CN100513563C

CN100513563C - Wt1衍生的hla-dr-结合抗原肽

Info

Publication number: CN100513563C
Application number: CNB2004800398865A
Authority: CN
Inventors: 杉山治夫
Original assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Current assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Priority date: 2003-11-05
Filing date: 2004-11-04
Publication date: 2009-07-15
Anticipated expiration: 2024-11-04
Also published as: CA2544214A1; CN101580538A; ES2378264T3; JP4621142B2; US20130243800A1; CN101580538B; KR101213015B1; ATE540111T1; KR101522079B1; DK2071028T3; EP1696027A1; CA2544214C; US10124046B2; WO2005045027A1; KR20120067374A; US20180207254A1; US20080070835A1; PT2071028E; US11027003B2; CY1112585T1

Abstract

本发明提供了一种WT1衍生的HLA-DRB1*0405-结合抗原肽，编码所述肽的多核苷酸，包含所述肽或多核苷酸的辅助性T细胞诱导物等等。其涉及由如SEQ ID NO：1所示的人WT1氨基酸序列中10-25个连续氨基酸残基组成的部分肽，该部分肽结合HLA-DRB1*0405并诱导辅助性T细胞，编码所述肽的多核苷酸，或包含所述肽或多核苷酸的辅助性T细胞诱导物。

Description

WT1衍生的HLA-DR-结合抗原肽

技术领域

本发明涉及WT1衍生的HLA-DRB1^＊0405-结合抗原肽。

背景技术

已鉴定WT1基因(Wilms’肿瘤基因1)是Wilms’肿瘤即小儿肾肿瘤致病基因之一(Cell 60：509，1990，Nature 343：774，1990)。WT1基因编码转录因子WT1，该因子在诸如细胞增殖、分化、凋亡以及组织发育等诸多进程中起重要作用(Int.Rev.Cytol.181：151，1998)。最初WT1基因被描述为是一种肿瘤抑制基因。但是，后续研究揭示了WT1基因在白血病及包括肺癌和乳腺癌的多种实体瘤中高表达，表明WT1基因更确切地发挥着促进癌症生长的致癌作用。另外，证实了当在体外用WT1-衍生的肽刺激HLA-A^＊0201或HLA-A^＊2402阳性的外周血单核细胞时，诱导了肽-特异性细胞毒性T-淋巴细胞(CTLs)并杀死内源性表达WT1的白血病和实体瘤细胞。这些结果证实WT1是癌症免疫疗法期望的靶分子(Int.J.Hematol 76：127，2002)。

业已报道了特异于癌抗原的辅助性T细胞的存在对于有效诱导CTLs是必要的(Cancer.Res.62：6438，2002)。

当其识别抗原呈递细胞上MHC II类分子和抗原肽复合物时，诱导(造成增殖)并活化辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)。所活化的辅助性T细胞产生诸如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和/或干扰素的细胞因子并介导B细胞的生长、分化和成熟。该活化的辅助性T细胞也起作用以促进诸如Tc和TD细胞的其他T细胞亚型的生长、分化和成熟。因此，该活化的辅助性T细胞能通过促进B和T细胞的生长和活化以活化免疫系统。因此，认为在MHC II类结合抗原肽(也称为“辅助肽”)的影响下，增强辅助性T细胞功能是有用的，籍此增加了癌症免疫疗法(癌症疫苗疗法)中癌症疫苗的功效(效力)(J.Immunother.，24：195，2001)。

就WT1-衍生肽而论，仅已知有一种抗原肽能结合MHC II类分子亚型，即HLA-DRB1^＊0401(CancerImmunol.Immunother.51：271，2002)。没有能结合不同亚型的WT1-衍生肽的报道。

发明内容

本发明的目的是提供WT1衍生的HLA-DRB1^＊0405-结合抗原肽，以及该肽作为癌症疫苗功效增强剂(一种用于增强癌症疫苗功效的试剂)的应用。

本发明人已对具有结合MHC II类抗原并在癌症免疫疗法中增强癌症疫苗功效(效力)的活性的WTI-衍生的抗原肽(“辅助肽”)进行了透彻的研究。结果，本发明人首次发现了WT1含有抗原肽部分，其具有与许多MHC II类亚类中的HLA-DRB1^＊0405结合并诱导辅助性T细胞的活性。该发现推动了新治疗方法的发展，即由该方法在HLA-DRB1^＊0405-阳性癌症患者中诱导并增强WT1-特异性辅助性T细胞。

近来有研究揭示了存在着非种系选择性(promiscuous)辅助肽，其是能与多种HLA II类分子结合并诱导辅助性CD4阳性T细胞的辅助肽(BritishJ.Cancer，85(10)，p1527-1534(2001)；J.Immunol.，169，p557-565(2002))。为阐明WT1_332-347是否为潜在的非种系选择性辅助肽，本发明人对作为上述的HLA-DRB1^＊0405-结合抗原肽(辅助肽)的该WT1_332-347进行了研究。结果，所述肽被证实为非种系选择性辅助肽，其不但与HLA-DRB1^＊0405分子结合，还与HLA-DRB1^＊1502分子结合。因此，本发明的WT1_332-347肽是一种可应用于具有HLA-DRB1^＊1502和HLA-DRB1^＊0405患者的辅助肽。本发明人也首次发现了能与多种MHC II类亚类之一的HLA-DRB1^＊1502结合，并诱导辅助性T细胞的WT1含有的抗原肽部分。

在这些发现的基础上建立了本发明。

本发明包括如下。

(1)一种由如SEQ ID NO：1所示的人WT1氨基酸序列中10-25个连续氨基酸组成的肽，其结合HLA-DRB1^＊0405并诱导辅助性T细胞。

(2)上述(1)的肽，其包含如SEQ ID NOS：2-23任一所示的氨基酸序列。

(3)上述(2)的肽，其包含如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列。

(4)一种10-25个氨基酸的肽，其包含如SEQ ID NOS：2-23任一所示的氨基酸序列的第1、4、6和/或9位的氨基酸残基被不同氨基酸残基所取代所得的氨基酸序列，且其结合HLA-DRB1^＊0405并诱导辅助性T细胞。

(5)上述(4)的肽，其包含如SEQ ID NOS：2-23任一所示的氨基酸序列的第1、4、6和/或9位的氨基酸残基被选自如下氨基酸的氨基酸残基所取代所得的氨基酸序列：

对于第1位，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸；

对于第4位，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；

对于第6位，天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和天冬氨酸；以及

对于第9位，天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。

(6)上述(5)的肽，其包含如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的第3、6、8和/或11位的氨基酸残基被选自如下氨基酸的氨基酸残基所取代所得的氨基酸序列：

对于第3位，苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸；

对于第6位，缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；

对于第8位，天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和天冬氨酸；以及

对于第11位，天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。

(7)一种由如SEQ ID NO：1所示的人WT1氨基酸序列中10-25个连续氨基酸组成的肽，其结合HLA-DRB1^＊1502并诱导辅助性T细胞。

(8)上述(7)的肽，其包含如SEQ ID NOS：46-56任一所示的氨基酸序列。

(9)上述(7)的肽，其包含如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列。

(10)一种包含如上述(1)-(9)任一所述的肽和癌抗原肽的肽。

(11)一种编码如上述(1)-(10)任一所述的肽的多核苷酸。

(12)一种包含如上述(11)所述的多核苷酸的表达载体。

(13)一种含有如上述(12)所述的表达载体的细胞。

(14)一种生产如上述(1)-(10)任一所述的肽的方法，其包括在该肽能表达的条件下培养如上述(13)所述的细胞。

(15)一种特异性结合如上述(1)-(9)任一所述的肽的抗体。

(16)一种药物组合物，其包含如上述(1)-(10)任一所述的肽、如上述(12)所述的表达载体，或如上述(13)所述的细胞，以及药学上可接受的载体。

(17)上述(16)的药物组合物，其是一种癌症治疗与预防剂。

(18)上述(16)的药物组合物，其是一种辅助性T细胞诱导物，且其包含如上述(1)-(9)任一所述的肽；与如上述(1)-(9)任一所述的肽有关的(12)所述的表达载体；或与如上述(1)-(9)任一所述的肽有关的(13)所述的细胞，以及药学上可接受的载体。

(19)上述(16)的药物组合物，其是一种癌症疫苗功效增强剂，且其包含如上述(1)-(9)任一所述的肽；与如上述(1)-(9)任一所述的肽有关的(12)所述的表达载体；或与如上述(1)-(9)任一所述的肽有关的(13)所述的细胞，以及药学上可接受的载体。

(20)上述(16)的药物组合物，其是一种癌症治疗或预防剂，且其包含如上述(10)所述的肽；与如上述(10)所述的肽有关的(12)所述的表达载体；或与如上述(10)所述的肽有关的(13)所述的细胞，以及药学上可接受的载体。

(21)如上述(1)-(10)任一所述的肽、如上述(12)所述的表达载体或如上述(13)所述的细胞在制造癌症治疗或预防剂中的应用。

(22)一种治疗或预防癌症的方法，其包括对所需患者施用如上述(1)-(10)任一所述的肽、如上述(12)所述的表达载体或如上述(13)所述的细胞。

(23)一种药物组合物，其是由如上述(1)-(9)任一所述的肽和一种癌抗原肽组合而成的。

(24)上述(23)的药物组合物，其用于治疗或预防癌症。

(25)一种用于治疗或预防癌症的试剂盒，其包含一种包含如上述(1)-(9)任一所述的肽以及药学上可接受的载体的药物组合物，和一种包含癌抗原肽以及药学上可接受的载体的药物组合物。

(26)如上述(1)-(9)任一所述的肽与癌抗原肽的组合在制造癌症治疗或预防剂中的应用。

(27)一种治疗或预防癌症的方法，其包括对所需患者施用如上述(1)-(9)任一所述的肽以及癌抗原肽。

本发明提供了一种WT1衍生的HLA-DRB1^＊0405-结合抗原肽、编码该肽的多核苷酸、包含所述肽或多核苷酸的辅助性T细胞诱导物(“辅助性T细胞诱导物”)等等。本发明的辅助性T细胞诱导物用作为癌症疫苗功效增强剂。本发明的癌症疫苗功效增强剂适用于许多HLA-DRB1^＊0405-阳性患者，且特别有益于增强WT1疫苗的功效。

附图简述

图1显示了WT1-衍生的WT1_332-347肽刺激的CD4阳性T细胞(辅助性T细胞)与各种树突细胞应答的试验结果。在该图中，“未处理的”表示对不使用肽进行刺激的树突细胞的应答；“PHA”表示其中用PHA取代树突细胞处理CD4阳性T细胞的试验结果。“WT1_172-186刺激”表示对WT1_172-186肽刺激的树突细胞的应答，“WT1_225-243刺激”表示对WT1_225-243肽刺激的树突细胞的应答，以及“WT1_332-347刺激”表示对WT1_332-347肽刺激的树突细胞的应答。纵轴表示CD4阳性T细胞所摄入的[³H]-胸苷的量(cpm)。

