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）によって誘導することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１２、ＩＦＮ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、またはＩＬ－１のうちの１、２、３、４、５、６、または７つ）の分泌の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、食作用の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、生存の向上を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、マクロファージ（例えば、Ｍ１またはＭ２マクロファージ）への分化の増強を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、ＤＣ（例えば、常在性または移動性ＤＣ及び／またはリンパ組織及び非リンパ組織における）への分化の増強を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、腫瘍細胞に対する細胞傷害性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、腫瘍抗原提示の増加（例えば、食作用後の提示）及び／または抗原プロセシングの増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、腫瘍殺傷の増加（例えば、食作用、溶解、アポトーシス、または腫瘍殺傷サイトカイン（例えば、ＴＮＦα）の産生による）を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、エフェクター機能（例えば、食作用、標的細胞傷害、抗原提示、またはサイトカイン分泌）の増加と典型的には関連する１つ以上の遺伝子の発現の増加か、またはエフェクター機能（例えば、食作用、標的細胞傷害、抗原提示、またはサイトカイン分泌）の減少と典型的には関連する１つ以上の遺伝子の発現の減少のうち一方または両方を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、ＲＯＳの産生の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、代謝の再プログラミングを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、細胞生存メカニズムの誘導を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、細胞死メカニズムの誘導を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、食作用チェックポイントに対する耐性の増加、輸送を助けるためのケモカイン受容体の発現の増加、他の免疫細胞を動員するためのケモカインの発現の増加、ＥＣＭ分解酵素の発現の増加（例えば、腫瘍ＥＣＭを分解し、及び／または抗線維化活性を示すＭＭＰ）、または増殖の増加、のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカイン及び本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインを含まない単球と比較して、外因性サイトカイン発現の持続時間の改善、細胞表面上でのＣＡＲの安定性の改善、外因性サイトカイン発現レベルの増加、及び／または外因性サイトカインのバックグラウンド活性の低下のうち１つ、２つ、３つ、または４つを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載の融合タンパク質を含まない単球と比較して、融合タンパク質発現の持続時間の改善、細胞表面上での融合タンパク質の安定性の改善、融合タンパク質発現レベルの増加、または融合タンパク質のバックグラウンド活性の低下のうち１つ、２つ、３つ、または４つを示す。
樹状細胞
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答の開始及び自己抗原に対する免疫系の寛容の維持に関与する、骨髄由来の特殊な抗原提示細胞である。樹状細胞は、リンパ器官と非リンパ器官の両方に見られる場合があり、一般にリンパ系または骨髄系から生じると考えられている。
いくつかの実施形態では、ＤＣは、１つ以上の表現型マーカーを含むかまたは発現する。ＤＣの例示的な表現型マーカーには、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１４１、ＣＤ２０７、ＣＬＥＣ９ａ、ＣＤ１２３、ＣＤ８５、ＣＤ１８０、ＣＤ１８７、ＣＤ２０５、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、及び部分的にＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８及びＣＤ２０９が含まれるが、これらに限定されない。
未成熟ＤＣは、抗原捕捉能力が高いが、Ｔ細胞刺激能力が比較的低いことを特徴とする場合がある。炎症性メディエーターは、ＤＣの成熟を促進する。ＤＣが成熟段階に達すると、抗原捕捉能力の低下及び／またはＴ細胞を刺激する能力の増加など、未成熟ＤＣと比較して特性が劇的に変化する。いくつかの実施形態では、ＤＣは、未成熟ＤＣを含むか、または未成熟ＤＣである。他の実施形態では、ＤＣは成熟ＤＣを含むか、または成熟ＤＣである。
理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するようにＤＣ細胞を修飾することにより、成熟ＤＣは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないＤＣと比較して、抗原捕捉能力及びＴ細胞刺激の増加を同時に示すことができると考えられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するＤＣは、腫瘍抗原提示を媒介し、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないＤＣと比較して、例えば、腫瘍抗原提示を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するＤＣは、腫瘍Ｔ細胞刺激を媒介し、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないＤＣと比較して、例えば、Ｔ細胞刺激を増加させる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないＤＣと比較して、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１２、ＩＦＮ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、またはＩＬ－１のうちの１、２、３、４、５、６、または７つ）の分泌の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないＤＣと比較して、食作用の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないＤＣと比較して、腫瘍抗原提示の増加（例えば、食作用後の提示）、抗原プロセシングの増加、抗原交差提示の増加、Ｔ細胞プライミングの増加、及び／またはＴ細胞の刺激を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないＤＣと比較して、好ましい遺伝子の発現の増加または好ましくない遺伝子の発現の減少の一方または両方を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないＤＣと比較して、ＲＯＳの産生の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないＤＣと比較して、代謝の再プログラミングを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないＤＣと比較して、細胞生存メカニズムの誘導を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないＤＣと比較して、細胞死メカニズムの誘導を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインまたは本明細書に記載の融合タンパク質を含まないＤＣと比較して、食作用チェックポイントに対する耐性の増加、輸送を助けるためのケモカイン受容体の発現の増加、他の免疫細胞を動員するためのケモカインの発現の増加、ＥＣＭ分解酵素の発現の増加（例えば、腫瘍ＥＣＭを分解し、及び／または抗線維化活性を示すＭＭＰ）、または増殖の増加、のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカイン及び本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載の外因性サイトカインを含まないＤＣと比較して、外因性サイトカイン発現の持続時間の改善、細胞表面上でのＣＡＲの安定性の改善、外因性サイトカイン発現レベルの増加、及び／または外因性サイトカインのバックグラウンド活性の低下のうち１つ、２つ、３つ、または４つを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載の融合タンパク質を含まないＤＣと比較して、融合タンパク質発現の持続時間の改善、細胞表面上での融合タンパク質の安定性の改善、融合タンパク質発現レベルの増加、または融合タンパク質のバックグラウンド活性の低下のうち１つ、２つ、３つ、または４つを示す。
免疫細胞の修飾方法
本開示は、とりわけ、免疫細胞（例えば、幹細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞）を修飾する方法であって、免疫細胞への外因性サイトカイン及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上の核酸を含む核酸コンストラクトを免疫細胞に導入することを含む、方法を提供する。方法は、外因性サイトカイン及びＣＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む核酸コンストラクトを免疫細胞（例えば、幹細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞）に導入することを含む場合がある。
本開示は、とりわけ、免疫細胞（例えば、幹細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞）を修飾する方法であって、免疫細胞への融合タンパク質またはその断片をコードする１つ以上の核酸を含む核酸コンストラクトを免疫細胞に導入することを含む、方法を提供する。方法は、サイトカイン、リンカー、及びサイトカイン受容体を含む融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む核酸コンストラクトを免疫細胞（例えば、幹細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞）に導入することを含む場合がある。
本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたは本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸コンストラクトは、物理的、化学的、または生物学的方法によって免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）に導入することができる。本明細書に記載の核酸コンストラクトを免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）に導入するための物理的方法は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、またはそれらの組み合わせを含むことができる。核酸コンストラクトは、市販の方法、例えば、エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ－ＩＩ（登録商標）（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＣＭ ８３０ ＢＴＸ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、またはＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（登録商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ，Ｈａｍｂｕｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用して免疫細胞に導入することができる。核酸コンストラクトはまた、ｍＲＮＡトランスフェクション、例えばカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、リポフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクション、または「遺伝子銃」などの微粒子銃導入システムを用いて免疫細胞に導入することができる（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１－７０（２００１）を参照のこと、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
本明細書に記載の核酸コンストラクトを免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）に遺伝子を挿入するために広く使用されるようになっている。ウイルスベクターはまた、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５ｆ３５）、またはアデノ随伴ウイルスに由来し得る（例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。レンチウイルスなどのレトロウイルスベクターは、導入遺伝子の長期かつ安定な組み込み及び娘細胞におけるその増殖が可能になる長期遺伝子導入を達成するための好適なツールである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｖｐｘタンパク質とともにパッケージングされる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開番号ＷＯ２０１７／０４４４８７に記載されているように）。いくつかの実施形態では、Ｖｐｘは、ビリオン関連タンパク質（例えば、ウイルス複製のためのアクセサリータンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、Ｖｐｘタンパク質は、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ－２）によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｖｐｘタンパク質は、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）によってコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、Ｖｐｘタンパク質がパッケージングされたレンチウイルスベクターでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、Ｖｐｘは、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）の少なくとも１つの抗ウイルス因子を阻害する。いくつかの実施形態では、Ｖｐｘタンパク質がパッケージングされたレンチウイルスベクターは、例えば、Ｖｐｘタンパク質がパッケージングされていないレンチウイルスベクターと比較して、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）のトランスフェクション効率の増大を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）に、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、例えば、Ａｄ２ベクターまたはＡｄ５ベクター（例えば、Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスベクター、例えば、ヘルパー依存性Ａｄ５Ｆ３５アデノウイルスベクター））によるトランスフェクションの前に、少なくとも１つのＶＰＸ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションの一方または両方を行う。
本明細書に記載の核酸コンストラクトを免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）に導入するための化学的手段には、コロイド分散システム、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び脂質系システム（例えば、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、ナノ粒子、リポソーム、及びリポフェクタミン－核酸複合体）が含まれる。
本明細書に記載の核酸コンストラクトを導入するための例示的システムは、脂質系システムである。本明細書に記載の核酸コンストラクトは、リポソームの水性内部に封入され、脂質二重層内に散在し、連結分子を介してリポソームに付着し、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体を形成し、脂質を含む溶液または懸濁液に分散され、脂質と混合され、ミセルと複合体を形成し、またはそうでなければ脂質と会合されてもよい。本明細書に記載の方法で使用する脂質は、天然に存在する脂質または合成脂質であり得る。脂質は商業的供給源から入手することもできる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手することができ、ジセチルホスフェートは、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から入手することができ、コレステロールは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロールは、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ．）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の原液は、約－２０℃で保存することができる。
本開示のいくつかの実施形態では、核酸コンストラクトは、ｍＲＮＡであるか、またはｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡは、非修飾または修飾ｍＲＮＡとして合成され得る。通常、ｍＲＮＡは、安定性を高めるために修飾される。ｍＲＮＡの修飾には、例えば、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含めてもよい。したがって、本開示による修飾ｍＲＮＡには、例えば、骨格修飾、糖修飾または塩基修飾を含めてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを修飾するステップは、ｍＲＮＡに修飾ヌクレオチド、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に対する改変、キャップ構造、及び／またはポリ（Ａ）テールを含めることを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ（例えば、外因性サイトカインをコードするｍＲＮＡ、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ、または融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ）は、ＲＮＡ骨格修飾を含み得る。典型的には、骨格修飾は、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾される修飾である。例示的な骨格修飾には、典型的には、メチルホスホネート、メチルホスホルアミデート、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’－Ｏ－（１－チオホスフェート））、ボラノホスフェート、正に荷電したグアニジニウム基など、からなる群からの修飾が含まれるが、これらに限定されず、これは、ホスホジエステル結合を他のアニオン性基、カチオン性基または中性基で置き換えることを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ（例えば、外因性サイトカインをコードするｍＲＮＡ、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ、または融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ）は、糖修飾を含み得る。典型的な糖修飾は、含まれるヌクレオチドの糖の化学修飾であり、２’－デオキシ－２’－フルオロ－オリゴリボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－デオキシ－２’－デアミン－オリゴリボヌクレオチド（２’－アミノ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－Ｏ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン５’－三リン酸、２’－メチルウリジン５’－三リン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、及びその異性体（２’－アラシチジン５’－三リン酸、２’－アラウリジン５’－三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、からなる群から選択される糖修飾が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ（例えば、外因性サイトカインをコードするｍＲＮＡ、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ、または融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ）は、ヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含み得る。塩基修飾を含む修飾ヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドとも呼ばれる。
典型的には、ｍＲＮＡ合成は、Ｎ末端（５’）末端への「キャップ」及びＣ末端（３’）末端への「テール」の付加を含む。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に見られるヌクレアーゼに対する耐性を提供する上で重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役割を果たす。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ（例えば、外因性サイトカインをコードするｍＲＮＡ、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ、または融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ）は、５’キャップ構造を含む。５’キャップは通常、以下のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基の１つを除去し、２つの末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加され、５’三リン酸結合が生成され、グアニンの７－窒素は、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。キャップ構造の例には、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ）及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、キャップはＣａｐ０構造を含む。キャップ０構造は、塩基１及び２に付着したリボースの２’－Ｏ－メチル残基を欠いている。いくつかの実施形態では、キャップはＡＧＣａｐ１構造を含む。ＡＧＣａｐ１構造は、塩基２に２’－Ｏ－メチル残基を有する。いくつかの実施形態では、キャップはＣａｐ２構造を含む。Ｃａｐ２構造は、塩基２及び３の両方に付着した２’－Ｏ－メチル残基を有する。いくつかの実施形態では、キャップ構造は、ＡＧＣａｐ１、ｍ６ＡＧＣａｐ１、または抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ｍＲＮＡは、ｍ６ＡＧＣａｐ１及びシュードウリジン（ＰｓＵ）を含む修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ（例えば、外因性サイトカインをコードするｍＲＮＡ、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ、または融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ）は、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端のポリ（Ａ）テールには、通常、約１０～４００個のアデノシンヌクレオチド（配列番号１７６）（例えば、約１００～４００個のアデノシンヌクレオチド、約１０～２００個のアデノシンヌクレオチド、約１０～１５０個のアデノシンヌクレオチド、約１０～１００個のアデノシンヌクレオチド、約２０～７０個のアデノシンヌクレオチド、または約２０～６０個のアデノシンヌクレオチド）が含まれる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端の好適なポリ（Ｃ）テールには、通常、約１０～２００個のシトシンヌクレオチド（配列番号１７７）（例えば、約１０～１５０個のシトシンヌクレオチド、約１０～１００個のシトシンヌクレオチド、約２０～７０個のシトシンヌクレオチド、約２０～６０個のシトシンヌクレオチド、または約１０～４０個のシトシンヌクレオチド）が含まれる。ポリ（Ｃ）テールは、ポリ（Ａ）テールに付加されてもよいし、ポリ（Ａ）テールの代替物であってもよい。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ（例えば、外因性サイトカインをコードするｍＲＮＡ、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ、または融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ）は、５’及び／または３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を与える１つ以上の要素、例えば、鉄応答要素を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、長さが約５０～５００ヌクレオチドの間であり得る。
いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞内でのｍＲＮＡの位置の安定性に影響を与えるタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、長さが５０～５００ヌクレオチド以上であり得る。
修飾中の免疫細胞の処理及び培養
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、免疫細胞を修飾するプロセス中に免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を処理する１つ以上のステップを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を、インビトロで転写されたｍＲＮＡによって活性化される経路のモジュレーターで処理するステップを含む。インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡは、種々のエンドソーム自然免疫受容体（Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８）及び細胞質自然免疫受容体（プロテインキナーゼＲＮＡ活性化（ＰＫＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉタンパク質（ＲＩＧ－Ｉ）、メラノーマ分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）及び２’－５’－オリゴアデニル酸シンターゼ（ＯＡＳ））によって認識される。これらの異なる経路を介したシグナル伝達は、１型インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＩＬ－１２、及び転写プログラムのカスケードの活性化に関連する炎症を引き起こす。全体として、これらは、特異的免疫応答を誘導する態勢にある炎症誘発性微小環境を作出する。さらに、真核生物の翻訳開始因子２α（ｅＩＦ２α）リン酸化による翻訳の減速、リボヌクレアーゼＬ（ＲＮａｓｅＬ）によるＲＮＡ分解の促進、自己増幅ｍＲＮＡの複製の過剰発現及び阻害などの下流の影響は、薬物動態及びＩＶＴ ｍＲＮＡの薬力学と関連性がある。
いくつかの実施形態では、インビトロで転写されたｍＲＮＡによって活性化される経路のモジュレーターは、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、インビトロで転写されたｍＲＮＡによって活性化される経路のモジュレーターは、ＲＮａｓｅＬ、ＲＮａｓｅ Ｔ２またはＲＮａｓｅ１阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、インビトロで転写されたｍＲＮＡによって活性化される経路のモジュレーターは、ＲＮａｓｅＬ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅＬ阻害剤は、スニチニブを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅＬ阻害剤は、ＡＢＣＥ１を含む。
いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）をＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理すると、ＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理されなかった同じタイプの修飾免疫細胞におけるｍＲＮＡ安定性と比較して、修飾免疫細胞におけるｍＲＮＡ安定性が増加する。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）をＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理すると、ＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理されなかった同じタイプの修飾免疫細胞における外因性サイトカイン発現と比較して、修飾免疫細胞における外因性サイトカイン発現が増加する。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）をＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理すると、ＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理されなかった同じタイプの修飾免疫細胞における融合タンパク質発現と比較して、修飾免疫細胞における融合タンパク質発現が増加する。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）をＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理すると、ＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理されなかった同じタイプの修飾免疫細胞におけるエフェクター活性と比較して、修飾免疫細胞におけるエフェクター活性が増加する。
本開示のいくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を処理するステップは、ｍＲＮＡを免疫細胞に導入するステップの前に行われる。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）をサイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養するステップを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＳＴＮＧＬ、ＬＰＳ、ＣＤ４０アゴニスト、４－１ＢＢリガンド、組換え４－１ＢＢ、ＣＤ１９アゴニスト、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ－１、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－４、ＴＬＲ－５、ＴＬＲ－６、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８またはＴＬＲ－９）、ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、またはＴＧＦ－β３）、糖質コルチコイド、免疫複合体、インターロイキン－１アルファ（ＩＬ－１α）、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２０、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＴＮＦ－β、ＣＤ１５４、リンホトキシンベータ（ＬＴ－β）、Ａ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＴＡＬＬ－１（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３Ｂ－ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦ関連弱アポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦ関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、甲状腺ペルオキシダーゼ前駆体（Ｔｐｏ）、ＦＭＳ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ－３Ｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、メロゾイト表面タンパク質（ＭＳＰ）、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質（ＮＯＤ）リガンド（例えば、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、またはＮＯＤ１／２アゴニスト）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）リガンド（例えば、５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡ、３ｐ－ｈｐＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、またはＰｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ））、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）リガンド（例えば、カードラン、β－グルカン、ＨＫＣＡ、ラミナリン、プスツラン、スクレログルカン、分散性ＷＧＰ、可溶性ＷＧＰ、ザイモザン、ザイモザン劣化、フルフルマン（ｆｕｒｆｕｒｍａｎ）、ｂ－ＧｌｃＣｅｒ、ＧｌｃＣ１４Ｃ１８、ＨＫＭＴ、ＴＤＢ、ＴＤＢ－ＨＳ１５、またはＴＤＭ）、環式ジヌクレオチドセンサーリガンド（例えば、Ｃ－Ｇａｓアゴニストまたはインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）リガンド）、インフラマソーム誘導因子（例えば、ミョウバン、ＡＴＰ、ＣＰＰＤ結晶、ヘモゾイン、ＭＳＵ結晶、ナノＳｉＯ２、ニゲリシン、またはＴＤＢ）、アリール炭化水素（ＡｈＲ）リガンド（例えば、ＦＩＣＺ、インジルビン、ＩＴＥ、またはＬ－キヌレニン）、アルファプロテインキナーゼ１（ＡＬＰＫ１）リガンド、マルチＰＲＲリガンド、ＮＦＫＢ／ＮＦＡＴアクチベーター（例えば、コンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ Ａ）、イオノマイシン、ＰＨＡ－Ｐ、またはＰＭＡ）、またはそれらの組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ－βを含む。
本開示のいくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を培養するステップは、ｍＲＮＡを免疫細胞に導入するステップの後に行われる。
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）をサイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養すると、サイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養されなかった同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、修飾免疫細胞の生存率が増加する。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）をサイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養すると、サイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養されなかった同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、修飾免疫細胞のタンパク質（例えば、外因性サイトカイン、ＣＡＲ、または融合タンパク質）発現が増加する。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）をサイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養すると、サイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養されなかった同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、タンパク質（例えば、外因性サイトカイン、ＣＡＲ、または融合タンパク質）発現の寿命が延伸する。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）をサイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養すると、サイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養されなかった同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、修飾免疫細胞のエフェクター活性が増加する。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）をサイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養すると、サイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養されなかった同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、修飾免疫細胞の炎症誘発性（Ｍ１）分極化が増大する。
修飾免疫細胞
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、本開示の方法によって作製される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、生存率の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードするｍＲＮＡの発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲ発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードするｍＲＮＡの寿命の延伸を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲの寿命の延伸を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、エフェクター活性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、外因性サイトカイン及び／またはＣＡＲをコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、炎症誘発性（Ｍ１）分極化の増大を示す。
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、本開示の方法によって作製される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する融合タンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、融合タンパク質をコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、生存率の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する融合タンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、融合タンパク質をコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する融合タンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、融合タンパク質をコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して融合タンパク質発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する融合タンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、融合タンパク質をコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡの寿命の延伸を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する融合タンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、融合タンパク質をコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、融合タンパク質の寿命の延伸を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する融合タンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、融合タンパク質をコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、エフェクター活性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する融合タンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、融合タンパク質をコードする未修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、炎症誘発性（Ｍ１）分極化の増大を示す。
アッセイ
免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）における本明細書に記載の核酸コンストラクトの存在を確認するために、様々なアッセイを行うことができる。例えば、そのようなアッセイとしては、サザンブロット法及びノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ等の当業者に周知の分子生物学的アッセイ、ならびに例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法）による特定のペプチドの存在または不在の検出等の生化学的アッセイが挙げられる。本開示の他のアッセイには、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、免疫蛍光顕微鏡法、ＭＳＤサイトカイン分析、質量分析（ＭＳ）、ＲＮＡ－Ｓｅｑ及び機能アッセイが含まれる。
様々なアッセイを実行して、修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）の種々の特徴、例として、限定されるものではないが、免疫細胞の生存率、核酸の発現、核酸の寿命、タンパク質（例えば、外因性サイトカイン、ＣＡＲ、または融合タンパク質）の発現、タンパク質（例えば、外因性サイトカイン、ＣＡＲ、または融合タンパク質）の寿命、エフェクター活性、及び炎症誘発性（Ｍ１）分極化などを決定することができる。例えば、そのようなアッセイとしては、フローサイトメトリー、定量ＰＣＲ、ならびにサイトカイン／ケモカイン分泌、食作用及び目的の腫瘍細胞の特異的な溶解アッセイなどのインビトロ機能アッセイが挙げられる。
外因性サイトカイン
いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、融合タンパク質を含まない。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、少なくとも１つの外因性サイトカイン及び少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。本明細書で使用される場合、「外因性サイトカイン」という用語は、サイトカインをコードする外因性核酸物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の免疫細胞への導入の結果として産生されるサイトカインを指す。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインは、炎症誘発性（Ｍ１）サイトカインであるか、または炎症誘発性（Ｍ１）サイトカインを含む。いくつかの実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、もしくはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、もしくはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、またはＧＭ－ＣＳＦであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインは、抗炎症性（Ｍ２）サイトカインであるか、または抗炎症性（Ｍ２）サイトカインを含む。いくつかの実施形態では、抗炎症性サイトカインは、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、またはＴＧＦ－βであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、もしくはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、もしくはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、またはＴＧＦ－βであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、表１から選択されるものである。
いくつかの実施形態では、本発明の外因性サイトカインは、内因性サイトカインと同じ直鎖アミノ酸配列（例えば、表２ａ及び表２ｂの配列）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の外因性サイトカインは、操作されたアミノ酸配列（例えば、表６の配列）を含むサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、操作されたサイトカインアミノ酸配列は、内因性サイトカイン配列に由来する。
いくつかの実施形態では、外因性サイトカインは、環状順列であるか、または環状順列を含む。環状順列とは、アミノ酸のセクションが並び替えられて、内因性タンパク質の中央部分のアミノ酸領域が代わりにＮ末端またはＣ末端に位置するようなタンパク質のバージョンであるが、その結果生じたタンパク質は、内因性タンパク質と類似した全体的な３次元形状を保っている。いくつかの実施形態では、サイトカインの環状順列を含む外因性サイトカインは、内因性サイトカインと同じ直鎖アミノ酸配列を含む外因性サイトカインと比較して、サイトカインとその対応するサイトカイン受容体との結合が強くなるであろう。いくつかの実施形態では、サイトカインの環状順列を含む外因性サイトカインは、内因性サイトカインと同じ直鎖アミノ酸配列を含む外因性サイトカインと比較して、シグナル伝達が増加するであろう。いくつかの実施形態では、本発明の外因性サイトカインは、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、またはＩＬ－１３の環状順列を含む。
いくつかの実施形態では、外因性サイトカインは、単鎖サイトカインであるか、または単鎖サイトカインを含む。本明細書で使用される場合、単鎖サイトカインは、互いに融合されたサイトカインの２つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、単鎖サイトカインにおけるサイトカインの２つ以上のコピーは、リンカーによって分離される。いくつかの実施形態では、単鎖サイトカインにより、本開示の外因性サイトカインは、その対応するサイトカイン受容体に結合するときに多量体として作用する内因性サイトカインを模倣することができる。いくつかの実施形態では、本発明の外因性サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、またはＩＬ－１０の２つ以上のコピーを含む単鎖サイトカインを含む。
