CN110709424B - 细胞免疫治疗的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了治疗表现出表达Wilms肿瘤蛋白1(WT1)的细胞的受试者的方法。典型地，所述方法将抗WT1抗原结合单元或嵌合抗原受体免疫应答细胞用于有需要的受试者以施行对肿瘤细胞的杀伤。

Description

细胞免疫治疗的组合物和方法
交叉引用
本申请要求于2017年5月31日提交的国际PCT申请第PCT/CN2017/086606号的权益，该申请通过引用而并入本文。
背景技术
癌症在全球范围内对社会产生重大影响。在2016年，仅在美国，估计将诊断出1,685,210例新癌症病例，并将有595,690人死于该疾病。根据the Journal of OncologyPractice(Erikson 2007)，到2020年，将有1820万美国人(约19人中有1人)是癌症患者或癌症幸存者，而2005年为1170万(26人中有1人)。癌症在全球范围内对社会产生重大影响。在2016年，仅在美国，估计将诊断出1,685,210例新癌症病例，并将有595,690人死于该疾病。根据the Journal of Oncology Practice(Erikson 2007)，到2020年，将有1820万美国人(约19人中有1人)是癌症患者或癌症幸存者，而2005年为1170万(26人中有1人)。
嵌合抗原受体(CAR)是抗原的重组受体，其在单个分子中，重定向T细胞和其他免疫细胞的特异性和功能。它们在癌症免疫治疗中的应用可以绕开主动免疫的障碍，快速产生靶向肿瘤的T细胞。一旦在细胞中表达，CAR修饰的细胞可以在受试者中发挥立即和长期的作用。
嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法，其编辑癌症患者的T细胞以识别他们的肿瘤，已显示对治疗血癌有效。在最近的临床试验中，CAR T细胞疗法已大大改善了(除了不可治疗形式的白血病和淋巴瘤)晚期血癌症患者的预后。相反，CAR T细胞在实体瘤的背景下面临着一系列独特的挑战。这些挑战包括鉴别出下述抗原，该抗原的表达清楚地在肿瘤和正常组织上有区分，并建立对肿瘤内肿瘤细胞的有效杀伤，从而减小肿瘤的大小。
发明概述
迫切需要针对多种实体瘤的替代和有效治疗。本发明满足了这种需求并且还提供了相关的优点。
因此，本发明公开了一种抗原结合单元，其包含轻链CDR和重链CDR，其中所述抗原结合单元特异地结合与HLA复合的WT1肽，其中所述WT1肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，而且其中所述抗原结合单元没有表现出和与HLA复合的参比肽的显著结合，其中所述参比肽具有SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。本文还公开了一种抗原结合单元，其包含轻链CDR和重链CDR，其中所述抗原结合单元特异地结合与HLA复合的WT1肽，其中所述WT1肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，而且其中与具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的参比抗原结合单元相比，所述抗原结合单元表现出更少的和与HLA复合的参比肽的非特异性结合，其中所述参比肽具有SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。在一些情况下，其中所述HLA包含HLA-A2。在一些情况下，与HLA复合的参比肽的结合水平可以为：不超过与HLA复合的WT1肽的结合水平的10％。在一些情况下，结合特异性可以通过FACS确定。在一些情况下，所述结合特异性可以通过ELISA确定。在一些情况下，所述抗原结合单元可表现出小于1.5nM的KD。在一些情况下，所述抗原结合单元可表现出小于50pM的KD。在一些情况下，所述轻链CDR可包含LCDR1,LCDR2和LCDR3；而所述重链CDR可包含HCDR1,HCDR2和HCDR3；其中所述LCDR1,LCDR2和LCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列：SEQ ID NO:5-7和11-15；而且其中所述HCDR1,HCDR2,HCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列：SEQ ID NO:2-4,8-10和16-17的序列。在一些情况下，所述轻链CDR可包含选自以下LCDR序列组合的氨基酸序列：SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:13；以及SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:13。在一些情况下，所述重链CDR可包含选自以下HCDR序列组合的氨基酸序列：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SEQID NO:8,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:10；以及SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:10。在一些情况下，所述抗原结合单元可以是单克隆抗体，人源化抗体，嵌合抗体或嵌合抗原受体。在一些情况下，所述抗原结合单元可以是sFc,Fv,Fab或(Fab)2。
本文公开了一种抗原结合单元，其包含轻链CDR和重链CDR，其中所述轻链CDR包含LCDR1,LCDR2和LCDR3；而所述重链CDR包含HCDR1,HCDR2和HCDR3，其中所述LCDR1,LCDR2和LCDR3各自包含与选自由下述构成的组的序列共享至少80％序列同源性的序列：SEQ IDNO:5-7和11-15，而其中所述HCDR1,HCDR2和HCDR3各自包含与选自由下述构成的组的序列共享至少80％序列同源性的序列：SEQ ID NO:2-4,8-10和16-17。在一些情况下，所述轻链CDR可包含LCDR1,LCDR2和LCDR3；而所述重链CDR包含HCDR1,HCDR2和HCDR3；其中所述LCDR1,LCDR2和LCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列：SEQ ID NO:5-7和11-15；而其中所述HCDR1,HCDR2，HCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列：SEQ ID NO:2-4,8-10和16-17。在一些情况下，所述轻链CDR可包含选自以下LCDR序列组合的氨基酸序列：SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；以及SEQID NO:14,SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:13。在一些情况下，所述重链CDR可包含选自以下HCDR序列组合的氨基酸序列：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:8,SEQID NO:9和SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:10；和SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:10。在一些情况下，所述抗原结合单元可以是单克隆抗体，人源化抗体，嵌合抗体或嵌合抗原受体。在一些情况下，所述抗原结合单元可以是scFv,Fv,Fab或(Fab)2。
本文公开了一种嵌合抗原受体，其包含胞外抗原结合单元，跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外抗原结合单元特异地结合与HLA复合的WT1肽，其中所述WT1肽具有SEQID NO:1的氨基酸序列，而其中所述胞外抗原结合单元没有表现出和与HLA复合的参比肽显著结合，其中所述参比肽具有SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。并且本文公开了一种嵌合抗原受体，其包含胞外抗原结合单元，跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外抗原结合单元特异地结合与HLA复合的WT1肽，其中所述WT1肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，而且其中与具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的参比抗原结合单元相比，所述胞外抗原结合单元表现出更少的和与HLA复合的参比肽的非特异性结合，其中所述参比肽具有SEQID NO:58或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。在一些情况下，所述胞外抗原结合单元可包含轻链CDR和重链CDR，而且其中所述轻链CDR包含LCDR1,LCDR2和LCDR3；而所述重链CDR包含HCDR1,HCDR2和HCDR3；其中所述LCDR1,LCDR2和LCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列SEQ ID NO:5-7和11-15；而其中所述HCDR1,HCDR2,HCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列：SEQ ID NO:2-4,8-10和16-17。在一些情况下，所述轻链CDR可包含选自以下LCDR序列组合的氨基酸序列：SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；以及SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:13。在一些情况下，其中所述重链CDR可包含选自以下HCDR序列组合的氨基酸序列：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:10；和SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:10。在一些情况下，所述胞内结构域可包含SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些情况下，所述嵌合抗原受体可以诱导对包含WT1或与HLA复合的WT1肽的细胞的细胞毒性。在一些情况下，当嵌合抗原受体与靶细胞的比例为20:1,10:1,5:1,3:1,2.5:1,1:1或1:3时，细胞毒性的水平为至少5％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％或45％。
本文公开了一种药物组合物，其包含本文公开的抗原结合单元或本文公开的嵌合抗原受体，以及药学上可接受的赋形剂。本文公开了一种经分离的核酸，其编码本文公开的抗原结合单元或本文公开的嵌合抗原受体。本文公开了一种载体，其包含编码本文公开的抗原结合单元或本文公开的嵌合抗原受体的核酸序列。本文公开了一种宿主细胞，其表达本文公开的抗原结合单元或本文公开的嵌合抗原受体。本文公开了一种宿主细胞，其包含编码本文公开的抗原结合单元或本文公开的嵌合抗原受体的核酸。本文公开了一种生产本文公开的抗原结合单元的方法，其包含：在适于表达所述抗原结合单元的条件下培养本文公开的宿主细胞；以及分离由所述宿主细胞表达的所述抗原结合单元。本文公开了一种生产本文公开的嵌合抗原受体的方法，其包含：在适于表达所述嵌合抗原受体的条件下培养本文公开的宿主细胞；以及分离由所述宿主细胞表达的所述嵌合抗原受体。
本文公开了一种诱导包含与HLA复合的WT1肽的细胞死亡的方法，所述方法包含使所述细胞与本文公开的嵌合抗原受体接触。在一些情况下，所述细胞可以在体内与所述嵌合抗原受体接触。在一些情况下，所述细胞可以在体外与所述嵌合抗原受体接触。在一些情况下，所述细胞可以是癌细胞。在一些情况下，所述细胞可以是血液癌细胞或实体瘤细胞。在一些情况下，所述细胞可以是肾母细胞瘤细胞，结肠癌细胞，直肠癌细胞，卵巢癌细胞，慢性髓样白血病细胞或肠癌细胞。在一些情况下，所述细胞可以是间皮瘤癌细胞。
本文公开了一种诱导靶细胞死亡的方法，所述方法包括向所述靶细胞施用多个本文公开的宿主细胞，其中相对于施用类似量的缺少所述抗原结合单元、嵌合抗原受体或编码它们的核酸的宿主细胞，将多个宿主细胞施用于所述靶细胞诱导了更大程度的靶细胞死亡。在一些情况下，可以将所述多个宿主细胞在体内施用于所述靶细胞。在一些情况下，可以将所述多个宿主细胞在体外施用于所述靶细胞。在一些情况下，所述靶细胞可以是癌细胞。在一些情况下，所述癌细胞可以是血液癌细胞或实体瘤细胞。在一些情况下，所述细胞可以是肾母细胞瘤细胞，结肠癌细胞，直肠癌细胞，卵巢癌细胞，慢性髓样白血病细胞或肠癌细胞。在一些情况下，所述细胞可以是间皮瘤癌细胞。
本文公开了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体诱导癌细胞的死亡。本文公开了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的本文公开的抗原结合单元或本文公开的嵌合抗原受体。本文公开了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包含：向所述受试者施用有效量的本文公开的药物组合物。在一些情况下，所述癌症可以是血液癌或实体瘤。在一些情况下，所述癌症可以是间皮瘤。在一些情况下，所述癌症可以是肾母细胞瘤，结肠癌，直肠癌，卵巢癌，慢性髓样白血病或肠癌。
本文公开了一种免疫应答细胞，其包含本文描述的嵌合抗原受体和IL-12。在一些情况下，所述IL-12在所述免疫应答细胞的表面上表达。在其他情况下，所述IL-12在所述免疫应答细胞内表达。在一些实施方案中，所述免疫应答细胞(其包含本文描述的嵌合抗原受体和IL-12)具有至少20％，至少30％，至少40％，至少50％或至少60％的细胞毒性。在一些情况下，所述免疫应答细胞在效应子:靶标(E:T)比例为5:1,10:1,15:1,20:1或者它们的组合时具有至少20％，至少30％，至少40％，至少50％或至少60％的细胞毒性。包含如本文所述的嵌合抗原受体和IL-12的免疫应答细胞可以在靶细胞中诱导死亡。在一些情况下，所述靶细胞包含与HLA复合的WT1肽。并且本文描述了一种在有需要的受试者中诱导包含与HLA复合的WT1肽的细胞死亡的方法，所述方法包含：向所述受试者施用有效量的免疫应答细胞，其包含本文所述的嵌合抗原受体和IL-12。
通过引用并入
本文中的所有出版物，专利和专利申请均通过引用，以每篇出版物、专利和专利申请被具体且单独指出地通过引用并入的程度并入。在本文中的术语与并入的参考文献中的术语发生冲突的情况下，以本文中的术语为准。
附图说明
在所附权利要求中具体阐述了本公开的新颖特征。本公开的特征和优点的更好理解会通过参考以下阐述了示例说明的实施方案(其中可以利用本公开的原理)及其附图的详细描述获得：
图1描绘了融合HLA.A0201-BSP基因的草图。
图2A和图2B分别描绘经分离的多肽的色谱图和琼脂糖凝胶纯化实施例。
图3描绘了来自ELISA测定的实施例数据。
图4描绘了来自结合测定的实施例数据。
图5描绘了来自ELISA测定的实施例数据。
图6描绘了来自选择抗原结合单元的序列比对。
图7描绘了来自KD实验的实施例数据。
图8描绘了来自结合测定的实施例数据。
图9描绘了多肽纯化结果的实施例。
图10A和图10B描绘了来自细胞毒性实验的实施例数据。
图11描绘了表达IL-12的CAR-T细胞基因构建体实施例。
图12A、图12B和图12C描绘了来自使用表达IL-12的CAR T细胞的细胞毒性实验的实施例数据。
具体实施方式
以下描述和实例详细示出了本公开的实施方案。应该理解的是，本公开不限于本文描述的特定实施方案，并且因此可以变化。本领域技术人员会认识到，本公开有许多变化和修改，它们被涵盖在其范围内。除非另有说明，否则任何实施方案可以与任何其他实施方案组合。
如本文所使用的，除非另有说明，否则本文的一些发明实施方案考虑数值范围。本发明的多个方面可以以范围格式呈现。应当理解的是，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，应该将范围的描述视为已具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值，就好像已明确写出一样。例如，范围诸如从1至6的描述应视为已具体地公开了子范围，诸如从1至3，从1至4，从1至5，从2至4，从2至6，从3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1,2,3,4,5和6。无论范围的广度如何，这都适用。当存在范围时，则范围包括范围端点。
定义
如本文所使用的，除非另有说明，否则冠词“a”意指一个或多个，除非另有明确规定。
如本文所使用的，除非另有说明，否则术语诸如“含有(contain)”，“含有(containing)”，“包括(include)”，“包括(including)”等意指“包含(comprising)”。
如本文所使用的，术语“活化”及其语法同义语可意指细胞从静止状态转变为活动状态的过程。该过程可以包含对抗原的反应，迁移和/或表型或遗传改变为功能上的活动状态。例如，术语“活化”可意指T细胞活化的逐步过程。例如，T细胞可能需要至少两个信号以变成完全活化。第一信号可以在TCR与抗原-MHC复合物的接合后发生，而第二信号可以通过共刺激分子的接合而发生(表4)。在体外，抗CD3可以模拟第一信号，而抗CD28可以模拟第二信号。例如，工程化改造的T细胞可以通过表达的CAR来活化。如本文所使用的，“T细胞活化”或“T细胞触发”可意指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖，细胞因子生产和/或可检测的效应子功能的T细胞状态。
如本文所使用的，术语“抗原结合单元”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即，含有与抗原特异地结合(“与抗原有免疫反应”)的抗原结合位点的分子。也涵盖在术语“抗原结合单元”中的是多种物种来源的免疫球蛋白分子，这些物种包括无脊椎动物和脊椎动物。在结构上，最简单的自然发生的抗体(例如，IgG)包含通过二硫键相互连接的四个多肽链，两个重(H)链和两个轻(L)链。免疫球蛋白代表一大类分子，包括几种类型的分子，诸如IgD,IgG,IgA,IgM和IgE。术语“免疫球蛋白分子”包括例如杂交的抗体或经改造的抗体及其片段。已经显示，可以通过自然发生的抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。这些片段统称为“抗原结合单元”。也涵盖在术语“抗原结合单元”中的是具有特定形状的任何含有多肽链的分子结构，该形状适合并识别表位，在此一种或多种非共价结合相互作用稳定化了分子结构和该表位之间的复合物。
如果抗原结合单元以比其结合包括多肽或其他物质的其他参比抗原更大的亲和力(affinity)或亲合力(avidity)结合，则抗原结合单元“特异地结合”抗原或“与抗原有免疫反应”。
如本文所使用的“抗原”意指通过抗原结合单元得到特异地识别以及结合的物质。抗原可以包括肽，蛋白质，糖蛋白，多糖和脂质；它们的部分以及它们的组合。非限制性的、示例性的抗原包括来自人、鼠以及其他的它们的同源物的Wilms肿瘤蛋白1(WT1)。“抗原”也可意指引起免疫应答的分子。此免疫反应可涉及抗体生产，或特定免疫感受态细胞的活化，或两者兼有。本领域技术人员理解任何的大分子，其包括几乎所有蛋白质或肽，都可以充当抗原。
如本文所使用的，术语“免疫球蛋白”或“Ig”可意指一类蛋白质，其起抗体的作用。B细胞表达的抗体有时称为嵌合抗原受体或抗原受体。此类蛋白质中包括的五个成员是IgA，IgG，IgM，IgD和IgE，其中IgG是最常见的循环抗体。它是凝集，补体固定和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，并且对于防御细菌和病毒很重要。例如，肿瘤细胞抗原可以被CAR识别。
术语“抗WT1抗体”可意指能够以足够的亲和力结合WT1或WT1肽的抗体或抗体结合位点，从而该抗体可用于将WT1或WT1肽与由细胞表达的其他抗原区分开。在一个实施方案中，抗WT1抗体与不相关的非WT1蛋白的结合程度为，小于例如通过放射免疫测定(RIA)所测量的该抗体与WT1或WT1肽的结合程度的约10％。在某些实施方案中，与WT1结合的抗体可具有<1μΜ,<100nM,<10nM,<5nM,<4nM,<3nM,<2nM,<1nM,<0.1nM,<0.01nM或<0.001nM(例如,10-8M或更小,例如10-8M至10-13M,例如,10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗WT1抗体结合在不同物种的WT1中保守的WT1表位。
如本文中所使用的，术语“自体的”及其语法同义语可意指源自相同的存在物。例如，样品(例如，细胞)可以被移出、处理并在迟些时候送回给同一受试者(例如，患者)。自体过程区分于异体过程，在此在异体过程中供体和受体是不同的受试者。
如本文所使用的，“异种移植”及其语法同义语可涵盖涉及将细胞，组织或器官移植，植入或输注到受体中的任何程序，在此受体和供体是不同的物种。本文描述的细胞，器官和/或组织的移植可用于异种移植到人类中。异种移植包括但不限于：血管化的异种移植，部分血管化的异种移植，非血管化的异种移植，异种敷料，异种绷带和异种结构。
如本文所使用的，“同种异体移植(Allotransplantation)”及其语法同义语(例如，同种异体的移植(allogenic transplantation))可涵盖：涉及将细胞、组织或器官移植、植入或输注到受体中的任何程序，其中受体和供体是相同的物种，但是是不同个体。本文所述的细胞、器官和/或组织的移植可用于同种异体移植到人类中。同种异体移植包括但不限于：血管化的同种异体移植，部分血管化的同种异体移植，非血管化的同种异体移植，同种异体敷料，同种异体绷带和同种异体结构。
如本文所使用的，“自体移植(Autotransplantation)”及其语法同义语(例如，自体的移植(autologous transplantation))可涵盖涉及将细胞、组织或器官移植、植入或输注到受体中的任何程序，在此受体和供体是相同的个体。本文所述的细胞，器官和/或组织的移植可用于自体移植到人类中。自体移植包括但不限于：血管化的自体移植，部分血管化的自体移植，非血管化的自体移植，自体敷料，自体绷带和自体结构。
如本文所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指工程化的分子，其可以由免疫细胞所表达，该细胞包括但不限于T细胞。CAR在T细胞中表达时可以重定向T细胞以诱导(以由人工受体指令的特异性)杀伤靶细胞。CAR的细胞外结合结构域可以源自鼠的、人源化的或全人的单克隆抗体。“抗WT1-CAR”是能够结合WT1或WT1肽的CAR。
如本文所使用的，术语“表位”及其语法同义语可意指可以被抗体，B细胞，T细胞或工程化细胞识别的抗原的一部分。例如，表位可以是被TCR识别的癌症表位。抗原内的多个表位也可以被识别。所述表位也可以被突变。
如本文所使用的，术语“工程化的”及其语法同义语可意指核酸(例如生物体的基因组内的核酸)的一处或多处改造。术语“工程化的”可意指基因的改造、添加和/或缺失。工程化细胞也可意指带有经添加、缺失和/或改造的基因的细胞。
如本文所使用的，术语“细胞”或“工程化细胞”及其语法同义语可意指人类或非人动物来源的细胞。工程化细胞也可意指表达CAR的细胞。
如本文所使用的，术语“良好生产规范”(GMP)及其语法同义语可意指根据FDA安全、有效或纯净的产品。GMP有时也可以称为“cGMP”。“c”代表“当前”。产品的制造商可采用最新的技术和系统，以符合GMP产品的规定。与研究环境相反，GMP相容产品通常在临床环境中使用。
“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养物，其可以是或曾经是主题载体的接受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。由于自然、偶然或人为的突变，该后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学上或在总DNA互补体的基因组学上)。宿主细胞包括用本发明的载体在体内转染的细胞。“宿主细胞”可意指原核细胞、真核细胞或作为单细胞实体培养的细胞系，其可以或已经用作重组载体或其他转移多核苷酸的接受体，并且包括已转染的原始细胞的后代。应当理解，由于自然的、偶然的或人为的突变，单个细胞的后代在形态学上或在基因组学上或总DNA互补体上可能不一定与原始亲本完全相同。
“细胞系”或“细胞培养物”指在体外生长或维持的细菌，植物的、昆虫的或更高等的真核细胞。细胞的后代可能与亲代细胞不完全相同(在形态学上、基因型上或表型上)。
如本文所使用的，术语“转染”指将外源核酸引入真核细胞。转染可以通过本领域已知的多种手段来完成，包括磷酸钙-DNA共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，聚凝胺介导的转染，电穿孔法，显微注射法，脂质体融合法，脂质体转染法，原生质体融合法，逆转录病毒感染法和基因枪法。
术语“稳定转染”或“经稳定转染”指将外源核酸、DNA或RNA引入并整合到被转染的细胞的基因组中。术语“稳定转染子”指已将外源DNA稳定整合到基因组DNA中的细胞。
如本文所使用的，术语“核酸分子编码”，“DNA序列编码”和“DNA编码”指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸顺序。因而，核酸序列编码氨基酸序列。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，以指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链、环状或支链的，它可包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经修饰的氨基酸聚合物，例如，经由硫酸化，糖基化，脂质化，乙酰化，磷酸化，碘化，甲基化，氧化，蛋白水解处理，磷酸化，异戊烯化，外消旋化，硒化，转运RNA介导的把氨基酸添加至蛋白质(诸如精氨化，泛素化)或任何其他操作(诸如与标签成分的结合)。如本文所使用的，术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L旋光异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。“源自”指定蛋白质的多肽或氨基酸序列意指多肽的来源。优选地，该多肽具有与该序列或其部分编码的多肽基本上相同的氨基酸序列，其中该部分由至少10-20个氨基酸，或至少20-30个氨基酸，或至少30-50个氨基酸组成，或者用该序列编码的多肽能够在免疫学上鉴别。该术语还包括由指定的核酸序列表达的多肽。
如本文所使用的，术语“受试者”是指任何动物，例如，哺乳动物或有袋类动物。本发明的受试者包括但不限于：人类，非人灵长类动物(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)，小鼠，猪，马，驴，牛，绵羊，大鼠和任何种类的禽类。
如本文所使用的，术语“接受体”及其语法同义语可意指接受疗法或治疗的人类或非人动物。
本文使用的术语“治疗(treatment)”，“治疗(treating)”，“治疗(treat)”等通常指获得所希望的药理和/或生理作用。就完全或部分防止疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全稳定化或治愈该疾病和/或可归因于该疾病的不良反应而言，该效果可以是治疗性的。如本文所使用的，“治疗”涵盖对哺乳动物，例如小鼠，大鼠，兔，猪，灵长类动物(包括人类和其他猿类，尤其是人)的疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病或症状在可能易患该疾病或症状但尚未被诊断为患有该疾病或症状的受试者中发生；(b)抑制疾病症状；(c)阻止疾病发展；(d)减轻疾病症状；(e)导致疾病或症状消退；或它们的任何组合。
术语“癌症”，“赘生物”，“肿瘤”和“癌”在本文中可互换使用，意指表现出相对自发生长的细胞，从而它们表现出异常的生长表型，其特征在于显著丧失对细胞增殖的控制。一般而言，本申请中用于检测或治疗的目的细胞包括癌症前期的(例如良性的)，恶性的，转移前的，转移性和非转移性的细胞。在“正常细胞”的上下文中使用的术语“正常”意指未经转化的表型的细胞或表现出所检查的组织类型的未经转化的细胞形态的细胞。“癌性表型”通常意指具有癌性细胞特征的多种生物学现象中的任何一种，这些现象可以随癌症的类型而变化。通常通过例如细胞生长或增殖(例如，不受控制的生长或增殖)，细胞周期的调节，细胞迁移，细胞-细胞间相互作用或转移等的异常来鉴别出癌性表型。
如本文所使用的，术语“外周血淋巴细胞”(PBL)及其语法同义语可意指在血(例如，外周血)中循环的淋巴细胞。外周血淋巴细胞可意指不定位于器官的淋巴细胞。外周血淋巴细胞可包含T细胞，NK细胞，B细胞或它们的任何组合。
术语“免疫应答细胞”可意指可引发免疫应答的细胞，包括但不限于T细胞，B细胞和NKT细胞，它们各自的前体细胞及其后代。免疫应答细胞也可意指淋巴或骨髓谱系的细胞。
如本文所使用的，术语“T细胞”及其语法同义语可意指任何来源的T细胞。例如，T细胞可以是原代T细胞，例如，自体T细胞，细胞系等。T细胞也可以是人类的或者非人的。
如本文所使用的，术语“T细胞活化”或“T细胞触发”及其语法同义语可意指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖，细胞因子生产和/或可检测的效应子功能的T细胞的状态。在一些情况下，“完全T细胞活化”可类似于触发T细胞细胞毒性。可以使用本领域已知的多种测定来测量T细胞活化。所述测定可以是用于测量细胞因子分泌的ELISA，ELISPOT，用于测量细胞内细胞因子表达的流式细胞测定法(CD107)，用于测量增殖的流式细胞测定法，以及用于确定靶细胞消除的细胞毒性测定法(51Cr释放测定法)。所述测定通常使用对照(非工程化细胞)与工程化细胞(CAR T)进行比较，以确定与对照相比工程化细胞的相对活化。另外，所述测定可以比较经温育的或与不表达靶抗原的靶细胞接触的工程化细胞。例如，所述比较物可以是与不表达CD19的靶细胞温育的CD19-CAR T细胞。
当用于指核苷酸序列时，术语“序列”及其语法同义语可以涵盖DNA或RNA；可以是单链或双链。核酸序列可以被突变。核酸序列可以具有任何长度，例如，长度为2至1,000,000个或更多个核苷酸(或在其之间或之上的任何整数值)，例如约100至约10,000个核苷酸，或约200至约500个核苷酸。
如本文所使用的，术语“分离的”意指与组分、细胞或其他物分离，其中多核苷酸，肽，多肽，蛋白质，抗体，或它们的片段在自然中通常是合在一起的。对本领域技术人员显而易见的是，非自然发生的多核苷酸，肽，多肽，蛋白质，抗体，或它们的片段不需要“分离”即可将其与其自然发生的对应物区分开。此外，“浓缩的”，“分离的”或“稀释的”多核苷酸，肽，多肽，蛋白质，抗体，或它们的片段与它们自然发生的对应物的区别在于，以每体积的分子浓度或数量计，“浓缩的”大于它们自然发生的对应物或“分离的”小于它们自然发生的对应物。可以基于绝对值测量富集，诸如每体积溶液中的重量，或者，可以相对于源头混合物中存在的第二种、可能有干扰的物质来测量它。根据本发明的实施方案来增加富集是越来越优选的。因此，例如，优选2倍富集，更优选10倍富集，更优选100倍富集，甚至更优选1000倍富集。物质也可以通过人工组装过程(诸如通过化学合成或重组表达)以分离状态提供。
“连接的”和“融合的”或“融合”在本文中可互换使用。这些术语意指通过包括化学结合或重组手段在内的任何手段将两个以上化学元素或成分联接在一起。“框内融合”意指以维持对原始ORF框正确阅读的方式将两个或更多个开放阅读框(ORF)联接起来以形成连续的更长ORF。因而，所得重组融合蛋白是含有两个或更多个区段的单个蛋白质，所述区段对应于由原始ORF编码的多肽(这些区段在自然界中通常不是这样联接)。尽管因而使阅读框经整个融合区段连续，但是可以通过例如框内接头序列(例如“flexon”)在物理上或空间上将这些区段分开。
应用于多核苷酸的“重组的”意指该多核苷酸是下述的不同组合的产物：克隆、限制和/或连结步骤以及产生不同于自然界中发现的多核苷酸的构建体的其他程序。
术语“基因”或“基因片段”在本文可互换使用。它们意指含有至少一个开放阅读框的多核苷酸，该阅读框能够在被转录和翻译后编码特定的蛋白质。基因或基因片段可以是基因组的，cDNA的或合成的，只要该多核苷酸含有至少一个下述开放阅读框，其可以覆盖整个编码区或其区段。
“可操作地(Operably)连接”或“可操作地(operatively)连接”意指并置，其中所描述的成分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。例如，如果启动子序列促进编码序列的转录，则说启动子序列可操作地连接至编码序列。
如本文所使用的，“表达”意指将多核苷酸转录成mRNA的过程和/或随后将被转录的mRNA(也称为“转录物”)翻译成肽，多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽统称为基因产物。在真核细胞中，如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可包括剪接mRNA。
组合物–抗原结合单元
