ES2832523T3

ES2832523T3 - Agente inductor de inmunidad

Info

Publication number: ES2832523T3
Application number: ES16786585T
Authority: ES
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2021-06-10
Anticipated expiration: 2036-04-28
Also published as: HUE052947T2; KR102676438B1; WO2016175309A1; EP3290048A4; BR112017021957A2; RU2017134664A3; MX2017013473A; AU2016253740A1; CN107530411A; EP3290048B1; JPWO2016175309A1; EP3290048A1; RU2744843C2; JP7160462B2; CN107530411B; PL3290048T3; RU2017134664A; CA2983575A1; AU2016253740B2; US11478539B2

Abstract

Una composicion para su uso en un metodo de tratamiento y/o prevencion de un cancer que expresa CSPG5 mediante la induccion de inmunidad en un sujeto, en donde la composicion comprende, como principio activo, (i) al menos un polipeptido que tiene actividad inductora de inmunidad y se selecciona del grupo que consiste en los siguientes polipeptidos (a), (b) y (c), o (ii) un vector recombinante que comprende un polinucleotido que codifica el polipeptido y que tiene la capacidad de expresar dicho polipeptido in vivo: (a) un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos representada por los SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14; (b) un polipeptido que tiene una identidad de secuencia del 85 % o mas con la secuencia de aminoacidos representada por los SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14; (c) un polipeptido que comprende los polipeptidos (a) o (b) como una secuencia parcial.

Description

DESCRIPCIÓN

Agente inductor de inmunidad

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo agente inductor de inmunidad que es útil como agente terapéutico y/o preventivo, o similar, para cánceres.

La presente invención también se refiere a una célula presentadora de antígeno o un linfocito T citotóxico para su uso en inmunoterapia contra el cáncer, o a un método para la preparación de las células.

Antecedentes de la técnica

El cáncer es la principal causa global de muerte. En la actualidad, la forma principal de técnica de tratamiento del cáncer es el tratamiento quirúrgico, que se lleva a cabo en combinación con radioterapia y quimioterapia. A pesar del desarrollo de nuevas técnicas quirúrgicas y el descubrimiento de nuevos agentes antineoplásicos en los últimos años, los resultados del tratamiento del cáncer aún no han mejorado, excepto en los casos de algunos tipos de cáncer. En los últimos años, se han identificado antígenos de cáncer reconocidos por linfocitos T citotóxicos que son reactivos al cáncer y genes que codifican antígenos de cáncer, junto con el desarrollo de la biología molecular y la inmunología del cáncer, y han aumentado las expectativas de una inmunoterapia específica para antígenos.

La inmunoterapia precisa la presencia específica de células cancerosas de un péptido, polipéptido o proteína que se reconozca como antígeno diana, así como una ausencia sustancial de los mismos en células normales desde el punto de vista del alivio de los efectos secundarios. En 1991, Boon et al. (Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, Bélgica) aislaron el antígeno de melanoma humano MAGE1 reconocido por el linfocito T CD8+ mediante la clonación de expresión de ADNc utilizando una línea de células cancerosas autólogas y linfocitos T reactivos al cáncer (bibliografía no de patentes 1). Después de eso, se informó sobre el método Se ReX (forma siglada de serological identification of antigens by recombinant expression cloning, identificación serológica de antígenos mediante clonación de expresión recombinante), que identifica el antígeno tumoral reconocido por el anticuerpo producido en respuesta al cáncer autólogo en el cuerpo de un paciente con cáncer mediante clonación de expresión génica (Literatura de patentes 1, Literatura de no patentes 2). Algunos antígenos de cáncer se han aislado mediante tales técnicas. Además, se han iniciado pruebas clínicas de inmunoterapia del cáncer dirigida a algunos de tales antígenos de cáncer.

Como en el caso de los seres humanos, sabe que los perros y gatos padecen diversos tumores, tales como el cáncer de glándula mamaria y el carcinoma de células escamosas, y los tumores ocupan un lugar destacado en las estadísticas de enfermedades caninas o felinas. Sin embargo, actualmente no existen agentes terapéuticos, preventivos o de diagnóstico eficaces para el cáncer canino o felino. La mayoría de los dueños de perros o gatos no se darían cuanta de los tumores caninos o felinos hasta que los tumores avancen y se agranden. Incluso si los tumores se extirpan mediante una operación quirúrgica o se administran fármacos para el uso humano (por ejemplo, fármacos contra el cáncer), los tumores a menudo ya no tienen cura y los animales mueren poco después del tratamiento. En estas circunstancias, si se dispone de agentes terapéuticos, preventivos y de diagnóstico para el cáncer que sean eficaces para perros o gatos, se puede esperar su aplicación para el cáncer canino o felino.

El proteoglucano de condroitín sulfato 5 (CSPG5, forma siglada de Chondroitin Sulfate Proteoglycan 5) es una proteína transmembrana de tipo 1 y es una de las proteínas de la familia de las neurregulinas. Además, se informa que CSPG5 se une a ErbB3 para actuar como factor de crecimiento; y que la expresión de CSPG5 aumenta en el cáncer de ovario que tiene una mutación de BRCA1 (Bibliografía no patentes 3 y 4). Se sabe además que CSPG5 se expresa de forma elevada en tejidos del sistema nervioso tales como las células ganglionares de la retina, células de Purkinje y el hipocampo, y actúa como un factor de proliferación/diferenciación de las células nerviosas implicadas en el alargamiento de los axones nerviosos (Bibliografía no de patentes 5, 6 y 7). Sin embargo, no ha habido informes de que la proteína CSPG5 tenga una actividad inductora de inmunidad contra las células cancerosas y, por lo tanto, sea útil para el tratamiento y la prevención de los cánceres.

La bibliografía no de patentes 8 divulga el uso de CSPG4 humana como vacuna de ADN en un modelo de melanoma canino. La bibliografía no de patentes 9 divulga una disminución de la expresión de CSPG5 en el carcinoma ductal invasivo de mama en comparación con el tejido de mama normal y que la disminución es mayor en los tumores de gran malignidad en comparación con los tumores de escasa malignidad. La bibliografía no de patentes 10 divulga que CSPG5 (neuroglucano-C) se expresa en líneas celulares de adenocarcinoma de colon y gástrico, y que se une a ERBB3 y estimula la proliferación de células de cáncer de mama humano.

LISTADO DE CITAS BILIOGRÁFICAS

Bibliografía de patentes

Bibliografía de patentes 1: Patente de Estados Unidos n.° 5698396

Bibliografía no de patentes

Literatura no de patentes 1: Bruggen, P. et al., Science, 254:1643-1647 (1991)

Literatura no de patentes 2: Sahin, U et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995)

Literatura no de patentes 3: Kinugasa, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun 321: 1045 (2004) Literatura no de patentes 4: Press, JZ. et al., Neoplasia. Dic.; 12 (12): 993-1002. (2010)

Literatura no de patentes 5: Yasuda, Y. et al., Neurosci. Res. 32: 313 (1998)

Literatura no de patentes 6: Aono, S. et al., J. Neurosci. Res.83: 110 (2006)

Literatura no de patentes 7: Nakanishi, K. et al., J. Biol. Chem. 281: 24970 (2006)

Literatura no de patentes 8: Riccardo, F. et al., Clin. Canc. Res. 20(14):3753-3762 (2014)

Literatura no de patentes 9: Yip, GW. et al., Breast 22(S1):S34 (2013)

Literatura no de patentes 10: Wu, WK. et al. Anticancer Res. 29(1):229-234

Sumario de la invención

Problema técnico

Es un objetivo de la presente invención encontrar un polipéptido nuevo útil para un agente terapéutico y/o preventivo del cáncer, y proporcionar tal polipéptido para su uso como agente inductor de inmunidad.

Solución del problema

Los presentes inventores realizaron estudios intensivos y, como resultado, han obtenido ahora un ADNc que codifica una proteína que se une a un anticuerpo presente en sueros de organismos vivos portadores de cáncer mediante el método SEREX, utilizando una biblioteca de ADNc obtenida de testículos caninos junto con sueros de perros portadores de cáncer. Basándose en el ADNc, los presentes inventores prepararon un polipéptido de proteoglucano de condroitín sulfato 5 canino (en lo sucesivo en el presente documento denominado "CSPG5") que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2. Adicionalmente, basándose en genes homólogos de ser humano, de gato y de ratón del gen obtenido, prepararon polipéptidos de CSPG5 de un ser humano, gato y ratón que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16. Los presentes inventores también han descubierto ahora que estos polipéptidos de CSPG5 se expresan específicamente en tejidos o células de cáncer de mama, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer de ovario, leucemia, linfoma maligno, adenocarcinoma, mastocitoma, carcinoma de células escamosas, melanoma o neuroblastoma. Adicionalmente, ahora han descubierto adicionalmente que se pueden inducir células inmunitarias contra CSPG5 in vivo administrando estos CSPG5 a organismos vivos, y que se puede reducir el tamaño de un tumor en los organismos vivos donde se expresa CSPG5. Además, ahora han descubierto que un vector recombinante que tiene la capacidad de expresar un polinucleótido que codifica el polipéptido de CSPG5 o un fragmento del mismo induce un efecto antitumoral en un cáncer que expresa CSPG5 in vivo.

Los presentes inventores también han descubierto ahora que el polipéptido de CSPG5 es presentado por una célula presentadora de antígeno y tiene una capacidad (es decir, una actividad inductora de inmunidad) de activar y hacer proliferar un linfocito T citotóxico específico para el polipéptido; que el polipéptido es útil para el tratamiento y/o la prevención de cánceres debido a su capacidad; y que la célula presentadora de antígeno, que estaba en contacto con el polipéptido, y el linfocito T, que estaba en contacto con la célula presentadora de antígeno, son útiles para el tratamiento y/o la prevención de cánceres. Basándose en los hallazgos, se logró la presente invención.

