JP2002504327A

JP2002504327A - セレベリン−２関連ポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするｄｎａ

Info

Publication number: JP2002504327A
Application number: JP2000532516A
Authority: JP
Inventors: バーンズ、マイケル、ロバート
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
Priority date: 1998-02-23
Filing date: 1999-02-22
Publication date: 2002-02-12
Also published as: WO1999042576A1; EP1056846A1

Abstract

(57)【要約】セレベリン−2ポリペプチドおよびセレベリン−2ポリヌクレオチド、ならびにかかるポリペプチドを組換え技術により生産する方法が開示されている。さらに、セレベリン−2ポリペプチドおよびセレベリン−2ポリヌクレオチドを治療に用いる方法、およびそのための診断アッセイも開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、新たに同定されたポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド、該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの治療の際のまたは治療
に潜在的に有効でありうるアゴニスト、アンタゴニストおよび／またはインヒビ
ターである化合物を同定する際の使用、並びに該ポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドの生産方法に関する。

【０００２】発明の背景薬物探索プロセスには目下根本的な大変化が生じている。というのは、それが
「機能性ゲノミクス」(functional genomics)、すなわちハイスループット（高効率）のゲノムまたは遺伝子ベースの生物学に及んでいるからである。遺伝子お
よび遺伝子産物を治療の標的として同定するための手段としてのこのアプローチ
は「ポジショナルクローニング」に基づいた比較的初期のアプローチに急速に取
って代わりつつある。表現型、つまり生物学的機能または遺伝病、が同定され、
続いてその遺伝子地図の位置を手がかりとして病因遺伝子が突き止められるだろ
う。

【０００３】機能性遺伝子科学は、高効率のＤＮＡ配列決定技術および現在入手できる多く
の分子生物学データベースから興味のもてそうな遺伝子配列を同定するための生
物情報科学(bioinformatics)の様々なツールに大きく依存している。依然として
、まだ未解明の遺伝子およびその関連ポリペプチド／タンパク質を薬物探索の標
的として同定し特性づける必要性が存在している。

【０００４】発明の概要本発明は、セレベリン−2、特にセレベリン−2ポリペプチドおよびセレベリン
−2ポリヌクレオチド、組換え物質、並びにその生産方法に関する。もう一つの態様において、本発明は、神経系障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、双
極性障害および単極性障害を含む情動障害、精神分裂病、オリーブ橋小脳萎縮、
シャイ‐ドレーガー症候群、およびシナプス機能の破壊により生じる他の障害（
以後まとめて「前記疾患」という）の治療をはじめとする、前記ポリペプチドお
よびポリヌクレオチドの使用方法に関する。他の態様では、本発明は、本発明に
より提供される物質を用いてアゴニストおよびアンタゴニスト／インヒビターを
同定する方法、並びに同定された化合物を用いてセレベリン−2平衡異常と関連した症状を治療することに関する。さらに他の態様において、本発明は不適当な
セレベリン−2活性またはセレベリン−2レベルと関連した疾病を検出するための
診断アッセイに関する。

【０００５】発明の説明一の態様において、本発明はセレベリン−2ポリペプチドに関する。この種のペプチドには、配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列と少なく
とも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドとし
ては配列番号２のアミノ酸配列を含むものがある。

【０００６】本発明の他のペプチドには、そのアミノ酸配列が配列番号２の全長にわたって
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも
９７〜９９％の同一性を有する単離されたポリペプチドが含まれる。こうしたポ
リペプチドとしては配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがある。

【０００７】本発明の更なるペプチドには、配列番号１に含まれるヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチドが含まれる。

【０００８】本発明のポリペプチドはセレベリン神経ペプチドファミリーのメンバーである
と考えられる。従って、本発明のポリペプチドは、このタンパク質がヘキサデカ
ペプチドセレベリンの近似パラログ（paralog）およびそのプレタンパク質であるので重要であり、セレベリンは、背部蝸牛神経核のカートホイール（cartwhee
l）ニューロンにおける小脳プルキンエ細胞の後シナプス構造中に非常に富んでいることが示されている。マウスおよびラットセレベリン−2タンパク質は、1つ
の膜貫通ドメインを有する膜固定タンパク質と推定されている。反対に、本発明
者らは、ヒトセレベリン−2はおそらく完全長プレタンパク質のアミノ酸52〜53 の間に有望と思われるシグナルペプチド切断部位を有する、分泌されるタンパク
質であると推定している（完全長ラットタンパク質の分析を基にしている）。マ
ウス突然変異体「stagger」は、セレベリンを完全に欠損していると考えられ、そのシナプス機能および神経学的機能における中枢役割を示唆している。セレベ
リン−2は染色体16q22−16q23にマッピングされ、数多くの独立した研究において、この染色体領域は双極性障害に非常に関連しているとされてきた。それゆえ
ヒトセレベリン−2は該病状について有望な候補遺伝子でありうる。これらの特性を以後「セレベリン−2活性」または「セレベリン−2ポリペプチド活性」ある
いは「セレベリン−2の生物学的活性」という。これらの活性の中には、前記セレベリン−2ポリペプチドの抗原性および免疫原性活性、特に配列番号２のポリペプチドの抗原性および免疫原性活性も含まれる。本発明のポリペプチドはセレ
ベリン−2の少なくとも１つの生物学的活性を示すことが好ましい。

【０００９】本発明のポリペプチドは「成熟」タンパク質の形であっても、前駆体または融
合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。しばしば
、追加のアミノ酸配列を含めることが有利であり、このようなアミノ酸配列とし
ては、分泌すなわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製
に役立つ配列、または組換え生産の間の安定性を確保する付加的配列などがある
。

【００１０】また、前記ポリペプチドの変異体、すなわち保存的アミノ酸置換（ある残基が
性質の似ている他の残基により置換される）により基準ポリペプチドと相違して
いるポリペプチドも本発明に含まれる。典型的なこうした置換は、Ala, Val, Le
u および Ileの間；Ser とThr の間；酸性残基 AspとGlu の間；Asn とGln の間
；塩基性残基 LysとArg の間；または芳香族残基 PheとTyr の間で起こる。特に
、数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸が任
意の組合せで置換、欠失または付加されている変異体が好適である。

【００１１】本発明のポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。このよう
なポリペプチドには、単離された天然のポリペプチド、組換え的に生産されたポ
リペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せに
より製造されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドを製造するため
の手段は当業界でよく理解されている。

