JP2002523029A - ヒトヒストンデアセチラーゼ遺伝子ｈｄ４ - Google Patents

ヒトヒストンデアセチラーゼ遺伝子ｈｄ４

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ズー，シュエジュン
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Abstract

(57)【要約】 HD4ポリペプチドおよびHD4ポリヌクレオチド、ならびにかかるポリペプチドを組換え技術により生産する方法が開示されている。さらに、HD4ポリペプチドおよびHD4ポリヌクレオチドを治療に用いる方法、およびそのための診断アッセイも開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、新たに同定されたポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド、該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの治療の際のまたは治療
に潜在的に有効でありうるアゴニスト、アンタゴニストおよび／またはインヒビ
ターである化合物を同定する際の使用、ならびに該ポリペプチドおよびポリヌク
レオチドの生産方法に関する。
【０００２】発明の背景 薬物探索プロセスには目下根本的な大変化が生じている。というのは、それが
「機能性ゲノム学」、すなわちハイスループット（高効率）のゲノムまたは遺伝
子ベースの生物学に及んでいるからである。このアプローチは「ポジショナルク
ローニング」に基づいた比較的初期のアプローチに急速に取って代わりつつある
。表現型、つまり生物学的機能または遺伝病、が同定され、続いてその遺伝子地
図の位置を手がかりとして病因遺伝子が突き止められていた。
【０００３】 機能性ゲノム学は、現在入手できる多くの分子生物学データベースから興味の
もてそうな遺伝子配列を同定するための生物情報科学(bioinformatics)の様々な
ツールに大きく依存している。依然として、未解明の遺伝子およびその関連ポリ
ペプチド／タンパク質を薬物探索の標的として同定し特性づける必要性が存在し
ている。
【０００４】 ヒストンデアセチラーゼは、遺伝子の転写調節だけでなくクロマチン構造モデ
リングにも関与する、新しく発見された酵素である。この酵素はアセチル化され
たヒストンからアセチル基を除去し、それによってヒストンタンパク質の電荷を
変化させることができる。それらの変更はクロマチン構造に重大な影響を与える
。活性クロマチンは一般に高度にアセチル化されており、一方ヘテロクロマチン
はあまりアセチル化されていない。近年、転写調節とヒストンアセチル化との直
接的な関連性が明らかになってきた。多くの転写因子（例えばp300およびGCN5）
がヒストンアセチラーゼ活性を有する。さらに、異常な腫瘍細胞が、ヒストンア
セチラーゼに関わる突然変異から生じることが示されている。ヒストンアセチラ
ーゼは、２つの別個の変更事象：ヒストンアセチラーゼ（HAT）により触媒され
るアセチル化とヒストンデアセチラーゼ（HD）により触媒されるデアセチル化を
もたらす。これら２つの酵素活性のバランスが、クロモソーム活性化／不活化お
よびある一組の遺伝子からの転写活性化という結果をモジュレートする。
【０００５】 ヒストンアセチル化に影響を及ぼすいくつかの薬物が指摘されている。それら
の薬物の１つの例が酪酸塩である。酪酸塩は、in vitroで骨髄性細胞の分化を誘
導することができ、その活性は、酪酸塩が低濃度でヒストンデアセチラーゼを阻
害しうるという事実と密接に関連している。したがって、ヒストンアセチル化状
態に影響を与える薬物は細胞の生理機能に重大な影響を及ぼす。
【０００６】発明の概要 本発明は、HD4、特にHD4ポリペプチドおよびHD4ポリヌクレオチド、組換え物
質、ならびにその生産方法に関する。もう一つの態様において、本発明は、特に
癌、炎症、関節炎、自己免疫疾患、糖尿病、白血病、リンパ腫、前立腺肥大およ
び前立腺癌、腎臓病、腎不全、ならびに腫瘍（以後まとめて「前記疾患」という
）の治療をはじめとする、前記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法
に関する。他の態様では、本発明は、本発明により提供される物質を用いてアゴ
ニストおよびアンタゴニスト／インヒビターを同定する方法、ならびに同定され
た化合物を用いてHD4平衡異常と関連した症状を治療することに関する。さらに
他の態様において、本発明は不適当なHD4活性またはHD4レベルと関連した疾病を
検出するための診断アッセイに関する。
【０００７】発明の説明 第一の態様において、本発明はHD4ポリペプチドに関する。この種のペプチド
には、配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも70％
の同一性、好ましくは少なくとも80％の同一性、より好ましくは少なくとも90％
の同一性、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少なくと
も97〜99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが含ま
れる。こうしたポリペプチドとしては配列番号２のアミノ酸配列を含むものがあ
る。
【０００８】 本発明の他のペプチドには、そのアミノ酸配列が配列番号２の全長にわたって
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80
％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なく
とも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97〜99％の同一性を有する単離さ
れたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドとしては配列番号２のアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドがある。
【０００９】 本発明の更なるペプチドには、配列番号１に含まれるヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチドが含まれる。
【００１０】 本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのヒストンデアセチラーゼファミリー
のメンバーであると考えられる。従って、ヒストンデアセチラーゼはアセチルCo
Aからヒストンのリシン残基へのアセチル基の転移を触媒するので、それらは興
味深い。この変更はヒストンのコンホーメーション変化を誘導し、そのクロマチ
ン構造全体を変化させ得る。多くの実験結果が、ヒストンデアセチラーゼを阻害
することにより遺伝子発現のパターンが変化することを示している。したがって
、ヒストンデアセチラーゼは介在点を提供するものであり、それによって、その
酵素活性を増強または阻害することができ、また重要な治療的効果を有し得る特
定の一組の遺伝子の遺伝子発現パターンを変化させることができる小分子を設計
することができることから、ヒストンデアセチラーゼは興味深い。これらの特性
を以後「HD4活性」もしくは「HD4ポリペプチド活性」または「HD4の生物学的活
性」という。これらの活性の中には、前記HD4ポリペプチドの抗原性および免疫
原性活性、特に配列番号２のポリペプチドの抗原性および免疫原性活性も含まれ
る。本発明のポリペプチドはHD4の少なくとも１つの生物学的活性を示すことが
好ましい。
【００１１】 本発明のポリペプチドは「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質
のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加のアミ
ノ酸配列を含めることが有利であり、このようなアミノ酸配列としては、分泌す
なわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列
、または組換え生産の間の安定性を確保する付加的配列などがある。
【００１２】 また、前記ポリペプチドの変異体、すなわち保存的アミノ酸置換（ある残基が
性質の似ている他の残基により置換される）により基準ポリペプチドと相違して
いるポリペプチドも本発明に含まれる。典型的なこうした置換は、Ala, Val, Le
u および Ileの間；Ser とThr の間；酸性残基 AspとGlu の間；Asn とGln の間
；塩基性残基 LysとArg の間；または芳香族残基 PheとTyr の間で起こる。特に
、数個、5〜10個、1〜5個、1〜3個、1〜2個または1個のアミノ酸が任意の組合せ
で置換、欠失または付加されている変異体が好適である。
【００１３】 本発明のポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。このよう
なポリペプチドには、単離された天然のポリペプチド、組換え的に生産されたポ
リペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せに
より製造されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドを製造するため
の手段は当技術分野でよく理解されている。
【００１４】 本発明の更なる態様において、本発明は、HD4ポリヌクレオチドに関する。こ
のようなポリヌクレオチドには、配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミ
ノ酸配列と少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の同一性、より
好ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性
を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌク
レオチドが含まれる。これに関して、少なくとも97％の同一性を有するポリペプ
チドが一層好ましいが、少なくとも98〜99％の同一性を有するものがより一層好
ましく、少なくとも99％の同一性を有するポリペプチドが最も好ましいものであ
る。かかるポリヌクレオチドとして、配列番号２のポリペプチドをコードする配
列番号１に含まれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１５】 本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号２のポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列と、その全コード領域にわたって、少なくとも70％の同一性
、好ましくは少なくとも80％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一性
、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単
離されたポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、少なくとも97％の同一性
を有するポリヌクレオチドが一層好ましいが、少なくとも98〜99％の同一性を有
するものがより一層好ましく、少なくとも99％の同一性を有するポリヌクレオチ
ドが最も好ましいものである。
【００１６】 本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号１の全長にわたって配列番号
１のポリヌクレオチドと少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の
同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なくとも
95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが含
まれる。これに関して、少なくとも97％の同一性を有するポリヌクレオチドが一
層好ましいが、少なくとも98〜99％の同一性を有するものがより一層好ましく、
少なくとも99％の同一性を有するポリヌクレオチドが最も好ましいものである。
かかるポリヌクレオチドとして、配列番号１のポリヌクレオチドを含むポリヌク
レオチドおよび配列番号１のポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１７】 本発明はまた、上記の全てのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを
提供する。
【００１８】 配列番号１のヌクレオチド配列は、RPD3に対するアフリカツメガエルAB21のmR
NA(X78454)[Ladomery,M., Lyons,S.およびSommerville,J. Gene 198(1-2), 275-
280(1997)]との相同性を示す。配列番号１のヌクレオチド配列はcDNA配列であり
、配列番号２のポリペプチドである377個のアミノ酸のポリペプチドをコードす
るポリペプチドコード配列(ヌクレオチド56〜1189)を含む。配列番号２のポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に含まれるポリペプチドコ
ード配列と同一であっても、遺伝子コードの重複性（縮重）のため、やはり配列
番号２のポリペプチドをコードする、配列番号１に含まれる配列以外の配列であ
ってもよい。配列番号２のポリペプチドは、前記ヒストンデアセチラーゼファミ
リーの他のタンパク質と構造的に関連しており、ヒトヒストンデアセチラーゼ-R
PD3-2B(U75697) [Yang,W.M., Yao,Y.L., Sun,J.M., Davie,J.R.,およびSeto,E.
J. Biol. Chem. 272(44),28001-28007 (1997)]）との相同性および／または構造
類似性を有する。
【００１９】 本発明の好適なポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、それと相
同なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／性質をもつこ
とが期待される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドは少なくとも１つのHD4活性を有する。
【００２０】 本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング技
術により、エクスプレスド・シーケンス・タグ（Expressed Sequence Tag：EST
）分析（Adams, M.D.ら、Science(1991) 252:1651-1656；Adams, M.D.ら、Natur
e(1992) 355:632-634；Adams, M.D.ら、Nature(1995) 377 supp:3-174）を使用
して、ヒト脳、心臓、および腎臓の細胞中のmRNAから作製したcDNAライブラリー
から、得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチドはゲノムDNAライブ
ラリーのような天然源から得ることができ、商業的に入手可能な公知の技法を用
いて合成することもできる。
【００２１】 本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え体生産のために用
いる場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列単独、ま
たは他のコード配列（例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−もし
くはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするもの
）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配列が含まれ
る。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得
る。本発明のこの態様の特定の好ましい具体例においては、マーカー配列は、pQ
Eベクター(Qiagen, Inc.)により提供されかつ Gentzら（Proc. Natl. Acad. Sci
. USA (1989) 86:821-824）に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチド
、またはHAタグである。また、このポリヌクレオチドは5'および3'非コード配列
、例えば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニル
化シグナル、リボソーム結合部位、およびmRNA安定化配列を含んでいてもよい。
【００２２】 本発明の更なる具体例としては、数個、例えば5〜10個、1〜5個、1〜3個、1〜
2個、または1個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されてい
る、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド変異体をコードするポ
リヌクレオチドがある。
【００２３】 配列番号１に含まれるヌクレオチド配列と同一であるか十分に同一であるポリ
ヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする完全長cDNAおよびゲノムク
ローンを単離するために、また、配列番号１に対して高い配列類似性を有する他
の遺伝子（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ(orthologs)をコー
ドする遺伝子を含む）のcDNAおよびゲノムクローンを単離するために、cDNAおよ
びゲノムDNA用のハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅（PCR
）反応用のプライマーとして用いることができる。一般的に、これらのヌクレオ
チド配列は基準のヌクレオチド配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90
％、最も好ましくは95％同一である。プローブまたはプライマーはたいてい15個
以上のヌクレオチドを含み、好ましくは30個以上を含み、50個以上のヌクレオチ
ドを有していてもよい。特に好ましいプローブは30〜50個の範囲のヌクレオチド
を有するものである。
【００２４】 本発明のポリペプチド（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログを含
む）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列またはそ
の断片を有する標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下で適当なライブラリーをスクリーニングし、該ポリヌクレオチド配列
を含む完全長cDNAおよびゲノムクローンを単離する各工程を含む方法により得ら
れる。このようなハイブリダイゼーション技法は当業者に公知である。好ましい
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50% ホルムアミド、５×SS
C (150mM NaCl, 15mM クエン酸三ナトリウム) 、50mMリン酸ナトリウム (pH7.6)
、５×Denhardt溶液、10% デキストラン硫酸および20μg/mlの変性し剪断したサ
ケ精子DNAを含有する溶液中４２℃で一夜インキュベートし、次いでフィルター
を 0.1×SSC 中約６５℃で洗浄することを含む。かくして、本発明は、配列番号
１のヌクレオチド配列またはその断片を有する標識プローブを用いて、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下で適当なライブラリーをスクリーニン
グすることにより得られるポリヌクレオチドをも包含する。
【００２５】 当業者には理解されるように、多くの場合、ポリペプチドをコードする領域の
cDNA5'末端が短いことから、単離されたcDNA配列は不完全であるだろう。それは
逆転写酵素のためであり、この酵素はもともと「プロセシビティ」（processivi
ty：重合反応中に鋳型に結合した状態でいる該酵素の能力の尺度）が低く、第一
鎖cDNA合成の間にmRNA鋳型のDNAコピーを完成させることができない。
【００２６】 完全長cDNAを得るための、または短鎖cDNAを伸長させるための、当業者に公知
で利用可能な方法がいくつかあり、例えば、cDNA末端高速増幅法（RACE）に基づ
いた方法がある（例えば、Frohmanら, PNAS USA 85, 8998-9002, 1988を参照の
こと）。例えばMarathonTM技術(Clontech Laboratories Inc.)により示されるよ
うな、上記技法の最近の改良により、より長いcDNAの検索が大いに簡便化された
。MarathonTM技術では、所定の組織より抽出されたmRNAからcDNAを作製し、各末
端に「アダプター」配列を連結する。続いて、遺伝子特異的およびアダプター特
異的なオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いて核酸増幅（PCR）を行い
、cDNAの「欠失」5'末端を増幅する。次に、「ネステッド（nested）」プライマ
ー、すなわち増幅産物の内部にアニールするように設計されたプライマー（典型
的には、アダプター配列のさらに3'側にアニールするアダプター特異的プライマ
ーおよび既知遺伝子配列のさらに5'側にアニールする遺伝子特異的プライマー）
を用いてPCR反応を繰り返す。その後、この反応の産物をDNA塩基配列決定により
解析し、この産物を既存のcDNAに直接結合するか、または5'プライマー設計用の
新たな配列情報を用いて別の全長PCRを行うことにより、完全長cDNAを構築する
ことができる。
【００２７】 本発明の組換え体ポリペプチドは、当業界で公知の方法を用いて、発現系を含