Por consiguiente, la presente invención proporciona composiciones para su uso, métodos de preparación de células presentadoras de antígeno, métodos de preparación de linfocitos T citotóxicos, células presentadoras de antígeno y linfocitos T citotóxicos, todo tal como se define en las reivindicaciones.

La descripción incluye los contenidos divulgados en la solicitud de patente JP n.° 2015-093354 de la que la presente solicitud reivindica la prioridad.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un nuevo agente inductor de inmunidad útil para, el tratamiento y/o la prevención, o similar, de cánceres. Cuando el polipéptido o el vector que codifica el polipéptido utilizado en la invención se administra a un sujeto, se pueden inducir células inmunitarias en el organismo vivo del sujeto y un cáncer que se ya ha aparecido puede reducirse en tamaño o remitir, como se muestra específicamente en los Ejemplos mencionados más adelante. Por tanto, el polipéptido o el vector es útil para el tratamiento o la prevención de cánceres.

Breve descripción de los dibujos

[Fig. 1] Esta figura muestra los patrones de expresión del gen de CSPG5 identificado en tejidos tumorales caninos o en líneas celulares de cáncer. El número de referencia 1 muestra patrones de expresión del gen de CSPG5 canino en tejidos y líneas celulares caninos individuales; y el número de referencia 2 muestra patrones de expresión del gen de GAPDH canino en tejidos y líneas celulares caninos individuales.

[Fig.2] Esta figura muestra los patrones de expresión del gen de CSPG5 identificado en tejidos tumorales humanos o en líneas celulares de cáncer. Se descubrió que el gen de GAPDH humano se expresaba en todos los tejidos y líneas celulares humanos.

[Fig. 3] Esta figura muestra los patrones de expresión del gen de CSPG5 identificado en tejidos tumorales de ratón o en líneas celulares de cáncer. El número de referencia 3 muestra patrones de expresión del gen de CSPG5 de ratón en tejidos y líneas celulares de ratón individuales; el número de referencia 4 muestra patrones de expresión del gen de GAPDH ratón en tejidos y líneas celulares de ratón individuales.

Descripción de las realizaciones

La presente invención se describirá más específicamente.

1. Polipéptido

Como polipéptido que tiene actividad inductora de inmunidad y está contenido como principio activo en la composición para el uso de la presente invención, se incluyen los polipéptidos definidos en los siguientes (a) a (c):

(a) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14;

(b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 85 % o más con la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14;

(c) un polipéptido que comprende el polipéptido (a) o (b) como una secuencia parcial.

En el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a una molécula formada por una pluralidad de aminoácidos unidos a través de un enlace peptídico, e incluye no solo una molécula polipeptídica constituida por un gran número de aminoácidos, sino también una molécula de bajo peso molecular (es decir, un oligopéptido) constituido por un pequeño número de aminoácidos, o una proteína de longitud completa. En la presente invención, también se incluye la proteína CSPG5 de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14.

En el presente documento, la frase "que tiene una (la) secuencia de aminoácidos" significa que los restos de aminoácidos se alinean en el orden mostrado en la secuencia de aminoácidos, a menos que se especifique otra cosa. Por consiguiente, por ejemplo, el "polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 8" se refiere a un polipéptido que tiene un tamaño de 566 restos de aminoácido y que consiste en la secuencia de aminoácidos de Met Gly Arg Ala, Gly .. (omisión).. Asn, Asn, Leu y Thr representada por el SEQ ID NO: 8. El "polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el s Eq ID NO: 8" a veces se denomina simplemente, por ejemplo, "el polipéptido del SEQ ID NO: 8". Lo mismo se aplica a la expresión "que tiene una (la) secuencia de nucleótidos". En la frase "que tiene una (la) secuencia de aminoácidos" o "que tiene una (la) secuencia de nucleótidos", la expresión "que tiene" puede reemplazarse por la expresión "consistente en", a menos que se especifique otra cosa.

En el presente documento, la expresión "actividad inductora de inmunidad" se refiere a la capacidad de inducir células inmunitarias que secretan citocinas, tales como interferón, en el organismo vivo de un sujeto.

En la presente, el término "sujeto" se refiere a un animal que necesita inducción de inmunidad para el tratamiento o la prevención de un cáncer (o tumor) mediante la composición para el uso de la presente invención, preferentemente, se refiere a un mamífero, incluido un ser humano, un animal de compañía, tal como un perro o un gato, un animal tal como un panda criado en un zoológico, un animal de granja tal como una vaca y un animal de carreras como un caballo.

Puede confirmarse si el polipéptido anterior tiene o no actividad inductora de inmunidad utilizando, por ejemplo, el ensayo ELISpot (ensayo ImmunoSpot ligado a enzimas) conocido en la técnica. De manera más específica, por ejemplo, como se describe en los siguientes Ejemplos, la actividad inductora de inmunidad puede evaluarse mediante: la obtención de células como células mononucleares de sangre periférica de un animal al que se le ha administrado el polipéptido a evaluar para determinar la actividad inductora de inmunidad; el cocultivo de las células con el polipéptido; y la medición de la cantidad de una citocina producida a partir de las células mediante el uso de un anticuerpo específico, determinando de este modo el número de células inmunitarias en las células.

Como se describe en los siguientes Ejemplos, cuando los polipéptidos de los anteriores (a) a (c) (preferentemente, un polipéptido recombinante) se administran cada uno a organismos vivos portadores de cáncer, los tumores pueden remitir debido a la actividad inductora de inmunidad de los polipéptidos. Por consiguiente, la actividad inductora de inmunidad puede evaluarse como una capacidad para suprimir la proliferación de células cancerosas o de reducir el tamaño de un tejido canceroso (tumor), o de eliminar un tejido canceroso (tumor) (en lo sucesivo denominado "actividad antitumoral"). La actividad antitumoral de un polipéptido se puede confirmar administrando de hecho el polipéptido a animales portadores de cáncer y examinando, por ejemplo, si se reduce o no el tamaño de un tumor, por ejemplo, como se describe específicamente en los siguientes Ejemplos. Como alternativa, la actividad antitumoral de un polipéptido puede evaluarse examinando, por ejemplo, si un linfocito T citotóxico, que se induce al administrar el polipéptido a animales portadores de cáncer, presenta actividad citotóxica para un tumor. Se puede determinar la actividad citotóxica de un linfocito T in vivo mediante la administración de un anticuerpo, que elimine al linfocito T de un organismo vivo, a animales portadores de cáncer, y examinar si se reduce o no el tamaño de un tumor. Sin embargo, el método para determinar la actividad citotóxica no se limita a los mencionados anteriormente.

Como alternativa, la actividad antitumoral de los polipéptidos mencionados anteriormente puede evaluarse examinando si los linfocitos T estimuladas con los polipéptidos (más específicamente, los linfocitos T que se ponen en contacto con las células presentadoras de antígeno que presentan los polipéptidos) presentan actividad citotóxica contra las células tumorales in vitro. Los linfocitos T y las células presentadoras de antígeno pueden ponerse en contacto entre sí mediante el cocultivo de ambas células en un medio líquido, como se describe más adelante. La actividad citotóxica puede medirse mediante el método conocido llamado ensayo de liberación de 51Cr, por ejemplo, descrito en D. D. Kharkevitch et al., Int. J. Cancer, 58: 317-323, 1994. Cuando los polipéptidos mencionados anteriormente se utilizan para el tratamiento y/o la prevención de cánceres, la actividad inductora de inmunidad se evalúa preferentemente utilizando la actividad antitumoral como indicador, aunque tal evaluación no se limita particularmente a la misma.

En la presente invención, las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 y 14 como se describe en el Listado de Secuencias son las secuencias de aminoácidos de CSPG5, que se aislaron, como los polipéptidos que se unen a anticuerpos específicos presentes en los sueros obtenidos de perros portadores de cáncer, mediante el método SEREX utilizando una biblioteca de ADNc obtenida de testículos caninos y los sueros de perros portadores de cáncer, y como factores homólogos de ser humano, gato y ratón (véase el Ejemplo 1). El CSPG5 humano, que es un homólogo humano homólogo con la CSPG5 de perro, tiene una identidad de secuencia de nucleótidos del 87 % y una identidad de secuencia de aminoácidos del 87 %. El CSPG5 de gato, que es un homólogo de gato, tiene una identidad de secuencia de nucleótidos del 92 % y una identidad de secuencia de aminoácidos del 91 %. El CSPG5 de ratón, que es un homólogo de ratón, tiene una identidad de secuencia de nucleótidos del 84 % y una identidad de secuencia de aminoácidos del 85 %.

Como se conoce en la técnica, si un polipéptido tiene aproximadamente 7 o más restos de aminoácido, entonces el polipéptido puede presentar antigenicidad e inmunogenicidad. Como tales, cuando el polipéptido tiene 7 o más restos de aminoácido consecutivos en la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ iD NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14, puede poseer una actividad inductora de inmunidad y, por tanto, puede utilizarse para la preparación del agente inductor de inmunidad de la divulgación.