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗原结合单元，其包含轻链CDR和重链CDR，其中所述抗原结合单元特异地结合与HLA复合的WT1肽，其中所述WT1肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，而其中所述抗原结合单元没有表现出和与HLA复合的参比肽的显著结合，其中所述参比肽具有SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种抗原结合单元，其包含轻链CDR和重链CDR，其中所述抗原结合单元特异地结合与HLA复合的WT1肽，其中所述WT1肽具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列，而其中与具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的参比抗原结合单元相比，所述抗原结合单元表现出更少的和与HLA复合的参比肽的非特异性结合，其中所述参比肽具有SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，本公开提供了一种抗原结合单元，其包含轻链CDR和重链CDR，其中所述轻链CDR包含LCDR1,LCDR2和LCDR3；而所述重链CDR包含HCDR1,HCDR2和HCDR3；其中所述LCDR1,LCDR2和LCDR3各自包含与选自由下述构成的组的序列共享至少80％序列同源性的序列：SEQ ID NO:5-7和11-15，而其中所述HCDR1,HCDR2和HCDR3各自包含与选自由下述构成的组的序列共享至少80％序列同源性的序列：SEQ ID NO:2-4,8-10和16-17。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元包含轻链CDR。轻链CDR可以是抗原结合单元的轻链的互补决定区。轻链CDR可包含氨基酸残基的一个连续序列或氨基酸残基的两个或更多个连续序列，所述序列被非互补决定区诸如框架区分开并且可选被侧卫。在一些实例中，轻链CDR包含两个或更多个轻链CDR，其可以被称为轻链CDR-1，CDR-2等。在有利的实例中，轻链CDR包含三个轻链CDR，其可以分别称为轻链CDR-1，轻链CDR-2和轻链CDR-3。在一些实例中，存在于共同轻链上的一组CDR可统称为轻链CDR。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元包含重链CDR。重链CDR可以是抗原结合单元的重链的互补决定区。重链CDR可包含氨基酸残基的一个连续序列或氨基酸残基的两个或更多个连续序列，所述序列被非互补决定区诸如框架区分开并可选地被侧卫。在一些实例中，重链CDR包含两个或更多个重链CDR，其可以被称为重链CDR-1，CDR-2等。在有利的实例中，重链CDR包含三个重链CDR，其可以分别称为重链CDR-1，重链CDR-2和重链CDR-3。在一些实例中，存在于共同重链上的一组CDR可统称为重链CDR。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，主题抗原结合单元特异地结合WT1或WT1肽。在一些实例中，主题抗原结合单元特异地结合与HLA复合的WT1肽。如本文所使用的，WT1还可意指已知WT1序列的直系同源物，同型物，密码子优化形式，截短形式，片段形式，突变形式或任何其他已知衍生物形式。例如，WT1可以是人WT1，其用GenBank登录号[P19544]代表，并包含SEQ ID NO:1的序列。另外，WT1可包含与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:58和SEQ IDNO:59中的任何一个共享至少50％同一性的序列。WT1可包含与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59中的任何一个共享至少50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,99％或大于99％同一性的序列。
结合特异性可以通过互补决定区或CDR，诸如轻链CDR或重链CDR来确定。在许多情况下，结合特异性由轻链CDR和重链CDR确定。重链CDR和轻链CDR的给定组合提供了给定的结合口袋，该结合口袋赋予对WT1或与HLA复合的WT1肽(与其他参比抗原或参比肽相比)更大的亲和力和/或特异性。
抗原结合单元和与HLA复合的WT1肽的结合可以通过本领域已知的任何方法表征或表达。例如，结合可以通过结合亲和力来表征，该结合亲和力可以是抗原结合单元与抗原之间相互作用的强度。结合亲和力可以通过本领域已知的任何方法来确定，诸如体外结合测定。例如，当在体外结合测定中利用表达WT1和HLA的细胞进行测定时，可以确定本文公开的抗原结合单元的结合亲和力。主题抗原结合单元的结合亲和力可以用Kd表示，Kd是抗体与它的相应抗原之间的平衡解离常数。在一些情况下，本文公开的抗原结合单元特异地结合与HLA复合的WT1肽，Kd值在约10μM至约1fM的范围。例如，抗原结合单元可以以小于约10μM,1μM,0.1μM,10nM,1nM,0.1nM,10pM,1pM,0.1pM,10fM,1fM,0.1fM或小于0.1fM的Kd特异地结合CD47。在一些实例中，Kd小于1.5nM。在一些示例中，Kd小于50pM。
在一些方面，主题抗原结合单元没有表现出和与HLA复合的参比肽的显著结合。在一些实例中，主题抗原结合单元和与HLA复合的参比肽的结合水平为，不超过所述抗原结合单元和与HLA复合的WT1肽的结合水平的10％。例如，该结合水平可以是所述抗原结合单元和与HLA复合的WT1肽的结合水平的10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％或小于1％。在一些实例中，该参比肽具有SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在一些方面，与参比抗原结合单元相比，主题抗原结合单元表现出与HLA复合的参比肽更少的非特异性结合。在一些实例中，与参比抗原结合单元相比，主题抗原结合单元表现出与HLA复合的参比肽5％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或100％更少的非特异性结合。在一些实例中，与参比抗原结合单元相比，主题抗原结合单元表现出与HLA复合的参比肽1倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍或大于10倍更少的非特异性结合。在一些实例中，参比抗原结合单元具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在一些实例中，参比肽具有SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，主题抗原结合单元包含轻链CDR和重链CDR。主题抗原结合单元可以包含表1中列出的任何LCDR或HCDR。额外地或者替选地，主题抗原结合单元可包含与表1中列出的与任何LCDR或HCDR具有至少60％同一性的LCDR或HCDR。在一些方面，主题LCDR或HCDR可表现出与表1中所列的任何序列ID号(SEQ ID NO)至少65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,99％或更高的序列同一性。
表1
抗原结合单元 VL VH
ABU1 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:18
ABU2 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:20
ABU3 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:20
ABU4 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:22
ABU5 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:24
在一些情况下，轻链(LC)CDR包含轻LCDR1,LCDR2和LCDR3；而重链(HC)CDR包含HCDR1,HCDR2和HCDR3。在一些实例中，所述LCDR1,LCDR2和LCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列：SEQ ID NO:5-7和11-15。在一些实例中，所述HCDR1,HCDR2，HCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列：SEQ ID NO:2-4,8-10和16-17。在一些实例中，所述LCDR1,LCDR2和LCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列：SEQ ID NO:5-7和11-15，而所述HCDR1,HCDR2，HCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列：SEQ ID NO:2-4,8-10和16-17。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元包含轻链CDR，其中所述轻链(LC)CDR包含三个LCDR(即LCDR1,LCDR2和LCDR3)的组合。三个LCDR的组合可包含表2中列出的任何组合。
表2
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元包含重链CDR，其中所述重链(HC)CDR包含三个HCDR(即HCDR1,HCDR2和HCDR3)的组合。三个HCDR的组合可以包含表3中列出的任何组合。
表3
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元包含轻链CDR和重链CDR，其中所述轻链CDR和所述重链CDR分别包含选自由下述构成的组的LCDR和HCDR：表2中列出的LCDR的任何组合和表3中列出的HCDR的任何组合。
在一些方面，主题抗原结合单元是单克隆抗原结合单元，多克隆抗原结合单元，人源化抗原结合单元，嵌合抗原结合单元，单价抗原结合单元，多价抗原结合单元，双特异抗原结合单元，或它们的任何组合。抗原结合单元可采用多种形式，包括但不限于：sFC，Fv，ccFv，Fab'，F(ab')2和Fd。这样的抗体结合单元可以通过蓖麻毒蛋白，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶或其他蛋白酶切割作用由完整的免疫球蛋白产生。主题抗原结合单元也可以包含在嵌合抗原受体(CAR)内。在这样的实例中，该抗原结合单元通常是胞外抗原结合单元。
另外，可以利用重组免疫球蛋白技术设计抗原结合单元。例如，可通过经由肽接头将可变轻链区连接至可变重链区来生产出本发明的“Fv”免疫球蛋白。例如，肽接头可以是聚甘氨酸或不形成α螺旋或β折叠基序的另一序列。还可以制成下述Fv，其包含在VH和VL区之间的稳定化二硫键，如美国专利第6,147,203号所述，其全部内容通过引用并入本文。这些抗原结合单元中的任何一个均可用于本发明。在一些方面，抗原结合单元可以是具有两个轻链与两个重链配对的完整免疫球蛋白。
抗原结合单元可以是包含轻链多肽和重链多肽的异多聚体。抗原结合单元的实例包括但不限于：(i)由美国专利第6,833,441号(其全部内容并入本文)公开的、由异二聚序列稳定化的ccFv片段；(ii)包含至少一个如本文所述的ccFv片段的任何其他单价和多价分子；(iii)由VL，VH，CL和CH1结构域组成的Fab片段；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(vi)F(ab')2片段，即包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；和(vii)双体抗体。
多克隆抗体可以通过向生产动物注射抗原组合物的标准方案来产生。参见，例如，Harlow和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。当利用整个蛋白质或蛋白质的较大部分时，可以通过用该蛋白质和合适的佐剂(例如弗氏剂，弗氏完全剂，水包油乳液等)免疫生产用动物来生成抗体。当利用较小的肽时，有利的是将肽与较大的分子结合以制成免疫刺激性结合物。可商购用于此用途的常用结合蛋白包括：牛血清白蛋白(BSA)和匙孔血蓝蛋白(KLH)。为了生成针对特定表位的抗体，可以利用源自全序列的肽。替选地，为了产生针对蛋白质靶标的相对短的肽部分的抗体，如果多肽与载体蛋白(诸如卵清蛋白，BSA或KLH)联接，则可以引发优异的免疫应答。
多克隆或单克隆抗原结合单元或抗体可以由已经过基因改造来生产人免疫球蛋白的动物生产。可以通过下述来生产转基因动物：首先生产出不生产自然的动物抗体的“敲除”动物，然后用人类抗体基因座(例如，通过使用人类人工染色体)稳定转化该动物。在这样的情况下，则改动物仅制造人类抗体。在美国专利第6,162,963号和第6,150,584号(通过整体引用将其并入本文)中描述了产生这样的动物并从中衍生出抗体的技术。这样的抗体可以称为异生人类抗体。
替选地，可以从含有人类可变区的噬菌体文库来生产抗原结合单元。参见美国专利第6,174,708号(通过整体引用将其并入本文)。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元是由杂交瘤生产的。例如，本文公开的抗原结合单元可以由选自由下述构成的组的杂交瘤来生产：表达表1所列的抗原结合单元之一的杂交瘤。
对于单克隆抗原结合单元或单克隆抗体，杂交瘤可通过分离出受刺激的免疫细胞(诸如来自被接种动物的脾脏的那些)形成。然后可以将这些细胞(诸如骨髓瘤细胞或经转化细胞)与永生化细胞融合，它们能够在细胞培养物中无限复制，由此生产出永生的、分泌免疫球蛋白的细胞系。所利用的永生细胞系被选出(是否缺乏对利用某些营养物所必需的酶)。许多这样的细胞系(诸如骨髓瘤)是本领域技术人员已知的，并且包括例如：胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)。这些缺陷允许了：根据融合细胞在例如次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶核苷培养基(HAT)上生长的能力选择出融合细胞。
另外，可以通过基因工程来生产主题抗原结合单元。下述可用于本发明：当施用于人类时产生较少免疫应答的、人源化的、嵌合的或异生人类抗原结合单元。
本文公开的抗原结合单元可具有降低的在人类中诱导出不希望的免疫应答(例如过敏性休克)的倾向，并且还可表现出降低的引发免疫应答的倾向，这将防止抗体治疗剂或显象剂的重复给药(例如，人抗鼠抗体“HAMA”应答)。这样的抗原结合单元包括但不限于人源化的、嵌合的或异生人类抗原结合单元。
通过采用基因工程，可以多种方式修饰抗原结合单元。在一些情况下，抗原结合单元可以被突变，从而可以选择抗原结合单元以对其靶标具有更高的亲和力(例如，与HLA复合的WT1肽)。在某些情况下，抗原结合单元对其靶标的亲和力可以针对该可以在正常组织上低水平表达的靶标进行优化。可以进行此优化以最小化潜在的毒性。在其他情况下，对膜结合形式的靶标具有更高亲和力的抗原结合单元的克隆可优于其可溶形式的对应物。可以进行此修饰，这是因为一些靶标也可以以不同水平的可溶形式被检测到，并且对它们的靶向可能导致非预期的毒性。
在一些情况下主题抗原结合单元可以是鼠的、人源化的或全人的。抗原结合单元可以是约1％至约100％人类的。在一些情况下，抗原结合单元可以是约10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或高达约100％人类的。
嵌合抗原结合单元或嵌合抗体可以例如通过重组手段，通过组合获自鼠(或其他动物来源的)杂交瘤克隆的鼠可变轻链和重链区(VK和VH)来制成，从而产生主要具有人类结构域的抗体，其具有人类恒定的轻链和重链区域。此类嵌合抗体的生产是本领域公知的，并且可以通过标准手段来实现(如在例如在美国专利第5,624,659号(通过整体引用将其并入本文)中所描述)。
应用于非人类(例如，啮齿类动物或灵长类动物)抗体的术语“人源化”是杂合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。对于绝大部分，人源化抗体是人类免疫球蛋白(接受体抗体)，其中该接受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或灵长类动物)的CDR的残基替代，具有所希望特异性，亲和力和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含在接受体抗体或转入的CDR或框架序列中均未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善和优化抗体性能，并将它的在引入人体时的免疫原性降至最低。在一些实例中，人源化抗体会包含至少一个并且通常是两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，而全部或基本上全部的FR区是人类免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白的恒定区。
人源化抗体可以工程化为：含有人样免疫球蛋白结构域，并且仅掺入动物源性抗体的互补决定区。这可以通过下述来完成：仔细检查单克隆抗原结合单元或单克隆抗体的可变区的高变环的序列，并使它们适合于人类抗原结合单元或人类抗体链的结构。参见例如：美国专利第6,187,287号(通过整体引用将其并入本文)。
用于使非人抗体人源化的方法是本领域中公知的。“人源化”抗体是这样的抗体，其中至少部分序列已从其初始形式被改造成使其更像人类免疫球蛋白。在一些版本中，重(H)链和轻(L)链恒定(C)区被人序列替代。这可以是包含可变(V)区和异源免疫球蛋白C区的融合多肽。在一些版本中，互补决定区(CDR)包含非人抗体序列，而V框架区也已被转变为人序列。参见例如EP0329400。在一些版本中，通过设计人和鼠V区的共有序列，并在共有序列之间不同的CDR之外转变残基，将V区人源化。
原则上，来自人源化抗体的框架序列可以用作CDR移植的模板；然而，已经证明直接替代CDR进入这样的框架可导致与抗原的结合亲和力的显著损失。Glaser等(1992)J.Immunol.149:2606；Tempest等(1992)Biotechnology9:266；和Shalaby等(1992)J.Exp.Med.17:217。人源抗体(HuAb)与原始鼠抗体(muAb)同源性越高，人源框架会向鼠源CDR中引入可降低亲和力的畸变的可能性就越小。基于针对抗体序列数据库的序列同源性搜索，HuAb IC4提供了与muM4TS.22良好的框架同源性，尽管其他高度同源的HuAb也适用(尤其是来自人I亚组的κ链或来自人III亚组的H链)。Kabat等(1987)。可以使用不同的计算机程序(诸如ENCAD(Levitt et al.(1983)J.Mol.Biol.168:595))来预测V区的理想序列。因此，本发明涵盖了带有不同可变(V)区的HuAb。确定合适的V区序列并优化这些序列在本领域技术人员的能力范围内。获得带有降低的免疫原性的抗体的方法也在美国专利第5,270,202号和欧洲专利第699,755号中得到描述。
可以使用亲本和人源化序列的三维模型，通过对亲本序列和不同的在概念上人源化产物进行分析的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是本领域技术人员熟悉的。可获得下述计算机程序，其说明并显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些展示的检查允许了：分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即对影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基的分析。以这种方式，可以从共有序列和转入的序列中选择并结合FR残基，从而获得希望的抗体特征(诸如对靶抗原的亲和力的增加)。
用于使主题抗原结合单元进行人源化的过程如下所示。基于用于移植的人类抗体种系的同源性、典型结构和物理特性，选择最适合的种系受体重链和轻链可变区。进行了mVH/VL与移植的hVH/VL的计算机建模，并产生出原型人源化抗体序列。如果建模表明需要框架反向突变，则会产生带有所示出FW变化的第二个变体。合成出编码所选种系框架和鼠CDR的DNA片段。将合成的DNA片段亚克隆到IgG表达载体中，并通过DNA测序确认序列。人源化抗体在诸如293F的细胞中表达，并且例如以MDM吞噬作用测定法和抗原结合测定法测试该蛋白质。将人源化抗原结合单元与亲本抗原结合单元的抗原结合亲和力进行比较，例如通过FACS对表达靶抗原的细胞进行比较。如果亲和力比亲本抗原结合单元低2倍以上，则可以如上所述地进行第二轮的产生和测试人源化变体。
如上所述，抗原结合单元可以是“单价”或“多价”的。前者在每个抗原结合单元具有一个结合位点，而后者含有多个结合位点，其能够结合相同或不同种类的多于一个抗原。取决于结合位点的数量，抗原结合单元可以是二价的(具有两个抗原结合位点)，三价的(具有三个抗原结合位点)，四价的(具有四个抗原结合位点)等等。
多价抗原结合单元可以基于它们的结合特异性进一步分类。“单特异”抗原结合单元是能够结合相同种类的一个或多个抗原的分子。“多特异”抗原结合单元是对至少两种不同抗原具有结合特异性的分子。尽管这样的分子通常会仅结合两种不同的抗原(即双特异抗原结合单元)，但是当在本文中使用时，该表达涵盖具有其他特异性的抗体(诸如三特异抗体)。本公开进一步提供了多特异抗原结合单元。多特异抗原结合单元是能够结合至少两种不同抗原的多价分子。优选的多特异抗原结合单元是分别对两种和三种不同的抗原表现出结合特异性的双特异和三特异分子。
在本文公开的实施方案的一些方面，抗原结合单元是双特异抗原结合单元，其中所述抗原结合单元特异地结合与HLA复合的WT1肽和第二抗原。在一些实例中，第二抗原不是WT1。在一些实例中，第二抗原是CD3。在一些实例中，第二抗原是PD1或PD-L1。在一些实例中，第二抗原是其他免疫检查点分子，包括CTLA-4,OX40,OX40L,4-1BB(CD137),CD40,CD40L,ICOS,CD70,CD27,GITR,GITRL,TL1A,TNFRSF25,VISTA,TIM-3,LAG-3,TIGIT,CD112,CD112R,CD226,CD96,B7-H3,B7-H4,CD48,CD244,CD200R,CD200,HVEM,BTLA,CD160,LIGHT,HHLA2,TMIGD2,BTNL2,CD39,CD73,NKG2A,NKG2D,MICA/B,KIR2DL-1,KIR2DL-2,KIR2DL-3,和KIR3DL2。在一些实例中，第二抗原是EGFR。在一些实例中，第二抗原是CD19,CD20,CD22,CD33,CD44,CD52,CD79b,CD96,CD97,CD99,CD123,CD138,CD155,CD171,PTHR2,HAVCR2或其他已知的癌细胞标记。合适的第二抗原的其他实例包括但不限于：FcγRI,CD 15,p185HER2,HER3,FcγRIII(CD16),CD3,恶性B细胞(1D10),p97,claudin18.2,OVCAR-3,磷脂酰肌醇聚糖-3,间皮素,L-D1(结肠癌),Trop2,刺激黑素细胞的激素类似物,ErbB2,CAMA1,MoV18,CAIX(羧基酸酐酶IX)，神经细胞粘附分子(NCAM)，叶酸结合蛋白(FBP),GD2,GD3,EpCAM,EGP-40,VEGFR2,MUC-1,MUC-16,STEAP1(前列腺的六跨膜上皮抗原),PSMA,PSCA(前列腺干细胞抗原),GPC-3,LMP-1,DNAM-1(DNAX辅助分子1)，大肠癌相关抗原(AMOC-31)，皂草素,Id-1,CD7,CD38,CD30,CD44v7/8,CEA,蓖麻蛋白A链，干扰素-α(IFN-α)，杂交瘤独特型，长春花生物碱，碱性磷酸酶，纤维蛋白，组织纤溶酶原活化剂(tPA)，尿激酶型纤溶酶原活化剂(uPA)，低密度脂蛋白(LDL)，Fc受体(例如FcγRI,FcγRII或FcγRIII)，单纯疱疹病毒(HSV)，T细胞受体，流感,FcγR,HIV,EOTUBE,DPTA,半抗原，兔IgG，铁蛋白，辣根过氧化物酶(HRP)，激素，生长抑素，P物质，FITC和β-半乳糖苷酶。其他合适的第二抗原包括但不限于：肿瘤细胞抗原，细胞毒性触发分子，毒素，纤维蛋白溶解剂，细胞表面受体，传染病靶标，疫苗佐剂，诊断试剂，检测分子，以及报道分子。
组合物–嵌合抗原受体
在一个实施方案中，本公开提供了一种嵌合抗原受体，其包含胞外抗原结合单元，跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外抗原结合单元特异地结合与HLA复合的WT1肽，其中所述WT1肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且其中胞外抗原结合单元没有表现出和与HLA复合的参比肽的显著结合，其中该参比肽具有SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本公开提供了一种嵌合抗原受体，其包含胞外抗原结合单元，跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外抗原结合单元特异地结合与HLA复合的WT1肽，其中所述WT1肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中与具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的参比抗原结合单元相比，胞外抗原结合单元表现出更少的和与HLA复合的参比肽的非特异性结合，其中参比肽具有SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
主题抗WT1嵌合抗原受体(CAR)通常包含胞外抗原结合单元，跨膜结构域和控制免疫应答细胞活化的胞内信号传导区。在一些情况下，抗WT1 CAR还包括铰链或间隔子。在一些情况下，抗WT1 CAR进一步包含一个或多个共刺激结构域。
在本文公开的任何实施方案的一个方面，主题嵌合抗原受体包含本文公开的任何主题抗原结合单元。在一些实例中，主题抗原结合单元包含下述胞外抗原结合单元，其是主题抗原结合单元或包含主题抗原结合单元。
嵌合抗原受体通常包含胞外抗原结合单元。在一个实施方案中，该胞外抗原结合单元可以是全人的。在其他情况下，该胞外抗原结合单元可以被人源化。在其他情况下，该胞外抗原结合单元可以是鼠的或在下述胞外抗原结合单元中嵌合的，其由源自至少两种不同动物物种的氨基酸序列组成。在一些情况下，胞外抗原结合单元可以是非人的。可以设计多种抗原结合单元来靶向与HLA复合的WT1肽。非限制性的实例包括：源自抗体的单链可变片段(scFv的)，选自文库的片段抗原结合单元(Fab)，单结构域片段，或者与其同源受体接合的天然配体。胞外抗原结合单元可以涵盖scFv，Fab或天然配体，以及它们的任何衍生物。胞外抗原结合单元可意指除完整抗体以外的分子，其可以包含完整抗体的一部分并且可以结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例可包括但不限于：Fv,Fab,Fab',Fab'-SH,F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；由抗体片段形成的多特异抗体。
胞外抗原结合单元(例如scFv、Fab或天然配体)可以是决定抗原特异性的CAR的一部分。胞外抗原结合单元可以结合任何互补靶标。胞外抗原结合单元可以源自已知可变区序列的抗体。胞外抗原结合单元可以源自从可获得的小鼠杂交瘤获得的抗体序列。替选地，胞外抗原结合单元可从肿瘤细胞或原代细胞(诸如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))的全外显子测序获得。
在某些情况下，胞外抗原结合单元的结合特异性可以通过互补决定区或CDR(诸如轻链CDR或重链CDR)来确定。在许多情况下，结合特异性可以通过轻链CDR和重链CDR确定。重链CDR和轻链CDR的给定组合可提供给定的结合口袋，其可以赋予与抗原(诸如与HLA复合的WT1肽)更大的(与其他参比抗原或与HLA复合的参比肽相比)亲和力和/或特异性。例如，对与HLA复合的WT1肽特异的CDR可以在CAR的细胞外结合区域中表达，从而靶向与HLA复合的WT1肽的CAR可以使免疫应答细胞靶向表达与HLA复合的WT1肽的肿瘤细胞。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，胞外抗原结合单元(诸如scFv)可包含对与HLA复合的WT1肽具有特异性的轻链CDR。轻链CDR可以是抗原结合单元诸如CAR的scFv的轻链的互补决定区。轻链CDR可包含氨基酸残基的一个连续序列或氨基酸残基的两个或更多个连续序列，所述序列被非互补决定区诸如框架区分开并且可选被侧卫。在一些情况下，轻链CDR可包含两个或更多个轻链CDR，其可被称为轻链CDR-1，CDR-2等。在一些情况下，轻链CDR可包含三个轻链CDR，其可分别称为轻链CDR-1，轻链CDR-2和轻链CDR-3。在一些实例中，存在于共同轻链上的一组CDR可统称为轻链CDR。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，胞外抗原结合单元，诸如scFv，可以包含对与HLA复合的WT1肽具有特异性的重链CDR。重链CDR可以是抗原结合单元诸如scFv的重链的互补决定区。重链CDR可包含氨基酸残基的一个连续序列或氨基酸残基的两个或更多个连续序列，所述序列被非互补决定区诸如框架区分开并且可选被侧卫。在一些情况下，重链CDR可包含两个或更多个重链CDR，其可被称为重链CDR-1，CDR-2等。在一些情况下，重链CDR可包含三个重链CDR，其可分别称为重链CDR-1，重链CDR-2和重链CDR-3。在一些情况下，存在于共同重链上的一组CDR可统称为重链CDR。
在一些情况下，胞外抗原结合单元特异地识别与HLA复合的WT1肽。在一些情况下，胞外抗原结合单元可靶向WT1的N端肽，C端肽或任何肽。在一些情况下，WT1肽具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列。
在一些情况下，抗WT1的CAR免疫应答细胞可表达靶向与HLA复合的WT1肽的胞外抗原结合单元。在一些情况下，结合与HLA复合的WT1肽的CDR、轻链和/或重链可以包含在CAR免疫应答细胞诸如CAR T细胞的胞外抗原结合单元内。在一些情况下，经修饰的抗WT1 CDR可以在CAR免疫应答细胞的胞外抗原结合单元上表达，并且与原始抗WT1 CDR具有约50％至约100％的同源性。在一些情况下，经修饰的抗WT1 CDR可包含与未经修饰的抗WT1 CDR约50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或高达约100％的同源性。
通过采用基因工程，可以以多种方式修饰胞外抗原结合单元。在一些情况下，可以使胞外抗原结合单元突变，从而可以选出下述胞外抗原结合单元，其对其靶标具有更高的亲和力。在某些情况下，该胞外抗原结合单元对其靶标的亲和力可以针对该可以在正常组织上低水平表达的靶标进行优化。可以进行此优化以最小化潜在的毒性。在其他情况下，对膜结合形式的靶标具有更高亲和力的胞外抗原结合单元的克隆可优于其可溶形式的对应物。可以进行此修饰，这是因为一些靶标也可以以不同水平的可溶形式被检测到，并且对它们的靶向可能导致非预期的毒性。
在一些情况下，胞外抗原结合单元可以是鼠的、人源化的或全人的。胞外抗原结合单元可以是约1％至约100％人类的。在一些情况下，胞外抗原结合单元可以是约10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或高达约100％人类的。
在一些实例中，主题嵌合抗原受体可包含胞外抗原结合单元，其包含轻链(LC)CDR和重链(HC)CDR。
在一些情况下，主题胞外抗原结合单元可包含表1中所列的任何LCDR或HCDR。额外地或者替选地，胞外抗原结合单元可包含与表1中所列的LCDR或HCDR的任何一种具有至少60％同一性的LCDR或HCDR。在一些方面，主题LCDR或HCDR可表现出与表1中所列的任何序列ID号(SEQ ID NO)至少65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,99％或更高的序列同一性。
在一些情况下，轻链(LC)CDR包括LCDR1,LCDR2和LCDR3；而重链(HC)CDR包含HCDR1,HCDR2和HCDR3。在一些实例中，所述LCDR1,LCDR2和LCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列：SEQ ID NO:5-7和11-15。在一些实例中，所述HCDR1,HCDR2，HCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列：SEQ ID NO:2-4,8-10和16-17。在一些实例中，所述LCDR1,LCDR2和LCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列：SEQ ID NO:5-7和11-15，并且所述HCDR1,HCDR2，HCDR3各自具有选自由下述构成的组的序列：SEQ ID NO:2-4,8-10和16-17。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，胞外抗原结合单元包含轻链CDR，其中所述轻链(LC)CDR包含三个LCDR的组合，即LCDR1,LCDR2和LCDR3。三个LCDR的组合可包含表2中所列的任何组合。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，胞外抗原结合单元包含重链CDR，其中所述重链(HC)CDR包含三个HCDR的组合，即HCDR1,HCDR2和HCDR3。三个HCDR的组合可包含表3中所列的任何组合。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，胞外抗原结合单元包含轻链CDR和重链CDR，其中所述轻链CDR和所述重链CDR分别包含选自由下述构成的组的LCDR和HCDR：表2所列出的LCDR的任何组合和表3所列出的HCDR的任何组合。
在一些情况下，胞外抗原结合单元包含铰链或间隔子。术语铰链和间隔子可以互换使用。铰链可以认为是CAR的一部分，其用于向胞外抗原结合单元提供柔性。在一些情况下，铰链可用于检测细胞的细胞表面上的CAR，特别是当检测胞外抗原结合单元的抗体不起作用或无法获得时。例如，取决于该表位在胞外抗原结合单元所靶向的靶标上的位置，可能需要优化源自免疫球蛋白的铰链的长度。
在一些情况下，铰链可能不属于免疫球蛋白，而是属于另一个分子，诸如CD8α分子的天然铰链。CD8α铰链可含有半胱氨酸和脯氨酸残基，已知这些残基作用于CD8共受体和MHC分子的相互作用。所述半胱氨酸和脯氨酸残基可影响所述CAR的性能。在一些实例中，CD8α铰链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
CAR铰链可以是尺寸可调的，并且可以在一定程度上补偿了对CAR免疫应答细胞和靶细胞之间的垂直突触距离正常化。免疫应答细胞与靶细胞之间的免疫突触的这种拓扑结构还定义了一个距离，该距离由于细胞表面靶分子上的膜远端表位而无法通过CAR功能接通，即使使用短铰链CAR也无法实现使突触距离接近信号传导。同样地，已经描述了膜近端CAR靶标抗原表位，它的信号传导输出值仅在长铰链CAR的情况下被观察到。铰链可以根据所使用的胞外抗原结合单元进行调节。铰链可以是任何长度。
跨膜结构域可以将CAR锚定至细胞的质膜。CD28的天然跨膜部分可用于CAR。在其他情况下，CD8α的天然跨膜部分也可以在CAR中使用。“CD8”其可以意指与NCBI参考号：NP_001759具有至少85,90,95,96,97,98,99或100％同一性的蛋白质或其具有刺激活性的片段。“CD8核酸分子”其可以意指编码CD8多肽的多核苷酸。在一些情况下，跨膜区可以是CD28的天然跨膜部分。“CD28”其可以意指与NCBI参考号：NP_006130具有至少85,90,95,96,97,98,99或100％同一性的蛋白质或具有刺激活性的片段。“CD28核酸分子”可以意指编码CD28多肽的多核苷酸。在一些情况下，跨膜部分可包含CD8α区。
CAR的胞内信号传导区可以负责活化至少一种免疫应答细胞的效应子功能(CAR已经放置在该细胞中)。CAR可以诱导T细胞的效应子功能，例如，这可能是细胞溶解活性或辅助子活性(包括分泌细胞因子)。因此，术语胞内信号传导区意指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞进行特定的功能。尽管通常可以采用整个胞内信号传导区，但是在许多情况下，不必使用信号传导结构域的整个链。在一些情况下，使用胞内信号传导区的截短部分。因此，在一些情况下，术语胞内信号传导区意在包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导区的任何截短部分。
