KR20230132806A - 키메라 표적 인자 수용체 - Google Patents

Abstract

수상 세포 등의 항원 제시 세포를 표적 인자 특이적으로 활성화할 수 있는 키메라 표적 인자 수용체를 제공하는 것. 표적 인자 결합성 도메인, 막 관통 도메인, 및 TLR 세포내 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는, 키메라 표적 인자 수용체.

Description

키메라 표적 인자 수용체

본 발명은, 키메라 표적 인자 수용체 등에 관한 것이다.

키메라 항원 수용체는, 항체의 특이성에 따라서 항원에 결합하고, 이로써 표적 세포의 상해·사이토카인 방출·자극 후의 T 세포 분열을 일으킬 수 있다. 유전자 도입에 의해 T 세포에 특이성을 부여하는 것이 가능하고, 세포의 조제는 내재성의 종양 특이적 T 세포 리셉터 양성 T 세포를 배양 증폭시키는 경우에 비해 대체로 용이하다. 또, 키메라 항원 수용체를 이용한 치료법 (CAR-T 요법) 은, 항체 요법과 비교하여 높은 세포 상해 활성을 나타낼 수 있다.

수상 세포는, 세균, 바이러스 등의 미생물 특이적 항원을 인식하여 자연 면역 활성화를 담당하는 면역 세포이다. 이 면역 활성화능에 주목하여, 암항원을 인식시킨 수상 세포를 체내로 되돌리는 「수상 세포 백신 요법」 등도 시도되고 있다.

US 2017/0151281 A1

키메라 항원 수용체를 수상 세포에 삽입한 CAR-DC 로는, 특허문헌 1 에서 보고되어 있다. 그러나, 세포내 도메인의 구성에 대해 상세하게 검토된 보고는 없다.

본 발명은, 수상 세포 등의 항원 제시 세포를 표적 인자 특이적으로 활성화시킬 수 있는 키메라 표적 인자 수용체를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자는 상기 과제를 감안하여 예의 연구를 진행시킨 결과, 표적 인자 결합성 도메인, 막 관통 도메인, 및 TLR 세포내 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 키메라 표적 인자 수용체이면, 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 알아내었다. 이 지견에 기초하여 더욱 연구를 진행시킨 결과, 본 발명이 완성되었다. 즉, 본 발명은 하기의 양태를 포함한다.

항 1. 표적 인자 결합성 도메인, 막 관통 도메인, 및 TLR 세포내 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는, 키메라 표적 인자 수용체.

항 2. 상기 TLR 세포내 도메인이, TLR2 세포내 도메인, TLR3 세포내 도메인, 및 TLR9 세포내 도메인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 항 1 에 기재된 키메라 표적 인자 수용체.

항 3. 상기 TLR 세포내 도메인이, TLR3 세포내 도메인, 및 TLR9 세포내 도메인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 청구항 1 또는 2 에 기재된 키메라 표적 인자 수용체.

항 4. 상기 세포내 도메인이 추가로 CD40 세포내 도메인을 포함하는, 항 1 ∼ 3 중 어느 하나에 기재된 키메라 표적 인자 수용체.

항 5. 상기 표적 인자 결합성 도메인의 구조가 단사슬 항체 구조인, 항 1 ∼ 4 중 어느 하나에 기재된 키메라 표적 인자 수용체.

항 6. 상기 표적 인자가, 암항원, 사이토카인 수용체, 및 세포 증식 인자 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 항 1 ∼ 5 중 어느 하나에 기재된 키메라 표적 인자 수용체.

항 7. 항 1 ∼ 6 중 어느 하나에 기재된 키메라 표적 인자 수용체를 코드하는, 폴리뉴클레오티드.

항 8. 항 7 에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포.

항 9. 항원 제시 세포인, 항 8 에 기재된 세포.

항 10. 수상 세포인, 청구항 8 또는 9 에 기재된 세포.

항 11. 항 8 ∼ 10 중 어느 하나에 기재된 세포를 함유하는, 의약 조성물.

항 12. 암, 자기 면역 질환, 알레르기 질환, 및 감염증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 치료, 예방, 또는 개선용인, 항 11 에 기재된 의약 조성물.

항 12A. 암, 자기 면역 질환, 알레르기 질환, 및 감염증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 갖는 대상 또는 환자에 대해, 항 8 ∼ 10 중 어느 하나에 기재된 세포를 투여하는 것을 포함하는, 암, 자기 면역 질환, 알레르기 질환, 및 감염증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 치료, 예방, 또는 개선방법.

항 12B. 암, 자기 면역 질환, 알레르기 질환, 및 감염증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 치료, 예방, 또는 개선용 의약 조성물로서의 사용을 위한, 항 8 ∼ 10 중 어느 하나에 기재된 세포.

항 12C. 암, 자기 면역 질환, 알레르기 질환, 및 감염증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 치료, 예방, 또는 개선용 의약 조성물의 제조를 위한, 항 8 ∼ 10 중 어느 하나에 기재된 세포의 사용.

항 13. 고형암의 치료, 예방, 또는 개선용인, 항 11 또는 12 에 기재된 의약 조성물.

항 14. 상기 TLR 세포내 도메인이, TLR3 세포내 도메인, 및 TLR9 세포내 도메인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종이고, 또한 상기 세포가 수상 세포인, 항 13 에 기재된 의약 조성물.

항 15. 상기 세포내 도메인이 추가로 CD40 세포내 도메인을 포함하고, 또한 상기 세포가 수상 세포인, 항 13 또는 14 에 기재된 의약 조성물.

항 16. 면역 체크 포인트 저해제와의 병용에 사용하기 위한, 항 11 ∼ 15 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

본 발명에 의하면, 수상 세포 등의 항원 제시 세포를 표적 인자 특이적으로 활성화할 수 있는, 키메라 표적 인자 수용체를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 당해 키메라 표적 인자 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 당해 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포, 당해 세포를 포함하는 의약 조성물 등을 제공할 수도 있다.

도 1 은, In vitro 수상 세포 활성화 시험 (시험예 4, 공배양 5 시간, 지표 인자 CD80) 의 결과를 나타낸다. TLR 있음은, 세포내 도메인으로서 그래프 좌상측에 나타내는 TLR 의 세포내 도메인을 채용한 경우의 결과이고, TLR 없음은, 세포내 도메인 없음의 경우의 결과를 나타낸다. 가로축은, CD80 의 발현량을 나타내고, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 2 는, In vitro 수상 세포 활성화 시험 (시험예 4, 공배양 24 시간, 지표 인자 CD80) 의 결과를 나타낸다. 각 표시의 설명은 도 1 과 동일하다.
도 3 은, In vitro 수상 세포 활성화 시험 (시험예 4, 공배양 48 시간, 지표 인자 CD80) 의 결과를 나타낸다. 각 표시의 설명은 도 1 과 동일하다.
도 4 는, In vitro 수상 세포 활성화 시험 (시험예 4, 공배양 5 시간, 지표 인자 CD86) 의 결과를 나타낸다. 각 표시의 설명은 도 1 과 동일하다.
도 5 는, In vitro 수상 세포 활성화 시험 (시험예 4, 공배양 24 시간, 지표 인자 CD86) 의 결과를 나타낸다. 가장 좌열의 그래프에 대해, TLR 있음은, 세포내 도메인으로서 그래프 좌상측에 나타내는 TLR 의 세포내 도메인을 채용한 경우의 결과이고, TLR 없음은, 세포내 도메인 없음의 경우의 결과를 나타낸다. 중앙의 열 및 가장 우열의 그래프에 대해, TLR+CD40 있음은, 세포내 도메인으로서 그래프 좌상측에 나타내는 TLR 의 세포내 도메인과 CD40 의 세포내 도메인 (표시 중, 좌측이 세포막측을 나타낸다.) 을 채용한 경우의 결과이고, TLR+CD40 없음은, 세포내 도메인 없음의 경우의 결과를 나타낸다. 세로축과 가로축의 설명은 도 1 과 동일하다.
도 6 은, In vitro 매크로파지 탐식 시험 (시험예 5) 의 결과를 나타낸다. 가로축은, 세포내 도메인을 나타내고, Δ 는 세포내 도메인 없음의 경우를 나타낸다. 세로축은, 매크로파지의 탐식능을 나타낸다.
도 7 은, 항종양 효과의 평가 시험 (시험예 6, MSLN 발현 세포 (Pan02/MSLN) 이식 마우스를 사용한 경우) 의 결과를 나타낸다. Empty 는, 빈 벡터 (pMXs-GFP) 를 도입한 수상 세포를 투여한 경우를 나타내고, MSLN-TLR9 는, 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포 (시험예 2 : 표적은 MSLN, 세포내 도메인은 TLR9 의 세포내 도메인) 을 투여한 경우를 나타내고, 컨트롤 (Control) 은 세포를 투여하지 않은 경우를 나타낸다. 세로축은, 종양 사이즈를 나타내고, 가로축은 초회 투여로부터의 경과 일수를 나타낸다.
도 8 은, 항종양 효과의 평가 시험 (시험예 6, MSLN 비발현 세포 (Pan02) 이식 마우스를 사용한 경우) 의 결과를 나타낸다. 각 표시의 설명은 도 7 과 동일하다.
도 9 는, In vitro 수상 세포 활성화 시험 (시험예 7, 지표 인자 MHC class I) 의 결과를 나타낸다. 각 표시의 설명은 도 1 과 동일하다.
도 10 은, In vitro 수상 세포 활성화 시험 (시험예 7, 지표 인자 MHC class II) 의 결과를 나타낸다. 각 표시의 설명은 도 1 과 동일하다.
도 11 은, In vitro 수상 세포 활성화 시험 (시험예 8, 지표 인자 CD86) 의 결과를 나타낸다. 각 표시의 설명은 도 1 과 동일하다.
도 12 는, In vitro 수상 세포 활성화 시험 (시험예 8, 지표 인자 MHC class II) 의 결과를 나타낸다. 각 표시의 설명은 도 5 와 동일하다.
도 13 은, 항종양 효과의 평가 시험 (시험예 9, MSLN 발현 세포 (Pan02/MSLN) 이식 마우스를 사용한 경우) 의 결과를 나타낸다. 컨트롤은 세포를 투여하지 않은 경우를 나타내고, 그 밖은 키메라 표적 인자 수용체의 표적 (MSLN) 및 세포내 도메인을 나타낸다 (예를 들어 「TLR9」 는 TLR9 의 세포내 도메인을 나타낸다. 「Δ」 는 세포내 도메인 없음을 나타낸다.). 세로축은, 종양 사이즈를 나타내고, 가로축은 초회 투여로부터의 경과 일수를 나타낸다.
도 14 는, 항종양 효과의 평가 시험 (시험예 11, MSLN 발현 세포 (Pan02/MSLN) 이식 마우스를 사용한 경우) 의 결과를 나타낸다. 컨트롤은 세포를 투여하지 않은 경우를 나타내고, 그 밖은 키메라 표적 인자 수용체의 표적 (MSLN) 및 세포내 도메인을 나타낸다 (예를 들어 「TLR9」 는 TLR9 의 세포내 도메인을 나타낸다.). 세로축은, 종양 사이즈를 나타내고, 가로축은 초회 투여로부터의 경과 일수를 나타낸다.

