CN102803487A - 癌抗原辅助肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及WT1肽和包含WT1肽的药物组合物等，所述WT1肽具有由来源于WT1蛋白的连续氨基酸组成的氨基酸序列，并通过与MHC II类分子结合而诱导WT1特异性辅助性T细胞。

Description

癌抗原辅助肽
技术领域
本发明涉及WT1辅助肽、编码所述肽的多核苷酸、由所述肽诱导的WT1特异性辅助性T细胞、包含它们的用于治疗/预防癌症的药物组合物。本申请要求2009年4月23日申请的日本专利申请号2009-105286的优先权，日本专利申请号2009-105286的公开内容通过引用结合到本文中。
背景技术
WT1基因(维尔姆斯瘤(Wilms’tumor)1基因)是一种被鉴定为儿童期肾癌维尔姆斯瘤诱发基因的基因(非专利文献1和2)，并且是具有锌指结构的转录因子。WT1基因最初被认为是癌症抑制基因。然而，随后的研究表明，上述基因更合适充当造血器官肿瘤和实体癌的癌基因(非专利文献3-6)。
由于WT1基因在许多恶性肿瘤中高表达，因此已经证实作为没有突变的自身蛋白的WT1基因产物是否存在体内免疫原性。结果表明，来源于在肿瘤细胞中高表达的WT1基因的蛋白质被胞内加工成片段，所得到的肽与展示在细胞表面上的MHC I类分子形成复合物，通过WT1肽疫苗接种可诱导识别这类复合物的细胞毒性T细胞(下文亦称CTL)(非专利文献7-9)。研究还表明，用WT1肽或WT1 cDNA免疫的小鼠以高比率排斥植入的表达WT1基因的肿瘤细胞(非专利文献7和10)，但内源性表达WT1基因的正常组织不被诱导的CTL破坏(非专利文献7)。在此之前，有研究强有力的表明，不仅仅在小鼠中而且还在人中可诱导WT1特异性CTL，而且这类CTL具有针对高表达WT1基因的肿瘤细胞的细胞毒活性，但对于内源性表达WT1基因的正常细胞没有细胞毒活性(非专利文献7和10-14)。
另一方面，据报道，为了有效地诱导CTL，对癌抗原有特异性的辅助性T细胞的存在十分重要(非专利文献15)。辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)通过识别MHC II类分子与抗原呈递细胞上的抗原肽的复合物被诱导、增殖和激活。活化的辅助性T细胞产生IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干扰素(IFN)等细胞因子并促进B细胞和其它T细胞亚群的增殖、分化和成熟。因此，有研究认为，与MHC II类分子结合的抗原肽通过诱导辅助性T细胞，有效地激活CTL等，并提高免疫功能(非专利文献16)。在此之前，有关WT1仅报道了与MHC II类分子的HLA-DRB1*0401和HLA-DRB1*0405结合的抗原肽(非专利文献17和专利文献1)，有必要寻找针对其它亚型的抗原肽。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开号WO 2005/045027
非专利文献：
非专利文献1：Daniel A.Haber等，Cell.1990年6月29日；61(7)：1257-69。
非专利文献2：Call KM等，Cell.1990年2月9日；60(3)：509-20。
非专利文献3：Menke AL等，Int Rev Cytol.1998；181：151-212。综述。
非专利文献4：Yamagami T等，Blood.1996年4月1日；87(7)：2878-84。
非专利文献5：Inoue K等，Blood.1998年4月15日；91(8)：2969-76。
非专利文献6：Tsuboi A等，Leuk Res.1999年5月；23(5)：499-505。
非专利文献7：Oka Y等，J Immunol.2000年2月15日；164(4)：1873-80。
非专利文献8：Melief CJ等，Immunol Rev.1995年6月；145：167-77。
非专利文献9：Ritz J，J Clin Oncol.1994年2月；12(2)：237-8。
非专利文献10：Tsuboi A等，J Clin Immunol.2000年5月；20(3)：195-202。
非专利文献11：Oka Y等，Immunogenetics.2000年2月；51(2)：99-107。
非专利文献12：Ohminami H等，Blood.2000年1月1日；95(1)：286-93。
非专利文献13：Gao L等，Blood.2000年4月1日；95(7)：2198-203。
非专利文献14：Ohminami H等，Blood.2000年1月1日；95(1)：286-93。
非专利文献15：Cancer.Res.62：6438，2002。
非专利文献16：J.Immunol.Immunother.，24：195，2001。
非专利文献17：Cancer.Immunol.Immunother.51：271，2002。
发明内容
发明要解决的技术问题
因此，本发明要达到的目的是提供通过与各种MHC II类分子结合而诱导WT1特异性辅助性T细胞的肽、编码所述肽的多核苷酸、由所述肽诱导的WT1辅助性T细胞以及包含它们的用于治疗/预防癌症的药物组合物。
解决技术问题的技术手段
本发明人进行了深入研究以达到上述目的。结果发现，具有编码WT1蛋白的连续氨基酸序列的一部分的肽起癌抗原辅助肽的作用，换句话说，所述肽通过与MHC II类分子结合而展示在抗原呈递细胞上，并且诱导WT1特异性辅助性T细胞，且显示该肽可用于治疗/预防癌症的药物组合物。
因此，本发明提供：
(1)一种肽，其具有由来源于WT1蛋白的连续氨基酸组成的氨基酸序列，并通过与MHC II类分子结合诱导WT1特异性辅助性T细胞，其中氨基酸序列选自：
(a)SEQ ID NO：3所述氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：4所述氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：5所述氨基酸序列；和
(d)一种氨基酸序列，其中(a)-(c)所述氨基酸序列中一个或几个氨基酸被取代、缺失或添加；
(2)(1)中的肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO：3所述氨基酸序列；
(3)(1)或(2)中的肽，其中MHC II类分子选自DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*0802、DRB1*0803、DRB1*0901、DRB1*1201、DRB1*1403、DRB1*1501、DRB1*1502、DPB1*0201、DPB1*0202、DPB1*0402、DPB1*0501、DPB1*0901、DQB1*0301、DQB1*0302、DQB1*0401、DQB1*0501、DQB1*0601、DQB1*0602和DRB5*0102；
(4)(1)或(2)中的肽，其中MHC II类分子选自DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*1502、DPB1*0201、DPB1*0202和DQB1*0601；
(5)编码(1)-(4)中任一项的肽的多核苷酸；
(6)包含(5)中的多核苷酸的表达载体；
(7)抗(1)-(4)中任一项的肽或(5)的多核苷酸的抗体；
(8)一种用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含(1)-(4)中任一项的肽、(5)中的多核苷酸或(6)中的载体；
