JP2003047479A - ビタミンｄ３水酸化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 活性型ビタミンＤ３の生体内合成と代謝制御
に関与する新規な遺伝子及び蛋白質、該蛋白質に対する
活性調節剤の効率的な評価方法を提供する。 【解決手段】 ヒト由来の特定の塩基配列からなるＤＮ
Ａ及び該ＤＮＡにコードされるビタミンＤ３水酸化酵
素、該ＤＮＡ配列に対するアンチセンス核酸、該蛋白質
を利用した該蛋白質の活性調節化合物の評価方法、該蛋
白質に対する特異抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生体内でのビタミ
ンＤ、特にビタミンＤ３の代謝に関わるビタミンＤ３水
酸化酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有す
る組換えベクター、該ベクターを用いた形質転換体、該
酵素に対する特異抗体、該酵素の発現を抑制するアンチ
センス核酸、及び該酵素またはそれをコードするＤＮＡ
を用いた診断薬、阻害剤、医薬品などのスクリーニング
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビタミンＤ３は、生体内に摂取された
後、主に肝臓において側鎖の２５位が水酸化されて２５
ヒドロキシビタミンＤ３（２５（ＯＨ）Ｄ３）へと誘導
された後、更に、主として腎臓において１α位、２３
位、２４位、２６位などの部位が水酸化されて代謝され
る事が知られている。

【０００３】一般に、カルシウムの代謝調節作用、細胞
の分化誘導、免疫調節など多様な生理作用を持つホルモ
ンとして知られている活性型ビタミンＤ３の正体は、２
５位と１α位に水酸基が導入された１α２５（ＯＨ）_２
Ｄ３である。その他のビタミンＤ３代謝物は、この１α
２５（ＯＨ）_２Ｄ３に比べると極めて低い生理活性しか
示さないため、ビタミンＤ３欠乏性疾患に対して有効な
医薬の殆どが、この１α２５（ＯＨ）_２Ｄ３様の生理活
性を有する化合物として開発されている。また、この活
性型ビタミンＤ３が生体内で合成される経路に関して
も、研究が重ねられている。

【０００４】これまでの研究で、ビタミンＤ３が活性化
型である１α２５（ＯＨ）_２Ｄ３に変換される過程に
は、２種類の水酸化酵素が関与していることが明らかに
されている。

【０００５】活性型ビタミンＤ３生合成の第１の反応
は、ビタミンＤ３側鎖の２５位への水酸基の導入であ
る。この反応は、２５位水酸化酵素（ＣＹＰ２７Ａ）に
より触媒される。この蛋白質は既に精製され、その遺伝
子はラット肝臓（特開平３―２３２４８９３）およびヒ
ト肝臓（Ａｘｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，９１巻、１００１４頁、１９９４年）からク
ローニングされている。この酵素は、ラットＣＹＰ２７
Ａがミクロソームとミトコンドリアの両器官に存在する
一方で、ヒトＣＹＰ２７Ａがミトコンドリアにしか存在
しないなど、種によってその挙動が相異するという特徴
を有する。

【０００６】第２の反応は、２５（ＯＨ）Ｄ３の１α位
への水酸基の導入である。この反応は１α水酸化酵素
（ＣＹＰ２７Ｂ）により行われる。この蛋白質をコード
する遺伝子も、既にラット腎臓（特開平１１−７５８６
３）及びマウス腎臓（Science,２７７巻，１８２７頁〜
１８３０頁、１９９７年）、ヒト腎臓（Ｋｉｔａｎａｋ
ａら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３３８，
６５３−６６１，１９９８年）などからクローニングさ
れている。

【０００７】ＣＹＰ２７Ａ、ＣＹＰ２７Ｂは、ともに補
欠分子として鉄プロトポルフィリンＩＸをもつヘム含有
酵素のチトクロームＰ４５０酵素である。そのアミノ酸
配列には、ヘムが配位する蛋白質に広く認められる共通
配列（ヘム結合配列）が存在している。また、ミトコン
ドリアに局在するチトクロームＰ４５０の補酵素結合部
位であるアドレノドキシン結合配列の存在も認められて
いる。

【０００８】上記の２種の酵素反応を経て生成される１
α２５（ＯＨ）_２Ｄ３は、微量でも生体内では血中カル
シウム濃度を急激に増加させる活性を示し、また前述の
様に、骨代謝、分化誘導、脂質代謝などに広く関与する
ことから、その生体内濃度は複雑に制御されている。Ｃ
ＹＰ２７Ｂの酵素活性は、副甲状腺ホルモンやカルシト
ニンによって更新される。その一方、１α２５（ＯＨ）
_２Ｄ３自身が自らを代謝する酵素である２４−水酸化酵
素を誘導して、１α２５（ＯＨ）_２Ｄ３を低活性型の２
４位水酸化型ビタミンＤ３へと代謝させる。この一連の
代謝は、血中カルシウム濃度上昇、血清リン濃度、性ホ
ルモン等様々な要素により、厳格に制御されている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】ラットでのＣＹＰ２７
Ａの細胞内局在性、生体内での１α２５（ＯＨ）_２Ｄ３
濃度の複雑な制御機構が存在していることなどから、既
に報告されているヒトのＣＹＰ２７Ａ、ＣＹＰ２７Ｂ以
外にも、ビタミンＤ３から２５（ＯＨ）Ｄ３あるいは１
α２５（ＯＨ）_２Ｄ３を生成あるいは代謝する新規な水
酸化酵素が存在する可能性が考えられる。この様な酵素
ならびにこれをコードする遺伝子を新たに単離できれ
ば、活性型ビタミンＤ３の医薬分野において新規な機構
に基づく医薬の提供が可能となり得る。

【００１０】本発明は、生体内での活性化型ビタミンＤ
３の生成あるいはその代謝に関与する新規なビタミンＤ
３水酸化酵素及びそれをコードするＤＮＡを提供するこ
とにある。さらに、本発明は当該ＤＮＡを用いた当該酵
素の生産方法、当該酵素活性を調節する化合物のスクリ
ーニング方法を提供することを目的とするものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヒト神経細胞
（ＮＴ２細胞系、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）から単離さ
れた新規な遺伝子（ｖｄｄｈとする）、当該遺伝子にコ
ードされるビタミンＤ３水酸化酵素（ＶＤＤＨとする）
に関する。また、当該遺伝子を用いて形質転換した宿主
細胞、該形質転換細胞を用いた組換ＶＤＤＨの生産方法
を提供する。

【００１２】（核酸）本発明は、ＶＤＤＨ（後に詳しく
述べる）をコードする遺伝子ｖｄｄｈを提供する。該遺
伝子はヒト神経細胞から単離同定することができるが、
本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブリダ
イゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクローニン
グやホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調
製されるＤＮＡであってもよい。その形態としてはｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれ
るが、特に制限はない。また、本発明のＤＮＡは１本鎖
であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮ
Ａと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。ま
た、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化
学発光物質等で標識されていてもよい。

【００１３】ｖｄｄｈの塩基配列が提供されれば、これ
より導かれるＲＮＡの配列や、相補的なＤＮＡ及びＲＮ
Ａの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、本
発明のＤＮＡに対応するＲＮＡあるいは本発明のＤＮＡ
と相補的な配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡもまた提供
するものと理解すべきである。

【００１４】さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号１
または配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとス
トリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡをも
含むものである。

【００１５】配列番号１または配列番号３に記載の塩基
配列からなるＤＮＡに対しては、これとストリンジェン
トな条件でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡにコードさ
れる蛋白質がビタミンＤ３水酸化酵素活性を保持する範
囲内において、塩基配列のバリエーションが許容され
る。例えば、いわゆるコドン縮重による同一アミノ酸残
基をコードする複数のコドンの存在や、種々の人為的処
理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダ
ム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・
連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであ
っても、これらＤＮＡ変異体が配列番号１または配列番
号３に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつビタミンＤ３水酸化酵素活性をコー
ドするＤＮＡであれば、配列番号１または配列番号３に
示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内
のものである。

