JPH11503324A

JPH11503324A - Ｃｎｓミエリンによる抑制に対するニューロン細胞応答のモジュレーター

Info

Publication number: JPH11503324A
Application number: JP8530594A
Authority: JP
Inventors: ローチ，アーサー; ロザーノ，アンドレス; ラベス，モニカ; ロダー，ジョン
Original assignee: マウント・サイナイ・ホスピタル・コーポレイション
Priority date: 1995-04-13
Filing date: 1996-04-12
Publication date: 1999-03-26
Also published as: AU5264496A; CA2174025A1; EP0821731A1; CA2217731A1; WO1996032476A1

Abstract

(57)【要約】成熟した動物の中枢神経系ミエリンによる抑制に対するニューロン細胞の応答を調節する物資の分析方法。軸索突起発達に影響すると思われる被験化合物の存在下、軸索突起成長傾向を有するニューロン細胞を哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリン上で増殖させる。本発明はまた、軸索突起発達で役目を果たす新規蛋白質をコードする単離された核酸分子に関する。本発明は、該核酸分子およびその蛋白質生成物の種々の用途を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＮＳミエリンによる抑制に対するニューロン細胞応答のモジュレーター発明の分野本発明は、総じて、新規蛋白質、該蛋白質をコードする核酸分子、新規ハイブリドーマ・セル・ラインおよび、特に、ニューロン細胞膜に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ・セル・ラインに関する。また、該蛋白質、核酸分子およびモノクローナル抗体の使用方法、哺乳動物中枢神経系ミエリンによる抑制に対するニューロン細胞応答を調節する物質を同定する方法および軸索突起（neurite）成長抑制活性の分析法も提供する。発明の背景成熟した哺乳動物の末梢神経における軸索の著しい特徴は、中断された後、それらが遠位神経断端を介して再生し、それらのターゲットと再び連結して、機能を再確立できることである。しかし、このことは、中枢神経系（ＣＮＳ）では真実ではない。成熟した哺乳動物の脳、視神経または脊髄中の傷ついた軸索は、うまく再成長しない。これにより、ニューロン回路の不可逆的破壊と永久的な神経学的不能がもたらされる。ＣＮＳと末梢神経系（ＰＮＳ）における軸索の再生能の相違は臨床医学者および神経科学者を悩ませ、彼等をこの現象の分子ベースの探究に挑戦させた。ニューロン突起（process）の成長を調節する分子の多くが同定されている。最近まで、環境分子だけがニューロン成長の陽性効果を発揮する指示を与えることが知られていた。これらの陽性シグナルには、神経成長因子および脳誘導神経向性因子のような成長因子（Barde,Y.A.,[Review],Neutron 2：1525-1534,1989 およびDechantら,J.Journal of Neuroscience 13：2610-2616,1993）、コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンのような細胞外マトリックス成分（Goodma nおよびSchatz,1993,Neuron 10(Suppl.)：77-98の総説）およびＮＣＡＭのような細胞表面分子（上記GoodmanおよびSchatz,1993）が包含される。最近、かなり興味があるのは、神経系がまた、軸索成長を抑制または制限する機能を有する分子も含有するという知見である。該抑制分子は成長錐体（growth cone）崩壊を起こす性質を有する。成長錐体は成長する軸索突起の遠位端における特殊な構造であり、主に、成長錐体の成長および軸索の伸長を調節する環境シグナルの導入に関与する。これらの分子のいくつかは、発達の初期に発現される膜関連糖蛋白質である。例えば、後部椎板は、ヒナ後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン成長錐体の崩壊の原因となる蛋白質を含有する（Daviesら,1990,Neuron 4,1 1-20）。ヒナの後部中脳蓋は、側頭部の崩壊を起こすが、鼻網膜神経節細胞（ＲＧＣ）成長錐体を崩壊しない３３kＤaのホスホグリセロールイノシチド結合蛋白質を有する（Stableら,1990,Neuron 5,735-743）。ヒナの脳からの８８kＤaの分子、コラプシンは、後根神経節および網膜神経節細胞成長錐体の崩壊を起こす（ Luoら,1993,Cell,75:217-227）。細胞外マトリックスに見いだされるテネイシン（Lochterら,1991,J.Cell.Biol.,113,1159）、ヤヌシン（janusin；Peshevaら,1 989,J.Cell Biol.,109,1765-1778）を包含する他の分子は抗接着性で、軸索突起誘導において役割を果たし得る。神経系の発達の間の抑制分子の機能は、特定の神経突起（neural projection）に沿った適当なシナプスターゲットに対する軸索の集中および制限であり得る。成熟哺乳動物のＣＮＳも、損傷後の軸索再生が成功しないことに関与しうる抑制分子を含有する。非ニューロン起源の２つのフラクションが、軸索突起発達を阻害する成熟哺乳動物中枢神経系ミエリン中で同定された。これらのフラクションはＮＩ−３５およびＮＩ−２５０（神経突起阻害剤：ＮＩ）と命名され、ＣＮＳのミエリンに見られるが、末梢神経には見られない（CaroniおよびSchwabb,J. Cell Biol.,106：1281-1,1988）。該フラクションは、胎児のＣＮＳ軸索発達の期間は存在しないが、確立された軸索突起のミエリン形成直前に乏突起神経膠細胞により産生される（CaroniおよびSchwabb,J.Cell Biol.,106：1281-1,1988）。囓歯動物胎児にいて、照射によって誘発した乏突起神経膠細胞産生の停止による分子のダウンレギュレーションは、ＣＮＳでの軸索再生傾向の増加を伴う（SavioおよびSchwab,PNAS,87：4130-4133,1990）。さらに、抗体を用いるＮＩ−３５およびＮＩ−２５０活性の中和は、ＣＮＳ環境を軸索成長を許さないものから、許容するものへ変える（CaroniおよびSchwabb,J.CellBiol.,106：1 281-1,1988）。より最近、抗ＮＩ−３５およびＮＩ−２５０抗体の存在下、成熟したラットの脊髄において中断された軸索のサブセットが、長い距離にわたって再生できたことが示されている（SchnellおよびSchwab,1990,Nature,343(6255)2 69-72)）。さらに、ニューロトロフィン（neurotrophin）ＮＴ−３の局所投与によるミエリン中和抗体の共適用は、成熟したラットの脊髄軸索再成長のいくぶん大きい促進をもたらした（Schellら,Nature,367：269-272,1994）。成熟したＣＮＳミエリン蛋白質が軸索突起発達を阻止するメカニズムは未知である。培養中に、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン成長錐体の先端に適用すると、ＮＩ−３５は速やかな、劇的な成長錐体の崩壊を生じる（Bandtlowら,1993,Sc ience,259：80-83およびIgarashiら,1993,Science,259：77-79）。低濃度で抑制効果が見られ、シグナル増幅が必要であり得ることを示唆している。最近の報告から、成熟したラットＣＮＳミエリンからの抑制分子により誘発される成長錐体崩壊は、細胞内Ｃa⁺⁺レベルの上昇が先に起こり得ること（Bandtlo wら,1993,Science,259：80-83）およびＧ蛋白質経路に依存すること（Igarashi ら,1993,Science,259：77-79）が示されている。このＮＩ−３５誘発ＤＲＧ成長錐体崩壊は、Ｇ蛋白質活性化剤であって、Ｇ蛋白質ブロッカーである百日咳トキシンによってブロックされるマストパラン（mastoparan）により模倣することができる。さらに、ミエリン誘導抑制剤による成長錐体の崩壊は、ＮＩ−３５に対するモノクローナル抗体により特異的にブロックされる（Bandtlowら,1993,Scie nce,259：80-83およびIgarashiら,1993,Science,259：77-79）。かくして、ＣＮＳミエリン関連成長抑制分子は、ニューロン表面のレセプターに結合することによって導入され得るニューロンにおける活性生化学応答を引き起こすことにより作用するように見える。発明の概要成熟した哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリンの成分がニューロン成長錐体の崩壊を起こし、軸索の成長を抑制する。この活性は、ＣＮＳにおける中断された軸索の再生欠如に関与し得る。同じ活性が、線維芽セル・ラインの展着を抑制し（CaroniおよびSchnell,上記1988）、その効果が神経細胞に限定されないことを示唆している。本発明者らは、軸索突起成長に対するＣＮＳミエリンのin v ivo抑制効果と類似するin vitro軸索突起成長分析方法を開発した。本発明者らは、彼等の軸索突起成長分析方法を使用して、抑制応答のブロッキング能を有するクローンについて、ラットニューロン膜蛋白質に対するモノクローナル抗体のパネルをスクリーニングした。１０Ｄの実験室名称を有する１つのモノクローナル抗体が、ＣＮＳミエリン基質上でいくつかのニューロン・タイプにより軸索成長の抑制を中和することが見いだされた。１０Ｄモノクローナル抗体は、ウエスタンブロット法に適用すると、ニューロンおよび線維芽セル・ラインならびにラットの脳および肝臓で発現されたＭ_r３５，０００およびＭ_r３３, ０００の最も顕著なバンドを認識する。１０Ｄモノクローナル抗体に認識される蛋白質は、細胞とそれらの増殖基質との間の相互反応における役割を果たし、ミエリン抑制剤に対する細胞レセプターについての新しい候補である。また、本発明者らは、１０Ｄモノクローナル抗体を用いて成熟したラットの脳ｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングした。得られたクローンの、ニューロン・セル・ラインにおいてアンチセンス転写体として発現した場合の、抑制ＣＮＳミエリン基質における軸索成長の調節能を試験した。実験室名称Ｄ１を有するクローンからのアンチセンス構造物を含有するトランスフェクション体はミエリンでの軸索成長の十分な促進を示した。部分Ｄ１ｃＤＮＡクローンの配列分析は、それが従前に報告されていない遺伝子であることを示した。該部分ｃＤＮＡクローンの配列から由来したプローブを使用してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、軸索成長抑制の調節に関与する蛋白質をコードする、「ペトリン（"petrin"）」と命名した遺伝子を同定した。ペトリン遺伝子は、蛋白質ホスファターゼ２Ｃファミリー（"ＰＰ２Ｃ"）の新しいメンバーである６０〜６４ｋＤａの蛋白質をコードする。この新しい蛋白質を「ペトリン（Petrin）」と命名した。ヒトペトリン遺伝子座は染色体１２に局在している。本発明者らは、ペトリン遺伝子が脳組織中のニューロン、特に、小脳のプルキニエ細胞、大脳皮質の第３および第４層ならびに海馬の分散したニューロンで発現されることもin situハイブリダイゼーションで証明した。ＲＮＡブロット分析は、ラット脳中で、発現は胎児１３日目でまず検出でき、成熟脳で最高のレベルに増加したことを示した。ノーザンおよびＤＮＡ分析は、該蛋白質が、マウス、ラット、ハムスターおよびヒトのような異なる哺乳動物種に存在することも示した。免疫沈降物質でのホスファターゼ分析を使用してペトリンの生物学的機能を調べ、ペトリンが、いずれもマグネシウム依存性であるセリン／スレオニンホスファターゼ活性およびトリプシンホスファターゼ活性を有することを見いだした。また、ホスファターゼ活性は、ＭＧ１０８細胞が増殖し、軸索突起を成長させている間に最高であることが示され、末期の増殖期では検出されなかった。セリン／スレオニンホスファターゼおよびトリプシンホスファターゼ活性は、各々、オカダ酸（okadaic acid）またはオルトバナジン酸塩により阻害された。本発明者らはまた、ペトリンに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを作り、それらがin vitroの機能分析において軸索突起成長を促進することを見いだした。したがって、本発明は、軸索突起の発達に影響すると思われる被験物質の存在下、哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリン上で、軸索突起成長傾向を有するニューロン細胞を増殖させ、軸索突起の発達を分析することからなる成熟した動物の中枢神経系ミエリンによる抑制に対するニューロン細胞の応答を調節する物質の分析方法である。本発明のさらなる態様によれば、（ａ）ニューロン膜蛋白質と免疫反応し；（ｂ）哺乳動物の中枢神経系ミエリンによる軸索突起増殖の抑制を中和し；（ｃ）ニューロンおよび線維芽セル・ラインならびにラット脳およびラット肝臓で発現されたＭ_r３５,０００およびＭ_r３３,０００のバンドを認識することを特徴とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ・セル・ラインが提供される。また、本発明は、軸索突起発達を許容する条件にて、哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリン上で、既知濃度の本発明のモノクローナル抗体の存在下、かつ活性化剤または阻害剤と思われる物質の存在下で、軸索突起成長傾向を有ニューロン細胞を増殖し、軸索突起の発達を分析することを特徴とする本発明のハイブリドーマ・セル・ラインによって産生されるモノクローナル抗体の活性化剤または阻害剤の存在の分析方法を提供する。本発明の他の態様は、ニューロン細胞に存在し、その発現が哺乳動物の中枢神経系ミエリンによる軸索突起成長に必要であり、配列表の配列番号１、３、４、５、６、７および／または８あるいは図９および１１〜１４ならびに２１で示される塩基配列からなる単離された核酸分子に関する。本発明の単離、精製された核酸分子には、（ａ）配列番号１、３、４、５、６、７および／または８で示される塩基配列あるいは図９、１１〜１４および２１の配列でＴがＵであってもよい塩基配列；（ｂ）（ａ）の配列に相補性の塩基配列；（ｃ）配列番号１、３、４、５、６、７および８と、少なくとも８０〜９０％の同一性、好ましくは９０％の同一性を有する塩基配列；（ｄ）少なくとも１５個の塩基を有し、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズする核酸分子のフラグメント；または（ｅ）遺伝コードの縮重により、コドン配列において（ａ）〜（ｄ）の核酸とはいずれかが異なる核酸分子からなる核酸分子が含まれる。また、本発明は、（ａ）図２４（配列番号１２）に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする塩基配列；（ｂ）（ａ）に相補性の塩基配列；（ｃ）（ａ）と少なくとも８０％、好ましくは９０％の同一性を有する塩基配列；または（ｄ）少なくとも１５個の塩基を有し、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズする（ａ）または（ｂ）のフラグメントからなる単離され、精製された核酸分子に関する。好ましくは、単離され、精製された核酸分子には、（ａ）ＴがＵであってもよい、図２３（配列番号１１）、好ましくは、図２３（配列番号１１）の約第４８６〜第１９７７塩基に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする塩基配列；（ｂ）（ａ）に相補性の塩基配列；（ｃ）（ａ）と少なくとも８０％、好ましくは９０％の同一性を有する塩基配列；または（ｄ）少なくとも１５個の塩基を有し、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズする（ａ）または（ｂ）のフラグメントが含まれる。本発明の核酸分子またはそのフラグメントは、適当な発現ベクター、すなわち、挿入した蛋白質コード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含むベクターに挿入できる。したがって、本発明の核酸分子と、該核酸分子に作動可能に連結した転写および翻訳エレメントからなる宿主細胞の形質転換用の組み換え分子を構築できる。該組み換え分子を用いて、本発明の核酸分子またはそのフラグメントによってコードされる蛋白質またはその一部を発現する形質転換宿主細胞を作ることができる。したがって、本発明は、本発明の組み換え分子を含む宿主細胞を提供する。また、本発明は、その生殖細胞および体細胞が本発明の組み換え分子を含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物も包含する。本発明はさらに、本発明の単離、精製された核酸分子を利用する、本発明の核酸分子またはその一部によりコードされる蛋白質の製造方法を提供する。本発明の１つの具体例は、（ａ）本発明の組み換え発現ベクターを宿主細胞に導入し；（ｂ）形質転換された宿主細胞を形質転換されなかった宿主細胞から選択し；（ｃ）選択した宿主細胞をペトリンが発現する条件下で培養し；（ｄ）ペトリンを単離することを特徴とするペトリンの製造方法である。本発明はまた、本発明の核酸分子によりコードされる蛋白質も包含する。蛋白質は、配列表の配列番号２および１０ならびに図１０で示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列、およびそれらに対して少なくとも８０〜９０％の同一性を有する配列からなる。本発明の蛋白質は、脳、ＮＧ１０８およびＰＣ１２細胞に見いだすことができる。本発明の１つの具体例において、精製ペトリンが提供され、これは図２４または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する。本発明の蛋白質には、精製されたペトリン蛋白質の末端短縮体（truncations）、アナログ、ホモログおよびイソフォーム、これらの末端短縮体が包含される。本発明の蛋白質は、融合蛋白質調製のための蛋白質のような他の分子と共役してもよい。これは、例えば、融合蛋白質のＮ−末端またはＣ−末端の合成により行うことができる。本発明はまた、本発明の核酸分子、したがって、本発明の蛋白質または本発明の蛋白質の一部に対して独特のヌクレオチドプローブの構築も包含する。かくして、本発明は本発明の核酸またはそのフラグメントからなるプローブにも関する。該プローブは、例えば、検出可能な物質でラベルでき、塩基配列の混合物から本発明の蛋白質またはその一部の特性を示す蛋白質をコードする塩基配列を選択するのに使用できる。本発明はさらに、本発明の蛋白質または蛋白質の一部の、該蛋白質に特有のエピトープに対して特異性を有する抗体も包含する。