JP2000095795A

JP2000095795A - プロテオグリカンのコアタンパク質のポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ

Info

Publication number: JP2000095795A
Application number: JP10283430A
Authority: JP
Inventors: Atsuhiko Ohira; 敦彦大平; Shigeki Higashiyama; 繁樹東山
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1998-09-18
Filing date: 1998-09-18
Publication date: 2000-04-04

Abstract

(57)【要約】【課題】脳から得られた新規なプロテオグリカン、そ
のアミノ酸配列これをコードするＤＮＡの提供。【解決手段】ラット脳、ヒト脳から得られるプロテオ
グリカン、このプロテオグリカンは分子量約 150kDで、
分子量約30kDのコンドロイチン硫酸鎖を有し、ノイラミ
ニダーゼ等により糖鎖が遊離する。リン酸化作用を有
し、上皮成長因子受容体をリン酸化するのでこの作用を
利用して試薬あるいは医薬として用いられる。このプロ
テオグリカンを構成する約 514乃至539 のアミノ酸及び
これをコードするＤＮＡ。このプロテオグリカンに結合
する抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なプロテオグ
リカンのコアタンパク質のポリペプチド及びそれをコー
ドするＤＮＡに関する。また、本発明は、該ポリペプチ
ドをコアタンパク質として有する新規なプロテオグリカ
ン、それに反応する抗体及び該プロテオグリカンからな
るリン酸化剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】プロテオグリカンは、グリコサミノグリ
カンが共有結合的にタンパク質（コアタンパク質）に結
合した化合物の総称である。近年、哺乳動物の脳の発生
過程で様々なプロテオグリカンが正確に調節されて発現
することが明らかにされるなど、プロテオグリカンが脳
中のいくつかの複雑な構造形成に関与していることが示
されている。しかしながら脳におけるプロテオグリカン
の多くがまだ未同定のままであり、その機能の詳細につ
いてもほとんど知られていない。例えばラット脳の膜結
合分画においては、少なくとも16種類のコアタンパク質
が存在することが報告されているが（Neuron 4, 949-96
1(1990))、その完全な一次構造が明らかにされているプ
ロテオグリカンはわずか３種類（NG2 (J.Cell Biol.11
4,359-371(1991)) 、グリピカン(glypican)(Biochem.Bi
opys.Res.Commun.188,395-401(1992)) およびセレブロ
グリカン(cerebroglycan)(J.Cell Biol.124,149-160(19
94))にすぎない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】これらの従来技術から
みて、脳に存在する新規なプロテオグリカン、そのコア
タンパク質及びそれをコードするＤＮＡ等が解明され、
これらを提供することができれば、脳研究の進展をもた
らし、脳疾患の新規な診断方法の確立、脳疾患の新規な
治療方法・予防方法の開発等が期待される。本発明者ら
は、これらのことに基づいて研究を重ねた結果、新規な
プロテオグリカン、そのコア蛋白質、それをコードする
ＤＮＡ、このプロテオグリカンに結合する抗体及びこの
プロテオグリカンの用途を見出した。従って本発明が解
決しようとする課題は、新規なプロテオグリカンのコア
タンパク質及びそれをコードするＤＮＡ、並びに該コア
タンパク質を有する新規なプロテオグリカン、それに結
合する抗体及び該プロテオグリカンの用途を提供するこ
とである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、新規なプロテオ
グリカンのコアタンパク質のポリペプチド及びそれをコ
ードするＤＮＡ、並びに該ポリペプチドをコアタンパク
質として有する新規なプロテオグリカン、それに結合す
る抗体及び該プロテオグリカンを有効成分とするリン酸
化剤を見出し、本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は、配列表配列番号２の
アミノ酸番号１〜514 で示されるアミノ酸配列を含むポ
リペプチド（以下「本発明ポリペプチド１」という）及
び配列番号４のアミノ酸番号31〜539 で示されるアミノ
酸配列を含むポリペプチド（以下「本発明ポリペプチド
２」という）に関する。なお、以下本発明ポリペプチド
１と本発明ポリペプチド２をまとめて「本発明ポリペプ
チド」という。また本発明は、本発明ポリペプチド１又
は本発明ポリペプチド２をコードするＤＮＡ（以下、本
発明ポリペプチド１をコードするＤＮＡを「本発明ＤＮ
Ａ１」、本発明ポリペプチド２をコードするＤＮＡを
「本発明ＤＮＡ２」、これらをまとめて「本発明ＤＮ
Ａ」という）に関する。また、本発明は、本発明ポリペ
プチドをコアタンパク質として有するプロテオグリカン
に関する。本発明のプロテオグリカンは、次の性質を示
す。 (1) 分子量約 150キロダルトン（還元条件下におけるド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により測定）。 (2) 請求項１又は２記載のポリペプチドをコアタンパク
質として有する。 (3) 分子量約30キロダルトンのコンドロイチン硫酸鎖を
含有する。（以下、本発明ポリペプチド１をコアタンパ
ク質として有するプロテオグリカンを「本発明プロテオ
グリカン１」、本発明ポリペプチド２をコアタンパク質
として有するプロテオグリカンを「本発明プロテオグリ
カン２」、これらをまとめて「本発明プロテオグリカ
ン」という）また、本発明は、本発明プロテオグリカンに結合する抗
体（以下「本発明抗体」という）に関する。さらに、本
発明は、本発明プロテオグリカンを有効成分とする上皮
成長因子受容体のリン酸化剤（以下「本発明リン酸化
剤」という）に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】次に、本発明について具体的に説
明する。１．本発明ポリペプチド (1) 本発明ポリペプチド１本発明ポリペプチド１は、ラットの脳において初めて見
出された。このポリペプチド１は、配列表配列番号２の
アミノ酸番号１〜514 で示されるアミノ酸配列を含むポ
リペプチドである。本発明ポリペプチド１は、配列表配
列番号２のアミノ酸番号１〜514 で示されるアミノ酸配
列を含む限りにおいて特に限定されず、例えば配列番号
２のアミノ酸番号−30〜514 で示されるアミノ酸配列
や、配列番号２のアミノ酸番号１〜514 で示されるアミ
ノ酸配列からなるポリペプチド等が包含される。これら
の中でも、配列番号２のアミノ酸番号１〜514 で示され
るアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。

【０００７】本発明ポリペプチド１は、そのアミノ酸配
列が本発明により開示されたので、その配列に基づいて
ペプチド合成等の化学的手法によって製造することも可
能である。また、後述の本発明ＤＮＡ１を用いて遺伝子
工学的手法により製造することも可能である。さらに後
述の本発明プロテオグリカン１に結合している糖鎖を除
去することにより製造することも可能である。これらの
なかでも、本発明ＤＮＡ１を用いた遺伝子工学的手法に
より製造する方法や、後述の本発明プロテオグリカン１
に結合している糖鎖を除去することにより製造する方法
が好ましく、特に本発明ＤＮＡ１を用いた遺伝子工学的
手法により製造する方法が、大量生産が可能であること
からも好ましい。これらの製造方法については後述す
る。なお本発明ポリペプチド１は、もともとはラット由
来であるが、その由来は限定されず化学的手法や遺伝子
工学的手法により製造されたポリペプチドも当然に包含
される。

【０００８】(2) 本発明ポリペプチド２本発明ポリペプチド２は、遺伝子工学的手法による探索
の結果、ヒトに存在することが明らかにされたポリペプ
チドであり、配列表配列番号４のアミノ酸番号31〜539
で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。本
発明ポリペプチド２は、配列表配列番号４のアミノ酸番
号31〜539 で示されるアミノ酸配列を含む限りにおいて
特に限定されず、例えば配列番号４のアミノ酸番号１〜
539 で示されるアミノ酸配列や、配列番号４のアミノ酸
番号31〜539で示されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チド等が包含される。これらの中でも、配列番号４のア
ミノ酸番号31〜539 で示されるアミノ酸配列からなるポ
リペプチドが好ましい。

【０００９】本発明ポリペプチド２は、そのアミノ酸配
列が本発明により開示されたので、その配列に基づいて
ペプチド合成等の化学的手法によって製造することも可
能である。また、後述の本発明ＤＮＡ２を用いて遺伝子
工学的手法により製造することも可能である。また、後
述の本発明プロテオグリカン２に結合している糖鎖を除
去することにより製造することも可能である。特に本発
明ＤＮＡ２を用いた遺伝子工学的手法により製造する方
法が、大量生産が可能であることからも好ましい。この
方法については後述する。なお本発明ポリペプチド２
は、もともとはヒト由来であるが、その由来は限定され
ず化学的手法や遺伝子工学的手法により製造されたポリ
ペプチドも当然に包含される。

【００１０】天然に存在するポリペプチドにはそれをコ
ードする遺伝子の多形や変異の他、生成後のポリペプチ
ドの生体内および精製中の修飾反応などによってそのア
ミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の
変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しな
いポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を
示すものがあることが知られている。このように構造的
に若干の差違があってもその機能については大きな違い
が認められないものも本発明ポリペプチドに包含され
る。

【００１１】人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上
記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合
にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能であ
る。例えば、ヒトインターロイキン2(IL−2)のアミノ酸
配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリ
ペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知
られている［サイエンス（Science)、第 224巻、1431頁
(1984)〕。また、ある種のポリペプチドは、活性には必
須でないペプチド領域を有していることが知られてい
る。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在す
るシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見ら
れるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほと
んどは翻訳後、または活性型ポリペプチドへの転換に際
して除去される。このようなポリペプチドは、一次構造
上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機
能を有するポリペプチドであり、このようなポリペプチ
ドも本発明ポリペプチドに包含される。

【００１２】本発明ポリペプチドの製造方法の一例とし
て、遺伝子工学的手法により製造する方法および、本発
明プロテオグリカンから製造する方法について説明す
る。遺伝子工学的手法により製造する方法：本発明ＤＮ
Ａを移入した細胞を、好適な培地で培養し、本発明ポリ
ペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物から本
発明ポリペプチドを採取することによって、本発明ポリ
ペプチドを製造することができる。

【００１３】本発明ＤＮＡを移入した細胞は、公知の発
現ベクターに本発明ＤＮＡを挿入して組換えプラスミド
を構築し、この組換えプラスミドを細胞に移入すること
によって得ることができる。細胞としては大腸菌等の原
核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞が例示される。この
製造方法においては、タンパク質の製造に通常用いられ
る宿主−ベクター系を使用することができる。培地や培
養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜選択
される。ここで本発明ＤＮＡは直接発現させてもよい
し、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現
させてもよい。また本発明ＤＮＡは全長を発現させても
よいし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。