【００１６】上記のＤＮＡ変異の程度は、配列番号１ま
たは配列番号３に記載のＤＮＡ配列と７０％以上、好ま
しくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の同一性
を有するものであれば許容範囲内である。ＤＮＡ配列の
同一性の判断にはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ
Ｆ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ．，３６，ｐｐ．２９０−
３００（１９９３）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，ｐｐ．４０
３−１０（１９９０））を用いることができる。また、
ハイブリダイズする程度としては、通常の条件下、例え
ばＤＩＧ ＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ベーリン
ガー・マンハイム社製Ｃａｔ Ｎｏ．１１７５０３３）
でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ Ｅａ
ｓｙ Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａ
ｔ Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、
５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤ
Ｓを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣ
は０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナト
リウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、
配列番号１または配列番号３に記載の核酸にハイブリダ
イズする程度であればよい。

【００１７】配列番号１または配列番号３に記載の塩基
配列からなるＤＮＡあるいはその部分断片は、活性型ビ
タミンＤ３欠乏性の諸疾患等、本発明の蛋白質が関与す
る疾患の特異的プローブとして有用であると考えられ
る。

【００１８】本発明のＤＮＡは、ＶＤＤＨを大量に生産
するために使用することができる。該ＤＮＡはまた、酵
素等で標識して、組織における本発明の蛋白質の発現状
況を検査するために使用することができる。すなわち、
該ＤＮＡをプローブとして使用し、細胞における本発明
の蛋白質の発現量を、ｍＲＮＡ発現量を指標として確認
することにより、本発明の蛋白質の製造に適した細胞や
その培養条件を決定することができるほか、本発明の蛋
白質が関連する疾患の診断を行うことも可能である。

【００１９】また、本発明のＤＮＡの一部をプライマー
として使用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉ
ｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈｉｓｍ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ
ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｈｉｓｍ）法、シークエンシング等の方法によ
り、核酸配列上の異常あるいは多形を検査・診断するこ
とができる。

【００２０】また、本発明のＤＮＡを生体内の細胞に導
入し、本発明の蛋白質の発現または活性が損なわれてい
ることによる疾患の遺伝子治療にも使用する事ができ
る。

【００２１】本発明のＤＮＡは、形質転換細胞の調製、
さらには該形質転換細胞を用いた組換蛋白質ＶＤＤＨの
生産方法、あるいはＶＤＤＨの発現を特異的に制御する
化合物の探索に大いに有用である。

【００２２】本発明における形質転換細胞は当業者に公
知の技術を適用して調製することが可能であり、例え
ば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々な
ベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のＤＮＡ
を組み入れることが可能である。その際、遺伝子ｖｄｄ
ｈプロモーターやエンハンサーに代表される発現制御遺
伝子の影響下におくことで、遺伝子ｖｄｄｈの宿主細胞
内での発現を任意にコントロールすることが可能であ
る。この手法は、形質転換された宿主細胞を用いた蛋白
質ＶＤＤＨの生産において好適に用いられる他、遺伝子
ｖｄｄｈの発現制御機構の研究あるいは該遺伝子の発現
を調節し得る物質の探索などにも応用することが可能と
なる。

【００２３】例えば、任意の被験物質と遺伝子ｖｄｄｈ
を含むベクターで形質転換された細胞とを適当な条件下
で接触させることで、被験物質の遺伝子ｖｄｄｈの発現
を促進あるいは抑制する作用を有する物質を探索し、あ
るいは評価を行うことができる。

【００２４】（蛋白質ＶＤＤＨ）ｖｄｄｈにコードされ
る蛋白質は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるＶ
ＤＤＨである。このアミノ酸配列は、既知のビタミンＤ
３水酸化酵素であるヒトＣＹＰ２７Ａのアミノ酸配列と
６２％、ヒトＣＹＰ２７Ｂのアミノ酸配列とは６０％の
相同性を示す。また、ＶＤＤＨはヘムを配位する蛋白質
に認められる特徴的配列であるＦＧＨＧＶＲＳＣＩＧ
を、アドレノドキシンに対して親和性を有する蛋白質に
認められる特徴的配列であるＰＬＶＲＡＬＬＫＥＴＬＲ
ＬＦＰを、ともにＣＹＰ２７ＡやＣＹＰ２７Ｂと比較し
て、それぞれ相当する部位に有している。以上の事実よ
り、ＶＤＤＨは新規なヒトビタミンＤ３水酸化酵素であ
ると判断される。

【００２５】ＶＤＤＨは活性型ビタミンＤ３の生合成に
関与する酵素であることから、この酵素の生体内での機
能変化は、活性型ビタミンＤ３の欠乏に起因する種々の
疾患、例えば慢性腎不全、副甲状腺機能低下症、くる
病、骨粗しょう症、乾せんなどの発症とも密接に関与し
ているものと推察される。従って、ＶＤＤＨそれ自体が
活性型ビタミンＤ３欠乏性の諸疾患に対する医薬として
の有用性を持つと期待される。

【００２６】なお、ビタミンＤ３水酸化酵素活性を有す
る限り、配列番号２に示す蛋白質のアミノ酸配列におい
て、１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／若しくは
付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋
白質も本発明の範囲内である。

【００２７】蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖
は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なる
が、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言
う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つか
の関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換に
ついては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、
Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、
ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタ
ミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギ
ン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン
（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン
（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニ
ン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、Ａｌａ、Ｖａ
ｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、メチオニン（Ｍｅｔ）、
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒ
ｐ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓは、共に非極性アミノ酸に分類さ
れるため、互いに似た性質を有すると考えられる。非荷
電極性アミノ酸としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、チロシン
（Ｔｙｒ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。酸性アミノ
酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。塩基性
アミノ酸としてはＬｙｓ、Ａｒｇ、ヒスチジン（Ｈｉ
ｓ）が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう
場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能、本発明にお
いてはビタミンＤ３水酸化酵素活性、を失わない変異も
当業者に多く知られている。さらに、異なる生物種間に
保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あ
るいは分散して欠失あるいは挿入されていてもなお本質
的な機能を保持している例も多く認められている。

【００２８】従って、配列番号２に示したアミノ酸配列
上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、
その変異が本発明の本質的機能であるビタミンＤ３水酸
化酵素活性を有する蛋白質であれば、これらは本発明の
範囲内にあるものと言うことができる。

【００２９】このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多形
等によって生ずる変異の様に自然界において認められる
他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発
剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用
いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことが
できる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白質
がビタミンＤ３水酸化酵素活性を保持する限り特に制限
はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましく
は１０アミノ酸以内、更に好ましくは１または数個であ
る。

【００３０】（抗体）本発明はさらにＶＤＤＨに結合す
る抗体を提供する。本発明の抗体は、上記蛋白質全体あ
るいはその部分ペプチドを抗原として特異的に認識する
抗体であり、モノクローナル抗体及び／またはポリクロ
ーナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構造、
物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５つの
クラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、
あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれに属す
るものであってもよい。さらに、免疫グロブリンを例え
ばペプシンで分解したときのＦ（ａｂ’）_２、パパイン
で分解したときのＦａｂなどのフラグメントであって
も、またキメラ抗体であってもよい。これらの抗体は、
ＶＤＤＨの研究的あるいは臨床的な検出、ＶＤＤＨによ
ってもたらされ得る疾患の臨床治療等に有用である。

【００３１】（アンチセンス核酸）本発明は、生体内に
おいて核酸レベルでのＶＤＤＨ生合成を抑制することの
できる、いわゆるアンチセンス核酸を提供する。かかる
アンチセンス核酸は、ＶＤＤＨをコードするｍＲＮＡを
作り出すのに必要なゲノム領域からｐｒｅ−ｍＲＮＡへ
の転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプ
ロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段階の
いずれかで、遺伝子情報を担うＤＮＡもしくはＲＮＡに
結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋
白質の発現を調節するものを意味し、遺伝子ｖｄｄｈの
核酸配列の全体あるいはいずれかの部分に相補する配列
からなるものであってもよい。好ましくは、配列番号１
または配列番号３に記載の核酸配列に相当あるいは相補
する配列から成る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡを含む）であ
る。また、ゲノム領域から転写されるｍＲＮＡがイント
ロン構造あるいは５’末端や３’末端に被翻訳領域を含
む形であるときは、かかる非翻訳部分の配列に相当ある
いは相補するアンチセンス核酸も本発明のアンチセンス
核酸と同等の機能を有するものとなろう。