【００１２】本発明の更なる態様において、本発明は、セレベリン−2ポリヌクレオチドに関する。このようなポリヌクレオチドには、配列番号２の全長にわたって配列番
号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。これに関
して、少なくとも９７％の同一性を有するポリペプチドが一層好ましいが、少な
くとも９８〜９９％の同一性を有するものがより一層好ましく、少なくとも９９
％の同一性を有するポリペプチドが最も好ましいものである。かかるポリヌクレ
オチドとして、配列番号２のポリペプチドをコードする配列番号１に含まれるヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。

【００１３】本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号２のポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列と、その全コード領域にわたって、少なくとも９５％の同一
性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。こ
れに関して、少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドが一層好まし
いが、少なくとも９８〜９９％の同一性を有するものがより一層好ましく、少な
くとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドが最も好ましいものである。

【００１４】本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号１の全長にわたって配列番号
１のポリヌクレオチドと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を
含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、少なくとも９７％
の同一性を有するポリヌクレオチドが一層好ましいが、少なくとも９８〜９９％
の同一性を有するものがより一層好ましく、少なくとも９９％の同一性を有する
ポリヌクレオチドが最も好ましいものである。かかるポリヌクレオチドとして、
配列番号１のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドおよび配列番号１のポリ
ヌクレオチドが挙げられる。

【００１５】本発明はまた、上記の全てのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを
提供する。

【００１６】配列番号１のヌクレオチド配列はマウスセレベリン−2（Kavetyら、1994、Bra
in Res. Mol. Brain Res.、27(1)、152-156）との相同性を示す。配列番号１のヌクレオチド配列はｃＤＮＡ配列であり、配列番号２のポリペプチドである224 個のアミノ酸のポリペプチドをコードするポリペプチドコード配列(ヌクレオチド番号277〜951)を含む。配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に含まれるポリペプチドコード配列と同一であっても、遺伝
子コードの重複性（縮重）のため、やはり配列番号２のポリペプチドをコードす
る、配列番号１に含まれる配列以外の配列であってもよい。配列番号２のポリペ
プチドはセレベリン神経ペプチドファミリーの他のタンパク質と構造的に関連し
ており、ラットセレベリン様糖タンパク質（Wadaら、1991、Brain Res. Mol. Br
ain Res.、9(1-2)、71-76）との相同性および／または構造類似性を有する。

【００１７】本発明の好適なポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、それと相
同なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／性質をもつこ
とが期待される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドは少なくとも１つのセレベリン−2活性を有する。

【００１８】また、本発明は、配列番号１および配列番号２の対応する全長配列の決定に先
立って最初に同定された部分的なまたは他のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドに関する。

【００１９】したがって、更なる態様において、本発明は、 (a) 配列番号３の全長にわたって配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも
９５％の同一性、好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するヌクレオ
チド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、 (b) 配列番号３の全長にわたって配列番号３と少なくとも９５％の同一性、好
ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する単
離されたポリヌクレオチド、 (c) 配列番号３のポリヌクレオチドからなる単離されたポリヌクレオチド、ま
たは (d) 配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５
％の同一性、好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチド、並びに配列番号３のポリヌクレオチド、を提供する。

【００２０】さらに、本発明は、 (a) 配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５
％の同一性、好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列
を含むポリペプチド、 (b) 配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５
％の同一性、好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列
を有するポリペプチド、 (c) 配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または (d) 配列番号４のポリペプチドからなるポリペプチド、並びに配列番号３に含まれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチド、を提供する。

【００２１】配列番号３のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるペプチド配列は
エクスプレスド・シーケンス・タグ（Expressed Sequence Tag：ＥＳＴ）配列か
ら誘導される。当業者であれば、ＥＳＴ配列中に若干のヌクレオチド配列読み取
り誤差が必然的に存在することを理解するであろう（Adams, M.D.ら, Nature 37
7 (supp)3, 1995を参照のこと）。したがって、配列番号３のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるペプチド配列は配列精度において同一の固有の限
界を受ける。さらに、配列番号３によりコードされるペプチド配列は、最も相同
性または構造類似性が高いタンパク質と同一の領域、または高い相同性および／
または構造類似性（例えば、保存的アミノ酸の差異）の領域を含んでいる。

【００２２】本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング技
術(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))により、ヒトの脳の細胞中のｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラリーから得ることが
できる。また、本発明のポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡライブラリーのような
天然源から得ることができ、商業的に入手可能な公知の技法を用いて合成するこ
ともできる。

【００２３】本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え体生産のために用
いる場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列単独、ま
たは他のコード配列（例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−もし
くはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするもの
）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配列が含まれ
る。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得
る。本発明のこの態様の特定の好ましい具体例においては、マーカー配列は、ｐ
ＱＥベクター(Qiagen, Inc.)により提供されかつ Gentzら, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1989) 86:821-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチド
、またはＨＡタグである。また、このポリヌクレオチドは5'および3'非コード配
列、例えば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニ
ル化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍＲＮＡ安定化配列を含んでいても
よい。

【００２４】本発明の更なる具体例としては、数個、例えば５〜１０個、１〜５個、１〜３
個、１〜２個、または１個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付
加されている、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド変異体をコ
ードするポリヌクレオチドがある。

【００２５】配列番号１に含まれるヌクレオチド配列と同一であるか十分に同一であるポリ
ヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノム
クローンを単離するために、また、配列番号１に対して高い配列類似性を有する
他の遺伝子（ヒト起源のパラログ(paralogs)ならびにヒト以外の種に由来するオ
ーソログ(orthologs)およびパラログをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブ
リダイゼーションプローブとして、または核酸増幅（ＰＣＲ）反応用のプライマ
ーとして用いることができる。一般的に、これらのヌクレオチド配列は基準のヌ
クレオチド配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ま
しくは９５％同一である。プローブまたはプライマーはたいてい１５個以上のヌ
クレオチドを含み、好ましくは３０個以上を含み、５０個以上のヌクレオチドを
有していてもよい。特に好ましいプローブは３０〜５０個の範囲のヌクレオチド
を有するものである。特に好ましいプライマーは２０〜２５個の範囲のヌクレオ
チドを有するものである。