有する遺伝子操作宿主細胞から生産することができる。したがって、更なる態様
において、本発明は、本発明の1つ以上のポリヌクレオチドを含有する発現系、
該発現系により遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本発明ポリペ
プチドの生産に関する。本発明のDNA構築物から誘導されたRNAを用いてこの種の
タンパク質を生産するために、無細胞翻訳系を使用することもできる。
【００２８】 組換え体生産に関しては、本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部
を組み込むために宿主細胞を遺伝子操作することができる。宿主細胞へのポリヌ
クレオチドの導入は、Davisら, Basic Methods in Molecular Biology (1986)
および Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))などの多
くの標準的な実験室マニュアルに記載された方法により行うことができる。好適
なこうした方法として、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvect
ion)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)
、弾丸導入(ballistic introduction)または感染などがある。
【００２９】 適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞（例：ストレプトコッカス(Strepto
cocci)、スタフィロコッカス(Staphylococci)、大腸菌(E.coli)、ストレプトミ
セス(Streptomyces)、枯草菌(Bacillus subtilis)）、真菌細胞（例：酵母、ア
スペルギルス(Aspergillus)）、昆虫細胞（例：ショウジョウバエ(Drosophila)S
2、スポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127
、3T3、BHK、HEK293、Bowesメラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられる。
【００３０】 多種多様な発現系を使用することができる。こうした発現系として、特に、染
色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由来、バク
テリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因子由来
、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、SV40のような
パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂
犬病ウイルス、レトロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せに由来
するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリ
オファージの遺伝的要素に由来するものがある。これらの発現系は発現を起こさ
せるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。一般的に、宿主内
でのポリペプチドの産生のためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現する
ことができる系またはベクターはどれも使用しうる。Sambrookら, Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual (前掲) に記載されるような、日常的に用いられる
公知の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入すること
ができる。翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞
外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み
込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であ
っても、異種シグナルであってもよい。
【００３１】 スクリーニングアッセイで使用するため本発明のポリペプチドを発現させよう
とする場合、一般にそのポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適であ
る。その場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先立って細胞を回収する。
該ポリペプチドが培地に分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製する
ために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、そ
の後にポリペプチドを回収する必要がある。
【００３２】 組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いるこ
とができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる
。ポリペプチドが、単離および／または精製中に変性されるときは、タンパク質
の再折りたたみのための公知の技法を用いて、活性のあるコンフォメーションを
復元することが可能である。
【００３３】 本発明はまた、診断薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機
能障害と関連した、配列番号１のポリヌクレオチドにより特徴づけられる遺伝子
の変異型の検出は、該遺伝子の過少発現、過剰発現または変化した発現により生
ずる疾病またはその疾病への罹りやすさの診断に追加しうる、またはその診断を
下しうる診断用ツールを提供するだろう。該遺伝子に突然変異がある個体を、さ
まざまな技法によりDNAレベルで見つけ出すことができる。
【００３４】 診断用の核酸は、被験体の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖
検材料由来の細胞から得ることができる。検出のためにゲノムDNAを直接使用し
てもよいし、分析前にPCRまたは他の増幅法を使ってゲノムDNAを酵素的に増幅し
てもよい。同様の方法でRNAまたはcDNAを使用することもできる。欠失および挿
入突然変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により
検出できる。点突然変異は増幅DNAを標識化HD4ヌクレオチド配列とハイブリダイ
ズさせることで同定できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖とはRN
アーゼ消化により、または融解温度の差異により区別できる。また、DNA配列の
差異は、変性剤を含むもしくは含まないゲルでのDNA断片の電気泳動の移動度の
変化により、または直接DNA塩基配列決定によっても検出できる（例えば、Myers
ら, Science (1985) 230:1242 を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレ
アーゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよびＳ１プロテクション
）または化学的開裂法によっても確認できる（Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA (1985) 85:4397-4401を参照のこと）。別の実施態様では、例えば、遺伝
子変異の効率のよいスクリーニングを行うため、HD4ヌクレオチド配列またはそ
の断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイ(array)を構築することがで
きる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能性を有し、遺伝子発現、遺伝的連
鎖および遺伝的変異性を含めた分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために
用いられている（例えば、M. Cheeら, Science, Vol.274, pp.610-613 (1996)
を参照のこと）。
【００３５】 診断アッセイは、前記の方法によりHD4遺伝子の変異を検出することで、前記
疾患への罹りやすさを診断または判定する方法を提供する。さらに、被験体から
得られたサンプルからポリペプチドまたはmRNAのレベルの異常な低下または増加
を測定する方法により、前記疾患の診断を下すことができる。発現の低下または
増加は、当業界で公知のポリヌクレオチドの定量法、例えば核酸増幅（例：PCR
、RT−PCR）、RNアーゼプロテクション、ノーザンブロッティング、その他のハ
イブリダイゼーション法のいずれかによりRNAレベルで測定することができる。
宿主から得られたサンプル中の本発明ポリペプチドのようなタンパク質のレベル
を測定するアッセイ法は当業者によく知られている。こうしたアッセイ法として
、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ELISA
アッセイなどがある。
【００３６】 かくして、もう一つの態様において、本発明は、 (a) 本発明のポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列
）もしくはその断片、 (b) (a) のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、 (c) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）もしく
はその断片、または (d) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対す
る抗体、 を含む診断用キットに関する。
【００３７】 このようなキットにおいて、(a)、(b)、(c)または(d)が実質的な構成成分であ
ることが理解されよう。かかるキットは疾患または疾患への罹りやすさ、中でも
特に癌、炎症、関節炎、自己免疫疾患、糖尿病、白血病、リンパ腫、前立腺肥大
および前立腺癌、腎臓病、腎不全、ならびに腫瘍などについて診断するうえで有
用である。
【００３８】 また、本発明のヌクレオチド配列は染色体同定にも有用である。この配列は個
々のヒト染色体上の特定の位置をターゲッティングし、その特定位置とハイブリ
ダイズすることができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成すること
は、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関させるうえで重要な第一段階である
。ひとたび配列が正確な染色体位置にマッピングされたら、その染色体上のその