抗体は検出可能な物質でラベルでき、組織または細胞中の本発明の蛋白質の検出に使用できる。本発明は、本発明の蛋白質および活性化剤または阻害剤と思われる物質の存在下、軸索突起成長傾向を有するニューロン細胞を増殖し、軸索突起の発達を分析する本発明の蛋白質の活性化剤または阻害剤の存在を分析する方法を提供する。また、本発明は、哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリン上で軸索突起成長傾向を有し、かつ、本発明の蛋白質および活性化剤または阻害剤と思われる物質の存在下で本発明の蛋白質を発現するニューロン細胞を増殖し、軸索突起の発達を分析する本発明の蛋白質の活性化剤または阻害剤の存在を分析する方法を提供する。軸索突起成長に影響する物質も、被験物質の存在下または不存在下で組織および細胞中で、本発明の新規核酸物質および／または新規蛋白質の発現パーンおよびレベルを比較することにより同定できる。本発明はまた、ニューロン成長に影響すると思われる物質を非ヒト動物または動物組織に投与し、該非ヒト動物または組織での本発明の核酸分子および／または新規蛋白質を検出し、所望により定量することを特徴とするニューロン成長に影響する物質の分析方法も包含する。また、本発明は、本発明の蛋白質または蛋白質の一部を、該蛋白質または該蛋白質の一部に結合できる少なくとも１つの物質と蛋白質−物質複合体形成可能な条件下で、反応させ、物質−蛋白質複合体、遊離物質および／または非複合蛋白質を分析することを特徴とする本発明の蛋白質または蛋白質の一部に結合できる物質の同定方法も包含する。さらに、本発明は、本発明の蛋白質またはその一部と該蛋白質に結合する物質との相互反応の活性化剤または阻害剤の存在について培養液を分析する方法も提供する。具体的には、この方法は、既知濃度の本発明の蛋白質または蛋白質の一部を用意し、該蛋白質または蛋白質の一部を、該蛋白質またはその一部と結合する物質および活性化剤または阻害剤と思われる物質と共にインキュベートし、物質−蛋白質複合体について分析することからなる。本発明は、本発明の蛋白質を、該蛋白質のホスファターゼ活性に影響すると思われる物質の存在下、該蛋白質により脱リン酸化されて脱リン酸化生成物を生成できる基質と、該基質の脱リン酸化可能条件下に反応させ、脱リン酸化生成物を分析し、該物質の不存在下で得られた生成物と比較して該物質の蛋白質のホスファターゼ活性に対する影響を測定することを特徴とする本発明の蛋白質のホスファターゼ活性に影響する物質の分析方法も包含する。また、本発明は（ａ）本発明のハイブリドーマ・セル・ラインによって産生されたモノクローナル抗体；（ｂ）本発明のハイブリドーマ・セル・ラインによって産生されたモノクローナル抗体の阻害剤および活性化剤；（ｃ）本発明の核酸分子発現の阻害剤および活性化剤；（ｄ）本発明の蛋白質の活性の阻害剤および活性化剤；および（ｅ）本発明の方法を使用して同定される物質を用いる医薬組成物および方法も包含する。本発明はまた、診断用途も有する。本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなろう。しかしながら、詳細な説明および実施例は、これらの詳細な記載から、本発明の精神および範囲内で種々の変形および修飾できることは当業者にあきらかであり、説明のためにのみ、本発明の好ましい具体例を示すものである。図の説明本発明は、図の参照でよりよく理解されるであろう：図１Ａは、ポリ−Ｌ−リシンのみ（ａ）、ポリ−Ｌ−リシン、次いで２０μｇ／ｃｍ²ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｂ）、ポリ−Ｌ−リシン、次いで２０ μｇ／ｃｍ²ＣＮＳミエリン（ｃ）でコートした組織培養プラスチック上で培養したジブチリル環状ＡＭＰ誘導ＮＧ１０８細胞の培養体の代表的な範囲の顕微鏡写真を示し、（ｄ）は、ミエリンなしのパッチで増殖する単^dbcAMPＮＧ１０８細胞を示し；図１Ｂは、ウシ血清アルブミンまたは筋肉、座骨神経および脳抽出物でコートした穴で培養後、１細胞径よりも大きな突起を有する^dbcAMPＮＧ１０８細胞の割合を示すグラフであり；図２は、ポリ−Ｌ−リシンコート穴上で異なる密度のＣＮＳミエリンで培養後２４時間で測定した突起を生じている^dbcAMPＮＧ１０８細胞を示すグラフであり；図３Ａは、１０Ｄ抗体がＣＮＳミエリンの増殖阻害効果を逆転させることを示している、ポリ−Ｌ−リシンのみまたは１０μｇ／ｃｍ²のＣＮＳミエリンで増殖した^dbcAMPＮＧ１０８細胞の顕微鏡写真を示し；図３Ｂは、１穴あたり５μｌの対照腹水（黒棒）または１０Ｄ腹水（白棒）で、２４または７２時間ＣＮＳミエリンで増殖した突起を生じている細胞の定量を示すグラフであり；図４Ａは、ポリ−Ｌ−リシンコートガラススライド上で４８時間増殖し、１：１０００に希釈した対照腹水での免疫細胞化学のために固定され、処理された細胞の顕微鏡写真であり；図４Ｂは、ポリ−Ｌ−リシンコートガラススライド上で４８時間増殖し、１：１０００に希釈した１０Ｄ腹水での免疫細胞化学のために固定され、処理された細胞の顕微鏡写真であり；図５は、マーカー蛋白質および１０μｇの肝臓、大脳（どちらも２日齢ラット由来）、^dbcAMPＮＧ１０８細胞および成熟ＣＮＳミエリン由来の蛋白質を負荷して、全蛋白質をクーマーシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）で染色し（左）、一方はニトロセルロースに転写し、１０Ｄモノクローナル抗体と反応させた（右）二個の同一の変性１３％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルを示す写真であり、；図６は、１０Ｄモノクローナル抗体で選択されるクローンを特徴付けるために使用された方策を表す模式図であり；図７は、ＰＬＬ、およびミエリン、１０Ｄ抗体有りおよび無しで突起が成長したＡ３アンチセンス形質転換細胞およびＮＧ１０８親細胞の数を示すグラフであり：図８は、ＮＧ１０８細胞および１ｋｂＤ１ｃＤＮＡインサートでプローブした形質転換細胞株Ａ３由来のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化したもののサザンブロットを示し；図９は、Ｄ１Ｔ７と名付けられたｃＤＮＡクローンＤ１のフラグメントのヌクレオチド配列を示し；図１０は、本発明の核酸分子によってコードされる蛋白質部分のアミノ酸配列を示し；図１１は、Ｄ１Ｔ３と名付けられたｃＤＮＡクローンＤ１のフラグメントのヌクレオチド配列を示し；図１２は、ＭＬ０７Ｔ３と名付けられたｃＤＮＡクローンのフラグメントのヌクレオチド配列を示し；図１３は、Ｓ４Ｔ３と名付けられたｃＤＮＡクローンのフラグメントのヌクレオチド配列を示し；図１４は、Ｓ５Ｔ７と名付けられたｃＤＮＡクローンのフラグメントのヌクレオチド配列を示し；図１５は、Ｄ１ｃＤＮＡクローンの配列決定したフラグメント部分を示す概略図であり；図１６は、対照（Ａ）および（Ｂ）新生児ラット上部頚部神経節一次ニューロンにおける１０Ｄ腹水によるミエリンの神経突起成長阻害効果の中和を示す写真であり；図１７は、Ｄ１ｃＤＮＡが対応するヒト配列を認識して、それらを染色体１２へ局在化させることを示すイムノブロットであり；図１８は、Ｄ１ｃＤＮＡが対応するヒト配列を認識して、それらを染色体１２へ局在化させることを示すブロットであり；図１９は、Ｄ１ｃＤＮＡがヒトＲＮＡ転写物を認識することを示すブロットであり；図２０は、神経突起伸長を有するＮＧ−１０８−１５細胞のミエリン濃度（μ ｇ／ｃｍ²）に対する％を示すグラフであり；図２１は、Ｄ１ｃＤＮＡクローンのフラグメントのヌクレオチド配列を示し；図２２は、Ｄ１ｃＤＮＡの配列決定領域を有する概略図を示し；図２３は、本発明のペトリン（Petrin）蛋白質のヌクレオチド配列を示し；および図２４は、本発明のペトリン（Petrin）蛋白質のアミノ酸配列および蛋白質ホスファターゼ２Ｃファミリーの他のメンバーのアミノ酸配列を示す。発明の詳細な説明本明細書では、アミノ酸残基のための標準的な略語：Ａ,Ａｌａ−アラニン；Ｃ,Ｃｙｓ−システイン；Ｄ,Ａｓｐ−アスパラギン酸；Ｅ,Ｇｌｕ−グルタミン酸；Ｆ,Ｐｈｅ−フェニルアラニン；Ｇ,Ｇｌｙ−グリシン；Ｈ,Ｈｉｓ−ヒスチジン；Ｉ，Ｉｌｅ−イソロイシン；Ｋ,Ｌｙｓ−リシン；Ｌ,Ｌｅｕ−ロイシン；Ｍ,Ｍｅｔ−メチオニン：Ｎ,Ａｓｎ−アスパラギン；Ｐ,Ｐｒｏ−プロリン；Ｑ，Ｇｌｎ−グルタミン；Ｒ,Ａｒｇ−アルギニン；Ｓ,Ｓｅｒ−セリン；Ｔ,Ｔｈｒ −スレオニン；Ｖ,Ｖａｌ−バリン；Ｗ,Ｔｒｐ−トリプトファン；Ｙ,Ｔｙｒ− チロシン；およびｐ.Ｙ.,Ｐ.Ｔｙｒ−ホスホチロシンを使用する。説明を容易にするために、本発明の説明を以下のセクション：（Ａ）ＣＮＳミエリンによる神経突成長阻害のアッセイ（Ｂ）ハイブリドーマ細胞株およびモノクローナル抗体；（Ｃ）新規な核酸分子および新規な蛋白質；および（Ｄ）ハイブリドーマ細胞株、モノクローナル抗体、核酸分子、蛋白質、および本明細書中に記載した方法を用いて同定される物質を適用するための応用に分割する。Ａ．神経突起成長阻害のアッセイ本明細書中で論議するように、本発明者は、インビトロ（in vitro）でのＣＮＳミエリンでの制限された神経突起伸長が、インビボ（in vivo）でのＣＮＳにおける制限された軸索伸長に似ているin vitroでの方法を開発した。その方法は、ニューロン細胞の成熟中枢神経系ミエリンによる阻害に対する応答を調節する物質のアッセイに使用してもよい。その方法は、神経突起成長の傾向を有するニューロン細胞の調製、神経突起成長に影響すると推測される試験物質の存在下での哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリンでのニューロン細胞の成長、および神経突起成長のアッセイを伴う。本発明の方法において使用できる神経突起成長傾向を有するニューロン細胞は、ジブチル環状ＡＭＰおよび胎児コウシ血清で誘導されたＮＧ１０８−１５ラット・神経芽腫および神経膠腫ハイブリッド細胞株、特に０.５〜１ｍＭ、特に１ｍＭのｄｂｃＡＭＰ、および５％胎児コウシ血清で１〜７日、特に２日処理した細胞を包含する。本発明の方法で使用し得る他のニューロン細胞は、５〜７日間１００ｎｇ／ｍｌＮＧＦ（Green）での誘導によって神経突起の成長を引き起こすＰＣ１２細胞、小脳ニューロン（Trenkner,E.,in Culturing Nerve Cells，Ba nker，G.，and Goslin，K.(eds)(Cambridge，USA:MIT Press)1991）、および皮質ニューロン（Baughman et al.，in Culturing Nerve cells，Banker，G．and Goslin，K.(eds)(Chambridge，USA:MIT Press)1991）を包含する。「哺乳動物ＣＮＳミエリン」は、ミエリン塩基性蛋白質およびミエリン結合糖蛋白質を含有する哺乳動物中枢神経系ミエリンの抽出物を意味する。好ましい具体例において、哺乳動物ＣＮＳミエリンは、ミエリン特異的マーカー、ミエリン塩基性蛋白質およびミエリン結合糖蛋白質のために約四倍に濃縮した調製物である。この調製物は、NortonおよびPoduslo，J．Neurochem 21:749-758，1973に記載されるように、ミエリン単離のための標準的手順に従って成熟ラット脳から得てもよい。ミエリン塩基性蛋白質およびミエリン結合糖蛋白質の量は、標準的なウェスタンブロッティング技術（Li et al.，Nature 369:747-750，1994）によって測定してもよい。ミエリンは、いずれの哺乳動物、特にヒト、ウシおよびラット、および特に成熟哺乳動物から得てもよい。好ましい具体例において、アッセイは、ヒト脳誘導ミエリンを基質として使用する。本発明は、強力な神経突起伸長阻害活性がヒトＣＮＳミエリンに存在することを発見した。ヒトＣＮＳミエリンは、強力に、新生児ラット後根神経節ニューロンおよびＮＧ−１０８−１５細胞由来の神経突起伸長を阻害する。ヒト・ＣＮＳミエリンにおける阻害活性は、密接に、成熟囓歯動物ＣＮＳミエリンで観察される神経突起成長のミエリン阻害に似ている。ヒトＣＮＳミエリンによる神経突起伸長の阻害は、傷付いたヒトＣＮＳにおけるニューロン回復および修復を増加させるための方法を開発するためのモデルとして使用することができる。哺乳動物ＣＮＳミエリンは、支持体上で懸濁液として乾燥させる。支持体は、ガラスまたはプラスチックのような固相であってもよく、例えば、チューブ、試験プレート、ディスク、穴等の形であってもよい。支持体は、好ましくは、ニューロンの伸長を促進する物質、例えばポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、フィブロネクチン、およびまたはラミニンでコートする。試験物質は、ニューロン細胞に加えられるか、または試験物質は、一般的にニューロン細胞を処理することによって持ち込まれ得る。例えば、ニューロン細胞は、試験物質をコードする配列、または神経突起成長の阻害に必要であると推測される試験物質をアンチセンス方向にコードする配列を含有する組み換え分子でトランスフェクトされ得る。本発明の前記の方法を実施する条件は、ニューロン細胞、試験物質および哺乳動物ＣＮＳミエリンの天然物および量のような因子に基づいて選択され得る。好ましい具体例において、ＣＮＳミエリン上のニューロン細胞は、約３７℃および５％ＣＯ₂にて、試験物質存在下で約１８〜７２時間、好ましくは２４および７２時間増殖する。アッセイに使用できるニューロン細胞の濃度は、１ｃｍ²当たり１００〜３０００細胞、好ましくは０．３３ｃｍ²当たり１０００細胞である。神経突起伸長は、神経突起を有するニューロン細胞の数を測定することによってアッセイする。これは、長さが１細胞径より大きい突起を有する細胞数および全細胞数の両方を数えることによって測定する。また、神経突起伸長は、神経突起形態を測定すること（Lochter et al.，J．Cell Biol.113:1159-1171，1991）、神経突起成長の生化学的相関を測定すること（Goslin and Banker，J．Cell B iol 108:1507-1515，1989）およびLeica Quanti Met 500 Plus（Leica，Deerfie ld，III）として既知のシステムのような画像分析システムを用いることによってアッセイしてもよい。本発明の方法の対照として、本方法は、ラミニンまたはＰＬＬを用いる阻害物質非存在下で、またはウシ血清アルブミンを用いる中性物質存在下でニューロン細胞を増殖させることによって行うことができる。Ｂ．ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体本発明は、（ａ）ニューロン膜蛋白質と免疫反応する；（ｂ）成熟哺乳動物中枢神経系ミエリンによる神経突起成長の阻害を中和する；および（ｃ）ニューロンおよび繊維芽細胞株において、およびラット大脳およびラット肝臓におて発現した分子量３５０００および分子量３３０００のバンドを認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を企図する。より好ましいハイブリドーマ細胞株は、研究室名称Ｄ１０を有する株である。本発明のハイブリドーマは、参照により本明細書に記載されているものと見なされるKohlerおよびMilstein,Nature 256、495(1975)および米国特許第ＲＥ３２ ,０１１、４,９０２,６１４、４,５４３,４３９、および４,４１１,９９３号において記載されているような簡便な方法を用いて形成してもよい（また、リファレンスによって本明細書中に記載されるMonoclonal Antibodies， Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，Kennet t，McKearn，and Bechtol(eds.)，1980，and Antibodies: A Laboratory Manual ，Harlow and Lane(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988参照）。一般に、ハイブリドーマ細胞株は、不死細胞株と適当に免疫された動物由来の脾臓細胞の適当な条件下での融合を伴うプロセスによって調製して、所望の抗体を得る。不死細胞株は、起源はネズミであるが、ラット、ウシ、イヌ、ヒト起源等を包含する他の哺乳動物種の細胞株を使用してもよい。不死細胞株は、ほとんどしばしば腫瘍起源、特にミエローマ細胞であるが、例えばエプスタインバーウイルス（Epstein Barr Virus）で形質転換された正常細胞を包含してもよい。いずれの不死細胞も、本発明のハイブリドーマを調製するために使用できる。細胞を生産する抗体は、融合パートナー、例えば脾臓細胞または末梢血リンパ球として使用し得る。細胞を得るべき動物は、時々、ニューロン細胞、例えばラットのクロム親和細胞腫ＰＣ−１２（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）から得られた膜フラクションで免疫してもよい。不死細胞およびリンパ球は、ハイブリドーマを形成するために、ポリエチレングリコールを融合剤として使用する標準的でよく知られた技術に従って、融合してもよい。別法で、融合は、電気融合によって成し遂げてもよい。ハイブリドーマは、適当なモノクローナル抗体選抜のために、本明細書のセクションＡに記載された方法を用いて、腹水から得た上清または精製蛋白質の反応性をアッセイすることによってスクリーニングする。ハイブリドーマは、成熟哺乳動物ＣＮＳミエリンによる神経突起成長の阻害を調節するであろう抗体のためにスクリーニングする。本発明の一の具体例内で、ラットまたはマウス、例えばＢＡＬＢ／Ｃマウスのような被験動物に、ラットのクロム親和細胞腫ＰＣ−１２のようなニューロン細胞から得た膜フラクションを注射する。膜フラクションは、生じる免疫応答を増加させるために、フロイントの完全または不完全アジュバンドのようなアジュバンドと混合してもよい。免疫開始後１〜３週間で、動物を二次免疫注射で再免疫し、その血清で、ニューロン蛋白質と反応する抗体、または本明細書に記載されたアッセイを用いて神経突起阻害をブロックする能力を試験した。動物が、そのブロッキングまたは結合活性において安定水準に達するとすぐに、該動物を犠牲にし、大量のＢ細胞を含有する器官、例えば脾臓およびリンパ節を回収する。免疫した動物から得た細胞は、エスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のようなウイルスでのトランスフェクションによって不死になり得る（Glasky and Reading ，Hybridoma 8(4):377-389，1989参照）。別法で、より好ましい具体例において、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するために、回収した脾臓および／またはリンパ節細胞懸濁液を適当なミエローマ細胞と融合させる。適当なミエローマ株は、例えばＳｐ２ミエローマ細胞を包含する（Shulman et al. ,Nature 276:269-270，1978）。