【００２６】本発明のポリペプチド（ヒト以外の種に由来する相同体を含む）をコードする
ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片を有する標
識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で適当
なライブラリーをスクリーニングし、該ポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮ
Ａおよびゲノムクローンを単離する各工程を含む方法により得られる。このよう
なハイブリダイゼーション技法は当業者に公知である。好ましいストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件は、50% ホルムアミド、５×SSC (150mM NaCl,
15mM クエン酸三ナトリウム) 、50mMリン酸ナトリウム (pH7.6)、５×Denhardt
溶液、10% デキストラン硫酸および20μg/mlの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡを
含有する溶液中４２℃で一夜インキュベートし、次いでフィルターを 0.1×SSC
中約６５℃で洗浄することを含む。かくして、本発明は、配列番号１のヌクレオ
チド配列またはその断片を有する標識プローブを用いて、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下で適当なライブラリーをスクリーニングすることに
より得られるポリヌクレオチドをも包含する。

【００２７】当業者には理解されるように、多くの場合、ポリペプチドをコードする領域の
ｃＤＮＡ5'末端が短いことから、単離されたｃＤＮＡ配列は不完全であるだろう
。それは逆転写酵素のためであり、この酵素はもともと「プロセシビティ」（pr
ocessivity：重合反応中に鋳型に結合した状態でいる該酵素の能力の尺度）が低
く、第一鎖ｃＤＮＡ合成の間にｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを完成させることが
できない。

【００２８】全長ｃＤＮＡを得るための、または短鎖ｃＤＮＡを伸長させるための、当業者
に公知で利用可能な方法がいくつかあり、例えば、ｃＤＮＡ末端高速増幅法（Ｒ
ＡＣＥ）に基づいた方法がある（例えば、Frohmanら, PNAS USA 85, 8998-9002,
1988を参照のこと）。例えばMarathon^TM技術(Clontech Laboratories Inc.)により示されるような、上記技法の最近の改良により、より長いｃＤＮＡの検索が
大いに簡便化された。Marathon^TM技術では、所定の組織より抽出されたｍＲＮＡ
からｃＤＮＡを作製し、各末端に「アダプター」配列を連結する。続いて、遺伝
子特異的およびアダプター特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用
いて核酸増幅（ＰＣＲ）を行い、ｃＤＮＡの「欠失」5'末端を増幅する。次に、
「ネステッド（nested）」プライマー、すなわち増幅産物の内部にアニールする
ように設計されたプライマー（典型的には、アダプター配列のさらに3'側にアニ
ールするアダプター特異的プライマーおよび既知遺伝子配列のさらに5'側にアニ
ールする遺伝子特異的プライマー）を用いてＰＣＲ反応を繰り返す。その後、こ
の反応の産物をＤＮＡ塩基配列決定により解析し、この産物を既存のｃＤＮＡに
直接結合するか、または5'プライマー設計用の新たな配列情報を用いて別の全長
ＰＣＲを行うことにより、全長ｃＤＮＡを構築することができる。

【００２９】本発明の組換え体ポリペプチドは、当業界で公知の方法を用いて、発現系を含
有する遺伝子操作宿主細胞から生産することができる。したがって、更なる態様
において、本発明は、本発明の１以上のポリヌクレオチドを含有する発現系、該
発現系により遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本発明ポリペプ
チドの生産に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いてこの
種のタンパク質を生産するために、無細胞翻訳系を使用することもできる。

【００３０】組換え体生産に関しては、本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部
を組み込むために宿主細胞を遺伝子操作することができる。宿主細胞へのポリヌ
クレオチドの導入は、Davisら, Basic Methods in Molecular Biology (1986) および Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))などの多
くの標準的な実験室マニュアルに記載された方法により行うことができる。好適
なこうした方法として、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvect
ion)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)
、弾丸導入(ballistic introduction)または感染などがある。

【００３１】適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞（例：ストレプトコッカス(Strepto
cocci)、スタフィロコッカス(Staphylococci)、大腸菌(E.coli)、ストレプトミセス(Streptomyces)、枯草菌(Bacillus subtilis)）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス(Aspergillus)）、昆虫細胞（例：ドロソフィラ(Drosophila)Ｓ２、スポドプテラ(Spodoptera)Ｓｆ９細胞）、動物細胞（例：ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈ
ｅＬａ、Ｃ127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ293、Bowes メラノーマ細胞）および植
物細胞が挙げられる。

【００３２】多種多様な発現系を使用することができる。こうした発現系として、特に、染
色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由来、バク
テリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因子由来
、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ４０のよ
うなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮
性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せに
由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバク
テリオファージの遺伝的要素に由来するものがある。これらの発現系は発現を起
こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。一般的に、宿
主内でのポリペプチドの産生のためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現
することができる系またはベクターはどれも使用しうる。Sambrookら, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual (前掲) に記載されるような、日常的に用いら
れる公知の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入する
ことができる。翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または
細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに
組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性
であっても、異種シグナルであってもよい。

【００３３】スクリーニングアッセイで使用するため本発明のポリペプチドを発現させよう
とする場合、一般にそのポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適であ
る。その場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先立って細胞を回収する。
該ポリペプチドが培地に分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製する
ために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、そ
の後にポリペプチドを回収する必要がある。

【００３４】組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いるこ
とができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる
。ポリペプチドが細胞内合成、単離および／または精製中に変性されるときは、
タンパク質の再折りたたみのための公知の技法を用いて、活性のあるコンフォメ
ーションを復元することが可能である。

【００３５】本発明はまた、診断薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機
能障害と関連した、配列番号１のポリヌクレオチドにより特徴づけられる遺伝子
の変異型の検出は、該遺伝子の過少発現、過剰発現または空間的もしくは時間的
に変化した発現により生ずる疾病またはその疾病への罹りやすさの診断に追加し
うる、またはその診断を下しうる診断用ツールを提供するだろう。該遺伝子に突
然変異がある個体を、さまざまな技法によりＤＮＡレベルで見つけ出すことがで
きる。

【００３６】診断用の核酸は、被験体の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖
検材料由来の細胞から得ることができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用
してもよいし、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使ってゲノムＤＮＡを酵素的
に増幅してもよい。同様の方法でＲＮＡまたはｃＤＮＡを使用することもできる
。欠失および挿入突然変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイ
ズの変化により検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識化セレベリン−2ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることで同定できる。完全にマッチした配
列とミスマッチの二重鎖とはＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差異によ
り区別できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を含むもしくは含まないゲル
でのＤＮＡ断片の電気泳動の移動度の変化により、または直接ＤＮＡ塩基配列決
定によっても検出できる（例えば、Myersら, Science (1985) 230:1242 を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレアーゼプロテクションアッセイ（例え
ば、ＲＮアーゼおよびＳ１プロテクション）または化学的開裂法によっても確認
できる（Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401を参照の
こと）。別の実施態様では、例えば、遺伝子変異の効率のよいスクリーニングを
行うため、セレベリン−2ヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイ(array)を構築することができる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能性を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含
めた分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために用いられている（例えば、
M. Cheeら, Science, Vol.274, pp.610-613 (1996) を参照のこと）。