用于CAR的信号传导结构域的优选实例可包括T细胞受体(TCR)和共受体(它们共同作用以在靶标受体接合后启动信号转导)的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能的任何合成序列。
在一些情况下，所述胞内信号传导区可含有被称为免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)的信号传导基序。含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括：源自TCRζ，FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b和CD66d的那些。然而，在优选的实施方案中，细胞内信号传导结构域源自CD3ζ链。
含有一个或多个ITAM基序的T细胞信号传导结构域的实例是CD3ζ结构域，也称为T细胞受体T3ζ链或CD247。此结构域是T细胞受体-CD3复合物的一部分，并在下述过程中起重要作用：即将抗原识别耦联至带有T细胞主要效应子活化的几种胞内信号转导途径。如本文所使用的，CD3ζ首先针对由Swissprot条目P20963已知的人CD3ζ及其亚型，包括具有基本相同序列的蛋白质。作为嵌合抗原受体的一部分，还是不需要全T细胞受体T3ζ链，并且其包含T细胞受体T3ζ链的信号传导结构域的任何衍生物都是合适的(包括其任何功能等同物。)
胞内信号传导结构域可以选自表4的任何一个结构域。在一些情况下，可以修饰结构域，从而与任何一个参比结构域的同源性可为约50％至约100％。可以修饰表4的任何一个结构域，从而经修饰的版本可包含约50,60,70,80,90,95,96,97,98,99或高达约100％的同源性。
CAR的胞内信号传导区可以进一步包含一个或多个共刺激结构域。胞内信号传导区可包含单个共刺激结构域，例如ζ链(第1代CAR)或CD28或4-1BB(第2代CAR)。在其他实例中，胞内信号传导区可包含两个共刺激结构域，诸如CD28/OX40或CD28/4-1BB(第3代)。
这些共刺激域与胞内信号传导结构域诸如CD8一起可产生激酶途径的下游活化，其支持基因转录和功能性细胞应答。CAR的共刺激结构域可活化与CD28(磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶)或4-1BB/OX40(TNF-受体相关因子衔接子蛋白)途径以及MAPK和Akt活化相关的近端信号传导蛋白。
在一些情况下，通过CAR产生的信号可以与次要或共刺激信号复合。关于共刺激信号传导结构域，可以将嵌合抗原受体样复合物设计成包含几个可能的共刺激信号传导结构域。如本领域中所公知的，在天然(naive)T细胞中，仅T细胞受体的接合不足以诱导T细胞完全活化为细胞毒性T细胞。完全的、多产的T细胞活化需要第二个共刺激信号。已报道为T细胞活化提供共刺激的几种受体，其包括但不限于：CD28,OX40,CD27,CD2,CD5,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),4-1BBL,MyD88和4-1BB。这些共刺激分子利用的信号传导通路共享与主要T细胞受体活化信号协同作用的共同特性。这些共刺激信号区域提供的信号可以与源自一个或多个ITAM基序(例如CD3ζ信号传导结构域)的主要效应子活化信号协同作用，并可满足活化T细胞的要求。
在一些情况下，向嵌合抗原受体样复合物添加共刺激结构域可增强工程化细胞的功效和耐久性。在另一个实施方案中，T细胞信号传导结构域和共刺激结构域彼此融合，由此组成信号传导区。
表4.共刺激结构域
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在一些情况下，主题CAR可包含与SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:66中的任一个表现出约50％至约100％的序列同一性的序列或其部分。在一些情况下，主题CAR可包含与SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:66中的任一个表现出约50％,60％,70％,80％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或高达约100％的序列同一性的序列。
在一些情况下，主题CAR可包含与SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:75(表5)中的任一个具有约50％至约100％的序列同一性的序列。在一些情况下，主题CAR可包含与SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:75中的任一个表现出约50％,60％,70％,80％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或高达约100％的序列同一性的序列。
表5：示例性的抗WT1 CAR
SEQ ID NO: 构建体
67 ABU3-28Z
68 ABU3-BBZ
69 ABU3-28BBZ
70 ABU2-28Z
71 ABU2-BBZ
72 ABU2-28BBZ
73 ABU4-28Z
74 ABU4-BBZ
75 ABU4-28BBZ
本发明的多核苷酸和载体
在一些实施方案中，本公开提供了编码本文公开的任何抗原结合单元或嵌合抗原受体的经分离的核酸。在另一个实施方案中，本公开提供了包含编码本文公开的任何抗原结合单元或嵌合抗原受体的核酸序列的载体。在一些实施方案中，本发明提供了编码本文公开的抗原结合单元或胞外抗原结合单元的轻链CDR和重链CDR的经分离的核酸。
主题抗原结合单元或嵌合抗原受体可以通过重组DNA技术、合成化学技术或其组合来制备。例如，通常使用本领域已知的标准分子技术将编码抗原结合单元或嵌合抗原受体的所希望的成分的序列(包括轻链CDR和重链CDR)克隆化地组装至表达载体中。这些序列可以从编码所希望的蛋白质序列的其他载体，使用各自的模板核酸从PCR产生的片段、或者由编码所希望序列的合成寡核苷酸的组装体来组装。可以通过用包含感兴趣的抗原结合单元的表达载体转染合适的细胞来创建表达系统。
可以使用常规技术容易地获得与现有抗体的轻链或重链的多个区域相对应的核苷酸序列，并对其进行测序，所述常规技术包括但不限于杂交、PCR和DNA测序。生产单克隆抗体的杂交瘤细胞用作抗体核苷酸序列的优选来源。可以从公共的或私立的存储库中获得大量地生产一系列单克隆抗体的杂交瘤细胞。最大的保藏机关是美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，atcc.org)，该保藏中心提供了多种良好表征的杂交瘤细胞系的保藏。替选地，可以从经免疫或未经免疫的啮齿动物或人类以及形成器官(诸如脾脏和外周血淋巴细胞)获得抗体核苷酸。适用于提取和合成抗体核苷酸的特定技术在Orlandi等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86:3833-3837；Larrick等(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.160:1250-1255；Sastry等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.86:5728-5732；以及美国专利第5,969,108号中描述。
编码抗原结合单元或嵌合抗原受体的多核苷酸也可以例如通过用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源非人序列来修饰。以这种方式，制备了保留原始抗原结合单元的结合特异性的嵌合抗体。
还应理解，本发明中体现的多核苷酸包括编码示例性多肽的功能等同物及其片段的那些。功能上等同的多肽包括增强、降低或未显著影响由此编码的多肽的特性的那些。功能等同物可以是具有保守氨基酸取代基的多肽、包括融合体以及突变体的类似物。
由于遗传密码的简并性，抗原结合单元编码序列以及适合于构建本发明的多核苷酸和载体的序列的核苷酸可以有相当大的变化。序列变体可具有经修饰的DNA或氨基酸序列，一个或多个取代、缺失或添加，其净作用是保留所希望的抗原结合活性。例如，可以在编码区进行多种取代，这些取代既不改变被编码的氨基酸，也不导致保守性变化。这些取代被涵盖在本发明中。保守氨基酸取代包括下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。尽管保守性取代确实有效地改变了要生产的多肽中所含有的一个或多个氨基酸残基，但是预期该取代不会干扰得出的要生产的抗原结合单元的抗原结合活性。不改变编码氨基酸残基的核苷酸取代可用于优化不同系统中的基因表达。合适的取代是本领域技术人员已知的，并且进行它，以例如反映表达系统中的优选密码子采用。下表示例性地说明了保守性取代。
表6
原始AA 典型的保守取代 优选的保守取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
在希望时，本公开的重组多核苷酸可包含有助于检测基因产物的表达和纯化的异源序列。这样的序列的实例是本领域已知的，并且包括编码报道蛋白诸如β-半乳糖苷酶，β-内酰胺酶，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，荧光素酶，绿色荧光蛋白(GFP)以及它们的衍生物的那些。其他有助于纯化的异源序列可能编码表位，诸如Myc，HA(源自流感病毒血凝素)，His-6，FLAG或免疫球蛋白的Fc部分，谷胱甘肽S-转移酶(GST)和麦芽糖结合蛋白(MBP)。
本文公开的多核苷酸可以与上述多种有化学功能的部分结合。通常采用的部分包括能够产生可检测信号的标签，信号肽，增强免疫反应的试剂，促进与固体载体(solidsupport)耦联的试剂，疫苗载体，生物应答调节剂，顺磁性标签和药物。这些部分可以重组地或通过本领域已知的其他手段共价连接多核苷酸。
本发明的多核苷酸可包含其他序列，诸如同一转录单位内的其他编码序列，控制元件诸如启动子，核糖体结合位点和聚腺苷酸化位点，在相同或不同启动子控制下的其他转录单位，允许克隆、表达和转化宿主细胞的序列，以及提供本发明实施方案可能需要的任何这样的构建体。
本发明体现的多核苷酸可以使用化学合成，重组克隆方法，PCR，或它们的任何组合来获得。化学多核苷酸合成的方法是本领域中公知的，在此无需详细描述。本领域技术人员可以使用本文提供的序列数据通过采用DNA合成仪或从商业服务订购来获得所希望的多核苷酸。
可以将包含所希望序列的多核苷酸插入合适的载体，转而可以将该载体引入合适的宿主细胞中用于复制和扩增。因此，本发明涵盖包含一种或多种本发明的多核苷酸的多种载体。还提供了表达载体的可选择文库，其包含编码本文公开的抗原结合单元的至少一种载体。
本发明的载体通常包含表达抗原结合单元所需的转录的或者翻译的控制序列。合适的转录或翻译控制序列包括但不限于：复制起点，启动子，增强子，阻遏物结合区，转录起始位点，核糖体结合位点，翻译起始位点，和对于转录和翻译的终止位点。
对启动子的选择会在很大程度上取决于被引入载体的宿主细胞。也可以利用通常与所希望轻链或重链基因相关的启动子，条件是这样的控制序列与宿主细胞系统相容。也可以使用细胞特异性或组织特异性启动子。本领域技术人员已经描述并采用了种类繁多的组织特异性启动子。在选择性动物细胞中可操作的示例性启动子包括肝细胞特异性启动子和心肌特异性启动子。取决于对接受细胞类型的选择，本领域技术人员会知道适用于构建本发明表达载体的其他合适的细胞特异性或组织特异性启动子。
使用已知的分子克隆或基因工程技术，合适的转录控制序列，增强子，终止子或本领域已知的任何其他基因元件可以以可操作的关系整合，可选另外具有根据本发明表达的完整的可选择融合基因。除了上述元件外，载体还可以含有选择性标记(例如，编码用该载体转化的宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质的基因)，尽管这样的标记基因可以在共同引入宿主细胞中的另一种多核苷酸序列上携带。
本发明的多核苷酸和载体具有几种特定用途。它们例如在用于生产抗原结合单元或嵌合抗原受体的表达系统中是有用的。这样的多核苷酸可用作下述引物，其影响所希望的多核苷酸的扩增。此外，本发明的多核苷酸还可用于药物组合物，其包括疫苗、诊断剂和药物。
本发明的宿主细胞尤其可以用作，尤其是，主题多核苷酸、载体的储存库，或者用作用于基于其抗原结合特异性生产和筛选所希望的抗原结合单元或嵌合抗原受体的运载体。
因此，本发明提供了鉴别与所希望的抗原发生免疫反应的抗原结合单元或嵌合抗原受体的方法。这样的方法可包括以下步骤：(a)制备在基因上不同的抗原结合单元的文库，其中该文库包含至少一个主题抗原结合单元；(b)使抗原结合单元的文库与所希望的抗原接触；(c)检测抗原结合单元与抗原之间的特异性结合，由此鉴别与所希望的抗原发生免疫反应的抗原结合单元。
抗原结合单元或嵌合抗原受体特异地结合所希望的抗原的能力可以通过本领域良好建立的多种方法来测试。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York；Gherardi等(1990)J.Immunol.Meth.126:61-68。一般地，可以通过免疫测定，例如通过使加标签的抗原结合单元与固定化在固体载体或基底上的抗原反应，直接检测表现出所希望结合特异性的抗原结合单元。一般而言，用在免疫测定过程中表现出低水平非特异性结合的材料来制造抗原所粘附的基底。示例性固体载体由下述一种或多种材料制成：塑料聚合物，玻璃，纤维素，硝化纤维素，半导体材料和金属。在一些实例中，该基底是培养皿，色谱珠，磁珠等。
对于这样的固相测定，未反应的抗原结合单元通过洗涤除去。然而，在液相测定中，未反应的抗原结合单元通过一些其他分离技术，例如过滤或色谱法除去。将抗原与加标签的抗原结合单元结合后，确定结合标记的量。该技术的一种变化是竞争性测定，其中抗原被原始结合分子结合至饱和。当将一群主题抗原结合单元引入至复合物中时，只有那些表现出更高结合亲和力的抗原会有能力竞争，并且因而保持与抗原的结合。
替选地，可以通过细胞分选来评估与给定抗原的特异性结合，这包括将所希望的抗原呈递到待分选的细胞上，然后用与可检测试剂耦联的抗原结合单元给靶细胞加标签，然后在细胞分选仪中从未加标签的细胞中分离出加标签的细胞。先进的细胞分离方法是荧光活化细胞分选术(FACS)。以细流单行行进的细胞穿过激光束，然后测量被加荧光标签的抗原结合单元所结合的每个细胞的荧光。
洗脱的抗原结合单元的后续分析可涉及蛋白质测序，以描绘轻链和重链的氨基酸序列。基于推出的氨基酸序列，然后可以通过重组克隆方法，其包括PCR，文库筛选，现有核酸数据库中的同源性搜索或它们的任意组合，获得编码抗体多肽的cDNA。通常采用的数据库包括但不限于：GenBank,EMBL,DDBJ,PDB,SWISS-PROT,EST,STS,GSS和HTGS。
当在噬菌体或细菌颗粒上展示抗原结合单元的文库时，优选使用亲和色谱法进行选择。该方法通常以将噬菌体抗原结合单元的文库与溶液中的抗原包被的板，柱基质，细胞或生物素化的抗原结合，接着捕获来进行。洗涤与固相结合的噬菌体或细菌，然后通过可溶性半抗原，酸或碱洗脱。替选地，增加抗原浓度可用于从亲和基质上解离抗原结合单元。对于对抗原具有极高亲和力或亲合力的某些抗原结合单元，如WO 92/01047中所述的，有效洗脱可需要高pH或温和的还原性溶液。
选择的效率可能取决于几个因素的组合，包括洗涤过程中的解离动力学，以及单个噬菌体或细菌上的多个抗原结合单元是否可同时与固体载体上的抗原结合。例如，可以通过使用短洗涤，多价展示和在固体载体上高的抗原包被密度来保留具有快速解离动力学(以及弱的结合亲和力)的抗体。相反，通过使用长洗涤，单价噬菌体和低的抗原包被密度，可以有利于选择具有缓慢解离动力学(以及良好结合亲和力)的抗原结合单元。
在希望时，可以针对不相关的抗原预选择抗原结合单元的文库以反选择不希望的抗原结合单元。还可以针对相关抗原预选择文库，以分离例如抗独特型抗原结合单元。
本发明的宿主细胞
在一些实施方案中，本公开提供表达本文公开的任何一种抗原结合单元的宿主细胞。主题宿主细胞通常包含编码本文公开的任何一种抗原结合单元的核酸。
本发明提供了用上述多核苷酸、载体或载体文库转染的宿主细胞。可以通过许多合适的手段(包括电穿孔，微粒轰击；脂质体转染，感染(其中载体与感染试剂耦联)，采用氯化钙，氯化铷，磷酸钙，DEAE-葡聚糖或其他物质进行的转染)中的任何一种将载体引入合适的原核或真核细胞中。引入载体的手段的选择通常会取决于宿主细胞的特征。
对于大多数动物细胞，任何上述方法都适用于载体递送。优选的动物细胞是脊椎动物细胞，优选例如毫克水平的哺乳动物细胞，其能够大量表达外源导入的基因产物。优选细胞的非限制性实例是NIH3T3细胞，COS，HeLa和CHO细胞。
一旦引入合适的宿主细胞中，可以使用本领域已知的任何核酸或蛋白质测定来确定抗原结合单元的表达。例如，轻链CDR或重链CDR或抗原结合单元的转录mRNA的存在可以使用与抗原结合单元多核苷酸的任何区域互补的探针，通过常规杂交测定(例如RNA印迹分析)，扩增程序(例如RT-PCR)，SAGE(美国专利第5,695,937号)和/或基于阵列的技术(参见例如美国专利第5,405,783,5,412,087和5,445,934号)来检测和/或定量。
载体的表达也可以通过检查被表达的抗原结合单元来确定。多种技术在本领域中可用于蛋白质分析。它们包括但不限于放射免疫测定，ELISA(酶联免疫放射测定)，“三明治”免疫测定，免疫放射测定，原位免疫测定(使用例如，胶体金，酶或放射性同位素标签)，蛋白质印迹分析，免疫沉淀测定，免疫荧光测定，和SDS-PAGE。
抗原结合单元的制备
在一些实施方案中，本公开提供了生产本文公开的任何抗原结合单元或嵌合抗原受体的方法，其中该方法包括：在适于表达抗原结合单元或嵌合抗原受体的条件下培养表达抗原结合单元或嵌合抗原受体的宿主细胞，并分离宿主细胞表达的抗原结合单元或嵌合抗原受体。
可以使用本领域已知的多种蛋白质纯化技术分离表达的抗原结合单元或嵌合抗原受体。一般地，抗原结合单元是作为分泌的多肽从培养基中分离的，尽管当不含信号肽地直接生产时，可以从宿主细胞裂解物或细菌周质中回收它们。如果抗原结合单元是膜结合的，则它们可以通过本领域技术人员通常采用的合适的去污剂溶液来溶解。可以通过盐沉淀(例如，用硫酸铵)，离子交换色谱法(例如，在在中性pH运行并用增加离子强度的逐步梯度洗脱的阳离子或阴离子交换柱上)，凝胶过滤色谱法(包括凝胶过滤HPLC)，和在标志物(tag)亲和柱上或在亲和树脂(诸如蛋白A，蛋白G，羟基磷灰石和抗免疫球蛋白)上的色谱法来进一步纯化回收的抗原结合单元。
此外，在本发明的方法和组合物中可以利用下述衍生出的免疫球蛋白：其带有添加的化学接头，可检测的部分(诸如荧光染料，酶，底物，化学发光部分)，特异性结合部分(诸如链霉亲和素，亲和素或生物素)或药物结合物。
本文另外公开了结合至化学功能部分的抗原结合单元或嵌合抗原受体。一般地，该部分是能够产生可检测信号的标签(label)。这些结合的抗原结合单元或嵌合抗原受体可用于例如检测系统，诸如肿瘤负荷的定量，转移灶的成像和肿瘤成像。这样的标签在本领域中是已知的，并且包括但不限于放射性同位素，酶，荧光化合物，化学发光化合物，生物发光化合物底物辅因子和抑制剂。参见，有关教导使用这样的标签的专利的实例，美国专利第3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241号。该部分可以通过第二试剂，诸如第二抗体，蛋白A或生物素-亲和素复合物与抗原结合单元共价连接，重组连接或结合至抗原结合单元。
其他功能部分包括信号肽，增强免疫反应的试剂，促进与固体载体耦联的试剂，疫苗载体，生物应答调节剂，顺磁性标签和药物。信号肽是短的氨基酸序列，其指导新合成的蛋白质通过细胞膜，通常是真核细胞的内质网，以及细菌的内膜或内外膜。信号肽可以在多肽的N-末端部分或多肽的C-末端部分，并且可以从生物合成至多肽从细胞分泌之间酶法去除。可以将这样的肽掺入抗原结合单元以允许合成分子的分泌。
增强免疫应答的试剂包括但不限于细菌超抗原。促进耦联至固体载体的试剂包括但不限于生物素或亲和素。免疫原载体包括但不限于任何生理上可接受的缓冲液。生物应答调节剂(包括细胞因子，特别是肿瘤坏死因子(TNF)，白介素-2，白介素-4，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和γ-干扰素)。
合适的药物部分包括抗肿瘤试剂。非限制性实例包括放射性同位素，长春花生物碱类，诸如长春碱，长春新碱和硫酸长春地辛，阿霉素，硫酸博来霉素，卡铂，顺铂，环磷酰胺，阿糖胞苷，达卡巴嗪，放线菌素，盐酸柔红霉素，盐酸多柔比星，依托泊苷，氟尿嘧啶，洛莫司汀，盐酸甲基氯乙胺，美法仑，巯基嘌呤，甲氨蝶呤，丝裂霉素，米托坦，喷司他丁，哌泊溴烷，盐酸甲基苄肼(procarbazine hydrochloride)，链脲霉素，紫杉醇，硫鸟嘌呤和尿嘧啶氮芥。
可以通过重组手段生产包括抗原结合单元的免疫毒素。本领域中公知不同免疫毒素的生产，并且这些方法可以在例如“Monoclonal Antibody-toxin Conjugates:Aimingthe Magic Bullet,”Thorpe等(1982)Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine,Academic Press,pp.168-190；Vitatta(1987)Science238:1098-1104；以及Winter和Milstein(1991)Nature 349:293-299中找到。合适的毒素包括但不限于蓖麻毒素，放射性核素，商陆抗病毒蛋白，假单胞菌外毒素A，白喉毒素，蓖麻毒素A链，真菌毒素(诸如局限曲菌素和磷脂酶)。一般地，参见，“Chimeric Toxins,”Olsnes和Pihl,Pharmac.Ther.15:355-381(1981)；以及“Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,”编辑Baldwin和Byers,pp.159-179,224-266,Academic Press(1985)。
例如，可以通过创建编码抗原结合单元和功能性部分的融合基因来重组制成化学功能性部分。替选地，抗原结合单元可以通过多种良好建立的化学程序中的任何一种化学键合至该部分。例如，当该部分是蛋白质时，可以通过异双功能交联剂，例如，SPDP，碳二亚胺戊二醛等连接。这些部分可以通过第二试剂诸如第二抗体，蛋白A或生物素-亲和素复合物共价连接或结合。顺磁性部分及其与抗体的结合是本领域公知的。参见，例如，Miltenyi等(1990)Cytometry 11:231-238。
使用的方法
在一个实施方案中，本公开提供了诱导细胞死亡的方法，该细胞包含与HLA复合的WT1肽，所述方法包括使该细胞与主题嵌合抗原受体接触。
在一些实例中，该细胞在体内与嵌合抗原受体接触。在其他实例中，该细胞在体外或离体与嵌合抗原受体接触。
在一些实例中，该细胞是癌细胞。例如，该癌细胞可以是血液癌细胞，实体瘤癌细胞，间皮瘤癌细胞，结肠癌细胞或肠癌细胞。
在一个实施方案中，本公开提供了诱导靶细胞死亡的方法，该方法包括向靶细胞施用表达主题抗原结合单元或嵌合抗原受体的多个宿主细胞，其中与施用相当数量的缺乏抗原结合单元或嵌合抗原受体或编码它们的核酸的宿主细胞相比，向靶细胞施用多个宿主细胞诱导更大程度的靶细胞死亡。
在一些实例中，多个宿主细胞在体内施用于靶细胞。在一些实例中，多个宿主细胞在体外或离体施用于靶细胞。
在一些实例中，靶细胞是癌细胞。例如，癌细胞可以是血液癌细胞，实体瘤癌细胞，间皮瘤癌细胞，结肠癌细胞或肠癌细胞。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的主题嵌合抗原受体或包含其的宿主细胞，其中嵌合抗原受体诱导癌细胞的死亡。在一些实例中，癌症是血液癌，实体瘤癌，间皮瘤癌，结肠癌或肠癌。
在一个实施方案中，本公开提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的主题抗原结合单元或包含其的宿主细胞，所述癌症是血液癌，实体瘤癌，间皮瘤癌，结肠癌或肠癌。
在一个实施方案中，本公开提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含主题药物赋形剂和主题抗原结合单元或主题嵌合抗原受体。在一些实例中，所述癌症是血液癌，实体瘤癌，间皮瘤癌，结肠癌或肠癌。
通过本文公开的方法治疗的受试者可表现为癌症或实体瘤。通常，癌细胞或实体瘤细胞表达一种或多种肿瘤抗原。一般地，肿瘤抗原是WT1或WT1肽，诸如具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT1肽。表现为表达与HLA复合的WT1肽的癌症或实体瘤的受试者可称为表现为WT1-阳性癌症。
表达与HLA复合的WT1肽的癌症包括但不限于：肝癌，胃癌，食道癌，肺癌，乳腺癌，头颈癌，卵巢癌，肾癌，膀胱癌，宫颈癌，胰腺癌，脂肪肉瘤，睾丸非精原性生殖细胞癌(testicular nonseminomatous germ cell cancer)，黑色素瘤，腺瘤，肾上腺癌，神经鞘瘤，恶性，纤维组织肌瘤，间皮瘤，结肠的，肠的，或它们的任何组合。该主题方法还适用于治疗胃肠道的鳞状细胞癌或腺癌，神经内分泌癌。另外，本文公开的免疫应答细胞(诸如本文公开的抗WT1-CAR-T细胞)可用于靶向卵巢癌，胆管癌，间皮瘤，乳腺癌，肺癌的鳞状细胞癌，宫颈上皮内瘤，子宫颈鳞状细胞癌，肝内和肝外癌，胆囊癌，浸润性导管癌，透明细胞癌，嗜酸粒细胞腺瘤，乳头状癌，腺癌，乳头状癌，以及乳腺的小叶和髓样癌。
在一些情况下，可以通过流式细胞术或免疫组织化学评估癌细胞或肿瘤细胞的WT1表达。癌细胞或肿瘤细胞上的WT1的水平可以分为低、中或高。
在一些情况下，癌症或肿瘤细胞可以在细胞表面上表达与HLA复合的WT1肽。例如，可以使用针对WT1的抗体以诸如免疫组织化学或流式细胞分析来确定与HLA复合的WT1肽在细胞表面的表达。替选地，可以认为WT1mRNA表达与细胞表面上的WT1表达相关，并且可以通过选自原位杂交和RT-PCR的方法来确定。
可以将编码主题抗WT1 CAR的转基因掺入细胞中。例如，可以将转基因掺入免疫应答细胞，诸如T细胞。当插入细胞中时，转基因可以是互补DNA(cDNA)区段(其是信使RNA(mRNA)的副本)，或者可以是本身位于其基因组DNA原始区域的基因(带有或不带有内含子)。
可以将编码转基因序列的核酸，例如DNA，随机插入细胞的染色体中。将核酸，例如DNA，引入细胞的任何方法均可导致随机整合。例如，该方法可以是但不限于：电穿孔，声致穿孔，使用基因枪，脂质体转染，磷酸钙转染，使用树状聚合物，显微注射，以及使用病毒载体(包括腺病毒，AAV和逆转录病毒载体，和/或II组核糖酶)。
可以经由电穿孔将编码转基因的DNA引入细胞。也可以经由脂质体转染，感染或转化将DNA引入细胞。电穿孔和/或脂质体转染可用于转染原代细胞。电穿孔和/或脂质体转染可用于转染原代造血细胞。也可以不使用同源重组将DNA引入细胞基因组。在一些情况下，DNA可以由工程化的位点侧卫，该位点与基因组中靶向的双链断裂区域互补。在一些情况下，DNA可以从多核酸中切除，因此可以将其插入双链断裂区而无需同源重组。
待插入的转基因可以由与基因组中靶向的双链断裂位点类似的工程化位点侧卫，以从多核酸中切除转基因，从而可以将其插入双链断裂区。
还可以将编码转基因的DNA设计成包括报道基因，从而可以经由活化报道基因来检测转基因或其表达产物的存在。可以使用任何报道基因，诸如在上文公开的那些。通过在细胞培养物中选择那些已活化报道基因的细胞，可以选择出含有转基因的细胞。
主题抗WT1 CAR的表达可以通过表达测定法(例如qPCR)或通过测量RNA的水平来验证。表达水平也可以表示拷贝数。例如，如果表达水平极高，则表明在基因组中整合了CAR的一个以上的拷贝。替选地，高表达可以表明转基因被整合在高度转录的区域中，例如在高度表达的启动子附近。表达也可以通过测量蛋白质水平(诸如通过蛋白质印迹)来验证。
主题抗-WT1 CAR免疫应答细胞可包含一个或多个转基因。一个或多个转基因可以表达识别并结合抗原上的至少一个表位(例如，与HLA复合的WT1肽)的CAR蛋白，或结合抗原上的突变表位。CAR可以是功能性CAR。本发明的抗WT1 CAR免疫应答细胞也可以包含一个或多个CAR，或者可以包含单个CAR和二级工程化的受体。
转基因可以编码自杀基因。如对癌症患者的许多有效治疗方法所证明的，对CAR免疫应答细胞应答的客观肿瘤消退可能伴有毒性。在一些情况下，当该靶向抗原由肿瘤组织和正常组织共享时，CAR免疫应答细胞可能无法区分肿瘤组织和正常组织(“中靶/肿瘤外”毒性，“on-target/off-tumor”toxicity)。在其他情况下，可发生免疫系统的系统紊乱，称为细胞因子释放综合征(CRS)。所述CRS可包括全身性炎性反应综合征或细胞因子风暴，这可能是CAR免疫应答细胞在体内迅速扩增的结果。CRS是一种以发烧和低血压为特征的病况，在严重的情况下，可导致多器官衰竭。在大多数情况下，所述毒性与输注的CAR免疫应答细胞的体内扩增有关，这可引起免疫系统的总体紊乱，并释放高水平的促炎性细胞因子，诸如TNFα和IL-6。
在一些情况下，可以产生靶向与正常组织共有的抗原的CAR免疫应答细胞，从而它们瞬时表达CAR，例如在电穿孔编码受体的mRNA之后。另外，存在大量的努力以通过包括安全开关进一步工程化CAR免疫应答细胞，这些安全开关可在严重中靶毒性的情况下彻底消除CAR免疫应答细胞。可以将编码CAR的载体与安全开关结合，其诸如为可诱导的caspase-9基因(由二聚化的化学诱导物活化)或EGF受体R的截短形式(由单克隆抗体西妥昔单抗(cetuximab)活化)或RQR8。
主题抗WT1 CAR免疫应答细胞可以编码自杀基因转基因。所述转基因还可包含CAR受体或另一相似受体。自杀基因可诱导消除CAR免疫应答细胞。自杀基因可以是在所述CAR免疫应答细胞中诱导凋亡的任何基因。自杀基因可以与抗WT1 CAR一起在病毒载体内编码。
一个或多个转基因可以来自不同物种。例如，一个或多个转基因可包含人基因，小鼠基因，大鼠基因，猪基因，牛基因，狗基因，猫基因，猴子基因，黑猩猩基因，或它们的任何组合。例如，转基因可以来自人，其具有人基因序列。一个或多个转基因可以包含人类基因。在一些情况下，一个或多个转基因不是腺病毒基因。
转基因可以以随机的或位点特异的方式插入免疫应答细胞的基因组中，如上文所述。例如，可以将转基因插入免疫应答细胞基因组中的随机基因座。这些转基因可以是功能性的，例如，如果随意插入基因组中的任何地方，则是完全功能性的。例如，转基因可以编码其自身的启动子，或者可以插入内源启动子控制下的位置。替选地，可将转基因插入基因中，诸如基因的内含子或基因的外显子，启动子或非编码区。可以插入转基因，从而该插入破坏基因，例如内源性免疫检查点。
有时，可以将多于一个拷贝的转基因插入基因组中的多于一个随机基因座中。例如，可以将多个拷贝插入基因组中的随机基因座中。与将转基因随机插入一次相比，这可以导致总体表达增加。替选地，可以将转基因的一个拷贝插入基因，而将转基因的另一个拷贝插入不同的基因。可以靶向转基因，从而可以将其插入免疫应答细胞的基因组中的特定基因座。
在一些情况下，包含编码主题抗WT1 CAR的序列的多核酸可以采取质粒载体的形式。质粒载体可包含启动子。在一些情况下，启动子可以是组成型的。在一些情况下，启动子可以是诱导型的。启动子可以是或可以源自CMV，U6，MND或EF1a。在一些情况下，启动子可以与CAR序列相邻近。在一些情况下，质粒载体进一步包含剪接受体。在一些情况下，剪接受体可以与主题CAR序列相邻。启动子序列可以是PKG或MND启动子。MND启动子可以是合成启动子，其含有具有骨髓增生性肉瘤病毒增强子的经修饰的MoMuLV LTR的U3区。
在一些情况下，编码主题抗WT1 CAR的多核酸可以设计为以通过非病毒技术将其递送至细胞。在一些情况下，多核酸可能是与良好生产规范(GMP)相容的试剂。
编码主题抗WT1 CAR的多核酸的表达可以由一个或多个启动子控制。启动子可以是遍在的，组成型的(允许相关基因连续转录的非调控启动子)，组织特异的启动子或诱导型启动子。可以调节在启动子邻近处或附近处插入的转基因的表达。例如，转基因可以在遍在的启动子附近或紧接其插入。一些遍在的启动子可以是CAGGS启动子，hCMV启动子，PGK启动子，SV40启动子或ROSA26启动子。
启动子可以是内源的或外源的。例如，可以将一个或多个转基因插入内源或外源ROSA26启动子的邻近处或附近处。此外，启动子可以对免疫应答细胞具有特异性。例如，可以在猪ROSA26启动子的邻近处或附近处插入一个或多个转基因。
组织特异性启动子或细胞特异性启动子可用于控制表达的位置。例如，可以将一个或多个转基因组织特异性启动子邻近处或附近处插入。组织特异性启动子可以是FABP启动子，Lck启动子，CamKII启动子，CD19启动子，角蛋白启动子，白蛋白启动子，aP2启动子，胰岛素启动子，MCK启动子，MyHC启动子，WAP启动子，或Col2A启动子。
组织特异性启动子或细胞特异性启动子可用于控制表达的位置。例如，可以将一个或多个转基因在组织特异性启动子邻近处或附近处插入。组织特异性启动子可以是FABP启动子，Lck启动子，CamKII启动子，CD19启动子，角蛋白启动子，白蛋白启动子，aP2启动子，胰岛素启动子，MCK启动子，MyHC启动子，WAP启动子，或Col2A启动子。
也可以使用诱导型启动子。这些诱导型启动子可以在需要时通过添加或去除诱导试剂来开启和关闭。认为的是，诱导型启动子可以是但不限于Lac,tac,trc,trp,araBAD,phoA,recA,proU,cst-1,tetA,cadA,nar,PL,cspA,T7,VHB,Mx,和/或Trex。
此外，尽管不是对于表达所必需的，但转基因序列也可包括转录或翻译调控序列，例如，启动子，增强子，绝缘子，内部核糖体进入位点，编码2A肽的和/或聚腺苷酸化信号的序列。
在一些情况下，转基因编码主题抗-WT1 CAR，其中转基因被插入安全港(safeharbor)中，从而表达抗-WT1CAR。在一些情况下，将转基因插入PD1和/或CTLA-4基因座。在其他情况下，转基因在慢病毒中递送到细胞以随机插入，而PD1或CTLA-4特异性核酸酶可以mRNA形式提供。在一些情况下，转基因是经由病毒载体系统(诸如逆转录病毒，AAV或腺病毒)与编码对安全港(例如AAVS1，CCR5，白蛋白或HPRT)具有特异性的核酸酶的mRNA一起递送的。也可以用编码PD1和/或CTLA-4特异性核酸酶的mRNA处理细胞。在一些情况下，编码CAR的多核苷酸与编码HPRT特异性核酸酶和PD 1-或CTLA-4特异性核酸酶的mRNA一起经由病毒递送系统提供。可以与本文公开的方法和组合物一起使用的CAR可包括所有类型的这些嵌合蛋白，包括第一代，第二代和第三代设计。其他试剂，诸如CCR2或siRNA，可用于减少PD-1表达。
在一些情况下，逆转录病毒载体(γ-逆转录病毒或慢病毒)可用于将转基因引入免疫应答细胞。例如，可以将编码主题CAR(例如，抗WT1 CAR)或结合与HLA复合的WT1肽的任何受体的转基因克隆到逆转录病毒载体中，并且表达可由其内源启动子，由逆转录病毒长末端重复序列，或由对感兴趣的靶细胞类型具有特异性的启动子来驱动。可也以使用非病毒载体。非病毒载体递送系统可包括DNA质粒，裸核酸和与诸如脂质体或泊洛沙姆(poloxamer)的递送运载体复合的核酸。
已经开发了许多基于病毒的系统用于把基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。源自逆转录病毒(诸如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期稳定的整合以及使其在子代细胞中繁殖。慢病毒载体比源自肿瘤逆转录病毒(诸如鼠白血病病毒)的载体具有更多的优势，因为它们可以转导非增殖细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。腺病毒载体具有的优点是它们不会整合到靶细胞的基因组中，由此绕过了与整合相关的负面事件。
