JP2002325584A - 組換えヒトｉｖ型コラーゲンペプチドとその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 組換えヒトIV型コラーゲンペプチドと、大腸
菌を用いたこの組換えコラーゲンペプチドの製造方法の
提供。 【解決手段】 ヒトIV型コラーゲンをコードするポリヌ
クレオチドと、非ヒトコラーゲン親水性ペブチドをコー
ドするポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドによ
って形質転換した大腸菌にヒトIV型コラーゲンと非ヒト
コラーゲン親水性ペプチドとのキメラタンパク質を発現
させることを特徴とする組換えヒトIV型コラーゲンペプ
チドの製造方法と、この方法によって製造される組換え
ヒトIV型コラーゲンペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、特定タン
パク質クローンを産出する遺伝子組換え技術によるヒト
IV型コラーゲンペプチドの製造方法とその遺伝子産物に
関するものである。さらに詳しくは、この出願は、人体
の内部・表面にもちいる医療材料等として有用な組換え
ヒトIV型コラーゲンペプチドと、その製造方法に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】コラーゲンは動物細胞に最も多量に存在
するタンパク質である。コラーゲンの主な機能の1つは
細胞の間隙に存在し、細胞どうしの結合を行なう細胞外
マトリクスとして働くことである。コラーゲンを構成す
るポリペプチドは、その中央部にGly-Xaa-Yaaのくり返
しのアミノ酸配列からなるいわゆるコラーゲン領域をも
ち、今までに１９種類以上の型が報告されている。コラ
ーゲンは繊維構造の構成・接着に関与するものと、網目
構造をとるものとに大きく区別される（中村桂子ら、
「細胞の分子生物学」第３版（1995））。I型コラーゲ
ン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、V型コラーゲ
ン、XI型コラーゲンは原繊維（collagen fibrils）の構
造体をつくり、IX型コラーゲン、XII型コラーゲンはそ
の原繊維を結合させる構造的機能を持つ。一方、IV型コ
ラーゲン、VII型コラーゲンは網目構造を構成する。繊
維状コラーゲンとして典型的なI型・III型コラーゲンは
3本のペプチド鎖のコラーゲン領域がらせん状にからま
って繊維原を形成する。それに対して、網目状構造をつ
くるIV型コラーゲンは4分子が互いに結合し平面構造を
つくる。繊維状のI型コラーゲンは成熟過程でポリペプ
チドのN・C両末端の親水性領域が切除されて疎水性にな
るのに対し、IV型コラーゲンはC末端親水性領域が切除
されない。そのため、コラーゲンペプチドを形質転換し
た宿主内で蓄積させるために重要な水和性も、IV型コラ
ーゲンペプチドでは成熟I型コラーゲンペプチドより高
いことが期待される。

【０００３】IV型コラーゲンの形成する網目状構造は表
皮の下で基底層をつくる。シート状の基底層の生理学的
機能は重要で、腎糸球体では血液から尿への通過分子を
決める濾過装置になり、肺胞においては選択的な物質透
過のフィルターになり、筋細胞・脂肪細胞・シュワン細
胞の周囲では細胞極性・細胞分化・物質代謝・再生細胞
移動などに影響をおよぼす（中村桂子ら、「細胞の分子
生物学」第3版（1995））。従って、人工臓器や人口皮
膚の医療担体素材としての利用が見込まれている。ま
た、IV型コラーゲンはガラス体レンズ包の主成分であり
（宮田暉夫、Fragrance Journal，1989年４月号：115-1
23）、角膜の基底層の重要な構成成分である。そのた
め、IV型コラーゲンペプチドは角膜移植、その他の眼科
手術に用いる医療材料としての活用が期待されている
（宮田暉夫、Fragrance Journal，1990年９月号：66-7
3）。

