JP2003079374A - プロテオグリカンのコアタンパク質のポリペプチド、それをコードするｄｎａおよびそのプロモーターｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 プロテオグリカンのコアタンパク質の新規な
ポリペプチド、それをコードするＤＮＡおよびそのプロ
モーターＤＮＡ等を提供する。 【解決手段】 ヒト由来プロテオグリカンの新規なアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドおよびこれらのポリペプ
チドをコードするＤＮＡ、これらのプロモーター領域の
塩基配列を含むＤＮＡを見出した。さらに、プロテオグ
リカンのコアタンパク質の特定のポリペプチド、それを
認識する抗体、および神経組織における該ペプチドのア
ミノ酸配列を検出することを含む軸策の染色方法を提供
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、プロテオグリカン
のコアタンパク質のポリペプチド、それをコードするＤ
ＮＡおよびそのプロモーターＤＮＡに関する。また本発
明は、プロテオグリカンのコアタンパク質の特定のポリ
ペプチドに含まれる特定のアミノ酸配列からなるペプチ
ド、それを認識する抗体、および神経組織における当該
ペプチドのアミノ酸配列を検出する工程を少なくとも含
む軸索の染色方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】プロテオグリカンは、グリコサミノグリ
カンが共有結合的にタンパク質（コアタンパク質）に結
合した化合物の総称である。近年、哺乳動物の脳の発生
過程で様々なプロテオグリカンが正確に調節されて発現
することが明らかにされるなど、プロテオグリカンが脳
中のいくつかの複雑な構造形成に関与していることが示
されている。

【０００３】特開平９−１９４５０２や特開２０００−
９５７９５には、ラットやヒトの脳に存在するプロテオ
グリカン（ニューログリカン Ｃ；ＮＧＣ）が開示され
ている。またJ. Biol. Chem., 275(1), 337-342(2000)
には、マウスのＮＧＣについて、３つのアイソフォーム
（NGC-I、-II、-III）が開示されている。

【０００４】またJ. Biol. Chem., 276(10), 7337-7345
(2001)には、ニワトリ、マウスおよびラットのＮＧＣ
（CALEB）のアイソフォーム（aおよびb）が開示されて
いる。しかし、ヒトのＮＧＣのアイソフォーム、それを
コードするＤＮＡおよびそのプロモーターＤＮＡ等につ
いては知られていなかった。またそのアイソフォームの
特性等についても調べられていなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】これらの従来技術から
みて、ヒト由来のＮＧＣのアイソフォーム、それをコー
ドするＤＮＡおよびそのプロモーターＤＮＡや、前記ア
イソフォームの特性等が明らかになれば、特にヒトにお
ける脳研究の進展をもたらし、脳疾患の新規な診断方法
の確立、脳疾患の新規な治療方法・予防方法の開発等が
期待される。

【０００６】従って本発明が解決しようとする課題は、
ヒト由来のＮＧＣのアイソフォーム、それをコードする
ＤＮＡおよびそのプロモーターＤＮＡ並びにこれらの応
用技術や用途を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒト由来のプ
ロテオグリカンのコアタンパク質の新規なポリペプチ
ド、それをコードするＤＮＡおよびそのプロモーターＤ
ＮＡを見い出した。さらに本発明者らは、プロテオグリ
カンのコアタンパク質の特定のポリペプチドに含まれる
特定のアミノ酸配列からなるペプチド、それを認識する
抗体、および神経組織における当該ペプチドのアミノ酸
配列を検出する工程を少なくとも含む軸索の染色方法を
も見い出し、これらを提供するに至り、本発明を完成し
た。

【０００８】すなわち本発明は、配列番号４のアミノ酸
番号１〜４０１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド（以下、本発明ポリペプチド１という）、および、
配列番号６のアミノ酸番号１〜５６６で示されるアミノ
酸配列を含むポリペプチド（以下、本発明ポリペプチド
２という）を提供する。また本発明は、本発明ポリペプ
チド１をコードするＤＮＡ(以下、本発明ＤＮＡ１とい
う)、および、本発明ポリペプチド２をコードするＤＮ
Ａ（以下、本発明ＤＮＡ２という）を提供する。

【０００９】また本発明は、配列番号１の塩基番号１〜
１２３９で示される塩基配列を含むＤＮＡ（以下、本発
明プロモーター１という）、および、配列番号３の塩基
番号１〜４６３で示される塩基配列を含むＤＮＡ（以
下、本発明プロモーター２という）を提供する。

【００１０】また本発明は、本発明プロモーター１の塩
基配列と配列番号１の塩基番号３３３９〜４９５８で示
される塩基配列の両方を含むＤＮＡ（以下、ＮＧＣ-I遺
伝子という）、本発明プロモーター２の塩基配列と本発
明ＤＮＡ１の塩基配列の両方を含むＤＮＡ（以下、ＮＧ
Ｃ-II遺伝子という）、および、本発明プロモーター１
の塩基配列と本発明ＤＮＡ２の塩基配列の両方を含むＤ
ＮＡ（以下、ＮＧＣ-III遺伝子という）を提供する。な
お本明細書において「遺伝子」とは、タンパク質の一次
構造を規定している構造遺伝子のみならず、プロモータ
ー等の特定の制御機能をもつ核酸上の領域をも含む意味
で用いる。

【００１１】ＮＧＣ-I遺伝子としては配列番号１の塩基
配列で示されるＤＮＡが好ましく、ＮＧＣ-II遺伝子と
しては配列番号３の塩基配列で示されるＤＮＡが好まし
く、ＮＧＣ-III遺伝子としては配列番号５の塩基配列で
示されるＤＮＡが好ましい。

【００１２】また本発明は、配列番号６のアミノ酸４８
７〜５１３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド
（以下、本発明ペプチドという）、本発明ペプチドを認
識する抗体（以下、本発明抗体という）、および、神経
組織において本発明ペプチドのアミノ酸配列を検出する
工程を少なくとも含む軸索の染色方法（以下、本発明染
色方法という）を、提供する。本発明染色方法の「本発
明ペプチドのアミノ酸配列を検出する工程」において
は、本発明抗体を用いることが好ましい。

【００１３】

【発明の実施の形態】次に、本発明について具体的に説
明する。 １．本発明ポリペプチド 本発明ポリペプチド１は、配列番号４のアミノ酸番号１
〜４０１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドで
ある。また本発明ポリペプチド２は、配列番号６のアミ
ノ酸番号１〜５６６で示されるアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドである。両ポリペプチドともに、それぞれ所定
のアミノ酸配列を含む限りにおいて特に限定されず、他
のペプチドやポリペプチドが付加されているもの（本発
明ポリペプチドと他のペプチド等との融合ポリペプチ
ド）等も包含される。これらの中でも、本発明ポリペプ
チド１としては配列番号４のアミノ酸番号１〜４０１で
示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが好まし
く、本発明ポリペプチド２としては配列番号６のアミノ
酸番号１〜５６６で示されるアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドが好ましい。