可以用编码主题CAR的转基因转染细胞。转基因浓度可以为约100皮克至约50微克。在一些情况下，可以改变可以引入细胞的核酸(例如，ssDNA，dsDNA，RNA)的量以优化转染效率和/或细胞活力。例如，对于电穿孔可以将1微克的dsDNA添加到每个细胞样品中。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的核酸(例如，dsDNA)的量可以是细胞类型特异性的。在一些情况下，用于每个样品的核酸(例如，dsDNA)的量可以直接对应于转染效率和/或细胞活力。例如，一定范围的转染浓度。由载体编码的转基因可以整合到细胞基因组中。在一些情况下，由载体编码的转基因的整合是正向的。在其他情况下，由载体编码的转基因的整合是反向的。
在一些情况下，可以改变用于细胞修饰(诸如主题CAR的病毒递送)的起始细胞密度，以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，用于用病毒载体转染或转导细胞的起始细胞密度可以小于约1×105个细胞。在一些情况下，用病毒载体进行细胞修饰的起始细胞密度可以是至少约1×105个细胞至至少约5×107个细胞。在一些情况下，用于最佳转染效率和/或细胞活力的起始细胞密度可以是细胞类型特异性的。例如，对于巨噬细胞，1.5×106个细胞的起始细胞密度可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在另一个例子中，对于人类细胞，5×106个细胞的起始细胞密度可以是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，一定范围的起始细胞密度对于给定的细胞类型可能是最佳的。例如，对于诸如T细胞的人类细胞，在5.6×106～5×107个细胞的起始细胞密度可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。
具有例如病毒系统的编码主题CAR的核酸序列整合到细胞基因组中的效率可以是或可以是大约20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.9％或超过99.9％。在一些情况下，在工程化细胞的细胞膜上主题CAR的检测值可以是或可以是大约20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.9％或超过99.9％，如通过流式细胞仪所测。
在一些情况下，免疫应答细胞可以是由CD45RO(-),CCR7(+),CD45RA(+),CD62L+(L-选择蛋白),CD27+,CD28+和/或IL-7Rα+组成的干记忆TSCM细胞，所述干记忆细胞还可以表达CD95,IL-2Rβ,CXCR3和/或LFA-1，并显示出所述干记忆细胞特有的许多功能属性。替选地，免疫应答细胞也可以是包含L-选择蛋白和CCR7的中枢记忆TCM细胞，其中中枢记忆细胞可以分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。免疫应答细胞也可以是包含L-选择蛋白或CCR7的效应子记忆TEM细胞，并生产例如效应子细胞因子，诸如IFNγ和IL-4。
载体可通过施用于个体患者，通常通过全身施用(例如，静脉内，腹膜内，肌内，皮下或颅内输注)或局部施用在体内递送，如下所述。替选地，可以将载体离体递送至细胞，诸如从个体患者移植出的细胞(例如，淋巴细胞，T细胞，骨髓抽出物，组织活检)，接着通常在选择出已经掺入载体的细胞后将细胞再植入给患者。在选择之前或之后，可以扩增细胞。
用于表达抗WT1 CAR的合适的免疫应答细胞对于有此需要的受试者可以是自体的或非自体的细胞。
可以从受试者获得合适的免疫应答细胞的来源。在一些情况下，可以获得T细胞。所述T细胞可自多种来源获得，包括PBMC，骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺组织，以及感染部位的组织，腹水，胸腔积液，脾组织和肿瘤。在某些情况下，可以使用本领域技术人员已知的任何数种技术(诸如FicollTM分离法)由从受试者收集的单位血液中获取T细胞。在一个实施方案中，来自个体的循环血液的细胞通过单采术(apheresis)获得。单采术产物通常含有淋巴细胞(包括T细胞，单核细胞，粒细胞，B细胞)，其他有核白细胞，红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以除去血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于随后的处理步骤。
替选地，细胞可以源自健康供体、源自诊断为癌症的患者或诊断为感染的患者。在另一个实施方案中，细胞可以是呈现不同表型特征的混合细胞群体的一部分。还可以根据前述方法从转化的T细胞获得细胞系。也可以从细胞治疗库获得细胞。可以通过本文所述的任何方法获得对免疫抑制处理具有抗性的经修饰的细胞。也可以在修饰之前选择所希望的细胞群体。也可以在修饰后选择工程化细胞群体。工程化细胞可用于自体移植。替选地，可以将细胞用于同种异体移植。在一些情况下，将细胞施用于与下述同一的患者，该患者的样品用于鉴别癌症相关靶序列。在其他情况下，将细胞施用于与下述不同的患者，该患者的样品用于鉴别癌症相关靶序列。
在一些情况下，免疫应答细胞可以是原代细胞(包括原代T细胞，干细胞或祖细胞)。祖细胞可以是造血祖细胞。本发明的细胞可以是人类细胞。合适的细胞可以离体扩增。合适的细胞也可以是CD45RO(-),CCR7(+),CD45RA(+),CD62L(+),CD27(+),CD28(+),IL-7Rα(+)，或它们的组合。
在一些情况下，合适的原代细胞包括外周血单核细胞(PBMC)，外周血淋巴细胞(PBL)和其他血细胞亚群，诸如但不限于T细胞，自然杀伤细胞，单核细胞，自然杀伤T细胞，单核细胞前体细胞，造血干细胞或非多能干细胞。在一些情况下，该细胞可以是任何免疫细胞，包括任何T细胞，诸如肿瘤浸润细胞(TIL)，诸如CD3+T细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞，或任何其他类型的T细胞。T细胞还可以包括记忆T细胞，记忆干T细胞，或效应子T细胞。T细胞也可以选自批量群体，例如，从全血中选出T细胞。T细胞也可以从批量群体中扩增。T细胞也可以偏向特定群体和表型。例如，可以使T细胞偏向下述表型，包括CD45RO(-),CCR7(+),CD45RA(+),CD62L(+),CD27(+),CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。可以选择合适的细胞，其包含从表中选择的多个标记之一，所述列表包含：CD45RO(-),CCR7(+),CD45RA(+),CD62L(+),CD27(+),CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。合适的细胞还包括干细胞，诸如，例如，胚胎干细胞，诱导的多能干细胞，造血干细胞，神经元干细胞和间充质干细胞。合适的细胞可包含任何数量的原代细胞，例如人类细胞，非人细胞和/或小鼠细胞。合适的细胞可以是祖细胞。合适的细胞可以源自待治疗的受试者(例如，患者)。合适的细胞可以源自人类供体。合适的细胞可以是由CD45RO(-),CCR7(+),CD45RA(+),CD62L+(L-selectin),CD27+,CD28+和IL-7Rα+组成的干记忆TSCM细胞，所述干记忆细胞还可以表达CD95，IL-2Rβ，CXCR3和LFA-1，并显示出所述干记忆细胞特有的许多功能属性。合适的细胞可以是包含L-选择蛋白和CCR7的中枢性记忆TCM细胞，所述中枢性记忆细胞可以分泌，例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。合适的细胞也可以是包含L-选择蛋白或CCR7的效应性记忆TEM细胞，并生产例如效应性细胞因子，诸如IFNγ和IL-4。
在一些情况下，一种方法可以包括在细胞快速扩增之前，使培养的T细胞富集出CD8+T细胞。在IL-2中培养T细胞之后，使用例如CD8微珠分离(例如，使用CliniMACSplus CD8微珠系统(Miltenyi Biotec))，T细胞可以使CD4+细胞枯竭并富集出CD8+细胞。不局限于特定理论，据信，CD4+,CD25+调节T细胞可以阻碍抗肿瘤应答。因此，据信，使培养的T细胞富集出CD8+T细胞并减少或消除CD4+细胞可以改善过继转移的抗肿瘤CD8+细胞的影响，提高患者的应答率，和/或降低减少由于CD4+细胞生产细胞因子而得到的毒性。此外，可以相信，富集出的CD8+“年轻”T细胞在临床规模的快速扩增中比批量T细胞表现得更加可靠和可预测。
细胞可以是良好生产规范(GMP)相容的试剂。细胞可以是在有此需要的受试者中治疗癌症，感染，自身免疫性病症或移植物抗宿主病(GVHD)的联合疗法的一部分。在一些情况下，本发明的细胞可以作为单一疗法施用于有此需要的受试者。
在一些情况下，表达主题CAR的细胞包括异种T细胞群体。在一些情况下，所使用的细胞可以主要由多样化比例的CD4和CD8T细胞组成。所述CD4和CD8细胞可具有循环效应性T细胞的表型特征。所述CD4和CD8细胞还可以具有效应记忆性细胞的表型特征。在另一个实施方案中，细胞可以是中枢性记忆细胞。
可以从供体分离的合适细胞可以处于任何下述发育阶段，其包括但不限于胎儿，新生儿，青年和成人。例如，供体免疫应答细胞可以从成人分离。供体人类免疫应答细胞可以在10,9,8,7,6,5,4,3,2或1岁以下。例如，可以从6岁以下的人分离免疫应答细胞。还可以从3岁以下的人分离免疫应答细胞。供体的年龄可以超过10岁。
获得合适细胞的方法可以包含：基于给定的标志物进行选择。例如，这样的标志物可包含GFP，抗性基因，细胞表面标志物或内源标签。可以使用任何内源性标记选择细胞。适用的细胞选择技术包括流式细胞仪和/或磁柱。随后可以将选择的细胞输注到受试者中。选择的细胞也可以扩增至大量。选择的细胞可以在输注前扩增。
对患者有效治疗所必需的细胞数量可以根据细胞的活力以及经基因修饰的细胞的效率(例如，转基因整合到一个或多个细胞中的效率，或由转基因编码的蛋白质的表达水平)而变化。在一些情况下，经基因修饰的细胞的活力和转基因整合的效率的乘积(例如做乘法)可对应于对于施用于受试者可获得的细胞的治疗学等份。在一些情况下，经基因修饰的细胞的活力的增加可对应于对患者治疗有效的施用所必需的细胞数量的减少。在一些情况下，转基因已经整合到一个或多个细胞中的效率的增加可对应于对患者治疗有效的施用所必需的细胞数量的减少。在一些情况下，确定治疗有效所必需的细胞数量可以包含：确定对应于细胞活力随时间变化的函数。在一些情况下，确定治疗有效所必需的细胞数量可以包含：确定对应于转基因可整合到一个或多个细胞中的效率变化针对时间相关变量(例如，细胞培养时间，电穿孔时间，细胞刺激时间)的函数。在一些情况下，治疗有效的细胞可以是包含在细胞表面上的抗WT1 CAR有约30％至约100％表达的细胞群体。在一些情况下，治疗有效的细胞可以在细胞表面以约30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.9％至超过约99.9％表达抗WT1 CAR，如通过流式细胞仪测量的。
多种细胞可以用于表达主题CAR，如上所述。抗WT1 CAR可以存在于真核细胞例如哺乳动物细胞的质膜中，其中合适的哺乳动物细胞包括但不限于：细胞毒性细胞，T淋巴细胞，干细胞，干细胞的后代，祖细胞，祖细胞的后代和NK细胞。
当存在于真核细胞的质膜中时，主题CAR可以在其结合靶标的存在下具有活性。例如，抗WT1 CAR可以在与HLA复合的WT1肽存在下具有活性。靶标，诸如与HLA复合的WT1肽，可以在膜上表达。靶标也可以是可溶的(例如，未与细胞结合)。靶标可以存在于细胞诸如靶标细胞的表面上。靶可以存在于诸如脂质双层等的固体表面上。靶标可以是可溶的，诸如可溶性抗原。靶标可以是抗原。抗原可以存在于细胞诸如靶细胞的表面上。抗原可以存在于诸如脂质双层等的固体表面上。在一些情况下，靶标可以是抗原的表位。在本文公开的方法中，抗原通常是与HLA复合的WT1肽，并且与表达HLA的靶细胞复合的WT1肽的细胞是癌细胞或肿瘤细胞。
在一些情况下，主题CAR，当存在于细胞的质膜上时，和当通过结合其靶标而受到活化时，可以导致细胞对靶标产生细胞毒活性，该靶标在其细胞表面表达与CAR的结合结构域结合的抗原。例如，在一些情况下，细胞可以是细胞毒性细胞(例如，NK细胞或细胞毒性T淋巴细胞)，本公开的CAR，当存在于细胞的质膜中时，以及当通过结合其靶标而受到活化时，可以增加细胞毒性细胞对靶细胞的细胞毒活性，所述靶细胞在其细胞表面表达与CAR的结合结构域结合的抗原。例如，在一些情况下，细胞可以是NK细胞或T淋巴细胞，与不存在结合靶标的细胞的细胞毒活性相比，本公开的CAR，当存在于细胞的质膜中时，以及当通过结合其靶标而受到活化时，可以增加细胞的细胞毒活性至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少75％，至少2倍，至少2.5倍，至少5倍，至少10倍或多于10倍。
在一些情况下，主题CAR，当通过结合其靶标而受到活化时，可导致其他与CAR活化有关的事件，诸如增殖和扩增(由于增加的细胞分裂或抗凋亡反应)。可以通过观察如在显微镜下看到的细胞团块目测测量细胞增殖。细胞扩增可以通过血细胞计数器测量来测量。在一些情况下，与类似的T细胞(非CAR T细胞)相比，CAR-T细胞可具有增加的细胞增殖和扩增能力。与类似的细胞相比，增加的细胞扩增可以是约1倍至约20倍。与类似的细胞相比，增加的细胞扩增可以是约1倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，17倍，18倍，19倍或高达20倍。细胞扩增可以在一段时间内测量。例如，细胞扩增可以从细胞获取到输注到受试者体内的时间发生。在其他情况下，细胞扩增可以在获取后约1天至高达约30天发生。细胞扩增可以在约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或高达30天发生。在一些情况下，可以在输注到受试者体内之前利用快速扩增方案(REP)来扩增细胞。在一些情况下，REP可能会在约14天的时间内发生。
在一些情况下，当CAR通过结合其靶标而受到活化时，可导致其他与CAR活化相关的事件，诸如细胞内信号传导调节，细胞分化或细胞死亡。在一些情况下，CAR在细胞上的表达可改变细胞的细胞内信号传导。在其他情况下，CAR的表达可改变细胞分化。
可以将一种或多种细胞因子与主题CAR或包含其的宿主细胞一起引入。细胞因子可用于促进转移的细胞(包括过继转移的肿瘤特异性细胞)在肿瘤微环境中扩增。在一些情况下，IL-2可用于促进本文所述细胞的扩增。也可以采用例如IL-15的细胞因子。也可以利用免疫治疗领域中的其他相关细胞因子，诸如IL-2，IL-7，IL-12和IL-21，或它们的任何组合。在一些情况下，使用重组细胞因子。
在一些实施方案中，可以通过使免疫应答细胞暴露于IL-12来增强包含本文所述的主题CAR的免疫应答细胞(例如T细胞或NK细胞)的功能。在一些情况下，IL-12可以具有免疫调节活性，并可以增强效应T细胞，活化的NK细胞或两者的功能。
在一些实施方案中，包含主题CAR的免疫应答细胞包含IL-12，由此使免疫应答细胞暴露于IL-12。在一些情况下，IL-12在免疫应答细胞的表面表达。在一些情况下，IL-12在免疫应答细胞内表达。例如，图11描绘了包含主题CAR和IL-12的示例性基因构建体。
在一些实施方案中，将免疫应答细胞与分泌IL-12的细胞共同施用。分泌IL-12的细胞的实例包括树突细胞和巨噬细胞。
在其他情况下，IL-12可以与包含本文所述的主题CAR的免疫应答细胞一起施用。在一些情况下，在施用包含主题CAR的免疫应答细胞之前，一起，之后，或以它们的组合，来施用IL-12。在一些情况下，IL-12可以与其他细胞因子同时或以任何顺序依次，通过相同途径或不同途径来施用。在一些实施方案中，使免疫应答细胞暴露于IL-12增强免疫应答细胞的细胞毒性效应子功能。在一些情况下，暴露于IL-12的免疫应答细胞的细胞毒性可以比没有暴露于IL-12的免疫应答细胞的细胞毒性高至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％。
在一些情况下，包含本文所述主题CAR的免疫应答细胞可暴露于IL-12，并可具有至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少为70％，至少80％，至少90％的细胞毒性，或在体外细胞毒性测定中在效应子与靶标(E:T)为5:1的比例至少90％的细胞毒性。
在一些情况下，包含本文所述的主题CAR的免疫应答细胞可以暴露于IL-12，并且可以具有至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％的细胞毒性，或在体外细胞毒性测定中，在效应子与靶标(E:T)为10:1的比例，至少90％的细胞毒性。
在一些情况下，包含本文所述的主题CAR的免疫应答细胞可以暴露于IL-12，并且可以具有至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％的细胞毒性，或在体外细胞毒性测定中，在效应子与靶标(E:T)为15:1的比例，至少90％的细胞毒性。
在一些情况下，包含本文所述的主题CAR的免疫应答细胞可以暴露于IL-12，并且可以具有至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％的细胞毒性，或在体外细胞毒性测定中，在效应子与靶标(E:T)为20:1的比例，至少90％的细胞毒性。
在一些实施方案中，使免疫应答细胞暴露于IL-12增强免疫应答细胞的细胞因子生产和/或分泌能力。在一些情况下，生产和/或分泌的细胞因子是干扰素-γ(IFN-γ)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)或IL-2。在其他情况下，将免疫应答细胞暴露于IL-12减少了IL-4介导的IFN-γ抑制。
在一些情况下，可以将T细胞生长因子与主题CAR或包含其的宿主细胞一起施用。可以通过任何合适的途径来施用生长因子。如果施用一种以上的T细胞生长因子，则它们可以同时或以任何顺序依次，通过相同途径或不同途径施用。T细胞生长因子，诸如阿地白介素(Aldesleukin，IL-2)，可以快速浓注方式静脉内施用。T细胞生长因子诸如IL-2的剂量本领域普通技术人员认为是高的。优选地，可以每天施用三次约720,000IU/kg的IL-2的剂量直至容许量。在一些情况下，施用约5至15剂的IL-2，平均约9剂。T细胞生长因子的剂量可以为约0至约20。T细胞生长因子可以施用1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,或高达约20次。
IL-2可以以静脉团注的方式以720,000IU/kg的剂量(基于总体重)施用。在一些情况下，IL-2可以在15分钟的时间内施用。在一些情况下，IL-2可以在20分钟的时间内施用。IL-2可以通过立即注射施用。在一些情况下，IL-2可以在1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59分钟,1小时，2小时，3小时，4小时，5小时或高达6小时的时间内施用。
在一些情况下，IL-2可以在细胞输注后24小时内开始施用，并持续长达约4天(最多12剂)。在某些情况下，IL-2可以在初次施用后施用多达约5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40天。
IL-2的给药可以为每8小时施用一次。在一些情况下，IL-2可以在初次施用后约每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24小时施用一次。在一些情况下，如果检测到毒性，可以停止IL-2给药。在一些情况下，除了阿地白介素常见的可逆3级毒性外，诸如腹泻，恶心，呕吐，低血压，皮肤变化，厌食，粘膜炎，吞咽困难或全身症状和实验室变化，如果患者由于阿地白介素导致达到3级或4级毒性，则可以延迟或停止给药。在一些情况下，如果可以通过支援性措施在24小时内容易地逆转这些毒性，则可以进行额外的给药。另外，可以根据进行治疗的医生的处置维持或停止给药。
在一些情况下，与不表达抗WT1 CAR的类似免疫应答细胞相比，表达抗WT1 CAR的免疫应答细胞可以具有增加的抗肿瘤功效。
在一些情况下，抗肿瘤功效可意指细胞毒活性。在其他情况下，抗肿瘤功效可意指持久性。抗肿瘤功效还可意指细胞靶向肿瘤的能力。可以使用多种体外测定来测量抗肿瘤功效。例如，可以通过测量白介素2(IL-2)或干扰素-γ(IFNγ)的释放的ELISA来测量细胞毒能力。细胞毒活性可以通过杀伤测定(诸如铬51释放测定法或共培养测定法)来测量。在一些情况下，与类似的细胞相比，抗WT1 CAR免疫应答细胞可具有增加的抗肿瘤功效和能力。
抗WT1 CAR治疗功效可以使用多种形式来评估。功效可意指抗肿瘤功效，该功效为对肿瘤(诸如WT1阳性肿瘤)控制、减少或消除的程度。治疗功效还可意指CAR免疫应答细胞扩增，持久性，肿瘤靶向，及它们的任何组合。
可以在输注期间，输注后立即或输注后长达数年期间对施用了抗WT1CAR免疫应答细胞疗法(诸如抗WT1 CAR T细胞疗法)的受试者进行评估。例如，经治疗的受试者可以返回门诊进行评估，时间为约1天至受试者生命的长度。可以从受试者CAR免疫应答细胞的初始施用后1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,60,70,80或长达90年评估经治疗的受试者。在一些情况下，评估计划可以包括每日监控，每周监控，每月监控或每年监控。在一些情况下，可以更频繁地观看受试者，如临床上所指出的。评估可以包括身体检查，化学评估，全血细胞计数，甲状腺检查，毒性评价，身体区域的计算机断层扫描(CT)扫描，单采术，以及它们的任何组合。
在一些情况下，可以在施用受试者CAR免疫应答细胞输注之前和之后约1至约10周进行单采术。在其他时间点，受试者的外周血淋巴细胞(PBL)可以通过用以Ficoll梯度离心的纯化法从全血中获得。可以将外周血单核细胞(PBMC)的等份冷冻保存用于细胞功能的免疫学监测。在一些情况下，多种测试可包括评估特定的裂解和细胞因子释放，代谢组学和生物能研究(使用Seahorse)，细胞因子生产的细胞内FACS，ELISA斑点测定以及淋巴细胞亚群分析可以用于评估主题CAR免疫应答细胞治疗的免疫相关因素。一般而言，在这些测定中约2至约3倍的差异可表明有真正的生物学差异。在一些情况下，抗WT1 CAR免疫应答细胞治疗后，体外测定的差异为约1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,4.5，高达约5倍，则可表明有治疗功效。
在一些情况下，如通过计算机断层摄影(CT)扫描或MRI所测量的，主题CAR免疫应答细胞治疗可以减小肿瘤尺寸。抗-WT1 CAR免疫应答细胞治疗可使肿瘤尺寸缩小至少约5％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或高达约100％。如通过CT扫描测量的，CAR-T治疗可以消除肿瘤。在一些情况下，抗WT1 CAR免疫应答细胞治疗可稳定化肿瘤尺寸，如通过计算机断层扫描(CT)所测量的：肿瘤病变直径的基线测量值的变化小于10％。例如，在施用抗WT1 CAR免疫应答细胞后，肿瘤可以不再扩增。在一些情况下，稳定化可以认为是：肿瘤尺寸(与治疗前的测量值相比)的变化小于10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或1％。
在一些情况下，可以根据受试者的存活时间来考虑抗WT1 CAR免疫应答细胞的功效。例如，用抗WT1 CAR免疫应答细胞诸如抗WT1 CAR T细胞治疗的受试者比未治疗的受试者或用不同疗法治疗的受试者可存活更长。
在一些情况下，抗WT1 CAR免疫应答细胞功效可通过添加二级治疗来改善。二级治疗可以与抗WT1 CAR免疫应答细胞治疗协同作用。在一些情况下，二级治疗可产生抗WT1CAR免疫应答细胞疗法的累加作用。二级治疗可以是淋巴细胞减少，另外形式的细胞疗法，抗体疗法，化学疗法，放射疗法，手术，抗血管生成疗法，以及它们的任何组合。
可以使用由修订的实体瘤应答评估标准(Response Evaluation Criteria inSolid Tumors，RECIST)指南(1.1版)提出的国际标准来评估治疗应答。在RECIST标准中，可以使用肿瘤病变最大直径(一维测量值)和恶性淋巴结最短直径的变化。例如，可测量的病变可以定义为：可以在至少一个维度(要记录的最长直径)上通过胸部X射线精确测量为>20mm，用CT扫描为>10mm或用卡尺通过临床检查>10mm的那些。为了认为是在病理上是可扩展的并且是可测量的，当通过CT扫描评估时，淋巴结的短轴可以是>15mm。所有其他病变(或疾病部位)，包括小病变(最长直径<10mm或短轴≥10至<15mm的病理性淋巴结)，都可以认为是不可测量的疾病。骨病变，软脑膜疾病，腹水，胸膜/心包积液，皮肤淋巴管炎/肺炎，炎性乳腺疾病可认为是不可测量的。
代表所有涉及的器官的所有可测量的病变(每个器官高达2个病变，总共5个病变)可鉴别为目标病变，并记录和测量基线。可以基于其尺寸(最长直径的病变)选择靶标病变，其代表所有涉及的器官，但除此之外，还应是适合可重复地进行重复测量的那些值。情况可以是，有时，最大的病变可能不适合本身进行可重复的测量，在这种情况下，应选择可重复测量的下一个最大的病变。可以计算所有靶标病变的直径的总和(非淋巴结病变最长者，淋巴结病变短轴)，并将其报道为基线总直径。如果要在总和中包括淋巴结，则只能将短轴添加到总和中。基线总直径会用作参比，以进一步表征疾病可测量尺寸内的任何客观肿瘤消退。
在一些情况下，当临床病变可以是浅表的(例如，皮肤结节和可触及的淋巴结)并且如使用卡尺评估的约10mm直径(例如，皮肤结节)时，可以认为是可测量的。在无法使用卡尺测量病变的情况下，也可以使用CT扫描或MRI。在一些情况下，CT扫描可产生约5mm或更小的产品切片。在一些情况下，CT扫描可以具有5mm，4mm，3mm，2mm，1mm或0.5mm扫描厚度。如果CT扫描具有大于5毫米的切片厚度，则可测量病变的最小大小可以是切片厚度的两倍。在一些情况下，也可以进行MRI以评估受试者。理想地，在确定治疗功效时，应使用相同类型的扫描仪，并且应与先前的扫描尽可能接近地遵循图像获取方案。如有可能，应使用屏气扫描技术进行身体扫描。在一些情况下，氟脱氧葡萄糖(FDG)-正电子发射断层扫描(PET)可用于测量治疗功效。
一旦评估了受试者，就可以将靶病变分为稳定疾病(SD)，进行性疾病(PD)，部分应答(PR)和/或完全应答(CR)。以最小的直径总和作为参比，认为：SD没有足够的收缩以取得PR的资格，也没有足够的增加以取得PD的资格。以最小的总和作为参比(如果可能最小，则可以包括基线总和)，PD可以认为是目标病灶直径总和至少增加20％。在一些情况下，除了相对增加约20％外，总和还必须显示出至少约5mm的绝对增加。以直径的基线总和作为参比，PR可以为减少目标病变直径的总和至少约30％。CR可以为消除靶病变。
主题抗-WT1抗原结合单元或主题抗-WT1CAR免疫应答细胞可以配制成药物，并用于治疗经诊断患有疾病(例如癌症)的、有此需要的人类或哺乳动物。这些药物可以与一种或多种化学治疗剂或化学治疗化合物一起共同施用于人类或哺乳动物。
可以使用技术人员已知的技术配制主题CAR免疫应答细胞(例如CAR T细胞群体)以施用于受试者。包含CAR免疫应答细胞群体的制剂可以包括药学上可接受的赋形剂。制剂中包括的赋形剂会具有不同的目的，这取决于例如，所用T细胞的亚群和施用的模式。通常使用的赋形剂的实例包括但不限于：盐水，缓冲盐水，右旋糖，注射用水，甘油，乙醇，以及它们的组合，稳定剂，增溶剂和表面活性剂，缓冲剂和防腐剂，张度剂，填充剂和润滑剂。通常会在不存在任何非人类成分诸如动物血清的情况下制备并培养包含CAR免疫应答细胞群体的制剂。制剂可包括一个群体的CAR免疫应答细胞，或多于一个的群体，诸如两个，三个，四个，五个，六个或更多个群体的CAR免疫应答细胞。例如，制剂可包含一个群体的CAR T细胞，或多于一个群体，诸如两个，三个，四个，五个，六个或更多个群体的CAR T细胞。
可以使用技术人员已知的模式和技术将包含抗-WT1 CAR免疫应答细胞群体的制剂施用于受试者。示例性模式包括但不限于静脉内注射。其他模式包括但不限于：肿瘤内，皮内，皮下(SC，sq，sub-Q，Hypo)，肌内(i.m.)，腹膜内(i.p.)，动脉内，髓内，心内，关节内(关节)，滑膜内(关节液地区)，颅内，脊柱内和鞘内(脊液)。可用于制剂的输注的肠胃外注射的任何已知装置可用于施行这样的施用。
包含施用于受试者的受试者CAR免疫应答细胞的群体的制剂包含有效治疗和/或预防特定适应症或疾病的许多CAR免疫应答细胞。因而，可以施用于受试者CAR免疫应答细胞的治疗有效群体。一般而言，施用包含约1×104至约1×1010个CAR个免疫应答细胞的制剂。在大多数情况下，所述制剂会包含约1×105至约1×109个CAR免疫应答细胞，约5×105至约5×108个CAR免疫应答细胞，或约1×106至约1×107个CAR免疫应答细胞。然而，施用于受试者的CAR免疫应答细胞的数量会在很宽的范围内变化，这取决于癌症的位置，来源，身份，广度和严重程度，待治疗个体的年龄和状况等。医生最终会确定要使用的适当剂量。
可以在施用主题CAR免疫应答细胞之前，同时或之后，将靶向肿瘤的分子施用于受试者。靶向肿瘤的分子可通过与肿瘤相关抗原或肿瘤特异抗原结合而与受试者的靶细胞结合。可以使用技术人员已知的技术配制靶向肿瘤的分子以施用于受试者。靶向肿瘤的分子的制剂可包括药学上可接受的赋形剂。通常使用的赋形剂的实例包括但不限于：盐水，缓冲盐水，右旋糖，注射用水，甘油，乙醇以及它们的组合，稳定剂，增溶剂和表面活性剂，缓冲剂和防腐剂，张度剂，填充剂和润滑剂。
可以使用技术人员已知的模式和技术将靶向肿瘤的分子施用于受试者。示例性模式包括但不限于静脉内，腹膜内和肿瘤内注射。其他模式包括但不限于皮内，皮下(SC，sq，sub-Q，Hypo)，肌内(i.m.)，动脉内，髓内，心内，关节内(关节)，滑膜内(关节液区域)，颅内，脊柱内和鞘内(脊液)。在一些情况下，CAR-T可以在肿瘤病变(例如肝脏病变)处局部施用。可用于制剂的肠胃外注射或输注的任何已知装置可用于施行这样的施用。
将包含靶向肿瘤的分子的制剂以有效治疗和/或预防特定适应症或疾病的量施用于受试者。一般而言，将包含至少约0.1mg/kg至约100mg/kg体重的靶向肿瘤的分子的制剂施用于需要治疗的受试者。在大多数情况下，考虑到施用的途径，症状等，剂量为每天约1mg/kg至约100mg/kg体重的标志物蛋白。医生会确定要使用的合适剂量。
在一个实施方案中，主题嵌合抗原受体用于刺激免疫应答细胞介导的免疫应答。例如，T细胞介导的免疫应答是涉及T细胞活化的免疫应答。活化的抗原特异性细胞毒性T细胞能够诱导在其表面上展示异质抗原的表位的靶细胞(诸如例如在展示肿瘤抗原的癌细胞)的凋亡。在另一个实施方案中，嵌合抗原受体用于在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫。由于T细胞介导的免疫应答，受试者会发展出抗肿瘤免疫。
在某些情况下，治疗患有癌症的受试者的方法可涉及：向需要治疗的受试者施用一种或多种靶向肿瘤的分子的制剂，其中这些分子与癌细胞结合，并施用一种或多种治疗有效群体的主题CAR免疫应答细胞，其中CAR免疫应答细胞可以结合靶向肿瘤的分子并诱导癌细胞死亡。另一个实施方案可以涉及治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向需要治疗的受试者施用一种或多种治疗有效群体的主题抗WT1 CAR免疫应答细胞，其中所述CAR免疫应答细胞与癌细胞结合，从而诱导癌细胞死亡。
包含抗WT1 CAR免疫应答细胞和抗WT1 CAR免疫应答细胞与靶向肿瘤的分子组合的两种制剂的施用频率会根据包括下述的因素改变：所治疗疾病，包含CAR免疫应答细胞和靶向肿瘤的分子的元件，以及施用的方式。每种制剂可以独立地每日施用4,3,2或1次，隔天一次，每三天一次，每四天一次，每五天一次，每六天一次，每周一次，每八天一次，每九天一次，每十天一次，每两周一次，每月一次和每两月一次。
如本文所使用的，“化学治疗剂”或“化学治疗化合物”及其语法同义语可以是可用于治疗癌症的化学化合物。可以与所公开的CAR免疫应答细胞组合使用的化学治疗癌症试剂包括但不限于有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些包括长春新碱，长春碱，长春地辛和NavelbineTM(长春瑞滨，5'-noranhydroblastine)。在其他实施方案中，化学治疗癌症试剂包括拓扑异构酶I抑制剂，诸如喜树碱化合物。如本文所使用的，“喜树碱化合物”包括CamptosarTM(盐酸伊立替康)，HycamtinTM(盐酸拓扑替康)和衍生自喜树碱及其类似物的其他化合物。可用于本文公开的方法和组合物中的另一类化学治疗癌症试剂是鬼臼毒素衍生物，诸如依托泊苷(teniposide)，替尼泊苷(teniposide)和米托肼(mitopodozide)。本公开进一步涵盖被称为烷基化剂的其他化学治疗癌症试剂，其将肿瘤细胞中的遗传物质烷基化。这些包括但不限于顺铂，环磷酰胺，氮芥，三亚甲基硫代磷酰胺，卡莫司汀(carmustine)，白消安，苯丁酸氮芥，洛莫司汀(belustine)，尿嘧啶氮芥，chlomaphazin和达卡巴嗪(dacarbazine)。本公开内容涵盖抗代谢物作为化学治疗剂。这些类型的试剂的例子包括胞嘧啶阿拉伯糖苷，氟尿嘧啶，甲氨蝶呤，巯基嘌呤，硫唑嘌呤和丙卡巴肼。可用于本文公开的方法和组合物中的化学治疗癌症试剂的另一类包括抗生素。实例包括但不限于阿霉素，博来霉素，放线菌素，柔红霉素，光神霉素(mithramycin)，丝裂霉素，丝裂霉素C和红比霉素(daunomycin)。对于这些化合物有许多可商购的脂质体制剂。本公开进一步涵盖其他化学治疗癌症试剂，包括但不限于抗肿瘤抗体，达卡巴嗪(dacarbazine)，氮胞苷(azacytidine)，安吖啶(amsacrine)，美法仑(melphalan)，异环磷酰胺和米托蒽醌(mitoxantrone)。
主题抗WT1 CAR免疫应答细胞可以与其他抗肿瘤试剂，包括细胞毒性/抗肿瘤试剂和抗血管生成剂组合施用。细胞毒性/抗肿瘤试剂可以定义为攻击和杀伤癌细胞的试剂。一些细胞毒性/抗肿瘤试剂可以是烷基化剂，其将肿瘤细胞中的遗传材料烷基化，例如顺铂，环磷酰胺，氮芥，三亚甲基硫代磷酰胺，卡莫司汀，白消安，苯丁酸氮芥，洛莫司汀(belustine)，尿嘧啶氮芥，chlomaphazin和达卡巴嗪。其他细胞毒性/抗肿瘤试剂可以是肿瘤细胞的抗代谢物，例如，胞嘧啶阿拉伯糖苷，氟尿嘧啶，甲氨蝶呤，巯基嘌呤，硫唑嘌呤和丙卡巴肼。其他细胞毒性/抗肿瘤试剂可以是抗生素，例如阿霉素，博来霉素，放线菌素，柔红霉素，光神霉素，丝裂霉素，丝裂霉素C和红比霉素。对于这些化合物有许多可商购的脂质体制剂。其他细胞毒性/抗肿瘤试剂也可以是有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些包括长春新碱，长春碱和依托泊苷。多种多样的细胞毒性/抗肿瘤试剂包括紫杉醇及其衍生物，L-天冬酰胺酶，抗肿瘤抗体，达卡巴嗪，氮胞苷，安吖啶，美法仑，VM-26，异环磷酰胺，米托蒽醌和长春地辛。
