CN105814073A - Sema5b肽和含有sema5b肽的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本文描述了针对癌症的肽疫苗。具体的说，提供衍生于SEMA5B基因的分离表位肽，其引起CTL，因此适合用于癌症的免疫治疗。所述发明性的肽包含SEMA5B衍生肽以及其修饰形式，其中一个、两个、或几个氨基酸被取代、缺失、插入或添加，只要这些修饰形式保留了原始序列的必备CTL诱导能力。进一步提供编码此类肽的多核苷酸，以及包括任意此类肽或多核苷酸作为活性试剂的药物组合物。还提供靶向此类肽的抗原呈递细胞和分离的CTL，以及用于诱导所述抗原呈递细胞或CTL的方法。此外，本发明提供用于治疗和/或预防(例如阻止)癌症(肿瘤)(比如食管癌、NSCLC、RCC和SCLC)和/或阻止其转移或术后复发的方法，以及用于诱导CTL的方法，用于诱导抗肿瘤免疫力的方法，其使用衍生于SEMA5B的肽，编码所述肽的多核苷酸，或呈递所述肽的抗原呈递细胞，或本发明的药物组合物进行。

Description

SEMA5B肽和含有SEMA5B肽的疫苗
技术领域
本发明涉及生物科学领域，更具体的涉及癌症治疗领域。特别地，本发明涉及作为癌症疫苗有效的新肽，以及用于肿瘤治疗和/或预防任一项或两项的药物。
优先权
本发明要求2012年12月4日提交的美国临时申请号61/733279的权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)已被证明识别表位肽，然后杀死肿瘤细胞，所述表位肽衍生自发现于主要组织相容性复合物(MHC)I类分子上的肿瘤相关抗原(TAAs)。自从黑色素瘤抗原(MAGE)家族作为TAAs的第一个例子被发现，主要通过免疫学方法(NPL1-2)已发现多种其它TAAs。这些TAAs的一些作为免疫治疗靶标目前正在进行临床开发。
有利的TAAs对于癌细胞的增殖和存活是必不可少的。这些TAAs作为免疫治疗靶标的使用可以最小化有很好描述的癌细胞免疫逃逸风险，其可归于作为治疗驱动的免疫选择(therapeuticallydrivenimmuneselection)结果的TAA缺失、突变或下调。因此，对能够诱导有效的并且特异性的抗肿瘤免疫应答的新TAAs的鉴定保证了进一步的开发。因此，用于各种类型的肿瘤的肽疫苗接种策略的临床应用正在进行中(NPL3-10)。至今，已有使用这些TAA衍生肽的临床试验的数个报告。不幸的是，这些癌症疫苗试验至今只取得了较低的客观应答率(NPL11-13)。因此，对适合用作免疫治疗靶标的新TAAs仍然有需求。
SEMA5B是semaphorin蛋白家族的成员，其为一类神经发育期间参与轴突引导的分泌型和膜型蛋白(NPL14)。最近的研究提示，semaphorin家族蛋白的功能不仅涉及神经系统，还涉及器官发生、血管生成和癌症的进展。
在使用由23040个基因组成的cDNA微阵列，通过基因表达谱分析来阐明肾细胞癌(RCC)的分子机制的过程中，发现SEMA5B在RCC中频繁上调。
在衍生于RCC患者的cDNA样品中对该基因的RT-PCR分析证明，SEMA5B在所有的RCC样品中上调。使用SEMA5BcDNA片段作为探针的后续Northern杂交分析揭示了一种在RCC组织中高表达，但除了胎儿的脑和肾之外，在正常人组织中几乎检测不到的SEMA5B转录物(PTL1)。此外，在RCC细胞系(NPL15)中通过siRNA敲低SEMA5B减弱了RCC细胞的生长。
引用表
专利文献
[PTL1]WO2007/013575
非专利文献
[NPL1]BoonT,IntJCancer1993,54(2):177-80
[NPL2]BoonT&vanderBruggenP,JExpMed1996,183(3):725-9
[NPL3]HarrisCC,JNatlCancerInst1996,88(20):1442-55
[NPL4]ButterfieldLH等,CancerRes1999,59(13):3134-42
[NPL5]VissersJL等,CancerRes1999,59(21):5554-9
[NPL6]vanderBurgSH等.,JImmunol1996,156(9):3308-14
[NPL7]TanakaF等,CancerRes1997,57(20):4465-8
[NPL8]FujieT等,IntJCancer1999,80(2):169-72
[NPL9]KikuchiM等,IntJCancer1999,81(3):459-66
[NPL10]OisoM等,IntJCancer1999,81(3):387-94
[NPL11]BelliF等,JClinOncol2002,20(20):4169-80
[NPL12]CouliePG等,ImmunolRev2002,188:33-42
[NPL13]RosenbergSA等,NatMed2004,10(9):909-15
[NPL14]O'ConnorTP等,NeuralDev.2009,23(4)18
[NPL15]HirotaE.等,IntJOncol.2006,29(4):799-827
发明简述
本发明至少部分基于对新肽的发现，其可以作为免疫治疗的适合靶标。因为TAAs通常被免疫系统感知为“自身的”，因此通常没有先天免疫原性，对合适靶标的发现仍然具有重要意义。在本发明的过程中，SEMA5B(典型的氨基酸序列示于SEQID75、78或80；典型的核苷酸序列示于SEQID74、76、77或79(GenBankAccessionNo.NM_001031702,NM_001256346,NM_001256347或NM_001256348))被证明特异性的在癌症中过表达，其例子包括但不限于，食管癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)和小细胞肺癌(SCLC)(表1)。因此，本发明致力于SEMA5B作为癌症/肿瘤免疫治疗的候选靶标。
为了这个目的，本发明至少部分要求，在衍生于SEMA5B的肽中对具有对SEMA5B特异的诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)能力的特异性表位肽的鉴定。如下面更详细讨论的，从健康供体获得的外周血单核细胞(PBMCs)使用衍生自SEMA5B的HLA-A*2402结合候选肽刺激。然后建立了具有特异性细胞毒性的CTL系，所述特异性细胞毒性针对用各种候选肽冲激(plusedwith)的HLA-A24阳性靶细胞。本文的结果证明，这些肽是HLA-A24限制性表位肽，其能够诱导针对表达SEMA5B细胞的有效的且特异性的免疫反应。这些结果进一步表明SEMA5B为强免疫原性，并且其表位是癌症/肿瘤免疫治疗的有效靶标。
相应的，本发明的一个目的是提供分离的肽，其能够结合HLA抗原，并包括衍生于SEMA5B的氨基酸序列(SEQIDNO:75、78或80)。此类肽预期具有CTL诱导能力，因此可以用于体外或离体诱导CTLs，或直接施用于受试者以诱导针对癌症的体内免疫应答，其例子包括但不限于食管癌、NSCLC、RCC和SCLC。
本发明的肽通常长度少于15、14、13、12、11或10个氨基酸。优选的肽为九肽和十肽，更优选的为具有选自SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列的九肽和十肽。在这些中，特别优选具有选自SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54的氨基酸序列的肽。
本发明也考虑修饰的肽，其具有在选自于SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列上取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或更多个氨基酸的氨基酸序列，如果所得的修饰肽保留了原始未修饰肽必备的CTL诱导能力和HLA结合能力。
在一个实施方案中，当所述原始肽是9聚物(例如SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13和20中的一个)，所述修饰肽的大小优选在9到40个氨基酸的范围内，例如9到20个氨基酸的范围内，例如9到15个氨基酸的范围内。同样的，当所述原始肽是10聚物(例如SEQIDNOs:40、41、47和54中的一个)，所述修饰肽的大小优选在10到40个氨基酸的范围内，例如10到20个氨基酸的范围内，例如10到15个氨基酸的范围内。
本发明进一步包含编码本发明任意一种肽的分离的多核苷酸。这些多核苷酸可以用于诱导或制备具有CTL诱导能力的抗原呈递细胞(APCs)。和本发明的肽一样，此类APCs可以施用于受试者来诱导针对癌症的免疫应答。
当施用于受试者时，本发明的所述肽可以被呈递到APCs的表面，从而诱导靶向各个肽的CTLs。因此，本发明的一个目的是提供包括本发明一种或多种肽，或编码此类肽的一种或多种多核苷酸的试剂或组合物。所述试剂或组合物可以用于诱导CTL。此类试剂或组合物可以用于癌症的治疗和/或预防，和/或防止其转移或术后复发。本发明考虑的靶标癌症的例子包括但不限于食管癌、NSCLC、RCC和SCLC。
本发明进一步考虑包括本发明的一种或多种肽或多核苷酸的药物组合物或试剂。所述药物组合物或试剂优选配制用于癌症，更具体的，原发癌的治疗和/或预防，和/或阻止其转移或术后复发。代替或除本发明所述的肽或多核苷酸之外，本发明的药物试剂或组合物可以包括呈递本发明的任意肽的APCs或外来体作为活性成分。
本发明的肽或多核苷酸可以用于诱导APCs，其在表面呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物，例如，通过使衍生于受试者的APCs接触本发明的肽，或将编码本发明肽的多核苷酸引入APCs中。此类APCs具有诱导CTLs的能力，并且对于癌症的免疫治疗是有用的，所述的诱导CTLs的能力特异性识别在表面上呈递靶标肽的细胞。相应的，本发明包含用于诱导具有CTL诱导能力的APCs的方法，以及通过此类方法得到APCs。另外，本发明还包含用于诱导具有CTL诱导能力的APCs的试剂或组合物，此类试剂和组合物包括本发明的任意肽或多核苷酸。
本发明进一步的一个目标是提供用于诱导CTLs的方法，此类方法包括将CD8阳性T细胞和在其表面呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的APCs共培养的步骤，将CD8阳性T细胞和在其表面呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的外来体共培养的步骤，或将编码两种T细胞受体(TCR)亚基的多核苷酸或编码各种TCR亚基的多核苷酸引入的步骤，其中所述TCR可以结合呈递在细胞表面的本发明的肽和HLA抗原的复合物。通过此类方法得到的CTLs可以应用于癌症的治疗和/或预防，其例子包括但不限于食管癌、NSCLC、RCC和SCLC。相应的，本发明包含用于诱导CTLs的方法，和通过此类方法得到的CTLs。本发明的另一个目标是提供分离的APCs，其在表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物。本发明进一步提供靶向本发明的肽的分离的CTLs。此类CTLs也可以定义为能够识别(或结合)在细胞表面上的本发明的肽和HLA抗原的复合物的CTLs。这些APCs和CTLs可以用于癌症免疫治疗。
本发明的再一个目标是提供用于在有此需要的受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，此类方法包括将试剂或组合物施用于受试者的步骤，所述试剂或组合物包括至少一种选自下组的成分(a)本发明的肽或编码此类肽的多核苷酸，(b)呈递此类肽的APC或外来体和(c)能够识别在其表面呈递本发明肽的细胞的CTL。
本发明的一个方面有关本发明的肽、包含用作药物的此类肽的试剂或组合物。本发明的适用性延伸至与SEMA5B过表达相关或由其引起的任意若干疾病，例如癌症，其例子包括但不限于食管癌、NSCLC、RCC和SCLC。
更具体的，本发明提供以下：
[1]具有细胞毒性T淋巴细胞诱导能力的分离肽，其中所述肽包含以下的氨基酸序列(a)或(b):
(a)SEMA5B免疫活性片段的氨基酸序列；
(b)氨基酸序列，其在SEMA5B免疫活性片段的氨基酸序列上取代，缺失、插入和/或添加1个、2个或几个氨基酸，
其中通过所述肽诱导的CTL具有针对细胞的特异性细胞毒性活性，所述细胞呈递衍生于SEMA5B的片段。
[2][1]的肽，其中所述肽包含以下氨基酸序列(a)或(b)：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54；
(b)选自下组的氨基酸序列：SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54中一个、两个或几个氨基酸被取代，缺失、插入和/或增加的氨基酸序列；
[3][2]的肽，其中所述肽具有一个或两个以下特性:
(a)自N端的第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；以及
(b)C端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸；
[4][1]至[3]任一项的肽，其中所述肽是九肽或十肽；
[5]编码[1]至[4]任一项的肽的分离的多核苷酸；
[6]用于诱导CTL的组合物，其中所述组合物包含至少一种选自下组的活性成分：
(a)[1]至[4]任一项的肽；
(b)[5]的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递[1]至[4]任一项的肽的抗原呈递细胞(APC)；和
(d)在其表面上呈递[1]至[4]任一项的肽的外来体；
[7]用于治疗和/或预防癌症，和/或防止其术后复发，或诱导针对所述癌症的免疫应答的药物组合物，其中所述组合物包含至少一种选自下组的活性成分：
(a)[1]至[4]任一项的肽；
(b)[5]的多核苷酸；
(c)在其表面呈递[1]至[4]任一项的肽的抗原呈递细胞(APC)；
(d)在其表面呈递[1]至[4]任一项的肽的外来体；和
(e)能够识别呈递[1]至[4]任一项的肽的细胞的CTL；
[8][7]的药物组合物，其中所述药物组合物配制用于施用到HLA抗原为HLA-24的受试者；
[9]用于诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其中所述方法包含选自下组的步骤：
(a)使APC与[1]至[4]任一项的肽接触，和
(b)将编码[1]至[4]任一项的肽的多核苷酸引入APC；
[10]用于诱导CTL的方法，其中所述方法包含选自下组的步骤：
(a)共培养CD8阳性T细胞和在其表面上呈递HLA抗原和[1]至[4]任一项的肽的复合物的APC；
(b)共培养CD8阳性T细胞和在其表面上呈递HLA抗原和[1]至[4]任一项的肽的复合物的外来体；和
(c)将编码两种T细胞受体(TCR)亚基的多核苷酸或编码各种TCR亚基的多核苷酸引入CD8阳性T细胞中，其中由所述亚基形成的TCR能够结合细胞表面上的[1]至[4]任一项的肽和HLA抗原的复合物；
[11]分离的APC，其在表面上呈递HLA抗原和[1]至[4]任一项的肽的复合物；
[12][11]的APC，其是通过[9]的方法诱导的；
[13]分离的CTL，其靶向[1]至[4]任一项的肽；
[14][13]的CTL，其是通过[10]的方法诱导的；
[15]在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，其中所述方法包括对所述受试者施用包含[1]至[4]任一项的肽或编码所述肽的多核苷酸的组合物的步骤；
[16]抗体或其免疫活性片段，其针对[1]至[4]任一项的肽；
[17]载体，其包含编码[1]至[4]任一项的肽的核苷酸序列；
[18]宿主细胞，其由[17]的载体转化或转染；
[19]诊断试剂盒，其包含[1]至[4]任一项的肽、[5]的多核苷酸或[16]的抗体或免疫活性片段；
[20]筛选具有诱导CTL的能力的肽的方法，所述CTL具有针对呈递衍生于SEMA5B片段的细胞的特异性细胞毒性活性，其中所述方法包含以下步骤：
(i)提供候选序列，其由原始氨基酸序列通过取代、缺失、插入和/或增加一个、两个或几个氨基酸残基修饰的氨基酸序列组成，其中所述原始氨基酸序列选自下组：SEQIDNOs:41、2、3、4、8、9、10、13、20、40、47和54；
(ii)选择候选序列，所述候选序列除与SEMA5B外的任意衍生自已知人基因产物的肽不具有实质显著的同源性；
(iii)使由步骤(ii)中选择的候选序列组成的肽与抗原呈递细胞接触；
(iv)使步骤(iii)的抗原呈递细胞与CD8阳性T细胞接触；和
(v)鉴定CTL诱导能力与由原始氨基酸序列组成的肽相同或更高的肽。
[21]包含[1]至[4]任一项的肽的药物组合物；
[22]用作药物的[1]至[4]任一项的肽；
[23]用作药物的[5]的多核苷酸或[17]的载体。
或者，在另一个实施方案中，本发明还提供以下肽及其用途：
[1]具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力的长度少于15个氨基酸的分离肽，其中所述肽包含以下氨基酸序列(a)或(b)：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQIDNOs:41、2、3、4、8、9、10、13、20、40、47和54；
(b)氨基酸序列，其在选自下组的氨基酸序列：SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54上取代，缺失、插入和/或添加一个、两个或几个氨基酸；
[2][1]的肽，其中所述肽具有以下一种或两种特性:
(a)自N端的第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；和
(b)C端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸；
[3][1]或[2]的肽，其中所述肽是九肽或十肽。
当阅读下面的详细说明结合随附的附图和实施例，本发明的目的和特征将变得更加充分明显。应当理解本发明前面的发明简述和后面的详细说明为示例性的实施方案，并不对本发明或本发明的其它可替换实施方案构成限制。
尤其是，虽然本文就若干具体的实施方案对本发明进行了描述，应当理解这些描述对本发明是说明性的，而不构成对本发明的限制。在不背离如附加的权利要求所描述的本发明的精神和范围下，本领域的技术人员可以想到本发明的各种修改和应用。同样地，本发明的其它目的、特征、益处和优势将从此概要和下文描述的特定实施方案而明显，并且将对于本领域技术人员是显而易见的。根据上文结合随附的实施例、数据、附图以及从中能够合理推断的内容，单独或考虑本文引用的参考文献，这些目的、特征、益处和优势将是明显的。
附图简述
本领域技术人员在考虑了下文的附图简要说明及对本发明及其优选实施方案的详细描述后，将清楚的得知本发明的各个方面和应用。
图1-1
图1由(a)至(m)一系列照片组成，显示使用衍生于SEMA5B的肽诱导的CTLs的干扰素(IFN)γ酶联免疫斑点(ELISPOT)试验的结果。在孔编号7#中使用SEMA5B-A24-9-512(SEQIDNO:2)(a)、3#中使用SEMA5B-A24-9-1010(SEQIDNO:3)(b)、3#中使用SEMA5B-A24-9-196(SEQIDNO:4)(c)、4#中使用SEMA5B-A24-9-723(SEQIDNO:8)(d)、5#中使用SEMA5B-A24-9-280(SEQIDNO:9)(e)，以及3#中使用SEMA5B-A24-9-293(SEQIDNO:10)(e)诱导的CTLs与对照相比，分别显示出强的IFN-γ生成。这些图中孔上的方框提示来自于对应孔中的细胞扩张形成CTL系。相反的，作为典型的阴性数据，使用SEMA5B-A24-9-247(SEQIDNO:1)刺激的CTL没有观察到特异性的IFN-γ生成(m)。在这个图中，“+”表明针对使用适合的肽冲激的靶细胞的IFN-γ生成，“-”表明针对没有使用任何肽冲激的靶细胞的IFN-γ生成。