【００１４】本発明ポリペプチド１および２ともに、そ
のアミノ酸配列が本発明によって開示されたので、その
配列に基づいてペプチド合成等の化学的手法によって製
造することも可能である。また、後述の本発明ＤＮＡ１
または２を用いて遺伝子工学的手法により製造すること
も可能である。さらに本発明ポリペプチド１または２を
コアタンパク質として有するプロテオグリカンを単離
し、このプロテオグリカンに結合している糖鎖を除去す
ることによって製造することもできる。

【００１５】これらのなかでも、本発明ＤＮＡ１または
２を用いた遺伝子工学的手法により製造する方法は、大
量生産が可能であるという点からも好ましい。なお本発
明ポリペプチド１および２は、もともとはヒト由来のも
のであるが、その由来は限定されず化学的手法や遺伝子
工学的手法により製造されたポリペプチドも当然に包含
される。

【００１６】本発明ポリペプチドの製造方法の一例とし
て、遺伝子工学的手法により製造する方法および、本発
明ポリペプチドをコアタンパク質として有するプロテオ
グリカンから製造する方法について説明する。 遺伝子工学的手法により製造する方法：本発明ＤＮ
Ａ１または２を移入した細胞を、好適な培地で培養し、
本発明ポリペプチド１または２を培養物中に生成蓄積さ
せ、その培養物から本発明ポリペプチドを採取すること
によって、本発明ポリペプチドを製造することができ
る。

【００１７】本発明ＤＮＡを移入した細胞は、公知の発
現ベクターに本発明ＤＮＡを挿入して組換えプラスミド
を構築し、この組換えプラスミドを細胞に移入すること
によって得ることができる。細胞としては大腸菌等の原
核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞が例示される。この
製造方法においては、タンパク質の製造に通常用いられ
る宿主−ベクター系を使用することができる。培地や培
養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜選択
される。

【００１８】ここで本発明ＤＮＡは直接発現させてもよ
いし、他のペプチドやポリペプチドとの融合ポリペプチ
ドとして発現させてもよい。また本発明ＤＮＡは全長を
発現させてもよいし、一部を部分ペプチドとして発現さ
せてもよい。培養物からの本発明ポリペプチドの採取
は、公知のポリペプチドの抽出、精製方法によって行う
ことができる。なお培養物には、培地および当該培地中
の細胞が包含される。

【００１９】本発明ポリペプチドの抽出方法として具体
的には、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処
理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽
出、あるいは界面活性剤抽出、またはこれらの組合わせ
等の処理操作が挙げられる。

【００２０】抽出液からの本発明ポリペプチドの精製方
法も特に限定されず、例えば硫酸アンモニウム（硫安）
や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外
濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー若しくは電気泳
動法又はこれらの組み合わせ等の処理操作が例示され
る。

【００２１】 本発明ポリペプチドをコアタンパク質
として有するプロテオグリカンから製造する方法：本発
明ポリペプチド１または２をコアタンパク質として有す
るプロテオグリカンに結合している糖鎖を除去すること
により、本発明ポリペプチドを製造することも可能であ
る。

【００２２】具体的には、本発明ポリペプチドをコアタ
ンパク質として有するプロテオグリカンを調製し、これ
にコンドロイチナーゼを作用させることによって、本発
明ポリペプチドを製造することができる。用いるコンド
ロイチナーゼは特に限定されず、コンドロイチナーゼＡ
ＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣI、コンドロイチナーゼ
ＡＣII若しくはコンドロイチナーゼＢ又はこれらの組合
わせ等が例示されるが、コンドロイチナーゼＡＢＣを用
いることが好ましい。

【００２３】なお、糖鎖の除去をより完全にするため、
コンドロイチナーゼを作用させることにより得られる本
発明ポリペプチドに、さらにヘパリチナーゼを作用させ
ることが好ましい。また、糖鎖の除去をさらに完全にす
るため、コンドロイチナーゼおよびヘパリチナーゼを作
用させることにより得られる本発明ポリペプチドに、さ
らにノイラミニダーゼ、Ｎ−グリコシダーゼ及びＯ−グ
リコシダーゼを作用させることが好ましい。

【００２４】これらの酵素を本発明プロテオグリカンに
作用させる際の条件は特に限定されず、当業者が適宜決
定することができるが、用いる酵素の至適ｐＨ及び至適
温度条件であることが好ましい。

【００２５】このようにして得られた本発明ポリペプチ
ドの精製方法も特に限定されず、例えば硫酸アンモニウ
ム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、
透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆
相クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー若しく
は電気泳動法又はこれらの組み合わせ等の処理操作が例
示される。

【００２６】２．本発明ＤＮＡ 本発明ＤＮＡ１は、本発明ポリペプチド１をコードする
ＤＮＡである。また本発明ＤＮＡ２は、本発明ポリペプ
チド２をコードするＤＮＡである。両ＤＮＡともに、そ
れぞれの本発明ポリペプチドをコードしている限りにお
いて特に限定されない。例えば本発明ＤＮＡ１には、後
述の「ＮＧＣ-II遺伝子」や、当該遺伝子の好ましい態
様である「配列番号３の塩基配列で示されるＤＮＡ」等
も包含される。また本発明ＤＮＡ２には、後述の「ＮＧ
Ｃ-III遺伝子」や、当該遺伝子の好ましい態様である
「配列番号５の塩基配列で示されるＤＮＡ」等も包含さ
れる。

【００２７】これらの中でも、本発明ＤＮＡ１として
は、配列番号４のアミノ酸番号１〜４０１で示されるア
ミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡが
好ましく、特に配列番号３の塩基番号９８６〜２１９１
で示される塩基配列からなるＤＮＡが好ましい。また本
発明ＤＮＡ２としては、配列番号６のアミノ酸番号１〜
５６６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを
コードするＤＮＡが好ましく、特に配列番号５の塩基番
号３３３９〜５０３９で示される塩基配列からなるＤＮ
Ａが好ましい。

【００２８】本発明ＤＮＡは、その塩基配列が本発明に
より開示されたので、その配列に基づいてＤＮＡを合成
し、あるいはその配列に基づいて作成したオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チ
ェイン・リアクション法）によって染色体ＤＮＡから、
あるいはＲＴ−ＰＣＲ法（リバース・トランスクリプシ
ョン−ＰＣＲ法）によってｍＲＮＡから本発明ＤＮＡを
増幅することによって取得することも可能である。ま
た、以下の各工程からなるｃＤＮＡクローニングによっ
て製造することも可能である。

【００２９】マウスまたはラット由来のＮＧＣ-Iをコ
ードするＤＮＡをプローブとして、ヒト脳ｃＤＮＡライ
ブラリーから本発明ＤＮＡをスクリーニングすることに
よって本発明ＤＮＡ１および２を取得する。

