TW201431874A - Ｓｅｍａ５ｂ胜肽與含此之疫苗 - Google Patents

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Abstract

本文中描述抗癌之胜肽疫苗，特別是關於經分離的抗原決定位胜肽，其源自誘發細胞毒殺性T淋巴球之SEMA5B基因，且因此適合用於癌症免疫治療領域。本發明之胜肽包括SEMA5B衍生之胜肽與其經修飾之形式兩者，於經修飾之形式中，一、二或數個胺基酸被取代、刪除、插入或加入，但仍保留原始序列必要之誘發細胞毒殺性T淋巴球的能力。更提供編碼出此些胜肽的多核苷酸與包括任何上述胜肽或多核苷酸的藥物組合物。並提供以此些胜肽為標的之抗原呈現細胞及經分離之細胞毒殺性T淋巴球，以及誘發此抗原呈現細胞或細胞毒殺性T淋巴球之方法。此外，本發明提供癌症(腫瘤)治療及/或預防治療(prophylaxis)(預防)之方法，例如：食道癌(esophageal cancer)、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎細胞癌(RCC)、小細胞肺癌(SCLC)，及/或其預防轉移(prevention of a metastatic)或術後復發(postoperative recurrence)之方法，以及誘發細胞毒殺性T淋巴球之方法、使用源自SEMA5B之胜肽誘發抗腫瘤免疫之方法、編碼出此些胜肽的多核苷酸、表現此些胜肽之抗原呈現細胞或本發明之藥物組合物。

Description

SEMA5B胜肽與含此之疫苗
本發明係關於生物科學領域，更精確而言是關於癌症治療領域。特別是，本發明特別關於新穎之胜肽，其作為癌症疫苗及腫瘤治療及/或預防之任一或兩者的藥物為有效的。
已證實CD8陽性細胞毒殺性T淋巴球(CTLs)可辨認主要組織相容性抗原複合體(major histocompatibility complex,MHC)class I分子上所發現之腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens,TAAs)的抗原決定位胜肽，並殺死腫瘤細胞。自從黑色素瘤抗原(melanoma antigen,MAGE)家族的發現成為第一個腫瘤相關抗原例子，主要藉由免疫方法，已發現許多其他腫瘤相關抗原(非專利文獻1-2)。部份腫瘤相關抗原目前正在進行作為免疫治療標的之臨床發展。
合適的腫瘤相關抗原對於癌症細胞增殖與存活係為不可或缺。使用此類腫瘤相關抗原為免疫治療標的可將廣為敘述之癌細胞免疫逃脫(immune escape)的風險最小化，而癌細胞免疫逃脫係因治療驅使免疫篩選的結果，其歸因於腫瘤相關抗原的刪除、突變或向下調控。因此，能誘導有效且專一之抗 腫瘤免疫反應的新腫瘤相關抗原的鑑定成為更進一步發展的保證，所以對於多種形式癌症之胜肽疫苗接種策略(vaccination strategies)的臨床研究正進行著(非專利文獻3-10)。截至目前為止，已有使用這些腫瘤相關抗原衍生胜肽的一些臨床試驗報導。不幸的是，這些癌症疫苗試驗迄今僅顯示低的客觀反應率(objective response rate)(非專利文獻11-13)。因此仍存在對適合做為免疫治療標的之新腫瘤相關抗原之需要。
SEMA5B為重组人蛋白(semaphorin protein)家族，一種在神經發展(neural development)期間中參與神經導引(axon guidance)的分泌類膜蛋白的一員(非專利文獻14)。最近研究顯示重组人家族蛋白之功能不只與神經系統相關，也與器官生成(organogenesis)、血管生成(angiogenesis)及癌症發展有關。
當使用由23,040個基因組成的cDNA微陣列進行基因表達模式分析(gene-expression profile analysis)釐清腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)分子機制的過程中，發現於腎細胞癌中SEMA5B頻繁地被向上調控。
在自RCC患者所得的cDNA樣本中之此基因的RT-PCR分析證實，SEMA5B在所有RCC樣品中均為向上調控。後續使用SEMA5B之cDNA片段作為探針之北方墨漬分析(Northern blot analysis)顯示SEMA5B的轉錄物(transcript)在腎癌組織中為高度表達(highly expressed)，但在正常人體組織中卻幾乎檢測不到，除了胎兒大腦和腎臟(專利文獻1)。此外，於RCC細胞株中，經由siRNA消除SEMA5B減弱了RCC細胞之成長 (非專利文獻15)。
[引用文獻]
[專利文獻] (Patent Literature)
[專利文獻1] WO2007/013575
[非專利文獻] (Non Patent Literature)
[非專利文獻1] Boon T, Int J Cancer 1993, 54(2): 177-80
[非專利文獻2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996, 183(3): 725-9
[非專利文獻3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996, 88(20): 1442-55
[非專利文獻4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999, 59(13): 3134-42
[非專利文獻5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999, 59(21): 5554-9
[非專利文獻6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996,156(9): 3308-14
[非專利文獻7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997, 57(20): 4465-8
[非專利文獻8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999, 80(2): 169-72
[非專利文獻9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999, 81(3): 459-66
[非專利文獻10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999, 81(3): 387-94
[非專利文獻11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002, 20(20): 4169-80
[非專利文獻12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002, 188: 33-42
[非專利文獻13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004, 10(9): 909-15
[非專利文獻14] O’Connor TP et.al., Neural Dev. 2009,23(4)18
[非專利文獻15] Hirota E. et.al., Int J Oncol. 2006, 29(4):799-827
本發明至少部分係基於發現可免疫治療合適標的之新穎胜肽。由於腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens,TAAs)一般被免疫系統感知為“自身”，而通常不具有先天性免疫抗原性(innate immunogenicity)，所以發現適合之標的仍然係重要的。在本發明中，SEMA5B[典型之胺基酸序列顯示於序列辨識號：75、78或80；典型之核苷酸序列顯示於序列辨識號：74、76、77或79(GenBank Accession No.NM_001031702,NM_001256346,NM_001256347或NM_001256348)]已被證實於癌細胞中為專一地過度表現，其例子包括但不限於：食道癌(esophageal cancer)、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)、腎細胞癌(RCC)及小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)(表1)。因此，本發明聚焦於以SEMA5B作為候選對象的癌症/腫瘤免疫療法。
為此目的，本發明至少部份係關於鑑定具有誘發細胞毒殺性T淋巴球能力的特定抗原決定位胜肽，而此細胞毒殺性T淋巴球在源自SEMA5B之胜肽中對SEMA5B具有專一性。如下更詳細討論，使用與HLA-A*2402結合之源自SEMA5B的候選胜肽來刺激取自健康提供者獲得的周邊血液單核球細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。接著建立細胞毒殺性T淋巴球株，其對於經各候選胜肽脈衝(pulsed)之HLA-A24陽性目標細胞具有專一細胞毒性。文中這些結果證明這些胜肽為HLA-A24限制的抗原決定位胜肽，其可誘導強而專一抗(against)表現SEMA5B之細胞的免疫反應。這些結果更指出SEMA5B具強烈的免疫原性，因此其抗原決定位為癌症/腫瘤免疫治療之有效目標。
因此，本發明之一目的為提供經分離的胜肽，其可與HLA抗原結合並包括源自SEMA5B之胺基酸序列(序列辨識號：75、78或80)。預期此些胜肽具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力，且因而可用於in vitro、ex vivo或in vivo誘導細胞毒殺性T淋巴球，或可直接投予於個體，藉此in vivo誘導抗癌症的免疫反應，癌症的例子包括但不限於：食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌。
本發明之胜肽一般小於15、14、13、12、11或10個胺基酸長度，較佳胜肽為九胜肽與十胜肽，更佳為具有擇自序列辨識號：2至69之胺基酸序列的九胜肽與十胜肽。在此之中，具有擇自序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47與54之胺基酸序列的胜肽特別受喜愛。
本發明也考慮經修飾之胜肽，其具有擇自序列辨識號：2至69之胺基酸序列，於其中一、二或多個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加入，提供所產生之經修飾的胜肽保留原始未經修飾的胜肽所必需的細胞毒殺性T淋巴球誘發能力及HLA結合能力。
於一實施例中，當原始胜肽為九員胜肽(例如序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13及20之一)，其經修飾之胜肽的大小較佳為於9-40個胺基酸之範圍內，例如於9-20個胺基酸之範圍內，例如於9-15個胺基酸之範圍內。相同地，當原始胜肽為十員胜肽(例如序列辨識號：40、41、47及54之一)，其經修飾之胜肽的大小較佳為於10-40個胺基酸之範圍內，例如於10-20個胺基酸之範圍內，例如於10-15個胺基酸之範圍內。
本發明更包括編碼出本發明任一胜肽之經分離的多核苷酸。這些多核苷酸可用以誘導或製備具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞(antigen presenting cells,APCs)。如同本發明之胜肽，此類抗原呈現細胞可被投予至個體以誘導抗癌之免疫反應。
當投予至個體時，本發明之胜肽可被呈現於抗原呈現細胞之表面，以便誘導以各胜肽為目標的細胞毒殺性T淋巴球。因此，本發明之一目標為提供包括一或多個本發明之胜肽或一或多個編碼出此類胜肽之多核苷酸之試劑或組合物，此類試劑或組合物可被用於誘導細胞毒殺性T淋巴球。此類試劑或組合物可被用於癌症之治療及/或預防，及/或其轉移或術後復發之治療及/或預防。本發明所考慮之目標癌症的例子包括 但不限於：食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌。
本發明更考慮藥學組合物或試劑，其包括本發明之一或多個胜肽或一或多個多核苷酸。此藥學組合物或試劑較佳係被配製用於癌症之治療及/或預防，更精確而言係原發癌症(primary cancer)、及/或其轉移或其術後復發的預防。本發明之藥學試劑或組合物可包括呈現任何之本發明胜肽的抗原呈現細胞及/或外吐小體(exosomes)作為活性成分，其可用以替代本發明之胜肽或多核苷酸或作為除了本發明之胜肽或多核苷酸以外的活性成份。
本發明之胜肽或多核苷酸可用來誘導於表面上呈現HLA抗原及本發明胜肽之複合物的抗原呈現細胞，例如，藉由將來自個體之抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸或將編碼出本發明胜肽的多核苷酸引入抗原呈現細胞。此種抗原呈現細胞具有誘發細胞毒殺性T淋巴球的能力且對於癌症免疫治療為有效的，其中所述之細胞毒殺性T淋巴球可專一辨識呈現目標胜肽於其表面之細胞。因此，本發明包括誘導具細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法與藉由此方法獲得之抗原呈現細胞。此外，本發明也包括用於誘導具細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的試劑或組合物，此試劑或組合物包括任何本發明之胜肽或多核苷酸。
本發明更進一步之一目標為提供誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法，此方法包括將CD8陽性T細胞與於其表面上呈現HLA抗原及本發明胜肽之複合物之抗原呈現細胞共培養的步驟，將CD8陽性T細胞與於其表面上表現HLA抗原及本發明 胜肽之複合物之外吐小體共培養的步驟，或引入編碼出二種T細胞受體(T cell receptor,TCR)次單元之多核苷酸或編碼出任一T細胞受體(T cell receptor,TCR)次單元之多核苷酸的步驟，其中此T細胞受體可結合至表現於細胞表面之本發明胜肽與HLA抗原之複合物。藉由此種方法獲得之細胞毒殺性T淋巴球可用於癌症之治療及/或預防，其舉例包括但不限於：食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌。因此，本發明包括誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法與藉由此方法獲得之細胞毒殺性T淋巴球。本發明又另一目標為提供經分離之抗原呈現細胞，其呈現HLA抗原及本發明胜肽之複合物於表面上。本發明更提供經分離並以本發明胜肽為目標之細胞毒殺性T淋巴球。這些細胞毒殺性T淋巴球亦被鑑定為可辨識(或結合)呈現於細胞表面之HLA抗原及本發明胜肽之複合物。這些抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球可被用於癌症免疫治療。
本發明又另一目標為提供於需要之個體中誘導抗癌免疫反應的方法，此類方法包括投予試劑或組合物至個體的步驟，此試劑或組合物至少包含一種成份擇自(a)本發明之胜肽或編碼出此類胜肽之多核苷酸，(b)呈現此類胜肽之外吐小體或抗原呈現細胞，與(c)可辨認呈現此類胜肽於其表面上之細胞的細胞毒殺性T淋巴球。
本發明之一面向涉及本發明之胜肽，一包括此胜肽之試劑或組合物作為醫藥物質。本發明之應用性擴展至多種關於或起因於SEMA5B過度表現的疾病中的任一種，例如癌症，其例子包括但不限於：食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌 及小細胞肺癌。
更精確而言，本發明所提供如下：
[1]一種經分離的胜肽，其具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力，其中該胜肽包括下列(a)或(b)之胺基酸序列：
(a)SEMA5B免疫活性片段之胺基酸序列
(b)SEMA5B免疫活性片段之胺基酸序列，且於其中1、2或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加入之。其中，經此胜肽所誘發之細胞毒殺性T淋巴球對於呈現源自SEMA5B片段之細胞具有專一細胞毒殺活性。
[2]如[1]所述之胜肽，其中所述之胜肽包括下列(a)或(b)之胺基酸序列：
(a)胺基酸序列，其擇自由序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47與54所組成之群組。
(b)胺基酸序列，其擇自由序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47與54所組成之群組，且於其中1、2或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加入之。
[3]如[2]所述之胜肽，其中所述之胜肽具有下述特徵之一或兩項：(a)其自N端的第二個胺基酸為苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸；以及(b)其C端的末端氨基酸為苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫胺酸。
[4]如[1]至[3]任一項所述之胜肽，其中該胜肽為九胜肽或十胜肽。
[5]一種經分離之多核苷酸，其編碼出如[1]至[4]任一項所述之胜肽。
[6]一種誘導細胞毒殺性T淋巴球之組合物，其中該組合物包括至少一種活性成份擇自以下所組成之群組：(a)如[1]至[4]任一項所述之胜肽；(b)如[5]所述之多核苷酸；(c)抗原呈現細胞，其表現如[1]至[4]任一項所述之胜肽於其表面上；以及(d)外吐小體，其表現如[1]至[4]任一項所述之胜肽於其表面上。
[7]種藥物組合物，用於癌症之治療及/或預防、及/或防止其術後復發、或引發對抗所述癌症之免疫反應，其中該組合物包括至少一種活性成份擇自以下所組成之群組：(a)如[1]至[4]任一項所述之胜肽；(b)如[5]所述之多核苷酸；(c)抗原呈現細胞，其表現如[1]至[4]任一項所述之胜肽於其表面上；(d)外吐小體，其表現如[1]至[4]任一項所述之胜肽於其表面上；以及(e)細胞毒殺性T淋巴球，其可辨認呈現如[1]至[4]任一項所述之胜肽的細胞。
[8]如[7]所述之藥物組合物，其中該藥物組合物係配製以投予於個體，其人類白血球組織抗原(HLA antigen)為HLA-A24。
[9]一種誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細 胞的方法，其中該方法包括步驟擇自以下所組成之群組：(a)將抗原呈現細胞與如[1]至[4]任一項所述之胜肽接觸；以及(b)將編碼出如[1]至[4]任一項所述之胜肽的多核苷酸引入抗原呈現細胞。
[10]一種誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法，其中該方法包括步驟擇自以下所組成之群組：(a)將CD8陽性T細胞與抗原呈現細胞共培養，該抗原呈現細胞呈現人類白血球組織抗原及如[1]至[4]任一項所述之胜肽的複合物於其表面上；(b)將CD8陽性T細胞與外吐小體共培養，該外吐小體呈現人類白血球組織抗原及如[1]至[4]任一項所述之胜肽的複合物於其表面上；以及(c)將編碼出兩種T細胞受體次單元之多核苷酸或將編碼出任一種T細胞受體次單元之多核苷酸引入CD8陽性T細胞，其中由該T細胞受體次單元所形成之該T細胞受體可結合至於一細胞表面上之如[1]至[4]任一項所述之胜肽及人類白血球組織抗原的複合物。
[11]一種經分離的抗原呈現細胞，其表現一人類白血球組織抗原及如[1]至[4]任一項所述之胜肽的一複合物於其表面上。
[12]如[11]所述之抗原呈現細胞，其藉由如[9]所述之方法來誘導。
[13]一種經分離之細胞毒殺性T淋巴球，其以如[1]至[4]任一 項所述之胜肽為標的。
[14]如[13]所述之細胞毒殺性T淋巴球，其藉由如[10]所述之方法來誘導。
[15]一種於個體中誘導抗癌症之免疫反應的方法，其中該方法包括投予該個體組合物之步驟，該組合物包括如[1]至[4]任一項所述之胜肽、或編碼出該胜肽之多核苷酸。
[16]一種抗體或其免疫活性片段，其抗如[1]至[4]任一項所述之胜肽。
[17]一種載體，其包括編碼出如[1]至[4]任一項所述之胜肽的核苷酸序列。
[18]一種宿主細胞，其由如[17]所述之載體所轉型或轉染。
[19]一種診斷套組，包括如[1]至[4]任一項所述之胜肽、如[5]所述之多核苷酸、或如[16]所述之抗體或免疫活性片段。
[20]一種篩選具有誘導一細胞毒殺性T淋巴球之一能力的胜肽的方法，該細胞毒殺性T淋巴球對於表現源自SEMA5B之一片段的一細胞具有專一細胞毒殺活性，其中該方法包括以下之步驟：(i)提供候選序列，其由藉由取代、刪除、插入及/或加入1、2或數個胺基酸殘基至原始胺基酸序列來修飾的一胺基酸序列所組成，其中該原始胺基酸序列係擇自由序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47與54所組成之群組；(ii)選擇候選序列，其除了SEMA5B之外，不與源自任何 已知之人類基因產物之胜肽具有實質顯著的同源性；(iii)將由步驟(ii)中所選擇之該候選序列所組成之胜肽與抗原呈現細胞接觸；(iv)將步驟(iii)之該抗原呈現細胞與CD8陽性T細胞接觸；以及(v)鑑定出其細胞毒殺性T淋巴球誘發能力相同或高於由該原始胺基酸序列所組成之一胜肽的胜肽。
[21]一種藥物組合物，其包括如[1]至[4]任一項所述之胜肽。
[22]如[1]至[4]任一項所述之胜肽，其用以作為藥物物質。
[23]如[5]所述之多核乾酸或如[17]所述之載體，其用以作為藥物物質。
相對地，於另一實施例中，本發明亦提供下列胜肽及其使用：
[1]一種經分離的胜肽，其長度小於15個胺基酸並具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力，其中該胜肽包括下列(a)或(b)之胺基酸序列：：
(a)胺基酸序列，其擇自由序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47與54所組成之群組。