融合後、細胞を適当な培地、例えばＲＰＭＩ１６４０、またはＤＭＥＭ（Dulb ecco's Modified Eagles Medium）（JRH Biosciences，Lenexa，Kansas）、ならびに付加成分、例えば胎児ウシ血清（FBS，ie.，from Hyclone，Logan，Utah，o r JRH Bioscienses）を含有する培養プレート上に置く。さらに、培地は、融合した脾臓およびミエローマ細胞の増殖を選択的に可能にする試薬、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）（Sigma Chemical Co.， St．Louis，Missouri）を含むべきである。本明細書に記載されたアッセイにおけるＣＮＳミエリンの阻害活性を調節する抗体の存在を決定するために、約７日後、生じる融合細胞または増殖しているハイブリドーマを含有する培地をスクリーニングしてもよい。また、他の技術を利用して、モノクローナル抗体を構築してもよい（William D．Huse et al.，"Generation of a Large Combinational Library of the Immu noglobulin Repertoire in Phage Lambda，"Science 246:1275-1281，December 1989参照;また、L．Sastry et al.，"Cloning of the Immunological Repertoir e in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Constraction of Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library，"Pro c Natl．Acad．Sci USA 86:5728-5732，August 1989参照;また Michelle Alting-Mees et al.，"Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas，"Strategies in Molecular Biology 3: 1 -9，January 1990参照;これらの参考文献は、商業的システムでStratacyte，La Jolla，Californiaから入手可能であり、それは、組み換え技術を経て抗体を生産できる）。また、本発明のハイブリドーマ細胞株によって生産されたモノクローナル抗体は、本発明の一部である。本発明のハイブリドーマ細胞株によって生産されたモノクローナル抗体は、ニューロン膜蛋白質と免疫反応し、免疫グロブリンＭ蛋白質クラスに属する。ニューロン膜蛋白質と免疫反応するモノクローナル抗体は、ニューロン細胞上に発現した抗原と免疫反応できる免疫グロブリンの均一集団を包含する。免疫グロブリンが、それらのアミノ酸組成および環境に依存する酸性、塩基性、または中性型で存在し得ること、およびそれらが、他の分子、例えば多糖または脂質と結合して発見され得ることが理解される。また、多くの抗体がいずれの細胞表面にも存在し得ること、別法で、ニューロン細胞上のある抗原が他の細胞タイプ上にも生じることが理解される。さらに、実際そのような抗原は、多くの抗原決定基を有する。本発明のハイブリドーマ細胞株によって生産されたモノクローナル抗体は、１またはそれ以上のこれらの決定基に対して反応し得る。ニューロン膜と結合したいずれの特徴的抗原も、必須の抗原決定基を供給し得る。ハイブリドーマ細胞株によって生産されたモノクローナル抗体が、ニューロン膜蛋白質、特にラットのクロム親和細胞腫ＰＣ−１２のようなニューロン細胞から得たニューロン膜蛋白質と選択的に反応する能力が残存するかぎり、それらが本発明の範囲内にあることが企図される。本発明ハイブリドーマ細胞株によって生産されたモノクローナル抗体は、成熟哺乳動物中枢神経系ミエリンによる神経突起成長の阻害を中和することが発見された。研究室名称１０Ｄを有するモノクローナル抗体は、ＮＧ１０８−１５細胞、ＰＣ１２^NGF細胞および一次ＳＧＣニューロン上で、１０μｇ／ｃｍ²のＣＮＳミエリンの基質による神経突起成長のほぼ完全な抑制を逆転することが示された。１０Ｄモノクロール抗体は、非阻害基質（ラミニン、ＰＬＬ）または中性基質（ＢＳＡ）での神経突起成長を増加させなかった。さらに、１０Ｄ抗体のこの成長促進効果は、純粋な非特異的ＩｇＭ抗体で、あるいは抗ガラクトースセレブロシド、抗ミエリン塩基性蛋白質または抗ミエリン結合糖蛋白質のようなＣＮＳミエリンと結合する抗体で観察されなかった。または抗ＮＣＡＭおよび抗ＴＨＹ−１；その両方がニューロンの細胞表面に存在するようなニューロンを認識する抗体を用いて観察されない。本明細書に記載されたモノクローナル抗体によって認識される抗原もまた、本発明の一部である。本発明は、本発明のモノクローナル抗体の、組織、例えば成熟ラット大脳ならびにラット肝臓、および細胞株、例えば^dbcAMPＮＧ１０８細胞およびＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞との免疫反応性を、標準的免疫細胞化学技術を用いて調べた。モノクローナル抗体は、ニューロンならびに繊維芽細胞株において、およびラット脳ならびに肝臓において発現した分子量３５０００および３３０００のバンドに対して免疫反応性があることが発見された。本発明のハイブリドーマ株によって生産されたモノクローナル抗体、特に研究室名称１０Ｄを有するモノクローナル抗体によって認識される抗原は、脳、脳幹および小脳における特異的なニューロン細胞へ、簡便な免疫細胞化学方法を用いて局在化されてもよい。特に、胎児の、新生児のおよび成熟Sprague-Dawleyラットを使用してもよい。固定した脳、小脳、脳幹または脊髄のクリオスタットセクションは、１０Ｄ腹水で１：５０ないし１：５００希釈にてインキュベートし、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ技術（ABC Vectastain）によって処理してもよい。これは、ＣＮＳにおける細胞のクラスが１０Ｄ抗原を発現することを決定付けるであろう。ニューロンおよび膠の両方が該分子を発現し得る。１０Ｄ抗原を発現するＣＮＳにおける領域を調べることができる。神経系経路のサブセットに対する抗原の可能な局在性および１０Ｄ抗原の獲得パターンは、１０Ｄ抗原の機能において重要な洞察を供給し、１０Ｄ抗原ブロッキングまたは過発現の影響を決定するために最適なニューロン集団を確立するであろう。もし、１０Ｄモノクローナル抗体が阻害的ミエリン蛋白質に対する推定のニューロンレセプターと結合するならば、ミエリン阻害剤（Wictorin et al．1990; Nature，Vol．347 :556 and Davies et al.，1994）に対して非感受性を表わす初期の発達におけるニューロンは、１０Ｄ染色に陰性であってもよい。ミエリン阻害剤に対する感受性の獲得は、ニューロン１０Ｄ免疫反応性の発生と同時に起こるべきである。また、本発明は、本発明のハイブリドーマ細胞株によって生産されるモノクローナル抗体の活性剤または阻害剤の存在をアッセイする方法を供給し、モノクローナル抗体の既知濃度存在下で、およびモノクローナル抗体の推定活性剤または阻害剤存在下で、哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリンでの神経突起成長の傾向を有するニューロン細胞の増殖、および神経突起伸長のアッセイを含む。本発明の方法は、以下に論じるような様々な応用を有する中枢神経系環境における神経突起成長の潜在的剌激剤または阻害剤の同定を可能にする。Ｃ．新規な核酸分子および蛋白質研究室名称１０Ｄを有するモノクローナル抗体を、研究室名称「Ｄ１」を有するクローンを同定するために使用した。Ｄ１クローンから誘導したアンチセンス構築物を含有するトランスフェクト細胞は、ミエリンでの神経突起の有意な増加を示した。Ｄ１ｍＲＮＡは、脳およびＮＧ１０８−１５細胞に存在する７ｋｂの転写産物であるようである。部分的Ｄ１ｃＤＮＡクローンの配列決定分析は、それが以前に報告されていない遺伝子であることを示した。本発明者は、Ｄ１クローンを配列決定し、それが配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８ならびに、図９、１１〜１４および２１に示される核酸配列を包含することを発見した。部分的配列は、以前に報告された遺伝子と同一の配列ではないことを示す。Ｄ１遺伝子における配列表に示された核酸配列の位置は、図１５に示す。Ｄ１の配列決定領域の概略図は、図１６に示す。部分的ｃＤＮＡクローンにおける配列から誘導されたプローブは、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用し、神経突起成長阻害において役割を果たす蛋白質をコードする「ペトリン（Petrin）」と名付けられた遺伝子を同定した。ペトリン遺伝子の配列は、図２３に示す。フレーム内で、推定開始コドンはヌクレオチド４８６にあり、終止コドンはヌクレオチド１９７７にある。ペトリン部位は、染色体１２に局在された。従って、本発明は、（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７および／または配列番号：８、あるいは図９、１１〜１４および２１に示される核酸配列（ここで、ＴはＵでもあり得る）；（ｂ）（ａ）に相補的な核酸配列；（ｃ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８と少なくとも８０〜９０％、好ましくは９０％同一性を有する核酸配列；（ｄ）少なくとも１５塩基であり、厳しいハイブリダイゼーション条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズするであろう核酸分子のフラグメント、または（ｅ）遺伝コードの縮重が原因で、コドン配列において（ａ）ないし（ｂ）のいずれかの核酸分子と異なる核酸分子を含む単離および精製核酸分子を提供する。また、本発明は、（ａ）図２４（または配列番号：１２）に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする核酸配列；（ｂ）（ａ）に相補的な核酸配列；（ｃ）（ａ）と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一である核酸配列；または（ｄ）少なくとも１５塩基であり、厳しいハイブリダイゼーション条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズするであろう（ａ）または（ｂ）のフラグメントを含む核酸分子に関する。好ましくは、単離および精製核酸分子は、（ａ）図２３（または配列番号：１１）、好ましくは図２３（または配列番号：１１）に示される約ヌクレオチド４８６〜１９７７に示される核酸配列（ここで、ＴはＵでもあり得る）；（ｂ）（ａ）に相補的な核酸配列；（ｃ）（ａ）に少なくとも８０〜９０％同一な、好ましくは９０％同一な核酸配列；または（ｄ）少なくとも１５塩基であり、厳しいハイブリダイゼーション条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズするであろう（ａ）または（ｂ）のフラグメントを含む。用語「単離精製された」とは、組み換えＤＮＡ法または化学法により製造された場合に細胞性物質または培地を実質的に含まない核酸、あるいは化学合成された場合に他の化学薬品を実質的に含まない核酸についていう。また「単離精製された」核酸は、当該核酸が得られる天然状態において隣接している核酸配列（すなわち、当該核酸の５'および３'末端）を実質的に含まない。用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含し、２本鎖または１本鎖のいずれであってもよい。それゆえ、本発明は、本発明核酸分子またはそのフラグメントを含む２本鎖ヌクレオチド配列であって相補的塩基配列に水素結合しているもの、さらにはこの２本鎖ヌクレオチド配列の転写により作られるＲＮＡを包含する。本発明は、ペトリン（petrin）遺伝子によりコードされる蛋白質の末端短縮体をコードしている核酸分子、および該蛋白質のアナログおよび相同体をコードしている核酸分子、およびその末端短縮体を包含することが理解されるであろう。本発明ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡのスプライシングにより生じる本発明核酸分子の変種形態は本発明に包含されることも理解されるであろう。本発明核酸分子のフラグメントは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８ならびに図９、１１ないし１４および２１に示されるヌクレオチド配列のフラグメントを包含する。本発明核酸分子をは挿入または欠失を有するように製造され、例えば、ペトリン蛋白質のアナログをコードしている核酸分子が製造されることも考えられる。さらに、本発明は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８ならびに図９、１１ないし１４および２１、または図２３もしくは配列番号：１１に示される核酸配列と実質的に同一の配列を有する核酸配列を含む核酸分子、ならびにそのフラグメントを包含することが理解されるであろう。用語「実質的に同一の配列を有する配列」は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８ならびに図９、１１ないし１４および２１、または図２３もしくは配列番号：１１に示される配列に対してわずかなあるいは意味をなさない程度の変化を有する核酸配列を意味し、すなわち、実質的に同じように機能し、本明細書セクションＡに記載のアッセイにおいて実質的に同じ活性を示すものである。その変化は局部的な変異または構造上の修飾によるものであってもよい。配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８ならびに図９、１１ないし１４および２１、または図２３もしくは配列番号：１１に示される配列に対して少なくとも８０〜９０％、好ましくは９０％の同一性を有する実質的に同じ核酸配列を有する核酸配列、ならびにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこれらの配列にハイブリダイゼーションする少なくとも１５塩基を有するそれらのフラグメントも包含される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、特異性を提供し、ミスマッチの数を減少させるが、許容される速度でハイブリダイゼーションを可能にする条件である。かかる条件は当業者に知られており、例えば、Sambrook,et al,( 1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor)に記載されている。例えば、短いヌクレオチドとのストリンジェントなハイブリダイゼーションを、高濃度のプローブ（例えば、０.０１〜１.０pmole/ml）を用い、Ｔｍよりも５〜１０℃低い温度で行ってもよい。本明細書記載のペトリン（Petrin）活性を有する蛋白質をコードしており、遺伝コードの縮重により図２３（配列番号：１１）に示す核酸配列とは異なる配列を有する単離精製された核酸分子も、本発明の範囲内である。かかる核酸は機能的に等価な蛋白質（例えば、ペトリンホスファターゼ活性を有する蛋白質）をコードするが、遺伝コードの縮重により図２３（配列番号：１１）の配列とは配列が異なる。ペトリンのヌクレオチド配列中のＤＮＡ配列多型性は、ＤＮＡにおける「サイレント」変異を生じる可能性があるが、その変異はコードされるアミノ酸には影響しない。しかしながら、ＤＮＡ配列多型性は、集団中のペトリンのアミノ酸配列中の変化を引き起こす可能性がある。ペトリン活性を有する蛋白質をコードしている核酸の１またはそれ以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３〜４％まで）におけるこれらの変化は、集団中の個体に存在している可能性があり、それは天然に対立遺伝子の変化によるものである。かかるヌクレオチド変化および結果生じるアミノ酸多型性は本発明の範囲内である。図２３もしくは配列番号：１１、または図９、１１ないし１４および２１に示す核酸配列（配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８または配列番号：１１）の全体または一部に基づく標識核酸プローブを調製し、標識核酸プローブを用いて適当なＤＮＡライブラリー（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー）をスクリーニングすることにより、ＤＮＡを含む本発明単離精製核酸分子を単離することができる。ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離された核酸を、標準的方法により配列決定することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを用いてペトリン蛋白質をコードしている核酸を選択的に増幅することにより、ＤＮＡである本発明の単離精製された核酸を単離することもできる。図９、１１ないし１４、２１または２３（配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：１１）に示すヌクレオチド配列からＰＣＲに使用する合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計することが可能である。オリゴヌクレオチドプライマーおよび標準的ＰＣＲ増幅法を用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから核酸を増幅することができる。増幅された核酸を適当なベクター中に組み込むことができ、ＤＮＡ配列分析により特徴づけることができる。種々の方法、例えば、Chirgwin et al.,Biochemi stry,18,5294-5299(1979)のグアニジニウム−チオシアネート抽出法を用いることにより全細胞ｍＲＮＡを単離することによって、ｃＤＮＡをｍＲＮＡから調製してもよい。次いで、逆転写酵素（例えば、Gibco/BRL、Bethesda,MDから市販されているMoloney MLV逆転写酵素、またはSeikagaku America,Inc.,St.Petersbur g,FLから市販されているAMV逆転写酵素）を用いてｃＤＮＡをｍＲＮＡから合成する。ペトリン蛋白質をコードしているｃＤＮＡを適当なベクター（ｃＤＮＡの転写を可能にして、ホスファターゼ活性を示す蛋白質をコードしているＲＮＡ分子を生じる）中に組み込むことにより、ＲＮＡである本発明の単離精製された核酸分子を単離することができる。例えば、ｃＤＮＡを、ベクター中のバクテリオファージプロモーター（例えばＴ７プロモーター）の下流に組み込むことができ、Ｔ７ポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを転写することができ、得られたＲＮＡを標準的方法により単離することができる。フラグメントを包含する本発明核酸分子を、標準的方法を用いて化学合成してもよい。