配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることができる。この種のデータ
は、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins Uni
versity Welch Medical Library からオンラインで入手可能) 中に見いだせる。
その後、同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係を連鎖解析
（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝）により確認する。
【００３９】 罹患個体と非罹患個体とのcDNAまたはゲノム配列の差異も調べることができる
。罹患個体の一部または全部に突然変異が観察されるが、どの正常個体にも観察
されない場合は、その突然変異が疾患の原因である可能性がある。
【００４０】 本発明のポリペプチド、その断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細
胞は、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体を生産するための免疫原として
も使用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が従来技術における他
の関連ポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実
質的に高い親和性を示すことを意味する。
【００４１】 本発明のポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコルを用いて、動物（好
ましくはヒト以外の動物）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類似
体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノクローナル抗体の調製には
、連続細胞系の培養物から抗体を産生させる任意の技法を用いることができる。
例を挙げると、ハイブリドーマ法 (Kohler, G.およびMilstein, C., Nature (19
75) 256:495-497)、トリオーマ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法 (Kozborら, Imm
unology Today (1983) 4:72) およびEBV−ハイブリドーマ法 (Coleら, Monoclon
al Antibodies and Cancer Therapy, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985) な
どがある。
【００４２】 本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、米国特許第4,946,
778号に記載されるような一本鎖抗体の調製法を適応させることができる。また
、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動
物を含む他の生物を利用することができる。
【００４３】 前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現するクローンを単離・同定した
り、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもで
きる。
【００４４】 本発明のポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、前記疾患の治療に使用でき
る可能性がある。
【００４５】 本発明の更なる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断
片と、各種サブクラス（IgG、IgM、IgA、IgE）の免疫グロブリンのH鎖またはL鎖
の定常領域の様々な部分と、を含んでなる遺伝子工学的に作製された可溶性融合
タンパク質に関する。免疫グロブリンとしてはヒトIgG、特にIgG1のH鎖の定常部
が好ましく、その場合は融合がヒンジ領域で起こる。特定例では、血液凝固Xa因
子で開裂され得る開裂配列を組み込むことで、Fc部分を簡単に除去できる。さら
に、本発明は、これら融合タンパク質の遺伝子工学的作製方法、ならびに薬物ス
クリーニング、診断および治療におけるそれらの使用に関する。また、本発明の
更なる態様はこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する
。融合タンパク質技術の例は国際特許出願 WO94/29458 およびWO94/22914に見い
だせる。
【００４６】 本発明の更なる態様は哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関し、
この方法は、特に前記疾患から該動物を防御するための抗体および／またはＴ細
胞免疫応答を生ずるのに十分な本発明のポリペプチドを哺乳動物に接種すること
を含んでなる。本発明のさらに別の態様は、哺乳動物を前記疾患から防御する抗
体を産生させるような免疫学的応答を引き出すために、in vivoで本発明のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介して該ポ
リペプチドを供給することを含んでなる、哺乳動物において免疫学的応答を引き
出す方法に関する。
【００４７】 本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導入したとき、その哺乳動物において
本発明のポリペプチドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン製剤
（組成物）に関し、この組成物は本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
を含有する。ワクチン製剤は適当な担体をさらに含んでいてもよい。ポリペプチ
ドは胃の中で分解される可能性があるので、非経口的に（例えば、皮下、筋肉内
、静脈内または皮内注射により）投与することが好ましい。非経口投与に適した
製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液と等
張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注射液、ならびに懸濁剤または
増量剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量
容器または複数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供するこ
とができ、また、使用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態
で保管することもできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増強するための
アジュバント系、例えば水中油型のアジュバント系や当業界で公知の他のアジュ
バント系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性により変化するが、ル
ーチンな実験操作により簡単に決定できる。
【００４８】 本発明のポリペプチドは、多くの病状、特に前記疾患を含めて、多くの生物学
的機能に関与している。それゆえ、このポリペプチドの機能を刺激または抑制す
る化合物を同定するスクリーニング法を開発することが望ましい。したがって、
更なる態様において、本発明は、このポリペプチドの機能を刺激または抑制する
化合物を同定するための化合物のスクリーニング法を提供する。一般的には、前
記疾患の治療および予防目的のためにアゴニストまたはアンタゴニストが使用さ
れる。種々の供給源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリーおよ
び天然産物の混合物から化合物を同定することができる。このように同定された
アゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターは、場合により、該ポリペプチ
ドの天然のまたは修飾された基質、リガンド、受容体、酵素などであってよく、
また、その構造的または機能的なミメティックであってもよい（Coliganら, Cur
rent Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)を参照のこと）。
【００４９】 スクリーニング法では、本発明のポリペプチド、または該ポリペプチドを担持
する細胞もしくは膜、またはその融合タンパク質への候補化合物の結合を、候補
化合物に直接または間接的に結合された標識を用いて簡単に測定できる。あるい
はまた、スクリーニング法では標識した競合物質との競合を用いることもある。
さらに、こうしたスクリーニング法では、候補化合物がポリペプチドの活性化ま
たは抑制により生ずるシグナルを結果的にもたらすか否かを、該ポリペプチドを
担持する細胞に適した検出系を用いて試験することができる。一般的には、既知
のアゴニストの存在下で活性化のインヒビターをアッセイして、アゴニストによ
る活性化に候補化合物の存在が与える影響を調べる。アゴニストまたはインヒビ
ターの非存在下で、候補化合物がポリペプチドの活性化を抑制するか否かを調べ
ることによる逆アゴニストまたはインヒビターのスクリーニング法では、構成的
に活性のあるポリペプチドが用いられる。さらに、これらのスクリーニング法は
、候補化合物と本発明のポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせて混合物をつく
り、この混合物中のHD4活性を測定し、そしてこの混合物のHD4活性をスタンダー
ドと比較する各ステップを単に含むだけでよい。本発明のポリペプチドのアンタ
ゴニストを同定する高効率スクリーニングアッセイでは、上記のようなＦc部分
とHD4ポリペプチドから作製されるような融合タンパク質も使用することができ
る(D. Bennettら, J. Mol. Recognition, 8:52-58 (1995) およびK. Johansonら
, J. Biol. Chem., 270(16):9459-9471 (1995)を参照のこと）。
【００５０】 また、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは該ポリペプチドに対す
る抗体を用いて、細胞内でのmRNAまたはポリペプチドの産生に及ぼす添加化合物
の作用を検出するためのスクリーニング法を組み立てることができる。例えば、
当業界で公知の標準方法によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用い
て、ポリペプチドの分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するためのELISAア
ッセイを構築することができ、これは適切に操作された細胞または組織からのポ
