CN106029699B - Wt1抗原性多肽和含有该多肽的抗肿瘤剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种能够对来源不同的多种T细胞进行刺激，对多种癌症强烈诱导免疫应答的多肽。一种多肽，其为含有来自WT1蛋白质的辅助表位及来自WT1蛋白质的杀伤表位的融合多肽，在每1分子的该融合多肽中含有总计3～6个的前述辅助表位和前述杀伤表位。

Description

WT1抗原性多肽和含有该多肽的抗肿瘤剂
技术领域
本发明涉及能够用于癌症免疫疗法的、来自由Wilms肿瘤基因WT1编码的WT1蛋白质的抗原性多肽、制造对该多肽特异性的T细胞的方法、以及含有该多肽等的抗肿瘤剂。
背景技术
作为难以医治的疾病-癌症(恶性肿瘤)的治疗方法之一，可以列举利用患者个体所具有的免疫系统使癌细胞萎缩的、即所谓的癌症免疫疗法。该方法的重点在于，如何使免疫系统将癌细胞识别为异物、并诱导出对癌细胞具有攻击性的免疫细胞。
参与抗肿瘤免疫的重要免疫细胞有表达作为细胞表面蛋白质的CD8的T细胞(CD8+T细胞)、表达作为细胞表面蛋白质的CD4的T细胞(CD4+T细胞)。CD8+T细胞为在被活化时将提呈与HLA I类分子结合的抗原的细胞溶解的T细胞(细胞毒性T细胞、CTL)。CD4+T细胞为分泌细胞因子的Th细胞，被通过HLAII类分子提呈抗原的巨噬细胞和/或树突状细胞等活化，对用于诱导和维持CD8+T细胞发挥辅助功能。此外，已知Th细胞根据所分泌的细胞因子的种类而分成Th1细胞(产生IFN-γ等的细胞)、Th2细胞(产生白介素-4等的细胞)和Th0细胞(产生细胞因子能力低或同时产生IFN-γ、IL-4等的细胞)，各细胞的作用正不断地得到阐明。此外，CD4+T细胞通过针对MHC II类分子阴性肿瘤(MHC II类-肿瘤)的间接机制、例如通过活化巨噬细胞或介由杀伤T细胞、NK细胞或者通过针对MHC II类阳性肿瘤的直接机制，从而也能够具有效应功能。
迄今为止，人的癌症免疫治疗中的T细胞研究主要聚焦于CD8+HLA I类限制性CTL应答的鉴定和诱导(专利文献1)。对于CD4+T细胞，报道了作为癌抗原之一的酪氨酸酶及其对CD4+T细胞的表位(辅助表位)的鉴定(专利文献2)。酪氨酸酶在黑素细胞系列的正常细胞及肿瘤细胞中表达，是与被视为CD4+黑素瘤反应性T细胞的特异性靶标的、MHC II类分子结合的黑素瘤缔合性组织特异性抗原(非专利文献1)。但是，酪氨酸酶为仅在有限类型的肿瘤中表达的抗原，很难称其为癌症免疫治疗中有希望的癌抗原。
本发明人中的部分发明人着眼于编码被称为MAGE的、被CD8+T细胞识别的肿瘤特异抗原的基因家族，发现来自其中之一的MAGE-A4蛋白质的多肽片段作为癌症疫苗肽(辅助表位)有用(专利文献3)。但是，表达MAGE-A4蛋白质的癌症的种类有限，因此，依然非常期待对更多种类的癌症也能够诱导免疫应答的新的多肽的发现。
另一方面，WT1蛋白质是在白血病、各种固体癌中高表达的由Wilms肿瘤基因WT1编码的蛋白质。期待其作为癌症疫苗肽的候选，多名研究者已经报道了来自WT1蛋白质的多个辅助表位、杀伤表位，是癌相关蛋白质的代表例子(专利文献4～6、非专利文献1～3)。
此外，由这样的辅助表位、杀伤表位诱导的免疫应答受HLA基因的多态性控制(限制)(参照后述表1～5的“HLA限制性”)。此外，还已知，即使是来自具有相同的HLA等位基因的患者的T细胞之间，对于基于辅助表位、杀伤表位的免疫应答也在其的有无、强弱方面存在差异。因此，需要对来源不同的多种T细胞进行刺激、对多种癌症能够诱导更强的免疫应答的多肽。
关于这一点，本发明人等开发了一种使1个辅助表位和1个杀伤表位键合而成的长链多肽(辅助/杀伤-嵌合表位长肽；H/K-HELP)，进而还明确了：通过使用该H/K-HELP，与将该辅助表位及该杀伤表位混合使用时相比，能够更有效地诱导抗原特异性免疫应答(产生抗原特异性CTL及Th细胞)(非专利文献4)。此外，关于所涉及的H/K-HELP，本发明人还证实：通过将使1个来自MAGE蛋白质的辅助表位和1个来自MAGE蛋白质的杀伤表位键合而成的H/K-HELP施与大肠癌转移到肺的人类患者，对MAGE强烈诱导了特异性免疫应答，该患者的肿瘤增殖以及CEA肿瘤标志物有意义地降低(非专利文献4及5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第95/19783号
专利文献2:国际公开第97/11669号
专利文献3:国际公开第2008/053579号
专利文献4:国际公开第2007/047764号
专利文献5:国际公开第00/18795号
专利文献6:日本日本特开2006-280324号公报
非专利文献
非专利文献1:Oka Y.等、Current Medicinal Chemistry、2008年12月、15卷、29号、3052～3061页
非专利文献2:Kobayashi H.等、Cancer Immunol Immunother.、2006年7月、55卷、7号、850～860页
非专利文献3:Borbulevych OY等、Mol Immunol.、2010年9月、47卷、15号、2519～2524页
非专利文献4:大竹淳矢等、“辅助/杀伤-嵌合表位长肽(H/K-HELP)与短肽相比显示优异的抗原特异性Th1、Tc1细胞诱导能”、第71回日本癌学会学术总会记事、2012年8月30日发行、101页