いくつかの実施形態では、外因性サイトカインは、単量体サイトカインであるか、または単量体サイトカインを含む。本明細書で使用される場合、単量体サイトカインは、その対応するサイトカイン受容体に結合するために、多量体化（例えば、二量体化または三量体化）する必要がないように操作されている。いくつかの実施形態では、本発明の外因性サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、またはＩＬ－１０の操作されたバージョンを含む単量体サイトカインを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表４ａ、表４ｂ、または表７から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表４ａ、表４ｂ、または表７から選択される配列と少なくとも８５％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表４ａ、表４ｂ、または表７から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表４ａ、表４ｂ、または表７から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表４ａ、表４ｂ、または表７から選択される配列と少なくとも９６％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表４ａ、表４ｂ、または表７から選択される配列と少なくとも９７％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表４ａ、表４ｂ、または表７から選択される配列と少なくとも９８％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表４ａ、表４ｂ、または表７から選択される配列と少なくとも９９％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の外因性サイトカインは、表４ａ、表４ｂ、または表７から選択される配列と同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。
融合タンパク質
「融合タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、サイトカインがそのテザー受容体に分子内結合して、下流シグナル伝達を誘導できるように、その対応する受容体サブユニットのうち少なくとも１つに融合されたサイトカインを含む人工キメラタンパク質を指す。融合タンパク質は、例えば、養子細胞移入による治療剤として使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、及び／または樹状細胞）は、患者から（例えば、血液、腫瘍または腹水から）取り出され、融合タンパク質を発現するように修飾される。いくつかの実施形態では、このような修飾免疫細胞は、次に、治療剤として同じ患者または異なる患者に再導入される。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上のサイトカイン、１つ以上のリンカー、及び１つ以上のサイトカイン受容体のうち１つ以上を含み得る（図１を参照）。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、膜結合している。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、膜結合していない。
実施形態では、本開示の融合タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、サイトカイン、リンカー、及びサイトカイン受容体を含む（図２を参照）。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、サイトカインとサイトカイン受容体との間にリンカーを含む。本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、本開示の融合タンパク質においてポリペプチド鎖でサイトカインをサイトカイン受容体に結合するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大３００個のアミノ酸、好ましくは、５～１００個のアミノ酸、及び最も好ましくは５～３０個のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質を含む免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、１つ以上の制御システムを含み得、そのような制御システムとしては、安全スイッチ（例えば、オンスイッチ、オフスイッチ、自殺スイッチ）、転写制御（例えば、細胞特異的プロモーター、細胞状態特異的プロモーター、融合タンパク質活性化の下流プロモーター、内因性シグナル伝達経路の下流プロモーター、または薬物誘導性転写）、融合タンパク質ｍＲＮＡの転写後制御（例えば、内因性もしくは組換えｍｉＲＮＡによるＲＮＡベースの阻害）、または融合タンパク質構造または安定性の翻訳後制御（例えば、薬物／光誘導性会合（シグナル伝達を可能にする）もしくは解離（シグナル伝達を阻害する）によってその細胞内ドメインが完全構造物と条件付きで会合する融合タンパク質、または誘導安定化（シグナル伝達を可能にする）または分解（シグナル伝達を阻害する）のために薬物によってその安定性が調節された融合タンパク質）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの制御システムは、論理ゲート、例えば、ＡＮＤゲート（例えば、薬物依存的な方法で会合し、ゆえに融合タンパク質活性化及び小分子の存在を必要とする融合タンパク質誘導性プロモーター及び細胞質ゾルドメインを有する融合タンパク質）、ＯＲゲート（例えば、融合タンパク質活性化または小分子追加のいずれかの後に転写によって活性化するプロモーターの制御下にある融合タンパク質）、及び／またはＮＯＴゲート（例えば、天然の免疫細胞シグナル伝達状態で発現する内因性ｍｉＲＮＡによってそのｍＲＮＡが分解される融合タンパク質（特定のサイトカインシグナル伝達経路によってアップレギュレートし、ゆえにこのサイトカインの不在下でのみ融合タンパク質が発現するｍｉＲＮＡなど））を作成するために組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞、例えば、修飾された幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞は、その中で融合タンパク質を発現することによって生成される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、サイトカイン、リンカー、及びサイトカイン受容体を含む融合タンパク質を含み、ここで、免疫細胞は、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞を含み、かつサイトカインは、サイトカイン受容体に結合する。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表１から選択されるサイトカイン、及び表１の同じ行から選択される対応する受容体１を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表１から選択されるサイトカイン、及び表１の同じ行から選択される対応する受容体２／共受容体を含む。
Figure 2024505564000002
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、リンカー、及びインターロイキン－１０受容体（ＩＬ１０Ｒ）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）、リンカー、及びインターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）を含む。
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む。
本開示はまた、融合タンパク質をコードする核酸配列（例えば、単離された核酸配列）を含む免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）であって、該核酸配列は、サイトカインをコードする核酸配列、リンカーをコードする核酸配列、及びサイトカイン受容体をコードする核酸配列を含み、該細胞は、融合タンパク質を発現する幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞である、免疫細胞も提供する。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）での発現のために、サイトカイン受容体などの融合タンパク質の別のドメインに作動可能に連結されたサイトカインを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）の表面で発現する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、サイトカイン産生、遺伝子発現変化、細胞表面マーカー、及び／または機能アッセイによって示されるような、炎症誘発性表現型を誘導する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、サイトカイン産生、遺伝子発現変化、細胞表面マーカー、及び／または機能アッセイによって示されるような、抗炎症性表現型を誘導する。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表９から選択される配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表９から選択される配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表９から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表９から選択される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表９から選択される配列と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表９から選択される配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表９から選択される配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表９から選択される配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表９から選択される配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表１０から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表１０から選択される配列と少なくとも８５％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表１０から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表１０から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表１０から選択される配列と少なくとも９６％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表１０から選択される配列と少なくとも９７％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表１０から選択される配列と少なくとも９８％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表１０から選択される配列と少なくとも９９％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表１０から選択される配列と同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、長い期間をかけて炎症誘発性表現型を維持する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、融合タンパク質をコードする核酸で免疫細胞が修飾された後、少なくとも４時間、２日、４日、７日、１４日、及び／または２８日、炎症誘発性表現型を維持する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、可溶性サイトカインによる事前処理によって誘導された免疫細胞よりも長く炎症誘発性表現型を維持する。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、長い期間をかけて抗炎症性表現型を維持する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、融合タンパク質をコードする核酸で免疫細胞が修飾された後、少なくとも４時間、２日、４日、７日、１４日、及び／または２８日、抗炎症性表現型を維持する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、可溶性サイトカインによる事前処理によって誘導された免疫細胞よりも長く抗炎症性表現型を維持する。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、炎症誘発性表現型を維持し、及び／または抗炎症性サイトカインによって誘発される場合の破壊に抵抗する。いくつかの実施形態では、環境サイトカインに対する修飾免疫細胞の感受性は、炎症誘発性融合タンパク質を含む修飾免疫細胞を抗炎症性サイトカインの濃度を増加させて処理することによる炎症誘発性マーカーの用量反応曲線を作成することによって測定される。いくつかの実施形態では、環境サイトカインに対する修飾免疫細胞の感受性は、炎症誘発性融合タンパク質を含む修飾免疫細胞を炎症誘発性サイトカインの濃度を増加させて処理することによる炎症誘発性マーカーの用量反応曲線を作成することによって（例えば、ＩＦＮ－β融合タンパク質を含む修飾免疫細胞に対する可溶性ＩＦＮ－βの影響を定量化することによって）測定される。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、抗炎症性表現型を維持し、及び／または炎症誘発性サイトカインによって誘発される場合の破壊に抵抗する。いくつかの実施形態では、環境サイトカインに対する修飾免疫細胞の感受性は、抗炎症性融合タンパク質を含む修飾免疫細胞を炎症誘発性サイトカインの濃度を増加させて処理することによる抗炎症性マーカーの用量反応曲線を作成することによって測定される。いくつかの実施形態では、環境サイトカインに対する修飾免疫細胞の感受性は、抗炎症性融合タンパク質を含む修飾免疫細胞を抗炎症性サイトカインの濃度を増加させて処理することによる抗炎症性マーカーの用量反応曲線を作成することによって（例えば、ＩＬ－１０融合タンパク質を含む修飾免疫細胞に対する可溶性ＩＬ－１０の影響を定量化することによって）測定される。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、周囲の細胞に対して最小限の影響を有する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）の未修飾細胞（例えば、本開示の融合タンパク質を含んでいない免疫細胞）に対する影響は、修飾免疫細胞を未修飾免疫細胞と共培養して、フローサイトメトリーを使用して未修飾細胞での炎症誘発性マーカー及び抗炎症性マーカーの発現を分析することによって試験することができる。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞及び未修飾免疫細胞は、修飾免疫細胞と未修飾免疫細胞とが互いに接触する培養皿内で共培養することができる。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞及び未修飾免疫細胞は、修飾免疫細胞と未修飾免疫細胞とがトランスウェルアッセイ膜で分離された培養皿内で共培養することができる。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞の未修飾免疫細胞に対する影響の試験向けの陽性対照は、本開示の融合タンパク質の代わりに、拡散して周囲の細胞を刺激する可能性のある可溶性サイトカインを発現する修飾免疫細胞を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、周囲の細胞に対して最小限の細胞傷害効果を有する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質を含むように免疫細胞を修飾することは、修飾免疫細胞に対して細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞からのＲＮＡｓｅｑデータを検査して、細胞傷害効果を示す遺伝子のアップレギュレーションが存在するかどうかを判定する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲも含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）における本開示の融合タンパク質の発現は、ＣＡＲを含むが融合タンパク質を含まない修飾免疫細胞と比較して、修飾免疫細胞の目的のエフェクター機能（例えば、食作用、標的細胞傷害、抗原提示、またはサイトカイン分泌）を低下させない。いくつかの実施形態では、ＣＡＲも含む修飾免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）における本開示の融合タンパク質の発現は、ＣＡＲを含むが融合タンパク質を含まない修飾免疫細胞と比較して、修飾免疫細胞の目的のエフェクター機能（例えば、食作用、標的細胞傷害、抗原提示、またはサイトカイン分泌）を増加させる。
サイトカイン
本開示は、サイトカインを含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、サイトカインは、炎症誘発性（Ｍ１）サイトカインであるか、または炎症誘発性（Ｍ１）サイトカインを含む。いくつかの実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、もしくはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、もしくはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、またはＧＭ－ＣＳＦであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、抗炎症性（Ｍ２）サイトカインであるか、または抗炎症性（Ｍ２）サイトカインを含む。いくつかの実施形態では、抗炎症性サイトカインは、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、またはＴＧＦ－βであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、もしくはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、もしくはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、またはＴＧＦ－βであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、表１から選択されるものである。
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、内因性サイトカインと同じ直鎖アミノ酸配列（例えば、表２ａ及び表２ｂの配列）を含むサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、操作されたアミノ酸配列（例えば、表６の配列）を含むサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、操作されたサイトカインアミノ酸配列は、内因性サイトカイン配列に由来する。
いくつかの実施形態では、操作されたサイトカインは、環状順列であるか、または環状順列を含む。環状順列とは、アミノ酸のセクションが並び替えられて、内因性タンパク質の中央部分のアミノ酸領域が代わりにＮ末端またはＣ末端に位置するようなタンパク質のバージョンであるが、その結果生じたタンパク質は、内因性タンパク質と類似した全体的な３次元形状を保っている。いくつかの実施形態では、サイトカインの環状順列を含む融合タンパク質は、内因性サイトカインと同じ直鎖アミノ酸配列を含むサイトカインを含む融合タンパク質と比較して、サイトカインとサイトカイン受容体との結合が強くなるであろう。いくつかの実施形態では、サイトカインの環状順列を含む融合タンパク質は、内因性サイトカインと同じ直鎖アミノ酸配列を含むサイトカインを含む融合タンパク質と比較して、シグナル伝達が増加するであろう。いくつかの実施形態では、サイトカインの環状順列を含む融合タンパク質は、内因性サイトカインと同じ直鎖アミノ酸配列を含むサイトカインを含む融合タンパク質と比較して、短いリンカーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、またはＩＬ－１３の環状順列を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたサイトカインは、単鎖サイトカインであるか、または単鎖サイトカインを含む。本明細書で使用される場合、単鎖サイトカインは、互いに融合されたサイトカインの２つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、単鎖サイトカインにおけるサイトカインの２つ以上のコピーは、リンカーによって分離される。いくつかの実施形態では、単鎖サイトカインにより、本開示の融合タンパク質は、サイトカイン受容体に結合するときに多量体として作用する内因性サイトカインを模倣することができる。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、またはＩＬ－１０の２つ以上のコピーを含む単鎖サイトカインを含む。
いくつかの実施形態では、操作されたサイトカインは、単量体サイトカインであるか、または単量体サイトカインを含む。本明細書で使用される場合、単量体サイトカインは、その対応するサイトカイン受容体に結合するために、多量体化（例えば、二量体化または三量体化）する必要がないように操作されている。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、またはＩＬ－１０の操作されたバージョンを含む単量体サイトカインを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表２ａ、表２ｂ、または表６から選択される配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表４ａ、表４ｂまたは表７から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表４ａ、表４ｂまたは表７から選択される配列と少なくとも８５％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表４ａ、表４ｂまたは表７から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表４ａ、表４ｂまたは表７から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表４ａ、表４ｂまたは表７から選択される配列と少なくとも９６％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表４ａ、表４ｂまたは表７から選択される配列と少なくとも９７％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表４ａ、表４ｂまたは表７から選択される配列と少なくとも９８％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表４ａ、表４ｂまたは表７から選択される配列と少なくとも９９％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表４ａ、表４ｂまたは表７から選択される配列と同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。
リンカー