(9)一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将有效量的(1)-(4)中任一项的肽、(5)中的多核苷酸或(6)中的载体给予具有(3)或(4)中的MHC II类分子的受试者；
(10)(1)-(4)中任一项的肽、(5)中的多核苷酸或(6)中的载体在治疗或预防癌症中的用途；
(11)通过(3)或(4)中的MHC II类分子展示(1)-(4)中任一项的肽的抗原呈递细胞；
(12)一种用于诱导抗原呈递细胞的方法，所述方法包括在(1)-(4)中任一项的肽的存在下培养不成熟的抗原呈递细胞，并从不成熟的抗原呈递细胞中诱导通过(3)或(4)中的MHC II类分子展示肽的抗原呈递细胞；
(13)(1)-(4)中任一项的肽所诱导的WT1特异性辅助性T细胞；
(14)一种用于诱导WT1特异性辅助性T细胞的方法，所述方法包括在(1)-(4)中任一项的肽的存在下培养外周血单核细胞，并从外周血单核细胞中诱导WT1特异性辅助性T细胞；
(15)一种诱导WT1特异性辅助性T细胞的试剂盒，其包括(1)-(4)中任一项的肽作为必需成分；
(16)一种用于预防或治疗癌症的试剂盒，其包括(1)-(4)中任一项的肽、(5)中的多核苷酸或(6)中的载体作为必需成分；
(17)一种在具有(3)或(4)中的MHC II类分子的受试者中测定WT1特异性辅助性T细胞的存在情况或量的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使(1)-(4)中任一项的肽与得自受试者的样品反应；然后
(b)测定样品中所包含的细胞因子的存在情况或量。
发明的有益效果
按照本发明，可获得与以下多种类型的MHC II类分子结合的WT1辅助肽：例如DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*0802、DRB1*0803、DRB1*0901、DRB1*1201、DRB1*1403、DRB1*1501、DRB1*1502、DPB1*0201、DPB1*0202、DPB1*0402、DPB1*0501、DPB1*0901、DQB1*0301、DQB1*0302、DQB1*0401、DQB1*0501、DQB1*0601、DQB1*0602和DRB5*0102；还可获得一种包含所述WT1辅助肽的用于治疗/预防癌症的药物组合物。因此，在各类受试者(具体地讲大多数日本人具有上述分子)中体内和体外诱导WT1特异性辅助性T细胞是可能的。因为本发明诱导了WT1特异性辅助性T细胞，因此也可能在高表达WT1的癌中有效地激活T细胞和B细胞。
附图简述
图1表示通过在用各种肽刺激各肽特异性T细胞系后测定细胞增殖得到的结果，所述细胞系通过用3种肽(mWT135、mWT186和mWT1294)的每一种进行脉冲来制备。图中，符号“-”表示无肽刺激。
图2表示通过在抗MHC I类或II类抗体存在下用各种相应肽刺激各肽特异性T细胞系后测定细胞增殖得到的结果，所述细胞系通过用3种肽(mWT135、mWT186和mWT1294)进行脉冲制备。图中，符号“-”表示无肽刺激。纵坐标中的符号“cpm”表示每分钟计数。
图3表示通过测定各WT1肽特异性T细胞系响应以下细胞进行的细胞增殖而得到的结果：C1498细胞、用3种肽(mWT135、mWT186和mWT1294)进行脉冲的C1498细胞以及强制表达WT1蛋白的C1498细胞。纵坐标中的符号“cpm”表示每分钟计数。
图4表示通过在用3种肽(mWT135、mWT186和mWT1294)进行脉冲制备的各肽特异性T细胞系中测定产IFN-γ能力得到的结果。
图5表示通过测定3种肽(mWT135、mWT186和mWT1294)的CTL细胞毒活性而得到的结果。●表示使用用WT1126肽(MHC I类限制性肽)进行脉冲的RMAS细胞进行实验的结果。○表示使用对照RMAS细胞进行实验的结果。
图6表示在肿瘤植入实验中进行肿瘤植入和免疫的时间序列的示意图。在给小鼠皮下植入表达WT1的白血病细胞后第7、14和21天用mWT135辅助肽进行免疫，以及在第29天进行解剖。向下的白色箭头表示皮内给予对照(PBS)(IFA/30μl)的时间点。向下的黑色箭头表示皮内给予mWT135辅助肽(50μM/IFA/30μl)的时间点。
图7表示用mWT135辅助肽免疫的小鼠中的肿瘤大小和无病小鼠群的比例。在用mWT135辅助肽免疫的小鼠中，10只小鼠中有4只无病。另一方面，在用对照免疫的小鼠中，9只小鼠中不存在无病小鼠。
图8表示在用mWT135辅助肽免疫的小鼠中的无病存活率。
图9表示CTL在用mWT135辅助肽免疫的小鼠中的细胞毒活性。●表示使用用mWT1126肽(MHC I肽)进行脉冲的RMAS细胞进行实验的结果。○表示使用对照RMAS细胞进行实验的结果。圆括号内的数字表示肿瘤大小(mm)。
图10表示mWT1特异性CTL在对照小鼠中的细胞毒活性。●表示使用用mWT1126肽(MHC I肽)进行脉冲的RMAS细胞进行实验的结果。○表示使用对照RMAS细胞进行实验的结果。圆括号内的数字表示肿瘤大小(mm)。
图11表示当给予mWT135肽时，mWT1126肽特异性CTL的细胞毒活性(左)和WT1126四聚体阳性T细胞的比例(右)。
图12表示在具有MHC II类分子的各健康受试者的外周血单核细胞中，通过测定WT135肽刺激的细胞增殖而得到的结果。
图13表示当将应答物(Responder)[从DRB1*0101/0405、DPB1*0201/0402和DQB1*0401/0501的阳性健康受试者(健康受试者A)中得到的PBMC]用刺激物(Stimulator)[从DRB1*0405/0901、DPB1*0201/0501和DQB1*0303/0401的阳性健康受试者(健康受试者B)中得到的PBMC]处理时，通过测定细胞增殖而得到的结果。纵坐标表示所掺入的3H-胸苷的量(cpm)。横坐标表示所加入的各种抗体类型(无抗体、抗HLA-DR抗体、抗HLA-DP抗体和抗HLA-DQ抗体)。
图14表示当将应答物[从DRB1*0101/0405、DPB1*0201/0402和DQB1*0401/0501的阳性健康受试者(健康受试者A)中得到的PBMC]用刺激物[从DRB1*0405/0803、DPB1*0202/0501和DQB1*0401/0601的阳性健康受试者(健康受试者G)中得到的PBMC]处理时，通过测定细胞增殖而得到的结果。纵坐标表示所掺入的3H-胸苷的量(cpm)。横坐标表示所加入的各种抗体类型(无抗体、抗HLA-DR抗体、抗HLA-DP抗体和抗HLA-DQ抗体)。
图15表示当将应答物[从具有DRB1*0101/0405、DPB1*0201/0402和DQB1*0401/0501(健康受试者A)的健康受试者中得到的PBMC]用刺激物[从DRB1*0101/0803、DPB1*0501/-和DQB1*0501/0601阳性健康受试者(健康受试者H)中得到的PBMC]处理时，通过测定细胞增殖而得到的结果。纵坐标表示所掺入的3H-胸苷的量(cpm)。横坐标表示所加入的各种抗体类型(无抗体、抗HLA-DR抗体、抗HLA-DP抗体和抗HLA-DQ抗体)。
图16表示当将应答物[从DRB1*0405/0803、DPB1*0202/0501和DQB1*0401/0601的阳性健康受试者(健康受试者G)中得到的PBMC]用刺激物(导入DQB1*0601基因的L细胞)处理时，通过测定产IFN-γ能力而得到的结果。纵坐标表示T细胞中IFN-γ的量的比例。横坐标表示用WT135肽的脉冲的存在与否(+或-)。
图17表示当将应答物[从DRB1*1502/1502、DPB1*0201/0901和DQB1*0601/0601的阳性健康受试者(健康受试者D)中得到的PBMC]用刺激物(从与应答物中相同健康受试者中得到的PBMC)处理时，通过测定细胞增殖而得到的结果。纵坐标表示所掺入的3H-胸苷的量(cpm)。横坐标表示所加入的各种抗体类型(无抗体、抗HLA-DR抗体、抗HLA-DP抗体和抗HLA-DQ抗体)。