(b)胺基酸序列，其擇自由序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47與54所組成之群組，且於其中1、2或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加入之。
[2]如[1]所述之胜肽，其中所述之胜肽具有下述特徵之一或兩項：(a)其自N端的第二個胺基酸為苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫 胺酸或色胺酸；以及(b)其C端的末端氨基酸為苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫胺酸。
[3]如[1]至[2]任一項所述之胜肽，其中該胜肽為九胜肽或十胜肽。
配合所附圖式與實施例閱讀以下詳細說明，當可完全地明白本發明之目的與特徵。應瞭解的是，上述之發明內容與以下之詳細說明，兩者均為示範之實施例，並不限制本發明或本發明其他替代實施例。
尤其，應瞭解的是，雖已藉由多個特定實施例於此敘述本發明，然其敘述係為本發明之說明，且不應做為本發明之限制。熟悉此技藝人士可在不背離如所附申請專利範圍所述本發明之精神與範圍下，產生各種修飾與應用。同樣地，由發明內容與下述特定實施例，可清楚了解本發明之其他目的、特徵、好處與優點，且熟悉此技藝人士當可立即明白。由上述搭配所附實施例、資料、圖式與所有經單獨或考慮結合引用參考文獻得到之合理推論，可清楚這些目的、特徵、好處與優點。
經由下述本發明之圖式簡單說明、實施方式及其較佳實施例，技藝人士可了解本發明之各個面向及其應用。
第1圖由(a)-(m)一系列照片所組成，其顯示以源自SEMA5B之胜肽誘導之細胞毒殺性T淋巴球的干擾素(IFN)-γ酵素結合免疫斑點分析(ELISPOT)結果。而於以SEMA5B-A24-9-512(序 列辨識號：2)誘導之孔洞編號#7(a)、SEMA5B-A24-9-1010(序列辨識號：3)誘導之孔洞編號#3(b)、SEMA5B-A24-9-196(序列辨識號：4)誘導之孔洞編號#3(c)、SEMA5B-A24-9-723(序列辨識號：8)誘導之孔洞編號#4(d)、SEMA5B-A24-9-280(序列辨識號：9)誘導之孔洞編號#5(e)、SEMA5B-A24-9-293(序列辨識號：10)誘導之孔洞編號#3(f)、SEMA5B-A24-9-470(序列辨識號：13)誘導之孔洞編號#6(g)、SEMA5B-A24-9-558(序列辨識號：20)誘導之孔洞編號#3(h)、SEMA5B-A24-10-354(序列辨識號：40)誘導之孔洞編號#4(i)、SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)誘導之孔洞編號#6(j)、SEMA5B-A24-10-1044(序列辨識號：47)誘導之孔洞編號#5(k)與SEMA5B-A24-10-489(序列辨識號：54)誘導之孔洞編號#4(l)中的細胞毒殺性T淋巴球相較於控制組分別顯示IFN-γ的強力產生。這些照片之孔洞上的正方形指示其對應孔洞之細胞被擴張來建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株。相對的，做為典型的負資料，在以SEMA5B-A24-9-247(序列辨識號：1)(m)刺激的細胞毒殺性T淋巴球並未觀察到專一的IFN-γ產生。於圖中，“+”指出抗以適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生，而“-”指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生。
第2圖由(a)-(d)一系列線圖所組成，顯示以SEMA5B-A24-9-512(序列辨識號：2)(a)、SEMA5B-A24-9-1010(序列辨識號：3)(b)、SEMA5B-A24-9-293(序列辨識號：10)(c)與SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)(d)刺激之細胞毒殺性T淋巴球細胞株的IFN-γ產生。藉由IFN-γ酵素連結免疫吸 附分析(ELISA)來測量細胞毒殺性T淋巴球產生之IFN-γ的量。結果顯示，相較於控制組，藉由以各胜肽刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強而有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出抗以適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生，而“-”指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生。
第3圖由(a)-(c)一系列線圖所組成，顯示藉由來自以SEMA5B-A24-9-512(序列辨識號：2)(a)、SEMA5B-A24-9-1010(序列辨識號：3)(b)與SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)(c)刺激之細胞毒殺性T淋巴球細胞株之限制稀釋所建立的細胞毒殺性T淋巴球複製的IFN-γ產生。結果顯示，相較於控制組，藉由以各胜肽刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示強而有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出抗以適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生，而“-”指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生。
第4圖為一線圖，其顯示抗表現SEMA5B與HLA-A*2402的目標細胞之細胞毒殺性T淋巴球複製的專一細胞毒殺性T淋巴球活性。製備以HLA-A*2402或全長之SEMA5B基因轉染之COS7細胞做為控制組。以SEMA5B-A24-10-291(序列辨識號：41)建立之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示抗以SEMA5B與HLA-A*2402兩者轉染之COS7細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性(菱形)。另一方面，沒有偵測到顯著專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，其抗表現HLA-A*2402(三角形)或SEMA5B(圓形)之任一的目標細胞。
雖然在實施或試驗本發明之實施例時可使用相似或等同於本文敘述的任何方法與材料，但是現在敘述較佳之方法、元件與材料。然而在敘述本發明材料與方法之前，需瞭解的是，此描述僅用於說明並非意圖限制本發明。也需瞭解的是，本發明並不限於本文敘述之特定大小、形狀、尺寸、材料、方法學、步驟等，因為這些可依例行實驗法及最佳化進行變更。此外，本文敘述中使用之專門用語僅為了描述特定之變化形式或實施例，而非意圖限制僅受限於所附申請專利範圍的本發明範圍。
本說明書中提及之各刊物、專利或專利申請之揭露，其內容將完整地引入本文做為參考。然而，本文並未被解釋為承認本發明因效力或先前發明而不被給予先於這些揭露之權力。
除非特別定義，本文使用之所有技術及科學用語與本發明所屬領域具通常知識者所普遍瞭解的意義相同。若發生抵觸，以本說明書(包括定義)為主。此外，材料、方法與實施例僅為解釋說明而非意圖限制本發明。
I.定義
除非以其他方式明確指出，本文用字“一”與“該”意指“至少一”。使用“分離的”與“純化的”之措辭關聯至一物質(例如，胜肽、抗體、多核苷酸等)，意指此物質實質上不含有其自然來源中可能包含之至少一種物質。因此，經分離或純化之胜肽意指其實質上沒有細胞材料，例如：碳水化合物、脂質或來自胜肽所源自之細胞或組織來源的其他污染蛋白質，或 在化學合成時，實質上不含有化學前驅物或其他化學物。
用語“實質上沒有細胞材料”包括製備胜肽，此胜肽是自本身被分離或重組產生之細胞的細胞組成中分離而得。因此，實質上沒有細胞材料之胜肽，其包括含有小於30%、20%、10%或5%(乾重)之異源蛋白質(此處也意指為“污染蛋白質”)的多胜肽製備。當胜肽經重組產生時，較佳為實質上不含有培養基，其包括含有少於約20%、10%或5%之胜肽製劑體積之培養基的胜肽製備。當藉由化學合成產生胜肽時，較佳為實質上不含有化學前驅物或其他化學物，其包括含有小於約30%、20%、10%或5%(乾重)之胜肽製劑體積的參與胜肽合成之化學前驅物或其他化學物的胜肽製備。包含經分離或經純化胜肽之特定胜肽製劑，可由例如：在蛋白質製劑經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(sodium dodecyl sulfate(SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis)與考馬斯亮藍染色(Coomassie Brilliant Blue staining)或上述膠體的類似物之後出現的單一條帶顯示。在較佳實施例中，本發明之胜肽與多核苷酸為經分離或經純化。
本文可替換使用之用語“多胜肽”、“胜肽”與“蛋白質”意指胺基酸殘基之聚合物。此用語適用於其中一或多個胺基酸殘基為經修飾之殘基或非自然發生之殘基的胺基酸聚合物，例如：對應自然發生胺基酸之人工化學模仿物，以及自然發生的胺基酸聚合物。
本文中使用用語“寡胜肽”意指由20或更少個胺基酸殘基，一般為15或更少個胺基酸殘基所組成的胜肽。如本文 中所使用，用語”九胜肽”意指由9個胺基酸殘基所組成的胜肽，用語”十胜肽”意指由10個胺基酸殘基所組成的胜肽。
本文中使用用語“胺基酸”意指自然發生與合成之胺基酸，以及與自然發生之胺基酸具相似作用之胺基酸類似物與胺基酸模仿物。胺基酸可為L-胺基酸或D-胺基酸。自然發生胺基酸為基因密碼所編碼的胺基酸以及細胞中在轉譯後經修飾的胺基酸[例如：羥脯胺酸(hydroxyproline)、γ-羧基谷胺酸(gamma-carboxyglutamate)與O-磷絲胺酸(O-phosphoserine)]。措辭“胺基酸類似物”意指具有相同於自然發生胺基酸之基礎化學結構(α碳鍵結至氫、羧基、胺基與R基)的化合物，但具有經修飾之R基或經修飾之骨架[例如：同絲胺酸(homoserine)、降亮胺酸(norleucine)、甲硫胺酸(methionine)、亞碸(sulfoxide)、甲基硫氨磺(methionine methyl sulfonium)]。措辭“胺基酸模仿物”意指與一般胺基酸結構不同但功能相似的化學化合物。可藉由IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission所建議之其一般所知的三字母符號或一字母符號來指出此處之胺基酸。
除非以其他方式明確指出，本文之用語“多核苷酸”、“寡核苷酸”與“核酸”可替換使用，並可參照使用它們一般被接受的單一字母編碼。本文可替換使用之用語“試劑”與“組合物”意指包括特定含量之特定成分的產物，與任何直接或間接來自於特定含量之特定成分組合的產物。當此用語用於關連修飾詞語“藥學的”(如於“藥學試劑”與“藥學組合物”中)，其意圖包括含有活性成分與形成載體之惰性成分的產物，以及任 何直接或間接來自任兩個或多個成份之組合、複合或聚集的產物，或來自一或多個成分之解離，或來自一或多個成分之反應或相互作用的其他形式。因此，在本發明內容中，用語“藥學試劑”與“藥學組合物”意指藉由混合本發明之分子或化合物與藥學上或生理上可接受之載體所製成的任何產物。
於此使用之用語“活性成分”意指在試劑或組合物中的物質，其為具生物或生理活性的。特別是，在藥學試劑或組合物的內容中，用語“活性成分”意指成分物質其顯示客觀的藥學作用。例如，若藥學試劑或組合物用於癌症之治療或避免中，在試劑或組合物中的活性成分可直接或間接引起對癌細胞及/或組織的至少一生物或生理作用。此作用較佳可包括減低或抑制癌細胞生長、損傷或殺死癌細胞及/或組織等。一般而言，有效成分的間接作用為誘導細胞毒殺性T細胞，其可辨認或殺死癌細胞。在被配製前，“活性成分”也可意指為“主體(bulk)”、“藥物物質(drug substance)”或“技術產物(technical product)”。
如此處所使用之措辭“藥學上可接受之載體”或“生理上可接受之載體”意指藥學上或生理上可接受之材料、組合物、物質或載劑，包括，但不限於液體或固體填充料、稀釋劑、賦形劑、溶劑及套膜材料。
本發明之一些藥學試劑或組合物提供特別用途為疫苗。在本發明內容中，用語“疫苗(也意指為致免疫性組合物)”意指試劑或組合物，其經接種至動物具有改善、增強及/或誘導抗腫瘤免疫力的功能。
除非另有定義，用語“癌症”意指過度表現SEMA5B基因之癌症或腫瘤，其例子包括但不限於：食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌。除非另有定義，用語“細胞毒殺性T淋巴球”、“細胞毒殺性T細胞”與“CTL”於此可替換使用，且除非另以其他方式特別指出，其意指可辨認非自身細胞(例如，腫瘤/癌症細胞、被病毒感染之細胞)且誘導這些細胞死亡之T淋巴球次族群。
除非特別定義，如於本文使用之用語“HLA-A24”，典型地意指其次型，其例子包括但不限於：HLA-A*2401、HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2404、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2420、HLA-A*2425與HLA-A*2488。除非特別定義，於此使用之用語“套組”被使用於關於試劑與其他材料之組合。與此考慮之套組包括微陣列、晶片、標誌等。並無打算使用語“套組”限制於試劑及/或材料之特定組合。
如於本文使用之用語，在個體或病患的敘述中，措辭“個體之(或病患之)HLA抗原為HLA-A24”意指此個體或病患同型結合地(homozygously)或異質結合地(heterozygously)具有HLA-A24抗原基因，且HLA-A24抗原被表現於此個體或病患的細胞中作為HLA抗原。
在本發明方法與組合物提供用於癌症“治療”內容之範圍中，若治療導致臨床優點，例如：降低個體中癌症之大小、普遍程度(prevalence)或轉移潛力、存活時間的延長、抑制轉移或手術後復發等，則其被視為“有效”。當治療為預防性(prophylactically)提供時，“有效”意指減緩或避免癌症形成， 或避免或減輕癌症之臨床症狀。有效性可經相關之診斷或治療特定腫瘤形式的任何已知方法進行確認。
在本發明方法與組合物提供用於癌症“避免”與“預防”內容之範圍中，此類用詞可於本文中交替使用，其意指任何減少死亡率之負載或來自疾病之死亡率之活動。避免與預防可發生於“初期、第二期與第三期避免層級”。初期避免與預防避免了疾病之發展，而第二期與第三期層級之避免與預防包括以下述為目的的活動：避免與預防疾病發展與症狀浮現及藉由恢復功能與減少疾病相關併發症，以減少已建立疾病之負向發展。或者，治療或避免可包括廣泛範圍之預防疾病治療，其以減緩特定疾病之嚴重度為目標，例如減少腫瘤之增殖與轉移。
在本發明內容中，癌症之治療及/或預防，及/或其轉移或手術後復發的避免包括任何導致下列事件之活動，例如：癌細胞之手術移除、癌類細胞之生長抑制、腫瘤之衰退或退化、減緩與抑制癌症發生之誘導、腫瘤退化、轉移之減少與抑制、手術後復發的抑制與存活時間的延長。癌症之有效治療及/或預防減少具有癌症之個體致死率與改善其預後、減低血液中癌症標記的程度與減緩伴隨著癌症之可偵測症狀。例如，構成有效治療及/或預防之症狀減輕或改善，其包括10%、20%、30%或更加減輕，或穩定疾病。
在本發明內容中，用語“抗體”意指免疫球蛋白與其片段，其與選定蛋白質或其胜肽專一反應。抗體可包括人類抗體、靈長類抗體、嵌合抗體(chimeric antibody)、雙專一抗體(bispecific antibody)、人源化抗體、與其他蛋白質或放射標誌 融合之抗體，與抗體片段。此外，此處之抗體為最大解釋範圍且特別包含完整單株抗體、多株抗體、由至少兩個完整抗體形成之多專一抗體(multispecific antibody)(例如雙專一抗體)與抗體片段，只要其存在所需生物活性。“抗體”意指所有之種類(例如，IgA、IgD、IgE、IgG與IgM)。除非特別定義，於此使用之所有技術與科學用語為與熟悉此技藝人士所通常瞭解之意義相同。
II.胜肽
以下詳述之本發明胜肽可意指為“SEMA5B胜肽”或“SEMA5B多胜肽”。
為了證明來自SEMA5B之胜具有作為被細胞毒殺性T淋巴球(CTLs)辨認之抗原的功能，分析來自SEMA5B之胜肽(序列辨識號：75)以確定它們是否為由一般遇到HLA對偶基因(allele)之HLA(人類白血球組織抗原)-A24所限制之抗原決定位(Date Y et al.,Tissue Antigens 47：93-101,1996；Kondo A et al.,J Immunol 155：4307-12,1995；Kubo RT et al.,J Immunol 152：3913-24,1994)。根據其對HLA-A24之結合親和力確認來自SEMA5B之HLA-A24結合胜肽的候選物，以下為經確認之胜肽候選物：序列辨識號：2-69。
在經下列這些胜肽脈衝(載有)之樹突細胞(dendritic cell,DC)in vitro刺激T細胞後，成功建立細胞毒殺性T淋巴球：SEMA5B-A24-9-512(序列辨識號：2)、SEMA5B-A24-9-1010(序列辨識號：3)、SEMA5B-A24-9-196(序列辨識號：4)、SEMA5B-A24-9-723(序列辨識號：8), SEMA5B-A24-9-280(序列辨識號：9)、SEMA5B-A24-9-293(序列辨識號：10)、SEMA5B-A24-9-470(序列辨識號：13)、SEMA5B-A24-9-558(序列辨識號：20)、SEMA5B-A24-10-354(序列辨識號：40)、SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)、SEMA5B-A24-10-1044(序列辨識號：47)及SEMA5B-A24-10-489(序列辨識號：54)。
上方所提及之被建立的細胞毒殺性T淋巴球對經各別胜肽脈衝之目標細胞顯示強而專一的細胞毒殺性T淋巴球活性。這些結果證明SEMA5B為由細胞毒殺性T淋巴球所辨認之抗原，且上方胜肽為由HLA-A24限制之SEMA5B的抗原決定位胜肽；因此，此類胜肽可有效作為細胞毒殺性T淋巴球之細胞毒性的目標抗原。
由於SEMA5B基因於癌症細胞與組織中被過度表現，包括，例如食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌的癌細胞與組織中，且在大部分正常器官中不被表現，顯示其為良好之免疫治療標的。因此，本發明提供對應來自SEMA5B之細胞毒殺性T淋巴球辨認抗原決定位的九胜肽(由九個胺基酸殘基所組成之胜肽)與十胜肽(由十個胺基酸殘基所組成之胜肽)。或者，本發明提供可誘導細胞毒殺性T淋巴球之分離胜肽，其中此些胜肽是由SEMA5B之致免疫活性片段所組成。在一些實施例中，本發明提供包括胺基酸序列擇自序列辨識號：2到69之胜肽，較佳為包括胺基酸序列擇自序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47及54之胜肽。於較佳實施例中，本發明胜肽為包括胺基酸序列擇自序列辨識號：2到69 中，特別是包括胺基酸序列擇自序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47及54中之九胜肽或十胜肽。本發明胜肽之較佳是範例為包括由擇自序列辨識號：2到69中之胺基酸序列所組成的胜肽。
一般而言，可使用現今於例如網路可得之軟體程式，例如於Parker KC et al.,J Immunol 1994,152(1)：163-75與Nielsen M et al.,Protein Sci 2003；12：1007-17中所敘述的那些，來計算in silico介於各種胜肽與HLA抗原間之結合親和力。可測量與HLA抗原之結合親和力，例如Parker KC et al.,J Immunol 1994,152(1)：163-75,Kuzushima K et al.,Blood 2001,98(6)：1872-81,Larsen MV et al.BMC Bioinformatics.2007；8：424,Buus S et al.Tissue Antigens.,62：378-84,2003,Nielsen M et al.,Protein Sci 2003；12：1007-17，及Nielsen M et al.PLoS ONE 2007；2：e796中所述，其總結於，例如，Lafuente EM et al.,Current Pharmaceutical Design,2009,15,3209-3220之中。測定親和力之方法敘述，例如於Journal of Immunological Methods(1995,185：181-190)與Protein Science(2000,9：1838-1846)中。所以熟悉此技藝人士可使用此種軟體程式來選擇源自SEMA5B且對HLA抗原具有高結合親和力之片段。因此本發明包括由源自SEMA5B之任何片段所組成之胜肽，其藉由此類已知程式來確認會與HLA抗原結合。此外，此類胜肽可包括由全長之SEMA5B序列所構成之胜肽。
本發明胜肽，特別是本發明之九胜肽與十胜肽可於側面具有額外之胺基酸殘基，只要所產生之胜肽維持其細胞 毒殺性T淋巴球誘發能力。特定之額外胺基酸殘基可由任何種類之胺基酸所組成，只要它們不減少原始胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。因此，本發明包括具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之胜肽，特別是源自SEMA5B之胜肽。此種胜肽，例如小於約40個胺基酸，時常小於約20個胺基酸與通常小於約15個胺基酸。