1. 정의

본 명세서 중에 있어서, 「함유」 및 「포함하는」 이라는 표현에 대해서는, 「함유」, 「포함하는」, 「실질적으로 이루어지는」 및 「만으로 이루어지는」 이라는 개념을 포함한다.

아미노산 서열의 「동일성」 이란, 2 이상의 대비 가능한 아미노산 서열의, 서로에 대한 아미노산 서열의 일치의 정도를 말한다. 따라서, 어느 2 개의 아미노산 서열의 일치성이 높을수록, 그들 서열의 동일성 또는 유사성은 높다. 아미노산 서열의 동일성의 레벨은, 예를 들어, 서열 분석용 툴인 FASTA 를 사용하고, 디폴트 파라미터를 사용하여 결정된다. 혹은, Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST (KarlinS, Altschul SF. "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes" Proc Natl Acad Sci USA. 87 : 2264 - 2268(1990), KarlinS, Altschul SF. "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences." Proc Natl Acad Sci USA. 90 : 5873 - 7(1993)) 를 사용하여 결정할 수 있다. 이와 같은 BLAST 의 알고리즘에 기초한 BLASTX 라고 불리는 프로그램이 개발되고 있다. 이들 해석 방법의 구체적인 수법은 공지이고, National Center of Biotechnology Information (NCBI) 의 웹 사이트 (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/) 를 참조하면 된다. 또, 염기 서열의 『동일성』 도 상기에 준하여 정의된다.

본 명세서 중에 있어서, 「보존적 치환」 이란, 아미노산 잔기가 유사한 측사슬을 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것을 의미한다. 예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘과 같은 염기성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기끼리로 치환되는 것이 보존적인 치환에 해당한다. 그 밖에, 아스파르트산, 글루탐산과 같은 산성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 ; 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 스레오닌, 티로신, 시스테인과 같은 비대전성 극성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 ; 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판과 같은 비극성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 ; 스레오닌, 발린, 이소류신과 같은 β-분지 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 ; 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘과 같은 방향족 측사슬을 갖는 아미노산 잔기끼리에서의 치환도 동일하게, 보존적인 치환에 해당한다.

본 명세서 중에 있어서, 「CDR」 란, Complementarity Determining Region 의 약어이고, 상보성 결정 영역이라고도 칭해진다. CDR 이란, 이뮤노글로불린 또는 T 세포 수용체의 가변 영역에 존재하는 영역이고, 항체 또는 T 세포 수용체의 항원에 대한 특이적인 결합에 깊게 관여하는 영역이다. 또한, 「경사슬 CDR」 이란 이뮤노글로불린의 경사슬 가변 영역에 존재하는 CDR 이고, 「중사슬 CDR」 이란 이뮤노글로불린의 중사슬 가변 영역에 존재하는 CDR 을 의미한다. T 세포 수용체에 있어서도, α 사슬, β 사슬, γ 사슬, δ 사슬 등이 있고, 이들 CDR 에 대해서도 동일하다.

본 명세서 중에 있어서, 「가변 영역」 이란, CDR1 ∼ CDR3 (이하, 간단히 「CDRs1-3」 이라고 한다) 을 포함하는 영역을 의미한다. 이들 CDRs1-3 의 배치 순서는 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는, N 말단측으로부터 C 말단측의 방향으로, CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 순서이거나, 혹은 이 반대의 순서로, 연속 또는 후술하는 프레임 워크 영역 (FR) 이라고 칭해지는 다른 아미노산 서열을 개재하여, 배치된 영역을 의미한다. 또한, 「중사슬 가변 영역」 이란, 이뮤노글로불린에 있어서, 상기 서술한 중사슬 CDRs1-3 이 배치된 영역이고, 「경사슬 가변 영역」 이란, 이뮤노글로불린에 있어서, 상기 서술한 경사슬 CDRs1-3 이 배치된 영역이다. T 세포 수용체에 있어서도, α 사슬, β 사슬, γ 사슬, δ 사슬 등이 있고, 이들 CDR 대해서도 동일하다.

각 가변 영역의 상기 CDR1-3 이외의 영역은, 상기 서술하는 바와 같이 프레임 워크 영역 (FR) 이라고 칭해진다. 특히 가변 영역의 N 말단과 상기 CDR1 사이의 영역을 FR1, CDR1 과 CDR2 사이의 영역을 FR2, CDR2 와 CDR3 사이의 영역을 FR3, CDR3 과 가변 영역의 C 말단 사이를 FR4 로 각각 정의된다.

2. 키메라 표적 인자 수용체

본 발명은, 그 일 양태에 있어서, 표적 인자 결합성 도메인, 막 관통 도메인, 및 TLR 세포내 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는, 키메라 표적 인자 수용체 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 키메라 표적 인자 수용체」 로 나타내는 경우도 있다.) 에 관한 것이다. 이하에, 이것에 대해 설명한다.

표적 인자 결합성 도메인은, 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체가 세포막 상에 배치되었을 때에 세포외에 배치되는 도메인이고, 표적 인자를 인식하고, 당해 표적 인자에 결합할 (바람직하게는 특이적으로 결합할) 수 있는 도메인인 한, 특별히 제한되지 않는다. 표적 인자로는, 예를 들어 암항원, 각종 수용체 (예를 들어, 인터류킨 수용체 등의 사이토카인 수용체, 세포 증식 인자 수용체 등), 세포 접착 인자, 세균·바이러스의 막 단백질 등을 들 수 있다. 표적 인자의 구체예로는, 예를 들어 CD19, GD2, GD3, CD20, CD37, CEA, HER2, EGFR, type III mutant EGFR, CD38, BCMA, MUC-1, PSMA, WT1, cancer testis antigen (예를 들어 NY-ESO-1, MAGE-A4 등), mutation peptide (예를 들어 k-ras, h-ras, p53 등), hTERT, PRAM, TYRP1, 메소텔린, PMEL, 뮤신, IL-12R, IL-4R, IL-13R, IL-6R, IL-23R, CTLA4, EGFR806, PSCA, Claudin 18.2, EpCAM, VEGFR2, Nectin4/FAP, LewisY, Glypican-3, IL-13Rα2, CD171, MUC16, AFP, AXL, CD80/86, c-MET, DLL-3, DR5, EpHA2, FR-α, gp100, MAGE-A1/3/4, LMP1 등을 들 수 있다. 표적 인자 결합성 도메인으로는, 예를 들어 항체 또는 T 세포 수용체의 CDR 을 포함하는 도메인, 사이토카인 또는 세포 증식 인자의 전부 또는 일부를 포함하는 도메인 (사이토카인 또는 세포 증식 인자 도메인), 세포 접착 인자의 전부 또는 일부를 포함하는 도메인 (세포 접착 인자 도메인) 등을 들 수 있다. 항체 또는 T 세포 수용체의 CDR 을 포함하는 도메인은, 통상, 표적 인자에 대한 항체 또는 T 세포 수용체의 CDR (예를 들어, 항체의 CDR 이면, 중사슬 CDR1, 중사슬 CDR2, 중사슬 CDR3, 경사슬 CDR1, 경사슬 CDR2, 및 경사슬 CDR3) 중 1 개 이상, 바람직하게는 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 이상, 보다 바람직하게는 6 개 모두를 갖는다. CDR 을 포함하는 도메인은, 보다 바람직하게는 표적 인자에 대한 항체 또는 T 세포 수용체의 가변 영역 (항체의 경우이면, 예를 들어 중사슬 가변 영역 및/또는 경사슬 가변 영역) 을 포함한다. 사이토카인 또는 세포 증식 인자 도메인으로는, 예를 들어 IL-12, IL-4, IL-13, IL-6, IL-23, GM-CSF 등의, 수용체와의 결합성을 갖는 도메인을 포함하는 도메인을 들 수 있다.