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、サイトカインとサイトカイン受容体との間にリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、可動性リンカーある。いくつかの実施形態では、可動性リンカーは、非極性（例えば、セリンもしくはスレオニン）または極性（例えば、グリシン）のいずれかの小型のアミノ酸を主に含む。いくつかの実施形態では、可動性リンカーは、リンカーの溶解性を改善するために、既知のリンカーと比較して、アミノ酸置換（例えば、リジン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、及び／またはアスパラギン）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーの可動性は、リンカーがらせん状に折りたたまれるか（すなわち、剛構造）、または非構造的（すなわち、可動性）コイルであるかを試験する円偏光二色性分光法を使用して決定される。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、５～５０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、１９～２６個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、２６個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、長さが少なくとも９０オングストロームである。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、またはアラニン（Ａ）から選択されるアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（ここで、ｎ＝１～５である（配列番号１７０））、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー、及びリンカー２６からなる群から選択されるリンカーであるか、またはそれらを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも８０％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも８５％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも９０％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも９５％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも９６％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも９７％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも９８％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも９９％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるリンカー配列と同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。
サイトカイン受容体
本開示は、サイトカイン受容体を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、炎症誘発性（Ｍ１）サイトカイン受容体であるか、または炎症誘発性（Ｍ１）サイトカイン受容体を含む。いくつかの実施形態では、炎症誘発性サイトカイン受容体は、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１Ｒ３、ＩＬ－６Ｒα、ｇｐ１３０、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＩＬ－１７ＲＡ、ＩＬ－１７ＲＢ、ＩＬ－１７ＲＣ、ＩＬ－２３Ｒ、ＣＳＦ２－Ｒα、またはＣＳＦ２－Ｒβであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、抗炎症性（Ｍ２）サイトカイン受容体であるか、または抗炎症性（Ｍ２）サイトカイン受容体を含む。いくつかの実施形態では、抗炎症性サイトカイン受容体は、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－４Ｒα１、ＩＬ－２Ｒγｃ、ＩＬ－１０Ｒ１、ＩＬ－１０Ｒ２、ＩＬ－１３Ｒα１、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ、ＣＳＦ１－Ｒ、ＴＧＦ－βＲ１、またはＴＧＦ－βＲ２であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１Ｒ３、ＩＬ－６Ｒα、ｇｐ１３０、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＩＬ－１７ＲＡ、ＩＬ－１７ＲＢ、ＩＬ－１７ＲＣ、ＩＬ－２３Ｒ、ＣＳＦ２－Ｒα、ＣＳＦ２－Ｒβ、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－４Ｒα１、ＩＬ－２Ｒγｃ、ＩＬ－１０Ｒ１、ＩＬ－１０Ｒ２、ＩＬ－１３Ｒα１、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ、ＣＳＦ１－Ｒ、ＴＧＦ－βＲ１、またはＴＧＦ－βＲ２であるか、またはそれらを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、内因性サイトカインと同じ直鎖アミノ酸配列（例えば、表３ａ及び表３ｂの配列）を含むサイトカイン受容体を含む。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、操作されたアミノ酸配列を含むサイトカイン受容体を含む。いくつかの実施形態では、操作されたサイトカインアミノ酸配列は、内因性サイトカイン配列に由来する。
ＩＦＮ－β及びＩＬ－１０を含む多くのサイトカインは、ヘテロ二量体受容体複合体を介してシグナル伝達する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、サイトカイン及びいずれかのサイトカイン受容体サブユニットを含む（表１を参照）。いくつかの実施形態では、本開示のサイトカインは、そのテザー受容体サブユニット（融合タンパク質中にサイトカインとともに含まれる受容体サブユニット）に結合し、その後、内因的に発現する第２の受容体サブユニットを引き寄せる。例えば、ＩＦＮ－β及びＩＦＮＡＲ－１を含む融合タンパク質は、内因性ＩＦＮＡＲ－２を引き寄せるであろう。あるいは、ＩＦＮ－β及びＩＦＮＡＲ－２を含む融合タンパク質は、内因性ＩＦＮＡＲ－１を引き寄せるであろう。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、サイトカイン、及び両方の受容体サブユニット（例えば、表１から選択されるサイトカイン、及び表１の同じ行の受容体１及び受容体２の両方）を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン及び両方の受容体サブユニットを含む本開示の融合タンパク質は、受容体サブユニット間に切断可能リンカーをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表３ａまたは表３ｂから選択される配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表３ａまたは表３ｂから選択される配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表３ａまたは表３ｂから選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表３ａまたは表３ｂから選択される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表３ａまたは表３ｂから選択される配列と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表３ａまたは表３ｂから選択される配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表３ａまたは表３ｂから選択される配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表３ａまたは表３ｂから選択される配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表３ａまたは表３ｂから選択される配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表５ａまたは表５ｂから選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表５ａまたは表５ｂから選択される配列と少なくとも８５％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表５ａまたは表５ｂから選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表５ａまたは表５ｂから選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表５ａまたは表５ｂから選択される配列と少なくとも９６％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表５ａまたは表５ｂから選択される配列と少なくとも９７％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表５ａまたは表５ｂから選択される配列と少なくとも９８％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表５ａまたは表５ｂから選択される配列と少なくとも９９％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表５ａまたは表５ｂから選択される配列と同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。
シグナルペプチド
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、Ｎ末端にシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸は、シグナルペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトシグナルペプチドであるか、またはヒトシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のシグナルペプチドは、膜発現タンパク質または膜分泌性タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、本開示のシグナルペプチドは、膜発現サイトカインまたは膜分泌性サイトカインに由来する。いくつかの実施形態では、本開示のシグナルペプチドは、改変タンパク質の細胞膜局在化をもたらす任意のシグナルペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８シグナルペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも８５％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも９０％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも９５％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも９６％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも９７％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも９８％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも９９％同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と同一である配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞上で発現するように操作され、細胞を特異的に標的とし、及び／または抗原に結合する人工細胞表面受容体を指す。ＣＡＲは、例えば、養子細胞移入による治療として使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、及び／または樹状細胞）は、患者から（例えば、血液、腫瘍または腹水から）取り出され、特定の形態の抗原に特異的な受容体を発現するように修飾される。いくつかの実施形態では、このような修飾免疫細胞は、次に、治療剤として同じ対象または異なる対象に再導入される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原、例えば腫瘍関連抗原に対して特異的に発現している。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞、例えば、修飾された幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞は、その中でＣＡＲを発現することによって生成される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＣＡＲを含み、免疫細胞は、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞外リーダードメイン、１つ以上の細胞外ヒンジドメイン、及び１つ以上の細胞内共刺激ドメインのうちの１つ以上をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサードメインまたはヒンジを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞内ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサードメインまたはヒンジを含む。本明細書で使用する場合、「スペーサードメイン」または「ヒンジ」という用語は、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の細胞外ドメインまたは細胞内ドメインのいずれかに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、スペーサードメインまたはヒンジは、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーは、好ましくは長さが２～１０の間のアミノ酸であり、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間の連結を形成し得る。リンカーの例には、グリシン－セリンダブレットが含まれる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを含む免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、安全スイッチ（例えば、オンスイッチ及びオフスイッチ、自殺スイッチ）、論理ゲート、例えば、ＡＮＤゲート（例えば、２つ以上のＣＡＲであって、そのそれぞれが１つ以上のシグナル伝達ドメインを欠いているため、完全な免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）の活性化または機能には、両方／すべてのＣＡＲの活性化が必要であるもの）、ＯＲゲート（例えば、２つ以上のＣＡＲであって、そのそれぞれがＣＤ３ζ及び共刺激ドメインなどの細胞内ドメインを有するもの）、及び／またはＮＯＴゲート（例えば、２つ以上のＣＡＲであって、そのうち１つがもう１つのＣＡＲ（複数可）の機能に拮抗する阻害ドメインを含むもの）を含むがこれらに限定されない１つ以上の制御システムを含み得る。
本開示はまた、ＣＡＲをコードする核酸配列（例えば、単離された核酸配列）を含む免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）であって、該核酸配列は、細胞外ドメインをコードする核酸配列、膜貫通ドメインをコードする核酸配列、及び細胞内ドメインをコードする核酸配列を含み、該細胞は、ＣＡＲを発現する幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞である、免疫細胞も提供する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、免疫細胞での発現のために、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインなどのＣＡＲの別のドメインに作動可能に連結された細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインをコードする核酸は、膜貫通ドメインをコードする核酸に作動可能に連結され、膜貫通ドメインをコードする核酸は、細胞内ドメインをコードする核酸に作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを含む免疫細胞のエフェクター活性は、ＣＡＲの抗原結合ドメインに特異的に結合する抗原を含む標的細胞に対して指向される。いくつかの実施形態では、標的細胞に対して指向される標的エフェクター活性は、食作用、標的細胞傷害、抗原提示、またはサイトカイン分泌であるか、またはそれらを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）における抗食作用シグナル伝達を阻害する少なくとも１つのドメイン（例えば、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／または細胞内ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、例えば、ＣＤ４７及び／またはＳＩＲＰα活性の阻害を増強することにより、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）のエフェクター活性を改善する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、例えば、ＣＤ４７に結合し、ドミナントネガティブ受容体として働き、ＳＩＲＰα活性を阻害する（例えば、ＣＤ４７シンク）。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαに結合する本明細書に記載のＣＡＲは、例えば、活性化受容体を含む（例えば、ＣＤ３ｚ細胞内ドメインを含む）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの少なくとも１つの相互作用を阻害する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、食作用論理ゲートであるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、本明細書に記載の外因性サイトカイン、融合タンパク質、及び／またはＣＡＲを含むまたは発現する）は、ＳＩＲＰα（例えば、ドミナントネガティブＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαの高親和性改変バリアント（例えば、ＣＶ１））、５Ｆ９ ｓｃＦｖ、Ｂ６Ｈ１２ ｓｃＦｖ（例えば、ヒト化Ｂ６Ｈ１２ ｓｃＦｖ）、ＰＤ１（例えば、ドミナントネガティブＰＤ１またはＨＡＣ－Ｉ）、抗ＰＤ１ ｓｃＦｖ（例えば、Ｅ２７またはデュルバルマブ）、Ｓｉｇｌｅｃ－１０、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１１、及び／またはＳＨＰ－１、のうちの少なくとも１つのバリアントまたは断片を含むか、または発現する。いくつかの実施形態では、バリアントまたは断片は、変異細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、バリアントまたは断片は、少なくとも１つの細胞内ドメインを含まないまたは発現しない（例えば、免疫細胞は、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジドメイン、及びＣＤ８膜貫通を含むまたは発現する）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、本明細書に記載の外因性サイトカイン、融合タンパク質、及び／またはＣＡＲを含むまたは発現する）は、例えば阻害チェックポイントをブロックするドミナントネガティブ受容体を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ及び／またはＴ２Ａペプチド）と、抗食作用シグナル伝達の少なくとも１つの阻害ドメインを含む少なくとも１つの第２のＣＡＲとをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２のＣＡＲは、ＳＩＲＰα（例えば、ＳＩＲＰαの高親和性改変バリアント（例えば、ＣＶ１））、５Ｆ９ ｓｃＦｖ、Ｂ６Ｈ１２ ｓｃＦｖ（例えば、ヒト化Ｂ６Ｈ１２ ｓｃＦｖ）、またはＣＤ４７結合細胞外ドメインまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２のＣＡＲは、ＳＩＲＰα膜貫通ドメインまたはその断片を含む。特定の実施形態では、第２のＣＡＲは、ヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８ヒンジドメイン）をさらに含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの第２のＣＡＲは、（ｉ）リーダー配列（例えば、ＣＤ８リーダー）、ｉｉ）細胞外ドメイン（例えば、ＳＩＲＰα、ＣＶ１、５Ｆ９ ｓｃＦｖ、またはＢ６Ｈ１２ ｓｃＦｖ（例えば、ヒト化Ｂ６Ｈ１２ ｓｃＦｖ）細胞外ドメイン）、及びｉｉ）膜貫通ドメイン（例えば、ＳＩＲＰα膜貫通ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａペプチド）及び少なくとも１つのマーカータンパク質（例えば、ＣＤ２０またはその断片、ＣＤ１９またはその断片、ＮＧＦＲまたはその断片、合成ペプチド、及び／または蛍光タンパク質）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、本明細書に記載の外因性サイトカイン、融合タンパク質、及び／またはＣＡＲを含むまたは発現する）は、１つ以上のホスファターゼデッド（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｄｅａｄ）ドメイン（例えば、ホスファターゼデッドＳｈｐ１、ホスファターゼデッド７２－５ｐｔａｓｅ（ＩＮＰＰ５Ｅ）、ホスファターゼデッドＳｈｐ２、及び／またはホスファターゼデッドＳＨＩＰ－１ドメイン）及び／または構成的に活性なキナーゼドメイン（例えば、構成的に活性なＬＹＮドメイン）を含むまたは発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ及び／またはＴ２Ａペプチド）及び１つ以上のホスファターゼデッド（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｄｅａｄ）ドメイン（例えば、ホスファターゼデッドＳｈｐ１、ホスファターゼデッド７２－５ｐｔａｓｅ（ＩＮＰＰ５Ｅ）、ホスファターゼデッドＳｈｐ２、及び／またはホスファターゼデッドＳＨＩＰ－１ドメイン）及び／または構成的に活性なキナーゼドメイン（例えば、構成的に活性なＬＹＮドメイン）をさらに含む。
細胞外ドメイン
本開示は、細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、リーダードメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ細胞外ドメイン、リーダードメイン、抗原結合ドメイン、及びヒンジドメインのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。
ＦｃＲ細胞外ドメイン
いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、全長ＦｃＲ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、全長ＦｃＲ細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメイン（またはその一部）は、ヒトＦｃＲ細胞外ドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、またはＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）ドメインを含む。
ＴＬＲ細胞外ドメイン
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、全長ＴＬＲ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、全長ＴＬＲ細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメイン（またはその一部）は、ヒトＴＬＲ細胞外ドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９ドメインを含む。
リーダードメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞外リーダードメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、細胞外リーダードメインをコードする核酸配列を含むが、細胞外リーダードメインは、ＣＡＲが免疫細胞内で発現する前にＣＡＲから切断される。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、ヒト細胞外リーダードメインであるか、またはヒト細胞外リーダードメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、ＣＤ８細胞外リーダードメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、刺激または共刺激ドメイン由来のリーダードメインを含む（例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ１、ＩＮＳＲ、ｃＭＥＴ、ＭＵＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＲＥＴ、ＲＯＲ１、ＲＯＳ１、ＲＹＫ、ＴＩＥ２、ＴＲＫ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＲＥＭ－１、ＴＲＥＭ－２、ＤＡＰ１２、ＭＲ、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８ドメイン）。
抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば標的細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、自己免疫疾患、及び／またはがん細胞に関連する抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する抗原を認識する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、目的の腫瘍またはがんに特異的な抗原などの腫瘍抗原に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、１つ以上の抗原がんエピトープを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９及び１９Ａ２４とも称される）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１またはＣＬＥＣＬ１）、ＣＤ３３、上皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）、Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））、プロテアーゼ特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２（ＩＬ－１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）、メソテリン、インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プロテアーゼセリン２１（テスチシン（Ｔｅｓｔｉｓｉｎ）またはＰＲＳＳ２１）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイス（Ｙ）抗原、ＣＤ２４、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－β）、ステージ特異的胎児抗原－４（ＳＳＥＡ－４）、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、受容体チロシン－プロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、プロスターゼ（Ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、切断点クラスター領域（ＢＣＲ）及びエーベルソンマウス白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなるがん遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）、チロシナーゼ、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）、ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）、トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、葉酸受容体ベータ、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連物（ＴＥＭ７Ｒ）、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ポリシアル酸、胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）、ｇｌｏｂｏＨグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分、乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）、ウロプラキン２（ＵＰＫ２）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）、パンネキシン３（ＰＡＮＸ３）、Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）、リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）、嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）、ＴＣＲ γ選択的リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）、黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異体遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）、精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）、Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）、アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）、黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）、黒色腫癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）、Ｆｏｓ関連抗原１、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ｐ５３突然変異体、プロステイン、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）、テロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１またはガレクチン８）、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原（メランＡまたはＭＡＲＴ１）、ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、肉腫転座切断点、アポトーシスの黒色腫阻害因子（ＭＬ－ＩＡＰ）、ＥＲＧ（膜貫通型プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）、Ｎ－アセチルグルコサミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）、ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）、ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳまたはＢｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｓｉｔｅｓ）、Ｔ細胞３によって認識される扁平上皮細胞癌抗原（ＳＡＲＴ３）、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）、プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）、Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）、滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ－１）、腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）、腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）、レグマイン、ヒト乳頭腫ウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）、ヒト乳頭腫ウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）、腸管カルボキシルエステラーゼ、熱ショックタンパク質７０－２突然変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、または免疫グロブリンλ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）、を含む。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）を含む。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＰＳＭＡを含む。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、メソセリンを含む。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ミスフォールドタンパク質抗原またはタンパク質凝集体のタンパク質、例として目的の疾患／障害に特異的なタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、疾患／障害は、神経変性疾患／障害、炎症性疾患／障害、心血管疾患／障害、線維性疾患／障害、またはアミロイドーシス（例えば、免疫グロブリン軽鎖またはトランスサイレチンのタンパク質凝集体によって媒介される）である。いくつかの実施形態では、神経変性疾患／障害は、タウオパチー、アシンヌクレオパチー、初老期認知症、老人性認知症、アルツハイマー病（ベータアミロイドのタンパク質凝集体によって媒介される）、第１７染色体に関連するパーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ピック病、原発性進行性失語症、前頭側頭型認知症、皮質基底型認知症、パーキンソン病、認知症を伴うパーキンソン病、レビー小体型認知症、ダウン症候群、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハラーフォルデン・シュパッツ症候群、ポリグルタミン病、トリヌクレオチドリピート病、家族性英国型認知症、致死性家族性不眠症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（アイスランド型）（ＨＣＨＷ Ａ－Ｉ）、散発性致死性不眠症（ｓＦＩ）、可変プロテアーゼ感受性プリオン病（ＶＰＳＰｒ）、家族性デンマーク型認知症、及びプリオン病（クロイツフェルト・ヤコブ病、ＣＪＤ、バリアント・クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）など）、からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意のドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、またはそれらの任意の断片、例えばｓｃＦｖであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、アプタマー、ダーピン（ｄａｒｐｉｎ）、センチリン（ｃｅｎｔｙｒｉｎ）、天然に存在する受容体もしくは合成受容体、アフィボディ、または他の改変タンパク質認識分子であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、哺乳動物抗体もしくはその断片であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、全体的または部分的に、ＣＡＲが最終的に使用される同じ種に由来する。例えば、ヒトで使用する場合、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはその断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、２つ以上の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、１つ以上の抗原結合ドメインを含む２つ以上の異なるＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲを含む、及び／または１つ以上の抗原結合ドメインを含む２つ以上の異なるＣＡＲを含む免疫細胞は、２つの抗原が存在することを必要とすることによって、オフターゲット及び／またはオンターゲット組織外効果を低減することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、二重特異性ＣＡＲを含み、及び／または１つ以上の抗原結合ドメインを含む２つ以上の異なるＣＡＲを含み、この場合、ＣＡＲは、単独では修飾細胞の活性化を媒介するには不十分であるが、一緒になると相乗的であり、修飾細胞の活性化を刺激する別個のシグナルを提供する。いくつかの実施形態では、そのような構成は、「ＡＮＤ」論理ゲートと称してもよい。
いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲを含む、及び／または１つ以上の抗原結合ドメインを含む２つ以上の異なるＣＡＲを含む免疫細胞は、細胞の活性が刺激される前に、１つの抗原が存在し、第２の正常なタンパク質抗原は存在しないことを必要とすることによって、オフターゲット及び／またはオンターゲット組織外効果を低減することができる。いくつかの実施形態では、そのような構成は、「ＮＯＴ」論理ゲートと呼んでもよい。ＡＮＤゲートとは対照的に、ＮＯＴゲートＣＡＲ修飾細胞は、単一の抗原に結合することによって活性化される。しかし、第２の受容体の第２の抗原への結合は、ＣＡＲを介して永続化されている活性化シグナルを無効化するように機能する。典型的には、そのような阻害受容体は、正常組織では豊富に発現するが腫瘍組織には存在しない抗原を標的とする。
ヒンジドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞外ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ヒンジドメインは、ヒト細胞外ヒンジドメインであるか、またはヒト細胞外ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ヒンジドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞外ヒンジドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞外ヒンジドメインは、ＣＤ８ａ細胞外ヒンジドメインまたはＩｇＧ４もしくはＣＤ２８細胞外ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ヒンジドメインは、例えば、腫瘍抗原に対する最適なサイズ（例えば、阻害分子の排除を可能にする）、最適な柔軟性、最適なタンパク質フォールディング、最適なタンパク質の安定性、最適な結合、最適なホモ二量体化、及び／またはホモ二量体化の欠如など、ＣＡＲの物理化学的パラメーターを最適化する。
膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば、細胞外ドメインを細胞内ドメインに接続する膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの１つ以上の他のドメイン（複数可）と天然で関連している。いくつかの実施形態では、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、膜貫通ドメインを修飾して、他の表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避することができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然に存在する源または合成源のいずれかに由来し得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然に存在する膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒト膜貫通ドメインであるか、またはヒト膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ、ＴＲＬ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＲＬ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ１、ＩＮＳＲ、ｃＭＥＴ、ＭＵＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＲＥＴ、ＲＯＲ１、ＲＯＳ１、ＲＹＫ、ＴＩＥ２、ＴＲＫ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＲＥＭ－１、ＴＲＥＭ－２、ＤＡＰ１２、ＭＲ、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲγ、Ｖ／Ｉ／ＬｘＹｘｘＬ／Ｖ、ＳＩＲＰα、ＣＤ４５、Ｓｉｇｌｅｃ－１０、ＰＤ１、ＳＨＰ－１、ＳＨＰ－２、ＫＩＲ－２ＤＬ、ＫＩＲ－３ＤＬ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ１７０、ＣＤ３３、ＢＴＬＡ、ＣＤ３２ｂ、ＳＩＲＰβ、ＣＤ２２、ＰＩＲ－Ｂ、ＬＩＬＲＢ１、ＣＤ３６、またはＳｙｋ膜貫通ドメインを含む。
ＦｃＲ膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、全長ＦｃＲ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、全長ＦｃＲ膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、ヒトＦｃＲ膜貫通ドメインもしくはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、またはＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）ドメインを含む。
ＴＬＲ膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、全長ＴＬＲ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、全長ＴＬＲ膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、ヒトＴＬＲ膜貫通ドメインもしくはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９ドメインを含む。
細胞内ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ヒト細胞内ドメインもしくはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメイン及び／または他の細胞質ドメインは、ＣＡＲが発現する細胞（例えば、免疫細胞）の活性化に関与する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、当該ＣＡＲを含む免疫細胞におけるシグナル活性化及び／または伝達に関与する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、シグナル活性化及び／または伝達に関与する少なくとも１つのドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、共刺激分子及びシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つであるか、またはそれらのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、二重シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、３つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、表面受容体の細胞質部分を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは共刺激分子を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、免疫細胞においてシグナル伝達を開始するように作用する分子を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、１つ以上の共刺激分子、例として、ＣＤ３由来の少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、ＦｃイプシロンＲＩガンマ鎖、その任意の誘導体またはバリアント、同じ機能的能力を有するそれらの任意の合成配列、及びそれらの任意の組み合わせ、の任意の部分を含む。
ＦｃＲ細胞内ドメイン
いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、全長ＦｃＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、全長ＦｃＲ細胞内ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、ヒトＦｃＲ細胞内ドメインまたはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、またはＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）ドメインを含む。
ＴＬＲ細胞内ドメイン
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、全長ＴＬＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、全長ＴＬＲ細胞内ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、ヒトＴＬＲ細胞内ドメインもしくはその一部であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９ドメインを含む。
シグナル伝達ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、ＦｃＲ γ、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ１、ＩＮＳＲ、ｃＭＥＴ、ＭＵＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＲＥＴ、ＲＯＲ１、ＲＯＳ１、ＲＹＫ、ＴＩＥ２、ＴＲＫ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＲＥＭ－１、ＴＲＥＭ－２、ＤＡＰ１２、ＭＲ、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、Ｖ／Ｉ／ＬｘＹｘｘＬ／Ｖ、ＳＩＲＰα、ＣＤ４５、Ｓｉｇｌｅｃ－１０、ＰＤ１、ＳＨＰ－１、ＳＨＰ－２、ＫＩＲ－２ＤＬ、ＫＩＲ－３ＤＬ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ１７０、ＣＤ３３、ＢＴＬＡ、ＣＤ３２ｂ、ＳＩＲＰβ、ＣＤ２２、ＰＩＲ－Ｂ、ＬＩＬＲＢ１、Ｓｙｋ、４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ、ＴＮＦＳＦ９）、ＣＤ２７、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＭ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＣＤ２０９、デクチン－２、または１つ以上のサイトカイン受容体シグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８Ｒ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０Ｒ、ＩＬ１１Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１４Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＦＮａＲ、ＩＦＮｇＲ、ＴＮＦＲ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２Ｒ、Ｄａｐ１０、ＣＤ３６、デクチン－１、またはＩＣＯＳＬ細胞内シグナル伝達ドメイン）、を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、二重シグナル伝達ドメイン、例として４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＣＤ１１６受容体ベータ鎖、ＣＳＦ１－Ｒ、ＬＲＰ１／ＣＤ９１、ＳＲ－Ａ１、ＳＲ－Ａ２、ＭＡＲＣＯ、ＳＲ－ＣＬ１、ＳＲ－ＣＬ２、ＳＲ－Ｃ、ＳＲ－Ｅ、ＣＲ１、ＣＲ３、ＣＲ４、デクチン１、ＤＥＣ－２０５、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＣＤ１４、ＣＤ３６、ＬＯＸ－１、ＣＤ１１ｂを、上記の段落に列挙したシグナル伝達ドメインのいずれかと任意の組み合わせで含む。