ポリデオキシヌクレオチドを化学合成するための種々の方法が知られており、これらの方法にはペプチド合成と同様の固相合成があり、市販ＤＮＡ合成装置において十分に自動化されている（例えば、Itakuraらの米国特許第４５９８０４９号；Caruthersらの米国特許４４５８０６６およびItakuraの米国特許第４４０１７９６号および第４３７３０７１号参照）。特定の核酸分子がペトリン活性を有する蛋白質をコードしているかどうかの決定を、標準的方法により適用な宿主細胞においてｃＤＮＡを発現させ、発現蛋白質のホスファターゼ活性または発現蛋白質の軸索増殖抑制能を試験することにより行うことができる。そのようにして単離されたペトリンの生物学的活性を有するｃＤＮＡを、ジデオキシヌクレオチド鎖ターミネーション法またはマキサム− ギルバート化学的配列決定法のごとき核酸配列決定のための標準的方法により配列決定し、コードされる蛋白質のアミノ酸配列を推定することができる。例えばＰＣ／Ｇｅｎｅ（IntelliGenetics Inc.,Calif.）用の現在利用可能なコンピューターソフトウェアを用いてペトリンの開始コドンおよび非翻訳配列を決定してもよい。ペトリンをコードしている本発明核酸分子を用いてゲノムＤＮＡクローンライブラリーを探査することにより、ペトリンをコードしている遺伝子のイントロン−エキソン構造および転写調節配列を同定してもよい。慣用的方法を用いて調節エレメントを同定することができる。エレメントに作動するように連結された細菌ｌａｃＺ遺伝子のごときレポーター遺伝子を発現させることによりエレメントの機能を確認することができる。標準的手順を用いてこれらの構築物を培養細胞中または非ヒト・トランスジェニック動物中に導入してもよい。当該分野で知られた方法を用い、かかる構築物を用いて、エレメントと相互作用する核蛋白質を同定してもよい。本発明核酸分子中に含まれる列核酸配列、またはそのフラグメント、すなわち配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８ならびに図９、１１ないし１４および２１、または図２３（配列番号：１１）に示す１またはそれ以上の核酸配列を、それらの転写に関する正常な形とは逆にしてアンチセンス核酸分子を得ることもできる。当該分野で知られた手順を用い、化学合成および酵素による連結反応を用いてアンチセンス核酸分子を構築してもよい。天然に存在するヌクレオチドを用いて、あるいは分子の生物学的安定性を向上させ、またはｍＲＮＡもしくはもとの遺伝子との間に形成される２本鎖の物理的安定性を向上させるように設計された種々の修飾ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換誘導体）を用いて、本発明アンチセンス核酸分子またはそのフラグメントを化学合成してもよい。組み換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態の発現ベクターを細胞に導入することにより、アンチセンス配列を生物学的に得てもよい（細胞中おいて高効率調節領域の制御下でアンチセンス配列が生成され、また調節領域の活性は、ベクターが導入される細胞のタイプにより決定される）。本発明の１の具体例において、アンチセンス核酸分子は以下の配列：ＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＣＡＴ（配列番号：１３）を含む。このアンチセンス配列は機能的インビボアッセイにおいて軸索増殖を促進した。ペトリンのｃＤＮＡの翻訳により、１個の大きな読み枠（推定上の開始コドンであるヌクレオチド４８６からイン−フレーム停止コドンであるヌクレオチド１９７７まで）が明らかとなった。本発明者らは、推定蛋白質の１次構造を決定し、その推定分子量が６０ないし６４ｋＤａであると決定した。該蛋白質は、蛋白質ホスフェート２Ｃ（ＰＰ２Ｃ）ファミリーのメンバーに対して６０％までの同一性を有する３個ないし４個のはっきりとした領域を有している（図２４参照）。蛋白質ホスフェート２Ｃファミリーのメンバーは蛋白質のセリンまたはスレオニン残基を脱リン酸化する（Wera,S.,and B.A.Hemmings,Biochem.J.(1995)311,1 7-29によるレビュー参照）。該新規蛋白質を「ペトリン（petrin）」と命名した。また本発明者らは、インシトゥ（in situ）ハイブリダイゼーションにより、ペトリン遺伝子が脳組織中のニューロンにおいて、詳細には小脳のPurkinje細胞；大脳皮質の第３層および第４層；および海馬中の分散したニューロンにおいて発現されることを見いだした。ペトリンの発現は１３日目以降の胚において起こり、以後増加し続け、成人において発現が最大となる。該蛋白質が、マウス、ラット、ハムスター、およびヒトのごとき異なる種においても存在することもノーザンおよびＤＮＡ分析によって示された。免疫沈降した材料および他の同様のＰＰ２Ｃのメンバーについてホスファターゼアッセイを用いてペトリンの生物学的機能を調べたところ、マグネシウム依存性のセリン／スレオニンホスファターゼ活性を有することが示された。セリン／スレオニンホスファターゼおよびチロシンホスファターゼ活性は、それぞれオカダ酸（okadaic acid）またはオルトバナジン酸により阻害された。また本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを調製し、それらが機能的インビトロアッセイにおいて軸索増殖を促進することを見いだした。また、ホスファターゼ活性は、ＮＧ１０８細胞増殖中および増殖中の軸索において最高であり、後期増殖段階においては検出されないことも示された。それゆえ、本発明は、配列番号：２および１０、および図１０、および配列番号：９に示すアミノ酸配列、ならびにそれらの配列に対して８０〜９０％の同一性を有する配列を包含する。本発明の１の具体例において、蛋白質は図２４（または配列番号：１２）に示すアミノ酸配列を含む。本発明蛋白質は、脳、ＮＧ１０８、およびＰＣ１２細胞に見いだされる。全長のアミノ酸配列（図２４または配列番号：１２）のほかに、本発明蛋白質は、本明細書記載の該蛋白質の末端短縮体およびアナログおよび相同体、ならびにそれらの末端短縮体を包含する。末端短縮された蛋白質は、３ないし１９００個のアミノ酸残基からなるペプチドを含んでいてもよく、トリペプチドから１９００量体のポリペプチドのザイズであってよい。例えば、末端短縮された蛋白質は、ＰＰ２Ｃ蛋白質間で高度に保存された領域（例えば、図２４または配列番号：１２のアミノ酸２８１から３２４まで、４１１から４５１まで、５１６から５５７まで、または６３０から６４０まで）を含んでいてもよい。末端短縮された蛋白質は、配列番号：２、９、１０または図１０に示す配列を有する蛋白質も含む。末端短縮された蛋白質はアミノ基（−ＮＨ₂）、疎水性基（例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル、またはｔ−ブチルオキシカルボニル）、アセチル基、９ −フルオレニルメトキシ−カルボニル（ＰＭＯＣ）基、または高分子（脂質−脂肪酸複合体、ポリエチレングリコール、または炭水化物を包含するが、これらに限らない）をアミノ末端に有していてもよい。末端短縮された蛋白質は、カルボキシル基、アミノ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、または高分子（脂質−脂肪酸複合体、ポリエチレングリコール、または炭水化物を包含する）をカルボキシ末端に有していてもよい。また本発明蛋白質は、図２４（配列番号：１２）に示すペトリンのアナログおよび／または本明細書記載のその末端短縮体を包含してもよく、それらは１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含んでいてもよい。アミノ酸置換は保存的性質であっても、保存的性質でなくてもよい。保存的アミノ酸置換は、１個またはそれ以上のアミノ酸の、同様の電荷、サイズ、および／または疎水性のアミノ酸での置換を含む。保存的置換のみが存在する場合、生じるアナログは本明細書記載のペトリンと機能的に等価なはずである。非保存的置換は、１個またはそれ以上のアミノ酸の、同様でない電荷、サイズ、および／または疎水性の１個またはそれ以上のアミノ酸での置換を含む。１個またはそれ以上のアミノ酸の挿入を図２４（配列番号：１２）に示すアミノ酸配列中に導入してもよい。アミノ酸挿入物は、１個のアミノ酸または長さ２ないし１５個の一連のアミノ酸からなっていてもよい。例えば、アミノ酸挿入を用いて蛋白質のホスファターゼ活性を破壊してもよい。欠失は、図２４（配列番号：１２）のペトリンアミノ酸配列からの１個またはそれ以上のアミノ酸、あるいは不連続な部分（例えば、図２４または配列番号：１２のアミノ酸２８１から３２４まで、４１１から４５１まで、５１６から５５７まで、または６３０から６４０まで）の除去からなっていてもよい。欠失されたアミノ酸は連続したものであっても連続したものでなくてもよい。欠失突然変異により得られるアナログの長さの下限は約１０アミノ酸、好ましくは１００アミノ酸である。また本発明蛋白質は、図２４または配列番号：１２に示すペトリンの相同体および／または本明細書記載のその末端短縮体を包含する。かかる相同体は、そのアミノ酸配列が他の種由来のペトリン領域のアミノ酸配列を含む蛋白質であり、他の種は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書中のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件についての記載を参照のこと）にて図２４または配列番号：１２に示すペトリンを得るために用いるプローブとハイブリグイゼーションするものである。相同体はペトリンおよびＰＰ２Ｃ蛋白質に特徴的な同一の領域を有するであろう。これらのペトリン領域の外側において図２４または配列番号：１２に示すアミノ酸配列に対して約５０％類似、好ましくは８０ないし９０％類似であるアミノ酸配列を含む蛋白質はホスファターゼ活性を示し、軸索増殖を阻害するであろう。また本発明は、本発明ペトリン蛋白質のイソ形態（isoform）を含む。イソ形態は本発明蛋白質と同数かつ同種のアミノ酸を含むが、イソ形態は異なった分子構造を有する。本発明のイソ形態は、本明細書記載の本発明蛋白質と同じ特性を有する蛋白質である。また本発明は、融合蛋白質を得るために選択された蛋白質または選択可能マーカー蛋白質（下記参照）と結合したペトリン蛋白質を包含する。さらに、ペトリン蛋白質の免疫原性部分も本発明の範囲内である。組み換えＤＮＡ法を用いて本発明核酸分子によりコードされる蛋白質を調製してもよい。したがって、既知方法において、本発明核酸分子またはそのフラグメントを適当な発現ベクター中に組み込んで、蛋白質の良好な発現を確実なものにしてもよい。ベクターが使用宿主細胞に適合するものである限り、使用可能な発現ベクターはコスミド、プラスミド、または修飾ウイルスを包含する（これらに限らない）。それゆえ、本発明は、本発明核酸分子またはそのフラグメントおよび挿入配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む本発明組み換え分子を包含する。適当な転写および翻訳エレメントを種々のソース（細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫遺伝子を包含）から誘導することができる。適当な転写および翻訳エレメントの選択は、下記のごとく選択される宿主細胞に依存し、当業者により容易に行われうる。かかるエレメントの例は、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列を包含する。さらに、選択される宿主細胞および使用ベクターによっては、複製開始点、さらなるＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写誘導可能性を付与する配列のごとき他の遺伝学的エレメントを発現ベクター中に導入してもよい。必要な転写および翻訳エレメントは、もとの遺伝子および／またはその隣接領域により提供されうることも理解されよう。本発明組み換え分子は、本発明組み換え分子を用いて形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞の選択を容易にする選択可能マーカー蛋白質をコードしているレポーター遺伝子を含んでいてもよい。レポーター遺伝子の例は、β −ガラクトシダーゼのごとき蛋白質（例えばｌａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタル・ルシフェラーゼ、または免疫グロブリンもしくはその一部分（例えば、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分）をコードしている遺伝子である。β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタル・ルシフェラーゼのごときレポーター蛋白質濃度の変化によりレポーター遺伝子の転写をモニターする。このことは、本発明組み換え蛋白質の発現を可視化し、その発現のアッセイを可能にし、特に、発現および表現型に対する変異の影響を調べることを可能にする。形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション等により組み換え分子を宿主細胞中に導入することができる。宿主細胞の外来ＤＮＡを発現させる形質転換、トランスフェクション等の方法は当該分野においてよく知られている（例えば、Itakuraらの米国特許第４７０４３６２号；Hinnen et al.,PNA S USA 75:1929-1933,1978；Murrayらの米国特許第４８０１５４２号；Upshallらの米国特許第４９３５３４９号；Hagenらの米国特許第４７８４９５０号；Axel らの米国特許第４３９９２１６号；Goeddelらの米国特許第４７６６０７５号；およびSambrook et al.Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd edition,C old Sping Harbor Laboratory Press,1989参照、これらすべての開示を、参照により本明細書に記載されているものとみなす）。適当な宿主細胞は広範な原核宿主細胞および真核宿主細胞を包含し、細菌、哺乳動物、酵母または他の真菌、ウイルス、植物、または昆虫細胞があるが、好ましくはＮＧ１０８由来のセル・ラインおよびＰＣ１２のごときニューロン細胞である。本発明の実施に適する細菌宿主細胞は、イー・コリ（E.coli）、ビー・ズブチリス（B.subtilis）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、およびシュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトミセス（Streptomyces ）属、およびスタフィロコッカス（Staphylococcus）属に属する種々の種、ならびに当該分野においてよく知られた他の多くの細菌種を包含する。細菌宿主細胞の典型例は、イー・コリＢＬ２１、ＤＥ３、ストレプトミセス・リビダンス（ Streptomyces lividans）株６６を包含する。好ましくは、適当な細菌発現ベクターは、宿主細胞において機能するプロモーター、１個またはそれ以上の選択可能マーカー、および細菌の複製開始点を含む。典型的なプロモーターは、β− ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Chang et a l.,Nature 275:615,1978）、ｔｒｐプロモーター（Nichols and Yanofsky,Meth in Enzymology 101:155,1983）、ｔａｃプロモーター（Russell et al.,Gene 20 :231,1982）、およびファージＴ３プロモーター（Studier and Moffat,J.Mol.Bi ol.189:113-130,1986）を包含する。典型的な選択可能マーカーは、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子のごとき種々の抗生物質耐性マーカーを包含する。適当な発現ベクターは、ラムダ誘導体のごときバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２（Bolivar et al.,Gene 2:95,1977参照）、ｐＵＣプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（Messing,Meth in Enzymolo gy 101:20-77,1983およびVieira and Messing,Gene 19:259-268,1982）、およびｐＥＴ１０（Studier et al.,Meth in Enzymol.185:60-89,1990）のごときプラスミドを包含する。本発明の実施に適する酵母および真菌宿主細胞は、とりわけ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピシア（Pichia）属またはクルイベロミセス（Kluyveromyces）属、およびアスペルギルス（Aspergillus）属の種々の種を包含する。酵母および真菌に適する発現ベクターは、とりわけ、酵母用のＹＣ_p５０（ＡＴＣＣ番号３７４１９）、ならびにａｍｄＳクローニングベクターｐＶ３（Tumbull,Bio/Technology 7:169,1989）を包含する。酵母の形質転換についてのプロトコールも当業者によく知られている（例えば、Hinnen et al .,PNAS USA 75:1929,1978；Itoh et al.,J.Bacteriology 153:163,1983；および Cullen et al.Bio/Technology 5:369,1987参照）。本発明の実施に適する哺乳動物細胞は、とりわけ、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１），ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、Ｈｅｌａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）、ＣＨＯＰ、およびＮＳ−１細胞を包含する。一般的には、哺乳動物細胞において発現を指令するのに適する発現ベクターは、プロモーターならびに他の転写および翻訳制御配列を含んでいる。共通のプロモーターは、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥｌａ、ＣＭＶ、即時初期、免疫グロブリン重鎖プロモーターおよびエンハンサー、ならびにＲＳＶ−ＬＴＲを包含する。哺乳動物細胞のトランスフェクションのためのプロトコールは当該分野においてよく知られており、リン酸カルシウムにより媒介されるエレクトロポレーション、レトロウイルス、およびプロトプラスト融合により媒介されるトランスフェクション（Sambrookらの上記文献参照）がある。