【００３７】診断アッセイは、前記の方法によりセレベリン−2遺伝子の変異を検出することで、前記疾患への罹りやすさを診断または判定する方法を提供する。さらに、
被験体から得られたサンプルからポリペプチドまたはｍＲＮＡのレベルの異常な
低下または増加を測定する方法により、前記疾患の診断を下すことができる。発
現の低下または増加は、当業界で公知のポリヌクレオチドの定量法、例えば核酸
増幅（例：ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブロ
ッティング、その他のハイブリダイゼーション法のいずれかによりＲＮＡレベル
で測定することができる。宿主から得られたサンプル中の本発明ポリペプチドの
ようなタンパク質のレベルを測定するアッセイ法は当業者によく知られている。
こうしたアッセイ法として、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエス
タンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイなどがある。

【００３８】かくして、もう一つの態様において、本発明は、 (a) 本発明のポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列
）もしくはその断片、 (b) (a) のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、 (c) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）もしく
はその断片、または (d) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対す
る抗体、を含む診断用キットに関する。

【００３９】このようなキットにおいて、(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質的な構成成分
であることが理解されよう。かかるキットは疾患または疾患への罹りやすさ、特
に神経系障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、双極性障害および単極性障
害を含む情動障害、精神分裂病、オリーブ橋小脳萎縮、シャイ‐ドレーガー症候
群、およびシナプス機能の破壊により生じる他の障害を診断するうえで有用であ
る。

【００４０】また、本発明のヌクレオチド配列は染色体の局在位置決定にも有用である。こ
の配列は個々のヒト染色体上の特定の位置をターゲッティングし、その特定位置
とハイブリダイズすることができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作
成することは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関させるうえで重要な第一
段階である。ひとたび配列が正確な染色体位置にマッピングされたら、その染色
体上のその配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることができる。この
種のデータは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns H
opkins University Welch Medical Library からオンラインで入手可能) 中に見
いだせる。その後、同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係
を連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝）により確認する。

【００４１】罹患個体と非罹患個体とのｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異も調べることがで
きる。罹患個体の一部または全部に突然変異が観察されるが、どの正常個体にも
観察されない場合は、その突然変異が疾患の原因である可能性がある。

【００４２】本発明の遺伝子はヒト染色体16q22−16q23にマッピングされる。該染色体領域
は、多数の独立した研究において双極性障害に非常に関連しているとされてきた
。

【００４３】また、本発明のヌクレオチド配列は、組織の局在位置決定にも有用である。こ
うした技術によって、組織におけるヒトセレベリン−2ポリペプチドの発現パターンを、これらをコードするｍＲＮＡを検出することで決定することができる。
これらの技術として、in situハイブリダイゼーション技術、およびヌクレオチド増幅技術(例えばＰＣＲ)が挙げられる。こうした技術は当該技術分野で周知で
ある。これらの研究の結果から、生物における該ポリペプチドの正常な機能の指
標が得られる。さらに、ヒトセレベリン−2 ｍＲＮＡの正常な発現パターンとヒ
トセレベリン−2遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの発現パターンとの比較検討により、疾患状態におけるヒトセレベリン−2ポリペプチド突然変異体の役割、あるいは正常なヒトセレベリン−2ポリペプチドの不適切な発現の役割についての有益な知見が得られる。そうした不適切な発現は、時間的、空間的または
単に量的な性質のものでもあり得る。

【００４４】本発明のポリペプチド、その断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細
胞は、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体を生産するための免疫原として
も使用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が従来技術における他
の関連ポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実
質的に高い親和性を示すことを意味する。

【００４５】本発明のポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコルを用いて、動物（好
ましくはヒト以外の動物）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類似
体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノクローナル抗体の調製には
、連続細胞系の培養物から抗体を産生させる任意の技法を用いることができる。
例を挙げると、ハイブリドーマ法 (Kohler, G.およびMilstein, C., Nature (19
75) 256:495-497)、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 (Kozborら, Im
munology Today (1983) 4:72) およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法 (Coleら, Mono
clonal Antibodies and Cancer Therapy, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985
) などがある。

【００４６】本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、米国特許第4,946,
778号に記載されるような一本鎖抗体の調製法を適応させることができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動
物を含む他の生物を利用することができる。

【００４７】前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現するクローンを単離・同定した
り、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもで
きる。

【００４８】本発明のポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、前記疾患の治療に使用でき
る可能性がある。

【００４９】本発明の更なる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断
片と、各種サブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の免疫グロブリンの
Ｈ鎖またはＬ鎖の定常領域の様々な部分と、を含んでなる遺伝子工学的に作製さ
れた可溶性融合タンパク質に関する。免疫グロブリンとしてはヒトＩｇＧ、特に
ＩｇＧ１のＨ鎖の定常部が好ましく、その場合は融合がヒンジ領域で起こる。特
定例では、血液凝固Ｘａ因子で開裂され得る開裂配列を組み込むことで、Ｆｃ部
分を簡単に除去できる。さらに、本発明は、これら融合タンパク質の遺伝子工学
的作製方法、並びに薬物スクリーニング、診断および治療におけるそれらの使用
に関する。また、本発明の更なる態様はこのような融合タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドに関する。融合タンパク質技術の例は国際特許出願 WO94/2945
8 およびWO94/22914に見いだせる。

【００５０】本発明の更なる態様は哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関し、
この方法は、特に前記疾患から該動物を防御するための抗体および／またはＴ細
胞免疫応答を生ずるのに十分な本発明のポリペプチドを哺乳動物に接種すること
を含んでなる。本発明のさらに別の態様は、哺乳動物を前記疾患から防御する抗
体を産生させるような免疫学的応答を引き出すために、in vivo で本発明のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介して該ポ
リペプチドを供給することを含んでなる、哺乳動物において免疫学的応答を引き
出す方法に関する。

【００５１】本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導入したとき、その哺乳動物において
本発明のポリペプチドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン製剤
（組成物）に関し、この組成物は本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
を含有する。ワクチン製剤は適当な担体をさらに含んでいてもよい。ポリペプチ
ドは胃の中で分解される可能性があるので、非経口的に（例えば、皮下、筋肉内
、静脈内または皮内注射により）投与することが好ましい。非経口投与に適した
製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液と等
張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注射液、並びに懸濁剤または増
量剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量容
器または複数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供すること
ができ、また、使用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で
保管することもできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増強するためのア
ジュバント系、例えば水中油型のアジュバント系や当業界で公知の他のアジュバ
ント系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性により変化するが、ルー
チンな実験操作により簡単に決定できる。