リペプチドの産生を抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニストまたはア
ゴニストともいう）の探索に用いることができる。
【００５１】 膜に結合した受容体または可溶性の受容体が存在するのであれば、当業界で公
知の標準的な受容体結合法によりこの種の受容体を同定するために本発明のポリ
ペプチドを用いることができる。こうした受容体結合法には、限定するものでは
ないが、リガンド結合アッセイおよび架橋アッセイがあり、これらのアッセイで
は、ポリペプチドを放射性アイソトープ（例：125I）で標識するか、化学的に修
飾（例：ビオチン化）するか、または検出や精製に適したペプチド配列に融合さ
せ、そして推定上の受容体源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液など
）とインキュベートする。その他の方法としては、表面プラズモン共鳴および分
光法のような生物物理的方法がある。これらのスクリーニング法は、該ポリペプ
チドのその受容体への結合と競合する、該ポリペプチドのアゴニストまたはアン
タゴニストを（存在するのであれば）同定するために用いることもできる。スク
リーニングアッセイを行うための標準的な方法は当業界でよく理解されている。
【００５２】 潜在的なポリペプチドアンタゴニストの例としては、抗体、ある場合には、該
ポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素などと密接な関係があるオリゴヌ
クレオチドもしくはタンパク質（例えば、リガンド、基質、受容体、酵素などの
断片）、または本発明のポリペプチドと結合するが応答を誘導しない（それゆえ
該ポリペプチドの活性を妨げる）小分子などがある。
【００５３】 かくして、他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのアゴニスト
、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、またはこの種のポリペ
プチドの産生を低下または増加させる化合物を同定するためのスクリーニングキ
ットに関し、このキットは、 (a) 本発明のポリペプチド、 (b) 本発明のポリペプチドを発現している組換え細胞、 (c) 本発明のポリペプチドを発現している細胞膜、または (d) 本発明のポリペプチドに対する抗体、 を含み、前記ポリペプチドは好ましくは配列番号２のポリペプチドである。 こ
のようなキットにおいて、(a)、(b)、(c)または(d)が実質的な構成成分であるこ
とが理解されよう。
【００５４】 当業者であれば、本発明のポリペプチドは、その構造に基づいて該ポリペプチ
ドのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターを設計する方法にも使用で
きることが容易に理解されよう。この方法は、 (a) 最初に該ポリペプチドの三次元構造を解析し、 (b) アゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターの有望と思われる反応部
位または結合部位の三次元構造を想定し、 (c) 想定された結合部位または反応部位と結合または反応すると予想される候
補化合物を合成し、そして (d) その候補化合物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビター
であるか否かを調べる、 ことを含んでなる。これは通常反復プロセスであることがさらに理解されよう。
【００５５】 更なる態様において、本発明は、HD4ポリペプチド活性の過剰発現と過小発現
のいずれかに関係した、例えば癌、炎症、関節炎、自己免疫疾患、糖尿病、白血
病、リンパ腫、前立腺肥大および前立腺癌、腎臓病、腎不全、ならびに腫瘍など
の異常な状態の治療法を提供する。
【００５６】 該ポリペプチドの活性が過剰である場合は、いくつかのアプローチが利用可能
である。一つのアプローチは、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素などの結
合をブロックすることにより、または第２のシグナルを抑制することで異常な状
態を軽減することにより、該ポリペプチドの機能を抑制するのに有効な量で、上
記のインヒビター化合物（アンタゴニスト）を場合により製薬上許容される担体
とともに被験体に投与することを含んでなる。もう一つのアプローチでは、内因
性のポリペプチドとの競合状態でリガンド、基質、酵素、受容体などと結合する
能力がまだある可溶性形態のポリペプチドを投与することができる。このような
競合物質の典型的な例はHD4ポリペプチドの断片である。
【００５７】 さらに別のアプローチでは、発現阻止法を使って内因性HD4ポリペプチドをコ
ードする遺伝子の発現を抑制することができる。こうした公知技術は、体内で産
生されるか別に投与されるアンチセンス配列の使用を必要とする（例えば、Olig
odeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (遺伝子発現
のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド), CRC Press
, Boca Raton, FL (1988) 中のO'Connor, J. Neurochem (1991) 56:560を参照の
こと）。あるいはまた、この遺伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレオ
チドを供給することもできる（例えば、Leeら, Nucleic Acids Res (1979) 6:30
73; Cooneyら, Science (1988) 241:456; Dervanら, Science (1991) 251:1360
を参照のこと）。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することもできるし、関
連オリゴマーをin vivoで発現させることもできる。
【００５８】 HD4およびその活性の過少発現に関係した異常な状態を治療する場合も、いく
つかのアプローチを取ることができる。一つのアプローチは、治療に有効な量の
本発明ポリペプチドを活性化する化合物（すなわち、前記アゴニスト）を製薬上
許容される担体とともに被験体に投与して、異常な状態を緩和することを含んで
なる。別法として、被験体の関連細胞においてHD4を内因的に産生させるために
遺伝子治療を用いることができる。例えば、上で述べたような複製欠陥レトロウ
イルスベクターによる発現のために本発明のポリヌクレオチドを遺伝子操作する
。次にレトロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードする
RNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケージ
ング細胞に導入する。その結果、パッケージング細胞は対象の遺伝子を含有する
感染性のウイルス粒子を産生するようになる。in vivo細胞操作およびin vivo
ポリペプチド発現のために、これらのプロデューサー細胞を被験体に投与する。
遺伝子治療の概論に関しては、Human Molecular Genetics, T Strachanおよび A
P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)中のChapter 20, Gene Thera
py and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches(およびその中
の引用文献) を参照のこと。もう一つのアプローチは治療量の本発明のポリペプ
チドを適当な製薬上の担体とともに投与することである。
【００５９】 更なる態様において、本発明は、治療に有効な量のポリペプチド（例えば、可
溶性形態の本発明ポリペプチド）、アゴニストもしくはアンタゴニストペプチド
、または小分子化合物を製剤学上許容される担体または賦形剤と共に含有する医
薬組成物を提供する。この種の担体としては、食塩水、緩衝化食塩水、デキスト
ロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せがあるが、これ
らに限らない。本発明はさらに、上記の本発明の組成物の１以上の成分を充填し
た１以上の容器を含んでなる医薬パックおよびキットに関する。本発明のポリペ
プチドおよび他の化合物は単独で使用しても、他の化合物、例えば治療用化合物
と一緒に使用してもよい。
【００６０】 医薬組成物は投与経路、例えば全身または経口による投与経路に適合させるこ
とができる。全身投与に適した形態は、注入、典型的には静脈内注射である。皮
下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。全身投与の別の手
段には、胆汁酸塩、フシジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘
膜および経皮投与がある。さらに、本発明のポリペプチドまたは他の化合物を腸
溶剤またはカプセル剤として製剤化し得るのであれば、経口投与も可能である。
これらの化合物を軟膏、ペースト、ゲルなどの剤形で局所に投与しても、かつ／
または局在化させてもよい。
【００６１】 必要な投与量範囲は、本発明のペプチドまたは他の化合物の選択、投与経路、
製剤の性質、被験体の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投
与量は被験体の体重１kgあたり0.1〜100μgの範囲である。入手可能な化合物が
多様であること、投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与
量は広範に変動することが予測される。例えば、経口投与は静注による投与より
も高い投与量を必要とすると予想されよう。こうした投与量レベルの変動は、当
業界でよく理解されているような、標準の経験的な最適化手順を用いて調整する
ことができる。
【００６２】 治療に用いるポリペプチドは、上述したような「遺伝子治療」と称する治療法
において、被験体の体内で産生させることもできる。例えば、被験体由来の細胞
を、ポリペプチドをコードするDNAまたはRNAのようなポリヌクレオチドにより、
例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、ex vivo で遺伝子工学的に
操作する。その後、これらの細胞を被験体に導入する。
【００６３】 ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列は、類似の相同性を有する別の配
列を同定する際の価値ある情報源を提供する。これは、こうした配列をコンピュ
ータ読み取り可能媒体中に保存し、次に保存したデータを用いてGCCなどの公知
の検索ツールにより配列データベースを検索することで最大限促進される。した
がって、更なる態様において、本発明は、配列番号１の配列を含むポリヌクレオ
チドおよび／またはそれによりコードされるポリペプチドを保存したコンピュー
タ読み取り可能媒体を提供する。
