CN105452287A - 免疫抑制性TGF-β信号转换器 - Google Patents

Abstract

本发明的实施方式涉及细胞治疗方法和组合物，其利用表达至少嵌合TGFβ受体的细胞，该嵌合TGFβ受体包含TGFβII受体的外结构域和不来自TGFβ受体的内结构域，从而将T细胞增殖的TGFβ的负信号转化为T细胞激活信号。在至少某些方面中，携带该嵌合TGFβ受体的细胞还携带一种或多种嵌合抗原受体。

Description

免疫抑制性TGF-β信号转换器

本发明要求2013年4月17日提交的美国临时专利申请第61/812,917号的优先权，其通过引用全文纳入本文。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明是在美国国防部基金第W81XWH-11-1-0625号的政府支持下完成的。政府对本发明拥有某些权利。

技术领域

本发明的实施方式至少涵盖以下领域：免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学，包括癌症医学。

背景

转化生长因子β(TGFβ)已被证明在调控免疫应答方面起重要作用，主要是通过其对于免疫系统细胞的抑制功能。TGFβ是抗原特异性T细胞增殖的抑制因子，其至少通过降低细胞周期速率发挥功能，与诱导凋亡相反。具体而言，TGFβ作用于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)以特异性抑制至少五种溶细胞性基因产物的表达：穿孔蛋白、粒酶A、粒酶B、Fas配体和干扰素γ，其对于CTL介导的肿瘤细胞毒性而言至关重要(Thomas和Massagué，2005)。

概述

本发明的实施方式包括用于癌症治疗的方法和组合物。在具体的实施方式中，描述了涉及癌症的细胞疗法的方法和组合物。虽然具体的实施方式可用于任何癌症，但在具体实施方式中，这些方法和组合物对于分泌TGFβ或位于释放TGFβ的肿瘤微环境(包括肿瘤间质)中的癌症特别有效。适用于使用本发明公开的组合物和方法进行治疗的示例性癌症包括但不限于：前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、脑癌、结肠癌、食道癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、胆囊癌、甲状腺癌、肛门癌、子宫内膜癌、膀胱癌、脑下垂体癌、白血病、淋巴瘤、胃癌和脾癌。

本发明的各方面利用经修饰的细胞来表达一种或多种非天然分子，这些分子使细胞有效地对抗分泌TGFβ的癌症。在具体的实施方式中，这些细胞可用于过继细胞疗法。在具体的方面中，这些细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、细胞毒性T淋巴细胞、抗原特异性T细胞(包括肿瘤或病原体(如病毒或细菌)特异性T细胞)、具有αβT细胞受体(TCR)的T细胞、包含至少一种嵌合抗原受体的T细胞，等。细胞可经遗传工程改造以在TGFβ存在时发挥作用，且还可具有或不具有其他非天然产生的遗传修饰。除嵌合TGFβ受体外，这些细胞还可表达其他非天然分子。在具体的实施方式中，这些非天然分子是细胞表面受体。这些分子可以是特异性针对例如肿瘤细胞表面分子或αβTCR的嵌合抗原受体(CAR)。在某些方面中，细胞可使用一种或多种嵌合抗原受体和嵌合TGFβ受体。

在本发明的各实施方式中，本发明的细胞通过使用嵌合TGFβ受体将来自TGFβ的正常抑制信号转化为对T细胞的激活刺激，该嵌合TGFβ受体使用细胞表面上的TGFβ胞外受体，其连接能够产生激活信号的另一实体的胞内结构域(endodomain)。在具体实施方式中，与缺少这类嵌合受体的细胞相比，使用这类嵌合受体修饰的T细胞具有提高的效力。本发明的具体实施方式使用以下嵌合TGFβ受体，其表达与来自另一分子的胞内结构域相连的TGFβRII的胞外结构域(exodomain)。在具体实施方式中，该胞外结构域和胞内结构域通过跨膜结构域相连，且在某些实施方式中该跨膜结构域是天然产生的针对所选胞内结构域的跨膜结构域。虽然TGFβ的受体可以是TGFβ受体1、TGFβ受体2或TGFβ受体3中任一种的部分或全部，但在具体实施方式中其包含该受体的TGFβ受体2同种型。在具体实施方式中，该胞内结构域包含示例性toll样受体(TLR)4的胞内结构域，但也可使用其他，如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、CD28、4-1BB、OX40、CD3ζ、CD40、CD27，或其组合。在具体实施方式中，该嵌合细胞因子受体是经标记的，例如使用GFP、mOrange、蓝色荧光蛋白等标记。

在本发明的某些方面中，包含嵌合TGFβ受体的细胞还包含嵌合抗原受体。该嵌合抗原受体(CAR)可以是任何类型，但在具体实施方式中该CAR靶向也分泌TGFβ分子的癌症。示例性CAR包括至少特异性针对以下任意一种或多种的CAR：EphA2、HER2、GD2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、5T4、8H9、α_vβ₆整联蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ轻链、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎儿AchR、叶酸受体α、GD2、GD3、HLA-AIMAGEA1、HLA-A2、IL11Ra、IL13Ra2、KDR、Lambda、Lewis-Y、MCSP、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSC1、PSMA、ROR1、Sp17、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、癌胚抗原、HMW-MAA、VEGF受体、和/或其他在肿瘤的胞外基质中存在的示例性抗原(如纤连蛋白的癌胚变体、生腱蛋白或肿瘤的坏死区)和通过例如肿瘤的遗传分析和或差异表达研究鉴定的其他肿瘤相关抗原或可用突变，或其组合。本发明的细胞可具有超过一种CAR，且CAR可具有特异性针对不同抗原的超过一种scFv。

在本发明的某些方面中，包含(如表达)嵌合TGFβ受体的细胞还包含(如表达)抗原特异性受体。该抗原可以是肿瘤抗原或病原体抗原，包括例如病毒或细菌抗原。

示例性的肿瘤抗原至少包括下述：肠癌癌胚抗原(CEA)；卵巢癌CA-125；乳腺癌MUC-1或上皮肿瘤抗原(ETA)或CA15-3；恶性黑色素瘤的酪氨酸酶或黑色素瘤相关抗原(MAGE)；和各种类型肿瘤的ras、p53的异常产物；肝细胞瘤、卵巢癌或睾丸癌的α胎甲球蛋白；睾丸癌男性患者的hCG的β亚基；前列腺癌的前列腺特异抗原；多发性骨髓瘤或一些淋巴瘤中的β2微球蛋白；结肠直肠癌、胆管癌和胰腺癌的CA19-9；肺癌和前列腺癌的嗜铬粒蛋白A；黑素瘤、软组织肉瘤和乳腺癌、结肠癌和肺癌的TA90。本领域已知肿瘤抗原的例子，例如Cheever等2009中所述，其通过引用全文纳入本文。肿瘤抗原的具体示例至少包括例如CEA、gp100、间皮素、TRP1、CD40、EGFP、Her2、TCRα、trp2、MUC1、cdr2、ras、GITR、WT1、MUC1、LMP2、HPVE6E7、EGFRvIII、HER-2/neu、MAGEA3、p53非突变体、NY-ESO-1、PSMA、GD2、MelanA/MART1、Ras突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(PR1)、bcr-abl、酪氨酸酶、生存素、PSA、hTERT、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、多聚唾液酸、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、海藻糖GM1、间皮素、PSCA、MAGEA1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精液蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE1、B7H3、豆荚蛋白、Tie2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2和Fos相关抗原1。

可由抗原受体T细胞针对的特定病毒包括：EBV、CMV、腺病毒、BK病毒、HHV6、RSV、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠状病毒、LCMV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、偏肺病毒、细小病毒B、轮状病毒、西尼罗河病毒、JC、HHV7，及其组合。在一些情况中，该病毒是EBV且该抗原选自EBNA1、LMP2和BZLF1；该病毒可以是CMV且该抗原可选自IE1和pp65；该病毒可以是Adv且该抗原可选自六邻体和五邻体；该病毒可以是BK病毒且该抗原可选自LT和VP-1；该病毒可以是HHV6且该抗原可选自U14、U11、U71、U54和U90；该病毒可以是RSV且该抗原可选自N和F；该病毒可以是流感病毒且该抗原可选自MP1和NP1。

在本发明的实施方式中，存在T细胞上新型免疫抑制性信号转换器的转基因表达。该信号转换器通过使用嵌合TGFβ受体将免疫效应细胞上TGFβ的正常抑制作用转变为针对细胞的刺激信号，该嵌合TGFβ受体具有TGFβ胞外结构域，其与不来自TGFβ受体的胞内结构域相连且提供激活信号。

在本发明的实施方式中，存在一种包含编码嵌合TGFβ受体的核苷酸序列的多核苷酸，该受体包含TGFβ受体的胞外结构域和非TGFβ受体胞内结构域。在具体实施方式中，该胞内结构域包含免疫刺激蛋白的胞内结构域或其功能片段，该胞内结构域或其功能片段来自toll样受体(TLR)1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、CD28、41BB、41BB、OX40、CD40、CD27，或其组合。在具体情况中，该胞内结构域来自toll样受体(TLR)4。在具体实施方式中，该多核苷酸还包含编码嵌合抗原受体(CAR)或αβT细胞受体(TCR)的多核苷酸序列。在一些实施方式中，嵌合TGFβ受体的表达和CAR和/或αβTCR的表达在相同或不同的一个或多个调控元件的控制下。

在其中使用一种或多种多核苷酸的实施方式中，该多核苷酸可进一步限定为表达构建体或载体，且该载体可以是病毒载体(如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体)或非病毒载体，如质粒或RNA，包括mRNA。

在某些实施方式中，提供了包含本发明所述多核苷酸的一种或多种细胞。这类细胞可以是例如T细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、抗原特异性T细胞，或包含αβTCR的T细胞，或CTL。在具体的实施方式中，这些抗原特异性T细胞被进一步限定为肿瘤特异性T细胞或病原体特异性T细胞。在具体的方面中，该TGFβ受体包含部分或全部TGFβ受体II。在一些情况中，这些抗原特异性T细胞的抗原特异性是天然的，而在某些情况中，这些抗原特异性T细胞的抗原特异性是重组生成的。在具体的情况中，该细胞是抗原特异性T细胞，和/或包含αβTCR，其可以是对T细胞而言初始的(native)或是经工程改造的分子。在具体的方面中，该抗原特异性T细胞被进一步限定为肿瘤特异性T细胞或病原体特异性T细胞。在一些情况中，该抗原特异性T细胞的抗原特异性是天然的，而在某些情况中，该抗原特异性T细胞的抗原特异性是重组生成的。在一些情况中，细胞上的αβTCR是天然的，而在其他方面中，细胞上的αβTCR是重组生成的；该αβTCR可选自例如文库。

在本发明的实施方式中，存在一种或多种细胞，其包含编码嵌合TGFβ受体的第一多核苷酸(该嵌合TGFβ受体包含TGFβ受体的胞外结构域和非TGFβ受体胞内结构域)以及编码CAR和/或αβTCR的第二多核苷酸。在一些情况中，第一和第二表达构建体是相同或不同的分子。该抗原特异性T细胞可以是肿瘤特异性T细胞受体或病原体特异性T细胞受体。该CAR可特异性针对选自下组的抗原：PSCA、HER2、CD19、CD20、CD22、κ链或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体α2、IL-11受体Rα、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、LewisY、G250/CAIX、HLA-AIMAGEA1、HLA-A2NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎牛AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1、TEM8，或其组合。