本明細書の教示により、プロモーター、ターミネーター、および適当なタイプの発現ベクターを植物、トリ、および昆虫細胞に導入するための方法を容易に行うことができる。例えば、１の具体例の範囲内で、本発明核酸を植物細胞から発現させることができる（Sinker et al.,J.Biosc(Bangalore)11,47-58,1987参照（この文献はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）のベクターについてのレビューである）；さらにZambryski et al.,Genetic Engin eering,Princuoles and Methods,Hollaender and Setlow(eds),Vol.VI,pp.253-2 78,Plenim Press,New York,1984参照（植物細胞用発現ベクター、特にｐＡＳ２０２２、ｐＡＳ２０２３およびｐＡＳ２０３４の使用が記載されている））。本発明の実施に適する昆虫細胞は、ボムビックス（Bombyx）またはスポドテラ（Spodotera）種由来の細胞およびセル・ラインを包含する。昆虫細胞における発現を指令するのに適する発現ベクターは、オートグラファ・カリフォルニア（ Autographa californica）の核ポリヘドロシスウイルス（Miller et al.,1987,G enetic Engineering,Vol.8 ed．Setler,J.K.et al.,Plenum Press,New York）およびボムビックス・モリ（Bombyx mori）の核ポリヘドロシスウイルスのごときバキュロウイルス（Maeda et al.,1985,Nature 315:592）を包含する。別法として、本発明核酸分子によりコードされている蛋白質を、マウス、ラット、ウサギ、ヤギおよびブタのごとき非ヒト・トランスジェニック動物において発現させてもよい（Hammer et al.(Nature 315:680-683,1985)、Palmiter et al . (Science 222:809-814,1983)、Brinster et al.(Proc.Natl.Acad.Sci USA 82:44 38-4442,1985)、Palmiter and Brinster（Cell 41:343-345,1985）および米国特許第４７３６８６６号参照）。固相合成（Merrifield,1964,J.Am.Chem.Assoc.85:2149-2154）または均一溶液中での合成（Houbenweyl,1987,Methods of Organic Chemistry,ed.E.Wansch,Vol .15 I and II,Thieme,Stuttgart）のごとき蛋白質化学の分野においてよく知られた方法を用いる化学合成により本発明蛋白質およびその一部分を調製してもよい。本発明蛋白質は、蛋白質またはポリペプチドのごとき他の分子に結合していてもよい。例えば、Ｎ末端またはＣ末端融合蛋白質を合成することによりこれを行うことができる。よって、組み換え法により、蛋白質のＮ末端またはＣ末端と、所望の生物学的機能を有する選択された蛋白質とを融合させることにより融合蛋白質を調製してもよい。得られる融合蛋白質は、選択された蛋白質に融合した蛋白質またはその一部分を含む。融合蛋白質の調製に使用可能な蛋白質の例は、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来の神経親和性因子（ＢＤＮＦ）、繊毛神経親和性因子（ＣＮＴＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、およびＮＴ−３のごとき神経親和性因子を包含する。Ｄ．適用本発明の核酸分子またはそのフラグメントにより、当業者であれば、細胞および組織を包含する生物材料中のヌクレオチド配列の検出において使用するためのヌクレオチド・プローブを構築することができる。プローブの例には、配列番号：１のごとき配列表およびＮＯＳ.３ないし６、７、８および９に示すフラグメントが包含される。ヌクレオチド・プローブは、³²Ｐ、³Ｈ、¹⁴Ｃなどのごとき、十分なシグナルを提供し、十分な半減期を有する放射能ラベルのごとき検出可能な物質で標識することができる。使用することができる他の検出可能な物質には、特異的な標識抗体、蛍光化合物、酵素、標識抗原に特異的な抗体、および化学ルミネセンスによって認識される抗原が包含される。適当な標識は、検出すべき核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションおよび結合の速度、ならびにハイブリダイゼーションに利用し得る核酸の量に注意をはらいつつ選択し得る。標識プローブは、Sambrookら,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(2nd ed .)に一般的に記載されているニトロセルロース繊維またはナイロン膜のごとき固体支持体上の核酸にハイブリダイズさせることができる。該ヌクレオチド・プローブを用いて、好ましくはヒト細胞中の遺伝子を検出することができ、それは本発明の核酸分子、好ましくは、本明細書中に記載したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子にハイブリダイズする。本発明の１つの具体例によれば、Ｄ１またはペトリンｃＤＮＡ(図２３または配列番号：１１)を用いて、対応するヒト遺伝子を同定し、研究し、単離することができる。本発明者らは、（配列番号：７として配列表に示す）ポジションｂｐ２３０ないしｂｐ１０９５のＤ１ｃＤＮＡ配列が、ラットおよびマウスＤＮＡで認識されるものと数が同様なヒトゲノムＤＮＡフラグメントを特異的に認識することを示した。本発明者らは、ヒト-囓歯類ハイブリッドセル・ラインのパネルを用いて、すべてのＤ１遺伝子配列が第１２染色体上に存在するヒトゲノムに検出されたことも示した。従って、Ｄ１プローブを用いて、ヒト不全症がペトリンまたはＤ１遺伝子に遺伝的にリンクしているのか否かを判断することができる。本発明者らは、ラットＤ１ｃＤＮＡを用いて、ヒトＤ１ｍＲＮＡを検出し、正常組織および疾病におけるその発現を研究できることも明らかにした。本発明の蛋白質またはその一部分を用いて、抗体を調製し得る。蛋白質に対して特異性を有する抗体は、前記のごとく宿主細胞で融合蛋白質を発現させることによって生成した融合蛋白質から生起することもできる。本発明の文脈内において、抗体とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント(例えば、ＦａｂおよびＦ(ａｂ')₂)、ならびに組換え的に作製した結合パートナーを包含すると理解される。抗体は、それが１０^-7Ｍ以上のＫ_aで結合する場合には、本発明の核酸分子によってコードされた蛋白質に対して反応性であると理解される。当業者であれば理解し得るごとく、抗体は、蛋白質に結合するのみならず、蛋白質の調節領域にも結合し、また蛋白質の生物活性を遮断するように開発し得る。ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、種々のニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットのごとき種々の恒温動物から、当業者により容易に生成し得る。簡単には、本発明の蛋白質を用いて、フロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバントのごときアジュバントと結合して、腹膜内、筋肉内、眼内、または皮下注射を介して該動物を免疫化する。幾つかの追加免疫後に、血清試料を採取し、蛋白質に対する反応性について試験する。特に好ましいポリクローナル抗血清ならば、これらのうちの１つのアッセイに対して、バックグラウンドよりも少なくとも３倍大きなシグナルを供するであろう。動物の力価が蛋白質に対するその反応に関してプラトーに達したら、週間採血によるか、または動物を全採血することによって、より多量の血清を容易に得ることができる。モノクローナル抗体も、前記したごとき従来技術を用いて容易に生成することができる。結合パートナーを組換えＤＮＡ技術を用いて構築し、特異的に結合する抗体をコードする遺伝子の可変領域を導入することができる。１つの具体例において、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからの可変領域をコードする遺伝子は、可変領域に対するヌクレオチド・プライマーを用いて増幅する。これらのプライマーは、当業者によって合成することができ、あるいは、市販供給業者から購入し得る。他のもの、Ｖ_Ha、Ｖ_Hb、Ｖ_Hc、Ｖ_Hd、Ｃ_Hl、Ｖ_LおよびＣ_L に対するプライマーを包含するマウスおよびヒトの可変領域に対するプライマーは、Stratacyte社(La Jolla,CA)から入手可能である。これらのプライマーを用いて、重鎖または軽鎖の可変領域を増幅し、ついでそれをImmunoZAP^TMHまたはIm munoZAP^TML(Stratacyte社)のごときベクターに各々挿入することができる。ついで、このベクターを発現用のE.coliに導入し得る。これらの技術を用いれば、ＶＨおよびＶＬドメインの融合物を含有する多量の一本鎖蛋白質を産生することができる(Birdら,Science,242：423-426,1988を参照されたし)。加えて、かかる技術を用いて、抗体の結合特異性を変化させることなく、「ネズミ」抗体を「ヒト」抗体に変化させることができる。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体および結合パートナーを用いて、例えば、種々の生物材料中の本発明の蛋白質を検出することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイまたは組織化学試験に用いることができる。かくして、特定の細胞性事象または病理状態におけるその役割を決定するために、該抗体を用いて試料中の蛋白質の量を定量することができ、かかる病理状態を診断し治療することができる。特に、本発明のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、例えば、細胞およびサブーサブ細胞レベルにおける免疫-組織化学分析に使用して、本発明の蛋白質を検出し、それを特定の細胞および組織ならびに特定のサブ細胞位置に位置付け、かつ発現のレベルを定量することができる。光学顕微鏡および電子顕微鏡を用いて抗原を位置決定するための当該分野で知られている組織化学技術を用いて、本発明の蛋白質を検出することができる。一般的に、蛋白質に特異的な抗体は、本明細書に記載するごとき検出可能な物質で標識することができ、該蛋白質をその検出可能な物質の存在に基づいて組織において位置決定することができる。本発明の核酸分子によってコードされる蛋白質に対して反応的な抗体に対して特異性を有する二次抗体の導入によって一次抗原-抗体反応を増幅する間接法も用いることができる。放射能標識を検出可能な物質として用いる場合、本発明の核酸分子によってコードされる蛋白質は、オートラジオグラフィーによって位置決定することができる。オートラジオグラフィーの結果は、種々の光学的方法によってか、または染色度を計測することによってオートラジオグラフ中の粒子の密度を測定することによって定量化することができる。生物、組織および胚中の本発明の核酸分子および／または蛋白質を検出し、位置決定することによって、核酸分子およびそのフラグメントならびに蛋白質を検出するための前記の方法を用いて、神経突起増殖をモニターすることができる。前記の方法を用いて本発明の蛋白質の発生的発現を研究することができ、従って、ＣＮＳにおけるニューロン増殖における蛋白質の役割に対してさらなる洞察が提供されることも当業者であれば明らかであろう。本発明は、本発明の蛋白質および予想されるアクチベーターまたはインヒビター物質の存在下で神経突起増殖の性質を有するニューロン細胞を増殖させ、神経突起の生長をアッセイすることよりなる、本発明の蛋白質のアクチベーターまたはインヒビターの存在についてアッセイする方法を提供する。本発明は、また、予想されるアクチベーターまたはインヒビター物質の存在下にて、哺乳動物の中枢神経系(ＣＮＳ)ミエリン上の神経突起増殖の性質を有し、本発明の蛋白質を発現するニューロン細胞を増殖させ、神経突起の生長をアッセイすることよりなる、本発明の蛋白質のアクチベーターまたはインヒビターの存在についてアッセイする方法も提供する。該アクチベーターまたはインヒビターは、内因性の生理物質であっても、または天然もしくは合成の薬剤であってもよい。本発明のこれらの方法を行うための条件は、好ましい神経突起の生長、およびニューロン細胞および試験物質の性質および量のごとき因子に対して注意をはらいつつ選択する。該方法により、以下に論じる種々の適用を有する中枢神経系環境における神経突起増殖の潜在的なアクチベーターまたはインヒビターの同定が許容される。細胞神経突起増殖に影響する物質は、試験物質の存在および不存在下の組織および細胞において、本発明の新規な核酸またはその蛋白質産物の発現パターンまたは発現レベルを比較することによっても同定し得る。また、本発明は、非-ヒト動物または動物の組織にニューロン増殖に影響すると予想される物質を投与し、該非-ヒト動物または組織中の本発明の核酸分子または本発明の蛋白質を検出する、および所望により定量することよりなる、ニューロン増殖に影響する物質をアッセイする方法も意図している。また、本発明は、物質-蛋白質複合体の形成を許容する条件下にて、蛋白質またはその蛋白質の一部分を該蛋白質またはその蛋白質の一部分と潜在的に結合し得る少なくとも１種の物質と反応させ、物質-蛋白質複合体、および／または遊離物質、および非-複合体形成蛋白質についてアッセイすることよりなる、本発明の蛋白質またはその蛋白質の一部分に結合し得る物質を同定する方法も意図している。なおさらに、本発明は、本発明の蛋白質またはその一部分と、該蛋白質に結合する物質との相互作用のアクチベーターまたはインヒビターの存在について、培地をアッセイする方法も提供する。具体例において、該方法は、既知濃度の本発明の蛋白質またはその蛋白質の一部分を得、物質-蛋白質複合体の形成を許容する条件下にて、蛋白質またはその蛋白質の一部分を該蛋白質または蛋白質の一部分に結合する物質、および予想されるアクチベーターまたはインヒビター物質とインキュベートし、物質複合体についてアッセイすることよりなる。また、本発明は、基質の脱ホスホリル化を許容する条件下、蛋白質のホスファターゼ活性に影響すると予想される物質の存在下にて、本発明の蛋白質と蛋白質によって脱ホスホリル化され脱ホスホリル化産物を生成し得る物質とを反応させ、脱ホスホリル化産物をアッセイし、該物質不存在下にて得られた産物を比較して蛋白質のホスファターゼ活性に対する該物質の影響を測定することよりなる、本発明のホスファターゼ活性に影響する物質についてアッセイする方法も意図している。適当な基質には、セリン、スレオニン、またはチロシンホスホ-ペプチドが包含される。基質の脱ホスホリル化を許容する条件は、基質の性質および量、基質、および蛋白質の量のごとき因子に注意をはらいつつ選択し得る。本発明のハイブリドーマセル・ラインによって産生されるモノクローナル抗体、本発明の核酸分子および蛋白質、および本発明のアンチセンス核酸分子を包含する本発明の方法を用いて同定される神経突起増殖を調節する物質は、イン・ビボにおける神経突起の生長を調節するのに有用となり、哺乳動物ＣＮＳにおける神経突起増殖／軸索再生を高める、または阻害するための戦略の基礎を形成し得る。例えば、該物質を用いて、(１)外傷性ＣＮＳ病斑後のＣＮＳにおける軸索再増殖：(２)ニューロン移植療法におけるニューロン連結の形成；ならびに(３)新たな接合を形成する生存ニューロンの能力、およびそれによるアルツハイマー病およびパーキンソン病のごときＣＮＳ神経変性性の疾患において消失したニューロン機能の幾分かの肩代わり、を向上することができる。従って、本明細書にて同定する物質を用いて、中枢神経系の外傷障害、発作、または変性性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、髄鞘脱落疾患、進行性の脊髄筋萎縮症、発作および神経組織の腫瘍から生じる外傷および虚血、癲癇、緑内障ならびに神経繊維腫症、から生じる神経障害を含む症状に関連するニューロン再生を刺激し、または阻害し得る。本明細書記載の方法または本明細書記載の抗体を用いて同定する物質は、該物質または抗体を、単独で、または他の有効物質と一緒に含有する医薬組成物に導入することができる。かかる医薬組成物は、経口、局所、直腸、非経口、局所(l ocal)、吸入または大脳内用途とすることができる。従って、それは固形または半固形の形態、例えば、丸薬、錠剤、クリーム、ゼラチンカプセル、カプセル、坐薬、軟質ゼラチンカプセル、ジェル、メンブレン、錠である。ＣＮＳに物質をクモ膜下的にデリバリーするPennら,Lancet 335(8691)：738-747,1990によって記載されている方法は、本発明の医薬組成物を投与するのに特に有用となり得る。本発明の医薬組成物は、ヒトまたは動物に投与することを意図し得る。投与すべき用量は、個人の要望、目的の効果、および選択した投与経路に依存する。医薬組成物は、患者に投与され得る医薬上許容される組成物の調製に以前に知られている方法によって、有効量の有効物質が医薬上許容されるビヒクルと混合物中で結合されるように調製し得る。適当なビヒクルは、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publ-is hing Company,Easton,Pa.,USA 1985)に記載されている。これに基づいて、該医薬組成物は、独占的にではないが、１または２以上の医薬上許容し得るビヒクルまたは希釈剤と一緒に有効な化合物または物質を含有し、生理学的流体で適当なｐＨおよび等透圧とした緩衝液中に含有される。該医薬組成物は、神経栄養因子、特にＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、Ｔ-３およびＦＧＦのごとき他の剤をさらに含有していてもよい。本発明のアンチセンス核酸分子は、遺伝子治療に用いて軸索再生を向上することができる。アンチ-センス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の論議については、Weintraub,Hら，「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysi s,Reviews-Trends in Genetics,Vol.1(1)1986」を参照されたし。アンチセンス配列またはそのオリゴヌクレオチドフラグメントを含む組換え分子は、細胞または組織に、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターのごときデリバリービヒクルを用いてイン・ビボで直接導入することができる。それは、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションのごとき物理的技術、または共沈およびリポソームへのＤＮＡの取り込みのごとき化学的方法を用いて、イン・ビボで細胞に導入することもできる。