【００３０】得られた本発明ＤＮＡ１および２の塩基
配列を解析する。

【００３１】なお本発明ＤＮＡは、もともとはヒト由来
であるが、その由来は限定されず、化学合成や遺伝子工
学的手法により製造されたＤＮＡも当然に包含される。

【００３２】なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基
配列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されること
は、当業者であれば容易に理解されるところである。ま
た本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又
はＲＮＡも包含される。さらに本発明ＤＮＡは、本発明
ポリペプチドをコードするコード鎖のみの一本鎖であっ
てもよく、この一本鎖およびこれと相補的な塩基配列を
有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖からなる二本鎖であって
もよい。

【００３３】３．本発明プロモーター 本発明プロモーター１は、配列番号１の塩基番号１〜１
２３９で示される塩基配列を含むＤＮＡである。また本
発明プロモーター２は、配列番号３の塩基番号１〜４６
３で示される塩基配列を含むＤＮＡである。両ＤＮＡと
もに、それぞれの所定の塩基配列を含む限りにおいて特
に限定されない。例えば本発明プロモーター１には、後
述の「ＮＧＣ-I遺伝子」や当該遺伝子の好ましい態様で
ある「配列番号１の塩基配列で示されるＤＮＡ」、およ
び、後述の「ＮＧＣ-III遺伝子」や当該遺伝子の好まし
い態様である「配列番号５の塩基配列で示されるＤＮ
Ａ」等も包含される。また、例えば本発明プロモーター
２には、後述の「ＮＧＣ-II遺伝子」や当該遺伝子の好
ましい態様である「配列番号３の塩基配列で示されるＤ
ＮＡ」等も包含される。

【００３４】これらの中でも、本発明プロモーター１と
しては、配列番号１の塩基番号１〜１２３９で示される
塩基配列（または配列番号５の塩基番号１〜１２３９で
示される塩基配列）からなるＤＮＡが好ましい。また本
発明プロモーター２としては、配列番号３の塩基番号１
〜４６３で示される塩基配列からなるＤＮＡが好まし
い。

【００３５】本発明プロモーターは、その塩基配列が本
発明により開示されたので、その配列に基づいてＤＮＡ
を合成し、あるいはその配列に基づいて作成したオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラー
ゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体ＤＮＡ
から増幅することによって取得することも可能である。

【００３６】なお、配列番号１の塩基番号１〜１２３９
で示される塩基配列（本発明プロモーター１）や、配列
番号３の塩基番号１〜４６３で示される塩基配列（本発
明プロモーター２）のうち、全ての領域がプロモーター
活性に必要ではなく、その一部であってもプロモーター
活性を示しうることは、当業者に容易に理解されるであ
ろう。

【００３７】またプロモーターとして機能するＤＮＡ
は、１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入等が生じて
も、その活性が維持されることが多いことが知られてい
る。配列番号１の塩基番号１〜１２３９で示される塩基
配列を含むＤＮＡ（本発明プロモーター１）や、配列番
号３の塩基番号１〜４６３で示される塩基配列を含むＤ
ＮＡ（本発明プロモーター２）は、このような置換、欠
失、挿入等を含んでいても、プロモーター活性を有する
限り、本発明プロモーターに含まれる。このような置
換、欠失、挿入等を含むＤＮＡは、配列番号１の塩基番
号１〜１２３９で示される塩基配列からなるＤＮＡ（本
発明プロモーター１）、配列番号３の塩基番号１〜４６
３で示される塩基配列からなるＤＮＡ（本発明プロモー
ター２）またはこれらを含む細胞を変異処理し、該ＤＮ
Ａまたは細胞から配列番号１の塩基番号１〜１２３９で
示される塩基配列からなるＤＮＡ（本発明プロモーター
１）、配列番号３の塩基番号１〜４６３で示される塩基
配列からなるＤＮＡ（本発明プロモーター２）にストリ
ンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプロモータ
ー活性を有するＤＮＡとして選択されうる。なお、本明
細書において「プロモーター活性」とは、プロモーター
が本質的に有する機能をいい、具体的には、プロモータ
ーの下流にあるＤＮＡ配列を鋳型としてＲＮＡポリメラ
ーゼがｍＲＮＡを合成（転写）するのを開始させる機能
をいう。

【００３８】４．本発明ＮＧＣ遺伝子 本発明ＮＧＣ-I遺伝子は、本発明プロモーター１の塩基
配列と配列番号１の塩基番号３３３９〜４９５８で示さ
れる塩基配列の両方を含むＤＮＡである。また本発明Ｎ
ＧＣ-II遺伝子は、本発明プロモーター２の塩基配列と
本発明ＤＮＡ１の塩基配列の両方を含むＤＮＡである。
また本発明ＮＧＣ-III遺伝子は、本発明プロモーター１
の塩基配列と本発明ＤＮＡ２の塩基配列の両方を含むＤ
ＮＡである。

【００３９】いずれのＮＧＣ遺伝子も、それぞれ所定の
塩基配列の双方を含んでいる限りにおいて特に限定され
ないが、本発明プロモーターの塩基配列の方が上流側
（5'-側）に存在することが好ましい。

【００４０】本発明ＮＧＣ-I遺伝子には、当該遺伝子の
好ましい態様である配列番号１の塩基配列で示されるＤ
ＮＡが包含される。本発明ＮＧＣ-II遺伝子には、当該
遺伝子の好ましい態様である配列番号３の塩基配列で示
されるＤＮＡが包含される。また本発明ＮＧＣ-III遺伝
子には、当該遺伝子の好ましい態様である配列番号５の
塩基配列で示されるＤＮＡが包含される。

【００４１】本発明ＮＧＣ遺伝子は、その塩基配列が本
発明により開示されたので、その配列に基づいてＤＮＡ
を合成し、あるいはその配列に基づいて作成したオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラー
ゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体ＤＮＡ
から増幅することによって取得することも可能である。

【００４２】５．本発明ペプチド 本発明ペプチドは、配列番号６のアミノ酸４８７〜５１
３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。

【００４３】本発明ペプチドは、本発明ポリペプチド２
に含まれる部分アミノ酸配列からなるペプチドであり、
当該部分アミノ酸配列は、本発明ポリペプチド２に含ま
れている特徴的な配列である。したがって、本発明ペプ
チドは本発明ＤＮＡ２の部分塩基配列によってコードさ
れており、本発明ＮＧＣ-III遺伝子の部分塩基配列によ
ってもコードされている。

【００４４】本発明ペプチドは、そのアミノ酸配列が本
発明によって開示されたので、その配列に基づいてペプ
チド合成等の化学的手法によって製造することも可能で
ある。また、本発明ＤＮＡ２のうち、本発明ペプチドを
コードしている部分（例えば、配列番号５における塩基
番号４７９７〜４８７７に相当する部分）を用いて遺伝
子工学的手法により製造することも可能である。さらに
本発明ポリペプチド２をコアタンパク質として有するプ
ロテオグリカンを単離し、このプロテオグリカンに結合
している糖鎖を除去し、ポリペプチドを適宜分解するこ
とによって製造することもできる。