【００１４】培養物からの本発明ポリペプチドの採取
は、公知のポリペプチドの抽出、精製方法によって行う
ことができる。なお培養物には、培地および当該培地中
の細胞が包含される。本発明ポリペプチドの抽出方法と
して具体的には、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、
音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕に
よる抽出、あるいは界面活性剤抽出、またはこれらの組
合わせ等の処理操作が挙げられる。抽出液からの本発明
ポリペプチドの精製方法も特に限定されず、例えば硫酸
アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、
遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグ
ラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル
浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー若しくは電気泳動法又はこれらの組み合わせ等の
処理操作が例示される。

【００１５】本発明プロテオグリカンから製造する
方法：本発明プロテオグリカンに結合している糖鎖を除
去することにより、本発明ポリペプチドを製造すること
も可能である。具体的には後述の方法で本発明プロテオ
グリカンを調製し、これにコンドロイチナーゼを作用さ
せることによって、本発明ポリペプチドを製造すること
ができる。用いるコンドロイチナーゼは特に限定され
ず、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡ
ＣI、コンドロイチナーゼＡＣII若しくはコンドロイチ
ナーゼＢ又はこれらの組合わせ等が例示されるが、コン
ドロイチナーゼＡＢＣを用いることが好ましい。

【００１６】なお、糖鎖の除去をより完全にするため、
コンドロイチナーゼを作用させることにより得られる本
発明ポリペプチドに、さらにヘパリチナーゼを作用させ
ることが好ましい。また、糖鎖の除去をさらに完全にす
るため、コンドロイチナーゼおよびヘパリチナーゼを作
用させることにより得られる本発明ポリペプチドに、さ
らにノイラミニダーゼ、Ｎ−グリコシダーゼ及びＯ−グ
リコシダーゼを作用させることが好ましい。これらの酵
素を本発明プロテオグリカンに作用させる際の条件は特
に限定されず、当業者が適宜決定することができるが、
用いる酵素の至適ｐＨ及び至適温度条件であることが好
ましい。

【００１７】このようにして得られた本発明ポリペプチ
ドの精製方法も特に限定されず、例えば硫酸アンモニウ
ム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、
透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆
相クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー若しく
は電気泳動法又はこれらの組み合わせ等の処理操作が例
示される。

【００１８】２．本発明ＤＮＡ (1) 本発明ＤＮＡ１本発明ＤＮＡ１は、本発明ポリペプチド１をコードする
ＤＮＡであり、より詳細には配列番号２のアミノ酸番号
１〜514 で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードするＤＮＡである。本発明ＤＮＡ１は、配列番号
２のアミノ酸番号１〜514 で示されるアミノ酸配列を含
むポリペプチドをコードする限りにおいて特に限定され
ず、例えば配列番号２のアミノ酸番号−30〜514 で示さ
れるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤ
ＮＡや、配列番号２のアミノ酸番号１〜514 で示される
アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ
等が包含される。これらの中でも、配列番号２のアミノ
酸番号１〜514 で示されるアミノ酸配列からなるポリペ
プチドをコードするＤＮＡが好ましい。このようなＤＮ
Ａとして具体的には、例えば配列番号１の塩基番号１〜
1632で示されるＤＮＡや、配列番号１の塩基番号91〜16
32で示されるＤＮＡ等が例示されるが、これらのなかで
も配列番号１の塩基番号91〜1632で示されるＤＮＡが好
ましい。

【００１９】本発明ＤＮＡ１は、その塩基配列が本発明
により開示されたので、その配列に基づいてＤＮＡを合
成し、あるいはその配列に基づいて作成したオリゴヌク
レオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・
チェイン・リアクション法）によって染色体ＤＮＡある
いはｍＲＮＡから本発明ＤＮＡ１を増幅することによっ
て取得することも可能である。

【００２０】本発明ＤＮＡ１は、実施例に示すように、
以下の各工程からなるｃＤＮＡクローニングにより初め
て得られたものであり、このような方法で製造すること
も可能である。ラットの全脳から得られるポリ(A) ⁺ＲＮＡを鋳型と
し、ランダムプライマーを用いることによってｃＤＮＡ
ライブラリーを作製する。ラットの全脳から得られるポリ(A) ⁺ＲＮＡを鋳型と
し、オリゴ(dT)プライマーを用いることによってｃＤＮ
Ａライブラリーを作製する。上記それぞれのｃＤＮＡライブラリーのプラーク
を、後述する本発明抗体を用いて免疫学的にスクリーニ
ングすることにより本発明ＤＮＡ１を取得する。得られた本発明ＤＮＡ１の塩基配列を解析する。なお本発明ＤＮＡ１は、もともとはラット由来である
が、その由来は限定されず、上記のように化学合成や遺
伝子工学的手法により製造されたＤＮＡも当然に包含さ
れる。

【００２１】(2) 本発明ＤＮＡ２本発明ＤＮＡ２は、本発明ポリペプチド２をコードする
ＤＮＡであり、より詳細には配列表配列番号４のアミノ
酸番号31〜539 で示されるアミノ酸配列を含むポリペプ
チドをコードするＤＮＡである。本発明ＤＮＡ２は、配
列番号４のアミノ酸番号31〜539 で示されるアミノ酸配
列を含むポリペプチドをコードする限りにおいて特に限
定されず、例えば配列番号４のアミノ酸番号１〜539 で
示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードす
るＤＮＡや、配列番号４のアミノ酸番号31〜539 で示さ
れるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ等が包含される。これらの中でも、配列番号４のア
ミノ酸番号31〜539 で示されるアミノ酸配列からなるポ
リペプチドをコードするＤＮＡが好ましい。このような
ＤＮＡとして具体的には、例えば配列番号３の塩基番号
１〜1617で示されるＤＮＡや、配列番号３の塩基番号91
〜1617で示されるＤＮＡ等が例示されるが、これらのな
かでも配列番号３の塩基番号91〜1617で示されるＤＮＡ
が好ましい。

【００２２】本発明ＤＮＡ２は、その塩基配列が本発明
により開示されたので、その配列に基づいて合成し、あ
るいはその配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチド
プライマーを用いる PCR法（ポリメラーゼ・チェイン・
リアクション法）によって染色体ＤＮＡあるいはｍＲＮ
Ａから本発明ＤＮＡ２を増幅することによって取得する
ことも可能である。

【００２３】本発明ＤＮＡ２は、実施例に示すように、
以下の各工程からなるｃＤＮＡクローニングにより初め
て得られたものであり、このような方法で製造すること
も可能である。本発明ＤＮＡ１を用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー
から本発明ＤＮＡ２をスクリーニングすることによって
本発明ＤＮＡ２を取得する。得られた本発明ＤＮＡ２の塩基配列を解析する。なお本発明ＤＮＡ２は、もともとはヒト由来であるが、
その由来は限定されず、上記のように化学合成や遺伝子
工学的手法により製造されたＤＮＡも当然に包含され
る。

【００２４】なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基
配列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されること
は、当業者であれば容易に理解されるところである。ま
た本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又
はＲＮＡも包含される。さらに本発明ＤＮＡは、本発明
ポリペプチドをコードするコード鎖のみの一本鎖であっ
てもよく、この一本鎖およびこれと相補的な塩基配列を
有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖からなる二本鎖であって
もよい。なお染色体由来の本発明ポリペプチドの遺伝子
は、コード領域にイントロンを含むことが予想される
が、そのようなイントロンで分断されているＤＮＡ断片
であっても、本発明ポリペプチドをコードする限り、本
発明ＤＮＡに包含される。すなわち、本明細書において
「コードする」とは、転写時にプロセッシング等を受け
て最終的に目的のポリペプチドを発現し得る塩基配列を
有することも包含する。

【００２５】なお前記１．で述べた通り、本発明ポリペ
プチドとは構造的に若干の差違があっても、その機能に
ついては大きな違いが認められないようなポリペプチド
も本発明ポリペプチドに包含される。本発明ＤＮＡも同
様に、本発明ポリペプチドとは構造的に若干の差違があ
っても、その機能については大きな違いが認められない
ようなポリペプチドをコードするＤＮＡも、本発明ＤＮ
Ａに包含される。具体的には、ＤＮＡの多形や変異等に
よって本発明ＤＮＡとは構造的に若干の差違があるが、
本発明ポリペプチドとほぼ同等の機能を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡが挙げられる。

【００２６】３．本発明プロテオグリカン本発明プロテオグリカンは、本発明ポリペプチド１また
は本発明ポリペプチド２をコアタンパク質として有する
プロテオグリカンである。本発明プロテオグリカンは、
そのコアタンパク質に最も特徴があり、従って本発明ポ
リペプチド１または本発明ポリペプチド２をコアタンパ
ク質として有する限りにおいて特に限定されないが、さ
らに下記の性質を有するものが好ましい。 (1) 分子量約 150キロダルトン（還元条件下におけるド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により測定）。 (2) 分子量約30キロダルトンのコンドロイチン硫酸鎖を
含有する。 (3) ノイラミニダーゼ、O-グリコシダーゼまたはＮ−グ
リコシダーゼを作用させると糖鎖が遊離する。 (4) 上皮成長因子受容体をリン酸化する活性を有する。

【００２７】本発明プロテオグリカンは、そのコアタン
パク質の構造（本発明ポリペプチド）およびその他の性
質が開示されたので、例えば本発明ポリペプチドを製造
し、当該ポリペプチドに糖鎖を共有結合させることによ
って本発明プロテオグリカンを製造することも可能であ
る。

【００２８】本発明プロテオグリカンは、実施例に示す
ように、次の各工程からなる天然物からのプロテオグリ
カンの抽出、分離・精製により初めて得られたものであ
り、このような方法で製造することも可能である。ラットの脳をホモジナイズし、抽出物を得る工程。の抽出物から不溶性画分を分離する工程。上記不溶性画分を界面活性剤存在下でホモジナイズ
し、抽出物を得る工程。の抽出物から可溶性画分を分離する工程。上記可溶性画分から、本発明プロテオグリカンを精
製する工程。なお、上記一連の工程は緩衝液中で行われることが好ま
しい。

