CN103751771B - 免疫诱导剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫诱导剂，其包含至少一种多肽或重组载体作为有效成分，所述的至少一种多肽具有免疫诱导活性并选自以下多肽(a)、(b)和(c):(a)选自序列表中所列SEQ ID NO:2至30的任意偶数SEQ ID编号所示氨基酸序列的至少七个连续氨基酸的多肽；(b)与多肽(a)具有90%或更多序列同一性的至少七个氨基酸的多肽；和(c)包含多肽(a)或(b)作为其部分序列的多肽；所述的重组载体包含编码所述多肽的多核苷酸并能够在体内表达所述多肽。

Description

免疫诱导剂

本申请是中国专利申请200980130313.6的分案申请，原申请的申请日是2009年8月5日，发明名称是“免疫诱导剂”。

技术领域

本发明涉及作为癌症的治疗剂和/或预防剂等有用的新的免疫诱导剂。

背景技术

癌症是占全部死亡原因的第一位的疾病。目前，癌症治疗技术的主要形式是外科手术治疗，其与放射治疗和化疗法联合实施。尽管近年来开发了新的手术技术和发现了新的抗癌剂，但是除了一些类型的癌症之外，癌症治疗的结果仍未改善。近年来，随着分子生物学和癌症免疫学的发展，已经鉴定了对癌症起反应的细胞毒T细胞所识别的癌抗原和编码癌抗原的基因，并且对抗原特异性免疫疗法的期望已经上升(Tsuyoshi Akiyoshi,Ganto Kagaku Ryouhou(癌症和化疗法),1997,第24卷,第551-519页,Cancer andChemotherapy Publishers Inc.,日本)。

从减轻副作用的角度看，免疫疗法需要被识别为靶抗原的癌细胞特异性肽、多肽或蛋白质的存在,以及其基本上不存在于正常细胞中。在1991年，Boon等人(路德维希癌症研究所，比利时)通过cDNA表达克隆法，使用自身癌细胞系和癌症反应性T细胞，分离了CD8+T细胞识别的人黑素瘤抗原MAGE1(Bruggen P.等人,Science,254:1643-1647,1991)。此后，报道了通过基因表达克隆法鉴定由抗体识别的肿瘤抗原的SEREX(通过重组表达克隆法对抗原的血清学鉴定)方法，其中所述的抗体是应答于癌症患者身体中的自身癌症而产生的(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92:11810-11813,1995；和美国专利号5,698,396)。一些癌抗原已经通过此类技术分离(Int.J.Cancer,72:965-971,1997；Cancer Res.,58:1034-1041,1998；Int.J.Cancer,29:652-658,1998；Int.J.Oncol.,14:703-708,1999；CancerRes.,56:4766-4772,1996；和Hum.Mol.Genet.6:33-39,1997)。此外，已经开始了靶向一些此类抗原的癌症免疫疗法的临床试验。

如同人的情况，犬和猫已知患有多种肿瘤，如乳腺癌、白血病和淋巴瘤，并且肿瘤在犬或猫疾病中在统计学上排名靠前。然而，目前没有用于犬或猫癌症的有效治疗剂、预防剂或诊断剂。大部分犬或猫主人不会注意到犬或猫肿瘤直至肿瘤变成晚期和增大。即便通过外科手术除去肿瘤或施用人用药物(例如，抗癌剂)，肿瘤经常已经无法治愈，并且动物经常在治疗后不久死亡。在这类情况下，如果对犬或猫有效的治疗剂、预防剂或诊断剂是可获得的，则可以预期其应用于犬或猫癌症。

当静止的正常细胞被活化或发生细胞分裂时，胞质和增殖相关蛋白1(CAPRIN-1)表达。CAPRIN-1是已知与细胞中的RNA形成胞内应激颗粒并与调节mRNA运输和翻译有关的胞内蛋白。CAPRIN-1也称作多种其他名称，并且其示例包括GPI锚定的膜蛋白1和膜组分表面标记1蛋白(M11S1)。CAPRIN-1具有传达以下印象的名字：它已知作为一种细胞膜蛋白。此类其他名字最初源自如下的一份报告：CAPRIN-1基因序列具有GPI结合区并且它是在大肠衍生的细胞系中表达的膜蛋白(J.Biol.Chem.,270:20717-20723,1995)。然而,后来已知该报告中的CAPRIN-1基因序列是不正确的，并且在该基因序列中，单个核苷酸从GenBank等中目前登记的CAPRIN-1基因序列中的缺失造成移码，因而导致80个氨基酸从羧基末端缺失，并且因而所得的人为产物(74个氨基酸)是前述报告中所提及的GPI结合区。此外，还已知该报告中所显示的CAPRIN-1基因序列在5’侧也具有错误，并且53个氨基酸残基从氨基端缺失(J.Immunol.,172:2389-2400,2004)。也已经报道由GenBank等中目前所登记CAPRIN-1基因序列编码的蛋白质不是细胞膜蛋白(J.Immunol.,172:2389-2400,2004)。

基于J.Biol.Chem.,270:20717-20723,1995对CAPRIN-1是细胞膜蛋白的报告，即，US2008/0075722和WO2005/100998描述了CAPRIN-1作为名为M11S1的细胞膜蛋白可以是癌症疗法的靶。然而，它们没有在实施例中包括任何具体的描述。然而，如J.Immunol.,172:2389-2400,2004中所报道的那样，从US2008/0075722申请以来直到现在，通说认为CAPRIN-1不表达在细胞表面。显然基于不正确信息即CAPRIN-1是细胞膜蛋白的US2008/0075722和WO2005/100998的公开内容不应当理解为本领域技术人员的技术常识。此外，不存在CAPRIN-1的表达水平在癌细胞(如乳腺癌细胞)中比正常细胞中高的报道。

发明概述

发明欲解决的问题

本发明的目的是发现用作癌症治疗剂和/或预防剂等的新多肽并提供这种多肽作为免疫诱导剂的用途。

用于解决该问题的手段

本发明人已经进行了深入的研究并且随后他们通过SEREX方法，使用犬睾丸组织衍生的cDNA文库和患有乳腺癌的犬的血清，获得了编码蛋白质的cDNA，所述的蛋白质与从患癌活体获得的血清中的抗体结合，并且使用此类cDNA，他们制备了具有SEQ ID NO:6、8、10、12和14所示氨基酸序列的犬CAPRIN-1多肽。使用所获得基因的人同源基因，他们也制备了具有SEQ ID NO:2和4所示氨基酸序列的人CAPRIN-1多肽。此外，他们发现此类CAPRIN-1多肽在乳腺癌、脑肿瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、食道癌和结直肠癌中特异性表达。进一步地，他们发现施用此类CAPRIN-1多肽至活体会导致活体中针对CAPRIN-1多肽的免疫细胞的诱导和活体中表达CAPRIN-1基因的肿瘤的退缩。此外，他们发现针对此类CAPRIN-1多肽的抗体会破坏表达CAPRIN-1基因的癌细胞并诱导体内抗肿瘤作用。这导致了本发明的完成。

因此，本发明具有以下特征。

(1)免疫诱导剂，包含至少一种多肽或重组载体作为有效成分，所述的至少一种多肽具有免疫诱导活性并选自以下多肽(a)、(b)和(c)，所述的重组载体包含编码此多肽的多核苷酸并能够在体内表达此多肽：

(a)选自序列表中所列SEQ ID NO:2至30的任意偶数SEQ ID编号所示氨基酸序列的至少七个连续氨基酸的多肽；

(b)与多肽(a)具有90%或更多序列同一性的至少七个氨基酸的多肽；和

(c)包含多肽(a)或(b)作为其部分序列的多肽。

(2)根据(1)的免疫诱导剂，其中多肽(b)是与多肽(a)具有95%或更多序列同一性的多肽。

(3)根据(1)的免疫诱导剂，其中具有免疫诱导活性的多肽是选自序列表中所列SEQ ID NO:2至30的任意偶数SEQ ID编号所示氨基酸序列的至少七个连续氨基酸的多肽或包含此多肽作为其部分序列的多肽。

(4)根据(3)的免疫诱导剂，其中具有免疫诱导活性的多肽是包含选自序列表中所列SEQ ID NO:2至30的任意偶数SEQ ID编号所示氨基酸序列的多肽。

(5)根据(3)的免疫诱导剂，其中具有免疫诱导活性的多肽是至少七个连续氨基酸的多肽，所述的至少七个连续氨基酸位于选自序列表中所列除SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:18之外的SEQ ID NO:2至30中任意偶数SEQ ID编号所示氨基酸序列的第41至400位氨基酸残基(aa)或第503至564位氨基酸残基(aa)的区域中，或包含此多肽作为其部分序列的多肽。

(6)根据(5)的免疫诱导剂，其中具有免疫诱导活性的多肽是序列表中任一SEQ IDNO:43至76所示氨基酸序列的多肽，或包含序列表中任一SEQ ID NO:43至76所示氨基酸序列作为其部分序列的8至12个氨基酸的多肽。

(7)根据(1)至(6)任一项所述的免疫诱导剂，其包含一种或多种此类多肽作为有效成分。

(8)根据(7)的免疫诱导剂,其中多肽是抗原呈递细胞的处理剂。

(9)根据(1)至(7)任一项所述的免疫诱导剂，其用于动物癌症的治疗或预防中。

(10)根据(9)的免疫诱导剂，其中癌症是乳腺癌、脑肿瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、食道癌或结直肠癌。

(11)根据(9)的免疫诱导剂，其中动物是人、犬或猫。

(12)根据(1)至(11)任一项所述的免疫诱导剂，其还包含免疫增强剂。

(13)根据(12)的免疫诱导剂，其中免疫增强剂是选自由弗氏不完全佐剂、Montanide、聚肌胞和其衍生物、CpG寡核苷酸、白细胞介素12、白细胞介素18、干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素γ和Flt3配体组成的组中的至少一种佐剂或细胞因子。

(14)分离的抗原呈递细胞，包含上述所提及的具有免疫诱导活性的多肽和HLA分子的复合体。

(15)分离的T细胞，其选择性地与上述所提及的具免疫诱导活性的多肽和HLA分子的复合体结合。

(16)用于诱导免疫的方法，包括向个体施用至少一种多肽或重组载体，所述的至少一种多肽具有免疫诱导活性并选自以下多肽(a)至(c)，所述的重组载体包含编码此多肽的多核苷酸并能够在体内表达此多肽：

(a)选自序列表中所列SEQ ID NO:2至30的任意偶数SEQ ID编号所示氨基酸序列的至少七个连续氨基酸的多肽；

(b)与多肽(a)具有90%或更多序列同一性的至少七个氨基酸的多肽；和

(c)包含多肽(a)或(b)作为其部分序列的多肽。

发明的效果

本发明提供了对癌症的治疗和/或预防等有用的新的免疫诱导剂。如下文实施例中具体描述，向患癌动物施用本发明中所用的多肽能够在该患癌动物的身体中诱导免疫细胞，所述的免疫细胞进一步能使现存的癌症缩小或退缩。

附图简述

图1显示正常组织和肿瘤细胞系中编码CAPRIN-1多肽的基因的表达模式。参考编号1代表编码CAPRIN-1蛋白的基因的表达模式，并且参考编号2代表GAPDH基因的表达模式。

在图2中，横轴上的参考编号3至31分别代表了用SEQ ID NO:43至71的肽脉冲的T2细胞刺激，HLA-A0201⁺CD8⁺T细胞产生IFN-γ的能力。参考编号32代表有关SEQ ID NO:77的阴性对照肽(一种具有本发明范围之外的序列的肽)的结果。

在图3中，横轴上的参考编号33至37分别代表了用SEQ ID NO:72至76的肽脉冲的JTK-LCL细胞刺激，HLA-A24⁺CD8⁺T细胞产生IFN-γ的能力。参考编号38代表有关SEQ ID NO:77的阴性对照的结果。