图1-2
图1由(a)至(m)一系列照片组成，显示使用衍生于SEMA5B的肽诱导的CTLs的干扰素(IFN)γ酶联免疫斑点(ELISPOT)试验的结果。在孔编号6#中使用SEMA5B-A24-9-470(SEQIDNO:13)(g)、3#中使用SEMA5B-A24-9-558(SEQIDNO:20)(h)、4#中使用SEMA5B-A24-10-354(SEQIDNO:40)(i)、6#中使用SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)(j)、5#中使用SEMA5B-A24-10-1044(SEQIDNO:47)(k)，以及4#中使用SEMA5B-A24-10-489(SEQIDNO:54)(l)诱导的CTLs与对照相比，分别显示出强的IFN-γ生成。这些图中孔上的方框提示来自于对应孔中的细胞扩张形成CTL系。相反的，作为典型的阴性数据，使用SEMA5B-A24-9-247(SEQIDNO:1)刺激的CTL没有观察到特异性的IFN-γ生成(m)。在这个图中，“+”表明针对使用适合的肽冲激的靶细胞的IFN-γ生成，“-”表明针对没有使用任何肽冲激的靶细胞的IFN-γ生成。
图2
图2由(a)至(d)一系列线状图组成，显示使用SEMA5B-A24-9-512(SEQIDNO:2)(a)、SEMA5B-A24-9-1010(SEQIDNO:3)(b)、SEMA5B-A24-9-293(SEQIDNO:10)(c)和SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)(d)刺激的CTLs系的IFN-γ生成。CTL生成的IFN-γ的量通过IFN-γ酶联免疫吸附试验(ELISA)测量。结果证明通过使用各种肽刺激建立的CTL系与对照相比，显示出强的IFN-γ生成。本图中，“+”表明针对使用适合的肽冲激的靶细胞的IFN-γ生成，“-”表明针对没有使用任何肽冲激的靶细胞的IFN-γ产生。
图3
图3由(a)至(c)一系列线状图组成，显示使用SEMA5B-A24-9-512SEMA5B-A24-9-512(SEQIDNO:2)(a)、SEMA5B-A24-9-1010(SEQIDNO:3)(b)、和SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)(c)刺激的CTLs系有限稀释建立的CTL克隆的IFN-γ生成。结果证明通过使用各种肽刺激建立的CTL系与对照相比，显示出强的IFN-γ生成。本图中，“+”表明针对使用适合的肽冲激的靶细胞的IFN-γ生成，“-”表明针对没有使用任何肽冲激的靶细胞的IFN-γ产生。
图4
图4是线状图，显示CTL克隆针对表达SEMA5B和HLA-A*2402的靶细胞的特异性CTL活性。转染HLA-A*2402或全长SEMA5B基因的COS7细胞制备作为对照。使用SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)建立的CTL系显示出针对转染了SEMA5B和HLA-A*2402(-菱形-)两者的COS7细胞的特异性CTL活性。另一方面，没有检测到针对表达HLA-A*2402(-三角形-)或SEMA5B(圆圈)的靶细胞的显著特异性CTL活性。
实施方案的描述
虽然与本文所描述的相似或等同的任意方法和材料可以用于实施或检验本发明的实施方案，现在所描述的是优选的方法、设备和材料。然而，在描述现在的材料和方法之前，应当理解这些描述都是说明性的而非为了限制。还应当理解本发明不限于本文所述的特定大小、形状、规模、材料、方法学、方案等，因为这些可以依照常规实验和优化而变化。此外，说明书中使用的术语仅是为了描述具体形式和实施例的目的，而非为了限制本发明的范围，其仅由所附的权利要求限制。在说明书中提到的每一篇出版物、专利或专利申请的公开内容通过提述，明确的将其整体并入本文。然而，本文中无一处可解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于这些公开文本。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。在冲突的情况下，以本发明书，包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的而非为了限制。
I.定义
除非另有说明，如本文中使用的，词语“一个”、“一种”和“所述”表示“至少一个/种”。
术语“分离的”和“纯化的”与物质(例如肽、抗体、多核苷酸等)相关使用时，表明该物质基本不含至少一种包括在天然来源中的物质。因此，分离的或纯化的肽指基本不含细胞材料例如碳水化合物、脂质或其它污染蛋白的肽，其来源于所述肽衍生于的细胞或组织来源，或当化学合成时，基本不含化学前体或其它化学物。
术语“基本不含细胞材料”包括多肽的制备物，其中所述多肽与分离出该多肽或重组产生该多肽的细胞的细胞组分分离。因此，基本不含细胞材料的多肽包括多肽的制备物，其具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的异源蛋白(本文也称为“污染蛋白”)。当所述肽通过重组产生时，其也优选基本不含培养基，包括培养基少于约20％、10％或5％多肽制备物体积的多肽制备物。当所述肽通过化学合成产生时，其优选基本不含化学前体或其它化学物，包括合成中涉及的化学前体或其它化学物少于约20％、10％或5％(以干重计)多肽制备物体积的多肽制备物。含有分离或纯化的肽的具体肽制备物可以通过，例如蛋白制备物的十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳和对凝胶进行考马斯亮蓝染色等处理后出现的单一条带来显示。在优选的实施方案中，本发明的肽和多核苷酸是分离的或纯化的。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可替换使用，指代氨基酸残基的多聚物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基可能是修饰的残基或非自然发生的残基的氨基酸多聚物，例如对应自然发生的氨基酸的人工化学模拟物，以及自然发生的氨基酸多聚物。
如本文中使用术语“寡肽”指代由20个氨基酸残基或更少，典型的15个氨基酸残基或更少所组成的肽。如本文中使用的，术语“九肽”指代由9个氨基酸残基组成的肽，术语“十肽”指代由10个氨基酸残基组成的肽。
如本文中使用的术语“氨基酸”指代自然发生或合成的氨基酸，以及具有与自然发生的氨基酸相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸。自然发生的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及在细胞中翻译后修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、γ-羟基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指代与自然发生的氨基酸具有相同的基本化学结构(α碳与氢、羧基、氨基和R基团结合)，但具有修饰的R集团或修饰的主链的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸、亚砜、甲硫氨酸甲基硫)。短语“氨基酸模拟物”指代具有与一般氨基酸不同的结构但相似功能的化合物。
氨基酸在本文中可以通过其公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指代。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在本文中可替换使用，除非另有特殊说明，通过其普遍接受的单字母代码来指代。
术语“试剂”和“组合物”在本文中可替换使用，指代包括特定量的特定成分的产品，以及从所述量的所述成分的直接或间接组合得到的任何产品。这些术语当与修饰语“药物”关联使用时(例如“药物试剂”和“药物组合物”)，意在涵盖包括活性成分和组成载体的惰性成分的产品，以及通过所述任意两种或更多成分的组合、复合或聚集，或通过一种或多种组分的分离，或通过一种或多种组分的其它类型的反应或相互作用直接或间接得到的产品。相应的，在本发明的语境中，术语“药物试剂”和“药物组合物”指代任何通过混合本发明的分子或化合物和药学或生理学上可接受的载体而制成的产品。
术语“活性成分”在本文中指代试剂或组合物中的生物学或生理学活性物质。具体的，在药物试剂或组合物的语境中，术语“活性成分”指代显示客观的药物学效果的物质成分。例如，在用于癌症治疗或预防的药物试剂或组合物的情况下，所述试剂或组合物中的活性成分可以直接或间接引起癌细胞和/或组织上的至少一种生物学或生理学作用。优选的，此类作用可以包括减少或抑制癌细胞生长、破坏或杀死癌细胞和/或组织，等等。典型的，活性成分的间接效果是诱导能够识别或杀死癌细胞的CTLs。在配制前，所述“活性成分”也可称为“原材料(bulk)”、“药物物质(drugsubstance)”或“技术产品(technicalproduct)”。
如本文中所使用的短语“药学可接受载体”或“生理学可接受载体”表示药学或生理学上可接受的材料、组合物、物质或媒介物，包括但不限于液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂以及封装材料。
本发明的一些药物试剂或组合物发现作为疫苗的特定用途。在本发明的上下文中，术语“疫苗”(也称为“免疫原性组合物”)指代当接种到动物中，具有改善、增强和/或诱导抗肿瘤免疫力的功能的试剂或组合物。
除非另有定义，术语“癌症”指代过表达SEMA5B基因的癌症或肿瘤，其例子包括但不限于，食管癌、NSCLC、RCC和SCLC。
除非另有定义，术语“细胞毒性T淋巴细胞”、“细胞毒性T细胞”和“CTL”在本文中可替换使用，并且除非另有明确说明，指代能够识别非自身细胞(例如肿瘤/癌细胞、病毒感染细胞)，并诱导此类细胞死亡的T淋巴细胞亚群。
除非另有定义，如本文所使用的术语“HLA-A24”指代亚型，其例子包括但不限于HLA-A*2401、HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2404、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2420、HLA-A*2425和HLA-A*2488。
除非另有定义，如本文所使用的术语“试剂盒”用于指代试剂和其它材料的组合。本文所考虑的是，试剂盒可以包括微阵列、芯片、标记物等。术语“试剂盒”不限于特定的试剂和/或材料的组合。
如本文所使用的，在受试者或患者的语境中，短语“受试者的(或患者的)HLA抗原为HLAA24”指代所述受试者或患者纯合地或杂合地拥有HLA-A24抗原基因，并且HLA-A24抗原在所述受试者或患者的细胞中作为HLA抗原表达。
在本发明的方法或组合物在癌症“治疗”的情况下发现实用的范围内，如果其导致临床上的益处，例如受试者中癌症大小、发生率或转移潜能的降低、存活时间的延长、术后复发或转移的抑制等等，则认为治疗是“有效的”。当预防性应用所述治疗时，“有效性”表示其延迟或阻止癌症的形成，或阻止或减缓癌症的临床症状。有效性结合用于诊断或治疗特定肿瘤类型的任意已知方法来确定。
在本发明的方法和组合物在癌症“预防”和“防范”的情况下发现实用的范围内，这些术语在本文中可替换使用，指代任何降低疾病死亡率或发病率负担的活动。“预防”和“防范”可以发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的形成，而二级和三级预防和防范水平包含目的为预防和防范疾病的进展和症状的出现，以及通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来减轻已建立疾病的负面影响的活动。或者，预防和防范可以包括目的为减轻具体病症的严重程度的广泛的预防疗法，例如降低肿瘤的增殖和转移。
在本发明的语境中，癌症的治疗和/或预防和/或其转移或术后复发的阻止包括任意导致下述事件的活动，例如癌细胞的手术切除，癌细胞生长的抑制，肿瘤的退化或消退，诱导癌症的缓解或抑制其发生，肿瘤退化，以及转移的降低或抑制，癌症术后复发的抑制，及存活时间的延长。癌症的有效治疗和/或预防降低患有癌症的个体的死亡率并改善其预后，降低血液中肿瘤标志物的水平，以及减轻伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构成有效的治疗和/或预防，包括10％、20％、30％或更多的降低，或稳定疾病。
在本发明的语境中，术语“抗体”指代免疫球蛋白及其片段，其特异性与指定的蛋白或其肽反应。抗体可以包括人抗体、灵长源化抗体，嵌合抗体，双特异性抗体、人源化抗体、与其它蛋白或放射性标记物融合的抗体、以及抗体片段。此外，本文中的抗体以最广泛的意义使用，特别的涵盖完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及只要其展现出期望的生物学活性的抗体片段。“抗体”指示所有类别(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义都与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的意义相同。
II.肽
下述详细描述的本发明的肽可以称为“SEMA5B肽”或“SEMA5B多肽”。
为了证明衍生于SEMA5B的肽作为被CTLs识别的抗原发挥功能，分析衍生于SEMA5B(SEQIDNO:75)的肽来确定其是否为HLA-A24的限制性抗原表位，HLA-A24是常见的HLA等位基因(DateY等，TissueAntigens47:93-101,1996；KondoA等，JImmunol155:4307-12,1995；KuboRT等，JImmunol152:3913-24,1994)。
基于其与HLA-A24的结合亲和力鉴定了衍生于SEMA5B的候选HLA-A24结合肽。鉴定了以下候选肽：SEQIDNOs:2至69。
在上述候选肽中，以下肽通过使用这些肽冲激(加载)的树突细胞(DCs)在对T细胞的体外刺激后，导致了CTLs的成功建立：
SEMA5B-A24-9-512(SEQIDNO:2)、SEMA5B-A24-9-1010(SEQIDNO:3)、SEMA5B-A24-9-196(SEQIDNO:4)、SEMA5B-A24-9-723(SEQIDNO:8)、SEMA5B-A24-9-280(SEQIDNO:9)、SEMA5B-A24-9-293(SEQIDNO:10)、SEMA5B-A24-9-470(SEQIDNO:13)、SEMA5B-A24-9-558(SEQIDNO:20)、SEMA5B-A24-10-354(SEQIDNO:40)、SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)、SEMA5B-A24-10-1044(SEQIDNO:47)、和SEMA5B-A24-10-489(SEQIDNO:54)。
上述纪录的CTLs显示出针对使用各自肽冲激的靶细胞的有效的特异性CTL活性。这些结果证明SEMA5B是被CTLs识别的抗原，并且上述肽是HLA-A24限制的SEMA5B表位肽；因此，这些肽可以作为CTLs细胞毒性的靶标抗原是有效的。
由于SEMA5B基因在癌细胞和组织中过表达，包括例如食管癌、NSCLC、RCC和SCLC，并且在大多数正常器官中不表达，其代表了用于免疫治疗的良好靶标。因此，本发明提供对应SEMA5B的CTL识别表位的九肽(由9个氨基酸残基构成的肽)和十肽(由10个氨基酸残基构成的肽)。或者，本发明提供能够诱导CTLs的分离的肽，其中所述肽由SEMA5B的免疫活性片段构成。在一些实施方案中，本发明提供包括选自SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列的肽，更优选的包括选自SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54的氨基酸序列的肽。在优选的实施方案中，本发明的所述肽是包括选自SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列，特别是选自SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54的氨基酸序列的九肽或十肽。本发明的肽的优选实施例包括由选自SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列构成的肽。
通常来说，软件程序目前是可获得的，例如在互联网上，例如描述于ParkerKC等，JImmunol1994,152(1):163-75和NielsenM等，ProteinSci2003；12:1007-17，可用于计算机模拟计算各种肽和HLA抗原之间的结合亲和力。与HLA抗原的结合亲和力可以测量如描述于，例如ParkerKC等，JImmunol1994,152(1):163-75,KuzushimaK等，Blood2001,98(6):1872-81,LarsenMV等，BMCBioinformatics.2007；8:424,BuusS等，TissueAntigens.,62:378-84,2003,NielsenM等，ProteinSci2003；12:1007-17和NielsenM等，PLoSONE2007；2:e796，其总结于例如LafuenteEM等，CurrentPharmaceuticalDesign,2009,15,3209-3220。确定结合亲和力的方法描述于例如JournalofImmunologicalMethods(1995,185:181-190)和ProteinScience(2000,9:1838-1846)。因此，本领域技术人员能够使用这些软件程序来选择具有与HLA抗原高结合亲和力的衍生于SEMA5B的片段。相应的，本发明包含由衍生于SEMA5B的任意片段构成的肽，其能够通过这些已知软件确定与HLA抗原的结合。此外，这些肽可以包括组成为全长SEMA5B序列的肽。
本发明的肽，特别是本发明的九肽和十肽，可以和附加的氨基酸残基侧翼相接，只要所得的肽保留了其CTL诱导能力。具体的附加氨基酸残基可以由任何种类的氨基酸构成，只要其不损害原始肽的CTL诱导能力。因此，本发明包含具有CTL诱导能力的肽，特别是衍生于SEMA5B的肽。这些肽，例如，少于约40个氨基酸，常常少于约20个氨基酸，通常少于约15个氨基酸。
通常已知肽中的一个、两个、几个或更多氨基酸的修饰不影响肽的功能，并且在一些情况下甚至增强原始肽的所需功能。事实上，修饰肽(例如由与原始参考序列相比，1个、2个或几个氨基酸残基被修饰(例如取代、增加、缺失和/或插入)的氨基酸序列构成的肽)已知保留原始肽的生物学活性(Mark等，ProcNatlAcadSciUSA1984,81:5662-6；Zoller和Smith,NucleicAcidsRes1982,10:6487-500；Dalbadie-McFarland等，ProcNatlAcadSciUSA1982,79:6409-13)。因此，在一个实施方案中，本发明的肽同时具有CTL诱导能力和选自SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列，其中一个、两个或者甚至更多的氨基酸被增加和/或取代。换句话说，本发明的肽同时具有CTL诱导能力以及选自SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列，优选的选自SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54的氨基酸序列中一个、两个或几个氨基酸被取代、缺失、插入和/或增加的氨基酸序列，如果所述修饰肽保留了原始肽的CTL诱导能力。