在一些实施方式中，本发明提供了一种或多种细胞，其限定为：1)是抗原特异性T细胞，和/或包含CAR的细胞，和/或包含αβT细胞受体的细胞；以及2)包含嵌合TGFβ受体，该受体包含TGFβ受体的胞外结构域和非TGFβ受体胞内结构域。在具体实施方式中，该细胞对于所述细胞的接受者(recipient)而言是自体的。在一些情况中，该细胞对于所述细胞的接受者而言是同种异体的。

在本发明的实施方式中，提供了一种治疗和/或预防个体中癌症的方法，包括以下步骤：向该个体递送治疗有效量的本发明所述多种细胞，该个体患有癌症，该癌症具有分泌TGFβ的细胞和/或具有产生TGFβ的微环境。虽然在一些情况中该癌症可以是任意类型，但在具体情况中，该癌症是前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、脑癌、结肠癌、食道癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、胆囊癌、甲状腺癌、肛门癌、子宫内膜癌、膀胱癌、脑下垂体癌、白血病、淋巴瘤、胃癌、脾癌或骨髓瘤。在具体的实施方式中，这些细胞经静脉内、腹膜内、瘤内、鞘内和/或跨直肠递送。在一些实施方式中，细胞暴露于TGFβ保护或增强该细胞的抗肿瘤活性。在具体方面中，向该个体提供另一种癌症治疗，例如手术、化疗、免疫治疗、激素治疗、放疗或其组合。在某些实施方式中，这些细胞对于所述个体而言是同种异体或自体的。在一些实施方式中，本发明的方法还包括从该个体或另一个体获得外周血单核细胞(PBMC)的步骤。在具体实施方式中，该方法包括以下步骤：从这些PBMC获得T细胞并修饰这些T细胞以包含含有编码嵌合TGFβ受体的核苷酸序列的多核苷酸，该受体包含TGFβ受体的胞外结构域和非TGFβ受体胞内结构域。在本发明的实施方式中，超过一次地向该个体提供细胞。在具体的情况中，当超过一次提供细胞且这些细胞包含特异性针对特定肿瘤抗原的CAR时，一次或多次后续递送后这些细胞包含特异性针对不同肿瘤抗原的CAR。

在本发明的一个实施方式中，存在一种将T细胞抑制性细胞因子信号转化为T细胞刺激性信号的方法，包括以下步骤：将抑制性细胞因子暴露于T细胞上的受体，所述受体具有胞外结构域和不与该胞外结构域天然连接的胞内结构域，该胞外结构域能够结合抑制性细胞因子且该胞内结构域向该T细胞提供刺激性信号，该胞外结构域和胞内结构域配对为同源二聚体。在具体实施方式中，该细胞因子是TGFβ或VEGF。

在本发明的一个实施方式中，存在一种将T细胞抑制性细胞因子信号转化为T细胞刺激性信号的方法，包括以下步骤：将抑制性细胞因子暴露于T细胞上的受体，所述受体具有胞外结构域和不与该胞外结构域天然连接的胞内结构域，该胞外结构域能够结合抑制性细胞因子且该胞内结构域向该T细胞提供刺激性信号，该抑制性细胞因子不是IL4或IL7或上述两者。在具体实施方式中，该细胞因子是TGFβ或VEGF。

本发明的实施方式在存在分泌抑制剂TGFβ的癌细胞的情况下改善了体内过继转移治疗的细胞活性。

在本发明的一个实施方式中，存在包含本文所述多核苷酸或多肽和/或一种或多种本文所述细胞的试剂盒。

前述内容描述了本发明内容的特征和技术优点，使得能够更好地理解以下的详细说明。以下描述的本发明内容的附加特征和优点构成本发明要求的主题。本领域的技术人员应理解，所揭示的观念和具体实施方式可以方便地被用作改进或设计实现本发明的同样目的的其他结构的基础。本领域的技术人员还应认识到这种等价结构没有偏离所附权利要求书中提出的本发明的精神和范围。被认为是本发明的特性的新特征，对于其构建和方法的操作，还有其他对象和优点等，可以结合以下详细的说明和附图一起，得到更好的理解。但应理解，各附图仅仅是为了示意和说明，并不旨在对本发明进行限定。

附图简要说明

为了更完整地理解本发明，下面结合附图提供以下说明，其中：

图1显示装备T细胞以耐受抑制性肿瘤微环境的示例性实施方式。

图2提供对照DNRII、RIID2和RIID4的示例性逆转录病毒载体图谱。

图3显示DNRII、RIID2和RIID4转基因T细胞的生成。

图4A-4B显示DNRII、RIID2和RIID4与CAR-PSCA.2G共表达的测定。

图5显示RIID2和RIID4是否保护暴露于TGFβ的CAR修饰的T细胞。

图6A-6C显示在抑制条件下RIID2和RIID4修饰的T细胞是否受到保护。

图7显示给予TGFβ1选择RIID2和RIID4转导的T细胞。

图8显示CARPSCA.2G/RIID2和/RIID4T细胞需要抗原刺激以进行扩增。

图9提供RIID2和RIID4增强CARPSCA.2G针对DU145细胞的抗肿瘤作用。

图10显示TGFβ暴露对于示例性CART细胞的影响。A)信号转导，B)溶细胞功能，C)扩增，D)活力，以及E)PD1表达。

图11显示A)野生型TGFβR，和B)RIID4信号转导。

图12显示A)一种RIID4构建体的示例的逆转录病毒载体，B)转导的细胞上的RIID4表达，C)TGFβ存在或不存在时T细胞培养物的显微照片，以及D)流式测得的T细胞中的PD1表达。

图13显示示例性嵌合细胞因子逆转录病毒受体。

图14显示TGFβ1不诱导RIID4修饰的T细胞中的pSmad2/3。

图15显示RIID4对来自TGFβ1诱导的凋亡的T细胞的保护。

图16显示RIID4阻止PD1上调。

图17显示RIID4阻止TGFβ1诱导的溶细胞功能抑制。

图18显示通过TGFβ1暴露选择RIID4+细胞。

图19显示撤回抗原和TGFβ1导致培养失败。

图20显示共培养实验设置的一个示例。

图21提供2G.CAR-PSCA/RIID4细胞在TGFβ1存在的情况下消除肿瘤的证据。

图22显示2G.CAR-PSCAT细胞在TGFβ1存在的情况下不增殖。

图23显示2G.CAR-PSCA/RIID4细胞能够扩增且这些细胞取决于抗原存在。

图24显示给予TGFβ1促进2G.CAR-PSCA/RIID4T细胞的增殖。

发明详述

本说明书(包括权利要求)中使用的单词“一种”和“一个”与单词包括一致，表示“一种或多种”。本发明的一些实施方式可能由一个或多个本发明的元素、方法步骤和/或方法组成或基本由其组成。应理解本发明所述的任何方法或组合物都可相对于本发明所述的任何其他方法或组合物实施并在不偏离本发明精神和范围的前提下仍能获得相同或类似的结果。

本发明的实施方式涵盖用于过继细胞转移的细胞，其经修饰以将抑制免疫细胞增殖的抑制性信号转化为增强免疫细胞增殖和至少在一些情况中增强抗肿瘤活性的刺激性信号。在具体实施方式中，本发明的免疫细胞配备有受体，这些受体设计为结合抑制性分子但传送正信号而非抑制性信号。即，这些细胞将“刹车”信号(如TGFβ)转化为“加速”信号以改善各免疫细胞的抗肿瘤作用。

在某些实施方式中，这些细胞包含嵌合细胞因子受体，其包括(例如)TGFβ胞外结构域与来自另一种分子的胞内结构域的嵌合体，使得TGFβ与该胞外结构域的结合导致胞内结构域刺激T细胞活性。这些细胞可以具有或不具有其他性状，是天然的和/或经人遗传工程改造，包括其他分子的受体，包括至少αβTCR，抗原特异性受体(包括肿瘤特异性受体)，和/或(例如)嵌合抗原受体。

嵌合细胞因子受体

在本发明的实施方式中，存在包含嵌合细胞因子受体的组合物，这些嵌合细胞因子受体结合Th2或免疫抑制性细胞因子(例如TGFβ)但诱导免疫刺激信号而非免疫抑制，导致维持Th1(效应)表型、增殖和细胞毒性特征。本发明包括多肽和编码这些多肽的核苷酸形式的受体。

本发明的实施方式包括多肽(和编码其的多核苷酸)，其包含与免疫刺激分子的胞内结构域融合的免疫抑制细胞因子的受体的胞外结构域。在具体实施方式中，TGFβR的胞外结构域与一种或多种刺激性胞内结构域融合，包括例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、CD28、4-1BB、OX40，或前述的任意组合。携带这类嵌合细胞因子受体的细胞保护肿瘤反应性免疫细胞免受免疫抑制性细胞因子(如TGFβ)的影响。

在某些实施方式中，本文提供了仅包含TGFβ受体的胞外结构域或其TGFβ结合片段的嵌合TGFβ受体。

在某些实施方式中，该嵌合TGFβ受体包含TGFβ受体的胞外结构域。可使用天然TGFβ受体的任何同种型的胞外结构域，包括TGFβ受体1、TGFβ受体2和TGFβ受体3。在具体实施方式中，TGFβ受体2的胞外结构域被用于本发明的组合物(包含例如表达构建体和细胞)中。编码TGFβ受体2的示例性核苷酸序列包括登录号NM_001024847.2(SEQIDNO:3)(多肽是NP_001020018；SEQIDNO:4)或NM_003242.5(多肽是NM_003242)。胞内结构域的一个示例是TLR4，且TLR4的一个示例性序列是登录号U88880(SEQIDNO:5)(多肽是AAC34135；SEQIDNO:6)。

在具体实施方式中，该受体的多核苷酸可包含编码TGFβ受体的信号肽的核苷酸序列。在某些实施方式中，该信号肽如下所示(TGFβ受体2的1-22位氨基酸)：MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIAS(SEQIDNO:1)。在具体实施方式中，该胞外结构域(其可以称作胞胞外结构域)包含来自TGFβ受体2的23-166位氨基酸，如SEQIDNO:2所示：

TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ(SEQIDNO:2)。在其他具体的实施方式中，该胞外结构域来自TGFβ受体1、TGFβ受体3，或来自任何其他TGFβ受体或其变体。

本发明包括嵌合TGFβ受体的多核苷酸和多肽以及携带这些多核苷酸和多肽的细胞。本发明包括在治疗癌症的方法中使用嵌合TGFβ受体，所述癌症分泌TGFβ或处于提供TGFβ的肿瘤环境中。这些嵌合TGFβ受体可与也包含一种或多种CAR的细胞联用。

在具体实施方式中，本发明的嵌合TGFβ受体包含不来自内源性TGFβ受体的胞内结构域。该胞内结构域可以是任何类型，前提是其给予免疫效应细胞激活信号，所述刺激信号在TGFβ结合嵌合TGFβ受体胞外结构域后产生，例如导致表达嵌合TGFβ受体的T细胞在TGFβ存在时增殖。示例性胞内结构域包括，例如，来自以下一种或多种的免疫刺激胞内结构域或其片段：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、CD28、4-1BB、OX40、CD3ζ、CD40、CD27，或其组合。