也可以使用抗血管生成剂。用于所公开的方法和组合物中的合适的抗血管生成剂包括抗VEGF抗体，包括人源化抗体和嵌合抗体，抗VEGF适体和反义寡核苷酸。其他血管生成抑制剂包括血管抑制素，内皮他丁(endostatin)，干扰素，白介素1(包括α和β)白介素12，视黄酸和金属蛋白酶-1和-2(TIMP-1和-2)的组织抑制剂。也可以使用小分子，包括拓扑异构酶，诸如丙亚胺，一种具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。
可与本发明的主题抗WT1 CAR免疫应答细胞组合使用的其他抗癌剂包括但不限于：阿西维辛(acivicin)；阿柔比星(aclarubicin)；盐酸阿考达唑(acodazolehydrochloride)；阿克罗宁(acronine)；阿多来新(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin)；六甲蜜胺(altretamine)；安波霉素(ambomycin)；醋酸阿美蒽醌(ametantrone acetate)；氨鲁米特(aminoglutethimide)；安吖啶(amsacrine)；阿那曲唑(anastrozole)；安曲霉素(anthramycin)；天冬酰胺酶；曲林菌素(asperlin)；阿瓦斯丁(avastin)；阿扎胞苷(azacitidine)；阿替派(azetepa)；阿佐霉素(azotomycin)；巴马司他(batimastat)；苯佐替派(benzodepa)；比卡鲁胺(bicalutamide)；盐酸比生群(bisantrenehydrochloride)；甲碘酸双奈法特(bisnafide dimesylate)；比折来新(bizelesin)；硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)；布喹那钠(brequinar sodium)；溴匹立明(bropirimine)；白消安(busulfan)；放线菌素c；卡芦睾酮(calusterone)；卡醋胺(caracemide)；卡贝替姆(carbetimer)；卡铂(carboplatin)；卡莫司汀(carmustine)；盐酸卡柔比星(carubicinhydrochloride)；卡泽来新(carzelesin)；西地芬戈(cedefingol)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；西罗霉素(cirolemycin)；顺铂(cisplatin)；克拉立滨(cladribine)；甲磺酸克立那托(crisnatol mesylate)；环磷酰胺；阿糖胞苷(cytarabine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；更生霉素(dactinomycin)；盐酸柔红霉素(daunorubicinhydrochloride)；地西他滨(decitabine)；右奥马铂(dexormaplatin)；地扎胍宁(dezaguanine)；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌(diaziquone)；多西他赛(docetaxel)；多柔比星(doxorubicin)；盐酸多柔比星；屈洛昔芬(droloxifene)；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)；达佐霉素(duazomycin)；依达曲沙(edatrexate)；盐酸依氟鸟氨酸(eflornithine hydrochloride)；依沙芦星(elsamitrucin)；恩洛铂(enloplatin)；恩普氨酯(enpromate)；依匹哌啶(epipropidine)；盐酸表柔比星(epirubicin hydrochloride)；厄布洛唑(erbulozole)；盐酸依索比星(esorubicinhydrochloride)；雌莫司汀(estramustine)；雌莫司汀磷酸钠(estramustine phosphatesodium)；依他硝唑(etanidazole)；依托泊苷(etoposide)；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺(etoprine)；盐酸法罗唑啉(fadrozole hydrochloride)；法扎拉滨(fazarabine)；芬维A胺(fenretinide)；氟尿苷(floxuridine)；磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)；氟尿嘧啶(fluorouracil)；氟西他滨(flurocitabine)；磷喹酮(fosquidone)；福司曲星钠(fostriecin sodium)；吉西他滨(gemcitabine)；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星(idarubicin hydrochloride)；异环磷酰胺(ifosfamide)；伊莫福新(ilmofosine)；白介素II(包括重组白介素II,或rIL2),干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-I；干扰素γ-I b；异丙铂(iproplatin)；盐酸伊立替康(irinotecan hydrochloride)；醋酸兰瑞肽(lanreotide acetate)；来曲唑(letrozole)；醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)；盐酸利阿唑(liarozole hydrochloride)；洛美曲索钠(lometrexol sodium)；洛莫司汀(lomustine)；盐酸洛索蒽醌(losoxantrone hydrochloride)；马索罗酚(masoprocol)；美坦辛(maytansine)；盐酸二氯甲基二乙胺(mechlorethaminehydrochloride)；醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)；醋酸甲稀雌醇(melengestrolacetate)；美法仑(melphalan)；美诺立尔(menogaril)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶(metoprine)；美妥替哌(meturedepa)；米丁度胺(mitindomide)；米托克星(mitocarcin)；丝裂红素(mitocromin)；米托洁林(mitogillin)；米托马星(mitomalcin)；丝裂霉素(mitomycin)；米托司培(mitosper)；米托坦(mitotane)；盐酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)；霉酚酸(mycophenolic acid)；诺考达唑(nocodazole)；诺拉霉素(nogalamycin)；奥马铂(ormaplatin)；奥昔舒仑(oxisuran)；紫杉醇(paclitaxel)；培门冬酶(pegaspargase)；培利霉素(peliomycin)；溴新斯的明(pentamustine)；硫酸培洛霉素(peplomycin sulfate)；培磷酰胺(perfosfamide；哌泊溴烷(pipobroman；哌泊舒凡(piposulfan；盐酸吡罗蒽醌(piroxantrone hydrochloride)；普利霉素(plicamycin)；普洛美坦(plomestane)；卟吩姆钠(porfimer sodium)；泊非霉素(porfiromycin)；泼尼莫司汀(prednimustine)；盐酸丙卡巴肼(procarbazinehydrochloride)；嘌罗霉素(puromycin)；盐酸嘌呤霉素(puromycin hydrochloride)；吡唑霉素(pyrazofurin)；利波腺苷(riboprine)；罗谷亚胺(rogletimide)；沙芬戈(safingol)；盐酸沙芬戈；司莫司汀(semustine)；辛曲秦(simtrazene)；磷乙酰天冬氨酸钠(sparfosatesodium)；司帕霉素(sparsomycin)；盐酸螺旋锗(spirogermanium hydrochloride)；螺莫司汀(spiromustine)；螺铂(spiroplatin)；链黑菌素(streptonigrin)；链佐星(streptozocin)；磺氯苯脲(sulofenur)；他利霉素(talisomycin)；替可加兰钠(tecogalansodium)；替加氟(tegafur)；盐酸替洛蒽醌(teloxantrone hydrochloride)；替莫泊芬(temoporfin)；替尼泊苷(teniposide)；替罗昔隆(teroxirone)；睾内酯(testolactone)；硫咪嘌呤(thiamiprine)；硫鸟嘌呤(thioguanine)；塞替派(thiotepa)；噻唑呋林(tiazofurin)；替拉扎明(tirapazamine)；柠檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)；醋酸曲托龙(trestolone acetate)；磷酸曲西立滨(triciribine phosphate)；三甲曲沙(trimetrexate)；普糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林(triptorelin)；盐酸妥布氯唑(tubulozolehydrochloride)；尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；乌瑞替派(uredepa)；伐普肽(vapreotide)；维替泊芬(verteporfin)；硫酸长春碱(vinblastine sulfate)；硫酸长春新碱(vincristine sulfate)；长春地辛(vindesine)；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定(vinepidine sulfate)；硫酸长春甘酯(vinglycinate sulfate)；硫酸环氧长春碱(vinleurosine sulfate)；酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)；硫酸异长春碱(vinrosidine sulfate)；硫酸长春利定(vinzolidine sulfate)；伏氯唑(vorozole)；泽尼铂(zeniplatin)；净司他丁(zinostatin)；盐酸佐柔比星(zorubicin hydrochloride)。其他抗癌药包括但不限于:20-表-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔尿嘧啶；阿比特龙(abiraterone)；阿柔比星(aclarubicin)；酰基富烯；adecypenol；阿多来新(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin)；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺(altretamine)；氨莫司汀(ambamustine)；amidox；氨磷汀(amifostine)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；氨柔比星(amrubicin)；安吖啶(amsacrine)；阿那格雷(anagrelide)；阿那曲唑(anastrozole)；穿心莲内酯(andrographolide)；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯(antarelix)；抗背突形态发生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非科林(aphidicolin glycinate)；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦(atamestane)；阿莫司汀(atrimustine)；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼(azasetron)；阿扎毒素(azatoxin)；重氮酪氨酸(azatyrosine)；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他(batimastat)；CAR/ABL拮抗剂；benzochlorins；benzoylstaurosporine；β-内酰胺衍生物；β-alethine；betaclamycin B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺(bicalutamide)；比生群(bisantrene)；bisaziridinylspermine；双奈法德(bisnafide)；bistratene A；比折来新(bizelesin)；breflate；溴匹立明(bropirimine)；布度钛(budotitane)；丁硫氨酸硫酸亚胺(buthionine sulfoximine)；卡泊三醇(calcipotriol)；钙感光蛋白C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨(capecitabine)；羧酰胺-氨基三唑；羧酰胺基三唑；CaRest M3；CARN700；软骨衍生抑制剂；卡泽来新(carzelesin)；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；澳粟精胺(castanospermine)；天蚕抗菌肽B；西曲瑞克(cetrorelix)；二氢卟酚类(chlorins)；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素(cicaprost)；顺卟啉；克拉立滨(cladribine)；氯米芬类似物；克霉唑(clotrimazole)；碰撞霉素A(collismycin A)；碰撞霉素B(collismycin B)；考布他汀A4(combretastatin A4)；考布他汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克立那托(crisnatol)；自念珠藻环肽8(cryptophycin 8)；自念珠藻环肽A衍生物；curacin A；环戊蒽醌；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷烷磷酯(cytarabine ocfosfate；)细胞溶解因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗(dacliximab)；地西他滨(decitabine)；脱氢膜海鞘素B(dehydrodidemnin B)；地洛瑞林(deslorelin)；地塞米松(dexamethasone)；右异环磷酰胺(dexifosfamide)；右丙亚胺(dexrazoxane)；右维拉帕米(dexverapamil)；地吖醌(diaziquone)；代代宁B(didemnin B)；didox；二乙基去甲精胺(diethylnorspermine)；二氢-5-氮杂胞啶(dihydro-5-azacytidine)；二氢紫杉醇(dihydrotaxol),9-；dioxamycin；二苯基螺莫司汀(diphenyl spiromustine)；多西他赛(docetaxel)；二十二醇；多拉司琼(dolasetron)；去氧氟尿苷(doxifluridine)；屈洛昔芬(droloxifene)；屈大麻酚(dronabinol)；多卡米星SA(duocarmycin SA)；依布硒(ebselen)；依考莫司汀(ecomustine)；依地福新(edelfosine)；依屈洛单抗(edrecolomab)；依氟鸟氨酸(eflornithine)；榄香烯(elemene)；乙嘧替氟(emitefur)；表柔比星(epirubicin)；爱普列特(epristeride)；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑(etanidazole)；磷酸依托泊甙(etoposide phosphate)；依西美坦(exemestane)；法罗唑(fadrozole)；法扎拉滨(fazarabine)；芬维A胺(fenretinide)；非格司亭(filgrastim)；非那雄胺(finasteride)；flavopiridol；氟卓斯汀(flezelastine)；fluasterone；氟达拉滨(fludarabine)；盐酸氟柔红霉素(fluorodaunorunicin hydrochloride)；福酚美克(forfenimex)；福美坦(formestane)；福司曲星(fostriecin)；福莫司汀(fotemustine)；德克萨斯卟啉钆(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨(galocitabine)；加尼瑞克(ganirelix)；明胶酶抑制剂；吉西他滨(gemcitabine)；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；调蛋白(heregulin)；六亚甲基双乙酰胺(hexamethylene bisacetamide)；金丝桃素(hypericin)；伊班膦酸(ibandronic acid)；伊达比星(idarubicin)；艾多昔芬(idoxifene)；伊决孟酮(idramantone)；伊莫福新(ilmofosine)；伊洛马司他(ilomastat)；咪唑并吖啶酮(imidazoacridones)；咪喹莫德(imiquimod)；免疫刺激剂肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘阿霉素(iododoxorubicin)；甘薯苦醇(ipomeanol),4-；伊罗普拉(iroplact)；伊索拉定(irsogladine)；异苯并咪唑(isobengazole)；异高软海绵素B(isohomohalicondrin B)；伊他司琼(itasetron)；jasplakinolide；kahalalide F；三醋酸层状素-N(lamellarin-N triacetate)；兰瑞肽(lanreotide)；雷拉霉素(leinamycin)；来格司亭(lenograstim)；硫酸香菇多糖(lentinansulfate)；leptolstatin；来曲唑(letrozole)；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林(leuprorelin)；左旋咪唑(levamisole)；利罗唑(liarozole)；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂(lobaplatin)；蚯蚓磷脂(lombricine)；洛美曲索(lometrexol)；氯尼达明(lonidamine)；洛索蒽醌(losoxantrone)；洛伐他汀(lovastatin)；洛索立宾(loxoribine)；勒托替康(lurtotecan)；镥替沙林(lutetium texaphyrin)；利索茶碱(lysofylline)；溶解肽；美坦新(maitansine)；mannostatin A；马立马司他(marimastat)；马索罗酚(masoprocol)；人乳腺丝抑蛋白(maspin)；基质溶解因子抑制剂(matrilysin inhibitors)；基质金属蛋白酶抑制剂(matrix metalloproteinase inhibitors)；美诺立尔(menogaril)；麦尔巴隆(merbarone)；美替瑞林(meterelin)；甲硫氨酸酶(methioninase)；甲氧氯普胺(metoclopramide)；MIF抑制剂；米非司酮(mifepristone)；米替福新(miltefosine)；米立司亭(mirimostim)；错配的双链RNA；米托胍腙(mitoguazone)；二溴卫矛醇(mitolactol)；丝裂霉素类似物(mitomycin analogues)；米托萘胺(mitonafide)；线粒体成纤维细胞生长因子-皂素；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫法罗汀(mofarotene)；莫拉司亭(molgramostim)；单克隆抗体；人绒毛膜促性腺激素；单磷酰脂质A+分支杆菌细胞壁sk；莫哌达醇(mopidamol)；多药耐药基因抑制剂；基于多种肿瘤抑制因子1的治疗；芥末抗癌剂；印度洋海绵B(mycaperoxide B)；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰基地那林(N-acetyldinaline)；N-取代苯甲脒(N-substituted benzamides)；那法瑞林(nafarelin；nagrestip)；纳洛酮+喷他佐辛(naloxone+pentazocine)；napavin；naphterpin；那托司亭(nartograstim)；奈达铂(nedaplatin)；奈柔比星(nemorubicin)；奈立膦酸(neridronicacid)；中性内肽酶；尼鲁米特(nilutamide；nisamycin)；氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化物；nitrullyn；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽(octreotide)；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮(onapristone)；昂丹司琼(ondansetron)；昂丹司琼(ondansetron)；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂(ormaplatin)；奥沙特龙(osaterone)；奥沙利铂(oxaliplatin)；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米膦酸(pamidronic 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1模拟物；司莫司汀(semustine)；衰老衍生抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃(sizofiran)；索布佐生(sobuzoxane)；硼卡钠(sodiumborocaptate)；苯乙酸钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明(sonermin)；斯帕福斯酸(sparfosic acid)；穗霉素D(spicamycin D)；螺莫司汀(spiromustine)；splenopentin；spongistatin 1；司夸胺(squalamine)；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；stipiamide；基质溶解素抑制剂；sulfinosine；超活性血管活性肠肽拮抗剂；suradista；舒拉明(suramin)；苦马豆素(swainsonine)；合成的糖胺聚糖；他莫司汀(tallimustine)；他莫西芬甲硫碘化物(tamoxifen methiodide)；牛磺莫司汀(tauromustine)；他扎罗汀(tazarotene)；替可加兰钠(tecogalan sodium)；替加氟(tegafur)；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬(temoporfin)；替莫唑胺(temozolomide)；替尼泊苷(teniposide)；四氯十二氧化物；tetrazomine；菌体胚素(thaliblastine)；噻可拉林(thiocoraline)；血小板生成素(thrombopoietin)；血小板生成素模拟物；胸腺法新(thymalfasin)；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南(thymotrinan)；甲状腺刺激激素；乙基锡初紫红素(tin ethyletiopurpurin)；替拉扎明(tirapazamine)；二氯环戊二烯钛；topsentin；托瑞米芬(toremifene)；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；triacetyluridine；曲西立滨(triciribine)；三甲曲沙(trimetrexate)；曲普瑞林(triptorelin)；托烷司琼(tropisetron)；妥罗特来(turosteride)；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostins)；UBC抑制剂；乌苯美司(ubenimex)；泌尿生殖窦源性生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；载体系统，红细胞基因治疗；维拉雷琐(velaresol)；藜芦明(veramine)；verdins；维替泊芬(verteporfin)；长春瑞滨(vinorelbine)；vinxaltine；vitaxin；伏氯唑(vorozole)；扎诺特隆(zanoterone)；泽尼铂(zeniplatin)；亚苄维czilascorb；和净司他丁酯(zinostatin stimalamer)。在一个实施方案中，抗癌药是5-氟尿嘧啶，泰素(taxol)或亚叶酸(leucovorin)。
在一些情况下，可以通过注射，导管等引入主题抗-WT1 CAR免疫应答细胞。在一些情况下，也可以包括免疫刺激剂，包括但不限于白介素，例如IL-2，IL-3，IL-6和IL-11，以及其他白介素，集落刺激因子，诸如G-，M-和GM-CSF，干扰素，例如γ-干扰素和促红细胞生成素。在一些情况下，可以用CAR-T，免疫耗竭剂和免疫刺激剂治疗受试者。可以用IL-2治疗受试者以增强CAR-T细胞产品的性能。在一些情况下，免疫刺激剂可以是重组蛋白。免疫刺激剂还可包含蛋白质的活性部分。在一些情况下，免疫刺激剂可仅包含蛋白质的一部分。蛋白质的一部分可以是蛋白质的约50％，60％，70％，80％，90％或高达约100％。
包含主题抗-WT1 CAR免疫应答细胞，诸如CAR T细胞的组合物可以方便地以无菌液体制剂的形式提供，例如等渗水溶液，悬浮液，乳剂，分散液或粘性组合物，其可以缓冲至选择的pH。液体制剂通常比凝胶，其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在某种程度上更方便施用，尤其是通过注射。另一方面，可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水，盐水，磷酸盐缓冲盐水，多元醇(例如甘油，丙二醇，液体聚乙二醇等)和它们的合适的混合物。无菌注射溶液可以通过将用于实施本发明的基因修饰的CAR免疫应答细胞与所需量的适当溶剂与不同量的其他成分混合而制备出，如所希望的。这样的组合物可以与合适的载体，稀释剂或赋形剂诸如无菌水，生理盐水，葡萄糖，右旋糖等混合。该组合物也可以是冻干的。所述组合物可含有辅助物质，诸如润湿剂，分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)，pH缓冲剂，胶凝剂或粘性增强添加剂，防腐剂，增香剂，着色剂等，这取决于施用的途径和所希望的制剂。可以参考标准教科书，诸如“雷明顿制药科学(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE)”，第17版，1985，通过引用将其并入本文，以制备合适的制剂，而无需过度的实验。可以添加可以增强组合物的稳定性和无菌性的不同添加剂，包括抗微生物防腐剂，抗氧化剂，螯合剂和缓冲剂。可以通过多种抗菌和抗真菌试剂，例如对羟基苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等来确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。然而，根据本发明，所使用的任何运载体，稀释剂或添加剂将必须与经基因修饰的CAR免疫应答细胞或其祖细胞相容。
在一些情况下，组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。本发明组合物的所希望的等渗性可以使用氯化钠或其他药学上可接受的试剂例如右旋糖，硼酸，酒石酸钠，丙二醇或其他无机或有机溶质来实现。特别优选氯化钠用于含有钠离子的缓冲液。如果希望，可使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘性保持在所选的水平。优选甲基纤维素，因为它可以容易且经济地获得并且易于使用。其他合适的增稠剂包括，例如，黄原胶，羧甲基纤维素，羟丙基纤维素，卡波姆(carbomer)等。增稠剂的优选浓度会取决于所选的试剂。重要的是要使用会达到所选粘度的用量。显然，合适载体和其他添加剂的选择会取决于施用的确切途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，是否将组合物配制成溶液，悬浮液，凝胶或其他液体形式，诸如定时释放形式或液体填充形式)。
在一些情况下，例如在治疗癌症的组合物，制剂和方法中，所施用的组合物或制剂的单位剂量可以是5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100mg。在一些情况下，所施用的组合物或制剂的总量可以是0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,4.5,5,5.5,6,6.5,7,7.5,8,8.5,9,9.5,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,40,50,60,70,80,90或100g。
在一些情况下，可以通过任何途径单独或与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用包含主题抗-WT1 CAR免疫应答细胞，诸如CAR T细胞的药物组合物，并且这样的施用可以单剂型地以及多剂型地进行。更具体地，药物组合物可以与片剂，胶囊，锭剂，糖锭，水果硬糖(hard candy)，散剂，喷雾剂，水性混悬剂，可注射溶液，酏剂，糖浆等形式的多种药学上可接受的惰性载体组合。这样的载体包括固体稀释剂或填充剂，无菌水性介质和各种无毒的有机溶剂等。此外，这样的口服药物制剂可以通过通常用于该目的的多种类型的试剂适当地变甜和/或调味。
例如，细胞可以与多种相关治疗方式(例如，之前，同时或之后)一起施用于患者，包括但不限于用下述试剂治疗，诸如抗病毒疗法，西多福韦(cidofovir)和白介素-2，或阿糖胞苷(也称为ARA-C)。在一些情况下，工程化细胞可与化学疗法，放射疗法，免疫抑制剂(诸如环孢菌素，硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，霉酚酸酯和FK506)，抗体或其他免疫消除剂(诸如CAMPATH)，抗CD3抗体或其他抗体疗法，细胞毒素，氟达拉滨(fludaribine)，环孢菌素，FK506，雷帕霉素(rapamycin)，mycoplienolic acid，类固醇，FR901228，细胞因子和辐射结合使用。工程化细胞的组合物还可以与骨髓移植，使用任何化学治疗剂诸如氟达拉滨，外部束放射疗法(XRT)，环磷酰胺，或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)的T细胞消除疗法联合(例如，之前，同时或之后)施用于患者。在一些情况下，工程化细胞的组合物可以在B细胞消除疗法后施用，诸如与CD20反应的药剂，例如Rituxan。例如，受试者可以接受高剂量化学疗法的标准治疗，接着进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者可以接受输注工程化细胞，例如经扩增的工程化细胞。另外，可以在手术之前或之后施用经扩增的工程化细胞。通过本文描述的任何一种方法获得的工程化细胞可用于需要针对宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主疾病(GvHD)治疗的患者。因此，可以考虑一种需要针对宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主疾病(GvHD)治疗的受试者的方法，包括通过向所述患者施用有效量的工程化细胞来治疗所述患者，所述工程化细胞包含非活化的TCRα和/或TCRβ基因。
试剂盒
本文公开的可以是包含组合物的试剂盒。本文还公开了用于治疗或预防癌症，病原体感染，免疫病症或同种异体移植的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒可包含治疗或预防性组合物，其含有有效量的细胞，该细胞包含一种或多种单位剂型的抗WT1抗原结合单元或抗WT1 CAR。在一些实施方案中，试剂盒包括无菌容器，该无菌容器可以包含治疗或预防性疫苗；这样的容器可以是盒子，安瓿，瓶子，小瓶，管，袋，小袋，泡罩包装或本领域已知的其他合适的容器形式。这样的容器可以由塑料，玻璃，层压纸，金属箔或其他适合于存储药物的材料制成。在一些情况下，主题抗WT1 CAR免疫应答细胞(诸如CAR T细胞)可以与将CAR免疫应答细胞施用于受试者的说明书一起提供，所述受试者具有癌症，病原体感染，免疫病症或同种异体移植或处于发展癌症，病原体感染，免疫病症或同种异体移植的风险中。该说明书通常会包括有关该组合物用于治疗或预防癌症，病原体感染，免疫病症或同种异体移植的信息。在一些情况下，试剂盒可包含约1×104个细胞至约1×1012个细胞。在一些情况下，试剂盒可包含至少约1×105个细胞，至少约1×106个细胞，至少约1×107个细胞，至少约4×107个细胞，至少约5×107个细胞，至少约6×107个细胞，至少约6×107个细胞，至少约8×107个细胞，至少约9×107个细胞，至少约1×108个细胞，至少约2×108个细胞，至少约3×108个细胞，至少约4×108个细胞，至少约5×108个细胞，至少约6×108个细胞，至少约6×108个细胞，至少约8×108个细胞，至少约9×108个细胞，至少约1×109个细胞，至少约2×109个细胞，至少约3×109个细胞，至少约4×109个细胞，至少约5×109个细胞，至少约6×109个细胞，至少约6×109个细胞，至少约8×109个细胞，至少约9×109个细胞，至少约1×1010个细胞，至少约2×1010个细胞，至少约3×1010个细胞，至少约4×1010个细胞，至少约5×1010个细胞，至少约6×1010个细胞，至少约6×1010个细胞，至少约8×1010个细胞，至少约9×1010个细胞，至少约1×1011个细胞，至少约2×1011个细胞，至少约3×1011个细胞，至少约4×1011个细胞，至少约5×1011个细胞，至少约6×1011个细胞，至少约6×1011个细胞，至少约8×1011个细胞，至少约9×1011个细胞，或至少约1×1012个细胞。例如，试剂盒中可包含约5×1010个细胞。在另一个实例中，试剂盒可以包括3×106个细胞。细胞可以扩增至约5×1010个细胞并施用于受试者。