图2显示了G2细胞系对WT1-衍生的WT1_332-347肽刺激的树突细胞应答的试验结果。在该图中，“未处理的”表示使用未进行肽刺激的树突细胞所获得的结果；以及“WT1_332-347脉冲”表示使用WT1_332-347刺激的树突细胞所获得的结果。纵轴表示G2细胞系所摄入的[³H]-胸苷的量(cpm)。

图3显示了G2细胞系对表达WT1基因的B-LCL(+)细胞应答的试验结果。在该图中，“B-LCL(-)”表示使用不表达WT1基因的B-LCL(-)细胞所获得的结果，“B-LCL(+)”表示使用表达WT1基因的B-LCL(+)细胞所获得的结果，以及“B-LCL(+)+抗-HLA-DR抗体”表示使用抗-HLA-DR抗体处理的B-LCL(+)细胞所获得的结果。纵轴表示G2细胞系所摄入的[³H]-胸苷的量(cpm)。

图4显示了E04.1细胞系对WT1-衍生的WT1_332-347肽刺激的树突细胞应答的试验结果。在该图中，“-”表示使用不进行肽刺激的树突细胞所获得的结果，以及“332”表示使用WT1_332-347肽刺激的树突细胞所获得的结果。纵轴表示E04.1细胞系所摄入的[³H]-胸苷的量(cpm)。

图5显示了E04.1细胞系对先用WT1-衍生的WT1_332-347肽刺激再用各种抗-HLA抑制性抗体处理的刺激细胞(stimulated cells)应答的试验结果。所使用的刺激细胞是B-LCL(-)细胞，其是一种建立自对HLA-DRB1^＊0405阳性的健康志愿者血液的B细胞系，如本文中以下实施例3所示。在该图中，“-”表示使用不进行肽刺激的刺激细胞所获得的结果，以及“332”表示使用WT1_332-347肽刺激的刺激细胞所获得的结果。此外，“332+α-I类”表示使用WT1_332-347肽和抗-HLA-I类抗体处理的刺激细胞所获得的结果，“332+α-DR”表示使用WT1_332-347肽和抗-HLA-DR抗体处理的刺激细胞所获得的结果，“332+α-DQ”表示使用WT1_332-347肽和抗-HLA-DQ抗体处理的刺激细胞所获得的结果。另外，“332+mIgG”表示使用WT1_332-347肽和作为抑制性抗体阴性对照的抗-小鼠-IgG抗体处理的刺激细胞所获得的结果。纵轴表示E04.1细胞系所摄入的[³H]-胸苷的量(cpm)。

图6显示了E04.1细胞系对用WT1-衍生的WT1_332-347肽刺激的HLA-DRB1^＊0405-阳性或阴性PBMC应答的试验结果。在该图中，“-”表示使用未进行肽刺激的PBMC所获得的结果，以及“332”表示使用WT1_332-347刺激的PBMC所获得的结果。各种供体的HLA-DRB1基因型如下。供体1(HLA-DRB1^＊0405/0803)，供体2(HLA-DRB1^＊0405/0101)，供体3(HLA-DRB1^＊0101/1001)，以及供体4(HLA-DRB1^＊1201/0802)。纵轴表示E04.1细胞系所摄入的[³H]-胸苷的量(cpm)。

图7显示了E04.1细胞系对表达WT1基因的B-LCL(+)细胞应答的试验结果。在该图中，“B-LCL(-)”表示使用不表达WT1基因的B-LCL(-)基因作为刺激细胞所获得的结果，以及“B-LCL(+)”表示使用表达WT1基因的B-LCL(+)基因作为刺激细胞所获得的结果。纵轴表示E04.1细胞系所摄入的[³H]-胸苷的量(cpm)。

图8显示了E04.1细胞系对用已诱导凋亡的B-LCL(+)细胞刺激的树突细胞应答的试验结果。在该图中，“凋亡的B-LCL(+)”表示使用表达WT1基因并已诱导凋亡的B-LCL(+)细胞刺激的树突细胞所获得的结果，以及“凋亡的B-LCL(-)”表示使用不表达WT1基因并已诱导凋亡的B-LCL(-)细胞刺激的树突细胞所获得的结果。此外，“E04.1+”表示通过共培养E04.1细胞和树突细胞所获得的结果，以及“E04.1-”表示通过不与E04.1细胞共培养所获得的结果。纵轴表示E04.1细胞系所摄入的[³H]-胸苷的量(cpm)。

图9显示了E04.1细胞系对用WT1-衍生的WT1_332-347肽刺激的树突细胞应答中细胞因子产生的试验结果。在该图中，“-”表示使用未进行肽刺激的树突细胞所获得的结果，以及“332”表示使用WT1_332-347肽刺激的树突细胞所获得的结果。纵轴表示显示产生IL-4(空白条)或IFN-γ(填充条)的E04.1细胞的百分比(％)。

图10显示了通过流式细胞仪分析用抗-CD4抗体和抗-CXCR3抗体染色的E04.1细胞系的结果。在该图中，横轴和纵轴分别表示对CD4和CXCR3阳性的细胞。对CD4和CXCR3阳性的细胞百分比为90.1％.。

图11显示了WT1-衍生的WT1_332-347肽对WT1-特异性CTLs诱导影响的试验结果。在(A)WT1_235-243肽、(B)WT1_235-243肽+WT1_332-347肽、(C)WT1_235-243肽+E04.1细胞和(D)WT1_235-243肽+WT1_332-347肽+E04.1细胞刺激条件下，培养来自健康志愿者(HLA-A^＊2402/1101，DRB1^＊0405-0803)的PBMCs7天。然后，用流式细胞仪对一半的回收细胞分析以获得WT1_235-243-特异性CTL前体的百分比。横轴和纵轴分别表示对CD8和WT1_235-243肽/HLA-A^＊2402阳性细胞的百分比。

图12显示了WT1-衍生的WT1_332-347肽对WT1-特异性CTLs活化影响的试验结果。用WT1_235-243肽刺激在图11提及的试验中另一半的回收细胞6小时，且胞内IFN-γ被染色。纵轴和横轴分别表示对胞内IFN-γ和抗-小鼠IgG抗体阳性的细胞。该图显示了用(E)WT1_235-243肽、(F)WT1_235-243肽+WT1_332-347肽、(G)WT1_235-243肽+E04.1细胞和(H)WT1_235-243肽+WT1_332-347肽+E04.1细胞刺激的结果

图13显示了WT1-衍生的WT1_332-347肽刺激的CD4阳性T细胞与各种树突细胞应答的试验结果。在该图中，“-”表示使用未进行肽刺激的树突细胞所获得的结果，“332”表示使用WT1_332-347肽刺激的树突细胞所获得的结果，“172”表示使用WT1_172-347肽刺激的树突细胞所获得的结果，以及“225”表示使用WT1_225-347肽刺激的树突细胞所获得的结果。纵轴表示CD4阳性T细胞所摄入的[³H]-胸苷的量(cpm)。符号“＊＊”和“n.s.”分别表示测试组中差异是统计学显著或不显著的。

图14显示了用WT1-衍生的WT1_332-347肽刺激CD4阳性T细胞的T细胞反应谱(repertoire)分析的结果。用特异于TCR各种Vβ链的不同抗体染色细胞并通过流式细胞仪进行分析。在上一行图中，在四分区域右下部分中的细胞群代表Vβ3-阳性细胞。在下一行图中，在四分区域右下部分中的细胞群代表Vβ20-阳性细胞。

图15显示了E15.1细胞系或E15.2细胞系对用WT1-衍生的WT1332-347肽刺激的自体PBMCs应答的试验结果。在该图中，“-”表示使用未进行肽刺激的自体PBMCs所获得的结果，以及“332”表示使用WT1_332-347肽刺激的自体PBMCs所获得的结果。纵轴表示不同细胞系所摄入的[³H]-胸苷的量(cpm)。A)和B)分别显示了使用E15.1细胞系和E15.2细胞系所获得的结果。符号“＊＊”表示测试组中差异是统计学显著的。

图16显示了E15.2细胞系对用WT1-衍生的WT1332-347肽刺激的自体PBMCs应答中细胞因子产生的试验结果。在该图中，“-”表示使用未进行肽刺激的树突细胞所获得的结果，以及“332”表示使用WT1_332-347肽刺激的自体PBMCs所获得的结果。纵轴表示显示产生IL-4(空白条)或IFN-γ(填充条)的E15.2细胞的百分比(％)。

图17显示了WT1-衍生的WT1332-347肽刺激的自体PBMCs浓度和E15.2细胞系应答之间关系的试验结果。纵轴表示E15.1细胞系所摄入的[³H]-胸苷的量(cpm)。横轴表示WT1332-347肽刺激的自体PBMC的浓度。

图18显示了E15.2细胞系对用WT1-衍生的WT1332-347肽刺激的HLA-DRB1^＊1502阳性或阴性的PBMCs应答的试验结果。在该图中，“-”表示使用未进行WT1332-347肽刺激的PBMCs所获得的结果，以及“332”表示使用该肽刺激的PBMCs所获得的结果。A)显示了使用来自HLA-DRB1^＊1502-阳性健康志愿者的PBMCs所获得的结果以及B)显示了使用来自HLA-DRB1^＊1502·阴性健康志愿者的PBMCs所获得的结果。纵轴表示E15.2细胞系所摄入的[³H]-胸苷的量(cpm)。符号“＊＊”和“n.s.”分别表示测试组中差异是统计学显著或不显著的。

发明的最佳实施方式

本发明提供了一种由如SEQ ID NO：1所示的人WT1氨基酸序列中10-25个连续氨基酸组成的肽，所述肽结合HLA-DRB1^＊0405并诱导辅助性T细胞。本发明包括其中N-末端和/或C-末端氨基酸残基被修饰的肽或其中特定氨基酸残基被改变的那些肽。

在下文中，“诱导辅助性T细胞的肽(或诱导CD4阳性T细胞的肽)”可称为“辅助肽”。

如SEQ ID NO：1所示的人WT1氨基酸序列是已知的序列，描述于Cell，60：509，1990和NCBI数据库(登录号XP_034418和P19544)中。

本发明的肽是一种由存在于如SEQ ID NO：1所示的人WT1氨基酸序列中的10-25个连续氨基酸组成的部分(partial)肽。该“10-25个氨基酸”的定义是基于通常由10-25个氨基酸所组成的肽具有结合MHCII类活性这一事实(Immunogenetics，41：178-228，1995，Biochimica etBiophysica Acta 1316，85-101(1996)，Immunology，96，1-9(1999)，Peptides，Vol.19，179-198(1998)，Immunobiology，第5版，116-117，Garland Publishing(2001))。优选的肽是那些由人WT1氨基酸序列中13-17个连续氨基酸所组成的。