【００３２】本発明のアンチセンス核酸は、ＤＮＡやＲ
ＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮＡあるいはＲＮＡ
と類似する各種誘導体のすべてを含むものである。例え
ば、３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合した核
酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくと
もいずれか１つにおいて置換や修飾が生じた核酸、天然
には存在しないような塩基、糖あるいはリン酸を有する
核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有
する核酸等が挙げられる。これらの核酸は、ヌクレアー
ゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも
１つが高められた誘導体として好適である。すなわち、
ＶＤＤＨの活性発現を抑制し得る機能を有する限り、核
酸の形態に制限はない。

【００３３】また本発明では、一般的には、ステム・ル
ープを形成しているｍＲＮＡのループ部分にハイブリダ
イズするような塩基配列、すなわちステム・ループを形
成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつア
ンチセンス核酸が好適である。あるいは、翻訳開始コド
ン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプ
ライス部位に結合するようなアンチセンス核酸、すなわ
ちこれらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセ
ンス核酸も、一般に高い発現抑制効果が期待できる点で
好ましい。

【００３４】この様なアンチセンス核酸を細胞内に取り
込ませ、効率的に作用させるためには、本発明のアンチ
センス核酸の鎖長は１５塩基以上３０塩基以下、好まし
くは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩
基以上２２塩基以下の塩基数からなる塩基配列からなる
ものが好適である。

【００３５】本発明のアンチセンス核酸の発現抑制効果
は、公知の手法、例えば本発明の遺伝子の発現制御領
域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または５’
翻訳領域等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポータ
ー遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応（プロメガ
社：Ｒｉｂｏ ｍａｘ ｓｙｓｔｅｍ等）とｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒ
ａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ
Ｓｙｓｔｅｍ等）を併用する系のような本発明の遺伝
子が転写または翻訳される環境下で候補物質を系に添加
し、該レポーター遺伝子の発現量を測定することにより
評価することができる。

【００３６】本発明のアンチセンス核酸は、生体内にお
けるＶＤＤＨの発現を抑制することができるので、ＶＤ
ＤＨの過剰発現による生じる高カルシウム血症に起因す
る疾患の予防・治療剤として有用である。

【００３７】

【発明の実施の形態】（核酸）遺伝子ｖｄｄｈは、ヒト
神経細胞から単離同定することができる。本発明のＤＮ
ＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲ
ノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハ
イブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体
を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニング
し、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこか
ら制限酵素等を用いて切り出す方法がある。ハイブリダ
イゼーション法によるスクリーニングは、配列番号１ま
たは配列番号３に記載の塩基配列もしくはその一部を有
するＤＮＡを^３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意
のｃＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法で（例え
ば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２年）行うこ
とができる。イムノスクリーニング法で用いる抗体は、
後述する本発明の抗体を使用することができる。本発明
の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしく
はｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっ
ても得る事ができる。ＰＣＲは、配列番号１または配列
番号３に記載の塩基配列をもとに、センスプライマー、
アンチセンスプライマーを作成し、任意のＤＮＡライブ
ラリーに対し、公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ
Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ Ｇｕｉ
ｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０年
参照）等を行って、本発明のＤＮＡを得る事もできる。
上記各種方法で使用するＤＮＡライブラリーは、本発明
のＤＮＡを有するＤＮＡライブラリーを選択して使用す
る。当該ＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有す
るライブラリーであれば、いかなるものも使用可能であ
り、市販のＤＮＡライブラリーを使用したり、本発明の
ＤＮＡを有する細胞からｃＤＮＡライブラリーを作成す
るのに適した細胞を選び公知の方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ 等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年参照）に従っ
て、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、利用することがで
きる。

【００３８】また、本明細書に開示された配列を基にホ
スホアミダイト法などの化学合成的手法により調製する
ことも可能である。

【００３９】本発明のＤＮＡを有する組換えベクター
は、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよ
い。かかる組換えベクターは、本発明のＤＮＡに加え、
必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基
配列とは、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、
リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用
される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配
列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付
加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカ
ーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。本発明の組
換えベクターの好ましい一例は、発現ベクターである。

【００４０】遺伝子組み換えに際しては、適当な合成Ｄ
ＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コド
ンを本発明のＤＮＡに付加したり、あるいは塩基配列内
に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消
失させることも可能である。これらは当業者が通常行う
作業の範囲内であり、本発明のＤＮＡを基に任意かつ容
易に加工することができる。

【００４１】また本発明のＤＮＡを保持するベクター
は、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使
用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、
バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィル
ス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に
制限はない。

【００４２】本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有の
プロモーター配列の制御下に発現させることができる。
かかる発現系を用いれば、本発明の遺伝子の転写を促進
あるいは抑制する物質の探索がより有利に行える。ある
いは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモー
ターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは
置き換えて使用することもできる。この場合に使用する
プロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択
すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プ
ロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモータ
ー、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合
にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤ
Ｈプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳ
Ｖ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター
等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されな
い。

【００４３】ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知で
ある（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、ＤＮＡ
とベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られ
たそれぞれの断片をＤＮＡリガーゼを用いてライゲーシ
ョンさせればよい。

【００４４】（蛋白質）本発明の蛋白質は、天然に発現
している各種臓器から調製することができるが、生体内
でのＶＤＤＨの発現量は少ないことから、ペプチド合成
機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３０Ａ型、パー
キンエルマージャパン（株）製）を使用した化学合成
法、あるいは原核生物や真核生物から選択される適当な
宿主細胞を用いた組換え方法によって調製することが好
ましい。

【００４５】前項の組換えベクターを用いて形質転換さ
せる宿主細胞には特に制限はなく、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓあるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに
代表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細
胞、昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細
胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、本発明に対
しても利用可能である。

【００４６】組換えベクターを宿主細胞に導入する方法
としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト
法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡ
Ｅデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイ
ルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増
刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０日発
行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用いても
構わない。

【００４７】当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するに
は、上述の形質転換体を培養して培養混合物を回収し、
当該蛋白質を精製する。形質転換体の培養は、一般的な
方法で行うことができる。形質転換体の培養については
各種の成書（たとえは、「微生物実験法」社団法人日本
生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年、参
照）があるので、それらを参考にして行うことができ
る。

【００４８】培養混合物から本発明の蛋白質を精製する
方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法
の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。
すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾
過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎
水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の
各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォ
ーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロ
マトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切
な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を
使用して適当な順序で精製を行えば良い。

【００４９】組換えＶＤＤＨ蛋白質が形質転換体のペリ
プラズムまたは細胞質内に存在する場合は、適当な緩衝
液に懸濁した細胞に対して、例えば超音波処理、凍結融
解処理、あるいはリゾチーム処理などを行って細胞壁お
よび／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過など
の方法で本発明の蛋白質を含有する膜画分を得、さらに
該膜画分を適当な界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液
を調製する。そして、当該粗溶液から常法により目的蛋
白質を単離、精製することができる。

【００５０】また、本発明の蛋白質を他の蛋白質やタグ
（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテイン
Ａ、ヒキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との
融合蛋白質として発現させることも可能である。発現さ
せた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビンそ
の他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとして
蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。本発
明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合
わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させた
ときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好
ましい。

【００５１】また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞
系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．
（１９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に生産す
る方法の１つである。

【００５２】この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形
態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製する
ことができるが、これらのみに制限されるものではな
く、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させる
ことも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学
修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不
溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手
法による加工が考えられる。また、用いる宿主によって
は糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認めら
れる。かかる場合にあっても、ビタミンD3水酸化酵素と
して機能する限りにおいて、なお、本発明の思想下にあ
るというべきである。

【００５３】本発明の蛋白質は、抗体を作製するための
抗原として使用したり、該蛋白質に結合する物質や該蛋
白の活性を調節する物質のスクリーニングに使用するこ
とができ、有用である。