在本发明的实施方式中，这些嵌合TGFβ受体还可在胞外结构域和胞内结构域之间包含跨膜结构域。该跨膜结构域可来自任何来源，但在具体实施方式中其与胞内结构域来自相同的分子。在具体实施方式中，该嵌合受体包含TGFβ受体的胞外结构域、免疫刺激分子的胞内结构域和跨膜结构域；在具体方面中，该跨膜结构域来自与免疫刺激分子相同的分子。在具体实施方式中，该嵌合TGFβ受体包含跨膜结构域和一个或多个其他氨基酸(例如一个、两个、三个、四个、五个或更多个其他氨基酸(aa))，所述其他氨基酸与跨膜结构域(TM)来自相同的分子。嵌合TGFβ受体的示例性模式如下：

TGFβR胞外结构域—1、2、3或更多个来自TM的aa—TM—非TGFβR胞内结构域

在某些方面中，该胞外结构域可不包含整个胞外结构域而是包含表位，且在一些情况中包含与胞内结构域相连的间隔子。

包含嵌合细胞因子受体的宿主细胞

在本发明的实施方式中，将细胞用于治疗。本发明中涵盖的细胞可以是免疫细胞，例如免疫效应细胞，其包括T细胞，包括细胞毒性T细胞(也称为TC，细胞毒性T淋巴细胞，CTL，T杀伤细胞，溶细胞性T细胞，CD8+T细胞或杀伤T细胞)；NK细胞；NKT细胞；和能够引发效应功能的其他免疫细胞。在具体实施方式中，整合本发明的受体的细胞例如至少通过消耗来自肿瘤微环境的抑制性细胞因子以在肿瘤微环境下显示周边效应(bystandereffect)。

本文所用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语也包括其后代，其是任意或全部的后代。应理解，由于有意或偶然的突变，所有的后代可能不是相同的。在表达异源核酸序列的内容中，“宿主细胞”是指真核细胞，其能够复制载体和/或表达由载体编码的异源基因。宿主细胞可用作，且已经用作载体的受主。宿主细胞可以是“转染的”或“转化的”，其指外源性核酸转染或转导到宿主细胞中的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。本文所用的术语“工程改造的”和“重组的”细胞或宿主细胞往往指其中已经导入外源性核酸序列，例如载体的细胞。因此，重组细胞可与不含导入的重组核酸的天然存在的细胞相区分。

在某些实施方式中，考虑到RNA或蛋白质序列可以与其他选定的RNA或蛋白质序列在相同的细胞(如相同的CTL)中共表达。可通过用两种或更多种不同的重组载体共转染或共转导CTL来实现共表达。或者，可将单个重组载体构建成包含多个不同RNA编码区，其然后可在用单一载体转染或转导的CTL中表达。

一些载体可采用控制序列，这些控制序列使得它们在原核和真核细胞中复制和/或表达。本领域技术人员还会理解孵育全部上述宿主细胞以维持细胞并进行载体复制的条件。也理解并知晓能进行载体以及由载体编码的核酸及其关联多肽、蛋白或肽的大规模生产的技术和条件。

相对于接受它们的个体，该细胞可以是自体细胞、同系细胞、同种异体细胞，并且甚至在一些情况中可以是异种移植细胞。

在许多情况下可能希望能够杀死修饰的细胞，所述情况是希望终止治疗、该细胞变成肿瘤、在对该细胞存在后缺少该细胞的情况感兴趣的研究中，或其它事件。出于这一目的，可提供特定基因产物的表达，其中人们可在受控的条件下杀死修饰的细胞，如可诱导的自杀基因。

其他细胞特性

除包含嵌合细胞因子受体的细胞外，该细胞可具有可用于细胞免疫治疗的一种或多种其他特性。这类其他特性可以是对细胞而言固有的或可以是人进行遗传操作后细胞的一部分。除嵌合TGFβ受体外，可存在超过一种特性。在具体的实施方式中，除具有嵌合TGFβ受体的细胞外，该细胞可具有嵌合抗原受体(CAR)、αβT细胞受体，和/或抗原特异性受体，例如肿瘤特异性受体。

在一个实施方式中，该宿主细胞是T细胞，其包含一种或多种嵌合TGFβ受体且包含一种或多种经工程改造的αβTCR受体、特异性针对肿瘤抗原的天然受体，或CAR；在各种情况中，其他修饰都可靶向选定的肿瘤抗原。

天然产生的T细胞受体包含两个亚基：α-亚基和β-亚基，其各自是由各T细胞的基因组中的重组事件产生的独特蛋白质，并可根据对特定靶抗原(包括肿瘤抗原)的选择性来筛选TCR的文库。“工程改造的TCR”是指经选择、克隆和/或随后导入用于过继免疫疗法的T细胞群的对目标抗原有高度亲合力和反应性的天然TCR。与工程改造的TCR相反，CAR经工程改造以MHC-独立的方式结合靶抗原。在具体的实施方式中，CAR包含胞外结合结构域，其包括但不限于抗体或其抗原结合片段；跨膜结构域；一种或多种胞内共刺激信号转导结构域和主要信号转导结构域。

在其中T细胞受体生成于表达或将表达嵌合细胞因子受体的细胞内的实施方式中，在具体实施方式中这些方法使用将外周血单核细胞暴露于来自肿瘤抗原的肽的混合物的文库(参见PCT/US2013/025342，其通过引用全文纳入本文)。

在本发明的某些实施方式中，存在包含嵌合TGFβ受体的免疫效应细胞，且还存在经修饰以包含至少一种CAR的免疫效应细胞，所述CAR允许绕过肿瘤免疫逃逸机制，其是由于蛋白质-抗原加工和呈递中的异常所致。

在具体情况中，这些细胞包括嵌合、非天然且至少部分人工工程改造的CAR。在特定情况中，该工程改造的CAR具有1个、2个、3个、4个或更多个组件，并且在一些实施方式中，这一个或多个组件促进细胞(如T淋巴细胞)靶向或结合包含肿瘤抗原的癌细胞。在具体实施方式中，该CAR包含针对肿瘤抗原的抗体的一部分、胞质信号转导结构域的部分或全部、和/或一个或多个共刺激分子的部分或全部，例如共刺激分子的胞内结构域。在特定实施方式中，该抗体是单链可变区片段(scFv)。在某些方面中，抗体导向例如分泌TGFβ的癌细胞的细胞表面上的靶抗原。在某些实施方式中，采用胞质信号转导结构域，如衍生自T细胞受体ξ-链的那些作为嵌合受体的至少一部分以在接合嵌合受体与靶抗原之后产生T淋巴细胞增殖和效应功能的刺激信号。示例包括但不限于来自共刺激分子(如CD27、CD28、4-1BB和OX40)的胞内结构域。在特定实施方式中，采用共刺激分子来增强抗原接合后由CAR产生的T细胞的激活、增殖和细胞毒性。在具体实施方式中，这些共刺激分子是CD28、OX40和4-1BB。

例如，该CAR可以是例如第一代、第二代或第三代(其中由CD3ζ以及CD28和肿瘤坏死因子受体(TNFr)(如4-1BB或OX40)的共刺激来提供信号转导的CAR)。该CAR可特异性针对选自下组的抗原：PSCA、HER2、CD19、CD20、CD22、κ链或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB2、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体α2、IL-11受体Rα、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、LewisY、G250/CAIX、HLA-AIMAGEA1、HLA-A2NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎牛AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1、TEM8、由肿瘤表达的病毒相关抗原，或通过肿瘤的遗传分析和或差异表达研究鉴定的其他肿瘤相关抗原。单个细胞可具有多个CAR，包括靶向不同肿瘤抗原的CAR。

在具体实施方式中，该CAR在表达载体上编码，该表达载体还可编码或不编码嵌合TGFβ受体。在具体实施方式中，该载体可以是双顺反子。存在于同一表达构建体上时，CAR编码序列可设置在嵌合TGFβ受体编码序列5’或3’端。CAR和嵌合TGFβ受体的表达可处于相同或不同调控序列的指导下。

将构建体导入宿主细胞中

编码嵌合细胞因子受体且任选包含至少一种CAR、αβTCR和/或抗原特异性受体的表达载体可以一种或多种DNA分子或构建体导入，其中可存在至少一种标记物，其允许选择含有该构建体的宿主细胞。可以常规方式制备构建体，其中基因和调控区域可适当分离、连接、克隆到合适的克隆宿主中、通过限制或测序或其他常规方式来分析。具体地，使用PCR，可分离包括功能单元的全部或部分的个体片段，其中可使用“引物修复”、连接、体外诱变等引入一个或多个突变，视情况而定。一旦完成并证明具有合适序列的构建体然后可通过任意常规方式导入CTL中。构建体可被整合并包装到非复制、缺陷型病毒基因组中，如腺病毒、腺-相关病毒(AAV)或单纯疱疹病毒(HSV)或其他，包括逆转录病毒，用于感染或转导到细胞中。如果需要，构建体可包括用于转染的病毒序列。或者，可通过融合、电穿孔、基因枪、转染、脂质转染等导入构建体。宿主细胞可在导入构建体之前在培养基中生长并增殖，之后是适当的处理以导入构建体并整合构建体。然后细胞增殖并通过构建体中存在的标记物筛选。可成功使用的各种标记物包括hprt、新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素抗性等。

在一些情况中，可具有同源重组的靶位点，其中需要将构建体整合在特定基因座中。例如，可敲除内源基因并用通过使用本领域已知的材料和方法用于同源重组的构建体编码的基因代替(在相同或其他基因座)。对于同源重组，可使用OMEGA或O-载体。参见，例如，Thomas和Capecchi，Cell(1987)51,503-512；Mansour等，Nature(1988)336,348-352；和Joyner等，Nature(1989)338,153-156。

可以编码至少嵌合TGFβ受体和任选的CAR的单个DNA分子或具有一种或多种基因的不同DNA分子的形式导入构建体。可同时或连续导入构建体，各自具有相同或不同的标记物。

可用于制备大量构建体DNA并用于进行转染的含有可用元件，如细菌或酵母复制起点、可选择和/或可扩增标记物、用于在原核细胞或真核细胞中表达的启动子/增强子元件等的载体是本领域熟知的，并且许多是市售可得的。

编码嵌合细胞因子受体的多核苷酸

本发明还涵盖包含编码上文定义的嵌合细胞因子受体的核酸序列的组合物和具有该核酸序列的细胞。在特定方面中，该核酸分子是重组核酸分子，且其可以是合成的。其可包含DNA、RNA以及PNA(肽核酸)并且可以是其杂合体。

本领域技术人员显见，可向本发明的组合物中包含的核酸分子中添加一种或多种调控序列。例如，可以使用允许本发明的多核苷酸进行诱导表达的启动子、转录增强子和/或序列。合适的可诱导系统是例如四环素调控的基因表达，例如Gossen和Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992),5547-5551)以及Gossen等(TrendsBiotech.12(1994),58-62)所述，或地塞米松诱导型基因表达系统，例如Crook(1989)EMBOJ.8,513-519所述。

在某些实施方式中，该嵌合TGFβ受体由细胞或载体组成型表达。在其他实施方式中，嵌合TGFβ受体的表达处于可诱导启动子的控制下，例如可由TGFβ或肿瘤微环境中存在的另一种分子诱导的启动子。

此外，出于其他目的，设想核酸分子可含有例如硫酯键和/或核苷酸类似物。这些修饰可用于针对细胞中的核酸内切酶和/或外切酶稳定核酸分子。这些核酸分子可由适当的载体转录，其包含允许细胞中所述核酸分子转录的嵌合基因。在这一方面，还应理解，这类多核苷酸可用于“基因靶向”或“基因治疗”方法。在另一个实施方式中，这些核酸分子是标记的。检测核酸的方法是本领域熟知的，例如Southern和Northern印迹、PCR或引物延伸。在基因治疗方法期间，该实施方式可用于筛选方法以验证是否成功导入上文所述核酸分子。