【０００４】なお、ヒトIV型コラーゲンは、古典的な生
化学分画法で、胎盤より分離され同定されたが、このヒ
トIV型コラーゲンはさらにCMセルロースクロマトグラフ
ィーによりα1（IV）、α2（IV）の２成分に分離された
（宮田暉夫、Fragrance Journal，1989年４月号：115-1
23）。その後、これらのペプチドをコードするcolA1(I
V)，colA2(IV)遺伝子を単離する過程でこれらの遺伝子
にホモロジーのあるcolA3(IV)，colA4(IV)，colA5(I
V)，colA6(IV)遺伝子も単離されてきた（ButkowskiRJ
ら、J Biol Chem 262:7874-7877（1987）；Hudson BG
ら、Lab Invest 61:256-269（1989）；Zhou Jら、Scien
ce 261:1167-1169（1993））。しかし、α1(IV)、α2(I
V)以外のタイプのIV型コラーゲンは生体内での現存量が
少なく（宮田暉夫、Fragrance Journal，1989年４月
号：115-123）、各器官に特異的に発現するために、バ
イオマテリアルとして汎用性は低いとされている。免疫
学的にはα3(IV)はNC1領域部分がグッドパスチャー症侯
群などの自己免疫疾患の抗原となることが報告されてい
る（Turner Nら、J Clin Invest 89:592-601（199
2））。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、IV型コ
ラーゲンを人体の内部・表面に用いる医療材料等として
利用するためには、医学的安全性が保障されなければな
らない。しかしながら、整形外科等の医療製品として用
いている牛等の哺乳動物抽出コラーゲンは抗原性を下げ
るための化学処理を施しても皮下注射テスト陽性の患者
には用いることはできない。また、欧州・日本での狂牛
病（牛海綿状脳症）発生以降、ヒト変異型クロイツフェ
ルト・ヤコブ病の原因にもなる狂牛病プリオンが容易に
不活化されず、しかも発病前に感染生物体内に長期間潜
伏するために牛コラーゲン医療材料に対する安全性はセ
ンシティブに受けとめられてきている。

【０００６】この出願の発明は、以上の事情に鑑みてな
されたものであって、人体への適用に際しても免疫学的
・病理学的安全性が保障されるヒトIV型コラーゲンペプ
チドと、その製造方法を提供することを課題としてい
る。

【０００７】

【問題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決するために非哺乳動物宿主での遺伝子組換え技術
を駆使した発明として、ヒトIV型コラーゲンをコードす
るポリヌクレオチドと、非ヒトコラーゲン親水性ぺプチ
ドをコードするポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオ
チドによって大腸菌を形質転換し、この形質転換大腸菌
にヒトIV型コラーゲンと非ヒトコラーゲン親水性ペプチ
ドとのキメラタンパク質を発現させることを特徴とする
組換えヒトIV型コラーゲンペプチドの製造方法を提供す
る。

【０００８】また、この方法においては、ヒトIV型コラ
ーゲンをコードするポリヌクレオチドが、ヒトIV型コラ
ーゲンcDNAの少なくともコラーゲン領域の一部分をカバ
ーするポリヌクレオチドであることを好ましい態様とし
ている。

【０００９】この出願はまた、前記の方法によって製造
される組換えヒトIV型コラーゲンペプチドをも提供す
る。すなわち、前記従来技術について説明したとおり、
IV型コラーゲンは遺伝子工学的製造のために良好な親水
性を有しているが、発明者らは、ペプチド末端に非ヒト
コラーゲン由来の親水性アミノ酸配列を融合させ、さら
にIV型コラーゲンの水和性を増加させることにより、こ
の発明を完成させた。

【００１０】またさらに、IV型コラーゲン遺伝子のコラ
ーゲン領域のアミノ酸配列にはGly-Xaa-Yaaのくり返し
に対する不規則配列がI型コラーゲン遺伝子よりも多く
なっている（Soininenら、FEBS Lett 225:188-194（198
7））。一般に大腸菌などにおける外来遺伝子発現系に
おいては、I型コラーゲン遺伝子のように規則性の高い
アミノ酸反復配列を持つタンパク質をコードしている遺
伝子を導入した場合、DNA上の反復塩基配列が相同組み
換えを引き起こし、導入遺伝子の発現が妨げられること
がある。これに対し、IV型コラーゲン遺伝子は不規則配
列が多い点で、発現させるコラーゲン遺伝子としては最
適な侯補の一つといえる。また、機能的・形態的に他の
型のコラーゲンとは異なるIV型コラーゲンのコラーゲン
領域ペプチドは、その内に特有な不規則アミノ酸配列を
多く有するという特徴がある。