一般已知於胜肽中一、二、數個或多個胺基酸之修飾不影響胜肽的功能，且在些例子中，甚至增強原始胜肽所需之功能。事實上，經修飾之胜肽(即，相較於原始參考序列，由於其中1、2或數個胺基酸殘基被修飾[即，取代、加入、刪除及/或插入]之胺基酸序列所組成的胜肽)維持原始胜肽的生物活性為已知(Mark et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1984,81：5662-6；Zeller and Smith,Nucleic Acids Res 1982,10：6487-500；Dalbadie-McFarl and et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79：6409-13)。因此，於一實施例中，本發明胜肽具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力與於其中加入及/或取代一、二或甚至更多個胺基酸之擇自序列辨識號：2至69中的胺基酸序列兩者。換言之，本發明之胜肽同時具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力與於其中取代、刪除、插入及/或加入一、二或數個胺基酸之擇自序列辨識號：2至69中之胺基酸序列，較佳為於胺基酸序列擇自由序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47及54所組成之群組中，其提供維持原始胜肽細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之經修飾胜肽。
熟悉此技藝人士會認定改變單一胺基酸或整個胺 基酸序列之一小百分比的個別修飾(即，刪除、插入、加入及/或取代)至胺基酸序列傾向產生保存原始胺基酸支鏈的特性。因此，當蛋白質改變之結果為與原始蛋白質具有相似功能的經修飾蛋白質，則其一般被意指為“保守取代(conservative substitution)”或“保守修飾(conservative modification)”。提供功能相似胺基酸之保守取代表已為本技術領域所熟知。保守所需之胺基酸支鏈特徵例子包括，例如為疏水胺基酸(A,I,L,M,F,P,W,Y,V)、親水胺基酸(R,D,N,C,E,Q,G,H,K,S,T)與具有下列共同官能基或特徵之支鏈：脂肪族支鏈(G,A,V,L,I,P)；含羥基支鏈(S,T,Y)；含硫原子支鏈(C,M)；含羧酸與胺基支鏈(D,N,E,Q)；含鹼支鏈(R,K,H)；以及含芳香族支鏈(H,F,Y,W)。此外，下列八個族群各包含於本技術領域中可接受為彼此保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天門冬醯胺(N)、麩胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；以及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見，例如Creighton,Proteins 1984)。
此種經保守修飾胜肽也被視為本發明之胜肽。然而，本發明之胜肽並不限於此，且可包括非保守修飾，只要經 修飾之胜肽維持原始未修飾胜肽所必要的細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。更進一步而言，經修飾之胜肽應不排除源自SEMA5B之多形變體(polymorphic variant)、種間同質體(interspecies homologues)與對偶基因(alleles)的細胞毒殺性T淋巴球誘發的胜肽。
胺基酸殘基可被插入、取代、刪除/及或加入至本發明之胜肽，或者胺基酸殘基可被從其刪除以達到一較高之結合親和力。為了維持必須之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力，此技藝人士較佳為只修飾(即，刪除、插入、加入及/或取代)一小數目(例如，1、2或數個)或一小百分比之胺基酸。此處用語“數個”指5或更少個胺基酸，例如4或3個或更少。被修飾之胺基酸之百分比可能為，例如：30%或更少，較佳為20%或更少，更佳為15%或更少，甚至更佳為，10%或更少，例如1至5%。
當使用於癌症免疫治療之範圍時，本發明胜肽可於細胞或外吐小體之表面上被表現為與HLA抗原之複合物。因此，較佳為選擇不僅可誘導細胞毒殺性T淋巴球且對HLA抗原擁有高結合親合力之胜肽。為達成此目的，胜肽可藉由胺基酸殘基之取代、插入、刪除及/或加入來修飾以產生具有改善之HLA抗原結合親合力的經修飾胜肽。除了自然表現之胜肽外，由於藉由結合至HLA抗原來表現之胜肽序列的規則(J Immunol 1994,152：3913；Immunogenetics 1995,41：178；J Immunol 1994,155：4307)為已知，可將基於此規則之修飾引入本發明之致免疫性胜肽。
例如，具有高HLA-A24結合親和力之胜肽傾向以 苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸取代自N端的第二個胺基酸。同樣地，C末端胺基酸被以苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫胺酸取代的胜肽傾向具有高的HLA-A24結合親和力。所以，理想的是，以苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸取代自N端之第二個胺基酸，及/或以苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫胺酸取代於C末端之胺基酸，以增加HLA-A24結合親和力。因此，本發明也包含具有擇自序列辨識號：2至69中之胺基酸序列的胜肽，於其中來自序列辨識號之胺基酸序列之N端之第二個胺基酸被以苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸取代，及/或於其中序列辨識號之胺基酸序列之C末端之胺基酸被以苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫胺酸取代。又，本發明包括胜肽，其包含一胺基酸序列，於其中一、二或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加入於序列辨識號：2至69，此類胜肽具有下列特徵之任一或兩者：(a)自N端的第二個胺基酸為苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸；與(b)C末端之胺基酸為苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫胺酸。在較佳實施例中，本發明胜肽包括胺基酸序列，其在序列辨識號：2至69中之胺基酸序列中，自N端之第二個胺基酸被以苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸取代，及/或C末端之胺基酸被以苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫胺酸取代。
不止可將取代引入至末端胺基酸，也可引入至胜肽之潛在T細胞受體(TCR)辨認的位置。一些研究已證實具有胺基酸取代之胜肽可具有等同或比原來胜肽更好之功能，例如 CAP1、p53(264-272),Her-2/neu(369-377)或gp100(209-217)(Zaremba et al.Cancer Res.57,4570-4577,1997,T.K.Hoffmann et al.J Immunol.(2002)；168(3)：1338-47.,S.O.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.(2003)52：199-206 and S.O.Dionne et al.Cancer Immunology,Immunotherapy(2004)53,307-314)。
本發明也考慮一、二個或數個胺基酸的加入也可加至本發明胜肽之N及/或C端。此種具有高度HLA抗原結合親和力並保有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之經修飾的胜肽也包括於本發明中。
例如，本發明提供在長度小於15、14、13、12、11或10個胺基酸的一經分離的胜肽，其具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力且包括擇自由下列所組成之群組的胺基酸序列：(i)一胺基酸序列，其擇自由序列辨識號：2至39所組成之群組的胺基酸序列，且其1、2或數個胺基酸被修飾；及(ii)如(i)之胺基酸序列，其中此胺基酸序列具有下列特徵之一或兩者：(a)此序列辨識號之自N端的第二個胺基酸為或被修飾為擇自由苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸與色胺酸所組成之群組的一胺基酸；以及(b)此序列辨識號之C端末端胺基酸為或被修飾為擇自由苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸與甲硫胺酸所組成之群組的一胺基酸。
本發明也提供長度小於15、14、13、12或11個胺 基酸的一經分離的胜肽，其具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力且包括擇自由下列所組成之群組的胺基酸序列：(i’)胺基酸序列，其擇自由序列辨識號：40至69所組成之群組的胺基酸序列且其1、2或數個胺基酸被修飾；及(ii’)如(i’)之胺基酸序列，此胺基酸序列具有下列特徵之一或兩者：(a)此序列辨識號之自N端之第二個胺基酸為或被修飾為擇自由苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸與色胺酸所組成之群組的胺基酸；以及(b)此序列辨識號之C末端胺基酸為或被修飾為擇自由苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸與甲硫胺酸所組成之群組的胺基酸。
當這些胜肽與抗原呈現細胞接觸或被引入抗原呈現細胞，這些胜肽會在抗原呈現細胞中經過處理，以呈現擇自(i)至(ii)和(i’)至(ii’)的胜肽。
然而，當胜肽序列與具有不同功能之內生或外生蛋白質之胺基酸序列的一部份相同時，可能誘導負面副作用，例如自體免疫疾病及/或抗特定物質之過敏症候群。因此，理想的是，首先可使用可得之資料庫執行同源搜尋以避免胜肽之序列符合其他蛋白質之胺基酸序列的情況。當同源搜尋清楚顯示，於自然存在下沒有相同於目標胜肽或僅具有1或2個胺基酸不同的胜肽存在。為了增加其與HLA抗原之結合親和力，及/或增加其細胞毒殺性T淋巴球誘發能力而不具副作用之任何危險，可修飾目標胺基酸。
雖然如上述對HLA抗原具有高結合親和力的胜肽被預期為高效能，但根據高親和表現為指標所選擇之候選胜肽，將更進一步測試細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的表現。此處措辭“細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”意指當表現於抗原呈現細胞上時，胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球的能力。此外，“細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”包括胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球活化、細胞毒殺性T淋巴球增殖、促進藉由細胞毒殺性T淋巴球之目標細胞分解與增加藉由細胞毒殺性T淋巴球之IFN-γ的產生。
可藉由誘導攜帶人類MHC抗原之抗原呈現細胞(例如B-淋巴球、巨噬細胞與樹突細胞)，或更精確而言，來自人類周邊血液單核細胞之樹突細胞，並在以胜肽刺激抗原呈現細胞之後，混合抗原呈現細胞與CD8陽性T細胞以誘導細胞毒殺性T淋巴球，並接續測量由細胞毒殺性T淋巴球產生並釋放之抗目標細胞之IFN-γ，來達成細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的確定。如此反應系統，可使用已被產生來表現人類HLA之抗原基因轉殖動物(例如，於BenMohamed L,Krishnan R,Longmate J,Auge C,Low L,Primus J,Diamond DJ,Hum Immunol 2000,61(8)：764-79,Related Articles,Books,Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice：dependence on HLA class II restricted T(H)response中的描述)。或者可以51Cr放射標示目標細胞，且可由目標細胞釋放出的放射活性計算細胞毒殺性T淋巴球之細胞毒殺活性。或者，可在攜帶有固定化胜肽之細胞存在下，藉由測量由細胞毒殺性T淋巴球產生並釋放的IFN-γ，並使用抗IFN-γ 單株抗體於培養基上觀察抑制區，來評估細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。
如上述測試胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之結果，發現擇自由序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47及54所指示之胺基酸序列的九胜肽或十胜肽顯示特別高之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力及與HLA抗原之高結合親和力。因此這些胜肽被示例為本發明之較佳實施例。
此外，同源分析結果證明此種胜肽不與來自任何其他已知人類基因產物之胜肽具有顯著之同源性。當用於免疫治療時，這降低了未知或不需要之免疫反應的可能性。因此，亦源自此面向，這些胜肽對於在癌症病患中引起抗SEMA5B免疫力為有效。因此，本發明較佳包括，但不限於具有擇自由序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47及54之胺基酸序列的胜肽。
除了以上描述之修飾外，本發明胜肽也可連接其他胜肽，只要所產生之連結胜肽維持原始胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力，且更佳為也維持必要之HLA結合能力。適合之“其他”胜肽的例子包括：本發明胜肽或來自其他腫瘤相關抗原之細胞毒殺性T淋巴球誘導胜肽。本發明胜肽可經由連結子直接或間接地連結“其他”胜肽。胜肽間連結子為本技術領域所熟知，且包括，例如AAY(P.M.Daftarian et al.,J Trans Med 2007,5：26)、AAA、NKRK(序列辨識號：81)(R.P.M.Sutmuller et al.,J Immunol.2000,165：7308-7315)或K(S.Ota et al.,Can Res.62,1471-1476,K.S.Kawamura at al.,J Immunol.2002, 168：5709-5715)。
例如，也可隨後或同時使用非SEMA5B腫瘤相關抗原胜肽以增加經由HLA class I及/或HLA class II之免疫反應。癌症細胞可表現多於個腫瘤相關基因已為本技術領域所熟知。因此，熟悉此技藝人士可於例行實驗之範圍中確認特定個體是否表現額外腫瘤相關基因，故本發明藥學組合物或疫苗範圍包括源自SEMA5B此類基因之表現產物的HLA class I及/或HLA class II結合胜肽。
HLA class I與HLA class II結合胜肽之例子對熟悉此技藝人士而言是已知的(例如，參見Coulie,Stem Cells 13：393-403,1995)，且可依此處所揭露之類似方式用於本發明中。熟悉此技藝人士可使用傳統分子生物程序製備出包括一或多個SEMA5B胜肽與一或多個非SEMA5B胜肽的多胜肽，或編碼出此類多胜肽的核酸。
上述連結胜肽於此處意指為“多面體(polytope)”。即，兩個或多個潛在免疫原性(immunogenic)或免疫反應刺激胜肽的群組，胜肽可以多種排列(例如，串接或重疊)互相連接。多面體(或編碼出多面體的核酸)可根據標準免疫步驟投予至，例如：動物，以測試多面體於刺激、增強及/或引發免疫反應之功效。
胜肽可被直接連接或經由旁側序列連接以形成多面體，且多面體為疫苗之用途為本技術領域所熟知(參見，Thomson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 92(13)：5845-5849,1995；Gilbert et al.,Nature Biotechnol.15(12)：1280-1284,1997； Thomson et al.,J Immunol.157(2)：822-826,1996；Tarn et al.,J Exp.Med.171(1)：299-306,1990)。製備含有不同數目與組合之抗原決定位的多面體，並進行經細胞毒殺性T淋巴球的辨認與增加免疫反應中之功效測試。
本發明胜肽也可進一步被連接至其他物質，只要所產生之連結胜肽維持原始胜肽必要之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。適合之物質的例子包括，例如：胜肽、脂質、糖與糖鏈、乙醯基，天然與合成之聚合物等。胜肽可包含修飾，例如醣基化、支鏈氧化或磷酸化等，所提供之修飾不損壞原始胜肽之生物活性。這些種類之修飾可被執行以授予額外之功能(例如，標靶功能與傳送功能)或穩定胜肽。
例如，為了in vivo增加胜肽之穩定度，本技術領域已知引入D-胺基酸、胺基酸模仿物或非天然胺基酸；其概念也適用於本發明之胜肽。可以許多方法分析胜肽的穩定度。例如，可使用肽酶與多種生物培養基，例如人類血漿與血清，來測試穩定度(參見，例如Verhoef et al.,Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11：291-302)。
此外，如上所提到，在其中含有1、2或數個胺基酸殘基取代、刪除、插入及/或加入之經修飾的胜肽中，可篩選或選擇與原始胜肽相較具有相同或較高之活性的那些。因此本發明也提供篩選或選擇相較於原始胜肽具有相同或較高之活性的經修飾胜肽的方法。說明性之方法包括步驟：a：修飾(即，取代、刪除、插入及/或加入)至少一個本發明胜肽之胺基酸殘基， b：確定如a所述之經修飾胜肽的活性，及c：選擇相較於原始胜肽具有相同或較高之活性的胜肽。
於較佳實施例中，本發明提供一種篩選具有誘導細胞毒殺性T淋巴球之能力的胜肽的方法，該細胞毒殺性T淋巴球具有抗呈現源自SEMA5B之一片段的細胞的專一細胞毒性，其中該方法包括下列步驟：(i)提供候選序列，其由經取代、刪除、插入及/或加入一、二或數個胺基酸至原始胺基酸序列來進行修飾的胺基酸序列所組成，其中該原始胺基酸序列係擇自由序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47及54所組成之群組；(ii)選擇候選序列，其除了SEMA5B不與源自任何已知之人類基因產物具有實質顯著的同源性；(iii)將步驟(ii)中所選擇之該候選序列所組成的胜肽與抗原呈現細胞接觸；(iv)將步驟(iii)之抗原呈現細胞與CD8陽性T細胞接觸；以及(v)鑑定出其細胞毒殺性T淋巴球誘發能力相同或高於由該原始胺基酸序列所組成之胜肽的胜肽；或鑑定出具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力相同或高於由該原始胺基酸序列所組成之胜肽的胜肽。此處，要被分析之活性可包括MHC結合活性、抗原呈現細胞或細胞毒殺性T淋巴球誘發能力與細胞毒性活性。較佳而言，胜肽活性為細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。
III.SEMA5B胜肽之製備
可使用熟知之技術製備本發明之胜肽。可合成製備胜肽， 例如使用重組DNA技術或化學合成。本發明胜肽可單獨合成或合成包括兩個或多個胜肽之較長多胜肽。之後可分離此胜肽，即純化或分離以成為實質上不含其他自然發生之宿主細胞蛋白質與其片段或任何其他化學物質。
本發明胜肽可包含修飾，例如醣基化、支鏈氧化或磷酸化，其提供修飾不損壞原始胜肽之生物活性。其他示例性修飾包括D-胺基酸或其他胺基酸模仿物的合併，其可用來，例如增加胜肽之血清半衰期。
可根據經選擇之胺基酸序列的化學合成獲得本發明之胜肽。例如：適用此合成之一般胜肽合成方法包括：(i)胜肽合成(Peptide Synthesis)Interscience,New York,1966；(ii)蛋白質(The Proteins),Vol.2,Academic Press,New York,1976；(iii)胜肽合成(Peptide Synthesis)(in Japanese),Maruzen Co.,1975；(iv)胜肽合成之基礎與實驗(Basics and Experiment of Peptide Synthesis)(in Japanese),Maruzen Co.,1985；(v)藥學的發展(Development of Pharmaceuticals)(second volume)(in Japanese),Vol.14(peptide synthesis),Hirokawa,1991；(vi)WO99/67288；以及(vii)B arany G.& Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,“Solid Phase Peptide Synthesis”,Academic Press,New York,1980, 100-118。
或者，藉由採用任何已知產生胜肽之基因工程方法可獲得本發明之胜肽(例如，Morrison J,J Bacteriology 1977,132：349-51；Clark-Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology(eds.Wu et al.)1983,101：347-62)。例如，首先製備適合之載體，其懷有編碼出目標胜肽之多核苷酸於可表達的形式中(例如，調控序列的下游對應至啟動子序列)，並將載體轉殖進入適合之宿主細胞。本發明也提供這些載體及宿主細胞。之後培養宿主細胞以產生感興趣之胜肽。使用in vitro轉譯系統可in vitro產生胜肽。
IV.多核苷酸