【００４５】なお本発明ペプチドは、もともとはヒト由
来のものであるが、その由来は限定されず化学的手法や
遺伝子工学的手法により製造されたペプチドも当然に包
含される。本発明ペプチドを遺伝子工学的手法により製
造する方法、および、本発明ポリペプチド２をコアタン
パク質として有するプロテオグリカンから製造する方法
については、前記の「本発明ポリペプチド」の説明を参
照されたい。

【００４６】本発明ペプチドは、本発明ポリペプチド２
に特徴的なアミノ酸配列から構成されていることから、
本発明ペプチドのアミノ酸配列を指標として本発明ポリ
ペプチド２を特異的に検出することができる。

【００４７】６．本発明抗体 本発明抗体は、本発明ペプチドを認識する抗体である。

【００４８】本発明抗体は、本発明ペプチドを認識する
限りにおいて特に限定されないが、本発明ポリペプチド
２に特異的に結合する抗体であることがより好ましい。
本発明ペプチドは、そのアミノ酸配列に特徴がある新規
な物質である。本発明抗体は、本発明ペプチドやそれに
極めて類似するペプチドを抗原として用い、通常の抗体
の製法に従って製造することができる。本発明抗体はポ
リクローナル、モノクローナルのいずれであってもよ
い。

【００４９】以下にポリクローナルな本発明抗体及びモ
ノクローナルな本発明抗体の製造方法について説明す
る。

【００５０】 ポリクローナルな本発明抗体の製造方
法：本発明ペプチドやそれに極めて類似するペプチド
を、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツ
ジ等の被免疫動物の皮下または腹腔内に投与する。被免
疫動物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用
することは、抗体産生細胞を賦活するので望ましい。ま
た初回免疫後、２〜３週目に常法によって追加免疫を行
うと力価の高い抗血清が得られる。最終免疫から約１週
間後に血液を採取し、血清を分離する。この血清を熱処
理して補体を失活させた後、通常の抗体の精製方法によ
ってイムノグロブリン画分を精製してもよい。

【００５１】 モノクローナルな本発明抗体の製造方
法：モノクローナルな本発明抗体は、KohlerとMilstein
の方法（Nature 256,495-497(1975)）によって行うこと
ができる。

【００５２】例えば本発明ペプチドやそれに極めて類似
するペプチドを、マウス、ラット、モルモット、ウサ
ギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物の腹腔内、皮下、足蹠
(footpad）等に投与する。被免疫動物から脾臓細胞、リ
ンパ細胞、末梢血液等を採取し、これらと腫瘍細胞株で
あるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマ
を調製する。なお細胞融合に用いるミエローマ細胞は、
種々の哺乳動物の細胞株を利用することができるが、被
免疫動物と同種の動物の細胞株を用いることが好まし
い。またミエローマ細胞は、細胞融合の後に未融合細胞
と融合細胞とを区別できるようにするために、未融合の
ミエローマ細胞が生存できずハイブリドーマだけが増殖
できるように、マーカーを有するものを用いることが好
ましい。またミエローマ細胞は、固有のイムノグロブリ
ンを分泌しない株を使用することが、ハイブリドーマの
培養上清から目的の抗体を取得することが容易となる点
で好ましい。

【００５３】得られたハイブリドーマを連続増殖させ、
本発明ペプチドを認識する抗体を継続的に産生するハイ
ブリドーマ株を選別する。こうして選別されたハイブリ
ドーマ株を好適な培地で培養することによって、培地中
にモノクローナルな本発明抗体が得られる。なお、マウ
スの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマ株を培養
することによって、モノクローナルな本発明抗体を大量
に製造することもできる。このようにして得られたモノ
クローナルな本発明抗体は、通常の抗体の精製方法によ
って精製してもよい。

【００５４】抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、
硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿、
およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択
的沈殿分別法、電気泳動法、DEAE (ジエチルアミノエチ
ル）誘導体、CM (カルボキシメチル）誘導体等のイオン
交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテ
インＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロ
マトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラ
フィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過法および超遠心法等を挙げることができ
る。

【００５５】なお本発明抗体を、抗原結合部位(Fab) を
分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシ
ン、パパイン等）で処理して、Fab を含むフラグメント
としても良い。

【００５６】また本発明抗体をコードする遺伝子の塩基
配列もしくは本発明抗体のアミノ酸配列が決定されれ
ば、遺伝子工学的に本発明抗体のFab を含むフラグメン
トやキメラ抗体（例えば本発明抗体のFab 部分を含むキ
メラ抗体等）を作製することもできる。このような本発
明抗体のFab を含むフラグメントやキメラ抗体も、本発
明抗体に包含される。本発明抗体は、本発明ペプチド
や、本発明ペプチドのアミノ酸配列を有している「本発
明ポリペプチド２」の検出に利用することができる。

【００５７】７．本発明染色方法 本発明染色方法は、神経組織において配列番号６のアミ
ノ酸４８７〜５１３で示されるアミノ酸配列を検出する
工程を少なくとも含む、軸索の染色方法である。本発明
染色方法は、神経組織の軸索ではプロテオグリカンのコ
アタンパク質として本発明ポリペプチド２（配列番号６
のアミノ酸４８７〜５１３で示されるアミノ酸配列を含
んでいる）が特異的に発現しているという、本発明者ら
による新たな知見を、軸索の特異的染色方法として応用
したものである。

【００５８】本発明染色方法に付される神経組織は特に
限定されないが、再生した神経組織が好ましい。配列番
号６のアミノ酸４８７〜５１３で示されるアミノ酸配列
を検出する方法は、当該アミノ酸配列を特異的に検出で
きる限りにおいて特に限定されないが、当該アミノ酸配
列を認識して結合する物質が好ましい。このような物質
として抗体が例示され、特に本発明抗体を用いることが
好ましい。

【００５９】例えば本発明染色方法において本発明抗体
を用いる場合において、当該抗体自体を予め標識物質で
標識しておけば、神経組織と本発明抗体とを接触させた
後、染色された軸索を直ちに観察することができる。ま
た本発明抗体自体を予め標識しない場合には、標識した
二次抗体等を用いて、通常の免疫組織学的手法により軸
索を染色することができる。本発明染色方法によれば、
神経組織における軸索、特に神経組織における再生した
軸索を特異的に染色することができる。

【００６０】また本発明染色方法を応用して、神経組織
における軸索の染色試薬や染色キットを提供することも
できる。すなわち、配列番号６のアミノ酸４８７〜５１
３で示されるアミノ酸配列を検出するための物質（例え
ば、本発明抗体）を、神経組織における軸索の染色試薬
とすることもでき、二次抗体や発色試薬等と併せて染色
キットの構成試薬とすることもできる。