非专利文献5:Takahashi N.等、Cancer Sci.、2012年1月、103卷、1号、150～153页
发明内容
发明要解决的课题
本发明是鉴于前述现有技术所具有的课题而作出的，目的在于，提供一种能够对来源不同的多种T细胞进行刺激、对多种癌症强烈诱导免疫应答的多肽。
用于解决课题的手段
本发明人为了达成前述目的，着眼于在白血病、各种固体癌中高表达的由肿瘤基因WT1编码的蛋白质，制备使1个来自WT1蛋白质的辅助表位和1个来自WT1蛋白质的杀伤表位键合而成的H/K-HELP，对T细胞进行刺激，并与将这些表位混合而对T细胞进行刺激的情况进行了比较。但是，与预期相反的是，未能确认在非专利文献4和5中所确认到的免疫应答亢进等。
另一方面，发现：在利用使总计3个以上的来自WT1蛋白质的辅助表位和杀伤表位键合而成的H/K-HELP对T细胞进行刺激时，与将这些表位混合对T细胞进行刺激的情况相比，能够对来源不同的更多种的CD4+T细胞和CD8+T细胞进行刺激，诱导更多的产生细胞因子(IFN-γ)的Th1细胞及CTL。进而，通过利用在辅助表位的两侧键合有杀伤表位的H/K-HELP对T细胞进行刺激，与利用在辅助表位的一侧键合有2个杀伤表位的H/K-HELP对T细胞进行刺激的情况相比，能够对来源不同的更多的CD4+T细胞进行刺激，诱导更多的产生IFN-γ的Th1细胞，从而完成了下述各发明。
＜1＞一种多肽，其为含有来自WT1蛋白质的辅助表位及来自WT1蛋白质的杀伤表位的融合多肽，在每1分子的该融合多肽中含有总计3～6个的前述辅助表位和前述杀伤表位。
＜2＞根据＜1＞所述的多肽，其中，在每1分子前述融合多肽中含有1个前述辅助表位和2个前述杀伤表位。
＜3＞根据＜2＞所述的多肽，其中，前述杀伤表位键合在前述辅助表位的两侧。
＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的多肽，其中，前述辅助表位的氨基酸序列为选自序列号：2～39中记载的氨基酸序列中的至少一种氨基酸序列，且前述杀伤表位的氨基酸序列为选自序列号：40～45中记载的氨基酸序列中的至少一种氨基酸序列。
＜5＞根据＜2＞所述的多肽，其中，前述辅助表位的氨基酸序列为序列号：5中记载的氨基酸序列，且前述杀伤表位的氨基酸序列为序列号：40和/或44中记载的氨基酸序列。
＜6＞根据＜3＞所述的多肽，其中，前述辅助表位的氨基酸序列为序列号：5中记载的氨基酸序列，键合在前述辅助表位的氨基末端侧的前述杀伤表位的氨基酸序列为序列号：40中记载的氨基酸序列，且键合在前述辅助表位的羧基末端侧的前述杀伤表位的氨基酸序列为序列号：44中记载的氨基酸序列。
＜7＞一种抗肿瘤剂，其含有＜1＞～＜6＞中任一项所述的多肽作为有效成分。
＜8＞一种在体外制造针对表达WT1蛋白质的肿瘤细胞产生细胞因子的T细胞的方法，其含有如下工序：培育＜1＞～＜6＞中任一项所述的多肽和单核细胞的工序、以及培育前述所培育单核细胞和抗原提呈细胞的工序。
＜9＞一种抗肿瘤剂，其含有利用＜8＞所述的制造方法制造的T细胞作为有效成分。
＜10＞根据＜9＞所述的抗肿瘤剂，其还含有＜1＞～＜6＞中任一项所述的多肽。
＜11＞一种抗肿瘤剂，其以＜1＞～＜6＞中任一项所述的多肽及抗原提呈细胞为有效成分。
＜12＞一种抗肿瘤剂，其以利用＜1＞～＜6＞中任一项所述的多肽脉冲后的抗原提呈细胞为有效成分。
发明的效果
根据本发明，可以提供一种能够对来源不同的多种T细胞进行刺激、对多种癌症强烈诱导产生IFN-γ等细胞因子等的免疫应答的多肽。
附图说明
图1为示出使用来自WT1蛋白质的多肽、由末梢血单核细胞诱导对该多肽进行特异性免疫应答的T细胞(抗原特异性T细胞)的方法的概略图。
具体实施方式
＜本发明的来自WT1蛋白质的抗原性多肽＞
如后述实施例所示，通过使总计3个以上的来自WT1蛋白质的辅助表位和杀伤表位键合而制作长链多肽，与将这些表位混合而对T细胞进行刺激的情况相比，能够对来源不同的多种CD4+T细胞及CD8+T细胞进行刺激、更多地诱导产生细胞因子的Th1细胞及CTL。另一方面，即使使来自WT1蛋白质的辅助表位和杀伤表位各1个键合而制作长链多肽，所述Th1细胞或CTL的诱导也并不亢进。
因此，本发明的来自WT1蛋白质的抗原性多肽为含有来自WT1蛋白质的辅助表位及来自WT1蛋白质的杀伤表位的融合多肽，在每1分子的该融合多肽中含有总计3～6个的前述辅助表位和前述杀伤表位。
在本发明中，“多肽”是指多个氨基酸连接而成的化合物。即，所谓肽也包括寡肽及蛋白质。此外，构成多肽的氨基酸可以为天然型，也可以为非天然型，还可以为类似物(氨基酸的N-酰基化物、O-酰基化物、酯化物、酰胺化物、烷基化物等)。此外，氨基酸的侧链可以进行化学修饰(添加糖链、添加脂质、乙酰化、磷酸化、泛素化等)。进而，多肽的氨基末端、游离的氨基可以键合有甲酰基、乙酰基、叔丁氧羰基(t-Boc)等，本发明的肽的羰基末端、游离的羧基可以键合有甲基、乙基、叔丁基、苄基等。
在本发明中，“WT1蛋白质”是指在白血病、各种固体癌中高表达的由Wilms肿瘤基因WT1编码的蛋白，来自人的WT1蛋白质中，典型的为由序列号：1中记载的氨基酸序列构成的蛋白(RefSeq ID：NM＿024426.4所特定的碱基序列编码的蛋白质)。