표적 인자 결합성 도메인이 CDR 을 포함하는 도메인인 경우는, 단사슬 항체 구조를 취하는 것이 바람직하고, scFv 구조를 취하는 것이 보다 바람직하다. scFv 구조와 같이 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역을 포함하는 경우, 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역은, 통상, 링커를 개재하여 연결되어 있다. 링커는, 표적 인자 결합성이 현저하게 저해되지 않는 한 특별히 제한되지 않고, 임의이다. 링커로는, 바람직하게는 글리신 혹은 글리신과 세린으로 구성되는 링커 (GGS 링커, GS 링커, GGG 링커 등) 이다. 링커의 길이는 특별히 한정되지 않는다. 링커의 아미노산 잔기수는, 예를 들어 5 ∼ 30 이다. 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역의 배치 관계는 특별히 제한되지 않고, N 말단측이 경사슬 가변 영역인 양태와, N 말단측이 중사슬 가변 영역인 경우 중 어느 것이라도 채용 가능하다.

막 관통 도메인은, 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체가 세포막 상에 배치되었을 때에 세포막 내에 배치되는 도메인이고, 키메라 표적 인자 수용체를 구성할 수 있는 것인 한, 특별히 제한되지 않는다. 막 관통 도메인으로는, 예를 들어, CD28, CD3ε, CD8α, CD3, CD4, 4-1BB 등의 막 관통 영역을 사용할 수 있다. 막 관통 영역은, 공지이거나, 혹은 공지된 서열 정보로부터 (예를 들어 막 관통 영역의 예측 프로그램 등을 이용하여,) 용이하게 결정할 수 있다. 또, 인공적으로 구축한 폴리펩티드로 이루어지는 막 관통 도메인을 사용하는 것으로 해도 된다. 이들 막 관통 도메인은, 키메라 표적 인자 수용체의 기능을 현저하게 저해하지 않는 한, 적절히 변이가 도입되어 있어도 된다.

막 관통 도메인으로는, 바람직하게는 CD28 의 막 관통 영역을 채용할 수 있다. CD28 의 막 관통 영역의 구체예로는, 하기 (a) 에 기재하는 아미노산 서열 또는 하기 (b) 에 기재하는 아미노산 서열 :

(a) 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열, 또는

(b) 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열과 85 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체가 세포막 상에 배치되었을 때에 세포막 내에 배치될 수 있는 아미노산 서열

을 들 수 있다.

상기 (b) 에 있어서, 동일성은, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 98 ％ 이상, 특히 바람직하게는 99 ％ 이상이다.

상기 (b) 에 기재하는 아미노산 서열의 일례로는, 예를 들어

(b') 서열 번호 3 에 나타내는 아미노산 서열에 대해 1 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 또는 삽입된 아미노산 서열로서, 또한 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체가 세포막 상에 배치되었을 때에 세포막 내에 배치될 수 있는 아미노산 서열

을 들 수 있다.

상기 (b') 에 있어서, 복수개란, 예를 들어 2 ∼ 5 개이고, 바람직하게는 2 ∼ 3 개이고, 보다 바람직하게는 2 개이다.

표적 인자 결합성 도메인과 막 관통 도메인은, 직접 또는 스페이서를 개재하여 연결된다. 스페이서의 서열은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 IgG, 바람직하게는 인간 IgG (예를 들어 서브타입 IgG1 이나 IgG4) 의 힌지부 또는 그 일부, 힌지부와 CH2 의 일부, 혹은 막 관통 도메인에 이용하는 인자 (예를 들어 CD28) 의 일부 등의 서열을 스페이서에 사용할 수 있다. 또한, 힌지부 또는 그 일부의 서열을 이용함으로써, 유연성이 풍부한 스페이서가 구성되는 것을 기대할 수 있다.

세포내 도메인은, 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체가 세포막 상에 배치되었을 때에 세포 내에 배치되는 도메인이고, 항원 제시 세포의 활성화에 필요한 시그널을 전달하는 것이 가능한 도메인이다. 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체는, 세포내 도메인이 TLR 세포내 도메인을 포함한다.

TLR 세포내 도메인은, TLR (Toll-like receptor) 의 세포내 도메인의 아미노산 서열로 이루어지는 도메인이고, 이 한정에 있어서 특별히 제한되지 않는다.

TLR 로는, 예를 들어 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 고양이, 토끼 등의 여러 가지 포유류 유래의 TLR 을 채용할 수 있다. 그 중에서도, 대상 생물 (예를 들어 인간) 유래의 TLR 이 바람직하다. 여러 가지 생물종 유래 TLR 세포내 도메인의 아미노산 서열은 공지이다.

TLR 로는, 예를 들어, TLR1 (세포내 도메인의 아미노산 서열은 예를 들어 서열 번호 3), TLR2 (세포내 도메인의 아미노산 서열은 예를 들어 서열 번호 4), TLR3 (세포내 도메인의 아미노산 서열은 예를 들어 서열 번호 5), TLR4 (세포내 도메인의 아미노산 서열은 예를 들어 서열 번호 6), TLR9 (세포내 도메인의 아미노산 서열은 예를 들어 서열 번호 7) 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 항원 제시 세포 활성화능의 관점, 표적 인자에 응답하여 항원 제시 세포를 보다 조기에, 또 보다 지속적으로 활성화할 수 있다는 관점 등에서, 바람직하게는 TLR2, TLR3, TLR9 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 TLR3, TLR9 등을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 TLR3 을 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 양태에 있어서는, TLR 세포내 도메인은, TLR2 세포내 도메인, TLR3 세포내 도메인, 및 TLR9 세포내 도메인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종이다.

TLR 세포내 도메인은, 항원 제시 세포 활성화 작용을 갖는 한, 아미노산의 치환, 결실, 부가, 삽입 등의 변이를 가지고 있어도 된다. 변이로는, 상기 작용이 보다 저해되기 어렵다는 관점에서, 바람직하게는 치환, 보다 바람직하게는 보존적 치환을 들 수 있다.

TLR 세포내 도메인의 아미노산 서열의 바람직한 구체예로는, 하기 (c) 에 기재하는 아미노산 서열 및 하기 (d) 에 기재하는 아미노산 서열 :

(c) 서열 번호 3 ∼ 7 중 어느 것에 나타내는 아미노산 서열, 및

(d) 서열 번호 3 ∼ 7 중 어느 것에 나타내는 아미노산 서열과 85 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 항원 제시 세포 활성화 작용을 갖는 단백질을 구성하는 아미노산 서열

로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.

상기 (d) 에 있어서, 동일성은, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 98 ％ 이상, 특히 바람직하게는 99 ％ 이상이다.

상기 (d) 에 기재하는 아미노산 서열의 일례로는, 예를 들어

(d') 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열에 대해 1 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 또는 삽입된 아미노산 서열로서, 또한 항원 제시 세포 활성화 작용을 갖는 아미노산 서열

을 들 수 있다.

상기 (d') 에 있어서, 복수개란, 예를 들어 2 ∼ 5 개이고, 바람직하게는 2 ∼ 3 개이고, 보다 바람직하게는 2 개이다.

세포내 도메인은, 항원 제시 세포 활성화능의 관점, 표적 인자에 응답하여 항원 제시 세포를 보다 조기에, 또한 보다 지속적으로 활성화할 수 있다는 관점 등에서, 바람직하게는 추가로 CD40 세포내 도메인을 포함할 수 있다.

CD40 세포내 도메인은, CD40 의 아미노산의 세포내 도메인의 아미노산 서열로 이루어지는 도메인이고, 이 한정에 있어서 특별히 제한되지 않는다.

CD40 으로는, 예를 들어 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 고양이, 토끼 등의 여러 가지 포유류 유래의 CD40 을 채용할 수 있다. 그 중에서도, 대상 생물 (예를 들어 인간) 유래의 CD40 이 바람직하다.

여러 가지 생물종 유래 CD40 세포내 도메인의 아미노산 서열은 공지이다. 구체적으로는, 예를 들어, 서열 번호 8 에 나타내는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

CD40 세포내 도메인은, 항원 제시 세포 활성화 작용을 갖는 한, 아미노산의 치환, 결실, 부가, 삽입 등의 변이를 가지고 있어도 된다. 변이로는, 상기 작용이 보다 저해되기 어렵다는 관점에서, 바람직하게는 치환, 보다 바람직하게는 보존적 치환을 들 수 있다.

CD40 세포내 도메인의 아미노산 서열의 바람직한 구체예로는, 하기 (e) 에 기재하는 아미노산 서열 및 하기 (f) 에 기재하는 아미노산 서열 :

(e) 서열 번호 8 에 나타내는 아미노산 서열, 및

(f) 서열 번호 8 에 나타내는 아미노산 서열과 85 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 항원 제시 세포 활성화 작용을 갖는 단백질을 구성하는 아미노산 서열

로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.

상기 (f) 에 있어서, 동일성은, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 98 ％ 이상, 특히 바람직하게는 99 ％ 이상이다.

상기 (f) 에 기재하는 아미노산 서열의 일례로는, 예를 들어

(f') 서열 번호 8 에 나타내는 아미노산 서열에 대해 1 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 또는 삽입된 아미노산 서열로서, 또한 항원 제시 세포 활성화 작용을 갖는 아미노산 서열

을 들 수 있다.