【００６１】

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はこの実施例に何等制限されるもの
ではない。 １．本発明ＮＧＣ遺伝子、本発明ＤＮＡ、本発明プロモ
ーター、および本発明ポリペプチド 市販のヒト脳全ＲＮＡ（Gibco BRL社）を用いてＲＴ−
ＰＣＲを行い、マウスで発見された３種類のＮＧＣアイ
ソフォーム（J. Biol. Chem., 275(1), 337-342(200
0)）と相同性の高い塩基配列を有するＰＣＲ産物を得
た。プライマーはＮＧＣの染色体遺伝子の塩基配列から
設計した。NGC-I及びNGC-IIIのＰＣＲに用いたプライマ
ーを配列番号１０及び１１に、NGC-IIのＰＣＲに用いた
プライマーを配列番号８及び９にそれぞれ示す。塩基配
列を決定するために、ＰＣＲ産物をPGEM-T Easy Vector
（プロメガ社）に組み込んだ。5'RACE、3'RACEシステム
（Gibco BRL社）を用いて、それぞれの遺伝子について
転写開始点と転写終止点を決定した。

【００６２】[³²Ｐ]標識したヒト由来のＮＧＣのｃＤＮ
Ａをプローブとし、市販の染色体ライブラリー(Stratag
ene Cloning System社) からプラークハイブリダイゼー
ションによってＮＧＣ遺伝子を含むクローンを単離し
た。プラークハイブリダイゼーションの宿主には大腸菌
(Escherichia coli) XL-1 blue MRF'(Stratagene Clon
ing System社) を用いた。5.0 ×10⁵ クローンの中か
ら、ＸｂａＩによる異なった切断パターンを示す７つの
クローンが単離された。

【００６３】これらクローンを制限酵素消化およびサザ
ンハイブリダイゼーションによってマッピングした。全
てのエクソン配列、およびイントロン／エクソンのスプ
ライシング領域を含んでいる制限酵素断片を、pBluescr
ipt phagemid(Stratagene Cloning System社) にサブク
ローンして、ＤＮＡの塩基配列を解析した。インサート
ＤＮＡの相補鎖の両方について、Cy5TM AutoReadTM シ
ークエンシングキット(Amersham Pharmacia Biotech社)
を用いて、ＤＮＡの塩基配列を決定した。

【００６４】第１番目のＰＣＲ産物（クローン）の塩基
配列の解析結果と対応するアミノ酸配列を配列番号１
に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示した。

【００６５】第２番目のＰＣＲ産物（クローン）の塩基
配列の解析結果と対応するアミノ酸配列を配列番号３
に、アミノ酸配列のみを配列番号４に示した。

【００６６】第３番目のＰＣＲ産物（クローン）の塩基
配列の解析結果と対応するアミノ酸配列を配列番号５
に、アミノ酸配列のみを配列番号６に示した。

【００６７】これらについて解析した結果、 （１）第１番目のＰＣＲ産物は、公知のヒト由来のＮＧ
Ｃ（配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
以下、ＮＧＣ-Iという）の遺伝子であり、配列番号１の
塩基番号１〜１２３９で示される部分がプロモーター
（本発明プロモーター１）に相当し、配列番号１の塩基
番号３３３９〜４９５８で示される部分がコード領域に
相当することが明らかになった。

【００６８】（２）また、第２番目のＰＣＲ産物は、Ｎ
ＧＣ-Iの新規なアイソフォーム（配列番号４のアミノ酸
配列からなるポリペプチド（本発明ポリペプチド１）；
以下、ＮＧＣ-IIという）の遺伝子であり、配列番号３
の塩基番号１〜４６３で示される部分がプロモーター
（本発明プロモーター２）に相当し、配列番号３の塩基
番号９８６〜２１９１で示される部分がコード領域（本
発明ＤＮＡ１）に相当することが明らかになった。

【００６９】（３）また、第３番目のＰＣＲ産物は、Ｎ
ＧＣ-Iの新規なアイソフォーム（配列番号６のアミノ酸
配列からなるポリペプチド（本発明ポリペプチド２）；
以下、ＮＧＣ-IIIという）の遺伝子であり、配列番号５
の塩基番号１〜１２３９で示される部分（配列番号１の
塩基番号１〜１２３９で示される部分と全く同一）がプ
ロモーター（本発明プロモーター１）に相当し、配列番
号５の塩基番号３３３９〜５０３９で示される部分がコ
ード領域（本発明ＤＮＡ２）に相当することが明らかに
なった。またＮＧＣ-IIIには、他のアイソフォームには
見られない２７アミノ酸残基（配列番号６のアミノ酸４
８７〜５１３で示されるアミノ酸配列に相当）の特徴的
な挿入が見られた。

【００７０】２．本発明ペプチド、本発明抗体、および
本発明染色方法 ヒト由来のＮＧＣ-IIIと同様に、マウスのＮＧＣ-IIIに
存在する特徴的なアミノ酸配列（配列番号７）からなる
ペプチドを、Posnett, D. N. and Tam, J. P.(1989) Mu
ltiple antigenic peptide method for producing anti
peptide site-specific antibodies. Methods in Enzym
ology, 178: 739-746に記載の方法に従って、マルチプ
ル・アンチジェニック・ペプチド（ＭＡＰ）として化学
合成した。

【００７１】これによって製造したＭＡＰ−ペプチドを
抗原としてウサギに免疫し、抗血清を得た。得られた抗
血清を、配列番号７のアミノ酸配列を含むマウスＮＧＣ
-IIIの部分ペプチドとグルタチオン Ｓ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質を固相化したアフ
ィニティーカラムを用いて精製して、前記ペプチドを認
識する抗体を得た。

【００７２】この抗体と、二次抗体として蛍光標識され
た抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて、ラット大脳皮質由来の
初代培養神経細胞を免疫組織染色した結果、軸索、特に
軸索先端の成長円錐が濃染された。この結果から、ＮＧ
Ｃのアイソフォームのうち神経組織の軸索に輸送される
のはＮＧＣ-IIIであることが明らかになった。その結
果、軸索（軸索先端）に局在するＮＧＣ-IIIの特徴的な
アミノ酸配列を認識する抗体によって、神経組織におけ
る軸索を特異的に染色できることが確認された。

【００７３】

【発明の効果】本発明ポリペプチドは、ヒトＮＧＣ-Iの
アイソフォームとして新規なポリペプチドであり、本発
明ペプチドの製造や、脳神経系の新たな医薬としての可
能性を秘めており、極めて有用である。特に本発明ポリ
ペプチド２は軸索（軸索先端）に局在していることか
ら、これに関連した何らか生理活性を有している可能性
もある。また細胞内領域に本発明ペプチドを持ち、細胞
外領域に神経栄養因子などの活性分子を持つキメラ分子
を神経細胞に発現させることにより、その活性分子を軸
索先端へ輸送する手段に使用できる可能性がある。

【００７４】本発明ＤＮＡは本発明ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡであり、本発明ポリペプチドの遺伝子工学
的な大量製造等に利用することができることから極めて
有用である。また本発明ＤＮＡは、遺伝子治療や遺伝子
診断的用途に利用できる可能性もある。

【００７５】本発明プロモーターは、本発明ポリペプチ
ド等の発現の調節に用いることができ、極めて有用であ
る。

【００７６】本発明遺伝子は、プロモーター領域とコー
ド領域との両方を備えているものであり、本発明ポリペ
プチド等の遺伝子工学的な発現等に利用することがで
き、極めて有用である。