【００２９】また本発明プロテオグリカンの分解等を極
力防止するために、当該緩衝液中にはタンパク質分解酵
素阻害剤（例えばフェニルメチルスルフォニルフルオラ
イド等）、金属キレート剤（例えばエチレンジアミン四
酢酸(EDTA)等）及び還元剤（例えばＮ−エチルマレイミ
ド等）等を適宜添加しておくことが好ましい。上記お
よびにおける分離の操作は、不溶性画分と可溶性画分
を分離できる操作である限りにおいて特に限定されず、
例えば遠心分離法等が例示される。

【００３０】上記の工程において用いることができる
界面活性剤は特に限定されないが、本発明プロテオグリ
カンに対する直接作用の少ない非イオン性界面活性剤を
用いることが好ましい。このような非イオン性界面活性
剤としては、例えばトリトン系界面活性剤（ノニデット
P-40(商品名）等）等が例示される。上記の工程にお
いて用いることができる精製手法も特に限定されず、例
えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等によ
る塩析、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマ
トグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲ
ル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー若しくは電気泳動又はこれらの組み合わせ等の
処理操作が例示される。

【００３１】上記の工程の一例を示すと以下の通りで
ある。 −１：上記で得られた可溶性画分を陰イオン交換樹
脂と接触させ、次いで該樹脂を洗浄し、次いで該樹脂に
塩の濃度勾配を負荷して溶出された本発明プロテオグリ
カンを含む画分を回収する。 −２：−１で得られた本発明プロテオグリカンを含
む画分をゲル濾過クロマトグラフィーに付し、溶出され
た本発明プロテオグリカンを含む画分を回収する。 −３：−２で得られた本発明プロテオグリカンを含
む画分にエタノールを添加し、沈殿物（本発明プロテオ
グリカンを含有する）を得る。

【００３２】−４：−３で得られた沈殿物を緩衝液
で溶解し、これを疎水性クロマトグラフィーに付し、界
面活性剤の濃度勾配を負荷して、溶出された本発明プロ
テオグリカンを含む画分を回収する。 −５：−４で得られた本発明プロテオグリカンを含
む画分にエタノールを添加し、沈殿物（本発明プロテオ
グリカンを含有する）を得る。 −６：−５で得られた沈殿物を緩衝液で溶解し、こ
れを塩化セシウム(CsCl)密度勾配遠心に付して、精製さ
れた本発明プロテオグリカンを得る。

【００３３】このようにして得られる本発明プロテオグ
リカンは、前記した通りそのコアタンパク質（本発明ポ
リペプチド）に特徴があり、また下記の性質も有するこ
とから、これらの特性を指標として本発明プロテオグリ
カンの各精製工程における精製度を評価することができ
る。 (1) 分子量約 150キロダルトン（還元条件下におけるド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により測定）。 (2) 分子量約３０キロダルトンのコンドロイチン硫酸鎖
を含有する。 (3) ノイラミニダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼまたはＮ−
グリコシダーゼを作用させると糖鎖が遊離する。 (4) 上皮成長因子受容体をリン酸化する活性を有する。

【００３４】４．本発明抗体本発明抗体は、本発明プロテオグリカンに結合する抗体
である。本発明抗体は、本発明プロテオグリカンに結合
する限りにおいて特に限定されないが、本発明プロテオ
グリカン及び／又は本発明ポリペプチドに特異的に結合
する抗体であることがより好ましい。本発明プロテオグ
リカン及び本発明ポリペプチドは、そのアミノ酸配列に
特徴がある新規な物質である。この物質を抗原として用
い、通常の抗体の製法に従って本発明抗体を製造するこ
とができる。本発明抗体はポリクローナル、モノクロー
ナルのいずれであってもよい。

【００３５】以下にポリクローナルな本発明抗体及びモ
ノクローナルな本発明抗体の製造方法について説明す
る。ポリクローナルな本発明抗体の製造方法：本発明プ
ロテオグリカン又は本発明ポリペプチドを、マウス、ラ
ット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動
物の皮下または腹腔内に投与する。被免疫動物を免疫す
る際に、補助剤（アジュバント）を併用することは、抗
体産生細胞を賦活するので望ましい。また初回免疫後、
２〜３週目に常法によって追加免疫を行うと力価の高い
抗血清が得られる。最終免疫から約１週間後に血液を採
取し、血清を分離する。この血清を熱処理して補体を失
活させた後、通常の抗体の精製方法によってイムノグロ
ブリン画分を精製してもよい。

【００３６】モノクローナルな本発明抗体の製造方
法：モノクローナルな本発明抗体は、KohlerとMilstein
の方法（Nature 256,495-497(1975)）によって行うこと
ができる。例えば本発明プロテオグリカンをマウス、ラ
ット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動
物の腹腔内、皮下、足蹠(footpad）等に投与する。被免
疫動物から脾臓細胞、リンパ細胞、末梢血液等を採取
し、これらと腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞
融合させてハイブリドーマを調製する。なお細胞融合に
用いるミエローマ細胞は、種々の哺乳動物の細胞株を利
用することができるが、被免疫動物と同種の動物の細胞
株を用いることが好ましい。またミエローマ細胞は、細
胞融合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるよう
にするために、未融合のミエローマ細胞が生存できずハ
イブリドーマだけが増殖できるように、マーカーを有す
るものを用いることが好ましい。またミエローマ細胞
は、固有のイムノグロブリンを分泌しない株を使用する
ことが、ハイブリドーマの培養上清から目的の抗体を取
得することが容易となる点で好ましい。

【００３７】得られたハイブリドーマを連続増殖させ、
本発明プロテオグリカンまたは本発明ポリペプチドに対
して特異的に結合する抗体を継続的に産生するハイブリ
ドーマ株を選別する。こうして選別されたハイブリドー
マ株を好適な培地で培養することによって、培地中にモ
ノクローナルな本発明抗体が得られる。なお、マウスの
腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマ株を培養する
ことによって、モノクローナルな本発明抗体を大量に製
造することもできる。このようにして得られたモノクロ
ーナルな本発明抗体は、通常の抗体の精製方法によって
精製してもよい。

【００３８】抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、
硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿、
およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択
的沈殿分別法、電気泳動法、DEAE (ジエチルアミノエチ
ル）誘導体、CM (カルボキシメチル）誘導体等のイオン
交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテ
インＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロ
マトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラ
フィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過法および超遠心法等を挙げることができ
る。

【００３９】なお本発明抗体を、抗原結合部位(Fab) を
分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシ
ン、パパイン等）で処理して、Fab を含むフラグメント
としても良い。また本発明抗体をコードする遺伝子の塩
基配列もしくは本発明抗体のアミノ酸配列が決定されれ
ば、遺伝子工学的に本発明抗体のFab を含むフラグメン
トやキメラ抗体（例えば本発明抗体のFab 部分を含むキ
メラ抗体等）を作製することもできる。このような本発
明抗体のFab を含むフラグメントやキメラ抗体も、本発
明抗体に包含される。

【００４０】５．本発明リン酸化剤本発明リン酸化剤は、本発明プロテオグリカンを有効成
分とする上皮成長因子(EGF) 受容体のリン酸化剤であ
る。本発明リン酸化剤は、本発明プロテオグリカンの特
徴的な性質の１つであるEGF 受容体のリン酸化作用を、
リン酸化剤として応用したものである。なお本発明リン
酸化剤は、本発明プロテオグリカンを有効成分とする限
りにおいて、その提供形態は特に限定されない。例えば
本発明プロテオグリカン自体をそのまま本発明リン酸化
剤として提供しても良く、さらに本発明プロテオグリカ
ンのリン酸化作用を実質的に害さない限り他の成分を含
有せしめた形態で提供してもよい。このような他の成分
としては、通常の試薬または医薬の調製に用いられる賦
形剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を例示することがで
きる。また本発明リン酸化剤は、液体、凍結状態、乾燥
状態（例えば凍結乾燥状態）のいずれの形態であっても
よい。

【００４１】リン酸化されるEGF 受容体は、EGF の受容
体としての機能を有する物質である限りにおいて特に限
定されない。またEGF 受容体と共通する構造および機能
を有する物質であってもよい。このような物質として
は、例えば ErbB 等が例示される。また、本発明リン酸
化剤によってリン酸化される際のEGF 受容体の形態も特
に限定されず、遊離の形態、細胞膜に結合している形態
等が例示される。例えば、EGF 受容体は、皮膚の細胞以
外の多くの細胞の表面に存在していることが知られてお
り、このような細胞に本発明リン酸化剤を直接作用させ
て、EGF 受容体をリン酸化させることができる。EGF 受
容体は、通常、EGF と結合することにより自らリン酸さ
れ、活性化（チロシンキナーゼ活性の発現）されること
が知られている。本発明リン酸化剤は、EGFと同様に EG
F受容体をリン酸化する作用を有するものであり、この
作用を利用して EGFと同様に創傷治療、角膜障害治療、
火傷治療、抗腫瘍等の医薬用途への応用も期待される。
また本発明リン酸化剤は、試薬として利用することもで
きる。

【００４２】

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はこの実施例に何等制限されるもの
ではない。

【実施例１】本発明プロテオグリカンの抽出及び精製 10日齢スプラグ−ドウリー(Sprague-Dawley)ラットの脳
(Slc: SD系統；SLC(株）製）を、プロテアーゼ阻害剤と
して2mM のフェニルメチルスルフォニルフルオライド、
20mMのEDTA及び10mMのN-エチルマレイミドを含む、氷冷
したリン酸緩衝生理食塩水(phosphate-buffered salin
e；PBS)中でテフロングラスホモジナイザーを用いてホ
モジナイズした。ホモジナイズおよびそれに続く工程
は、特に示さない限り全て４℃で行なった。ホモジネー
トは27,000xgで40分間遠心した。沈澱物を同じ溶液で再
度ホモジナイズした。遠心後、PBS に不溶性の物質を前
記プロテアーゼ阻害剤と１％ノニデット(Nonidet) P-40
を含むPBS 中で、０℃においてホモジナイズした。ホモ
ジネートをマグネチックスターラーで60分間攪拌し、次
に27,000xgで40分間遠心した。上清は保存し、沈澱物を
再度界面活性剤含有緩衝液で処理し遠心した。遠心後、
これらの界面活性剤含有上清を合わせて凍結乾燥した。