在图4中，横轴上的参考编号39至67分别代表了用SEQ ID NO:43至71的肽刺激的HLA-A0201⁺CD8⁺T细胞对U-87MG细胞的细胞毒活性。参考编号68代表用阴性对照肽(SEQ IDNO:77)诱导的CD8⁺T细胞的细胞毒活性。

在图5中，横轴上的参考编号69至73分别代表了用SEQ ID NO:72至76的肽刺激的HLA-A24⁺CD8⁺T细胞对JTK-LCL细胞的细胞毒活性。参考编号74代表用阴性对照肽(SEQ IDNO:77)诱导的CD8⁺T细胞的细胞毒活性。

用于实施发明的实施方案

<多肽>

本发明的免疫诱导剂中所含作为有效成分的多肽包括选自以下多肽(a)、(b)和(c)的一种或多种多肽：

(a)在具有选自序列表中所列SEQ ID NO:2至30的任意偶数SEQ ID编号所示氨基酸序列的多肽中的至少七个连续氨基酸并具有免疫诱导活性的多肽；

(b)与多肽(a)具有90%或更多序列同一性，由至少七个氨基酸组成并具有免疫诱导活性的多肽；和

(c)包含多肽(a)或(b)作为其部分序列并具有免疫诱导活性的多肽。

本文中所用的术语“多肽”指通过多个氨基酸之间的肽键形成的分子。该术语不仅指由许多氨基酸构成的多肽分子，还指由少量氨基酸构成的低分子量分子(寡肽)和全长蛋白质。在本发明中，术语“多肽”也指SEQ ID NO:2至30当中任意偶数SEQ ID编号所示的全长序列的蛋白质。

编码由如SEQ ID NO:2至30当中偶数SEQ ID编号(即，SEQ ID NO:2、4、6...28和30)所示氨基酸序列组成的各个蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列通过SEQ ID NO:1至29当中奇数SEQ ID编号(即，SEQ ID NO:1、3、5...27和29)显示。

本文中所用的术语“具有氨基酸序列”指由处于特定顺序的氨基酸残基组成的序列。例如，术语“具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽”指具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列即Met Pro Ser Ala Thr...(中略)...Gln Gln Val Asn的709个氨基酸残基长度的多肽。术语“具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的多肽”有时缩写为“SEQ ID NO:2的多肽”。这同样适用于表述“具有核苷酸序列”。在这种情况下，术语“具有”与表述“由...组成”是可交换的。

本文中所用的术语“免疫诱导活性”指体内诱导分泌细胞因子(如干扰素或白细胞介素)的免疫细胞的能力。

多肽是否具有免疫诱导活性可以通过例如已知的ELISPOT测定法证实。具体而言，从活体获得细胞如外周血单核细胞，其中对所述活体已经施用待验定免疫诱导活性的多肽，将此类细胞在这种多肽存在下共培养并且来自所述细胞的细胞因子和/或趋化因子(如IFN-γ或白细胞介素(IL))的产生量例如利用如下文实施例中所述的特异性抗体测量。因此，可以验定所述细胞当中免疫细胞的数目。这能够评价免疫诱导活性。

备选地，基于SEQ ID NO:2至30当中任意偶数SEQ ID编号所示氨基酸序列而制备的重组多肽可以施用至患癌的动物，从而肿瘤可以因免疫诱导活性而退缩，如下文实施例中描述。因此，免疫诱导活性可以评价为抑制表达由SEQ ID NO:2至30当中任意偶数SEQ ID编号所示多肽的癌细胞生长的能力或缩小或消除癌组织(肿瘤)的能力(在下文，这种能力称作“抗肿瘤活性”)。所述多肽的抗肿瘤活性可以通过例如实际施用此类多肽至患癌的活体并检验肿瘤是否缩小予以确定，如下文实施例中具体描述。

备选地，可以检验受多肽刺激的T细胞(即，与呈递该多肽的抗原呈递细胞接触的T细胞)是否对体外肿瘤细胞显示细胞毒活性以评价该多肽的抗肿瘤活性。可以通过在如下文描述的液体培养基中共培养T细胞使其与抗原呈递细胞接触。细胞毒活性可以通过称作例如Int.J.Cancer,58:第317页,1994中所述⁵¹Cr释放测定法的已知技术验定。当所述多肽用于治疗和/或预防癌症，优选使用抗肿瘤活性作为一项指标评价免疫诱导活性，尽管不特别地限制评价方法。

本发明公开的序列表中所列SEQ ID NO:2至30当中的偶数SEQ ID 编号显示的氨基酸序列是CAPRIN-1多肽的氨基酸序列，其中通过SEREX方法，使用正常犬睾丸组织衍生的cDNA文库和患有乳腺癌的犬的血清，将所述的CAPRIN-1多肽作为与从患癌犬获得的血清中特异性存在的抗体结合的多肽、以及此多肽的人、牛、马、小鼠和鸡同源物而分离(见下文实施例1)。

上文所示的多肽(a)具有下述多肽中的至少7个和优选至少8、9、10个或更多个连续氨基酸并具有免疫诱导活性，所述多肽具有SEQ ID NO:2至30当中任意偶数SEQ ID编号所示的氨基酸序列。特别优选地，这种多肽具有SEQ ID NO:2至30当中任意偶数SEQ ID编号所示的氨基酸序列。如本领域已知，至少约7个氨基酸残基的多肽可以显示出抗原性。因此，具有SEQ ID NO:2至30当中任意偶数SEQ ID编号所示氨基酸序列的至少七个连续氨基酸残基的多肽可以显示出抗原性和免疫原性。即，具有SEQ ID NO:2至30当中任意偶数SEQ ID编号所示氨基酸序列的至少七个连续氨基酸残基的多肽可以具有免疫诱导活性并且该多肽可以用于制备本发明的免疫诱导剂。基于在体内针对抗原物质所产生的抗体是多克隆抗体的事实，氨基酸残基数量大的多肽可以诱导类型众多的识别该抗原物质上多个位点的抗体，因而增强免疫诱导活性。因此，为了增强免疫诱导活性，氨基酸残基的数目可以优选地是至少30或更大，或50或更大，更优选地至少100或更大，150或更大并且还优选地是至少200或更大或仍优选地是250或更大。

作为通过施用癌抗原多肽诱导免疫的原理，已知多肽被掺入抗原呈递细胞，所述多肽由该细胞内的肽酶降解成较小的片段(在下文，该片段可以称作“表位”)，此片段呈递在该细胞的表面上，细胞毒T细胞等识别该片段并选择性地杀死该抗原呈递细胞。呈递在抗原呈递细胞表面上的多肽的大小是相对小的，并且就氨基酸数目而言，它是约7至30个。因此，就抗原呈递细胞上的呈递而言，多肽(a)具有SEQ ID NO:2至30当中任意偶数SEQ ID编号所示氨基酸序列中约7至30个和优选地约8至30个或9至30个连续氨基酸是足够的。尺寸相对小的这种多肽可以直接呈递在抗原呈递细胞表面上，无需掺入该抗原呈递细胞中。

掺入抗原呈递细胞中的多肽在随机位置处被细胞中存在的肽酶切割，多种多肽片段生成并且此类多肽片段呈递在抗原呈递细胞表面上。因此，如果使用大的多肽如由SEQID NO:2至30当中任意偶数SEQ ID编号所示的全长序列，则通过抗原呈递细胞中的降解作用天然地生成有效用于由抗原呈递细胞所介导免疫诱导作用的多肽片段。因此，大尺寸多肽可以优选地用于由抗原呈递细胞所介导的免疫诱导作用，并且氨基酸的数目可以是至少30,更优选地是至少100，还优选地是至少200并且仍进一步优选地是至少250。

另外，可以使用匹配媒介对本发明的多肽筛选作为可能表位的肽，其中所述的匹配媒介可以检索充当对每种HLA类型具有结合基序的可能表位的肽，如生物信息学与分子分析选择预测HLA肽结合(HLA Peptide Binding Predictions of Bioinformatics&Molecular Analysis Selection (BIMAS))(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html)。具体地，优选至少七个连续氨基酸的多肽，其中所述的至少七个连续氨基酸位于选自除SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:18之外的SEQ ID NO:2至30当中任意偶数SEQID编号所示的氨基酸序列中第41至400位氨基酸残基(aa)或第503至564位氨基酸残基(aa)的区域中，或包含此多肽作为其部分序列的多肽。在SEQ ID NO:2的多肽中，由任一SEQ IDNO:43至76显示的多肽是更优选的。

上文的多肽(b)通过替换、缺失、添加和/或插入少数(优选地一个或几个)氨基酸残基从多肽(a)衍生，它与原始序列具有80%或更大、85%或更大、优选地90%或更大、更优选地95%或更大、还优选地98%或更大、99%或更大或99.5%或更大的序列同一性并且它具有免疫诱导活性。一般地，在蛋白质抗原中，即使该蛋白质的氨基酸序列中少数(优选地一个或几个)氨基酸残基被替换、缺失、添加或插入，本领域技术人员广泛已知的是所得的蛋白质有时具有基本上与原初蛋白质相同的抗原性或免疫原性。因此，上文的多肽(b)能够显示出免疫诱导活性并且它因此可以用于制备本发明的免疫诱导剂。备选地，上文的多肽(b)优选地是具有下述氨基酸序列的多肽，所述的氨基酸序列从SEQ ID NO:2至30当中任意偶数SEQID编号所示的氨基酸序列通过替换、缺失、添加和/或插入一个或几个氨基酸残基衍生。本文中所用的术语“几个”指从2至10的整数，优选地从2至6的整数并且还优选地从2至4的整数。

就氨基酸序列或核苷酸序列而言，本文中所用的术语“序列同一性”表示通过比对2个待比较的氨基酸序列(或核苷酸序列)从而使匹配性氨基酸残基(或核苷酸)的数目最大化并将匹配的氨基酸残基数目(匹配的核苷酸数目)除以氨基酸残基总数(或核苷酸总数)所确定的百分数(%)。当如上所述比对序列时，根据需要将空位适当地插入待比较的两个序列之一或二者。这种序列比对可以采用熟知的程序，例如BLAST、FASTA或CLUSTALW(Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:2264-2268,1993；Altschul等人,NucleicAcids Res.,25:3389-3402,1997)实施。当插入空位时，氨基酸残基总数(或核苷酸总数)是通过指定某空位为一个氨基酸残基(或一个核苷酸)所计数的残基数目(或核苷酸数目)。当因此确定的氨基酸残基总数(或核苷酸总数)在待比较的两个序列之间不同时，通过将匹配的氨基酸残基数目(匹配的核苷酸数目)除以较长序列的氨基酸残基总数(或核苷酸总数)确定同一性(%)。

优选的氨基酸替换是保守性氨基酸替换。构成天然存在蛋白质的20种氨基酸可以分成具有相似特性的氨基酸组：即具有低极性侧链的中性氨基酸(Gly、Ile、Val、Leu、Ala、Met和Pro)；具有亲水侧链的中性氨基酸(Asn、Gln、Thr、Ser、Tyr和Cys)；酸性氨基酸(Asp和Glu)；碱性氨基酸(Arg、Lys和His)；和芳族氨基酸(Phe、Tyr、Trp和His)。已知在此类组内的替换；即保守性替换，在许多情况下将不会改变多肽特性。因此，当本发明多肽(a)中的氨基酸残基被替换时，可以在此类组内实施替换，从而维持免疫诱导活性的可能性变大。然而，在本发明中，改变的多肽可以具有非保守性替换，条件是所得的多肽具有与未改变多肽的免疫诱导活性等同或基本上等同的免疫诱导活性。

多肽(c)包含多肽(a)或(b)作为其部分序列并具有免疫诱导活性。具体地，多肽(c)对应于在多肽(a)或(b)的一个或两个末端添加其他氨基酸或多肽并具有免疫诱导活性的多肽。该多肽可以用于制备本发明的免疫诱导剂。