【００５４】また、本発明の蛋白質は、それ自体を必要
に応じて、薬理学的に許容され得る補助成分を添加し
て、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、
座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型へと加工し、医薬
として用いることができる。これは、活性型ビタミンD3
が不足することによる各種疾患に対して有効な医薬とな
り得る。薬理学的に許容され得る補助成分とは、溶媒、
基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、緩衝剤等の
ことである。特に、蛋白質製剤にとって好適な安定化剤
や腑形剤の使用が望ましい。

【００５５】上述のような剤型とした場合、患者の年齢
や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、
その投与量を設定して使用することができる。すなわ
ち、病態を改善するのに適した量を、経口投与、あるい
は、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直
腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投
与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよ
い。

【００５６】（抗体）本発明の抗体は、ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にし
て得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免
疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説
明する。

【００５７】当該新規抗体を得るには、まず動物に、免
疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイント
の完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント
（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必
要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫
後、採血を行い抗血清を得る。抗原として用いる本発明
の蛋白質は、それか抗体の作製に使用しうる精製度のも
のであれはいかなる方法で得られたものであってもよ
い。本発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原とし
て好適に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプ
チドが、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０
アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それを
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャ
リアと結合させて抗原として使用すればよい。免疫する
動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常
当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、
ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等
から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用す
ることが好ましい。

【００５８】ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を
精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良
い。

【００５９】モノクローナル抗体を得るには以下のよう
に行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリ
ンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコ
ール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方
法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリド
ーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗
体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択
されたクローンの培養上清を精製することによって得れ
は良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を
適宜組み合わせて用いれば良い。

【００６０】また、遺伝子工学的な方法を用いても当該
新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその
部分ポリペプチドで免疫した動物の牌細胞、リンパ球あ
るいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対
するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから
ｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリー
を作成する。抗原と反応する抗体を産生しているクロー
ンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培
養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて
精製することができる。抗体を治療に使用する場合に
は、免疫原性の点からヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗
体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス（例Ｎａ
ｔ． Ｇｅｎｅｔ．、１５；１４６−１５６（１９９
７））を免疫することにより調製することが出来る。ま
た、モノクローナル抗体の超可変領域を用いて遺伝子工
学的に調製することもできる（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３；９９−１２１（１９９
１））。

【００６１】（アンチセンス核酸）アンチセンス核酸
は、公知方法で製造することができる（例えば、Ｓｔａ
ｎｌｅｙ Ｔ．ＣｒｏｏＫｅおよびＢｅＲＮＡｌｄ Ｌ
ｅｂｌｅｕ編、ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ出
版、フロリダ、１９９３年）。天然のＤＮＡやＲＮＡで
あれば、化学合成機を使用して合成したり、ＶＤＤＨを
鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス核酸を
得ることができる。また、メチルフォスフォネート型や
フォスフォロチオエート型等、誘導体の中には化学合成
機（たとえばパーキンエルマージャパン（株）製、３９
４型）を使用して合成できるものもある。この場合に
は、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を
行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を
用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、アン
チセンス核酸を得ることができる。

【００６２】本発明のＤＮＡやアンチセンス核酸を診断
用のプローブとして使用する場合には、それらを公知の
方法に従い、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、あ
るいは発光物質等で標識する。次に、検体からＤＮＡも
しくはｍＲＮＡを公知方法で調製し、これを被検物質と
して、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄し
て未反応の前記標識プローブを除去する。被検物質中
に、遺伝子ｖｄｄｈもしくはＲＮＡが含まれていれば、
当該アンチセンス核酸はそれらと結合する。結合形成の
有無は、標識した酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは
放射性同位元素等による発光、蛍光、放射能等を指標と
して知ることができる。

【００６３】本発明の核酸、特にアンチセンス核酸を医
薬用途に使用する場合には、医薬品として使用するのに
適した純度のものを、薬理学的に許容されうる使用方法
で使用することが好ましい。

【００６４】本発明の核酸あるいはアンチセンス核酸
は、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁して使
用してもよいし、リポソーム中に封入したり、適当なベ
クターに組み込んだ形にして使用してもよい。また、必
要に応じて、薬理学的に許容され得る補助成分を添加
し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、
座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にして使用しても
よい。薬理学的に許容され得る補助成分とは、溶媒、基
剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、緩衝剤等のこ
とである。

【００６５】本発明の核酸あるいはアンチセンス核酸
は、上述のような剤型とした場合、患者の年齢や、性
別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、その投
与量を設定して使用することができる。すなわち、病態
を改善するのに適した量を、経口投与、あるいは、吸
入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投
与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、腹
腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。

【００６６】（スクリーニング方法）本発明は、本発明
の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発
明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、または該
組換えベクターで形質転換された形質転換細胞を用いる
ことを特徴とする、本発明の蛋白質の機能または発現を
調節する物質をスクリーニング方法に関する。より具体
的には、（１）候補物質の存在下／非存在下におけるＶ
ＤＤＨのビタミンＤ３水酸化酵素活性を評価し、該酵素
活性を調節する物質を同定する方法、（２）候補物質の
存在下／非存在下における本発明の蛋白質または遺伝子
の発現レベルを比較し、本発明の蛋白質の発現を調節す
る物質をスクリーニングする方法などが挙げられる。
（１）の例としては、実施例４に示す系において、被験
物質存在下／非存在下におけるＶＤＤＨのビタミンＤ３
水酸化酵素活性を測定し、該酵素活性を調節、即ち阻害
あるいは促進する物質を選択することができる。ビタミ
ンＤ３水酸化活性を測定する方法としては、他にもＳｃ
ｉｅｎｃｅ ２７７；１８２７−１８３０（１９９７、
Ｔａｋｅｙａｍａら）やＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１；１００１４−１００１８
（１９９４、Ａｘｅｎら）に記載の方法を適宜用いるこ
とができる。（２）の例としては、ｖｄｄｈ遺伝子の発
現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域ま
たは５’翻訳領域等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等の
レポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、
本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で該レポ
ーター遺伝子の発現量を候補物質の存在下／非存在下で
測定し、候補物質の転写促進活性または転写抑制活性を
確認する方法が挙げられる。本発明の遺伝子の発現制御
領域や５’非翻訳領域は公知の方法で取得することが可
能である（新細胞工学実験プロトコール（秀潤社）、１
９９３年）。

【００６７】候補物質としては蛋白質、ペプチド、オリ
ゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合物、醗酵生
成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが
挙げられるがこれに限定されず、新規物質でも公知物質
でもよい。

【００６８】

【実施例】以下の実施例により本発明を更に詳述する
が、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきも
のではない。

【００６９】実施例１ 遺伝子vddhのクローニング （１）オリゴキャップ法による完全長ｃＤＮＡライブラ
リーの作製 ヒト培養細胞ＮＴ２細胞（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ ＃２
０４１０１）をカタログ記載のレチノイン酸（ＲＡ）処
理と生育阻害剤処理をする方法により培養し、神経分化
した細胞を濃縮回収後、文献（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇＳｅｃｏｎｄ ｅ
ｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）記
載の方法によりｍＲＮＡを全ＲＮＡで抽出した。抽出し
たＲＮＡよりオリゴキャプ法（Ｍ．Ｍａｒｕｙａｍａａ
ｎｄ Ｓ．Ｓｕｇａｎｏ，Ｇｅｎｅ，１３８：１７１−
１７４（１９９４））を改良した方法（公開特許ＷＯ
０１／０４２８６ ２００１．１．１８公開）によりｃ
ＤＮＡライブラリーを作成した。

【００７０】Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐ ｌｉｎｋｅｒ（5'-
AGC AUC GAG UCG GCC UUG UUG GCCUAC UGG-3'）および
Ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒ（5'- GCG GCT GAA GA
C GGC CTA TGT GGC CTT TTT TTT TTT TTT TTT-3'）を用
いて、公開特許ＷＯ ０１／０４２８６に記載したよう
にＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈ
ｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ
Ａｃｉｄ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、Ｒ
ＮＡライゲーション、第一鎖ｃＤＮＡの合成とRNAの除
去を行った。次いで、5'（5'- AGC ATC GAG TCG GCC TT
G TTG-3'）と3'（5'- GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT-
3'）のＰＣＲプライマーを用いＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖
ｃＤＮＡに変換し、SfiI切断した。