本發明也提供多核苷酸，其編碼出任何本發明上述之胜肽。這些包括來自自然發生之SEMA5B基因[GenBank Accession No.NM_001031702、NM_001256346、NM_001256347或NM_001256348(序列辨識號：74、76、77或79)]的多核苷酸與那些具有其之保守修飾之核苷酸序列。此處措辭“保守修飾之核苷酸序列”指序列其編碼出相同或實質上相同之胺基酸序列。由於基因密碼的退化，許多功能相同之核酸編碼出任何已知蛋白質。例如，密碼GCA、GCC、GCG與GCU皆編碼出胺基酸丙胺酸。因此，於每個經密碼指定為丙胺酸的位置，均可改變為任何上述之密碼而不會改變編碼出之胜肽。此核酸變化為“沈默變化(silent variation)”，其為保守修飾變化的一種。此處所述編碼出胜肽之每個核酸序列也描述核酸其可能的每一種沈默變化。熟悉此技藝人士會明白於核酸中各密碼(除了 AUG，其原本為甲硫胺酸之唯一密碼、與TGG其原本為色胺酸之唯一密碼)可被修飾以產生功能相同分子。因此，編碼出胜肽之核酸的任一沈默變化，被暗示性描述於各揭露之序列中。
本發明之多核苷酸可由DNA、RNA與其衍生物所組成。如本技術領域所熟知，DNA適合地由鹼基所組成，例如A、T、C與G，而T於RNA中為U所取代。熟悉此技藝人士可瞭解非自然發生鹼基也可被包含於多核苷酸中。
本發明之多核苷酸可編碼出本發明之多個胜肽，其具有或不具有介於中間之胺基酸序列。例如，介於中間之胺基酸序列可提供多核苷酸或經轉譯之胜肽的裂解位(例如酵素辨認序列)。更進一步而言，本發明之多核苷酸可包括相對於編碼出本發明胜肽之編碼序列之任何額外序列。例如，本發明之多核苷酸可為重組多核苷酸，其包括胜肽表現所需之調控序列，或可為具有標誌基因與此類之表現載體(質體)。一般而言，可經由使用例如聚合酶與內切酶之一般重組技術的多核苷酸操作製備此重組多核苷酸。
重組與化學合成技術兩者均可用以產生本發明之多核苷酸。例如，可產生本發明之多核苷酸藉由插入適合之載體，當其轉染進入勝任細胞(competent cell)時可被表現。或者，使用PCR技術或表現於適合的宿主可將本發明之多核苷酸放大(參見，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)。或者，使用固態技術如於Beaucage SL & Iyer RP,Tetrahedron 1992,48：2223-311；Matthes et al.,EMBO J 1984,3： 801-5中所敘述，可合成本發明之多核苷酸。
V.外吐小體(exosomes)
本發明進一步提供稱為外吐小體的胞間囊泡(intracellular vesicles)，其呈現本發明之胜肽與人類白血球抗原間形成的複合物於其表面。例如，藉由使用於日本專利公開號JPH 11-510507與WO99/03499所詳述的方法以及使用從接受治療和/或避免之病人所得的抗原表現細胞可製備外吐小體。本發明之外吐小體可如疫苗般地接種，以相似於本發明的胜肽之方式。
包含在複合物中的人類白血球抗原形式必須與需要治療及/或預防之個體的人類白血球抗原形式相符。例如，在日本人族群中，HLA-A24，特別是HLA-A*2402為普遍的，因此適合用於日本人病患之治療。使用高度表現於日本人與高加索人之中的HLA-A24型有助於獲得有效的結果，且次型，例如HLA-A*2402也找到用途。一般在臨床上，係預先調查需接受治療之病患的人類白血球抗原形式，這可適當地選擇對此特定抗原具有高度結合親合力的胜肽或經由抗原表現具有細胞毒性T淋巴細胞誘發性的胜肽。此外，為了獲得具有高度結合親合力與細胞毒性T淋巴細胞誘發性兩者的胜肽，可以天然產生之SEMA5B部分胜肽的胺基酸序列為基礎，執行1、2或數個胺基酸的取代、插入、刪除及/或添加。
當對於本發明之外吐小體使用HLA-A24型之HLA抗原時，包括擇自序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、47與54之胺基酸序列的胜肽具有特別的效用。在一些實施 例中，本發明之外吐小體呈現HLA-A24抗原與本發明胜肽之複合物於其表面上。
VI.抗原呈現細胞(APCs)
本發明也提供經分離之抗原呈現細胞，其表現HLA抗原及本發明胜肽之間形成的複合物於其表面上。抗原呈現細胞可源自接受治療及/或預防之病患，且可單獨或結合包括本發明之胜肽、外吐小體或細胞毒殺性T淋巴球之其他藥物作為疫苗投予。
抗原呈現細胞並不限於特定種類之細胞，並包括：樹突細胞、蘭格罕細胞(Langerhans cell)、巨嗜細胞、B細胞與活化之T細胞，已知其表現蛋白質(proteinaceous)抗原於其細胞表面以被淋巴球所辨認。由於樹突細胞為典型之抗原呈現細胞，其於抗原呈現細胞中具最強之細胞毒殺性T淋巴球誘導作用，所以樹突細胞適宜用作本發明之抗原呈現細胞。
例如，藉由誘導來自周邊血液單核細胞之樹突細胞，再in vitro、ex vivp或in vivp與本發明胜肽接觸(刺激)，可獲得本發明抗原呈現細胞。當本發明之胜肽投予至個體，將於個體身體內誘導表現本發明胜肽之抗原呈現細胞。因此，將本發明之胜肽投予至個體後，自此個體收集抗原呈現細胞可獲得本發明之抗原呈現細胞。或者，將收集自個體之抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸可獲得本發明之抗原呈現細胞。
可將本發明之抗原呈現細胞單獨或結合包括本發明之胜肽、外吐小體或細胞毒殺性T淋巴球的其他藥物投予至個體以誘導於個體中之抗癌免疫反應。例如，ex vivo投予可包 括步驟：a：自第一個體收集抗原呈現細胞，b：將步驟a之抗原呈現細胞與本發明之胜肽接觸，以及c：將步驟b之抗原呈現細胞投予第二個體。
第一個體與第二個體可為相同個體，或可為不同個體。自步驟b獲得之抗原呈現細胞可經配製為疫苗並投予，以治療及/或預防癌症，例如，食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌，但不限於此。
在本發明內容中，可使用本發明之胜肽製造可誘導抗原呈現細胞之藥學組合物。本發明也提供用於製造用以誘導抗原呈現細胞之藥學組合物的方法或製程，其中此方法包括將本發明之胜肽與藥學上可接受之載體一起混合或配製的步驟。本發明也提供本發明胜肽於誘導抗原呈現細胞的用途。
根據本發明之一方面，本發明之抗原呈現細胞具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。在抗原呈現細胞之內容中，措辭“細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”意指當與CD8陽性T細胞接觸時，抗原呈現細胞誘導細胞毒殺性T淋巴球之能力。再者，“細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”包括抗原呈現細胞誘導細胞毒殺性T淋巴球活化、細胞毒殺性T淋巴球增生、促進目標細胞藉由細胞毒殺性T淋巴球之裂解與增加藉由細胞毒殺性T淋巴球之IFN-γ產生的能力。藉由包括in vitro將編碼出本發明胜肽之多核苷酸轉移至抗原呈現細胞的步驟的方法與上述之方法，可製備此種具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。此經引入之基因可為DNA或RNA形式。引入方法的例子包括於 此領域一般被執行的各種方法並無特別限制，例如：可使用脂質體轉染(lipofection)、電穿孔法(electroporation)與磷酸鈣方法。更特別地，可如Cancer Res 1996,56：5672-7；J Immunol 1998,161：5607-13；J Exp Med 1996,184：465-72；日本專利公開號2000-509281中所述執行。藉由轉移基因進入抗原呈現細胞，基因於細胞中經歷轉錄、轉譯與此類，且所獲得之蛋白質經過MHC Class I或Class II處理，並經由呈現途徑以呈現部份胜肽。或者，可藉由包含將抗原呈現細胞與本發明胜肽簡單接觸之步驟的方法來製備本發明之抗原呈現細胞。
在一些實施例中，本發明之抗原呈現細胞表現HLA-A24抗原及本發明胜肽之複合物於其表面上。
VII.細胞毒殺性T淋巴球(CTLs)
抗任何本發明胜肽之經誘導細胞毒殺性T淋巴球增強in vivo以癌症細胞為標的之免疫反應，並因此可以相似於胜肽之方式使用作為疫苗。因此本發明提供經分離之細胞毒殺性T淋巴球其經由任一本發明之胜肽專一地誘導或活化而得。
可獲得此種細胞毒殺性T淋巴球，藉由(1)將本發明胜肽投予至個體；(2)將來自個體之抗原呈現細胞與CD8陽性T細胞或周邊血液單核淋巴球與本發明之胜肽in vitro接觸(刺激)；(3)將CD8陽性T細胞或周邊血液單核淋巴球in vitro與呈現HLA抗原及胜肽之複合物於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體接觸；或(4)於CD8陽性T細胞中引入編碼出兩種T細胞受體次單元的多核苷酸或編碼出任一種T細胞受體次單元的多核苷酸，其中由這些T細胞受體次單元形成的T細胞受體可 與細胞表面上之HLA抗原及本發明胜肽之複合物結合。可由上述之方法製備此類抗原呈現細胞或外吐小體。(4)之方法被詳細敘述於下方“VIII.T細胞受體(TCR)”的段落中。
本發明細胞毒殺性T淋巴球可來自接受治療及/或預防之病患個體，且可單獨投予或為了調節作用可與包括本發明之胜肽、抗原呈現細胞或外吐小體的其他藥物結合投予。所獲得之細胞毒殺性T淋巴球對表現本發明胜肽之目標細胞起專一作用，例如：與用於誘導相同之胜肽。目標細胞可為內生性表現SEMA5B之細胞，例如癌細胞，或經SEMA5B基因轉殖之細胞；且經由胜肽刺激表現本發明胜肽於細胞表面之細胞，也可做為經活化之細胞毒殺性T淋巴球攻擊的目標。
在一些實施例中，本發明之細胞毒殺性T淋巴球可辨認表現HLA-A24抗原及本發明胜肽之複合物的細胞。在細胞毒殺性T淋巴球的內容中，措辭“辨認細胞”意指經由其TCR與細胞表面上之HLA-A24抗原及本發明胜肽之複合物結合，並顯示抗此細胞之特定細胞毒殺性T淋巴球活性。於此“特定細胞毒殺性T淋巴球活性”意指顯示抗表現HLA-A24抗原及本發明胜肽之複合物的細胞，而不抗其他細胞。因此，本發明包含細胞毒殺性T淋巴球，其顯示專一抗呈現本發明胜肽之細胞的細胞毒性。
VIII.T細胞受體(TCR)
本發明也提供組合物，其包括編碼出兩種T細胞受體次單元的一或多個多核苷酸或編碼出任一種T細胞受體次單元的多核苷酸，其中由這些T細胞受體次單元形成的T細胞受體可與細 胞表面上之HLA抗原及本發明胜肽之複合物結合。本發明也考慮其使用方法。這些T細胞受體之次單元具有能力形成T細胞受體，其授與T細胞抗表現SEMA5B之腫瘤細胞的專一性。藉由使用本技術領域已知的方法，可確認編碼出以本發明之一或多個胜肽所誘導之細胞毒殺性T淋巴球之T細胞受體次單元α-與β-支鏈的多核苷酸[WO2007/032255與Morgan et al.,J Immunol,171,3288(2003)]。例如，較佳以聚合酶鏈鎖反應方法來分析T細胞受體。用於分析之聚合酶鏈鎖反應引子可為，例如：以5’-R引子(5’-gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(序列辨識號：70)作為5’端引子與以專一於T細胞受體alpha鏈C區之3-TRa-C引子(5’-tcagctggaccacagccgcagcgt-3’)(序列辨識號：71)、專一於T細胞受體beta鏈C1區之3-TRb-C1引子(5’-tcagaaatcctttctcttgac-3’)(序列辨識號：72)或專一於T細胞受體beta鏈C2區之3-TRbeta-C2引子(5’-ctagcctctggaatcctttctctt-3’)(序列辨識號：73)作為3’端引子，但不限於此。衍生之T細胞受體具高親合力以結合表現SEMA5B胜肽之目標細胞，並於in vivo與in vitro視需要調節以有效殺死表現本發明胜肽之目標細胞。
編碼出兩種T細胞受體次單元的多核苷酸或編碼出任一種T細胞受體次單元的多核苷酸，可併入適合之載體，例如反轉錄病毒載體。這些載體為本技術領域所熟知。包含其之多核苷酸或載體可被轉移至T細胞(例如，CD8陽性T細胞)，例如來自病患之T細胞。有利地，本發明提供現成(off-the-shelf)的組合物允許快速修飾病人所擁有之T細胞(或其他哺乳動物 之那些)，以快速簡單產生具有優秀之癌症細胞殺死特性的經修飾T細胞。
抗本發明胜肽之專一T細胞受體應可專一地辨認本發明之胜肽與HLA抗原之複合物，當T細胞受體被表現於T細胞表面時，給予T細胞抗表現本發明胜肽與HLA抗原之複合物之目標細胞的專一活性。可藉由任何已知的方法確認對上述複合物的特定辨識，其較佳的例子包括：使用HLA分子與本發明胜肽之HLA多聚體染色分析(HLA multimer staining analysis)及ELISPOT分析。藉由ELISPOT分析，可確認表現T細胞受體之細胞毒殺性T淋巴球可經由T細胞受體辨識細胞，並於細胞內傳送由此辨認所產生的訊號。也可藉由已知方法，對上述複合物被表現於T細胞表面可給予T細胞毒殺活性之現象進行確認。其較佳的例子包括：例如測定對HLA陽性靶細胞之毒殺活性，像是鉻(chromium)釋放分析。
本發明也提供細胞毒殺性T淋巴球，其藉由編碼出兩種T細胞受體次單元的多核苷酸或編碼出任一種T細胞受體次單元的多核苷酸轉導所製備，其中，由此類T細胞受體次單元所形成之T細胞受體可結合至SEMA5B胜肽，例如：在HLA-A24抗原範圍之序列辨識號：2至69。
經轉導之細胞毒殺性T淋巴球可in vivo自導引至癌症細胞，且可藉由熟知的培養方法in vitro擴張[例如，Kawakami et al.,J Immunol.,142,3452-3461(1989)]。本發明細胞毒殺性T淋巴球可用來形成致免疫組合物，其對於需要治療或保護之病患的癌症治療及預防之一或兩者為有效(參見 WO2006/031221，其內容於此被引入做為參考)。
IX.藥學試劑或組合物
由於相較於正常組織，癌症中SEMA5B表現為特別提高，其例子包括但不限於：食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌，本發明之胜肽或多核苷酸可用於誘導抗癌症或腫瘤細胞之免疫反應，並因而提供治療及/或預防癌症或原位癌，及/或避免轉移或其手術後復發。因此，本發明提供藥學組合物或試劑，其配製用於癌症之治療及/或預防，及/或避免轉移或其手術後復發，此類組合物或試劑包括至少一本發明胜肽或多核苷酸作為活性成分。或者，本發明之胜肽可表現於任何前述外吐小體或細胞表面，例如：用來作為藥學組合物或試劑之抗原呈現細胞。此外，上述以本發明任一胜肽為標的之細胞毒殺性T淋巴球也可用來作為本發明藥學組合物或試劑之活性成分。
因此，本發明提供試劑或組合物，包括至少一擇自下列之活性成分：(a)本發明之胜肽；(b)於可表現之形式，編碼出本發明此種胜肽的多核苷酸；(c)本發明之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。
在藥學組合物或試劑中，這些胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞或細胞毒殺性T淋巴球是以治療有效或藥學有效之劑量存在。
本發明之藥學組合物或試劑也提供作為疫苗使用。在本發明內容中，措辭“疫苗”(也意指為“致免疫組合物”)意指試劑或組合物，其藉由接種至動物具有改善、增強及/或誘導抗腫瘤免疫力的功能。換言之，本發明提供用以於個體中誘導抗癌免疫反應之藥學試劑或組合物。
本發明之藥學組合物後試劑可用以於個體或病患中治療及/或預防癌症，及/或避免轉移或其手術後復發。此類個體之例子包括人類與任何其他哺乳動物，其包括但不限於：小鼠、大鼠、天竺鼠、兔子、貓、狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴子、狒狒與黑猩猩，特別是商業上重要動物或被馴養的動物。在一些實施例中，本發明之藥學試劑或組合物可被配製用來投予至其HLA抗原為HLA-A24之個體。
在另一實施例中，本發明也提供活性成分於製造藥學組合物或試劑之用途，此藥學組合物或試劑是用於治療及/或預防癌症或腫瘤，及/或避免轉移或其手術後復發，所述活性成分擇自：(a)本發明胜肽；(b)於可表現之形式，編碼出本發明此種胜肽的多核苷酸；(c)表現本發明之胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。
或者，本發明更提供活性成分，用於治療及/或預防癌症或腫瘤，及/或避免轉移或其手術後復發，所述活性成 分擇自：(a)本發明胜肽；(b)於可表現之形式，編碼出本發明此種胜肽的多核苷酸；(c)表現本發明之胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。
或者，本發明更提供方法或製程，用於製造治療及/或預防癌症或腫瘤，及/或避免轉移或其手術後復發的藥學組合物或試劑，其方法或製程包括將藥學上或生理上可接受之載體與活性成分一起配製的步驟，其中活性成分擇自：(a)本發明胜肽；(b)於可表現之形式，編碼出本發明此種胜肽的多核苷酸；(c)表現本發明之胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。
在另一實施例中，本發明更提供方法或製程，用於製造治療及/或預防癌症或腫瘤，及/或避免轉移或其手術後復發的藥學組合物或試劑，其方法或製程包括將藥學上或生理上可接受之載體與活性成分混合的步驟，其中活性成分擇自：(a)本發明胜肽；(b)於可表現之形式，編碼出本發明此種胜肽的多核苷酸； (c)表現本發明之胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。
在另一實施例中，本發明也提供方法，用於治療及/或預防癌症或腫瘤，及/或避免轉移或其手術後復發，其方法包括投予個體至少一活性成分的步驟，活性成分擇自：(a)本發明胜肽；(b)於可表現之形式，編碼出本發明此種胜肽的多核苷酸；(c)表現本發明之胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。
根據本發明，具有擇自序列辨識號：2至69中之胺基酸序列的胜肽顯示為HLA-A24限制之抗原決定位胜肽，或因而提供作為候選物，其可於個體中誘導強且專一之抗表現HLA-A24及SEMA5B之癌症的免疫反應。因此包括任何具有擇自序列辨識號：2至69之胺基酸序列此等胜肽的藥學組合物或試劑特別適合投予其HLA抗原為HLA-A24之個體。這些藥學組合物或試劑中之胜肽含量應可於個體中顯著有效地誘發強且專一之抗表現SEMA5B之癌症的免疫反應。同樣地，其亦適用於包含編碼出任何這些胜肽之多核苷酸(即本發明之多核苷酸)的藥學組合物或試劑。
由本發明藥學組合物或試劑治療之癌症包括有關SEMA5B之任何癌症，其包括但不限於：食道癌、非小細胞肺 癌、腎細胞癌及小細胞肺癌。
本發明藥學組合物或試劑可包括除了上述活性成分外，具有誘導細胞毒殺性T淋巴球抗癌類細胞之能力的其他胜肽、編碼出此其他胜肽之其他多核苷酸、其他表現此其他胜肽之細胞與其類似物。具有誘導細胞毒殺性T淋巴球抗癌類細胞能力的此類“其他”胜肽之例子，包括但不限於衍生自癌症專一抗原(例如：經確認之腫瘤相關抗原)之胜肽。
若需要，本發明之藥學組合物或試劑可視需要包括其他治療物質作為額外之活性成分，只要此物質不抑制本發明活性成分之抗腫瘤功效，例如：任何本發明胜肽、多核苷酸、外吐小體、細胞毒殺性T淋巴球。例如，配方可包括抗發炎物質、止痛劑、化學治療與其類似。除了包括其他治療物質於藥劑其本身中，也可將本發明之藥劑與一或多個其他藥學組合物相繼或同時投予。藥劑與藥學組合物的量依照，例如使用何種藥學組合物、要治療之疾病與投藥的計畫與方式而定。
熟悉此技藝人士可瞭解，除了此處特別提及之成分外，本發明之藥學組合物或試劑可包括本技術領域一般之其他物質，其具有關於討論中之配方形式。
在本發明一實施例中，本發明之藥學組合物或試劑可被包裝為製造商品與套組，其包含對於要被治療之疾病，例如癌症的病理情況有用之材料。製造商品可包括具有標籤之任何本發明藥學組合物或試劑的容器。適合的容器包括瓶、小瓶(vial)與試管。容器可形成自各種材料，例如玻璃或塑膠。於容器上之標籤需指出組合物或試劑為用來治療或避免疾病 之一或多個情況。標籤也可指出投藥指示等。
除了上述容器外，套組包括本發明藥學組合物或試劑可視需要更進一步包括第二容器，其儲藏藥學上可接受之稀釋液。其可更包括商業或使用者觀點需要之其他材料，包括其他緩衝溶液、稀釋液、濾器、針、注射器與具有使用說明之包裝夾帶物。
本發明藥學組合物或試劑若需要可被包裝於包(pack)或分配器，其可包括含有活性成分之一或多單位劑量形式。包裝可例如包括金屬或塑膠箔，例如泡棉箱(blister pack)。包或分配器可伴隨著投藥指示。
(1)包含胜肽作為活性成分之藥學組合物：本發明胜肽可作為藥學組合物或試劑直接投予，若需要，其可經一般配方方法所配製。在之後的例子，除了本發明胜肽外，若適合可包括載體、賦形劑與原始做為藥物使用之此類而無特別限制。此類載體的例子包括但不限於滅菌水、生理食鹽水、磷酸緩衝溶液與培養液體(culture fluid)與此類。更進一步而言，若必須，本發明藥學組合物或試劑可含安定劑、懸液劑、防腐劑、界面活性劑與此類。本發明之藥學組合物或試劑可用來抗癌目的。
可將本發明之胜肽製備成組合物，其包括兩個或更多個本發明之胜肽，以in vivo誘導細胞毒殺性T淋巴球。這些胜肽可加入雞尾酒或可使用標準技術結合彼此。例如，胜肽可化學連接或如單一融合多胜肽表現。結合之胜肽可為相同或不同。藉由投予本發明之胜肽，此胜肽經HLA抗原高密度地呈 現於抗原呈現細胞上，接著誘導對形成於呈現胜肽與HLA抗原之間的複合物專一反應的細胞毒殺性T淋巴球。或者，抗原呈現細胞(例如，樹突細胞)可從個體移出，接續以本發明胜肽刺激以獲得呈現本發明任何胜肽於其表面上之抗原呈現細胞。這些抗原呈現細胞可再投予至個體以誘導個體中之細胞毒殺性T淋巴球，且因此可增加了對腫瘤相關內皮細胞的侵犯。
包括本發明任何胜肽為活性成分之用於治療及/或預防癌症的藥學組合物或試劑也可包含佐劑以有效建立細胞免疫力。或者，本發明藥學組合物或試劑可與其他活性成分一起投予，或可配製成顆粒來投予。佐劑指化合物、物質或組成，當與具有免疫活性之蛋白質一起投予(或依次)時，其增強抗蛋白質之免疫反應。於此考慮之佐劑，包括於文獻(Clin Microbiol Rev 1994,7：277-89)中所描述的那些。適合之佐劑的例子包括但不限於磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素、IFA[佛氏不完全佐劑(Incomplete Freund's adjuvant)]、CFA[佛氏完全佐劑(Complete Freund's adjuvant)]、ISCOMatrix、GM-CSF、CpG、O/W乳劑與與其類似物。此外，可便利地使用微脂體(liposome)配方與將胜肽連結至數微米直徑小珠之細粒配方，及連結胜肽至脂質之配方。