상기 (f') 에 있어서, 복수개란, 예를 들어 2 ∼ 5 개이고, 바람직하게는 2 ∼ 3 개이고, 보다 바람직하게는 2 개이다.

세포내 도메인이 CD40 세포내 도메인을 포함하는 경우, TLR 세포내 도메인과 CD40 세포내 도메인의 배치 관계는 특별히 제한되지 않고, N 말단측이 TLR 세포내 도메인인 양태와, N 말단측이 CD40 세포내 도메인인 경우 중 어느 것이라도 채용 가능하다. TLR 세포내 도메인 및 CD40 세포내 도메인은, 직접 연결되어 있거나, 혹은 링커를 개재하여 연결되어 있는 것이 바람직하다. 링커는, 특별히 제한되지 않고, 임의이다. 링커로는, 바람직하게는 글리신 혹은 글리신과 세린으로 구성되는 링커 (GGS 링커, GS 링커, GGG 링커 등) 이다. 링커의 길이는 특별히 한정되지 않는다. 링커의 아미노산 잔기수는, 예를 들어 1 ∼ 20, 바람직하게는 1 ∼ 10, 보다 바람직하게는 1 ∼ 5 이다.

본 발명의 키메라 표적 인자 수용체는, 상기 이외의 다른 영역을 포함할 수 있다. 다른 영역으로는, 예를 들어 CD3ζ, FcεRIγ 등의 세포내 도메인, CAR 의 세포막 상으로의 수송을 촉진하기 위해서 리더 서열 (시그널 펩티드) (예를 들어, GM-CSF 리셉터의 리더 서열), 스페이서/링커 (예를 들어 막 관통 영역과 세포내 시그널 도메인 사이, 세포내 도메인 내의 각 도메인간) 등을 들 수 있다.

본 발명의 키메라 표적 인자 수용체는, 표적 인자 결합성 도메인, 막 관통 도메인, 및 세포내 도메인이, 이 순서로 배치되어 있다.

본 발명의 키메라 표적 인자 수용체는, 1 종의 폴리펩티드로 이루어지는 분자여도 되고, 2 종 이상의 폴리펩티드의 복합체로 이루어지는 분자여도 된다. 또, 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체는, 폴리펩티드 또는 그 복합체로 이루어지는 분자여도 되고, 폴리펩티드 또는 그 복합체에, 다른 물질 (예를 들어 형광 물질, 방사성 물질, 무기 입자 등) 이 연결되어 이루어지는 것이어도 된다.

본 발명의 키메라 표적 인자 수용체는, 화학 수식된 것이어도 된다. 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체를 구성하는 폴리펩티드는, C 말단이 카르복실기 (-COOH), 카르복실레이트 (-COO-), 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) 중 어느 것이어도 된다. 여기서 에스테르에 있어서의 R 로는, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸 등의 C_1-6 알킬기 ; 예를 들어, 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C_3-8 시클로알킬기 ; 예를 들어, 페닐, α-나프틸 등의 C_6-12 아릴기 ; 예를 들어, 벤질, 페네틸 등의 페닐-C_1-2 알킬기 ; α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C_1-2 알킬기 등의 C_7-14 아르알킬기 ; 피발로일옥시메틸기 등이 사용된다. 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체를 구성하는 폴리펩티드는, C 말단 이외의 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 가, 아미드화 또는 에스테르화되어 있어도 된다. 이 경우의 에스테르로는, 예를 들어 상기한 C 말단의 에스테르 등이 사용된다. 또한, 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체를 구성하는 폴리펩티드에는, N 말단의 아미노산 잔기의 아미노기가 보호기 (예를 들어, 포르밀기, 아세틸기 등의 C_1-6 알카노일 등의 C_1-6 아실기 등) 로 보호되어 있는 것, 생체 내에서 절단되어 생성할 수 있는 N 말단의 글루타민 잔기가 피로글루탐산화된 것, 분자 내의 아미노산의 측사슬 상의 치환기 (예를 들어 -OH, -SH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등) 가 적당한 보호기 (예를 들어, 포르밀기, 아세틸기 등의 C_1-6 알카노일기 등의 C_1-6 아실기 등) 로 보호되어 있는 것도 포함된다.

본 발명의 키메라 표적 인자 수용체는, 공지된 단백질 태그, 시그널 서열 등의 단백질 또는 펩티드가 부가된 것이어도 된다. 단백질 태그로는, 예를 들어 비오틴, His 태그, FLAG 태그, Halo 태그, MBP 태그, HA 태그, Myc 태그, V5 태그, PA 태그, 형광 단백질 태그 등을 들 수 있다.

본 발명의 키메라 표적 인자 수용체는, 산 또는 염기와의 약학적으로 허용되는 염의 형태여도 된다. 염은, 약학적으로 허용되는 염인 한 특별히 한정되지 않고, 산성염, 염기성염 모두 채용할 수 있다. 예를 들어 산성염의 예로는, 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 인산염 등의 무기산염 ; 아세트산염, 프로피온산염, 타르타르산염, 푸마르산염, 말레산염, 말산염, 시트르산염, 메탄술폰산염, 파라톨루엔술폰산염 등의 유기산염 ; 아스파르트산염, 글루탐산염 등의 아미노산염 등을 들 수 있다. 또, 염기성염의 예로서, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염 ; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 등을 들 수 있다.

본 발명의 키메라 표적 인자 수용체는 용매화물의 형태여도 된다. 용매는, 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 물, 에탄올, 글리세롤, 아세트산 등을 들 수 있다.

키메라 표적 인자 수용체 및 그것을 발현하는 세포를 제조하는 기술은 공지이다. 이들은, 공지된 방법에 따라서 또는 준하여, 제조할 수 있다.

3. 폴리뉴클레오티드 및 그 이용

본 발명은, 그 일 양태에 있어서, 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체를 코드하는, 폴리뉴클레오티드 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 폴리뉴클레오티드」 라고 나타내는 경우도 있다.) 에 관한 것이다. 이하, 이것에 대해 설명한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체의 코드 서열 이외에, 다른 서열을 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체를 발현 가능한 상태로 포함하는 것이 바람직하다. 다른 서열로는, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 리프레서 서열, 인슐레이터 서열, 복제 기점, 리포터 단백질 (예를 들어, 형광 단백질 등) 코드 서열, 약제 내성 유전자 코드 서열 등을 들 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 바람직하게는 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체의 발현 카세트를 포함한다. 발현 카세트는 프로모터와, 당해 프로모터의 제어하에 있는 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체의 코드 서열을 포함한다. 프로모터의 제어하가 되도록, 통상, 프로모터의 하류에 코드 서열을 배치한다. 발현 카세트에 이용 가능한 프로모터로는, 예를 들어 CMV-IE (사이토메갈로 바이러스 초기 유전자 유래 프로모터), SV40ori, 레트로바이러스 LTP, SRα, EF1α, β 액틴 프로모터 등을 들 수 있다. 프로모터는 코드 서열에 작동 가능하게 연결된다. 여기서, 「프로모터가 코드 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는」 이란, 「프로모터의 제어하에 코드 서열이 배치되어 있는」 것과 동일한 의미이고, 통상, 프로모터의 3' 말단측에 직접 또는 다른 서열을 개재하여 코드 서열이 연결되게 된다. 코드 서열의 하류에는 폴리 A 부가 시그널 서열을 배치한다. 폴리 A 부가 시그널 서열의 사용에 의해 전사를 종료시킨다. 폴리 A 부가 시그널 서열로는 SV40 의 폴리 A 부가 서열, 소 유래 성장 호르몬 유전자의 폴리 A 부가 서열 등을 사용할 수 있다.