此外，WT1蛋白质除了这样的具有典型的氨基酸序列的蛋白质以外，在天然中还能存在氨基酸发生了变异的类型。因此，例如，人WT1蛋白质还包括在由序列号：1中记载的氨基酸序列构成的蛋白质中置换、缺失、插入或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列所构成的蛋白质。氨基酸序列的置换、缺失、插入或添加一般为10个以内的氨基酸(例如，5个以内的氨基酸、3个以内的氨基酸、1个氨基酸)。
在本发明中，“辅助表位”是指也被称为“Th表位”或“CD4+辅助表位”的、具有对CD4+T细胞进行刺激而诱导其的免疫应答的活性的抗原决定簇、构成其的氨基酸序列或含有该氨基酸序列的抗原性多肽中的任意者。在本发明中，对“辅助表位”的长度没有特别限制，通常为5～30个氨基酸，优选为7～25个氨基酸，更优选为9～22个氨基酸，特别优选为16个氨基酸。
需要说明的是，在本发明中，“免疫应答”是指T细胞等负责免疫的细胞将外源性异物(细菌、病毒等或它们的片段)或内源性异物(癌细胞等或它们的片段)识别为抗原、特异性地进行应答的反应，可以列举例如：通过识别所述抗原而进行的IFN-γ等细胞因子的产生、进而通过所涉及的细胞因子的产生等诱导的细菌、病毒及癌细胞等的清除。
在本发明中，“杀伤表位”是指：也被称为“CTL表位”或“细胞毒性T细胞表位”的、具有对CD8+T细胞进行刺激而诱导其的免疫应答的活性的抗原决定簇、构成其的氨基酸序列或含有该氨基酸序列的抗原性多肽。在本发明中，对“杀伤表位”的长度没有特别限制，通常为5～30个氨基酸，优选为6～25个氨基酸，更优选为8～20个氨基酸，特别优选为9个氨基酸。
抗原性多肽可以使用公知技术(例如，Paul WE编集、Fundamental Immunology、第3版、243～247页、Raven出版、1993年)来鉴定。作为用于鉴定抗原性多肽的技术，可以列举以与抗原特异性抗血清和/或T细胞株或克隆的进行反应的能力为指标的多肽筛选方法。例如，在ELISA和/或T细胞反应性分析中，以反应性实质上大于或等于全长WT1蛋白质的水平作为指标，在WT1蛋白质中的多肽中，可以选择与抗血清和/或T细胞反应的部分作为来自WT1蛋白质的抗原性多肽。这样的筛选可以使用Harlow和Lane、Antibodies：A LaboratoryManual、Cold Spring Harbor Laboratory、1998中记载的那样本领域技术人员公知的方法来实施。
此外，构成表位的氨基酸序列还可以通过利用电脑程序的分析来进行推测。辅助表位的氨基酸序列可以通过MHC-THREAD(http：//www.csd.abdn.ac.uk/～gjlk/MHC-Thread/)、EpiPredict(http：//www.epipredict.de/index.html)、HLA-DR4binding(http：//www-dcs.nci.nih.gov/branches/surgery/sbprog.html)、ProPred(http：//www.imtech.res.in/raghava/propred/)等电脑程序来进行推测。杀伤表位的氨基酸序列可以通过BIMAS(http：//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla＿bind/)、SVMHC(http：//www.sbc.su.se/svmhc/)、PREDEP(http：//bioinfo.md.huji.ac.il/marg/Teppred/mhc-bind/)、NetMHC(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)、PREDICT(http：//sdmc.krdl.org.sg：8080/predict/)、LpPep(http：//reiner.bu.edu/zhiping/lppep.html)等电脑程序来进行推测。此外，还可以通过SYFPEITHI(http：//syfpeithi.bmi-heidelberg.com/Scripts/MHCServer.dll/EpiPredict.htm)、RankPep(http：//www.mifoundation.org/Tools/rankpep.html)等电脑程序来推测杀伤表位及辅助表位的氨基酸序列。
含有通过这些电脑程序而推测出的氨基酸序列的多肽是否具有对CD4+T细胞或CD8+T细胞进行刺激、诱导其的免疫应答的活性，可以如后述实施例中所示那样在使用树突状细胞、末梢血细胞或纤维芽细胞的体外刺激分析中，通过供给所涉及的多肽，从而进行评价。此外，还可以通过将所涉及的多肽供于使用表达HLA的转基因小鼠动物的体内刺激分析，来进行评价。
在本发明中，“来自WT1蛋白质的辅助表位”或“来自WT1蛋白质的杀伤表位”不仅包括由天然WT1蛋白质的部分连续的氨基酸序列构成的抗原性多肽，还包括其的变异体。作为所涉及的变异体，可以列举含有在WT1蛋白质的部分连续的氨基酸序列中置换、缺失、插入或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列的变异体。氨基酸序列的置换、缺失、插入或添加一般为10个以内的氨基酸(例如，5个以内的氨基酸、优选为3个以内的氨基酸、更优选为1氨基酸)，作为本发明的变异体，特别优选含有在WT1蛋白质的部分连续的氨基酸序列中置换了1个氨基酸的氨基酸序列的变异体。