共刺激ドメイン
本明細書で使用される場合、「共刺激分子」または「共刺激ドメイン」は、初期刺激を高めるかまたは弱めるために使用される免疫細胞内の分子を指す。例えば、ＴＬＲなどの病原体関連パターン認識受容体またはＣＤ４７／ＳＩＲＰα軸は、免疫細胞上の分子であり、それぞれ初期刺激を高めたり弱めたりする。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＴＣＲ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ８６、共通ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１２７、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、本明細書に記載の他の共刺激分子、それらの任意の誘導体、バリアント、または断片、同じ機能的能力を有する、共刺激分子の任意の合成配列、及びそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。
本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル」は、免疫細胞上のＣＡＲの活性化などの一次シグナルと組み合わせて、免疫細胞の活性化をもたらすシグナルを指す。
切断ペプチド
本明細書で使用される場合、切断ペプチドとは、細胞内で組換えタンパク質の切断を誘導することができるペプチドを指す。いくつかの実施形態では、切断ペプチドは２Ａペプチドである。いくつかの実施形態では、切断ペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＴ２Ａペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、１つ以上の切断ペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断ペプチドをコードする核酸配列を含む核酸はまた、１つ以上の細胞内ドメインをコードする１つ以上の核酸配列、及び１つ以上のペプチド剤を含む１つ以上の核酸配列を含み、核酸の翻訳は、切断ペプチドによって１つ以上のペプチド剤から分離された１つ以上の細胞内ドメインを含むタンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、ＣＡＲをコードする１つ以上の核酸に作動可能に連結され、第２のプロモーターは、ペプチド剤をコードする１つ以上の核酸に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及び任意選択で１つ以上のペプチド剤を含む核酸配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列をさらに含む。ＩＲＥＳ配列は、翻訳の開始を促進するｍＲＮＡへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始する任意のウイルス、染色体または人工的に設計された配列であり得る。
ペプチド剤
本明細書で使用される場合、ペプチド剤は、免疫細胞においてＣＡＲと共発現するペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ペプチド剤を、ＣＡＲの化学量論的バランス及び最適なシグナル伝達を確保するために、ＣＡＲと共発現させる。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、同一のペプチド剤とホモ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、異なるペプチド剤とヘテロ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、１つ以上のペプチド剤をコードする１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、ＦｃＲガンマ鎖であるか、またはＦｃＲガンマ鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、任意のペプチド、タンパク質、受容体、分泌抗体またはその断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、またはナノボディ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮａ、ＩＦＮｂ、ＩＦＮ－ｙ、ＧＭＣＳＦ、またはＭＣＳＦのうちの１つ以上）、ＣＤ４０－Ｌ、ドミナントネガティブＳＩＲＰα、ドミナントネガティブＰＤ１、ドミナントネガティブＣＤ４５、ドミナントネガティブＳＩＧＬＥＣ１０、またはドミナントネガティブＬＩＬＲＢを含む。
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原結合ドメイン及びＦｃＲ細胞外ドメインを含み、及び／またはＣＡＲの膜貫通ドメインはＦｃＲ膜貫通ドメインを含み、及び／またはＣＡＲの細胞内ドメインはＦｃＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、１つ以上の細胞外結合ドメイン、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、及びＦｃＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、及びＦｃＲ細胞内ドメインのうちの１つ以上は、ヒトＦｃＲドメインであるか、またはヒトＦｃＲドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、及びＦｃＲ細胞内ドメインが一緒になって、全長ＦｃＲを構成する。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、及びＦｃＲ細胞内ドメインが一緒になって、全長ＦｃＲの一部を構成する。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、全長ＦｃＲ細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、全長ＦｃＲ膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、全長ＦｃＲ細胞内ドメインの一部を含む。
Ｔｏｌｌ様抗原受容体（ＴＬＲ）
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原結合ドメイン及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）細胞外ドメインを含み、及び／またはＣＡＲの膜貫通ドメインはＴＬＲ膜貫通ドメインを含み、及び／またはＣＡＲの細胞内ドメインはＴＬＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、１つ以上の細胞外結合ドメイン、ＴＬＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ膜貫通ドメイン、及びＴＬＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ膜貫通ドメイン、及びＴＬＲ細胞内ドメインのうちの１つ以上は、ヒトＴＬＲドメインであるか、またはヒトＴＬＲドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ膜貫通ドメイン、及びＴＬＲ細胞内ドメインが一緒になって、全長ＴＬＲを構成する。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ膜貫通ドメイン、及びＴＬＲ細胞内ドメインが一緒になって、全長ＴＬＲの一部を構成する。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、全長ＴＬＲ細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、全長ＴＬＲ膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、全長ＴＬＲ細胞内ドメインの一部を含む。
核酸コンストラクト
本開示は、とりわけ、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカインまたはその断片をコードする核酸分子を提供する。本開示は、とりわけ、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質またはその断片をコードする核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲまたはその断片をコードする核酸分子を提供する。免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、本明細書に記載の少なくとも１つのタンパク質（例えば、本開示の外因性サイトカイン、本開示の融合タンパク質、または本開示のＣＡＲ）をコードする核酸分子（例えば、外因性核酸分子）を含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸分子は、サイトカイン及びサイトカイン受容体を含む。
特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。「タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列」という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、型によってはイントロン（複数可）を含み得る程度までイントロンを含み得る。「コードする」とは、定義されたヌクレオチド（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）配列または定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの、ポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性ならびにそれに起因する生物学的特性を指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって細胞または他の生体系においてタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり通常は配列表に示されるヌクレオチド配列であるコード鎖も、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖もともに、タンパク質、またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードするということができる。
「作動可能に連結した」または「転写制御」という用語は、異種核酸配列の発現をもたらす、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、互いに隣接することができ、２つのタンパク質コード領域を繋げることが必要な場合、同じリーディングフレームにある。
本明細書に記載の少なくとも１つのタンパク質（例えば、本開示の外因性サイトカイン、本開示の融合タンパク質、または本開示のＣＡＲ）またはその断片をコードする核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載の少なくとも１つのタンパク質（例えば、本開示の外因性サイトカイン、本開示の融合タンパク質、または本開示のＣＡＲ）またはその断片をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物を含むか、またはそれである。いくつかの実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載の少なくとも１つのタンパク質（例えば、本開示の外因性サイトカイン、本開示の融合タンパク質、または本開示のＣＡＲ）またはその断片をコードするＤＮＡコンストラクトを含むか、またはそれである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質（例えば、本開示の外因性サイトカイン、本開示の融合タンパク質、または本開示のＣＡＲ）のすべてまたは断片は、例えば、細胞（例えば、哺乳動物細胞）での発現のために、コドン最適化核酸分子によってコードされる。例えば米国特許第５，７８６，４６４号及び第６，１１４，１４８号に開示されているように、様々なコドン最適化法が当技術分野で知られており、そのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の核酸の発現は、タンパク質（例えば、本開示の外因性サイトカイン、本開示の融合タンパク質、または本開示のＣＡＲ）またはその断片をコードする核酸を発現ベクター内でプロモーターに作動可能に連結させることによって実現できる。例示的なプロモーター（例えば、構成的プロモーター）には、伸長因子－１αプロモーター（ＥＦ－１α）プロモーター、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣプロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端リピート（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）プロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、またはクレアチンキナーゼプロモーター、が含まれるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターの例には、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。ベクターはまた、転写開始の頻度を制御するために、追加のプロモーター要素、例えばエンハンサーを含むことができる。
いくつかの実施形態では、タンパク質（例えば、本開示の外因性サイトカイン、本開示の融合タンパク質、または本開示のＣＡＲ）またはその断片をコードする核酸分子を含むベクターは、ウイルスベクターを含むか、またはウイルスベクターである。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹにおいて記載されている）。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクター）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターを含む（例えば、米国特許第９，１４９，５１９号または国際公開第ＷＯ２０１７／０４４４８７に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターを含む。アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡを含む大きなファミリーのウイルスである。アデノウイルスは、宿主の細胞機構を使用してウイルスのＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質を合成しながら、宿主細胞の核内で複製を行う。アデノウイルスは、複製細胞及び非複製細胞の両方に影響を与えて、大型の導入遺伝子を収容すること、及び宿主細胞ゲノムに組み込まれることなくタンパク質をコードすることが当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２ベクターまたはＡｄ５ベクター（例えば、Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスベクター、例えば、ヘルパー依存性Ａｄ５Ｆ３５アデノウイルスベクター）を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶシステムは、一般に当技術分野でよく知られている（例えば、Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０－１７（１９９４）；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（１３）：６０９４－９８（１９９２）；Ｃｕｒｉｅｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ，１３（２－３）：１４１－６４（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９（１９９２）；及びＡｓｏｋａｎ Ａ， ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照）。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを生成し、使用する方法は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に記載されている。
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１１、ならびにそのバリアントを含むいくつかのＡＡＶ血清型が特徴付けられている。一般に、任意のＡＡＶ血清型を使用して、本明細書に記載のタンパク質（例えば、本開示の外因性サイトカイン、本開示の融合タンパク質、または本開示のＣＡＲ）またはその断片を導入することができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型は、特定の組織に対する向性を有する。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して高レベルの正確なゲノム編集を促進し、相同組換え（ＨＲ）中にドナー鋳型ＤＮＡとして機能することが最近示されている。
いくつかの実施形態では、ベクターはガンマレトロウイルスベクターを含む（例えば、Ｔｏｂｉａｓ Ｍａｅｔｚｉｇ ｅｔ ａｌ．， “Ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ” Ｖｉｒｕｓｅｓ． ２０１１ Ｊｕｎ；３（６）： ６７７－７１３、に記載のもの、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例示的なガンマレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾限局巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、及び骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、ならびにそれらに由来するベクターが含まれる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、タンパク質、例えば、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカイン及び本明細書に記載のＣＡＲをコードする２つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、タンパク質、例えば、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質及び本明細書に記載のＣＡＲをコードする２つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、外因性サイトカイン及びＣＡＲをコードする２つ以上の核酸配列は、単一の核酸分子によって、例えば、同じフレーム内で単一のポリペプチド鎖としてコードされる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質及びＣＡＲをコードする２つ以上の核酸配列は、単一の核酸分子によって、例えば、同じフレーム内で単一のポリペプチド鎖としてコードされる。いくつかの実施形態では、２つ以上のタンパク質（例えば、外因性サイトカイン及びＣＡＲ）は、１つ以上の切断ペプチド部位（例えば、自動切断部位または細胞内プロテアーゼの基質）によって分離されている。いくつかの実施形態では、２つ以上のタンパク質（例えば、融合タンパク質及びＣＡＲ）は、１つ以上の切断ペプチド部位（例えば、自動切断部位または細胞内プロテアーゼの基質）によって分離されている。特定の実施形態では、切断ペプチドは、ブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）ペプチド、ゾセアアジグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａ型ウイルス（Ｅ２Ａ）ペプチド、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）ペプチド、またはそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、タンパク質、例えば、本明細書に記載の少なくとも１つの外因性サイトカイン、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質、または本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲをコードする少なくとも１つの核酸配列、ならびに、第２のタンパク質、例えば、本明細書に記載のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１２、ＩＦＮ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、及び／またはＩＬ－１）または本明細書に記載の刺激リガンド（例えば、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストもしくは抗体、及び／またはＢ７－Ｈ３リガンド）と共発現する少なくとも１つの遺伝子をコードする少なくとも１つの核酸を含む。
医薬組成物
本開示は、とりわけ、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
「治療有効量」、「免疫学的有効量」、「抗免疫応答有効量」、または「免疫応答阻害有効量」が示されている場合、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、免疫応答、及び状態の個体差を考慮して、医師が決定することができる。
本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物は、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、もしくはマンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化物質、ＥＤＴＡやグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、血清及び凍結防止剤などの防腐剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は汚染物質を実質的に含まない、例えば、検出可能なレベルの汚染物質（例えばエンドトキシン）は存在しない。
本明細書に記載の医薬組成物は、治療または予防すべき疾患、障害、または状態に適した様式で投与することができる。投与の量及び頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患、障害、または状態のタイプ及び重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は臨床試験によって決定され得る。
本明細書に記載の医薬組成物は、様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体及び固体の剤形、例として、液体溶液（例えば、注射用及び注入用溶液）、分散液または懸濁液、リポソーム、及び座薬などが含まれる。好ましい組成物は、注射用または注入用溶液であり得る。本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、経動脈、または腹腔内投与用に製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内）投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内注入または注射用に製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、筋肉内または皮下注射用に製剤化される。本明細書に記載の医薬組成物は、免疫療法で一般に公知の注入技術を使用して投与するために製剤化することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ． ３１９：１６７６， １９８８、を参照のこと、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明で使用される場合、「非経口投与」及び「非経口的に投与された」という用語は、通常は注射または注入による、経腸及び局所投与以外の投与様式を指し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、腫瘍内、及び胸骨内注射及び注入を含むがこれらに限定されない。