本领域的技术人员将认识到，改变单个氨基酸或全部氨基酸序列的很小比例的对氨基酸序列的个别修饰(例如缺失、插入、增加和/或取代)倾向于导致原始氨基酸侧链特性的保存。正因如此，其通常被称为“保守取代”或“保守修饰”，其中蛋白的改变产生与原始蛋白具有相似功能的蛋白。保守取代表提供功能类似的氨基酸，是本领域所公知的。氨基酸侧链特性需要保守的例子包括，例如疏水氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，亲水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，以及侧链具有以下共同的功能基团或特性：脂族侧链(G、A、V、L、I、P)；含有羟基基团的侧链(S、T、Y)；含有硫原子的侧链(C、M)；含有羧酸和氨基化合物的侧链(D、N、E、Q)；含有碱基的侧链(R、K、H)；以及含有芳香族的侧链(H、F、Y、W)。另外，以下8组每组包含本领域中所接受的彼此保守替换：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y),色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(见例如Creighton,Proteins1984)。
这些保守修饰的肽也认为是本发明的肽。然而，本发明的肽不限于此，还可以包括非保守修饰，只要所得的修饰肽保留了原始非修饰肽必备的CTL诱导能力。此外，所述修饰肽不应排除衍生于SEMA5B多态性变体、种间同源物以及等位基因的CTL可诱导肽。
氨基酸残基可以插入、取代和/或添加到本发明的肽中，或者，氨基酸残基可以从其中缺失，以达到更高的结合亲和力。为了保留必备的CTL诱导能力，本领域的技术人员优选地仅在少数(例如1个、2个或几个)或很小比例的氨基酸修饰(例如缺失、插入、添加和/或取代)。本文中，术语“几个”表示5个或更少的氨基酸，例如，4个或3个或更少。被修饰的氨基酸的百分比，例如30％或更少，优选20％或更少，更优选15％或更少，甚至更优选10％或更少，例如1至5％。
当在癌症免疫治疗的上下文中使用，本发明的肽可以和HLA抗原一起作为复合物被呈递到细胞或外来体的表面上。因此，优选的选择不仅诱导CTLs并且具有和HLA抗原高结合亲和力的肽。为了这个目的，所述肽可以通过氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或添加来修饰，以产生具有和HLA抗原改善的结合亲和力的修饰肽。除了自然展示的肽之外，由于通过结合HLA抗原展示的肽的序列的规律性是已经公知的(JImmunol1994,152:3913；Immunogenetics1995,41:178；JImmunol1994,155:4307)，基于此类规律的修饰可以被引入本发明的免疫原性肽中。
例如，具有高HLA-A24结合亲和力的肽倾向于具有被苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代的N端第二个氨基酸。同样的，其中C端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代的肽倾向于具有高HLA-24结合亲和力。相应的，可以期望使用苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代N端第二个氨基酸和/或使用苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代C端氨基酸来增加HLA-A24结合亲和力。因此，本发明包含具有选自SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列的肽，其中SEQIDNO的氨基酸序列的N端第二个氨基酸被苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代和/或SEQIDNO的氨基酸序列的C端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代。本发明也包含包括SEQIDNOs:2至69中一个、两个或几个氨基酸被取代、缺失、插入和/或增加的氨基酸序列的肽，这些肽具有以下特性(a)N端第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；以及(b)C端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。在优选的实施方案中，本发明的所属肽包括SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列中，N端第二个氨基酸被苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代，和/或C端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代的氨基酸序列。
取代不仅可以在末端氨基酸处引入，也可以在肽的潜在T细胞受体(TCR)识别位点的位置引入。几项研究已经证明，具有氨基酸取代的肽可能具有与原始肽等同或更好的功能，例如CAP1、p53(264-272)、Her-2/neu(369-377)或gp100(209-217)(Zaremba等，CancerRes.57,4570-4577,1997,T.K.Hoffmann等，JImmunol.(2002)；168(3):1338-47.,S.O.Dionne等，CancerImmunolimmunother.(2003)52:199-206以及S.O.Dionne等，CancerImmunology,Immunotherapy(2004)53,307-314)。
本发明也考虑1个、2个或几个氨基酸也可以被添加到本发明所述肽的N和/或C端。本发明也包括这些具有高HLA抗原结合亲和力，并保留了CTL诱导能力的这些修饰肽。
例如，本发明提供长度少于15、14、13、12、11或10个氨基酸的分离的肽，其具有CTL诱导能力，并包含选自下组的氨基酸序列：
(i)氨基酸序列，其在选自SEQIDNOs:2至39的氨基酸序列上修饰1个、2个或几个氨基酸；和
(ii)(i)的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有以下一个或两个特性：
(a)自所述SEQIDNOsN端的第二个氨基酸修饰为选自下组的氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，和
(b)所述SEQIDNOs的C端氨基酸修饰为选自下组的氨基酸：苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
本发明也提供长度少于15、14、13、12或11个氨基酸的分离肽，其具有CTL诱导能力，并包含选自下组的氨基酸序列：
(i')氨基酸序列，其在选自SEQIDNOs:40至69的氨基酸序列中修饰1个、2个或几个氨基酸；和
(ii')(i')的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有以下一个或两个特性：
(a)自所述SEQIDNOsN端的第二个氨基酸修饰为选自下组的氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，和
(b)所述SEQIDNOs的C端氨基酸修饰为选自下组的氨基酸：苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
当这些肽与APC接触，或被引入APC时，这些肽在APC中被处理，来呈递选自上述(i)至(ii)和(i')至(ii')的肽。
然而，当所述肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白的氨基酸序列的一部分相同时，可能引起负面影响例如自身免疫病患和/或针对特定物质的过敏症状。因此，可能需要首先使用可得的数据库进行同源性检索来避免所述肽的序列和另一个蛋白的氨基酸序列匹配的情况。当从同源检索中明确，没有与目标肽相比相同或仅有1个或2个氨基酸差异的自然发生的肽，所述目标肽可以被修饰来增加其与HLA抗原的结合亲和力和/或增加其CTL诱导能力，而没有此类副作用的任何危险。
虽然如上所述的具有与HLA抗原高结合亲和力的肽预期是高度有效的，但这些根据高结合亲和力的存在作为指标选择的候选肽，进一步检查CTL诱导能力的存在。本文中，短语“CTL诱导能力”表示当呈递到抗原呈递细胞(APC)上时，肽诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力。进一步，“CTL”诱导能力“包括肽诱导CTL活化、CTL增殖、促进CTL对靶细胞的溶解，以及增加CTL的IFN-γ生成的能力。
CTL诱导能力的确定通过诱导携带人MHC抗原的APCs(例如，B-淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞(DCs))，或更具体的来源于人外周血单核淋巴细胞的DCs，使用测试肽刺激APCs后，将所述APCs和CD8阳性T细胞混合来诱导CTLs，接着测量CTLs针对靶细胞生成并释放的IFN-γ。作为反应体系，可以使用通过表达人HLA抗原产生的转基因动物(例如，描述于BenMohamedL,KrishnanR,LongmateJ,AugeC,LowL,PrimusJ,DiamondDJ,HumImmunol2000,61(8):764-79,RelatedArticles,Books,LinkoutInductionofCTLresponsebyaminimalepitopevaccineinHLAA*0201/DR1transgenicmice:dependenceonHLAclassIIrestrictedT(H)response)。或者，所述靶细胞可以使用51Cr等放射性标记，CTLs的细胞毒性活性可以通过从靶细胞释放的放射性来计算。或者，可以通过测量在携带固定的肽的细胞存在时，CTLs生成和释放的IFN-γ，接着使用抗IFN-γ单克隆抗体显现介质上的抑制区来评估CTL诱导能力。
作为检查上述肽CTL诱导能力的结果，发现选自具有SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54所示氨基酸序列的肽的九肽和十肽显示出特别高的CTL诱导能力以及和HLA抗原的高结合亲和力。因此，这些肽作为本发明的优选实施方案示例。
此外，同源分析结果证明，这些肽和衍生于任何其它已知人基因产物的肽不具有显著同源性。这降低了当用于免疫治疗时，未知的或不希望的免疫应答的可能性。因此，也从这个方面，这些肽对于在癌症患者中引出针对SEMA5B的免疫力是有用的。因此，本发明优先包含具有选自SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54的氨基酸序列的肽。
除了上述的修饰之外，本发明的肽也可以与其它的肽相连，只要得到的连接肽保留了原始肽必备的CTL诱导能力，并且更优选的，也保留了其必备的HLA结合能力。适合的“其它”肽的例子包括：本发明的肽或衍生于其它TAAs的CTL-可诱导肽。本发明的所述肽可以直接或通过连接肽间接与一个或多个“其它”肽相连。肽之间的连接肽是本领域所熟知的，包括，例如AAY(P.M.Daftarianetal.,JTransMed2007,5:26)、AAA、NKRK(SEQIDNO:81)(R.P.M.Sutmuller等，JImmunol.2000,165:7308-7315)或K(S.Otaetal.,CanRes.62,1471-1476,K.S.Kawamura等，JImmunol.2002,168:5709-5715)。
例如，衍生于非SEMA5B肿瘤相关抗原的肽可以序贯或同时施用来增强通过HLAI类和/或HLAII类的免疫应答。癌症细胞可以表达多于一种肿瘤相关抗原是本领域所熟知的。因此，对于本领域的普通技术人员，确定具体的受试者是否表达另外的肿瘤相关基因，并接着将衍生于此类基因的表达产物的HLAI类或HLAII类结合肽包括在本发明的SEMA5B组合物或疫苗中属于常规实验的范围。
HLAI类和HLAII类结合肽的例子对于本领域的普通技术人员是已知的(例如，见Coulie,StemCells13:393-403,1995)，并可以如本文所公开的类似的方式和本发明相关使用。本领域的普通技术人员使用常规的分子生物学方法能够制备包括一种或多种SEMA5B肽和一种或多种非SEMA5B肽的多肽，或编码此类多肽的多核苷酸。
上述连接的肽在本文中称为“多胞形(polytopes)”，例如两种或更多潜在免疫原性或免疫应答刺激肽其可以以各种排列连接到一起(例如级联、重叠)的组。所述多胞形(或编码所述多胞形的核酸)可以依照标准的免疫方案施用到例如动物，来测试所述多胞形在刺激、提高和/或唤起免疫应答中的效力。
所述肽可以直接连接到一起，或通过使用侧翼序列来形成多胞形，多胞形作为疫苗使用是本领域公知的(见例如Thomson等，Proc.Natl.Acad.SciUSA92(13):5845-5849,1995；Gilbert等，NatureBiotechnol.15(12):1280-1284,1997；Thomson等，JImmunol.157(2):822-826,1996；Tarn等，JExp.Med.171(l):299-306,1990)。含有不同数量和表位组合的多胞形可以制备并测试被CTLs识别和增强免疫应答的效力。
本发明的肽也可以和其它物质相连，只要所得的连接肽保留了原始肽必备的CTL诱导能力。适合的物质的例子包括，例如：肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然和合成的多聚体等。所述肽可以含有修饰例如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，如果所述修饰不破坏原始肽的生物学活性。可以进行这些种类的修饰来赋予另外的功能(例如靶向功能和递送功能)或稳定所述肽。
例如，为了增加肽的体内稳定性，引入D-氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸是本领域已知的。该定义也可以适用于本发明的肽。肽的稳定性可以以一些方法来测定。例如，肽酶和各种生物媒介，比如人血浆和血清，可以用于测试稳定性(见例如Verhoef等，EurJDrugMetabPharmacokin1986,11:291-302)。
而且，如上所述，可以筛选或选择在其中取代、缺失、插入和/或添加1个、2个或几个氨基酸的所述修饰肽中，与原始肽相比，具有相同或更高活性的肽。因此本发明也提供筛选或选择与原始肽相比，具有相同或更高活性的修饰肽的方法。说明性的方法包括以下步骤：
a：本发明的肽修饰(例如取代、缺失、插入和/或添加)至少一个氨基酸残基，
b：确定步骤a中修饰的肽的活性，和
c：选择与原始肽相比，具有相同或更高活性的肽。
在优选的实施方案中，本发明提供用于筛选具有诱导CTL的能力的肽的方法，所述CTL针对呈递衍生于SEMA5B片段的细胞具有特异性细胞毒性，其中所述方法包含下述步骤：
(i)提供候选序列，其由原始氨基酸序列通过取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或几个氨基酸残基修饰的氨基酸序列组成，其中所述原始氨基酸序列选自下组：SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54；
(ii)选择除SEMA5B外与衍生于任何已知人基因产物的肽不具有实质性显著同源性的候选序列；
(iii)将组成为步骤(ii)中选择的候选序列的肽与抗原呈递细胞接触；
(iv)将步骤(iii)的抗原呈递细胞与CD8阳性T细胞接触；以及
(v)鉴定其CTL诱导能力与组成为原始氨基酸序列的肽相同或更高的肽，或鉴定具有与组成为原始氨基酸序列的肽相同或更高CTL诱导能力的肽。
本文中，待测定的活性包括MHC结合活性，APC或CTL诱导能力和细胞毒性活性。优选的，肽的所述活性是CTL诱导能力。
III.SEMA5B肽的制备
本发明的肽可以使用公知的技术制备。例如，所述肽可以使用重组DNA技术或化学合成来合成制备。本发明的肽可以单独制备，或制备为包括两个或更多肽的较长多肽。所述肽然后可以分离即纯化或分离，以致基本不含其他自然发生的宿主细胞蛋白及其片段，或任何其它化学物质。
本发明的肽可以含有修饰，例如糖基化、侧链氧化，或磷酸化，如果所述修饰不破坏原始肽的生物学活性。其它说明性的修饰包括整合D-氨基酸或其它可用的氨基酸模拟物，例如，来增加所述肽的血清半衰期。
本发明的肽可以基于所选择的氨基酸序列，通过化学合成得到。例如，可适用于合成的常规肽合成方法包括：
(i)PeptideSynthesis,Interscience,NewYork,1966；
(ii)TheProteins,Vol.2,AcademicPress,NewYork,1976；
(iii)PeptideSynthesis(日文),MaruzenCo.,1975；
(iv)BasicsandExperimentofPeptideSynthesis(日文),MaruzenCo.,1985；
(v)DevelopmentofPharmaceuticals(第二卷)(日文),Vol.14(肽合成),Hirokawa,1991；
(vi)WO99/67288；和
(vii)BaranyG.&MerrifieldR.B.,PeptidesVol.2,"SolidPhasePeptideSynthesis",AcademicPress,NewYork,1980,100-118。
或者，本发明的肽可以采取任何已知的用于肽生产的遗传工程方法获得(例如MorrisonJ,JBacteriology1977,132:349-51；Clark-Curtiss&Curtiss,MethodsinEnzymology(eds.Wu等，)1983,101:347-62)。例如，首先，制备携带编码所述目标肽，处于可表达形式(例如，位于对应启动子序列的调节序列下游)的多核苷酸的适合载体，并转化到适合的宿主细胞中。本发明也提供此类载体和宿主细胞。然后培养所述宿主细胞来产生感兴趣的肽。所述肽也可以采用体外翻译系统在体外生成。
IV.多核苷酸
本发明也提供编码任意本发明前面提及的肽的多核苷酸。这些包括衍生于自然发生的SEMA5B基因的多核苷酸(GenBankAccessionNo.NM_001031702、NM_001256346、NM_001256347或NM_001256348(SEQIDNO:74、76、77或79))，以及其具有保守修饰的核苷酸序列。本文中，短语“保守修饰的核苷酸序列”指代编码相同或基本相同氨基酸序列的序列。由于遗传密码子的简并，大量功能上相同的核酸编码任意所给的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个被密码子确定为丙氨酸的位置，所述密码子可以被替换为任意所述的相应密码子，而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其为一种保守的修饰变异。本发明的每种编码肽的核酸序列也描述所述核酸的每种可能的沉默变异。本领域的普通技术人员将认识到核酸中的每一个密码子(除了AUG，其通常为甲硫氨酸的仅有密码子，以及TGG，其通常为色氨酸的仅有密码子)可以修饰来产生功能上相同的分子。相应的，编码肽的核酸的每一种沉默变异隐含记载在每个公开的序列中。
本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA及其衍生物构成。如本领域所公知的，DNA适合的由碱基构成，例如A、T、C和G，而在RNA中T被U替换。本领域的技术人员将认识到非自然发生的碱基对也可以包括在多核苷酸中。
本发明的多核苷酸可以编码本发明的多种肽，带有或不带有居间(intervening)氨基酸序列。例如，所述居间氨基酸序列可以提供所述多核苷酸或翻译的肽的剪切位点(例如酶识别序列)。此外，本发明的多核苷酸可以包括除了编码本发明的肽的编码序列外任意的额外序列。例如，本发明的多核苷酸可以是重组的多核苷酸，其包括所述肽表达所需的调节序列，或可以是带有标记基因等的表达载体(质粒)。总之，此类重组多核苷酸可以通过常规重组技术使用，例如聚合酶和内切酶对核苷酸的操作来制备。