【００６４】 以下の定義は上記の説明中でしばしば用いられた用語を理解しやすくするため
のものである。
【００６５】 本明細書中で用いる「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにFabまたは他の免疫グロブリン
発現ライブラリーの産物を含むFabフラグメントが含まれる。
【００６６】 「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」変化されたことを
意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在するのであれば、それ
はそのもとの環境から変化しているか分離されており、またはその両方である。
例えば、生存している動物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離
されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように
、「単離された」ものである。
【００６７】 「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドをさし、これは修飾されていないRNAもしくはDNA、また
は修飾されたRNAもしくはDNAであり得る。「ポリヌクレオチド」には、制限する
ものではないが、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合
ったDNA、一本鎖および二本鎖RNA、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったRNA
、DNAとRNAを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、またはより典型的には二本鎖
でもよく、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。
加えて、「ポリヌクレオチド」はRNAまたはDNAまたはRNAとDNAの両方からなる三
重鎖領域を意味する。「ポリヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修飾
塩基を含有するDNAまたはRNA、および安定性または他の理由のために修飾された
骨格を有するDNAまたはRNAも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化
された塩基およびイノシンのような特殊な塩基がある。DNAおよびRNAに対してさ
まざまな修飾を行うことができる。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界
に一般的に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾され
た形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を包
含する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称され
る比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００６８】 「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわ
ち、ペプチドアイソスター）により互いに連結された２個以上のアミノ酸を含む
ペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は短鎖（通常はペプチ
ド、オリゴペプチドまたはオリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質と
いう）の両方をさす。ポリペプチドは20種類の遺伝子コード化アミノ酸以外のア
ミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然
のプロセスで、または当業界で公知の化学的修飾法のいずれかで修飾されたアミ
ノ酸配列を含む。このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文および
研究文献に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたは
カルボキシル末端を含めてポリペプチドのどこでも行うことができる。同じタイ
プの修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさまざまに異
なる程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの修飾を
含んでいてもよい。ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、分枝
のあるまたはない環状であってもよい。環状の、分枝した、または分枝した環状
のポリペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じることがあり、また、合成法に
よって製造することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP−リ
ボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド
またはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホス
ファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱
メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホ
ルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシ
ル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシン
グ、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化の
ようなタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、ユビキチン化などがある（
例えば、Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Cre
ighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Posttranslational Cova
lent Modification of Proteins, B.C. Johnson編, Academic Press, New York,
1983中のWold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspective
s and Prospects, pgs. 1-12; Seifterら, “Analysis for protein modificati
ons and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646; および R
attanら, “Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging
",Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62 を参照のこと）。
【００６９】 「変異体」とは、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、不
可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことである。
典型的なポリヌクレオチドの変異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列
の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチ
ドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても、しなくても
よい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準配列によりコードされ
るポリペプチドのアミノ酸の置換、欠失、付加、融合および末端切断（トランケ
ーション）をもたらしうる。典型的なポリペプチドの変異体は基準ポリペプチド
とアミノ酸配列の点で相違する。一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異体
の配列が全般的によく類似しており、多くの領域で同一となるような相違に限ら
れる。変異体と基準ポリペプチドは任意に組み合わせた１以上の置換、欠失、付
加によりアミノ酸配列が相違していてよい。置換または挿入されるアミノ酸残基
は遺伝子コードによりコードされるものであっても、なくてもよい。ポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの変異体はアレル変異体のように天然に存在するもの
でも、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発法または
直接合成により作製することができる。
【００７０】 当技術分野で知られた「同一性」とは、場合によりポリペプチド配列またはポ
リヌクレオチド配列の比較により決定された、2つ以上のかかる配列間の関連性
のことである。当技術分野ではまた、「同一性」はポリペプチド配列またはポリ
ヌクレオチド配列の鎖間のマッチ(match)により決定された、このような配列間
の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は公知の方法により難なく算出する
ことができ、こうした方法として、例えば Computational Molecular Biology,
Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Inf
ormatics and Genome Projects, Smith, D.W. 編, Academic Press, New York,
1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. and Grif
fin, H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molec
ular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Pr
imer, Gribskov, M. and Devereux, J. 編, M Stockton Press, New York, 1991
; および Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (19
88) に記載された方法があるが、これらに限らない。同一性を決定するための方
法は、検討する配列間で最大級のマッチが得られるように設計される。さらに、