【００１１】以下、この発明の実施形態についてさらに
詳しく説明する。

【００１２】

【発明の実施の形態】この発明の製造方法は、ヒトIV型
コラーゲンをコードするポリヌクレオチドと、非ヒトコ
ラーゲン親水性ペプチドをコードするポリヌクレオチド
との融合ポリヌクレオチドによって大腸菌を形質転換
し、この形質転換大腸菌にヒトIV型コラーゲンと非ヒト
コラーゲン親水性ペブチドとのキメラタンパク質を発現
させることを特徴とする組換えヒトIV型コラーゲンの製
造方法である。

【００１３】ヒトIV型コラーゲンをコードするポリヌク
レオチドは、前記の各ヒトIV型コラーゲン遺伝子（colA
1(IV)、colA2(IV)、colA3(IV)、colA4(IV)、colA5(IV)
およびcolA6(IV)）のcDNAを用いることができる。その
中で、特に、医療材料等のバイオマテリアル成分として
汎用性が高く、非免疫障害性であるα1(IV)およびα2(I
V)コラーゲンをそれぞれコードするcolA1(IV)およびcol
A2(IV)cDNAが望ましい態様の一つである。

【００１４】これらのcDNAポリヌクレオチドは、一例と
して、ヒト細胞由来のcDNAライブラリーからクローン化
することができる。cDNAライブラリーはヒト細胞から抽
出したpolyA RNAを鋳型として公知の方法（例えば、Mol
ecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Edition，1
989）により合成することができる。また市販のヒトcDN
Aライブラリーを用いることもできる。cDNAライブラリ
ーからこれらのcDNAをクローン化するには、公知のcDNA
配列（colAl(IV)：GenBank accession No．NM#001845、
colA2（IV）：GenBank accession No．M33653）の任意
部分の塩基配列に基づいて一本鎖ヌクレオチドを合成
し、これをプローブとして用いて、公知の方法によりコ
ロニーあるいはプラークハイブリダイゼーションによる
スクリーニングを行えばよい。また、目的とするポリヌ
クレオチドの両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチドを合成し、これをプライマーとして用いて、ヒト
細胞から単離したmRNAからRT-PCR法により増幅したヌク
レオチド鎖を前述のスクリーニングのプローブとして用
いることもできる。また、このRT-PCR法により、目的と
するポリヌクレオチドを直接調製することもできる。

【００１５】このようにして調製したヒトIV型コラーゲ
ンcDNAは、例えばヒトcolA1（IV）cDNAの場合、コード
領域は、成熟後切除されるN末端シグナルペプチド（27
残基）を除くと、Ｎ末端側から親水性７Ｓ領域（135残
基）、Gly-Xaa-Yaaくり返しのコラーゲン領域（約1278
残基）、親水性NC1領域（229残基）の構成を有してい
る。この発明では、これらの構成成分のうち、少なくと
もコラーゲン領域の一部分と必要であればさらにその外
側の親水性末端領域をカバーするポリヌクレオチドを、
非ヒトコラーゲン親水性ペプチドをコードするポリヌク
レオチドと連結させ、この融合ポリヌクレオチドを大腸
菌で発現させる方法である。

【００１６】非ヒトコラーゲン親水性ペプチドは、ヒト
コラーゲン以外の親水性ペプチドであって、ヒトコラー
ゲンとの融合タンパク質として親水性を顕著に付与する
ことのできる100アミノ酸残基以上のペプチドである。
例えば、マルトース結合タンパク質（malE）、チオレド
キシン（Trx）、ペリプラズム内酵素（Dsb）、グルタチ
オンS-トランスフェラーゼ（GST）、β-ラクタマーゼ
（bla）、カルモジュリン結合タンパク質（CBP）、セル
ロース結合ドメイン（CBD）、インテイン等のポリペプ
チドをコードする公知のポリヌクレオチド（例えば、cD
NA）を用いることができる。

【００１７】さらに、前記のヒトIV型コラーゲンをコー
ドするポリヌクレオチドと、非ヒトコラーゲン親水性ペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを、翻訳枠を一致
させて連結し、この融合ポリヌクレオチドを大腸菌用の
発現ベクターに組み換える。また、必要に応じて前記連
結部にプロテアーゼ認識・切断部位となるアミノ酸配列
をコードするポリヌクレオチドリンカーを挿入してもよ
い。このような発現ベクターは、大腸菌中で複製可能な
オリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、クロー
ニング部位、ターミネーター等を有する公知の大腸菌用
発現ベクターに、前記の融合ポリヌクレオチドを挿入結
合することによって構築することができる。あるいは、
前記のポリペプチドを融合タンパク質として発現するpE
TTrx融合システム、pETDsb融合システム、融合タンパク
質クローニングシステム-PheBo、pMalタンパク質融合シ
ステム、IMPACT T7融合システム等にヒトIVコラーゲン
をコードするポリヌクレオチドを挿入結合するようにし
てもよい。