발현 카세트 내에 검출용 유전자 (리포터 유전자, 세포 또는 조직 특이적인 유전자, 선택 마커 유전자 등), 인핸서 서열, WRPE 서열 등을 포함시키는 것으로 해도 된다. 검출용 유전자는, 발현 카세트의 도입의 성공 여부나 효율의 판정, CAR 유전자의 발현의 검출 또는 발현 효율의 판정, CAR 유전자가 발현한 세포의 선택이나 분취 등에 이용된다. 한편, 인핸서 서열의 사용에 의해 발현 효율의 향상이 도모된다. 검출용 유전자로는, 네오마이신에 대한 내성을 부여하는 neo 유전자, 카나마이신 등에 대한 내성을 부여하는 npt 유전자 (Herrera Estrella, EMBO J. 2(1983), 987 - 995) 나 nptII 유전자 (Messing & Vierra. Gene 1 9 : 259 - 268(1982)), 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hph 유전자 (Blochinger & Diggl mann, Mol Cell Bio 4 : 2929 - 2931), 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr 유전자 (Bourouis et al., EMBO J. 2(7)) 등 (이상, 마커 유전자), 루시페라아제 유전자 (Giacomin, P1. Sci. 116(1996), 59 ∼ 72 ; Scikantha, J. Bact. 178(1996), 121), β-글루쿠로니다아제 (GUS) 유전자, GFP (Gerdes, FEBS Lett. 389(1996), 44 - 47) 나 그 개변체 (EGFP 나 d2EGFP 등) 등의 형광 단백질의 유전자 (이상, 리포터 유전자), 세포내 도메인이 부족한 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 유전자 등의 유전자를 사용할 수 있다. 검출용 유전자는, 예를 들어, 바이시스트로닉성 제어 서열 (예를 들어, 리보솜 내부 인식 서열 (IRES)) 이나 자기 개열 펩티드를 코드하는 서열을 개재하여 키메라 표적 인자 수용체 유전자에 연결되어 있다. 자기 개열 펩티드의 예는 Thosea asigna virus 유래의 2A 펩티드 (T2A) 이지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 자기 개열 펩티드로서 제역 (蹄疫) 바이러스 (FMDV) 유래의 2A 펩티드 (F2A), 말 비염 A 바이러스 (ERAV) 유래의 2A 펩티드 (E2A), porcine teschovirus (PTV-1) 유래의 2A 펩티드 (P2A) 등이 알려져 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 직사슬형의 폴리뉴클레오티드여도 되고, 고리형의 폴리뉴클레오티드 (벡터 등) 여도 된다. 벡터는, 플라스미드 벡터, 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 또, 벡터는, 예를 들어, 클로닝용 벡터 또는 발현용 벡터일 수 있다. 발현용 벡터로는, 대장균, 또는 방선균 등의 원핵 세포용의 벡터, 혹은, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 포유류 세포 등의 진핵 세포용의 벡터를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 바이러스 벡터로서 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터 등을 들 수 있고, 비바이러스 벡터의 예로는, 각종 플라스미드 벡터, 리포솜 벡터, 정전하형 리포솜 벡터 (Felgner, P. L., Gadek, T. R., Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84 : 7413 - 7417, 1987), YAC 벡터, BAC 벡터를 들 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, DNA, RNA 뿐만 아니라, 이들에, 다음에 예시하는 바와 같이, 공지된 화학 수식이 실시된 것도 포함한다. 뉴클레아제 등의 가수분해 효소에 의한 분해를 방지하기 위해, 각 뉴클레오티드의 인산 잔기 (포스페이트) 를, 예를 들어, 포스포로티오에이트 (PS), 메틸포스포네이트, 포스포로디티오네이트 등의 화학 수식 인산 잔기로 치환할 수 있다. 또, 각 리보뉴클레오티드의 당 (리보스) 의 2 위치의 수산기를, -OR (R 은, 예를 들어 CH3(2'-O-Me), CH₂CH₂OCH₃(2'-O-MOE), CH₂CH₂NHC(NH)NH₂, CH₂CONHCH₃, CH₂CH₂CN 등을 나타낸다) 로 치환해도 된다. 또한, 염기 부분 (피리미딘, 푸린) 에 화학 수식을 실시해도 되고, 예를 들어, 피리미딘염기의 5 위치로의 메틸기나 카티온성 관능기의 도입, 혹은 2 위치의 카르보닐기의 티오카르보닐로의 치환 등을 들 수 있다. 나아가서는, 인산 부분이나 하이드록실 부분이, 예를 들어, 비오틴, 아미노기, 저급 알킬아민기, 아세틸기 등으로 수식된 것 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또, 「폴리뉴클레오티드」 의 단어는, 천연의 핵산 뿐만 아니라, BNA (Bridged Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), PNA (Peptide Nucleic Acid) 등 중 어느 것도 포함한다.

본 발명의 일 양태에 있어서는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 항원 제시 세포에 도입하는 것을 포함하는 방법에 의해, 표적 인자에 응답하여 활성화하는 항원 제시 세포를 얻을 수 있다. 당해 세포는, 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체를 발현한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 도입되는 항원 제시 세포로는, 예를 들어 수상 세포, 매크로파지, 그들의 전구 세포 등을 들 수 있다. 이들 세포를 포함하는 것이면, 여러 가지 세포 집단을 사용할 수 있다.

4. 세포

본 발명은, 그 일 양태에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 세포 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 세포」 라고 나타내는 경우도 있다.) 에 관한 것이다. 이하, 이것에 대해 설명한다.

본 발명의 세포의 유래 세포는, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 세포를, 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체의 정제에 있어서 사용하는 목적이면, 유래 세포로는, 단백질 발현에 사용할 수 있는 세포 (예를 들어, 곤충 세포, 진핵 세포, 포유류 세포 등) 등을 들 수 있다.

본 발명의 세포는 바람직하게는 항원 제시 세포 (예를 들어, 수상 세포, 매크로파지 등, 특히 바람직하게는 수상 세포) 이다. 또, 본 발명의 세포는, 일 양태에 있어서는, ES 세포, iPS 세포 등의, 항원 제시 세포로 분화 유도 가능한 줄기 세포일 수 있다. 이들 세포는, 바람직하게는 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체를 발현하는 세포이고, 보다 구체적인 양태에 있어서는, 이들 세포는, 본 발명의 표적 인자 수용체가 세포막 상에 발현하고 있고, 바람직하게는 본 발명의 표적 인자 수용체가 표적 인자 결합성 도메인을 세포막 외에 노출된 상태에서 발현하고 있다.

키메라 표적 인자 수용체를 발현하는 항원 제시 세포 등은 표적 인자 결합성 도메인으로 표적 인자를 인식한 후, 그 인식 시그널을 세포 내부에 전달하고, 그 세포 자신이 활성화된다. 그것에 의해, T 세포 (예를 들어 Th1 세포, Th2 세포, Th17 세포, 세포 장해성 T 세포 등), B 세포 등의 활성을 조절하여, 항암 활성, 면역 조절 활성 등을 발휘할 수 있다. 따라서, 본 발명의 키메라 표적 인자 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 (특히, 항원 제시 세포) 는, 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용하다.

5. 의약 조성물

본 발명은, 그 일 양태에 있어서, 본 발명의 세포를 함유하는, 의약 조성물 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 의약 조성물」 로 나타내는 경우도 있다.) 에 관한 것이다. 이하, 이것에 대해 설명한다.

본 발명의 의약 조성물은, 세포 제제로서, 표적 인자를 발현하는 종양/암의 치료, 예방, 또는 개선이나, 자기 면역 질환, 알레르기 질환 등의 치료, 예방, 또는 개선이나, 감염증의 치료, 예방, 또는 개선 등에 널리 이용할 수 있다. 암은 고형암 및 혈액암을 포함한다. 암으로는, 예를 들어 각종 B 세포성 악성 림프종 (B 세포성 급성 림프성 백혈병, 여포성 림프종, 미만성 림프종, 맨틀 세포 림프종, MALT 림프종, 혈관내 B 세포성 림프종, CD20 양성 호지킨 림프종 등), 골수 증식성 질환, 골수 이형성/골수 증식성 종양 (CMML, JMML, CML, MDS/MPN-UC), 골수 이형성 증후군, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 폐암, 대장암, 난소암, 유방암, 뇌종양, 위암, 간암, 설암, 갑상선암, 신장암, 전립선암, 자궁암, 골육종, 연골 육종, 횡문근 육종 등을 들 수 있다. 「치료」 란, 표적 질환에 특징적인 증상 또는 수반 증상을 완화시키는 것 (경증화), 증상의 악화를 저지 내지 지연시키는 것 등이 포함된다. 「예방」 이란, 질병 (장해) 또는 그 증상의 발증/발현을 방지 또는 지연시키는 것, 혹은 발증/발현의 위험성을 저하시키는 것을 말한다. 한편, 「개선」 이란, 질병 (장해) 또는 그 증상이 완화 (경증화), 호전, 관해, 또는 치유 (부분적인 치유를 포함한다) 되는 것을 말한다.

본 발명의 의약 조성물에는, 본 발명의 세포가 치료상 유효량 함유된다. 예를 들어 1 회의 투여용으로서, 1 × 10⁴ 개 ∼ 1 × 10¹⁰ 개의 세포를 함유시킬 수 있다. 세포의 보호를 목적으로 하여 디메틸술폭사이드 (DMSO) 나 혈청 알부민 등, 세균의 혼입을 저지할 목적으로 항생 물질 등, 세포의 활성화, 증식 또는 분화 유도 등을 목적으로 한 각종 성분 (비타민류, 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드 등) 등의 성분을 세포 제제에 함유시킬 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 투여 경로는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 문맥내 주사, 피내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 또는 복강내 주사에 의해 투여한다. 전신 투여에 상관 없이, 국소 투여하는 것으로 해도 된다. 국소 투여로서, 목적으로 하는 조직·장기·기관으로의 직접 주입을 예시할 수 있다. 투여 스케줄은, 대상 (환자) 의 성별, 연령, 체중, 병태 등을 고려하여 작성하면 된다. 단회 투여 외에, 연속적 또는 정기적으로 복수회 투여하는 것으로 해도 된다.

본 발명의 의약 조성물, 본 발명의 세포는, 다른 약제와 병용할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물, 본 발명의 세포는, 특히, 면역 체크 포인트 저해제 (예를 들어 항 PD-1 항체 (예를 들어, 니볼루맙이나 펨브롤리주맙 등), 항 PD-L1 항체 (예를 들어, 티센트릭이나 더발루맙이나 아벨루맙 등), 항 CTLA-4 항체 (예를 들어, 이필리무맙 등) 등) 와 병용함으로써, 항종양 효과 등을 향상시킬 수 있다. 이 관점에서, 본 발명의 의약 조성물, 본 발명의 세포는, 면역 체크 포인트 저해제와 병용하기 위해서, 사용할 수 있고, 또 본 발명의 의약 조성물은 면역 체크 포인트 저해제를 포함할 수 있다. 또한, 병용의 타이밍은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 본 발명의 의약 조성물, 본 발명의 세포와 면역 체크 포인트 저해제가 동시 또는 동일 투여여도 되고, 일방의 투여일의 1 또는 복수일 (예를 들어 2 ∼ 14 일) 전 또는 후에 다른 일방을 투여하는 형태여도 된다.