【００５２】本発明のポリペプチドは、1つ以上の病状、特に前記疾患を含めて、1つ以上の
生物学的機能に関与している。それゆえ、このポリペプチドの機能を刺激または
抑制する化合物を同定するスクリーニング法を開発することが望ましい。したが
って、更なる態様において、本発明は、このポリペプチドの機能を刺激または抑
制する化合物を同定するための化合物のスクリーニング法を提供する。一般的に
は、前記疾患の治療および予防目的のためにアゴニストまたはアンタゴニストが
使用される。種々の供給源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリ
ーおよび天然産物の混合物から化合物を同定することができる。このように同定
されたアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターは、場合により、該ポリ
ペプチドの天然のまたは修飾された基質、リガンド、受容体、酵素などであって
よく、また、その構造的または機能的なミメティックであってもよい（Coligan ら, Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)を参照のこと）
。

【００５３】スクリーニング法では、本発明のポリペプチド、または該ポリペプチドを担持
する細胞もしくは膜、またはその融合タンパク質への候補化合物の結合を、候補
化合物に直接または間接的に結合された標識を用いて簡単に測定できる。あるい
はまた、スクリーニング法では標識した競合物質との競合を用いることもある。
さらに、こうしたスクリーニング法では、候補化合物がポリペプチドの活性化ま
たは抑制により生ずるシグナルを結果的にもたらすか否かを、該ポリペプチドを
担持する細胞に適した検出系を用いて試験することができる。一般的には、既知
のアゴニストの存在下で活性化のインヒビターをアッセイして、アゴニストによ
る活性化に候補化合物の存在が与える影響を調べる。アゴニストまたはインヒビ
ターの非存在下で、候補化合物がポリペプチドの活性化を抑制するか否かを調べ
ることによる逆アゴニストまたはインヒビターのスクリーニング法では、構成的
に活性のあるポリペプチドが用いられる。さらに、これらのスクリーニング法は
、候補化合物と本発明のポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせて混合物をつく
り、この混合物中のセレベリン−2活性を測定し、そしてこの混合物のセレベリン−2活性をスタンダードと比較する各ステップを単に含むだけでよい。本発明のポリペプチドのアンタゴニストを同定する高効率スクリーニングアッセイでは
、上記のようなＦｃ部分とセレベリン−2ポリペプチドから作製されるような融合タンパク質も使用することができる(D. Bennettら, J. Mol. Recognition, 8:
52-58 (1995) およびK. Johansonら, J. Biol. Chem., 270(16):9459-9471 (199
5)を参照のこと）。

【００５４】また、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは該ポリペプチドに対す
る抗体を用いて、細胞内でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの産生に及ぼす添加化
合物の作用を検出するためのスクリーニング法を組み立てることができる。例え
ば、当業界で公知の標準方法によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体を
用いて、ポリペプチドの分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するためのＥＬ
ＩＳＡアッセイを構築することができ、これは適切に操作された細胞または組織
からのポリペプチドの産生を抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニスト
またはアゴニストともいう）の探索に用いることができる。

【００５５】膜に結合した受容体または可溶性の受容体が存在するのであれば、当業界で公
知の標準的な受容体結合法によりこの種の受容体を同定するために本発明のポリ
ペプチドを用いることができる。こうした受容体結合法には、限定するものでは
ないが、リガンド結合アッセイおよび架橋アッセイがあり、これらのアッセイで
は、ポリペプチドを放射性アイソトープ（例：¹²⁵I）で標識するか、化学的に修
飾（例：ビオチン化）するか、または検出や精製に適したペプチド配列に融合さ
せ、そして推定上の受容体源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液など
）とインキュベートする。その他の方法としては、表面プラズモン共鳴および分
光学のような生物物理的方法がある。これらのスクリーニング法は、該ポリペプ
チドの（存在するのであれば）その受容体への結合と競合する該ポリペプチドの
アゴニストまたはアンタゴニストを同定するために用いることもできる。スクリ
ーニングアッセイを行うための標準的な方法は当業界でよく理解されている。

【００５６】潜在的なポリペプチドアンタゴニストの例としては、抗体、ある場合には、該
ポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素などと密接な関係があるオリゴヌ
クレオチドもしくはタンパク質（例えば、リガンド、基質、受容体、酵素などの
断片）、または本発明のポリペプチドと結合するが応答を誘導しない（それゆえ
該ポリペプチドの活性を妨げる）小分子などがある。

【００５７】かくして、他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのアゴニスト
、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、またはこの種のポリペ
プチドの産生を低下または増加させる化合物を同定するためのスクリーニングキ
ットに関し、このキットは、 (a) 本発明のポリペプチド、 (b) 本発明のポリペプチドを発現している組換え細胞、 (c) 本発明のポリペプチドを発現している細胞膜、または (d) 本発明のポリペプチドに対する抗体、を含み、前記ポリペプチドは好ましくは配列番号２のポリペプチドである。こ
のようなキットにおいて、(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質的な構成成分であ
ることが理解されよう。

【００５８】当業者であれば、本発明のポリペプチドは、その構造に基づいて該ポリペプチ
ドのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターを設計する方法にも使用で
きることが容易に理解されよう。この方法は、 (a) 最初に該ポリペプチドの三次元構造を解析し、 (b) アゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターの有望と思われる反応部
位または結合部位の三次元構造を想定し、 (c) 想定された結合部位または反応部位と結合または反応すると予想される候
補化合物を合成し、そして (d) その候補化合物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビター
であるか否かを調べる、ことを含んでなる。これは通常反復プロセスであることがさらに理解されよう。

【００５９】更なる態様において、本発明は、セレベリン−2ポリペプチド活性の過剰発現と過小発現のいずれかに関係した、例えば神経系障害、パーキンソン病、アルツ
ハイマー病、双極性障害および単極性障害を含む情動障害、精神分裂病、オリー
ブ橋小脳萎縮、シャイ‐ドレーガー症候群、およびシナプス機能の破壊により生
じる他の障害などの異常な状態の治療法を提供する。