【００４３】得られた凍結乾燥物を、0.2 ％ノニデット
P-40、0.1M NaCl 、2mM EDTA、1mMN-エチルマレイミド
及び 0.2mMフェニルメチルスルフォニルフルオライドを
含む4M尿素、50mMトリス塩酸緩衝液、pH7.5(尿素緩衝
液）中に分散した。この分散液を、同じ緩衝液を用いて
透析した。27,000xgで30分間遠心後、上清を尿素緩衝液
で平衡化した DEAE-セファセル樹脂（ファルマシア社
製）と混合し、混合物をマグネチックスターラーで２時
間攪拌した。この DEAE-セファセル樹脂を6,500xg、10
分間の遠心によって回収し、尿素緩衝液で２回洗浄し
た。この樹脂をガラスカラムに詰め、この樹脂から、0.
1M〜0.7MのNaClを含む尿素緩衝液での直線濃度勾配によ
ってプロテオグリカンを溶出した。

【００４４】プロテオグリカン画分（0.45から0.68M の
NaCl濃度で溶出）を集め、ダイアフローYM-10 メンブラ
ン（アミコン（株）製）を使って5ml に濃縮した。濃縮
した溶液を、0.2 ％ノニデットP-40と前記プロテアーゼ
インヒビターとを含む4Mグアニジン塩酸、50mMトリス塩
酸(pH7.5) を用いてセファロース CL-4B (ファルマシア
社製）のカラム（直径 1.6cm×100cm)でクロマトグラフ
ィーを行った。プロテオグリカン画分（Kav 0.11から0.
65）を集め、ダイアフローYM-10 メンブランを用いて3m
l に濃縮した。プロテオグリカンを、1.3 ％(W/V) 酢酸
カリウムを含む３倍容の95％エタノールを添加して溶液
から沈澱させた。沈澱物を０℃下、１％(W/V) 酢酸カリ
ウムを含む75％エタノールで２回洗浄し、減圧下で乾燥
した。

【００４５】得られた乾燥物を室温で4Mグアニジン塩
酸、50mMトリス塩酸、pH7.5(グアニジン塩酸緩衝液) 10
ml中に溶解した。この溶液をオクチルセファロース（フ
ァルマシア社製）のカラム（直径1.6cm 径×5.0cm)に負
荷した。ノニデットP-40を０％から0.8 ％(V/V) 含むグ
アニジン塩酸緩衝液で直線濃度勾配によって溶出を行っ
た。0.3 ％から0.6 ％のノニデットP-40濃度で溶出した
画分を集め、集めた画分中のプロテオグリカンをエタノ
ールで沈澱し、上記と同様に乾燥した。

【００４６】さらに、得られたプロテオグリカンを、初
期密度1.38g/ml(4M グアニジン塩酸、50mMトリス塩酸、
pH7.5)のCsCl密度勾配によってRPS-65T ローター（日立
製）を用いて10℃で150,000xg で30時間超遠心すること
によって精製した。遠心後、遠心管の底に小さな穴を開
け、1/7 容量ずつ試験管に分取して７つの分画を得た。
分画番号２から６の試料を集め、４℃でPBS に対して
透析を行った。プロテオグリカン溶液中のヘキスロン酸
(hexuronate)とタンパク質の含量を Bitter and Muir法
（Anal. Biochem. 4, 330-334 (1962)）及びタンパク質
分析キット(Bio-Rad社製）によってそれぞれ測定した。
この精製方法によって、 100個の脳からヘキスロン酸含
量約３マイクロモル（蛋白質含量 2.2mg）のプロテオグ
リカン（本発明プロテオグリカン１）を得た。

【００４７】

【実施例２】本発明プロテオグリカンの性質 (1) 分子量および含有糖鎖実施例１で得られた本発明プロテオグリカン１を、６％
分離ゲルと３％スタッキングゲルを用いてジチオスレイ
トールでの還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し
た。その結果、約 150キロダルトンの分子量付近にバン
ドが検出された。従って本発明プロテオグリカン１は、
約 150キロダルトンの分子量（還元条件下におけるSDS-
PAGEによる測定）を有することが示された。

【００４８】また、実施例１で得られたプロテオグリカ
ンをコンドロイチナーゼ ABCで消化し、６％分離ゲルと
３％スタッキングゲルを用いてジチオスレイトールでの
還元条件下でSDS-PAGEによって分離した。その結果約12
0kDa付近にバンドが検出された。

【００４９】このバンドをPVDF (ポリビニリデンジフル
オリド) 膜 (イモビロン；ミリポア社製) に転写して、
後述のモノクローナル抗体 C1, C3, C5 及び C15を用い
たウエスタンブロットを行った結果、いずれの抗体によ
っても認識された。従って、本発明プロテオグリカン１
は分子量約30キロダルトン（還元条件下におけるSDS-PA
GEによる測定）のコンドロイチン硫酸鎖を含有している
ことが示された。

【００５０】また、実施例１で得られたプロテオグリカ
ンを、プロテアーゼの含まれていないコンドロイチナー
ゼ ABC (EC4.2.2.4 ；生化学工業株式会社製）で消化
し、次にヘパリチーゼＩ(heparitinase I)（EC4.2.2.8
；生化学工業株式会社製）で消化した（Neuroscience
60, 145-157(1994)）。得られたコアタンパク質（コア
グリコプロテイン）を、続いて2mM EDTA、1mM N-エチル
マレイミド、0.2 mMフェニルメチルスルフォニルフルオ
ライド及び0.07mMペプスタチンを含む50mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液、pH5.0 100μｌ中でノイラミニダーゼ 2ml U
(EC 3.2.1.18 ；ナカライテスク社製）で37℃、１時間
処理した。酵素反応を０℃下、1.3 ％酢酸カリウムを含
む95％エタノール 300μｌの添加によって停止させた。
１時間後コアグリコプロテインを遠心によって沈澱させ
た。コアグリコプロテインを変性後さらに１IU N- グリ
コシダーゼ F（EC 3.2.2.18 ；ベーリンガーマンハイム
社製）または１m IUのO-グリコシダーゼ（EC 3.2.1.97
；ベーリンガーマンハイム社製）を用いて37℃で24時
間消化することによって脱グリコシレーションした。

【００５１】それぞれのグリコシダーゼによる処理は、
SDS-PAGE上でのコアグリコプロテインのバンドの移動度
の増加をひきおこした。このことから、本発明プロテオ
グリカン１はノイラミニダーゼ、O-グリコシダーゼまた
はN-グリコシダーゼにより糖鎖が遊離することが示唆さ
れた。

【００５２】(2) 本発明プロテオグリカンのコアタンパ
ク質のアミノ酸配列後述の実施例３において説明する。 (3) 本発明プロテオグリカンによるEGF 受容体のリン酸
化 EGF 受容体（受容体型チロシンキナーゼ；ErbB2)に、本
発明プロテオグリカン１又はNTAKα(EGFファミリーの一
員である）を作用させて、ErbB2 のリン酸化を検出し
た。具体的には以下の手法で行った。ヒト乳癌細胞株MD
A-MB-453細胞（ErbB2 を発現している) に、以下に示す
検体を添加し、37℃で12分間培養後、細胞を可溶化溶液
(0.1％ Triton-X 、1mM オルトバナジン酸(orthovanada
te) 、1mM フッ化ナトリウム、100 μM ピロリン酸ナト
リウム、1mM EDTA、１μg/mL アプロチニン及び 100μ
M 3,4-ジクロロイソクマリンを含有する溶液) で可溶化
した。次いでこの可溶化画分に抗 ErbB2抗体を作用させ
て免疫沈降させ、この沈降物（ErbB2 が含有されてい
る）を抗リン酸化チロシン抗体を用いたウェスタンブロ
ット法により解析した。

【００５３】検体：本発明ＤＮＡ１を導入したＣＨＯ細胞の培養上清
（本発明プロテオグリカンを含有する）ラットNTAKαのｃＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞の培
養上清（ラットNTAKαを含有する）ラットNTAKαのｃＤＮＡを大腸菌に導入し、発現さ
れたラットNTAKαを精製したものコントロールベクターを導入したＣＨＯ細胞の培養
上清（コントロール）なお検体、及びはそれぞれ、本発明ＤＮＡ１を組
み込んだ pCINeo プラスミド、ラットNTAKαのｃＤＮＡ
を組み込んだpRc/CMV プラスミド、及び本発明ＤＮＡ１
を組み込んでいない pCINeo プラスミドを各々20μg ず
つ、リン酸カルシウム法によってＣＨＯ細胞に遺伝子導
入し、これらのＣＨＯ細胞を37℃で３日間培養して得た
培養上清である。また検体は、ラットNTAKαの細胞外
ドメインをコードするｃＤＮＡを、PinPoint Xa-1 ベク
ターに挿入した形で大腸菌DH5a株に遺伝子導入し、培養
後の菌体抽出液をヘパリンセファロースカラム及びC4逆
相カラムに付することによって得た、精製ラットNTAKα
である。

【００５４】結果を以下に示す。なお結果においては、
ウェスタンブロットにより検出されたシグナルの強度を
下記５段階で評価した結果を表示した。 −（シグナルは全く検出されなかった） ±（ごく僅かにシグナルが検出された）＋（弱いシグナルが検出された）＋＋（中程度のシグナルが検出された）＋＋＋（強いシグナルが検出された）

【００５５】結果：検体：＋＋＋検体：＋＋＋検体：＋＋＋検体：± この結果から、本発明プロテオグリカン１は、EGF と同
様にEGF 受容体をリン酸化する活性を有することが確認
された。

【００５６】

【実施例３】本発明ＤＮＡ及び本発明ポリペプチド (1)1) 本発明ＤＮＡ１のクローニング 18日齢（P18)スプラグ−ドウリー(Sprague-Dawley)ラッ
トの全脳から得られるポリ(A) ⁺ＲＮＡを鋳型として用
い、ランダムプライマーを用いてλgt11ｃＤＮＡライブ
ラリーを構築した。また８日齢（P8) スプラグ−ドウリ
ーラットの全脳から得られるポリ(A) ⁺ＲＮＡを鋳型と
して用い、オリゴ(dT)プライマーを用いてλgt11ｃＤＮ
Ａライブラリーを構築した。これらのｃＤＮＡライブラ
リーそれぞれについて、後述のモノクローナル抗体C1,
C3, C5及び C15の培養上清の混合液を用いて１×10⁶プ
ラークを免疫学的にスクリーニングした。免疫学的スク
リーニングはサムブロックら(Sambrook et al)の文献
（Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1
989) MolecularCloning: a Laboratory Manual, 2nd E
d., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, NY)の記載と同様に、免疫的検出のためのベ
クタステイン(Vectastain)ＡＢＣキットを用いて行なっ
た。