本发明的肽通过合成由如SEQ ID NO：1所示的人WT1氨基酸序列中的10-25个连续氨基酸组成的肽(候选肽)，并测定所述肽是否能与HLA-DRB1^＊0405结合并诱导辅助性T细胞而得到鉴定。

可根据肽化学领域中通常所用的方法进行肽的合成。这样的方法可见于文献中，包括Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；The Proteins，Vol.2 Academic Press Inc.，New York，1976；PeptideSynthesis，Maruzen，Inc.，1975；Pepteide-Gosei no Kiso to Jikken，Maruzen，Inc.1985；以及Iyakuhin no Kaihatsu(Zoku)，Vol.14，PeptideSynthesis，Hirokawa-syoten，1991。

使用描述于，例如，Cancer.Immunol.Immunother.51：271(2002)中的方法、描述于实施例中的方法或如下所述的方法，可以检测候选肽是否能结合HLA-DRB1^＊0405并诱导辅助性T细胞。

具体来说，通过从HLA-DRB1^＊0405阳性的人对象中分离外周血单核细胞(PBMCs)并除去不贴壁细胞，制备树突细胞(贴壁细胞)。分别地，通过使用菲可帕克(Ficoll-Paque)进行密度梯度离心等从相同的HLA-DRB1^＊0405-阳性对象中制备辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)。

在添加了候选肽后培养上述树突细胞，并与上述辅助性T细胞进行进一步的培养。然后回收辅助性T细胞并用候选肽刺激的树突细胞以类似方式刺激几次。通过测定，例如，(1)辅助性T细胞的生长活性或(2)辅助性T细胞的细胞因子产生活性，有可能评估辅助性T细胞在应答肽刺激中是否被诱导(活化)。具体来说，生长活性(1)可通过测定辅助性T细胞所摄入的[3H]-胸苷的量得到检验。细胞因子产生活性(2)可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或类似方法测定活化的辅助性T细胞所产生的诸如IFN-γ的细胞因子的量而得到检验。

结合MHC I类或MHC II类分子并呈递的抗原肽的氨基酸序列遵循某一规则(结合基序)。其为与MHC I类分子结合中起重要作用的在结合MHC I类分子的肽的两末端处的末端氨基酸残基；但是，在结合MHC II类分子的肽的任一末端并不存在这样的氨基酸，且该末端氨基酸并不与MHC II类分子结合。这样的肽更适合并纵向固定于(固定在)肽结合沟槽中。在肽结合沟槽中肽的固定可通过结合构成该肽的氨基酸的侧链与肽结合沟槽并结合该肽主链与在MHC II类分子完整的肽结合沟槽中保存良好的氨基酸的侧链以获得。肽结合沟槽具有小或大的口袋，且取决于MHC II类分子在构成该口袋的氨基酸残基中所具有的氨基酸多态性。

迄今为止所获得的X-射线结晶学揭示了在与这些结合口袋搭合的最小的MHC II类-结合肽的第1、4、6和9位处氨基酸残基的侧链。

通过分析常见于来自不同等位基因的MHC II类分子各自结合的肽中的氨基酸残基模式，可评估与肽结合沟槽的口袋结合的肽的氨基酸基序。考虑到，因为约9个氨基酸的肽具有适合肽结合沟槽的上述基序，该适合是以这样方式进行的，即两末端从沟槽的两位点上伸展出，基本上不限制能与MHC II类分子结合的肽的长度。但是，在许多情况下，通过肽酶将长肽切割为13-17个氨基酸长的肽(Immunobiology，第5版，116-117，Garland Publishing(2001))。

就具有HLA-DRB1^＊0405结合活性的肽而论，在由9个氨基酸组成的HLA(MHC)-结合城的第1、4、6和9位处的氨基酸预计具有如下规则性(基序)(Immunogenetics，41：178-228，1995，BiochimicaetBiophysica Acta 1316，85-101(1996))。

第1位：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)和甲硫氨酸(M)

第4位：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)

第6位：天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)和天冬氨酸(D)

第9位：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和谷氨酰胺(Q)。

近来，使用MHC II类结合肽的软件(Propred，Bioinformatics 17：1236，2001)有可能搜索到预期与MHC II类抗原结合的肽序列。

本发明是基于首次发现WT1(SEQ ID NO：1)含有结合HLA-DRB1^＊0405(一种MHC II类)并诱导辅助性T细胞的抗原肽部分。在所述WT1氨基酸序列中推定的HLA-DRB1^＊0405-结合9氨基酸部分的例子包括WT1衍生的9氨基酸部分，如SEQ ID NOS：2-23所示。因此，作为本发明肽的特定实施方案，本发明提供了一种包含如SEQ IDNOS：2-23任一所示的氨基酸序列，结合HLA-DRB1^＊0405并诱导辅助性T细胞的肽。

在所述肽是WT1的部分肽且包含如SEQ ID NOS：2-23任一所示的氨基酸序列，结合HLA-DRB1^＊0405并诱导辅助性T细胞的肽条件下，并不限制上述肽的长度。如上所述的，具有结合基序的约9个氨基酸的肽可适合于肽结合沟槽，其两端从沟槽的两侧伸展出，因此基本上不限制能与MHC II类分子结合的肽的长度。但是，长肽通常为肽酶所切割，且迄今为止已报道MHC II类结合肽长度约为10-25个氨基酸(Immunogenetics，41：178-228，1995，Biochimica et Biophysica Acta1316，85-101(1996)，Immunology，96，1-9(1999)，Peptides，Vol.19，179-198(1998)，Immunobiology，第5版，116-117，Garland Publishing(2001))。考虑到这一点，本发明的肽优选由约10-25个氨基酸组成，更优选由约13-17个氨基酸组成。

因此，包含如SEQ ID NOS：2-23任一所示的氨基酸序列的本发明的肽的优选实施方案的例子包括由10-25个氨基酸组成的(优选地，由13-17个氨基酸组成的)WT1衍生的部分肽，其包含如SEQ ID NOS：2-23任一所示的氨基酸序列，且具有结合HLA-DRB1^＊0405并诱导辅助性T细胞的活性。

更优选的实施方案的例子包括由10-25个氨基酸组成的(优选地，由13-17个氨基酸组成的)WT1衍生的部分肽，其包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，且具有结合HLA-DRB1^＊0405并诱导辅助性T细胞的活性。仍优选的实施方案的例子包括由16-25个氨基酸组成的(优选地，由16-17个氨基酸组成的)WT1衍生的部分肽，其包含如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，且具有结合HLA-DRB1^＊0405并诱导辅助性T细胞的活性。如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列表示WT1衍生的16氨基酸的部分肽，并包括如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。

最优选的实施方案是由如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列组成的肽。

本发明的肽可在保持活性的范围内进行适当的改变。在此使用的氨基酸残基的“改变”指氨基酸残基的取代、缺失和/或添加(所述添加包括在肽的N-和/或C-末端处氨基酸的添加)。氨基酸残基的取代是优选的。当改变涉及氨基酸残基取代时，在辅助肽活性保持的条件下，任何位置的任意数目的氨基酸残基可被取代。但是，因为结合HLA II类分子的肽通常长约10-25个氨基酸，所以改变优选涉及1个至几个氨基酸。

当通过取代改变氨基酸残基时，优选具有HLA-DRB1^＊0405结合基序结构的9氨基酸肽的第1、4、6和/或9位处的氨基酸残基被取代。

本发明有关取代的肽的具体例子包括10-25个氨基酸的肽，其包含如SEQ ID NOS：2-23任一所示的氨基酸序列的第1、4、6和/或9位处氨基酸残基为不同氨基酸残基所取代，且与HLA-DRB1^＊0405结合并诱导辅助性T细胞的氨基酸序列。

优选的例子包括10-25个氨基酸的肽，其包含如SEQ ID NOS：2-23任一所示的氨基酸序列的第1、4、6和/或9位处氨基酸残基为选自如下氨基酸：对于第1位，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸；对于第4位，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；对于第6位，天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和天冬氨酸；以及对于第9位，天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的氨基酸残基所取代，且结合HLA-DRB1^＊0405并诱导辅助性T细胞的氨基酸序列。

例如，可进行第1、4、6和/或9位处氨基酸残基的取代，用于改良HLA-DRB1^＊0405结合活性或增强上述提及的由WT1的部分序列组成的本发明天然型辅助肽的活性的目的。非肽第1、4、6和/或9位处取代的氨基酸的部分可保持天然型序列(即，保持具有WT1的部分序列)，或只要活性保持就可进一步改变。

更优选的实施例包括10-25个氨基酸的肽，其包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的第1、4、6和/或9位处氨基酸残基被选自如下氨基酸：对于第1位，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸；对于第4位，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；对于第6位，天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和天冬氨酸；以及对于第9位，天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的氨基酸残基所取代，且与HLA-DRB1^＊0405结合并诱导辅助性T细胞的氨基酸序列。

仍更优选的实施例包括如SEQ ID NO：24所示的WT1衍生的16氨基酸部分肽，其包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，的第3、6、8和/或11位处氨基酸残基为选自如下氨基酸：对于第3位，苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸；对于第6位，缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；对于第8位，天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和天冬氨酸；以及对于第11位，天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的氨基酸残基所取代的肽。优选的例子可包括16-25个氨基酸的肽，其包含来自SEQ ID NO：24的改变的氨基酸序列。

本发明也提供了一种包含本发明辅助肽(天然或改变的肽)以及癌抗原肽的肽(所谓之表位肽)。

近来，业已报道了一种表位肽，其中癌抗原肽(也称为“CTL表位”)和辅助肽(也称为“辅助表位”)相连，能有效诱导CTLs。也就是说，辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)为具有多种活性的辅助肽所活化，所述活性包括诱导CTLs分化和维持，以及活化诸如巨噬细胞等的效应物，因此被认为通过癌症抗原增强了CTL-诱导。作为其中辅助肽和癌抗原肽相连的肽的具体例子，报道了编码由HBV-来源的HLA-A2-限制性抗原肽(6肽)、HLA-A11-限制性抗原肽(3肽)和体内有效抗各种表位的CTLs诱导的辅助肽组成的表位肽的DNA(小基因)(Journal of Immunology 1999，162：3915-3925)。实际上，其中CTL表位(相应于黑色素瘤抗原gp100第280-288位的肿瘤抗原肽)和辅助肽