【００６０】該ポリペプチドの活性が過剰である場合は、いくつかのアプローチが利用可能
である。一つのアプローチは、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素などの結
合をブロックすることにより、または第２のシグナルを抑制することで異常な状
態を軽減することにより、該ポリペプチドの機能を抑制するのに有効な量で、上
記のインヒビター化合物（アンタゴニスト）を場合により製剤学上許容される担
体とともに被験体に投与することを含んでなる。もう一つのアプローチでは、内
因性のポリペプチドとの競合状態でリガンド、基質、酵素、受容体などと結合す
る能力がまだある可溶性形態のポリペプチドを投与することができる。このよう
な競合物質の典型的な例はセレベリン−2ポリペプチドの断片である。

【００６１】さらに別のアプローチでは、発現阻止法を使って内因性セレベリン−2ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制することができる。こうした公知技術は
、体内で産生されるか外部から投与されるアンチセンス配列の使用を必要とする
（例えば、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expressi
on (遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチ
ド), CRC Press, Boca Raton, FL (1988) 中のO'Connor, J. Neurochem (1991)
56:560を参照のこと）。あるいはまた、この遺伝子と共に三重らせん(トリプレックス)を形成するオリゴヌクレオチドを供給することもできる（例えば、Leeら
, Nucleic Acids Res (1979) 6:3073; Cooneyら, Science (1988) 241:456; Der
vanら, Science (1991) 251:1360 を参照のこと）。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することもできるし、関連オリゴマーをin vivo で発現させることも
できる。合成アンチセンスまたはトリプレックスオリゴヌクレオチドは修飾塩基
または修飾骨格を含みうる。後者の例にはメチルホスホネート、ホスホロチオエ
ートまたはペプチド核酸骨格が含まれる。そうした骨格はアンチセンスまたはト
リプレックスオリゴヌクレオチド中に取り込まれてヌクレアーゼによる分解から
の防御を提供しており、当分野で公知である。これらの、または他の修飾骨格を
用いて合成されたアンチセンスおよびトリプレックス分子も本発明の一部を構成
する。

【００６２】さらに、ヒトセレベリン−2ポリペプチドの発現は、ヒトセレベリン−2 ｍＲＮＡ配列に特異的なリボザイムを用いることにより阻止することができる。リボ
ザイムは触媒的に活性なＲＮＡであり、天然のものでも合成されたものでも良い
(例えば、Usman, Nら、Curr. Opin. Struct. Biol. (1996)6(4), 527-33を参照されたい)。合成リボザイムは、選択した部位でヒトセレベリン−2ｍＲＮＡを特
異的に切断するように設計することができ、それによりヒトセレベリン−2ｍＲＮＡから機能性ポリペプチドへの翻訳が阻止される。通常ＲＮＡ分子に見られる
ような天然のリボースリン酸骨格および天然の塩基を用いてリボザイムを合成す
ることもできる。また、リボヌクレアーゼ分解からの防御を提供するために非天
然骨格を用いてリボザイム、例えば、2’-Ｏ-メチルＲＮＡを合成することも可能であり、該リボザイムは修飾塩基を含みうる。

【００６３】セレベリン−2およびその活性の過少発現に関係した異常な状態を治療する場合も、いくつかのアプローチを取ることができる。一つのアプローチは、治療に
有効な量の本発明ポリペプチドを活性化する化合物（すなわち、前記アゴニスト
）を製剤学上許容される担体とともに被験体に投与して、異常な状態を緩和する
ことを含んでなる。別法として、被験体の関連細胞においてセレベリン−2を内因的に産生させるために遺伝子治療を用いることができる。例えば、上で述べた
ような複製欠陥レトロウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌクレ
オチドを遺伝子操作する。次にレトロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポ
リペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで
形質導入されたパッケージング細胞に導入する。その結果、パッケージング細胞
は対象の遺伝子を含有する感染性のウイルス粒子を産生するようになる。in viv
o 細胞操作およびin vivo ポリペプチド発現のために、これらのプロデューサー
細胞を被験体に投与する。遺伝子治療の概論に関しては、Human Molecular Gene
tics, T Strachanおよび A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)中
のChapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic
Approaches(およびその中の引用文献) を参照のこと。もう一つのアプローチは
治療量の本発明のポリペプチドを適当な製剤学上の担体とともに投与することで
ある。

【００６４】更なる態様において、本発明は、治療に有効な量のポリペプチド（例えば、可
溶性形態の本発明ポリペプチド）、アゴニストもしくはアンタゴニストペプチド
、または小分子化合物を製剤学上許容される担体または賦形剤と共に含有する医
薬組成物を提供する。この種の担体としては、食塩水、緩衝化食塩水、デキスト
ロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せがあるが、これ
らに限らない。本発明はさらに、上記の本発明の組成物の１以上の成分を充填し
た１以上の容器を含んでなる医薬パックおよびキットに関する。本発明のポリペ
プチドおよび他の化合物は単独で使用しても、他の化合物、例えば治療用化合物
と一緒に使用してもよい。

【００６５】医薬組成物は投与経路、例えば全身または経口による投与経路に適合させるこ
とができる。全身投与に適した形態は、注入、典型的には静脈内注射である。皮
下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。全身投与の別の手
段には、胆汁酸塩、フシジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘
膜および経皮投与がある。さらに、本発明のポリペプチドまたは他の化合物を腸
溶剤またはカプセル剤として製剤化し得るのであれば、経口投与も可能である。
これらの化合物を軟膏、ペースト、ゲルなどの剤形で局所に投与しても、かつ／
または局在化させてもよい。

【００６６】必要な投与量範囲は、本発明のペプチドまたは他の化合物の選択、投与経路、
製剤の性質、被験体の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投
与量は被験体の体重１kgあたり0.1〜100μgの範囲である。入手可能な化合物が多様であること、投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与
量は広範に変動することが予測される。例えば、経口投与は静注による投与より
も高い投与量を必要とすると予想されよう。こうした投与量レベルの変動は、当
業界でよく理解されているような、標準の経験的な最適化手順を用いて調整する
ことができる。

【００６７】治療に用いるポリペプチドは、上述したような「遺伝子治療」と称する治療法
において、被験体の体内で産生させることもできる。例えば、被験体由来の細胞
を、ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオチドに
より、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、ex vivo で遺伝子工
学的に操作する。その後、これらの細胞を被験体に導入する。

【００６８】ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列は、類似の相同性を有する別の配
列を同定する際の価値ある情報源を提供する。これは、こうした配列をコンピュ
ータ読み取り可能媒体中に保存し、次に保存したデータを用いてＧＣＧおよびＬ
ａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージのような利用可能な検索ツールにより
配列データベースを検索することで最大限促進される。したがって、更なる態様
において、本発明は、配列番号１の配列を含むポリヌクレオチドおよび／または
それによりコードされるポリペプチドを保存したコンピュータ読み取り可能媒体
を提供する。