Como principio de inducción inmunitaria mediante la administración de un polipéptido antigénico de cáncer, se conoce el siguiente procedimiento: un polipéptido se incorpora a una célula presentadora de antígeno y a continuación las peptidasas lo de degradan en la célula en fragmentos más pequeños, seguido de la presentación de los fragmentos sobre la superficie de la célula. Después, un linfocito T citotóxico o similar reconoce los fragmentos, el cual destruye selectivamente a las células que presentan el antígeno. El tamaño del polipéptido presentado sobre la superficie de la célula presentadora de antígeno es relativamente pequeño y es de aproximadamente 7 a 30 aminoácidos. Por lo tanto, desde el punto de vista de la presentación del polipéptido en la superficie de la célula presentadora de antígeno, un modo preferente del polipéptido (a) descrito anteriormente es un polipéptido compuesto por aproximadamente 7 a 30 aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14, y más preferentemente, es suficiente como polipéptido (a) un polipéptido compuesto por aproximadamente 8 a 30 o aproximadamente 9 a 30 aminoácidos. En algunos casos, estos polipéptidos relativamente pequeños se presentan directamente sobre la superficie de la célula presentadora de antígeno sin su incorporación en las células presentadoras de antígeno.

Además, dado que un polipéptido incorporado en una célula presentadora de antígeno se escinde en sitios aleatorios por medio de peptidasas de la célula, para proporcionar diversos fragmentos polipeptídicos, que después se presentan sobre la superficie de la célula presentadora de antígeno, la administración de un polipéptido grande tal como la región de longitud completa del SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14 inevitablemente provoca la producción de fragmentos polipeptídicos mediante degradación en la célula presentadora de antígeno, fragmentos que son eficaces para la inducción inmunitaria a través de la célula presentadora de antígeno. Por lo tanto, también para la inducción inmunitaria a través de células presentadoras de antígeno, se puede utilizar, preferentemente, un polipéptido grande, y el polipéptido puede estar compuesto por no menos de 30, preferentemente no menos de 100, más preferentemente no menos de 200, aún más preferentemente no menos de 250 aminoácidos. El polipéptido puede estar compuesto aún más preferentemente por la región de longitud completa del SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14.

El polipéptido descrito en (b) anterior es: un polipéptido, que tiene una identidad de secuencia del 85 % o más, el 90 % o más, preferentemente el 95 % o más, más preferentemente el 98 % o más, aún más preferentemente el 99 % o más, o el 99,5 % o más con la secuencia original (es decir, no modificada), y que tiene actividad inductora de inmunidad. En general, es ampliamente conocido por los expertos en la materia que un antígeno proteico, incluso si tiene una sustitución, deleción o una adición o inserción de un pequeño número de restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína, puede tener sustancialmente la misma antigenicidad que la proteína original. Por consiguiente, un polipéptido definido en (b) anterior puede presentar actividad inductora de inmunidad y, por tanto, puede utilizarse en la preparación de la composición para el uso de la presente invención. Además, es preferente que el polipéptido de (b) anterior sea preferentemente un polipéptido obtenido por sustitución, deleción y/o adición o inserción de uno o varios restos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14. En la memoria descriptiva, el término "varios" se refiere a un número entero de 2 a 10, preferentemente de 2 a 6 y más preferentemente de 2 a 4.

Como se usa en el presente documento, la expresión "identidad de secuencia" de secuencias de aminoácidos (o secuencias de nucleótidos) significa el valor calculado alineando dos secuencias de aminoácidos (o secuencias de nucleótidos) para compararlas de tal manera que el número de restos de aminoácido (o de nucleótidos) coincidentes sea el mayor como sea posible entre las secuencias de aminoácidos (o secuencias de nucleótidos), y dividiendo el número de restos de aminoácidos coincidentes (o el número de nucleótidos coincidentes) por el número total de restos de aminoácido (o el número total de nucleótidos), cuyo valor se representa como porcentaje. Cuando se realiza el alineamiento, se inserta un hueco (o huecos) en una o ambas de las dos secuencias a comparar según se precise. Dicho alineamiento de secuencias se puede llevar a cabo utilizando un programa muy conocido, tal como BLAST, FASTA o CLUSTAL W. Cuando se inserta un hueco (o huecos), el número total de restos de aminoácido descrito anteriormente es el número de restos calculado contando un hueco como un resto de aminoácido. Cuando el número total de restos de aminoácido así contados es distinto entre las dos secuencias a comparar, la identidad de secuencia (%) se calcula dividiendo el número de restos de aminoácido coincidentes por el número total de restos de aminoácido en la secuencia más larga.

Los 20 tipos de aminoácidos que constituyen las proteínas de origen natural se pueden clasificar en grupos en cada uno de los cuales se comparten propiedades similares, por ejemplo, en aminoácidos neutros con cadenas laterales que tienen baja polaridad (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), aminoácidos neutros que tienen una cadenas laterales hidrófilas (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), aminoácidos ácidos (Asp, Glu), aminoácidos básicos (Arg, Lys, His) y aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp). Se sabe que, en la mayoría de los casos, las sustituciones de aminoácidos dentro del mismo grupo no cambian las propiedades del polipéptido. Por lo tanto, en los casos en que uno o más restos de aminoácido del polipéptido (a) estén sustituidos, la probabilidad de que se pueda mantener la actividad inductora de inmunidad se vuelve alta por sustitución entre aminoácidos dentro de cada grupo, por lo que se prefiere la sustitución.

El polipéptido (c) comprende el polipéptido (a) o (b) como secuencia parcial del mismo, y tiene una actividad inductora de inmunidad. Es decir, el polipéptido (c) tiene al menos otro resto de aminoácido u otro polipéptido (o polipéptidos) (uno o más) añadidos en un extremo o en ambos extremos del polipéptido (a) o (b), y tiene una actividad inductora de inmunidad. Dicho polipéptido puede utilizarse también en la preparación de la composición para el uso de la presente invención.

Los polipéptidos anteriormente descritos pueden sintetizarse, por ejemplo, mediante un método de síntesis química, tal como el método de Fmoc (método de fluorenilmetiloxicarbonilo) o el método de tBoc (método de t-butiloxicarbonilo). Además, pueden sintetizarse mediante métodos convencionales utilizando diversos tipos de sintetizadores de péptidos disponibles en el mercado. Además, el polipéptido de interés puede obtenerse utilizando técnicas de ingeniería genética conocidas, preparando un polinucleótido que codifica el polipéptido anterior e incorporando el polinucleótido en un vector de expresión, que después se introduce en una célula hospedadora, seguido de dejar que el polipéptido se produzca en la célula hospedadora.

El polinucleótido que codifica el polipéptido anterior puede prepararse fácilmente mediante una técnica de ingeniería genética conocida o un método convencional utilizando un sintetizador de ácidos nucleicos disponible en el mercado. Por ejemplo, puede prepararse ADN que tenga la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1 llevando a cabo una PCR utilizando un ADN cromosómico canino o una biblioteca de ADNc como molde, y diseñarse una pareja de cebadores de tal forma que la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1 pueda amplificarse utilizando los cebadores. El ADN que tiene la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 3 se puede preparar de manera similar utilizando un ADN cromosómico humano o una biblioteca de ADNc como molde. Las condiciones de reacción para la PCR pueden ajustarse de manera adecuada y los ejemplos de las mismas incluyen, pero sin limitación, repetir el procedimiento de reacción de 94 °C durante 30 segundos (desnaturalización), 55 °C durante 30 segundos a 1 minuto (apareamiento) y 72 °C durante 2 minutos (extensión) como un ciclo, durante 30 ciclos, por ejemplo, seguido de la reacción a 72 °C durante 7 minutos. Además, el ADN deseado puede aislarse preparando una sonda (o sondas) o cebador (o cebadores) apropiado basado en la información de las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 1 y 3, en el Listado de Secuencias descrito en el presente documento, y cribando una biblioteca de ADNc de perro, ser humano o similar, utilizando la sonda (o sondas) o cebador (o cebadores). La biblioteca de ADNc se prepara preferentemente a partir de células, órganos o tejidos que expresan la proteína del SEQ ID NO: 2 o 4. Las operaciones descritas anteriormente, tales como la preparación de una sonda (o sondas) o cebador (o cebadores), la construcción de una biblioteca de ADNc, el cribado de una biblioteca de ADNc y la clonación del gen de interés son conocidas por los expertos en la materia y pueden llevarse a cabo de acuerdo con los métodos descritos en Molecular Cloning, Segunda edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Current Protocols in Molecular Biology (JOHN WILLY & SONS); y/o similares. A partir del ADN así obtenido, puede obtenerse el ADN que codifica el polipéptido (a). Además, dado que se conocen los codones que codifica cada aminoácido, puede especificarse fácilmente la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos específica. Por lo tanto, dado que la secuencia de bases de un polinucleótido que codifica el polipéptido (b) o el polipéptido (c) también se puede especificar fácilmente, tal polinucleótido también puede sintetizarse fácilmente utilizando un sintetizador de ácidos nucleicos disponible en el mercado de acuerdo con un método convencional.

Las células hospedadoras no están restringidas, siempre que puedan expresar el polipéptido descrito anteriormente, y los ejemplos de las mismas incluyen, pero sin limitación, células procariotas, tales como E. coli; y células eucariotas tales como células de mamífero en cultivo que incluyen células de riñón de mono COS1 y células de ovario de hámster chino CHO; levaduras en gemación; levaduras de fisión; células de gusano de seda; y células de huevos de Xenopus laevis.