重组和化学合成技术都可以用于生产本发明的多核苷酸。例如，本发明的多核苷酸可以通过在适合的载体中插入来生成，所述载体当转染到感受态细胞中时能够表达。或者，本发明的多核苷酸可以使用PCR技术扩增，或表达在适合的宿主中(见，例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1989)。或者，本发明的多核苷酸可以使用固相技术合成，如描述于BeaucageSL&IyerRP,Tetrahedron1992,48:2223-311；Matthes等，EMBOJ1984,3:801-5。
V.外来体
本发明进一步提供细胞内囊泡，称为外来体，在其表面上呈递本发明的肽和HLA抗原之间形成的复合物。外来体可以制备，例如使用详述于日本专利申请JPH11-510507和WO99/03499的方法，并可以使用从受治疗和/或预防的患者中得到的APCs制备。本发明的外来体可以以与本发明的肽相似的方式作为疫苗接种。
在所述复合物中包括的HLA抗原类型必须与需要治疗和/或预防的受试者匹配。例如，在日本人群中，HLA-A24特别是HLA-A*2402，是普遍的，因此适合用于日本患者的治疗。使用在日本人和高加索人中高表达的HLA-A24类型有利于获得有效的结果，并且亚类例如HLA-A*2402也有应用。典型的，在临床上，需要治疗的患者的HLA抗原类型提前调查，这使得能够适当的选择具有和特定抗原高水平结合亲和力，或通过抗原呈递具有高CTL诱导能力的肽。此外，为了获得同时具有高结合亲和力和CTL诱导能力的肽，可以在自然发生的SEMA5B部分肽的基础上，进行1个、2个或几个氨基酸的取代、插入、缺失和/或增加。
当使用HLA抗原的HLA-A24种类用于本发明的外来体时，具有选自SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54的氨基酸序列的肽具有特定的用途。
在一些实施方案中，本发明的外来体在其表面上呈递本发明的肽和HLA-A24抗原的复合物。
VI.抗原呈递细胞(APC)
本发明也提供分离的抗原呈递细胞(APCs)，其在表面上呈递本发明的肽和HLA抗原之间形成的复合物。所述APCs可以来自于受治疗和/或预防的患者，并可以作为疫苗单独施用或与包括本发明的肽、外来体或CTLs的其它药物联合。
所述APCs并不受限于特定种类的细胞，并包括树突细胞(DCs)、朗格汉斯细胞(Langerhanscells)、巨噬细胞、B细胞以及活化的T细胞，其已知在细胞表面呈递蛋白抗原，以便被淋巴细胞识别。由于DCs是代表性的APCs，在APCs中具有最强的CTL诱导行为，因此DCs适合作为本发明的APCs。
例如，本发明的APCs可以通过从外周血单核细胞诱导DCs来获得，接着使其在体外、离体或体内接触(刺激)本发明的肽。当本发明的肽被施用到受试者中，在所述受试者的身体中，呈递本发明的肽的APCs被诱导。因此，本发明的APCs可以通过将本发明的肽施用于受试者后，从所述受试者中收集APCs来获得。或者，本发明的APCs可以通过使收集于受试者的APCs接触本发明的肽来获得。
本发明的APCs可以单独或与包括本发明的肽、外来体或CTLs的其它药物联合施用于受试者，用于在受试者中诱导针对癌症的免疫应答。例如，所述离体施用可以包括以下步骤：
a.从第一个受试者收集APCs，
b.使步骤a的APCs接触本发明的肽，和
c.将步骤b的APCs施用于第二个受试者。
所述第一个受试者和第二个受试者可以是同一个个体，或不同个体。通过步骤b获得的APCs可以作为疫苗配制和施用，用于癌症的治疗和/或预防，比如食管癌、NSCLC、RCC和SCLC，但不限于这些。
在本发明的上下文中，人们可以使用本发明的肽用于制造能够诱导抗原呈递细胞的药物组合物。本发明还提供制造用于诱导抗原呈递细胞的药物组合物的方法或步骤，其中所述方法包括将本发明的肽和药学上可接受的载体混合或配制的步骤。
本发明也提供本发明的肽用于诱导抗原呈递细胞的用途。
根据本发明的一个方面，本发明的APCs具有CTL诱导能力。在APCs的语境中，短语“CTL”诱导能力”指代当与CD8阳性T细胞接触时，APC诱导CTL的能力。进一步的，“CTL诱导能力”包括APC诱导CTL活化、CTL增殖、促进CTL对靶细胞的溶解，以及增加CTL的IFN-γ生成的能力。此类具有CTL诱导能力的APCs可以通过包括在体外将编码本发明的肽的多核苷酸转化到APCs中的步骤的方法，以及上述的方法制备。所述引入的基因可以是DNA或RNA的形式。没有具体的限制，引入方法的例子包括各种通常在本领域实施的方法，例如可以使用脂转染、电穿孔以及磷酸钙方法。更具体的，可以如描述于CancerRes1996,56:5672-7；JImmunol1998,161:5607-13；JExpMed1996,184:465-72；国际公开号No.2000-509281的公开日语翻译中的方法实施。通过将所述基因转移到APCs中，该基因在细胞中经历转录、翻译等，接着得到的蛋白被MHCI类或II类加工，并经过呈递途径来呈递部分肽。或者，本发明的APCs可以通过包括简单的使APCs接触本发明的肽的步骤的方法制备。
在一些实施方案中，本发明的APCs在其表面上呈递本发明的肽和HLA-A24抗原的复合物。
VII.细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)
针对任何本发明的肽诱导的CTL加强体内靶向肿瘤细胞的免疫应答，因此可以类似于所述肽本身的方式用作疫苗。因此，本发明提供分离的CTLs，其通过本发明的任意一个肽特异性诱导或活化。
此类CTLs可以通过(1)将本发明的肽施用于受试者，(2)将衍生于受试者的APCs接触(刺激)CD8阳性T细胞，或使本发明的肽接触外周血单核淋巴细胞，(3)使CD8阳性T细胞或外周血单核淋巴细胞在体外接触在其表面上呈递HLA抗原和所述肽的复合物的APCs或外来体或(4)向CD8阳性T细胞中引入编码两种T细胞受体(TCR)亚基的多核苷酸，或编码每种TCR亚基的多核苷酸来获得，其中通过这些亚基形成的TCR能够结合细胞表面的本发明的肽和HLA抗原的复合物。此类APCs或外来提可以通过上述的方法制备。(4)的方法细节描述于以下的小节“VIII.T细胞受体(TCR)”中。
本发明的CTLs可以来自于受治疗和/或预防的患者，并能够独自或与包括本发明的肽、APCs或外来体的其它药物联合施用，用于调节作用的目的。得到的CTLs特异性的针对呈递本发明的肽的靶细胞行动，例如，用于诱导的相同的肽。所述靶细胞可以是内源性表达SEMA5B的细胞，比如癌细胞，或使用SEMA5B基因转染的细胞；由于所述肽刺激，在细胞表面上呈递本发明的肽的细胞也可以作为活化CTL攻击的靶标。
在一些实施方案中，本发明的CTLs识别呈递HLA-A24抗原和本发明的肽的复合物的细胞。在CTL的语境中，短语“识别细胞”指代通过其TCR结合细胞表面的HLA-A24抗原和本发明的肽的复合物，并表现出针对所述细胞的特异性细胞毒性活性。本文中，“特异性细胞毒性活性”指代针对呈递HLA-A24抗原和本发明的肽的复合物的细胞而非其它细胞表现出的细胞毒性活性。相应的，本发明包括CTLs，其表现出针对呈递本发明的肽的细胞的特异性细胞毒性活性。
VIII.T细胞受体(TCR)
本发明也提供组合物，其包括一种或多种编码两种TCR亚基的多核苷酸，或编码每种TCR亚基的多核苷酸，其中通过这些亚基形成的TCR能够结合细胞表面的HLA抗原和本发明的肽的复合物。也考虑使用所述组合物的方法。此类TCR亚基具有形成TCRs的能力，其赋予T细胞针对表达SEMA5B的肿瘤细胞的特异性。通过使用本领域已知的方法，可以鉴定编码使用本发明的一种或更多的肽诱导的CTL的TCR亚基alpha-和beta-链的多核苷酸(WO2007/032255andMorgan等，JImmunol,171,3288(2003))。例如，优选PCR方法分析所述TCR。用于分析的PCR引物可以是，例如，5’-R引物(5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3')作为5’端引物(SEQIDNO:70)以及TCR的alpha链C区(SEQIDNO:71)的特异性3-TRa-C引物(5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3')，TCR的beta链C1区(SEQIDNO:72)的特异性3-TRa-C引物(5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3')或TCR的beta链C2区(SEQIDNO:73)的特异性3-TRbeta-C2引物(5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3')作为3’端引物，但不限于此。衍生的TCR能够以高亲和力结合呈递本发明的肽的靶细胞，并且可选的，在体内和体外介导呈递本发明的肽的靶细胞的高效杀死。
编码两种TCR亚基的多核苷酸或编码各种TCR亚基的多核苷酸可以整合到适合的载体中，例如逆转录病毒载体。这些载体在本领域是公知的。所述多核苷酸或包括所述多核苷酸的载体可以被有用的转移到T细胞中(例如CD8阳性T细胞)，例如，来自于患者的T细胞。有利的，本发明提供现成的组合物，允许患者自身T细胞(或另一个哺乳动物的)的快速修饰，来快速和方便的产生具有极好的癌细胞杀伤特性的修饰T细胞。
当所述TCR呈递在T细胞表面时，针对本发明的肽的特异性TCRs应该能够特异性的识别本发明的肽和HLA分子的复合物，给予T细胞针对呈递本发明的肽和HLA抗原的靶细胞的特异性活性。对上述复合物的特异性识别可以通过任意已知方法确认，其优选的实施例包括使用HLA分子和本发明的肽的HLA多聚体染色分析，以及ELISPOT试验。通过进行ELISPOR试验，可以确定在细胞表面表达TCR的T细胞通过TCR识别细胞，并且该信号在细胞内传递。当所述复合物存在于T细胞表面时，对上述复合物能够给予T细胞细胞毒性活性的确定也可以通过已知方法实行。优选的方法包括，例如，明确针对HLA阳性靶细胞的细胞毒性活性，比如铬释放试验。
本发明也提供通过转导所述编码两种TCR亚基的多核苷酸或编码每个TCR亚基的多核苷酸制备的CTLs，其中通过这些TCR亚基形成的TCR在HLA-A24的情况下，能够结合SEMA5B肽，例如SEQIDNOs:2至69。
所述转导的CTLs能够在体内归巢至癌细胞，并且能够通过公知的培养方法在体外扩张(例如Kawakamietal.,JImmunol.,142,3452-3461(1989))。本发明的CTLs可以用于形成免疫原性组合物，在需要治疗或保护的患者中有用于癌症的治疗和预防之一或两者(见WO2006/031221，其内容通过引用并入本文)。
IX.药物组合物
由于与正常组织相比，SEMA5B的表达在癌症中特异性升高，其例子包括但不必限于食管癌、NSCLC、RCC和SCLC，本发明的肽或多核苷酸可以用于诱导针对癌症或肿瘤细胞的免疫应答，并因此作为治疗和/或预防癌症或原发癌，和/或阻止其转移或术后复发。因此，本发明提供药物组合物或试剂，其配制用于癌症的治疗和/或预防，和/或阻止其转移或术后复发，此类组合物或试剂包括至少一种本发明的肽或多核苷酸作为活性成分。或者，本发明的肽可以表达于任意前述的外来体或细胞的表面，比如APCs，其用作药物组合物或试剂。另外，前面提及的靶向任意一种本发明的肽的CTLs也可以作为本发明的药物组合物或试剂的活性成分使用。
相应的，本发明提供试剂或组合物，其包括至少一种选自以下项的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)如本文所公开的以可表达形式编码此类肽的多核苷酸；
(c)本发明的APC或外来体；和
(d)本发明的CTL。
本发明的药物组合物或试剂也作为疫苗应用。在本发明的上下文中，短语“疫苗”(也称为“免疫原性组合物”)指代试剂或组合物，当接种到动物中其具有改善、提高和/或诱导抗肿瘤免疫力的功能。换句话说，本发明提供用于在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的药物试剂或组合物。
本发明的药物组合物或试剂可以用于在受试者或患者中治疗和/或预防癌症，和/或阻止其转移或术后复发，所述受试者或患者包括人类以及任意其他哺乳动物，包括但不限于，小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、绵羊、山羊、猪、牛、马、猴、狒狒以及黑猩猩，尤其是在经济上重要的动物或家养动物。在一些实施方案中，本发明的药物试剂或组合物可以配制用于施用到HLA抗原为HLA-A24的受试者中。
在另一个实施方案中，本发明还提供活性成分在制造用于治疗和/或预防癌症或肿瘤，和/或抑制其转移或术后复发的药物组合物或试剂中的用途，所述活性成分选自以下项：
(a)本发明的肽；
(b)如本文所公开的以可表达形式编码此类肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC或外来体；和
(d)本发明的CTL。
或者，本发明进一步提供活性成分在治疗和/或预防癌症或肿瘤，和/或抑制其转移或术后复发中的用途，所述活性成分选自以下项：
(a)本发明的肽；
(b)如本文所公开的以可表达形式编码此类肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC或外来体；和
(d)本发明的CTL。
或者，本发明进一步提供用于制造药物组合物或试剂的方法或工艺，所述药物组合物或试剂配制用于癌症或肿瘤的治疗和/或预防，和/或抑制其转移或术后复发，其中所述方法或工艺包括配制药学上或生理学上可接受的载体和选自以下项的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)如本文所公开的以可表达形式编码此类肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC或外来体；和
(d)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明还提供用于制造药物组合物或试剂的方法或工艺，所述药物组合物或试剂配制用于癌症或肿瘤的治疗和/或预防，和/或抑制其转移或术后复发，其中所述方法或工艺包括将活性成分和药学上或生理学上可接受的载体混合的步骤，其中所述活性成分选自以下项：
(a)本发明的肽；
(b)如本文所公开的以可表达形式编码此类肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC或外来体；和
(d)本发明的CTLT细胞。
在另一个实施方案中，本发明还提供用于制造药物组合物或试剂的方法或工艺，所述药物组合物或试剂配制用于癌症或肿瘤的治疗和/或预防，和/或抑制其转移或术后复发，其中所述方法包含将至少一种选自以下项的活性成分施用到受试者的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)如本文所公开的以可表达形式编码此类肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC或外来体；和
(d)本发明的CTL。
根据本发明，具有选自SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列的肽表现为HLA-A24限制性表位肽，或因此作为能够在受试者中诱导有效的且特异性针对表达HLA-A24和SEMA5B的癌症的免疫应答的候选物。因此，包括任意具有选自SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列的肽的药物组合物或试剂特别适用于HLA抗原为HLA-A24的受试者。此类试剂或组合物中所述肽的量可以是在带有表达SEMA5B的癌症的受试者中，在显著诱导有效的且特异性的免疫应答中有效的量。
同样的也应用于包含编码任意这些肽的多核苷酸的药物组合物或试剂(例如本发明的多核苷酸)。
使用本发明的药物组合物或试剂待治疗和/或预防的癌症不限于并包括SEMA5B参与其中的所有种类的癌症，例子包括但不限于，食管癌、NSCLC、RCC和SCLC。
本发明的药物组合物或试剂除了前面提及的活性成分外，可以包括其它具有诱导针对癌细胞的CTLs的能力的肽，编码所述其它肽的其它多核苷酸，呈递所述其它肽的其它细胞等等。此类具有诱导针对癌细胞的CTLs的能力的“其它”肽包括但不限于衍生于癌症特异性抗原的肽(例如，已鉴定的TAAs)。
如果必要，本发明的药物组合物或试剂可选的包括其他治疗物质作为另外的活性成分，只要所述物质不抑制本发明活性成分的抗肿瘤效果，例如本发明的任意肽、多核苷酸、外来体、APC、CTL。例如，配方可以包括抗炎症物质、止疼药、化疗药物等等。除了药物本身包括其它治疗物质之外，本发明的药物也可以与一种或多种其它药物组合物序贯或同时施用。药物和药学组合物的量依赖于，例如所使用的药物组合物的类型、被治疗的疾病，以及施用的日程安排和途径。
本领域的技术人员将认识到，除了本文具体提及的成分，本发明的药物组合物或试剂可以根据所考虑制剂的类型包括本领域常规的其它物质。
在本发明的一个实施方案中，本发明的药物组合物或药剂可以包装在制品和试剂盒中，其含有有用于治疗需要治疗的疾病的病理环境的材料，例如癌症。所述制品可以包括本发明的任意药物组合物或药物的带有标签的容器。适合的容器包括瓶子、小瓶和试管。所述容器可以由多种材料形成，比如玻璃或塑料。所述容器的标签应该表明所述组合物或试剂用于治疗治疗或预防所述疾病的一种或多种病症。所述标签还可以表明关于施用的指导等。
除了上述的容器外，包括本发明的药物组合物或药剂的试剂盒可选的进一步包括第二个容器，储藏药学上可接受的稀释剂。其可以进一步包括从商业或使用者立场所需的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器以及带有使用说明的说明书。
本发明的药物组合物或试剂如果需要，可以在包装或分配器设备封装，其含有包含所述活性成分的一种或多种单位剂型。所述包装可以，例如，包括金属或塑料箔，比如罩板包装。所述包装或分配器设备可以附有施用说明书。
(1)含有所述肽作为活性成分的药学组合物：
本发明的肽可以作为药物组合物或药剂直接施用，或如有需要，通过常规配制方法配制。在后一种情况下，除了本发明的肽外，载体、赋形剂以及此类通常用于药物的物质可以作为适当的没有特别限制的包括在内。这些载体的例子包括但不限于无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液等。此外，本发明的药物组合物或药剂如果需要可以含有稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂等。本发明的药物组合物或药剂可以用于抗癌症的目的。
本发明的肽可以联合制备以在体内诱导CTLs，其包括两种或更多本发明的肽。所述肽可以是鸡尾酒或使用标准技术彼此缀合。例如，所述肽可以化学相连或作为单个的融合多肽表达。所述联合的肽可以是相同或不同的。通过施用本发明的肽，所述肽以高密度被HLA抗原呈递在APCs上，接着对展示的肽和HLA抗原之间所形成的复合物特异性反应的CTLs被诱导。或者，APCs(例如DCs)可以从受试者中移出，接着使用本发明的肽刺激以得到在其细胞表面呈递本发明的任意肽的APCs。这些APCs可以被再施用到所述受试者以诱导受试者中的CTLs，结果，对肿瘤相关内皮的攻击性可以被增强。
用于癌症的治疗和/或预防的所述药物组合物或试剂，其包括本发明的任意肽作为活性成分，还可以包括佐剂，使得细胞免疫将有效建立。或者，本发明的药物组合物或药剂可以与其它活性成分一起施用，或能够通过配制成颗粒施用。佐剂指代当与具有免疫原性的蛋白同时施用(或相继)时提高针对该蛋白的免疫应答的任意化合物、物质或组合物。本文考虑的佐剂包括描述于文献的那些(ClinMicrobiolRev1994,7:277-89)。适合的佐剂的例子包括但不限于，磷酸铝、氢氧化铝、明矾、霍乱毒素、沙门氏菌毒素、IFA(不完全弗氏佐剂)、CFA(完全弗氏佐剂)、ISCOMatrix、GM-CSF、O/W乳剂等等。