組換え分子は、エアゾールの形態で、または洗浄によってデリバリーすることもできる。本発明のアンチセンス核酸分子は、細胞への直接注射のごときによっても細胞外的に適用し得る。Freedら,New Eng.J.Med.327(22)：1549-1555,1992は、胎児細胞をパーキンソン病患者の脳に注射する方法を記載している。物質をクモ膜下的にＣＮＳにデリバリーするためのPaceら,Lancet 335(8691)：738-747によって記載れている方法も、本発明のアンチセンス核酸分子を含有する医薬組成物を投与するのに有用である。本発明のアンチセンス核酸分子は、大脳室内(intra-cer ebroventricular)投与を用いても導入し得る(例えば、C.Wahlestedtら，Nature 363：260-263,1993を参照されたし)。本発明の物質、抗体、アンチセンス核酸分子、および組成物の有用性は、動物実験モデル系で確認し得る。例えば、本発明の方法を用いて同定した１０Ｄ抗体および物質の効果は、ラット視神経におけるＣＮＳニューロンによって妨害されたニューロン経路の再生についてイン・ビボで試験し得る(Thanos,S.およびvon Boxderg,Y.,MetabolicBrai n Disease 4：67-72,1989を参照されたし)。眼神経節細胞(ＲＧＣ)からの軸索は、視神経のＣＮＳ環境に突出している。この突出は、通常は障害後に再生しないが、該軸索は非-阻害ＰＮＳ移植片に増殖し、環境的な因子を意味している。該モデルを用いて、視神経内で妨害されるＲＧＣ軸索が、試験物質および所望により神経栄養因子の存在下にて、その再生の性質を向上するか否かを判断することができる。視神経の眼神経節細胞の再生は有用なモデルである。なぜならば、全体的にＣＮＳ内のこの分離軸索突出が容易に接近でき、視神経を用いた外科的技術も知られているからである。脳へのハイブリドーマ移植を用いた以前の実験を用いて、抗体がＣＮＳへデリバリーされている。このアプローチを用いて、SchnellおよびSchwabは、ＣＮＳミエリン・インヒビターに対する抗体をデリバリーして、ＣＮＳ軸索の再生を促進することができた(Schnell,L.およびSchwab,ME.Nature 343(6255)：269-72,19 90)。さらに最近では、このグループは、インヒビター-中和抗体の使用と神経栄養因子の同時適用とを結合して、ＣＮＳ繊維の遠距離再生におけるより大きな向上を生成している(Schnellら,1994,Nature 367：170-173)。ＦＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ-３は軸索切断後のＲＧＣ生存を向上することが示されている(Johnson ら,1986,J.Neurosci.6：3031-3038；Liptonら,1988,Proc.Natl.Acad.Sci USA 85 ：2388-2392；MeyおよびThanos,1993,Brain Research 602：304-317)。かくして、ニューロトロピンを添加したか、またはしていない抗体を用いる戦略は、正の結果を得る先例および可能性を有する。視神経モデルの特異的なプロトコールは実施例６に記載する。第２のモデルには、背根神経節ニューロンの中枢処理の再生の検査が含まれる (Carlstedtら,Brain Res.Bulletin,Vol.22：93-102,1989を参照されたし)。脊髄内の末梢軸索の再成長を調節する試験物質の能力は、このモデルを用いて試験し得る。該モデルは、ＣＮＳインヒビターにも拘わらず軸索再成長の活動相に対する試験物質の効果の評価も許容する。幾つかの実験においては、３００-５００ μｇのＮＧＦまたはビヒクルを、初手術時に脊髄に注射することもできる。本発明により同定された試験物質と組み合わせた他のニューロトロピン(ＮＴ-３、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＦＧＦ)の投与も研究することができる。背根神経節ニューロンの再成長用の特異的プロトコールは実施例７に記載する。本発明により同定された物質の適用を試験するための非-ヒト動物モデルの他の例は、神経変性性症状のモデルであり、例えば、Langston,J.W.ら,Symposium of Current Concepts and Controversies in Parkinson's Disease,Montebello, Quebec,Canada,1983およびTatton,W.G.ら,Can.J.Neurol.Sci,1991,19に記載されているＭＰＴＰモデル、および外傷性神経障害、例えば、MacMillanら,Brain Re search 151：353-368(1978)に記載されているもののごとき動物発作モデルである。本発明のアンチセンス核酸分子の適用を試験するための、および特に、該分子の生理学的作用を測定するモデルは、C.Wahlestedtら， Nature 363：260-263,1993に記載されている。本発明は、本発明の核酸分子によってコードされる蛋白質の機能を検査するための方法も提供する。該蛋白質の発現を欠失した、または部分的に欠失した細胞、組織、および非-ヒト動物は、本発明の核酸分子中に特異的な欠失または挿入突然変異を有する本発明の組換え蛋白質を用いて開発し得る。組換え分子を用いて、相同性組換えにより内因性遺伝子を不活化または改変し、それによって欠損細胞、組織または動物を作製し得る。かかる突然変異細胞、組織または動物を用いて、本発明の核酸分子によってコードされる蛋白質に通常は依存する特異的な細胞集団、発生パターンおよびイン・ビボ修飾を明確にすることができる。以下の非限定的な実施例は、本発明の単なる実例である：実施例以下の物質および方法を、実施例に概略を示す研究において使用した。物質および方法細胞ラットのクロム親和性細胞腫ＰＣ−１２をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手した（メリーランド州、ロックビル、ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１７２１）。細胞を１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有のＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇibco）中で培養した。ＰＣ−１２細胞を神経増殖因子（ＮＧＦ）（１００ｎｇ／ｍｌ）と一緒に７日間分化させた。ＮＧ−１０８−１５系統の細胞をＧ.Ｃheng博士（カナダ国、マニトバ、マニトバ大学）から入手した。該細胞の調製は、Ｎelsonら、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ７３：１２３−１２７（１９７６）に記載されている。ＮＧ１０８−１５細胞を、１０％ＦＣＳ、１ｘＨＡＴ培地（Ｇibco）含有のＤＭＦ培地にて増殖させ、その細胞を血清を５％まで減少させ、かつ１ｍＭジブチリル環状アデノシン・一リン酸塩（dbcＡＭＰ）（Ｓi gma）を添加することにより、２ないし４日間、ニューロン表現型まで分化を誘発させた。一次上頚神経節ニューロンを新生ラットより得、ＰatersonおよびＣh un、Ｄev.Ｂiol.５６：２６３−２８０（１９７７）に記載されているように培養した。ペニシリン（２５Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）をすべての培地に加えた。基質の調製ＣＮＳミエリンを、前に記載されている方法（ＣaroniおよびＳchwab、Ｊ．Ｃ ell.Ｂiol １０６：１２８１−１２９８（１９８８））の変法を用い、スプレーグ・ドーリー・ラット（２５０−３００ｇ）より調製した。組織１ｇ当たり１０ｍｌの０．２５Ｍシュークロース、５ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭヨードアセトアミド（均質化緩衝液）を用い、ガラス製ホモジナイザーを用いて均質化を行った。そのホモジネートをＳorval ＨＢ−４ローター中、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離に付し、細胞残骸および核をペレット状にした。その上清を、３８ｍｌのＳＷ−２８試験管（Ｂeckman）中、２０ｍｌの０.８５Ｍシュークロース、５ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭヨードアセトアミドの頂上に層を形成させ、４℃および２８０００ｇで１時間遠心分離に付した。インターフェースを収集し、氷上に保持し、２０倍容量の３０ｍＭＨepes（pＨ７.４）、５ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭヨードアセトアミド中で洗浄した。２８０００ｇで４時間遠心分離に付した後、ペレットを均質化緩衝液中に再び懸濁させ、プロテアーゼ阻害剤、ＰＭＳＦを有する０ .８５Ｍシュークロース上に層を形成させた。サンプルを再び遠心分離（２８０００ｇ、１時間）に付し、得られたインターフェースを再び洗浄し、２８０００ｇで４時間ペレット状にし、少量の３０ｍＭＨepes（pＨ７.４）中に再び懸濁させた。ミエリン塩基性蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロット解析に付して、脳全体のホモジネートに対し、脳抽出物中にミエリンが４倍豊富に含まれることを確認した。蛋白質検定キット（Ｂio-Ｒad）および標品としてウシ血清アルブミン（ＩＶ型；Ｓigma）を用いて蛋白質測定を行った。ラットの坐骨神経、肝臓、筋肉およびヒト脳梁の抽出物を同様の方法にて調製した。抗体産生３ｘ１０⁷個のＮＧＦ処理したＰＣ−１２細胞を、１０ｍｌの０.２５Ｍシュークロース、０.１ｍＭＭgＣl、１０ｍＭＴris（ｐＨ７.４）を用い、ガラス製ホモジネーター中に均質化した。サンプルを２０００ｇで５分間遠心分離に付した。その上清を５ｍｌの試験管に移し、９００００ｇで１時間攪拌した。得られたペレットを１０ｍＭＨepes（pＨ７.４）中に再び懸濁させた。Ｂalb／Ｃマウスを、蛋白質（５０μｇ）含有のこの粗膜フラクションのアリコートで５回免疫処理に付した。すべてのマウスがＥＬＩＳＡ検定にてＰＣ−１２膜を認識する血清を産生した。脾臓リンパ球を、確立された操作（ＨarlowおよびＬane、Ａntibod ies,ＡＬaboratory Ｍanual（ＣＳＨ：ＣＳＨＬ,Ｎew Ｙork）１９８８）に従って、Ｓｐ２骨髄腫細胞（Ｓhulmanら、Ｎature ３６７：１７０−１７３（１９７８））と融合させた。一匹のマウスからの融合蛋白質をすべて９６ウェルに接種し、上清をＥＬＩＳＡ検定にてＰＣ−１２膜との反応について試験した。陽性の上清を以下に記載するインビトロのバイオアッセイにて試験した。陽性のバイオアッセイ結果を示すハイブリドーマをプールし、限界希釈培養法で接種し、クローンのセルラインを得た。クローン化ハイブリドーマ１０Ｄ由来の抗体含有の上清を採集するために、細胞を、細胞／完全Ａｂエンハンサー（Ｓtratagene）を含む細胞／完全無蛋白質補足培地中に培養した。その上清を採集し、上清中のＡｂの濃度に応じて、非希釈または希釈（１：５まで）するかのいずれかの、蛋白質結合膜の免疫検出に用いた。腹水流体を生成して高力価抗体溶液を得た。Ｂalb／Ｃマウスに腹腔内注射で不完全フロイントアジュバント（０.５ｍｌ）を投与した。翌日、動物に３５０ｍＲａｄで放射線照射し、１０⁶ないし１０⁷ハイブリドーマ細胞を注射した。２ないし３週間後、腹水を穿開術で採集した。腹水流体を３７℃で１時間インキュベートし、２０００ｇで５分間遠心分離に付した。上清をアリコートに分け、４ ℃で貯蔵した。ハイブリドーマ上清および腹水を市販のキット（Ｇibco；Ｎ.Ｙ.）を用いてアイソタイプに付した。標品として市販の免疫グロブリン（カナダ、オンタリオ、Ｈomby、Ｃedarlane、Ｒ.Ｒ＃１）を用いるＥＬＩＳＡ検定を利用して抗体濃度を測定した。スクリーニングハイブリドーマ上清の生物学的活性を試験するのに、ポリ−Ｌ−リシン処理の９６ウェル皿（皿は、各々、約０.３３ｃｍ²の表面積を有する）にミエリン蛋白質を接種した。簡単に言えば、３.３μｇのＣＮＳ抽出蛋白質を含有する７０ｍｌの懸濁液を試験ウェルに接種した。一夜乾燥した後、ウェルを１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭＮaＣlセイライン（ＰＢＳ）で２回洗浄した。紫外線を２０分間照射することで皿を滅菌処理した。５０μｌ中、１０００ないし２０００個のＰＣ−１２またはＮＧ１０８−１５細胞を等量のハイブリドーマ上清を入れた各皿に接種した。神経突起発芽後成長検定検定を９６ウェル皿（ＮunＣ）で行った。基質試験ウェルを１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リシン（Ｓigma）で予め被覆した。試験ウェルには、さらにウシ血清アルブミン（ＢＳＡＩＶ型；Ｓigma）または成体ラットの脳、坐骨神経、筋肉または肝臓のホモジネートまたは抽出物を被覆した。基質を被覆したウェルをＵＶ光処理に付し、ＰＢＳで２回洗浄した。等量の細胞懸濁液を有する５０μｌのハイブリドーマ上清を用いるか、または１００μｌの細胞中の１ないし１０μｌの腹水を用いて検定を行った。同一融合体からの対照ハイブリドーマ上清ならびにミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）、ガラクトースセレブロシド（ＧalＣ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）および神経細胞付着分子（ＮＣＡＭ）に対する抗体を生成するハイブリドーマ上清を対照に供した。骨髄腫融合パートナーＳｐ２（Ｃedarlane）由来のまたはＴhy-１（Ｎew Ｅngland Ｎuclear）に拮抗する腹水もまた対照実験にて用いた。１０００ないし２０００個の細胞をウェル毎に接種した。３７℃および５％ＣＯ₂で２４ないし７２時間培養した後、無作為な部分を撮影した。長さが１細胞径より大きな突起を有する細胞の割合を測定した。ある実験において、トリプシンを用いる基質消化の作用を研究した。基質を被覆したウェルを、室温で１０分間、ＰＢＳ中０.２５ないし０.０００２５％トリプシン（Ｓigma Ｔ−２９０４）で処理した。細胞培養培地を含有する１０％ＦＣＳでウェルを２回洗浄した。神経突起発芽後成長を前記のように測定した。免疫細胞化学ＮＧ１０８−１５細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆のマルチチャンバースライドで成長させた。細胞をＰＢＳにて洗浄し、腹水（１.５％ウマ血清含有のPBS中１：１０００希釈体）と１時間反応させた。細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで５分間固定した。１０分間洗浄した後、細胞をジアミノベンジジン（ＣＡ９４０１０、Ｂurlingame,ＡＢＣ kit Ｖector Ｌabs）を用い、ペルオキシダーゼ結合の免疫細胞化学法にて処理した。ある実験において、一次抗体を適用する前に、細胞を固定した。ウェスタンブロッティング本質的にＡusubelら、１９９３、分子生物学における最近のプロトコル、ボストン、Ｃurrent Ｐrotocolsに記載されているように、２０％メタノール転移緩衝液中、２５ボルトで一晩に生じるニトロセルロース膜上への転移に関してイムノブロットするために、サンプルを分離して調製した。膜を３％粉乳含有のＰＢＳ中で１時間プレインキュベートし、ついでリンスし、非希釈１０Ｄ上清中に２時間インキュベートし、つづいて３０分間、０.１％ツィーン（Ｔween）含有のＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）にて洗浄した。２次Ａb（ヤギ抗マウスＩｇＭ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合体）をＰＢＳ−Ｔ中１：１０００希釈体として用いた。すべての工程は室温で行った。Ａｇ／Ａｂ複合体の検出を、製造主の指示に従って、化学発光強化（ＥＣＬ）キット（Ａmersham）を用いて行った。ライブラリー・スクリーニング λgt１１成体ラットの脳ｃＤＮＡ発現ライブラリー（Ｃlontech）をそのライブラリーを供給するプロトコルハンドブックに従って１０Ｄと一緒にスクリーンに付した。簡単には、その主工程は以下のとおりであった：Ｅ．coli Ｙ１０９０ｒ−細胞を、プレート当たり３ｘ１０⁴ｐｆｕに感染させ、４２℃で３時間インキュベートした後、ＩＰＴＧ処理のＮＣ−フィルターを覆い、３７℃でさらに３.５時間インキュベートした。フィルターを取り外し、０.１％Ｔween ２０を有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）にてリンスし、２０％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ中、室温（ＲＴ）にて２時間ブロックした。その後、そのフィルターを、室温で２時間、１０Ｄハイブリドーマ上澄（１：５の希釈体）中でインキュベートした（ハイブリドーマ細胞をＡｂ−エンハンサー（Ｓtratagene）を補足した「完全無蛋白質細胞」組織培養培地にて増殖させた；得られたＡｂ濃度は１０ないし２０ｐｇ／ｍｌであった）。２次Ａｂ（ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ複合体；Ｂiorad）を、室温で１時間、ＰＢＳ中１：１０００で用いた。陽性プラークをＡmersham製のＥＣＬ化学発光キットを用いて検出した。ファージ調製、サブクローニングおよび配列解析ファージ溶菌液およびＤＮＡ抽出液を、ライブラリーハンドブックにあるプロトコルに従って得た。さらに解析するために、ｃＤＮＡ挿入体をベクターｐＢＳ −ＫＳ＋（Ｓtratagene）中にクローンし、ＡutoＲead ＳequencingキットおよびＡＬＦ配列決定システム（Ｐharmacia）を用いて配列解析を行った。プライマーはフルオレセイン標識のＴ３−およびＴ７−プライマーであった。配列解析およびデータベース検索はＧＣＧパッケージを用いて行った。実施例１ＣＮＳミエリンは、神経突起の発芽後成長を著しく阻害する。ＣＮＳミエリンの神経突起発芽後成長に対する影響を試験するために、インビトロ検定を開発した。ショ糖密度フラクションをミエリンを単離する標準操作に従って成体ラットの脳から調製し、ウェスタンブロッティングによりミエリン特異的マーカー、ミエリン塩基性蛋白質およびミエリン結合糖蛋白質について４倍富んでいると評価した（データは示さない）。この物質を、以下、「ＣＮＳミエリン」と称する。主として、ＮＧ１０８−１５ラット神経芽細胞腫および神経膠腫ハイブリッドセルラインを用いて、神経突起の成長に関する基質である物質の阻害特性を研究した。このラインの細胞は１０％血清補足培地で成長し、血清の減少に伴い、１ｍＭジブチルリル環状ＡＭＰ含有培地に移り、活性依存性アセチルコリン放出についての受容能の獲得（Ｃhristianら、ＢrainRes．