在另一實施例中，本發明胜肽也可以藥學上可接受鹽類之形式被投予。鹽類之較佳例子包括但不限於：具有鹼金屬之鹽、具金屬之鹽、具有機鹼之鹽、具胺基(amine)之鹽、具有機酸之鹽[例如，醋酸、甲酸(formic acid)、丙酸(propionic acid)、富馬酸(fumaric acid)、馬來酸(maleic acid)、琥珀酸 (succinic acid)、酒石酸(tartaric acid)、檸檬酸(citric acid)、蘋果酸(malic acid)、草酸(oxalic acid)、苯甲酸(benzoic acid)、甲磺酸(methanesulfonic acid)等]與具無機酸之鹽[例如，鹽酸、磷酸、氫溴酸(hydrobromic acid)、硫酸、硝酸等]。如此處所使用，措辭“藥學上可接受之鹽類”意指維持化合物生物有效性與特性及獲得自與無機或有機酸或鹼，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲基磺酸(methanesulfonic acid)、乙基磺酸(ethanesulfonic acid)、對甲苯磺酸(p-toluenesulfonic acid)、水楊酸(salicylic acid)與其類似物反應的那些鹽。
在一些實施例中，本發明之藥學組合物或試劑包括啟動細胞毒殺性T淋巴球之成分。脂質已被鑑定為可in vivo啟動抗病毒抗原之細胞毒殺性T淋巴球的組成。例如，可將棕櫚酸殘基黏附至離胺酸殘基之ε-與α-胺基，並接續連結至本發明之胜肽。之後脂質胜肽可被直接投予於微胞或顆粒中、併入微脂體或乳化於佐劑中。如脂質之其他例子，當E.coli脂蛋白，例如三軟脂酸-S甘油半胱氨酰-絲氨酰基絲氨酸(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serine,P3CSS)共價附加至合適之胜肽(參見，例如Deres et al.,Nature 1989,342：561-4)，可用來啟動細胞毒殺性T淋巴球。
投藥之適合方法的例子包括但不限於口服、皮膚內、皮下、肌肉內、骨內、腹膜、靜脈內注射或此類，以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域(即，直接注射)。可執行單次投藥或藉由多次投藥追加。可將藥學或治療有效劑量之胜肽投予至需要表現SEMA5B之癌症治療的個體，或者可投 予本發明之胜肽至帶有表現SEMA5B之癌症的個體，其劑量足以誘發抗表現SEMA5B之癌症或腫瘤之細胞毒殺性T淋巴球。本發明之胜肽劑量可根據要治療之疾病、病患年紀、體重、投藥方法、與此等適當地調整，且本發明之胜肽劑量一般為0.001mg至1000mg，例如0.01mg至100mg，例如0.1mg至10mg，例如0.5mg至5mg，且可於數天至數個月投藥一次，例如：每週一次。熟悉此技藝人士可適合地選擇合適的劑量。
(2)包含多核苷酸作為活性成分之藥學組合物：本發明藥學試劑或組合物也可包含於可表達形式之編碼出本文揭露之胜肽的核酸。此處措辭“於可表達之形式中”意指多核苷酸，當引入細胞，in vivo會被表現成誘導抗腫瘤免疫力之多胜肽。在一說明實施例中，感興趣之多核苷酸的核酸序列包括對於表現多核苷酸而言必須之調控要素。可裝配多核苷酸以穩定地插入目標細胞之基因體(參見，例如敘述Thomas KR & Capecchi MR,Cell 1987,51：503-12，對於同源重組卡匣載體之敘述。參見，例如Wolff et al.,Science 1990,247：1465-8；美國專利號5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；與WO 98/04720。DNA基底之輸送技術的例子包括“裸DNA”、經促進(bupivacaine、聚合物、胜肽介導)之輸送、陽離子脂質複合物與顆粒介導之(“基因槍”)或壓力介導之傳送(參見，例如美國專利號5,922,687)。
本發明之胜肽也可藉由病毒或細菌載體來表現。表現載體的例子包括減弱之病毒宿主，例如牛痘或禽痘。此方法包括使用牛痘病毒，例如作為載體以表現編碼胜肽之核苷酸 序列。藉由引入宿主，此重組之牛痘病毒表現致免疫胜肽且因而引起免疫反應。於免疫步驟中為有效之牛痘載體與方法敘述於，例如美國專利號4,722,848。另一載體為BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG載體敘述於Stover et al.,Nature 1991,351：456-60中。對於治療投藥或免疫有用之其他多種載體，例如腺與腺病毒相關之載體、反轉錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、經解毒之炭疽毒素載體與其類似為明顯的。參見，例如Shata et al.,Mol Med Today 2000,6：66-71；Shedlock et al.,J Leukoc Biol 2000,68：793-806；Hipp et al.,In Vivo 2000,14：571-85。
多核苷酸之輸送至病患可為直接的，於其例子中，個體直接或間接暴露於攜帶多核苷酸之載體，於其例子中，細胞首先in vitro以感興趣之多核苷酸轉形，之後將細胞轉殖進入病患。此兩方法分別為已知，為in vivo與ex vivo基因治療。
基因治療之方法之大體回顧，參見Goldspiel et al.,Clinical Pharmacy 1993,12：488-505；Wu and Wu,Biotherapy 1991,3：87-95；Tolstoshev,Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993,33：573-96；Mulligan,Science 1993,260：926-32；Morgan & Anderson,Ann Rev Biochem 1993,62：191-217；Trends in Biotechnology 1993,11(5)：155-215)。應用於本發明之於重組DNA技術中一般熟知的方法被描述於Ausubel et al.,in Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY,1993；與Krieger,in Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY,1990所述。
如同胜肽之投藥，可經口服、皮膚內、皮下、靜脈內、肌肉內、骨內、及/或腹膜注射或此類執行多核苷酸之投藥，與經由全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域(例如：直接注射)。可執行單次投藥或藉由多次投藥作加強。可將藥學或治療有效劑量之多核苷酸投予至一需要表現SEMA5B之癌症治療的個體，或者可投予本發明之多核苷酸至帶有表現SEMA5B之癌症的個體，其劑量足以誘發抗表現SEMA5B之癌症或腫瘤之細胞毒殺性T淋巴球。可根據要治療之疾病、病患年紀、體重、投藥方法與此等，適當地調整於適合載體中或經編碼出本發明胜肽之多核苷酸轉形之細胞中的多核苷酸的劑量，其一般為0.001mg至1000mg，例如0.01mg至100mg，例如0.1mg至10mg，例如0.5mg至5mg，且可於每數天一次至每數個月一次投藥，例如：每週一次。熟悉此技藝人士可立即確認合適與最理想之劑量。
X.使用胜肽、外吐小體、抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球的方法
可使用本發明之胜肽與多核苷酸來製備或誘導抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球。也可使用本發明之外吐小體與抗原呈現細胞來製備或誘導細胞毒殺性T淋巴球。胜肽、多核苷酸、外吐小體與抗原呈現細胞可與任何其他化合物結合使用，只要額外之化合物不抑制胞毒殺性T淋巴球誘發能力。因此，任何上述之本發明藥學組合物或試劑可用來製備或誘導細胞毒殺性T淋巴球。除此之外，包括胜肽及多核苷酸的那些也可 用來製備誘導抗原呈現細胞，如下所解釋。
(1)誘導抗原呈現細胞的方法
本發明提供使用本發明之胜肽或多核苷酸來誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法。
本發明之方法包括in vitro、ex vivo或in vivo將抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸的步驟。例如，將抗原呈現細胞胜肽接觸ex vivo誘導抗原呈現細胞的方法可包括步驟：a：自個體收集抗原呈現細胞，以及b：將步驟a之抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸。
抗原呈現細胞並不限於特定種類之細胞，包括：樹突細胞、蘭格罕細胞(Langerhans cell)、巨嗜細胞、B細胞與活化之T細胞，已知其表現蛋白質(proteinaceous)抗原於其細胞表面以被淋巴球所辨認。較佳為，可使用樹突細胞，因抗原呈現細胞中其具有最強的細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。本發明任一胜肽可以其本身或與本發明一或多個其他胜肽及/或源自除了SEMA5B外之腫瘤相關抗原的一或多個細胞毒殺性T淋巴球誘發胜肽結合使用。
另一方面，當投予本發明胜肽至個體時，抗原呈現細胞in vivo與胜肽接觸，而於個體體內誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。因此，本發明之方法可包括投予本發明胜肽至個體以於個體體內誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的步驟。相似地，當以可表達之形式投予本發明之多核苷酸至個體時，本發明之胜肽被表現且in vivo與抗原呈現細胞接觸，而於個體體內誘導具有細胞毒 殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。因此，本發明之方法可包括投予本發明多核苷酸至個體，以於個體體內誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的步驟。“可表達之形式”被描述於上述段落“IX.藥學組合物，(2)包含多核苷酸為活性成分之藥學組合物”中。
此外，本發明之方法可包括將本發明多核苷酸引入抗原呈現細胞，以誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的步驟。例如，方法可包括步驟：a：自個體收集抗原呈現細胞；以及b：將編碼出本發明胜肽之多核苷酸引入步驟a收集到的抗原呈現細胞。
可如前述段落“VI.抗原呈現細胞”中所述來執行步驟b。
或者本發明方法可包括製備可專一誘導抗SEMA5B之細胞毒殺性T淋巴球顯示細胞毒殺活性之抗原呈現細胞的步驟，經由下列步驟之一：(a)將抗原呈現細胞與本發明胜肽in vitro、ex vivo或in vivo接觸；以及(b)將編碼出本發明胜肽之多核苷酸引入抗原呈現細胞。
或者，本發明可包括誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞，此類方法包括擇自下列之一步驟：(a)將抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸；以及(b)將編碼出本發明胜肽的多核苷酸引入抗原呈現細胞。
本發明方法可於in vitro、ex vivo或in vivo執行。本發明方法較佳可於in vitro或ex vivo執行。用於具有細胞毒殺 性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞之誘導的抗原呈現細胞，可較佳為表現HLA-A24抗原之抗原呈現細胞。此類抗原呈現細胞可藉由本技術領域中熟知的方法，從HLA抗原為HLA-A24之個體獲得的周邊血液單核細胞來製備。由本發明所誘導之抗原呈現細胞可為表現本發明胜肽與HLA抗原(HLA-A24抗原)之複合物於其表面中之抗原呈現細胞。當藉由本發明方法誘導之抗原呈現細胞被投予至個體，以於此個體中誘發抗癌症免疫反應時，個體較佳為與其抗原呈現細胞被取得者為同一個。然而，個體可與抗原呈現細胞提供者為不同一個，只要個體具有與抗原呈現細胞提供者相同之HLA型。
在另一實施例中，本發明提供用於誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的試劑或組合物，且此類試劑或組合物包括一或多個本發明之胜肽或多核苷酸。
在另一實施例中，本發明提供本發明胜肽或編碼出此胜肽之多核苷酸於製造用以誘導抗原呈現細胞之試劑或組合物中的用途。
或者，本發明更提供本發明胜肽或編碼出此胜肽之多核苷酸於誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的用途。
(2)誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法
本發明也提供使用本發明胜肽、多核苷酸、外吐小體或抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法。
本發明也提供使用編碼出兩種T細胞受體次單元的多核苷酸或編碼出任一種T細胞受體次單元的多核苷酸來誘導細胞毒 殺性T淋巴球的方法，其中，由此類T細胞受體次單元所形成之T細胞受體可辨識(結合至)細胞表面上之本發明胜肽與HLA抗原之複合物。誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法較佳包括至少一步驟擇自下列之中：a：將CD8陽性T細胞與抗原呈現細胞接觸，此抗原呈現細胞表現HLA抗原及本發明胜肽之複合物於其表面；b：將CD8陽性T細胞與外吐小體接觸，此外吐小體表現HLA抗原及本發明胜肽之複合物於其表面；以及c：將多核苷酸引入CD8陽性T細胞，其中此多核苷酸編碼出兩種T細胞受體次單元或此多核苷酸編碼出任一種T細胞受體次單元，其中由此類T細胞受體次單元所形成之T細胞受體可辨識(結合至)細胞表面上之本發明胜肽與HLA抗原之複合物。
當本發明之胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞或外吐小體被投予至個體時，將於個體體內誘導細胞毒殺性T淋巴球，並可增強以表現SEMA5B癌細胞為目標之免疫反應的強度。因此，代替前述步驟，本發明之方法可包括將本發明之胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞或外吐小體投予至個體的步驟。
或者，也可藉由ex vivo或in vivo地使用它們誘導細胞毒殺性T淋巴球，且在誘導細胞毒殺性T淋巴球後，經活化之細胞毒殺性T淋巴球可返送回個體。例如，方法可包括步驟：a：自個體收集抗原呈現細胞；b：將步驟a之抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸；以及c：將步驟b之抗原呈現細胞與CD8陽性T細胞共培養。
如於前述段落“VI.抗原呈現細胞”中所述，也可藉 由將本發明多核苷酸轉移進入抗原呈現細胞，來製備上述步驟c中與CD8陽性T細胞共培養之抗原呈現細胞，然而，本發明並不限於此，且包括任何有效表現HLA抗原及本發明胜肽之複合物於其表面上的抗原呈現細胞。
可視需要使用呈現HLA抗原及本發明胜肽之複合物於其表面上的外吐小體代替上述抗原呈現細胞。換句話說，本發明可包括將呈現HLA抗原及本發明胜肽之複合物於其表面的外吐小體與本發明胜肽共培養之步驟。此種外吐小體可藉由前述於段落“V.外吐小體”中之方法來製備。適合本發明方法之抗原呈現細胞與外吐小體呈現本發明胜肽與HLA-A24之複合物於其表面上。
此外，也可藉由將編碼出兩種T細胞受體次單元或編碼出任一種T細胞受體次單元之多核苷酸，引入CD8陽性T細胞以誘導細胞毒殺性T淋巴球，其中由此類T細胞受體次單元所形成之T細胞受體可結合至細胞表面上之本發明胜肽與HLA抗原之複合物。可如於前述段落“VIII.T細胞受體(TCR)”中所述執行此轉導。
本發明方法可於in vitro、ex vivo或in vivo執行。本發明方法較佳可於in vitro或ex vivo執行。可藉由本技術領域中熟知的方法，由得自個體的周邊血液單核細胞來製備用於誘導細胞毒殺性T淋巴球的CD8陽性T細胞。在較佳實施例中，CD8陽性T細胞的提供者可為其HLA抗原為HLA-A24之個體。藉由本發明方法所誘導之細胞毒殺性T淋巴球，其可辨認表現本發明胜肽與HLA抗原之複合物於其表面之細胞。此類細胞毒 殺性T淋巴球可對呈現本發明胜肽於其表面上之細胞表現專一細胞毒性活性，也因此可對表現SEMA5B之細胞(例如，癌細胞)表現專一細胞毒性活性。當藉由本發明方法誘導之細胞毒殺性T淋巴球被投予至個體，以在此個體中誘發抗癌症免疫反應時，此個體較佳與其CD8陽性T細胞取得者為同一個。然而，此個體可與CD8陽性T細胞提供者為不同個，只要此個體具有與CD8陽性T細胞提供者相同之HLA型。
此外，本發明也提供製造誘導細胞毒殺性T淋巴球之藥學組合物或試劑的方法或製程，其中該方法或製程包括將本發明之胜肽與藥學上接受之載體一起混合或配製的步驟。
在另一實施例中，本發明提供用於誘導細胞毒殺性T淋巴球的試劑或組合物，其中試劑或組合物包括本發明之一或多個胜肽、一或多個多核苷酸、一或多個抗原呈現細胞及/或一或多個外吐小體。在另一實施例中，本發明提供本發明胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞或外吐小體於製造配製來誘導細胞毒殺性T淋巴球之試劑或組合物中的用途。或者，本發明更提供本發明胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞或外吐小體對於在誘導細胞毒殺性T淋巴球中的用途。
XI.誘導免疫反應的方法
此外，本發明提供誘導抗SEMA5B相關疾病之免疫反應的方法。所考慮的疾病包括癌症，其例子包括但不限於：食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌。
本發明方法亦考慮投予含有任何本發明胜肽或編碼出其之多核苷酸的試劑或組合物的步驟。或者。本發明方法可包括 投予表現任何本發明胜肽之外吐小體或抗原呈現細胞的步驟。細節參見“IX.藥學組合物”之項目，特別是敘述本發明試劑或組合物為疫苗之用途的部分。此外，可被使用於本發明誘導免疫反應之方法的本發明外吐小體與抗原呈現細胞，被詳細描述在前之於“V.外吐小體”、“VI.抗原呈現細胞”與“X.使用胜肽、外吐小體、抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球的方法”之(1)與(2)的項目。
本發明也提供製造誘導免疫反應之藥學試劑或組合物的方法或製程，其中該方法可包括將本發明之胜肽與藥學上接受之載體一起混合或配製的步驟。
或者，本發明方法可包括投予本發明之疫苗或藥學組合物或試劑的步驟，本發明疫苗或藥學組合物包含：
(a)本發明胜肽；
(b)於可表現之形式，編碼出本發明胜肽的多核苷酸；
(c)表現本發明胜肽於其表面上之抗原呈現細胞
(d)表現本發明胜肽於其表面上之外吐小體；或
(e)本發明之細胞毒殺性T細胞。
在本發明內容中，可以這些活性成份治療過度表現SEMA5B之癌症。此類癌症的例子包括但不限於：食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌。因此，在包括上述任何活性成分之疫苗或藥學組合物或試劑的投予前，其較佳為確認由要被治療之個體所取得之癌細胞或組織的SEMA5B表現程度，相較得自相同個體之正常細胞或組織是否為提高的。因此，在一實施例中，本發明提供於需要個體中治療(過度)表現 SEMA5B之癌症的方法，此種方法包括步驟：i)測定獲得自具有癌症要治療之個體的生物樣本中的SEMA5B表現程度；ii)與正常控制組比較SEMA5B表現程度；以及iii)投予擇自由上述(a)至(e)所組成之群組的至少一成份至與正常控制組相較具有過度表現SEMA5B之癌症的個體。
或者，本發明也可提供包含擇自上述(a)至(e)中之群組的至少一成份的疫苗或藥學組合物，其將被投予至具有過度表現SEMA5B之癌症的個體中。換句話說，本發明更提供鑑定要以本發明胜肽治療之個體的方法，此類方法包括測定來自個體生物樣本中的SEMA5B表現程度的步驟，其中與基因之正常控制程度相較，此表現程度增加指出個體可能具有可以本發明胜肽治療之癌症。本發明治療癌症的方法將於以下更詳細敘述。
可將任何源自個體之細胞或組織用於SEMA5B表現程度之測定，只要其包括SEMA5B之目標轉錄或轉譯產物。適合樣本的例子包括，但不限於身體組織或液體、例如血液、唾液與尿液。較佳為，生物樣本包含細胞族群，其包括上皮細胞，更佳為源自個體之細胞或組織包含細胞族群，其包括上皮細胞，更佳為癌症上皮細胞或來自癌組織的上皮細胞。此外，若需要，可自所獲得之身體組織或液體純化細胞，並使用作為源自個體之樣本。
以本發明方法治療之個體較佳為哺乳類動物。說明之哺乳類動物包括，但不限於，例如，人類、非人類靈長類 動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬與牛。
根據本發明，可測定獲得自個體之生物樣本中的SEMA5B表現程度。使用本技術領域已知方法可於轉錄(核酸)產物程度測定表現程度。例如，藉由雜合方法(例如，北方雜合)使用探針可將SEMA5B的mRNA定量。可於晶片或陣列上執行偵測。較佳為使用陣列偵測SEMA5B表現程度。熟悉此技藝人士可利用SEMA5B的序列資訊製備此種探針。例如，SEMA5B的cDNA可被使用為探針。若需要，可以適合之標誌來標誌探針，例如染劑、螢光物質與同位素，且SEMA5B的表現程度可被偵測為雜合標誌的強度。
此外，藉由擴大偵測方法(amplification-based detection method)(例如，RT-PCR)使用引子可將SEMA5B的轉錄產物進行定量。根據可獲得之SEMA5B序列資訊可製備此種引子。