【００１８】このようにして構築した発現ベクターを、
公知のエレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、
リポソーム法、DEAEデキストラン法等によって大腸菌に
導入し、形質転換された大腸菌を培養することによっ
て、この発明の組換えヒトIV型コラーゲンを、前記ペプ
チドとの融合タンパク質として得ることができる。培養
物から目的の融合タンパク質を単離精製するためには、
公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例え
ば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波
処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、
限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオ
ン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィーなどである。さらに、必要に応じて公知の方
法の組み合わせにより融合タンパク質の連結部分のアミ
ノ酸配列を認識・切断するプロテアーゼを反応させて、
融合タンパク質からIV型コラーゲンペプチドを回収する
ことができる。

【００１９】以下、実施例を示して、この出願の発明を
さらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の
例に限定されるものではない。

【００２０】

【実施例】実施例１ 基本的な方法は、Sambrook Jらのプロトコール集（Mole
cular Cloning A Laboratory Manual，2nd Edition, (1
989)）に準拠した。主な手順は以下のとおりである。培
養したヒト繊維芽細胞より全RNAを抽出し、これを用い
てオリゴdTセルロースによりpolyA RNAを精製した。こ
のpolyA RNAを鋳型にしてZAP-cDNA Synthesis Kit（Str
atagene）を用いてcDNAを合成し、Uni-ZAP XR Vector K
it（Stratagene）によりcDNAライブラリーを作成した。
また、前述のcDNAと２つのオリゴDNAプライマー（配列
番号２および３）を用いてPCR反応を行い、得られた0.6
kbのDNA断片をプローブとしてcDNAライブラリーをスク
リーニングし、クローンpHFB1-1bを得た。このクローン
の３’非コード領域の塩基配列を決定し、その配列をGe
nBankデータベースで検索した結果、同クローンがヒトc
olA1(IV)遺伝子由来のcDNAであることを確認した。この
cDNAクローンのインサート由来の0.9kbのBamHI・HindII
I断片を発現ベクターpMalc（New England Biolabs）に
クローニングし、プラスミドpMalCol9bを作成した（図
１）。クローニングした0.9kbのBamHI・HindIIIDNA断片
の塩基配列を確認するために、pMalCol9bを鋳型としダ
イターミネターシークエンスＦＳレディーリアクション
キット（PE Applied Biosystems）を用いて、塩基配列
を決定した。その結果、前述の塩基配列とこれ対応する
アミノ酸配列が配列番号１のとおりであることが確認さ
れた。公知のcDNA配列（GenBank accession No．NM#001
845）を参照にすると、開始コドンの第1塩基から5010番
塩基までの領域がタンパク質コード領域であり、ここに
1669残基のアミノ酸がコードされている（図1）。pMalC
ol9bの塩基配列を調べた結果、このヒトcolA1(IV)cDNA
の配列のうち、第4294番塩基のBamHIサイトから第5216
番塩基のHindIIIサイトまでのDNA断片（第1432残基のグ
リシンから第1670残基のストップコドンまでの領域とそ
れに続く約0.2kbの３’非コード領域に対応する）部分
（配列番号1）が、malE遺伝子にインフレームでコード
されていることを確認した。