同一性を決定する方法は一般に入手可能なコンピュータプログラムに編集されて
いる。2つの配列間の同一性を決定するコンピュータプログラム法としては、GCG
プログラムパッケージ (Devereux, J.ら, Nucleic Acids Research 12(1):387 (
1984))、BLASTP、BLASTNおよびFASTA(Atschul, S.F.ら, J. Molec. Biol. 215:4
03-410 (1990)) があるが、これらに限らない。BLAST XプログラムはNCBIおよび
他のソースから一般に入手可能である (BLAST Manual, Altschul, S.ら, NCBI N
LM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.ら, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1
990))。公知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性の決定に使用することがで
きる。
【００７１】 ポリペプチド配列を比較するためのパラメーターは次のものを含む： １）アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)； 比較マトリックス：BLOSSUM62 、Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992) ギャップペナルティー：12 ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group
(Madison WI)から「gap」プログラムとして一般に入手可能である。前記のパラ
メーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーター(default parameter)
である（末端ギャップのペナルティーは無し）。
【００７２】 ポリヌクレオチド配列を比較するためのパラメーターは次のものを含む： １）アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)； 比較マトリックス：マッチ＝＋10、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：50 ギャップ長ペナルティー：３ これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group
(Madison WI)から「gap」プログラムとして入手可能である。これらのパラメー
ターは核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
【００７３】 ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの「同一性」の、場合によっては好まし
い意味を以下の(1)および(2)に示す。
【００７４】 (1) 更なるポリヌクレオチドの実施形態には、配列番号１の基準配列と少なく
とも50、60、70、80、85、90、95、97または100％の同一性を有するポリヌクレ
オチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。該ポリヌクレオチド
は、配列番号１の基準配列と同一であっても、該基準配列と比較してある整数個
までのヌクレオチド変異を含んでいてもよい。該変異は少なくとも１個のヌクレ
オチドの欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを含む）または
挿入よりなる群から選択され、こうした変異は基準ヌクレオチド配列の5'もしく
は3'末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列
中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループ
として介在することができる。ヌクレオチド変異の数は、配列番号１のヌクレオ
チドの総数に、100で割った同一性％を意味する整数値を掛け、その積を配列番
号１のヌクレオチドの総数から差し引くことにより、すなわち、次式： ｎn ≦ｘn −（ｘn・ｙ） により求めることができる。式中、ｎnはヌクレオチド変異の数であり、ｘnは配
列番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙは50％については0.50、60％について
は0.60、70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85、90％
については0.90、95％については0.95、97％については0.97、100％については1
.00などであり、・は乗法演算子の記号である。ｘnとｙの非整数の積は、その積
をｘnから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。配列番号２のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列の改変は、そのコード配列にナンセンス、
ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を生じさせ、それにより、こうした変
異後に該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを改変させることが
できる。
【００７５】 例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号１の基準配列と同一、
すなわち100％同一であっても、該基準配列と比較して同一性％が100％未満とな
るような、ある整数個までの核酸変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくと
も１個の核酸の欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを含む）
または挿入よりなる群から選択され、こうした変異は基準ポリヌクレオチド配列
の 5'もしくは 3'末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよ
く、基準配列中の核酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグル
ープとして介在することができる。所定の同一性％についての核酸変異の数は、
配列番号１の核酸の総数に、100で割った同一性％を意味する整数値を掛け、次
いでその積を配列番号１の核酸の総数から差し引くことにより、すなわち、次式
： ｎn ≦ｘn −（ｘn・ｙ） により求めることができる。式中、ｎnは核酸変異の数であり、ｘnは配列番号１
の核酸の総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％については0.80、85
％については0.85などであり、・は乗法演算子の記号である。ｘnとｙの非整数
の積は、その積をｘnから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。
【００７６】 (2) ポリペプチドの実施形態には更に、配列番号２のポリペプチド基準配列と
少なくとも50、60、70、80、85、90、95、97、または100％の同一性を有するポ
リペプチドを含む単離されたポリペプチドが含まれる。該ポリペプチド配列は、
配列番号２の基準配列と同一であっても、該基準配列と比較してある整数個まで
のアミノ酸変異を含んでいてもよい。該変異は少なくとも１個のアミノ酸の欠失
、置換（保存的および非保存的アミノ酸置換を含む）または挿入よりなる群から
選択され、こうした変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末
端位置、またはこれらの末端位置の間のいずれに存在してもよく、基準配列中の
アミノ酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして介
在することができる。アミノ酸変異の数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、10
0で割った同一性％を意味する整数値を掛け、その積を配列番号２のアミノ酸の
総数から差し引くことにより、すなわち、次式： ｎa ≦ｘa −（ｘa・ｙ） により求めることができる。式中、ｎaはアミノ酸変異の数であり、ｘaは配列番
号２中のアミノ酸の総数であり、ｙは50％については0.50、60％については0.60
、70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85、90％につい
ては0.90、95％については0.95、97％については0.97、100％については1.00な
どであり、・は乗法演算子の記号である。ｘaとｙの非整数の積は、その積をｘa から引く前に、最も近似する整数に切り下げる。
【００７７】 例として、本発明のポリペプチド配列は配列番号２の基準配列と同一、すなわ
ち100％同一であっても、該基準配列と比較して同一性％が100％未満となるよう
な、ある整数個までのアミノ酸変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくとも
１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的および非保存的アミノ酸置換を含む）また
は挿入よりなる群から選択され、こうした変異は基準ポリペプチド配列のアミノ
もしくはカルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のいずれに存在して
もよく、基準配列中のアミノ酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続
するグループとして介在することができる。所定の同一性％についてのアミノ酸
変異の数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、100で割った同一性％を意味する
整数値を掛け、その積を配列番号２のアミノ酸の総数から差し引くことにより、
すなわち、次式： ｎa ≦ｘa −（ｘa・ｙ） により求めることができる。式中、ｎaはアミノ酸変異の数であり、ｘaは配列番
号２中のアミノ酸の総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％について
は0.80、85％については0.85などであり、・は乗法演算子の記号である。ｘaと
ｙの非整数の積は、その積をｘaから引く前に、最も近似する整数に切り下げる
。
【００７８】 「融合タンパク質」とは、２つの、しばしば無関係の、融合された遺伝子また
はその断片によりコードされるタンパク質のことである。一例として、EP-A-0 4
64には、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分と他のヒトタンパク質また