图18表示当将应答物[从DRB1*0101/1501、DPB1*0201/0402和DQB1*0501/0602的阳性健康受试者(健康受试者I)中得到的PBMC]用刺激物(从与应答物中相同健康受试者中得到的PBMC)处理时，通过测定产IFN-γ能力而得到的结果。纵坐标表示T细胞中IFN-γ的量的比例。横坐标表示用WT135肽的脉冲的存在与否(+或-)。
实施发明的方式
一方面，本发明涉及具有由来源于小鼠或人WT1蛋白的氨基酸组成的氨基酸序列的肽。WT1基因在例如以下肿瘤和癌中高表达：造血器官肿瘤，例如白血病；骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤；实体癌，例如胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。因此，本发明的肽存在于大量表达WT1基因的癌细胞中。
本发明的肽是这样的肽，其具有由来源于SEQ ID NO：2中所述的人WT1蛋白的连续氨基酸组成的氨基酸序列，保持与下述MHC II类分子结合的能力，并具有诱导WT1特异性辅助性T细胞的能力。对于本发明的肽的氨基酸序列和长度没有特殊限制，只要肽具有上述特征即可。然而，太长的肽易受蛋白酶作用的影响，而太短的肽无法很好地与肽容纳沟结合。本发明的肽的长度优选为10-25个氨基酸，更优选15-21个氨基酸，进一步优选16-20个氨基酸，例如17个氨基酸、18个氨基酸或19个氨基酸。本发明的肽的具体实例是具有SEQ IDNO：3所述氨基酸序列、SEQ ID NO：4所述氨基酸序列和SEQ ID NO：5所述氨基酸序列的那些肽。
同样，本发明的肽包括上述肽的变体。变体可含有例如这样的肽，其选自氨基酸序列中具有若干个氨基酸取代、缺失或添加的肽，例如1-9个、优选1-5、1-4、1-3个、更优选1-2个氨基酸，进一步优选上述氨基酸序列之一中的一个氨基酸。肽的氨基酸的取代可在任何位置上和用任何类型的氨基酸进行。优选保守氨基酸取代。例如，Glu残基可被Asp残基取代，Phe残基被Tyr残基取代，Leu残基被Ile残基取代，Ala残基被Ser残基取代以及His残基被Arg残基取代。氨基酸的添加或缺失可优选在肽中N端和C端进行，但也可在内部序列中进行。本发明肽的优选具体实例具有SEQ ID NO：3的序列。在这一方面，所有上述肽必须保持与MHC II类分子结合的能力，并具有诱导WT1特异性辅助性T细胞的能力。
就此而论，本发明的肽结合的MHC II类分子可属于HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP的任何亚类。优选MHC II类分子是选自：DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*0802、DRB1*0803、DRB1*0901、DRB1*1201、DRB1*1403、DRB1*1501、DRB1*1502、DPB1*0201、DPB1*0202、DPB1*0402、DPB1*0501、DPB1*0901、DQB1*0301、DQB1*0302、DQB1*0401、DQB1*0501、DQB1*0601、DQB1*0602和DRB5*0102。更优选MHC II类分子是DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*1403、DRB1*1502、DPB1*0201、DPB1*0202、DPB1*0901、DQB1*0301、DQB1*0601或DRB5*0102，最优选DRB1* 0101、DRB1*0405、DRB1*1502、DPB1*0201、DPB1*0202或DQB1*0601。在本说明书中，保持与MHC II类分子结合的能力并具有诱导WT1特异性辅助性T细胞的能力的肽称为WT1辅助肽。同样，在下文描述的实施例中，具有SEQ ID NO：3所述氨基酸序列的肽称为WT135肽、WT135辅助肽或WT135肽。
同样，本发明的肽可以是具有由来源于SEQ ID NO：1中所述的小鼠WT1蛋白的连续氨基酸组成的氨基酸序列的肽，且上述氨基酸序列可以是肽(SEQ ID NO：6)，其中在SEQ ID NO：4所述氨基酸序列9位上的氨基酸残基被亮氨酸取代；或者肽(SEQ ID NO：7)，其中SEQ IDNO：5所述氨基酸序列11位上的氨基酸残基被丝氨酸取代。而且，本发明的肽可含有这样的肽，所述肽选自氨基酸序列中具有若干个氨基酸取代、缺失或添加的肽，例如1-9个、优选1-5、1-4、1-3个、更优选1-2个氨基酸，进一步优选SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所述氨基酸序列中的一个氨基酸。在下文描述的实施例中，具有SEQ ID NO：6中所述氨基酸序列的肽亦称mWT186肽或mWT186辅助肽，而具有SEQID NO：7中所述氨基酸序列的肽亦称mWT1294肽或mWT1294辅助肽。
本发明的肽可来源于WT1蛋白，并可由上述连续氨基酸的序列组成或包含该序列。因此，本发明的肽可以是例如由上述氨基酸序列本身组成的肽或包含上述氨基酸序列的WT1蛋白或其部分。同样，本发明的肽可以是通过修饰上述氨基酸序列而获得的肽。上述氨基酸序列的氨基酸残基可通过已知方法修饰。这类修饰可以是例如在构成肽的氨基酸残基侧链的官能团上的酯化、烷基化、卤化、磷酸化、磺化、酰胺化等。同样，可使不同的物质与含有上述氨基酸序列的肽的N端和/或C端结合。例如可使氨基酸、肽、其类似物等与所述肽结合。如果这些物质与本发明的肽的结合，则可通过例如体内酶等或通过例如胞内加工过程处理，使得最终产生由上述氨基酸序列构成的肽，其作为与MHC II类分子的复合物展示在细胞表面上，由此能够获得对辅助性T细胞的诱导作用。这些物质可以是调节本发明的肽的溶解度的物质、提高肽的稳定性(例如蛋白酶抗性)的物质、使本发明的肽能够特异递送到例如指定组织或器官的物质或者具有增强抗原呈递细胞的摄取效率作用或其它作用的物质。同样，这些物质可以是提高诱导CTL的能力的物质，例如本发明的肽以外的辅助肽。
本发明的肽的修饰可以是肽的N端氨基酸上氨基或C端氨基酸上羧基的修饰。N端氨基酸上氨基的修饰基团包括例如1-3个具有1-6个碳原子的烷基、苯基、环烷基和酰基。酰基的具体实例包括具有1-6个碳原子的烷酰基、具有1-6个碳原子的被苯基取代的烷酰基、被具有5-7个碳原子的环烷基取代的羰基、具有1-6个碳原子的烷基磺酰基、苯基磺酰基、具有2-6个碳原子的烷氧基羰基、被苯基取代的烷氧基羰基、被具有5-7个碳原子的环烷氧基取代的羰基、苯氧基羰基等。C端氨基酸上羧基具有修饰的肽包括例如酯化肽和酰胺化肽。酯的具体实例包括具有1-6个碳原子的烷基酯、具有0-6个碳原子的被苯基取代的烷基酯、具有5-7个碳原子的环烷基酯等，而酰胺的具体实例包括酰胺、被具有1-6个碳原子的一个或两个烷基取代的酰胺，被一个或两个具有0-6个碳原子的被苯基取代的烷基取代的酰胺、形成包括酰胺基的氮原子在内的5-7元氮杂环烷烃的酰胺，等等。
同样，可通过使氨基酸残基通过肽键以外的键(例如碳-碳键、碳-氮键和碳-硫键)彼此结合而进行本发明的肽的修饰。而且，本发明的肽可含有一个或多个D-氨基酸。
上文提及的本发明的肽、变体肽和修饰肽仅用于说明，本领域技术人员可容易地采用、制备、评价和使用上述肽的其它变异体。