此外，作为本发明所涉及的“来自WT1蛋白质的辅助表位”的合适例子，可以列举由表1中记载的序列号：2～39中的任一个所述的氨基酸序列构成的多肽，作为更合适的例子，可以列举由序列号：5中记载的氨基酸序列构成的多肽。作为本发明所涉及的“来自WT1蛋白质的杀伤表位”的合适例子，可以列举由表5记载的序列号：40～45中的任一个记载的氨基酸序列构成的多肽，作为更合适的例子，可以列举由序列号：40或44中记载的氨基酸序列构成的多肽。
[表1]
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
需要说明的是，表1～5中记载的多肽对CD4+T细胞或CD8+T细胞具有抗原性已经在专利文献4～6、非专利文献1～3中证实。此外，如表1～5中记载的，由序列号：9中记载的氨基酸序列构成的多肽(辅助表位8)是将天然的WT1蛋白质中的194位的精氨酸残基置换为酪氨酸残基的多肽，由序列号：42中记载的氨基酸序列构成的多肽(杀伤表位3)是将天然的WT1蛋白质中的194位的精氨酸残基置换为酪氨酸残基的多肽，由序列号：44中记载的氨基酸序列构成的多肽(杀伤表位5)是将天然的WT1蛋白质中的304位的甲硫氨酸残基置换为酪氨酸残基的多肽。
本发明的“融合多肽”是将每1分子前述辅助表位和前述杀伤表位的总计3～6个多肽人为地键合而成的。前述辅助表位及前述杀伤表位的个数如果低于前述下限时，变得不能对来源不同的多种T细胞进行刺激；如果超过前述上限时，变得难以通过化学合成等制备。此外，对本发明的融合多肽的链长没有特别限制，优选为30～100个氨基酸。
关于本发明的每1分子融合多肽中所含有的表位(前述辅助表位或前述杀伤表位)的个数，规定为：在1个表位中含有其它表位时，并不含有该其它表位的个数(1个)。例如，关于含有表1中记载的辅助表位7(由人WT1蛋白质的第190～208位的氨基酸构成的多肽)的本发明的融合多肽，如表5所示，在人WT1蛋白质的第190～208位的氨基酸中含有杀伤表位7(由人WT1蛋白质的第194～202位的氨基酸构成的多肽)，但在该每1分子融合多肽中所含有的表位的个数不包括杀伤表位7的个数(1个杀伤表位)。此外，例如，关于含有表1中记载的辅助表位6(由人WT1蛋白质的第396～417位的氨基酸构成的多肽)的本发明的融合多肽，含有辅助表位2～4(分别为由人WT1蛋白质的第399～413位的氨基酸构成的多肽、由人WT1蛋白质的第405～415位的氨基酸构成的多肽、由人WT1蛋白质的第400～415位的氨基酸构成的多肽)，但在该每1分子融合多肽中所含有的表位的个数中不含辅助表位2～4(3个辅助表位)。
本发明的“融合多肽”中，每个各序列可以含有1个以上的序列不同的表位，也可以含有多个序列相同的表位。
此外，本发明的“融合多肽”中，对前述辅助表位及前述杀伤表位的配置没有特别限制，前述辅助表位及前述杀伤表位可以在中间未夹持前述杀伤表位及前述辅助表位地分别连续配置2个以上，此外，也可以是前述辅助表位和前述杀伤表位交替配置。
作为本发明的“融合多肽”，优选为在每1分子中含有总计3个的前述辅助表位和前述杀伤表位，更优选为含有1个前述辅助表位和2个前述杀伤表位，进而优选为包含含有序列号：5中记载的氨基酸序列的多肽、含有序列号：40中记载的氨基酸序列的多肽和含有序列号：44中记载的氨基酸序列的多肽的融合多肽。
此外，如后述实施例所示，从能够对来源不同的更多种的CD4+T细胞及CD8+T细胞进行刺激、更多地诱导抗原特异性的产生细胞因子的Th1细胞及CTL的观点出发，作为本发明的“融合多肽”进而优选为前述杀伤表位键合在前述辅助表位的两侧的多肽，特别优选为在含有序列号：5中记载的氨基酸序列的多肽的氨基末端侧键合有含有序列号：40中记载的氨基酸序列的多肽、在含有序列号：5中记载的氨基酸序列的多肽的羧基末端侧键合有含有序列号：44中记载的氨基酸序列的多肽的融合多肽。
本发明的“融合多肽”中，表位之间既可以直接键合也可以间接键合。作为所涉及的间接键合，可以列举例如介由连接多肽的键合。作为所涉及的连接多肽的长度，通常为1～100个氨基酸、优选为1～50个氨基酸、更优选为1～30个氨基酸、进而优选为2～10个氨基酸(例如，5个氨基酸)，特别优选为介由含有5个甘氨酸的连接多肽的键合。
本发明的融合多肽只要在每1分子中含有总计3～6个前述辅助表位和前述杀伤表位即可，也可以进一步添加对蛋白质的分离纯化有用通常作为标签使用的His标签、GFP之类的标记蛋白，还可以添加生物素等标记化合物。
本发明的融合多肽，可通过对编码它们的DNA应用各种公知的基因重组方法，来制造该融合多肽作为重组蛋白质。典型的例子为，使用适当的DNA合成仪合成编码有本发明的融合多肽的DNA，适当选择或组合该技术领域的参考书例如Sambrook等的MolecularCloning：A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年等)中介绍的各种方法，构建表达本发明的融合多肽的表达载体，用该表达载体转化大肠杆菌等适当的宿主细胞，生产该多肽。如前所述，此时可增加用于制造重组多肽的各种操作，如添加组氨酸标签等。