【００７１】次いで、通常は２ｋｂ以上（場合によって
は３ｋｂ以上）に分画したｃＤＮＡ断片をＤｒａＩＩＩ
で切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（ＧｅｎＢａｎ
ｋＡＢ００９８６４，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔ
ｏｒ）にｃＤＮＡの方向性を決めてクローニングし、ｃ
ＤＮＡライブラリーを作成した。

【００７２】（２）ｃＤＮＡクローン塩基配列及びその
推定蛋白質情報の解析 （１）の方法で作製したｃＤＮＡライブラリーより得た
クローンのプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’
端の塩基配列をＤＮＡシーケンシング試薬（ＢｉｇＤｙ
ｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ ＦＳＲｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ，ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、マニュ
アルに従ってシーケンシング反応後、ＤＮＡシーケンサ
ー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００，ＰＥ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ社製）でＤＮＡ塩基配列を解析した。得られ
たデータよりＣ−ＮＴ２ＮＥ２０００３９０を選択し、
ｃＤＮＡの全長配列を解析した。

【００７３】（１）に記載の方法で取得したプラスミド
Ｃ−ＮＴ２ＮＥ２０００３９０には、配列番号５で表さ
れる３７２個のアミノ酸からなる新規な蛋白質をコード
する、配列番号４で表される１１１６塩基の塩基配列か
らなるオープンリーディングフレームを含む配列番号６
で表わされる２０９３塩基対の塩基配列からなるｃＤＮ
Ａが含まれていた。

【００７４】（３）ｖｄｄｈ完全長ｃＤＮＡのクローニ
ング クローニングされたＣ−ＮＴ２ＮＥ２０００３９０に存
在する配列番号６で表される全長２０９３塩基対の塩基
配列に含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）にコードされる３７２個のアミノ酸からなる新規な
蛋白質について相同性検索を行った。

【００７５】その結果、Ｃ−ＮＴ２ＮＥ２０００３９０
のＮ端側１番目からのアミノ酸配列はＣＹＰ−２７（Ｇ
ＥＮＢＡＮＫ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＰ＿０００７７
５）のＮ端側１５７番目からと高い相同性を示した。し
かし、５’ＵＴＲの部分で読み枠をずらすと、ＣＹＰ−
２７のアミノ酸配列のうち１５６番目よりＮ末端側と高
い相同性を示す領域が見出された。このことから、Ｃ−
ＮＴ２ＮＥ２０００３９０はエクソンの欠失または読み
枠のずれが生じている可能性が考えられた。

【００７６】そこで、Ｃ−ＮＴ２ＮＥ２０００３９０の
５’末端及び３’末端側に相当するセンスプライマー
（5’-AGC CTC GCC GCC ATG CCG GG-3’）及びアンチセ
ンスプライマー（5’-ATT TTT GAG AAA GGG TCT CA-
3’）を設計し、Ｃ−ＮＴ２ＮＥ２０００３９０の発現
が確認された精巣由来のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行っ
た。得られたＤＮＡフラグメントの両末端をリン酸化し
た後、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）のＥｃｏＲＶサイトに挿入し、その塩基配列を決定
した。その結果、Ｃ−ＮＴ２ＮＥ２０００３９０の９０
番目のＧの３’端側に１９１ｂｐに相当する新たな塩基
の挿入が確認できた。得られた２２８４塩基からなるｃ
ＤＮＡの塩基配列は配列番号３に記載している。この遺
伝子は配列番号１で表される１４０７塩基の塩基配列か
らなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含
み、配列番号２で表される４６９個のアミノ酸からなる
新規な蛋白質ＶＤＤＨをコードしていた。

【００７７】（４）ｖｄｄｈ完全長ｃＤＮＡクローン塩
基配列及びその推定蛋白質情報の解析 相同性の検索にはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ
Ｆ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ．，３６，ｐｐ．２９０−
３００（１９９３）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，ｐｐ．４０３
−１０（１９９０））およびＦａｓｔａ（Ｗ．Ｒ． Ｐ
ｅａｒｓｏｎ ＆ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ．，ＰＮＡ
Ｓ．，８５，ｐｐ．２４４４−２４４８（１９８８））
を用いて、局部的な配列の一致を検索した。

【００７８】その結果、アミノ酸配列においてヒトＣＹ
Ｐ２７Ａ（ＧＥＮＢＡＮＫ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＰ
＿０００７７５）との相同性が４５６残基にわたり ６
２％、ヒトＣＹＰ２７Ｂ（ＧＥＮＢＡＮＫ ＡＣＣＥＳ
ＳＩＯＮ ＮＰ＿０００７７６）との相同性が４７６残
基にわたり６０％、ラットＣＹＰ２７（ＧＥＮＢＡＮＫ
ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｐ１７１７８）との相同性が４
７７残基にわたり６１％であった。また、ヘムを配位す
る蛋白質に認められる特徴的配列であるＦＧＨＧＶＲＳ
ＣＩＧ、アドレノドキシンに対して親和性を有する蛋白
質に認められる特徴的配列であるＰＬＶＲＡＬＬＫＥＴ
ＬＲＬＦＰ、がそれぞれ確認された。

【００７９】ＶＤＤＨのアミノ酸配列、ヒトＣＹＰ２７
ＢおよびラットＣＹＰ２７Ａのアミノ酸配列を、マルチ
プルアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ （Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎ ＪＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ，Ｇｉｂｓ
ｏｎ ＴＪ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，２２，ｐｐ．４６７３−４６８０（１９９４））
を用いて多重整列した結果を図１に示す。

【００８０】実施例２ ＰＣＲ法による各種臓器におけ
る発現解析 ＲＴ−ＰＣＲによるｖｄｄｈ遺伝子の組織発現プロファ
イル解析を行った。解析に用いたヒトＲＮＡは以下の通
りである。ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）及び、ヒ
ト胎盤組織から定法によりｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し
た。また、ヒト末梢血由来白血球を５０μｇ／ｍｌのＰ
ＨＡ存在下で２４時間培養した後にｔｏｔａｌ ＲＮＡ
を定法により調製した。さらにヒトの肺、腎臓、膵臓、
小腸、胸腺、脾臓、心臓、子宮、精巣、前立腺、骨格筋
のｔｏｔａｌ ＲＮＡをクローンテック社より、肝臓、
大腸、白血球、脳のｔｏｔａｌ ＲＮＡについてはＢｉ
ｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより購入した。次
に、これら各ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ６μｇよりオリゴｄ
Ｔプライマーを用いて１本鎖ｃＤＮＡの合成を定法に従
って行った。逆転写酵素としてはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐ
ｔＩＩＲＮａｓｅ Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ま
た、ＰＣＲに用いたｖｄｄｈ特異的なプライマーの配列
はセンスプライマー（5’- GGG TAT CTG ATT CCG AAA G
G -3’）、アンチセンスプライマー（5’-GCG AAC CCC
ATG ACC AAA GG -3’）である。解析した結果、vddh遺
伝子は子宮及び精巣で発現が高く、次いで小腸、脾臓の
他種々の組織で発現が確認された（図２）。

【００８１】実施例３ 哺乳細胞での発現 実施例１（３）で得られたプラスミドを下記の方法でＣ
ＯＳ−１細胞に導入し、ＶＤＤＨ蛋白質の発現を行うこ
とができる。

【００８２】ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノステ
ィックス社）５０μｌを実施例１（３）で得られたプラ
スミドＤＮＡ １２．５μｇと添付プロトコールに従い
混合し、１５０ｃｍ^２フラスコにセミコンフルエントに
増殖したＣＯＳ−１細胞に添加する。５％ＣＯ_２、３７
℃の条件下で７２時間培養した後に、ＶＤＤＨ蛋白質発
現細胞を回収し、実施例４に示す活性測定アッセイに供
する。