上文提及的多肽可以例如根据Fmoc(芴甲氧羰基)方法或tBoc(叔丁氧羰基)方法(Japanese Biochemical Society(编著),Seikagaku Jikken Kouza(生物化学实验教程)1,Tanpakushitsu no Kagaku(蛋白质化学)IV,Kagaku Shushoku to Peptide Gousei(化学修饰与肽合成),Tokyo Kagaku Dojin,日本,1981)化学地合成。另外，多种市售的肽合成仪可以根据常规技术用来合成所述多肽。另外，已知的遗传工程技术(例如，Sambrook等人,Molecular Cloning,第2卷,Current Protocols in Molecular Biology,1989,ColdSpring Harbor Laboratory Press；和Ausubel等人,Short Protocols in MolecularBiology,第3卷,A compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,1995,John Wiley&Sons)可以用来制备编码上述多肽的多核苷酸，可以将所得的多肽掺入表达载体中并随后导入宿主细胞，并且可以在这种宿主细胞中产生所述多肽以获得靶多肽。

通过已知的基因工程技术或使用市售核酸合成仪的常规技术，可以容易地制备编码上述多肽的多核苷酸。例如，可以通过开展PCR，使用人染色体DNA或cDNA文库作为模板和所设计的旨在扩增SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的引物对制备具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的DNA。类似地，可以使用犬染色体DNA或cDNA文库作为模板，制备具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列的DNA。PCR条件可以适当地确定。例如，重复30次以下反应循环：在94℃变性30秒、在55℃复性30秒至1分钟并在72℃延伸2分钟，使用热稳定性DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)和含Mg²⁺的PCR缓冲液，随后该反应在72℃持续7分钟，但是反应条件不限于此。PCR技术、条件等在例如Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology,第3卷,Acompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,1995,JohnWiley&Sons(特别是第15章)中描述。另外，可以基于本发明序列表中SEQ ID NO:1至30所示的核苷酸序列和氨基酸序列的信息制备适当的探针或引物，并且人、犬、牛或其他cDNA文库可以用此类探针或引物筛选，从而可以分离目的DNA。cDNA文库优选地从表达SEQ ID NO:2至30当中任意偶数SEQ ID编号所示蛋白质的细胞、器官或组织制备。上文所述的方法(如探针或引物的制备、cDNA文库的构建、cDNA文库的筛选和靶基因的克隆)是本领域已知的。例如，此类方法可以根据Sambrook等人,Molecular Cloning,第2卷,Current Protocols inMolecular Biology,1989)，Ausubel等人(如上文)中所述的方法实施。编码上述多肽(a)的DNA可以从由此获得的DNA获得。由于编码每种氨基酸的密码子是已知的，可以轻易地鉴定编码特定氨基酸序列的多核苷酸的核苷酸序列。因此，可以轻易地鉴定编码多肽(b)或(c)的多核苷酸的核苷酸序列，并且也可以使用市售核酸合成仪，根据常规技术轻易地合成此类多核苷酸。

宿主细胞可以是任意细胞，条件是前述多肽可以在其中表达。宿主细胞包括但不限于作为原核细胞的大肠杆菌细胞；和作为真核细胞的猴肾细胞(COS1)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾细胞系(HEK293)和胎小鼠皮肤细胞系(NIH3T3)等哺乳动物培养细胞、出芽的酵母细胞、分裂的酵母细胞、家蚕细胞和爪蟾卵细胞。

当使用原核宿主细胞时，使用可以在原核细胞中复制的具有例如起点、启动子、核糖体结合位点、多克隆位点、终止子、耐药基因和营养缺陷型互补基因的表达载体。大肠杆菌表达载体的实例包括pUC、pBluescriptII、pET表达系统和pGEX表达系统。可以将编码上述多肽的DNA掺入这种表达载体，原核宿主细胞可以用此种载体转化，并且可以培养所得的转化体。因此，可以在原核宿主细胞中表达由所述DNA编码的多肽。在这种情况下，这种多肽可以与另一种蛋白质的融合蛋白的形式表达。

当使用真核宿主细胞时，使用具有例如启动子、剪接区和聚腺苷酸添加位点的真核细胞表达载体。此类表达载体的实例包括pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV、pRS、pcDNA3和pYES2载体。如上所述，可以将编码上述多肽的DNA掺入这种表达载体，真核宿主细胞可以用此种载体转化，并且随后可以培养所得的转化体。因此，可以在真核宿主细胞中表达由所述DNA编码的多肽。当使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1或其他表达载体时，所述多肽可以带有多种标签如His标签(例如，(His)₆至(His)₁₀)、FLAG标签、myc标签、HA标签或GFP的融合蛋白的形式表达。

表达载体可以通过常规技术如电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、病毒感染、脂质转染法或与细胞膜透过性肽的结合导入宿主细胞中。

靶多肽可以通过联合使用已知的分离技术从宿主细胞分离和纯化。分离技术的实例包括但不限于用变性剂如脲或表面活性剂处理法、超声破碎法、酶消化法、盐析或用溶剂分级沉淀法、透析法、离心法、超滤法、凝胶过滤法、SDS-PAGE、等点聚焦法、离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法和反相层析法。

通过此类方法获得的一些多肽如上所述处于与任何其他蛋白质融合的融合蛋白形式。其实例包括与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或His标签的融合蛋白。融合蛋白形式的此类多肽作为多肽(c)处在本发明的范围内。另外，转化细胞中表达的多肽被翻译并且翻译的多肽有时在细胞中经历多种形式的修饰。此类翻译后修饰的多肽也处在本发明的范围内，条件是此类多肽具有免疫诱导活性。此类翻译后修饰的实例包括消除氨基端甲硫氨酸、氨基端乙酰化、添加糖链、胞内蛋白酶有限降解、十四烷酰化、异戊二烯化和磷酸化。

<免疫诱导剂>

如下文实施例中具体描述，向患癌活体施用具有免疫诱导活性的上述多肽能使现存的肿瘤退缩。因此，本发明的免疫诱导剂可以用作癌症的治疗剂和/或预防剂。

本文中所用的术语“肿瘤”和“癌症”指恶性赘生物并且这些术语彼此可互换地使用。

在这种情况下，作为靶的癌症是表达下述基因的那些癌症，其中所述的基因编码包含SEQ ID NO:2至30当中任意偶数SEQ ID编号所示的氨基酸序列或其由至少7个连续氨基酸组成的部分序列的多肽。优选地，此类癌症是乳腺癌、脑肿瘤、白血病、肺癌、淋巴瘤、肥大细胞瘤、食道癌或结直肠癌。此类具体癌症中包括但不限于例如乳腺癌、组合型乳腺癌、恶性混合性乳腺肿瘤、乳管内乳头状腺癌、慢性淋巴细胞性白血病、胃肠淋巴瘤、消化系统淋巴瘤和小细胞至中等细胞型淋巴瘤。

靶动物是哺乳动物，并且其实例包括哺乳动物，包括灵长类、宠物动物、家畜动物和竞技用动物，特别优选人、犬和猫。

本发明的免疫诱导剂可以口服地或肠胃外地施用至生物。优选肠胃外施用，如肌内、皮下、静脉内或动脉内施用。当这种免疫诱导剂用于癌症治疗目的时，该免疫诱导剂可以施用至待治疗肿瘤附近的局部淋巴结，从而改善如下文实施例中所述的抗肿瘤作用。剂量可以是任何量，只要它对于免疫诱导有效即可。例如，当该免疫诱导剂用于治疗和/或预防癌症时，有效治疗和/或预防癌症的量是足够的，并且该量可以根据例如动物的体重、性别(即，雄性或雌性)或症状改变。根据肿瘤大小、症状和其他条件适当地确定有效治疗和/或预防癌症的量。通常，每日针对靶动物的有效量是0.0001μg至1,000μg和优选地0.001μg至1,000μg，并且该免疫诱导剂可以单一剂量或多个剂量施用。优选地，该免疫诱导剂每隔几日或几个月以数个分立的剂量施用。如下文实施例中具体描述，本发明的免疫诱导剂能够使现存肿瘤退缩。因此，该免疫诱导剂可以对处于早期发展阶段的数量少的癌细胞显示抗肿瘤作用。在癌症发作前或在治疗后使用该免疫诱导剂导致预防癌症的发展或复发。具体地，本发明的免疫诱导剂用于治疗和预防癌症。

本发明的免疫诱导剂可以由多肽组成，或它可以与适用于相关剂型的添加剂如可药用的载体、稀释剂、赋形剂等充分混合。制剂方法和可以使用的添加剂是医药制剂领域熟知的，并且可以使用任何方法和添加剂。添加剂的具体实例包括，但不限于：稀释剂，如生理缓冲液；赋形剂,如砂糖、乳糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇和甘氨酸；粘合剂,如糖浆、明胶、阿拉伯胶、山梨醇、聚氯乙烯和黄蓍胶；及润滑剂,如硬脂酸镁、聚乙二醇、滑石和硅石。剂型的实例包括经口剂，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂和糖浆溶液剂，和肠胃外剂，如吸入剂、注射剂、栓剂和液体剂。此类制剂可以通过常见方法制备。

本发明的免疫诱导剂可以与能够在体内强化免疫应答的免疫增强剂联合使用。免疫增强剂可以掺入本发明的免疫诱导剂，或者它可以作为与本发明免疫诱导剂联合的另一种组合物施用至患者。

本文中所用的术语“患者”指动物，尤其是哺乳动物，并且它优选地是人、犬或猫。

免疫增强剂的实例是佐剂。佐剂提供(在细胞外部或在巨噬细胞中的)抗原储备库，它活化巨噬细胞，并且它刺激给定组织中的淋巴细胞。因此，佐剂可以强化免疫应答并增强抗肿瘤作用。因此，当本发明的免疫诱导剂用于治疗和/或预防癌症时，特别优选的是除作为有效成分的多肽之外，该免疫诱导剂还包含佐剂。多种类型的佐剂是本领域熟知的，并且可以使用任意的此类佐剂。其具体实例包括：MPL(SmithKline Beecham)；通过纯化和酸水解明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)Re595的脂多糖所获得的等效物；QS21(SmithKline Beecham)；从皂树(Quillja saponaria)提取物中纯化的纯皂苷QA-21；PCT申请(WO96/33739,SmithKline Beecham)中公开的DQS21；QS-7,QS-17,QS-18和QS-L1(So等人,Molecules and Cells,1997,7:178-186)；弗氏不完全佐剂；弗氏完全佐剂；维生素E；Montanide；明矾（alum）；CpG寡核苷酸(例如，Kreig等人,Nature,1995,374:546-549)；聚肌胞和其衍生物(例如，聚ICLC)；和从生物可降解油如角鲨烯和/或生育酚中制备的多种油包水乳液。特别优选弗氏不完全佐剂、Montanide、聚I:C、其衍生物和CpG寡核苷酸。与多肽混合的佐剂的比率一般是约1:10至10:1，优选地约1:5至5:1并且更优选地约1:1。应当指出佐剂不限于上文例举的那些佐剂，并且也可以在施用本发明的免疫诱导剂时使用本领域已知的其他佐剂(例如，Goding著,单克隆抗体：原理与实践(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice),第2卷,1986)。用于制备多肽和佐剂的混合物或乳液的方法是免疫领域技术人员熟知的。

作为免疫增强剂，除前述佐剂之外，还可以使用刺激目的免疫应答的因子。例如，刺激淋巴细胞或抗原呈递细胞的多种细胞因子可以作为免疫增强剂与本发明的免疫诱导剂联合使用。可以强化免疫应答的许多细胞因子是本领域已知的。其实例包括但不限于已知的强化疫苗的保护性作用的白细胞介素-12(IL-12)、GM-CSF、IL-18、干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素γ和Flt3配体。此类因子可以作为免疫增强剂使用，并且可以以与本发明免疫诱导剂在一起的混合物形式或作为另一种组合物与本发明的免疫诱导剂联合地施用至患者。