此外，可以方便的使用其中所述肽结合几微米直径的珠子的脂质体制剂、颗粒制剂，以及其中脂质结合所述肽的制剂。
在另一个实施方案中，本发明的肽也可以以药学上可接受的盐的形式施用。优选的盐的例子包括但不限于，带有碱金属的盐、带有金属的盐、带有有机碱基的盐、带有氨基的盐、带有有机酸的盐(例如乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸等)以及带有无机酸的盐(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸、硝酸等)。如本文所使用的，短语“药学上可接受的盐”指代保留了所述化合物的生物学有效性和特性的盐，其通过与有无机或有机酸或碱基反应获得，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物或药剂可以进一步包括使CTL接触抗原的组分。脂质已经被鉴定为能够在体内使CTL接触病毒抗原的组合物。例如，棕榈酸残基可以连接到赖氨酸残基的epsilon-和alpha-氨基基团，接着连接到本发明的肽。所述脂化的肽接着可以以整合到脂质体中的胶束或粒子直接施用，或乳化到佐剂中。如其他脂质的例子，大肠杆菌(E.coli)脂蛋白，比如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)当共价结合适合的肽时，可以用于使CTL接触抗原(见例如Deres等，Nature1989,342:561-4)。
适合的使用方法的例子包括但不必限于，口服、皮内、皮下、肌肉内、骨内、腹腔、以及静脉内注射，或者等，以及系统施用或局部施用于靶位点的附近(例如直接注射)。所述施用可以通过单次施用进行，或通过多次施用增强。所述肽的药学上或治疗上的有效量可以施用于需要治疗表达SEMA5B的癌症的受试者。或者，本发明的肽的足以诱导针对表达SEMA5B的肿瘤或癌症的CTLs的量可以施用于携带表达SEMA5B的癌症的受试者。本发明的肽的剂量可以根据所治疗的疾病、患者的年龄、体重、施用方法等等适当调整，通常为0.001mg至1000mg，例如0.01mg至100mg，例如0.1mg至10mg，例如0.5mg至5mg，并可以几天到几个月施用一次，例如每周一次。本领域的技术人员可以容易的确定适合的和最佳剂量。
(2)含有多核苷酸作为活性成分的药物组合物：
本发明的药物组合物或药剂也可以含有以可表达形式编码本发明公开的肽的核酸。本文中，短语“以可表达形式”表示所述核酸当引入细胞中时，将在体内表达诱导抗肿瘤免疫的多肽。在说明性的实施方案中，所述感兴趣的多核苷酸的核酸序列包括对于多核苷酸表达必须的调节元件。所述多核苷酸可以装备以达到稳定的插入靶细胞的基因组中(对于同源重组盒载体的描述见例如ThomasKR&CapecchiMR,Cell1987,51:503-12)。见例如Wolff等，Science1990,247:1465-8；美国专利号5,580,859、5,589,466、5,804,566、5,739,118、5,736,524、5,679,647、以及WO98/04720。基于DNA的递送技术的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、多聚物、肽介导的)递送、阳离子脂质复合物、以及颗粒介导(“基因枪”)或压力介导的递送(见例如美国专利号5,922,687)。
本发明的肽也可以通过病毒或细菌载体表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，比如牛痘或禽痘。此类方法涉及牛痘病毒的使用，例如作为载体来表达编码所述肽的核苷酸序列。当引入宿主中，所述重组牛痘病毒表达所述免疫原性的肽，并因此引起免疫应答。在免疫方案中有用的牛痘载体和方法描述于例如美国专利号4,722,848。另一个载体是BCG(卡介苗)。BCG载体描述于Stover等，Nature1991,351:456-60。对于治疗施用或免疫有用的各种其它载体例如腺病毒或腺病毒相关病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌载体、脱毒的炭疽毒素载体等等，将是显而易见的。见例如Shata等，MolMedToday2000,6:66-71；Shedlock等，JLeukocBiol2000,68:793-806；Hipp等，InVivo2000,14:571-85。
多核苷酸向患者的递送可以是直接的，在此类情况下所述患者直接暴露于携带多核苷酸的载体，或间接地，在此类情况下细胞首先使用感兴趣的多核苷酸体外转化，接着所述细胞移植到所述患者中。这两种方法分别作为体内和离体基因治疗所已知。
对于基因治疗的一般综述，见Goldspiel等，ClinicalPharmacy1993,12:488-505；Wu和Wu,Biotherapy1991,3:87-95；Tolstoshev,AnnRevPharmacolToxicol1993,33:573-96；Mulligan,Science1993,260:926-32；Morgan&Anderson,AnnRevBiochem1993,62:191-217；TrendsinBiotechnology1993,11(5):155-215。应用于本发明的本领域公知的重组DNA技术的方法描述于Ausubel等，inCurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons,NY,1993)；和KriegerinGeneTransferandExpression,ALaboratoryManual(StocktonPress,NY,1990)。
和肽的施用相似，多核苷酸的施用可以通过口服、皮内、皮下、静脉内、肌肉内、骨内和/或腹膜注射，或者等，以及通过系统施用或局部施用于靶位点的附近(例如直接注射)。所述施用可以通过单次施用进行，或通过多次施用增强。所述多核苷酸的药学上或治疗上的有效量可以施用于需要治疗表达SEMA5B的癌症的受试者。或者，本发明的多核苷酸的足以诱导针对表达SEMA5B的肿瘤或癌症的CTLs的量可以施用于携带表达SEMA5B的癌症的受试者。在适合的载体中的多核苷酸或使用编码本发明的肽的多核苷酸转化的细胞的剂量可以根据所治疗的疾病、患者的年龄、体重、施用方法等等适当调整，通常为0.001mg至1000mg，例如0.01mg至100mg，例如0.1mg至10mg，例如0.5mg至5mg，并可以几天到几个月施用一次，例如每周一次。本领域的技术人员可以容易的确定适合的和最佳剂量。
X.使用所述肽、外来体、APC和CTLs的方法
本发明的肽和多核苷酸可以用于制备或诱导APCs和CTLs。本发明的外来体和APCs也能够用于制备或诱导CTLs。所述肽、多核苷酸、外来体和APCs可以与任意其它化合物联合使用，只要所述另外的组合物不抑制CTL诱导能力。因此，任意前面提及的本发明的药物组合物或试剂可以用于制备或诱导CTLs。除此之外，包括所述肽和多核苷酸那些药物组合物或试剂也可以如下所述用于制备或诱导APCs。
(1)诱导抗原呈递细胞的方法(APCs)
本发明提供使用本发明的肽或多核苷酸诱导具有CTL诱导能力的APCs的方法。
本发明的所述方法包括在体外、离体或体内使APCs接触本发明的肽的步骤。例如，离体使APC接触所述肽的方法包括以下步骤：
a：从受试者收集APCs，和
b：使步骤a的APCs接触所述肽。
所述APCs并不受限于特定种类的细胞，并包括DCs、朗格汉斯细胞、巨噬细胞、B细胞以及活化的T细胞，其已知在细胞表面呈递蛋白抗原，以便被淋巴细胞识别。优选的，由于其在APCs中具有最强的CTL诱导行为，可以使用DCs。本发明的任意一种肽可以单独使用，或与一种或多种本发明的其它肽和/或一种或多种衍生于SEMA5B以外的TAAs的CTL可诱导肽联合使用。
另一方面，当本发明的肽施用到受试者时，APCs在体内与所述肽接触，因此，在所述受试者身体中，具有CTL诱导能力的APCs被诱导。因此，本发明的方法可以包括将本发明的肽施用于受试者来在所述受试者的身体中诱导具有CTL诱导能力的APCs的步骤。相似的，当本发明的多核苷酸以可表达的形式施用到受试者中，本发明的肽被表达，并在体内接触APCs，因此，在所述受试者身体中，具有CTL诱导能力的APCs被诱导。因此，本发明也可以包括将本发明的多核苷酸施用于受试者来在所述受试者的身体中诱导具有CTL诱导能力的APCs的步骤。短语“可表达形式”描述于以上小节“IX.药物组合物(2)含有多核苷酸作为活性成分的药学组合物”。
此外，本发明的方法可以包括将本发明的多核苷酸引入APC，来诱导具有CTL诱导能力的APC的步骤。例如，所述方法可以包括以下步骤：
a：从受试者收集APCs；和
b：将编码本发明的肽的多核苷酸引入步骤a收集的APC。
步骤b可以如上述小节“VI.抗原呈递细胞”所述的进行。
或者，本发明的方法可以包括制备抗原呈递细胞(APC)的步骤，其特异性诱导针对SEMA5B表现出细胞毒性活性的CTL，通过以下步骤中的一项：
(a)在体外、离体或体内使APC接触本发明的肽；以及
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸引入APC。
或者，本发明的方法可以包括诱导具有CTL诱导能力的APC的步骤，此类方法包括选自以下项的步骤：
(a)使APC接触本发明的肽；和
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸引入APC。
本发明的方法可以在体外、离体或体内实行。优选的，本发明的方法可以在体外或离体实行。用于诱导具有CTL诱导能力的APCs的APCs可以优选表达HLA-A24抗原的APCs。此类APCs可以使用本领域公知的方法，从获自于HLA抗原为HLA-A24的受试者的外周血单核细胞(PBMCs)制备。使用本发明的方法诱导的APCs可以是在其表面上呈递本发明的肽和HLA抗原(HLAA24抗原)的APCs。当通过本发明的方法诱导的APCs施用到受试者来在所述受试者中诱导针对癌症的免疫应答时，所述受试者优选为APCs从其衍生而来的同一人。然而，所述受试者可以与APC供体不同，只要所述受试者具有和APC供体相同的HLA类型。
在另一个实施方案中，本发明提供试剂或组合物用于诱导具有CTL诱导能力的APC，此类试剂或组合物包括一种或多种本发明的肽或多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸在制造配制用于诱导APCs的试剂或组合物中的用途。
或者，本发明进一步提供本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸在诱导具有CTL诱导能力的APC中的用途。
(2)诱导CTLs的方法：
本发明也提供使用本发明的肽、多核苷酸、或外来体或APCs用于诱导CTLs的方法。
本发明还提供使用编码两种TCR亚基的多核苷酸或编码每种TCR亚基的多核苷酸诱导CTLs的方法，其中通过此类亚基形成的所述TCRs能够识别(结合)细胞表面的本发明的肽和HLA抗原的复合物。优选的，所述用于诱导CTLs的方法可以包括至少一个选自以下项的步骤：
a：使CD8阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的抗原呈递细胞接触；
b：使CD8阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的外来体接触；和
c：向CD8阳性T细胞中引入编码两种TCR亚基的多核苷酸或编码每种TCR亚基的多核苷酸，其中通过此类亚基形成的所述TCRs能够识别(结合)细胞表面的本发明的肽和HLA抗原的复合物。
当本发明的肽、多核苷酸、APCs、或外来体施用于受试者，在所述受试者的身体中CTLs被诱导，靶向表达SEMA5B的癌细胞的免疫应答的强度提高。因此，本发明的方法包括将本发明的肽、多核苷酸、APCs、或外来体施用于受试者的步骤。
或者，CTLs可以通过在离体或体外使用它们来诱导，诱导CTLs后，所述活化的CTLs可以返回所述受试者。例如，所述方法可以包括以下步骤：
a：从受试者中收集APCs，
b：使步骤a的APC接触本发明的肽，以及
c：将步骤b的APCs和CD8阳性T细胞共培养。
上述步骤c中与CD8阳性T细胞共培养的APC也可以通过将本发明的多核苷酸转移到APC中来制备，如以上小节“VI.抗原呈递细胞”所述，尽管本发明不限于此，并因此包括在其表面有效的呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的任意APCs。
可任选的使用在其表面呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的外来体代替上面提及的APCs。也就是说，本发明包括将在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的外来体与CD8阳性T细胞共培养的步骤。此类外来体可以通过以上小节“V.外来体”所述的方法制备。适合用于本发明的方法的APCs和外来体在其表面上呈递本发明的肽和HLA-A24的复合物。
此外，CTLs可以通过向CD8阳性T细胞中引入编码两种TCR亚基的多核苷酸或编码每种TCR亚基的多核苷酸来诱导，其中通过此类亚基形成的所述TCRs能够识别(结合)细胞表面的本发明的肽和HLA抗原的复合物。此类转导可以如以上小节“VIII.T细胞受体(TCR)”所述的进行。
本发明的方法可以在体外、离体或体内实行。优选的，本发明的方法可以在体外或离体实行。用于诱导CTLs的CD8阳性T细胞可以通过本领域公知的方法，从受试者得到的PBMCs制备。在优选的实施方案中，CD8阳性T细胞的供体可以是HLA抗原为HLA-A24的受试者。通过本发明的方法诱导的CTLs可以是能够识别在其表面上呈递本发明的肽和HLA抗原的复合物的细胞的CTLs。此类CTLs可以表现出针对在其表面上呈递本发明的肽的细胞的特异性细胞毒性活性，因此可以显示出针对表达SEMA5B的细胞(例如癌细胞)的特异性细胞毒性活性。当通过本发明的方法诱导的CTLs施用到受试者来诱导所述受试者中针对癌症的免疫应答时，所述受试者优选的为CD8阳性T细胞从其而来的同一人。然而，所示受试者可以是与CD8阳性T细胞供体不同的人，只要所述受试者与所述CD8阳性T细胞供体具有相同的HLA类型。
另外，本发明提供用于制造诱导CTL的药物组合物或试剂的方法或步骤，其中所述方法或步骤包括将本发明的肽与药学上可接受的载体混合或配制的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供用于诱导CTL的试剂或组合物，其中所述试剂或组合物包含本发明的一种或多种肽、一种或多种多核苷酸、一种或多种APC(s)、和/或一种或多种外来体。
在另一个实施方案中，本发明提供本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体在制造配制用于诱导CTL的试剂或组合物中的用途。
或者，本发明进一步提供本发明的肽、多核苷酸、APC或组合物在诱导CTL中的用途。
XI.诱导免疫应答的方法：
此外，本发明提供诱导针对SEMA5B相关疾病的免疫应答的方法。考虑的疾病包括癌症，其例子包括但不限于食管癌、NSCLC、RCC和SCLC。本发明的方法可以包括施用包含本发明的任意肽或编码所述肽的多核苷酸的试剂或组合物的步骤。所述本发明的方法也考虑施用呈递本发明的任意肽的外来体或APCs。对于细节，见“IX.药物组合物”项，特别是描述本发明的药物组合物作为疫苗的用途的部分。另外，本方法可以采用的用于诱导免疫应答的外来体和APCs详述于前面的项“V.外来体”、“VI.抗原呈递细胞(APC)”以及“X.使用所述肽、外来体、APCs和CTLs的方法”的(1)和(2)中。
本发明也提供用于制造诱导针对癌症的免疫应答的药物组合物或试剂的方法，其中所述方法可以包括将本发明的肽和药学上可接受的载体混合或配制的步骤。
或者，本发明的方法可以包括施用本发明的疫苗、药物组合物或试剂的步骤，所述疫苗、药物组合物或药剂包括：
(a)本发明的肽；
(b)如本文所公开的以可表达形式编码此类肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；或
(e)本发明的CTL。
在本发明的上下文中，过表达SEMA5B的癌症可以使用这些活性成分治疗。这些癌症的例子包括但不限于食管癌、NSCLC、RCC和SCLC。相应的，在施用包含任意前面提及的活性试剂的疫苗、药物组合物或药剂之前，优选地确定从待治疗的受试者收集的癌细胞或组织中SEMA5B的表达水平与收集自同一个受试者的正常细胞或组织相比是否上升。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于在有所需要的患者中治疗(过)表达SEMA5B的癌症的方法，此类方法包括以下步骤：
i)确定从待治疗的患有癌症的患者得到的生物样品中SEMA5B的表达水平；
ii)将SEMA5B的表达水平与正常对照比较；和
iii)将选自上述(a)至(e)的至少一种组分施用到患有与正常对照相比过表达SEMA5B的癌症的受试者。
或者，本发明提供包括选自上述(a)至(e)至少一种组分的疫苗或药物组合物，施用于患有过表达SEMA5B的癌症的受试者。换句话说，本发明进一步提供鉴定待使用本发明的肽治疗的受试者的方法，此类方法包括确定衍生于受试者的生物样品中SEMA5B的表达水平，其中所述基因与正常对照相比升高的表达水平表明所述受试者可能患有可以使用本发明的肽治疗的癌症。本发明的治疗癌症的方法将在下面更详细的描述。
任何衍生于受试者的细胞或组织可以用于确定SEMA5B的表达水平，只要其包括SEMA5B的转录或翻译产物。适合的样品的例子包括但不限于身体组织或体液，比如血液、唾液和尿液。优选的，所述衍生于受试者的细胞或组织样品含有包括上皮细胞的细胞群，更优选的癌症上皮细胞或衍生于癌症组织的上皮细胞。此外，如有需要，所述细胞可以从得到的身体组织或体液纯化，并接着作为衍生于受试者的样品使用。
通过本发明的方法待治疗的患者优选是哺乳动物，说明性的哺乳动物包括但不限于，例如人、非人的灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。
根据本发明，可以确定获自于受试者的生物样品中SEMA5B的表达水平。使用本领域已知的方法，SEMA5B的表达水平可以在转录(核酸)产物水平确定。例如，SEMA5B的mRNA可以使用探针通过杂交方法(例如Northern杂交)定量。所述检测可以在芯片或微阵列上实行。优选使用微阵列来检测SEMA5B的表达水平。本领域的技术人员能够使用SEMA5B的序列信息制备此类探针。例如，SEMA5B的cDNA可以作为探针使用。如有必要，所述探针可以使用适合的标签标记，例如染料、荧光物质和同位素，并且SEMA5B的表达水平可以以杂交标签的强度来检测。
此外，SEMA5B的转录产物可以使用引物，通过基于扩增的检测方法(例如RT-PCR)来定量。此类引物可以基于可获得的SEMA5B序列信息制备。
特别的，用于本方法的探针或引物在严格、中度严格，或低严格条件下与SEMA5B的mRNA杂交。如本文中使用的，短语“严格(杂交)条件”指代在此类条件下，探针或引物将与其靶序列而不是其它序列杂交。严格条件是序列依赖的，将根据不同情况而不同。在较高温度下，观察到较长序列的特异性杂交而非较短的序列。通常来说，对于特定的序列在确定的离子强度和pH下，严格条件的温度选择为比热力学熔点(Tm)低约5摄氏度。所述Tm是在此温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)下，处于平衡状态50％的与靶序列互补的探针与所述靶序列杂交。由于所述靶序列通常过剩存在，在Tm下，处于平衡状态50％的探针被占据。典型的，严格条件为其中盐浓度低于约1.0M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子(或其它盐)在pH7.0至8.3，对于短探针或引物(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30摄氏度，而对于更长的探针或引物为至少60摄氏度。严格条件也可以使用添加去稳定物质来获得，例如甲酰胺。