【００８３】実施例４ ビタミンＤ３水酸化酵素活性の
測定 上記の組換えＣＯＳ細胞を５％ＣＯ_２下、３７℃にて培
養する。該発現系２５０μｌを５％ＣＯ_２下、３７℃に
て３０分間プレインキュベートし、１ｍＭ［^３Ｈ］ｖｉ
ｔａｍｉｎＤ３（仮、あるいは［^３Ｈ］２５−ｈｙｄｒ
ｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤ３、［^３Ｈ］１α，２５−ｈｙ
ｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤ３のいずれかとする）２．
５μｌを添加して反応を開始する。３７℃にて４時間イ
ンキュベーションし、遠心分離した上清を高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析する。対照群とし
て、非組換え細胞でも同様の処理を行う。ＨＰＬＣ条件
は以下の通りである； カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ（４．６×
１５０ｍｍ、ナカライ） カラム温度：４０℃ 移動相：メタノール：蒸留水＝８０：２０ 流速：１．０ｍｌ／分 測定波長：ＵＶ ２６４ｎｍ フローセル容量：５００μｌ シンチレーション：フローシンチＩＩ シンチレータ流速：３．０ｍｌ／分

【００８４】蛋白質発現群と対照群におけるｖｉｔａｍ
ｉｎＤ３水酸化物の生成量を比較することにより、本発
明の蛋白質のｖｉｔａｍｉｎＤ３水酸化活性を測定する
ことができる。

【００８５】

【発明の効果】ＶＤＤＨは活性型ビタミンＤ３の生合成
に関与する酵素であることから、この酵素の生体内での
機能変化は、活性型ビタミンＤ３の欠乏に起因する種々
の疾患、例えば慢性腎不全、副甲状腺機能低下症、くる
病、骨粗しょう症、乾せんなどの発症とも密接に関与し
ているものと推察される。従って、ＶＤＤＨそれ自体が
活性型ビタミンＤ３欠乏性の諸疾患に対する医薬として
の有用性を持つと期待される。