Cuando se utilizan células procariotas como células hospedadoras, se utiliza un vector de expresión en el que se utiliza un origen que permite la replicación del vector en una célula procariota, un promotor, la secuencia de Shine-Dalgarno (o sitio de unión a ribosoma), un sitio de clonación de ADN, un terminador y/o similares. Los ejemplos del vector de expresión para E. coli incluyen el sistema pUC, pBluescript II, el sistema de expresión pET y el sistema de expresión pGEX. Al incorporar un a Dn que codifica el polipéptido anterior en tal vector de expresión y transformar células hospedadoras procariotas con el vector, seguido del cultivo de los transformantes resultantes, puede expresarse el polipéptido codificado por el ADN en células hospedadoras procariotas. En este procedimiento, también puede expresarse el polipéptido como una proteína de fusión con otra proteína.

Cuando se utilizan células eucariotas tales como células hospedadoras, se utiliza como vector de expresión un vector de expresión para células eucariotas que tiene un promotor, una región de corte y empalme, un sitio de adición de poli(A) y/o similares. Los ejemplos de tal vector de expresión incluyen pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, un vector de VEB, pRS, pcDNA3, pMSG y pYES2. Del mismo modo descrito anteriormente, al incorporar un ADN que codifica el polipéptido anterior en tal vector de expresión y transformar células hospedadoras eucariotas con el vector, seguido del cultivo de los transformantes resultantes, puede expresarse el polipéptido codificado por el ADN en células hospedadoras eucariotas. En los casos en que pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 o similar se utilicen como vector de expresión, el polipéptido anterior puede expresarse como una proteína de fusión en donde se haya añadido una etiqueta, tal como una etiqueta His, etiqueta FLAG, una etiqueta myc o GFP.

Para la introducción del vector de expresión en las células hospedadoras, pueden utilizarse métodos bien conocidos, tales como electroporación, el método de fosfato de calcio, el método de liposomas y el método de DEAE dextrano.

El aislamiento y purificación del polipéptido de interés a partir de las células hospedadoras puede llevarse a cabo mediante una combinación de operaciones de separación conocidas. Los ejemplos de las operaciones de separación conocidas incluyen, pero sin limitación, tratamiento con un desnaturalizante, tal como urea o con un tensioactivo; tratamiento con ultrasonidos; digestión enzimática; extracción por precipitación salina o fraccionada de disolventes; diálisis; centrifugación; ultrafiltración; filtración en gel; SDS-PAGE; isoelectroenfoque; cromatografía de intercambio iónico; cromatografía hidrófoba; cromatografía de afinidad; y cromatografía en fase reversa.

Los polipéptidos obtenidos mediante el método anterior también incluyen, como se ha mencionado anteriormente, aquellos en forma de una proteína de fusión con otra proteína arbitraria. Los ejemplos de las mismas incluyen proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST) o con una etiqueta His. Dicho polipéptido en forma de proteína de fusión también cae dentro del ámbito de la presente invención como el polipéptido (c) descrito anteriormente. Además, en algunos casos, un polipéptido expresado en una célula transformada se modifica de diversas formas en la célula después de la traducción. Dicho polipéptido modificado postraduccionalmente también cae dentro del ámbito de la presente invención siempre que tenga una actividad inductora de inmunidad. Los ejemplos de tal modificación postraduccional incluyen: eliminación de metionina N-terminal; acetilación N-terminal; glucosilación; degradación limitada por una proteasa intracelular; miristoilación; isoprenilación; y fosforilación.

2. Composición para el uso

Como se describe más específicamente en los Ejemplos descritos más adelante, un tumor que ya ha aparecido puede remitir por la administración del polipéptido que tiene una actividad inductora de inmunidad a un animal portador del tumor. Por tanto, la composición para el uso de la presente invención puede utilizarse para el tratamiento y/o la prevención de cánceres. Además, el polipéptido que tiene una actividad inductora de inmunidad puede utilizarse en un método de tratamiento y/o prevención de cánceres mediante inducción de la inmunidad.

Como se usa en el presente documento, los términos "tumor" y "cáncer" significan una neoplasia maligna y se usan indistintamente.

En este caso, el cáncer diana es un cáncer que expresa CSPG5, más preferentemente, cáncer de mama, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer de ovario, leucemia, linfoma maligno, adenocarcinoma, mastocitoma, carcinoma de células escamosas, melanoma o neuroblastoma, y de forma particular preferentemente, cáncer de mama, cáncer de pulmón, tumor cerebral, leucemia, linfoma maligno, mastocitoma, melanoma o neuroblastoma.

El animal de interés (es decir, el sujeto) es preferentemente un mamífero, como se describe anteriormente; más preferentemente un mamífero que comprende un primate, un animal de compañía, cualquier animal criado en un zoológico o similar, un animal de granja y un animal de carreras; y de forma particular, preferentemente un ser humano, perro o gato.

La vía de administración de la composición para el uso de la presente invención a un organismo vivo puede ser administración oral o administración parenteral, y es preferentemente administración parenteral, tal como administración intramuscular, administración subcutánea, administración intravenosa o administración intrarterial. Puede administrarse en un ganglio linfático regional próximo al tumor a tratar, como se describe a continuación en los Ejemplos, para potenciar su actividad antineoplásica. La dosis puede ser cualquier dosis siempre que la dosis sea eficaz para la inducción de inmunidad, y eficaz para el tratamiento y/o la prevención de los cánceres. La dosis eficaz para el tratamiento y/o la prevención de cánceres se selecciona apropiadamente dependiendo del tamaño y los síntomas de un tumor y similares, y la dosis eficaz es habitualmente de 0,0001 |jg a 1000 |jg, preferentemente de 0,001 jg a 1000 jg por sujeto animal por día, lo que puede administrarse de una vez o en varias veces. El agente se administra preferentemente en varias veces, cada varios días a varios meses. Como se indica específicamente a continuación en los Ejemplos, la composición para el uso de la presente invención puede provocar la remisión de un tumor que ya se ha aparecido. Por lo tanto, dado que el agente puede ejercer su actividad antineoplásica también contra un pequeño número de células cancerosas en un estadio temprano, puede prevenirse el desarrollo o la recidiva del cáncer utilizando el agente antes del desarrollo del cáncer o después de la terapia para el cáncer. Por tanto, la composición para el uso de la presente invención es eficaz tanto para el tratamiento como para la prevención de cánceres.

La composición para el uso de la presente invención puede consistir en el polipéptido (o polipéptidos) solo o puede estar en forma de una preparación obtenida mezclando apropiadamente aditivos tales como un vehículo, diluyente, excipiente farmacéuticamente aceptable, y similares, que sean adecuados para las formas de dosificación. El término "preparación" puede utilizarse indistintamente con "una composición para inducir inmunidad" o "un medicamento para inducir inmunidad". Un método para preparar una preparación, así como los aditivos utilizables, es bien conocido en el campo de las preparaciones farmacéuticas y se puede utilizar cualquier método y aditivo. Los ejemplos de aditivos incluyen, pero sin limitación, diluyentes tales como soluciones tampón fisiológicas; excipientes tales como azúcar, lactosa, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol y glicina; aglutinantes, tales como jarabe, gelatina, goma arábiga, sorbitol, cloruro de polivinilo y tragacanto; y lubricantes, tales como estearato de magnesio, polietilenglicol, talco y sílice. Los ejemplos de formas de dosificación pueden incluir preparaciones orales tales como comprimidos, cápsulas, gránulos, polvo y jarabes; y preparaciones parenterales, tales como inhalatorios, inyecciones, supositorios y soluciones. Estas preparaciones pueden producirse mediante métodos generalmente conocidos en la técnica.

La composición para el uso de la presente invención puede utilizarse en combinación con un inmunopotenciador que tiene la capacidad de potenciar la respuesta inmunitaria de un organismo vivo. El inmunopotenciador puede estar contenido en la composición para el uso de la presente invención o administrarse como una composición separada a un paciente, en combinación con la composición para el uso de la presente invención.

Los ejemplos de inmunopotenciador incluyen adyuvantes. Los adyuvantes pueden potenciar la respuesta inmunitaria proporcionando una reserva de antígeno (de manera extracelular o dentro de macrófagos), activando macrófagos y estimulando conjuntos específicos de linfocitos, potenciando de este modo la respuesta inmunitaria y, por tanto, la acción antineoplásica. Por lo tanto, la composición para el uso comprende preferentemente un adyuvante, además del polipéptido anteriormente descrito como ingrediente eficaz. Se conocen bien en la técnica muchos tipos de adyuvantes y puede utilizarse cualquiera de estos adyuvantes. Los ejemplos específicos de adyuvantes incluyen MPL (SmithKline Beecham), homólogos de polisacárido de Salmonella minnesota Re 595 obtenidos después de la purificación e hidrólisis ácida del lipopolisacárido; QS21 (SmithKline Beecham), saponina QA-21 pura purificada de un extracto de Quillja saponaria; d Qs 21 descrito en la solicitud PCT WO96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 y QS-L1 (So et al., "Molecules and Cells", 1997, Vol. 7, pág. 178-186); adyuvante incompleto de Freund; adyuvante completo de Freund; vitamina E; Montanide; Hidróxido de aluminio o alumbre; Oligonucleótidos CpG (véase, por ejemplo, Kreig et al., Nature, Vol. 374, pág. 546-549); poli-IC y derivados del mismo (por ejemplo, poli ICLC); y diversas emulsiones de agua en aceite preparadas a partir de aceites biodegradables tales como escualeno y/o tocoferol; y agalactosilceramida. Entre ellos, los preferentes son el adyuvante incompleto de Freund, Montanide, poli-IC y derivados del mismo, y oligonucleótidos CpG. La relación de la mezcla entre el adyuvante anteriormente descrito y el polipéptido es normalmente de aproximadamente 1:10 a 10:1, preferentemente de aproximadamente 1:5 a 5:1, más preferentemente de aproximadamente 1:1. Sin embargo, el adyuvante no se limita a los ejemplos descritos anteriormente, y cuando se administra la composición para el uso de la presente invención también pueden utilizarse adyuvantes conocidos en la técnica distintos de los descritos anteriormente (véase, por ejemplo, Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd edition", 1986). Los métodos de preparación para mezclas o emulsiones de un polipéptido y un adyuvante son muy conocidos para los expertos en el campo de la vacunación.