本发明的探针或引物典型的是基本纯化的寡核苷酸。寡核苷酸典型的包括核苷酸序列区，其在严格条件下与至少约2000、1000、500、400、350、300、250、200、150、100、50、或25个包括SEMA5B序列的核酸的连续正义链核苷酸序列，或包括SEMA5B序列的核酸的反义链核苷酸序列，或这些序列的自然发生的突变杂交。具体的，例如，在优选的实施方案中，具有长5-50b(碱基)的寡核苷酸可以作为引物使用，用于扩增待检测的基因。更优选的，SEMA5B基因的mRNA或cDNA可以使用特定大小的寡核苷酸探针或引物检测，通常为长15-30b。大小范围可以从至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷酸。所述探针和引物大小范围可以从5-10个核苷酸、10-15个核苷酸、15-20个核苷酸、20-25个核苷酸、25-30个核苷酸。在优选的实施方案中，所述寡核苷酸探针或引物的长度可以选自15-25个核苷酸。通过使用这些寡核苷酸探针检测基因的试验方法、设备或试剂是公知的(例如寡核苷酸微阵列或PCR)。在这些试验中，探针或引物也可以包括标签或连接序列。进一步的，探针或引物可以使用可检测的标签或待捕获的亲和配体修饰。或者，在基于杂交的检测步骤中，具有几百(例如约100-200)碱基至几千(例如约1000-2000)碱基长度的多核苷酸也可以作为探针使用(例如Northern印记试验或cDNA微阵列分析)。
或者，通过本发明的方法，可以检测SEMA5B的翻译产物，用于待治疗的受试者的鉴定。例如，可以确定SEMA5B蛋白(SEQIDNO:75,78或80)的量。确定作为翻译产物的SEMA5B蛋白的量的方法包括使用特异性识别SEMA5B蛋白的抗体的免疫试验方法。所述抗体可以是单克隆或多克隆的。此外，所述抗体的任意片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等)可以用于所述检测，只要所述片段或修饰抗体保留了结合SEMA5B蛋白的能力。制备这些种类的抗体的方法是本领域公知的，并且可以采用任意方法来制备这些抗体和其等同物。
作为基于其翻译产物，检测SEMA5B表达水平的另一种方法，染色的强度可以通过使用针对SEMA5B蛋白的抗体的免疫组织化学分析来测量。也就是说，在此类测量中，强染色表明SEMA5B蛋白的存在/水平增加，同时，SEMA5B的高表达水平。
如果表达水平从SEMA5B的对照水平(例如，正常细胞中的表达水平)升高例如，10％、25％、或50％；或增加到多于1.1倍。多于1.5倍、多于2.0倍、多于5.0倍、多于10.0倍，或更多，衍生于受试者的样品中SEMA5B基因的表达水平可以确定为增加。
通过使用之前收集于健康受试者并储存的样品，对照水平可以与癌细胞同时确定。另外，从患有癌症待治疗器官的非癌症区域得到的正常细胞可以作为正常对照使用。或者，对照水平可以通过分析方法确定，其基于通过分析以前确定的来自于已知疾病状态的受试者的样品中SEMA5B表达水平的结果。此外，对照水平可以来自于以前测试的细胞的表达模式的数据库。此外，根据本发明的一个方面，生物样品中的SEMA5B的表达水平可以与多个对照水平比较，其确定来自于多个参考样品。优选的，使用与所述来源于受试者的生物样品来源于相似组织类型的参考样品的对照水平。此外，优选使用已知疾病状态的人群的SEMA5B基因表达水平标准值。所述标准值可以通过本领域的任意已知方法获得。例如，平均值+/-2S.D或平均值+/-3S.D的范围可以作为标准值使用。
在本文的上下文中，从已知为非癌症来源的生物样品确定的对照水平称为“正常对照水平”。另一方面，如果所述对照水平从癌症生物样品确定，其称为“癌症对照水平”。样品表达水平和对照水平之间的差异可以标准化为对照核酸的表达水平，例如看家基因，其表达水平已知不依赖于细胞的癌症和非癌症状态而不同。示例性的对照基因包括但不限于肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1。
当与正常对照水平相比，SEMA5B的表达水平增加，所述受试者可以被鉴定为患有通过本发明的药物组合物或试剂的施用来治疗的癌症的受试者。
本发明也提供选择受试者的方法，用于使用本发明前述的药物组合物或试剂的癌症治疗，此类方法包括以下步骤：
a)确定从患有癌症的受试者得到的生物样品中SEMA5B的表达水平；
b)将步骤a中确定的SEMA5B表达水平与正常对照水平比较；和
c)如果与正常对照水平相比SEMA5B的表达水平升高，选择所述受试者用于本发明的药物组合物或试剂的癌症治疗。
本发明也提供诊断试剂盒，用于鉴定或确定患有可以使用本发明的药物组合物或试剂治疗的癌症或有形成癌症风险的受试者，该试剂盒在评估和/或监控癌症的免疫治疗的效率或适用性中也可能是有用的。优选的，所述癌症包括但不限于食管癌、NSCLC、RCC和SCLC。更具体的，所述试剂盒优选的包括至少一种在衍生于受试者的样品中检测SEMA5B的表达水平的试剂，所述试剂可以选于下组：
(a)用于检测SEMA5BmRNA的试剂；
(b)用于检测SEMA5B蛋白的试剂；和
(c)用于检测SEMA5B蛋白的生物学活性的试剂。
适合用于检测SEMA5BmRNA的试剂的例子包括特异性结合或鉴定SEMA5BmRNA的核酸，例如具有与部分SEMA5BmRNA互补序列的寡核苷酸。这些种类的寡核苷酸通过特异性针对SEMA5BmRNA的引物和探针示例。这些种类的寡核苷酸可以基于本领域公知的方法制备。如果需要，所述用于检测SEMA5BmRNA的试剂可以固定在固体基质上。此外，所述试剂盒中可以包括多于一种的用于检测SEMA5BmRNA的试剂。
另一方面，适合用于检测SEMA5B蛋白的试剂的例子可以包括针对SEMA5B蛋白的抗体。所述抗体可以是单克隆或多克隆的。此外，所述抗体的任意片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等)可以作为所述试剂使用，只要所述片段或修饰抗体保留了对SEMA5B蛋白的结合能力。制备用于SEMA5B蛋白检测的此类抗体的方法是本领域公知的，并且本发明中可以采用任意方法来制备此类抗体和其等同物。此外，所述抗体可以通过直接连接或间接标记技术使用信号生成分子标记。用于标记抗体和检测所述抗体与其靶标结合的标签和方法是本领域公知的，并且本发明可以采用任意标签和方法。此外，所述试剂盒可以包括多于一种用于检测SEMA5B蛋白的试剂。
所述试剂盒可以含有多于一种前面提及的试剂。所述试剂盒可以进一步包括固体基质和用于结合针对SEMA5BmRNA的探针或针对SEMA5B蛋白的抗体的试剂，用于培养细胞的媒介和容器，阳性和阴性对照试剂，以及用于检测针对SEMA5B蛋白的抗体的第二抗体。例如，从不患有癌症的受试者得到的组织样品可以作为有用的对照试剂。本发明的试剂盒可以进一步包括从商业和使用者立场出发需要的其它材料，包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针、注射器，以及带有使用说明的包装插页(例如书面的、磁带、CD-ROM等)。这些试剂等可以保存在带有标签的容器中。适合的容器包括瓶、小瓶和试管。所述容器可以由多种材料形成，比如玻璃或塑料。
在一个实施方案中，当所述试剂是针对SEMA5BmRNA的探针时，所述试剂可以固定在固体基质上，比如多孔带(porousstrip)，来形成至少一个检测位点。所述多孔带的测量或检测区可以包括复数的位点，每一个含有核酸(探针)。检测带也可以含有用于阴性/或阳性对照的位点。或者，对照位点也可以位于与所述测试条分离的条带上。任选的，所述不同的检测位点可以含有不同量的固定的核酸，例如，第一个检测位点中较高的量和随后的位点中较少的量。当加入检测样品，显示出检测信号的位点的数量提供样品中存在的SEMA5BmRNA的量的定量指示。所述检测位点可以构造为任意适合的可检测形状，典型的以跨越测试条宽度的杆或点的形状。
本发明的试剂盒可以进一步包括阳性对照样品或SEMA5B标准样品。本发明的阳性对照样品可以通过收集SEMA5B阳性样品接着试验其SEMA5B的水平来制备。或者，纯化的SEMA5B蛋白或多核苷酸可以加到不表达SEMA5B的细胞中来形成阳性样品或SEMA5B标准样品。在本发明中，纯化的SEMA5B可以是重组蛋白。所述阳性对照样品中SEMA5B的水平为，例如，超过临界值。
在一个实施方案中，本发明进一步提供包括本发明的一种或多种肽的诊断试剂盒。
癌症可以通过在衍生于受试者的样品中(例如血液、组织)，使用本发明的肽，检测针对本发明的肽的抗体来诊断。
癌症的诊断可以通过确定抗SEMA5B抗体的量和如上所述的对应的对照样品之间的差异来进行。如果衍生于受试者的样品(例如血液样品)含有针对本发明的肽的抗体，并且所述抗体的量与对照水平相比，被确定为超过临界值，则所述受试者怀疑患有癌症。
在另一个实施方案中，本发明的诊断试剂盒可以包括本发明的肽和与其结合的HLA分子。使用抗原肽和HLA分子用于检测抗原特异性CTLs的方法已经建立(例如AltmanJD等，Science.1996,274(5284):94-6)。因此，本发明的肽和HLA分子的复合物可以用于检测肿瘤抗原特异性CTLs的检测方法，从而使得能够早期检测癌症的复发和/或转移。此外，可以采用选择包括本发明的肽作为活性成分的药物适用的受试者，或评估所述药物的治疗效果。
具体的，根据已知方法(见例如AltmanJD等，Science.1996,274(5284):94-6)，可以制备放射标记的HLA分子和本发明的肽的寡聚物复合物，例如四聚物。使用所述复合物，可以完成诊断，例如，通过量化衍生于怀疑患有癌症的受试者的外周血淋巴细胞中抗原-肽特异性CTLs。
本发明进一步提供使用本文所述的肽表位，用于评价受试者的免疫应答的方法和诊断试剂。在本发明的一个实施方案中，如本文所描述的HLA-A24限制性肽作为评价或预测受试者的免疫应答的试剂使用。待评价的免疫应答通过使免疫原与免疫活性细胞在体外或体内接触诱导。在优选的实施方案中，用于评价免疫应答的免疫活性细胞可以选自外周血、外周血淋巴细胞(PBL)和外周血单核细胞(PBMC)。收集或分离这些免疫活性细胞的方法是本领域公知的。在一些实施方案中，任何可能导致识别和结合所述肽表位的抗原特异性CTLs生成的试剂可以采用为所述试剂。所述肽试剂不需要作为免疫原使用。用于这些分析的测试系统包括相对较新的技术发展比如四聚物、细胞内淋巴因子染色和干扰素释放试验，或ELISPOT试验。在优选的实施方案中，与肽试剂接触的免疫活性细胞可以是包括树突细胞的抗原呈递细胞。
例如，本发明的肽可以用于四聚物染色试验来评估暴露于肿瘤细胞抗原或免疫原后，外周血单核细胞的抗原特异性CTLs。所述HLA四聚物复合物可以用于直接显现抗原特异性CTLs(见例如Ogg等，Science279:2103-2106,1998；和Altman等，Science174:94-96,1996)，并确定外周血单核细胞样品中抗原特异性CTL群的频率。使用本发明的肽的四聚物试剂可以如下所述生成。
结合HLA分子的肽在对应的HLA重链和beta2-微球蛋白的存在下复性来产生四聚物复合物。在所述复合物中，重链的羧基端在之前工程化到所述蛋白中的位点生物素化。接着，链霉亲和素加到所述复合物中来形成构成为三聚物复合物和链霉亲和素的四聚物。使用荧光标记的链霉亲和素，所述四聚物可以用于染色抗原特异性细胞。所述细胞接着例如通过流式细胞术鉴定。此类分析可以用于诊断或预后的用途。通过所述步骤鉴定的细胞可以用于治疗的用途。
本发明也提供包括本发明的肽评价免疫记忆应答的的试剂(见例如Bertoni等，J.Clin.Invest.100:503-513,1997和Penna等，JExp.Med.174:1565-1570,1991)。例如，从患有癌症待治疗的个体得到的患者PBMC样品使用特异性的肽来分析抗原特异性CTLs的存在。含有单核细胞的血液样品可以通过培养PBMCs并使用本发明的肽刺激细胞来评价。在适当的培养期后，扩张的细胞群可以分析，例如，CTL活性。
所述肽也可以作为评价疫苗的效力的试剂使用。从接种免疫原疫苗的患者得到的PBMCs可以使用，例如，上述方法的一项来分析。所述患者HLA分型，选择识别患者中存在的等位基因特异性分子的肽表位试剂用于分析。疫苗的免疫原性可以通过PBMC样品中表位特异性CTLs的存在来指示。
本发明的肽也可以用于制备抗体，使用本领域公知的技术(见例如CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,Wiley/Greene,NY；和AntibodiesALaboratoryManual,Harlow和Lane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)，其作为诊断或监控癌症的试剂是有用的。此类抗体可以包括那些在HLA分子的背景下识别肽，例如，结合肽-MHC复合物的抗体。
本发明的肽和组合物有一些另外的用途，其中的一些描述于本文。例如，本发明提供用于诊断或检测病患的方法，该病患特征为SEMA5B免疫原性多肽的量。这些方法涉及确定生物样品中SEMA5B肽或SEMA5B肽和HLAI类分子的复合物的量。肽或所述肽和HLAI类分子复合物的表达可以通过分析所述肽或组合物的结合伴侣来确定或检测。在优选的实施方案中，所述肽或复合物的结合伴侣是识别并特异性结合所述肽的抗体。生物样品比如肿瘤活检中的SEMA5B的表达，也可以通过使用SEMA5B引物的标准PCR扩增方案来测试。肿瘤表达的一个例子提出于本文中，用于SEMA5B扩增的示例性条件和引物进一步公开可以在WO2003/27322中找到。
优选的，所述诊断方法涉及将分离于受试者的生物样品和SEMA5B肽的特异性抗原接触，来检测生物学样品中SEMA5B肽的存在。如本文所使用的，“接触”表示在适合的条件下，例如浓度、温度、时间、离子强度，将所述生物样品放置在足够接近所述试剂，来允许所述试剂和所述样品中存在的SEMA5B肽特异性相互作用。一般来说，使所述试剂接触生物学样品的条件是本领域普通技术人员已知的促进分子和其同族(例如蛋白和其受体同族、抗体和其蛋白抗原同族、核酸和其互补序列同族)之间特异性相互作用的条件。用于促进分子和其同族之间特异性相互作用的最优条件描述于授予Low等的美国专利号5,108,921。
本发明的诊断方法可以在体内和体外之一或两者进行。相应的，本发明中生物学样品可以定位于体内或体外。例如，所述生物学样品可以是体内的组织，所述SEMA5B免疫原性多肽的特异性抗原可以用来检测所述组织中此类分子的存在。或者，所述生物样品可以在体外收集或分离(例如血液样品、肿瘤活检、组织提取物)。在具体的优选实施方案中，所述生物样品可以是含有细胞的样品，更优选的从待诊断或治疗的受试者收集的含有肿瘤细胞的样品。
或者，所述诊断可以通过允许抗原特异性T细胞的直接定量的方法完成，通过使用荧光标记的HLA多聚物复合物染色(例如Altman,J.D.等，1996,Science274:94；Altman,J.D.等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:10330；)。也提供细胞内淋巴因子的染色，以及干扰素-γ释放试验或ELISPOR试验。相比更常规的试验，四聚物染色，细胞内淋巴因子染色和ELISPOT试验似乎至少10倍更灵敏(Murali-Krishna,K.等，1998,Immunity8:177；Lalvani,A.等，1997,J.Exp.Med.186:859；Dunbar,P.R.等，1998,Curr.Biol.8:413；)。也可以使用五聚物(例如US2004-209295A)、dextramers(例如WO02/072631)和streptamers(例如Naturemedicine6.631-637(2002))。
例如，在一些实施方案中，本发明提供用于诊断或评价施用了至少一种本发明的SEMA5B肽的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在适合特异性针对抗原的CTL的诱导的条件下，使免疫原与免疫活性细胞接触；
(b)检测或确定步骤(a)的CTL的诱导水平；和
(c)将受试者的免疫应答和CTL诱导水平相关。
在本发明的语境中，所述免疫原优选的包括至少一种选自SEQIDNOs：2至69的氨基酸序列的SEMA5B肽，具有此类氨基酸序列的肽，和具有此类氨基酸序列其中被1个、2个或更多氨基酸取代所修饰的肽。同时，诱导免疫原特异性CTL的适合的条件是本领域公知的。例如，免疫活性细胞可以在免疫原的存在下在体外培养来诱导免疫原特异性CTL。为了诱导免疫原特异性CTLs，任意刺激因子可以被加到细胞培养物中。例如，IL-2是用于CTL诱导优选的刺激因子。
在一些实施方案中，监控或评价待使用肽癌症疗法治疗的受试者的免疫应答的步骤可以在治疗之前、之中和/或之后进行。一般来说，在癌症治疗方案期间，免疫原性肽重复的施用到待治疗的受试者。例如，免疫原性肽可以每周施用，持续3-10周。相应的，所述受试者的免疫应答可以在所述癌症治疗方案期间评价或监控。或者，癌症治疗的免疫应答的评价和监控的步骤可以在治疗方案完成之时。
根据本发明，与对照相比，提高的免疫原特异性CTL的诱导指示待评价或诊断的受试者免疫上对已经施用的免疫原反应。用于评价免疫应答的适合的对照可以包括，例如，当免疫活性细胞不接触肽时，或接触具有任意SEMA5B肽以外的氨基酸序列的对照肽(例如随机氨基酸序列)时，CTL的诱导水平。在优选的实施方案中，所述受试者的免疫应答通过序列特异性方式评价，通过比较施用到所述受试者的各个免疫原之间的免疫应答。具体的，甚至当一些种类的SEMA5B的混合物施用到所述受试者，取决于所述肽，免疫应答可能不同。在此类情况下，通过比较各个肽之间的免疫应答，可以鉴定所述受试者对其显示出较高应答的肽。
XII.抗体
本发明进一步提供结合本发明的肽的抗体。优选的抗体特异性结合本发明的肽，并将不结合(或将弱结合)其它肽。或者，抗体可以结合本发明的肽以及其同源物。针对本发明的肽的抗体可以用于诊断和预后试验，以及成像方法。相似的，此类抗体可以应用于其它癌症的治疗、诊断、和/或预后，在某种程度上SEMA5B也表达或过表达于癌症患者中。此外，细胞内表达的抗体(例如单链抗体)可以治疗性的应用于治疗其中涉及SEMA5B的表达的癌症，其例子包括但不限于，食管癌、NSCLC、RCC和SCLC。
本发明也提供用于检测和/或定量SEMA5B蛋白(SEQIDNO:75,78或80)或其片段的各种免疫试验，包括组成为选自SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列的多肽，优选的包括组成为选自SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54的氨基酸序列的多肽。此类测试可以视情况而定包括一种或多种能够识别和结合SEMA5B蛋白或其片段的抗SEMA5B抗体。在本发明的语境中，结合SEMA5B多肽的抗SEMA5B抗体优选的识别组成为选自SEQIDNOs:2至69，特别是SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54的氨基酸序列的多肽，优选的排除其它肽。抗体的结合特异性可以用抑制测试来确定。就是说，当待分析的抗体和全场SEMA5B多肽之间的结合在任意组成为SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列的多肽存在下被抑制，其被认为是特异性的结合所述片段。在本发明的语境中，此类免疫试验在各种本领域公知的免疫试验形式中进行，包括但不限于，各种类型的放射免疫测定、免疫-色谱技术、酶联免疫吸附测试(ELISA)，酶联免疫荧光测试(ELIFA)等等。
本发明的相关的非抗体免疫测试也包括T细胞免疫原性试验(抑制性或刺激性)以及MHC结合试验。另外，本发明考虑能够检测表达SEMA5B的癌症的免疫成像方法，其例子包括但不限于使用本发明的标记抗体的放射核素(radioscintigraphic)成像方法。此类试验在检测、监控和预后SEMA5B表达的癌症中发现临床应用，其例子包括但不限于食管癌、NSCLC、RCC和SCLC。