【００７７】本発明ペプチドは、本発明ポリペプチド２
（ＮＧＣ-III）に特徴的に存在するアミノ酸配列からな
るペプチドであり、本発明抗体の抗原等として極めて有
用である。

【００７８】本発明抗体は、本発明ペプチドや本発明ポ
リペプチド２を認識するので、本発明ペプチドや本発明
ポリペプチドの検出に有用である。また、本発明ペプチ
ドや本発明ポリペプチドのアフィニティー精製等に用い
ることもできる。

【００７９】本発明染色方法は、神経組織における軸索
を特異的に染色することができる方法であり、極めて有
用である。

【００８０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 生化学工業株式会社(Seikagaku Corporation) <120> プロテオグリカンのコアタンパク質のポリペプチド、それをコードするＤ ＮＡおよびそのプロモーターＤＮＡ <130> J200102900 <140> <141> <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 5319 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> promoter <222> (1)..(1239) <220> <221> CDS <222> (3339)..(4958) <400> 1 ggcctcagga agcttacaat cttggcggaa gacaaagggg agccagcatc acatggtgag 60 agcaggagtg agagagaaag tactaggttc atgtaaacaa ccagatctca catgaaccca 120 tgaagcaaga actcattacc tcgagcacca agccattcat ggggagtcca cccccatgac 180 ccaaacacct cacactaggc tcacgtccga cactggatgt cacatttcag catgagattt 240 ggagggaata aaacatccaa accatatcaa tgttagtggt taatactgag gacttaaagc 300 caggaatttc cagtccacac agctatgccc ccagccatgg caactggagc actcctctgg 360 actgcagccc cctggtcaag ccgggggttt ttcatgcagt cggaggctgg ctgcattcgt 420 ggcaatggac cttgagccta cctgagctct ggaggcaggc tgccaaccca gtaagaacct 480 cagaggcatg aagaaactgt tgacacataa aacatccctg atgcccaggt gcaagagaca 540 taaatacggg gacatggata taaggacgtc agtttccctt tctttcactc tgtggttcct 600 acatcttcta tctcttcttt accctaccac agtcctgtgc tcagaagaaa tactcatttg 660 actctctggt taccaagcat tttcacatat gagagacagg ttgctaactc aaagtcacgc 720 tgcagctgaa tcctgccctt cccatcacgt tccactgact gaattttccc attcatcttg 780 tggaggtgtt acccaaccaa gtgtgctatg ctcagttctc aaactgctag tgagatccac 840 tagggaagat cagaatgaaa ctgagtggca acaattgatt taaagtctca agttgggccg 900 ggcacggtgg ctcatgcctg caatcccagc actttgggag gccaaggcgg gcggatcacc 960 tgaggcctgg agttcgagac cagcctgagc caacatggag aaaccccgtc tctacaaaaa 1020 ataccaaatt agccgggcgt ggcatgcctg taatcccagc tactcgggag gctgaggcag 1080 agaatcactt gaacccagga ggcagaggtt gcagtgagtc aatatcacac cattgcactc 1140 tagtctgggt gacagagtga gactctgtct caacaaaaaa aaaaaattcc aaattgaagg 1200 aagcgttagc agacttcatc tccaggaaag ggaagaagaa gatacttaaa taattaacaa 1260 aatatattta aaatgagtgg gagaacttcc tccattaaac cctgttgaaa atgtgtgagt 1320 ggttgtcatg ccccagacat caaggaaccc atccatgagg tcttcccaca cagactggcc 1380 tcaggaaggg aaggaggagg taggccgctc tgacagccac aacccgagtt gaggaaacaa 1440 gcaaaggaac acagagagtc tacatacagt aaaaggtgac aggagttaag ctgcacacaa 1500 gggaagcaga gatgggttgg aggcagttaa gggtgcgttg ctgcctctgt ggctgaggtg 1560 agtgcaaagc cctacatggt cccctgttta gagaaggcta ttgtttcaaa catattttac 1620 ttggtccccg gaggcagcat gaaactatga aagaaagagc cttacccctt ttttcaaggc 1680 tctccagacc acagttctgg gatgggtgtg ggtggttgcc attcgttcat ttatgcctgt 1740 ctgatatgga gcctccctct gttaccagcc ctgtgcactc aagtgccttg cagtccagtg 1800 aggaataact gtagataaga tgagatgatg ggcattaagt gtaactgctg agaagccttc 1860 atagagggaa aggtgataag aactgagttt ttctggcatg aggagtttac caggcaggag 1920 aggtggagac gctaggctag gcaaataggc tgcagccata gttctgctga gaaacaggtt 1980 ttgaaccaag gcaactccat ctggagatat gtatcagaaa gattaggaga tagaatctcc 2040 atcttggtca cttatttggt cttctaagac agcaatggga ccgtctctta aatactggag 2100 ttgtcctatc tccttgggct gataccctga actgtcattt gggtgagtaa cacattaagg 2160 ggtagacggt cggtttgggg gaataaacta agtaactagg ttgcggttcc tcctgccgac 2220 taagcagacc tcctggtgcg tggtcttggg ttgccctgtg agccctgaag ctgtgaatgg 2280 gccccacaga tcactctaaa gccaagcatc catgtgtgcc cggctgggga tctagacccc 2340 cctggtctac ccaggaacct gagttttggt ggtctgagac acctggggga cgacgtatcc 2400 cggagaaggg accaggatta aaggccgctc cccaggctgc ccggagacta gaaggaaggc 2460 gaggtagccg cagtcccagg gagggtctta ccccttgctc ccgggatgcg ttatggcggg 2520 cctggctgtg cgagatctag gctagtggct ttggctgcga acggattaga tctgatccga 2580 ttagagcctg ggcggtcggc ttcgccccct tgccaggctc tgccaacgcc cgcccctccc 2640 tcgtggagac ccggagacct ccctgagagc cttcccgccc ggaacacggg attggtgcag 2700 aatccgagag gctccatgcg ccccgggcct ggcttgtttc cacagtgggg gctcgtgctt 2760 ccgccccctg cggctcttct ggaccccgcc ccgaccctgc gggtaactgg gcccgcgacg 2820 tccccgcctc cgtgcttgcc gcgtggcggg tgggttcctc cgggtcgggg ccccgtgccg 2880 cctgttcacc tggggcggga ccgtggcccc atcccacagg tctcccgccc gtgcacctgc 2940 cgcctaacgc cgcgcgccgc gccgtgcgcc tgcctcgcgc tccccgtccg cctgccccgc 3000 actccccgtc cgtgtgtctc ctagtcccca gcgaggggtc tgtctgttcc cctggcaggc 3060 tgaccaaggg gccggcgtca ccgctacgtg cggcggggcc ggcgcggcgg gcggggtgag 3120 ggcggcgctg agcgcagcgg cggcagcggc ggcgcgggag gcggggaggc gcggcgcgcc 3180 ggggacagcg gcggacggcg gcggcggcgg catgcggctc ctcgcgctgc ccatcgtggg 3240 ctgaggcggc cgcagaaccg gcgggaggcg cggcggccgg gcgagccgag ggcgcagcca 3300 gccgggcgga ccgcggacag cggtcggggc gccgcgcc atg ggg cga gcc ggg ggc 3356 Met Gly Arg Ala Gly Gly 1 5 ggg ggc ccg ggc cgg ggg ccg ccg cca ctg ctg ctg ttt ctg ggg gcc 3404 Gly Gly Pro Gly Arg Gly Pro Pro Pro Leu Leu Leu Phe Leu Gly Ala 10 15 20 gcg ctg gtc ctg gcc tct ggg gcc gtg ccg gcg cgt gag gcg ggc agc 3452 Ala Leu Val Leu Ala Ser Gly Ala Val Pro Ala Arg Glu Ala Gly Ser 25 30 35 gcg gtt gag gcc gaa gag ctg gtg aag ggc agc ccg gcg tgg gag ccg 3500 Ala Val Glu Ala Glu Glu Leu Val Lys Gly Ser Pro Ala Trp Glu Pro 40 45 50 cct gcc aac gac acg cgg gaa gaa gcc ggc cca cca gcg gct ggg gaa 3548 Pro Ala Asn Asp Thr Arg Glu Glu Ala Gly Pro Pro Ala Ala Gly Glu 55 60 65 70 gat gag gcg tcg tgg acg gcg ccc ggt ggc gag ctg gcc ggg cca gaa 3596 Asp Glu Ala Ser Trp Thr Ala Pro Gly Gly Glu Leu Ala Gly Pro Glu 75 80 85 gag gtg ctg cag gag tcg gct gcg gtg acc ggc acc gcc tgg ctg gaa 3644 Glu Val Leu Gln Glu Ser Ala Ala Val Thr Gly Thr Ala Trp Leu Glu 90 95 100 gct gac agc cca ggc ctg gga gga gtg acc gca gag gcg ggc agc ggc 3692 Ala Asp Ser Pro Gly Leu Gly Gly Val Thr Ala Glu Ala Gly Ser Gly 105 110 115 gat gcc cag gcc ctt cca gct acg ctc cag gct ccc cac gag gtc ctc 3740 Asp Ala Gln Ala Leu Pro Ala Thr Leu Gln Ala Pro His Glu Val Leu 120 125 130 ggg cag tca atc atg ccc cct gcc att cct gag gct aca gag gcc agc 3788 Gly Gln Ser Ile Met Pro Pro Ala Ile Pro Glu Ala Thr Glu Ala Ser 135 140 145 150 ggg cca ccc tcc ccc acc ccc ggc gac aag ctg agc cca gct tct gaa 3836 Gly Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys Leu Ser Pro Ala Ser Glu 155 160 165 ctc ccc aag gag agc ccc ttg gag gtt tgg ctg aac ctg ggg ggc agc 3884 Leu Pro Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp Leu Asn Leu Gly Gly Ser 170 175 180 aca ccc gac cct caa gtg cca gag ctg act tac cca ttt cag ggc acc 3932 Thr Pro Asp Pro Gln Val Pro Glu Leu Thr Tyr Pro Phe Gln Gly Thr 185 190 195 ctg gag ccc caa ccg gca tca gat atc att gac atc gac tac ttc gaa 3980 Leu Glu Pro Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu 200 205 210 gga ctg gat ggt gag ggt cgt ggc gca gat ctg ggg agc ttc cca ggg 4028 Gly Leu Asp Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp Leu Gly Ser Phe Pro Gly 215 220 225 230 tca cca gga acc tca gag aac cac cct gat act gag gga gag acc cct 4076 Ser Pro Gly Thr Ser Glu Asn His Pro Asp Thr Glu Gly Glu Thr Pro 235 240 245 tcc tgg agc ctg ctt gac tta tac gat gat ttc acc ccc ttc gat gaa 4124 Ser Trp Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Asp Asp Phe Thr Pro Phe Asp Glu 250 255 260 tct gat ttc tac ccc acc aca tcc ttt tat gat gac ttg gat gaa gag 4172 Ser Asp Phe Tyr Pro Thr Thr Ser Phe Tyr Asp Asp Leu Asp Glu Glu 265 270 275 gag gag gaa gag gag gat gac aaa gat gca gta gga ggt gga gac cta 4220 Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Lys