１４７：２６１−２７６,１９７８）および神経突起の伸長の強化を含む表現型の変化を受ける。１ｍＭｄｂｃＡＭＰで２日間誘導されたＮＧ１０８−１５細胞（本明細書にて、^dbcAMPＮＧ１０８細胞という）をポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）単独で、またはＰＬＬで、つづいてＣＮＳミエリン蛋白質の抽出物で処理した組織培養ウェルに接種した。図１Ａはポリ−Ｌ−リシン単独（ａ）、ポリ−Ｌ−リシン、続いて２０μｇ／ｃｍ²のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｂ）およびポリ−Ｌ−リシン、続いて２０μｇ／ｃｍ²のＣＮＳミエリン（ｃ）上に接種した^dbcAMPＮＧ１０８細胞の培養体の代表的な部分の顕微鏡写真である。パネル（ｄ）はミエリン不含パッチ上で成長している唯一の^dbcAMPＮＧ１０８細胞を示す。ミエリン被覆(「ＣＮＳ」) 面と非被覆（ポリ−Ｌ−リシンについては（「ＰＬ」）面の間の境界を小さな矢印で明示する。図１ｂは、ウシ血清アルブミンまたは筋肉、坐骨神経および脳からの抽出物をポリ−Ｌ−リシン被覆ウェル上で２０μｇ／ｃｍ²にて乾燥させた場合の実験を示す。等数の^dbaAMPＮＧ１０８細胞を各ウェルに接種した。２４時間後、無作為な部分を写真撮影し、１細胞径より大きな突起を有する細胞の割合を測定した。１０ないし１６個のウェルを独立して各基質について評点を付した。図１Ｂにおける誤差バーは平均値の標準誤差を示す。*は、ポリ−Ｌ−リシンとｐ＜０.０２５で統計的に異なっていることを示し；**は、ｐ＜０.０１で有意であることを示し；***は、ｔ−試験を用いてｐ＜０.０００５であることを示す。図１から明らかなように、^dbcAMPＮＧ１０８細胞による神経突起伸長の傾向はその基質により有意に影響を受けた。ポリ−Ｌ−リシン面に接種した２４時間後、^dbcAMPＮＧ１０８細胞の６４％±５％（平均および標準誤差）が長さが１細胞径より大きな神経突起を有した。突起を有する細胞のフラクションは、２０μｇ／ｃｍ²のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または筋肉蛋白質もしくはＣＮＳミエリンと同じ方法にて調製した末梢神経ミエリンの抽出物を被覆したウェル上でわずかに減少した。反対に、成体ラットのＣＮＳミエリンでは、神経突起の形成は大きく阻害され、２４時間で^dbcAMPＮＧ１０８細胞の２％より少ない細胞が有意な神経突起を有した。ＣＮＳミエリン上の細胞は、一般に、接種後、２４ないし７２時間で略円形であった。ポリ−Ｌ−リシン上の細胞は、より拡張し、より多くの神経突起を有し、より長い突起を示した（図１Ａ）。加えて、ポリ−Ｌ−リシン面上では、分化した^dbcAMPＮＧ１０８細胞を数週間維持することができるのに対して、ＣＮＳミエリンを被覆した面では７日後に残っている生存細胞はほとんどなかった。ＣＮＳミエリンによる神経突起の成長阻害は接触依存性である。ミエリン被覆ウェルが、ミエリン蛋白質のないパッチを含有する周辺のリムを有することがしばしばあった。かかる領域にある細胞は、該検定において評点を付していないが、興味のある特性を示した。図１Ａにある１のかかる領域に示されるように、神経突起の発芽後成長の停止は、阻害基質と接触している神経突起に限定されることがよくあった。同一細胞の他の突起は影響を受けないようである。このことは、神経突起の成長の停止が阻害剤と接触している突起に限定される、接触的依存性機構を介して起こることを示唆している。試験を行って、ＣＮＳミエリンの阻害活性がトリプシン消化に対して不安定であるかどうかを測定した。室温で１０分間、０.０２５％トリプシンで処理したＣＮＳミエリンを２０μｇ／ｃｍ²で被覆したウェルは有意な阻害活性を保持しなかった。０.０００２５％トリプシンと共にインキュベートしたウェルでは、約１０％の^dbcAMPＮＧ１０８細胞が２４時間で突起を有した。図２はＣＮＳミエリンをポリ−Ｌ−リシン被覆ウェルに接種した場合の実験結果を示す。２４時間で突起を有する^dbcAMPＮＧ１０８細胞のフラクションを測定した。図２の誤差バーは平均値の標準誤差を表す。各点は２ないし１０個のウェルに由来のデータを示す。ミエリン蛋白質に富むＣＮＳ抽出物による神経突起の成長阻害は、濃度依存性であった。図２から明らかなように、突起を有する^dbcAMPＮＧ１０８細胞のフラクションは、接種したミエリンの量が増加するにつれて減少した。神経突起の発芽後成長の最大の５０％阻害が１ｃｍ²当たり約５μｇの蛋白質で観察された。この観察はＣＮＳミエリンにおける神経突起の発芽後成長の悪さはトロフィック因子の供給の欠如よりも濃度依存性阻害によることを示している。ＣＮＳミエリンに関する神経突起の成長の濃度依存性阻害がＰＣ１２細胞および一次新生上部子宮頚部神経節（ＳＣＧ）ニューロンでも同様に観察された（図示せず）。以下に示すように、これらの結果から、インビトロ検定が前記した神経突起の成長のＣＮＳミエリン阻害剤に匹敵する阻害活性を検出することがわかる。実施例２抗ニューロン抗体は阻害性ＣＮＳ誘導基質上で神経突起の発芽後成長を増大させる。成体ＣＮＳミエリン蛋白質による神経突起の成長の阻害を媒介するニューロン分子を研究するために、神経細胞膜に対するモノクローナル抗体を得、これらの抗体をこの阻害基質上で発芽後成長を促進させるその能力についてインビトロにてスクリーンに付した。モノクローナル抗ニューロン抗体のパネルを、マウスをＮＧＦ処理のＰＣ−１２細胞由来の粗膜調製物で免疫化することにより生成した。ＥＬＩＳＡでＰＣ− １２膜に対して陽性であるこれらハイブリドーマのプールを、ＣＮＳミエリン上で神経突起の発芽後成長を促進する能力について試験した。ハイブリドーマライブラリーをスクリーンするために、ＰＣ−１２または^dbcAMPＮＧ１０８細胞を、ＮＧＦまたはｄｂｃＡＭＰおよび抗体含有のハイブリドーマ上清を補足した媒体の混合物（１：１）を含む、マイクロタイターウェル中の１０μｇ／ｃｍ²のＣＮＳミエリン上で成長させた。対照レベルに比べて神経突起生成を増加させる上清を生じさせるこれらハイブリドーマのプールを限界希釈培養法で接種し、クローン系統を生成した。腹水流体を、最も高い神経突起促進活性を有する１０Ｄと言われる１の系統で生成した。その迅速な成長と、容易に誘導される神経突起の確かな増殖を伴う、神経突起の分化のため、^dbcAMPＮＧ１０８細胞を優先的にその後の実験に用いた。図３Ａは、１０Ｄ抗体がＣＮＳミエリンの成長阻害作用を逆転させることを示す、ポリ−Ｌ−リシン単独または１０μｇ／ｃｍ²のＣＮＳミエリン上で成長した^dbcAMPＮＧ１０８細胞の顕微鏡写真を示す。５μｌの対照の腹水または５μｌの１０Ｄの抗ニューロン抗体腹水を細胞接種の時にウェルに加えた。細胞を培養して７２時間後に写真撮影した。各検定における容量は全体で１０５μｌであった。バー＝１００μｍ。図３Ｂは、ウェル当たり５μｌの対照の腹水（黒バー）または１０Ｄの腹水（中抜きバー）と共に２４時間または７２時間、ＣＮＳミエリン上で成長させた突起を有する細胞の数を示す。 ^dbcAMPＮＧ１０８細胞は１０μｇ／ｃｍ²のラットＣＮＳミエリン上で神経突起をあまり拡張させることができなかったのに対して、抗体１０Ｄはこの阻害を逆にさせることができた（図３）。^dbcAMPＮＧ１０８細胞のうち１−２％だけが、ＣＮＳミエリン上、対照の腹水の存在下、２４または７２時間で神経突起を伸長させた。反対に、１０Ｄの腹水の存在下では、２４時間後に長さが１細胞径よりも大きな神経突起を有する細胞フラクションは３２％まで増加した（図３Ａ）。７２時間までは、１０Ｄを含むミエリン上で突起を有する細胞のフラクションはポリ−Ｌ−リシン上のフラクションと等しく、その抗体が完全にこの非許容基質上の成長阻害を圧倒したことを示す（図３Ａおよび３Ｂ）。１０Ｄの腹水はまた、ＰＣ−１２細胞上のミエリンの神経突起成長阻害効果も中和した。抗体１０Ｄの生物学的活性はまた、一次ニューロンでも観察された。交感上頚神経節（ＳＣＧ）ニューロンを新生児のラットから単離し、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦおよび１０μＭのシトシンアラビノフラノシド（ＡraＣ）の存在する培養中に維持させ、その条件下でニューロンは生存し、細胞体の集合体を結び付ける束の形成を容易にする豊富な神経突起を伸長させた（HawrotおよびＰatterson、 Meth.Ｅnzymol．５８：５７４−５８５，１９７９）。これらの細胞を１０μｇ／ｃｍ²ＣＮＳミエリン上に接種した場合、図１６Ａに示すように、ニューロンは細胞体の集合体として生き残るが、神経突起形成は阻害される。抗体１０Ｄ含有の腹水をＣＮＳミエリン基質上のＳＣＧニューロンの姉妹培養体に加えると、図１６Ｂに示すような神経突起の束の形成を可能とする、阻害の逆転が生じる。したがって、抗体１０Ｄは阻害ＣＮＳ環境下にある一次ニューロンによる神経突起の成長を促進するのに有用とすることができる。同じ融合体から誘導された姉妹ハイブリドーマ上清および腹水、ならびにＳｐ２細胞由来の対照腹水（ハイブリドーマ融合体のパートナー）が神経突起の成長阻害を圧倒しないため、１０Ｄでの改良された発芽後成長は非特異的免疫グロブリン作用によるものではない。ガラクトースセレブロシド（ＧalＣ）、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）およびミエリン結合糖蛋白質（ＭＡＧ）を認識するミエリン特異的抗体は神経突起の発芽後成長を促進しなかったため、この阻害基質上の１０Ｄ抗体による改良された発芽後成長は、基質中のミエリン成分の非特異的遮断によるものではないようである。同様に、ニューロン細胞に結合する免疫グロブリンは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、神経細胞付着分子（ＮＣＡＭ）およびＴhy−１に対する抗体がＣＮＳミエリンの成長阻害特性を遮断しなかったため、神経突起の発芽後成長のミエリン阻害を圧倒するのに十分ではない。これらの対照抗体と神経細胞またはミエリンとの間の相互作用を免疫細胞化学およびウェスタンブロットを用いて確認した。実施例３１０Ｄは^dbcAMPＮＧ１０８−１５およびＰＣ１２細胞を認識する抗体１０Ｄと^dbcAMPＮＧ１０８細胞の間の相互作用を確認するために、これの細胞を免疫細胞化学に付した。特に、^dbcAMPＮＧ１０８−１５細胞をポリ−Ｌ− リシン被覆のガラススライド上で４８時間成長させ、固定し、各々、１：１０００に希釈した１０Ｄ腹水（ｂ）または対照腹水（ａ）で免疫細胞化学に付した。ビオチン−アビジンおよびジアミノベンジジン系に結合する第２抗体を用いた。図４に示すように、抗体は細胞ソーマ、突起および成長したコーンと反応した。ある細胞では、その細胞表面を染色することが非常に困難であるが、細胞体を通してより拡散して染色することもしばしばであった（図４）。蛍光体接合ペルオキシダーゼを用いて標識化した第２抗体も同様の結果を示した。実施例４１０Ｄ抗体により認識される細胞蛋白質１０Ｄ抗体は、ニューロンおよび繊維芽細胞の両方と基質との相互作用に影響を及ぼすと報告されているＣＮＳミエリン阻害剤の培養液中にてニューロンに対する作用を遮断する。１０Ｄ抗体により認識される分子種を測定するために、組織およびセルライン由来の蛋白質を変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースに移し、血清不含ハイブリドーマ上清と反応させた。特に、２つの同一の変性した１３％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルを、各々、マーカー蛋白質および肝臓、脳（共に２日齢のラット由来）、^dbcAMPＮＧ１０８細胞および成体ＣＮＳミエリン（同一調製物を阻害成長基質として使用）で負荷し、同時に作動させた。１のゲルをクマシー・ブリリアント・ブルー（Ｃoomassie Ｂrilliant Ｂlue）（左）ですべての蛋白質について染色し、他をニトロセルロースに移し、１０Ｄモノクローナル抗体と反応させた。また、別々に作動させかつブロットしたゲルであって、ＮＩＨ３Ｔ３細胞由来の１０μｇの蛋白質を負荷したゲルのレーンを図５に示す。強化した化学発光検出法を用いることで数種の免疫反応種が明らかになった（図５）。Ｍ_r３５０００のバンドが、成体ラットの脳、ラットの肝臓、^dbcAMPＮＧ１０８細胞およびマウスＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞のサンプルにて突出していた。このバンドは、突出しているクマシーブルー染色のいずれの種にも相当しなかった。４つのサンプルはすべてまた、僅かにより早く泳動するバンド（Ｍ_r３３０００）を含有し、Ｍ_r３５０００のバンドに相対して、各ケースにて、強度が同程度まで減少した。強度が低下する程、さらに高いＭ_r種（Ｍ_r６００００ないし１０００００）に対する免疫反応性が、いくつかのサンプルで見られることもあった。これらのバンドがより早い泳動種の集合体を示すのか、免疫学的に交差反応であるが、分子的に異なる蛋白質であるかどうかは決定しなかった。Ｍ_r１４０００と１８０００での２つのバンドが多種のサンプルで見られ、数種の独立した実験にて一貫して２つの突出しているクマシーブルーバンドと関連付けられた。これらは、一対の豊かな広範囲に発現された蛋白質との相互作用が低親和性である結果かもしれない。１０Ｄはミエリン蛋白質と反応して、非常に豊富なミエリン塩基性蛋白質との共局在化を示す弱いシグナルだけが得られた。実施例５Ｄ１：ＣＮＳミエリン基質上で神経突起の成長阻害の修飾能を有するｃＤＮＡクローンＣＮＳミエリン阻害に対する感受性のために必要とされる細胞単位にて発現される蛋白質をコードする遺伝子をクローンするために、１０ＤＭＡｂを用いて、ベクターλｇｔ１１におけるラット脳ｃＤＮＡ（成体）ライブラリーをスクリーンした。１０⁶個のプラークの１１の再びスクリーンに付した陽性かつ部分的な配列データを得、予備的な同定を行った。加えて、各インサートを用いてＮＧ１０８細胞ならびに生後１日および成体のラットの脳由来のＲＮＡのブロットをプローブした。１１のうち６つは公知の脳−発現配列を示したが、５つはこれまで報告されていなかった。以下の基準に従って、これら１１のうちいずれをさらなる研究に付すかを決定した。１) ＮＧ１０８細胞はＣＮＳミエリンで阻害され、この阻害はＭＡｂ１０Ｄで調節されるため、そのｃＤＮＡはＮＧ１０８細胞にて発現しなければならない。２) そのｃＤＮＡはＣＮＳで発現しなければならない。３) 以前に記載されているならば、遺伝子産物は阻害基質上で成長を調節する役割に適応し得るものでなければならない。図６は１０Ｄモノクローナル抗体を用いて選択されるクローンを特徴付けるのに用いられる方法を示す模式図である。クローンＤ１、Ｄ５、Ｄ１１およびＤ１２が最も明確にこれら基準に適合した。これらのいずれのクローンがＣＮＳ阻害基質上で神経突起の成長を調節する遺伝子であるかどうかを決定するために、機能的手段を追求した。これは、アンチセンスＲＮＡの細胞発現により、特異的ｃＤＮＡに相当する遺伝子産物をダウンレギュレートし、ついでＣＮＳミエリンおよび非阻害基質における神経突起の成長特性を検定することであった（図７参照）。ｃＤＮＡ挿入体を、アンチセンス配向にて、３つの新規クローンからベクターｐＢＫ−ＣＭＶにサブクローニングに付し、そこでストロングＨＣＭＶプロモーターが哺乳動物にてトランスクリプションを行うことができる。これらの構築物はＮＧ１０８細胞にエレクトロポレートされ、安定したトランスフェクタントをＧ４１８で選択し、許容（ＰＬＬ）および阻害ＣＮＳミエリン基質上での神経突起の成長を検定した。アンチセンスＤ５およびＤ１２構築物に由来する１０の個々のラインはすべて、ＰＬＬ上で正常な成長（同定可能な突起を有する細胞の約６０−９０％）およびＣＮＳミエリン上で正常な阻害（突起を有する細胞の１−４％）を示した。反対に、アンチセンスＤ１構築物でトランスフェクションされた１９のラインのうち１５は、数種の許容基質上で正常に成長しながら、ミエリン上で有意な成長の強化を示した。アンチセンスで形質転換されたラインによる神経突起の成長度は変化した。図７（Ｄ１／Ｄ３）に示すラインでは、５６％の細胞がミエリン上で突起を成長させ、１０Ｄ抗体を付加するとほとんど効果がなくなった。Ｄ１アンチセンス構築物で形質転換された３本のラインは、種々の許容基質上の成長において有意な効果を示さなかった（データを示さず）。Ｄ１アンチセンス形質転換体のミエリン上で神経突起を伸長させる能力の強化がＤ１遺伝子発現のアンチセンス阻害によるものかどうかを試験するために、選択されたクローンを詳細に分析した。ｐＢＫ−ＣＭＶ−Ｄ１構築物の安定した組込みコピーの存在を、細胞ＤＮＡのゲルブロットをＤ１ｃＤＮＡ挿入体でプローブすることにより決定した。完全なコピーは、親のNG１０８細胞のゲノムＤＮＡ中に存在しない、構築物中にｃＤＮＡである、１.０ｋｂＥcoＲＩフラグメントを含んでいると考えられる。図８はＮＧ１０８細胞（母細胞）からＥcoＲＩで消化したゲノムＤＮＡおよび１ｋｂ D１ｃＤＮＡ挿入体でプローブした形質転換されたセルラインＡ３のサザンブロットを示す。対照のレーンは１０ｐｇのＤ１挿入体（ＥcoＲＩ−フラグメント）を含有する。図８は、クローンＡ３が、ＮＧ１０８細胞においても存在し、内在性Ｄ１遺伝子から生じると推定される複数のバンドに加えて、予想される１ｋｂの雑種フラグメントを有することを示している。このように、他のｃＤＮＡアンチセンス構築物ではなく、D１アンチセンス構築物でトランスフェクションされたＮＧ１０８細胞のクローンは、阻害性ＣＮＳミエリン基質上で神経突起を成長させる能力を獲得した。図９および１１（配列番号１および３）はｃＤＮＡクローンＤ１の両末端の２つのフラグメントの配列を示す。各フラグメントの第１ヌクレオチドはライブラリー構築にて用いられたリンカーにて付加されたＥcoＲＩである。その２個の配列を別ける約２００ｂｐの配列決定されていないギャップがある。配列決定された部分（図９および１１ならびに配列番号１および３）を検索するコンピューターデータベースより、いずれの種からも実質的に類似する配列についての報告が今までにないことがわかった（Ｇenbank release ８４.０；ＥＭＢＬ release ３９.０）。ｃＤＮＡクローンの他のフラグメントの配列を図12ないし１４に示す（配列番号４ないし６）。さらなるｃＤＮＡ配列データが得られた（配列番号７−９、図２１）。このデータの顕著な特性は；１）５'の方向に有意にオープン・リーディング・フレームが伸びている、および２）５'末端の近くに約１００−３００ｂｐのギャップがあることである。そのオープン・リーディング・フレームはこのギャップの５ '側に続いているようである（この領域のＯＲＦ参照）。配列番号８および９は該遺伝子の下流域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。Ｄ１のクローン化領域の新しい図面を図２２に示す。Ｄ１の部分的ｃＤＮＡ配列は、重複するｃＤＮＡを再びスクリーニングに付して単離することにより拡張されるであろう。市販されているライブラリーならびにロングインサートのために厳密に選択されたλgt１０ライブラリーの両方がスクリーンに付されるであろう。