本发明也提供结合本发明的肽的抗体。本发明的抗体可以以任意形式使用，例如作为单克隆或多克隆抗体，并且可以进一步包括通过使用本发明的肽免疫动物比如兔得到的抗血清，所有种类的多克隆和单克隆抗体，通过基因重组产生的人抗体和人源化抗体。
作为抗原使用来获得抗体的本发明的肽可以衍生于任意动物种类，但优选的衍生物哺乳动物比如人、小鼠、或大鼠，更优选的来自于人。来源于人的肽可以从本文公开的核苷酸或氨基酸序列的到。
根据本发明，本发明的完全或部分肽可以作为免疫的抗原。适合的部分肽的例子包括，例如，本发明的肽的氨基(N)末端或羧基(C)端片段。
本文中，抗体定义为和SEMA5B肽的全长或片段反应的蛋白。在优选的实施方案中，本发明的肽可以识别具有选自SEQIDNOs:2至69的氨基酸序列，更优选的SEQIDNOs:2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47和54的氨基酸序列的SEMA5B的片段肽。合成寡肽的方法是本领域公知的。合成后，肽可以任选的在作为免疫原使用之前纯化。在本发明的语境中，所述寡肽(例如9或10聚物)可以与载体缀合或相连接来增强免疫原性。锁孔蓝蛋白(KLH)作为载体是公知的。将KLH和肽缀合的方法也是本领域公知的。
或者，编码本发明的肽或其片段的基因可以插入已知的表达载体，其接着用来如本文所述的转化宿主细胞。期望的肽或其片段可以从宿主细胞外或内通过任意标准方法恢复，并可以接着作为抗原使用。或者，表达所述肽的全细胞或其裂解物或化学合成的肽可以作为抗原使用。
任意哺乳动物可以使用所述抗原免疫，虽然优选的考虑其与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。一般来说，可以使用啮齿目、兔形目或灵长目的动物。啮齿目家族的动物包括，例如，小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目家族的动物包括，例如，兔。灵长目家族的动物包括，例如，狭鼻猴(旧世界猴)比如食蟹猴(Macacafascicularis)、恒河猴、神圣狒狒(sacredbaboon)和黑猩猩。
使用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹腔内注射和皮下注射抗原是用于免疫哺乳类的标准方法。更具体的，抗原可以稀释并悬浮于食量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等。如果需要，所述抗原悬浮液可以和适量的标准佐剂混合，比如弗氏完全佐剂，制成乳剂并接着施用于哺乳动物。优选的，其后每4至21天几次施用抗原混合适量的不完全弗氏佐剂。适合的载体也可以用于免疫。在上述免疫之后，可以通过标准方法检查血清所需抗体的量的增加。
针对本发明的肽的多克隆抗体可以通过收集来自于免疫的动物的血液，检查所需抗体在血清中的增加，以及通过任意常规方法将血清从血液中分离来制备。多克隆抗体可以包括含有多克隆抗体的血清，以及可以从血清中分离含有所述多克隆抗体的部分。免疫球蛋白G或M可以从仅识别本发明的肽的部分使用，例如偶联本发明的肽的亲和柱，接着使用蛋白A或蛋白G柱进一步纯化此部分来制备。
为了制备用于本发明的单克隆抗体，从使用所述抗原免疫，并如上所述检查了血清中所需抗体增加的水平的哺乳动物中收集免疫细胞，并用于细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选的从脾得到。其它优选的待与以上免疫细胞融合的亲本细胞包括，例如哺乳动物的骨髓瘤细胞，更优选的具有融合细胞通过药物选择获得的属性的骨髓瘤细胞。
以上免疫细胞和骨髓瘤细胞可以根据已知方法融合，例如，Milstein等得方法(Galfre和Milstein,MethodsEnzymol73:3-46(1981))。
通过细胞融合得到的杂交瘤可以通过在标准的选择培养基中培养来选择，比如HAT培养基(含有次黄嘌呤、氨基嘌呤和胸腺嘧啶的培养基)。所述细胞培养物典型的在所述HAT培养基中持续几天至几周，时间足以允许所有其它细胞，除了所需的杂交瘤之外(非融合细胞)死亡。然后，可以进行标准的限制性稀释来筛选和克隆产生所需抗体的杂交瘤细胞。
除了上述方法，其中非人得动物使用抗原免疫来制备杂交瘤，人淋巴细胞比如那些被EB病毒感染的可以使用肽、表达肽的细胞或其裂解物在体外免疫。接着，免疫的淋巴细胞与人来源的，能够无限分裂的骨髓瘤细胞融合，比如U266，来得到产生能够产生结合所述肽的所需人抗体的杂交瘤(日本专利申请JPS63-17688)。
得到的杂交瘤可以接下来移植到小鼠的腹腔中，提取腹水。得到的单克隆抗体可以通过，例如硫酸铵沉淀、蛋白A过蛋白G柱、DEAE离子交换色谱或偶联了本发明的肽的亲和柱来纯化。本发明的抗体不仅可以用于本发明的肽的纯化和检测，还可以作为本发明的肽的激动剂和拮抗剂的候选物。
或者，产生抗体的免疫细胞，比如免疫的淋巴细胞，可以通过癌基因永生化，并用于制备单克隆抗体。因此得到的单克隆抗体也可以使用基因工程技术重组制备(见，例如Borrebaeck和Larrick,TherapeuticMonoclonalAntibodies,publishedintheUnitedKingdombyMacMillanPublishersLTD(1990))。例如，编码抗体的DNA可以从免疫细胞中科龙，比如杂交瘤或产生所述抗体的免疫的淋巴细胞，插入到适合的载体中，并引入宿主细胞来制备重组抗体。本发明还提供如上所述制备的重组抗体。
本发明的抗体可以使抗体片段或修饰抗体，只要其结合一种或多种本发明的肽。例如，所述抗体片段可以是Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)，其中来自于H和L链的Fv片段通过适合的连接分子连接。(Huston等，ProcNatlAcadSciUSA85:5879-83(1988))。更具体的，抗体片段可以通过使用酶处理抗体来生成，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶。或者，可以构建编码抗体片段的基因，插入表达载体并在适合的宿主细胞中表达(见例如Co等，JImmunol152:2968-76(1994)；Better和Horwitz,MethodsEnzymol178:476-96(1989)；Pluckthun和Skerra,MethodsEnzymol178:497-515(1989)；Lamoyi,MethodsEnzymol121:652-63(1986)；Rousseaux等，MethodsEnzymol121:663-9(1986)；Bird和Walker,TrendsBiotechnol9:132-7(1991))。
抗体可以通过缀合各种分子修饰，比如聚乙二醇(PEG)。本发明提供此类修饰的抗体。所述修饰的抗体可以通过化学修饰抗体得到。这些修饰方法是本领域常规的。
或者，本发明的抗体可以作为衍生于非人抗体的可变区和衍生于人抗体的恒定区之间的嵌合抗体来获得，或人源化抗体，包括衍生于分人抗体的互补决定区(CDR)和衍生于人抗体的框架区(FR)和恒定区。此类抗体可以根据已知技术制备。人源化可以通过啮齿类CDRs或CDR序列取代人抗体的对应序列来进行(见例如Verhoeyen等，Science239:1534-1536(1988))。相应的，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中基本少于一个完整的人可变区被非人种类的对应序列取代。
全人抗体包括除了人框架区和恒定区也可以使用人可变区。此类抗体可以使用本领域的各种技术产生。例如，体外方法涉及展示在噬菌体上的人抗体片段重组库(例如Hoogenboom&Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991))。类似的，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因小鼠中来制备，例如内源性免疫球蛋白基因被部分或完全失活的小鼠。这一方法描述于于，例如美国专利号6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。
如上得到的抗体可以纯化至均一。例如，所述抗体的分离和纯化可以根据用于一般蛋白的分离和纯化方法进行。例如，所述抗体可以通过适当的选择和联合柱和色谱分析来分离，比如亲和色谱法、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦(Antibodies:ALaboratoryManual.EdHarlowandDavidLane,ColdSpringHarborLaboratory(1988))，但不限于此。A蛋白柱和G蛋白柱可以作为亲和柱使用。可以使用的示例性A蛋柱包括，例如，HyperD,POROS和SepharoseF.F(Pharmacia)。
除了亲和色谱法之外，适合的色谱技术的例子包括，例如离子交换色谱法，输水色谱法、凝胶过滤、反相色谱法、吸附色谱等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.Marshaketal.,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1996))。所述色谱方法可以通过液相色谱实行，比如HPLC和FPLC。
例如，吸光度测量、酶联免疫吸附测试(ELISA)、酶免疫试验(EIA)、放射免疫试验(RIA)和/或免疫荧光可以用于测量本发明的抗体的抗原结合活性。在ELISA中，本发明的抗体固定到平板上，本发明的肽施加到所述平板，接着施加含有所需抗体的样品，比如产生抗体的细胞的培养上清，或纯化的抗体。然后，施用识别第一抗体并使用酶，比如碱性磷酸酶标记的第二抗体，孵育平板。接着洗涤后，酶的底物比如对硝基苯磷酸施加到所述平板，测量吸光度来评价所述样品的抗原结合活性。所述肽的片段，比如C端或N端片段，可以作为抗原使用来评价所述抗体的结合活性。BIAcore(Pharmacia)可以用来评价根据本发明的抗体的活性。
上述方法通过将本发明的抗体暴露于推测含有本发明的肽的样品，并检测或测量通过所述抗体或所述肽形成的免疫复合物，允许检测或测量本发明的肽。
因为根据本发明的肽的检测或测量方法可以特异性的检测或测量肽，所述方法可以应用于其中使用所述肽的各种实验中。
XIII.媒介物和宿主细胞：
本发明也提供向其中引入编码本发明的肽的多核苷酸的媒介物和细胞。本发明的媒介物作为本发明的核苷酸特别是DNA的载体应用于宿主细胞中，来表达本发明的肽，或管理用于基因治疗的本发明的多核苷酸。
当选择大肠杆菌作为宿主细胞，并且所述媒介物在大肠杆菌(例如JM109、DH5alpha、HB101或XL1Blue)中大量扩增和产生，所述媒介物应该具有适合于在大肠杆菌中扩增的“ori”和适合于选择转化的大肠杆菌的标记基因(例如，通过药物比如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素或等选择的抗药基因)。例如，可以使用M13-系列媒介物、pUC-系列媒介物、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，pGEM-T、pDIRECT和pT7以及上述媒介物也可以用于亚克隆和提取cDNA。当媒介物用于产生本发明的蛋白时，可以使用表达媒介物。例如，在大肠杆菌中表达的表达媒介物应该具有上述特征来在大肠杆菌中扩增。当大肠杆菌比如JM109、DH5alpha、HB101或XL1Blue作为宿主细胞使用，所述媒介物应该具有启动子，例如，LacZ启动子(Ward等，Nature341:,544-6(1989)；FASEBJ6:2422-7(1992)),araBpromoter(Better等，Science240:1041-3(1988))，T7启动子或类似，其能够在大肠杆菌中有效的表达所需基因。在这方面，pGEX-5X-1(Pharmacia)、"QIAexpresssystem"(Qiagen)、pEGFP和pET(在这种情况下，所述宿主优选的是表达T7RNA聚合酶的BL21)，例如，可以用于代替上述媒介物。另外，所述媒介物可以含有用于肽分泌的信号序列。引导所述肽被分泌到大肠杆菌的外周胞质的示例性信号序列是pelB信号序列(Lei等，JBacteriol169:4379(1987))。将所述媒介物引入所述靶标宿主细胞的方法包括，例如，氯化钙法和电穿孔法。
除了大肠杆菌之外，例如，衍生于哺乳动物的表达媒介物(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(NucleicAcidsRes18(17):5322(1990))、pEF、pCDM8)，衍生于昆虫细胞的表达媒介物(例如"Bac-to-BAC杆状病毒表达系统"(GIBCOBRL)、pBacPAK8)，衍生于植物的表达媒介物(例如pMH1、pMH2)，衍生于动物病毒的表达媒介物(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)衍生于逆转录病毒的表达媒介物(例如pZIpneo)、衍生于酵母的表达媒介物(例如"PichiaExpressionKit"(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)以及衍生于枯草芽孢杆菌的表达媒介物(例如pPL608、pKTH50)可以用于生产本发明的肽。
为了在动物细胞中表达所述媒介物、比如CHO、COS或NIH3T3，所述载体应该具有在这些细胞中表达必需的启动子，例如，SV40启动子(Mulligan等，Nature277:108(1979))，MMLV-LTR启动子，EF1alpha启动子(Mizushima等，NucleicAcidsRes18:5322(1990))，CMV启动子及类似，并且优选的用于选择转化的标记基因(例如，通过药物(例如neomycin、G418)选择的抗药性基因)。已知的由这些特征的媒介物包括，例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
在下文中，本发明参考实施例进行更详细的描述。然而，虽然以下材料、方法和实施例可以用于帮助普通技术人员制造和施用本发明的某些实施例，只为了说明本发明的各方面，因此决不限制本发明的范围。本领域的普通技术人员将容易认识到，与描述于本文类似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本发明。
实施例
试验1
材料和方法
细胞系
TISI、HLA-A*2402阳性B类淋巴母细胞系购于IHWG细胞和基因库(Seattle,WA)。COS7(非洲绿猴肾细胞系)购于ATCC。
衍生于SEMA5B的肽的候选物选择
使用结合预测软件“BIMAS”(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind)(Parker等，(JImmunol1994,152(1):163-75),Kuzushimaetal.(Blood2001,98(6):1872-81))和“NetMHC3.2”(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)(Buus等，(TissueAntigens.,62:378-84,2003),Nielsen等，(ProteinSci.,12:1007-17,2003,Bioinformatics,20(9):1388-97,2004))预测结合HLA-A*2402分子的衍生于SEMA5B的9聚物和10聚物肽。这些肽由Biosythesis(Lewisville,Texas)根据标准固相合成方法合成，并通过反向高效液相色谱法(HPLC)纯化。所述肽的纯度(>90％)和身份分别通过分析型HPLC和质谱术分析确定。肽以20mg/ml溶解于二甲基亚砜，并储存于-80摄氏度。
体外CTL诱导
单核细胞来源的树突细胞(DC)用作抗原呈递细胞来诱导针对呈递于人白细胞抗原(HLA)上的肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。DC的体外生成如别处所述(NakaharaS等，ancerRes2003Jul15,63(14):4112-8)。特别地，通过粘附于塑料组织培养皿(BectonDickinson)分开通过Ficoll-Paqueplus(Pharmacia)溶液从正常志愿者(HLA-A*2402阳性)分离的外周血单核细胞，从而以单核细胞级份富集它们。单核细胞富集群体在1000IU/ml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(R&DSystem)和1000IU/ml白细胞介素(IL)-4(R&DSystem)存在的情况中在含有2％热失活的自体血清(AS)的AIM-V培养基(Invitrogen)中培养。培养7天后，细胞因子诱导的DC使用20微g/ml的每种合成肽在3微g/ml的beta2-微球蛋白的存在下在37摄氏度在AIM-V培养基中冲激3小时。产生的细胞在其表面上似乎表达DC相关分子，例如CD80、CD83、CD86和HLAII类(数据未示出)。这些肽冲激的DCs通过X射线辐射(20Gy)失活，并以1:20的比例与通过使用CD8阳性分离试剂盒(Dynal)阳性选择得到的自体CD8+T细胞混合。这些培养物设立于49孔板中(Corning)；每个孔含有0.5mlAIM-V/2％AS培养基中的1.5x104个肽冲激的DCs，3x105个CD8+T细胞和10ng/mlIL-7(R&DSystem)。3天后，给这些培养物补充IL-2(CHIRON)至终浓度20IU/ml。在第7天和第14天，T细胞进一步使用自体肽冲激的DC刺激。DC每次通过上述相同的方法制备。在第3轮肽刺激后在第21天，针对肽冲激的TISI细胞测试CTL(TanakaH等，BrJCancer2001Jan5,84(1):94-9；UmanoY等，BrJCancer2001Apr20,84(8):1052-7；UchidaN等，ClinCancerRes2004Dec15,10(24):8577-86；SudaT等，CancerSci2006May,97(5):411-9；WatanabeT等，CancerSci2005Aug,96(8):498-506)。
CTL扩增步骤
CTL在培养物中的扩增使用与由Riddell等描述的相似的方法(WalterEA等，NEnglJMed1995Oct19,333(16):1038-44；RiddellSRetal.,NatMed1996Feb,2(2):216-23)。总共5x104个CTL在40ng/ml抗CD3单克隆抗体(Pharmingen)的存在下悬浮于具有通过丝裂霉素C灭活的2种人B类淋巴母细胞细胞系的25mlAIM-V/5％AS培养基中。在起始培养后一天，120UL/ml的IL-2加到培养物中。在第5天、第8天和第11天使用含有30IU/mlIL-2的新鲜AIM-V/5％AS培养基供给培养物(TanakaH等，BrJCancer2001Jan5,84(1):94-9；UmanoY等，BrJCancer2001Apr20,84(8):1052-7；UchidaN等，ClinCancerRes2004Dec15,10(24):8577-86；SudaT等，CancerSci2006May,97(5):411-9；WatanabeT等，CancerSci2005Aug,96(8):498-506)。
CTL克隆的建立