可采用常规用于本领域的方法或其改进方法合成本发明的肽。这类合成方法公开于例如Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；The Proteins，第2卷，Academic Press Inc.，New York，1976；Peptide Synthesis，Maruzen Co.，Ltd.，1975；Basis and Experiments ofPeptide Synthesis，Maruzen Co.，Ltd.，1985；Development of Medicines(续)，第14卷，Peptide Synthesis，Hirokawa Shoten Co.，1991等。同样，可根据编码本发明的肽的核苷酸序列的信息，应用遗传工程技术来制备本发明的肽。这类遗传工程技术为本领域技术人员所熟知。可按照下述文献[Molecular Cloning，T.Maniatis等，CSH Laboratory(1983)；DNA Cloning，DM.Glover，IRL PRESS(1985)]所述方法或下述方法和其它方法应用这类技术。
可通过已知方法，例如Cancer Immunol.Immunother.51：271(2002)中描述的方法或本说明书实施例中描述的方法和其它方法，确定本发明的肽或其候选肽是否与上述MHC II类分子结合并诱导辅助性T细胞。
由于本发明的肽激活辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)，因此该肽诱导和保持CTL的分化，并发挥激活效应细胞(例如巨噬细胞)的作用。因此，可采用本发明的肽有效地治疗或预防癌症。
另一方面，本发明涉及编码上述WT1辅助肽的多核苷酸(下文亦称WT1多核苷酸)。本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA。本发明的多核苷酸的碱基序列可根据上述WT1辅助肽的氨基酸序列来确定。可通过例如DNA或RNA合成方法、PCR方法等制备多核苷酸。
本发明的多核苷酸包括在严格条件下与编码本发明的肽的多核苷酸的互补序列杂交并编码活性与本发明的肽的活性相当的肽的多核苷酸。至于术语“在严格条件下杂交”，本文使用的杂交可按照例如以下文献所述常规方法进行：Molecular Cloning，第2版，Sambrook J.，Frisch E.F.，Maniatis T.，Cold Spring Harbor Laboratory press等。同样，“严格条件”包括例如以下条件，其中在含有6×SSC(10×SSC是含有1.5M NaCl和0.15M柠檬酸三钠的溶液)和50％甲酰胺的溶液中于45℃形成杂合体，然后用2×SSC于50℃洗涤(Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6)等。
又一方面，本发明涉及包含上述多核苷酸的表达载体(下文亦称WT1表达载体)。可根据将表达载体导入其中的宿主的类型、导入目的等，适当选择表达载体的类型、除上述多核苷酸序列以外所包含的其它序列等。表达载体的实例包括质粒、噬菌体载体、病毒载体等。在宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞的情况下，载体的实例包括质粒载体，例如pUC118、pUC119、pBR322和pCR3；以及噬菌体载体，例如λZAPII和λgt11。在宿主是酵母细胞的情况下，载体的实例包括pYES2、pYEUra3等。在宿主是昆虫细胞的情况下，载体的实例为pAcSGHisNT-A等。在宿主是动物细胞的情况下，载体的实例包括质粒载体，例如pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV和pRc/CMV；病毒载体，例如反转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。载体可任选含有以下因子：例如表达诱导型启动子、编码信号序列的基因、选择用标记基因和终止子。同样，可将与硫氧还蛋白、His标签、GST(谷胱甘肽S-转移酶)等一起表达成融合蛋白的序列加入载体中以易于分离和纯化。在这种情况下，可使用具有在宿主细胞中起作用的合适的启动子(lac、tac、trc、trp、CMV、SV40早期启动子等)的GST融合蛋白质载体(pGEX4T等)、具有例如Myc和His等标签序列的载体(pcDNA3.1/Myc-His等)以及表达具有硫氧还蛋白和His标签等的融合蛋白的载体(pET32a)。
当将本发明的表达载体给予受试者以体内产生WT1辅助肽时，由所述肽诱导的WT1特异性辅助性T细胞产生各种细胞因子(例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干扰素(IFN)等)，并促进B细胞和其它T细胞的增殖、分化和成熟。因此，可特别使用本发明的WT1表达载体破坏具有MHC I类分子并高表达WT1的肿瘤细胞。
另一方面，本发明涉及抗上述WT1辅助肽或编码所述肽的多核苷酸的抗体(下文亦称WT1抗体)。本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。已知制备这类抗体的方法，而且本发明的抗体也可按照以下这类常规方法制备(Current protocols in Molecular Biology，Ausubel等(主编)，1987，John Wiley and Sons(出版)，第11.12-11.13节，Antibodies；A Laboratory Manual，Lane，H.D.等(主编)，Cold SpringHarber Laboratory Press(出版)，New York，1989)。
本发明涉及用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含上述WT1辅助肽、WT1多核苷酸或WT1表达载体。WT1基因在例如以下肿瘤和癌中高表达：造血器官肿瘤，例如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤；以及实体癌，例如胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌，因此，可使用本发明的药物组合物治疗或预防表达WT1基因的癌症。当将本发明的药物组合物给予具有MHC II类分子的受试者时，由药物组合物中包含的WT1辅助肽诱导的WT1特异性辅助性T细胞产生各种细胞因子(例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干扰素(IFN)等)，并促进B细胞和其它T细胞亚群的增殖、分化和成熟。因此，可使用本发明的肽特异性破坏具有MHC I类分子和高表达WT1的肿瘤细胞。
除上述WT1辅助肽、WT1多核苷酸或WT1表达载体作为有效组分以外，本发明的药物组合物可包含例如载体、赋形剂等。本发明的药物组合物中包含的WT1辅助肽诱导WT1特异性辅助性T细胞，因此本发明的药物组合物可包含合适的佐剂，或者可与合适的佐剂一起给予以提高诱导效率。优选的佐剂的实例包括但不限于弗氏完全或不完全佐剂、氢氧化铝等。同样，本发明的药物组合物还可包含除上述WT1辅助肽以外的已知癌抗原肽，例如诱导WT1特异性CTL的WT1126肽，作为有效组分(Oka等，“Cancer immunotherapy targetingWilms′tumor gene WT1 product(靶向维尔姆斯瘤基因WT1产物的癌症免疫疗法)”，Journal of Immunology，164：1873-1880，2000；以及Oka等，“Human cytotoxic T-lymphocyte responses specific for peptides of thewild-type Wilms′tumor gene(WT1)product(对野生型维尔姆斯瘤基因(WT1)产物的肽有特异性的人细胞毒性T-淋巴细胞应答)”，Immunogenetics，51：99-107，2000)。