실시예

이하에, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

시험예 1. 키메라 표적 인자 수용체 컨스트럭트의 제조

N 말단측으로부터,

·GMCSFR 의 시그널 펩티드 (아미노산 서열 : 서열 번호 19, 염기 서열 : 서열 번호 20),

·항 Her2 scFv 도메인 (아미노산 서열 : 서열 번호 1, 염기 서열 : 서열 번호 9),

·CD28 막 관통 도메인 (아미노산 서열 : 서열 번호 2, 염기 서열 : 서열 번호 10),

·세포내 도메인 :

(a) TLR1 세포내 도메인 (아미노산 서열 : 서열 번호 3, 염기 서열 : 서열 번호 11)

(b) TLR2 세포내 도메인 (아미노산 서열 : 서열 번호 4, 염기 서열 : 서열 번호 12)

(c) TLR3 세포내 도메인 (아미노산 서열 : 서열 번호 5, 염기 서열 : 서열 번호 13)

(d) TLR4 세포내 도메인 (아미노산 서열 : 서열 번호 6, 염기 서열 : 서열 번호 14)

(e) TLR9 세포내 도메인 (아미노산 서열 : 서열 번호 7, 염기 서열 : 서열 번호 15)

(f) TLR2 세포내 도메인-CD40 세포내 도메인 (아미노산 서열 : 서열 번호 8, 염기 서열 : 서열 번호 16)

(g) TLR3 세포내 도메인-CD40 세포내 도메인

(h) TLR9 세포내 도메인-CD40 세포내 도메인

(i) CD40 세포내 도메인-TLR2 세포내 도메인

(j) CD40 세포내 도메인-TLR3 세포내 도메인, 또는

(k) CD40 세포내 도메인-TLR9 세포내 도메인

의 순서로 배치되어서 이루어지는 키메라 표적 인자 수용체 컨스트럭트를 디자인하였다.

또한, N 말단측으로부터,

·GMCSFR 의 시그널 펩티드 (아미노산 서열 : 서열 번호 19, 염기 서열 : 서열 번호 20),

·항메소텔린 (MSLN) scFv 도메인 (아미노산 서열 : 서열 번호 17, 염기 서열 : 서열 번호 18),

·CD28 막 관통 도메인,

·세포내 도메인 :

(A) TLR1 세포내 도메인

(B) TLR2 세포내 도메인

(C) TLR3 세포내 도메인

(D) TLR4 세포내 도메인

(E) TLR9 세포내 도메인

(F) TLR2 세포내 도메인-CD40 세포내 도메인,

(G) TLR9 세포내 도메인-CD40 세포내 도메인

(H) CD40 세포내 도메인

(I) CD40 세포내 도메인-TLR9 세포내 도메인

(J) 없음

의 순서로 배치되어서 이루어지는 키메라 표적 인자 수용체 컨스트럭트를 디자인하였다.

상기 키메라 표적 인자 수용체 및 상기 키메라 표적 인자 수용체에 있어서 세포내 도메인을 결실시킨 키메라 표적 인자 수용체의 코드 서열을 pMXs-GFP 벡터(코스모·바이오사) 에 삽입하여, pMXs-CAR-GFP 벡터를 얻었다.

시험예 2. 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포의 제조

레트로바이러스 조제 세포 Plat-A 세포 (Cell Biolabs Inc 사) 에 pMXs-CAR-GFP 벡터 (시험예 1) 를 TransIT-293 Reagent (Mirus 사) 를 사용하여, 도입하였다. 48 시간 후, 배양 상청을 회수하였다. THP-1 세포 (JCRB 세포 뱅크로부터 입수) 에 배양 상청을 첨가하여, 바이러스에 감염시켰다. 감염 48 시간 후, BD FACS Aria 로 GFP 양성 세포를 회수하였다. 얻어진 세포에 인간 GM-CSF (BioLegend 사) 및 인간 IL-4 (BioLegend 사를 첨가, 5 일간 배양하고, 수상 세포로 분화시켜, 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포를 얻었다.

시험예 3. 키메라 표적 인자 수용체 발현 매크로파지의 제조

레트로바이러스 조제 세포 Plat-A 세포 (Cell Biolabs Inc 사) 에 pMXs-CAR-GFP 벡터 (시험예 1) 를 TransIT-293 Reagent (Mirus 사) 를 사용하여, 도입하였다. 48 시간 후, 배양 상청을 회수하였다. U937 세포 (JCRB 세포 뱅크로부터 입수) 에 배양 상청을 첨가하여, 바이러스에 감염시켰다. 감염 48 시간 후, BD FACS Aria 로 GFP 양성 세포를 회수하여, 키메라 표적 인자 수용체 발현 매크로파지를 얻었다.

시험예 4. In vitro 수상 세포 활성화 시험 1

Her2 발현 세포 (SKOV3 세포 : ATCC 로부터 입수) 에 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포 (시험예 2 : 표적 인자는 Her2) 를 첨가하고, 5, 24, 48 시간 배양하고, 수상 세포 활성화의 지표 인자 (CD80 및 CD86) 의 발현을 FACS 로 조사하였다.

결과를 도 1 ∼ 5 에 나타낸다. 도 1 ∼ 3 에 나타내는 바와 같이, 세포내 도메인으로서 TLR 의 세포내 도메인을 채용함으로써, 표적 인자에 응답하여, CD80 의 발현을 증가시킬 수 있는 것을 알 수 있었다. 그 중에서도, TLR3 및 9 의 세포내 도메인을 채용한 경우에는, 비교적 빠른 단계 (5 시간, 도 1) 에서 CD80 의 발현을 증가시킬 수 있고, 또, TLR2, 3 및 9 의 세포내 도메인을 채용한 경우에는, 보다 지속적으로 (48 시간, 도 3) CD80 의 발현을 증가시킬 수 있는 것을 알 수 있었다. 또, 도 4 에 나타내는 바와 같이, 세포내 도메인으로서 TLR 의 세포내 도메인을 채용함으로써, 표적 인자에 응답하여, CD86 의 발현도 증가시킬 수 있는 것을 알 수 있었다. 또, 세포내 도메인으로서 TLR 의 세포내 도메인에 더하여 CD40 의 세포내 도메인을 사용함으로써, 보다 지속적으로 (24 시간, 도 5) CD86 의 발현을 증가시킬 수 있는 것을 알 수 있었다.

시험예 5. In vitro 매크로파지 탐식 시험

Her2 발현 세포 (SKOV3 세포 : ATCC 로부터 입수) 에 키메라 표적 인자 수용체 발현 매크로파지 (시험예 2 : 표적 인자는 Her2) 를 첨가하고, 48 시간 배양하고, phagocytosis assay kit (Cayman 사) 를 사용하여, 탐식능을 조사하였다.

결과를 도 6 에 나타낸다. 도 6 에 나타내는 바와 같이, 세포내 도메인으로서 TLR 의 세포내 도메인을 채용함으로써, 표적 인자에 응답하여, 매크로파지도 활성화할 수 있는 것을 알 수 있었다.

시험예 6. 항종양 효과의 평가 시험 1

<시험예 6-1. MSLN 발현 마우스 종양 세포 Pan02/MSLN 의 제조>

pMXs-GFP 벡터에 인간 MSLN 유전자를 도입하였다. 얻어진 벡터와 pCL-Eco 벡터 (Addgene) 를 G3T-hi 세포 (Takara Bio 사) 에 TransIT-293 Reagent (Mirus 사) 를 사용하여 도입하였다. 48 시간 후 배양 상청을 회수하였다. 마우스 췌장암 세포 Pan02 세포에 배양 상청을 첨가하여, 바이러스에 감염시켰다. 감염 48 시간 후, BD FACS Aria 로 GFP 양성 세포를 회수하였다.

<시험예 6-2. 항종양 효과의 평가>

마우스의 피하에 Pan02, 또는 Pan02/MSLN (시험예 6-1) 을 이식하고, 수상 세포 (Empty : pMXs-GFP 도입), 또는 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포 (시험예 2 : 표적은 MSLN, 세포내 도메인은 시험예 1 의 (E)) 를 투여하고, 종양 증식 억제를 지표로 각각의 항종양 효과를 검토하였다. 가로세로 2 ㎜ 로 세절 (細切) 한 종양을 마우스의 측복부 피하에 종양 이식 바늘에 의해 이식하였다. 종양의 크기가 100 ㎣ 의 크기에 도달한 시점에서 군 나누기를 실시하고, 세포의 투여를 개시하였다. 세포 (수상 세포 (Empty), 또는 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포 (MSLN-TLR9)) 1 x 10⁵ 개를 종양 내에 1 회 (Day 0) 투여하였다. 주 2 회, 종양 사이즈를 측정하여, 항종양 효과를 평가하였다.

결과를 도 7 및 8 에 나타낸다. 도 7 및 8 에 나타내는 바와 같이, 세포내 도메인으로서 TLR 의 세포내 도메인을 채용함으로써, 표적 인자 (MSLN) 에 응답하여, 항종양 효과를 발휘할 수 있는 것을 알 수 있었다.

시험예 7. In vitro 수상 세포 활성화 시험 2

Her2 발현 세포 (SKOV3 세포 : ATCC 로부터 입수) 에 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포 (시험예 2 : 표적 인자는 Her2) 를 첨가하고, 24 시간 배양하여, 수상 세포 활성화의 지표 인자 (MHC class I 및 MHC class II) 의 발현을 FACS 로 조사하였다.