(破伤风毒素来源的T辅助表位)相连的肽已进行了临床试验(Clinical Cancer Res.，2001，7：3012-3024)。

因此，作为特定的实施方案，本发明的肽也包括包含本发明辅助肽和癌抗原肽的表位肽。

就癌抗原肽而言，任何已知的癌抗原肽均可使用；但是，优选使用WT1衍生的癌抗原肽(天然或改变的肽)。具体的例子包括限制HLA-A1、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0206、-A0207、-A11、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401、-Cw0602等的WT1-衍生肽。

WT1-衍生的癌抗原肽的例子包括列于WO2000/18795表II-表XLVI的那些及其具有作为癌抗原肽活性(结合HLA抗原和诱导CTLs活性)的改变的肽。

WT1-衍生的癌抗原肽更具体的例子包括如下：

Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：27)

Cys Tyr Thr Trp Asn Gln MetAsn Leu(SEQ ID NO：28)

Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：29)

Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SBQ ID NO：30)

Ser Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：31)

Ala Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：32)

Abu Tyr Thr Trp Asn Gln MetAsn Leu(SEQ ID NO：33)

Arg Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：34)

Lys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：35)

Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：36)

Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu(SEQ ID NO：37)

Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu(SBQ ID NO：38)

Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu(SEQ ID NO：39)

Arg Val Pro Gly Val Ala Pro THr Leu(SEQ ID NO：40)

Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：41)

Arg Tyr Pro Ser Ala Gln Lys Lys Phe(SBQ ID NO：42)

Arg Tyr Pro Ser Abu Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：43)

Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(SBQ ID NO：44)

Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val(SEQ ID NO：45)

上文中，“Abu”指“α-氨基乙酸”。

其中，如SEQ ID NOS：27和29所示的肽是HLA-A24抗原和HLA-A2抗原结合肽，以及如SEQ ID NOS：44和45所示的肽是HLA-A2抗原结合肽。其他的肽是HLA-A24抗原结合肽。

优选的癌抗原肽是如SEQ ID NO：27，28，29，30，44或45所示的之一。

本发明表位肽更具体的例子包括包含辅助肽，即包含如SEQ IDNOS：2-23任一所示的氨基酸序列并具有结合HLA-DRB1^＊0405和诱导辅助性T细胞活性的10-25个氨基酸的WT1-衍生的部分肽，以及如上述SEQ ID NOS：27-45任一所示的癌抗原肽的那些。

表位肽优选包含由如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列组成的辅助肽以及如SEQ ID NOS：27-45任一所示的癌抗原肽。

更优选地，表位肽包含由如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列组成的辅助肽以及如SEQ ID NOS：27-30，44和45任一所示的癌抗原肽。

表位肽可通过前述肽合成的常用方法制备。也可通过用于DNA合成的常用方法以及基于编码其中多表位连接的表位肽的多核苷酸的序列信息的遗传工程制备。具体来说，其中多表位连接的表位肽可通过插入编码该肽的多核苷酸到已知表达载体中，用所产生的重组表达载体转化宿主细胞，培养转化体，并从培养物中回收目标肽而得到制备。这些过程可依据，例如，描述于文献(Molecular Cloning，T.Maniatis等，GSH Laboratory(1983)，DNA Cloning，DM.Glover，IRL PRESS(1985))中的方法，或在下文中所描述的方法来进行。

所述作为辅助肽的表位肽的活性可依据前述方法得到证实。此外，所述作为癌抗原肽的表位肽的活性可通过将该肽给予人的模型动物得到证实，该模型动物描述于WO02/47474或Int J.Cancer.100，565-570，2002中。

本发明的表位肽被认为能用于建立更有效的癌症治疗或预防，因为在该辅助表位肽中辅助肽部分可活化辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)以提供具有多种活性的活化的辅助性T细胞，所述活性包括诱导CTLs分化和维持，以及活化诸如巨噬细胞的效应物，籍此通过癌抗原肽进一步增强了CTL-诱导。

可以修饰本发明上述肽(天然的、改变的或表位肽)的N-末端氨基酸的氨基或C-末端氨基酸的羧基。其中N-末端和/或C-末端氨基酸残基被修饰的肽落入本发明肽的范围中。

可用于N-末端氨基酸的氨基修饰的基团的例子包括选自：C_1-6烷基、苯基、环烷基和酰基的1-3种基团。酰基包括C_1-6烷酰基、苯基取代的C_1-6烷酰基、C_5-7环烷基取代的羰基、C_1-6烷基磺酰基、苯基磺酰基、C_2-6烷氧羰基、苯基取代的烷氧羰基、C_5-7环烷氧基取代的羰基、苯氧基羰基等等。

在C-末端氨基酸的羧基处修饰的肽的例子包括酯类和酰胺类。酯类具体包括C_1-6烷基酯、苯基取代的C_0-6烷基酯、C_5-7环烷基酯等等。酰胺类具体包括酰胺、为1或2个C_1-6烷基取代的酰胺、为1或2个苯基取代的C_0-6烷基取代的酰胺，形成包含酰胺基团氮原子的5至7元氮杂环烷的酰胺等等。

本发明也提供了一种编码上述提及的本发明肽(天然的、改变的或表位肽)的多核苷酸。该编码本发明肽的多核苷酸可以DNA或RNA的形式存在。基于关于本发明肽的氨基酸序列或编码其DNA的多核苷酸序列的信息，本发明的多核苷酸可容易地得到制备。具体来说，使用DNA合成的常用方法或通过PCR扩增可进行合成。

多核苷酸的具体例子包括编码上述提及的表位肽的那些。更具体地说，多核苷酸的例子包括编码包含辅助肽，即包含如SEQ ID NOS：2-23任一所示的氨基酸序列并具有结合HLA-DRB1^＊0405和诱导辅助性T细胞活性的10-25个氨基酸的WT1-衍生的部分肽，以及如上述SEQ ID NOS：27-45任一所述的癌抗原肽的表位肽的那些。

优选的例子包括编码包含由如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列组成的辅助肽以及如SEQ ID NOS：27-45任一所述的癌抗原肽的表位肽的多核苷酸。

更优选的例子包括编码包含由如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列组成的辅助肽以及如SEQ ID NOS：27-30，44和45任一所述的癌抗原肽的表位肽的多核苷酸。

该“编码本发明肽的多核苷酸”包括能在严禁条件下与所述多核苷酸互补序列杂交且编码的肽具有相当于本发明肽的活性的多核苷酸。关于“在严禁条件下杂交”，在此使用的“杂交”可依据描述于，例如，Sambrook J.，Frisch E.F.，Maniatis T.编，Molecular Cloning第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press，的常规方法进行。术语“严禁条件”指杂交在含有6xSSC(10 x SSC＝1.5M NaCl，1.5M柠檬酸三钠)，50％甲酰胺的溶液中于45℃下进行，接着在2xSSC溶液中于50℃下洗涤(Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6))等等。

可通过将上述制备的多核苷酸整合入表达载体中以构建用于表达本发明肽的重组表达载体。

在此可用的表达载体包括质粒、噬菌体载体、病毒载体等等。

当宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)时，载体的例子包括诸如pUC118，pUC119，pBR332，pCR3等的质粒载体；以及诸如λZAPII，λgt11等的噬菌体载体。当宿主是酵母时，载体的例子包括pYES2，pYEUra3等。当宿主是昆虫细胞时，载体的例子包括pAcSGHisNT-A等。当宿主是动物细胞时，载体的例子包括诸如pKCR，pCDM8，pGL2，pcDNA3.1，pRc/RSV，pRc/CMV等的质粒载体；以及诸如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体等的病毒载体。

表达载体可任选地含有诸如能诱导表达的启动子、编码信号序列的基因、用于选择的标记基因、终止子等的因子。

此外，表达载体可含有容许肽与硫氧还蛋白、组氨酸(His)标签、GST(谷胱甘肽S-转移酶)等作为融合蛋白表达以便促进分离和纯化的附加序列。在这样的情况下可用的载体包括含有在宿主细胞中起作用的合适启动子(lac，tac，trc，trp，CMV，SV40早期启动子等)的GST融合蛋白载体，例如pGEX4T；含有Tag序列(Myc，His等)的载体，例如pcDNA3.1/Myc-His；以及能表达硫氧还蛋白和组氨酸标签融合蛋白的载体，例如pET32a。

可通过用上述所获得的表达载体转化宿主细胞制备含有本发明载体的转化细胞。

在此可用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和动物细胞。大肠杆菌的例子包括诸如HB101，C600，JM109，DH5α和AD494(DE3)的大肠杆菌K-12菌株。酵母的例子包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。动物细胞的例子包括L929，BALB/c3T3，C127，CHO，COS，Vero和Hela细胞。昆虫细胞的例子包括sf9。

可使用适合于上述各种宿主细胞的常规方法将表达载体导入宿主细胞中。具体来说，可使用磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法以及使用用于基因转移的脂质体法(Lipofectamine、Lipofectin；Gibco-BRL)进行导入。在导入后，在含有选择标记物的常规培养基中培养细胞，籍此含有表达载体的转化体可得到选择。

本发明的肽可通过在合适的条件下(在该肽能表达的条件下)培养转化细胞产生。所产生的肽可依据标准的生化纯化程序进行进一步的分离和纯化。该纯化程序包括盐析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。如上所述，当本发明的多肽已作为与硫氧还蛋白、组氨酸标签、GST等的融合蛋白表达时，该肽可通过适当的纯化程序进行分离和纯化，该程序利用了融合蛋白或标签的特性。

本发明提供了一种特异性结合本发明肽的抗体。该本发明的抗体不限于任何形式，可以是抗作为抗原的本发明肽的多克隆或单克隆抗体。

如上所述，在其特异性结合本发明肽的条件下，并不限制本发明的抗体。优选的抗体的例子包括特异性结合辅助肽，即包含如SEQ IDNOS：2-23任一所示的氨基酸序列并具有结合HLA-DRB1^＊0405和诱导辅助性T细胞活性的10-25个氨基酸的WT1-衍生的部分肽，的那些。更优选特异性结合由如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列组成的辅助肽的抗体。

制备抗体的方法在本领域众所周知，且本发明的抗体可依据任一常规方法得到制备(Current protocols in Molecular Biology编辑Ausubel等.(1987)出版商.John Wiley & Sons.11.12-11.13节，Antibodies；A LaboratoryManual，Lane，H，D.等编，Cold Spring HarberLaboratory Press，New York 1989)。

具体来说，本发明的抗体可通过使用本发明的肽作为抗原免疫诸如兔的非人动物，并用常规方法从该免疫的动物血清中回收抗体以获得。就单克隆抗体来说，它们可通过用本发明的肽免疫诸如小鼠的非人动物，将所产生的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，并从所产生的杂交瘤细胞中回收单克隆抗体以获得(Current protocols in MolecularBiology编辑Ausubel等.(1987)出版商.John Wiley & Sons.11.4-11.11节)。