此外，本发明的药物组合物可与已知的癌抗原肽组合给予。例如可将已知的癌抗原肽(例如WT1126肽)在给予本发明的药物组合物之前或之后给予。本发明的药物组合物具有通过诱导WT1特异性辅助性T细胞激活B细胞或其它T细胞的特征，因此，可进一步提高由给予已知的癌抗原肽所诱导的CTL的活性，并显著提高治疗效果。
可根据疾病类型、受试者状况和靶向部位等条件适当选择给予本发明的药物组合物的方法。给予方法的实例包括但不限于皮内给予、皮下给予、肌内给予、静脉内给予、经鼻给予、口服给予等。同样，给予方法可以是淋巴细胞疗法或DC(树突细胞)疗法。可根据疾病类型、受试者状况和靶向部位等条件适当选择本发明的药物组合物所包含的肽的量、药物组合物的形式和给药频率等。总的来说，每个剂量所给予的肽的量为0.0001mg-1000mg，优选0.001mg-10,000mg。
另一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将有效量的上述药物组合物给予具有上述MHC II类分子的受试者。待治疗或预防的癌症可以是任何癌症，只要其表达WT1基因即可，包括例如造血器官肿瘤，例如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤；以及实体癌例如胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。
另一方面，本发明涉及上述WT1辅助肽、WT1多核苷酸或WT1表达载体用于治疗或预防癌症中的用途。
又一方面，本发明涉及WT1辅助肽在制备用于治疗或预防癌症的药物组合物中的用途。
又一方面，本发明涉及WT1多核苷酸或WT1表达载体在制备含有上述WT1多核苷酸或WT1表达载体的药物组合物中的用途。
另一方面，本发明涉及包含上述WT1辅助肽、WT1多核苷酸或WT1表达载体的细胞。可通过例如使用上述表达载体转化大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和动物细胞等宿主细胞来制备本发明的细胞。用表达载体转化宿主细胞可采用各种适当选择的方法进行。可通过培养转化细胞、回收和纯化所产生的WT1辅助肽，来制备本发明的肽。
又一方面，本发明涉及抗原呈递细胞(例如树突细胞、B-淋巴细胞、巨噬细胞等)，其通过上述MHC II类分子展示上述WT1辅助肽。本发明的抗原呈递细胞由上述WT1辅助肽诱导。使用本发明的抗原呈递细胞有效地诱导WT1特异性辅助性T细胞。
又一方面，本发明涉及用于诱导通过MHC II类分子展示WT1辅助肽的抗原呈递细胞的方法，所述方法包括在WT1辅助肽存在下培养不成熟的抗原呈递细胞，并从不成熟的抗原呈递细胞中诱导通过上述MHC II类分子展示WT1辅助肽的抗原呈递细胞。在本说明书中，不成熟的抗原呈递细胞是指在成熟时变成树突细胞、B-淋巴细胞和巨噬细胞等抗原呈递细胞的细胞。从中得到不成熟的抗原呈递细胞的受试者可以是任何受试者，只要他们具有上述MHC II类分子即可。因为在例如外周血单核细胞等中含有不成熟的抗原呈递细胞，因此可在上述WT1辅助肽存在下培养这类细胞。
另一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将通过上述MHC II类分子展示WT1辅助肽的抗原呈递细胞给予具有与上述MHC II类分子相同的分子的受试者。可根据疾病类型、受试者状况和靶向部位等条件适当选择抗原呈递细胞的给予方法。所述方法的实例包括但不限于静脉内给予、皮内给予、皮下给予、肌内给予、经鼻给予、口服给予等。
又一方面，本发明涉及通过诱导通过上述MHC II类分子展示WT1辅助肽的抗原呈递细胞而预防或治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使样品与编码WT1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列或具有其部分序列的核酸或上述WT1辅助肽反应；
(b)得到抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞通过上述MHC II类分子展示样品中所包含的WT1辅助肽；和
(c)将抗原呈递细胞给予具有与上述MHC II类分子相同的分子的受试者。
上述方法中的样品可以是任何样品，只要其具有含有淋巴细胞或树突细胞的可能性即可，包括例如得自受试者的样品(例如血液)、细胞培养液等。上述方法中的反应可采用常规技术进行，优选采用电穿孔。抗原呈递细胞的获得可采用本领域技术人员已知的方法进行。本领域技术人员可适当确定各个步骤中样品细胞的培养条件。抗原呈递细胞的给予方法可如上所述。
再一方面，本发明涉及由上述WT1辅助肽诱导的WT1特异性辅助性T细胞。当识别WT1辅助肽与MHC II类分子的复合物时，本发明的辅助性T细胞被诱导、增殖和激活。活化的WT1特异性辅助性T细胞产生细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干扰素(IFN)，并促进B细胞和其它T细胞亚群的增殖、分化和成熟。因此，可使用本发明的辅助性T细胞特异性破坏具有MHC I类分子和高表达WT1的肿瘤细胞。
另一方面，本发明涉及用于诱导WT1特异性辅助性T细胞的方法，所述方法包括在WT1辅助肽存在下培养外周血单核细胞，并从外周血单核细胞诱导WT1特异性辅助性T细胞。提供外周血单核细胞的受试者可以是任何受试者，只要他们具有上述MHC II类分子即可。通过在WT1辅助肽存在下培养外周血单核细胞，从外周血单核细胞中的辅助性T细胞的前体细胞诱导WT1特异性辅助性T细胞。可通过将由本发明获得的WT1特异性辅助性T细胞给予具有上述MHC II类分子的受试者，来治疗或预防受试者的造血器官肿瘤和实体癌。就此而论，本说明书中的外周血单核细胞包括不成熟的抗原呈递细胞，其是抗原呈递细胞的前体细胞(例如树突细胞、B-淋巴细胞、巨噬细胞等的前体细胞)。因为例如在外周血单核细胞中含有不成熟的抗原呈递细胞，因此可在上述WT1辅助肽存在下培养这类细胞。
又一方面，本发明涉及用于诱导WT1特异性辅助性T细胞的试剂盒，其包括上述WT1辅助肽作为必需成分。优选将试剂盒用于上述诱导WT1特异性辅助性T细胞的方法中。除上述WT1辅助肽以外，本发明的试剂盒可包括例如外周血单核细胞的获取工具、佐剂、反应容器等。一般而言，试剂盒中附有使用说明书。可使用本发明的试剂盒有效地诱导WT1特异性辅助性T细胞。
又一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将WT1特异性辅助性T细胞给予具有上述MHC II类分子的受试者。WT1特异性辅助性T细胞的给予方法可根据疾病类型、受试者状况和靶向部位等条件适当选择。给予方法的实例包括但不限于静脉内给予、皮内给予、皮下给予、肌内给予、经鼻给予、口服给予等。
此外，本发明涉及用于预防或治疗癌症的试剂盒，其包括上述WT1辅助肽、WT1多核苷酸或WT1表达载体作为必需成分。试剂盒是这样的试剂盒，其特征在于诱导抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞通过上述MHC II类分子展示上述WT1辅助肽。同样，除上述必需成分以外，本发明的试剂盒可包括例如样品的获得工具、反应容器等。一般而言，试剂盒附有使用说明书。可使用本发明的试剂盒有效获得通过上述MHC II类分子展示WT1辅助肽的抗原呈递细胞，并通过给予所述细胞以治疗或预防癌症。
另一方面，本发明涉及用于在具有上述MHC II类分子的受试者中测定WT1特异性辅助性T细胞的存在情况或量的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使上述WT1辅助肽与上述MHC II类分子的复合物与得自受试者的样品反应；然后