Además, además de los adyuvantes descritos anteriormente, pueden utilizarse factores que estimulen la respuesta inmunitaria de interés, como el inmunopotenciador descrito anteriormente. Por ejemplo, pueden utilizarse como inmunopotenciador en combinación con la composición para el uso de la presente invención diversas citocinas que tienen la propiedad de estimular linfocitos y/o células presentadoras de antígeno. Los expertos en la materia conocen una serie de tales citocinas que tienen la capaciad de potenciar la respuesta inmunitaria y los ejemplos de las mismas incluyen, pero sin limitación, interleucina 12 (IL-12), GM-CSF, IL-18, interferón a, interferón p, interferón w, interferón Y, y ligando de Flt3, que se ha demostrado que potencian la acción profiláctica de las vacunas. Dichos factores pueden utilizarse como inmunopotenciadores y administrarse a un paciente añadiéndolos a la composición para el uso de la presente invención, o administrarse como una composición independiente en combinación con la composición para el uso de la presente invención.

Poniendo el polipéptido descrito anteriormente en contacto con células presentadoras de antígeno (de un sujeto) ex vivo, in vivo o in vitro, puede hacerse que las células presentadoras de antígeno presenten el polipéptido. Es decir, el polipéptido (a), (b) o (c) descrito anteriormente se puede utilizar como el agente para el tratamiento de células presentadoras de antígeno. Los ejemplos de células presentadoras de antígeno que pueden utilizarse preferentemente incluyen células dendríticas o linfocitos B que tengan una molécula de MHC de clase I. Se han identificado y se conocen bien diversas moléculas de MHC de clase I. Las moléculas de MHC en seres humanos se denominan HLA. Los ejemplos de moléculas de HLA de clase I incluyen HLA-A, HLA-B y HLA-C, de manera más específica, HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401 y HLA-Cw0602.

Los ejemplos del uso del polipéptido descrito anteriormente en el tratamiento de células presentadoras de antígeno, como se describe a continuación en la Sección 3, incluyen el uso del polipéptido para la preparación de una célula presentadora de antígeno que contiene un complejo del polipéptido y una molécula de MHC, y el uso del polipéptido para la preparación de un linfocito T citotóxico específico para el polipéptido.

Pueden prepararse las células dendríticas o los linfocitos B que tengan una molécula de MHC de clase I a partir de sangre periférica mediante un método muy conocido. Por ejemplo, pueden inducirse células dendríticas específicas de tumores induciendo células dendríticas de la médula ósea, de sangre de cordón umbilical o de sangre periférica del paciente, utilizando factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) e IL-3 (o IL-4), y después añadiendo un péptido asociado a tumor al sistema de cultivo.

Al administrar una cantidad eficaz de tales células dendríticas, puede inducirse una respuesta deseada para la terapia de un cáncer. Como células a utilizar, pueden utilizarse médula ósea o sangre de cordón umbilical donada por un individuo sano, o médula ósea, sangre periférica o similares del propio paciente. Cuando se utilizan células autólogas del paciente, puede obtenerse una alta seguridad y se espera evitar efectos secundarios graves. La sangre periférica o la médula ósea pueden ser cualquiera de una muestra fresca, una muestra almacenada en frío y una muestra congelada. En lo referente a la sangre periférica, puede cultivarse sangre entera o pueden separarse y cultivarse solo los componentes leucocitarios, siendo esto último eficaz y por lo tanto preferente. Además, entre los componentes leucocitarios, pueden separarse células mononucleares. En los casos en que las células se originen en la médula ósea o en sangre del cordón umbilical, pueden cultivarse todas las células que constituyen la médula ósea o pueden separarse las células mononucleares de la misma y cultivarse. La sangre periférica, los componentes leucocitarios de la misma y las células de médula ósea contienen células mononucleares, células madre hematopoyéticas y células dendríticas inmaduras, a partir de las cuales se originan las células dendríticas, y también células CD4 positivas y similares. En lo referente a las citocinas a utilizar, el método de producción de las mismas no está restringido y puede emplearse una citocina de origen natural o recombinante, o similares, siempre que se haya confirmado su seguridad y actividad fisiológica. Preferentemente, se utiliza una preparación con una calidad para uso médico garantizada en la cantidad mínima necesaria. La concentración de la citocina (o citocinas) a añadir no está restringida siempre que se induzcan las células dendríticas a esa concentración, y habitualmente, la concentración total de la citocina (o citocinas) es preferentemente de aproximadamente 10-1000 ng/ml, más preferentemente de aproximadamente 20-500 ng/ml. El cultivo puede llevarse a cabo utilizando un medio muy conocido habitualmente utilizado para el cultivo de leucocitos. La temperatura de cultivo no está restringida siempre que se logre la proliferación de leucocitos a esa temperatura, y una temperatura de aproximadamente 37 °C, que es la temperatura corporal del ser humano, es la más preferente. El ambiente atmosférico durante el cultivo no está restringido siempre que se logre la proliferación de los leucocitos en el ambiente y está preferentemente ventilado con CO²al 5 %. El período de cultivo no está restringido siempre que se induzca el número necesario de células durante tal período, siendo habitualmente de 3 días a 2 semanas. En lo referente a los aparatos utilizados para la separación y el cultivo de las células, pueden emplearse aparatos adecuados, preferentemente aquellos cuya seguridad tras la aplicación a usos médicos se haya confirmado y cuyas operaciones sean estables y simples. En particular, en cuanto al aparato para el cultivo de células, no solo puede utilizarse un recipiente general tal como una placa de Petri, un matraz o una botella, sino también un recipiente de capa, un recipiente de múltiples fases, una botella rotatoria, una botella de tipo giratorio, un recipiente de cultivo de tipo bolsa, una columna de fibra hueca y similares.

Además, expresando un polinucleótido que codifica los polipéptidos (a), (b) o (c) en el cuerpo de un sujeto animal, puede inducirse en el organismo vivo la producción de anticuerpos y linfocitos T citotóxicos, y se puede obtener un efecto comparable al obtenido en el caso de la administración del polipéptido. Es decir, la composición para el uso de la presente invención puede ser una que comprenda, como ingrediente eficaz, un vector recombinante que tiene un polinucleótido que codifica el polinucleótido (a), (b) o (c), vector recombinante que tiene la capacidad de expresar el polipéptido en un organismo vivo. Dicho vector recombinante que tiene la capacidad de expresar un polipéptido antigénico como se muestra en los Ejemplos descritos a continuación también se denomina vacuna génica.

El vector utilizado para la producción de la vacuna génica no está restringido siempre que sea un vector que tiene la capacidad de expresar el polipéptido en una célula del sujeto animal (preferentemente en una célula de mamífero), y puede ser un vector plasmídico o un vector vírico y puede utilizarse cualquier el vector conocido en el campo de las vacunas génicas. El polinucleótido, tal como un ADN o ARN que codifica el polipéptido descrito anteriormente, se puede preparar fácilmente como se mencionó anteriormente mediante un método convencional. La incorporación del polinucleótido en el vector puede llevarse a cabo utilizando un método que conocen muy bien los expertos en la materia.

La vía de administración de la vacuna génica es preferentemente una ruta parenteral, tal como administración intramuscular, subcutánea, intravenosa o intraarterial, y la dosis puede seleccionarse de manera adecuada dependiendo del tipo de antígeno y similares, y habitualmente es de aproximadamente 0,1 |jg a 100 mg, preferentemente de aproximadamente 1 jg a 10 mg en términos del peso de la vacuna génica por 1 kg de peso corporal.

Los ejemplos del método que utiliza un vector vírico incluyen aquellos en donde se incorpora un polinucleótido que codifica el polipéptido descrito anteriormente en un virus de ARN o un virus de ADN, tal como un retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado, virus del herpes, virus de la variolovacuna, virus de la viruela, poliovirus o virus Sindbis, y después se infecta al sujeto animal con el virus resultante. Entre estos métodos, los que utilizan un retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado, virus de la variolovacuna o similar, son especialmente preferentes.

Los ejemplos de otros métodos incluyen un método en donde se administra un plásmido de expresión directamente por vía intramuscular (método de vacuna de ADN), un método de liposomas, un método de lipofectina, un método de microinyección, el método de fosfato de calcio y un método de electroporación, y son especialmente preferentes el método de vacuna de ADN y el método de liposomas.

Los métodos para permitir realmente que un gen que codifica el polipéptido descrito anteriormente utilizado en la presente invención actúe como un fármaco incluyen un método in vivo en donde el gen se introduce directamente en el cuerpo, y un método ex vivo en donde se recoge un determinado tipo de células de un sujeto aminal, y el gen se introduce en las células fuera del cuerpo, seguido de la devolución de las células al cuerpo (Nikkei Science, 1994, abril, pág. 20-45; The Pharmaceutical Monthly, 1994, Vol. 36, N.° 1, pág. 23-48; Experimental Medicine, Edición extra, 1994, Vol. 12, N.° 15; y las referencias citadas en esta bibliografía, y similares). Es más preferente el método in vivo.