这些核酸分子可以是包含前述核酸分子中任一种的重组产生的嵌合核酸分子，其可单独使用或联用。在具体方面中，这些核酸分子是载体的一部分。

本发明因此还涉及包含载体的组合物，其包含本发明所述的核酸分子。

许多合适在载体是分子生物学领域普通技术人员所已知的，其选择取决于所需的功能并且包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和遗传工程中常用的其它载体。本领域技术人员熟知的方法可用于构建各种质粒和载体；参见例如，Sambrook等(1989)和Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology(《新编分子生物学新方法》),纽约的格林出版联合公司和韦利出版公司(GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience)(1989)，(1994)所述的技术。或者，本发明的多核苷酸和载体可重组到脂质体中以用于递送至靶细胞。可使用克隆载体来分离DNA的单个序列。可将相关序列转移到表达载体中，该载体中需要特定多肽的表达。一般的克隆载体包括pBluescriptSK、pGEM、pUC9、pBR322和pGBT9。一般的表达载体包括pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT。

在具体实施方式中，存在一种包含核酸序列的载体，所述核酸序列是调控序列，其可操作地连接编码本发明所定义的嵌合细胞因子受体构建体的核酸序列。这类调控序列(控制序列)是本领域技术人员已知的且可包括启动子、拼接盒(splicecassette)、翻译起始密码子、用于将插入片段导入载体的翻译和插入位点。在具体实施方式中，该核酸分子操作性连接所述表达控制序列，从而在真核或原核细胞中表达。

设想载体是包含编码本文定义的嵌合细胞因子受体构建体的核酸分子的表达载体。在具体方面中，该载体是病毒载体，如慢病毒载体。慢病毒载体是市售可得的，包括来自例如克隆泰克公司(Clontech)(加利福尼亚州芒廷维尤)或复能基因公司(GeneCopoeia)(马里兰州罗克维尔)。

术语“调控序列”指实现所连接编码序列的表达所必需的DNA序列。这类控制序列的本质根据宿主生物体而不同。在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，通常控制序列包括启动子、终止子且在一些情况下包括增强子、反式激活因子或转录因子。术语“控制序列”旨在包括至少以下所有组分：其存在是表达所必需的，且还可包括其他有利的组分。

术语“可操作地连接”表示并置位置，其中如此描述的多个组分的关系允许其以所需方式发挥功能。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以在与控制序列相容的条件下完成编码序列表达的方式连接。在控制序列是启动子的情况下，优选使用双链核酸对本领域技术人员而言是显而易见的。

因此，在某些实施方式中，所述载体是一种表达载体。“表达载体”是一种构建体，其可用于转化所选宿主并提供所选宿主中编码基因的表达。表达载体可例如是克隆载体，双向载体或整合载体。表达包括核酸分子的转录，优选转录为可翻译的mRNA。确保原核和/或真核细胞中表达的调控元件是本领域技术人员熟知的。在真核细胞的情况下，其通常包括确保转录起始的启动子且任选地包括确保转录终止和转录本稳定化的聚A信号。允许在原核宿主细胞中表达的可能调控元件包括，例如，大肠杆菌中的P_L、lac、trp或tac启动子，并且允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的示例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或者哺乳动物和其它动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子(劳氏肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子或球蛋白内含子。

除负责转录起始的元件外，这类调控元件还可包含转录终止信号，如SV40聚A位点或tk聚A位点，其在多核苷酸的下游。此外，根据所用的表达系统，能够引导多肽至细胞隔室或将其分泌至介质中的前导序列可添加至所述核酸序列的编码序列中并且是本领域熟知的。这些前导序列与翻译、起始和终止序列以适当方式组装，且优选能够引导翻译后蛋白质或其部分分泌至周质空间或胞外介质的前导序列。任选地，异质性序列可编码包含N端鉴定肽的融合蛋白，所述N端鉴定肽具有所需特性，例如表达的重组蛋白的稳定化或简化纯化；参见同上。本文中，合适的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-BergcDNA表达载体pcDV1(法玛西亚公司(Pharmacia))、pEF-Neo、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(英杰公司(Invitrogen))、pEF-DHFR和pEF-ADA(Raum等，CancerImmunolImmunother(2001)50(3),141-150)或pSPORT1(GIBCOBRL公司)。

在一些实施方式中，这些表达控制序列是载体中的真核启动子系统，能够转化或转染真核宿主细胞，但也可使用用于原核宿主的控制序列。一旦载体整合到合适宿主中，即将宿主维持在适于核苷酸序列的高水平表达的条件下，并根据需要可随后收集和纯化本发明的多肽。

其他调控元件可包括转录以及翻译增强子。有利地，本发明的上述载体包含可选择和/或可评分的标记物。用于选择转化的细胞的可选择标记物基因是本领域技术人员熟知的且包括例如作为选择dhfr的基础的抗代谢物抗性，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Reiss,PlantPhysiol.(Life-Sci.Adv.)13(1994),143-149)；npt，其赋予对氨基糖甙类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素的抗性(Herrera-Estrella,EMBOJ.2(1983),987-995)以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Marsh,Gene32(1984),481-485)。已描述了其他可选择基因，即trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988),8047)；甘露糖-6-磷酸异构酶，其允许细胞利用甘露糖(WO94/20627)和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂，2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸，DFMO的抗性(McConlogue，1987，刊于CurrentCommunicationsinMolecularBiology(《分子生物学的当前通信》)，冷泉港实验室编)或来自土曲霉的脱氨酶，其赋予对杀稻瘟菌素-S的抗性(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995),2336-2338)。

有用的可评分标记物也是本领域技术人员已知的且市售可得。有利地，所述标记物是编码以下物质的基因：荧光素酶(Giacomin,Pl.Sci.116(1996),59-72；Scikantha,J.Bact.178(1996),121)、绿色荧光蛋白(Gerdes,FEBSLett.389(1996),44-47)或β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson,EMBOJ.6(1987),3901-3907)。对于简单和快速地筛选含有所述载体的细胞、组织和生物体而言，该实施方式是特别有用的。

如上所述，所述核酸分子可单独或者作为载体的部分用于细胞，以在细胞中表达编码的多肽。向细胞中导入含有编码上述嵌合细胞因子受体构建体中任一种的DNA序列的核酸分子或载体，其继而产生感兴趣的多肽。所述的核酸分子和载体可经设计用于直接导入或通过脂质体或病毒载体(例如，腺病毒，逆转录病毒)导入细胞中。在某些实施方式中，细胞是例如T-细胞、CART-细胞、NK细胞、NKT-细胞、MSC、神经干细胞或造血干细胞。

根据上文，本发明涉及衍生遗传工程改造中常规使用的载体，尤其是质粒、粘粒、病毒和噬菌体的方法，该载体包含编码本文定义的嵌合细胞因子受体构建体的多肽序列的核酸分子。在具体实施方式中，所述载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。源自病毒如逆转录病毒、痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于递送所述多核苷酸或载体到靶细胞群中。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建重组载体；参见例如Sambrook等(在上述引文中)、Ausubel(1989，在上述引文中)或其他标准教科书中描述的技术。替代地，可将所述核酸分子和载体重建成用于递送到靶细胞的脂质体。含有本发明的核酸分子的载体可通过熟知的方法转移至宿主细胞中，其根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电转可用于其它细胞宿主，参见Sambrook，同上。

药物组合物

根据本发明，术语“药物组合物”指用于给予个体的组合物且涵盖用于免疫治疗的细胞的组合物。在具体实施方式中，用于免疫治疗的细胞经工程改造以表达至少嵌合细胞因子受体。在某些实施方式中，这些细胞包含一种或多种其他修饰，例如一种或多种受体，包括针对肿瘤抗原的受体。

在具体实施方式中，该药物组合物包括用于胃肠道外、透皮、管腔内、动脉内、鞘内或静脉内给药或用于直接注射至癌症的组合物。具体设想通过输注或注射向个体给予所述药物组合物。可通过不同方式有效地给予合适的组合物，例如通过静脉内、皮下、腹膜内、肌内、局部或皮内给药。

本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的运载体。合适的药物运载体的示例是本领域已知的且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液，如油/水乳液、多种类型的润湿剂、无菌溶液等。可通过熟知的常规方法配制包含这类运载体的组合物。这些药物组合物可以合适剂量给予对象。

可由主治医师和临床因素确定剂量方案。如医学领域所熟知，用于任何一个患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待给予的特定化合物、性别、给药时间和给药途径、总体健康状况和同时给予的其他药物。用于给药的具体剂量的范围可以是5x10⁶/m²至3x10⁸/m²。

本发明的组合物可局部或全身性给予。在某些实施方式中，本发明提供的组合物(例如表达本发明提供的构建体的细胞)可通过胃肠道外给予，例如静脉内、动脉内、鞘内、真皮下或肌内给予。在某些其他实施方式中，可直接将编码本发明提供的构建体的DNA给予至靶位点，例如通过基因枪递送到内部或外部靶位点或通过导管递送到动脉内位点。在优选的实施方式中，皮下给予药物组合物，且在更优选的实施方式中，静脉内给予。胃肠道外给药制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。水性运载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠道外载剂包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格溶液或固定油。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格右旋糖的那些物质)等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本发明的药物组合物可包含蛋白性运载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选人来源的。除蛋白性嵌合细胞因子受体构建体或编码其的核酸分子或载体(如上文所述)外，设想本发明的药物组合物还可包含生物活性试剂，这取决于该药物组合物的预定用途。在具体实施方式中，在10％DMSO、40％盐水和50％人血清白蛋白中静脉内输注细胞。

嵌合细胞因子受体和包含嵌合细胞因子受体的宿主T细胞的治疗性应用

在多个实施方式中，本发明所述的嵌合细胞因子受体构建体、核酸序列、载体、和/或宿主细胞和/或包含这些物质的药物组合物可用于预防、治疗或缓解癌性疾病，如肿瘤性疾病。在具体实施方式中，本发明的药物组合物具体可用于预防、缓解和/或治疗癌症，包括例如实体瘤。在某些情况中，该癌症具有肿瘤抗原。

本文所用“治疗”或“处理”包括对疾病或病理状况的症状或病变的任何有益或需要的效果，并且可包括治疗中的疾病或病症(例如，癌症)的一种或多种可测量标记物的甚至很小的减少。治疗可任选地包括疾病或病症的症状的减少或缓解，或者疾病或病症进展的延迟。“治疗”不一定表示疾病或病症或其相关症状的完全根除或治愈。

本文所用的“预防”和类似词汇如“防止”等表示用于预防、抑制或降低疾病或病症(例如，癌症)出现或复发的可能性的方法。其也指延迟疾病或病症的发生或复发或者延迟疾病或病症的症状的出现或复发。本文所用“预防”和类似词汇也包括在疾病或病症发生或复发之前降低疾病或病症的强度、影响、症状和/或负担。

在具体的实施方式中，本发明部分考虑可使用标准载体和/或基因递送系统将细胞、嵌合细胞因子受体构建体、核酸分子和载体单独或以任意组合给予，且在至少一些方面中，与药学上可接受的运载体或赋形剂一同使用。在某些实施方式中，给药后，所述核酸分子或载体可稳定地整合至对象的基因组中。