はその一部とを含んでなる融合タンパク質が記載されている。多くの場合、治療
および診断における使用には、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦc
領域を使用することが有利であり、これにより例えば薬物速度論的性質が改良さ
れる（例えば、EP-A- 0232 262を参照のこと）。一方、いくつかの使用にとって
は、その融合タンパク質を発現させ、検出し、精製した後でＦc部分を除去する
ことが望ましいだろう。
【００７９】 本明細書中に引用された、特許および特許出願明細書を含めた全ての刊行物は
、あたかも各刊行物が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体を参
照によりここに組み入れるものとする。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 13/08 Ａ６１Ｐ 19/02 ４Ｂ０６５ 13/12 29/00 ４Ｃ０８４ 19/02 35/00 ４Ｈ０４５ 29/00 35/02 35/00 37/06 35/02 Ｃ０７Ｋ 16/40 37/06 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/14 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/14 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 ズー，ユアン アメリカ合衆国 19422 ペンシルバニア 州 ブルー ベル，オークモント ドライ ブ 203 (72)発明者 ズー，シュエジュン アメリカ合衆国 19333 ペンシルバニア 州 デボン，シュガータウン ロード 332 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA77 DA78 FB01 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 BA11 CA04 DA01 DA02 DA05 EA04 GA11 HA14 4B050 CC03 CC04 DD11 LL00 LL03 4B063 QA01 QA13 QA19 QQ02 QQ42 QQ53 QR55 QS34 4B064 AG27 CA19 CC24 DA03 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA31 CA44 CA46 4C084 AA01 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA02 NA14 ZA81 ZB02 ZB11 ZB26 ZB27 ZC35 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76 EA50 FA72 FA74

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下のポリペプチド： (i) 配列番号２の全長にわたる配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも以下の
    同一性： (a) 70％の同一性； (b) 80％の同一性； (c) 90％の同一性；もしくは (d) 95％の同一性； を有する群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、 (ii) 配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または (iii) 配列番号２のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド からなる群より選択される単離されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 以下のポリヌクレオチド： (i) 配列番号２の全長にわたる配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも以下の
    同一性： (a) 70％の同一性； (b) 80％の同一性； (c) 90％の同一性；もしくは (d) 95％の同一性； を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌク
    レオチド、 (ii) 配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とその全長に
    わたって少なくとも以下の同一性： (a) 70％の同一性； (b) 80％の同一性； (c) 90％の同一性；もしくは (d) 95％の同一性； を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、 (iii) 配列番号１の全長にわたる配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも
    以下の同一性： (a) 70％の同一性； (b) 80％の同一性； (c) 90％の同一性；もしくは (d) 95％の同一性； を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、 (iv) 配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離さ
    れたポリヌクレオチド、 (v) 配列番号１のポリヌクレオチドである単離されたポリヌクレオチド、も
    しくは (vi) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１の配
    列もしくはその断片を有する標識化プローブを用いて、適切なライブラリーをス
    クリーニングすることにより得ることのできる単離されたポリヌクレオチド からなる群より選択される単離されたポリヌクレオチド、 または、前記単離されたポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列。
  3. 【請求項３】 請求項１記載のポリペプチドに対して免疫特異的な抗体。
  4. 【請求項４】 被験者を治療する方法であって、 (i) 請求項１記載のポリペプチドの増強された活性もしくは発現を必要とする
    被験者の治療のための、 (a) 治療上有効な量の、前記ポリペプチドに対するアゴニストを被験者に投
    与すること、および／もしくは (b) 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリ
    ヌクレオチドを、in vivoで該ポリペプチド活性を産生させるような形態で被験
    者に提供すること、 を含む前記方法、または、 (ii) 請求項１記載のポリペプチドの活性もしくは発現を抑制する必要がある
    被験者の治療のための、 (a) 治療上有効な量の、前記ポリペプチドに対するアンタゴニストを被験者
    に投与すること、 (b) 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制する核酸
    分子を被験者に投与すること、および／もしくは (c) 前記ポリペプチドと、そのリガンド、基質もしくは受容体について競合
    する治療上有効な量のポリペプチドを被験者に投与すること、 を含む前記方法。
  5. 【請求項５】 被験者における請求項１に記載のポリペプチドの発現または
    活性に関連した疾病または該疾病への罹りやすさを検査する方法であって、 (a) 該被験者のゲノム中の該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に突
    然変異があるか否かを調べること、および／または (b) 該被験者から得られたサンプルにおける該ポリペプチド発現の存在または
    その量を分析すること、 を含む前記方法。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載のポリペプチドの機能を刺激または抑制する
    化合物を同定するためのスクリーニング法であって、 (a) 候補化合物と、該ポリペプチド（または該ポリペプチドを担持している細
    胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、該候補化合物に直接
    的または間接的に結合させた標識により測定すること、 (b) 候補化合物と、該ポリペプチド（または該ポリペプチドを担持している細
    胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、標識化競合物質の存
    在下で測定すること、 (c) 候補化合物が該ポリペプチドの活性化または抑制により生ずるシグナルを
    もたらすか否かを、該ポリペプチドを担持している細胞または細胞膜に適した検
    出系を用いて調べること、 (d) 候補化合物と、請求項１に記載のポリペプチドを含有する溶液とを混合し
    て混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプチドの活性を測定し、該混合物の活
    性をスタンダードと比較すること、および (e) 候補化合物が細胞における該ポリペプチドをコードするmRNAおよび該ポリ
    ペプチドの産生に及ぼす効果を、ELISAアッセイなどを用いて検出すること、 からなる群より選択される方法を含む、前記スクリーニング法。
  7. 【請求項７】 請求項１記載のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニ
    スト。
  8. 【請求項８】 発現系が適合性の宿主細胞内に存在する場合に請求項１に記
    載のポリペプチドを産生する能力のあるポリヌクレオチドを含有する前記発現系
    。
  9. 【請求項９】 組換え宿主細胞の生産方法であって、請求項８記載の発現系
    を用いて細胞を形質転換またはトランスフェクトし、該宿主細胞が適切な培養条
    件下で、配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも70
    ％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを産生するようにさせるこ
    とを含む、前記生産方法。
  10. 【請求項１０】 請求項９記載の方法により生産された組換え宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列と
    少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する、
    請求項１０記載の組換え宿主細胞の膜。
  12. 【請求項１２】 ポリペプチドを産生させるのに十分な条件下で請求項１０
    に記載の宿主細胞を培養し、この培養物から該ポリペプチドを回収することを含
    む、ポリペプチドの生産方法。
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