当取决于宿主使用不同佐剂增强免疫应答时，抗本发明肽的抗体也可产生。佐剂的例子包括弗氏(Freund)佐剂；诸如氢氧化铝的矿物凝胶；诸如溶血卵磷脂、

多元醇的表面活性剂、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝素和二硝基苯酚；诸如BCG(Bacille de Calmette-Guerin)或棒状杆菌的人佐剂等。

如上所述，识别本发明肽的抗体和中和其活性的抗体可通过以常规方式免疫动物而容易地得到制备。抗体可用于亲和层析、免疫诊断方法等等。免疫诊断方法可适当地选自免疫印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光或发光测定等等。该免疫诊断方法在诸如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚细胞癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌等的表达WT1基因的癌症诊断中是有效的。

本发明提供了一种药物组合物，包含本发明肽(天然的、改变的和表位型肽)、含有本发明多核苷酸的表达载体或含有本发明表达载体的细胞，以及药学上可接受载体。该药物组合物可有效地用作为辅助性T细胞的诱导物或癌症疫苗功效的增强剂，如下所详述。

(1)一种包含作为有效成分的本发明肽的辅助性T细胞诱导物(癌症疫苗功效的增强剂)

本发明的肽具有诱导辅助性T细胞的活性，且诱导的辅助性T细胞又能增强CTL-诱导的活性，其通过诱导CTLs的分化和维持并活化诸如巨噬细胞的效应物而作用于癌症疫苗。因此，本发明提供了一种包含作为有效成分的本发明的肽的癌症疫苗功效的增强剂(作为用于增强癌症疫苗功效试剂的药物组合物)。当本发明的增强剂给予HLA-DRB1^＊0405-阳性和WT1-阳性的患者时，该肽被呈递至抗原呈递细胞的HLA-DRB1^＊0405抗原；诱导并活化识别该肽与HLA-DRB1^＊0405抗原复合物的特异性辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)；该活化的辅助性T细胞可发挥涉及诱导CTLs分化和维持并活化诸如巨噬细胞的效应物的活性。在该方式中，作为癌症疫苗效应的活化并诱导的CTLs的活性得到增强。

本发明的癌症疫苗功效增强剂可用于预防或治疗伴有升高的WT1基因表达水平的癌症，例如，诸如白血病、脊髓发育异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤的血癌，以及诸如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌的实体癌。

本发明的癌症疫苗功效增强剂可在癌症疫苗给予前或给予后同时给予。

该包含作为有效成分得本发明的肽的癌症疫苗功效增强剂可含有作为有效成分的辅助肽或表位肽，其中所述肽与癌抗原肽(CTL表位)连接。如上所述，近来已显示表位肽中癌抗原肽(CTL表位)和辅助肽(辅助表位)能有效地诱导CTLs。当给予该形式的表位肽时，所述肽插入抗原呈递细胞中；在胞内降解所产生的抗原肽中，辅助肽与MHC II类抗原(HLA-DRB1^＊0405)结合，而癌抗原肽与MHC I类抗原结合；因此所形成的相应的复合物以高密度呈递至抗原呈递细胞表面。当辅助性T细胞识别HLA-DRB1^＊0405抗原和辅助肽复合物时，CTL-诱导的活性，即癌症疫苗的效应，作为诱导CTLs分化和维持及活化诸如巨噬细胞的效应物结果得到进一步增强。另一方面，当CTLs识别癌抗原肽和MHC I类抗原的复合物时，CTLs增殖并破坏癌细胞。因此，包含作为有效成分的本发明表位肽的本发明的药物组合物本身可用作为癌症疫苗，以及癌症疫苗功效的增强剂。

该包含作为有效成分的本发明的肽的癌症疫苗功效增强剂可与药学上可接受的载体，例如，合适的佐剂，一起给予，或以颗粒的形式使得细胞免疫性能有效地建立。关于佐剂，那些描述于文献(Clin.Microbiol.Rev.，7：277-289，1994)等中的是可用的。具体的例子包括微生物来源的成分、细胞因子、植物来源的成分、海洋生物来源的成分、诸如氢氧化铝的矿物凝胶、诸如溶血卵磷脂和Pluronic

多元醇的表面活性剂、聚阴离子、肽、油乳剂(乳剂制剂)等等。也包括脂质体制剂、其中成分结合至具有几微米直径的珠子上的微粒制剂、其中成分附于脂质的制剂等。

可进行例如，皮内、皮下、肌内或静脉内给药。虽然在制剂中本发明肽的剂量可取决于，例如所要治疗的疾病、患者的年龄和体重进行适当调节，其通常在0.0001mg-1000mg范围内，优选0.001mg-1000mg，更优选0.1mg-10mg，优选每几天至每几月给予一次。

本发明也提供一种包含本发明肽与癌抗原肽组合的药物组合物。依据本发明的组合应用，作为癌症疫苗的癌抗原肽效应(即诱导并活化CTLs活性)为本发明的肽所增强，且能更有效地进行癌症的治疗和预防。

术语“组合”包括两种形式，即本发明的肽和癌抗原肽以混合形式或分离形式给予。

可使用先前制备的含有作为混合物的肽的制剂，或在使用前将先前制备的分别包含相应肽的制剂组合以进行混合形式的肽的给予。

在肽以分离形式给予的情况下，该分离制剂可以时间间隔依次给予，或同时给予。当以时间间隔进行给药时，本发明的肽(癌症疫苗功效增强剂)和癌抗原肽(癌症疫苗)可依该顺序给予或以相反的顺序给予。

本发明的肽和癌抗原肽的组合的例子包括试剂盒。

就可与本发明的肽组合使用的癌抗原肽而言，任何通常所知的癌抗原肽都可以使用，例子包括WT1-衍生的癌抗原肽(天然型、改变型)。具体的例子包括如SEQ ID NOS：27-45任一所示的癌抗原肽，优选为SEQ ID NOS：27-30，44和45任一所示的癌抗原肽。

(2)包含作为有效成分的本发明的表达载体的辅助性T细胞诱导物(癌症疫苗功效的增强剂)

含有编码本发明的肽，类似于上述本发明的肽的多核苷酸的表达载体，具有诱导辅助性T细胞的活性，并可用作为本发明癌症疫苗功效增强剂的有效成分。因此，本发明提供了一种包含含有编码本发明的肽的多核苷酸的表达载体作为有效成分的癌症疫苗功效增强剂(即作为增强癌症疫苗功效试剂的药物组合物)。

近来，已显示编码其中癌抗原肽(CTL表位)和辅助肽(辅助表位)相连的表位肽的多核苷酸具有体内有效诱导CTLs的活性。例如，报道了编码其中HBV-来源的HLA-A2-限制性抗原肽(6肽)、HLA-A11-限制性抗原肽(3肽)和辅助肽连接的表位肽的DNA(小基因)体内诱导有效针对各种表位的CTLs(Journal of Immunology 1999，162：3915-3925)。

因此，癌症疫苗功效增强剂的有效成分可通过将编码上述本发明的表位肽的多核苷酸整合入合适的表达载体中而获得。

当给予含有作为癌症疫苗功效增强剂有效成分的本发明的多核苷酸的表达载体时，如下方法可以使用。

就用于将含有本发明多核苷酸的表达载体导入细胞中的方法而言，包括那些利用病毒载体的任何方法或其他方法都可以使用(Nikkei-Science，1994年4月，p20-45；Gekkan-Yakuji，36(1)，p23-48(1994)；Jikken-Igaku-Zokan，12(15)，1994，以及其中所引证的文献)。

利用病毒载体方法的例子包括其中将本发明DNA整合入诸如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒或辛德毕斯(Sindbis)病毒的DNA或RNA病毒，然后导入细胞中的那些。尤其是，利用逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒或牛痘病毒等等的方法是特别优选的。

其他方法的例子包括其中表达载体直接肌内注射(DNA接种)、脂质体法、脂转染(Lipofectin)法、微注射、磷酸钙法以及电穿孔。DNA接种和脂质体法是特别优选的。

至于在实践中将本发明表达载体作为药物应用的方法，存在着其中表达载体直接导入体内的体内方法以及其中表达载体在体外导入某些离体细胞中，然后将细胞再导入体内的先体外后体内方法(Nikkei-Science，1994年4月，20-45；Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994)；Jikken-Igaku-Zokan，12(15)，1994，以及其中所引证的文献)。体内方法是更优选的。

就体内方法而言，取决于所要治疗的疾病和症状，可通过任何合适的途径完成给药。例如，可通过静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌内途径等给药。当通过体内方法进行给药时，组合物可以各种形式进行给药，例如溶液，特别是配制的，例如，以含有作为有效成分的本发明的表达载体的注射液形式，如果需要的话，也可添加常规载体。至于含有本发明的表达载体的脂质体或膜融合的脂质体(例如仙台病毒(HVJ)-脂质体)，它们可以诸如悬液、冷冻药物、离心浓缩的冷冻药物等的脂质体制剂形式存在。

尽管取决于，例如，所要治疗的疾病、患者的年龄和体重，制剂中表达载体的含量可进行适当调节，但通常0.0001mg-100mg，优选0.001mg-10mg的本发明的表达载体可每几天至每几月给予一次。

当上述本发明的表达载体给予HLA-DRB1^＊0405-阳性和WT1-阳性患者时，本发明的肽呈递至抗原呈递细胞的HLA-DRB1^＊0405抗原；诱导并活化了识别该肽和HLA-DRB1^＊0405抗原复合物的特异性辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)；该活化的辅助性T细胞可发挥涉及诱导CTLs分化和维持并活化诸如巨噬细胞的效应物的活性。在该方式中，作为癌症疫苗效应的诱导CTLs的活性得到增强。包含作为有效成分的含有本发明多核苷酸的表达载体的癌症疫苗功效增强剂可用于预防或治疗伴有升高的WT1基因表达水平的癌症，例如，诸如白血病、脊髓发育异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤的血癌，以及诸如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌的实体癌。

在上述给予含有编码表位肽的多核苷酸的表达载体情况下，抗原呈递细胞整合了该表达载体并通过胞内降解产生抗原肽，其中辅助肽和癌抗原肽分别与MHC II类抗原(HLA-DRB1^＊0405)和MHC I类抗原结合，形成复合物。所形成的复合物以高密度呈递至抗原呈递细胞表面。当辅助性T细胞识别HLA-DRB1^＊0405抗原和辅助肽复合物时，CTL-诱导活性，即癌症疫苗效应，通过诱导CTLs分化和维持及活化诸如巨噬细胞的效应物而得到进一步增强。另一方面，当CTLs识别癌抗原肽和MHC I类抗原复合物时，CTLs增殖并破坏癌细胞。因此，包含作为有效成分的含有编码本发明表位肽的多核苷酸的表达载体的本发明药物组合物本身可用作为癌症疫苗，以及癌症疫苗功效的增强剂。