特別是，用於本方法之探針或引子於嚴厲(stringent)、適度嚴厲、低嚴厲條件下雜合至SEMA5B的mRNA。如此處使用，措辭“嚴厲(雜合)條件”意指在此在條件下探針或引子會雜合至目標序列，而非其他序列。嚴厲條件為序列依賴(sequence-dependent)，且在不同環境下會不同。比起較短之序列，較長序列之特定雜合於較高溫度下觀察到。一般而言，在定義之離子強度與pH下所選擇之嚴格條件的溫度為低於特定序列之熔點(Tm)約5℃。Tm為(在定義之離子強度與pH與核酸濃度下)在平衡下50%之與目標序列互補的探針雜合至目標序列之溫度。由於目標序列通常過量存在，所以於Tm， 在平衡下50%之探針被佔據。一般而言，嚴苛條件為於其中鹽濃度低於1.0M鈉離子，一般約0.01至1.0M鈉離子(或其他鹽)於pH 7.0至8.3，且對於短探針或引子(例如，10至50個核苷酸)而言溫度為至少約30℃，對於較長探針或引子而言溫度為至少約60℃。也可以添加去穩定試劑(destabilizing substances)，例如甲醯胺(formamide)來達到嚴苛條件。
本發明之探針或引子一般為實質上經純化之寡核苷酸。寡核苷酸一般包括核苷酸序列之一區域，其在嚴苛條件下雜合至至少約2000、1000、500、400、350、300、250、200、150、100、50或25包括SEMA5B序列之核酸之連續意義股(consecutive sense strand)核苷酸序列，或包括SEMA5B序列之核酸之反意義股(anti-sense strand)核苷酸序列，或這些序列之自然發生突變體。特別是，例如，在一較佳實施例中，長度為5-50b(鹼基)之寡核苷酸可被使用為用來擴大要被偵測之基因的引子。更佳為，可以具有15-30b之長度的寡核苷酸探針或引子來偵測SEMA5B基因之mRNA或cDNA。大小的範圍始於至少10個核苷酸、至少12個核苷酸、至少15個核苷酸、至少20個核苷酸、至少25個核苷酸、至少30個核苷酸，且探針與引子延伸大小始於5-10個核苷酸、10-15個核苷酸、15-20個核苷酸、20-25個核苷酸與25-30個核苷酸。在較佳實施例中，寡核苷酸探針或引子的長度可擇自15-25核苷酸。使用此種寡核苷酸探針或引子於基因偵測的分析程序、裝置或試劑為本技術領域所熟知(例如，寡核苷酸陣列或PCR)。在這些分析中，探針或引子也可包括標籤(tag)或連結子(linker)序列。此外，可以可偵測之標 誌或要被捕捉之親合配體來修飾探針或引子。或者在雜合偵測程序中，於長度具有少數百的鹼基(例如，約100-200)至少數千(kilo)(例如，約1000-2000)之鹼基的多核苷酸可用作探針(例如，北方墨點分析或cDNA微陣列分析)。
或者，可偵測SEMA5B轉譯產物鑑定要以本發明方法治療之個體。例如，可偵測SEMA5B蛋白質(序列辨識號：75、78或80)。測定作為轉錄產物之蛋白質含量的方法包括免疫分析方法，其使用抗體專一辨認此蛋白質。抗體可為單株或多株。此外，抗體之任何片段或修飾(例如嵌合型抗體(chimeric antibody)、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)可被用來偵測，只要片段或經修飾之抗體維持對SEMA5B蛋白質的結合能力。這些抗體的製備方法為本技術領域所熟知，且任何方法可被使用以製備此種抗體與其等同物(equivalent)。
如根據SEMA5B基因轉譯產物偵測SEMA5B之表現程度的另一方法，使用抗SEMA5B蛋白質之抗體經由免疫組織化學(immunohistochemical)分析可測量到染色強度。即，於此測量中，強的染色指出經增加之蛋白質的存在/程度及SEMA5B之高表現程度。
來自個體樣本之SEMA5B基因表現程度可被確認為提升的，若其表現程度較控制組程度(例如，正常細胞中的表現程度)增加，例如10%、25%、或50%，或增加至大於1.1倍、大於1.5倍、大於2.0倍、大於5.0倍、大於10.0倍或更多。
可使用預先自健康個體個體收集並儲存的樣本，在同一時間測定控制組程度與癌細胞。此外，獲得自具有癌症 要被治療之器官的非癌區域的正常細胞被使用為正常控制組。或者，根據獲得自分析先前測定之來自其疾病程度已知之個體之樣本中之SEMA5B的表現程度的結果，藉由統計方法，可測定控制組之程度。此外，控制組程度可為來自先前測試細胞之表現輪廓的資料庫。並且，根據本發明一方面於生物樣本中之SEMA5B的表現程度，可與多個控制組程度比較，控制組程度被測定自多個參考樣本。較佳為使用控制組程度測定自參考樣本，其來自組織形式相似於源自個體生物樣本之組織形式。此外，較佳為使用具有已知疾病階段之群組中的SEMA5B基因的表現程度的標準值(standard value)。標準值可獲得自本技術領域任何已知的方法。例如，平均值+/-2標準差或平均值+/-3標準差，可被使用為標準值。
本發明之內容中，測定自已知為非癌症之生物樣本的控制組程度被意指為“正常控制組程度”。另一方面，控制組程度測定自癌的生物組織，其意指為“癌的控制組程度”。可將介於樣本表現程度與控制組程度間的不同標準化至控制核酸的表現程度，例如管家基因(housekeeping gene)，根據細胞之癌症與非癌程度已知其表現程度並無不同。示範之控制基因包括，但不限於β肌動蛋白(beta-actin)、甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)與核糖蛋白P1。
當SEMA5B基因的表現程度相較於正常控制組程度為增加時，可鑑定此個體具有要經由投予本發明藥學組合物或試劑進行治療之癌症。
本發明也提供選擇使用上述本發明藥學組合物或 試劑進行癌症治療之個體的方法，此種方法包括步驟：a)測定由具有癌症個體所得之生物樣本的SEMA5B表現程度；b)將a)所測得之SEMA5B表現程度與正常控制組程度比較；c)若SEMA5B之表現程度相較於正常控制組程度為提高高的，則選擇此個體作為使用本發明藥學組合物或試劑進行癌症治療之個體。
本發明也提供診斷套組以鑑定或測定患有或罹患癌症發展風險之個體，而此癌症可使用藥學組合物或試劑進行治療，其對於評估與監控癌症免疫治療免疫的功效或應用性也是有用的。此癌症較佳為包括但不限於：食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌。更特別的是，套組較佳包括至少一用以偵測來自個體樣本之SEMA5B表現程度的試劑，此試劑可擇自下列組成之群組：(a)試劑用以偵測SEMA5B基因的mRNA；(b)試劑用以偵測SEMA5B蛋白質或其免疫活性片段；以及(c)試劑用以偵測SEMA5B蛋白質的生物活性。
適合用於SEMA5B mRNA之偵測試劑的例子可包括專一結合或辨認SEMA5B mRNA之核酸，例如，具有與SEMA5B mRNA之一部分互補的序列的寡核苷酸。這些種類之寡核苷酸示例為對SEMA5B mRNA專一之引子與探針。可根據本技術領域所熟知的方法製備這些種類之寡核苷酸。若需要， 可將用以偵測SEMA5B mRNA之試劑固定於固體基質(matrix)上。此外，套組中可包含大於一個之用以偵測SEMA5B mRNA的試劑。
另一方面，用以偵測SEMA5B蛋白質之適合試劑的例子可包括SEMA5B蛋白質的抗體。抗體可為單株或多株。此外，抗體之任何片段或修飾(例如嵌合型抗體(chimeric antibody)、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)可用來作為試劑，只要片段或經修飾之抗體維持對SEMA5B蛋白質的結合能力。製備這些用於偵測SEMA5B蛋白質之抗體的方法為本技術領域所熟知，且於本發明中可使用任何方法以製備此種抗體與其等同物(equivalent)。另外，可經由直接連接或間接標誌技術於抗體標誌訊號產生分子。標誌抗體之標誌與方法及偵測抗體與標的之結合為本技術領域所熟知，且於本發明中可使用任何標誌與方法。另外，套組中可包括多於一個之用於偵測SEMA5B蛋白質的試劑。
套組可包含多於一個之前述試劑。套組更可包括用以結合抗SEMA5B蛋白質之探針或抗SEMA5B蛋白質之抗體的固體基質與試劑、用以培養細胞之培養基與容器、正與負控制組試劑與用以偵測抗SEMA5B蛋白質之抗體的二次抗體。例如，自沒有癌症之個體所獲得的組織樣本可作為有用的控制組試劑。本發明之套組可更包括商業或使用者角度所需之其他材料，包括緩衝溶液、稀釋液、濾器、注射針、注射器與具有使用操作指南的包裝夾帶物(例如，書面、磁帶或CD-ROM等)。這些試劑或此類可保存於具標誌之容器。適合之容器包括瓶 子、小玻璃瓶(vial)與試驗試管。容器可由多樣化之材料形成，例如玻璃或塑膠。
在一實施例中，當試劑為抗SEMA5B mRNA之探針時，試劑可被固定於固體基質上，例如多孔條(porous strip)以形成至少一偵測位。多孔條之測量或偵測區可包括複數個位置，各含有核酸(探針)。測試條也可含有負及/或正控制組的位置。或者，控制組之位置可位於與測試條分離之另一條上。視需要而定，不同之偵測位可包含不同量之經固定化核酸，即一較高量位於第一偵測位中而較低含量位於後續之位置中。藉由測試樣本的加入，顯示可偵測訊號之位置數目提供樣本中SEMA5B mRNA存在量的定量指示。偵測位可被設置為任何適合之可偵測形狀且一般為橫跨測試條寬度的條狀或點狀物。
本發明之套組可更包括正控制組樣本或SEMA5B標準樣本。可經由收集SEMA5B正向樣本並分析其SEMA5B程度製備本發明之正控制組樣本。或者，可將經純化之SEMA5B蛋白質或多核苷酸加入不表現SEMA5B之細胞以形成正樣本(positive sample)或SEMA5B標準樣本。於本發明中，經純化之SEMA5B可為重組蛋白質。正控制組樣本之SEMA5B程度為，例如，大於截斷值(cut off value)。
在一實施例中，本發明更提供診斷套組，包括本發明胜肽。可診斷癌症藉由偵測得自個體之樣本(例如，血液、組織)中抗本發明胜肽之抗體。
可經由測定抗SEMA5B抗體含量與相對應之上述控制組樣本的差異來執行癌症診斷。若得自個體之樣本(例 如，血液樣本)中含有抗本發明胜肽之抗體，且抗體的量相較於正常控制組程度為大於截斷值時，此個體被懷疑罹患癌症。
在另一實施例中，本發明之診斷套組可包括本發明胜肽及與之結合的HLA分子。使用抗原胜肽與HLA分子偵測抗原專一細胞毒殺性T淋巴球的方法已被建立(例如，Altman JD et al.,Science.1996,274(5284)：94-6)。因此，本發明之胜肽與HLA分子的複合物可應用至偵測腫瘤抗原專一細胞毒殺性T淋巴球的偵測方法，藉此得以早期偵測癌症之復發及/或轉移。此外，其可用於篩選適用含有本發明胜肽為活性成分之藥物的個體，或藥物治療功效的評估。
特別是，可根據已知方法(參見，例如Altman JD et al.,Science.1996,274(5284)：94-6)，製備放射標誌之HLA分子與本發明胜肽之寡聚複合物，例如四聚體。經由使用複合物，可執行診斷，例如定量來自被懷疑罹患癌症之個體的周邊血液淋巴球(peripheral blood lymphocytes)中之抗原-胜肽專一細胞毒殺性T淋巴球。
本發明更提供使用本文敘述之胜肽抗原決定位，評估免疫反應之方法與診斷試劑。在本發明一實施例中，使用上述之HLA-A24限制胜肽作為評估或預測個體免疫反應的試劑。將免疫抗原(immunogen)與免疫活性細胞(immunocompetent)in vivo或in vitro接觸，以誘導要評估之免疫反應。在較佳實施例中，用以評估免疫反應的免疫活性細胞可選擇自周邊血液、周邊血液淋巴球(PBL)、與周邊血液單核細胞(PBMC)。收集或分離此類免疫活性細胞的方法為本技術領 域所熟知。在一些實施例中，可導致產生抗原專一細胞毒殺性T淋巴球的任何試劑可使用作為試劑，其中細胞毒殺性T淋巴球辨認與結合至胜肽抗原決定位。胜肽試劑不必被用作免疫原。用於此類分析之分析系統包括相當新近之技術發展，例如四聚體，細胞內淋巴激素(lymphokines)之染色與干擾素釋放分析或ELISPOT分析。在較佳實施例中，以胜肽試劑接觸之免疫勝任細胞可為抗原呈現細胞，其包括樹突細胞。
例如，本發明胜肽可用於四聚體染色分析評估周邊血液單核細胞，以瞭解暴露至腫瘤抗原或免疫抗原後，抗原專一細胞毒殺性T淋巴球之存在。HLA四聚體複合物可用來直接顯現抗原專一細胞毒殺性T淋巴球(參見，例如Ogg et al.,Science 279：2103-2106,1998；及Altman et al,Science 174：94-96,1996)，並測定於周邊血液單核細胞之樣本中抗原專一細胞毒殺性T淋巴球族群的頻率。可產生使用本發明胜肽之四聚體試劑如下所述：在對應之HLA重鏈與β2-微球蛋白存在下重新折疊結合至HLA之胜肽，以產生三分子複合物。在複合物中，於預先設計於蛋白質中之位置，重鏈之羧端經生物素化。之後將卵白素(streptavidin)加至複合物以形成由三分子複合物與卵白素所組成之四聚體。藉由螢光標誌卵白素的方式，四聚體可用來對抗原-專一細胞染色。之後可鑑定細胞，例如藉由流式細胞技術。此類分析可用於診斷與預後(prognostic)目的。
本發明也提供包括本發明之胜肽之評估免疫收回反應(immune recall responses)試劑(參見，例如Bertoni etal,J. Clin.Invest.100：503-513,1997與Penna et al,J Exp.Med.174：1565-1570,1991)，使用特定胜肽分析具有要被治療之癌症個體獲得之病患PBMC樣本，以瞭解抗原-專一細胞毒殺性T淋巴球的存在。藉由培養PBMC與以本發明胜肽刺激細胞可評估含單核細胞之血液樣本。在適合之培養期後，可分析經擴張之細胞族群，例如為了細胞毒殺性T淋巴球活性。
胜肽也可用作評估疫苗功效之試劑。使用例如上述方法可分析由免疫抗原接種之病患獲得的PBMC。病患經過HLA分型，且選擇辨認表現於病患中之對偶基因(allele)專一分子的胜肽抗原決定位試劑進行分析。藉由PBMC樣本中之抗原決定位-專一細胞毒殺性T淋巴球的存在，可指出疫苗之免疫抗原性(immunogenicity)。
本發明之胜肽也用來製造抗體，使用本技術領域已熟知的技術(參見，例如，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,Wiley/Greene,NY；與Antibodies A Laboratory Manual,Harlow and Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，其可有效作為診斷或監測癌症之試劑。此類抗體可包括於HLA分子內容中辨認胜肽者，即，結合至胜肽-MHC複合物的抗體。
本發明胜肽或組合物具有許多額外之用途，其中一些為此處所述。例如，本發明提供診斷或偵測以SEMA5B免疫活性胜肽數量為特徵之疾病的方法。這些方法包含測定生物樣本中SEMA5B胜肽或SEMA5B胜肽與HLA class I分子之複合物。藉由此胜肽或複合物之結合伙伴(binding partner)可測定或 偵測SEMA5B胜肽與HLA class I分子之複合物之表現程度。在一較佳實施例中，胜肽或複合物之結合伙伴為辨認且專一結合至胜肽之抗體。也可藉由使用SEMA5B引子之標準PCR放大步驟測試生物樣本中，例如腫瘤切片中之SEMA5B的表現。於此呈現腫瘤表現之例子，而更進一步揭露用於SEMA5B放大的示範條件與引子可於WO2003/27322中發現。
較佳而言，診斷方法包含將自個體分離的生物樣本與專一於SEMA5B胜肽之試劑接觸，以偵測生物樣本中SEMA5B胜肽的存在。此處所使用“接觸”意指在適合之條件下，例如，濃度、溫度、時間、離子強度，以足夠靠近試劑的方式放置生物樣本，以允許介於試劑與存在生物樣本中之SEMA5B胜肽的專一互相作用。一般而言，將試劑接觸生物樣本之條件為熟悉此技藝人士已知之條件，以促進分子及於生物樣本中其同類物(cognate)(例如，蛋白質與其受體同類物、抗體與其蛋白質抗原同類物、核酸與其互補序列同類物)之間的專一互相作用。促進分子與其同類物之間的專一互相作用的理想條件敘述於Low et al.所提出之美國專利號5,108,921。
可在in vivo或in vitro之一或兩者執行本發明之診斷方法。因此，本發明中生物樣本可位於in vivo或in vitro中。例如，生物樣本可為in vivo組織且專一於SEMA5B免疫原性多胜肽的試劑可用來偵測組織中此類分子的存在。或者，可in vitro收集或分離生物樣本(例如血液樣本、腫瘤切片、組織萃取物)。在一特別較佳實施例中，生物樣本可為含有細胞的樣本，更佳為含有自要被診斷或測試之個體收集而得的腫瘤細胞 樣本。
或者，可藉由以螢光素(fluorescein)標誌之HLA多聚複合物染色以允許直接定量抗原-專一T細胞的方法執行診斷(例如，Altman,J.D.et al.,1996,Science 274：94；Altman,J,D.et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10330)。也已提供細胞內淋巴激素(lymphokines)之染色與干擾素釋放分析或ELISPOT分析。四聚體染色、細胞內淋巴激素染色與ELISPOT分析皆顯示比一般分析靈敏至少10倍(Murali-Krishna,K.et al.,1998,Immunity 8：177；Lalvani,A.et al.,1997,J.Exp.Med.186：859；Dunbar,P.R.et al.,1998,Curr.Biol.8：413)。也可使用五聚體(例如，美國專利公開號2004-209295A)、右聚體(dextramer)(例如，WO O2/072631)、鏈聚體(streptamer)(例如，Nature medicine 6.631-637(2002))。
例如，在一些實施例中，本發明提供診斷或評估投予本發明至少一SEMA5B胜肽之個體的免疫反應的方法，此方法包括步驟：(a)在適合誘導專一於免疫原之細胞毒殺性T淋巴球的條件下，將免疫原與免疫活性細胞接觸；(b)偵測或測定於步驟(a)中所誘導之細胞毒殺性T淋巴球的誘導程度；以及(c)使個體之免疫反應與細胞毒殺性T淋巴球的誘導程度互相關連。
在本發明內容中，免疫原較佳包括(a)擇自序列辨識號：2至69之胺基酸序列中的SEMA5B胜肽、具有此種胺基酸 序列的胜肽與具有於此種胺基酸序列中有1、2或更多胺基酸取代所修飾的胜肽的至少一個。此同時，適合誘導免疫原專一之細胞毒殺性T淋巴球的條件為本技術領域所熟知。例如，可在免疫原存在下in vitro培養免疫勝任細胞，以誘導免疫原專一之細胞毒殺性T淋巴球。為了誘導免疫原專一之細胞毒殺性T淋巴球，可加入任何刺激因子於細胞培養物中。例如，IL-2為細胞毒殺性T淋巴球誘導之較佳刺激因子。
在一些實施例中，可在治療前、期間及/或後執行監測或評估以胜肽癌症治療之個體的免疫反應的步驟。一般而言，在癌症治療的程序中，一再地將免疫原性胜肽投予至要被治療的個體。例如，可每週投予免疫原性胜肽達3-10週。因此，在癌症治療程序期間，可評估或監測個體之免疫反應。或者，對於癌症治療之評估或監測的步驟可在治療程序完成時。
根據本發明，當相較於控制組，增強之免疫原專一細胞毒殺性T淋巴球誘導，指示被評估或診斷之個體對已投予之免疫原產生免疫性反應。適合用以評估免疫反應之控制組包括，例如當免疫活性細胞未與胜肽接觸或與具有除了任何SEMA5B胜肽之胺基酸序列的控制組胜肽(例如，隨機胺基酸序列)接觸時的細胞毒殺性T淋巴球的誘導程度。在一較佳實施例中，將投予至個體之各個免疫原間的免疫反應進行比較，以序列專一方式來評估個體之免疫反應。特別是，即使將一些SEMA5B胜肽的混合物投予至個體時，免疫反應將依胜肽種類改變。在此情況下，藉由將比較各個胜肽間的免疫反應，可確認出對於其個體顯示較高反應之胜肽。
XII.抗體
本發明更提供結合至本發明胜肽之抗體。較佳之抗體專一結合至本發明胜肽且不會結合(或微弱結合)至其他胜肽。或者抗體可結合至本發明胜肽與其同源物(homologs)。抗本發明胜肽之抗體可於癌症診斷與預後分析及成像方法(imaging methodologies)提供用途。相似地，此類抗體對於表現或過度表現SEMA5B程度之癌症病患，可提供其他癌症之治療、診斷，及/或預後之用途。此外，細胞內表現之抗體(例如，單鏈抗體)可提供治療效用於與SEMA5B之表現相關的癌症，與SEMA5B之表現相關的癌症例子包括但不限於：食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌。
本發明也提供SEMA5B蛋白質(序列辨識號：75、78或80)或其片段之偵測及/或定量的各種免疫活性分析，包括擇自由序列辨識號：2至69所組成之群組的胺基酸序列所組成的多胜肽。此類分析可包括一或多個具辨認及結合SEMA5B蛋白質或其片段之能力之抗SEMA5B抗體為適當的。在本發明內容中，與SEMA5B多胜肽結合之抗SEMA5B抗體，較佳為辨認多胜肽，此多胜肽為具有擇自由序列辨識號：2至69所組成之群組的胺基酸序列，尤其是序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47與54，且較佳為排除其他胜肽。可以抑制測試(inhibition test)之方式確認抗體之結合專一性。其為，在具有序列辨識號：2至69的胺基酸序列之任何多胜肽片段存在下，欲分析之抗體與全長之SEMA5B胜肽之間的結合被抑制時，其被視為專一結合片段。在本發明內容中，此類免疫分析 可於多種本技術領域熟知之免疫分析形式中執行，包括但不限於放射免疫分析(radio-immunoassays)、免疫色層分析技術(immuno-chromatgraph technique)、酵素連結免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)、酵素連結免疫螢光分析(enzyme-linked immunofluorescent assays,ELIFA)等。
本發明關於免疫但非抗體分析，也可包括T細胞致免疫性分析(immunogenicity assay)(抑制或刺激)與主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex,MHC)結合分析。此外，本發明也考慮具偵測表現SEMA5B之癌症能力的免疫成像分析，其例子包括但不限於使用本發明之經標誌的抗體的放射顯像成像(radio scintigraphic imaging)方法。此類分析提供臨床用途於表現SEMA5B之癌症偵測、監控與預後，表現SEMA5B之癌症的例子，包括但不限於，食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌。