在一些情况下，试剂盒可包括同种异体细胞。在一些情况下，试剂盒可包括可包含基因组修饰的细胞。在一些情况下，试剂盒可包含“现货”细胞。在一些情况下，试剂盒可包括可扩增用于临床的细胞。在一些情况下，试剂盒可含有用于研究目的的内容物。
在一些情况下，说明书包括以下至少一项：治疗剂的描述；用于治疗或预防瘤形成，病原体感染，免疫病症或同种异体移植，或它们的症状的给药方案和施用；预防措施；警告；适应症；不适应症(counter-indication)；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。这些说明书可以直接打印在容器上(如果有的话)，或者作为粘贴在容器上的标签，或者作为单独的纸页，小册子，卡片或与容器一起提供的折叠的印刷品。在一些情况下，说明书提供了在施用化学治疗剂后，施用抗WT1抗原结合单元或抗WT1 CAR免疫应答细胞，诸如CAR T细胞的程序。在一些情况下，说明书提供了在施用化学治疗剂之前施用抗WT1抗原结合单元或抗WT1 CAR免疫应答细胞的程序。在一些情况下，说明书提供了在施用化学治疗剂的同时施用抗WT1抗原结合单元或抗WT1 CAR免疫应答细胞的程序。在一些情况下，说明书提供了在施用化学治疗剂后至少12小时，施用抗WT1抗原结合单元或抗WT1CAR免疫应答细胞的程序。在一些情况下，说明书提供了施用化学治疗剂后至少约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30小时或高达2天，3天，4天，5天，6天或7天，施用抗WT1抗原结合单元或抗WT1 CAR免疫应答细胞的程序。在一些情况下，说明书提供了在施用化学治疗剂后至少24小时，施用抗WT1抗原结合单元或抗WT1 CAR免疫应答细胞的程序。可以配制抗WT1抗原结合单元或抗WT1 CAR免疫应答细胞用于静脉内注射。可以配制抗WT1抗原结合单元或抗WT1 CAR免疫应答细胞，以进行动脉内注射到可能包含实体瘤的受试者的肝脏中。
在一些情况下，试剂盒可含有环磷酰胺和/或氟达拉滨，其分别被配制成以约60mg/kg至约80mg/kg和约25mg/m2至约35mg/m2的剂量施用于有需要的受试者。在一些情况下，试剂盒可含有儿科剂量的产品。
重组方法是本领域公知的。除非另有说明，否则本发明的实施采用分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域技术范围内。这样的技术已在文献中得到充分说明，诸如，“Molecular Cloning:A LaboratoryManual”,第二版(Sambrook等,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,编辑,1984)；“Animal Cell Culture”(Freshney,编辑,1987)；“Methods in Enzymology”(AcademicPress,Inc.)；“Handbook of Experimental Immunology”(Wei和Blackwell,编辑)；“GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller和Calos,编辑,1987)；“CurrentProtocols in Molecular Biology”(Ausubel等,编辑,1987)；“PCR:The PolymeraseChain Reaction”,(Mullis等,编辑,1994)；和“Current Protocols in Immunology”(Coligan等,编辑,1991)。这些技术适用于多核苷酸和多肽的生产，并且因此可以在制定和实施本发明时考虑。在以下各节中讨论了特别有用的技术。
本文公开的方法可以包含移植。移植可意指细胞产品的过继移植。移植可以是自体移植，同种异体移植，异种移植或任何其他移植。例如，移植可以是异种移植。移植也可以是同种异体移植。
在一些情况下，向受试者施用约5×1010个主题抗WT1 CAR免疫应答细胞。在一些实施方案中，约5×1010个细胞代表施用于受试者的细胞的中位数。在一些实施方案中，需要约5×1010个细胞来影响受试者的治疗应答。在一些实施方案中，至少约至少约1×107个细胞，至少约2×107个细胞，至少约3×107个细胞，至少约4×107个细胞，至少约5×107个细胞，至少约6×107个细胞，至少约6×107个细胞，至少约8×107个细胞，至少约9×107个细胞，至少约1×108个细胞，至少约2×108个细胞，至少约3×108个细胞，至少约4×108个细胞，至少约5×108个细胞，至少约6×108个细胞，至少约6×108个细胞，至少约8×108个细胞，至少约9×108个细胞，至少约1×109个细胞，至少约2×109个细胞，至少约3×109个细胞，至少约4×109个细胞，至少约5×109个细胞，至少约6×109个细胞，至少约6×109个细胞，至少约8×109个细胞，至少约9×109个细胞，至少约1×1010个细胞，至少约2×1010个细胞，至少约3×1010个细胞，至少约4×1010个细胞，至少约5×1010个细胞，至少约6×1010个细胞，至少约6×1010个细胞，至少约8×1010个细胞，至少约9×1010个细胞，至少约1×1011个细胞，至少约2×1011个细胞，至少约3×1011个细胞，至少约4×1011个细胞，至少约5×1011个细胞，至少约6×1011个细胞，至少约6×1011个细胞，至少约8×1011个细胞，至少约9×1011个细胞，或至少约1×1012个细胞。例如，可以将约5×1010个细胞施用于受试者。在另一个实例中，以3×106个细胞开始，可以将细胞扩增至约5×1010个细胞并施用于受试者。在一些情况下，细胞会扩增至足以治疗的数量。例如，5×107个细胞可以进行快速扩增以生成足够的数量用于治疗。在一些情况下，用于治疗的足够数量可以是5×1010。可以输注任何数量的细胞用于治疗。例如，受试者可以被输注1×106至5×1012(含)数量的细胞。可以给患者输注尽可能多的为其产生的细胞。在一些情况下，输注患者体内的细胞并非全部工程化的。例如，输注到患者中的至少90％的细胞可以是工程化的。在其他情况下，输注到患者中的至少40％的细胞可以是工程化的。在一些实施方案中，方法可以包含：计算和/或施用于受试者一定量的工程化细胞以影响受试者的治疗应答。在一些实施方案中，计算影响治疗应答所必需的工程化细胞的数量包含：细胞的活力和/或抗WT1 CAR转基因已经整合到细胞基因组中的效率。在一些实施方案中，为了影响受试者的治疗应答，施用于受试者的细胞可以是活细胞。在一些实施方案中，为了在受试者中产生治疗应答，至少约95％，至少约90％，至少约85％，至少约80％，至少约75％，至少约70％，至少约65％，至少约60％，至少约55％，至少约50％，至少约45％，至少约40％，至少约35％，至少约30％，至少约25％，至少约20％，至少约15％，至少约10％的细胞是活细胞。在一些实施方案中，为了影响受试者的治疗应答，施用于受试者的细胞可以是具有成功整合到细胞基因组中的一种或多种转基因的细胞。在一些实施方案中，为了在受试者中产生治疗应答，至少约95％，至少约90％，至少约85％，至少约80％，至少约75％，至少约70％，至少约65％，至少约60％，至少约55％，至少约50％，至少约45％，至少约40％，至少约35％，至少约30％，至少约25％，至少约20％，至少约15％，至少约10％的细胞已经将一种或多种CAR转基因成功整合到细胞基因组中。
在一些情况下，可以向受试者施用主题抗WT1 CAR免疫应答细胞，其中可以施用的CAR免疫应答细胞可以为约1至约35天大。例如，施用的细胞可以是1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34或高达40天大。CAR免疫应答细胞的年龄可以根据刺激时间考虑。CAR免疫应答细胞的年龄可以根据单采术的时间考虑。CAR免疫应答细胞的年龄可以根据转导的时间考虑。在一些实施方案中，可以施用于受试者的CAR免疫应答细胞是约10至约14或约20天大。在一些情况下，CAR免疫应答细胞的“年龄”可以通过端粒的长度来确定。例如，“年轻”CAR免疫应答细胞可以具有比“耗竭的”或“老的”CAR免疫应答细胞更长的端粒长度。不局限于特定理论，据信，免疫应答细胞在培养中每周损失的估计端粒长度为约0.8kb，而年轻CAR免疫应答细胞培养物可具有比约44天大的免疫应答细胞的端粒更长(约1.4kb)的端粒。不局限于特定理论，据信，更长的端粒长度可以与患者中的阳性的客观临床应答和体内细胞的持久性相关。
在一些情况下，从受试者生物体中分离细胞，用核酸(例如，基因或cDNA)转染细胞，然后重新输注到受试者生物体(例如，患者)中。
在移植之前，之后和/或期间的细胞(例如，工程化细胞或工程化的原代T细胞)可以是具有功能的。例如，移植的细胞可以在移植后的至少或至少约第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,6,27,28,29,30,40,50,60,70,80,90或100天具有功能。移植的细胞可以在移植后至少或至少约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个月具有功能。移植的细胞可以在移植后至少或至少约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25或30年具有功能。在一些情况下，移植的细胞可以在受体的整个生命周期具有功能。
此外，移植的细胞可以其正常预期功能的100％具有功能。移植的细胞也可以发挥其正常预期功能的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98或高达100％。
移植的细胞也可以发挥其正常预期功能的100％以上。例如，移植的细胞可以发挥其正常预期功能的110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,250,300,400,500,600,700,800,900,1000或高达约5000％。
移植可以通过任何类型的移植进行。部位可包括但不限于肝下囊间隙，脾下囊间隙，肾下囊间隙，网膜，胃或肠粘膜下层，小肠血管段，静脉囊，睾丸，脑，脾或角膜。例如，移植可以是囊下移植。移植也可以是肌内移植。移植可以是门内移植。
治疗后(例如，本文公开的任何治疗)，与当使一种或多种野生型细胞移植到接受体中相比，可以改善移植排斥。例如，移植排斥可以是超急性排斥。移植排斥也可以是急性排斥。其他类型的排斥可能包括慢性排斥。移植排斥也可以是细胞介导的排斥，或T细胞介导的排斥。移植排斥也可以是自然杀伤细胞介导的排斥。
改善移植可意指减轻超急性排斥，其可涵盖不良反应或症状的减少，减轻或减弱。移植可意指细胞产品的过继移植。
成功移植的另一个指标可以是接受体不需要免疫抑制疗法的天数。例如，在本文提供的处理(例如，移植)之后，接受体可以不需要免疫抑制疗法至少或至少约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10天或更多天。这可表明移植成功。这也可表明对移植的细胞，组织和/或器官没有排斥。
在一些情况下，受体可不需要免疫治疗至少需要1天。受体还可不需要免疫抑制疗法至少7天内。受体可不需要免疫抑制疗法至少14天。接受体可不需要免疫抑制疗法至少21天。受体可不需要免疫抑制疗法至少28天。接受体可不需要免疫抑制疗法至少60天。此外，接受体可不需要免疫抑制疗法至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多年。
成功移植的另一个指标可以是接受体需要减少免疫抑制疗法的天数。例如，在本文提供的所述治疗之后，接受体可需要减少免疫抑制疗法至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10天或更多天。这可以表明移植成功。这也可以表明对移植的细胞，组织和/或器官没有排斥反应或排斥反应极少。
例如，接受体可需要减少免疫抑制疗法至少1天。接受体也可需要减少免疫抑制疗法至少7天。接受体可需要减少免疫抑制疗法至少14天。接受体可需要减少免疫抑制疗法至少21天。接受体可需要减少免疫抑制疗法至少28天。接受体可需要减少免疫抑制疗法至少60天。此外，接受体可需要减少免疫抑制疗法至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10年或更多年。
当将一种或多种野生型细胞移植到接受体中时，降低的免疫抑制疗法可意指(与所需的免疫抑制疗法相比)更少的免疫抑制疗法。
免疫抑制疗法可包含抑制免疫系统的任何治疗。免疫抑制疗法可帮助缓解，减少或消除接受体的移植排斥。例如，免疫抑制疗法可包含免疫抑制药。可以在移植之前、期间和/或之后使用的免疫抑制药物包括但不限于MMF(吗替麦考酚酯，Cellcept)，ATG(抗胸腺细胞球蛋白)，抗CD154(CD4OL)，抗CD40(2C10，ASKP1240，CCFZ533X2201)，阿仑珠单抗(Campath)，抗CD20(利妥昔单抗)，抗IL-6R抗体(托珠单抗，Actemra)，抗IL-6抗体(sarilumab，olokizumab)，CTLA4-Ig(阿巴西普/Orencia)，贝拉西普(belatacept，LEA29Y),西罗莫司(Rapimune)，依维莫司(everolimus)，他克莫司(Prograf)，达克珠单抗(Ze-napax)，巴利昔单抗(Simulect)，英利昔单抗(Remicade)，环孢素，脱氧精胍菌素，可溶性补体受体1，眼镜蛇毒因子，坎普他汀(compstatin)，抗C5抗体(依库珠单抗/Soliris)，甲泼尼龙，FTY720，依维莫司，来氟米特，抗IL-2R-Ab，雷帕霉素，抗CXCR3抗体，抗ICOS抗体，抗OX40抗体和抗CD122抗体。此外，可以一起或顺序使用一种或一种以上的免疫抑制剂/药物。一种或一种以上的免疫抑制剂/药物可用于诱导疗法或维持疗法。在诱导和维持阶段可以使用相同或不同的药物。在一些情况下，达克珠单抗(Zenapax)可用于诱导治疗，而他克莫司(Prograf)和西罗莫司(Rapimune)可用于维持治疗。达克珠单抗(Zenapax)也可用于诱导治疗，低剂量他克莫司(Prograf)和低剂量西罗莫司(Rapimune)可用于维持治疗。免疫抑制也可以使用非药物方案来实现，包括但不限于全身放射治疗，胸腺放射治疗以及全部和/或部分脾切除术。这些技术也可以与一种或多种免疫抑制药物组合使用。
实施例
通过参考以下示例性实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅出于示例说明的目的，并且除非另有说明，否则不意图限制。因此，本发明决不应解释为限于以下实施例，而是应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。
实施例1：HLA-肽复合物的制备
HLA.A0201-BSP基因是在体外合成的(SEQ ID NO:32)。如图1所示，该融合基因从N端到C端包含用于编码HLA.A0201分子的胞外区，而没有信号肽(SEQ ID NO:34)，一种短“GS”接头，和生物素蛋白连接酶BirA底物肽(BSP)。通过将NdeI/Bam H I消化的融合基因插入到pET-22b表达载体中来构建pET22b-HLA.A0201-BSP。
通过合成体外人β2m基因(SEQ ID NO:33)，并将NdeI/Bam H I消化的基因插入pET-22b表达质粒，类似地构建人β2m表达载体(pET22b-β2m)。
然后将pET22b-HLA.A0201-BSP和pET22b-β2m转化到BL21中，并将具有高表达水平的pET22b-HLA和pET22b-β2m的菌株在摇床上在2YT培养基中在37℃生长过夜。在第2天，将过夜培养物接种到2YT培养基中，终浓度为50μg/ml，并在250rpm的摇床上在37℃生长3小时。一旦OD600为约0.8，则添加异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM。在37℃和220rpm将混合物培养成肽4小时。通过在4℃离心(8,000rpm)收集细胞，并将其以40ml缓冲液/400ml细胞重悬于缓冲液(50mM Tris，25％蔗糖，10mM DTT，1mMEDTA，1％Triton X-100和1mM PMSF，pH8.0)中。然后将悬浮液通过超声(99*3s，间隔3s，400W)均质化共3次。通过以13,000rpm(15分钟)离心来收集上清液。
分别从200μl的对照培养物和表达培养物中收获细胞，并在4℃离心(8,000rpm)。然后将细胞重悬于30μl上样缓冲液中，煮沸10分钟，然后以13,000rpm离心2分钟。6μl上清液用于电泳以验证表达。
对均质化的细胞(6μl)分别进行上清液(可溶性，S)和沉淀物(不溶性，I)的电泳。SDS-PAGE验证了包涵体中HLA和β2m的表达。
将由均质化所得的沉淀重悬于缓冲液(50mM Tris，1m MDTT，1m MEDTA，0.5％Triton X-100和0.1M NaCl；pH8.0)中，在4℃振荡2h，然后以13,000rpm离心15分钟以收集沉淀物。将沉淀物洗涤5次直至包涵体变白。
然后将洗涤后的包涵体重悬浮于30ml的10mM Tris和pH 8.0的8M尿素中。震荡并离心后，将上清液上样到1.5ml Q柱上。用5倍柱体积(CV)的缓冲液(10mM Tris和8M尿素；pH8.0)平衡该柱。通过Q柱洗脱30ml的样品，收集流过物。通过流过该柱另一个电导率为3的15ml的缓冲液(10mM Tris和8M尿素；pH8.0)收集E1；通过流过另一个电导率为5的15ml缓冲液(10mM Tris和8M尿素；pH8.0)收集E2；通过另一个电导率为7的15ml缓冲液(10mM Tris和8M尿素；pH8.0)收集E3。
通过结合E1和E2获得HLA馏分，并通过结合流过物和E2获得β2m级分。将2mM DTT和1mM EDTA添加到级分中，并将蛋白质在室温重折叠2h。通过超滤将HLA和β2m浓缩至各自约10mg/ml的最终浓度，并保持在-80℃。
表7的肽，购自GL Biochem(上海)有限责任公司，用于制备不同的HLA-肽复合物。RMF是WT1的126-134片段。无关的肽YLL来自LMP-1。这些复合物用于确认本文公开的抗体的特异性。
表7
用重折叠缓冲液(0.1M Tris，2mM EDTA，5mM GSH，0.5mM SSG和0.2mM PMSF；pH8.0)重折叠表6的肽，并用补充有5％甘油的PBS缓冲液透析。然后通过超滤浓缩肽，每种肽达到约1.8ml的最终体积。浓缩的肽用Superdex75色谱纯化。结果示于图2。峰1对应于未复合的HLA多肽。峰2对应于HLA-WT1肽复合物。峰3对应于未复合的β2m。
然后用生物素化试剂盒(BirA，溶液A，溶液B，d-生物素；Avidity，Colorado，USA)标记复合物。
实施例2：使用全人噬菌体展示文库筛选特异地结合RMF/HLA复合物的scFv产生展示与HLA复合的WT1肽(RMF)(SEQ ID NO:1)的噬菌体文库，并用于筛选特异地结合该复合物的scFv。分离出许多具有连接VH和VL片段的接头(SEQ ID NO:53)的scFv。
实施例3：ABU1和ABU2的结合亲和力分析
通过进行ELISA测定(图3)和FACS分析(图4)，评价了被称为抗原结合单元1(ABU1)和ABU2的选择scFv对与HLA复合的WT1肽(RMF)的结合亲和力。
图3描绘了来自示例ELISA测定的结果。如图3所示，证明ABU1和ABU2对RMF/HLA.A0201复合物具有高度特异性。
图4描绘了来自示例结合亲和力测定的FACS结果。在该实施例中参比(REF)scFv(SEQ ID NO:60)评价ABU1和ABU2。使用固有为WT1阴性和HLA阳性的T2细胞系。然后工程化T2以表达WT1肽(T2/RMF)，YLL阴性对照(T2/YLL)，参比肽RMFS1(T2/RMFS1)或参比肽RMFS2(T2/RMFS2)。ABU1和ABU2都特异地结合与HLA(T2/RMF)复合的WT1肽。与ABU2相比，参比抗原结合单元(REF)对RMFS1和RMFS2具有更高的非特异性结合。
实施例4：亲和力成熟
进行亲和力成熟，并导致产生ABU3，ABU4和ABU5。评价ABU3-5和ABU2与WT1肽(RMF/HLA复合物)的结合亲和力。使用2.5μg/ml RMF，0.5μg/ml RMF，0.2μg/ml RMF或2.5μg/mlYLL的示例ELISA实验得到的数据在图5中描绘。如图5所示，在所有测试的抗原结合单元中保留有特异性。
对ABU2，ABU3，ABU4和ABU5进行测序，并且在图6中描绘可变轻链和可变重链区的示例比对。这些区域包含重链CDR HCDR1,HCDR2和HCDR3，以及轻链CDR LCDR1,LCDR2和LCDR3。
实施例5：使用表面等离子体共振的亲和力测定
通过表面等离振子共振(T200,BIAcore,Inc)进一步评价亲和力成熟的ABU3的结合亲和力，并将其与亲本ABU2进行比较。在图7中描绘来自示例实验的数据，其用BIAevaluation3.2，并用1:1Langmuir模型拟合的动力学曲线进行了分析。
实施例6：使用前沿亲和色谱法(FAC)进行抗体与不同细胞系的结合测定
使用多种细胞系进一步评价亲和力成熟的ABU3，ABU4和ABU5以及亲本ABU2的结合亲和力，并且示例实验的结果在图8中描绘。
H2452是间皮瘤细胞系，其为WT1阳性和HLA阳性。
SW480是结肠癌细胞系，其为WT1阳性和HLA阳性。
SKOV3是卵巢癌细胞系，其为WT1阳性和HLA阳性。
BV173是费城染色体(Ph1)阳性的急性白血病细胞系，其为WT1阳性和HLA阳性。
K562是红白血病细胞系，其为WT1阳性和HLA阴性。
T2是体细胞杂交细胞，其为WT1阴性和HLA阳性。
如图8所示，REF不但与WT1阳性和HLA阳性细胞系结合，而且与WT1阳性和HLA阴性细胞系结合。相反，ABU2-5与WT1阳性和HLA阳性细胞系显著结合，但不与WT1阴性或HLA阴性细胞系结合。
实施例7：ADCC测定
使用CytoTox 96(Promega,Madison,USA)通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定确定抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。用CD16a稳定转染的NK96细胞用作效应细胞，表达WT！HLA-A0201和HLA-A0201的H2452和SW480用作靶细胞。测试了Fc-scFv形式的ABU3-5的ADCC活性，并计算为(其中，spon.release表自发释放)：
实施例8：WT1 CAR-T细胞的构建
使用pRRLSIN-cPPT.EF-1α克隆表达多种基于ABU3的嵌合抗原受体的慢病毒质粒，包含：pRRLSIN-cPPT.EF-1α-1A4-28Z,pRRLSIN-cPPT.EF-1α-1A4-BBZ,pRRLSIN-cPPT.EF-1α-1A4-28BBZ,pRRLSIN-cPPT.EF-1α-1A4-28Z-F2A-EGFP,pRRLSIN-cPPT.EF-1α-1A4-BBZ-F2A-EGFP,和pRRLSIN-cPPT.EF-1α-1A4-28BBZ-F2A-EGFP。构建出ABU3-28Z的核酸序列，以具有编码CD8α信号传导结构域(SEQ ID NO:35)，ABU3 scFv(SEQ ID NO:37)和CD8铰链(SEQID NO:39)，CD28跨膜结构域(SEQ ID NO:41)，CD28胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:43)和CD3Z(SEQ ID NO:45)的构件(buildung block)。构建ABU3-28BBZ的核酸序列以具有编码CD8α信号传导结构域(SEQ ID NO:35)，ABU3 scFv(SEQ ID NO:37)，和CD8铰链(SEQ ID NO:39)，CD28跨膜结构域(SEQ ID NO:41)，CD28胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:43)，CD137胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:49)和CD3Z(SEQ ID NO:45)的构件。使用pRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP作为对照。
然后使用pRSV-REV，pMDLg-RRE和VSV-G(Addgene，Cambridge，MA，USA)包装表达ABU3 CAR的慢病毒质粒，并转染到293T细胞中(ATCC：CRL-11268)。转染的细胞在37℃生长72小时，并收集上清液以浓缩病毒。进行滴定以确定慢病毒的滴度。然后将浓缩的慢病毒以MOI＝15(32℃，1,800rpm)转导到活化的T细胞中。通过流式细胞术通过EGFP确定ABU3-CAR的表达。对照和ABU3 CAR(ABU3-28Z，ABU3-BBZ和ABU3-28BBZ)的转导效率确定为68.41％，58.3％，70.7％和32.6％。
评价抗WT1 CAR T细胞ABU3-28Z和ABU3-BBZ的细胞毒性，并与阴性对照(UTD)进行比较。示例实验的结果在图10A和图10B中示出。H2452是间皮瘤细胞系，其为WT1阳性和HLA阳性。SW480是结肠癌细胞系，其为WT1阳性和HLA阳性。如图10A和10B所示，通过对SW480和NCI-H2452的细胞毒性证实CAR T细胞。
针对ABU2，ABU4和ABU5构建了另外的CAR T细胞，并证实其对SW480和NCI-H2452是具有细胞毒性的。
实施例9：双功能抗体
产生能够特异地结合与HLA复合的WT1肽以及CD3的双功能抗体(ABU6)。具体地，在示例实验中，使用正向引物ABU3-PF(SEQ ID NO:54)和反向引物ABU3-PR(SEQ ID NO:55)从模板(V152-ABU3-huFC质粒)扩增抗WT1 scFv(ABU3)的片段1。用引物PCMV(SEQ ID NO:56)和PH-R(SEQ ID NO:57)从PIH-hu9F2-CD3质粒(CN201610626384.7)扩增抗CD3 scFv的片段2。将片段1和片段2连结并用PCMV和ABU3-PR扩增。用BamHI/NheI消化所得的scFv并将其插入消化的PIH-hu9F2-CD3质粒中得到了双功能的scFv(SEQ ID NO:63)。C端的6个连续His允许其通过Ni-NTA亲和色谱被纯化。然后将双功能scFv转染到293F细胞中，并通过Ni-NTA亲和色谱纯化。SDS PAGE结果显示在图9中，WT1/CD3双功能scFv显示为约55kDa的条带。
实施例10：表达IL-12的WT CAR-T细胞
根据与实施例8-9类似的方法构建图11所示的ABU3-28Z-IL12 CAR载体。进行ABU3(SEQ ID NO:37)，CD28跨膜结构域(SEQ ID NO:41)，和胞内结构域(SEQ ID NO:43)，CD3Z(SEQ ID NO:35)和EGFP(SEQ ID NO:78)的PCR扩增以提供ABU3-28Z-GFP片段，然后经由酶促切割将其插入pRRLSIN载体以提供ABU3-28Z-GFP CAR载体。经由PCT扩增IL-2启动子序列(SEQ ID NO:77)和IL-12基因序列(SEQ ID NO:76)以提供IL2-IL12序列，然后将其插入到pRRLSIN载体中以提供ABU3-28Z-IL12 CAR载体。已打包VRRLSIN-ABU3-28Z-IL12慢病毒。活化T细胞并用慢病毒转导，以提供ABU3-28Z-IL12 CAR T细胞。
将人结肠癌细胞系SW480，人间皮瘤细胞系H2452和卵巢癌细胞系OVCAR3用作靶细胞，以确定ABU3-28Z-IL12 CAR T细胞的体外细胞杀伤作用。以分别为20:1,10:1和5:1的效应子:靶标(E:T)的比例加入CAR T细胞，并在体外培养18小时。使用非放射性细胞毒性测定试剂盒(Non-RadioactiveCytotoxicity Assay Kits)，结果在图12A-C中显示。对于各个测试的E:T比例，ABU3-28Z-IL-12CAR-T细胞比ABU3-28Z CAR-T细胞和UTD细胞具有更大的细胞毒性。
表8：序列
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序列表
<110> 克莱格医学有限公司
<120> 细胞免疫治疗的组合物和方法
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<170> PatentIn version 3.5
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Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
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Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly
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Gly
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Leu Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val
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Gly Ser Asp Ser Gly Pro Val Thr Arg Gly His Tyr Pro Tyr
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Asp Thr Ser Arg Lys His Ser
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Leu Val Val Pro Ala Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe Gln
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Gly
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Leu Val Val Pro Asp Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe Gln
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Gly
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Gly Trp Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 19
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caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggaggt 300
agcagtggct ggtacaactg gttcgacccc tggggcagag gaaccctggt caccgtctcg 360
agt 363
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 20
Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
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ggggtgcagc tggtggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggactt gttgatcctg aagatggtga aacaatatac 180
gcagagaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tacagaccta 300
gcagctggta ctaatgacta ctggggcaaa ggcaccctgg tcaccgtctc gagt 354
<210> 22
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<212> PRT
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Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Val Pro Ala Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
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ggggtgcagc tggtggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggactt gttgtacctg ccgacggtga aacaatttac 180
gcagagaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tacagaccta 300
gcagctggta ctaatgacta ctggggcaaa ggcaccctgg tcaccgtctc gagt 354
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Val Pro Asp Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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ggggtgcagc tggtggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggacta gttgttcctg atgatggtga aacaatatac 180
gcagagaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tacagaccta 300
gcagctggta ctaatgacta ctggggcaaa ggcaccctgg tcaccgtctc gagt 354
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Met Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Val Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Ile Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
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<223> 人工序列描述：人工合成序列