本发明也提供了一种由如SEQ ID NO：1所示的人WT1氨基酸序列中10-25个连续氨基酸组成的肽，所述肽结合HLA-DRB^＊1502并诱导辅助性T细胞。本发明包含其中氨基酸残基的N-末端和/或C-末端被修饰的结合HLA-DRB1^＊1502的抗原肽或其中个别氨基酸残基被改变的那些。

可以类似于上述结合HLA-DRB1^＊0405的本发明抗原肽的方法合成结合HLA-DRB1^＊1502的抗原肽并测定其活性。

本发明的HLA-DRB1^＊1502-结合抗原肽是一种由如SEQ ID NO：1所示的人WT1氨基酸序列中10-25个连续氨基酸组成的部分肽。优选的肽是那些由人WT1氨基酸序列中13-17个连续氨基酸组成的。

本发明是基于发现人WT1含有具有结合HLA-DRB1^＊1502并诱导辅助性T细胞活性的抗原肽部分的。使用用于预测MHC II类结合肽的软件(Propred，Bioinformatics 17：1236，2001)进行可能与HLA-DRB1^＊1502结合的9氨基酸部分(能适合于MHC II类分子肽结合沟槽的9氨基酸部分)的搜索。所鉴定的WT1的9氨基酸部分的例子示于SEQ ID NOS：46-56中。因此，本发明的HLA-DRB1^＊1502结合抗原肽的具体例子包括包含如SEQ ID NOS：46-56任一所示的氨基酸序列，结合HLA-DRB1^＊1502并诱导辅助性T细胞的肽。

所述的肽优选由约10-25个氨基酸组成，更优选由约13-17个氨基酸组成。更优选的实施方案的例子包括WT1衍生的由10-25个氨基酸(优选由13-17个氨基酸)组成的部分肽，其包含如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，且具有结合HLA-DRB1^＊1502和诱导辅助性T细胞的活性。仍更优选的实施方案的例子包括WT1衍生的由16-25个氨基酸(优选由16-17个氨基酸)组成的部分肽，其包含如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，且具有结合HLA-DRB1^＊1502和诱导辅助性T细胞的活性。如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列表示WT1衍生的16氨基酸的部分肽，并包括如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列。

更优选的实施方案是由如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列组成的WT1_332-347肽。

所述WT1_332-347肽是一种非种系选择性辅助肽，其不但与HLA-DRB1^＊0405分子结合，还与HLA-DRB1^＊1502分子结合。因此，WT1_332-347是一种可应用于具有HLA-DRB1^＊0405患者以及同样具有HLA-DRB1^＊1502患者的辅助肽，因此从患者广泛应用范围的观点来看是有用的。

本发明HLA-DRB1^＊1502-结合抗原肽相关的表位肽、多核苷酸、抗体和药物组合物可以类似于上述本发明HLA-DRB1^＊0405-结合抗原肽的方法制备及使用。

实施例

本发明通过如下实施例进一步举例说明，但不应解释为本发明受限于此。

实施例1

1.制备树突细胞

通过密度梯度离心使用菲可帕克(Ficoll-Paque)从HLA-DRB1^＊0405-阳性健康志愿者血液中分离外周血单核细胞(PBMCs)。将所得到的8 x 10⁶个PBMCs悬浮在含1％AB血清的2ml X-VIVO 15^TM培养基(Camblex)中，接种在6孔培养平板中，培养2小时。培养后，除去不贴壁细胞，用Hanks溶液洗涤贴壁细胞。在含1％AB血清、1000U/ml IL-4和1000U/ml GM-CSF的X-VIVO 15^TM培养基中培养贴壁细胞。在培养的第2和4天，将一半的培养基置换为新鲜培养基。在第6天，添加TNF-α使其终浓度为100U/ml。在第7天存活的细胞用作为试验用树突细胞。

2.制备CD4阳性T细胞(辅助性T细胞)

如上述(1)中所述，使用获得自同一健康志愿者的血液。用RPMI培养基将血液稀释2倍。将约100ml稀释的血液添加到用于分离CD4阳性T细胞的抗体混合物(cocktail)，RosetteSep^TM(Stemcell)中，并将混合物在室温下静置20分钟。然后，通过密度梯度离心使用菲可帕克(Ficoll-Paque)收集CD4阳性T细胞。

3.诱导WT1肽特异性CD4阳性T细胞

使用预测程序(Propred，Bioinformatics 17：1236，2001)在WT1蛋白的氨基酸序列(NCBI数据库，登录号P19544，XP_034418，SEQ ID NO：1)中搜索可能结合HLA-DRB1^＊0405的肽。选择并合成了3种肽。这些肽具有与那些存在于WT1如下位置处的氨基酸序列相同的氨基酸序列：

第172-186位：PNHSFKHEDPMGQQG(WT1_172-186，SEQ ID NO：25)；

第225-243位：NLYQMTSQLECMTWNQMNL(WT1_225-243，SEQID NO：26)；以及

第332-347位：KRYFKLSHLQMHSRKH(WT1_332-347，SEQ ID NO：24)。

以3 X 10⁵细胞/孔将上述(1)中制备的树突细胞接种在24孔培养平板中，并添加SEQ ID NO：24的肽至50μg/ml。在培养4小时后，通过X-射线照射(25Gy)使细胞生长停止。以3 x 10⁶细胞/孔将上述(2)中制备的CD4阳性细胞添加到每个孔中，并与树突细胞共培养。至于培养基，使用含1％AB血清的X-VIVO 15^TM培养基。在培养开始后，每2天用新鲜培养基置换一半的培养基并添加IL-2至20U/ml。在从培养开始的第7和14天，收集T细胞并以3 x 10⁶细胞/孔接种在24孔培养平板中，另外再向孔中添加已用20μg/ml肽(SEQ ID NO：24)刺激并经受X-射线照射(25Gy)的3 x 10⁵树突细胞。接着共培养细胞。至于培养基，使用含1％AB血清和20U/ml IL-2的X-VIVO 15^TM培养基。

在第3次刺激后，回收T细胞并以3 x 10⁴细胞/孔接种在96孔平板中。以3 x 10⁴细胞/孔添加已用20μg/ml肽(SEQ ID NO：24)刺激并经受X-射线照射(25Gy)的树突细胞，接着进行共培养。作为阴性对照组，T细胞与未用肽进行刺激的树突细胞共培养，作为阳性对照组，添加0.2％PHA取代树突细胞。在培养80小时后，添加[³H]-胸苷(37kBq/孔)，细胞再培养16小时。然后，使用β-闪烁计数器测量掺入细胞中的[3H]-胸苷。结果示于图1中。当与用WT1_332-347刺激的树突细胞共培养时，用WT1第332-347位的肽(WT1_332-347，SEQ ID NO：24)刺激的CD4阳性T细胞显示了增殖应答。但是，当与未用肽进行刺激的树突细胞共培养时，或与用具有不同于SEQ ID NO：24的SEQ ID NO：25或26的氨基酸序列的肽刺激的树突细胞共培养时，CD4阳性T细胞并不显示增殖应答。这些结果表明WT1_332-347肽(SEQ ID NO：24)作为抗原肽诱导了特异性CD4阳性T细胞。

实施例2

建立特异于WT1肽的CD4阳性T细胞系

将以类似于实施例1的方法制备的树突细胞以10⁴细胞/孔接种在96孔平板中，然后以10³细胞/孔接种为WT1_332-347肽(SEQ ID NO：24)所诱导的CD4阳性T细胞。至于培养基，使用含1％AB血清、20U/mlIL-2和5μg/ml PHA的X-VIVO 15^TM培养基。通过连续培养建立CD-4阳性T细胞系并命名为“G2细胞系”。通过类似于权利要求1的方法测定G2细胞系对用肽刺激的树突细胞的应答。结果示于图2中。当与用WT1_332-347肽刺激的树突细胞共培养时，G2细胞系显示了增殖应答，当与未进行肽刺激的树突细胞共培养时，则不显示增殖应答。

这些结果表明G2细胞系是一种特异于WT1_332-347肽的CD4阳性T细胞系。

实施例3

WT1肽抗原呈递至HLA-DR分子

以类似于实施例1的方法，通过密度梯度离心使用菲可帕克(Ficoll-Paque)从HLA-DRB1^＊0405-阳性健康志愿者血液中分离外周血单核细胞(PBMCs)。然后，以10⁷细胞/孔将PBMCs接种在24孔平板中。至于培养基，使用含10％FCS和55μM 2ME的RPMI1640培养基。添加含EB病毒(EBV)的培养基后，再连续培养4周以建立用EBV转化的B-细胞系，该细胞系命名为“B-LCL(-)细胞”。EBV制备自B95-8(JCRBCell Bank No.9123)的培养物上清液中，该B95-8是一种产生EBV的细胞系。将B-LCL(-)细胞调节到3 x 10⁷细胞/mL，并向其中添加含表达WT1基因病毒的培养基，接着添加聚丙烯(终浓度，8μg/mL)，并以1ml/孔添加该混合物至24孔平板中。培养16小时后，添加1ml新鲜培养基到每个孔中，并继续进行培养。每个孔中添加G418(新霉素)至0.7μg/mL，当导入基因的细胞被选择时，培养平板5-7天。将所选择的表达WT1的B-细胞系命名为“B-LCL(+)细胞”。依据Blood，89：1405，1997中描述的方法，通过RT-PCR技术测定B-LCL(-)和B-LCL(+)细胞表达的WT1基因的量。该测量结果通过将作为阳性对照的K562细胞系的表达量假定为1进行转换。所得到的B-LCL(-)细胞的值为1.6 x 10^-4，而B-LCL(+)细胞的值为3.2，表明WT1基因是高表达的。以类似于实施例2的方法研究G2细胞对B-LCL(+)细胞的应答。在测试组中，在与G2细胞混合前，用抗HLA-DR抗体处理B-LCL(+)细胞以确认HLA-DR-限制性。结果示于图3中。其揭示了当与表达内源性WT1基因的B-LCL(+)细胞共培养时，对肽阳性的CD4阳性T细胞系G2显示了增殖应答，且所述应答为抗-HLA-DR抗体所抑制。这些结果表明WT1_332-347肽是WT1蛋白胞内产生的，且作为抗原内源性呈递至HLA-DR分子。

实施例4

建立特异于WT1 _332-347 肽的CD4阳性T细胞系E04.1

除了在第6天添加的TNF-α终浓度为200IU/ml外，以类似于实施例1的方法使用分离自HLA-DRB1^＊0405-阳性健康志愿者的血液制备树突细胞。使用获得自用于制备树突细胞的同一健康志愿者的血液制备CD4阳性T细胞。依据用于CD4阳性T细胞分离的RosetteSep(StemCell)的说明书分离CD4阳性T细胞。