本發明也提供結合至本發明胜肽的抗體。本發明抗體可使用於任何形式中，例如單株或多株抗體，且可更包括將動物，例如兔子，以本發明胜肽進行免疫而獲得之抗血清、所有類型之多株或單株抗體、人類抗體與由基因重組產生之人源化抗體。
作為抗原以獲得抗體之本發明胜肽可來自任何動物種類，但較佳為來自哺乳動物，例如，人類、老鼠或大鼠，更佳為人類。人類來源胜肽可自此處揭露之核苷酸或胺基酸序列獲得。
根據本發明，完整或部分本發明胜肽可做為免疫抗原。適合之部分胜肽的例子包括，例如，本發明胜肽之胺基(N)端或羧基(C)端片段。
此處，抗體被定義為與全長或片段SEMA5B胜肽反應之蛋白質。在一較佳實施例中，本發明之抗體可辨認SEMA5B胜肽片段，其具有擇自由序列辨識號：2至69所組成之群組的胺基酸序列，更精確而言為序列辨識號：2、3、4、8、9、10、13、20、40、41、47與54。合成寡胜肽的方法為本技術領域所熟知。在合成後，可在使用作為免疫抗原(immunogen)前視需要純化胜肽。在本發明內容中，寡胜肽(例如9或10員)可與載體結合或連結以增強致免疫性。鑰孔血藍蛋白(Keyhole-limpet hemocyanin,KLH)為熟知載體。結合鑰孔血藍蛋白與胜肽的方法為本技術領域所熟知。
或者，可將編碼出本發明胜肽或其片段的基因插入已知的表現載體，其之後被用於轉形宿主細胞，如於此所敘述。所需之胜肽或其片段可自宿主細胞之外部或內部藉由任何標準方法重新獲得，且後續可使用作為抗原。或者，可將表現胜肽之整個細胞或其細胞萃出物或化學合成胜肽使用為抗原。
可以抗原對任何哺乳動物進行免疫，但較佳應考慮與用以細胞融合之親代細胞的相容性。一般而言可使用囓齒目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或靈長目(Primate)。囓齒目家族的動物包括，例如小鼠、大鼠與倉鼠。兔形目家族的動物包括，例如兔子。靈長目家族的動物包括，例如狹鼻類(舊世界猴)猴子，例如馬來猴(Macaca fascicularis)、獼猴(rhesus monkey)、聖狒狒(sacred baboon)與黑猩猩(chimpanzees)。
以抗原免疫動物之方法為本技術領域所熟知。抗原腹腔內注射(intraperitoneal injection)或皮下注射(subcutaneous injection)為免疫哺乳動物之標準方法。更特別地，可將抗原稀釋或懸浮於適量的磷酸鹽緩衝溶液、生理食鹽水等。若需要，可將抗原懸浮液與適量之標準佐劑，例如佛氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)混合，製成乳狀液(emulsion)並且之後投予至哺乳動物。較佳為接著每4至21天投予與適量之佛氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant)混合的抗原。也可使用適合之載體來免疫。於上述免疫後，可以標準方法檢驗血清以瞭解所欲抗體之增加量。
藉由收集經檢驗血清中所需抗體增加之免疫動物的血液，並經任何一般方法自血液分離血清，可製備抗本發明胜肽之多株抗體。多株抗體可包括含多株抗體的血清，與自血清分離而含有多株抗體之部分(fraction)。可自僅辨認本發明胜肽之部分純化免疫球蛋白G或M，使用例如與本發明胜肽結合之親合管柱，且更進一步使用蛋白質A或蛋白質G管柱純化此部分。
為製備使用於本發明內容中之單株抗體，如上所述自經抗原免疫並確認其血清中所需抗體增加程度的哺乳動物收集免疫細胞且使免疫細胞經過細胞融合。用來細胞融合之免疫細胞，較佳可獲自脾臟。其他與上述免疫細胞融合之親代細胞包括，例如，哺乳動物之骨髓瘤(myeloma)，且較佳為經藥物篩選融合細胞而具有獲得特性的骨髓瘤細胞。
可根據已知方法將上述免疫細胞與骨髓瘤細胞融合，例如Milstein et al.(Galfre and Milstein,Methods Enzymol 73：3-46(1981))的方法。
經細胞融合產生的融合瘤，可藉由將它們培養於標準篩選培養基，例如HAT培養基(含亞黃嘌呤(hypoxanthine)、氨蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶(thymidine)之培養基)進行篩選。細胞通常持續培養於HAT培養基數天至數週，其時間應足以使所需融合瘤(非融合細胞)外之其他細胞死亡。之後，可執行標準限制稀釋以篩選並複製產生所需抗體之融合瘤。
除了上述以抗原免疫非人類動物製備融合瘤的方法，可以胜肽、表現胜肽之細胞或其細胞萃取物in vitro免疫人類淋巴細胞，例如被EB病毒感染的那些。之後，可將經免疫之淋巴細胞與具不明確分裂能力之來自人類之骨髓瘤，例如U266融合，以得到產生所需人類抗體之融合瘤，所需之人類抗體可與被獲得之胜肽結合(日本專利申請號JPS 63-17688)。
所獲得之融合瘤可接著被轉植進入小鼠之腹腔且萃取腹水。可純化所獲得之單株抗體，藉由例如硫酸銨沉澱、蛋白質A或蛋白質G管柱、DEAE離子交換色層分析或與本發明胜肽結合之親和管柱。本發明之抗體不只可用來純化與偵測本發明胜肽，也可作為本發明胜肽之促進劑與拮抗劑的候選物。
或者，產生抗體之免疫細胞，例如經免疫之淋巴細胞可藉由致癌基因永生化並用來製備單株抗體。
也可使用基因工程技術來重組製備因此獲得之單株抗體 [參見，例如Borrebaeck and Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodies,published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990)]。例如，編碼出抗體的DNA可自免疫細胞，例如產生抗體之融合瘤或經免疫的淋巴細胞被複製，插入適合之載體，並引入宿主細胞以製備重組抗體。本發明也提供如上述製備之重組抗體。
本發明抗體可為抗體片段或經修飾之抗體，只要其結合一或多個本發明之胜肽。例如，抗體片段可為Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv(scFv)，於其中來自重與輕鏈的Fv片段藉由合適的連結子來連接[Huston et al.,Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988)]。更精確而言，藉由以酵素例如木瓜酵素或胃蛋白酶處理抗體可產生抗體片段。或者，編碼出抗體之基因可被構築、插入表現載體且表現於適合的宿主細胞中(參見，例如Co et al.,J Immunol 152：2968-76(1994)；Better and Horwitz,Methods Enzymol 178：476-96(1989)；Pluckthun and Skerra,Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi,Methods Enzymol 121：652-63(1986)；Rousseaux et al.,Methods Enzymol 121：663-9(1986)；Bird and Walker,Trends Biotechnol 9：132-7(1991))。
可修飾抗體藉由與各種分子，例如聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)結合。本發明提供此類經修飾之抗體。藉由化學修飾抗體可獲得經修飾之抗體。這些修飾方法為本技術領域中所常見。
或者，本發明之抗體可被獲得為嵌合抗體，介於 來自非人抗體之可變區與來自人類抗體之固定區之間，或為人源化抗體，包括來自非人抗體之互補決定區(CDR)、框架區(frame work region,FR)與來自人類抗體之固定區。可根據已知方法製備此類抗體。藉由齧齒類互補決定區之序列取代人類抗體對應之互補序列進行人源化[參見，例如Verhoeyen et al.,Science 239：1534-1536(1988)]。因此，此類人源化抗體為嵌合抗體，其中實質上少於完整之人類可變區已被來自非人種類之對應序列取代。
也可使用包括除了框架區與固定區尚有人類可變區的全人類抗體。使用各種本技術領域所知的技術可產生此類抗體。例如，in vitro方法包括使用於噬菌體上呈現人類抗體片段的重組資料庫[例如，Hoogenboom & Winter,J.Mol.Biol.227：381(1991)]。相似地，可藉由將人類免疫球蛋白基因座(loci)引入轉殖動物，例如內生免疫球蛋白基因已被部分或完全去活化的小鼠，製造人類抗體。此方法被敘述，例如於美國專利號6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。
自上述獲得之抗體可被純化至同質(homogeneity)。例如，根據用於一般蛋白質的分離與純化方法可執行抗體之分離與純化。例如，藉由合適地選擇與結合管柱色層分析，例如親合管柱、過濾、超過濾、鹽析、透析、對鈉十二烷基的硫酸鹽聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis)、等電焦集法(isoelectric focusing)的使用可分開與分離抗體[Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]，但不限於此。蛋白質A管柱與蛋白質G管柱可被使用為親合管柱。可使用之示範蛋白質A管柱包括，例如Hyper D、POROS與Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了親合色層分析(chromatography)，適合之色層分析技術的例子包括，例如離子交換色層分析、疏水色層分析、膠體過濾、逆向色層分析、吸附色層分析等[Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)]藉由液相色層分析，例如HPLC與FPLC可執行色層分析步驟。
例如，可使用吸收之測量、酵素連結免疫吸附分析(ELISA)、酵素免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)及/或免疫螢光以測量本發明抗體之抗原結合活性。在酵素連結免疫吸附分析中，本發明抗體為固定於培養盤上，施加本發明胜肽至培養盤，且之後施加含所需抗體之樣本，如，施加產生抗體之細胞的培養懸浮液或經純化的抗體。之後，施加辨認第一抗體且被標誌酵素之第二抗體，例如鹼性磷酸酶，再接續培養培養盤。接著在清洗後，將酵素受質，例如對硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate)，加至培養盤，並測量吸收以評估樣本之抗原結合活性。胜肽之片段，例如C端或N端之片段可用作抗原以評估抗體結合活性。根據本發明，可使用BIAcore(Pharmacia)來評估抗體的活性。
上述方法藉由暴露本發明抗體至假定含本發明胜 肽之樣本並偵測或測量由抗體與胜肽所形成之免疫複合物，得以偵測或測量本發明胜肽。
由於根據本發明之胜肽偵測或測量方法可專一偵測或測量胜肽，其在各種使用胜肽之實驗中為有用的。
XIII.載體與宿主細胞
本發明也提供載體與宿主細胞，於其中引入編碼出本發明胜肽之多核苷酸。本發明之載體於宿主細胞中提供效用為本發明核苷酸，特別是DNA，之攜帶體(carrier)以表現本發明胜肽，或於基因治療中用以投予本發明多核苷酸。
當E.coli被選擇為宿主細胞且載體被放大並大量於E.coli(例如，JM109、DH5 alpha、HB101或XL1Blue)中製造時，載體應具有適合於E.coli中放大之“ori”與適合篩選轉形E.coli之標誌基因[例如，藉由例如安比西林(ampicillin)、四環黴素(tetracycline)、卡那黴素(kanamycin)、氯黴素(chloramphenicol)或類似物之藥物篩選之抗藥基因]。例如，可使用M13-系列載體、pUC-系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。此外，pGEM-T、pDIRECT與pT7也可被用來次複製與萃取cDNA及上述載體。當載體用以生產本發明蛋白質時，表現載體可提供效用。例如，要被表現於E.coli中之表現載體應具有上述特徵以於E.coli中被放大。當使用E.coli，例如JM109、DH5 alpha、HB101或XL1 Blue為宿主細胞時，載體應具有啟動子(promoter)，例如lacZ啟動子[Ward et al.,Nature 341：544-6(1989)；FASEB J 6：2422-7(1992)],araB promoter[Better et al.,Science 240：1041-3(1988)]、T7啟動子或類似 物，其可於E.coli.中有效表現所需基因。考慮此面向，可使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia),"QIAexpress system"(Qiagen)、pEGFP與pET(於此例子，宿主較佳為BL21，其表現T7 RNA聚合酶)，取代上述載體。另外，載體也可含用於胜肽分泌之訊號序列。引導要被分泌之胜肽至E.coli的胞膜間區(periplasm)的示範訊號序列為pelB訊號序列[Lei et al.,J Bacteriol 169：4379(1987)]。將載體引入目標宿主細胞的方式包括，例如，氯化鈣方法與電穿孔(electroporation)方法。
除了E.coli，例如來自哺乳動物之表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen)與pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)：5322(1990)),pEF,pCDM8)、來自昆蟲細胞之表現載體(例如，"Bac-to-BAC桿狀病毒表現系統(baculovirus expression system)"(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、來自植物之表現載體(例如，pMH1、pMH2)、來自動物病毒之表現載體(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)、來自反轉錄病毒之表現載體(例如，pZIpneo)、來自酵母菌之表現載體(例如，"Pichia Expression Kit"(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)與來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)之表現載體(例如，pPL608,pKTH50)可被用來產生本發明之多胜肽。
為了於動物細胞，例如CHO、COS或NIH3T3細胞中表現載體，載體應具有表現於此類細胞中所必須的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan et al.,Nature 277：108(1979))、MMLV-LTR啟動子、EF1 alpha啟動子(Mizushima et al.,Nucleic Acids Res 18：5322(1990))、CMV啟動子等，與篩選轉形物的 標誌基因(例如藉由藥物(例如，新黴素(neomycin)、G418)篩選之抗藥基因較佳。具有這些載體特徵之已知載體的例子包括，例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV與pOP13。
於此之後，本發明將以實施例更詳細描述。然而，儘管下述材料方法與例子可用來協助熟悉此技藝人士製造與使用本發明之特定實施例，然而其僅意圖用以說明本發明之態樣，且不因此限制本發明之範圍。熟悉此技藝人士將認可相似或等同於在此敘述的方法與材料可用於本發明之實施或測試中。
實驗1
材料與方法 細胞株
TISI、HLA-A*2402陽性B淋巴母細胞株是購自IHWG Cell 及Gene Bank(Seattle,WA)。COS7、非洲綠猴腎細胞株是購自ATCC。
衍生自SEMA5B之胜肽的候選物選擇
使用結合預測軟體“BIMAS”(http：//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind)(Parker et al.(J Immunol 1994,152(1)：163-75),Kuzushima et al.(Blood 2001,98(6)：1872-81)及“NetMHC3.2”(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)(Buus et al.(Tissue Antigens.,62：378-84,2003),Nielsen et al.(Protein Sci.,12：1007-17,2003,Bioinformatics,20(9)：1388-97,2004))預測結合至HLA-A*2402分子之衍生自SEM5B的9員與10員胜肽。這 些胜肽係根據標準固相合成方法，由Biosynthesis(Lewisville,Texas)所合成，且經由逆相高效能液相層析(reversed phase high performance liquid chromatography,HPLC)來純化。分別藉由分析型HPLC與質譜分析確認這些胜肽的純度(>90%)與身份(identity)。將胜肽以20mg/ml之濃度溶解於二甲基亞碸(dimethylsulfoxide,DMSO)並儲存於-80℃下。
體外(In vitro)細胞毒殺性T淋巴球誘導
使用源自單核白血球之樹突細胞做為抗原呈現細胞以誘導細胞毒殺性T淋巴球，此細胞毒殺性T淋巴球可對於表現於人類白血球組織抗原(HLA)上之胜肽反應。如別處(Nakahara S et al.,Cancer Res 2003 Jul 15,63(14)：4112-8)所述於體外產生樹突細胞。特別地，藉由使經由Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液分離自正常自願者(HLA-A*2402陽性)之周邊血液單核白血球貼附至塑膠組織培養盤(Becton Dickinson)來分離並使其富集(enrich)成單核白血球組分(fraction)。將富集之單核白血球族群(population)在1000IU/ml之顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)(R&D System)及1000IU/ml之白細胞介素(interleukin,IL)-4(R&D System)存在下，於含2%熱去活化自體血清(autologous serum,AS)之AIM-V培養基(Invitrogen)中培養。培養7天後，於AIM-V培養基中，在3μg/ml之β-2微球蛋白(beta 2-microglobulin)存在下，於37℃，以20μg/ml之各合成胜肽脈衝(pulsed)細胞激素誘導之樹突細胞3小時。其所產生的細胞顯示了表現樹突細胞相關分子，例如，CD80、CD83、CD86與HLA Class II於其細胞表面(資料未顯示)。接著，經X-射線(20 Gy)照射將這些胜肽脈衝之樹突細胞去活性並以1：20之比例與自體CD8陽性T細胞混合，其中CD8陽性T細胞係藉由CD8 Positive Isolation Kit(Dynal)之正選擇獲得。將這些培養物設置於48孔盤(Corning)中；各孔中有1.5 x 104胜肽脈衝之樹突細胞、3 x 105 CD8陽性T細胞及10ng/ml之IL-7(R&D System)於0.5ml之AIM-V/2%自體血清培養基中。三天後，以IL-2(CHIRON)添加至這些培養物至終濃度20IU/ml。在第7天與第14天，以自體胜肽脈衝之樹突細胞更進一步刺激T細胞。每次均以與上述相同之方法製備樹突細胞。在第21天，於第三輪胜肽刺激後，進行細胞毒殺性T淋巴球抗胜肽脈衝之TISI細胞測試(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1)：94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8)：1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8)：498-506)。
細胞毒殺性T淋巴球擴增步驟
使用與Riddell et al.(Walter EA et al.,N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16)：1038-44；Riddell SR et al.,Nat Med 1996 Feb,2(2)：216-23)所述之相似方法於培養中擴增細胞毒殺性T淋巴球。將總數為5 x 104之細胞毒殺性T淋巴球懸浮於25ml之含有兩種人類B類淋巴母細胞株的AIM-V/5%自體血清培養基中，在40ng/ml抗-CD3單株抗體(Pharmingen)存在下，經由絲裂黴素C(Mitomycin-C)去活化。開始培養1天後，將120IU/ml之IL-2 加入培養物中。於第5、8、11天供給培養物含30IU/ml之IL-2的新鮮AIM-V/5%自體血清培養基(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1)：94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8)：1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8)：498-506)。
細胞毒殺性T淋巴球複製(clone)之建立
進行稀釋，使96孔圓底(round-bottomed)微孔盤(Nalge Nunc International)中具有0.3、1及3個細胞毒殺性T淋巴球/孔。細胞毒殺性T淋巴球以於總量為150μl/孔之含5%自體血清的AIM-V培養基中的1 x 104細胞/孔之兩種人類B類淋巴母細胞株、30ng/ml之抗-CD3抗體與125IU/ml之IL-2培養。10天後將50μl/well之IL-2加入培養基中以達到125IU/ml IL-2之最終濃度。於第14天測試細胞毒殺性T淋巴球之活性，且使用上述相同方法擴增細胞毒殺性T淋巴球複製(Uchida N etal.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8)：498-506)。