<抗原呈递细胞>

另外，可以使上文提及的多肽在体外与抗原呈递细胞接触以呈递此类多肽至该抗原呈递细胞。具体地，多肽(a)至(c)可以作为抗原呈递细胞的处理剂使用。抗原呈递细胞的实例包括树突细胞、B细胞和巨噬细胞，并且优选地使用具有MHC I类分子的树突细胞或B细胞。多种MHC I类分子已经被鉴定并熟知。人MHC分子称作“HLA”。HLA I类分子的实例包括HLA-A、HLA-B和HLA-C。具体实例包括HLA-A1、HLA-A0201、HLA-A0204、HLA-A0205、HLA-A0206、HLA-A0207、HLA-A11、HLA-A24、HLA-A31、HLA-A6801、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B2705、HLA-B37、HLA-Cw0401和HLA-Cw0602。

具有MHC I类分子的树突细胞或B细胞可以通过熟知的技术从外周血制备。例如，用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-3(或IL-4)从骨髓、脐带血或患者的外周血诱导出树突细胞，并且将肿瘤相关肽添加至培养系统。因此，可以诱导出肿瘤特异性树突细胞。

施用有效量的此类树突细胞能够诱导癌症治疗想要的应答。可以使用的细胞的实例包括由健康个体提供的骨髓和脐带血以及患者的骨髓和外周血。当使用患者自己的自体细胞时，安全水平高，并且可以避免严重的副作用。外周血或骨髓可以是新鲜、低温贮藏或冷冻保存的样品。外周血可以通过培养全血或通过培养分离的白细胞组分制备，而从效率的观点看，优选后者。另外，单核细胞可以从白细胞组分分离。当样品从骨髓或脐带血制备时，可以培养构成骨髓的全部细胞，或可以从中分离并培养单核细胞。外周血、其白细胞组分和骨髓细胞包含衍生树突细胞的单核细胞、造血干细胞、未成熟树突细胞或CD4+细胞。细胞因子可以是天然存在的或基因重组类型的，并且不限制用于产生细胞因子的方法，条件是其安全性及生理学活性已经验证。优选地，使用最小需要量的具有验证了医学品质的样品。不特别地限制所添加细胞因子的浓度，条件是树突细胞被诱导即可。一般地，优选大约10至1,000ng/ml的细胞因子总浓度，并且进一步优选约20至500ng/ml。培养可以用通常用于白细胞培养的熟知培养基进行。不特别地限制培养温度，条件是可以增殖白细胞即可，并且人体温度(即,大约37℃)是最优选的。不特别地限制培养期间的气体环境，条件是可以增殖白细胞即可。优选伴有5%CO₂的通气。此外，不特别地限制培养持续时间，条件是必需数目的细胞被诱导即可。这通常是3日至2周。适当的仪器可以用于细胞分离或培养，并且优选此类仪器具有批准的医用安全性和稳定及简单的操作性。特别地，细胞培养装置不限于常见的容器，如培养皿、烧瓶和培养瓶，并且也可以使用分层或多级容器、滚瓶(rollerbottle)、转瓶(spinner bottle)、袋式培养装置、中空纤维柱等。

上文提及的多肽可以通过熟知的技术与抗原呈递细胞在体外接触。例如，抗原呈递细胞可以培养于含有此类多肽的培养液中。不特别地限制培养基中的肽浓度。通常，它是约1至100μg/ml，并且优选地是约5至20μg/ml。不特别地限制培养期间的细胞密度，并且它通常是约10³至10⁷个细胞/ml并且优选地是约5×10⁴至5×10⁶个细胞/ml。优选在37℃于5%CO₂中根据常规技术进行培养。可以呈递在抗原呈递细胞表面上的肽长度通常是最大约30个氨基酸残基。因此，当抗原呈递细胞与多肽在体外接触时，可以调节多肽的长度至约30个氨基酸残基或更小，尽管不特别地限制其长度。

通过在所述多肽存在下培养抗原呈递细胞，将肽掺入抗原呈递细胞的MHC分子并呈递在其表面上。因此，含有多肽与MHC分子的复合体的分离的抗原呈递细胞可以用此类多肽制备。此类抗原呈递细胞可以在体内或体外呈递所述多肽至T细胞、诱导对所述多肽特异的细胞毒T细胞并增殖此类T细胞。

如此制备的含有多肽与MHC分子的复合体的抗原呈递细胞可以与T细胞在体外接触从而可以诱导或增殖对此类多肽特异的细胞毒T细胞。这可以通过在液体培养基中将抗原呈递细胞与T细胞一起培养实现。例如，培养可以通过将抗原呈递细胞悬浮于液体培养基中、将所得悬浮液导入容器如微量平板的孔中并向其添加T细胞来进行。不特别地限制共培养时抗原呈递细胞对T细胞的混合比，并且就细胞计数而言，它通常是约1:1至1:10并且优选地是约1:5至1:20。也不特别地限制悬浮于液体培养基中的抗原呈递细胞的密度，并且它通常是约100个至10⁷个细胞/ml并且优选地是约10⁴至10⁶个细胞/ml。共培养优选地根据常规技术在37℃于5%CO₂中进行。不特别地限制培养持续时间，并且它通常是2日至3周并且优选地是约4日至2周。优选地，共培养在单一类型或多种类型的白细胞介素如IL-2、IL-6、IL-7和IL-12存在下进行。在这种情况下，IL-2或IL-7的浓度通常是约5U/ml至20U/ml，IL-6的浓度通常是约500U/ml至2,000U/ml，并且IL-12的浓度通常是约5ng/ml至20ng/ml，但是浓度不限于此。本文中所用的单位“U”表示活性单位。共培养可以重复一次或几次，伴以添加新鲜的抗原呈递细胞。例如，培养上清液在共培养后弃去，共培养进一步伴随添加新鲜抗原呈递细胞的悬液进行，并且这种操作可以重复一次或几次。共培养条件可以如上所述。

对所述多肽特异的细胞毒T细胞通过共培养进行诱导和增殖。因此，与多肽和MHC分子的复合体选择性结合的分离的T细胞可以用上述多肽制备。

如下文实施例中所述，编码SEQ ID NO:2至30当中任意偶数SEQ ID 编号的多肽的基因在乳腺癌细胞、白血病细胞和淋巴瘤细胞中特异性表达。因此，认为SEQ ID NO:2至30当中偶数SEQ ID编号的多肽在此类癌细胞中以比正常细胞中显著更大的量存在。当癌细胞中的一些多肽呈递至癌细胞表面上的MHC分子并且如上所述制备的细胞毒T细胞施用至活体时，使用其作为标记，细胞毒T细胞可以破坏癌细胞。由于呈递多肽的抗原呈递细胞能够在体内诱导和增殖对所述多肽特异的细胞毒T细胞，施用所述抗原呈递细胞至活体也可以破坏癌细胞。即，使用所述多肽制备的细胞毒T细胞或抗原呈递细胞也如本发明的免疫诱导剂那样用作癌症的治疗剂和/或预防剂。

当分离的抗原呈递细胞或分离的T细胞施用至活体时，优选此类分离的细胞是从接受治疗的患者采样的抗原呈递细胞或T细胞用上述多肽(a)至(c)制备的，以避免在体内将此类细胞识别为外来物质并攻击此类细胞的细胞免疫应答。

施用包含抗原呈递细胞或分离的T细胞作为有效成分的癌症治疗剂和/或预防剂的途径优选地是肠胃外途径，如静脉内或动脉内施用。根据症状、施用目的和其他状况适当地选择剂量，并且通常，1至10¹³个细胞和优选地10⁶至10⁹个细胞用于施用，并且此类细胞优选地每几日或几月施用一次。制剂可以例如是缓冲的生理盐水溶液中的细胞悬液，并且它可以联合其他抗肿瘤药或细胞因子使用。另外，可以添加医用制剂领域中熟知的一种或多种添加剂。

<基于基因的疫苗>

可以在靶动物的身体内表达编码多肽(a)至(c)的多核苷酸，从而可以在身体内诱导抗体产生或细胞毒T细胞，并且可以实现与通过多肽施用达到的那些作用等同的作用。具体地，本发明的免疫诱导剂可以包含编码多肽(a)至(c)的多核苷酸也可以包含能够在体内表达这种多肽的重组载体作为有效成分。能够表达抗原多肽的这种重组载体也称作“基于基因的疫苗”。

不特别地限制用于制备基于基因的疫苗的载体，条件是它可以在靶动物细胞(优选地哺乳动物细胞)中表达目的多肽即可。它可以是质粒或病毒载体，并且可以使用基于基因的疫苗领域中已知的任意载体。多核苷酸如编码所述多肽的DNA或RNA可以根据如上所述的常规技术轻易地制备。另外，所述多核苷酸可以通过本领域熟知的方法掺入载体。

优选地，基于基因的疫苗以肠胃外方式施用(例如，肌内、皮下、静脉内或动脉内施用)，并且可以根据抗原类型或其他条件适当地选择剂量。就每公斤体重基于基因的疫苗的重量而言，剂量通常是约0.1μg至100mg，并且优选地是约1μg至10mg。

涉及使用病毒载体的方法的实例包括其中编码上述多肽的多核苷酸掺入RNA病毒或DNA病毒如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒或辛德比斯病毒并用所述病毒感染靶动物的方法。涉及使用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或痘苗病毒的方法是特别优选的。

其他方法的实例包括其中将表达质粒直接施用至肌肉中的方法(DNA疫苗法)、脂质体法、Lipofectin法、显微注射法、磷酸钙法和电穿孔法，特别优选DNA疫苗法和脂质体法。

本文中所用的编码多肽的基因实际上允许通过将该基因直接导入身体的体内方法或其中给定细胞采样自靶动物、将该基因导入离体的细胞并随后将所述细胞返回身体的离体（ex vivo）方法作为药用产品发挥作用(Nikkei Science(科学美国人日文版),1994年4月,第20-45页,日本；Gekkan Yakuji(the Pharmaceuticals Monthly),1994,第36卷,第1期,第23-48页,日本；Jikken Igaku Zoukan(实验医学增刊),1994,第12卷,第15期,日本；以及其中引用的文献)。更优选体内方法。

当药剂通过体内方法施用时，该药剂可以根据治疗目的的疾病、症状和其他状况通过适当的途径施用。例如，施用可以静脉内、动脉内、皮下或肌内实施。例如，当药剂通过体内方法施用时，该药剂可以处于液体剂的形式。通常，该药剂处于含有编码本发明肽的DNA作为有效成分的注射制剂形式，并且可以根据需要添加常见载体。另外，包含该DNA的脂质体或膜融合脂质体(例如，仙台病毒(HVJ)-脂质体)可以处于脂质体制剂的形式，如混悬液、冷冻剂或通过离心法浓缩的冷冻剂。

在本发明中，术语“SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列”不仅指由SEQ ID NO:1实际上显示的核苷酸序列，还指与之互补的序列。因此，术语“具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸”指具有SEQ ID NO:1实际上所示核苷酸序列的单链多核苷酸、包含与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列的单链多核苷酸、和由此类单链多核苷酸组成的双链多核苷酸。当制备编码本文中所用多肽的多核苷酸时，会选择适当的核苷酸序列。本领域技术人员会轻易地选择这种适当的序列。

实施例

在下文，参考实施例来更详细地描述本发明，不过本发明的技术范围不限于下文的具体实施例。

实施例1：通过SEREX方法获得新的癌抗原蛋白

(1)cDNA文库的制备

通过酸胍-+酚-氯仿方法从健康犬的睾丸组织提取总RNA，并且使用Oligotex-dT30mRNA纯化试剂盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.)，根据该试剂盒中包含的说明书纯化poly(A)RNA。