(b)测定识别样品中包含的复合物的辅助性T细胞的存在情况或量。
得自受试者的样品可以是任何样品，只要它们具有含有淋巴细胞的可能性即可，包括例如体液(例如血液和淋巴液)、组织等。WT1辅助性T细胞与MHC II类分子的复合物可以是例如采用本领域技术人员已知的方法(例如生物素-链霉抗生物素方法)形成的例如四聚体、五聚体等的形式。可通过本领域技术人员已知的方法测定识别这类复合物的辅助性T细胞的存在情况或量。在本发明的该方面中，可对上述复合物进行标记。至于标记，可以使用已知标记，例如荧光标记和放射性标记。通过标记，可简单快速地测定辅助性T细胞的存在情况或量。采用本发明这个方面的方法，使癌症的诊断、预后等变得可行。
因此，本发明还提供包含WT1辅助肽与上述MHC II类分子的复合物的组合物，其用于测定具有上述MHC II类分子的受试者中的WT1特异性辅助性T细胞的存在情况或量。
同样，本发明提供包含WT1辅助肽与上述MHC II类分子的复合物的试剂盒，其用于测定具有上述MHC II类分子的受试者中的WT1特异性辅助性T细胞的存在情况或量。
又一方面，本发明涉及用于测定具有上述MHC II类分子的受试者中的WT1特异性辅助性T细胞的存在情况或量的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使上述WT1辅助肽与得自受试者的样品反应；然后
(b)测定样品中所包含的细胞因子的存在情况或量。
得自受试者的样品可以是任何样品，只要它们具有含有淋巴细胞的可能性即可，包括例如外周血单核细胞、血液、体液、组织等，优选外周血单核细胞。上述步骤(a)中的反应可采用常规技术通过使得自受试者的上述样品中的上述WT1辅助肽反应来进行。本领域的技术人员可适当地确定各步骤中样品细胞的培养条件。样品中包含的细胞因子的存在情况或量可通过本领域技术人员已知的方法测定。细胞因子可以是能够被辅助性T细胞诱导的细胞因子，例如干扰素-γ和白介素-10。在本发明的该方面中，可对上述细胞因子进行标记。至于标记，可以使用已知标记，例如荧光标记和放射性标记。使用上述细胞因子的存在情况或量作为指标，简单快速地测定WT1特异性辅助性T细胞的存在情况或量变得是可行的。
再一方面，本发明涉及使用WT1辅助肽与上述MHC II类分子的复合物获得WT1特异性辅助性T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使样品与该复合物反应；和
(b)获得包含在样品中并识别复合物的辅助性T细胞。
上文中描述了WT1辅助肽与上述MHC II类分子的复合物。样品可以是任何样品，只要它们具有含有淋巴细胞的可能性即可，包括例如得自受试者的样品(例如血液)、细胞培养液等。例如，识别复合物的辅助性T细胞的获得可采用本领域技术人员已知的方法进行，例如FACS和MACS。可培养所得到的WT1特异性辅助性T细胞，并将其用于治疗或预防各种癌症。
因此，本发明还涉及WT1特异性辅助性T细胞，其可通过使用WT1辅助肽与上述MHC II类分子的复合物获得WT1特异性辅助性T细胞的方法获得。
此外，本发明涉及用于获得WT1特异性辅助性T细胞的试剂盒，其包括WT1辅助肽与上述MHC II类分子的复合物。
又一方面，本发明涉及用于诊断癌症的方法，所述方法包括使用上述WT1特异性辅助性T细胞、通过上述MHC II类分子展示WT1辅助肽的上述抗原呈递细胞或上述WT1抗体。优选将WT1特异性辅助性T细胞用于本发明的诊断癌症的方法中。例如可将上述辅助性T细胞、抗原呈递细胞或抗体与得自具有上述MHC II类分子的受试者的样品一起温育，或者给予具有上述MHC II类分子的受试者，然后，例如，可测定辅助性T细胞、抗原呈递细胞或抗体的位置、部位、量等以诊断癌症。可对上述辅助性T细胞、抗原呈递细胞或抗体进行标记。通过标记，可有效地进行本发明用于诊断癌症的方法。
又一方面，本发明涉及用于诊断癌症的试剂盒，其包括上述WT1特异性辅助性T细胞、通过上述MHC II类分子展示WT1辅助肽的抗原呈递细胞或者抗WT1辅助肽的抗体或抗编码所述肽的多核苷酸的抗体作为必需成分。
下面通过实施例对本发明进行具体详细的描述，但不应将实施例理解为限制本发明。
实施例1
与MHC II类分子结合的候选WT1肽的选择
为了查找与MHC II类分子结合的肽序列，采用Rammensee等人所示的方法(Rammensee等，Immunogenetics 41：178-228，1995)。具体而言，使用表中右端栏所述程序以及Rammensee等人的法则进行选择。通过该方法，将WT135肽限制到表1和表2所示的肽序列，将WT186肽限制到表3和表4所示肽序列，和将WT1294肽限制到表5和表6所示肽序列。表1-6中的左端栏表示作为候选肽序列的“适合性”。“○”数越多，在Rammensee等人的法则中的适合性越高。无标记表示适合性差。同样，表1-6中“与MHC II类分子结合的候选肽序列”栏的括号中氨基酸组别表示可从括号中所列氨基酸中选择一个氨基酸。例如描述[FLM]是指选自氨基酸组别F、L和M的一个氨基酸。同样，描述[VYI(AL)]是指选自氨基酸组别V、Y和I的一个氨基酸，或者选自氨基酸组别A和L的一个氨基酸。“x”表示其可以是任何氨基酸。右端栏表示用于列举候选肽序列的程序的“程序名称”。
Figure BPA00001485246200231
Figure BPA00001485246200241
Figure BPA00001485246200251
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Figure BPA00001485246200311
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Figure BPA00001485246200331
接下来，从表1-6中直观地选择候选WT1肽，下表7中所示肽被鉴定为MHC II类分子的优选候选肽，如下述分析了这些肽的实际功能。
[表7]
鉴定小鼠MHC II类分子的肽候选物
WT135  WAPVLDFAPPGASAYGSL(SEQ ID N0：3)   18聚体  MW 1819.01
WT186  EQCLSAFTLHFSGQFTG(SEQ ID NO：6)    17聚体  MW 1944.01
WT1294 FRGIQDVRRVSGVAPTLVR(SEQ ID NO：7)  19聚体  MW 2126.48
WT1肽特异性细胞系的制备和细胞增殖能力的测定
首先，将上述WT1肽用弗氏不完全佐剂(Montanide ISA 51)乳化，以相当于100μg/小鼠的量用各种WT1肽皮内接种小鼠。免疫以一周的间隔进行3次，最终免疫1周后取出脾，制备脾细胞。使用未免疫小鼠的脾细胞作为刺激物，以10天间隔刺激脾细胞3次，该未免疫小鼠的脾细胞用与用于免疫各小鼠的相同的WT1肽进行脉冲并照射。然后，使用未免疫小鼠的脾细胞作为刺激物进行第4次刺激，该未免疫小鼠的脾细胞用表7所示各种肽(WT135、WT186或WT1294肽)进行脉冲和照射，并通过3H掺入实验测定响应各种刺激物的增殖反应。与WT1肽无关的OVA(卵清蛋白)肽用作对照肽。结果，用各WT135肽、WT186肽或WT1294肽免疫的小鼠脾细胞对用WT135肽、WT186肽或WT1294肽进行脉冲的刺激物作出应答并增殖(图1A-1C)。
如上所述，使用未免疫小鼠的脾细胞以10天间隔体外刺激脾细胞3次，未免疫小鼠的脾细胞用各种WT1肽进行脉冲和照射。然后当使用用上述各种肽进行脉冲并照射的未免疫小鼠的脾细胞作为刺激物进行第4次刺激，并测定增殖反应时，将MHC I类抗体(Db抗体)或MHC II类抗体(Ab抗体)加入培养液中，并测定3H掺入。结果，响应用各WT135肽、WT186肽和WT1294肽进行脉冲的刺激物的增殖反应因加入MHC II类抗体而被抑制(图2A-2C)。