【００６９】以下の定義は上記の説明中でしばしば用いられた用語を理解しやすくするため
のものである。

【００７０】本明細書中で用いる「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロブリ
ン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントが含まれる。

【００７１】「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」変化されたことを
意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在するのであれば、それ
はそのもとの環境から変化しているか分離されており、またはその両方である。
例えば、生存している動物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離
されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように
、「単離された」ものである。

【００７２】「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ
、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」に
は、制限するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖
領域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも
、またはより典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合っ
たものでもよい）が含まれる。加えて、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤ
ＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポリヌクレ
オチド」という用語はまた、１個以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ
、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲ
ＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノ
シンのような特殊な塩基がある。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾を
行うことができる。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界に一般的に存在
するポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、並びに
ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。ま
た、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短
いポリヌクレオチドも包含する。

【００７３】「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわ
ち、ペプチドアイソスター）により互いに連結された２個以上のアミノ酸を含む
ペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は短鎖（通常はペプチ
ド、オリゴペプチドまたはオリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質と
いう）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コード化アミノ酸以外の
アミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天
然のプロセスで、または当業界で公知の化学的修飾法のいずれかで修飾されたア
ミノ酸配列を含む。このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文およ
び研究文献に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまた
はカルボキシル末端を含めてポリペプチドのどこでも行うことができる。同じタ
イプの修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさまざまに
異なる程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの修飾
を含んでいてもよい。ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、分
枝のある又はない環状であってもよい。環状の、分枝した、または分枝した環状
のポリペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じることがあり、また、合成法に
よって製造することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−
リボシル化、アミド化、ビオチニル化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結
合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体
の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィ
ド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタ
メートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカ
ー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパ
ク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビ
キチン化などがある（例えば、Proteins - Structure and Molecular Propertie
s, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Po
sttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson編, Acade
mic Press, New York, 1983中のWold, F., Post-translational Protein Modifi
cations: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12; Seifterら, “Analysis fo
r protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 1
82:626-646; および Rattanら, “Protein Synthesis: Post-translational Mod
ifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62 を参照のこと）。

【００７４】「変異体」とは、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、不
可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことである。
典型的なポリヌクレオチドの変異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列
の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチ
ドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても、しなくても
よい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準配列によりコードされ
るポリペプチドのアミノ酸の置換、欠失、付加、融合および末端切断（トランケ
ーション）をもたらしうる。典型的なポリペプチドの変異体は基準ポリペプチド
とアミノ酸配列の点で相違する。一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異体
の配列が全般的によく類似しており、多くの領域で同一となるような相違に限ら
れる。変異体と基準ポリペプチドは任意に組み合わせた１以上の置換、欠失、付
加によりアミノ酸配列が相違していてよい。置換または挿入されるアミノ酸残基
は遺伝子コードによりコードされるものであっても、なくてもよい。ポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの変異体はアレル変異体のように天然に存在するもの
でも、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発法または
直接合成により作製することができる。

【００７５】当技術分野で知られた「同一性」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオ
チド配列の比較により決定された、２以上のかかる配列間の関連性のことである
。当技術分野ではまた、「同一性」はポリペプチド配列またはポリヌクレオチド
配列の鎖間のマッチ(match)により決定された、このような配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は公知の方法により難なく算出
することができ、こうした方法として、例えば Computational Molecular Biolo
gy, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing:
Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 編, Academic Press, New Yo
rk, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. and
Griffin, H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in M
olecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysi
s Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. 編, M Stockton Press, New York,
1991; および Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073
(1988) に記載された方法があるが、これらに限らない。同一性を決定するため
の好ましい方法は、検討する配列間で最大級のマッチが得られるように設計され
る。さらに、同一性および類似性を決定する方法は一般に入手可能なコンピュー
タプログラムに編集されている。２配列間の同一性および類似性を決定する好適
なコンピュータプログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ (Devereux
, J.ら, Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳ
ＴＮおよびＦＡＳＴＡ (Atschul, S.F.ら, J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990
)) があるが、これらに限らない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他
のソースから一般に入手可能である (BLAST Manual, Altschul, S.ら, NCBI NLM
NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.ら, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (199
0))。公知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性の決定に使用することができる。

【００７６】ポリペプチド配列を比較するための好適なパラメーターは次のものを含む：１）アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)；比較マトリックス：BLOSSUM62 、Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992) ギャップペナルティー：12 ギャップ長ペナルティー：４これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group
(Madison WI)から「ｇａｐ」プログラムとして一般に入手可能である。前記のパ
ラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーター(default parameter
) である（末端ギャップのペナルティーは無し）。

【００７７】ポリヌクレオチド配列を比較するための好適なパラメーターは次のものを含む
：１）アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)；比較マトリックス：マッチ＝＋10、ミスマッチ＝０ギャップペナルティー：50 ギャップ長ペナルティー：３これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group
(Madison WI)から「ｇａｐ」プログラムとして入手可能である。これらのパラメ
ーターは核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。

【００７８】例として、本発明のポリヌクレオチド配列は配列番号１の基準配列と同一、す
なわち100％同一であっても、該基準配列に対して、ある整数個までのヌクレオチド変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくとも１個のヌクレオチドの欠失
、置換（トランジションおよびトランスバージョンを含む）または挿入よりなる
群から選択され、こうした変異は基準ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位置
、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中のヌクレオ
チドの間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして介在す
ることができる。ヌクレオチド変異の数は、配列番号１のヌクレオチドの総数に
、それぞれの（100で割った）同一性％値を掛け、その積を配列番号１のヌクレオチドの総数から差し引くことにより、すなわち、次式：ｎ_ｎ ≦ｘ_ｎ −（ｘ_ｎ・ｙ）により求めることができる。式中、ｎ_ｎはヌクレオチド変異の数であり、ｘ_ｎは
配列番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％
については0.80、85％については0.85、90％については0.90、95％については0.
95などであり、ｘ_ｎとｙの非整数の積は、その積をｘ_ｎから引く前に、最も近似
する整数に切り下げる。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド配列の改変は、そのコード配列にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフ
ト突然変異を生じさせ、それにより、こうした変異後に該ポリヌクレオチドによ
りコードされたポリペプチドを改変させることができる。