使用获得的mRNA(5μg)合成犬睾丸cDNA噬菌体文库。使用cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA合成试剂盒和ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning试剂盒(STRATAGENE)，根据各试剂盒中所包含的各份说明书制备cDNA噬菌体文库。制备的cDNA噬菌体文库的大小是7.73×10⁵pfu/ml。

(2)使用血清筛选cDNA文库

使用上述制备的犬睾丸cDNA噬菌体文库实施免疫筛选。具体地，宿主大肠杆菌细胞(XL1-Blue MRF’)用噬菌体文库感染，每块NZY琼脂糖平板(Φ90x15mm)产生2210个克隆，在42℃培养3至4小时以形成噬斑，该平板以IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浸透的硝化纤维素膜(HybondC Extra:GE Healthcare Bio-Science)在37℃覆盖4小时以诱导并表达蛋白质，并且将蛋白质转移到该膜上。此后，将该膜回收，浸泡在含有0.5%脱脂乳的TBS(10mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)中并在4℃振摇过夜以封闭非特异性反应。使该滤膜与500倍稀释的临床患病犬血清在室温反应2至3小时。

就临床患病犬的血清而言，使用从患有乳腺癌的犬采样的血清。血清样品贮藏在-80℃并紧邻使用前预处理。血清样品按以下方式预处理。具体而言，宿主大肠杆菌细胞(XL1-BLue MRF’)用其中未导入外来基因的λZAP表达噬菌体感染，并且培养随后在NZY平板培养基上于37℃过夜实施。随后，添加含有0.5M NaCl的0.2M NaHCO₃缓冲液(pH8.3)至该平板，使该平板在4℃静置15小时，并且回收上清液作为大肠杆菌/噬菌体提取物。随后，使得回收的大肠杆菌/噬菌体提取物流经NHS-柱(GEHealthcare Bio-Science)，并将衍生自大肠杆菌/噬菌体的蛋白质固定在该柱上。使临床患病犬的血清流经固定有蛋白质的柱以与其反应，并且从血清中除去已经吸附至大肠杆菌和噬菌体的抗体。将已经流过该柱的血清级分用含有0.5%干脱脂乳的TBS稀释500倍，并且所得物用作免疫筛选样品。

已经转印上如此处理的血清和上文所提及融合蛋白的膜用TBS-T(0.05%吐温20/TBS)洗涤4次，使得已经用含有0.5%干脱脂乳的TBS稀释5000倍作为第二抗体的山羊抗犬IgG(山羊抗犬IgG-h+I HRP缀合的：BETHYL Laboratories)与该膜在室温反应1小时，检测通过使用NBT/BCIP反应溶液(Roche)的酶显色反应实施，从NZY琼脂糖平板(Φ90x15mm)取出与显色阳性的区域相对应的菌落，并将取出的菌落溶解于500μl SM缓冲液(100mM NaCl,10mM MgClSO₄,50mM Tris-HCl,0.01%明胶，pH7.5)。重复第二和第三筛选直至显色阳性菌落以与上文所述相同的方式再呈现单个菌落，并且分离5个阳性克隆作为筛选与血清中IgG反应的30940个噬菌体克隆的结果。

(3)分离的抗原基因的同源性搜索

为了使以上述方式分离的5个阳性克隆进行核苷酸序列分析，将噬菌体载体转变成质粒载体。具体地，调节至OD₆₀₀1.0的宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)的200μl溶液与250μl纯化的噬菌体溶液和1μl ExAssist辅助噬菌体(STRATAGENE)混合，使所得物在37℃反应15分钟，添加3ml LB培养基，培养在37℃进行2.5至3小时，此后立即将培养产物在水浴中于70℃孵育20分钟，所得物在4℃和1000×g离心15分钟并且将上清液作为噬菌粒溶液回收。随后，调节至OD₆₀₀1.0的噬菌粒宿主大肠杆菌(SOLR)的200μl溶液与10μl纯化的噬菌体溶液混合，使所得物在37℃反应15分钟，50μl所得物铺在含有氨苄青霉素(终浓度：50μg/ml)的LB琼脂培养基，并且培养在37℃过夜进行。挑取转化的SOLR的单菌落并且在含有氨苄青霉素(终浓度：50μg/ml)的LB琼脂培养基中在37℃培养，并且使用QIAGEN质粒小量制备试剂盒(QIAGEN)纯化具有目的插入物的质粒DNA。

使用SEQ ID NO:31的T3引物和SEQ ID NO:32的T7引物，通过引物步行法，对纯化的质粒进行插入物全长序列的分析。通过序列分析获得SEQ ID NO:5、7、9、11和13所示的基因序列。使用所述基因的核苷酸序列及其氨基酸序列(SEQ ID NO:6、8、10、12和14)来使用同源性搜索程序BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，开展与已知基因的同源性搜索。作为结果，发现获得的5个基因均编码CAPRIN-1。这五个基因之间的序列同一性如下：在待翻译成蛋白质的区域内100%的核苷酸序列同一性和99%的氨基酸序列同一性。所述基因与编码人同源物的基因的序列同一性如下：在待翻译成蛋白质的区域内94%的核苷酸序列同一性和98%的氨基酸序列同一性。人同源物的核苷酸序列由SEQ ID NO:1和3显示并且其氨基酸序列由SEQ ID NO:2和4显示。所获得的犬基因与编码牛同源物的基因的序列同一性如下：在待翻译成蛋白质的区域内94%的核苷酸序列同一性和97%的氨基酸序列同一性。牛同源物的核苷酸序列由SEQ ID NO:15显示并且其氨基酸序列由SEQ ID NO:16显示。编码人同源物的基因与编码牛同源物的基因之间的序列同一性如下：在待翻译成蛋白质的区域内94%的核苷酸序列同一性和93%至97%的氨基酸序列同一性。所获得的犬基因与编码马同源物的基因的序列同一性如下：在待翻译成蛋白质的区域内93%的核苷酸序列同一性和97%的氨基酸序列同一性。马同源物的核苷酸序列由SEQ ID NO:17显示并且其氨基酸序列由SEQ ID NO:18显示。编码人同源物的基因与编码马同源物的基因之间的序列同一性如下：在待翻译成蛋白质的区域内93%的核苷酸序列同一性和96%的氨基酸序列同一性。所获得的犬基因与编码小鼠同源物的基因的序列同一性如下：在待翻译成蛋白质的区域内87%至89%的核苷酸序列同一性和95%至97%的氨基酸序列同一性。小鼠同源物的核苷酸序列由SEQ ID NO:19、21、23、25和27显示并且其氨基酸序列由SEQ ID NO:20、22、24、26和28显示。编码人同源物的基因与编码小鼠同源物的基因之间的序列同一性如下：在待翻译成蛋白质的区域内89%至91%的核苷酸序列同一性和95%至96%的氨基酸序列同一性。所获得的犬基因与编码鸡同源物的基因的序列同一性如下：在待翻译成蛋白质的区域内82%的核苷酸序列同一性和87%的氨基酸序列同一性。鸡同源物的核苷酸序列由SEQ ID NO:29显示并且其氨基酸序列由SEQ ID NO:30显示。编码人同源物的基因与编码鸡同源物的基因之间的序列同一性如下：在待翻译成蛋白质的区域内81%至82%的核苷酸序列同一性和86%的氨基酸序列同一性。

(4)组织中的基因表达分析

通过逆转录-PCR(RT-PCR)检验以上述方式在犬和人正常组织及多种细胞株中获得的基因的表达。逆转录按照以下方式实施。具体地，使用TRIzol试剂(Invitrogen)，按照其中包含的方案从50至100mg组织样品和各细胞株5至10x106个细胞中提取总RNA。使用针对RT-PCR的Superscript第一链合成系统(Invitrogen)按照其中包含的方案，利用提取的总RNA合成cDNA。使用对所获得基因特异的引物(由SEQ ID NO:33和34显示)，按照以下方式实施PCR。具体地，将诸试剂(0.25μl通过逆转录制备的样品，2μM每种引物，0.2mM每种dNTP和0.65U ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.))与附带的缓冲液混合以调节至达到25μl总体积。使用Thermal Cycler(BIO RAD)，使所得物进行以下30个循环反应：94℃30秒，60℃30秒和72℃30秒。上述基因特异性引物用来扩增由SEQ IDNO:5显示的核苷酸序列(即，犬CAPRIN-1基因)第206至632位核苷酸的区域和由SEQ ID NO:1显示的核苷酸序列(即，人CAPRIN-1基因)第698至1124位核苷酸的区域。出于比较，同时使用GAPDH特异性引物(如SEQID NO:35和36所显示)。作为结果，在健康犬的睾丸组织中观察到强表达，并且在犬乳腺癌及腺癌组织中观察到表达，如图1中显示。此外，还检测了所获得基因的人同源物的表达，并且如同犬CAPRIN-1基因的情况那样，在正常组织的情况下，仅在睾丸中观察到其表达。然而，在类型多样的癌细胞系如乳腺癌、脑肿瘤、白血病、肺癌和食道癌细胞系中检测到人同源物的表达，并且，尤其在许多乳腺癌细胞系中观察到其表达。所述结果说明，在除睾丸组织之外的正常组织中观察不到CAPRIN-1表达，然而，CAPRIN-1在许多癌细胞中并且尤其在乳腺癌细胞系中表达。

在图1中，纵轴上的参考编号1显示上文所鉴定基因的表达模式并且参考编号2显示对照GAPDH基因的表达模式。

(5)免疫组织化学染色

(5)-1：小鼠和犬正常组织中的CAPRIN-1表达

小鼠(Balb/c，雌性)和犬(比格犬，雌性)在乙醚麻醉下和在氯胺酮/异氟烷麻醉下放血，打开腹腔，并将器官(胃、肝、眼球、胸腺、肌肉、骨髓、子宫、小肠、食道、心脏、肾、唾液腺、大肠、乳腺、脑、肺、皮肤、肾上腺、卵巢、胰腺、脾脏和膀胱)分别转移至盛有PBS的10-cm平皿。所述器官在PBS中切开并用含有4%多聚甲醛(PFA)的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)在回流条件下固定过夜。弃去回流液，用PBS淋洗所述器官的组织表面，将含有10%蔗糖的PBS溶液导入50-ml离心管，并将组织导入其中并且使用旋转器在4℃振摇2小时。将所得物转移到含有20%蔗糖的PBS溶液中，使其在4℃静置直至组织沉降，并且随后将组织转移到含有30%蔗糖的PBS溶液中并使其在4℃静置直至组织沉降。取出组织并使用手术刀切下必需的区域。随后，将OCT化合物(Tissue Tek)施加至组织表面并随后将组织置于Cryomold上。在Cryomold置于干冰上并迅速冷冻后，使用冷冻切片机(LEICA)，将组织切成厚度10μm至20μm，并且载玻片上的组织切片用电吹风进行30分钟风干以制备其上具有组织切片的载玻片。随后，将所述载玻片引入充满PBS-T(含有0.05%吐温20的生理盐水)的染色缸，将PBS-T每隔5分钟替换为新鲜的PBS-T，并且该流程重复3次。使用低尘擦拭纸（Kimwipes）擦掉切片周围的多余水分，用Dakopen(DAKO)圈定切片，将MOM小鼠Ig封闭试剂(VECTASTAIN)置于小鼠组织上作为封闭液，将含有10%胎牛血清的PBS-T溶液置于犬组织上作为封闭液，并且使这些切片置于保湿室中在室温持续1小时。随后，在切片上施加用封闭液调节为10μg/ml的包含针对CAPRIN-1的、与参考例1制备的癌细胞表面反应的具有SEQ ID NO:78的重链可变区和SEQ ID NO:79的轻链可变区的单克隆抗体的溶液，并且使所得物在保湿室中于4℃静置过夜。在载玻片用PBS-T持续10分钟洗涤3次后，添加用封闭液稀释250倍的MOM生物素标记的抗IgG抗体(VECTASTAIN)并随后使之在保湿室中于室温静置1小时。在载玻片用PBS-T持续10分钟洗涤3次后，将抗生物素蛋白-生物素ABC试剂(VECTASTAIN)施加在载玻片上并随后使之在保湿室中于室温静置5分钟。在载玻片用PBS-T持续10分钟洗涤3次后，将DAB显色溶液(10mg DAB+10μl30%H₂O₂/0.05M Tris-HCl,pH7.6,50ml)施加在载玻片上并随后使之在保湿室中于室温静置30分钟。载玻片用蒸馏水淋洗，将苏木精试剂(DAKO)施加在载玻片上，并且使载玻片在保湿室中于室温静置1分钟，随后用蒸馏水淋洗。载玻片依次地浸在70%、80%、90%、95%和100%乙醇溶液中，每次1分钟，并随后使其在二甲苯中静置过夜。取出载玻片，用Glycergel封片介质(DAKO)封片，并且随后观察。作为结果，在唾液腺、肾、结肠和胃组织的细胞内观察到弱的CAPRIN-1表达；然而在细胞的表面上观察不到其表达，并且在从其他器官衍生的组织中观察不到表达。