此外，本发明的融合多肽还可以以经各种保护基修饰过的氨基酸为原料通过化学合成来制造。不使用基因、宿主细胞而通过有机化学方法合成融合多肽的方法，对本领域技术人员而言是众所周知的。例如，“第5版实验化学讲座16有机化合物的合成IV”(相本三郎等著、日本化学会编)等介绍了各种多肽的化学合成方法，本发明的多肽可使用这些方法中的任意一种来合成。此外，也可以使用通常被称为肽合成仪的市售仪器来合成。
＜本发明的抗肿瘤剂＞
如后述实施例所示，前述融合多肽能够对来源不同的多种T细胞进行刺激，强烈诱导它们的免疫应答。因此，还能够提供一种含有本发明的融合多肽作为有效成分的抗肿瘤剂。
在本发明中，“抗肿瘤剂”是指对T细胞进行刺激而诱导它们的免疫应答，从而能够抑制肿瘤细胞的増殖和/或诱导该肿瘤细胞死亡的药剂。即，本发明的抗肿瘤剂不仅是能够通过施与对象而对对象内的T细胞进行刺激、激活免疫应答的药剂(用于主动免疫疗法的药剂)，还包括含有在对象外被刺激而使其免疫应答被激活的T细胞等的药剂(用于被动免疫疗法的药剂)。
此外，作为成为本发明的“抗肿瘤剂”的治疗或预防对象的肿瘤，只要是表达WT1蛋白质的肿瘤即可，可以列举例如白血病(急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病等)及固体癌(肾胚细胞瘤(Wilms瘤)、肾癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤等)。
此外，作为本发明的抗肿瘤剂的其它方式，可以列举含有使用本发明的融合多肽及该融合多肽制造的、对表达WT1蛋白质的肿瘤细胞产生细胞因子的T细胞作为有效成分的抗肿瘤剂。
所涉及的“对表达WT1蛋白质的肿瘤细胞产生细胞因子的T细胞”可以通过例如以下方法来制造。
所述方法含有培育本发明的融合多肽和单核细胞的工序、及培育前述所培育的单核细胞和抗原提呈细胞的工序。
在本发明中，“单核细胞”是指淋巴细胞及单核细胞，可以列举例如末梢血单核细胞(PBMC、末梢血单核细胞)、脐带血单核细胞、肿瘤组织浸润淋巴细胞的形态。需要说明的是，肿瘤组织浸润淋巴细胞是指从由罹患癌症的对象切除的肿瘤组织中、或采集的胸水、腹水中分离的淋巴细胞。
本发明的融合多肽和单核细胞的“培育”例如通过在培养单核细胞的培养基中添加本发明的融合多肽来进行。此外，还可以通过在固定有本发明的融合多肽的平板中培养单核细胞来进行。作为所涉及的培育时的条件，只要适合于单核细胞的维持即可，可以列举例如在为了维持单核细胞而利用的培养基(例如，添加血清的AIM-V培养基)中在37℃、5％CO2中培养15分钟～48小时。
作为按照此种方式进行培育的单核细胞和进行培育的抗原提呈细胞，只要是在其表面表达可以与在前述培育时使用的本发明的融合多肽结合的HLA的细胞即可，可以列举例如树突状细胞、B细胞、巨噬细胞。此外，作为本发明中所涉及的抗原提呈细胞，可以是在其表面上表达利用本发明的融合多肽脉冲的前述HLA的细胞。此外，所涉及的抗原提呈细胞可以在与单核细胞培育前照射X射线、丝裂霉素处理等而使其丧失增殖能力。
作为所涉及的抗原提呈细胞和单核细胞培育时的条件，只要适合于维持单核细胞及抗原提呈细胞即可，可以列举例如在为了维持单核细胞及抗原提呈细胞而利用的培养基(例如，AIM-V培养基)中在37℃、5％CO2中培养1～7天。此外，该培育时，在培养基中，从对T细胞进行刺激的观点出发，可以将IL-2、IL-7、IL-15、PHA、抗CD3抗体、IFN-γ、IL-12、抗IL-4抗体或这些的组合添加到培养基中。进而，从通过产生各种细胞因子而强化免疫应答的观点出发，可以将Picibanil(OK-432)、CpG DNA等Toll样受体(TLR)的激动剂等添加到培养基中。此外，为了确保被动免疫疗法所需要的T细胞数，可以将该抗原提呈细胞和单核细胞的培育反复进行多次。
如后述实施例所示，如此制造的T细胞含有对本发明的融合多肽特异性地产生细胞因子的CD4+T细胞(抗原特异性CD4+T细胞)和对本发明的融合多肽特异性产生细胞因子的CD8+T细胞(抗原特异性CD8+T细胞)。作为纯化所涉及的T细胞的方法，例如，可以使用固定有本发明的融合多肽的载体等进行分离。进而，还可以以所分泌的细胞因子为指标对所涉及的T细胞进行纯化。即，由于抗原特异性CD4+T细胞产生IFN-γ、IL-2、IL-4等细胞因子，因此可以通过使用针对这些物质的抗体的流式细胞术、亲和色谱、磁珠纯化法来进行纯化。
另一方面，由于抗原特异性CD8+T细胞产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子，因此可以通过使用针对这些的抗体的流式细胞术、亲和色谱、磁珠纯化法来进行纯化。
此外，所涉及的T细胞可以通过使用抗在各T细胞的细胞表面表达的蛋白质的抗体的流式细胞术、亲和色谱、磁珠纯化法来进行纯化。作为在抗原特异性CD4+T细胞的细胞表面表达的蛋白质，可以列举CD29、CD45RA、CD45RO等，作为在抗原特异性CD8+T细胞的细胞表面表达的蛋白质，可以列举CD107a、CD107b、CD63、CD69等。
此外，如前所述，为了将单核细胞诱导为抗原特异性T细胞，本发明的融合多肽及抗原提呈细胞是有用的。因此，作为用于通过被动免疫疗法治疗或预防癌症的药剂，还能够提供一种以本发明的融合多肽及抗原提呈细胞为有效成分抗肿瘤剂。
此外，本发明的抗肿瘤剂中所含有的T细胞及抗原提呈细胞、以及在该T细胞的制造中使用的单核细胞及抗原提呈细胞可以是分别独立地来自施与本发明的抗肿瘤剂的对象的细胞(自体)，也可以是与前述对象同种不同系的关系，此外还可以是HLA类型与前述对象一致的同种不同系的关系。