결과를 도 9 ∼ 10 에 나타낸다. 세포내 도메인으로서 TLR 의 세포내 도메인을 채용함으로써, 표적 인자에 응답하여, MHC class I 및 MHC class II 의 발현을 증가시킬 수 있는 것을 알 수 있었다. 그 중에서도, TLR2, 3, 9 를 사용한 경우에는, 활성화의 정도가 강한 것을 알 수 있었다 (도 9).

시험예 8. In vitro 수상 세포 활성화 시험 3

<시험예 8-1. MSLN 발현 마우스 종양 세포 Panc-1/MSLN 의 제조>

pMXs-rCD2 벡터에 인간 MSLN 유전자를 도입하였다. 얻어진 벡터를 Plat-A 세포 (Cell Biolabs Inc 사) 에 TransIT-293 Reagent (Mirus 사) 를 사용하여 도입하였다. 48 시간 후 배양 상청을 회수하였다. 인간 췌장암 세포 Panc-1 세포 (ATCC 로부터 입수) 에 배양 상청을 첨가하여, 바이러스에 감염시켰다. 감염 48 시간 후, BD FACS Aria 로 rCD2 양성 세포를 회수하였다.

<시험예 8-2. 활성 가능의 평가 시험>

Panc-1/MSLN (시험예 8-1) 에 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포 (시험예 2 : 표적 인자는 MSLN) 를 첨가하고, 24 시간 배양하여, 수상 세포 활성화의 지표 인자 (CD86 및 MHC class II) 의 발현을 FACS 로 조사하였다.

결과를 도 11 ∼ 12 에 나타낸다. 세포내 도메인으로서 TLR 의 세포내 도메인을 채용함으로써, 시험예 4 및 8 과는 상이한 표적 인자를 채용한 경우에도, CD86, 및 MHC clas II 의 발현을 증가시킬 수 있는 것을 알 수 있었다. 또, 본 시험예에 있어서도, 세포내 도메인으로서 TLR 의 세포내 도메인에 더하여 CD40 의 세포내 도메인을 사용함으로써, 수상 세포의 활성화의 정도/지속성을 높일 수 있는 것을 알 수 있었다.

시험예 9. 항종양 효과의 평가 시험 2

마우스의 피하에 Pan02, 또는 Pan02/MSLN (시험예 6-1) 을 이식하고, 수상 세포 (Empty : pMXs-GFP 도입), 또는 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포를 투여하고, 종양 증식 억제를 지표로 각각의 항종양 효과를 검토하였다. 투여한 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포 (시험예 2) 의 표적은 MSLN 이고, 키메라 표적 인자 수용체의 세포내 도메인은 시험예 1 의 (A) ∼ (E), (H), 및 (J) 중 어느 것이다. 가로세로 2 ㎜ 로 세절한 종양을 마우스의 측복부 피하에 종양 이식 바늘에 의해 이식하였다. 이식으로부터 7 일 경과 후에 군 나누기를 실시하고, 세포의 투여를 개시하였다. 세포 (수상 세포 (Empty), 또는 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포) 1 x 10⁵ 개를 종양 내에 1 회 (Day 0) 투여하였다. 주 2 회, 종양 사이즈를 측정하고, 항종양 효과를 평가하였다.

결과를 도 13 에 나타낸다. 세포내 도메인으로서 TLR3 또는 TLR9 의 세포내 도메인을 채용함으로써, 표적 인자 (MSLN) 에 응답하여, 다른 TLR 의 세포내 도메인을 사용하는 경우보다 현저하게 높은 항종양 효과를 발휘할 수 있는 것을 알 수 있었다.

시험예 10. 항종양 효과의 평가 시험 3

마우스의 피하에 Pan02, 또는 Pan02/MSLN (시험예 6-1) 을 이식하고, 수상 세포 (Empty : pMXs-GFP 도입), 또는 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포를 투여하고, 종양 증식 억제를 지표로 각각의 항종양 효과를 검토하였다. 투여한 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포 (시험예 2) 의 표적은 MSLN 이고, 키메라 표적 인자 수용체의 세포내 도메인은 시험예 1 의 (C) 또는 (E) 이다. 가로세로 2 ㎜ 로 세절한 종양을 마우스의 측복부 피하에 종양 이식 바늘에 의해 이식하였다. 이식으로부터 7 일 경과 후에 군 나누기를 실시하고, 세포 및/또는 약제 (PD-1 항체) 의 투여를 개시하였다. 세포 투여군에 대해서는, 세포 (키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포 (MSLN-TLR9)) 1 x 10⁵ 개를 종양 내에 2 회 (Day 1 및 Day 8) 투여하였다. PD-1 항체 투여군에 대해서는, PD-1 항체 250 μg 을 복강 내에 2 회 (Day 0 및 Day 7) 투여하였다. 주 2 회, 종양 사이즈를 측정하였다.

세포만을 투여한 군 (TLR3 군 또는 TLR9 군) 및 PD-1 항체만을 투여한 군 (αPD-1 군) 의 종양 사이즈의 측정 평균값, 세포 및 PD-1 항체를 병용 투여한 군의 종양 사이즈의 측정 평균값 (O-FTV), TLR3 군 또는 TLR9 군과 αPD-1 군의 측정값으로부터 기대되는, 병용 투여한 경우의 종양 사이즈 (E-FTV (= 군 1 의 측정 평균값 × 군 2 의 측정 평균값)), 및 E-FTV 를 O-FTV 로 나누어 이루어지는 값 (E/O) 을 표 1 및 표 2 에 나타낸다. E/O 가 1 을 초과하는 경우에는, 세포 및 PD-1 항체를 병용 투여에 의해 상승 효과가 발휘된 것을 나타낸다. 표 1 은, 키메라 표적 인자 수용체의 세포내 도메인이 TLR-3 의 세포내 도메인인 경우의 결과를 나타내고, 표 2 는, 키메라 표적 인자 수용체의 세포내 도메인이 TLR-9 의 세포내 도메인인 경우의 결과를 나타낸다. 표 중, 「Day」 의 란은, 이식으로부터 7 일 경과시를 Day 0 으로 한 경우의 경과 일수를 나타낸다.

표 1 및 표 2 에 나타내는 바와 같이, TLR 세포내 도메인을 갖는 키메라 표적 인자 수용체 발현 세포와 PD-1 항체를 병용함으로써, 항종양 효과가 상승적으로 향상되는 것을 알 수 있었다.

시험예 11. 항종양 효과의 평가 시험 4

마우스의 피하에 Pan02, 또는 Pan02/MSLN (시험예 6-1) 을 이식하고, 수상 세포 (Empty : pMXs-GFP 도입), 또는 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포를 투여하고, 종양 증식 억제를 지표로 각각의 항종양 효과를 검토하였다. 투여한 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포 (시험예 2) 의 표적은 MSLN 이고, 키메라 표적 인자 수용체의 세포내 도메인은 시험예 1 의 (E), (F), 또는 (I) 이다. 가로세로 2 ㎜ 로 세절한 종양을 마우스의 측복부 피하에 종양 이식 바늘에 의해 이식하였다. 이식으로부터 7 일 경과 후에 군 나누기를 실시하고, 세포의 투여를 개시하였다. 세포 (수상 세포 (Empty), 또는 키메라 표적 인자 수용체 발현 수상 세포) 1 x 10⁵ 개를 종양 내에 1 회 (Day 0) 투여하였다. 주 2 회, 종양 사이즈를 측정하고, 항종양 효과를 평가하였다.

결과를 도 14 에 나타낸다. 세포내 도메인으로서 TLR 의 세포내 도메인에 더하여 CD40 의 세포내 도메인을 사용함으로써, 항종양 효과가 향상되는 것을 알 수 있었다.

SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKAI NATIONAL HIGHER EDUCATION AND RESEARCH SYSTEM <120> Chimeric target factor receptor <130> P21-207WO <150> JP 2021-005337 <151> 2021-01-15 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Her2 scFv <400> 1 Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 35 40 45 Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly 130 135 140 Ser Glu Val 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165 170 <210> 5 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR3 <400> 5 Gly Trp Arg Ile Ser Phe Tyr Trp Asn Val Ser Val His Arg Val Leu 1 5 10 15 Gly Phe Lys Glu Ile Asp Arg Gln Thr Glu Gln Phe Glu Tyr Ala Ala 20 25 30 Tyr Ile Ile His Ala Tyr Lys Asp Lys Asp Trp Val Trp Glu His Phe 35 40 45 Ser Ser Met Glu Lys Glu Asp Gln Ser Leu Lys Phe Cys Leu Glu Glu 50 55 60 Arg Asp Phe Glu Ala Gly Val Phe Glu Leu Glu Ala Ile Val Asn Ser 65 70 75 80 Ile Lys Arg Ser Arg Lys Ile Ile Phe Val Ile Thr His His Leu Leu 85 90 95 Lys Asp Pro Leu Cys Lys Arg Phe Lys Val His His Ala Val Gln Gln 100 105 110 Ala Ile Glu Gln Asn Leu Asp Ser Ile Ile Leu Val Phe Leu Glu Glu 115 120 125 Ile Pro Asp Tyr Lys Leu Asn His Ala Leu Cys Leu Arg Arg Gly Met 130 135 140 Phe Lys Ser His Cys Ile Leu Asn Trp Pro Val Gln Lys Glu Arg Ile 145 150 155 160 Gly Ala Phe Arg His Lys Leu Gln Val Ala Leu Gly Ser Lys Asn Ser 165 170 175 Val His <210> 6 <211> 186 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR4 <400> 6 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ggttatacta gatatgccga tagcgtcaag ggccgtttca ctataagcgc agacacatcc 660 aaaaacacag cctacctgca gatgaacagc ctgcgtgctg aggacactgc cgtctattat 720 tgttctagat ggggagggga cggcttctat gctatggacg tgtggggtca aggaaccctg 780 gtcaccgtct cctcggcggc cgca 804 <210> 10 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 <400> 10 attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60 catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120 tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180 tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240 atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 300 gacttcgcag cctatcgctc caagctt 327 <210> 11 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR1 <400> 11 agctacttgg atctgccctg gtatctcagg atggtgtgcc agtggaccca gacccggcgc 60 agggccagga acataccctt agaagaactc caaagaaatc tccagtttca tgcatttatt 120 tcatatagtg ggcacgattc tttctgggtg aagaatgaat tattgccaaa cctagagaaa 180 gaaggtatgc agatttgcct tcatgagaga aactttgttc ctggcaagag cattgtggaa 240 aatatcatca cctgcattga gaagagttac aagtccatct ttgttttgtc tcccaacttt 300 gtccagagtg aatggtgcca ttatgaactc tactttgccc atcacaatct ctttcatgaa 360 ggatctaata gcttaatcct gatcttgctg gaacccattc cgcagtactc cattcctagc 420 agttatcaca agctcaaaag tctcatggcc aggaggactt atttggaatg gcccaaggaa 480 aagagcaaac gtggcctttt ttgggctaac ttaagggcag ccattaatat taagctgaca 540 gagcaagcaa agaaa 555 <210> 12 <211> 522 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR2 <400> 12 cgtttccatg gcctgtggta tatgaaaatg atgtgggcct ggctccaggc caaaaggaag 60 cccaggaaag ctcccagcag gaacatctgc tatgatgcat ttgtttctta cagtgagcgg 120 gatgcctact gggtggagaa ccttatggtc caggagctgg agaacttcaa tccccccttc 180 aagttgtgtc ttcataagcg ggacttcatt cctggcaagt ggatcattga caatatcatt 240 gactccattg aaaagagcca caaaactgtc tttgtgcttt ctgaaaactt tgtgaagagt 300 gagtggtgca agtatgaact ggacttctcc catttccgtc tttttgatga gaacaatgat 360 gctgccattc tcattcttct ggagcccatt gagaaaaaag ccattcccca gcgcttctgc 420 aagctgcgga agataatgaa caccaagacc tacctggagt ggcccatgga cgaggctcag 480 cgggaaggat tttgggtaaa tctgagagct gcgataaagt cc 522 <210> 13 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR3 <400> 13 ggctggagga tatcttttta ttggaatgtt tcagtacatc gagttcttgg tttcaaagaa 60 atagacagac agacagaaca gtttgaatat gcagcatata taattcatgc ctataaagat 120 aaggattggg tctgggaaca tttctcttca atggaaaagg aagaccaatc tctcaaattt 180 tgtctggaag aaagggactt tgaggcgggt gtttttgaac tagaagcaat tgttaacagc 240 atcaaaagaa gcagaaaaat tatttttgtt ataacacacc atctattaaa agacccatta 300 tgcaaaagat tcaaggtaca tcatgcagtt caacaagcta ttgaacaaaa tctggattcc 360 attatattgg ttttccttga ggagattcca gattataaac tgaaccatgc actctgtttg 420 cgaagaggaa tgtttaaatc tcactgcatc ttgaactggc cagttcagaa agaacggata 480 ggtgcctttc gtcataaatt gcaagtagca cttggatcca aaaactctgt acat 534 <210> 14 <211> 558 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR4 <400> 14 ttctattttc acctgatgct tcttgctggc tgcataaagt atggtagagg tgaaaacatc 60 tatgatgcct ttgttatcta ctcaagccag gatgaggact gggtaaggaa tgagctagta 120 aagaatttag aagaaggggt gcctccattt cagctctgcc ttcactacag agactttatt 180 cccggtgtgg ccattgctgc caacatcatc catgaaggtt tccataaaag ccgaaaggtg 240 attgttgtgg tgtcccagca cttcatccag agccgctggt gtatctttga atatgagatt 300 gctcagacct ggcagtttct gagcagtcgt gctggtatca tcttcattgt cctgcagaag 360 gtggagaaga ccctgctcag gcagcaggtg gagctgtacc gccttctcag caggaacact 420 tacctggagt gggaggacag tgtcctgggg cggcacatct tctggagacg actcagaaaa 480 gccctgctgg atggtaaatc atggaatcca gaaggaacag tgggtacagg atgcaattgg 540 caggaagcaa catctatc 558 <210> 15 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR9 <400> 15 tgggacctct ggtactgctt ccacctgtgc ctggcctggc ttccctggcg ggggcggcaa 60 agtgggcgag atgaggatgc cctgccctac gatgccttcg tggtcttcga caaaacgcag 120 agcgcagtgg cagactgggt gtacaacgag cttcgggggc agctggagga gtgccgtggg 180 cgctgggcac tccgcctgtg cctggaggaa cgcgactggc tgcctggcaa aaccctcttt 240 gagaacctgt gggcctcggt ctatggcagc cgcaagacgc tgtttgtgct ggcccacacg 300 gaccgggtca gtggtctctt gcgcgccagc ttcctgctgg cccagcagcg cctgctggag 360 gaccgcaagg acgtcgtggt gctggtgatc ctgagccctg acggccgccg ctcccgctac 420 gtgcggctgc gccagcgcct ctgccgccag agtgtcctcc tctggcccca ccagcccagt 480 ggtcagcgca gcttctgggc ccagctgggc atggccctga ccagggacaa ccaccacttc 540 tataaccgga acttctgcca gggacccacg gccgaa 576 <210> 16 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 <400> 16 aaaaaggtgg ccaagaagcc aaccaataag gccccccacc ccaagcagga accccaggag 60 atcaattttc ccgacgatct tcctggctcc aacactgctg ctccagtgca ggagacttta 120 catggatgcc aaccggtcac ccaggaggat ggcaaagaga gtcgcatctc agtgcaggag 180 agacag 186 <210> 17 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSLN scFV <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 130 135 140 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser 145 150 155 160 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser 165 170 175 Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro 180 185 190 Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 210 215 220 Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 225 230 235 240 Ala Ala Ala <210> 18 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSLN scFV <400> 18 caggtacaac tgcagcagtc tgggcctgag ctggagaagc ctggcgcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggactt attactcctt acaatggtgc ttctagctac 180 aaccagaagt tcaggggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240 atggacctcc tcagtctgac atctgaagac tctgcagtct atttctgtgc aagggggggt 300 tacgacggga ggggttttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360 gtaggcggtt caggcggcgg tggctctggc ggtggcggat cggacatcga gctcactcag 420 tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagtgccagc 480 tcaagtgtaa gttacatgca ctggtaccag cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg 540 atttatgaca catccaaact ggcttctgga gtcccaggtc gcttcagtgg cagtgggtct 600 ggaaactctt actctctcac aatcagcagc gtggaggctg aagatgatgc aacttattac 660 tgccagcagt ggagtggtta ccctctcacg ttcggtgctg ggacaaagtt ggaaataaaa 720 gcggccgct 729 <210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GMCSFR <400> 19 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro 20 <210> 20 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GMCSFR <400> 20 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atccca 66

Claims (16)

1. 표적 인자 결합성 도메인, 막 관통 도메인, 및 TLR 세포내 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는, 키메라 표적 인자 수용체.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 TLR 세포내 도메인이, TLR2 세포내 도메인, TLR3 세포내 도메인, 및 TLR9 세포내 도메인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 키메라 표적 인자 수용체.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 TLR 세포내 도메인이, TLR3 세포내 도메인, 및 TLR9 세포내 도메인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 키메라 표적 인자 수용체.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 세포내 도메인이 추가로 CD40 세포내 도메인을 포함하는, 키메라 표적 인자 수용체.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 표적 인자 결합성 도메인의 구조가 단사슬 항체 구조인, 키메라 표적 인자 수용체.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 표적 인자가, 암항원, 사이토카인 수용체, 및 세포 증식 인자 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 키메라 표적 인자 수용체.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 표적 인자 수용체를 코드하는, 폴리뉴클레오티드.
8. 제 6 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포.
9. 제 8 항에 있어서,
   항원 제시 세포인, 세포.
10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    수상 세포인, 세포.
11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 함유하는, 의약 조성물.
12. 제 11 항에 있어서,
    암, 자기 면역 질환, 알레르기 질환, 및 감염증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 치료, 예방, 또는 개선용인, 의약 조성물.
13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    고형암의 치료, 예방, 또는 개선용인, 의약 조성물.
14. 제 13 항에 있어서,
    상기 TLR 세포내 도메인이, TLR3 세포내 도메인, 및 TLR9 세포내 도메인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종이고, 또한 상기 세포가 수상 세포인, 의약 조성물.
15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    상기 세포내 도메인이 추가로 CD40 세포내 도메인을 포함하고, 또한 상기 세포가 수상 세포인, 의약 조성물.
16. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 체크 포인트 저해제와의 병용에 사용하기 위한, 의약 조성물.