Cuando el gen se administra mediante el método in vivo, puede administrarse mediante una vía de administración adecuada dependiendo de la enfermedad a tratar, el síntoma, y etc. El gen puede administrarse mediante, por ejemplo, administración intravenosa, intrarterial, subcutánea o intramuscular. Cuando el gen se administra mediante el método in vivo, puede formularse en una preparación, tal como una solución y, en general, se formula en una solución para inyección o similar que contiene Ad N que codifica el péptido anteriormente descrito de la presente invención como principio activo y, si es necesario, se puede añadir adicionalmente a la solución un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, solución salina fisiológica o solución tampón). En el caso de un liposoma o un liposoma de fusión de membrana (por ejemplo, un liposoma de virus Sendai (VHJ)) que contiene el ADN, puede formularse el liposoma en una preparación de liposomas, tal como una suspensión, una preparación congelada o una preparación congelada concentrada por centrifugación.

En la presente invención, "la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1" incluye no solo la secuencia de nucleótidos representada por la propia SEQ ID NO: 1, sino también la secuencia complementaria a la misma. Por tanto, "el polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1" incluye un polinucleótido monocatenario que tiene la secuencia de nucleótidos representada por la propia SEQ ID NO: 1, un polinucleótido monocatenario que tiene la secuencia de nucleótidos complementaria a la misma y un polinucleótido bicatenario compuesto de estos polinucleótidos monocatenarios. Cuando se prepara un polinucleótido que codifica un polipéptido utilizado en la presente invención, se selecciona una cualquiera de estas secuencias de nucleótidos de manera adecuada y los expertos en la materia pueden llevar a cabo fácilmente la selección.

3. Célula presentadora de antígeno o linfocito T citotóxico

La presente invención proporciona además un método para la preparación de una célula presentadora de antígeno que contiene un complejo del polipéptido mencionado anteriormente y una molécula de m Hc , que comprende poner en contacto el polipéptido con una célula presentadora de antígeno de un sujeto ex vivo o in vitro.

La presente invención también proporciona una célula presentadora de antígeno caracterizada por contener un complejo del polipéptido como se menciona anteriormente y una molécula de MHC y obtenida mediante el método.

El propio método de poner en contacto el polipéptido como se menciona anteriormente con una célula presentadora de antígeno ex vivo o in vitro, puede llevarse a cabo mediante un método muy conocido en la técnica, por ejemplo, mediante el cultivo de la célula presentadora de antígeno en un líquido de cultivo que contenga el polipéptido. Como medio, pueden utilizarse medios disponibles en el mercado para el cultivo de células presentadoras de antígeno. La concentración del péptido en el medio, que no está particularmente limitada, es habitualmente de aproximadamente 1 a 100 |jg/ml y es preferentemente de aproximadamente 5 a 20 |jg/ml. La densidad celular durante el cultivo, que no está particularmente limitada, es habitualmente de aproximadamente 103 a 107 células/ml y preferentemente de aproximadamente 5 x 104 a 5 x 106 células/ml. El cultivo se lleva a cabo preferentemente mediante métodos rutinarios a 37 °C en atmósfera de CO²al 5 %. La longitud del péptido que puede presentar la célula presentadora de antígeno en su superficie es habitualmente de aproximadamente 30 restos de aminoácido como máximo. Por consiguiente, cuando la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el polipéptido ex vivo o in vitro, el polipéptido se puede preparar para que tenga una longitud de 30 restos de aminoácidos o menos; sin embargo, el método no se limita a esto.

Mediante el cultivo de la célula presentadora de antígeno en presencia del polipéptido como se menciona anteriormente, el polipéptido se integra en una molécula de MHC de la célula presentadora de antígeno y se presenta en la superficie de la célula presentadora de antígeno. Por consiguiente, es posible preparar una célula presentadora de antígeno aislada que contenga un complejo del polipéptido y la molécula de MHC. Dicha célula presentadora de antígeno puede presentar el polipéptido in vivo, ex vivo o in vitro a un linfocito T y puede inducir y depositar un linfocito T citotóxico específico para el polipéptido.

La presente invención proporciona además un método para la preparación de un linfocito T citotóxico específico para el polipéptido como se menciona anteriormente, que comprende poner en contacto la célula presentadora de antígeno con un linfocito T de un sujeto ex vivo o in vitro, para activar el linfocito T.

La presente invención también proporciona un linfocito T citotóxico específico para el polipéptido como se menciona anteriormente, obtenido mediante este método.

Al ponerse en contacto con una célula presentadora de antígeno, que contiene un complejo del polipéptido como se menciona anteriormente y una molécula de MHC, preparada de la manera mencionada anteriormente, con un linfocito T ex vivo o in vitro, puede inducirse y proliferar el linfocito T citotóxico específico para el polipéptido. El contacto se puede hacer cocultivando la célula presentadora de antígeno y el linfocito T en un medio líquido; por ejemplo, suspendiendo la célula presentadora de antígeno en un medio líquido, colocando la suspensión resultante en un recipiente, tal como pocillos de una microplaca, añadiendo el linfocito T a los pocillos y cultivándolos. La relación de la mezcla de la célula presentadora de antígeno y el linfocito T durante el cocultivo, que no está particularmente limitada, es, habitualmente, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:100, preferentemente de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:20 en términos de una relación de número de células. La densidad de la célula presentadora de antígeno en el medio líquido, que no está particularmente limitada, es, habitualmente, de aproximadamente 100 a 10.000.000 células/ml y preferentemente de aproximadamente 10.000 a 1.000.000 células/ml. El cocultivo se lleva a cabo preferentemente mediante métodos rutinarios a 37 °C en atmósfera de CO²al 5 %. Como medio, se puede utilizar un medio de cultivo disponible en el mercado para células presentadoras de antígeno/linfocitos T. El tiempo de cultivo, que no está particularmente limitado, es, habitualmente, de aproximadamente 2 días a 3 semanas y preferentemente de aproximadamente 4 días a 2 semanas. El cocultivo se lleva a cabo preferentemente en presencia de uno o más tipos de interleucinas, tales como IL-2, IL-6, IL-7 y IL-12. En este caso, las concentraciones de IL-2 e IL-7 son habitualmente de aproximadamente 5 a 20 U/ml, la concentración de IL-6 es habitualmente de aproximadamente 500 a 2000 U/ml y la concentración de IL-12 es habitualmente de aproximadamente 5 a 20 ng/ml; sin embargo, las concentraciones no se limitan a estas. El cocultivo puede repetirse una o varias veces complementando la célula presentadora de antígeno fresca. Por ejemplo, puede repetirse una o varias veces una operación que comprende descartar el sobrenadante del cultivo después del cocultivo, añadir una suspensión de la célula presentadora de antígeno fresca y llevar a cabo el cocultivo. Las condiciones de cocultivo pueden ser las mismas que las anteriores.

A través del cocultivo, se induce y prolifera el linfocito T citotóxico específico para el polipéptido. Por consiguiente, el uso del polipéptido mencionado anteriormente puede utilizarse para preparar un linfocito T aislado que se une selectivamente a un complejo del polipéptido y la molécula de MHC.

Como se describe en los siguientes Ejemplos, el gen de CSPG5 se expresa específicamente en una célula de cáncer de mama, un tejido de cáncer de mama, una célula de cáncer de pulmón, un tejido de cáncer de pulmón, una célula de cáncer de hígado, un tejido de cáncer de hígado, una célula de tumor cerebral, un tejido de tumor cerebral, una célula de cáncer de ovario, un tejido de cáncer de ovario, leucemia, linfoma maligno, una célula de adenocarcinoma, un tejido de adenocarcinoma, mastocitoma, una célula de carcinoma de células escamosas, una célula de melanoma o una célula de neuroblastoma. Por consiguiente, en estos cánceres, se cree que la CSPG5 está significativamente más presente que en las células normales. Si se administra in vivo el linfocito T citotóxico preparado de la manera descrita anteriormente, de forma que la molécula MHC presenta en la superficie de una célula cancerosa una parte del polipéptido de CSPG5 existente en las células cancerosas, el linfocito T citotóxico puede dañar la célula cancerosa utilizando la parte del polipéptido de CSPG5 como marcador. La célula presentadora de antígeno que presenta una parte del polipéptido de CSPG5 puede inducir y proliferar el linfocito T citotóxico específico para el polipéptido in vivo. Por tanto, las células cancerosas también pueden dañarse al administrar la célula presentadora de antígeno a un organismo vivo. De manera más específica, el linfocito T citotóxico y la célula presentadora de antígeno preparadas mediante el uso del polipéptido mencionado anteriormente también son útiles para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, de manera similar a la composición para el uso de la presente invención.

En los casos en que las células presentadoras de antígeno aisladas descritas anteriormente o los linfocitos T aislados se administren a un organismo vivo, estos se preparan preferentemente tratando las células presentadoras de antígeno o los linfocitos T recogidos del paciente para tratarlos con el polipéptido (a), (b) o (c) como se describe anteriormente, para evitar la respuesta inmunitaria en el organismo vivo que ataca a estas células como cuerpos extraños.

El agente de tratamiento y/o prevención del cáncer que comprende, como ingrediente eficaz, las células presentadoras de antígeno o los linfocitos T, se administra preferentemente a través de administración parenteral, por ejemplo, mediante administración intravenosa o intrarterial. La dosis se selecciona de manera adecuada dependiendo de los síntomas, el fin de la administración y similares, y es habitualmente de 1 célula a 10.000.000.000.000 de células, preferentemente de 1.000.000 de células a 1.000.000.000 de células, dosis que se administra preferentemente de una vez cada varios días a una vez cada varios meses. La preparación puede ser, por ejemplo, las células suspendidas en solución salina tamponada fisiológica, y la preparación puede utilizarse en combinación con otro agente (o agentes) antineoplásico, citoquina (o citocinas), o similares. Además, también pueden añadirse uno o más aditivos bien conocidos en el campo de los productos farmacéuticos.