【００８６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. <110> Helix Research Institute, Inc. <120> Novel Vitamine D3 dehydrogenase <130> 44898 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1407 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgccggggc cgaggaccct cgccaacctg gcggagttct tctgcaggga cggcttcagc 60 cgcatccacg agatccagca gaagcacaca cgggaatatg gaaaaatctt caagtctcac 120 tttggtcctc agtttgtagt atctattgca gaccgcgata tggtggctca ggtgctccgg 180 gcggagggcg ctgcgcccca gagagccaac atggagtcct ggcgggagta ccgagacttg 240 cgggggagag ccaccgggct catctcggcg gagggtgaac agtggctcaa gatgagaagc 300 gtattgagac aaagaattct gaaaccgaaa gatgtggcca tctattctgg agaagtcaac 360 caagttattg ctgacttaat taaaagaatc tacctcctca ggagccaggc agaagatgga 420 gaaaccgtga ccaatgtcaa tgatcttttc ttcaaatatt caatggaagg agtggccacc 480 atcctttatg agagtcgttt gggctgcctg gaaaacagca tcccacagct gactgtggaa 540 tacatcgagg ccctggagct catgtttagc atgttcaaga cctccatgta tgcaggcgcc 600 atccccagat ggcttcgccc cttcatccca aagccctggc gggaattctg caggtcctgg 660 gatggactct tcaaattcag ccaaattcat gttgacaaca agttgaggga catacagtac 720 caaatggacc gaggccggag ggtgagcggg ggacttctca catacctctt ccttagccag 780 gctctgacgc tgcaggagat ctacgccaac gtgactgaga tgctgctggc cggcgtcgac 840 acgacgtcct tcaccttgtc ttggactgtg tacctcctgg caaggcaccc agaagtgcag 900 cagacggtgt accgggagat tgtgaagaat ttaggggaaa ggcatgttcc aactgcagct 960 gatgtcccca aggtcccgct ggtcagagct ctccttaagg aaaccctgag gctgtttcca 1020 gtgctgccag ggaacggccg ggtcacccag gaagacctgg ttattggcgg gtatctgatt 1080 ccgaaaggca cccagctggc cctttgccac tatgccacat cgtaccagga tgagaacttc 1140 cctcgggcca aggagttccg gcctgagcgc tggctgcgga aaggagactt agatagagtt 1200 gacaattttg gatccatccc ctttggtcat ggggttcgca gctgcatagg gcggagaatt 1260 gcagaactgg agattcacct cgtcgtgatc cagttgcttc aacattttga gatcaaaaca 1320 tcttctcaga ccaatgctgt tcatgcaaaa acccacgggc tcctgacgcc aggggggccc 1380 atccacgtgc gatttgttaa cagaaag 1407 <210> 2 <211> 469 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Gly Pro Arg Thr Leu Ala Asn Leu Ala Glu Phe Phe Cys Arg 1 5 10 15 Asp Gly Phe Ser Arg Ile His Glu Ile Gln Gln Lys His Thr Arg Glu 20 25 30 Tyr Gly Lys Ile Phe Lys Ser His Phe Gly Pro Gln Phe Val Val Ser 35 40 45 Ile Ala Asp Arg Asp Met Val Ala Gln Val Leu Arg Ala Glu Gly Ala 50 55 60 Ala Pro Gln Arg Ala Asn Met Glu Ser Trp Arg Glu Tyr Arg Asp Leu 65 70 75 80 Arg Gly Arg Ala Thr Gly Leu Ile Ser Ala Glu Gly Glu Gln Trp Leu 85 90 95 Lys Met Arg Ser Val Leu Arg Gln Arg Ile Leu Lys Pro Lys Asp Val 100 105 110 Ala Ile Tyr Ser Gly Glu Val Asn Gln Val Ile Ala Asp Leu Ile Lys 115 120 125 Arg Ile Tyr Leu Leu Arg Ser Gln Ala Glu Asp Gly Glu Thr Val Thr 130 135 140 Asn Val Asn Asp Leu Phe Phe Lys Tyr Ser Met Glu Gly Val Ala Thr 145 150 155 160 Ile Leu Tyr Glu Ser Arg Leu Gly Cys Leu Glu Asn Ser Ile Pro Gln 165 170 175 Leu Thr Val Glu Tyr Ile Glu Ala Leu Glu Leu Met Phe Ser Met Phe 180 185 190 Lys Thr Ser Met Tyr Ala Gly Ala Ile Pro Arg Trp Leu Arg Pro Phe 195 200 205 Ile Pro Lys Pro Trp Arg Glu Phe Cys Arg Ser Trp Asp Gly Leu Phe 210 215 220 Lys Phe Ser Gln Ile His Val Asp Asn Lys Leu Arg Asp Ile Gln Tyr 225 230 235 240 Gln Met Asp Arg Gly Arg Arg Val Ser Gly Gly Leu Leu Thr Tyr Leu 245 250 255 Phe Leu Ser Gln Ala Leu Thr Leu Gln Glu Ile Tyr Ala Asn Val Thr 260 265 270 Glu Met Leu Leu Ala Gly Val Asp Thr Thr Ser Phe Thr Leu Ser Trp 275 280 285 Thr Val Tyr Leu Leu Ala Arg His Pro Glu Val Gln Gln Thr Val Tyr 290 295 300 Arg Glu Ile Val Lys Asn Leu Gly Glu Arg His Val Pro Thr Ala Ala 305 310 315 320 Asp Val Pro Lys Val Pro Leu Val Arg Ala Leu Leu Lys Glu Thr Leu 325 330 335 Arg Leu Phe Pro Val Leu Pro Gly Asn Gly Arg Val Thr Gln Glu Asp 340 345 350 Leu Val Ile Gly Gly Tyr Leu Ile Pro Lys Gly Thr Gln Leu Ala Leu 355 360 365 Cys His Tyr Ala Thr Ser Tyr Gln Asp Glu Asn Phe Pro Arg Ala Lys 370 375 380 Glu Phe Arg Pro Glu Arg Trp Leu Arg Lys Gly Asp Leu Asp Arg Val 385 390 395 400 Asp Asn Phe Gly Ser Ile Pro Phe Gly His Gly Val Arg Ser Cys Ile 405 410 415 Gly Arg Arg Ile Ala Glu Leu Glu Ile His Leu Val Val Ile Gln Leu 420 425 430 Leu Gln His Phe Glu Ile Lys Thr Ser Ser Gln Thr Asn Ala Val His 435 440 445 Ala Lys Thr His Gly Leu Leu Thr Pro Gly Gly Pro Ile His Val Arg 450 455 460 Phe Val Asn Arg Lys 465 <210> 3 <211> 2284 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 agcctcgccg ccatgccggg gccgaggacc ctcgccaacc tggcggagtt cttctgcagg 60 gacggcttca gccgcatcca cgagatccag cagaagcaca cacgggaata tggaaaaatc 120 ttcaagtctc actttggtcc tcagtttgta gtatctattg cagaccgcga tatggtggct 180 caggtgctcc gggcggaggg cgctgcgccc cagagagcca acatggagtc ctggcgggag 240 taccgagact tgcgggggag agccaccggg ctcatctcgg cggagggtga acagtggctc 300 aagatgagaa gcgtattgag acaaagaatt ctgaaaccga aagatgtggc catctattct 360 ggagaagtca accaagttat tgctgactta attaaaagaa tctacctcct caggagccag 420 gcagaagatg gagaaaccgt gaccaatgtc aatgatcttt tcttcaaata ttcaatggaa 480 ggagtggcca ccatccttta tgagagtcgt ttgggctgcc tggaaaacag catcccacag 540 ctgactgtgg aatacatcga ggccctggag ctcatgttta gcatgttcaa gacctccatg 600 tatgcaggcg ccatccccag atggcttcgc cccttcatcc caaagccctg gcgggaattc 660 tgcaggtcct gggatggact cttcaaattc agccaaattc atgttgacaa caagttgagg 720 gacatacagt accaaatgga ccgaggccgg agggtgagcg ggggacttct cacatacctc 780 ttccttagcc aggctctgac gctgcaggag atctacgcca acgtgactga gatgctgctg 840 gccggcgtcg acacgacgtc cttcaccttg tcttggactg tgtacctcct ggcaaggcac 900 ccagaagtgc agcagacggt gtaccgggag attgtgaaga atttagggga aaggcatgtt 960 ccaactgcag ctgatgtccc caaggtcccg ctggtcagag ctctccttaa ggaaaccctg 1020 aggctgtttc cagtgctgcc agggaacggc cgggtcaccc aggaagacct ggttattggc 1080 gggtatctga ttccgaaagg cacccagctg gccctttgcc actatgccac atcgtaccag 1140 gatgagaact tccctcgggc caaggagttc cggcctgagc gctggctgcg gaaaggagac 1200 ttagatagag ttgacaattt tggatccatc ccctttggtc atggggttcg cagctgcata 1260 gggcggagaa ttgcagaact ggagattcac ctcgtcgtga tccagttgct tcaacatttt 1320 gagatcaaaa catcttctca gaccaatgct gttcatgcaa aaacccacgg gctcctgacg 1380 ccaggggggc ccatccacgt gcgatttgtt aacagaaagt aagcctagat tttaaacctg 1440 ggctgatgta gcagaccagc tcgccgacac acagtgggta tttgtgtgtc gctgatcacc 1500 gtggagaagg aaagcgatgt cgctaaaggc tgtcttgtta tagactggcc tcccaggtcc 1560 tgggacactt gtaaatcttt atgcaaagta atgtaaaaag gttgctattt tactggtgca 1620 taccagaagt tgccctttct ttgggggaaa cagctgttta aaaaccagtg gcagtgaatt 1680 tttatgcttc atacattgtg ctagactcaa tatttaatga ctggcagtat cctgtgcatt 1740 tacttgtaca gggaaatggt ggtttactta caaattcagt tcttcaatat atgttctcta 1800 atactggcat ctgggctcaa attgccatca acagtaagtt gaaggcaatt tcaacttact 1860 gtttctaatt tgaagaggga acattaagaa tgcctctgta atactgtaat tatgggaaga 1920 aagcaccaga ggcaacattc tatcctgagc accagattta gatcctgtta aagggctcaa 1980 acttaaaagg gctggccggg tgcggtggct cacgcctgta atcccagcac tttgggaggt 2040 caaggtggga ggattgcttg agccagaagt tcgagaccag cctgagcaac atggtgaaac 2100 cctgtctcta ccaaaaatac aaaaattagc cgggcgtggt ggtgcacacc tatggtccta 2160 gttactcgga agactgaggc aggaggatcg tttgagctca ggaggttggg tctgcagtga 2220 gctatctatg atggcaccac tgcacttcag cctgggtgac agagtgagac cctttctcaa 2280 aaat 2284 <210> 4 <211> 1116 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgagaagcg tattgagaca aagaattctg aaaccgaaag atgtggccat ctattctgga 60 gaagtcaacc aagttattgc tgacttaatt aaaagaatct acctcctcag gagccaggca 120 gaagatggag aaaccgtgac caatgtcaat gatcttttct tcaaatattc aatggaagga 180 gtggccacca tcctttatga gagtcgtttg ggctgcctgg aaaacagcat cccacagctg 240 actgtggaat acatcgaggc cctggagctc atgtttagca tgttcaagac ctccatgtat 300 gcaggcgcca tccccagatg gcttcgcccc ttcatcccaa agccctggcg ggaattctgc 360 aggtcctggg atggactctt caaattcagc caaattcatg ttgacaacaa gttgagggac 420 atacagtacc aaatggaccg aggccggagg gtgagcgggg gacttctcac atacctcttc 480 cttagccagg ctctgacgct gcaggagatc tacgccaacg tgactgagat gctgctggcc 540 ggcgtcgaca cgacgtcctt caccttgtct tggactgtgt acctcctggc aaggcaccca 600 gaagtgcagc agacggtgta ccgggagatt gtgaagaatt taggggaaag gcatgttcca 660 actgcagctg atgtccccaa ggtcccgctg gtcagagctc tccttaagga aaccctgagg 720 ctgtttccag tgctgccagg gaacggccgg gtcacccagg aagacctggt tattggcggg 780 tatctgattc cgaaaggcac ccagctggcc ctttgccact atgccacatc gtaccaggat 840 gagaacttcc ctcgggccaa ggagttccgg cctgagcgct ggctgcggaa aggagactta 900 gatagagttg acaattttgg atccatcccc tttggtcatg gggttcgcag ctgcataggg 960 cggagaattg cagaactgga gattcacctc gtcgtgatcc agttgcttca acattttgag 1020 atcaaaacat cttctcagac caatgctgtt catgcaaaaa cccacgggct cctgacgcca 1080 ggggggccca tccacgtgcg atttgttaac agaaag 1116 <210> 5 <211> 372 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Arg Ser Val Leu Arg Gln Arg Ile Leu Lys Pro Lys Asp Val Ala 1 5 10 15 Ile Tyr Ser Gly Glu Val Asn Gln Val Ile Ala Asp Leu Ile Lys Arg 20 25 30 Ile Tyr Leu Leu Arg Ser Gln Ala Glu Asp Gly Glu Thr Val Thr Asn 35 40 45 Val Asn Asp Leu Phe Phe Lys Tyr Ser Met Glu Gly Val Ala Thr Ile 50 55 60 Leu Tyr Glu Ser Arg Leu Gly Cys Leu Glu Asn Ser Ile Pro Gln Leu 65 70 75 80 Thr Val Glu Tyr Ile Glu Ala Leu Glu Leu Met Phe Ser Met Phe Lys 85 90 95 Thr Ser Met Tyr Ala Gly Ala Ile Pro Arg Trp Leu Arg Pro Phe Ile 100 105 110 Pro Lys Pro Trp Arg Glu Phe Cys Arg Ser Trp Asp Gly Leu Phe Lys 115 120 125 Phe Ser Gln Ile His Val Asp Asn Lys Leu Arg Asp Ile Gln Tyr Gln 130 135 140 Met Asp Arg Gly Arg Arg Val Ser Gly Gly Leu Leu Thr Tyr Leu Phe 145 150 155 160 Leu Ser Gln Ala Leu Thr Leu Gln Glu Ile Tyr Ala Asn Val Thr Glu 165 170 175 Met Leu Leu Ala Gly Val Asp Thr Thr Ser Phe Thr Leu Ser Trp Thr 180 185 190 Val Tyr Leu Leu Ala Arg His Pro Glu Val Gln Gln Thr Val Tyr Arg 195 200 205 Glu Ile Val Lys Asn Leu Gly Glu Arg His Val Pro Thr Ala Ala Asp 210 215 220 Val Pro Lys Val Pro Leu Val Arg Ala Leu Leu Lys Glu Thr Leu Arg 225 230 235 240 Leu Phe Pro Val Leu Pro Gly Asn Gly Arg Val Thr Gln Glu Asp Leu 245 250 255 Val Ile Gly Gly Tyr Leu Ile Pro Lys Gly Thr Gln Leu Ala Leu Cys 260 265 270 His Tyr Ala Thr Ser Tyr Gln Asp Glu Asn Phe Pro Arg Ala Lys Glu 275 280 285 Phe Arg Pro Glu Arg Trp Leu Arg Lys Gly Asp Leu Asp Arg Val Asp 290 295 300 Asn Phe Gly Ser Ile Pro Phe Gly His Gly Val Arg Ser Cys Ile Gly 305 310 315 320 Arg Arg Ile Ala Glu Leu Glu Ile His Leu Val Val Ile Gln Leu Leu 325 330 335 Gln His Phe Glu Ile Lys Thr Ser Ser Gln Thr Asn Ala Val His Ala 340 345 350 Lys Thr His Gly Leu Leu Thr Pro Gly Gly Pro Ile His Val Arg Phe 355 360 365 Val Asn Arg Lys 370 <210> 6 <211> 2093 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agcctcgccg ccatgccggg gccgaggacc ctcgccaacc tggcggagtt cttctgcagg 60 gacggcttca gccgcatcca cgagatccag ggagggtgaa cagtggctca agatgagaag 120 cgtattgaga caaagaattc tgaaaccgaa agatgtggcc atctattctg gagaagtcaa 180 ccaagttatt gctgacttaa ttaaaagaat ctacctcctc aggagccagg cagaagatgg 240 agaaaccgtg accaatgtca atgatctttt cttcaaatat tcaatggaag gagtggccac 300 catcctttat gagagtcgtt tgggctgcct ggaaaacagc atcccacagc tgactgtgga 360 atacatcgag gccctggagc tcatgtttag catgttcaag acctccatgt atgcaggcgc 420 catccccaga tggcttcgcc ccttcatccc aaagccctgg cgggaattct gcaggtcctg 480 ggatggactc ttcaaattca gccaaattca tgttgacaac aagttgaggg acatacagta 540 ccaaatggac cgaggccgga gggtgagcgg gggacttctc acatacctct tccttagcca 600 ggctctgacg ctgcaggaga tctacgccaa cgtgactgag atgctgctgg ccggcgtcga 660 cacgacgtcc ttcaccttgt cttggactgt gtacctcctg gcaaggcacc cagaagtgca 720 gcagacggtg taccgggaga ttgtgaagaa tttaggggaa aggcatgttc caactgcagc 780 tgatgtcccc aaggtcccgc tggtcagagc tctccttaag gaaaccctga ggctgtttcc 840 agtgctgcca gggaacggcc gggtcaccca ggaagacctg gttattggcg ggtatctgat 900 tccgaaaggc acccagctgg ccctttgcca ctatgccaca tcgtaccagg atgagaactt 960 ccctcgggcc aaggagttcc ggcctgagcg ctggctgcgg aaaggagact tagatagagt 1020 tgacaatttt ggatccatcc cctttggtca tggggttcgc agctgcatag ggcggagaat 1080 tgcagaactg gagattcacc tcgtcgtgat ccagttgctt caacattttg agatcaaaac 1140 atcttctcag accaatgctg ttcatgcaaa aacccacggg ctcctgacgc caggggggcc 1200 catccacgtg cgatttgtta acagaaagta agcctagatt ttaaacctgg gctgatgtag 1260 cagaccagct cgccgacaca cagtgggtat ttgtgtgtcg ctgatcaccg tggagaagga 1320 aagcgatgtc gctaaaggct gtcttgttat agactggcct cccaggtcct gggacacttg 1380 taaatcttta tgcaaagtaa tgtaaaaagg ttgctatttt actggtgcat accagaagtt 1440 gccctttctt tgggggaaac agctgtttaa aaaccagtgg cagtgaattt ttatgcttca 1500 tacattgtgc tagactcaat atttaatgac tggcagtatc ctgtgcattt acttgtacag 1560 ggaaatggtg gtttacttac aaattcagtt cttcaatata tgttctctaa tactggcatc 1620 tgggctcaaa ttgccatcaa cagtaagttg aaggcaattt caacttactg tttctaattt 1680 gaagagggaa cattaagaat gcctctgtaa tactgtaatt atgggaagaa agcaccagag 1740 gcaacattct atcctgagca ccagatttag atcctgttaa agggctcaaa cttaaaaggg 1800 ctggccgggt gcggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggtc aaggtgggag 1860 gattgcttga gccagaagtt cgagaccagc ctgagcaaca tggtgaaacc ctgtctctac 1920 caaaaataca aaaattagcc gggcgtggtg gtgcacacct atggtcctag ttactcggaa 1980 gactgaggca ggaggatcgt ttgagctcag gaggttgggt ctgcagtgag ctatctatga 2040 tggcaccact gcacttcagc ctgggtgaca gagtgagacc ctttctcaaa aat 2093