【００５７】上記の免疫学的スクリーニングにより、P1
8 のラット脳から誘導されたλgt11ｃＤＮＡライブラリ
ー（ランダムプライマー）から陽性クローン (λNGC1)
を単離し、P8のラット脳から誘導されたλgt11ｃＤＮＡ
ライブラリー（オリゴ−(dT)プライマー）から他の陽性
クローン（λNGC3) を単離した。λNGC1中のインサート
ｃＤＮＡをメガプライム（Megaprime)ＤＮＡラベリング
システム（アマシャムインターナショナル社製）を用
いて〔³²Ｐ〕-dCTP で標識し、これをプローブとしたプ
ラークハイブリダイゼーションによって、P18 のラット
脳から誘導されたλgt11ｃＤＮＡライブラリー（ランダ
ムプライマー）からプロテオグリカンのコアタンパク質
の全長をコードするｃＤＮＡを得た。

【００５８】ＤＮＡの塩基配列決定は、BcaBEST Dideox
y Sequencing kit-dCTP Version(宝酒造製）を用いて行
った。本発明プロテオグリカン１のコアタンパク質（本
発明ポリペプチド１）の全長をコードするｃＤＮＡ配列
と対応するアミノ酸配列を配列表配列番号１に、アミノ
酸配列のみを配列番号２に示した。これらのクローンは
544アミノ酸をコードするオープンリーデングフレーム
を含んでいた。

【００５９】2) 本発明ポリペプチド１のＮ末端アミノ
酸配列の解析上記実施例２の(1) で得られたコアタンパク質のアミノ
酸配列分析を行った。コアタンパク質の断片を、Bioche
m.Biophys.Res.Commun.155,1353-1359(1988)に記載され
たように臭化シアン(CNBr)処理によって得た。完全なコ
アタンパク質とその断片とを SDS-PAGE によって分離し
た。そして該タンパク質とその断片とを10％メタノール
を含む10mM CAPS (3-(シクロヘキシルアミノ）プロパン
スルホン酸）緩衝液(pH11)中で0.3 A(アンペア）で４
℃、３時間でPVDF膜に移した。0.5％ポンシューレッド
(Ponceau Red) 含有１％酢酸で染色後、タンパク質のバ
ンドをPVDF膜から切り出し、タンパク質のアミノ酸配列
を自動タンパク質シークエンサー(PPSQ-10；島津）で決
定した。

【００６０】上記実施例２の(1) で得られた本発明プロ
テオグリカン１のコアタンパク質のＮ末端アミノ酸配列
を決定した結果、アミノ酸の一文字表記で VPAREAGSAIE
AEELであった。この部分は配列番号２のアミノ酸番号１
〜15に相当することから、本発明プロテオグリカン１
は、配列番号２のアミノ酸番号１〜514 で示されるアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドをコアタンパク質として
有していることが示された。また、配列番号２のアミノ
酸番号−30〜-1で示されるアミノ酸配列は、シグナルペ
プチド配列であると考えられる。

【００６１】(2) 本発明ＤＮＡ２のクローニング〔³²Ｐ〕で標識したｃＤＮＡプローブを、本発明ＤＮＡ
１の断片（制限酵素XbaI-Hind III 消化ＤＮＡ断片：配
列番号１の塩基番号 612〜1723) をもとにして作製し
た。これをプローブとし２歳の健常な女性の側頭皮質よ
り作製した市販のｃＤＮＡライブラリー(Stratagene Cl
oning System社) からプラークハイブリダイゼーション
によって相同性の高い塩基配列を有するクローンを単離
した。プラークハイブリダイゼーションの宿主には大腸
菌(Escherichia coli) XL-1 blueMRF'(Stratagene Clo
ning System社) を用いた。ハイブリダイゼーション
は、ストリンジェントな条件（60℃、3 × SSC (SSC ：
0.15M NaCl、0.015M酢酸ナトリウム) 中）で行い、洗浄
は60℃、0.1 ×SSC で行った。5.0 ×10⁵クローンの中
から３つのクローンが単離され、これらの中で最も長い
ヌクレオチド配列を有するＤＮＡクローンを選択し、pB
luescript II(Stratagene Cloning System社) にサブク
ローンした。

【００６２】ＤＮＡの塩基配列決定は、BcaBEST Dideox
y Sequencing kit-dCTP Version(宝酒造製）を用いて行
った。本発明ポリペプチド２の全長をコードするｃＤＮ
Ａ配列と対応するアミノ酸配列を配列表配列番号３に、
アミノ酸配列のみを配列番号４に示した。これらのクロ
ーンは 539アミノ酸をコードするオープンリーデングフ
レームを含んでいた。また本発明ポリペプチド１と本発
明ポリペプチド２との相同性は86.8％であった。

【００６３】(3) 本発明ＤＮＡを用いたノーザンブロ
ット分析ノーザンブロット解析によって本発明プロテオグリカン
のコアタンパク質のｍＲＮＡの組織分布を調べた。

【００６４】1) 本発明ＤＮＡ１を用いたノーザンブロ
ット分析全ＲＮＡを、Anal. Biochem. 162, 156-159(1987) に記
載の方法で生後７日および成熟ラットの脳から抽出し
た。また同様に、成熟ラットの腎臓、肝臓、肺及び筋肉
からも全ＲＮＡを抽出した。ポリ(A) ⁺ＲＮＡはオリゴ
テックス-dT30(タカラバイオケミカル社製）を用いて精
製した。ポリ(A) ⁺ＲＮＡ (５μg)を、2.2Mホルムアル
デヒドを含む１％アガロースゲル上で電気泳動し、PVDF
膜に転写した。λNGC1中のインサートｃＤＮＡを、メガ
プライム（Megaprime)ＤＮＡラベリングシステム（アマ
シャムインターナショナル社製）を用いて〔³²Ｐ〕dC
TPで標識してプローブとして用い、ストリンジェントな
条件下でノーザンブロッティングを行った。このフィル
ターを最後に 0.2×SSC(SSC:0.15M NaClと0.015M酢酸ナ
トリウム) 中で68℃で洗浄し、オートラジオグラフィー
を行った。その結果、７日齢と成熟ラットの脳において
単一の転写産物が検出された。しかし腎臓、肝臓、肺及
び筋肉においては、単一の転写産物は検出されなかっ
た。

【００６５】2) 本発明ＤＮＡ２を用いたノーザンブロ
ット分析全ＲＮＡ及びポリ(A) ⁺ＲＮＡは、上記1)と同様の方法
で、ヒトの脳組織、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎
臓及び膵臓から調製した。配列番号３に示される本発明
ＤＮＡ２をEcoR IおよびCla I により切断し、ランダム
プライマーＤＮＡラベリングシステム（random-primer
DNA labeling system；アマシャム社製）を用いて[α-
³²P]dCTP(>111 TBq/mmol、ICN製)でラベルした。これを
プローブとして、２μg のポリ(A) ⁺ｍＲＮＡを付着さ
せたフィルター（ヒトMTN ブロット；クローンテック社
製）を用いて、ストリンジェントな条件下でノーザンブ
ロッティングを行った。その結果、ヒト脳組織由来の検
体から2.4kb のバンドが検出された。この転写産物のサ
イズは本発明ＤＮＡとほぼ一致する。このサイズのバン
ドは、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓及び膵臓で
は検出されなかった。このことから、本発明プロテオグ
リカンのｍＲＮＡは脳で特異的に発現していることが示
唆された。

【００６６】(4) 本発明ＤＮＡの染色体上の存在位置
の探索本発明ＤＮＡの染色体上の位置を調べるため、本発明Ｄ
ＮＡ２を用いて以下の実験を行った。 1) 染色体の調製複製された R- 及びG/Q - バンドを検出するため、中期
(metaphase) の染色体を、以下の手法（Takahashi et a
l., Hum.Genet.86,14-16(1990)）により調製した。正常
な男性から採取した末梢のリンパ球を、10％(v/v) のウ
シ胎児血清および10μg/mlのフィトヘムアグルチニン(p
hytohemagglutinin)を含有する MEM (ギブコBRL 製）中
で培養した。48時間培養後、細胞を 300μg/mlのチミジ
ンで15.5時間処理した。細胞を新鮮なＭＥＭで２回洗浄
し、25μg/mlのBrdU (ブロモデオキシウリジン) で6.5
時間処理し、常法により中期染色体の標本を作製した。
１μg/mlのヘキスト 33258で染色体標本を染色し、２×
SSC(pH7.8)でリンスして、カバーグラスをかぶせた。染
色された標本は、ホットプレートを用いて75℃で３分間
インキュベートし、ブラックライト（東芝製、20W)を６
分間照射した。

【００６７】2) 蛍光in situ ハイブリダイゼーション
(FISH) FISH(fluorescence in situ hybridization)は、Takaha
shi et al.(Cytogenet. Cell Genet. 54,84-85 (1990))
及びOno et al.(Cytogenet.Cell Genet.79, 101-102(19
97))の一部を改良した方法で行った。ニックトランスレ
ーションキット（nick translation kit；ベーリンガー
製）を用いて、プローブ（本発明ＤＮＡ２）をビオチン
-16-dUTPで標識した。これを超音波処理したサケ精子Ｄ
ＮＡ (シグマ社）と共にエタノールで共沈殿させた後、
標識されたプローブＤＮＡを 100％ホルムアミド中で80
℃、10分間変性させた。スライドグラス上の染色体ＤＮ
Ａを、70％ホルムアミド／２×SSC 中で70℃、２分間変
性させ、次いでエタノール中で脱水した。変性した染色
体ＤＮＡを、５×SSC 、15％デキストラン硫酸、30％ホ
ルムアミド、２mg/ml ウシ血清アルブミン(BSA) 、0.4m
g/mlサケ精子ＤＮＡ及び約20μg/mlの標識プローブを含
有する溶液中でインキュベート（ハイブリダイゼーショ
ン）した。ハイブリダイゼーション後、50％ホルムアミ
ド／２×SSC 中で70℃、15分間、次いで２×SSC 中で室
温、15分間、次いで１×SSC 、室温、15分間インキュベ
ートすることにより、反応液を除去した。