(5)-2：犬乳腺癌组织中的CAPRIN-1表达

使用已经通过病理诊断法诊断为患有恶性乳腺癌的犬的108份冷冻乳腺癌组织标本来制备其上包含冷冻切片的载玻片并且使用针对CAPRIN-1的单克隆抗体以如上文所述相同的方式实施免疫组织化学染色，其中所述的单克隆抗体具有SEQ ID NO:78的重链可变区和SEQ ID NO:79的轻链可变区。作为结果，在108份标本的100份(92.5%)中观察到CAPRIN-1表达，并且发现CAPRIN-1表达在异型度高的癌细胞表面上是特别强烈的。

(5)-3:人乳腺癌组织中的CAPRIN-1表达

对石蜡包埋的人乳腺癌组织阵列(BIOMAX)上的188份乳腺癌组织标本实施免疫组织化学染色。该人乳腺癌组织阵列在60℃处理3小时，将该阵列导入充满二甲苯的染色缸，将二甲苯每隔5分钟替换为新鲜的二甲苯，并且该流程重复3次。随后，重复相似流程，使用乙醇和PBS-T替代二甲苯。人乳腺癌组织阵列导入用含有0.05%吐温20的10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)充满的染色缸，该阵列在125℃处理5分钟，并且该阵列在室温静置至少40分钟。使用低尘擦拭纸（Kimwipes）擦掉切片周围的多余水分，用Dakopen(DAKO)圈定切片，并且向其逐滴添加足够量的过氧化物酶阻断剂(DAKO)。使该阵列在室温静置5分钟后，将该阵列导入充满PBS-T的染色缸，将PBS-T每隔5分钟替换为新鲜的PBS-T，并且该流程重复3次。将含有10%FBS的PBS-T溶液施加在该阵列上作为封闭液，并且使该阵列置于保湿室中在室温持续1小时。随后，在该阵列上施加用含有5%FBS PBS-T溶液调节以包含10μg/ml针对CAPRIN-1的单克隆抗体的溶液，并且使该阵列在保湿室中于4℃静置过夜，其中所述的单克隆抗体具有SEQ ID NO:78的重链可变区和SEQ ID NO:79的轻链可变区，与参考例1制备的癌细胞表面反应。在该阵列用PBS-T持续10分钟洗涤3次后，将足够量的Peroxidase Labelled PolymerConjugated(DAKO)逐滴添加至该阵列，并且随后使阵列在保湿室中于室温静置30分钟。该阵列用PBS-T持续10分钟洗涤3次后，在其上施加DAB显色液(DAKO)，使该阵列在室温静置约10分钟，并且弃去显色液。该阵列用PBS-T持续10分钟洗涤3次，用蒸馏水淋洗，依次地浸在70%、80%、90%、95%和100%乙醇溶液中，每次1分钟，并随后使其在二甲苯中静置过夜。取出载玻片，用Glycergel封片介质(DAKO)封片，并且随后观察。作为结果，在全部188份乳腺癌组织标本的138份(73%)中观察到强烈的CAPRIN-1表达。

(5)-4:人恶性脑肿瘤中的CAPRIN-1表达

用针对CAPRIN-1的单克隆抗体以如上文(5)-3中相同的方式对石蜡包埋的人恶性脑肿瘤组织阵列(BIOMAX)上的247份恶性脑肿瘤组织标本实施免疫组织化学染色，其中所述的单克隆抗体具有SEQ ID NO:78的重链可变区和SEQ ID NO:79的轻链可变区。作为结果，在全部247份恶性脑肿瘤组织标本的227份(92%)中观察到强烈的CAPRIN-1表达。

(5)-5:人乳腺癌转移的淋巴结中的CAPRIN-1表达

用针对CAPRIN-1的单克隆抗体以如上文(5)-3中相同的方式对石蜡包埋的人乳腺癌转移的淋巴结组织阵列(BIOMAX)上的150份人乳腺癌转移的淋巴结组织标本实施免疫组织化学染色，其中所述的单克隆抗体具有SEQ ID NO:78的重链可变区和SEQ ID NO:79的轻链可变区。作为结果，在全部150份人乳腺癌转移的淋巴结组织标本的136份(90%)中观察到强烈的CAPRIN-1表达。发现CAPRIN-1表达在转移自乳腺癌的癌组织中是强烈的。

参考例1：制备针对CAPRIN-1的单克隆抗体

100μg在实施例2中制备的SEQ ID NO:2的抗原蛋白(人CAPRIN-1)与等量的MPL+TDM佐剂(Sigma Corporation)混合，并且将该混合物用作每只小鼠的抗原溶液。该抗原液腹膜内地施用至6周龄的Balb/c小鼠(Japan SLC,Inc.)，并且每周施用该溶液多于3次。将终末免疫3日后取出的脾脏夹在两片无菌的载玻片之间、研磨，用PBS(-)(Nissui)洗涤并以1500转/分钟离心10分钟，并且取出上清液。该流程重复3次以获得脾脏细胞。获得的脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞(购自ATCC)以10:1混合，向其添加PEG溶液，其中所述的PEG溶液通过将200μl含有10%FBS的RPMI1640培养基与800μl在37℃加热的PEG1500(Boehringer)混合而制备，并且使所得物静置5分钟以进行细胞融合。所得物以1700转/分钟离心5分钟，取出上清液，将细胞悬浮于150ml已经添加2%等量HAT溶液(Gibco)的含有15%FBS的RPMI1640培养基(HAT选择培养基)中，并且将100μl细胞悬液铺种于15块96孔平板(Nunc)的各孔中。培养在37℃于5%CO₂中进行7日以获得因脾脏细胞与骨髓瘤细胞的融合而产生的杂交瘤。

使用由所得杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-1蛋白的结合亲和力作为指标，选择杂交瘤。将实施例2中制备的CAPRIN-1蛋白溶液(1μg/ml)以每孔100μl的量添加至96孔平板，并使该平板在4℃静置18小时。各孔用PBS-T洗涤3次，以每孔400μl的量添加0.5%牛血清白蛋白(BSA)溶液(Sigma Corporation)，并且使该平板在室温静置3小时。移走该溶液，各孔用每孔400μl的PBS-T洗涤3次，以每孔100μl的量添加上文获得的杂交瘤的培养上清液，并且使该平板在室温静置2小时。在各孔用PBS-T洗涤3次后，以每孔100μl的量添加用PBS稀释5,000倍的HRP标记的抗小鼠IgG(H+L)抗体（Invitrogen），并且使该平板在室温静置1小时。在各孔用PBS-T洗涤3次后，以每孔100μl的量添加TMB底物溶液(Thermo)，并且使该平板静置15至30分钟以进行显色反应。在颜色显现后，以每孔100μl的量添加1N硫酸以终止该反应，并且使用吸光度计测定在450nm和在595nm的吸光度。作为结果，选出了产生具有高吸光度值的抗体的多株杂交瘤。

将选出的杂交瘤以每孔0.5个细胞的量添加至96孔平板并培养。1周后，在多个孔内观察到一些杂交瘤形成单个集落。进一步培养此类孔中的细胞，并且使用从克隆的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-1蛋白的结合亲和力作为指标，选择杂交瘤。将实施例2中制备的CAPRIN-1蛋白溶液(1μg/ml)以每孔100μl的量添加至96孔平板，并使该平板在4℃静置18小时。在各孔用PBS-T洗涤3次后，以每孔400μl的量添加0.5%BSA溶液，并且使该平板在室温静置3小时。移走该溶液，各孔用每孔400μl的PBS-T洗涤3次，以每孔100μl的量添加上文获得的杂交瘤的培养上清液，并且使该平板在室温静置2小时。在各孔用PBS-T洗涤3次后，以每孔100μl的量添加用PBS稀释5000倍的HRP-标记的抗小鼠IgG(H+L)抗体（Invitrogen），并且使该平板在室温静置1小时。在各孔用PBS-T洗涤3次后，以每孔100μl的量添加TMB底物溶液(Thermo)，并且使该平板静置15至30分钟以进行显色反应。在颜色显现后，以每孔100μl的量添加1N硫酸以终止该反应，并且使用吸光度计测定在450nm和在595nm的吸光度。作为结果，获得了产生与CAPRIN-1蛋白显示反应性的单克隆抗体的多个杂交瘤株，使用G蛋白载体纯化杂交瘤的培养上清液以获得150个与CAPRIN-1蛋白结合的单克隆抗体。

随后，在上述单克隆抗体当中选出与表达CAPRIN-1的乳腺癌细胞的表面具有反应性的单克隆抗体。具体地，在1.5ml微量离心管中离心人乳腺癌细胞系MDA-MB-231V的106个细胞，添加100μl上文制备的杂交瘤上清液至其中，并且使所得物在冰上静置1小时。在平板用PBS洗涤后，添加用含有0.1%胎牛血清的PBS稀释500倍的FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Invitrogen)，并且使该平板在冰上静置1小时。在平板用PBS洗涤后，使用FACSCalibur(Becton Dickinson)测量荧光强度。另外，作为对照，实施除添加培养基替代抗体之外的相同程序。作为结果，选出了11个显示比对照更强荧光强度的单克隆抗体；即，选出了11个与乳腺癌细胞表面反应的单克隆抗体。此类单克隆抗体之一的重链可变区的序列由SEQ IDNO:78显示，并且其轻链可变区的序列由SEQ ID NO:79显示。

实施例2：制备新的犬和人癌抗原蛋白

(1)重组蛋白的制备

使用实施例1中获得的SEQ ID NO:5的基因以下文所述方式制备重组蛋白。试剂(从实施例1中获得的噬菌粒溶液制备并经过序列分析的载体(1μl)、0.4μM含有NdeI和KpnI限制性位点的两种类型的引物(SEQ ID NO:37和38)中每种引物、0.2mM dNTP和1.25UPrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.))与附带的缓冲液混合以调节至达到总体积50μl。使用Thermal Cycler(BIO RAD)，使所得物进行30个循环98℃10秒和68℃1.5分钟的反应。使用上述两种引物来扩增编码SEQ ID NO:6的全长氨基酸序列的区域。在实施PCR后，扩增的DNA在1%琼脂糖凝胶上电泳，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化约1.4kbp的DNA片段。

将纯化的DNA片段连接入pCR-Blunt克隆载体(Invitrogen)。将所得物转化到大肠杆菌中，回收质粒，并且通过测序证实扩增的基因片段匹配目的序列。用NdeI和KpnI限制性酶处理已经发现了匹配于目的序列的质粒，用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化所得物，并且将目的基因序列插入用NdeI和KpnI限制性酶处理的大肠杆菌表达载体(pET30b,Novagen)。使用这种载体能够产生融合有His标签的重组蛋白。将所述质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并用1mM IPTG诱导以在大肠杆菌中表达目的蛋白。