本发明的抗肿瘤剂中，可以在不妨碍本发明的融合多肽、T细胞或树突状细胞的作用的范围内含有为了药物的制剂化而一般使用的各种赋形剂、其它药物活性成分等。本发明的抗肿瘤剂特别优选处于能够使本发明的融合多肽、T细胞及树突状细胞保持稳定的缓冲液或液体培养基的形态。
作为缓冲液的非限定性例子，可举出中性的缓冲生理盐水或磷酸缓冲生理盐水等。此外，还可以进一步含有例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖醇等糖质，蛋白质、氨基酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(例如、EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(例如、氢氧化铝、KLH、QS21、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、磷酸铝、BCG、明矾、CpG DNA等TLR激动剂)、渗透压调节剂、悬浮剂、增粘剂和/或防腐剂等。
此外，本发明的抗肿瘤剂优选处于本发明的融合多肽及T细胞、以及本发明的融合多肽及树突状细胞分别混合的形态，但也可以是本发明的融合多肽和T细胞或树突状细胞分别保存、并能够在使用时混合并施与的所谓试剂盒形态。
本发明的抗肿瘤剂还可以与癌症的治疗或预防中使用的公知的药物组成物组合使用。此外，本发明的抗肿瘤剂可以以包括人在内的动物为使用对象。对人以外的动物没有特别限制，可以以各种家畜、家禽、宠物、实验用动物等为对象。此外，对施与本发明的抗肿瘤剂的对象没有特别限制，不仅可以是罹患表达WT1蛋白质的肿瘤的动物，也可以是尚未罹患的动物。例如，从预防癌症复发的观点出发，可以是通过外科手术、化疗方法、放疗方法等治疗过癌症的动物。
对本发明的抗肿瘤剂的施与形态没有特别限制，可以列举例如皮下注射、静脉注射、皮内注射、肌肉内注射、向肿瘤组织部位的局部注射。在施与本发明的抗肿瘤剂时，其施与量可以根据对象的年龄、体重、症状、健康状态等适当选择，例如，本发明的抗肿瘤剂的施与量(有效成分换算量)根据有效成分的种类而不同，例如，在有效成分为多肽时，通常为0.01～10mg，在有效成分为细胞时，通常为106～1012个细胞。
本发明还提供一种用于对对象的癌症进行治疗或预防的方法，其特征在于，按照上述方式将本发明的抗肿瘤剂施与对象。
本发明的抗肿瘤剂的制品或其说明书可以附带主旨为在癌症的治疗或预防中使用的标识。这里,“制品或说明书附带标识”是指：在制品的主体、容器、包装等中附带标识、或者在用于公开制品信息的说明书、所附文件、宣传物、其他印刷物等中附带标识。在主旨为在癌症的治疗或预防中使用的标识中，可以含有：通过施与本发明的融合多肽、该融合多肽和使用该融合多肽制造的对表达WT1蛋白质的肿瘤细胞产生细胞因子的T细胞、或者该融合多肽及树突状细胞，从而抑制肿瘤细胞的增殖、和/或诱导该肿瘤细胞死亡的机理的相关信息。
实施例
以下基于实施例及比较例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受以下实施例限定。
＜树突状细胞的调制＞
从6名健康志愿者提供的血液中，使用Ficoll-Paque(安玛西亚(AmershamBioscience)公司制)分离人末梢血单核细胞(PBMC)。将所分离的PBMC用无血清的AIM-V在细胞培养烧瓶(BD生物科学公司制)中在37℃、CO2培养箱内培养1小时后，除去非粘附性细胞。然后，将残留在烧瓶上的粘附性细胞在重组GM-CSF(10ng/ml、和光公司制)及重组IL-4(10ng/ml、Wako公司制)存在下开始用AIM-V培养基进行培养。在开始培养起3天后，交换为添加有GM-CSF和IL-4的AIM-V培养基，在开始培养起7天后用胰蛋白酶回收树突状细胞(DC)。将该DC作为抗原特异性T细胞的诱导、或由T细胞产生抗原特异性细胞因子(IFN-γ)的解析时的抗原提呈细胞(APC：antigen-presenting cells)使用。
＜来自WT1蛋白质的多肽＞
设计表6所示的6种来自WT1蛋白质的多肽，由株式会社肽研究所(PEPTIDEINSTITUTE,INC.)进行化学合成，以95％以上的纯度获得多肽。
[表6]
需要说明的是，辅助/杀伤-嵌合表位长肽(H/K-HELP)1是从N末端侧起介由由5个甘氨酸构成的连接多肽将辅助表位(HE)4和杀伤表位(KE)1键合而成的融合多肽。H/K-HELP2是从N末端侧起介由由5个甘氨酸构成的连接多肽将HE4和KE1和KE5键合而成的融合多肽。H/K-HELP3是从N末端侧起介由由5个甘氨酸构成的连接多肽将KE1和HE4和KE5键合而成的融合多肽。
此外，后述PBMC向培养培养基中的添加以下述4个方式来进行。
混合物(比较例1)：将各5μM的HE4、KE1及KE5混合而成的物质添加到培养基中
H/K-HELP1(比较例2)：将5μM的H/K-HELP1添加到培养基中
H/K-HELP2(实施例1)：将5μM的H/K-HELP2添加到培养基中
H/K-HELP3(实施例2)：将5μM的H/K-HELP3添加到培养基中。
＜抗原特异性Th细胞(CD4阳性T细胞)及CTL(CD8阳性T细胞)的诱导＞