【００２１】このプラスミドpMalCol9bを大腸菌（Esche
richia coli）XLlblue（Stratagene）に導入後、37℃で
前培養し、イソプロピルチオガラクトピラノシド（IPT
G）を添加後２時間培養した。SDS PAGE法により各時期
の細胞を電気泳動し、CBB染色または抗ヒトIV型コラー
ゲン抗体（抗マルチプルアンチジェンタイプIVコラーゲ
ン抗体、LSL）を用いたウエスタンブロット解析を行っ
た。結果は図２に示したとおりである。IPTG添加２時間
後、約68kDの位置に抗ヒトIV型コラーゲン抗体に認識さ
れるタンパク質が検出された。 実施例２ 図１に示した方法でヒトIV型コラーゲンcDNA 0.9kb Bam
HI・HindIII断片を発現ベクターpMalc2にクローニング
し、マルトース結合タンパク質（MBP）との融合タンパ
ク質として発現させた。アミロース樹脂によりアフィニ
ティー精製したところSDS PAGEゲル上で約68kDの融合タ
ンパク質がほぼ単一バンドとして回収された。大腸菌破
砕後の精製過程等で一部分の融合タンパク質の低分子化
が見られた。プロテアーゼファクターXa処理によりMBP
とIV型コラーゲンペプチドとのリンカー配列にあるファ
クターXaの認識配列の切断を試みた（図３）。その結
果、融合タンパク質から42kDのMBPが切り離され、ファ
クターXaを構成するペプチドとは異なる約23kDのコラー
ゲン遺伝子産物が確認された。プロテアーゼ処理後のMB
P、コラーゲン遺伝子産物、プロテアーゼの混合液は、
公知のカラムクロマトグラフィー等の方法を組み合わせ
ることによりそれぞれを単離することができる。以上の
ことから融合タンパク質からヒトIV型コラーゲンペプチ
ドのみを単離できることを確認した。

【００２２】発現させた前述の0.9kb BamHI・HindIII断
片は、C末端のNC1領域の上流に３リピートのGly-Xaa-Ya
aのアミノ酸くり返し配列をコードするが、公知のヒトI
V型cDNA配列の中で、このくり返し配列をより長く含む
領域の発現をおこなった（図４A,B,C）。ヒトIV型コラ
ーゲンcDNAの1.6kb EcoRI・HindIII断片にはC末端の468
残基のアミノ酸配列がコードされ、この中のコラーゲン
領域部分は78のGly-Xaa-Yaaリピートと２ケ所のリピー
ト不規則配列とを含む(配列番号４)。EcoRIサイトを平
滑化し前述のIV型コラーゲン遺伝子断片とmalEとを図１
に示した方法と同様にインフレームでクローニングし、
IPTG誘導により発現させた（図４A）。SDSPAGEの結果、
期待される分子量の位置にバンドがあらわれた。

【００２３】同様にして1.1kb SmaI・HindIII断片をKpn
I・HindIII処理したpMalcのMBPにインフレームでクロー
ニングし、配列番号５に示される27のGly-Xaa-Yaaリピ
ートのコラーゲン領域とNC1領域を含むアミノ酸配列を
発現させた（図４B）。SDS PAGEサンプル回収の過程で
分子量の低下した誘導タンパク質のバンドも確認された
が、IPTG誘導により期待される分子量の位置にバンドが
あらわれた。

【００２４】colA3(IV)というタイプのヒトIV型コラー
ゲンでは、内在するNC1領域に抗原性の存在する部分も
ある。発現させるコラーゲンペプチドからNC1領域ペプ
チド配列の除去が可能かどうかを調べた。前述の1.1kb
SmaI・HindIII断片を用いたプラスミドの挿入断片内の
3'端側の0.9kb BamHI・HindIIIを欠失させたコンストラ
クトを作成した。このコンストラクトは配列番号６に示
したように25のGly-Xaa-Yaaリピートの下流に続くNC1領
域を欠失させ、HindIIIサイトの下流に存在するベクタ
ー配列上の終止コドンを利用したものである。IPTG誘導
により発現を誘導させた結果、期待される分子量の位置
にバンドが確認された（図４C）。

【００２５】以上のことから、ヒトIV型コラーゲン遺伝
子産物としてのGly-Xaa-Yaaリピートからなるコラーゲ
ン領域を含むヒトIV型コラーゲンペプチドを産出できる
ことを示した。N末端側の外来親水性ペプチドとの融合
タンパク質として合成後、N末端側異種ペプチドを公知
の方法によりプロテアーゼ除去することが可能であり、
また、IV型遺伝子のNC1を含まないcDNA領域を発現させ
ることも可能であった。

【００２６】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、大腸菌による組換えヒトIV型コラーゲン
ペプチドの製造方法と、この方法によって製造される組
換えヒトIV型コラーゲンペプチドが提供される。