Ejemplos

Ahora, la presente invención se describirá a continuación de manera más concreta basándose en Ejemplos; sin embargo, el ámbito de la presente invención no está limitado por los Ejemplos.

<Obtención de una nueva proteína antigénica de cáncer mediante el método SEREX>

(1) Preparación de la biblioteca de ADNc

Se extrajo ARN total de testículos caninos en conformidad con el método ácido guanidinio-fenol-cloroformo, y después, el ARN poli(A) se purificó utilizando el kit de purificación de ARNm Oligotex-dT30 (Takara Shuzo Co., Ltd., Kioto, Japón), en conformidad con el protocolo adjunto al kit.

Utilizando el ARNm obtenido (5 |jg) se sintetizó una fagoteca de ADNc. Para la preparación de la fagoteca de ADNc, se utilizó el kit de síntesis de ADNc, el kit de síntesis Zap-cDNA o el kit de clonación ZAP-cDNA GigapacklII Gold (STRATAGENE), en conformidad con el protocolo adjunto al kit. El tamaño de la fagoteca de ADNc preparada fue de 1 x 106 ufp/ml.

(2) Cribado de la biblioteca de ADNc con suero

Utilizando la fagoteca de ADNc preparada, se llevó a cabo una inmunocribado. De manera más específica, se infectó la E. coli (XL1-Blue MRF') hospedadora con el fago para obtener 2340 clones en una placa de agarosa NZY de O 90 x 15 mm y se cultivó a 42 °C durante 3-4 horas para obtener placas. La placa se cubrió con membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Science) impregnada con IPTG (isopropil-p-D-tiogalactósido) a 37 °C durante 4 horas, para inducir la expresión de proteínas, y la proteína se transfirió a la membrana. Después de eso, se tomó la membrana, se empapó en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM pH 7,5) que contenía leche desnatada en polvo al 0,5 % y se agitó a 4 °C durante una noche para suprimir una reacción inespecífica. Se dejó que este filtro reaccionara con el suero diluido 500 veces de un perro enfermo a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.

Como sueros de perros enfermos mencionados anteriormente se utilizaron sueros extraídos de perros con cáncer de mama. Estos sueros se almacenaron a -80 °C y se pretrataron inmediatamente antes de su uso. El método de pretratamiento de los sueros fue el siguiente. Es decir, en primer lugar, la Escherichia coli (XL1-Blure MRF') hospedadora se infectó con fago A ZAP Express, en el que no había ningún gen extraño insertado, y después se cultivó en un medio de placa NZY a 37 °C durante una noche. Posteriormente, se añadió a la placa tampón de NaHCO30,2 M (pH 8,3) que contenía NaCl 0,5 M, y se dejó reposar la placa a 4 °C durante 15 horas, seguido de la recogida del sobrenadante como un extracto de E.coli/fagos. Después de eso, se dejó que el extracto de Escherichia coli/fago recogido fluyera a través de una columna NHS (GE Healthcare Bio-Science) para inmovilizar las proteínas procedentes de Escherichia coli/fago en la columna. Se dejó que el suero del paciente canino fluyera a través y reaccionara con la columna con proteínas inmovilizadas, para retirar del suero los anticuerpos adsorbidos a Escherichia coli y fagos. La fracción de suero que pasó a través de la columna se diluyó 500 veces con TBS que contenía leche desnatada en polvo al 0,5 %, y el diluyente resultante se utilizó como material para la inmunocribado.

La membrana a la que se transfirieron el suero así tratado y las proteínas de fusión descritas anteriormente se lavó con TBS-T (Tween 20 al 0,05 %/TBS) 4 veces, y se dejó reaccionar con IgG de cabra anti-perro (IgG-h+1 de cabra anti de perro conjugado a HRP; BETHYL Laboratories) diluido 5.000 veces con TBS que contenía leche desnatada en polvo al 0,5 % como anticuerpo secundario, a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de la detección por la reacción de coloración de la enzima utilizando la solución de reacción NBT/BCIP (Roche). Las colonias en las posiciones en que se observó una reacción de coloración positiva se recuperaron de la placa de agarosa NZY con un tamaño de 090 * 15 mm, y se disolvieron en 500 pl de tampón SM (NaCI 100 mM, MgClSO410 mM, Tris-HCl 50 mM, gelatina al 0,01 %; pH 7,5). El cribado se repitió como una segunda y una tercera cribado, de la misma manera que se describe anteriormente, hasta que se obtuvo una única colonia positiva para la reacción de coloración, aislando de este modo un clone positivo después del cribado de 9110 clones de fagos reactivos con IgG en el suero.

(3) Búsqueda de identidad de secuencia de los genes de antígeno aislados

Para someter al único clon positivo aislado mediante el método descrito anteriormente a un análisis de secuencia de nucleótidos, se llevó a cabo una operación de conversión del vector de fago en un vector plasmídico. Específicamente, se mezclaron una solución (200 pl) que contenía la Escherichia coli (XL1-Blue MRF') hospedadora preparada para mostrar una DO⁶⁰⁰de absorbancia de 1,0, una solución de fagos purificada (100 pl) y 1 pl adicional de fago auxiliar ExAssist (STRATAGENE), y se dejó reaccionar a 37 °C durante 15 minutos. Se añadió medio LB (3 ml) y se llevó a cabo el cultivo a 37 °C durante 2,5-3 horas. El cultivo resultante se mantuvo inmediatamente en un baño de agua a 70 °C durante 20 minutos y a continuación se centrifugó a 4 °C a 1000 X g durante 15 minutos para recuperar el sobrenadante como una solución de fagémido. Posteriormente, se mezclaron una solución (200 pl) que contenía la Escherichia coli (SOLR) hospedadora de fagémido preparada para tener una DO⁶⁰⁰de absorbancia de 1,0 y la solución de fagos purificada (10 pl), y se dejó reaccionar a 37 °C durante 15 minutos. La solución resultante (50 pl) se sembró en un medio de agar LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 pg/ml) y se cultivó a 37 °C durante una noche. Se recogió una única colonia de SOLR transformada, se cultivó en medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 pg/ml) a 37 °C y, después de eso, se purificó con el kit QIAGEN plasmid Miniprep (QIAGEN) para obtener un ADN plasmídico que tuviera el inserto deseado.

El plásmido purificado se sometió barrido con cebadores (primer walking) utilizando el cebador de T3 representado por el SEQ iD NO: 17 y el cebador de T7 representado por el SEQ ID NO: 18, para analizar la secuencia completa del inserto. La secuencia génica representada por el SEQ ID NO: 1 se obtuvo mediante el análisis por secuenciación. Utilizando la secuencia de nucleótidos del gen y la secuencia de aminoácidos del mismo, se llevó a cabo la búsqueda de identidad de secuencia, que es una búsqueda de una secuencia idéntica con genes conocidos, mediante el programa de búsqueda de identidad de secuencias búsqueda BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Como resultado, se descubrió que el gen obtenido anteriormente es el gen de Cs PG5. En el de CSPG5 humana, que es un factor humano homólogo a la CSPG5 de canino, la identidad de secuencia de nucleótidos y la identidad de secuencia de aminoácidos con la CSPG5 de canino fueron ambas del 87 %. En CSPG5 de gato, la identidad de secuencia de nucleótidos fue del 92 % y la identidad de secuencia de aminoácidos fue del 91 %. En el factor homólogo de ratón, es decir, CSPG5 de ratón, la identidad de secuencia de nucleótidos fue del 84 % y la identidad de secuencia de aminoácidos fue del 85 %. Las secuencias de nucleótidos de la CSPG5 de ser humano están representadas por las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 y 11, y sus secuencias de aminoácidos están representadas por las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 y 12. La secuencia de nucleótidos de CSPG5 de gato está representada por el SEQ ID NO: 13 y la secuencia de aminoácidos de la misma está representada por el SEQ ID NO: 14. La secuencia de nucleótidos de CSPG5 de ratón está representada por el SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de la misma está representada por el SEQ ID NO: 16.

(4) Análisis de expresión génica en distintos tejidos

La expresión de los genes obtenidos mediante el método anterior en tejidos normales y tejidos cancerosos, y en líneas celulares de cáncer de perros, seres humanos y ratones, se examinó mediante un método de RT-PCR (transcripción inversa-PCR). La reacción de retrotranscripción se llevó a cabo del siguiente modo. En primer lugar, se extrajeron los ARN totales de tejidos individuales (50-100 mg) y líneas celulares individuales (5-10* 106 células) mediante el uso de reactivo TRIZOL (Invitrogen) en conformidad con el protocolo adjunto. Utilizando los ARN totales, se sintetizaron los ADNc utilizando Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) en conformidad con el protocolo adjunto. Como los ADNc de tejidos humanos normales (del cerebro, hipocampo, testículos, colon y placenta), se utilizaron ADNc de agrupamiento de genes (Invitrogen), ADNc QUICK-Clone (Clontech) y Large-Insert cDNA Library (Clontech). La reacción de PCR se llevó a cabo utilizando los cebadores específicos de genes obtenidos (los cebadores para canino están representados por las SEQ ID NO: 19 y 20, los cebadores para ser humano están representados por las SEQ ID NO: 21 y 22, los cebadores para ratón están representados por las SEQ ID NO: 23 y 24), como sigue. Es decir, se añadieron los reactivos al tampón adjunto, en donde los reactivos contienen 0,25 pl de la muestra preparada mediante la reacción de transcripción inversa, los cebadores anteriores (2 pM para cada uno), los dNTP (0,2 mM para cada uno) y 0,65 U de una polimerasa ExTaq (Takara Shuzo Co., Ltd.). La mezcla de reacción, de 25 pl en total, se sometió a PCr utilizando un termociclador (BIO RAD). En la PCR, se repitieron 30 ciclos, en donde un ciclo consiste en los tratamientos: a 94 °C durante 30 segundos; 55 °C durante 30 segundos; y a 72 °C durante un minuto. Para la comparación, se utilizaron simultáneamente cebadores específicos de GAPDH (es decir, cebadores para GAPDH de canino y de humana representados por las SEQ ID NO: 25 y 26, y cebadores para GAPDH de ratón representados por las SEQ ID NO: 27 y 28). Como resultado, como se muestra en la Fig. 1, el gen de CSPG5 de canino no se expresó en casi todos los tejidos de canino normales, pero se expresó fuertemente en los tejidos tumorales de canino. De manera similar al gen CSPG5 de canino, la expresión de los genes de CSPG5 humana y de ratón en tejidos de ser humano y de ratón normales casi no se confirmó; sin embargo, la expresión de los mismos se detectó en células cancerosas, es decir, cáncer de mama, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer de ovario, leucemia, líneas celulares de linfoma maligno (las Fig. 2 y 3).