将由健康志愿者分离的前述PBMC按照2×106个细胞/孔的方式播种在24孔平板(BD生物科学公司制)中。然后，用1ml/孔的、添加前述来自WT1蛋白质的用于诱导抗原特异性T细胞的各多肽(5μM)及血清的AIM-V培养基，在37℃、CO2培养箱内开始进行培养。
在开始培养起7天后，将前述DC(自体DC)添加到相同来源的PBMC中。此外，将培养基交换为添加OK-432(0.1KE/ml、商品名：Picibanil、中外制药株式会社制)的无血清AIM-V培养基(生命科技(Life Technologies)公司制)，培养2小时。需要说明的是，溶链菌(OK-432)是用青霉素对A群溶血性链球菌的弱毒性自然变异株(Su株)进行处理而得的制剂，通过产生各种细胞因子(免疫因子)而激发免疫增强作用，这是已知的。
然后，在前述2小时的培养后，加入丝裂霉素C(MMC、协和发酵麒麟株式会社制)处理50分钟。进而，在前述用于诱导抗原特异性T细胞的各多肽(5μM)存在下，将自体DC和T细胞在含有非活化的5％人AB血清(北海道红十字中心)的AIM-V培养基中进行共培养，进行T细胞的再刺激。2天后按照最终浓度达到10U/ml的方式添加重组IL-2(ShionogiPharmaceutical Institute Co.Ltd制)。从共培养开始14天后，将前述用于诱导抗原特异性T细胞的各多肽(5μM)对自体DC脉冲2小时，将进行了MMC处理的产物作为APC，进行T细胞的再刺激。此外，从共培养开始14天后，此后将重组IL-2的添加浓度设为20U/ml而进行培养。然后，通过离心分离等将共培养第21天的T细胞回收，供于以下所示的抗原特异性反应性的解析。
＜利用细胞内染色法(ICS)进行的T细胞的抗原特异性细胞因子产生的解析＞
将按照前述那样诱导的T细胞(前述共培养第21天的T细胞)按照达到5×104个细胞/孔的方式，此外将自体DC按照达到5×103个细胞/孔的方式播种在96孔平板(BD生物科学公司制)的同一孔内。然后，在存在5μM的用于抗原特异性反应性的解析的各多肽(HE4、KE1、KE5、H/K-HELP1、H/K-HELP2或H/K-HELP3)的条件下进行培养。此外，制备不加多肽的组作为对照组。
细胞内细胞因子染色法按照常规方法进行，首先在培养开始时加入蛋白转运抑制剂(Brefeldin A)(西格玛公司制)来抑制细胞内蛋白质转运，使细胞因子在细胞内蓄积。然后，对于培养了15～20小时的细胞，为了检测CD4阳性T细胞，用抗CD4抗体和抗细胞因子抗体进行染色，此外，为了检测CD8阳性T细胞，用抗CD8抗体和抗细胞因子抗体进行染色，通过流式细胞术进行解析。需要说明的是，使用FITC标记小鼠抗人CD4mAb作为抗CD4抗体，使用PerCP-Cy7标记小鼠抗人IFN-γmAb作为抗细胞因子抗体，使用APC标记小鼠抗人CD8mAb作为抗CD8抗体。此外，测定中使用FACSCantoTMII，解析中使用FACSDivaTM6.1(均为BD生物科学公司制)。
然后，测定CD4阳性T细胞(Th细胞)中的抗原特异性IFN-γ产生细胞的比率，在用于解析抗原特异性反应性的各多肽存在下的测定值中，选择最高的比率。然后，将该比率为对照组(多肽非添加组)的比率的2.5倍以上、且其差为2％以上的情况，评价为通过前述用于诱导抗原特异性T细胞的多肽诱导出诱导了细胞因子产生的T细胞(抗原特异性T细胞)。此外，还测定了CD8阳性T细胞(CTL)中的抗原特异性IFN-γ产生细胞的比率，与前述CD4阳性T细胞同样地评价抗原特异性T细胞的诱导。获得的结果示于表7。表7中，“+”表示确认诱导出抗原特异性T细胞，“-”表示未确认到抗原特异性T细胞的诱导。“诱导效率(％)”表示能够由所提供的供体不同的6种PBMC诱导出抗原特异性T细胞的比率。此外，“最优肽”是指各PBMC中抗原特异性IFN-γ产生细胞的比率最高(多肽添加组和多肽非添加组的抗原特异性IFN-γ产生细胞的比率之差最大)的用于诱导抗原特异性T细胞的多肽。进而，“最优肽(％)”表示在6种PBMC中被评价为前述最优肽的比率。
[表7]
如表7所示的结果所阐释的，使用本发明的融合多肽的情况(实施例1～2)下，与将构成本发明的融合多肽的表位混合使用的情况(比较例1)相比，能够对来源不同的更多种的CD4阳性T细胞及CD8阳性T细胞进行刺激，诱导产生细胞因子(IFN-γ)的Th1细胞及CTL(参照表7“诱导效率(％)”的“CD4”及“CD8”)。进而，使用在辅助表位的两侧键合有杀伤表位的本发明的融合多肽的情况(实施例2)下，与实施例1相比可知，能够对来源不同的更多种的CD4阳性T细胞进行刺激，诱导产生细胞因子(IFN-γ)的Th1细胞(参照表7“诱导效率(％)”的“CD4”)。另一方面，使用键合有杀伤肽和辅助表位各1个的融合多肽的情况(比较例2)下，诱导CD4阳性T细胞及CD8阳性T细胞中的抗原特异性T细胞的活性与比较例1没有发生变化(参照表7“诱导效率(％)”的“CD4”及“CD8”)。
此外，如表7所示，可知使用本发明的融合多肽的情况(实施例1～2)下，与比较例1及2相比，产生细胞因子的Th1细胞及CTL的诱导效率高，即强烈诱导了免疫应答(参照表7“最优肽”)。进而可知：使用在辅助表位的两侧键合有杀伤表位的本发明的融合多肽的情况(实施例2)下，与实施例1相比，也能够对来源不同的更多种的CD4阳性T细胞及CD8阳性T细胞进行刺激，诱导产生细胞因子(IFN-γ)的Th1细胞及CTL(参照表7“最优肽(％)”)。