在具体的实施方式中，可使用特异性针对某些细胞或组织且在所述细胞中持续存在的病毒载体。合适的药物运载体和赋形剂在本领域是众所周知的。根据本发明制备的组合物可而用于预防或治疗或延缓上述鉴定的疾病。

此外，本发明涉及一种预防、治疗或缓解肿瘤性疾病的方法，包括以下步骤：向有此需要的对象给予有效量的细胞，所述细胞携带本发明所述和/或由本发明所述方法生成的嵌合细胞因子受体分子、核酸序列、载体。

给予示例性包含嵌合细胞因子受体的细胞的可能适应症是癌症，包括肿瘤疾病，包括乳腺、前列腺、肺和结肠癌或上皮癌，如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、皮肤癌、生殖-泌尿道癌症，例如卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌和肾癌、肺癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、唾液腺癌和甲状腺癌。给予本发明的组合物可用于癌症的所有阶段和类型，包括用于例如微小残留病、早期癌症、晚期癌症和/或转移性癌症和/或难以治疗的癌症。

本发明还包括与其它化合物，例如双特异性抗体构建体、靶向毒素或其它化合物(其通过免疫细胞发挥作用)的共同给药方案。共同给予本发明的化合物的临床方案可包括在给予其他组分同时、之前或之后共同给予。具体的联合治疗包括化疗剂(如下文VII.A.部分列举的化疗剂)、放疗、手术、激素治疗或其他类型的免疫治疗与本发明提供的表达嵌合TGFβ受体的细胞联用。

各实施方式涉及包含上文所述嵌合细胞因子受体构建体、上文所述核酸序列、上文所述载体和/或上文所述宿主的试剂盒。还考虑本发明的试剂盒包含上文所述药物组合物，其单独使用或与其他待给予药物联用于需要医学治疗或干预的个体。

通过示例的方式，如下治疗癌症患者或易患癌症的患者或疑似患有癌症的患者。如本文所述修饰的细胞可给予个体并且停留延长的时间段。该个体可接受细胞的一次或多次给药，且给药的间隔时间可以是数天、数周、数月或数年。在具体实施方式中，多次给药可在彼此的数周或数月内发生，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多周或月。在一些实施方式中，遗传修饰的细胞经包封以抑制免疫识别并位于肿瘤位点。在使用本发明的细胞进行初始治疗后肿瘤复发后向个体提供细胞的情况中，可改变这些细胞使其识别不同的靶肿瘤抗原。例如，当初始轮次包括携带嵌合细胞因子受体和特异性针对特定抗原的另一受体的细胞时，后续轮次后(包括肿瘤复发后(如果发生))可使用针对不同特定抗原的受体。

在具体的情况中，向个体提供有效量的治疗性细胞，所述治疗性细胞包含嵌合TGFβ受体以及任选的2)CAR、αβTCR和/或抗原特异性受体。可与一种或多种其他癌症治疗同时或不同时递送这些细胞。可在同一或单独的制剂中递送这些细胞和其他癌症治疗。可以单独的递送途径向个体提供细胞和其他癌症治疗。可通过例如在肿瘤位点处注射或静脉内或口服来递送细胞和/或其他癌症治疗。这类组合物的常规递送途径是本领域已知的。

已经用构建体修饰的细胞在选择性条件下在培养基中生长，并且选择具有构建体的细胞然后可增殖并使用例如聚合酶链反应进一步分析以确定宿主细胞中存在构建体。一旦已经鉴定到修饰的宿主细胞，然后可根据计划使用它们，例如在培养中扩增或导入宿主生物体。

根据细胞的性质，可以多种方式将细胞导入宿主生物体(如哺乳动物)。在具体实施方式中，可在肿瘤位点处导入细胞，但在替代性实施方式中，细胞定位到癌症或者经修饰定位到癌症。所采用的细胞数量将取决于多种情况，例如导入的目的、细胞的寿命、待使用的方案、给药的次数、细胞繁殖的能力、重组构建体的稳定性等。细胞可以分散体的形式应用，通常注射到或接近感兴趣的位点。细胞可以处于生理上可接受的基质中。

DNA转导不需要在每种情况中都产生整合。在一些情况中，导入的DNA的瞬时维持可能是足够的。通过这种方式，可能有短期效果，其中可将细胞导入宿主，然后在预定的时间后开启，例如，在细胞已经能够定位到特定位点之后。

可根据需要给予细胞。在某些实施方式中，可使用多种方案来调节方案参数。在具体实施方式中，给药的途径或次数或时机、细胞的寿命和/或存在的细胞数目可以发生变化。给药的次数可例如至少部分取决于上述因素。

应理解，该系统易受许多因素的影响，如对配体的细胞响应、表达效率、以及适当地，分泌水平、表达产物的活性、个体的具体需求，这些可随着时间和环境变化，由于缺少细胞导致的细胞活性缺失率或单个细胞的表达活性等。因此，即使存在可大规模给予群体的通用细胞，预期对于各个体患者监测各患者的个体合适剂量，并且这类监测患者的实践在本领域中是常规的。

在具体实施方式中，存在一种筛选试验，其被用作或未被用作本发明的方法的一部分。例如，在某些实施方式中，提取活检样品并评估TGFβ产生水平以确定构建体是否在被提取活检样品的个体中起作用。在具体实施方式中，该试验方法鉴定可检测地表达TGFβ或特定水平的TGFβ的癌症。

本发明的试剂盒

本文所述的任意组合物可包含于试剂盒中。在一个非限制性实施例中，可在试剂盒中包含用于细胞疗法的表达嵌合细胞因子受体的细胞和/或生成用于细胞疗法的一种或多种细胞的试剂，该疗法含有重组表达载体。以合适的容器方式提供试剂盒组分。

这些试剂盒的一些组分可包装在水性基质中或包装成冻干形式。这些试剂盒的容器用具通常包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器用具，其中该组分可放置，并优选适当分装于其中。在试剂盒中存在超过一种组分的情况中，该试剂盒通常还含有第二、第三或其他容器，其中可分开放置其他组分。然而，可在小瓶中包含组分的各种组合。本发明的试剂盒通常还包含用于市售的封闭约束形式含有该组分的器具。此类容器可包括注塑或吹塑的塑料容器，其中保留所需小瓶。

当在一种和/或多种液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液是水性溶液，无菌水性溶液是特别有用的。在一些情况中，容器用具本身可以是注射器、移液器和/或其他这类设备，从中可将制剂施用于身体的受感染区域、注射到动物中和/或甚至用于和/或与试剂盒的其他组分混合。

然而，试剂盒的组分可以干粉形式提供。当以干粉提供试剂和/或组分时，可通过加入合适的溶剂来重建粉末。设想也可以另一种容器用具提供溶剂。该试剂盒还可包含含有无菌的、药学上可接受的缓冲剂和/或其他稀释剂的第二容器用具。

在本发明的具体实施方式中，在试剂盒中提供待用于细胞疗法的细胞，并且在一些情况中，细胞基本上是试剂盒的唯一组分。该试剂盒可包含制备所需细胞的试剂和材料。在具体实施方式中，该试剂和材料包含用于扩增所需序列的引物、核苷酸、合适的缓冲剂或缓冲试剂、盐等，并且在一些情况中，该试剂包括编码本文所述嵌合细胞因子受体和/或其调控元件的DNA和/或载体。

在具体实施方式中，试剂盒中存在适用于从个体提取一个或多个样品和/或向个体递送细胞的一种或多种设备。该设备可以是注射器、解剖刀等。

在本发明的一些情况中，除了细胞疗法实施方式以外，试剂盒还包括第二癌症疗法，例如化疗、激素疗法和/或另一种免疫疗法。这些试剂盒可针对个体的具体癌症进行调整并且包含该个体的相应第二癌症疗法。

联合治疗

在本发明的某些实施方式中，用于临床方面的本发明的方法与在过度增殖性疾病治疗中有效的其他试剂(如抗癌试剂)联用。“抗癌”试剂能对对象的癌症产生不利影响，例如通过杀死癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞生长速率、降低转移的发生率或数量、降低肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供给、促进对癌细胞或肿瘤的免疫应答、阻止或抑制癌症发展、或延长患癌对象的寿命。更一般地，这些其他组合物会以有效杀死或抑制细胞增殖的组合量提供。该过程可涉及用表达构建体和试剂或多种因子同时接触所述癌细胞。这可通过用单一组合物或包括两种试剂的药物制剂接触所述细胞，或者通过用两种不同组合物或制剂同时接触所述细胞来实现，其中一种组合物包括所述表达构建体而另一种包括所述第二试剂。

耐受化疗和放疗试剂的肿瘤细胞是临床肿瘤学中的主要问题。现有的癌症研究的一个目标是寻找通过将化疗和放疗与其它疗法组合改善化疗和放疗的效率的方式。在本发明中，考虑可类似地将细胞治疗与化疗、放疗和/或免疫治疗介入联用。

替代地，本发明的细胞治疗可先于或在其他试剂治疗之后，间隔数分钟到数周。在对个体分开应用其他试剂和本发明的实施方式中，一般需保证各递送的时间之间没有明显过期，从而该试剂和本发明的治疗仍可在细胞上产生有利的组合效果。在这类情况中，考虑可将细胞与两种方式接触，互相间隔在约12-24小时内，并且更优选互相间隔在约6-12小时内。然而在一些情况中，可能需要显著延长治疗时间，其中各给药之间间隔数天(2、3、4、5、6或7)到数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

可采用各种组合，本发明为“A”，所述第二试剂如放疗或化疗为“B”。

A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/B

B/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/A

B/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A

预期所述治疗循环在需要时重复。还预期各种标准治疗法以及外科手术介入可与本发明细胞治疗法联用。

A.化疗

癌症疗法可包括多种同时有基于化学品和放射的治疗的组合疗法。组合抗癌试剂包括，例如，阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；乙酸阿美蒽醌；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；门冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布(COX-2抑制剂)；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；盐酸法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；氮尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；异丙铂；伊立替康；盐酸伊立替康；乙酸兰瑞肽；来曲唑；乙酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；乙酸基孕甾酮；乙酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；氨甲喋呤；氨甲喋呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托洁林；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺拉霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；奈莫司汀；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟菲尔钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌罗霉素；盐酸嘌罗霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；链黑霉素；链佐星；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；泰素帝；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酪；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；塞替派；噻唑呋林；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；乙酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星；