如上所述，使用用各种WT1肽进行脉冲和照射的未免疫小鼠的脾细胞以10天间隔体外刺激脾细胞3次。然后，使用经照射的不表达任何WT1蛋白的C1498细胞、用各种上述WT1肽进行脉冲的C1498细胞或者通过导入WT1基因而表达WT1蛋白的C1498细胞作为刺激物，通过3H掺入来测定增殖反应。结果，响应与用于体内免疫相同的WT1肽进行脉冲的C1498细胞和因导入WT1基因而表达WT1蛋白的C1498细胞，产生增殖反应(图3)。这就揭示，通过内源性WT1蛋白的胞内加工产生了WT135肽、WT186肽和WT1294肽，并展示在MHC II类分子上。从上述事实来看，表明了这三种WT1肽是MHC II类限制性WT1肽。
产IFN-γ能力的测定
如上所述，使用用各种WT1肽进行脉冲和照射的未免疫小鼠的脾细胞，以10天间隔体外刺激脾细胞3次。然后，使用ELISA试剂盒(BIOSOURCE Immunoassay Kit，Invitrogen)，测定培养物上清液中IFN-γ和IL-4的浓度。结果，两只独立小鼠的脾细胞对用各种WT1肽进行脉冲和照射的未免疫小鼠的脾细胞作出应答，并产生干扰素-γ，但几乎不产生白介素-4(图4)。这就表明这三种类型的WT1肽诱导Th1型的WT1特异性辅助性T细胞。
实施例2
WT1特异性细胞毒性T细胞(CTL)的测定
将小鼠用仅WT1126肽(MHC I类)、WT1126肽(MHC I类)+WT135肽(MHC II类)、WT1126肽(MHC I类)+WT186肽(MHC II类)或WT1126肽(MHC I类)+WT1294肽(MHC II类)免疫3次，并制备小鼠的脾细胞。然后，将脾细胞使用WT1126肽(MHC I类)体外刺激一次，第6天，使用用WT1126肽(MHC I类)进行脉冲的RMAS细胞作为靶细胞，测定了细胞毒活性。未用WT1126肽(MHC I类)脉冲的RMAS细胞用作对照靶细胞。因此，与用仅WT1126肽(MHCI I类)免疫的小鼠脾细胞相比，用WT1126肽(MHC I类)+WT1辅助肽(MHC II类)免疫的小鼠脾细胞更强地诱导WT1特异性细胞毒性T细胞(图5)。这就表明3种WT1肽(MHC II类)是WT1特异性辅助肽。
实施例3
肿瘤植入实验
将表达WT1的C1498白血病细胞以2.5×105个细胞/小鼠的比例皮下植入小鼠，自植入后一周起，一周一次共3次，将50μg/小鼠的WT135辅助肽与弗氏不完全佐剂一起皮内给予(图6)。作为对照，用生理盐水替换WT135辅助肽与弗氏不完全佐剂一起皮内给予。测量皮下肿瘤随着时间变化的大小，计算无病存活率直到皮下植入后的第29天。结果，肿瘤在对照组的所有小鼠中扩大，而在WT135辅助肽(MHCII类)免疫组中，10只小鼠中有4只的肿瘤增殖被完全抑制(图7)。同样，WT135辅助肽免疫组与对照组之间看到显著差异(p＜0.05)(图8)。这就表明，WT135辅助肽(MHC II类)是具有体内诱导肿瘤免疫能力的WT1肽。
接下来，在开始上述实验后第29天解剖小鼠，切取脾，使用脾细胞分析WT1特异性免疫应答。简单地说，当解剖WT135辅助肽(MHCII类)免疫组和对照组的小鼠时切取脾，制备脾细胞。脾细胞用WT1126肽(MHC I类)刺激一次，在刺激后第6天，使用用WT1126肽(MHC I类)进行脉冲的RMAS细胞作为靶细胞，测定了脾细胞的细胞毒活性。作为对照，使用RMAS细胞作为靶细胞，测定了脾细胞的细胞毒活性。结果，在WT135辅助肽(MHC II类)免疫组的全部4只小鼠中诱导WT1特异性细胞毒性T细胞(图9)。另一方面，对照组的3只小鼠中非常弱地诱导WT1特异性细胞毒性T细胞(图10)。在一只小鼠中未诱导出WT1特异性细胞毒性T细胞。同样，明显的是，与WT135辅助肽(MHC II类)免疫组相比，WT1特异性细胞毒性T细胞的诱导较低(图9和图10)。这就表明，通过给予WT135II类辅助肽，诱导了WT1特异性辅助性T细胞，并且通过WT1特异性辅助性T细胞的作用，通过对由植入肿瘤细胞表达的WT1蛋白的免疫应答诱导的WT1特异性细胞毒性T细胞在体内强烈地放大。因此，结果表明了WT135辅助肽的有用性。
接下来，在上述WT135辅助肽(MHC II类)免疫组和对照组的小鼠中，分析特异性细胞溶解。简单地说，将靶细胞是RMAS细胞时的细胞溶解率(％)从靶细胞是上述实验中用WT1126肽(MHC I类)进行脉冲的RMAS细胞时的细胞溶解率(％)中减去而得到的细胞溶解程度(％)用作特异性细胞溶解(％)(图11，左)。同样，将上述制备的脾细胞和荧光标记的WT1四聚体(H-2Db WT1四聚体-RFMPNAPYL-PE)于4℃温育20分钟，洗涤，然后用荧光标记的CD3和CD8抗体染色，再次洗涤，并通过FACS进行分析。CD3阳性、CD8阳性和WT1四聚体阳性细胞充当WT1特异性细胞毒性T细胞(图11，右)。结果，与对照组小鼠的脾细胞相比，在WT135辅助肽(MHC II类)免疫组的小鼠脾细胞中诱导显著高的WT1特异性细胞毒性T细胞(p＜0.05)(图11)。
实施例4
人的WT1特异性细胞毒性T细胞(CTL)的增殖能力的测定
从6名具有图12所示DRB1、DPB1、DQB1或DRB5亚类分子的健康受试者中制备外周血单核细胞。向外周血单核细胞中加入WT135辅助肽，并将细胞培养一周。然后，对这些外周血单核细胞，使用用WT135辅助肽进行脉冲和照射的得自同一受试者的外周血单核细胞作为刺激物，以一周的间隔进行刺激共4次，在第6天测定3H掺入。在所有6名健康受试者中，外周血单核细胞对WT135辅助肽所出应答并增殖(图12)。这就表明WT135辅助肽具有与所提及的HLA II类分子结合并引起增殖反应的功能。就此而论，对于在方框包围位置上的一个氨基酸，小鼠WT186肽和WT1294肽不同于人WT186肽(SEQID NO：4)和WT1294肽(SEQ ID NO：5)，如表8所示。
[表8]
小鼠和人WT135、WT186和WT1294肽之间的序列的差异
Figure BPA00001485246200381
实施例5
WT1 35 肽的HLA II类分子限制性
为了测定WT135肽的HLA II类分子限制性，通过下面简述的本领域技术人员熟知的方法进行进一步实验。首先，对得自健康受试者[DRB1*0101/0405、DPB1*0201/0402和DQB1*0401/0501阳性健康受试者(下文称为健康受试者A)]的外周血单核细胞(PBMC)，用WT135肽刺激5次以制备应答物。接下来，对得自HLA II类类型不同的另一名健康受试者[DRB1*0405/0901、DPB1*0201/0501和DQB1*0303/0401阳性健康受试者(称为健康受试者B)]的外周血单核细胞(PBMC)，用WT135肽进行脉冲以制备刺激物，并测定细胞增殖[所掺入的3H-胸苷的量(cpm)]。在未加入抗体、加入抗HLA-DR抗体(+a-DR)、加入抗HLA-DP抗体(+a-DP)或加入抗HLA-DQ抗体(+a-DQ)的条件下进行了测定。对应答物和刺激物两者呈阳性的共同HLA II类类型显示WT135肽的限制性。实验结果表明，WT135肽是DRB1*0405限制性的，因为在加入抗DR抗体的条件下增殖被抑制，而且DRB1*0405是健康受试者A和B中共同的，如图13所示。
接下来，除了使用从不同于健康受试者A的健康受试者[DRB1*0405/0803、DPB1*0202/0501和DQB1*0401/0601阳性健康受试者(称为健康受试者G)]中得到的PBMC为刺激物以外，在与上述实验相同的条件下进行了实验。结果表明，WT135肽是DRB1*0405、DPB1*0201和DPB1*0202限制性的，因为在加入抗HLA-DR抗体或抗HLA-DP抗体的条件下增殖受抑制，而且DRB1*0405、DPB1*0201和DPB1*0202在健康受试者A和健康受试者G中是共同的(DPB1*0201和DPB1*0202具有高相似性，并是交叉反应性的，因此，它们被认为是共同的分子)，如图14所示。