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gaaattgtga tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagggccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gattgttatg agcaacttct tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca ggagggtcac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcagtc tcatcatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caatatggta gctcaccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acgt 324
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列描述：人工合成序列
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Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Lys His Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Leu Ser Tyr Ser Gly
85 90 95
Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 29
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 29
caggctgtgg tgactcagga gccctcagtg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60
acctgtggct ccgacactgg agctgtcacc agtggtcatt atccctactg gttccagcag 120
aagcctggcc aagcccccag gacactgatt tatgatacaa gcaacaaaca ctcctggaca 180
cctgcccggt tctcaggctc cctccttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240
cagcctgacg atgaggctga ctattactgc ttgctctcct atagtggtga atgggtgttc 300
ggcggaggga ccaaagtcac cgtccta 327
<210> 30
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 30
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Ser Gly Pro Val Thr Arg Gly
20 25 30
His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr
35 40 45
Leu Ile Asp Asp Thr Ser Arg Lys His Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Leu Ser Tyr Ser Gly
85 90 95
Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 31
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 31
caggctgtgg tgactcagga gccctcagtg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60
acctgtggct ccgactctgg accggtcacc cgagggcatt acccctactg gttccagcag 120
aagcctggcc aagcccccag gacactgatt gatgatacaa gccgcaaaca ctcctggaca 180
cctgcccggt tctcaggctc cctccttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240
cagcctgacg atgaggctga ctattactgc ttgctctcct atagtggcga atgggtgttc 300
ggcggaggga ccaaagtcac cgtccta 327
<210> 32
<211> 901
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 32
atacatatgg gtagccatag catgcgctat tttttcacca gcgttagccg tccgggtcgt 60
ggtgaaccgc gttttattgc agttggttat gttgatgata cccagtttgt gcgctttgat 120
agtgatgcag caagccagcg tatggaaccg cgtgcaccgt ggattgaaca agaaggtccg 180
gaatattggg atggtgaaac ccgtaaagtt aaagcacata gccagaccca tcgtgttgat 240
ctgggcaccc tgcgtggcta ttataaccag agcgaagcag gttcacatac cgttcagcgt 300
atgtatggtt gtgatgttgg tagcgattgg cgttttctgc gtggttatca tcagtatgcc 360
tatgatggca aagattatat cgccctgaaa gaagatctgc gtagctggac cgcagcagat 420
atggcagcac agaccaccaa acataaatgg gaagcagcac atgttgcaga acagctgcgt 480
gcatatctgg aaggcacctg tgttgaatgg ctgcgtcgtt atctggaaaa tggtaaagaa 540
accctgcagc gtaccgatgc accgaaaacc cacatgaccc atcatgcagt tagcgatcat 600
gaagcaaccc tgcgttgttg ggcactgagc ttttatccgg cagaaatcac cctgacctgg 660
cagcgtgatg gtgaagatca gacccaggat accgaactgg ttgaaacacg tcctgccggt 720
gatggcacct ttcagaaatg ggcagcagtt gttgttccga gcggtcaaga acagcgttat 780
acctgtcatg ttcagcatga aggtctgccg aaaccgctga ccctgcgctg ggaaggtagc 840
ggtctgaatg atatttttga agcccagaaa atcgaatggc acgagtaata aggatccgcg 900
c 901
<210> 33
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 33
atatccatat gattcagcgt accccgaaaa ttcaggttta tagccgtcat ccggcagaaa 60
atggtaaaag caattttctg aattgctacg tgagcggttt tcatccgagc gatattgaag 120
ttgatctgct gaaaaatggc gaacgcattg aaaaagttga acatagcgat ctgagcttta 180
gcaaagattg gagcttttat ctgctgtact ataccgaatt taccccgacc gaaaaagatg 240
aatatgcctg tcgtgttaat catgttaccc tgagccagcc gaaaattgtt aaatgggatc 300
gtgatatgta ataaggatcc agtcg 325
<210> 34
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 34
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
50 55 60
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu
115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
130 135 140
His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His
180 185 190
Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp Glu
275
<210> 35
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 35
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 36
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 36
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 37
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 37
ggggtgcagc tggtggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggactt gttgatcctg aagatggtga aacaatatac 180
gcagagaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tacagaccta 300
gcagctggta ctaatgacta ctggggcaaa ggcaccctgg tcaccgtctc gagtggtgga 360
ggcggttcag gcggaggtgg ttctggcggt ggcggatcgc aggctgtggt gactcaggag 420
ccctcagtga ctgtgtcccc aggagggaca gtcactctca cctgtggctc cgactctgga 480
ccggtcaccc gagggcatta cccctactgg ttccagcaga agcctggcca agcccccagg 540
acactgattg atgatacaag ccgcaaacac tcctggacac ctgcccggtt ctcaggctcc 600
ctccttgggg gcaaagctgc cctgaccctt tcgggtgcgc agcctgacga tgaggctgac 660
tattactgct tgctctccta tagtggcgaa tgggtgttcg gcggagggac caaagtcacc 720
gtccta 726
<210> 38
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 38
Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Ser Gly
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Asp Asp Thr Ser Arg Lys His Ser Trp
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Val Leu
<210> 39
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 39
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 40
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 40
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 41
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 41
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 42
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 42
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 43
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 43
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggccaaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 44
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 44
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 45
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 45
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339
<210> 46
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 46
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 47
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 47
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
acc 63
<210> 48
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 48
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 49
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 49
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 50
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 50
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 51
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 51
ggggtgcagc tggtggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggacta gttgttcctg atgatggtga aacaatatac 180
gcagagaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tacagaccta 300
gcagctggta ctaatgacta ctggggcaaa ggcaccctgg tcaccgtctc gagtggtgga 360
ggcggttcag gcggaggtgg ttctggcggt ggcggatcgc aggctgtggt gactcaggag 420
ccctcagtga ctgtgtcccc aggagggaca gtcactctca cctgtggctc cgacactgga 480
gctgtcacca gtggtcatta tccctactgg ttccagcaga agcctggcca agcccccagg 540
acactgattt atgatacaag caacaaacac tcctggacac ctgcccggtt ctcaggctcc 600
ctccttgggg gcaaagctgc cctgaccctt tcgggtgcgc agcctgacga tgaggctgac 660
tattactgct tgctctccta tagtggtgaa tgggtgttcg gcggagggac caaagtcacc 720
gtccta 726
<210> 52
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 52
Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Val Pro Asp Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Thr Gly
145 150 155 160
Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Lys His Ser Trp
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Val Leu
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 53
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 54
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 54
gctttggttt ccaggtgcaa gatgtggggt gcagctggtg gagt 44
<210> 55
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 55
gatatcggat ccaccacctc ctaggacggt gactttggtc c 41
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 56
ggctaactag agaacccact gc 22
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 57
acatcttgca cctggaaacc aaagc 25
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 58
Arg Met Phe Pro Thr Pro Pro Ser Leu
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 59
Arg Met Phe Pro Gly Glu Val Ala Leu
1 5
<210> 60
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 60
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Asp Pro Trp Gly Gln Glu Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
130 135 140
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile
145 150 155 160
Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
165 170 175
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
195 200 205
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Pro Gly
210 215 220
Thr Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
225 230 235
<210> 61
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 61
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
35 40 45
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
50 55 60
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
65 70 75 80
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro
85 90 95
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
100 105 110
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
115 120 125
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
130 135 140
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145 150
<210> 62
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 62
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
35 40 45
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
50 55 60
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
65 70 75 80
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn
85 90 95
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
100 105 110
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
115 120 125
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
130 135 140
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145 150 155
<210> 63
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 63
Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Ser Gly
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Asp Asp Thr Ser Arg Lys His Ser Trp
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala
245 250 255
Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser
260 265 270
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro
275 280 285
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr
290 295 300
Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp
305 310 315 320
Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
325 330 335
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys
340 345 350
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp
370 375 380
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
385 390 395 400
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
405 410 415
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
420 425 430
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
435 440 445
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
450 455 460
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
465 470 475 480
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His
485 490 495
<210> 64
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 64
ggggtgcagc tggtggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggactt gttgatcctg aagatggtga aacaatatac 180
gcagagaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tacagaccta 300
gcagctggta ctaatgacta ctggggcaaa ggcaccctgg tcaccgtctc gagtggtgga 360
ggcggttcag gcggaggtgg ttctggcggt ggcggatcgc aggctgtggt gactcaggag 420
ccctcagtga ctgtgtcccc aggagggaca gtcactctca cctgtggctc cgactctgga 480
ccggtcaccc gagggcatta cccctactgg ttccagcaga agcctggcca agcccccagg 540
acactgattg atgatacaag ccgcaaacac tcctggacac ctgcccggtt ctcaggctcc 600
ctccttgggg gcaaagctgc cctgaccctt tcgggtgcgc agcctgacga tgaggctgac 660
tattactgct tgctctccta tagtggcgaa tgggtgttcg gcggagggac caaagtcacc 720
gtcctaggag gtggtggatc cgatatcaaa ctgcagcagt caggggctga actggcaaga 780
cctggggcct cagtgaagat gtcctgcaag acttctggct acacctttac taggtacacg 840
atgcactggg taaaacagag gcctggacag ggtctggaat ggattggata cattaatcct 900
agccgtggtt atactaatta caatcagaag ttcaaggaca aggccacatt gactacagac 960
aaatcctcca gcacagccta catgcaactg agcagcctga catctgagga ctctgcagtc 1020
tattactgtg caagatatta tgatgatcat tactgccttg actactgggg ccaaggcacc 1080
actctcacag tctcctcagt cgaaggtgga agtggaggtt ctggtggaag tggaggttca 1140
ggtggagtcg acgacattca gctgacccag tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg 1200
gagaaggtca ccatgacctg cagagccagt tcaagtgtaa gttacatgaa ctggtaccag 1260
cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg atttatgaca catccaaagt ggcttctgga 1320
gtcccttatc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctcat actctctcac aatcagcagc 1380
atggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccaacagt ggagtagtaa cccgctcacg 1440
ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa catcatcacc atcatcat 1488
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 65
Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu
1 5
<210> 66
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 66
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
35 40 45
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
50 55 60
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
65 70 75 80
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
85 90 95
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
100 105 110
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
115 120 125
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
130 135 140
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
145 150 155 160
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
165 170 175
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
180 185 190
Leu Pro Pro Arg
195
<210> 67
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 67
Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Ser Gly
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Asp Asp Thr Ser Arg Lys His Ser Trp
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe
275 280 285
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
290 295 300
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
340 345 350
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
355 360 365
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
370 375 380
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
385 390 395 400
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
420 425 430
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
435 440 445
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
450 455 460
Leu Pro Pro Arg
465
<210> 68
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 68
Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Ser Gly
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Asp Asp Thr Ser Arg Lys His Ser Trp
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
275 280 285
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
290 295 300
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
305 310 315 320
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
325 330 335
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
340 345 350
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
355 360 365
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