20-表-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇(adecypenol)；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；阿米多克斯(amidox)；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管新生抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗-背侧化形成蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮(antineoplaston)；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；阿苏拉科林(asulacrine)；阿他美坦；阿莫司汀；阿西他汀(axinastatin)1；阿西他汀2；阿西他汀3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；巴拉醇(balanol)；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚(benzochlorin)；苯甲酰星孢素；β内酰胺衍生物；β-阿里辛(β-alethine)；贝塔克拉霉素(betaclamycin)B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮丙啶精胺；双奈法德；比特迪尼(bistratene)A；比折来新；贝伏特(breflate)；溴匹立明；布度钛；丁基硫堇亚胺；卡泊三醇；卡弗他丁(calphostin)C；喜树碱衍生物；卡培他滨；羧酰胺-氨基-三唑；羧基酰胺三唑；CaRestM3；CARN700；软骨衍生的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；澳粟精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；双氢叶吩(chlorlns)；氯代喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺-卟啉；克拉屈滨；恩氯米芬类似物；克霉唑；克利霉素(collismycin)A；克利霉素B；考布他汀A4；考布他汀类似物；克纳宁(conagenin)；科莱贝司丁(crambescidin)816；克立那托；自念珠藻环肽(cryptophycin)8；自念珠藻环肽A衍生物；麻疯树毒蛋白(curacin)A；环戊蒽醌(cyclopentanthraquinone)；环普拉坦(cycloplatam)；塞培霉素(cypemycin)；阿糖胞苷十八烷基磷酸钠；细胞裂解因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；脱氢代代宁B；地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；代代宁B；二羟基苯并氧肟酸(didox)；二乙基正精胺；二氢-5-氮杂胞苷；二氢紫杉醇，9-；二氧霉素(dioxamycin)；二苯基螺莫斯汀；多西他赛；二十二烷醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；阿霉素；屈洛昔芬；屈大麻酚；多卡霉素SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；依立雄胺；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊甙；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；黄皮酮(flavopiridol)；氟卓斯汀；夫卢丝龙(fluasterone)；氟达拉滨；盐酸氟代柔红霉素(fluorodaunorunicin)；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；德卟啉钆(gadoliniumtexaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；赫舒反(hepsulfam)；调蛋白；环己基双乙酰胺；金丝桃蒽酮；伊班膦酸；黄胆素；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；伊马替尼(如)；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘阿霉素；甘薯苦醇，4-；伊罗普拉；伊索拉定；异本格唑(isobengazole)；异高软海绵素(isohomohalicondrin)B；伊他司琼；结丝立得(jasplakinolide)；卡哈拉得(kahalalide)F；片螺素(lamellarin)-N三乙酸；兰瑞肽；雷纳霉素(leinamycin)；来格司亭；硫酸蘑菇多糖；莱托斯汀(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；直链多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；利索纳得(lissoclinamide)7；洛铂；胍乙基磷酸丝氨酸；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛索立宾；勒托替康；德卟啉镥(lutetiumtexaphyrin)；莱索菲林(lysofylline)；细胞裂解肽；美坦新；慢诺他汀(mannostatin)A；马立马司他；马索罗酚；马斯平(maspin)；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；硫巴妥苯胺；美替瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；米托毒素(mitotoxin)成纤维细胞生长因子-皂草毒蛋白；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；爱必妥，人绒毛膜促性腺激素；单磷酰基脂质A+分支杆菌细胞壁骨架；莫哌达醇；多药耐药基因抑制剂；印度洋海绵(mycaperoxide)B；分枝杆菌细胞壁提取物；米亚普龙(myriaporone)；N-乙酰基地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替喷(nagrestip)；纳洛酮+镇痛新；纳帕英(napavin)；萘萜二醇(naphterpin)；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼鲁米特；尼萨霉素(nisamycin)；氮氧化物调节剂；硝基氧抗氧化剂；尼多林(nitrullyn)；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；奥可斯酮(okicenone)；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；奥莱辛(oracin)；口服细胞因子诱导物；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；氧杂奥诺霉素(oxaunomycin)；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕劳胺(palauamine)；棕榈酰根霉素；帕米磷酸；人参炔三醇；帕诺米芬；副菌铁素(parabactin)；帕折普汀；培门冬酶；培得星；戊聚硫钠；喷司他丁；喷托唑(pentrozole)；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏子醇；苯那霉素(phenazinomycin)；乙酸苯酯(phenylacetate)；磷酸酶抑制剂；皮西巴尼(picibanil)；盐酸匹鲁卡品；吡柔比星；吡曲克辛；胎盘素(placetin)A；胎盘素B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟菲尔钠；泊非霉素；氯泼尼松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微藻(microalgal)；蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑啉吖啶；吡哆醛化的血红蛋白聚氧乙烯偶联物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化的瑞替普汀；依替膦酸铼Re186；根霉素；核酶；RII维甲酰胺(retinamide)；罗希吐碱(rohitukine)；罗莫肽；罗喹美克；卢比格酮(rubiginone)B1；卢伯西(ruboxyl)；沙芬戈；伞托平(saintopin)；SarCNU；萨可菲醇(sarcophytol)A；沙格司亭；Sdi1模拟物；司莫司汀；衰老衍生的抑制剂1；正义寡核苷酸；信号转导抑制剂；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯基乙酸钠；索尔醇(solverol)；生长调节素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；斯卡霉素(spicamycin)D；螺莫司汀；脾脏五肽(splenopentin)；海绵他汀(spongistatin)1；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；斯提酰胺(stipiamide)；基质分解素抑制剂；斯菲诺辛(sulfinosine)；强效血管活性肠肽拮抗剂；素拉迪塔(suradista)；苏拉明；苦马豆碱；他莫司汀；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；碲吡喃洋(tellurapyrylium)；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；十氧化四氯(tetrachlorodecaoxide)；四佐胺(tetrazomine)；泰立拉汀(thaliblastine)；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；本紫红素乙酯锡；替拉扎明；二氯环戊二烯钛；拓扑森汀(topsentin)；托瑞米芬；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰基尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦衍生的生长抑制因子；脲激酶受体拮抗剂；伐普肽；瓦立奥林(variolin)B；维拉雷琐；藜芦明；瓦尔丁(verdins)；维替泊芬；长春瑞滨；威科萨汀(vinxaltine)；维他辛(Vitaxin)；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；和净司他丁斯酯，或上述任何类似物或衍生变体及其组合。

在具体实施方式中，针对个体的化疗与本发明联用，例如，在本发明的给药之前、期间和/或之后。

B.放疗

造成DNA损伤并已广泛使用的其他因素包括通常称为γ射线、X射线和/或将放射性同位素直接递送给肿瘤细胞。也考虑其它形式的DNA破坏因素，如微波和紫外辐射。所有这些因素很有可能会对DNA、DNA前体、DNA复制和修复、染色体装配和维持造成较宽范围的损伤。X-射线的剂量范围从延长期间(3至4周)50至200伦琴的每天剂量到2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围差异很大，取决于所述同位素的半衰期、发射辐射的强度和类型、以及肿瘤细胞的摄入。

本文所用术语“接触”和“暴露”用于细胞时，描述治疗构建体和化疗或放疗试剂递送给靶细胞或放置成与所述靶细胞直接并置所用的方法。为了实现细胞杀死或静止，以有效杀死所述细胞或阻止其分裂的结合量将两种试剂递送给细胞。

C.免疫治疗

免疫治疗通常依赖于使用免疫效应细胞和分子靶向并破坏癌细胞，且在某些实施方式中可使用不同于本发明的表达嵌合细胞因子的细胞的免疫治疗。免疫效应物可为例如对肿瘤细胞表面的一些标记特异的抗体。抗体本身可用作治疗效应物或其可招募其他细胞以实际影响细胞杀死。抗体也可与药物或毒素(化疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)偶联并且仅用作靶向剂。替代地，所述效应物可为携带表面分子的淋巴细胞，所述分子直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。

除本发明所述治疗以外的免疫治疗可因此用作组合治疗的一部分，与本发明的细胞治疗联用。组合疗法的一般方法如下所述。一般而言，肿瘤细胞必须携带一些易于靶向的标记物，即，不存在于大多数其它细胞上。存在许多肿瘤标记物并且这些标记物中的任一种适用于在本发明的内容中靶向。常见的肿瘤标记物包括癌胚抗原、前列腺特异抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erbB和p155。

在某些其他实施方式中，该免疫治疗包括使用针对例如DLL4、Notch或Wnt通路蛋白的抗体。

D.基因

在另一实施方式中，所述第二治疗为基因治疗，其中在本发明临床实施方式之前、之后或同时给予治疗性多核苷酸。本发明涵盖各种表达产物，包括细胞增殖诱导剂、细胞增殖抑制剂或细胞程序性死亡调节剂。

E.手术

约60％的癌症患者会经历一些类型的外科手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和缓解性外科手术。治愈性外科手术是可与其他治疗法联用的癌症治疗，所述治疗法如本发明的治疗、化疗、放疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或其他治疗。

治愈性外科手术包括切除术，其中所有或部分癌组织被物理移除、切割和/或破坏。肿瘤切除是指物理去除至少部分肿瘤。除了肿瘤切除术，外科手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微镜控制手术(莫氏(Mohs)手术)。还预期本发明可与浅表性癌、初癌或附带量的正常组织移除联用。

所有癌细胞、组织或肿瘤的部分切割后，可在体内形成空腔。治疗可通过灌注、直接注射或局部区域应用其他抗癌治疗来实现。该治疗可例如每1、2、3、4、5、6或7天或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复。这些治疗也可用不同的剂量。

F.其他试剂

可考虑其它试剂与本发明联用以改善治疗效力。这些其他试剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体和GAP连接上调的试剂、细胞抑制和分化试剂、细胞粘附抑制剂、或增加所述过度增殖性细胞对凋亡诱导物的敏感性的试剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其他趋化因子。还考虑细胞表面受体或其配体如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL的上调将通过对过度增殖细胞建立自分泌或旁分泌作用来增强本发明的凋亡诱导能力。通过提高GAP接头的数量将提高对相邻过度增殖细胞群的抗-过度增殖作用。在其他实施方式中，细胞抑制或分化试剂可与本发明联用以改进所述治疗的抗过度增殖效力。考虑细胞粘附抑制剂来改善本发明的效力。细胞粘附抑制剂的例子为粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。还可考虑增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其它药剂(如抗体c225)与本发明联用以提高治疗效力。

实施例

纳入下列实施例以显示本发明的优选实施方式。本领域的普通技术人员应理解，根据本发明人揭示的技术，实施例中公开的技术能很好地用于实施本发明，从而可将其视为实施本发明的优选模式。但是，本领域技术人员根据本公开应理解，在不偏离本发明精神和范围的前提下，可对所公开的具体实施方式进行许多变化，同时仍能获得相同或类似的结果。

实施例1

本发明的示例性实施方式

图1显示装备T细胞以克服抑制性肿瘤微环境的示例性方法。该方法使来自TGFβ的抑制性信号转化为(例如)肿瘤特异性CTL增殖的正信号。转化位置位于TGFb受体处，其中该受体利用细胞因子受体胞外结构域和胞内结构域，该胞内结构域以正信号传送信号。图2提供了适用于本发明的示例性载体(其编码嵌合TGFβ受体)，包括使用TLR2胞内结构域的载体(RIID2)或使用TLR4胞内结构域的载体(本文也称为RIID4)。显示了显性阴性受体的对照，其包含TGFβ受体胞外结构域且不具有胞内结构域。虽然任何类型的载体都可包含表达构建体，但使用了逆转录病毒载体。

图3显示DNRII对照以及示例性嵌合TGFβ受体RIID2和RIID4的生成。流式细胞术图像显示表达特定嵌合受体的细胞的百分比(图3)。

图4A显示显性阴性对照DNRII以及示例性嵌合TGFβ受体RIID2(用mOrange标记)和RIID4(用GFP标记)与特异性针对PSCA的示例性第二代嵌合抗原受体(CAR)的共表达。图4B进一步显示可在第二代CAR-PSCAT细胞上表达RIID4。

图5显示RIID2和RIID4保护暴露于TGFβ的CAR修饰的T细胞。在显微镜下观察细胞团簇形式的处于健康环境中并增殖的T细胞(弱抗原刺激并给予5ng/ml的TGFβ1；不给予IL2)。图5显示，虽然对照DNRII和RIID2在TGFβ1存在的情况下显示一些细胞团簇，但在比较不存在和存在TGFβ1的情况时RIID4细胞几乎无法区分。