另外，使用SEQ ID NO:7的基因以下文所述方式制备犬同源基因的重组蛋白。试剂(通过RT-PCR在实施例1中所制备的组织或细胞cDNA当中证实其表达的cDNA(1μl)、0.4μM含有NdeI和KpnI限制性位点的两种类型的引物(SEQ ID NO:39和40)中每种引物、0.2mM dNTP和1.25U PrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.))与附带的缓冲液混合以调节至达到总体积50μl。使用Thermal Cycler(BIO RAD)，使所得物进行30个循环98℃10秒和68℃2.5分钟的反应。使用上述两种引物来扩增编码SEQ ID NO:8的全长氨基酸序列的区域。在实施PCR后，扩增的DNA在1%琼脂糖凝胶上电泳，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化约2.2kbp的DNA片段。

将纯化的DNA片段连接入pCR-Blunt克隆载体(Invitrogen)。将所得物转化到大肠杆菌中，回收质粒，并且通过测序证实扩增的基因片段匹配目的序列。用NdeI和KpnI限制性酶处理已经发现了匹配于目的序列的质粒，用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化所得物，并且将目的基因序列插入用NdeI和KpnI限制性酶处理的大肠杆菌表达载体(pET30b,Novagen)。使用这种载体能够产生融合有His标签的重组蛋白。将所述质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并用1mM IPTG诱导以在大肠杆菌中表达目的蛋白。

使用SEQ ID NO:1的基因以下文所述方式制备人同源基因的重组蛋白。试剂(通过RT-PCR在实施例1中所制备的组织或细胞cDNA当中证实其表达的cDNA(1μl)、0.4μM含有SacI和XhoI限制性位点的两种类型的引物(SEQ ID NO:41和42)中每种引物、0.2mM dNTP和1.25UPrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.))与附带的缓冲液混合以调节至达到总体积50μl。使用Thermal Cycler(BIO RAD)，使所得物进行30个循环98℃10秒和68℃2.5分钟的反应。使用上述两种引物来扩增编码SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列的区域。在实施PCR后，扩增的DNA在1%琼脂糖凝胶上电泳，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化约2.1kbp的DNA片段。

将纯化的DNA片段连接入pCR-Blunt克隆载体(Invitrogen)。将所得物转化到大肠杆菌中，回收质粒，并且通过测序证实扩增的基因片段匹配目的序列。用SacI和XhoI限制性酶处理已经发现了匹配于目的序列的质粒，用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化所得物，并且将目的基因序列插入用SacI和XhoI限制性酶处理的大肠杆菌表达载体(pET30a,Novagen)。使用这种载体能够产生融合有His标签的重组蛋白。将所述质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并用1mM IPTG诱导以在大肠杆菌中表达目的蛋白。

(2)重组蛋白的纯化

表达上文所获得的SEQ ID NO:1、5或7的基因的重组大肠杆菌细胞在含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基中在37℃培养直至在600nm的吸光度变成大约0.7，添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度1mM，并且培养在37℃进行4小时。此后，将细胞以4800转/分钟离心10分钟和收获。将细胞沉淀悬浮在磷酸盐缓冲的生理盐水中，所得物以4800转/分钟离心额外的10分钟，并随后洗涤细胞。

将细胞悬浮在磷酸盐缓冲的生理盐水中并在冰上超声破碎。超声破碎的大肠杆菌细胞的溶液以6000转/分钟离心20分钟，所得的上清液称为可溶性级分，并且沉淀称为不溶性级分。

将可溶性级分添加至根据常规技术制备的镍螯合柱(载体：ChelateingSepharose^TM Fast Flow(GE Health Care)；柱体积：5ml；平衡缓冲液：50mM盐酸缓冲液pH8.0)。用10个柱体积的50mM盐酸缓冲液(pH8.0)和含有20mM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗去未吸附的级分，随后立即用6个床体积的含有100mM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗脱。用含有100mM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗脱的级分添加至强阴离子交换柱(载体：Q Sepharose^TM Fast Flow(GE Health Care)；柱体积：5ml；20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)作为平衡缓冲液)，在所述级分中已通过考马斯染色法证实了目的蛋白的洗脱。用10个柱体积的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)和含有200mM氯化钠的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗去未吸附的级分，随后立即用5个床体积的含有400mM氯化钠的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱。获得了各自包含SEQ ID NO:2、6和8所示氨基酸序列的蛋白质的纯化级分并随后将它们指定为用于施用试验的材料。

通过上述方法获得的纯化样品的部分(200μl)分散到1ml的反应缓冲液(20mMTris-HCl,50mM NaCl,2mM CaCl₂,pH7.4)中，添加2μl肠激酶(Novagen)，使所得物在室温静置过夜，使反应继续进行，切除His标签，并且使用肠激酶切割捕获试剂盒(Novagen)，根据随附的说明书实施纯化。随后，通过使用Nanosep10K Omega(Pall)的超滤法，对1.2ml由上述方法获得的纯化样品进行磷酸盐缓冲的生理盐水(Nissui)的缓冲液置换，通过HTTuffryn Acrodisc(孔径：0.22μm,Pall)实施除菌过滤，并且所得物用于以下实验。

实施例3：施用重组蛋白至患癌犬的试验

(1)抗肿瘤评价

对表皮上具有肿瘤的患癌犬(乳腺癌)进行上文所纯化重组蛋白的抗肿瘤作用的评价。

以上述方式纯化的具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的重组多肽(100μg,0.5ml)与相等量的弗氏不完全佐剂(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)混合以制备癌症治疗剂。所得药剂作为初始施用及此后3日和7日总共3次施用至肿瘤附近的局部淋巴结。作为结果，施用癌症治疗剂时大小约86mm³的肿瘤在初始施用后10日、20日和30日分别缩小至55mm³、30mm³和20mm³。

0.5ml具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重组多肽与0.5ml弗氏不完全佐剂的混合物以与上文所述相同的方式总共3次施用至另一只患有乳腺癌的犬。另外，100μg犬白细胞介素12与该药剂一起同时施用。作为结果，施用癌症治疗剂时大小约123mm³的肿瘤在初始施用该癌症治疗剂后45日彻底退缩。

另外，0.5ml具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重组多肽与0.5ml弗氏不完全佐剂的混合物以与上文所述相同的方式总共3次施用至另一只患有乳腺癌的犬。另外，100μg犬白细胞介素12与该药剂一起同时施用。作为结果，施用癌症治疗剂时大小约96mm³的肿瘤在初始施用该癌症治疗剂后27日彻底退缩。

(2)免疫诱导能力的评价

在施用前和初始施用后10日和30日获得临床患病的犬的血液样本，其中具有SEQID NO:6、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重组多肽已经在上文(1)中进行的施用试验中施用至所述犬；根据常规技术分离外周血单核细胞；并且使用所述外周血单核细胞，通过IFNγ的ELISpot测定法评价该重组蛋白的免疫诱导能力。

以100μl/孔的量添加70%乙醇至96孔平板(MultiScreen-IP，MAIPS4510,Millipore)，该平板静置5分钟，吸弃乙醇，该平板用灭菌水洗涤，以300μl/孔的量添加200mM碳酸氢钠(pH8.2)，该平板静置5分钟，吸弃碳酸氢钠，并且洗涤该平板。随后，将添加至200mM碳酸氢钠的抗犬干扰素γ单克隆抗体(克隆142529,MAB781,R&D)以0.5μg/孔的量添加至该平板，在37℃实施过夜孵育，并且第一抗体固定化。在吸弃溶液中的第一抗体后，以300μl/孔的量添加封闭液(1%BSA-5%蔗糖-200mM碳酸氢钠，pH8.2)，并且在4℃实施过夜孵育以封闭该平板。在吸弃封闭液后，以300μl/孔的量添加含有10%胎牛血清的RPMI培养基(Invitrogen)，该平板静置5分钟，并且吸弃培养基。此后，以5×10⁵个细胞/孔的量添加悬浮在含有10%胎牛血清的RPMI培养基中的犬外周血单核细胞至该平板，以10μl/孔的量添加施用所使用的犬衍生多肽或人衍生多肽至该平板，并且培养在37℃于5%CO₂下进行24小时，旨在从外周血单核细胞当中的免疫细胞产生干扰素γ。在进行培养后，除去培养基，并且各孔用洗液(0.1%吐温，20-200mM碳酸氢钠，pH8.2)洗涤6次。以100μl/孔的量添加用封闭液稀释1,000倍的兔抗犬多克隆抗体至该平板并随后在4℃孵育过夜。在各孔用上述洗液洗涤3次后，以100μl/孔的量添加用封闭液稀释1,000倍的HRP-标记的抗兔抗体至该平板，并且使反应在37℃进行2小时。在各孔用上述洗液洗涤3次后，借助Konica immunostain(Konica)显现颜色，并且所述孔用水洗涤以终止反应。在反应终止后，将膜干燥，并且使用KSElispot(Carl Zeiss)计数显色的点的数目。作为结果，在多肽施用前的临床患病犬的外周血单核细胞中没有检测到显色点。然而，在施用多肽后的情况下，在施用后10日和30日从已经施用具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的重组多肽的临床患病犬获得的外周血单核细胞中检测到13个和82个点。另外，在已经施用具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重组多肽的临床患病犬的情况下，在施用后10日和30日的外周血单核细胞中检测到53个和189个点。另外，在已经施用具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重组多肽的临床患病犬的情况下，在施用后10日和30日的外周血单核细胞中检测到32个和117个点。

以上结果说明，应答于已经施用的重组蛋白而特异性产生干扰素γ的免疫细胞在已经施用该重组多肽的临床患病犬中被诱导。所述结果还说明，此类免疫细胞发挥中心作用的免疫反应产生上文(1)中所述的抗肿瘤作用。

实施例4：DNA疫苗的抗肿瘤作用

使用SEQ ID NO:19的基因按以下方式制备重组质粒。试剂(按照与实施例1(4)中相同的方式从其中已经观察到CAPRIN-1表达的小鼠结直肠癌细胞系(CT26,购自ATCC)提取的cDNA(1μl)、0.4μM两种类型的引物(SEQ ID NO:80和81)中每种引物、0.2mM dNTP和1.25UPrimeSTAR HS聚合酶)与附带的缓冲液混合以调节至达到总体积50μl。使用ThermalCycler，使所得物进行以下30个循环的PCR：98℃10秒，55℃15秒和72℃4分钟。使用上述两种引物来扩增编码SEQ ID NO:20的全长氨基酸序列的区域。在实施PCR后，扩增的DNA在1%琼脂糖凝胶上电泳，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化约2,100bp的DNA片段。

将纯化的DNA片段连接入pCR-Blunt克隆载体(Invitrogen)。将所得物转化到大肠杆菌中，回收质粒，分析片段的序列，并且获得具有与目的序列匹配的扩增基因片段的质粒。该质粒用EcoRI限制性酶处理，所得物用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化，并将目的基因序列插入根据常规技术用EcoRI限制性酶处理的哺乳动物表达载体(pcDNA3.1,Invitrogen)。

将50μg金粒子(Bio Rad)、100μl精胺(SIGMA)和100μl的1M CaCl2添加至上文制备的100μg质粒DNA，通过涡旋混合器搅拌混合物，并且使所得物在室温静置10分钟(下文称作“金-DNA粒子”)。在混合物以3,000转/分钟离心1分钟后，弃去上清液，并且粒子用100%乙醇洗涤3次。添加100%乙醇(6ml)至金-DNA粒子，通过涡旋混合器彻底搅拌所得物，并且将金-DNA粒子导入Tefzel Tubing(Bio Rad)并沉淀在壁上。将附着有金-DNA粒子的TefzelTubing中的乙醇进行风干并且将干燥的管状物切割成适合于基因枪应用的长度。