Ｄ１の阻害逆転特性は、ＮＧ１０８細胞をＤ１遺伝子由来の非重複フラグメントのアンチセンス構築物でトランスフェクションすることにより独立して試験されるであろう。さらなる配列データを測定し、コード蛋白質の１次構造を予測する。付加的な独立して単離されたクローンＤ１トランスフェクタント（センスおよびアンチセンスの両方）を機能的および分子の特徴付けのために培養する。細胞を阻害ＣＮＳおよび許容基質の両方の上で成長させ、神経突起の成長を本明細書に記載の標準的操作により定量する。レベルが異なる神経突起成長のラインを分子データとの相関関係で同定する。Ｄ１遺伝子の他の領域に由来のアンチセンス（ＡＳ）ＲＮＡが有効であろうと期待される；したがって、ＡＳ構築物を、それらが得られるように、Ｄ１ｃＤＮＡの新たに単離された部分から調製する。Ｐ１２細胞もまた、アンチセンスＤ１構築物でトランスフェクションされるであろう。得られたラインで、Ｄ１アンチセンスの阻害遮断活性を独立して試験してもよく、阻害およびその逆転を介在する細胞内経路をプローブするのに用いてもよい。ＮＧ１０８細胞における発現のレベルは低いため、センスおよびアンチセンスＤ１トランスクリプトを個々に測定する能力を有するＲＮase保護検定を用いてもよい（Melton,D.A,,1984,Ｎucleic Ａcids Ｒes.12：7035−7056）。この検定を用いて定常状態ｍＲＮＡレベルとミエリン成長特性とを相関させてもよい。阻害の逆転の機構がｍＲＮＡプロセッシングまたは二重螺旋を形成することによる分解のプロモーションの妨害であるならば、ｍＲＮＡレベルを減少させてもよい。また、その機構が翻訳の特異的阻害に関連しているならば、ｍＲＮＡレベルは一定に保持することができる。視覚軸策の再生成熟した雌のスプラーグ−ドーリーラット(Sprague-Dawley rat)を、ケタミン（４０−８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５−１０ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内または筋肉内投与で麻酔する。麻酔したラットにおいて、左の視神経を顕微鏡の助けを借りて暴露し、液体窒素で冷却した宝石細工用のピンセットで、球の３ｍｍ後方にて押し潰す。眼窩上切開を閉じ、動物を２−４週間回復させる。動物を次いで再び麻酔し、５μｌのアンテログレードトレーサー（３％ローダミンイソチオシアネートまたはワサビのペルオキシダーゼ）をハミルトンシリンジを用いて眼筋内に注入する。２日後、動物に過剰用量の麻酔をかけ、心臓を介してリン酸緩衝セーライン（ＰＢＳ）で潅流する。視神経を取り出し、クリオスタットで切片に切る。切片をニューロフィラメント免疫細胞化学のためおよび視覚軸策の末端の位置を決定するアンテログレードトレーサー（anterograde tracers）を検出するために処理する。実験動物において、１０Ｄ抗体または無関係の姉妹対照抗体を分泌している１００μｌ中の１０⁸個のハイブリドーマ細胞は、外科手術の時に、視神経圧搾の部位において沈積する。屠殺時に、脳脊髄液の試料を、脊柱内の１０Ｄ抗体の産生および輸送を証明するために、マウスＩｇの検出のために得る。ある実験において、１０Ｄを分泌しているハイブリドーマ細胞の適用を、ハミルトンシリンジを用いて、３００−５００μｇのＮＧＦ、ＢＤＢＦ、ＦＧＦまたはセーラインの眼内投与と関連づけられる。これらの成長因子は、傷害後のＲＧＣ生存を増強させることが示されており、１０Ｄ抗体との組み合わせにおいて、それらが、１０Ｄ抗体単独使用よりも、傷害ＣＮＳ中の軸策のより大きい増強につながるであろう。実施例７背部根ガングリオンニューロン中央突起の再生成熟した雌のスプラーグ−ドーリーラット(Sprague-Dawley rat)を、ケタミン（４０−８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５−１０ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内または筋肉内で麻酔する。顕微鏡を用いて、動物に、腰部の脊髄を暴露するために椎弓切除術を行う。Ｌ５背部根を、背部根ガングリアに近位で押し潰し、１０⁶ 個の抗体分泌ハイブリドーマ細胞は手術の部位で沈積する。１０Ｄ分泌細胞および、無関係の対照抗体を産生する姉妹クローンを用いるであろう。軸策を、脊髄に向けて２−４週間にわたり再生させる。動物に再び麻酔し、Ｌ５背部根ガングリオンを再び暴露し、上記記載のアンテログレードトレーサーを注入する。４８時間後、動物を、過剰用量の麻酔で殺し、それらをＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで潅流する。脊髄を集め、ＧＡＰ−４３免疫細胞化学のために処理し、成長期の軸策を可視化し、アンテログレードトレーサーを可視化する。犠牲的行為の時、脊柱管内の１０Ｄ抗体の産生および輸送を示すためのウェスタンブロッティングにより、分泌されたマウス免疫グロブリンを検出するために脳脊髄液の試料が得られるであろう。実施例８Ｄ１ｃＤＮＡは、対応するヒト遺伝子を同定し、研究し、単離するために用いることができる。これは、インビトロデータで示されるような、細胞−基質相互作用における他のより一般的な役割と同様、神経系の発達および成人における再生での、Ｄ１遺伝子およびその蛋白質産生物の疑わしい役割の研究を可能とするであろう。それは、ＣＮＳ中の神経繊維の再成長を増強する潜在的な治療薬剤を見いだすための薬剤発見適用における使用のための、ヒト遺伝子のクローニングおよびその発現を可能とするであろう。位置ｂｐ２３０からｂｐ１０９５までのＤ１ｃＤＮＡ配列（配列番号：７ないし図２１の配列表に示されるように）は、ラットおよびマウスＤＮＡにおいて認識されているゲノムＤＮＡフラグメントと数において類似のヒトのゲノムＤＮＡフラグメントを特に認識することが示された。さらに、ヒト−囓歯類ハイブリッド細胞株（NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository,Coriell Inst.for Medical Res.,アメリカ合衆国０８０１３ニュージャージー州、カムデン）のパネルを用いて、ヒト・ゲノムで検出された全てのＤ１遺伝子配列は、染色体１２（図１７および図１８）に検出されることが示された。このマッピングの成功は、ヒトの異常が遺伝的にＤ１遺伝子に連結するか否かを決定するために本明細書中に記載されるＤ１プローブを用いることが可能であろうことを示す。具体的には、図１７と図１８は、Ｄ１ｃＤＮＡが対応するヒト配列を認識し、それらを染色体１２に局在させることを示す。１０μｇのＤＭＡをＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動し、ナイロンメンブランにトランスファーし、Ｄ１（ｂｐ２３０ないしｂｐ１０９５）プローブとハイブリダイズさせた。試料は、ハムスター、ヒトまたはマウスのゲノムＤＮＡ（印を付けたごとく）、または、ほとんどマウスまたはハムスター染色体と、印を付けたヒト染色体を含むハイブリッド細胞株からのＤＮＡであった。ヒトに特異的なバンドは、「ハムスター／Ｃｈ１２」系からのハイブリッドＤＮＡのみに現れる。本明細書中に記載されたラットのＤ１ｃＤＮＡが、ヒトのＤ１ｍＲＮＡを検出し、正常な組織および病的な組織における発現を検出し、研究するために使用できることがまた示されてきた。図１９は、ラットＤ１配列ｂｐ２３０ないしｂｐ１０９５が、この場合外科的に除去された肺転移腫瘍から単離した、対応するヒトＲＮＡを検出できることを示す。検出された転写物は、同じゲル移動度であって、ラット脳組織およびセル・ラインからのＲＮＡにおいて検出されたものと同じゲル移動度であり、同様に豊富である。具体的には、図１９は、Ｄ１ｃＤＮＡがヒトＲＮＡ転写物を認識することを示す。肺起源のヒト転移腫瘍、およぴ成熟したラット脳からの１２μｇの全ＲＮＡを、変性させ、電気泳動し、ナイロンにトランスファーし、Ｄ１ｃＤＮＡ（ｂｐ２３０ないしｂｐ１０９５）プローブとハイブリダイズさせた。実施例９ヒトへの本発明のＣＮＳミエリン／神経突起アウトグロウスアッセイの適切さを研究するために、ヒト脳由来のミエリンを基質として用いるバイオアッセイを開発した。結果は、強力な神経突起副産物阻害活性がヒトＣＮＳミエリンにおいて現れていることを示す。ヒトＣＮＳミエリンは、新生ラット背部根ガングリオンニューロンおよびＮＧ−１０８−１５細胞からの神経突起増殖を強力に阻害する。阻害は、ミエリン濃度の増加とともに増加する（図２０）。それは神経突起およびミエリン基質の間に直接の接触に依存する。ヒトＣＮＳミエリンにおける阻害活性は、成熟した囓歯類のＣＮＳミエリンで観察される神経突起成長のミエリン阻害に密接に類似する。ヒトＣＮＳミエリンの神経突起アウトグロウスの阻害は、傷害を受けたヒトＣＮＳの回復を増強させるための方法を開発するためのモデルとして用いることができる。実施例１０配列分析重複する部分的ｃＤＮＡクローンに基づき（ラット脳ｃＤＮＡ発現ライブラリーから単離）、４５１５塩基対（ｂｐ）を配列決定し、これは、６４７アミノ酸（ａａ）をコードする１９４１ｂｐの読み枠（ＯＲＦ）を含んでいた。３つのメチオニンコドンが位置４３６、４７５および４８６にあり、これらのうち第三のものはKozakコンセンサス配列によって先行される。この発見に基づき、このＡＴＧは、翻訳開始のための最もそれらしい部位であり、コードされた蛋白質の予言された分子量は約６０ｋＤであろう。ペトリン(Petrin)と名付けられた該蛋白は、Ｃ−末端に２つの潜在的チロシンリン酸化部位を有する。トランスメンブランドメインまたは他の公知のモチーフは、配列中に見いだされなかった。今日までで、最も関連した公知の蛋白質は、蛋白質ホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２Ｃ）、多くの種類および異なる組織から単離されたｓｅｒ／ｔｈｒホスファターゼ（ Mann，D.J.ら、Biochim Biophys Acta １１３０：１００−４,１９９２；Hou，E .W.ら、Biochem Mol Biol Int ３２：７７３−７８０,１９９４；Terasawa,Tら、 Arch Biochem Biophys ３０７：３４２−９,１９９３；Kato，S.ら、Arch Bioch em Biophys ３０８：３８７−３９３,１９９５；およびT．KuromoriならびにYam amotoの、Nucleic Acids Res ２２：５２９６−５３０１,１９９４）である。ペトリンの離れた領域は、アミノ酸同一性／類似性が６３％までとなり、全ホモロジーは２０％以下である。ＤＮＡおよびＲＮＡハイブリダイゼーション実験により、マウス、ハムスターおよびヒトの非常に関連した遺伝子の存在が確実となった。ヒト・ペトリン相同体は、染色体１２に位置するであろう。発現：ノーザンブロットおよびインシトゥ分析ペトリンの発現は脳特異的のように思われる。ペトリンｍＲＮＡは肝臓、膵臓、筋肉、または線維芽細胞には検出されない。ラットの脳において、その発現は、発達するように制御される。それは、胚のＥ１３日以降に初めて検出され、年令とともに増加し、成熟したラットにおいて最高である。ＤＩＧ−ＵＴＰ標識ＲＮＡプローブ（３’）を用いたインシトゥ・ハイブリダイゼーションにより、ペトリンはニューロンにおいて特異的に発現することが示された。染色は、異なる程度で脳の全てにわたり見いだされ、いくつかの領域は、強く染色されたニューロンを含んでいる（例えば、小脳；プルキンエ細胞；第３および第４の層の細胞；海馬）．機能分析ポリクローナル抗体は、ペトリンのＣ−末端の２１０ａａを含むＧＳＴ融合蛋白質に対するウサギ中に生じた。２つの抗血清のうち１つ（ナンバー１１）は、具体的には、６０−６４ｋＤ蛋白質を沈降させる（³⁵Ｓ−標識ＮＧ１０８細胞ライセートから）。抗体（Ａｂ）は、ウエスタンブロットで機能がないだけでなく、ミエリン基質上の神経突起成長阻害を阻害する。ラット脳およびＮＧ１０８細胞からの免疫沈降物は、Ｍｇ²⁺依存ホスファターゼ（Ｐase）活性を示す。この活性は、ｔｙｒホスホーペプチドよりも、ｓｅｒ／ｔｈｒホスホ−ペプチドで行うほうが約５倍高い。ＣＯＳ細胞を、完全なＯＲＦを含む発現構築物でトランスフェクトする場合、特異的なＰａｓｅ活性は、Ａｂナンバー１１を用いて沈降することができる。この活性の大部分は、膜およびサイトゾル蛋白質内への粗分画後の細胞溶解物の可溶性画分において見い出される。ＨＡ（ヘマグルチニン）エピトープを含むペプチド配列を、再生させ、該蛋白質のＮ’−およびＣ’−末端領域にクローン化した（ＢｓｉＷＩおよびＥｃｏＲＶ部位にそれぞれ）。ペトリンのＨＡ−標識誘導体を含む発現構築物を導入し、ＣＯＳ細胞ライセートの免疫沈降のための抗−ＨＡモノクローナル抗体を用いた場合、Ｐａｓｅ活性は、３’ＨＡ−標識ペトリンで検出でき、５’−ＨＡペトリンでは非常に少なかった（１／３）（陰性対照）。ウエスタンブロットにおいて、抗−ＨＡＡｂは、ＯＲＦ−ＨＡでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの約６０ｋＤのバンドを特異的に検出する。ＮＧ１０８細胞上のアンチセンスオリゴヌクレオチドの適用およびミエリン基質の成長２つの離れたＡＴＧ、すなわち、仮定された翻訳開始部位で重複するオリゴヌクレオチド（ＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＣＡＴ）を、ｃＡＭＰ処理ＮＧ１０８細胞（終濃度１μｍｏｌ、３日間毎２４時間および第４日毎１２時間）に適用し、それらの細胞はミエリン上に引き続いて置かれた。アンチセンス処理細胞の４５％が、ミエリン上にて神経突起を拡大し、混合されたもので処理された細胞の７％および未処理の細胞の２％が神経突起の成長を示した。透過性基質ポリ−Ｌ−リジンにおいて、細胞の８０−９０％が神経突起を拡大した。好ましい具体例において、本発明の原理を例示し、記載したので、当該分野の当業者にとって、本発明が、配列および詳細において修飾され、そのような主要部から逸脱しないのが好ましい。本発明者らは、以下の請求の範囲の範囲内に入る全ての修飾を特許請求する。全ての出版物、特許および特許出願は、それぞれの出版物、特許または特許出願が、具体的に、または個々に、その完全に形で引用して一部とするのと同じ程度にここに引用して本明細書の一部とする。以下の配列表は、本願の一部をなす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｂ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラベス，モニカカナダ、エム６ジー・２ケイ９、オンタリオ、トロント、マーカム・ストリート406 番 (72)発明者ロダー，ジョンカナダ、エム５ティ・１エックス９、オンタリオ、トロント、ビバリー・ストリート 46番

Claims

【特許請求の範囲】１．軸索突起の発達に影響すると思われる被験物質の存在下、哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリン上で、軸索突起成長傾向を有するニューロン細胞を増殖させ、軸索突起の発達を分析することからなる成熟した動物の中枢神経系ミエリンによる抑制に対するニューロン細胞の応答を調節する物質の分析方法。２．ニューロン細胞に存在し、その発現が哺乳動物の中枢神経系ミエリンによる軸索突起成長に必要であり、配列表の配列番号１、３、４、５、６、７および／または８で示される塩基配列からなる単離された核酸分子。３．（ａ）配列番号１、３、４、５、６、７および／または８で示される塩基配列あるいは図９、１１〜１４および２１の配列でＴがＵであってもよい塩基配列；（ｂ）（ａ）の配列に相補性の塩基配列；（ｃ）配列番号１、３、４、５、６、７および８と、少なくとも８０〜９０％の同一性、好ましくは９０％の同一性を有する塩基配列；少なくとも１５個の塩基を有し、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズする（ａ）〜（ｃ）のフラグメント；または（ｅ）遺伝コードの縮重により、コドン配列において（ａ）〜（ｄ）の核酸とはいずれかが異なる核酸分子からなる請求項２記載の単離された核酸分子。４．（ａ）図２４（配列番号１２）に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする塩基配列；（ｂ）（ａ）に相補性の塩基配列；（ｃ）（ａ）と少なくとも８０％、好ましくは９０％の同一性を有する塩基配列；または（ｄ）少なくとも１５個の塩基を有し、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズする（ａ）または（ｂ）のフラグメントからなる単離され、精製された核酸分子。５．アンチセンセス配向にある請求項４記載の塩基配列。６．請求項４記載の塩基配列からなる宿主細胞の形質転換用の組み換え分子。７．請求項６記載の組み換え分子を含む形質転換された宿主細胞。８．（ａ）請求項６記載の組み換え発現ベクターを導入し；（ｂ）形質転換された宿主細胞を形質転換されなかった宿主細胞から選択し；（ｃ）選択した宿主細胞を蛋白質が発現する条件下で培養し；（ｄ）蛋白質を単離することを特徴とする蛋白質の製造方法。９．配列表の配列番号２または９で示されるアミノ酸配列およびそれに対して少なくとも８０〜９０％の同一性を有する配列を含み、請求項３記載の核酸分子によりコードされ、脳、ＮＧ１０８、ＰＣ１２および線維芽細胞で発現される、単離し、精製された蛋白質。１０．図２４または配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる単離し、精製された蛋白質、その末端短縮体、アナログ、ホモログおよびイソフォーム、これらの末端短縮体。１１．哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリン上で、軸索突起成長傾向を有し、かつ活性化剤または阻害剤と思われる物質の存在下で請求項１０記載の蛋白質を発現するニューロン細胞を増殖し、軸索突起の発達を分析することを特徴とする請求項１０記載の蛋白質の活性化剤または阻害剤の存在の分析方法。１２．請求項１０記載の蛋白質を、請求項１０記載の蛋白質または該蛋白質の一部に結合できる少なくとも１つの物質と蛋白質−物質複合体形成可能な条件下で、反応させ、物質−蛋白質複合体、遊離物質および／または非複合蛋白質を分析することを特徴とする請求項１０記載の蛋白質に結合できる物質の同定方法。１３．請求項１０記載の蛋白質を、該蛋白質のホスファターゼ活性に影響すると思われる物質の存在下、該蛋白質により脱リン酸化されて脱リン酸化生成物を生成できる基質と、該基質の脱リン酸化可能条件下に反応させ、脱リン酸化生成物を分析し、該物質の不存在下で得られた生成物と比較して該物質の蛋白質のホスファターゼ活性に対する影響を測定することを特徴とする請求項１０記載の蛋白質のホスファターゼ活性に影響する物質の分析方法。１４．請求項１０記載の蛋白質のエピトープに対して特異性を有する抗体。１５．（ａ）ニューロン膜蛋白質と免疫反応し；（ｂ）哺乳動物の中枢神経系ミエリンによる軸索突起増殖の抑制を中和し；（ｃ）ニューロンおよび線維芽セル・ラインならびにラット脳およびラット肝臓で発現されたＭ_r３５，０００およびＭ_r３３，０００のバンドを認識することを特徴とするモノクローナル抗体。