图6A-6C显示，在抑制条件下，RIID2和RIID4修饰的T细胞在TGFβ存在时受到保护。图6A显示在仅携带CAR的对照细胞中，T细胞增殖下降，在TGFβ1存在时特别快。在显性阴性受体DNR存在的情况下，在后期出现了增殖降低。图6B中，存在嵌合TGFβ受体RIID2增强增殖，即使在TGFβ存在时也是如此。即使在几乎100天后，这些细胞也能在TGFβ存在时增殖。图6C还显示存在嵌合TGFβ受体RIID4增强增殖，即使在TGFβ存在时也是如此。

图7显示在TGFβ1存在的情况下选择携带示例性嵌合TGFβ受体RIID2和RIID4的细胞，且图8显示携带RIID2和RIID4的细胞需要抗原刺激来进行扩增。因此，在具体实施方式中，当体内细胞成功降低肿瘤负载时，其增殖将下降。

图9显示RIID2和RIID4增强示例性PSCACAR针对示例性DU145前列腺癌细胞的抗肿瘤作用。

实施例2

免疫抑制性TGF-Β信号转换器

嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞是用于治疗癌症的理想工具。为将该治疗方式扩展至前列腺癌，发明人生成了靶向肿瘤抗原PSCA的第2代CAR(2G.CAR-PSCA)，其向细胞提供杀死PSCA+前列腺肿瘤细胞的能力(20:1E:T下Du145细胞的51.7±1.2％特异性裂解)。然而，许多肿瘤(包括前列腺癌)分泌TGFβ，其抑制体内T细胞增殖、激活和功能。本发明满足了本领域的这一需要以克服T细胞的这一体内限制。

先前已证明，可通过转基因表达截短的显性阴性受体(DNRII)(其阻断TGFβ信号的传送)来保护过继转移的T细胞免于TGFβ的抑制性作用。本发明中，发明人通过将来自TGFβ的抑制性信号转化为针对T细胞的激活刺激来延伸该策略。发明人生成了一种嵌合细胞因子受体，其表达与示例性toll样受体(TLR)4的胞内结构域和GFP相连的TGFβRII的胞外结构域(RIID4)。

发明人生成了一种嵌合细胞因子受体，其表达与示例性toll样受体(TLR)4的胞内结构域和GFP相连的TGFβRII的胞外结构域(RIID4)。发明人使用RIID4转导原代T细胞并获得69.3±6.0％转导，其稳定持续超过60天的培养期。

为确认RIID4的转基因表达是否针对TGFβ进行保护，发明人修饰了2G.CAR-PSCAT细胞以共表达显性阴性DNRII或RIID4受体。随后在具有或不具有外源性TGFβ1(5ng/mL)的情况下使用PSCA+肿瘤细胞(K562-PSCA)每周刺激这些T细胞。在TGFβ1不存在的情况下，2G.CAR-PSCA、2G.CAR-PSCA(DNRII)或2G.CAR-PSCA(RIID4)T细胞以类似水平增殖30天(分别是6.4x10²、2.5x10³、5.9x10³倍)。但是，在TGFβ1存在的情况下，2G.CAR-PSCAT细胞不扩增，但培养在2周内失败。相反地，DNRII或RIID4的转基因表达保护细胞免受该细胞因子的抑制性影响(在培养2周时分别为7.4和21倍)。为确定DNRII和RIID4修饰的细胞之间是否存在长期差异，发明人监测了细胞扩增并发现仅RIID4修饰的T细胞能够在TGFβ1存在的情况下扩增持续超过60天(3.0x10⁵倍)而DNRII细胞在培养30天后开始收缩(0.72倍)。给予TGFβ1还选择2G.CAR-PSCA(RIID4)T细胞，导致该转基因细胞群随时间富集(从63.6％至93.3％)。该修饰是安全的，因为仅给予TGFβ1不足以驱动转基因T细胞增殖(0.04倍)，且撤回抗原性刺激导致T细胞收缩(0.02倍)。最后，为确认该修饰是否可改善CAR-T细胞的抗肿瘤活性，发明人将表达PSCA并产生TGFβ1的1x10⁶个萤火虫荧光素酶-Du145细胞与1x10⁵个2G.CAR-PSCA,2G.CAR-PSCA(DNRII)或2G.CAR-PSCA(RIID4)T细胞共培养。6天后，与仅DNRII或CAR的条件相比，表达RIID4的T细胞对肿瘤生长的控制更好(总通量；分别是9±0.1x10⁹、10±1x10⁹、20±1x10⁹p/s)。因此，RIID4不仅保护细胞免受TGFβ的抑制性作用还将该细胞因子信号转化为刺激性信号。

实施例3

肿瘤微环境中的嵌合细胞因子受体

已在癌症(包括至少前列腺癌)的患者中检测到高水平的TGFβ，其通过抑制效应T细胞功能同时促进调节性T细胞(Treg)发育发挥作用。在野生型条件下，TGFβ参与导致Smad2/3的磷酸化，其触发多条抑制通路(图10A)。为评估TGFβ对于肿瘤特异性T细胞的影响，将CAR-PSCAT细胞与TGFβ(5ng/ml)一起培养并每周给予两次。如同预期的那样，这导致Smad2/3的磷酸化并降低了CAR-PSCAT细胞中的溶细胞功能(图10A和10B)。此外，TGFβ暴露导致CART细胞扩增的降低，这部分是由于较高的细胞死亡(图10C和10D)。有趣的是，CAR-PSCAT细胞暴露于TGFβ也导致PD1上调，表明T细胞耗尽(图10E)。有趣的是，TGFβ1不诱导RIID4修饰的T细胞中的pSmad2/3(图14)。

配备CAR-PSCAT细胞针对TGFβ：为确定嵌合细胞因子受体是否可用于保护肿瘤特异性T细胞免受TGFβ的免疫抑制作用，用TGFβ胞内结构域代替免疫刺激分子的相应部分。胞内结构域的一个示例来自Toll样受体(TLR)家族，其构成先天免疫应答的重要组成部分。具体而言，已证明T细胞中的TLR4信号转导改善T细胞激活同时减少共刺激的需要。因此，出于将TGFβ的抑制性信号转化为免疫刺激信号的目的，使用TGFβR胞内结构域替换TLR4胞内结构域(在本发明中称作“RIID4”)(图11B和12A)。

RIID4表达保护CART细胞免受TGFβ影响。为评估嵌合细胞因子受体是否能够保护CART细胞免受TGFβ影响，生成了一种逆转录病毒载体，其表达TGFβR的胞外组分和TLR4的胞内信号转导结构域(RIID4)。随后使用IRES将该序列与GFP相连，允许检测转基因T细胞群(图12A)。随后使用编码RIID4/GFP的逆转录病毒载体转导激活的T细胞，如图12B所示。如同受体表达与GFP的直接关联所示，T细胞上的RIID4表达是稳定的。为评估构建体的保护性质，在CAR-PSCAT细胞上共表达RIID4并在TGFβ存在的情况下对其进行培养。重要的是，在与TGFβ共培养时仅表达RIID4的CART细胞能够扩增，如图12C中的培养照片所示。如预期的那样，向CART细胞给予TGFβ诱导PD1表达上调。相反地，使用RIID4构建体修饰的T细胞不表达PD1，表明这些T细胞中缺少消耗(图12D)。

本发明的实施方式扩展了嵌合细胞因子受体的靶标范围。具体的实施方式包括表达TGFβ受体的胞外结构域和不同共刺激分子的胞内结构域的嵌合细胞因子受体的不同排列的阵列，如图13所示。随后，可鉴定这些构建体中哪一种在TGFβ存在的情况下最有效地增强了T细胞功能并确定纳入这类修饰是否能够通过降低抑制性产生TGFβ的T调节细胞的功能来提供积极的周边作用。

载体生产和评估：可通过本领域中标准的重组方法生成多种不同的TGFβ/免疫刺激性胞内结构域构建体(TGFβR/Th1)。表达TGFβ受体的胞外结构域和TLR4的胞内结构域的逆转录病毒载体的一个示例RIID4示于图12A。使用该载体作为模板的示例，可通过使用例如OX40、CD28、41BB和CD28/41BB替换跨膜结构域和TLR4的胞内结构域来亚克隆额外的配置。在具体实施方式中，这些载体可共表达标记物，如GFP。随后可比较这些不同载体在T细胞中的表达和功能。

构建体评估：为表征不同构建体对逆转TGFβ的抑制性信号转导的适用性，可生成病毒上清液并转导T细胞。可通过流式细胞术分析将TGFβ受体与GFP表达相关联来评估蛋白质表达，如图12B所示。可通过例如比较TGFβ存在或不存在的情况下的T细胞(i)扩增、(ii)细胞因子产生、(iii)表型特征包括效应、记忆和消耗标记物的表达和(iv)溶细胞功能来评估转基因功能。

在具体实施方式中，不同的TGFβ细胞因子受体构建体可实现大于60％的转导效率。在具体实施方式中，如流式细胞术分析检测的那样，这些构建体在T细胞表面上稳定表达。在一般的实施方式中，TGFβR/Th1构建体的排列显示TGFβ存在时优异的T细胞扩增、细胞因子产生、表型特征和溶细胞功能。然而，由于某些实施方式中共刺激胞内结构域的差异，与表达含单个胞内结构域的受体的细胞相比，用CD28/41BB构建体修饰的T细胞在扩增方面具有更高的潜力。在某些方面中，该增强的增殖能力导致过度激活和细胞消耗，如同例如PD1、TIM3和LAG3的上调所测量的那样。

可评估双重特异性CTL中TGFβR/Th1的体外和体内功能。这些研究可显示是否可通过双重特异性CTL表达TGFβR/Th1，以及转基因CTL是否即使在TGFβ存在的情况下也能维持其增殖能力和抗肿瘤活性。双顺反子逆转录病毒载体中可包含一种或多种TGFβR/Th1构建体。在具体的实施例中，该双顺反子逆转录病毒载体编码CAR-PSCA和TGFβR/Th1。

例如，可通过使用IFNγELIspot(其中使用PSMA和PSCA肽混物作为刺激物)并在短期(4小时Cr⁵¹试验)、长期(4天共培养)细胞毒性试验中和携带TRPC肿瘤的小鼠中通过测量TGFβ存在情况下的杀伤(其中使用TRPC肿瘤作为靶标)来确认CTL在TGFβ存在的情况下维持其功能和抗肿瘤活性。

在具体实施方式中，表达TGFβR/Th1的双重特异性CTL维持针对其各自靶标(如PSCA和PSMA)的抗原特异性。然而，在具体实施方式中，在TGFβ存在的情况下仅表达TGFβR/Th1的T细胞是功能性的，导致更强的体外和体内抗肿瘤作用(表1)。

表1：表达嵌合细胞因子受体的双重CTL的预期评估

评估TGFβR/Th1的周边作用可通过从肿瘤微环境中消耗抑制性细胞因子来评价TGFβR/Th1对接受者免疫系统提供积极周边作用的能力。为进行评估，可通过进行产生TGFβ的T调节细胞的自体转移(其将在肿瘤位点处递送TGFβ)来在动物模型中重建免疫抑制肿瘤环境。实验组可细分为两组：(i)双重-CTL-TGFβR/Th1或(ii)双重-CTL作为对照。T细胞治疗后两周，可处死一组小鼠以评价TGFβ的瘤内水平以及T调节细胞的数目和功能。