接下来，除了使用从不同于健康受试者A的健康受试者[DRB1*0101/0803、DPB1*0501/-、DQB1*0501/0601阳性(称为健康受试者H)]得到的PBMC作为刺激物以外，在与上述实验相同的条件下进行实验。结果表明，WT135肽是DRB1*0101限制性的，因为在加入抗HLA-DR抗体的条件下增殖被抑制，而且DRB1*0101在健康受试者A和健康受试者H中是共同的，如图15所示。
此外，为了测定WT135肽的限制性，将得自健康受试者G的PBMC用作应答物，导入DQB1*0601基因的L细胞用作刺激物。测定了在用L细胞的WT135肽进行的脉冲存在或不存在时产生的IFN-γ的量的差异。采用作为本领域技术人员熟知技术的FACS，测定了胞内IFN-γ产生的比例。结果表明，WT135肽是DQB1*0601限制性的，因为通过用WT135肽对L细胞进行脉冲激活了应答物，如图16所示。
接下来，使用得自相同健康受试者的PBMC作为应答物和刺激物如上所述进行了实验。将用于本实验的健康受试者所具有的HLA II类分子类型概括于下表9中。
[表9]
用于本实验的健康受试者所具有的HLA II类分子的类型
Figure BPA00001485246200391
结果发现，当使用得自健康受试者A-E的PBMC进行实验时，加入抗DR抗体或抗DP抗体，导致所掺入的3H-胸苷的量(cpm)降低，因此导致抑制增殖。同样，当使用得自健康受试者F的PBMC时，加入仅抗DR抗体导致增殖受抑制。此外，当使用得自健康受试者G的PBMC时，加入仅抗HLA-DP抗体导致增殖受抑制。使用健康受试者A的实验表明，WT135肽是DRB1*0101或0405限制性的，并是DPB1*0201或0402限制性的。使用健康受试者B的实验表明，WT135肽是DRB1*0405或0901限制性的，以及是DPB1*0201或0501限制性的。健康受试者C的实验表明，WT135肽是DRB1*0802或1201限制性的，并且是DPB1*0201或0501限制性的。使用健康受试者D的实验表明，WT135肽是DRB1*1502限制性的，因为DRB1*1502是纯合子(图17)。另外表明WT135肽是DPB1*0201或0901限制性的。使用健康受试者E的实验表明，WT135肽是DRB1*0405或0901限制性的，并且是DPB1*0202或0501限制性的。使用健康受试者F的实验表明，WT135肽是DRB1*1403或1502限制性的。使用健康受试者G的实验表明，WT135肽是DPB1*0202或0501限制性的。
同样，使用得自健康受试者I的PBMC作为应答物和刺激物，测定了在用WT135肽进行的脉冲存在或不存在时所产生的IFN-γ的量的差异。采用作为本领域技术人员熟知技术的FACS，测定了胞内IFN-γ产生的比例。结果，通过WT135肽进行脉冲，IFN-γ的量的比例显著提高(图18)。这表明WT135肽受以下任一种的限制：DRB1*0101、DRB1*1501、DPB1*0201、DPB1*0402、DQB1*0501和DQB1*0602。
工业实用性
本发明提供受许多类型的MHC II类分子限制的WT1肽、编码所述肽的多核苷酸、含有它们的药物组合物等。因此，可将其用于药物领域，例如用于各种高表达WT1基因的造血器官肿瘤和实体肿瘤的预防性或治疗性药物的开发和制备领域。
[序列表自由文本]
Figure IPA00001485245700011
Figure IPA00001485245700021
Figure IPA00001485245700031
Figure IPA00001485245700051
Figure IPA00001485245700061
Figure IPA00001485245700071
Figure IPA00001485245700081

Claims (17)

1.一种肽，其具有由来源于WT1蛋白的连续氨基酸组成的氨基酸序列，并通过与MHC II类分子结合诱导WT1特异性辅助性T细胞，其中所述氨基酸序列选自：
(a)SEQ ID NO：3所述氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：4所述氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：5所述氨基酸序列；和
(d)其中在(a)-(c)所述氨基酸序列中一个或几个氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列。
2.权利要求1的肽，其中所述氨基酸序列是SEQ ID NO：3所述氨基酸序列。
3.权利要求1或2的肽，其中所述MHC II类分子选自DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*0802、DRB1*0803、DRB1*0901、DRB1*1201、DRB1*1403、DRB1*1501、DRB1*1502、DPB1*0201、DPB1*0202、DPB1*0402、DPB1*0501、DPB1*0901、DQB1*0301、DQB1*0302、DQB1*0401、DQB1*0501、DQB1*0601、DQB1*0602和DRB5*0102。
4.权利要求1或2的肽，其中所述MHC II类分子选自DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*1502、DPB1*0201、DPB1*0202和DQB1*0601。
5.一种编码权利要求1-4中任一项的肽的多核苷酸。
6.一种包含权利要求5的多核苷酸的表达载体。
7.一种抗权利要求1-4中任一项的肽或权利要求5的多核苷酸的抗体。
8.一种用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项的肽、权利要求5的多核苷酸或权利要求6的载体。
9.一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1-4中任一项的肽、权利要求5的多核苷酸或权利要求6的载体给予具有权利要求3或4的MHC II类分子的受试者。
10.权利要求1-4中任一项的肽、权利要求5的多核苷酸或权利要求6的载体用于治疗或预防癌症的用途。
11.通过权利要求3或4的MHC II类分子展示权利要求1-4中任一项的肽的抗原呈递细胞。
12.一种用于诱导抗原呈递细胞的方法，所述方法包括在权利要求1-4中任一项的肽存在下培养不成熟的抗原呈递细胞，并从不成熟的抗原呈递细胞中诱导通过权利要求3或4的MHC II类分子展示所述肽的抗原呈递细胞。
13.由权利要求1-4中任一项的肽诱导的WT1特异性辅助性T细胞。
14.一种用于诱导WT1特异性辅助性T细胞的方法，所述方法包括在权利要求1-4中任一项的肽存在下培养外周血单核细胞，并从外周血单核细胞中诱导WT1特异性辅助性T细胞。
15.一种诱导WT1特异性辅助性T细胞的试剂盒，其包含权利要求1-4中任一项的肽作为必需成分。
16.一种用于预防或治疗癌症的试剂盒，其包含权利要求1-4中任一项的肽、权利要求5的多核苷酸或权利要求6的载体作为必需成分。
17.一种用于在具有权利要求3或4的MHC II类分子的受试者中测定WT1特异性辅助性T细胞的存在情况或量的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使权利要求1-4中任一项的肽与得自受试者的样品反应；然后
(b)测定样品中所包含的细胞因子的存在情况或量。
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