Asp Ala Val Gly Gly Gly Asp Leu 280 285 290 gaa gat gaa aat gag ctt cta gtg ccc act ggg aag cct ggt ctg ggg 4268 Glu Asp Glu Asn Glu Leu Leu Val Pro Thr Gly Lys Pro Gly Leu Gly 295 300 305 310 ccc ggg aca ggc cag ccc acc agt cgg tgg cat gct gtc cct cca cag 4316 Pro Gly Thr Gly Gln Pro Thr Ser Arg Trp His Ala Val Pro Pro Gln 315 320 325 cac act ctg ggg tcg gtc ccc ggc agc agc atc gcc ctc agg ccc cgc 4364 His Thr Leu Gly Ser Val Pro Gly Ser Ser Ile Ala Leu Arg Pro Arg 330 335 340 cca gga gag cca ggc agg gac ttg gcc tcc agt gaa aat ggc act gag 4412 Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Leu Ala Ser Ser Glu Asn Gly Thr Glu 345 350 355 tgc cgc agt ggc ttt gtg cgg cat aac ggc tcc tgc cgg tca gtg tgc 4460 Cys Arg Ser Gly Phe Val Arg His Asn Gly Ser Cys Arg Ser Val Cys 360 365 370 gac ctc ttc cca agt tac tgt cac aat ggc ggc cag tgc tac ctg gtg 4508 Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val 375 380 385 390 gag aac ata ggg gcc ttc tgc agg tgc aac acg cag gac tac atc tgg 4556 Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp 395 400 405 cac aag ggg atg cgc tgc gag tcc atc atc acc gac ttc cag gtg atg 4604 His Lys Gly Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile Thr Asp Phe Gln Val Met 410 415 420 tgc gtg gcc gtg ggc tcg gct gcc ctc gtc ctg ctc ctg ctc ttc atg 4652 Cys Val Ala Val Gly Ser Ala Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Phe Met 425 430 435 atg acg gtg ttc ttt gcc aag aag ctc tac ctg ctc aag acg gag aat 4700 Met Thr Val Phe Phe Ala Lys Lys Leu Tyr Leu Leu Lys Thr Glu Asn 440 445 450 acc aag ctg cgt agg acc aac aaa ttc cgg acc cca tct gag ctc cac 4748 Thr Lys Leu Arg Arg Thr Asn Lys Phe Arg Thr Pro Ser Glu Leu His 455 460 465 470 aat gat aac ttc tcc ctc tcc acc att gcc gag ggc tct cac cca aat 4796 Asn Asp Asn Phe Ser Leu Ser Thr Ile Ala Glu Gly Ser His Pro Asn 475 480 485 gat gat cct agt gct ccc cac aaa atc cag gag gtt ctc aag tcc tgc 4844 Asp Asp Pro Ser Ala Pro His Lys Ile Gln Glu Val Leu Lys Ser Cys 490 495 500 ctg aaa gag gag gag tca ttt aac atc cag aac tcc atg tcg ccc aaa 4892 Leu Lys Glu Glu Glu Ser Phe Asn Ile Gln Asn Ser Met Ser Pro Lys 505 510 515 ctt gag ggt ggc aaa ggt gac cag gct 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Gly Gly 65 70 75 80 Glu Leu Ala Gly Pro Glu Glu Val Leu Gln Glu Ser Ala Ala Val Thr 85 90 95 Gly Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Ser Pro Gly Leu Gly Gly Val Thr 100 105 110 Ala Glu Ala Gly Ser Gly Asp Ala Gln Ala Leu Pro Ala Thr Leu Gln 115 120 125 Ala Pro His Glu Val Leu Gly Gln Ser Ile Met Pro Pro Ala Ile Pro 130 135 140 Glu Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys 145 150 155 160 Leu Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp 165 170 175 Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp Pro Gln Val Pro Glu Leu Thr 180 185 190 Tyr Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu Pro Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile 195 200 205 Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp 210 215 220 Leu Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Glu Asn His Pro Asp 225 230 235 240 Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Asp Asp 245 250 255 Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr Pro Thr Thr Ser Phe Tyr 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Lys Asp Ala 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aag ctg agc cca gct tct gaa 3836 Gly Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys Leu Ser Pro Ala Ser Glu 155 160 165 ctc ccc aag gag agc ccc ttg gag gtt tgg ctg aac ctg ggg ggc agc 3884 Leu Pro Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp Leu Asn Leu Gly Gly Ser 170 175 180 aca ccc gac cct caa gtg cca gag ctg act tac cca ttt cag ggc acc 3932 Thr Pro Asp Pro Gln Val Pro Glu Leu Thr Tyr Pro Phe Gln Gly Thr 185 190 195 ctg gag ccc caa ccg gca tca gat atc att gac atc gac tac ttc gaa 3980 Leu Glu Pro Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu 200 205 210 gga ctg gat ggt gag ggt cgt ggc gca gat ctg ggg agc ttc cca ggg 4028 Gly Leu Asp Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp Leu Gly Ser Phe Pro Gly 215 220 225 230 tca cca gga acc tca gag aac cac cct gat act gag gga gag acc cct 4076 Ser Pro Gly Thr Ser Glu Asn His Pro Asp Thr Glu Gly Glu Thr Pro 235 240 245 tcc tgg agc ctg ctt gac tta tac gat gat ttc acc ccc ttc gat gaa 4124 Ser Trp Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Asp Asp Phe Thr Pro Phe Asp Glu 250 255 260 tct gat ttc tac 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160 Leu Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp 165 170 175 Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp Pro Gln Val Pro Glu Leu Thr 180 185 190 Tyr Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu Pro Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile 195 200 205 Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp 210 215 220 Leu Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Glu Asn His Pro Asp 225 230 235 240 Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Asp Asp 245 250 255 Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr Pro Thr Thr Ser Phe Tyr 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Lys Asp Ala 275 280 285 Val Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Asn Glu Leu Leu Val Pro Thr 290 295 300 Gly Lys Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Gly Gln Pro Thr Ser Arg Trp 305 310 315 320 His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Ser Val Pro Gly Ser Ser 325 330 335 Ile Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Leu Ala Ser 340 345 350 Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser Gly Phe Val Arg His Asn Gly 355 360 365 Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly 370 375 380 Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn 385 390 395 400 Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile 405 410 415 Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly Ser Ala Ala Leu Val 420 425 430 Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe Ala Lys Lys Leu Tyr 435 440 445 Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg Thr Asn Lys Phe Arg 450 455 460 Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn Phe Ser Leu Ser Thr Ile Ala 465 470 475 480 Glu Gly Ser His Pro Asn Val Arg Lys Leu Cys Asn Thr Pro Arg Thr 485 490 495 Ser Ser Pro His Ala Arg Ala Leu Ala His Tyr Asp Asn Val Ile Cys 500 505 510 Gln Asp Asp Pro Ser Ala Pro His Lys Ile Gln Glu Val Leu Lys Ser 515 520 525 Cys Leu Lys Glu Glu Glu Ser Phe Asn Ile Gln Asn Ser Met Ser Pro 530 535 540 Lys Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asp Gln Ala Asp Leu Asp Val Asn Cys 545 550 555 560 Leu Gln Asn Asn Leu Thr 565 <210> 7 <211> 27 <212> PRT <213> Designed peptide based on polypeptide of mouse Neuroglycan C-III(N GC-III) <400> 7 Val Arg Lys Phe Cys Asp Thr Pro Arg Val Ser Ser Pro His Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Ala His Tyr Asp Asn Ile Val Cys Gln 20 25 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 tctgagggtg gcgaggtctg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 9 aagctgggct cagcttgtcg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 10 tgcgacctct tcccaagtta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 11 atgactcctc ctctttcagg 20