本明細書に記載の免疫細胞を含む医薬組成物は、約１０４～約１０９細胞／ｋｇ体重（例えば、約１０５～約１０６細胞／ｋｇ体重）の投与量で投与することができ、これらの範囲内のすべての整数値を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）の用量は、少なくとも約１×１０６、約１．１×１０６、約２×１０６、約３．６×１０６、約５×１０６、約１×１０７、約１．８×１０７、約２×１０７、約５×１０７、約１×１０８、約２×１０８、約５×１０８、約１×１０９、約２×１０９、または約５×１０９個の細胞を含む。本明細書に記載の医薬組成物は、ある特定の投与量で複数回投与することもできる。特定の患者に最適な投与量及び治療レジーム（ｒｅｇｉｍｅ）は、患者を疾患、障害、または状態の徴候について監視し、適宜に治療を調整することによって、当業者によって容易に決定され得る。
本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物を対象に投与し、続いて血液を再採取し（またはアフェレーシスを実施し）、収集した免疫細胞を活性化し、活性化された免疫細胞を対象に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、複数回、例えば数週間ごとに実行することができる。免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、約１０ｃｃから約４００ｃｃまでの採血から活性化することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、約２０ｃｃ、約３０ｃｃ、約４０ｃｃ、約５０ｃｃ、約６０ｃｃ、約７０ｃｃ、約８０ｃｃ、約９０ｃｃ、または約１００ｃｃの採血から活性化される。理論に拘束されるものではないが、本明細書に記載の複数回の採血及び再注入を含む方法を、ある特定の免疫細胞集団に対して選択することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物は、第２の治療と組み合わせて（例えば、前、同時、または後に）投与される。例えば、第２の治療法には、抗ウイルス療法（例えば、シドフォビル、インターロイキン－２、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃ）、またはナタリズマブ）、キメラ抗原受容体－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）－Ｔ細胞療法、化学療法、放射線、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、ＦＫ５０６抗体、またはグルココルチコイド）、アンタゴニスト（例えば、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト、ＣＤ４７アンタゴニスト、ＳＩＲＰαアンタゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト、またはＳＴＩＮＧアゴニストのうちの１つ以上）、または免疫除去剤（例えば、抗ＣＤ５２抗体（例えば、アレムツズマブ）、抗ＣＤ３抗体、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、または照射）、が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物は、化学療法剤（例えば、フルダラビン、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはリツキサン）を使用する骨髄移植またはリンパ球除去療法と組み合わせて（例えば、その前、それと同時、またはその後に）投与される。ある特定の実施形態では、対象は、高用量化学療法による標準治療とその後の末梢血幹細胞移植を受ける。ある特定の実施形態では、移植後、対象は、本明細書に記載の免疫細胞を含む医薬組成物の注入を受ける。本明細書に記載の医薬組成物は、手術前または手術後に投与することができる。
対象に投与される任意の前述の療法の投与量は、治療される疾患、障害、または状態により、また特定の対象に基づいて、変化する。ヒトへの投与のための投与量のスケーリングは、当技術分野で認められている慣行に従って行うことができる。例えば、アレムツズマブの用量は、一般に、成人に対して約１ｍｇ～約１００ｍｇであり、通常、約１日～約３０日の間の期間、毎日投与され、例えば、１日あたり約１ｍｇ～約１０ｍｇの日用量である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１２０，７６６号に記載されているように）。
治療方法
本開示は、とりわけ、対象における疾患または障害（例えば、本明細書に記載の疾患または障害）を治療する方法であって、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物を送達することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物が、疾患または障害を有する対象に投与される。本明細書に記載の医薬組成物は、対象の疾患もしくは障害を治療するため、または対象の免疫応答を刺激するための医薬の製造に使用するためのものであり得る。
本明細書に記載の方法で治療される対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒト（例えば、本明細書に記載の疾患もしくは障害を有する、または有するリスクのある患者）であり得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、対象に関して自己由来、同種異系、または異種であり得る。本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載の投与レジメンに従って、単独で、または１つ以上の治療剤、手順、または治療方針と組み合わせて対象に投与することができる。
本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物は、腫瘍またはがんに関連する疾患、神経変性疾患または障害、炎症性疾患または障害、心血管疾患または障害、線維性疾患または障害、アミロイドーシスに関連する疾患、及びそれらの組み合わせ、を治療または予防するために使用することができる。
本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物を用いて、対象のがんまたは腫瘍を治療する（例えば、低減させる、阻害する、またはその進行を遅延させることのうちの１つ以上）方法が提供される。対象は、がんの成人型または小児型を有する可能性がある。がんは、初期、中期、もしくは後期段階にあるか、または転移性がんであり得る。がんとしては、固形腫瘍、血液癌（例えば、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫などの骨髄腫）、または転移病変を挙げることができるが、これらに限定されない。固形腫瘍の例としては、種々の器官系の悪性腫瘍、例えば、肉腫及び癌腫、例えば、腺癌、例として、肺、乳房、卵巣、リンパ系、胃腸（例えば結腸）、肛門、生殖器及び尿生殖路（例えば、腎臓、尿路上皮、膀胱細胞、前立腺）、咽頭、ＣＮＳ（例えば、脳、神経またはグリア細胞）、頭頸部、皮膚（例えば、黒色腫、例えば皮膚黒色腫）、膵臓、及び骨（例えば、脊索腫）を侵すものなど、が挙げられる。
いくつかの実施形態では、がんは、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（例えば、扁平上皮及び／または非扁平上皮組織に関する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、またはＮＳＣＬＣ腺癌）、または小細胞肺癌（ＳＣＬＣ））、皮膚癌（例えば、メルケル細胞癌または黒色腫（例えば、進行性黒色腫））、卵巣癌、中皮腫、膀胱癌、軟部組織肉腫（例えば、血管周囲細胞腫（ＨＰＣ））、骨癌（骨肉腫）、腎臓癌（例えば、腎癌（例えば、腎細胞癌））、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、胆管癌、肉腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、前立腺癌、乳癌（例えば、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、またはＨｅｒ２／ｎｅｕの１つ、２つまたはすべてを発現しない乳癌、例えば、トリプルネガティブ乳癌）、大腸癌（例えば、再発性大腸癌または転移性大腸癌、例えば、マイクロサテライト不安定性大腸癌、マイクロサテライト安定性大腸癌、ミスマッチ修復熟練（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）大腸癌、またはミスマッチ修復欠損大腸癌）、鼻咽頭癌、十二指腸癌、子宮内膜癌、膵臓癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ））、肛門癌、胃食道癌、甲状腺癌（例えば、甲状腺未分化癌）、子宮頸癌（例えば、子宮頸部扁平上皮細胞癌）、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）（例えば、非定型肺カルチノイド腫瘍））、リンパ増殖性疾患（例えば、移植後リンパ増殖性疾患）、リンパ腫（例えば、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫）、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、または白血病（例えば、骨髄性白血病またはリンパ性白血病）、から選択される。
いくつかの実施形態では、がんは、脳腫瘍、例えば膠芽腫、神経膠肉腫、または再発性脳腫瘍である。いくつかの実施形態では、がんは、膵臓癌、例えば、進行膵臓癌である。いくつかの実施形態では、がんは、皮膚癌、例えば、黒色腫（例えば、ステージＩＩ～ＩＶ黒色腫、ＨＬＡ－Ａ２陽性黒色腫、切除不能黒色腫、または転移性黒色腫）、またはメルケル細胞癌である。いくつかの実施形態では、がんは、腎癌、例えば腎細胞癌（ＲＣＣ）（例えば、転移性腎細胞癌）である。いくつかの実施形態では、がんは、乳癌、例えば転移性乳癌またはステージＩＶ乳癌、例えばトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）である。いくつかの実施形態では、がんは、ウイルス関連癌である。いくつかの実施形態では、がんは、肛門管癌（例えば、肛門管の扁平上皮癌）である。いくつかの実施形態では、がんは、子宮頸癌（例えば、子宮頸部の扁平上皮癌）である。いくつかの実施形態では、がんは、胃癌（例えば、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）陽性胃癌、または胃癌もしくは胃食道接合部癌）である。いくつかの実施形態では、がんは、頭頸部癌（例えば、ＨＰＶ陽性及び陰性頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））である。いくつかの実施形態では、がんは、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）である。いくつかの実施形態では、がんは、大腸癌、例えば、再発性大腸癌、転移性大腸癌、例えば、マイクロサテライト不安定性大腸癌、マイクロサテライト安定性大腸癌、ミスマッチ修復熟練大腸癌、またはミスマッチ修復欠損大腸癌、である。
いくつかの実施形態では、がんは、血液癌である。いくつかの実施形態では、がんは、白血病、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性白血病、または急性白血病である。いくつかの実施形態では、がんは、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）（例えば、再発性もしくは難治性ＨＬまたはＤＬＢＣＬ）である。いくつかの実施形態では、がんは、骨髄腫、例えば多発性骨髄腫である。
本明細書に記載の免疫細胞（例えば、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物を使用して、対象における免疫応答を増強または調節することができる。一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、対象（例えば、本明細書に記載の疾患もしくは障害を有する、またはそのリスクがある対象）における免疫応答を増強、刺激、または増加させる。ある特定の実施形態では、対象は、免疫不全であるか、またはそのリスクがある。例えば、対象は、化学療法及び／または放射線療法を受けているかまたは受けたことがある。
いくつかの実施形態では、対象は、炎症性障害（例えば、慢性または急性炎症性障害）を発症しているか、または発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、対象は、自己免疫疾患もしくは障害を発症しているか、または発症するリスクがある。本明細書に記載の方法で治療することができる例示的な自己免疫疾患としては、アルツハイマー病、喘息（例えば、気管支喘息）、アレルギー（例えば、アトピー性アレルギー）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アテローム性動脈硬化症、ベーチェット病、セリアック病、心筋症、クローン病、肝硬変、糖尿病、糖尿病性網膜症、湿疹、線維筋痛症、線維筋炎、糸球体腎炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ギラン・バレー症候群、溶血性貧血、多発性硬化症、重症筋無力症、変形性関節症、多発性軟骨炎、乾癬、関節リウマチ、敗血症、脳卒中、血管炎、人工呼吸器誘発性肺損傷、移植拒絶、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、またはウェゲナー肉芽腫症、が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の医薬組成物の投与は、任意の都合のよい方法（例えば、注射、摂取、輸液、吸入、埋込み、または移植）で行うことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、注射または注入によって投与される。本明細書に記載の医薬組成物は、患者に、経動脈、皮下、静脈内、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、または腹腔内投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、非経口的に（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内に）投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、筋肉内または皮下注射によって投与される。本明細書に記載の医薬組成物は、対象の炎症部位、局所疾患部位、リンパ節、臓器、腫瘍、または感染部位に直接注射することができる。
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を含む、本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。加えて、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似または同等の方法及び物質を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法及び物質を本明細書に記載する。
本開示は、以下の実施例によってさらに説明される。本実施例は、説明のみを目的として提供されている。それらの実施例は、本開示の範囲または内容を何らかの形で限定するものと解釈されるべきではない。
以下の実施例は、本明細書に記載の方法及び組成物をどのように作製及び使用するかを当業者に説明するために提供するものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞表面への融合タンパク質の輸送
０日目に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を使用して、プラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一時的にトランスフェクトした。２日目に、本開示の例示的なコンストラクト（図５Ａ及び図５Ｂを参照）から発現させた融合タンパク質の発現及び輸送について、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を評価した。融合タンパク質のＮ末端のＦＬＡＧタグに対する免疫染色は、融合タンパク質の適切なフォールディング及び細胞表面への輸送を示し、同時に、完全長融合タンパク質の質量を検出するためにウェスタンブロット法を実施した。
図６Ａに示すように、融合タンパク質をコードするコンストラクトによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションは、トランスフェクトしていない細胞と比較して細胞の生存率に影響を与えなかった。図６Ｂに示すように、ＨＥＫ細胞は、ＦＬＡＧタグに対する免疫染色によって示されるように、細胞表面で３つの別々の融合タンパク質（ＩＦＮ－β及びＩＦＮＡＲ１、ＩＬ－４及びＩＬ２Ｒγｃ、ならびにＩＬ－４及びＩＬ１３Ｒα）を発現することができた。さらに、図７に示すように、抗体によるＦＬＡＧタグの検出と、ＩＦＮβ－ＩＦＮＡＲ１群及びＩＬ４－ＩＬ１３Ｒα群でのｍＣｈｅｒｒｙ発現との間に相関性があった。さらに、ウェスタンブロット分析により、融合タンパク質の発現が確認された（図８を参照）。サイトカイン（小さな分子量）を標的とする抗体を使用することにより、サイトカイン受容体との直接的な融合から生じる、より大きな分子量が検出された。サイトカイン受容体への融合は、ＩＦＮβの場合に特に顕著であった。ＩＦＮＡＲ１は、多量にグリコシル化され、その質量はアミノ酸確認に基づいて予測された質量をほぼ２倍超えて増加しており、ウェスタンブロットではスメアなバンドが生じた。サイトカインＩＦＮβを標的とすることによって、ウェスタンブロットによりＩＦＮＡＲ１のグリコシル化された性質がキャプチャされ、これらの２つのタンパク質の融合が実証された。
実施例２：初代マクロファージでの融合タンパク質の発現
０日目に、融合タンパク質を含むＶＰＸレンチウイルス（ＭＯＩ １０）でマクロファージを形質導入した。２日目に、マクロファージ培地を新しい培地と交換した。４日目に、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）を実施して、融合タンパク質のＮ末端のＦＬＡＧタグ（図９を参照）に対する免疫染色を用いて、本開示の例示的なコンストラクトによってコードされた融合タンパク質の表面発現を分析した。
図１０Ａに示すように、融合タンパク質をコードするコンストラクトによるマクロファージのトランスフェクションにより、トランスフェクトしていないマクロファージと比較して細胞の生存率が低下した。図１０Ａ及び図１０Ｂに示すように、ＩＬ４ベースの融合タンパク質は、マクロファージの表面で順調に発現したが、その一方で、ＩＦＮ－βベースの融合タンパク質は、マクロファージの表面で検出されなかった。これらの結果は、実施例１のものと比較して、各融合タンパク質の設計に対して、マクロファージがＨＥＫ２９３Ｔ細胞よりも感受性が高い可能性があることを示している。さらに、これらの結果は、シグナル伝達には表面発現が必要ではないことを示している可能性があり、例えば、機能的シグナル伝達カスケードが小胞体から発生する可能性がある。総タンパク質発現は、ウェスタンブロットを用いて測定することができ、一方で、フローサイトメトリーと細胞透過処理とを使用することにより、細胞内発現を測定できる。また、ＩＦＮ－βベースの融合タンパク質は細胞表面で発現したが、システムの信号対雑音比では検出できなかった可能性もある。最後に、図１１Ａ及び図１１Ｂに示す結果は、融合タンパク質を含むＶＰＸレンチウイルスで形質導入したマクロファージにおける、生存率、Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現、及び融合タンパク質の表面発現を示している。
実施例３：炎症誘発性マーカー及び抗炎症性マーカーに対する炎症誘発性融合タンパク質の効果
０日目に、融合タンパク質を含むＶＰＸレンチウイルス（ＭＯＩ １０）でマクロファージを形質導入した。３日目に、マクロファージ培地を新しい培地と交換した。４日目に、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）を実施して、炎症誘発性（すなわち、Ｍ１）マーカー（ＣＤ８０及びＣＤ８６）ならびに抗炎症性（すなわち、Ｍ２）マーカー（ＣＤ１６３及びＣＤ２０６）を分析した。
図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、炎症誘発性融合タンパク質（ＩＦＮβ－ＩＦＮＡＲ１）の形質導入は、炎症誘発性マーカーのアップレギュレーション及び抗炎症性マーカーのダウンレギュレーションを伴って、炎症誘発性マクロファージ表現型を順調に誘導した。レンチウイルス単独による形質導入は、炎症誘発性表現型を誘導するため、レンチウイルス単独の効果（ｍＣｈｅｒｒｙ対照で表される）以上にＩＦＮβ－ＩＦＮＡＲ１融合タンパク質がマクロファージを分極化したことに留意することが重要である。
ＩＦＮβ－ＩＦＮＡＲ１は、マクロファージ表面で検出されなかったが（実施例２を参照）、このＭ１／Ｍ２パネルからの結果は、融合タンパク質の機能には表面発現が必要ではない可能性があることを示している。
実施例４：マクロファージ生存率及びＣＡＲ発現に対するサイトカインとＣＡＲとの共発現の効果
末梢血ＣＤ１４＋単球からマクロファージを派生させ、７日間１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを用いて分化させた。抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ（ＣＡＲ１）をコードする５０μＭのｍＲＮＡ（化学修飾を含む）を用いて、サイトカインをコードする５０μＭのｍＲＮＡを用いて、または用いずに、初代ヒト単球由来マクロファージにエレクトロポレーションを行った。２４時間後、フローサイトメトリーを使用して、生細胞のパーセントを定量化した（図１３）。加えて、フローサイトメトリーを使用して、ＣＡＲ＋細胞のパーセントを評価した。図１４に示すように、ＣＡＲをトランスフェクトしたマクロファージの５０％を超えるマクロファージが、サイトカインｍＲＮＡとの同時トランスフェクションの有無にかかわらず、２４時間以内にそれらの表面にＣＡＲを発現した。
実施例５：サイトカイン発現に対するサイトカインとＣＡＲとの共発現の効果
２×１０６個のヒトマクロファージに、５０μＭのＣＡＲ ｍＲＮＡ、または５０μＭのＣＡＲ ｍＲＮＡ及びＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＣＣＬ１９、またはＣＸＣＬ１２をコードする５０μＭのｍＲＮＡをトランスフェクトした（図１５、１６、１７、及び１８を参照）。エレクトロポレーションの２４時間後に上澄液を収集し、ＭＳＤ機器を使用してサイトカインレベルを評価した。図１５に示すように、ＣＡＲ ｍＲＮＡ及びＩＦＮ－γ ｍＲＮＡ（ＣＡＲ１＋ＩＦＮｇ群）をトランスフェクトしたマクロファージは、高レベルのＩＦＮ－γを分泌したが、一方で、ＣＡＲ ｍＲＮＡ及びＩＬ－１０、ＣＣＬ１９またはＣＸＣＬ１２をコードするｍＲＮＡのトランスフェクションでは、ＩＦＮ－γ分泌は生じなかった。同様に、図１６に示すように、ＣＡＲとＩＬ－１０ ｍＲＮＡとを共トランスフェクトしたマクロファージは、高レベルのＩＬ－１０を分泌したが、一方で、ＣＡＲ ｍＲＮＡ及びＩＦＮ－γ、ＣＣＬ１９またはＣＸＣＬ１２をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージでは、ＩＬ－１０分泌は生じなかった。また、図１７に示すように、ＣＡＲ ｍＲＮＡ及びＣＣＬ１９ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージは、高レベルのＣＣＬ１９を分泌したが、一方で、ＣＡＲ ｍＲＮＡ及びＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、またはＣＸＣＬ１２をコードするｍＲＮＡのトランスフェクションでは、ＣＣＬ１９分泌は生じなかった。最後に、図１８に示すように、ＣＡＲ ｍＲＮＡ及びＣＸＣＬ１２ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージは、ＣＡＲ ｍＲＮＡ及びＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、またはＣＣＬ１９をコードするｍＲＮＡのトランスフェクションよりも、高レベルのＣＸＣＬ１２を分泌した。ＣＣＬ１９及びＣＸＣＬ１２の両方は、Ｔ細胞及びその他の免疫細胞の動員をもたらす化学走性誘因物質ケモカインである。
実施例６：マクロファージ表現型に対するサイトカインとＣＡＲとの共発現の効果