【００６８】ハイブリダイゼーションシグナルは、アビ
ジン−FITC (ベーリンガー製）およびビオチン化抗−ア
ビジンＤ抗体（Vector Lab. 製) を用いて、公知の方法
（Ono and Yoshida, Jpn.J.Genet.68,617-621(1993))に
より検出した。

【００６９】染色体は、１μg/mlのプロピジウムイオダ
イド (propidium iodide；PI) で対照染色した。観察
は、オリンパス BX60 蛍光顕微鏡を用いて行った。PI染
色した染色体におけるFITCシグナルとR-バンドは、オリ
ンパス U-MWIB 蛍光キューブを通して可視化した。同じ
中期染色体について、オリンパス U-MWU蛍光キューブを
用いてInazawa らの方法(Genomics 17, 153-162, 1993)
により紫外線励起によるG/Q-バンドパターンを調べた。
135 個の中期染色体を調べた結果、116 個の二重ドット
シグナル(double-dotsignal)が検出された。116 シグナ
ル（86％）は第３番染色体のバンドp21.3 に特異的に存
在していた。残りの19シグナルは10箇所の異なった位置
に存在していたので、バックグラウンドと判断された。

【００７０】以上の結果から、本発明プロテオグリカン
２は染色体3p21.3に存在することが示された。染色体3p
21.3には、例えばSotos症候群（脳性巨人症）に関連す
る遺伝子が存在していることが報告されており、本発明
ＤＮＡ２の染色体における変異等が何らかの脳疾患に関
与している可能性も示唆される。

【００７１】

【実施例４】本発明抗体まず本実施例において共通して用いたウェスタンブロッ
トの手法について説明する。検体（試料）をSDS-PAGE
後、ゲルを４℃で20％(V/V) メタノールを含む25mMトリ
ス、192mM グリシン (pH8.3)中で一昼夜60V でPVDF膜に
電気泳動的に転写させた。抗体の非特異的結合を阻止す
るため、該膜を１％スキムミルク (DIFCO ラボラトリー
ス社製）を含むPBS 中でインキュベートした。次にこの
膜を、後述のハイブリドーマの培養上清または抗血清で
４℃、一昼夜処理し、そしてベクタステイン(Vectastai
n) ABCキット（ベクター研究所製）を用いてPBS 中で染
色した。

【００７２】(1) 本発明ポリペプチド１をコアタンパ
ク質として有するプロテオグリカンに対するモノクロー
ナル抗体の製造上記実施例１で製造した本発明プロテオグリカン１（50
μｇタンパク質）を２週間間隔で完全および不完全フロ
イントアジュバントと共にBALB/ ｃマウスの腹腔に注射
した。４回目にブースターとして投与後、マウスを屠殺
し、得られた脾臓細胞をポリエチレングリコールを用い
てPAI ミエローマ細胞と融合した。HAT培地中で選択し
たハイブリドーマを10％ウシ胎児血清を含む RPMI1640
培地（シグマ社製）で培養した。培養されたハイブリド
ーマを培養上清を用いて本発明プロテオグリカン１と反
応する抗体の有無でウエスタンブロッテイングによって
スクリーニングした。陽性ハイブリドーマは限界希釈法
によってクローン化した。

【００７３】その結果、４種類のハイブリドーマ細胞株
(C1, C3, C5 及びC15)を選択した。それぞれが、ウエス
タンブロットにおいて上記実施例１で製造した本発明プ
ロテオグリカンと反応する抗体（モノクローナル抗体 C
1, C3, C5 及びC15)を生産した。これらの４つの抗体
は、すべてマウスモノクローナル抗体イソタイピングキ
ット（イムノタイプ（商品名）；シグマ社製）を用いて
ＩｇＧ1 であると決定された。

【００７４】(2) 上記(1) で製造されたモノクローナ
ル抗体の特徴上記モノクローナル抗体(C1, C3, C5 及びC15)は、全て
実施例１で製造された本発明プロテオグリカン１を検体
としたウエスタンブロッティングを行った結果、平均分
子量150kDaに相当する非常に広いバンドを認識した。ま
た、この本発明プロテオグリカン１をコンドロイチナー
ゼ ABCで消化したコアグリコプロテインにおいては、12
0kDaのタンパク質のバンドがモノクローナル抗体C5を用
いたウエスタンブロッティングで検出された。ヘパリチ
ナーゼで処理してもこのバンドは移動しなかった。なお
モノクローナル抗体C5は、ラットの肝臓、肺臓、腎臓、
筋肉及び軟骨のような、神経系以外から調製したいかな
るプロテオグリカンのコアタンパク質とも反応しなかっ
た。なお上記コアグリコプロテインを３種のグリコシダ
ーゼ（ノイラミダーゼ、O-グリコシダーゼ、N-グリコシ
ダーゼ）で順に消化した結果、前述の通り、SDS-PAGE上
でのコアタンパク質のバンドの移動度が増加した。コア
タンパク質を認識するモノクローナル抗体C5の反応性
は、グリコシダーゼ消化によっても影響されなかった。
よってモノクローナル抗体C5によって認識されるエピト
ープは、本発明プロテオグリカン１のコアタンパク質部
分に存在していると思われる。

【００７５】(3) 本発明ポリペプチド１をコアタンパ
ク質として有するプロテオグリカンに対するポリクロー
ナル抗体の製造本発明ＤＮＡ１とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
(GST) 遺伝子を利用して、配列番号２のアミノ酸番号３
〜229 で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（以下、抗原用ポリペプチドという）とGST との融合タ
ンパク質をE.coli中で発現させた。この融合タンパク質
は、グルタチオン−セファロース４Ｂ（ファルマシア
製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより
精製した。

【００７６】精製された融合タンパク質をウシのトロン
ビン（EC 3.4.21.5 ；生化学工業株式会社販売）で切断
し、グルタチオン−セファロース4Bを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーによって GST部分を除去した。
精製された抗原用ポリペプチド(1mg) を、フロイントの
完全アジュバントと混合してウサギの皮下に注射した。
１ヶ月後、抗原用ポリペプチドをフロイントの不完全ア
ジュバントと混合して追加免疫した。追加免疫後10日目
にウサギの血液を採取し、血清（抗血清）を分離して、
本発明ポリペプチド１をコアタンパク質として有するプ
ロテオグリカン１に対するポリクローナル抗体を作製し
た。

【００７７】(4) 上記(3) で製造されたポリクローナ
ル抗体の特徴ニワトリ、ラット、マウス、ネコ、サル及び種々の年齢
のヒトの脳組織を検体として、上記ポリクローナル抗体
を用いたウェスタンブロッティングを行った。組織をタ
ンパク質分解酵素阻害剤を含有するリン酸緩衝生理食塩
水(PBS) 中でホモジナイズし、ホモジネートを２％SDS
存在下でボイルした。このサンプルを３％の濃縮ゲル及
び６％分離ゲルを用いたSDS-PAGEにより分離し、ウエス
タンブロッティングを行った。７日齢ラットの大脳及び
小脳を検体とした結果、いずれの検体においても、150k
Da 付近に非常に幅広いバンドが検出された。この非常
に幅広いバンドはプロテオグリカンの特徴の一つであ
り、またこのバンドの出現位置は本発明プロテオグリカ
ン１の分子量とほぼ一致している。従って上記ポリクロ
ーナル抗体は、本発明プロテオグリカン１を認識してい
ることが示唆された。

【００７８】またこのバンドは、コンドロイチナーゼ A
BCで処理することによって、約 120kDa の比較的幅の狭
いバンドが生じた。また、上記バンドの他にはバンドは
検出されなかった。従って、上記ポリクローナル抗体
は、本発明プロテオグリカン１及び本発明ポリペプチド
１に特異的であることが示唆された。また種々の脊椎動
物（13日および17日齢のニワトリ胚、10日及び31日齢の
マウス、ネコ、サル、３ヶ月、５歳及び10歳のヒト）の
大脳組織のホモジネートをコンドロイチナーゼ ABCで消
化し、上記ポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロ
ッティングを行った。その結果、120kDa付近に単一のバ
ンドが観察された。このことは、本発明プロテオグリカ
ンに免疫学的に類似したプロテオグリカンが種々の脊椎
動物の大脳に存在しており、進化的に保存されているこ
とを示唆している。このことは、本発明プロテオグリカ
ンがヒトを含む脊椎動物における脳の発生及び／又は脳
機能の維持において基本的な役割を果たしている可能性
を示唆している。

【００７９】

【発明の効果】本発明プロテオグリカンは、脳の発生や
脳機能の維持等に関係していることが示唆されることか
ら、神経疾患等の診断、予防、治療等に利用できること
が期待される。また本発明プロテオグリカンは、EGF 受
容体をリン酸化する活性を有するため、本発明リン酸化
剤として利用することができる。また本発明プロテオグ
リカンは、研究用試薬として利用することもできる。

【００８０】本発明ポリペプチドは、本発明プロテオグ
リカンにおいてコアタンパク質として含有されるポリペ
プチドであり、本発明プロテオグリカンや本発明抗体の
製造に用いることができる。本発明ＤＮＡは本発明ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡであり、本発明ポリペプチ
ドの遺伝子工学的な大量製造等に利用することができ
る。また遺伝子治療や遺伝子診断的用途に利用できるこ
とも期待される。

【００８１】本発明抗体は、本発明ポリペプチドや本発
明プロテオグリカンに結合するので、本発明ポリペプチ
ドや本発明プロテオグリカンの検出に有用である。ま
た、本発明ポリペプチドや本発明プロテオグリカンのア
フィニティー精製等に用いることもできる。本発明リン
酸化剤は、EGF 受容体をリン酸化する活性を有するた
め、EGF と同様に創傷治療等の医薬用途への利用が期待
できる。また、本発明リン酸化剤は試薬として利用する
こともできる。