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Claims (16)

【整理番号】 J200102900 【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号４のアミノ酸番号１〜４０１で
   示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号６のアミノ酸番号１〜５６６で
   示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のポリペプチドをコード
   するＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２に記載のポリペプチドをコード
   するＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号１の塩基番号１〜１２３９で示
   される塩基配列を含むＤＮＡ。
6. 【請求項６】 配列番号３の塩基番号１〜４６３で示さ
   れる塩基配列を含むＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項５に記載のＤＮＡの塩基配列と、
   配列番号１の塩基番号３３３９〜４９５８で示される塩
   基配列の両方を含むＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項６に記載のＤＮＡの塩基配列と、
   請求項３に記載のＤＮＡの塩基配列の両方を含むＤＮ
   Ａ。
9. 【請求項９】 請求項５に記載のＤＮＡの塩基配列と、
   請求項４に記載のＤＮＡの塩基配列の両方を含むＤＮ
   Ａ。
10. 【請求項１０】 配列番号１の塩基配列で示されるＤＮ
    Ａ。
11. 【請求項１１】 配列番号３の塩基配列で示されるＤＮ
    Ａ。
12. 【請求項１２】 配列番号５の塩基配列で示されるＤＮ
    Ａ。
13. 【請求項１３】 配列番号６のアミノ酸４８７〜５１３
    で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
14. 【請求項１４】 配列番号６のアミノ酸４８７〜５１３
    で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗
    体。
15. 【請求項１５】 神経組織において、配列番号６のアミ
    ノ酸４８７〜５１３で示されるアミノ酸配列を検出する
    工程を少なくとも含む、軸索の染色方法。
16. 【請求項１６】 配列番号６のアミノ酸４８７〜５１３
    で示されるアミノ酸配列を検出する工程において、請求
    項１４に記載の抗体を用いることを特徴とする、請求項
    １５に記載の染色方法。