【図面の簡単な説明】

【図１】ＶＤＤＨとヒトＣＹＰ２７Ａ、ヒトＣＹＰ２７
ＢおよびラットＣＹＰ２７とのアミノ酸配列アライメン
トの結果を示す。

【図２】ｖｄｄｈ遺伝子のヒト臓器および各種細胞での
発現プロファイルを表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/02 1/26 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ｚ 1/26 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ａ (72)発明者 磯貝 隆夫 茨城県稲敷郡阿見町大室511−12 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA08 CA04 CA09 CA12 CA20 DA02 EA04 GA13 HA11 HA13 HA14 HA17 4B050 CC01 CC03 DD11 EE01 LL01 LL03 LL05 4B063 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QQ91 QQ95 QR02 QR08 QR32 QR35 QR40 QR56 QR62 QR77 QR80 QS05 QS16 QS25 QS34 QS36 QX01 QX02 4B065 AA01X AA58X AA72X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA05 BD50 CA28 CA44 CA46 4H045 AA11 CA40 DA75 EA20 EA50 FA71

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ； （ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ； （ｂ）配列番号：１のＤＮＡとストリンジェントな条件
   でハイブリダイズし、かつビタミンＤ３水酸化酵素をコ
   ードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 請求項１または請求項２に記載のＤＮＡ
   にコードされるビタミンＤ３水酸化酵素。
3. 【請求項３】 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質； （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
   質； （ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列においてアミノ酸が
   欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるビ
   タミンＤ３水酸化酵素。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のＤＮＡを含む組換えベ
   クター。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の組換えベクターにより
   形質転換された形質転換細胞。
6. 【請求項６】 請求項２または請求項３に記載の蛋白質
   の発現を抑制するアンチセンス核酸。
7. 【請求項７】 核酸配列が、請求項１に記載のＤＮＡま
   たは配列番号３に記載の核酸の全部または一部に相補す
   る配列である、請求項６に記載のアンチセンス核酸。
8. 【請求項８】 請求項２または請求項３に記載の蛋白質
   もしくはその部分ペプチドに対する抗体。
9. 【請求項９】 請求項２又は請求項３に記載の蛋白質あ
   るいは該蛋白質を発現している形質転換細胞と候補物質
   とを接触させ、該蛋白質のビタミンＤ３水酸化活性の変
   化を検出することを特徴とする、ビタミンＤ３水酸化酵
   素活性調節作用を示す物質の検索方法。
10. 【請求項１０】 請求項４に記載の組換えベクターまた
    は請求項５に記載の形質転換細胞と候補物質とを接触さ
    せ、請求項１に記載のＤＮＡの発現レベルの変化を検出
    することを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡの発現
    調節作用を示す物質の検索方法。