【配列表】ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧ〈１１０〉 SEIKAGAKU KOGYO KABUSHIKI KAISHA (SEIKAGAKU Corporation) 〈１２０〉 Coreprotein of Proteoglycan and DNA encoding it 〈１３０〉〈１６０〉４〈２１０〉１〈２１１〉１７２８〈２１２〉ＤＮＡ〈２１３〉 rat brain 〈４００〉１ atg ggc cga gct gga ggc ggg ggc ccg ggc tgg ggg ccg ccg cca gtg 48 Met Gly Arg Ala Gly Gly Gly Gly Pro Gly Trp Gly Pro Pro Pro Val -30 -25 -20 -15 ctg ctg ctt ctg ggg gtc acg ctg gtg ctc acc gct ggg gct gta ccg 96 Leu Leu Leu Leu Gly Val Thr Leu Val Leu Thr Ala Gly Ala Val Pro -10 -5 1 gca cgg gaa gca ggc agt gcg atc gag gct gaa gag ctg gtg agg agc 144 Ala Arg Glu Ala Gly Ser Ala Ile Glu Ala Glu Glu Leu Val Arg Ser 5 10 15 ggc ctt gca tgg gag tcg cgt gcc aat gac acg cgg gag gaa gct ggc 192 Gly Leu Ala Trp Glu Ser Arg Ala Asn Asp Thr Arg Glu Glu Ala Gly 20 25 30 ctg cca gca gca ggg gaa gat gag acc tcg tgg aca gag cgg ggc agt 240 Leu Pro Ala Ala Gly Glu Asp Glu Thr Ser Trp Thr Glu Arg Gly Ser 35 40 45 50 gag ctg gct gcg gtg ggc cct ggg gtc ggg cca gag gag aca cta gag 288 Glu Leu Ala Ala Val Gly Pro Gly Val Gly Pro Glu Glu Thr Leu Glu 55 60 65 gca tcg gct gca gtg act ggg act gcc tgg cta gag gca gat ggc aca 336 Ala Ser Ala Ala Val Thr Gly Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Gly Thr 70 75 80 ggc ctg ggt gga gtg act gca gag gct ggt agt ggc gac gcc aag acc 384 Gly Leu Gly Gly Val Thr Ala Glu Ala Gly Ser Gly Asp Ala Lys Thr 85 90 95 ctt cca gct aca ctc cag gct cct gac gag gcc ctt ggg tca tct aca 432 Leu Pro Ala Thr Leu Gln Ala Pro Asp Glu Ala Leu Gly Ser Ser Thr 100 105 110 atg ccc cct gcc atc cct gag gct act gaa gcc agt gga cct ccc tcc 480 Met Pro Pro Ala Ile Pro Glu Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser 115 120 125 130 ccc acc ctc cgt gat aaa cct agc cta gtc cct gaa ctc cct aag gag 528 Pro Thr Leu Arg Asp Lys Pro Ser Leu Val Pro Glu Leu Pro Lys Glu 135 140 145 atc ccc ttg gaa gtt tgg ctg aac ctg gga ggc agc aca cct gac cct 576 Ile Pro Leu Glu Val Trp Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp Pro 150 155 160 caa agg cca gag cct act ttt ccc ctt cag ggc act cta gag aca caa 624 Gln Arg Pro Glu Pro Thr Phe Pro Leu Gln Gly Thr Leu Glu Thr Gln 165 170 175 cca gcc tca gat ata att gac att gat tac ttt gaa gga ttg gat agc 672 Pro Ala Ser Asp Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Ser 180 185 190 gag ggc cga ggc aca gac atg ggc agg ttc ccg ggc tca cca gga acc 720 Glu Gly Arg Gly Thr Asp Met Gly Arg Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr 195 200 205 210 tca gaa aat cac cct gat act gaa gga gag acc ccc tcc tgg agc ctg 768 Ser Glu Asn His Pro Asp Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu 215 220 225 ctt gac tta tat gat gac ttc acc ccc ttt gat gag tct gat ttc tac 816 Leu Asp Leu Tyr Asp Asp Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr 230 235 240 ccc acc aca tcc ttc tat gat gac ttg gaa gag gag gaa gag gag gag 864 Pro Thr Thr Ser Phe Tyr Asp Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 245 250 255 gag gat aag gat gca gtg gga ggc gga gac ctg gaa gat gaa agt gac 912 Glu Asp Lys Asp Ala Val Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Ser Asp 260 265 270 ctc ctc ctg ccc tct cag aag cct ggt gtg ggg cct ggg acg gga cag 960 Leu Leu Leu Pro Ser Gln Lys Pro Gly Val Gly Pro Gly Thr Gly Gln 275 280 285 290 ccc acc agt cga tgg cat gca gtt cct cca cag cat act ctg ggg atg 1008 Pro Thr Ser Arg Trp His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Met 295 300 305 gta cct ggt ggc agc atc tct ctt agg ccc cgc cct gga gat cca ggc 1056 Val Pro Gly Gly Ser Ile Ser Leu Arg Pro Arg Pro Gly Asp Pro Gly 310 315 320 aag gac ctg gcc acg agc gaa aat gga aca gag tgc cga gtt ggc ttt 1104 Lys Asp Leu Ala Thr Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Val Gly Phe 325 330 335 gtc aga cac aat ggc tcc tgt cgg tca gtc tgt gac ctc ttc ccg agt 1152 Val Arg His Asn Gly Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser 340 345 350 tac tgt cac aat ggc ggc caa tgc tac ctg gtg gag aac ata ggg gct 1200 Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala 355 360 365 370 ttc tgc agg tgt aac acc cag gac tat atc tgg cac aag ggg atg cgc 1248 Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg 375 380 385 tgt gag tcc atc atc acc gac ttc cag gtg atg tgc gtg gcc gtc ggc 1296 Cys Glu Ser Ile Ile Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly 390 395 400 tcg gct gcg ttg gtg ctg ctc ctt ctg ttc atg atg act gtg ttc ttt 1344 Ser Ala Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe 405 410 415 gcc aag aaa ctc tat ctg ctc aag act gag aac acc aag ctg agg agg 1392 Ala Lys Lys Leu Tyr Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg 420 425 430 acc aac aaa ttc cgg acc cca tct gag ctc cac aat gat aac ttc tcc 1440 Thr Asn Lys Phe Arg Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn Phe Ser 435 440 445 450 ctc tcc acc att gcc gag ggc tcc cat cca aat gat gac ccc agc gct 1488 Leu Ser Thr Ile Ala Glu Gly Ser His Pro Asn Asp Asp Pro Ser Ala 455 460 465 ccc cac aaa atc cag gaa gct ctc aag tcc cgc ctg aag gag gaa gag 1536 Pro His Lys Ile Gln Glu Ala Leu Lys Ser Arg Leu Lys Glu Glu Glu 470 475 480 tcc ttt aac atc cag aac tcc atg tca ccc aaa ctc gag ggt ggc aaa 1584 Ser Phe Asn Ile Gln Asn Ser Met Ser Pro Lys Leu Glu Gly Gly Lys 485 490 495 ggt gac cag gat gac ttg gag gtg aac tgt ctc cag aat aac ctg acc 1632 Gly Asp Gln Asp Asp Leu Glu Val Asn Cys Leu Gln Asn Asn Leu Thr 500 505 510 tgagacggag gagggagagg ggagaggggg gtgggggagg gaaggaccgt ggtctcctct *** cgggcagccg gctcctcata accatttgtt aagctt 1728 〈２１０〉２〈２１１〉５４４〈２１２〉ＰＲＴ〈２１３〉 rat brain 〈４００〉２ Met Gly Arg Ala Gly Gly Gly Gly Pro Gly Trp Gly Pro Pro Pro Val -30 -25 -20 -15 Leu Leu Leu Leu Gly Val Thr Leu Val Leu Thr Ala Gly Ala Val Pro -10 -5 1 Ala Arg Glu Ala Gly Ser Ala Ile Glu Ala Glu Glu Leu Val Arg Ser 5 10 15 Gly Leu Ala Trp Glu Ser Arg Ala Asn Asp Thr Arg Glu Glu Ala Gly 20 25 30 Leu Pro Ala Ala Gly Glu Asp Glu Thr Ser Trp Thr Glu Arg Gly Ser 35 40 45 50 Glu Leu Ala Ala Val Gly Pro Gly Val Gly Pro Glu Glu Thr Leu Glu 55 60 65 Ala Ser Ala Ala Val Thr Gly Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Gly Thr 70 75 80 Gly Leu Gly Gly Val Thr Ala Glu Ala Gly Ser Gly Asp Ala Lys Thr 85 90 95 Leu Pro Ala Thr Leu Gln Ala Pro Asp Glu Ala Leu Gly Ser Ser Thr 100 105 110 Met Pro Pro Ala Ile Pro Glu Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser 115 120 125 130 Pro Thr Leu Arg Asp Lys Pro Ser Leu Val Pro Glu Leu Pro Lys Glu 135 140 145 Ile Pro Leu Glu Val Trp Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp Pro 150 155 160 Gln Arg Pro Glu Pro Thr Phe Pro Leu Gln Gly Thr Leu Glu Thr Gln 165 170 175 Pro Ala Ser Asp Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Ser 180 185 190 Glu Gly Arg Gly Thr Asp Met Gly Arg Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr 195 200 205 210 Ser Glu Asn His Pro Asp Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu 215 220 225 Leu Asp Leu Tyr Asp Asp Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr 230 235 240 Pro Thr Thr Ser Phe Tyr Asp Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 245 250 255 Glu Asp Lys Asp Ala Val Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Ser Asp 260 265 270 Leu Leu Leu Pro Ser Gln Lys Pro Gly Val Gly Pro Gly Thr Gly Gln 275 280 285 290 Pro Thr Ser Arg Trp His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Met 295 300 305 Val Pro Gly Gly Ser Ile Ser Leu Arg Pro Arg Pro Gly Asp Pro Gly 310 315 320 Lys Asp Leu Ala Thr Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Val Gly Phe 325 330 335 Val Arg His Asn Gly Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser 340 345 350 Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala 355 360 365 370 Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg 375 380 385 Cys Glu Ser Ile Ile Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly 390 395 400 Ser Ala Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe 405 410 415 Ala Lys Lys Leu Tyr Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg 420 425 430 Thr Asn Lys Phe Arg Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn Phe Ser 435 440 445 450 Leu Ser Thr Ile Ala Glu Gly Ser His Pro Asn Asp Asp Pro Ser Ala 455 460 465 Pro His Lys Ile Gln Glu Ala Leu Lys Ser Arg Leu Lys Glu Glu Glu 470 475 480 Ser Phe Asn Ile Gln Asn Ser Met Ser Pro Lys Leu Glu Gly Gly Lys 485 490 495 Gly Asp Gln Asp Asp Leu Glu Val Asn Cys Leu Gln Asn Asn Leu Thr 500 505 510 〈２１０〉３〈２１１〉１７２２〈２１２〉 DNA 〈２１３〉 human brain 〈４００〉３ atg ggg cga gcc ggg ggc ggg ggc ccg ggc cgg ggg ccg ccg cca ctg 48 Met Gly Arg Ala Gly Gly Gly Gly Pro Gly Arg Gly Pro Pro Pro Leu 1 5 10 15 ctg ctg ttt ctg ggg gcc gcg ctg gtc ctg gcc tct ggg gcc gtg ccg 96 Leu Leu Phe Leu Gly Ala