以类似于实施例1的方法，将上述树突细胞和CD4阳性T细胞用于诱导特异于WT1肽(SEQ ID NO：24，WT1_332-347)的CD4阳性T细胞。通过有限稀释技术连续培养所产生的特异于WT1_332-347肽的CD4阳性T细胞以建立CD4阳性T细胞系E04.1。作为在该有限稀释结束中的饲养细胞，以类似于实施例1的方法制备并通过X-射线照射处理的PBMCs以1 x 10⁵细胞/孔进行接种。至于培养基，使用含20IU/ml IL-2和5μg/ml PHA的X-VIVO 15^TM培养基。

除了在添加[³H]-胸苷后培养持续进行18小时外，通过类似于实施例1的方法测定E04.1细胞系对用WT1_332-347肽刺激的树突细胞的应答。结果示于图4中。当与用WT1_332-347肽刺激的树突细胞共培养时，E04.1细胞显示增殖应答，而与未用该肽刺激的树突细胞共培养时，则不显示增殖应答。这些结果表明E04.1细胞是一种特异于WT1_332-347肽的CD4阳性T细胞系。

实施例5

WT1 _332-347 肽与HLA-DR的特异性结合

将实施例4中建立的E04.1细胞以1 x 10⁴细胞/孔接种在96孔培养平板中。建立自实施例3中HLA-DRB1^＊0405-阳性健康志愿者血液的B细胞系B-LCL(-)细胞用20μg/ml浓度的WT1_332-347肽刺激，并通过X-射线照射处理，以3 x 10⁴细胞/孔接种在96孔平板中，并与E04.1细胞共培养。作为阴性对照组，将不用肽刺激的B-LCL(-)细胞与E04.1细胞共培养。

作为测试组，用20μg/ml的抗-HLA-DR抗体(G46.6，BDParMingen)、抗-HLA-I类抗体(G46-2.6，BD ParMingen)或抗-HLA-DQ抗体(SPVL3，Immunotech)处理已用WT1_332-347肽刺激并经受X-射线照射的B-LCL(-)细胞30分钟，并与E04.1细胞共培养以确认HLA-DR限制性。作为抗体处理的阴性对照组，抗-小鼠IgG抗体处理的细胞以类似的方式与E04.1细胞共培养。

共培养后，以类似于实施例4的方法测定E04.1细胞的生长。结果示于图5中。当与用WT1_332-347肽刺激的B-LCL(-)细胞共培养时，E04.1细胞显示了增殖应答。但是，当用抗-HLA-DR抗体处理WT1_332-347肽刺激的B-LCL(-)细胞时，细胞生长被抑制了。此外，对于用其他抗体处理的WT1_332-347肽刺激的B-LCL(-)细胞，E04.1细胞显示了增殖应答，但是对不用肽刺激的B-LCL(-)细胞则不显示增殖应答。这些结果表明WT1_332-347肽特异性结合HLA分子中的HLA-DR，并诱导特异于WT1_332-347肽的CD4阳性E04.1细胞系的生长。

实施例6

WT1 _332-347 肽与HLA-DRB1 ^＊ 0405的特异性结合

以类似于实施例4的方法从HLA-DRB1^＊0405-阳性或阴性健康志愿者血液中制备PBMCs。然后，PBMCs用20μg/ml的WT1_332-347肽刺激并经受X-射线照射，以3 x 10⁴细胞/孔接种在96孔平板中。然后，以1 x 10⁴细胞/孔将E04.1细胞接种到该96孔平板中，共培养细胞。作为阴性对照组，将不用肽刺激的PBMCs与E04.1细胞共培养。

共培养后，以类似于实施例4的方法测定E04.1细胞的生长。结果示于图6中。供体1(HLA-DRB1^＊0405/0803)和供体2(HLA-DRB1^＊0405/0101)是HLA-DRB1^＊0405-阳性的，与分离自每个供体的PBMCs共培养、并用WT1_332-347肽刺激的E04.1细胞显示了增殖应答。另一方面，供体3(HLA-DRB1^＊0101/1001)和供体4(HLA-DRB1^＊1201/0802)是HLA-DRB1^＊0405-阴性的，与分离自每个供体的PBMCs共培养并用WT1_332-347肽刺激的E04.1细胞并不显示增殖应答。此外，在所有的情况下，当使用不用肽刺激的PBMCs时，没有观察到增殖应答。上述结果表明WT1_332-347肽与显示多态性的HLA-DRB1分子中的HLA-DRB1^＊0405特异性结合，并诱导WT1_332-347特异性CD4阳性细胞系E04.1的生长。

实施例7

WT1 _332-347 肽抗原呈递至HLA-DRB1 ^＊ 0405

如实施例3所述，建立自HLA-DRB1^＊0405·阳性健康志愿者血液的B-LCL(-)细胞(B-细胞系)和B-LCL(+)细胞(表达WT1的B-细胞系)，分别经受X-射线照射并以3 x 10⁴细胞/孔接种至在96孔平板中。E04.1细胞以1 x 10⁴细胞/孔接种并共培养。然后以类似于实施例4的方法测定E04.1细胞的生长应答。结果示于图7中。当与表达WT1的B-LCL(+)细胞共培养时，E04.1细胞显示了增殖应答，但与不表达WT1的B-LCL(-)细胞共培养时，则不显示增殖应答。

接着，已诱导凋亡的B-LCL(-)或B-LCL(+)细胞(分别为1 x 10⁵细胞)与以类似于实施例4的方法制备自HLA-DRB1^＊0405-阳性健康志愿者血液的树突细胞(3 x 10⁴细胞)共培养16小时，接种在96孔平板的孔中，并与E04.1细胞(1 x 10⁴细胞)共培养。然后，以类似于实施例1的方法测定E04.1细胞的生长应答。结果示于图8中。当与用凋亡诱导的B-LCL(+)细胞刺激的树突细胞共培养时，E04.1细胞显示了增殖应答，但与用凋亡诱导的B-LCL(-)细胞刺激的树突细胞共培养时，则不显示增殖应答。这些结果表明WT1_332-347肽首先是通过B-LCL(+)细胞中降解的WT1蛋白产生的，接着呈递至HLA-DRB1^＊0405并诱导E04.1细胞的增殖。

通过渗压休克进行B-LCL(-)和B-LCL(+)细胞的凋亡的诱导。即，将1 x 10⁶细胞悬浮在500μl的高渗培养基(含0.5M蔗糖、10％w/v聚乙二醇1000和10mM HEPES，pH7.2的RPMI培养基)中，并在37℃下静置10分钟。然后在调节到37℃前，用低渗培养基(60％RPMI，40％水)稀释该培养物30倍，并在37℃下静置2-3分钟。通过在室温下离心5分钟收集细胞并用作为凋亡诱导细胞。通过用于死亡细胞染色的荧光染料(碘化丙锭，和膜联蛋白V，即磷脂酰丝氨酸-结合试剂)来确证凋亡的诱导。

实施例8

用WT1 _332-347 肽活化E04.1细胞

以类似于实施例4的方法用WT1_332-347肽刺激制备来自HLA-DRB1^＊0405-阳性健康志愿者血液的树突细胞，与E04.1细胞混合，培养24小时。作为阴性对照组，将不用肽刺激的树突细胞与E04.1细胞混合。培养24小时后，添加终浓度为10μg/ml的布雷菲德菌素(Brefeldin)A以抑制E04.1细胞的胞外分泌。此外，在又培养6小时后回收CD4阳性T细胞，并用含2％甲醛的PBC固定，用含0.1％皂角甙的渗透性溶液处理以增加抗体的细胞膜渗透性。然后，通过用PE-标记的抗IFN-γ抗体(BD，PharMingen)和FITC-标记的抗-IL-4抗体(BD，PharMingen)对所处理的细胞进行胞内染色，并使用流式细胞仪进行分析。结果示于图9中。揭示了E04.1细胞，当与用WT1_332-347肽刺激的树突细胞共培养时，强烈诱导产生了Th-1型细胞因子IFN-γ，但没有产生Th-2型细胞因子IL-4。

通过用抗-CD4抗体和抗-CXCR3抗体染色未经刺激的E04.1细胞，并通过流式细胞仪进行分析。结果示于图10中。揭示了超过90％的E04.1细胞是Th-1型CD4阳性T细胞，且为对CD4和CXCR3阳性。已知CXCR3是一种在Th-1型免疫细胞上高表达的趋化因子受体。

上述结果表明WT1_332-347肽活化WT1_332-347特异性CD4阳性细胞系E04.1细胞，并诱导细胞产生Th-1型细胞因子IFN-γ。这些结果表明WT1_332-347肽活化并使CD4阳性T细胞分化为Th-1型。

实施例9

通过WT1 _332-347 肽增强WT1-特异性CTLs的诱导和活化

以类似于实施例4的方法使用用于建立E04.1细胞的同一健康志愿者(HLA-A^＊2402/1101，Drb1^＊0405.0803)血液制备PBMCs，并以3 x 10⁴细胞/孔接种在24孔培养平板中。以如下方式向孔中添加WT1_235-243肽(SEQ ID NO：27)和E04.1细胞，并在37℃下培养平板7天，即WT1_235-243肽(20μg/ml)；WT1_235-243肽(20μg/ml)+WT1_332-347肽(20μg/ml)；WT1_235-243肽(20μg/ml)+E04.1细胞(1.5 x 10⁶细胞/孔)；或WT1_235-243肽(20μg/ml)+WT1_332-347肽(20μg/ml)+E04.1细胞(1.5 x 10⁶细胞/孔)。至于培养基，使用含10％AB血清的X-VIVO 15^TM培养基。在此使用的WT1_235-243肽是一种具有诱导HLA-A^＊2402-限制性CTLs活性的癌抗原肽(WO2004/024175)。

培养7天后，回收细胞并用抗-CD8抗体(BD PharMingen)和WT1_235-243肽/HLA-A^＊2402特异性PE-标记的四聚物染色一半的细胞，通过流式细胞仪进行分析。结果示于图11(A-D)中。业已报道了用WT1_235-243肽刺激PBMCs产生了对CD8和WT1_235-243肽/HLA-A^＊2402阳性的WT1_235-243肽特异性CTL前体的诱导(Cancer ImmunolImmunother，51，p614-620(2002))。当用WT_1235-243肽单独刺激PBMCs时，WT1_235-243肽特异性CTL前体的百分比是0.12％(图11-A)。当用WT1_235-243肽加WT1_332-347肽进行刺激时，WT1_235-243肽特异性CTL前体的百分比增加到0.69％(图11-B)。当用WT1_235-243肽加E04.1细胞进行刺激时，WT1_235-243肽特异性CTL前体的百分比进一步增加到4.51％(图11-C)。当用WT1_235-243肽加WT1_332-347肽加E04.1细胞进行刺激时，WT1_235-243肽特异性CTL前体的百分比又增加到7.12％(图11-D)。