專一之細胞毒殺性T淋巴球活性
為了測試專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，執行IFN-γ酵素結合免疫斑點(ELISPOT)分析與IFN-γ酵素結合免疫吸附(ELISA)分析。製備胜肽脈衝之TISI細胞(1 x 104/孔)作為刺激細胞(stimulator cell)。使用培養於48孔盤之細胞作為應答細胞 (responder cell)。根據製造商程序執行IFN-γ酵素結合免疫斑點分析與IFN-γ酵素結合免疫吸附分析。
強力表現目標基因與HLA-A24任一或兩者的細胞之建立
藉由PCR將編碼出目標基因的開放讀框或HLA-A*2402之互補去氧核糖核酸(cDNA)放大。將PCR放大產物選殖進入表現載體。根據製造商建議流程，使用lipofectamine 2000(Invitrogen)將質體轉染至COS7，其為目標基因及HLA-A*2402無效細胞株。於轉染後2天，以versene(Invitrogen)收集經轉染的細胞，並用以作為細胞毒殺性T淋巴球活性分析之刺激細胞(5 x 104細胞/孔)。
結果
癌症中增強之SEMA5B表現
使用c-DNA微陣列獲得自各種癌症之廣泛基因表現概況(profile)顯示，相較於對應之正常組織，於癌症組織中SEMA5B(GenBank Accession No.NM_001031702，序列辨識號：74)表現被專一地提升。於2個食道癌中有1個、1個非小細胞肺癌中有1個、17個腎細胞癌中有14個與4個小細胞肺癌中4個，有效地提升SEMA5B表現(表1)
表1、相較於正常對應組織，於癌症組織中觀察到SEMA5B向上調控之案例比例
源自SEMA5B之HLA-A24結合胜肽的預測
表2a和2b以高結合親和力之順序顯示SEMA5B之9員與10員胜肽的HLA-A24結合。選擇總共69個具有潛在HLA-A24結合能力之胜肽並進行試驗以確定抗原決定位胜肽。
以源自SEMA5B之HLA-A*2402限制的預測胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘導
根據“材料與方法”敘述之步驟產生用於源自SEMA5B之胜肽的細胞毒殺性T淋巴球。藉由IFN-γ酵素結合免疫斑點分析偵測胜肽專一細胞毒殺性T淋巴球活性(第1a-1圖)。相較於控制組孔洞，具有SEMA5B-A24-9-512(序列辨識號：2)之孔洞編號#7(a)、具有SEMA5B-A24-9-1010(序列辨識號：3)之孔洞編號#3(b)、具有SEMA5B-A24-9-196(序列辨識號：4)之孔洞編號#3(c)、具有SEMA5B-A24-9-723(序列辨識號：8)之孔洞編號#4(d)、具有SEMA5B-A24-9-280(序列辨識號：9)之孔洞編號#5(e)、具有SEMA5B-A24-9-293(序列辨識號：10)之孔洞編號#3(f)、具有SEMA5B-A24-9-470(序列辨識號：13)之孔洞編號#6(g)、具有SEMA5B-A24-9-558(序列辨識號：20)之孔洞編號#3(h)、具有SEMA5B-A24-10-354(序列辨識號：40)之孔洞編號#4(i)、具有SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)之孔洞編號#6(j)、具有SEMA5B-A24-10-1044(序列辨識號：47)之孔 洞編號#5(k)及具有SEMA5B-A24-10-489(序列辨識號：54)之孔洞編號#4(l)顯示強效之IFN-γ產生。另一方面，以顯示於表2a與2b中之其他胜肽的刺激，儘管那些胜肽具有與HLA-A*2402之可能結合活性，卻沒有偵測到專一之細胞毒殺性T淋巴球活性。作為典型之負控制資料(negative data)，從以SEMA5B-A24-9-247(序列辨識號：1)(m)刺激之細胞毒殺性T淋巴球沒有觀察到專一IFN-γ的產生。總而言之，這些結果建議源自SEMA5B之12個入選胜肽可誘導強力之細胞毒殺性T淋巴球。
抗SEMA5B衍生胜肽之細胞毒殺性T淋巴球細胞株及其複製的建立
在具有SEMA5B-A24-9-512(序列辨識號：2)之孔洞編號#7之、具有SEMA5B-A24-9-1010(序列辨識號：3)之孔洞編號#3、具有SEMA5B-A24-9-293(序列辨識號：10)之孔洞編號#3及具有SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)之孔洞編號#6中顯示藉由IFN-γ酵素結合免疫斑點分析所偵測之胜肽專一細胞毒殺性T淋巴球活性的細胞，被擴張並建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株。藉由IFN-γ酵素結合免疫吸附分析來測量這些細胞毒殺性T淋巴球細胞株的細胞毒殺性T淋巴球活性(第2圖)。相較於無胜肽脈衝之目標細胞，細胞毒殺性T淋巴球細胞株對於使用SEMA5B-A24-9-512(序列辨識號：2)(a)、SEMA5B-A24-9-1010(序列辨識號：3)(b)、SEMA5B-A24-9-293(序列辨識號：10)(c)及SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)(d)脈衝後之目標細胞展現強效的IFN-γ產生。此外，如“材料與方法”所述，經由 細胞毒殺性T淋巴球細胞株之限制稀釋建立細胞毒殺性T淋巴球複製，且藉由IFN-γ酵素結合免疫吸附分析測量由細胞毒殺性T淋巴球複製抗經胜肽脈衝之目標細胞所產生的IFN-γ。自以SEMA5B-A24-9-512(序列辨識號：2)(a)、SEMA5B-A24-9-1010(序列辨識號：3)(b)及SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)(c)刺激之細胞毒殺性T淋巴球複製觀察到強效的IFN-γ產生(第3圖)
抗表現SEMA5B與HLA-A*2402之目標細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性
檢驗所建立之提升抗SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)胜肽的細胞毒殺性T淋巴球株，對於辨認表現SEMA5B與HLA-A*2402分子之目標細胞的能力。經全長之SEMA5B與HLA-A*2402基因兩者轉染(對於表現SEMA5B與HLA-A*2402基因之目標細胞的特定模式)的COS7細胞被製備做為刺激細胞，且以經全長之SEMA5B或HLA-A*2402之任一轉染的COS7細胞做為控制組。在第4圖中，以SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)刺激之細胞毒殺性T淋巴球株顯示抗表現SEMA5B與HLA-A*2402兩者之COS7細胞的強效細胞毒殺性T淋巴球活性。另一方面，控制組沒有偵測到顯著專一的細胞毒殺性T淋巴球活性。因此，此資料清楚證明SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)胜肽被內化處理(endogeneously processed)並表現於具有HLA-A*2402分子之目標細胞上，而被細胞毒殺性T淋巴球所辨認。這些結果指出，此源自SEMA5B之胜肽可提供應用於具有SEMA5B表現之腫瘤的病患所需之癌症疫苗。
抗原胜肽之同源性分析
經SEMA5B-A24-9-512(序列辨識號：2)、SEMA5B-A24-9-1010(序列辨識號：3)、SEMA5B-A24-9-196(序列辨識號：4)、SEMA5B-A24-9-723(序列辨識號：8)、SEMA5B-A24-9-280(序列辨識號：9)、SEMA5B-A24-9-293(序列辨識號：10)、SEMA5B-A24-9-470(序列辨識號：13)、SEMA5B-A24-9-558(序列辨識號：20)、SEMA5B-A24-10-354(序列辨識號：40)、SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)、SEMA5B-A24-10-1044(序列辨識號：47)及SEMA5B-A24-10-489(序列辨識號：54)刺激之細胞毒殺性T淋巴球顯示顯著且專一之細胞毒殺性T淋巴球活性。這些結果可能是起因於SEMA5B-A24-9-512(序列辨識號：2)、SEMA5B-A24-9-1010(序列辨識號：3)、SEMA5B-A24-9-196(序列辨識號：4)、SEMA5B-A24-9-723(序列辨識號：8)、SEMA5B-A24-9-280(序列辨識號：9)、SEMA5B-A24-9-293(序列辨識號：10)、SEMA5B-A24-9-470(序列辨識號：13)、SEMA5B-A24-9-558(序列辨識號：20)、SEMA5B-A24-10-354(序列辨識號：40)、SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)、SEMA5B-A24-10-1044(序列辨識號：47)及SEMA5B-A24-10-489(序列辨識號：54)的序列為同源於源自其他分子的胜肽之事實，上述其他分子為已知對人類免疫系統敏感之其他分子。為了排除此可能性，使用如BLAST演算法(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)查詢，對這些胜肽序列進行同源性分析，其結果顯示沒有序列具有顯著之同源性。這 些同源性分析結果顯示SEMA5B-A24-9-512(序列辨識號：2)、SEMA5B-A24-9-1010(序列辨識號：3)、SEMA5B-A24-9-196(序列辨識號：4)、SEMA5B-A24-9-723(序列辨識號：8)、SEMA5B-A24-9-280(序列辨識號：9)、SEMA5B-A24-9-293(序列辨識號：10)、SEMA5B-A24-9-470(序列辨識號：13)、SEMA5B-A24-9-558(序列辨識號：20)、SEMA5B-A24-10-354(序列辨識號：40)、SEMA5B-A24-10-290(序列辨識號：41)、SEMA5B-A24-10-1044(序列辨識號：47)及SEMA5B-A24-10-489(序列辨識號：54)之序列為獨特的，且因此，根據我們最佳的了解，這些分子只有很小可能性對於一些非相關分子提高非預期之免疫反應。
總結而言，在此所鑑定出之源自SEMA5B的新穎HLA-A*2402抗原決定位胜肽，可於癌症免疫治療之領域中提供效用。
[產業利用性]
本發明提供源自SEMA5B之新抗原決定位胜肽，其可誘導強力且專一的抗腫瘤免疫反應，並可應用於廣泛多樣化之癌症形式。此胜肽可用以作為抗與SEMA5B相關疾病的胜肽疫苗，其疾病例如：癌症，更精確而言為，食道癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌。
由於本發明於此做了詳盡描述並提及其特定實施例，因此，需瞭解的是，前述敘述之本質為示例與解釋並意圖說明本發明與其較佳實施例。熟悉此技藝人士當可瞭解，在不脫離本發明之精神下，可透過例行實驗實行各種改變與修飾， 因此，本發明之邊界與範圍當由所附申請專利範圍來定義。
<110> 腫瘤療法．科學股份有限公司
<120> SEMA5B胜肽與含此之疫苗
<130> ONC-A1214-TW
<150> US 61/733,279
<151> 2012-12-04
<160> 81
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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Claims (19)

  1. 一種經分離的胜肽，其長度小於15個胺基酸並具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力，其中該胜肽包括下列(a)或(b)之一胺基酸序列：(a)一胺基酸序列，其擇自由序列辨識號：41、2、3、4、8、9、10、13、20、40、47與54所組成之群組。(b)一胺基酸序列，其擇自由序列辨識號：41、2、3、4、8、9、10、13、20、40、47與54所組成之群組，且於其中1、2或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加入之。
  2. 如申請專利範圍第1項所述經分離的胜肽，其中該胜肽具有下述特徵之一或兩項：(a)其自N端的第二個胺基酸為苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸；以及(b)其C端的末端氨基酸為苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫胺酸。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述經分離的胜肽，其中該胜肽為九胜肽或十胜肽。
  4. 一種經分離之多核苷酸，其編碼出如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽。
  5. 一種誘導細胞毒殺性T淋巴球之組合物，其中該組合物包括至少一活性成份擇自以下所組成之群組：(a)如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽；(b)如申請專利範圍第4項所述之多核苷酸；(c)一抗原呈現細胞，其表現如申請專利範圍第1至3項之 任一項所述之胜肽於其表面上；以及(d)一外吐小體，其表現如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽於其表面上。
  6. 一種藥物組合物，用於癌症之治療及/或預防、及/或防止其術後復發，其中該組合物包括至少一種活性成份擇自以下所組成之群組：(a)如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽；(b)如申請專利範圍第4項所述之多核苷酸；(c)一抗原呈現細胞，其表現如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽於其表面上；(d)一外吐小體，其表現如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽於其表面上；以及(e)一細胞毒殺性T淋巴球，其可辨認呈現如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一細胞。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之藥物組合物，其中該藥物組合物係配製以投予於一個體，其人類白血球組織抗原(HLA antigen)為HLA-A24。
  8. 一種誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法，其中該方法包括一步驟擇自以下所組成之群組：(a)將一抗原呈現細胞與如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽接觸；以及(b)將編碼出如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一多核苷酸引入一抗原呈現細胞。
  9. 一種誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法，其中該方法包括一 步驟擇自以下所組成之群組：(a)將一CD8陽性T細胞與一抗原呈現細胞共培養，該抗原呈現細胞呈現人類白血球組織抗原及如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一複合物於其表面上；(b)將一CD8陽性T細胞與一外吐小體共培養，該外吐小體呈現人類白血球組織抗原及如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一複合物於其表面上；以及(c)將編碼出兩種T細胞受體次單元之一多核苷酸或將編碼出任一種T細胞受體次單元之一多核苷酸引入一CD8陽性T細胞，其中由該T細胞受體次單元所形成之該T細胞受體可結合至於一細胞表面上之如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽及人類白血球組織抗原的一複合物。
  10. 一種經分離的抗原呈現細胞，其表現一人類白血球組織抗原及如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一複合物於其表面上。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之抗原呈現細胞，其藉由如申請專利範圍第8項所述之方法來誘導。
  12. 一種經分離之細胞毒殺性T淋巴球，其以如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽為標的。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之細胞毒殺性T淋巴球，其藉由如申請專利範圍第9項所述之方法來誘導。
  14. 一種於一個體中誘導一抗癌症之免疫反應的方法，其中該方法包括投予該個體一組合物之步驟，該組合物包括如申 請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽、或編碼出該胜肽之一多核苷酸。
  15. 一種抗體或其免疫活性片段，其抗如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽。
  16. 一種載體，其包括編碼出如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一核苷酸序列。
  17. 一種宿主細胞，其由如申請專利範圍第16項所述之載體所轉型或轉染。
  18. 一種診斷套組，包括如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽、如申請專利範圍第4項所述之多核苷酸、或如申請專利範圍第15項所述之抗體或免疫活性片段。
  19. 一種篩選具有誘導一細胞毒殺性T淋巴球之一能力的胜肽的方法，該細胞毒殺性T淋巴球對於表現源自SEMA5B之一片段的一細胞具有專一細胞毒殺活性，其中該方法包括以下之步驟：(i)提供一候選序列，其由藉由取代、刪除、插入及/或加入1、2或數個胺基酸殘基至一原始胺基酸序列來修飾的一胺基酸序列所組成，其中該原始胺基酸序列係擇自由序列辨識號：41、2、3、4、8、9、10、13、20、40、47與54所組成之群組；(ii)選擇一候選序列，其除了SEMA5B之外，不與源自任何已知之人類基因產物之胜肽具有實質顯著的同源性；(iii)將由步驟(ii)中所選擇之該候選序列所組成之一胜肽與一抗原呈現細胞接觸； (iv)將步驟(iii)之該抗原呈現細胞與一CD8陽性T細胞接觸；以及(v)鑑定出其細胞毒殺性T淋巴球誘發能力相同或高於由該原始胺基酸序列所組成之一胜肽的胜肽。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6481873B2 (ja) * 2015-03-09 2019-03-13 日本電気株式会社 Ｍｕｃ１由来のペプチド、これを用いた癌の治療又は予防のための医薬組成物、免疫誘導剤、及び抗原提示細胞の製造方法
GB201505585D0 (en) * 2015-03-31 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002074237A2 (en) * 2001-03-19 2002-09-26 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of kidney cancer
DK2267021T3 (en) * 2002-09-12 2015-03-30 Oncotherapy Science Inc KDR peptides and vaccines comprising the same
DE10344799A1 (de) * 2003-09-26 2005-04-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
DE102005013846A1 (de) * 2005-03-24 2006-10-05 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
WO2007013575A2 (en) * 2005-07-28 2007-02-01 Oncotherapy Science, Inc. Method for diagnosing and treating renal cell carcinoma
TWI434853B (zh) * 2007-04-11 2014-04-21 Oncotherapy Science Inc 腫瘤血管內皮標誌８胜肽及包含此胜肽之疫苗
TW200932260A (en) * 2007-11-28 2009-08-01 Oncotherapy Science Inc STAT3 epitope peptides
TW201136604A (en) * 2009-12-14 2011-11-01 Oncotherapy Science Inc TMEM22 peptides and vaccines including the same
SG183945A1 (en) * 2010-04-09 2012-10-30 Oncotherapy Science Inc Cdca5 peptides and vaccines including the same
TW201302800A (zh) * 2011-06-10 2013-01-16 Oncotherapy Science Inc Ｓｅｍａ５ｂ胜肽及含其之疫苗

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