CT26细胞以10⁶个细胞/小鼠的量皮下地植入20只Balb/c小鼠(JapanSLC,Inc.)的背部区并且生长成大约7mm直径的肿瘤。此后，将上文制备的管状物固定在基因枪上，使用纯氦气以400psi压力经皮施用至剃毛小鼠的腹腔(接种的质粒DNA的量是2μg/小鼠)，并且评价抗肿瘤作用。

作为结果，肿瘤在已经施用不包含CAPRIN-1基因的空质粒的10只对照小鼠中变大并且这10只小鼠在肿瘤移植后63日全部死亡。然而，在已经施用了包含插入其中的CAPRIN-1基因的质粒的10只小鼠中，肿瘤在肿瘤移植后25日完全退缩，并且全部小鼠在肿瘤移植后63日仍存活，此时全部对照小鼠死亡。

实施例5：诱导肽表位反应性CD8+T细胞

(1)HLA-A0201结合肽基序和HLA-A24结合肽基序的预测

人CAPRIN-1多肽的氨基酸序列信息从GenBank获得。为了预测HLA-A0201结合肽基序和HLA-A24结合肽基序，通过计算机预测程序，使用已知的BIMAS软件(在http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/可获得)分析人CAPRIN-1多肽的氨基酸序列，选出了预测能够与HLA-A0201分子结合的由SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:71显示的29种肽和预测能够与HLA-A24分子结合的由SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:76显示的5种肽。

(2)诱导肽表位反应性CD8⁺T细胞

外周血从HLA-A0201阳性健康个体分离，覆以淋巴细胞分离介质(OrganonpTeknika,Durham,NC)并以1,500转/分钟在室温离心20分钟。将含有PBMC的级分回收并在冷的磷酸盐缓冲液中洗涤3次(或多次)以获得外周血单核细胞(PBMC)。使获得的PBMC悬浮于20ml的AIM-V培养基(Life Technologies)中并在37℃于5%CO₂下黏附至培养瓶(Falcon)2小时。未贴壁的细胞用于T细胞制备并且贴壁的细胞用于树突细胞制备。

贴壁的细胞在AIM-V培养基中在IL-4(1,000U/ml)和GM-CSF(1,000U/ml)存在下培养。6日后，将该培养基交换为已经添加了IL-4(1,000U/ml)、GM-CSF(1,000U/ml)、IL-6(1,000U/ml，Genzyme，Cambridge，MA)、IL-1β(10ng/ml，Genzyme，Cambridge，MA)和TNF-α(10ng/ml，Genzyme，Cambridge，MA)的另一种AIM-V培养基，培养进行额外2日，并且使用所获得的未贴壁细胞群体作为树突细胞。

将制备的树突细胞以细胞密度1×10⁶个细胞/ml悬浮于AIM-V培养基中，以10μg/ml向该培养基添加上文(1)中所选择的预测能够与HLA-A0201分子结合的由SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:71显示的肽，并且培养在37℃于5%CO₂下使用96孔平板进行4小时。在进行培养后，所述细胞用X射线(3,000rad)照射，用AIM-V培养基洗涤，悬浮于含有10%人AB血清(Nabi,Miami,FL)、IL-6(1,000U/ml)和IL-12(10ng/ml,Genzyme,Cambridge,MA)的AIM-V培养基中并以1×10⁵个细胞/孔的量添加至24孔平板。另外，以1×10⁶个细胞/孔的量添加制备的T细胞群体并将其在37℃于5%CO₂下培养。7日后弃去培养上清液，用以上述方式获得的肽处理并随后用X射线照射的树突细胞悬浮于含有10%人AB血清(Nabi,Miami,FL)、IL-7(10U/ml,Genzyme,Cambridge,MA)和IL-2(10U/ml,Genzyme,Cambridge,MA)的AIM-V培养基中(细胞密度：1×10⁵个细胞/ml)，将所述细胞以1x10⁵个细胞/孔的量添加至24孔平板并且再度进行培养。在此流程每隔7日重复一次，重复4至6次后，回收刺激的T细胞并且通过流式细胞术证实CD8⁺T细胞诱导。

就预测能够与HLA-A24分子结合的SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:76的肽而言，使用从HLA-A24阳性健康个体的外周血中诱导的树突细胞和T细胞群体，也按照与上文所述相同的方式尝试了诱导肽表位反应性CD8⁺T细胞。

作为阴性对照，使用具有本发明范围之外的序列(SEQ ID NO:77)的肽。

实施例6：细胞毒T细胞抗原表位的确定

(1)产生IFN-γ的能力

为了研究实施例5(2)中诱导的T细胞中观察到增殖的T细胞分别对肽表位的特异性，将5×10³个T细胞添加至5x10⁴个预计能够与HLA-A0201分子结合的各肽脉冲的、表达HLA-A0201分子的T2细胞(Salter RD等人,Immunogenetics,21:235-246,1985,T2细胞购自ATCC)(所述各肽以10μg/ml添加至AIM-V培养基并且在37℃于5%CO₂下培养4小时)，并且所得物在96孔平板上于含有10%人AB血清的AIM-V培养基中培养24小时。培养后收集上清液并且通过ELISA测量所产生IFN-γ的量。作为结果，在从其中使用了以肽SEQ ID NO:43至SEQID NO:71脉冲的T2细胞的孔中获得的培养上清液中比从其中不使用以肽脉冲的T2细胞的孔中获得的培养上清液中更多地观察到IFN-γ产生(图2)。所述结果说明，上述肽是能够特异性刺激HLA-A0201⁺CD8⁺T细胞增殖以诱导IFN-γ产生的T细胞表位肽。

以与上文所述相同的方式，按照以下方式研究了实施例5(2)中使用肽SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:76所诱导的肽表位反应性CD8⁺T细胞对所述肽表位的特异性。具体地，针对肽脉冲的、表达HLA-A24分子的JTK-LCL细胞(JTK-LCL细胞购自日本RIKEN)，通过ELISA测量T细胞的IFN-γ产生水平。作为结果，在从其中使用了以肽SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:76脉冲的JTK-LCL细胞的孔中获得的培养上清液中比从其中不使用以肽脉冲的JTK-LCL细胞的孔中获得的培养上清液中更多地观察到IFN-γ产生(图3)。所述结果说明，SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:76的肽是能够特异性刺激HLA-A24+CD8+T细胞增殖以诱导IFN-γ产生的T细胞表位肽。

(2)细胞毒性评价

随后,研究了本文中所用SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:71的肽是否呈递在表达人CAPRIN-1多肽的HLA-A0201+肿瘤细胞的HLA-A0201分子上和用所述肽刺激的CD8⁺T细胞是否能够破坏表达人CAPRIN-1多肽的HLA-A0201⁺肿瘤细胞。将经证实表达人CAPRIN-1多肽的10⁶个U-87MG人神经胶质瘤细胞(购自ATCC)收集于50-ml离心管，添加100μCi铬-51并且在37℃孵育2小时。此后,所述细胞用含有10%胎牛血清(下文称作“FBS”，Gibco)的RPMI培养基(Gibco)洗涤3次并以10³个细胞/孔的量添加至96孔V形底平板。另外，添加用所述肽刺激过的悬浮于含有10%FBS的RPMI培养基中的5×10⁴个HLA-A0201⁺的肽表位反应性CD8⁺T细胞并且培养在37℃于5%CO₂下进行4小时。在培养后，测量培养上清液中从破坏的肿瘤细胞释放的铬-51的量以确定肽刺激的CD8⁺T细胞的细胞毒活性。作为结果，发现肽刺激的HLA-A0201⁺CD8⁺T细胞具有针对U-87MG细胞的细胞毒活性(图4)。相反，用阴性对照肽(SEQ ID NO:77)诱导的CD8⁺T细胞不显示细胞毒活性。因此，发现本文中所用的肽(即，SEQ ID NO:43至SEQID NO:71的肽)被呈递在表达人CAPRIN-1多肽的HLA-A0201⁺肿瘤细胞的HLA-A0201分子上。另外，也发现所述肽能够诱导可破坏此类肿瘤细胞的CD8⁺细胞毒T细胞。

随后,以如上文所述的相同方式研究了本文中所用SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:76的肽是否呈递在表达人CAPRIN-1多肽的HLA-A24⁺肿瘤细胞的HLA-A24分子上和用所述肽刺激的CD8⁺T细胞是否能够破坏表达人CAPRIN-1多肽的HLA-A24⁺肿瘤细胞。将铬-51掺入表达人CAPRIN-1多肽的HLA-A24⁺JTK-LCL细胞，添加HLA-A24+和肽表位反应性CD8⁺T细胞，进行培养，并且测量培养上清液中从破坏的细胞释放的铬-51的量。作为结果，发现用SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:76的肽刺激的HLA-A24⁺CD8⁺T细胞具有针对JTK-LCL细胞的细胞毒活性(图5)。因此，发现SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:76的肽被呈递在表达人CAPRIN-1多肽的HLA-A24⁺细胞的HLA-A24分子上并且发现所述肽能够诱导能破坏此类细胞的CD8⁺细胞毒T细胞。用阴性对照肽(SEQ ID NO:77)诱导的CD8⁺T细胞不展示细胞毒活性。

为确定细胞毒活性，用本文中所用肽刺激和诱导的5×10⁴个CD8⁺T细胞与其中已经掺入铬-51的10³个U-87MG或JTK-LCL细胞混合，培养4小时，并且测量在培养后释放入培养基的铬-51的量。本文中所用的细胞毒活性意指根据以下计算式^*确定的CD8⁺T细胞针对U-87MG细胞或JTK-LCL细胞(即，靶细胞)的细胞毒活性。

式^*：细胞毒活性(%)=添加CD8+T细胞时从U-87MG或JTK-LCL细胞释放的铬-51的量/添加1N盐酸时从靶细胞释放的铬-51的量×100

工业应用性

本发明工业地用于治疗和预防癌症的目的。

本说明书包括日本专利申请号2008-202065的说明书和/或附图的全部或部分公开内容，其中本申请对所述的日本专利申请号要求优先权。本文中引用的全部出版物、专利和专利申请也通过引用的方式完整并入本文中。

序列表独立文本

SEQ ID NO:31:T3引物

SEQ ID NO:32:T7引物

SEQ ID NO:33至34：引物

SEQ ID NO:35至36：GAPDH引物

SEQ ID NO:37至42和80至81：引物

Claims (6)

1.多肽的用途或编码所述多肽的多核苷酸的用途，用于制备治疗或预防表达CAPRIN-1多肽的动物癌症的免疫诱导剂，其中癌症是乳腺癌、脑肿瘤、白血病、肺癌或食道癌，并且动物是人或犬，其中所述免疫诱导剂包含所述多肽或具有所述多核苷酸的重组载体作为有效成分，所述多肽具有免疫诱导活性并是以下多肽(a)，所述的重组载体能够在体内表达所述多肽：

(a)由选自序列表中所列SEQ ID NO:2或4所示氨基酸序列组成的多肽。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述免疫诱导剂包含一种或多种所述多肽作为有效成分。

3.根据权利要求2所述的用途,其中多肽是抗原呈递细胞的处理剂。

4.根据权利要求1至3任一项所述的用途，其中所述免疫诱导剂还包含免疫增强剂。

5.根据权利要求4所述的用途，其中免疫增强剂是选自由弗氏不完全佐剂、Montanide、聚肌胞和其衍生物、CpG寡核苷酸、白细胞介素12、白细胞介素18、干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素γ和Flt3配体组成的组中的至少一种佐剂或细胞因子。

6.重组载体的用途，用于制备治疗或预防表达CAPRIN-1多肽的动物癌症的免疫诱导剂，其中癌症是乳腺癌、脑肿瘤、白血病、肺癌或食道癌，并且动物是人或犬，其中所述重组载体包含编码具有免疫诱导活性并是以下多肽(a)的多肽的多核苷酸并能够在体内表达所述多肽：

(a)由选自序列表中所列SEQ ID NO:2或4所示氨基酸序列组成的多肽。