<Análisis de la antigenicidad para el cáncer in vivo de CSPG5 >

(1) Preparación de un vector recombinante que expresa CSPG5 in vivo

Se preparó un vector recombinante que expresa CSPG5 in vivo basándose en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 15, en conformidad con el siguiente método. La PCR se llevó a cabo de la siguiente manera. Se preparó una mezcla de reacción añadiendo reactivos: una molécula de ADNc (1 |jl), que se preparó a partir de la línea celular 1 de neuroblastoma de ratón (N2a: adquirida en ATCC), cuya expresión se observó en el Ejemplo 1, dos tipos de cebadores (0,4 jM para cada uno) que tienen secuencias de escisión con las enzimas de restricción HindlII y Xbal (representadas por las SEQ ID NO: 29 y 30), los DNTP 0,2 mM y 1,25 U de polimerasa PrimeSTAR HS (Takara Shuzo Co., Ltd.), y el tampón adjunto, para obtener una cantidad total de 50 j l ; y se sometió a PCR utilizando un termociclador (BIO RAD). En la PCR, se repitieron 30 ciclos, en donde un ciclo consiste en los tratamientos: a 98 °C durante 10 segundos; a 55 °C durante 15 segundos; y a 72 °C durante 4 minutos. Los dos tipos de cebadores mencionados anteriormente se utilizaron para amplificar una región que codifica una secuencia de aminoácidos de longitud completa representada por el SEQ ID NO: 15. Después de la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1000 pb mediante el uso del kit QIAquick Gel Extraction Kit (QIa Ge N).

El fragmento de ADN purificado se ligó al vector de clonación pCR-Blunt (Invitrogen), vector que después se transformó en células E. coli, seguido de la recuperación del vector plasmídico. Mediante su secuenciación, se confirmó que la secuencia del fragmento de gen amplificado era idéntica a la secuencia deseada. El plásmido cuya secuencia era idéntica a la secuencia deseada se trató con las enzimas de restricción HindIII y Xbal. Después de llevar a cabo la purificación con el kit QIAquick Gel Extraction Kit, se insertó una secuencia génica deseada en el vector de expresión en mamíferos PCDNA3.1 (Invitrogen) tratado con las enzimas de restricción HindIII y Xbal. Debido al uso del vector, la proteína CSPG5 se produce en una célula de mamífero.

Para el ADN plasmídico (100 jg ) preparado anteriormente, se añadieron 50 jg de partículas de oro (Bio Rad), espermidina (100 j l) (SIGMa ) y CaCh 1 M (100 j l (SIGMA)). La mezcla se agitó mediante un agitador vorticial y se dejó reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente (en lo sucesivo denominadas "partículas de oro-ADN"). Después de centrifugar a 3000 rpm durante un minuto, se descartó el sobrenadante, seguido del lavado del sedimento tres veces con etanol al 100 % (WAKO). A las partículas de oro-ADN, se les añadió etanol al 100 % (6 ml) y la mezcla se agitó suficientemente mediante un agitador vorticial. Las partículas de oro-ADN se vertieron en un tubo Tefzel (Bio Rad) para precipitarlas en su pared. El tubo Tefzel con las partículas de oro-ADN unidas se secó al aire mediante la eliminación de etanol y después de eso se cortó en trozos que tenían una longitud adecuada para su uso en un cañón de genes.

(2) Efecto antitumoral de CSPG5 mediante el método de vacuna de ADN

Se utilizaron diez ratones A/J (de 7 semanas de edad, machos, adquiridos en Japan SLC). El tubo preparado anteriormente se inmovilizó en un cañón de genes. Se administró por vía percutánea una vacuna de ADN a la cavidad peritoneal afeitada de los ratones, con la ayuda de gas helio puro a una presión de 2,76 MPa (400 psi), tres veces cada 7 días (cantidad de inoculación de ADN plasmídico: 2 jg/animal). Después de la administración percutánea, se injertaron en cada ratón células N2a, que son una línea celular de neuroblastoma de ratón, para evaluar el efecto antitumoral (denominado modelo de prevención). Para el control, se administró a 10 ratones en cada grupo modelo el ADN plasmídico sin el gen de CSPG5 insertado.

El efecto antitumoral se evaluó en cuanto al tamaño del tumor (diámetro largo * (diámetro corto)2 / 2) y la tasa de ratones supervivientes. Como resultado, en el modelo de prevención, los tamaños tumorales después de 21 días del grupo de control y del grupo de administración del plásmido de CSPG5 fueron de 1866 mm3 y 459 mm3, respectivamente. Por tanto, se descubrió que el tamaño tumoral se redujo significativamente en el grupo de administración de plásmido de CSPG5. Como resultado de que se observó una situación de supervivencia en el modelo de prevención, todos los casos del grupo de control murieron 54 días después de la administración; mientras que en el grupo de administración del plásmido de CSPG5, el 60 % de los ratones estaban vivos. A partir de estos resultados, se demostró el efecto antitumoral significativo en el grupo de administración de plásmido de CSPG5 en comparación con el grupo de control.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona una composición para su uso que comprende un polipéptido que presenta una actividad antitumoral contra cánceres y, por tanto, es útil para el tratamiento y/o la prevención de cánceres.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en un método de tratamiento y/o prevención de un cáncer que expresa CSPG5 mediante la inducción de inmunidad en un sujeto, en donde la composición comprende, como principio activo, (i) al menos un polipéptido que tiene actividad inductora de inmunidad y se selecciona del grupo que consiste en los siguientes polipéptidos (a), (b) y (c), o (ii) un vector recombinante que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido y que tiene la capacidad de expresar dicho polipéptido in vivo:

(a) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por los SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14;

(b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 85 % o más con la secuencia de aminoácidos representada por los SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14;

(c) un polipéptido que comprende los polipéptidos (a) o (b) como una secuencia parcial.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido que tiene actividad inductora de inmunidad es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por los SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el polipéptido se incorpora en células presentadoras de antígeno.

4. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en tumor cerebral, leucemia, linfoma maligno y neuroblastoma.

5. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende adicionalmente un inmunopotenciador.

6. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el inmunopotenciador es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en adyuvante incompleto de Freund, Montanide, Poli IC y derivados del mismo, oligonucleótidos CpG, interleucina 12, interleucina 18, interferón a, interferón p, interferón w, interferón y y ligando de Flt 3.

7. Un método para la preparación de una célula presentadora de antígeno que contiene un complejo de un fragmento de un polipéptido y una molécula de MHC, que comprende poner en contacto el polipéptido con una célula presentadora de antígeno de un sujeto ex vivo o in vitro, en donde el polipéptido tiene actividad inductora de inmunidad y se selecciona del grupo que consiste en los siguientes polipéptidos (a), (b) y (c):

(b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 85 % o más con la secuencia de aminoácidos representada por los SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 o 14; y

(c) un polipéptido que comprende los polipéptido (a) o (b) como una secuencia parcial.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica o un linfocito B que tiene una molécula de MHC de clase I.

9. Un método para la preparación de un linfocito T citotóxico específico para un polipéptido, que comprende poner en contacto la célula presentadora de antígeno obtenida mediante el método de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8 con un linfocito T de un sujeto ex vivo o in vitro, activando de este modo el linfocito T, en donde el polipéptido tiene actividad inductora de inmunidad y se selecciona del grupo que consiste en los siguientes polipéptidos (a), (b) y (c):

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el método comprende cocultivar las células en presencia de al menos una interleucina seleccionada del grupo que consiste en interleucina 2, interleucina 6, interleucina 7 e interleucina 12.

11. Una célula presentadora de antígeno obtenida mediante el método de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, y que contiene un complejo de un fragmento de un polipéptido y una molécula de MHC, en donde el polipéptido tiene actividad inductora de inmunidad y se selecciona del grupo que consiste en los siguientes polipéptidos (a), (b) y (c):

12. Un linfocito T citotóxico obtenido mediante el método de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, y específico para un polipéptido, en donde el polipéptido tiene actividad inductora de inmunidad y se selecciona del grupo que consiste en los siguientes polipéptidos (a), (b) y (c):

13. La composición para su uso, el método, la célula presentadora de antígeno o el linfocito T citotóxico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la identidad de secuencia es del 95 % o más, el 98 % o más, o el 99 % o más.