トランスフェクトしたマクロファージの炎症誘発性（Ｍ１）表現型または抗炎症性（Ｍ２）表現型への自己分極化の能力を評価するために、エレクトロポレーションの２４時間後に、フローサイトメトリーを使用してマクロファージ表現型を評価した。図１９に示すように、ＣＡＲ ｍＲＮＡ及びＩＦＮ－γ ｍＲＮＡ（ＣＡＲ１＋ＩＦＮｇ群）をエレクトロポレーションしたマクロファージは、ヒトＭ１マクロファージマーカーＣＤ８０及びＣＤ８６の最も高いレベルの表面発現を示した。これらのデータは、マクロファージにＣＡＲ ｍＲＮＡとＩＦＮ－γ ｍＲＮＡとを共トランスフェクトすることにより、Ｍ１表現型への分極化が可能になることを実証している。図２０に示すように、ＣＡＲ ｍＲＮＡ及びＩＬ－１０ ｍＲＮＡ（ＣＡＲ＋ＩＬ１０群）をエレクトロポレーションしたマクロファージは、最も高いレベルのヒトＭ２マクロファージマーカーＣＤ１６３及びＣＤ２０６の表面発現を示した。これらのデータは、マクロファージにＣＡＲ ｍＲＮＡとＩＬ－１０ ｍＲＮＡとを共トランスフェクトすることにより、Ｍ２表現型への分極化が可能になることを実証している。
例示的配列
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等価物
当業者は、本開示に対する様々な変更、修正、及び改良が当業者には容易に想起されることが理解されるべきである。そのような変更、修正、及び改良は、本開示の一部であることを意図しており、本発明の精神及び範囲内であることを意図している。したがって、前述の説明及び図面は、単なる例であり、以下の請求項によってさらに詳細に説明されている場合、本開示に記載されているいずれかの発明である。
当業者は、本明細書に記載のアッセイまたは他のプロセスで得られた値に起因する偏差または誤差の典型的な基準を理解するであろう。本発明の背景を説明し、その実践に関するさらなる詳細を提供するために、本明細書で参照される刊行物、ウェブサイト、及び他の参考資料は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (82)

  1. サイトカイン、リンカー、及びサイトカイン受容体を含む融合タンパク質を含む修飾免疫細胞であって、
    前記修飾免疫細胞は、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞であり、
    前記サイトカインは、前記サイトカイン受容体に結合する、
    前記修飾免疫細胞。
  2. 前記融合タンパク質は、膜結合している、請求項１に記載の修飾免疫細胞。
  3. 前記リンカーは、可動性リンカーである、請求項１または２に記載の修飾免疫細胞。
  4. 前記リンカーは、切断可能リンカーである、請求項１～３のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  5. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  6. 前記融合タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  7. 前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、前記シグナルペプチド、前記サイトカイン、前記リンカー、及び前記サイトカイン受容体を含む、請求項６に記載の修飾免疫細胞。
  8. 前記融合タンパク質は、表２ａ、表２ｂ、表３ａ、表３ｂ、表６、表８、または表９から選択される配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  9. サイトカイン、リンカー、及びサイトカイン受容体を含む融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む修飾免疫細胞であって、
    前記修飾免疫細胞は、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞であり、
    前記サイトカインは、前記サイトカイン受容体に結合する、
    前記修飾免疫細胞。
  10. 前記融合タンパク質は、膜結合している、請求項９に記載の修飾免疫細胞。
  11. 前記リンカーは、可動性リンカーである、請求項９または１０に記載の修飾免疫細胞。
  12. 前記リンカーは、切断可能リンカーである、請求項９～１１のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  13. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、請求項９～１２のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  14. 前記融合タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含む、請求項１３に記載の修飾免疫細胞。
  15. 前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、前記シグナルペプチド、前記サイトカイン、前記リンカー、及び前記サイトカイン受容体を含む、請求項１４に記載の修飾免疫細胞。
  16. 前記１つ以上の核酸は、表１０から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項９～１５のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  17. 前記１つ以上の核酸は、表１１ｂから選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項９～１５のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  18. 前記１つ以上の核酸は、表４ａ、表４ｂ、または表７から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項９～１５のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  19. 前記１つ以上の核酸は、表５ａまたは表５ｂから選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項９～１５のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  20. 前記１つ以上の核酸は、表８から選択されるシグナルペプチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項９～１５のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  21. 前記１つ以上の核酸は、表８から選択されるリンカー配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項９～１５のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  22. 前記シグナルペプチドは、ＣＤ８ａ、ＩｇＧκ、ＰＤＧＦＲ－β、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、またはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、またはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－β、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１Ｒ３、ＩＬ－６Ｒα、ｇｐ１３０、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＩＬ－１７ＲＡ、ＩＬ－１７ＲＢ、ＩＬ－１７ＲＣ、ＩＬ－２３Ｒ、ＣＳＦ２－Ｒα、ＣＳＦ２－Ｒβ、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－４Ｒα１、ＩＬ－２Ｒγｃ、ＩＬ－１０Ｒ１、ＩＬ－１０Ｒ２、ＩＬ－１３Ｒα１、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ、ＣＳＦ１－Ｒ、ＴＧＦ－βＲ１、またはＴＧＦ－βＲ２シグナルペプチドであるか、またはそれらを含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  23. 前記サイトカインは、炎症誘発性サイトカインであるか、または炎症誘発性サイトカインを含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  24. 前記サイトカインは、抗炎症性サイトカインであるか、または抗炎症性サイトカインを含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  25. 前記サイトカインは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、もしくはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、もしくはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、またはＧＭ－ＣＳＦであるか、またはそれらを含む、請求項２３に記載の修飾免疫細胞。
  26. 前記サイトカインは、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、またはＴＧＦ－βであるか、またはそれらを含む、請求項２４に記載の修飾免疫細胞。
  27. 前記サイトカインは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、もしくはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、もしくはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、またはＴＧＦ－βであるか、またはそれらを含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  28. 前記サイトカイン受容体は、炎症誘発性サイトカイン受容体であるか、または炎症誘発性サイトカイン受容体を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  29. 前記サイトカイン受容体は、抗炎症性サイトカイン受容体であるか、または抗炎症性サイトカイン受容体を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  30. 前記サイトカイン受容体は、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１Ｒ３、ＩＬ－６Ｒα、ｇｐ１３０、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＩＬ－１７ＲＡ、ＩＬ－１７ＲＢ、ＩＬ－１７ＲＣ、ＩＬ－２３Ｒ、ＣＳＦ２－Ｒα、またはＣＳＦ２－Ｒβであるか、またはそれらを含む、請求項２８に記載の修飾免疫細胞。
  31. 前記サイトカイン受容体は、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－４Ｒα１、ＩＬ－２Ｒγｃ、ＩＬ－１０Ｒ１、ＩＬ－１０Ｒ２、ＩＬ－１３Ｒα１、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ、ＣＳＦ１－Ｒ、ＴＧＦ－βＲ１、またはＴＧＦ－βＲ２であるか、またはそれらを含む、請求項２９に記載の修飾免疫細胞。
  32. 前記サイトカイン受容体は、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１Ｒ３、ＩＬ－６Ｒα、ｇｐ１３０、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＩＬ－１７ＲＡ、ＩＬ－１７ＲＢ、ＩＬ－１７ＲＣ、ＩＬ－２３Ｒ、ＣＳＦ２－Ｒα、ＣＳＦ２－Ｒβ、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－４Ｒα１、ＩＬ－２Ｒγｃ、ＩＬ－１０Ｒ１、ＩＬ－１０Ｒ２、ＩＬ－１３Ｒα１、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ、ＣＳＦ１－Ｒ、ＴＧＦ－βＲ１、またはＴＧＦ－βＲ２であるか、またはそれらを含む、請求項１～３ａのいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  33. 前記リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（ここで、ｎ＝１～５である（配列番号１７０））、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー、及びリンカー２６からなる群から選択されるリンカーであるか、またはそれらを含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  34. インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、リンカー、及びインターロイキン－１０受容体（ＩＬ１０Ｒ）を含む融合タンパク質を含む、修飾免疫細胞。
  35. インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）、リンカー、及びインターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）を含む融合タンパク質を含む、修飾免疫細胞。
  36. 前記融合タンパク質は、膜結合している、請求項３４または３５に記載の修飾免疫細胞。
  37. 前記リンカーは、可動性リンカーである、請求項３４または３５に記載の修飾免疫細胞。
  38. 前記リンカーは、切断可能リンカーである、請求項３４～３７のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  39. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、請求項３４～３８のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  40. 請求項１～３９のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞を含む、医薬組成物。
  41. 薬学的に許容される担体を含む、請求項４０に記載の医薬組成物。
  42. サイトカイン及びサイトカイン受容体を含む融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む、核酸コンストラクト。
  43. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上の核酸をさらに含む、請求項４２に記載の核酸コンストラクト。
  44. 請求項４２または４３に記載の核酸コンストラクトを含む、医薬組成物。
  45. 薬学的に許容される担体を含む、請求項４４に記載の医薬組成物。
  46. 対象の疾患または障害を治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項４０、４１、４４、または４５のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に送達することを含む、前記方法。
  47. 免疫細胞を修飾する方法であって、前記免疫細胞にサイトカイン、リンカー、及びサイトカイン受容体を含む融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む核酸コンストラクトを導入することを含む、前記方法。
  48. 前記リンカーは、可動性リンカーである、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記リンカーは、切断可能リンカーである、請求項４７または４８に記載の方法。
  50. 前記核酸コンストラクトは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上の核酸をさらに含む、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記導入は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または化学的に修飾されたｍＲＮＡのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションを含む、請求項４７～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記導入は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターによる形質導入を含む、請求項４７～５０のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターを含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記レンチウイルスベクターは、Ｖｐｘタンパク質とともにパッケージングされる、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記アデノウイルスベクターは、Ａｄ２ベクターまたはＡｄ５ベクターを含む、請求項５２に記載の方法。
  56. 前記Ａｄ５ベクターは、Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスベクターを含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記導入は、トランスポゾンに基づく導入またはＣＲＩＳＰＲに基づく標的組み込みを含む、請求項４７～５０のいずれか１項に記載の方法。
  58. 外因性サイトカイン及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む修飾免疫細胞であって、
    前記修飾免疫細胞は、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞であり、
    前記外因性サイトカインは、炎症誘発性サイトカイン、抗炎症性サイトカイン、または化学走性誘因物質ケモカインであるか、またはそれらを含む、
    前記修飾免疫細胞。
  59. 前記外因性サイトカインは、シグナルペプチドを含む、請求項５８に記載の修飾免疫細胞。
  60. 前記外因性サイトカインは、表２ａ、表２ｂ、表６、または表８から選択される配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５８または５９に記載の修飾免疫細胞。
  61. 外因性サイトカイン及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上の核酸を含む修飾免疫細胞であって、
    前記修飾免疫細胞は、幹細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞であり、
    前記外因性サイトカインは、炎症誘発性サイトカイン、抗炎症性サイトカイン、または化学走性誘因物質ケモカインであるか、またはそれらを含む、
    前記修飾免疫細胞。
  62. 前記外因性サイトカインは、シグナルペプチドをさらに含む、請求項６１に記載の修飾免疫細胞。
  63. 前記１つ以上の核酸は、表４ａ、表４ｂ、表７、または表１１ｂから選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項６１または６２に記載の修飾免疫細胞。
  64. 前記１つ以上の核酸は、表８から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項６１または６２に記載の修飾免疫細胞。
  65. 前記１つ以上の核酸は、シグナルペプチドをコードする、請求項６１～６４のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  66. 前記シグナルペプチドは、ＣＤ８ａ、ＩｇＧκ、ＰＤＧＦＲ－β、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、またはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、またはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－β、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１Ｒ３、ＩＬ－６Ｒα、ｇｐ１３０、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＩＬ－１７ＲＡ、ＩＬ－１７ＲＢ、ＩＬ－１７ＲＣ、ＩＬ－２３Ｒ、ＣＳＦ２－Ｒα、ＣＳＦ２－Ｒβ、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－４Ｒα１、ＩＬ－２Ｒγｃ、ＩＬ－１０Ｒ１、ＩＬ－１０Ｒ２、ＩＬ－１３Ｒα１、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ、ＣＳＦ１－Ｒ、ＴＧＦ－βＲ１、またはＴＧＦ－βＲ２シグナルペプチドであるか、またはそれらを含む、請求項６２または６５に記載の修飾免疫細胞。
  67. 前記外因性サイトカインは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１３、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７、ＩＦＮ－α２１、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－ε、もしくはＩＦＮ－κ）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３、もしくはＩＦＮ－λ４）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－β、ＣＣＬ１９またはＣＸＣＬ１２であるか、またはそれらを含む、請求項５８～６６のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
  68. 前記外因性サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＣＣＬ１９、またはＣＸＣＬ１２であるか、またはそれらを含む、請求項６７に記載の修飾免疫細胞。
  69. 請求項５８～６８のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞を含む、医薬組成物。
  70. 薬学的に許容される担体を含む、請求項６９に記載の医薬組成物。
  71. 外因性サイトカイン及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上の核酸を含む核酸コンストラクト。
  72. 請求項７１に記載の核酸コンストラクトを含む、医薬組成物。
  73. 薬学的に許容される担体を含む、請求項７２に記載の医薬組成物。
  74. 対象の疾患または障害を治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項６９、７０、７２、または７３のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に送達することを含む、前記方法。
  75. 免疫細胞を修飾する方法であって、前記免疫細胞に外因性サイトカイン及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上の核酸を含む核酸コンストラクトを導入することを含む、前記方法。
  76. 前記導入は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または化学的に修飾されたｍＲＮＡのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションを含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記導入は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターによる形質導入を含む、請求項７５に記載の方法。
  78. 前記レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターを含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記レンチウイルスベクターは、Ｖｐｘタンパク質とともにパッケージングされる、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記アデノウイルスベクターは、Ａｄ２ベクターまたはＡｄ５ベクターを含む、請求項７７に記載の方法。
  81. 前記Ａｄ５ベクターは、Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスベクターを含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記導入は、トランスポゾンに基づく導入またはＣＲＩＳＰＲに基づく標的組み込みを含む、請求項５０に記載の方法。
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