制成稀释物以具有在96圆底微孔滴定板(NalgeNuncInternational)中的0.3、1和3个CTLs/孔。CTLs与含有5％AS的总共150微l/孔的AIM-V培养基中1x104细胞/孔的两种人B类淋巴母细胞细胞系、30ng/ml抗CD3抗体，和125IU/mlIL-2一起培养。10天后，50微l/孔的IL-2加到培养基中，使得达到终浓度为125IU/mlIL-2。CTL活性在第14天测试，并且CTL克隆的扩增使用上述相同的方法(UchidaN等，ClinCancerRes2004Dec15,10(24):8577-86；SudaT等，CancerSci2006May,97(5):411-9；WatanabeT等，CancerSci2005Aug,96(8):498-506)。
特异性CTL活性
为了检查特异性CTL活性，进行了IFN-γELISPOT试验和IFN-γELISA。制备肽冲激的TISI(1x104/孔)作为刺激细胞。在48孔中的培养细胞用作应答细胞。IFN-γELISPOT试验和IFN-γELISA按照制造过程进行。
强制表达目标基因和HLA-A24中的一个或两个的细胞的建立
编码目标基因或HLA-A*2402的开放阅读框的cDNA通过PCR扩增。PCR扩增产物克隆到表达载体中。所述质粒使用lipofectamine2000(Invitrogen)，根据制造商的推荐步骤转染到COS7中，其为目标基因和HLA-A*2402无效的细胞系。从转染起2天后，所述转染的细胞使用依地酸(versene)(Invitrogen)收集，并作为刺激细胞(5x104细胞/孔)用于CTL活性试验。
结果
癌症中SEMA5B增强的表达
使用cDNA-微阵列从各种癌症得到的广泛基因表达谱数据表明SEMA5B(GenBankAccessionNo.NM_001031702；SEQIDNo:74)的表达在癌症组织中与相应的正常组织相比特异性升高。SEMA5B的表达在2例食管癌中的1例，1例NSCLC中的1例，17例RCC中的14例以及4例SCLC中的4例中有效升高(表1)。
表1
与对应正常组织相比，在癌组织中观察到SEMA5B上调的病例比率
癌症/肿瘤 比率
食管癌 1/2
NSCLC 1/1
RCC 14/17
SCLC 4/4
预测衍生于SEMA5B的HLA-A24结合肽
表2a和2b以高结合亲和力的顺序显示了SEMA5B的9聚物和10聚物肽的HLA-A24结合。选择总共有69种具有潜在的HLA-A24结合能力的肽并检查以确定表位肽。
表2a
衍生于SEMA5B的HLA-A24结合9聚物肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
247 LYAATVIDF 99 1
512 CYLEELHVL 244 2
1010 PYSEIPVIL 404 3
196 VFMCGTNAF 429 4
355 YYNELQSAF 502 5
139 IVGARNYLF 554 6
412 AWLPIANPI 583 7
723 IFWASWGSW 829 8
280 KWLNEPNFV 922 9
293 IGLFAYFFL 1370 1039 -->
374 VFTTNVNSI 1401 11
1093 YTPMEFKTL 1488 12
470 RFSHLVVDL 1570 13
371 IYGVFTTNV 1865 14
1126 TYYPSPLNK 2037 15
29 GWTVGGWLL 2062 16
533 ILHSARALF 3110 17
110 DLQPWNSNF 3118 18
590 NMSLWTQNI 3324 19
558 AYRSQGACL 3481 20
667 WTPWSSWAL 3501 21
1055 VYLSCQHCQ 3692 22
1122 VYTTTYYPS 3705 23
1099 KTLNKNNLI 3716 24
273 RTAQYNSKW 3825 25
291 YDIGLFAYF 3843 26
24 QQLRCGWTV 4294 27
525 REPLRSLRI 4296 28
1114 FYPLQQTNV 4449 29
144 NYLFRLSLA 4680 30
331 LLEDTWTTF 4761 31
490 YIGTESGTI 4985 32
起始位置 氨基酸序列 结合分数 SEQ ID NO
362 AFHLPEQDL 24 33
404 RYQENPRAA 18 34
440 RSLQDAQRL 14.4 35
1092 KYTPMEFKT 13.2 36
532 RILHSARAL 12 37
264 RSLGSGPPL 12 38
184 NYVRVLIVA 10.5 39
起始位置表明从SEMA5B的N端开始的氨基酸残基数量。
结合分数和解离常数[Kd(nM)]来自于“BIMAS”和“NetMHC3.2”。表2b
衍生于SEMA5B的HLA-A24结合10聚物肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
354 FYYNELQSAF 121 40
290 AYDIGLFAYF 136 41
404 RYQENPRAAW 294 4240 -->
1114 FYPLQQTNVY 329 43
666 AWTPWSSWAL 1299 44
291 YDIGLFAYFF 2015 45
138 LIVGARNYLF 2129 46
1044 CFLGSGLLTL 2237 47
119 CFLGSGLLTL 2264 48
335 TWTTFMKARL 2436 49
117 NFTYPGARDF 2683 50
532 RILHSARALF 2696 51
297 AYFFLRENAV 2699 52
330 FLLEDTWTTF 2919 53
489 LYIGTESGTI 3355 54
246 ELYAATVIDF 4738 55
440 RSLQDAQRLF 4857 56
起始位置 氨基酸序列 结合分数 SEQ ID NO
1092 KYTPMEFKTL 576 57
797 RFRFTCRAPL 40 58
286 NFVAAYDIGL 30 59
540 LFVGLRDGVL 30 60
1097 EFKTLNKNNL 24 61
500 KALSTASRSL 12 62
803 RAPLADPHGL 12 63
27 RCGWTVGGWL 11.2 64
898 EYQDCNPQAC 10.8 65
52 RTAEGPIMVL 9.6 66
747 RACENGNSCL 9.6 67
1127 YYPSPLNKHS 9 68
144 NYLFRLSLAN 9 69
起始位置表明从SEMA5B的N端开始的氨基酸残基数量。
结合分数和解离常数[Kd(nM)]来自于“BIMAS”和“NetMHC3.2”。
使用以HLA-A*2402限制的SEMA5B的预测肽的CTL诱导
针对那些衍生于SEMA5B的肽的CTLs根据描述于“材料和方法”中的步骤产生。肽特异性CTL活性通过IFN-gammaELISPOT试验检测(图1a-1)。孔编号7#中使用SEMA5B-A24-9-512(SEQIDNO:2)(a)、3#中使用SEMA5B-A24-9-1010(SEQIDNO:3)(b)、3#中使用SEMA5B-A24-9-196(SEQIDNO:4)(c)、4#中使用SEMA5B-A24-9-723(SEQIDNO:8)(d)、5#中使用SEMA5B-A24-9-280(SEQIDNO:9)(e)以及3#中使用SEMA5B-A24-9-293(SEQIDNO:10)(f)、6#中使用SEMA5B-A24-9-470(SEQIDNO:13)(g)、3#中使用SEMA5B-A24-9-558(SEQIDNO:20)(h)、4#中使用SEMA5B-A24-10-354(SEQIDNO:40)(i)、6#中使用SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)(j)、5#中使用SEMA5B-A24-10-1044(SEQIDNO:47)(k)，以及4#中使用SEMA5B-A24-10-489(SEQIDNO:54)(l)，与对照孔相比，表现出强IFN-gamma生成。另一方面，使用示于表2a和b中的其它肽刺激没有检测到特异性CTL活性，尽管这些肽具有与HLA-A*2402可能的结合活性。作为典型的阴性数据，使用SEMA5B-A24-9-247(SEQIDNO:1)(m)刺激的CTL没有观察到特异性IFN-gamma生成。总的来说，这些结果提示所选择的衍生于SEMA5B的12种肽能够诱导强CTLs。
针对SEMA5B衍生肽的CTL系和克隆的建立
在使用SEMA5B-A24-9-512(SEQIDNO:2)的#7号孔，使用SEMA5B-A24-9-1010(SEQIDNO:3)的#3号孔，使用SEMA5B-A24-9-293(SEQIDNO:10)的#3号孔和使用SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)的#6号孔中显示通过IFN-γELISPOT试验检出的肽特异性CTL活性的细胞扩增并建立CTL系。这些CTL系的CTL活性通过IFN-γELISA测量(图2)。与没有肽冲激的靶细胞相比，CTL系表现出针对使用SEMA5B-A24-9-512(SEQIDNO:2)(a)、SEMA5B-A24-9-1010(SEQIDNO:3)(b)、SEMA5B-A24-9-293(SEQIDNO:10)(c)和SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)冲激的靶细胞的有效的IFN-γ产生。此外，所述CTL克隆通过CTL系的限制性稀释建立，如描述于“材料和方法”，而针对使用肽冲激的靶细胞的IFN-γ产生通过IFN-γELISA测量。观察到了使用SEMA5B-A24-9-512(SEQIDNO:2)(a)、SEMA5B-A24-9-1010(SEQIDNO:3)(b)和SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)(c)的CTL克隆的有效的IFN-γ产生(图3)。
针对表达SEMA5B和HLA-A*2402的靶细胞的特异性CTL活性
检查针对SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)肽生成的建立的CTL系的识别表达SEMA5B和HLA-A*2402分子的靶细胞的能力。用完整的SEMA5B和HLA-A*2402基因转染的COS7细胞(表达SEMA5B和HLA-A*2402基因的靶细胞的具体模型)制备为刺激细胞，而用全长SEMA5B或HLA-A*2402转染的C07细胞作为对照使用。在图4中，使用SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)刺激的CTL系显示出针对表达SEMA5B和HLA-A*2402的COS7细胞的强CTL活性。另一方面，没有检测到针对对照的显著特异性CTL活性。因此，这一数据清楚的揭示了SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)肽被内源性处理，并随HLA-A*2402分子表达在靶细胞上，并被CTLs识别。这些结果表明，衍生于SEMA5B的这种肽可以提供给适用于具有表达SEMA5B肿瘤的患者的癌症疫苗。
抗原肽的同源分析
使用EMA5B-A24-9-512(SEQIDNO:2)、SEMA5B-A24-9-1010(SEQIDNO:3)、SEMA5B-A24-9-196(SEQIDNO:4)、SEMA5B-A24-9-723(SEQIDNO:8)、SEMA5B-A24-9-280(SEQIDNO:9)、SEMA5B-A24-9-293(SEQIDNO:10)、SEMA5B-A24-9-470(SEQIDNO:13)、SEMA5B-A24-9-558(SEQIDNO:20)、SEMA5B-A24-10-354(SEQIDNO:40)、SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)、SEMA5B-A24-10-1044(SEQIDNO:47)和SEMA5B-A24-10-489(SEQIDNO:54)刺激的CTLs显示出显著和特异性的CTL活性。这些结果可能是由于SEMA5B-A24-9-512(SEQIDNO:2)、SEMA5B-A24-9-1010(SEQIDNO:3)、SEMA5B-A24-9-196(SEQIDNO:4)、SEMA5B-A24-9-723(SEQIDNO:8)、SEMA5B-A24-9-280(SEQIDNO:9)、SEMA5B-A24-9-293(SEQIDNO:10)、SEMA5B-A24-9-470(SEQIDNO:13)、SEMA5B-A24-9-558(SEQIDNO:20)、SEMA5B-A24-10-354(SEQIDNO:40)、SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)、SEMA5B-A24-10-1044(SEQIDNO:47)和SEMA5B-A24-10-489(SEQIDNO:54)的序列与衍生于其它已知致敏人免疫系统的分子的肽同源这一事实。为了排除这种可能性，作为BLAST算法的查询序列对这些肽序列进行了同源分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，其表明无显著同源的序列。同源分析的结果表明，SEMA5B-A24-9-512(SEQIDNO:2)、SEMA5B-A24-9-1010(SEQIDNO:3)、SEMA5B-A24-9-196(SEQIDNO:4)、SEMA5B-A24-9-723(SEQIDNO:8)、SEMA5B-A24-9-280(SEQIDNO:9)、SEMA5B-A24-9-293(SEQIDNO:10)、SEMA5B-A24-9-470(SEQIDNO:13)、SEMA5B-A24-9-558(SEQIDNO:20)、SEMA5B-A24-10-354(SEQIDNO:40)、SEMA5B-A24-10-290(SEQIDNO:41)、SEMA5B-A24-10-1044(SEQIDNO:47)和SEMA5B-A24-10-489(SEQIDNO:54)的序列是独特的，因此据我们所知，这些分子引起针对某些无分子的非意图免疫应答的可能性很小。
总之，本文鉴定的衍生于SEMA5B的新HLA-A*2402表位肽可以应用于癌症免疫治疗的领域。
实用性
本发明提供衍生于SEMA5B的新表位肽，其可以诱导有效的且特异性的抗肿瘤免疫应答，具有多种癌症类型的实用性。此类肽可以作为针对SEMA5B相关疾病的肽疫苗应用，例如癌症，更具体的，食管癌、NSCLC、RCC和SCLC。
虽然本发明详细描述于本文中，并参考其具体的实施方案，应当理解上述描述本质上是示例性和解释性的，为了说明本发明以及其优选的实施方案。通过常规实验方法，本领域的技术人员将容易认识到不脱离本发明的精神和范围，可以对其进行各种变化和修饰。本发明的边界和其界限通过随附的权利要求定义。

Claims (19)

1.一种具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力的长度少于15个氨基酸的分离的肽，其中所述肽包含以下氨基酸序列(a)或(b)：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQIDNO:41、2、3、4、8、9、10、13、20、40、47和54；
(b)在选自下组的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1个、2个或几个氨基酸的氨基酸序列：SEQIDNO:41、2、3、4、8、9、10、13、20、40、47和54。
2.权利要求1的肽，其中所述肽具有一个或两个以下特性：
(a)从N端起的第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；和
(b)C端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
3.权利要求1或2的肽，其中所述肽是九肽或十肽。
4.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至3任一项的肽。
5.一种用于诱导CTL的组合物，其中所述组合物包含至少一种选自下组的活性成分：
(a)权利要求1至3任一项的肽；
(b)权利要求4的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递权利要求1至3任一项所述的肽的抗原呈递细胞(APC)；和
(d)在其表面上呈递权利要求1至3任一项所述的肽的外来体。
6.一种用于治疗和/或预防癌症，和/或防止其术后复发的药物组合物，其中所述组合物包含至少一种选自下组的活性成分：
(a)权利要求1至3任一项的肽；
(b)权利要求4的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递权利要求1至3任一项所述的肽的APC；
(d)在其表面上呈递权利要求1至3任一项所述肽的外来体；
(e)CTL，其能够识别呈递权利要求1至3任一项所述的肽的细胞。
7.权利要求6的药物组合物，其中所述药物组合物配制用于施用给其HLA抗原为HLA-A24的受试者。
8.一种用于诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其中所述方法包含选自下组的步骤：
(a)使APC与权利要求1至3中任一项所述的肽接触；和
(b)将编码权利要求1至3中任一项所述肽的多核苷酸引入到APC中。
9.一种用于诱导CTL的方法，其中所述方法包含选自下组的步骤：
(a)共培养CD8阳性T细胞和在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项所述肽的复合物的APC；
(b)共培养CD8阳性T细胞和在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项所述肽的复合物的外来体；和
(c)将编码两种T细胞受体(TCR)亚基的多核苷酸或编码各个TCR亚基的多核苷酸引入CD8阳性T细胞中，其中通过所述亚基形成的TCR可以结合细胞表面上的权利要求1至3任一项的肽和HLA抗原的复合物。
10.一种分离的APC，其在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3任一项所述的肽的复合物。
11.权利要求10的APC，其通过权利要求8的方法诱导。
12.一种分离的CTL，其靶向权利要求1至3任一项的肽。
13.权利要求12的CTL，其通过权利要求9的方法诱导。
14.一种在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，其中所述方法包含将组合物施用给所述受试者的步骤，所述组合物包含权利要求1至3任一项的肽，或编码所述肽的多核苷酸。
15.一种针对权利要求1至3任一项所述的肽的抗体或其免疫活性片段。
16.一种载体，其含有编码权利要求1至3任一项所述肽的核苷酸序列。
17.一种用权利要求16所述的载体转化或转染的宿主细胞。
18.一种诊断试剂盒，其包含权利要求1至3中任一项所述的肽，权利要求4所述的多核苷酸，或权利要求15所述的抗体或免疫活性片段。
19.一种筛选具有诱导CTL的能力的肽的方法，所述CTL具有针对呈递衍生自SEMA5B的片段的细胞的特异性细胞毒性活性，其中所述方法包含以下步骤：
(i)提供候选序列，其由通过对原始氨基酸序列取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或几个氨基酸残基而修饰的氨基酸序列组成，其中所述原始氨基酸序列选自下组：SEQIDNO:41、2、3、4、8、9、10、13、20、40、47和54；
(ii)选择候选序列，其与衍生自除SEMA5B外的任何已知人基因产物的肽没有实质显著的同源性；
(iii)使由步骤(ii)中选择的候选序列组成的肽与抗原呈递细胞接触；
(iv)使步骤(iii)的抗原呈递细胞与CD8阳性T细胞接触；和
(v)鉴定CTL诱导能力与/比由原始氨基酸序列组成的肽相同或更高的肽。
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