在特定实施方式中，存在T调节细胞的情况下仅存在来自双重-CTL(单独)的边缘抗肿瘤应答(marginalanti-tumorresponse)(表2)。在具体实施方式中，且相反，使用表达TGFβR/Th1的双重-CTL进行治疗消耗来自肿瘤微环境的TGFβ的水平，影响T调节细胞的功能和持久性(表2)，导致总体增强的抗肿瘤应答。

表2：使用包含嵌合细胞因子受体的双重-CTL的结果的示例

携带RIID4的T细胞被保护免受TGFβ1诱导的凋亡(图15)；此外，RIID4阻止PD1上调(图16)和TGFβ1诱导的对溶细胞功能的抑制(图17)。

图18显示通过TGFβ1暴露选择RIID4+细胞，而撤回抗原和TGFβ1导致培养失败(图19)。

图20显示共培养实验设置的一个示例。

图21显示TGFβ1存在的情况下2G.CAR-PSCA/RIID4细胞消除肿瘤。

图22显示2G.CAR-PSCAT细胞在TGFβ1存在的情况下不增殖。

图23显示2G.CAR-PSCA/RIID4细胞能够依赖于抗原存在而扩增。图24显示给予TGFβ1促进2G.CAR-PSCA/RIID4T细胞的增殖。因此，RIID4修饰的T细胞可将TGFβ1用于其增殖。

在具体实施方式中，TGFβR/Th1嵌合细胞因子受体可与另一种嵌合细胞因子受体联用。在具体实施方式中，TGFβR/Th1嵌合细胞因子受体用于与IL4Rα/IL7R(4/7R)嵌合细胞因子受体相同的细胞中。在具体实施方式中，TGFβR/Th1嵌合细胞因子受体和其他嵌合细胞因子受体导致合作信号转导。因此，在具体实施方式中，提供了双重CTL，其表达(i)4/7R(ii)TGFβR/Th1或(iii)4/7R和TGFβR/Th1。在某些实施方式中，使用4/7R和TGFβR/Th1嵌合细胞因子受体导致协同应答。

尽管已经详细描述了本发明和其优势，但是应当理解，可对本文进行各种变化、替代和改变而不背离所附权利要求所定义的本发明的精神和范围。此外，本申请的范围不是旨在限制于本说明书所述的形式、手段、方法和步骤的过程、机器、制造、组合物的具体实施方式。本领域普通技术人员通过本发明的内容将容易理解，现存或后续开发的与本文所述相应实施方式实施基本相同功能或实现基本相同结果的形式、手段、方法、或步骤的过程、机器、制造、组合物均可使用。因此，所附权利要求旨在将形式、手段、方法、或步骤的过程、机器、制造、组合物包括在其范围内。

Claims (58)

1.一种包含编码嵌合TGFβ受体的核苷酸序列的多核苷酸，所述受体包含TGFβ受体的胞外结构域和非TGFβ受体的胞内结构域。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，所述胞内结构域包含免疫刺激蛋白的胞内结构域或其功能片段，所述胞内结构域或其功能片段来自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、CD28、41BB、41BB、OX40、CD3ξ、CD40、CD27，或其组合。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，所述胞内结构域来自toll样受体(TLR)4。

4.如权利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸还包含编码嵌合抗原受体(CAR)或αβT细胞受体(TCR)的多核苷酸序列，所述TCR是所述T细胞的原有TCR或是工程改造的TCR。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，所述多核苷酸编码CAR。

6.如权利要求4所述的多核苷酸，所述嵌合TGFβ受体的表达和所述CAR和/或αβTCR的表达在相同的一个或多个调控元件的控制下。

7.如权利要求1所述的多核苷酸，所述嵌合TGFβ受体的表达和所述CAR和/或αβTCR的表达分别在不同的一个或多个调控元件的控制下。

8.如权利要求4-7中任一项所述的多核苷酸，包含结合以下一种或多种的靶向结构域：PSCA、HER2、CD19、CD20、CD22、κ链或轻链、BCMA、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原(CEA)、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体α2、IL-11受体Rα、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、LewisY、G250/CAIX、HLA-AIMAGEA1、HLA-A2NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎牛AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1、TEM8，或其组合。

9.如权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸被进一步限定为表达构建体或载体。

10.如权利要求9所述的多核苷酸，所述载体是病毒载体或非病毒载体。

11.如权利要求10所述的多核苷酸，所述病毒载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

12.如权利要求11所述的多核苷酸，所述非病毒载体是质粒或mRNA。

13.如权利要求1-12中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含在细胞中。

14.如权利要求13所述的多核苷酸，所述细胞是T细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、抗原特异性T细胞，或包含αβTCR的T细胞，所述αβTCR是所述T细胞的原有TCR或是工程改造的TCR。

15.如权利要求14所述的多核苷酸，所述抗原特异性T细胞被进一步限定为肿瘤特异性T细胞或病原体特异性T细胞。

16.如权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸，所述TGFβ受体包含部分或全部的TGFβ受体II。

17.一种由权利要求1-16中任一项所述多核苷酸编码的多肽。

18.一种包含权利要求1-16中任一项所述多核苷酸的组合物。

19.如权利要求18所述的组合物，所述组合物还包含含有CAR或编码αβTCR编码序列的多核苷酸，所述αβTCR是所述T细胞的原有TCR或是工程改造的TCR。

20.如权利要求19所述的组合物，其中，包含编码嵌合TGFβ受体的序列的多核苷酸还包含含有CAR或αβTCR编码序列的多核苷酸。

21.如权利要求19所述的组合物，其中，包含编码嵌合TGFβ受体的序列的多核苷酸不包含含有CAR或αβTCR编码序列的多核苷酸。

22.包含一种或多种细胞的组合物，所述细胞包含权利要求1-16中任一项所述多核苷酸。

23.如权利要求22所述的组合物，所述细胞是免疫细胞。

24.如权利要求22所述的组合物，所述细胞是T细胞、NK细胞或NKT细胞。

25.如权利要求22所述的组合物，所述细胞是抗原特异性T细胞，和/或包含αβTCR，所述TCR是所述T细胞的原有TCR或是经工程改造的TCR。

26.如权利要求25所述的组合物，所述抗原特异性T细胞被进一步限定为肿瘤特异性T细胞或病原体特异性T细胞。

27.如权利要求25所述的组合物，所述抗原特异性T细胞的抗原特异性是天然的。

28.如权利要求25所述的组合物，所述抗原特异性T细胞的抗原特异性是重组生成的。

29.如权利要求25所述的组合物，其中，细胞上的αβTCR是天然的。

30.如权利要求25所述的组合物，其中，细胞上的αβTCR是重组生成的。

31.如权利要求22所述的组合物，所述细胞包含嵌合抗原受体。

32.一种包含细胞的组合物，其中，一种或多种细胞包含：

编码嵌合TGFβ受体的第一多核苷酸，所述嵌合TGFβ受体包含TGFβ受体的胞外结构域和非TGFβ受体胞内结构域；以及

编码CAR和/或αβTCR的第二多核苷酸。

33.如权利要求32所述的组合物，其中，所述第一和第二表达构建体同分子。

34.如权利要求32所述的组合物，其中，所述第一和第二表达构建体是不同的分子。

35.如权利要求32所述的组合物，所述抗原特异性T细胞是肿瘤特异性T细胞受体或病原体特异性T细胞受体。

36.如权利要求32所述的组合物，所述CAR特异性针对选自下组的抗原：PSCA、HER2、CD19、CD20、CD22、κ链或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体α2、IL-11受体Rα、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、LewisY、G250/CAIX、HLA-AIMAGEA1、HLA-A2NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎牛AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1、TEM8，及其组合。

37.一种包含一种或多种细胞的组合物，所述细胞：

1)是抗原特异性T细胞，和/或包含CAR的细胞，和/或包含αβT细胞受体的细胞；以及

2)包含嵌合TGFβ受体，所述受体包含TGFβ受体的胞外结构域和非TGFβ受体胞内结构域。

38.如权利要求22-37中任一项所述的组合物，所述细胞对于所述细胞的接受者而言是自体的。

39.如权利要求22-37中任一项所述的组合物，所述细胞对于所述细胞的接受者而言是同种异体的。

40.一种治疗和/或预防个体中癌症的方法，所述方法包括以下步骤：向所述个体递送治疗有效量的权利要求15-29中任一项所述的组合物，所述个体患有癌症，所述癌症具有分泌TGFβ的细胞/或具有产生TGFβ的微环境。

41.如权利要求40所述的方法，所述癌症是前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、脑癌、结肠癌、食道癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、胆囊癌、甲状腺癌、肛门癌、子宫内膜癌、膀胱癌、脑下垂体癌、白血病、淋巴瘤、胃癌、脾癌、结肠癌、胃癌或骨髓瘤。

42.如权利要求40所述的方法，所述细胞经静脉内、腹膜内、瘤内、鞘内和/或直肠递送。

43.如权利要求40所述的方法，所述细胞暴露于TGFβ保护或增强所述细胞的抗肿瘤活性。

44.如权利要求40所述的方法，其中，所述个体接受另一种癌症治疗。

45.如权利要求44所述的方法，所述癌症治疗是手术、化疗、免疫治疗、激素疗法、放疗、或其组合。

46.如权利要求40-44中任一项所述的方法，所述细胞对于所述个体而言是同种异体或自体的。

47.如权利要求40-44中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述个体或另一个体获得外周血单核细胞(PBMC)的步骤。

48.如权利要求47所述的方法，所述方法包括以下步骤：从所述PBMC获得免疫细胞并修饰所述免疫细胞以包含含有嵌合TGFβ受体编码序列的多核苷酸，所述受体包含TGFβ受体的胞外结构域和非TGFβ受体胞内结构域。

49.如权利要求48所述的方法，所述免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。

50.如权利要求40所述的方法，其中，超过一次地向所述个体提供所述组合物。

51.如权利要求50所述的方法，当所述组合物的提供超过一次且所述细胞包含特异性针对特定肿瘤抗原的CAR时，一次或多次后续递送的所述细胞包含特异性针对不同肿瘤抗原的CAR。

52.一种将T细胞抑制性细胞因子信号转化为T细胞刺激信号的方法，所述方法包括以下步骤：将抑制性细胞因子暴露于T细胞上的受体，所述受体具有胞外结构域和不与所述胞外结构域天然连接的胞内结构域，所述胞外结构域能够结合抑制性细胞因子且所述胞内结构域向所述T细胞提供刺激信号，所述胞外结构域和所述胞内结构域配对为同源二聚体。

53.如权利要求52所述的方法，所述细胞因子是TGFβ或VEGF。

54.一种将T细胞抑制性细胞因子信号转化为T细胞刺激信号的方法，所述方法包括以下步骤：将抑制性细胞因子暴露于T细胞上的受体，所述受体具有胞外结构域和不与所述胞外结构域天然连接的胞内结构域，所述胞外结构域能够结合抑制性细胞因子且所述胞内结构域向所述T细胞提供刺激信号，所述抑制性细胞因子不是IL4、不是IL7也不是这两者。

55.如权利要求54所述的方法，所述细胞因子是TGFβ。

56.如权利要求54所述的方法，所述细胞因子是VEGF且所述胞外结构域来自VEGF受体。

57.如权利要求56所述的方法，所述胞内结构域选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、CD28、4-1BB、OX40，及其组合。

58.一种试剂盒，其包含权利要求1-16中任一项所述的多核苷酸、权利要求17所述的多肽、权利要求18-39中任一项所述的组合物，或其组合。