将另一半回收的细胞(3 x 10⁵细胞)与用WT1_235-243肽刺激并经受X-射线照射(30Gy)的树突细胞培养6小时。在培养开始1小时后，添加布雷菲德菌素A以抑制细胞的胞外分泌。培养再持续5小时，并用抗-CD8抗体和WT1_235-243肽/HLA-A^＊2402-特异性PE-标记的四聚物对细胞染色。固定细胞并用渗透性溶液处理以增加细胞膜渗透性，以类似于实施例8的方法用PE-标记的抗IFN-γ抗体进行胞内染色。作为阴性对照组，用APC-标记的抗-小鼠IgG抗体(BD PharMingen)染色细胞，且对IFN-γ和小鼠IgG都是阳性的细胞群作为非特异性染色被排除。

结果示于图12(A-D)中。当用WT1_235-243肽刺激WT1_235-243肽特异性CTL前体6小时时，诱导了并对CD8、WT1_235-243肽/HLA-A^＊2402阳性和IFN-γ阳性的、特异于活化的WT1_235-243肽的CTLs。当用WT1_235-243肽单独刺激时，特异于活化的WT1_235-243肽的CTLs的百分比为17.0％(图12-A)。当用WT1_235-243肽加WT1_332-347肽刺激时，特异于活化的WT1_235-243肽的CTLs的百分比增加到23.3％(图12-B)。当用WT1_235-243肽加E04.1细胞刺激时，特异于活化的WT1_235-243肽的CTLs的百分比增加到25.7％(图12-C)。当用WT1_235-243肽加WT1_332-347肽加E04.1细胞刺激时，特异于活化的WT1_235-243肽的CTLs的百分比增加到39。0％(图12-D)。

从上述结果中，揭示了WT1_332-347肽是一种增强WT1特异性CTL前体诱导和活化的辅助肽。也揭示了E04.1细胞是一种增强WT1特异性CTLs活化的辅助性T细胞，其辅助功能通过WT1_332-347肽得到增加，并增强了WT1特异性CTLs活化。

实施例10

WT1 _332-347 肽非种系选择性特性的研究

研究WT1_332-347肽是否也能与据说许多日本人具有的HLA-DRB1^＊1502分子结合，以及作为非种系选择性辅助肽对WT1_332-347特异性CD4阳性T细胞的诱导。

3.实验方法

1)制备树突细胞(DC)

外周血单核细胞(PBMCs)分离自健康志愿者(HLA-DRB1^＊1502/1403)的外周血中，并以1 x 10⁷细胞/孔接种在使用1％AB-型血清(Nabi，Miami，FL)和X-VIVO 15^TM培养基(Cambrex)的6孔塑料平板中，培养2小时。在除去不贴壁细胞后，在含1000IU/ml IL-4(PeproTech)、1000IU/ml GM-CSF(PeproTech)、1％AB型血清和X-VIVO15^TM的培养基中培养剩下的贴壁细胞。在第2和4天，更换培养基并添加IL4和GM-CSF，在第6天，添加TNF-α至100IU/ml以使树突细胞成熟。

2)诱导WT1_332-347特异性CD4阳性T细胞

使用用于分离CD4阳性T细胞的RosetteSep(StemCell)自同一志愿者的血液分离CD4阳性T细胞。将所获得的CD4阳性T细胞以3 x 10⁶细胞/孔接种在24孔平板中，并用经WT1_332-347肽(20μg/ml)刺激并经受放射线照射(25Gy)的自体树突细胞(3 x 10⁵细胞)进行刺激。刺激的第2天，添加IL-2至20IU/ml。以类似的方法，用经WT1_332-347肽(20μg/ml)刺激的树突细胞每隔一周刺激经刺激的CD4阳性T细胞一次。此外，在第二次刺激后使用含IL-2培养基每隔一天更换培养基一次。在该实验中，所诱导的CD4阳性T细胞总共经过3次刺激。

3)生长测定

通过[³H]-胸苷掺入法进行生长测定。将肽刺激诱导的CD4阳性T细胞(3 x 10⁴细胞；效应物)与用选自WT1_332-347、WT1_172-186和WT1_225-243肽的肽刺激并经受放射线照射的PBMCs(1 x 10⁵细胞；“刺激物”)在96孔平板中共培养。作为阴性对照，使用不用肽刺激的DC(-)。80小时共培养后，以37kBq/孔添加[³H]-胸苷(Amersham Biosciences)。该平板温育又16小时并用β闪烁计数器测定。度量单位是“计数/分钟(cpm)”，每次测定重复进行三次。

4)通过流式细胞仪分析细胞因子产生

以生长测定相同的方法，将CD4阳性T细胞与刺激物共培养2小时，并向其中添加布雷菲德菌素A。4小时后，回收细胞，进行固定和渗透处理，用FITC-标记的抗-IL-4抗体(BD Pharmingen)和PE-标记的抗-IFN-γ抗体(BD Pharmingen)染色，通过流式细胞仪进行分析。

5)ELISA测定

通过放射线照射(25Gy)用或不用WT1_332-347肽刺激的PBMCs(6 x 10⁵细胞)，每组细胞与WT1_332-347诱导的CD4阳性T细胞(6 x 10⁵细胞)共培养。72小时培养后，回收上清液，将300μl溶液用于IL-4和IFN-γ测定。

6)TCR反应谱测定

使用TCR V β反应谱试剂盒(BECKMAN COULTER)、FACsort(BECTON DICKINSON)对WT1_332-347肽诱导的CD4阳性T细胞的T-细胞受体(TCR)β链的反应谱进行分析。

2.实验结果

分离自健康志愿者(HLA-DRB1^＊1502/1403)血液的CD4阳性T细胞用经WT1_332-347肽刺激的自体树突细胞总共刺激3次。通过分别使用WT1_172-186、WT1_225-243和WT1_332-347肽的生长测定，研究所诱导的CD4阳性T细胞对该肽的特异性。结果，WT1_332-347肽诱导的CD4阳性T细胞在缺少该肽或在用WT1_172-186或WT1_225-243刺激的条件下无法增殖，但当用WT1_332-347刺激时，增殖达约10倍之多(图13)。根据这些结果，诱导的CD4阳性T细胞对WT1_332-347具有特异性。

WT1_332-347肽诱导的CD4阳性T细胞进行TCR反应谱测定。结果示于图14中。具有Vβ3的细胞和具有Vβ20的那些占优势，分别占总数的10％。

这些占优势的CD4阳性T细胞通过分选分离，具有Vβ3的细胞系命名为E15.1亚系，而具有Vβ20的命名为E15.2亚系。在这两种细胞系中，E15.2亚系显示了对WT1_332-347肽更高的应答(图15)。

然后，用WT1_332-347肽刺激E15.2亚系，通过胞内染色法测定所分泌的IL-4和IFN-γ。结果，揭示了IFN-γ(Th-1型细胞因子)而非IL-4(Th-2型细胞因子)在所述细胞系产生的细胞因子中占优势(图16)。也揭示了E15.2亚系的WT1_332-347特异性增殖应答取决于WT1_332-347的浓度(图17)。这些结果表明E15.2亚系是一种特异于WT1_332-347的Th-1型CD4阳性T细胞系。

如上所述，有可能从对HLA-DRB1^＊1502分子阳性，但对HLA-DRB1^＊0405分子阴性的健康志愿者来源的CD4阳性T细胞诱导特异于WT1_332-347的Th-1型CD4阳性T细胞系。基于这些结果，认为所述的CD4阳性T细胞参与细胞免疫性并可通过分泌细胞因子活化CTLs。因此，通过组合使用WT1_332-347和能活化CTLs的HLA-I类限制性WT1肽(癌抗原肽)，显示了抗肿瘤效应可进一步得到增强。

用WT1_332-347肽刺激来自HLA-DRB1^＊1502阳性健康志愿者(1502/0901)或HLA-DRB1^＊1502阴性健康志愿者(1302/0803)的PBMCs以获得刺激物。将刺激物分别与E15.2亚系共培养，并通过生长测定分析对WT1_332-347特异性的增殖。结果示于图18中。在HLA-DRB1^＊1502-阳性的健康志愿者中，观察到WT1_332-347特异性增殖，但在HLA-DRB1^＊1502-阴性的健康志愿者中，没有观察到增殖(图18)。这表明E15.2亚系的WT1_332-347特异性增殖限于HLA-DRB1^＊1502。

如上所述，使用特异于WT1_332-347肽的Th-1型CD4阳性T细胞系的E15.2亚系进行分析，表明WT1_332-347是一种非种系选择性辅助肽，其不但与HLA-DRB1^＊0405分子结合，还与HLA-DRB1^＊1502分子结合，这些分子在日本人中出现频率分别为第一和第三。

工业实用性

本发明提供了一种WT1衍生的HLA-DRB1^＊0405结合性抗原肽，编码所述肽的多核苷酸，包含所述肽或多核苷酸的辅助性T细胞诱导物等等。本发明的辅助性T细胞诱导物用作为癌症疫苗功效的增强剂。本发明的癌症疫苗功效增强剂可适用于许多HLA-DRB1^＊0405阳性的癌症患者，尤其用作为WT1疫苗功效增强剂。

序列表

<110>Haruo，Sugiyama

<120>WT1衍生的HLA-DR结合抗原肽

<130>

<140>2003-375603

<141>2003-11-05

<160>56

<170>Patentln Ver.2.1

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Claims

1.一种肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，且其结合HLA-DRB1^＊0405并诱导辅助性T细胞。

2.一种编码权利要求1所述的肽的多核苷酸。

3.一种含有权利要求2所述的多核苷酸的表达载体。

4.一种含有权利要求3所述的表达载体的细胞。

5.一种生产权利要求1所述的肽的方法，其包括在该肽能表达的条件下培养权利要求4所述的细胞。

6.一种特异性结合权利要求1所述的肽的抗体。

7.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的肽，以及药学上可接受的载体。

8.权利要求1所述的肽在制造药物组合物中的应用，所述药物组合物用于治疗或预防癌症。

9.权利要求1所述的肽在制造药物组合物中的应用，所述药物组合物为辅助性T细胞诱导剂。

10.权利要求1所述的肽在制造药物组合物中的应用，所述药物组合物为癌症疫苗效力增强剂。

11.权利要求10的应用，其中所述癌症疫苗为癌症抗原肽疫苗。

12.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的肽以及癌抗原肽。

13.权利要求1所述的肽以及癌抗原肽的组合在制造癌症治疗或预防药物组合物中的应用。