产业实用性
如以上所说明，根据本发明，能够对来源不同的多种T细胞进行刺激，对多种癌症强烈诱导免疫应答。
因此，通过将本发明的融合多肽、以及该融合多肽和树突状细胞施与对象，能够对对象内的T细胞进行刺激，强烈活化免疫应答，因此作为癌症的主动免疫疗法用药剂有用。此外，由该融合多肽诱导的抗原特异性T细胞、及利用该融合多肽脉冲的抗原提呈细胞作为被动免疫疗法用药剂或抗肿瘤剂有用。这些细胞优选与该融合多肽一起使用。
序列号：1
＜223＞人WT1蛋白质
序列号：2
＜223＞辅助表位1(HE1)
序列号：3
＜223＞辅助表位2(HE2)
序列号：4
＜223＞辅助表位3(HE3)
序列号：5
＜223＞辅助表位4(HE4)
序列号：6
＜223＞辅助表位5(HE5)
序列号：7
＜223＞辅助表位6(HE6)
序列号：8
＜223＞辅助表位7(HE7)
序列号：9
＜223＞由在WT1蛋白质的180～208位中、194位的精氨酸被置换为酪氨酸的氨基酸序列构成的辅助表位8(HE8)
序列号：10
＜223＞辅助表位9(HE9)
序列号：11
＜223＞辅助表位10(HE10)
序列号：12
＜223＞辅助表位11(HE11)
序列号：13
＜223＞辅助表位12(HE12)
序列号：14
＜223＞辅助表位13(HE13)
序列号：15
＜223＞辅助表位14(HE14)
序列号：16
＜223＞辅助表位15(HE15)
序列号：17
＜223＞辅助表位16(HE16)
序列号：18
＜223＞辅助表位17(HE17)
序列号：19
＜223＞辅助表位18(HE18)
序列号：20
＜223＞辅助表位19(HE19)
序列号：21
＜223＞辅助表位20(HE20)
序列号：22
＜223＞辅助表位21(HE21)
序列号：23
＜223＞辅助表位22(HE22)
序列号：24
＜223＞辅助表位23(HE23)
序列号：25
＜223＞辅助表位24(HE24)
序列号：26
＜223＞辅助表位25(HE25)
序列号：27
＜223＞辅助表位26(HE26)
序列号：28
＜223＞辅助表位27(HE27)
序列号：29
＜223＞辅助表位28(HE28)
序列号：30
＜223＞辅助表位29(HE29)
序列号：31
＜223＞辅助表位30(HE30)
序列号：32
＜223＞辅助表位31(HE31)
序列号：33
＜223＞辅助表位32(HE32)
序列号：34
＜223＞辅助表位33(HE33)
序列号：35
＜223＞辅助表位34(HE34)
序列号：36
＜223＞辅助表位35(HE35)
序列号：37
＜223＞辅助表位36(HE36)
序列号：38
＜223＞辅助表位37(HE37)
序列号：39
＜223＞辅助表位38(HE38)
序列号：40
＜223＞杀伤表位1(KE1)
序列号：41
＜223＞杀伤表位2(KE2)
序列号：42
＜223＞由在WT1蛋白质的194～202位中、194位的精氨酸被置换为酪氨酸的氨基酸序列构成的杀伤表位3(KE3)
序列号：43
＜223＞杀伤表位4(KE4)
序列号：44
＜223＞由在WT1蛋白质的303～311位中、304位的甲硫氨酸被置换为酪氨酸的氨基酸序列构成的杀伤表位5(KE5)
序列号：45
＜223＞杀伤表位6(KE6)
序列号：46
＜223＞从N末端起依次键合有HE4、由5个甘氨酸构成的连接子和KE1的融合多肽
序列号：47
＜223＞从N末端起依次键合有HE4、由5个甘氨酸构成的连接子、KE1、由5个甘氨酸构成的连接多肽和KE5的融合多肽
序列号：48
＜223＞从N末端起依次键合有KE1、由5个甘氨酸构成的连接子、HE4、由5个甘氨酸构成的连接多肽和KE5的融合多肽

Claims (6)

1.一种融合多肽，其为含有来自WT1蛋白质的辅助表位及来自WT1蛋白质的杀伤表位的融合多肽，在每1分子的该融合多肽中含有总计3个所述辅助表位和所述杀伤表位，所述辅助表位的氨基酸序列为选自序列号：2～39中记载的氨基酸序列中的至少一种氨基酸序列，且所述杀伤表位的氨基酸序列为选自序列号：40～45中记载的氨基酸序列中的至少一种氨基酸序列，
所述辅助表位的氨基酸序列为序列号：5中记载的氨基酸序列，键合在所述辅助表位的氨基末端侧的所述杀伤表位的氨基酸序列为序列号：40中记载的氨基酸序列，且键合在所述辅助表位的羧基末端侧的所述杀伤表位的氨基酸序列为序列号：44中记载的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的融合多肽，其中，在每1分子所述融合多肽中含有1个所述辅助表位和2个所述杀伤表位。
3.根据权利要求2所述的融合多肽，其中，所述杀伤表位键合在所述辅助表位的两侧。
4.一种抗肿瘤剂，其含有权利要求1～3中任一项所述的融合多肽作为有效成分。
5.在体外制造针对表达WT1蛋白质的肿瘤细胞而产生细胞因子的T细胞的方法，含有如下工序：
培育权利要求1～3中任一项所述的融合多肽和单核细胞的工序、以及
培育所述所培育的单核细胞和抗原提呈细胞的工序。
6.一种抗肿瘤剂，其以权利要求1～3中任一项所述的融合多肽及抗原提呈细胞为有效成分。
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