【００７９】同様に、本発明のポリペプチド配列は配列番号２の基準配列と同一、すなわち
100％の同一性であっても、該基準配列に対して、ある整数個までのアミノ酸変異を含んで同一性％が100％未満であってもよい。前記変異は少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的および非保存的アミノ酸置換を含む）または挿入
よりなる群から選択され、こうした変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしく
はカルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のいずれに存在してもよく
、基準配列中のアミノ酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグ
ループとして介在することができる。所定の同一性％についてのアミノ酸変異の
数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、それぞれの（100で割った）同一性％値を掛け、その積を配列番号２のアミノ酸の総数から差し引くことにより、すなわ
ち、次式：ｎ_ａ ≦ｘ_ａ −（ｘ_ａ・ｙ）により求めることができる。式中、ｎ_ａはアミノ酸変異の数であり、ｘ_ａは配列
番号２中のアミノ酸の総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％につい
ては0.80、85％については0.85などであり、ｘ_ａとｙの非整数の積は、その積を
ｘ_ａから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。

【００８０】「相同体」とは、対象の配列に対して高度の配列関連性を有するポリヌクレオ
チドまたはポリペプチド配列を示すための当技術分野で使用される一般的な用語
である。こうした関連性は、上記のような比較すべき配列間の同一性および／ま
たは類似性の程度を決定することにより定量化できる。別の種におけるポリヌク
レオチドまたはポリペプチドの機能的等価物であるポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドを意味する「オーソログ」(ortholog)、および同一の種内で考えるとき
に機能的に類似した配列を意味する「パラログ」(paralog)という用語はこの一般的な用語に含まれる。

【００８１】「融合タンパク質」とは、２つの、しばしば無関係の、融合された遺伝子また
はその断片によりコードされるタンパク質のことである。一例として、EP-A-0 4
64には、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分と他のヒトタンパク質また
はその一部とを含んでなる融合タンパク質が記載されている。多くの場合、治療
および診断における使用には、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ
領域を使用することが有利であり、これにより例えば薬物速度論的性質が向上す
る（例えば、EP-A- 0232 262を参照のこと）。一方、いくつかの使用にとっては
、その融合タンパク質を発現させ、検出し、精製した後でＦｃ部分を除去するこ
とが望ましいだろう。

【００８２】本明細書中に引用された、特許および特許出願明細書を含めた全ての刊行物は
、あたかも各刊行物が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体を参
考としてここに組み入れるものとする。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１２年９月４日（２０００．９．４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/68 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/68 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ (72)発明者バーンズ、マイケル、ロバートイギリス国シーエム19 ５エーダブリュエセックス，ハーロウ，サードアベニュー，ニューフロンティアズサイエンスパークサウス，スミスクラインビーチャムファーマシューティカルズ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性
を有するポリペプチド配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】配列番号２のポリペプチド配列を含む、請求項１に記載のポ
リペプチド。
【請求項３】配列番号２の単離されたポリペプチド。
【請求項４】配列番号２のポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有
するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリ
ヌクレオチド、または該単離されたポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチ
ド配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同
一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、または
該単離されたポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド配列からなるポリヌ
クレオチド。
【請求項６】以下の(a)〜(d)より選択される単離されたポリヌクレオチド
： (a) 配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリ
ヌクレオチド、 (b) 配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 (c) 配列番号１のポリヌクレオチド、および (d) ライブラリーを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、
配列番号１の配列またはその断片を有する標識化プローブを用いてスクリーニン
グすることにより得ることができるポリヌクレオチド、あるいは前記単離されたポリヌクレオチドと、その全長にわたって相補的なヌク
レオチド配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項７】発現系が適合性の宿主細胞内に存在する場合、請求項１に記
載のポリペプチドを産生する能力のあるポリヌクレオチドを含有する発現系。
【請求項８】請求項７に記載の発現系を含有する宿主細胞、または請求項
１に記載のポリペプチドを発現しているその細胞膜。
【請求項９】請求項１に記載のポリペプチドを産生させるのに十分な条件
下で、請求項８に記載の宿主細胞を培養し、この培養培地から該ポリペプチドを
回収するステップを含む、請求項１に記載のポリペプチドの生産方法。
【請求項１０】請求項１〜３のいずれか1項に記載のポリペプチドに対して免疫特異的な抗体。
【請求項１１】請求項１に記載のポリペプチドの機能を刺激または抑制す
る化合物を同定するためのスクリーニング法であって、 (a) 候補化合物と、該ポリペプチド（または該ポリペプチドを発現する細胞も
しくはその膜）あるいはその融合タンパク質との結合を、該候補化合物に直接ま
たは間接的に結合させた標識により測定すること、 (b) 候補化合物と、該ポリペプチド（または該ポリペプチドを発現する細胞も
しくはその膜）あるいはその融合タンパク質との結合を、標識化競合物質の存在
下で測定すること、 (c) 候補化合物が該ポリペプチドの活性化または抑制により産生されるシグナ
ルをもたらすか否かを、該ポリペプチドを発現する細胞または細胞膜に適した検
出系を用いて調べること、 (d) 候補化合物と、請求項１に記載のポリペプチドを含有する溶液とを一緒に
して混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプチドの活性を測定し、該混合物の
活性をスタンダードと比較すること、および (e) 候補化合物が細胞における該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよび該
ポリペプチドの産生に及ぼす作用を、ELISAアッセイなどを用いて検出すること、からなる群より選択される方法を含む、前記スクリーニング法。
【請求項１２】被験体において請求項１に記載のポリペプチドの発現また
は活性に関連した疾病または該疾病への罹りやすさを診断する方法であって、 (a) 該被験体のゲノム中の該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に突
然変異があるか否かを調べること、および／または (b) 該被験体から得られたサンプルにおいて該ポリペプチド発現の存在または
その量を分析すること、を含む、前記診断方法。
【請求項１３】以下の(a)〜(d)より選択される単離されたポリヌクレオチ
ド： (a) 配列番号３の全長にわたって配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有
するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、 (b) 配列番号３のポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド、 (c) 配列番号３のポリヌクレオチド、または (d) 配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５
％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離され
たポリヌクレオチド。
【請求項１４】以下の(a)〜(e)より選択されるポリペプチド： (a) 配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５
％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、 (b) アミノ酸配列が配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ酸配列と
少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド、 (c) 配列番号４のアミノ酸を含むポリペプチド、 (d) 配列番号４のポリペプチドであるポリペプチド、または (e) 配列番号３に含まれる配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポ
リペプチド。