Ala Leu Val Leu Ala Ser Gly Ala Val Pro 20 25 30 gcg cgt gag gcg ggc agc gcg gtt gag gcc gaa gag ctg gtg aag ggc 144 Ala Arg Glu Ala Gly Ser Ala Val Glu Ala Glu Glu Leu Val Lys Gly 35 40 45 agc ccg gcg tgg gag ccg cct gcc aac gac acg cgg gaa gaa gcc ggc 192 Ser Pro Ala Trp Glu Pro Pro Ala Asn Asp Thr Arg Glu Glu Ala Gly 50 55 60 cca cca gcg gct ggg gaa gat gag gcg tcg tgg acg gcg ccc ggt ggc 240 Pro Pro Ala Ala Gly Glu Asp Glu Ala Ser Trp Thr Ala Pro Gly Gly 65 70 75 80 gag ctg gcc ggg cca gaa gag gtg ctg cag gag tcg gct gcg gtg acc 288 Glu Leu Ala Gly Pro Glu Glu Val Leu Gln Glu Ser Ala Ala Val Thr 85 90 95 ggc acc gcc tgg ctg gaa gct gac agc cca ggc ctg gga gga gtg acc 336 Gly Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Ser Pro Gly Leu Gly Gly Val Thr 100 105 110 gca gag gcg ggc agc ggc gat gcc cag gcc ctt cca gct acg ctc cag 384 Ala Glu Ala Gly Ser Gly Asp Ala Gln Ala Leu Pro Ala Thr Leu Gln 115 120 125 gct ccc cac gag gtc ctc ggg cag tca atc atg ccc cct gcc att cct 432 Ala Pro His Glu Val Leu Gly Gln Ser Ile Met Pro Pro Ala Ile Pro 130 135 140 gag gct aca gag gcc agc ggg cca ccc tcc ccc acc ccc ggc gac aag 480 Glu Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys 145 150 155 160 ctg agc cca gct tct gaa ctc ccc aag gag agc ccc ttg gag gtt tgg 528 Leu Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp 165 170 175 ctg aac ctg ggg ggc agc aca ccc gac cct caa gtg cca gag ctg act 576 Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp Pro Gln Val Pro Glu Leu Thr 180 185 190 tac cca ttt cag ggc acc ctg gag ccc caa ccg gca tca gat atc att 624 Tyr Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu Pro Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile 195 200 205 gac atc gac tac ttc gaa gga ctg gat ggt gag ggt cgt ggc gca gat 672 Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp 210 215 220 ctg ggg agc ttc cca ggg tca cca gga acc tca gag aac cac cct gat 720 Leu Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Glu Asn His Pro Asp 225 230 235 240 act gag gga gag acc cct tcc tgg agc ctg ctt gac tta tac gat gat 768 Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Asp Asp 245 250 255 ttc acc ccc ttc gat gaa tct gat ttc tac ccc acc aca tcc ttt tat 816 Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr Pro Thr Thr Ser Phe Tyr 260 265 270 gat gac ttg gat gaa gag gag gag gaa gag gag gat gac aaa gat gca 864 Asp Asp Leu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Lys Asp Ala 275 280 285 gta gga ggt gga gac cta gaa gat gaa aat gag ctt cta gtg ccc act 912 Val Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Asn Glu Leu Leu Val Pro Thr 290 295 300 ggg aag cct ggt ctg ggg ccc ggg aca ggc cag ccc acc agt cgg tgg 960 Gly Lys Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Gly Gln Pro Thr Ser Arg Trp 305 310 315 320 cat gct gtc cct cca cag cac act ctg ggg tcg gtc ccc ggc agc agc 1008 His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Ser Val Pro Gly Ser Ser 325 330 335 atc gcc ctc agg ccc cgc cca gga gag cca ggc agg gac ttg gcc tcc 1056 Ile Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Leu Ala Ser 340 345 350 agt gaa aat ggc act gag tgc cgc agt ggc ttt gtg cgg cat aac ggc 1104 Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser Gly Phe Val Arg His Asn Gly 355 360 365 tcc tgc cgg tca gtg tgc gac ctc ttc cca agt tac tgt cac aat ggc 1152 Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly 370 375 380 ggc cag tgc tac ctg gtg gag aac ata ggg gcc ttc tgc agg tgc aac 1200 Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn 385 390 395 400 acg cag gac tac atc tgg cac aag ggg atg cgc tgc gag tcc atc atc 1248 Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile 405 410 415 acc gac ttc cag gtg atg tgc gtg gcc gtg ggc tcg gct gcc ctc gtc 1296 Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly Ser Ala Ala Leu Val 420 425 430 ctg ctc ctg ctc ttc atg atg acg gtg ttc ttt gcc aag aag ctc tac 1344 Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe Ala Lys Lys Leu Tyr 435 440 445 ctg ctc aag acg gag aat acc aag ctg cgt agg acc aac aaa ttc cgg 1392 Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg Thr Asn Lys Phe Arg 450 455 460 acc cca tct gag ctc cac aat gat aac ttc tcc ctc tcc acc att gcc 1440 Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn Phe Ser Leu Ser Thr Ile Ala 465 470 475 480 gag ggc tct cac cca aat gat gat cct agt gct ccc cac aaa atc cag 1488 Glu Gly Ser His Pro Asn Asp Asp Pro Ser Ala Pro His Lys Ile Gln 485 490 495 gag gtt ctc aag tcc tgc ctg aaa gag gag gag tca ttt aac atc cag 1536 Glu Val Leu Lys Ser Cys Leu Lys Glu Glu Glu Ser Phe Asn Ile Gln 500 505 510 aac tcc atg tcg ccc aaa ctt gag ggt ggc aaa ggt gac cag gct gac 1584 Asn Ser Met Ser Pro Lys Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asp Gln Ala Asp 515 520 525 ttg gat gtg aac tgt ctt cag aat aat tta acc taa 1620 Leu Asp Val Asn Cys Leu Gln Asn Asn Leu Thr ^*** 530 535 539 agcagagcaa gaagagagga agcggggtag tgggtggggg tagggaagaa acattatctc 1680 ctcttgtaca gagtctattt cttgtaacca tttgttaaac tc 〈２１０〉４〈２１１〉５３９〈２１２〉 PRT 〈２１３〉 human brain 〈４００〉４ Met Gly Arg Ala Gly Gly Gly Gly Pro Gly Arg Gly Pro Pro Pro Leu 1 5 10 15 Leu Leu Phe Leu Gly Ala Ala Leu Val Leu Ala Ser Gly Ala Val Pro 20 25 30 Ala Arg Glu Ala Gly Ser Ala Val Glu Ala Glu Glu Leu Val Lys Gly 35 40 45 Ser Pro Ala Trp Glu Pro Pro Ala Asn Asp Thr Arg Glu Glu Ala Gly 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Gly Glu Asp Glu Ala Ser Trp Thr Ala Pro Gly Gly 65 70 75 80 Glu Leu Ala Gly Pro Glu Glu Val Leu Gln Glu Ser Ala Ala Val Thr 85 90 95 Gly Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Ser Pro Gly Leu Gly Gly Val Thr 100 105 110 Ala Glu Ala Gly Ser Gly Asp Ala Gln Ala Leu Pro Ala Thr Leu Gln 115 120 125 Ala Pro His Glu Val Leu Gly Gln Ser Ile Met Pro Pro Ala Ile Pro 130 135 140 Glu Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys 145 150 155 160 Leu Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp 165 170 175 Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp Pro Gln Val Pro Glu Leu Thr 180 185 190 Tyr Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu Pro Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile 195 200 205 Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp 210 215 220 Leu Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Glu Asn His Pro Asp 225 230 235 240 Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Asp Asp 245 250 255 Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr Pro Thr Thr Ser Phe Tyr 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Lys Asp Ala 275 280 285 Val Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Asn Glu Leu Leu Val Pro Thr 290 295 300 Gly Lys Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Gly Gln Pro Thr Ser Arg Trp 305 310 315 320 His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Ser Val Pro Gly Ser Ser 325 330 335 Ile Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Leu Ala Ser 340 345 350 Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser Gly Phe Val Arg His Asn Gly 355 360 365 Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly 370 375 380 Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn 385 390 395 400 Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile 405 410 415 Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly Ser Ala Ala Leu Val 420 425 430 Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe Ala Lys Lys Leu Tyr 435 440 445 Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg Thr Asn Lys Phe Arg 450 455 460 Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn Phe Ser Leu Ser Thr Ile Ala 465 470 475 480 Glu Gly Ser His Pro Asn Asp Asp Pro Ser Ala Pro His Lys Ile Gln 485 490 495 Glu Val Leu Lys Ser Cys Leu Lys Glu Glu Glu Ser Phe Asn Ile Gln 500 505 510 Asn Ser Met Ser Pro Lys Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asp Gln Ala Asp 515 520 525 Leu Asp Val Asn Cys Leu Gln Asn Asn Leu Thr ^***

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA41 BA80 CA04 CA07 DA02 DA06 EA04 GA05 GA11 GA18 GA19 HA04 HA15 HA17 4B064 AG01 AG27 BA16 CA02 CA10 CA19 CA20 CA21 CB07 CC24 CE12 CE14 DA03 DA13 4B065 AA26X AA91X AA91Y AB01 AB04 BA02 BD16 CA24 CA25 CA44 CA46 4H045 AA10 BA10 BA41 CA45 EA21 EA50 FA70 FA72 FA74 GA10 GA15 GA23 GA25 GA26 HA07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表配列番号２のアミノ酸番号１〜51
4 で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】配列表配列番号４のアミノ酸番号31〜53
9 で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３】請求項１又は２記載のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ。
【請求項４】請求項１又は２記載のポリペプチドをコ
アタンパク質として有するプロテオグリカン。
【請求項５】請求項４記載のプロテオグリカンに結合
する抗体。
【請求項６】請求項４記載のプロテオグリカンを有効
成分とする上皮成長因子受容体のリン酸化剤。