370 375 380
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
385 390 395 400
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
405 410 415
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
420 425 430
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
435 440 445
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
450 455 460
Arg
465
<210> 69
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 69
Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Ser Gly
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Asp Asp Thr Ser Arg Lys His Ser Trp
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe
275 280 285
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
290 295 300
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
340 345 350
Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
355 360 365
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
370 375 380
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
385 390 395 400
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
420 425 430
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 70
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 70
Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Thr Gly
145 150 155 160
Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Lys His Ser Trp
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe
275 280 285
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
290 295 300
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
340 345 350
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
355 360 365
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
370 375 380
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
385 390 395 400
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
420 425 430
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
435 440 445
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
450 455 460
Leu Pro Pro Arg
465
<210> 71
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 71
Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Thr Gly
145 150 155 160
Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Lys His Ser Trp
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
275 280 285
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
290 295 300
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
305 310 315 320
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
325 330 335
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
340 345 350
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
355 360 365
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
370 375 380
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
385 390 395 400
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
405 410 415
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
420 425 430
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
435 440 445
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
450 455 460
Arg
465
<210> 72
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 72
Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Thr Gly
145 150 155 160
Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Lys His Ser Trp
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe
275 280 285
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
290 295 300
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
340 345 350
Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
355 360 365
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
370 375 380
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
385 390 395 400
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
420 425 430
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 73
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 73
Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Val Pro Ala Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Thr Gly
145 150 155 160
Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Lys His Ser Trp
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe
275 280 285
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
290 295 300
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
340 345 350
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
355 360 365
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
370 375 380
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
385 390 395 400
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
420 425 430
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
435 440 445
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
450 455 460
Leu Pro Pro Arg
465
<210> 74
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 74
Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Val Pro Ala Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Thr Gly
145 150 155 160
Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Lys His Ser Trp
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
275 280 285
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
290 295 300
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
305 310 315 320
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
325 330 335
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
340 345 350
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
355 360 365
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
370 375 380
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
385 390 395 400
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
405 410 415
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
420 425 430
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
435 440 445
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
450 455 460
Arg
465
<210> 75
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 75
Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Val Pro Ala Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Thr Gly
145 150 155 160
Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Lys His Ser Trp
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe
275 280 285
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
290 295 300
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
340 345 350
Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
355 360 365
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
370 375 380
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
385 390 395 400
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
420 425 430
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 76
<211> 1620
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 76
ggaagcattc agatagctca tcactctatc aatagtcact gcccgaattc tgaaagcatg 60
aagaagtatg cagagcttga ttttagtttt ataaaaatcc ggttcttcaa gggaggattt 120
ttgtggcaca gtctcactgt tgaaattcag ggcctgcatc agctcatcaa taactgccag 180
catgttttga tctagaaaga tctgcctctt aggatccatc agaagctttg cattcatggt 240
cttgaactcc acctggtaca tcttcaagtc ttcataaata ctactaaggc acagggccat 300
cataaaagag gtctttctgg aggccaggca actcccatta gttatgaaag aggtctctct 360
ggaatttagg caactctcat tcttggttaa ttccaatggt aaacaggcct ccactgtgct 420
ggttttatct tttgtgatat cttcatgatc aatctcttca gaagtgcaag ggtaaaattc 480
tagagtttgt ctggccttct ggagcatgtt gctgacggcc ctcagcaggt tttgggagtg 540
gtgaaggcat gggaacattc ctgggtctgg agtggccacg gggaggtttc tagatccgcc 600
gccacccgac ccaccaccgc ccgagccacc gccaccactg cagggcacag atgcccattc 660
gctccaagat gagctatagt agcggtcctg ggcccgcacg ctaatgctgg catttttgcg 720
gcagatgacc gtggctgagg tcttgtccgt gaagactcta tctttctttt ctctcttgct 780
cttgccctgg acctgaacgc agaatgtcag ggagaagtag gaatgtggag tactccaggt 840
gtcagggtac tcccagctga cctccacctg ccgagaattc tttaatggct tcagctgcaa 900
gttcttgggt gggtcaggtt tgatgatgtc cctgatgaag aagctgctgg tgtagttttc 960
atacttgagc ttgtgaacgg catccaccat gacctcaatg ggcagactct cctcagcagc 1020
tgggcaggca ctgtcctcct ggcactccac tgagtactca tactccttgt tgtcccctct 1080
gactctctct gcagagagtg tagcagctcc gcacgtcacc ccttgggggt cagaagagcc 1140
tctgctgctt ttgacactga atgtcaaatc agtactgatt gtcgtcagcc accagcaggt 1200
gaaacgtcca gaataattct tggcctcgca tcttagaaag gtcttatttt tgggttcttt 1260
ctggtccttt aaaatatcag tggaccaaat tccatcttcc tttttgtgaa gcagcaggag 1320
cgaatggctt agaacctcgc ctcctttgtg acaggtgtac tggccagcat ctccaaactc 1380
tttgacttgg atggtcaggg ttttgccaga gcctaagacc tcactgctct ggtccaaggt 1440
ccaggtgata ccatcttctt caggggtgtc acaggtgagg accaccattt ctccaggggc 1500
atccggatac caatccaatt ctacgacata aacatctttc ttcagttccc atatggccac 1560
gaggggagat gccagaaaaa ccagggaaaa ccaagagatg accaactgct ggtgacacat 1620
<210> 77
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 77
caggagttga ggttactgtg agtagtgatt aaagagagtg atagggaact cttgaacaag 60
agatgcaatt tatactgtta attctggaaa aatattatgg gggtgtcaaa atgtcccggg 120
acaattgacg ccttctgtat gaaacagttt ttcctccacg ccttctgtat gaaacagttt 180
ttcctccacg ccttctgtat gaaacagttt ttcctccgtc gaggacaatt gacgccttct 240
gtatgaaaca gtttttcctc cacgccttct gtatgaaaca gtttttcctc cacgccttct 300
gtatgaaaca gtttttcctc c 321
<210> 78
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：人工合成序列
<400> 78
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

Claims (61)

1. 一种抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，其中所述抗体特异地结合与HLA复合的WT1肽，其中所述轻链可变区包含LCDR1, LCDR2和LCDR3，所述重链可变区包含HCDR1,HCDR2和HCDR3，所述抗体选自：
(1)其中LCDR1, LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别是SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；以及HCDR1, HCDR2, HCDR3的氨基酸序列分别是SEQ IDNO:8, SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；或者
(2)其中LCDR1, LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别是SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；以及HCDR1, HCDR2, HCDR3的氨基酸序列分别是SEQ IDNO:8, SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；或者
(3)其中LCDR1, LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别是SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；以及HCDR1, HCDR2, HCDR3的氨基酸序列分别是SEQ IDNO:8, SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；或者
(4)其中LCDR1, LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别是SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；以及HCDR1, HCDR2, HCDR3的氨基酸序列分别是SEQ IDNO:8, SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体选自：
(1)其中轻链可变区具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：8所示的HCDR1，SEQ ID NO：9所示的HCDR2和SEQ ID NO：10所示的HCDR3；或，
具有SEQ ID NO：20所示的重链可变区，SEQ ID NO：11所示的LCDR1，SEQ ID NO：12所示的LCDR2和SEQ ID NO：13所示的LCDR3；或
(2)其中轻链可变区具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：8所示的HCDR1，SEQ ID NO：9所示的HCDR2和SEQ ID NO：10所示的HCDR3；或，
具有SEQ ID NO：20所示的重链可变区，SEQ ID NO：14所示的LCDR1，SEQ ID NO：15所示的LCDR2和SEQ ID NO：13所示的LCDR3；或
(3)其中轻链可变区具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：8所示的HCDR1，SEQ ID NO：16所示的HCDR2和SEQ ID NO：10所示的HCDR3；或，
具有SEQ ID NO：22所示的重链可变区，SEQ ID NO：11所示的LCDR1，SEQ ID NO：12所示的LCDR2和SEQ ID NO：13所示的LCDR3；或
(4)其中轻链可变区具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：8所示的HCDR1，SEQ ID NO：17所示的HCDR2和SEQ ID NO：10所示的HCDR3；或，
具有SEQ ID NO：24所示的重链可变区，SEQ ID NO：11所示的LCDR1，SEQ ID NO：12所示的LCDR2和SEQ ID NO：13所示的LCDR3。
3. 根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体选自：
(1)其中轻链可变区为如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，以及重链可变区为如SEQID NO：18所示的氨基酸序列；或者
(2)其中轻链可变区为如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO：28，以及重链可变区为如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；或者
(3)其中轻链可变区为如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，以及重链可变区为如SEQID NO：20所示的氨基酸序列；或者
(4)其中轻链可变区为如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，以及重链可变区为如SEQID NO：22所示的氨基酸序列；或者
(5)其中轻链可变区为如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，以及重链可变区为如SEQID NO：24所示的氨基酸序列。
4. 根据权利要求1所述的抗体，其中，所述WT1肽具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，所述抗体没有表现出和与HLA复合的参比肽显著结合，其中所述参比肽具有SEQ ID NO: 58或SEQ ID NO: 59的氨基酸序列。
5.权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体，人源化抗体，嵌合抗体或多价抗体。
6. 权利要求5的抗体，其中所述多价抗体是双功能抗体，包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列。
7. 权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体是scFv, Fv, Fab或(Fab)2。
8. 权利要求7所述的抗体，其中所述抗体是scFv，如SEQ ID NO：38或52所示。
9. 一种嵌合抗原受体，其包含胞外抗体，跨膜结构域和胞内结构域，
其中所述胞外抗体特异地结合与HLA复合的WT1肽，其中所述WT1肽具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，和
其中所述胞外抗体为权利要求1-8中任一项所述的抗体。
10. 权利要求9的嵌合抗原受体，其中所述的跨膜结构域选自CD28或CD8的跨膜区；和/或，所述胞内结构域包含胞内信号区，所述胞内信号区包含一个或多个共刺激结构域，
所述胞内信号区选自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，CD278，CD66d，CD3ζ，CD28，和4-1BB；和/或
所述共刺激结构域选自CD27，CD28，CD7，CARD11，CD30，CD40，CD54，CD83，OX40，CD137，CD134，CD150，CD152，CD223，CD270，PD-L2，PD-L1，CD278，DAP10，LAT，NKD2C, SLP76，TRIM，FcεRIγ，CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, MyD88，4-1BB和4-1BBL的胞内信号区。
11.权利要求10的嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体包括如下的顺序连接的抗体、跨膜区和胞内信号区：
权利要求1-8所述的抗体、CD8的跨膜区和CD3ζ；
权利要求1-8所述的抗体、CD8的跨膜区、CD137的胞内信号区和CD3ζ；
权利要求1-8所述的抗体、CD28的跨膜区、CD28的胞内信号区和CD3ζ；或
权利要求1-8所述的抗体、CD28的跨膜区、CD28的胞内信号区、CD137和CD3ζ。
12. 权利要求9-11中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域包含SEQ IDNO: 46, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 66的氨基酸序列。
13. 权利要求12的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO：67、68、69、70、71、72、73、74或75所示的氨基酸序列。
14.权利要求9-11中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体诱导对包含WT1或与HLA复合的WT1肽的细胞的细胞毒性。
15. 权利要求14的嵌合抗原受体，其中当嵌合抗原受体与靶细胞的比例为20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2.5:1, 1:1或1:3时，细胞毒性的水平为至少5%。
16.权利要求15的嵌合抗原受体，其中所述细胞毒性的水平为至少10%。
17.权利要求15的嵌合抗原受体，其中所述细胞毒性的水平为至少15%。
18.权利要求15的嵌合抗原受体，其中所述细胞毒性的水平为至少20%。
19.权利要求15的嵌合抗原受体，其中所述细胞毒性的水平为至少25%。
20.权利要求15的嵌合抗原受体，其中所述细胞毒性的水平为至少30%。
21.权利要求15的嵌合抗原受体，其中所述细胞毒性的水平为至少35%。
22.权利要求15的嵌合抗原受体，其中所述细胞毒性的水平为至少40%。
23.权利要求15的嵌合抗原受体，其中所述细胞毒性的水平为至少45%。
24.一种药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项的抗体或权利要求9-23中任一项的嵌合抗原受体，以及药学上可接受的赋形剂。
25.一种经分离的核酸，其编码权利要求1-8中任一项的抗体或权利要求9-23中任一项的嵌合抗原受体。
26.一种载体，其包含编码权利要求1-8中任一项的抗体或权利要求9-23中任一项的嵌合抗原受体的核酸序列。
27.一种宿主细胞，其表达权利要求1-8中任一项的抗体或权利要求9-23中任一项的嵌合抗原受体。
28.一种宿主细胞，其包含编码权利要求1-8中任一项的抗体或权利要求9-23中任一项的嵌合抗原受体的核酸。
29.一种生产权利要求1-8中任一项的抗体的方法，其包含：在适于表达所述抗体的条件下培养权利要求27或28的宿主细胞；以及分离出由所述宿主细胞表达的所述抗体。
30.一种生产权利要求9-23中任一项的嵌合抗原受体的方法，其包含：在适于表达所述嵌合抗原受体的条件下培养权利要求27或28的宿主细胞；以及分离出由所述宿主细胞表达的所述嵌合抗原受体。
31.表达权利要求中9-23中任一项所述的嵌合抗原受体的免疫效应细胞在制备诱导包含与HLA复合的WT1肽的细胞死亡的药物中的用途，所述用途包含：使所述细胞与表达权利要求9-23中任一项的嵌合抗原受体的免疫效应细胞接触。
32.权利要求31的用途，其中所述细胞在体内与表达所述嵌合抗原受体的免疫效应细胞接触。
33.权利要求31的用途，其中所述细胞在体外与表达所述嵌合抗原受体的免疫效应细胞接触。
34.权利要求31的用途，其中所述细胞是癌细胞。
35.权利要求34的用途，其中所述癌细胞是血液癌细胞或实体瘤细胞。
36.权利要求34的用途，其中所述癌细胞是肾母细胞瘤细胞，结肠癌细胞，直肠癌细胞，卵巢癌细胞，慢性髓样白血病细胞或肠癌细胞。
37.权利要求34的用途，其中所述癌细胞是间皮瘤癌细胞。
38.权利要求27或28的宿主细胞在制备诱导靶细胞死亡的药物中的应用。
39.权利要求38的应用，其中将多个所述宿主细胞在体内施用于所述靶细胞。
40.权利要求38的应用，其中将多个所述宿主细胞在体外施用于所述靶细胞。
41.权利要求38的应用，其中所述靶细胞是癌细胞。
42.权利要求41的应用，其中所述癌细胞是血液癌细胞或实体瘤细胞。
43.权利要求41的应用，其中所述癌细胞是肾母细胞瘤细胞，结肠癌细胞，直肠癌细胞，卵巢癌细胞，慢性髓样白血病细胞或肠癌细胞。
44.权利要求41的应用，其中所述癌细胞是间皮瘤癌细胞。
45.权利要求1-8中任一项的抗体或表达权利要求9-23中任一项的嵌合抗原受体的免疫效应细胞在制备治疗癌症的药物中的应用。
46.权利要求24所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
47.权利要求45或46的应用，其中所述癌症是血液癌或实体瘤。
48.权利要求45或46的应用，其中所述癌症是间皮瘤。
49.权利要求45或46的应用，其中所述癌症是肾母细胞瘤，结肠癌，直肠癌，卵巢癌，慢性髓样白血病或肠癌。
50.一种免疫应答细胞，其包含权利要求9-23中任一项的嵌合抗原受体和IL-12。
51.权利要求50的免疫应答细胞，其中所述IL-12在所述免疫应答细胞的表面上表达。
52.权利要求50的免疫应答细胞，其中所述IL-12在所述免疫应答细胞内表达。
53.权利要求50的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞具有至少20%的细胞毒性。
54.权利要求50的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞具有至少30%的细胞毒性。
55.权利要求50的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞具有至少40%的细胞毒性。
56.权利要求50的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞具有至少50%的细胞毒性。
57.权利要求50的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞具有至少60%的细胞毒性。
58. 权利要求53-57的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞效应子:靶标比例为5:1,10:1, 15:1, 20:1。
59.权利要求50的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞在靶细胞中诱导死亡。
60.权利要求59的免疫应答细胞，其中所述靶细胞包含与HLA复合的WT1肽。
61.权利要求50所述的免疫应答细胞在制备诱导包含与HLA复合的WT1肽的细胞死亡的药物中的应用。
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