【００２７】原核生物の大腸菌（Escherichia coli）を
もちいたタンパク質の発現系では真核生物に感染するプ
リオンやウイルスに宿主が感染しないために、真核生物
の感染症病原体をコラーゲン製品に持ち込む可能性がな
いという利点がある。また、真核生物のコラーゲンにみ
られる翻訳後修飾がおこなわれない利点がある。一般に
ペプチド鎖から枝分かれする修飾糖鎖はペプチド配列と
は異なる立体構造を付与し、高い抗原性をあたえる。抗
原性を有する糖鎖部分を欠如した大腸菌産生コラーゲン
ペプチドはヒトの体内に包理した時に、ウシ組織抽出コ
ラーゲンの糖鎖に起因する免疫障害を誘起しない。ま
た、本発明で示してきた通り、融合タンパク質からマル
トース結合タンパク質などの外来親水性ペプチドや内在
性NC1領域ペプチド等を切除することが可能で、これら
の部分の抗原性を取り除くことができる。以上のことか
ら、この発明によって提供される組換えヒトIV型コラー
ゲンは、各種の医療用材として有用である。例えば、眼
内のガラス体レンズ包はほぼIV型コラーゲンのみからで
きているため、この発明の組換えコラーゲンは代用ガラ
ス体素材としての利用も考えられる。角膜の創傷治癒に
は角膜基底膜の再生が重要であり（宮田暉夫、Fragranc
e Journal 1989年７月号：99-103）、この発明のコラー
ゲンは角膜バンデージレンズ（角膜包帯）、人工角膜、
コンタクトレンズ、角膜保護用粘稠液（viscosurgery）
などに適用することができ、また、創傷カバー材、ドラ
ッグデリバリーシステム（drug delivery system）、止
血材、GTR（guided tissue regeneration）法の歯周組
織再生素材としての用途がある。腎糸球体はほぼIV型の
みのコラーゲンからなり、糸球体基底膜は血液から尿に
通過する分子を決定する透過障壁として働くため（中村
桂子ら、「細胞の分子生物学」第３版（1995））、この
発明の組換えコラーゲンペプチドは人工透析膜などのコ
ラーゲン濾過装置への応用も可能である。IV型コラーゲ
ンが多量に含まれる胎盤は発生途中の胚と母体との物質
交換がおこなわれる器官であるため（宮田暉夫、Fragra
nce Journal 1989年４月号：115-123）、この発明の組
換えコラーゲンは胚培養の培養基材として利用できる。

【００２８】IV型コラーゲンは医学培養用プラスチック
製品（フラスコ、ディッシュ、マイクロテストプレー
ト）のコーティング材として用いられており、この発明
の組換えコラーゲン細胞培養容器コーティング材として
の用途がある。

【００２９】皮膚上の保水力をもたせる目的で化粧品に
コラーゲン・ゼラチンが添加される。可溶性nativeウシ
コラーゲンはpH５（化粧品のpH）以上のpHでは繊維再生
を引き起し、沈澱化し化粧品として用いることができな
いが（宮田暉夫、FragranceJournal 1990年10月号：93-
100）、この発明の組換えコラーゲンペプチドは中性付
近でも水溶性を失わないモノマーペプチドのクローンな
ので、化粧品（ローション、クリーム、ファンデーショ
ン）、美顔用フェイシヤルマスク構成成分などに応用で
きる。

【００３０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Recombinant Human Type IV Collagen and A Method for Producing it <130> NP01446-YS <140> <141> <150> JP2000-364816 <151> 2000-11-30 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 917 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <400> 1 gga tcc atg ggg ccc cca ggc acc cca tct gtt gat cac ggc ttc ctt 48 Gly Ser Met Gly Pro Pro Gly Thr Pro Ser Val Asp His Gly Phe Leu 1 5 10 15 gtg acc agg cat agt caa aca ata gat gac cca cag tgt cct tct ggg 96 Val Thr Arg His Ser Gln Thr Ile Asp Asp Pro Gln Cys Pro Ser Gly 20 25 30 acc aaa att ctt tac cac ggg tac tct ttg ctc tac gtg caa ggc aat 144 Thr Lys Ile Leu Tyr His Gly Tyr Ser Leu Leu Tyr Val Gln Gly Asn 35 40 45 gaa cgg gcc cat gga cag gac ttg ggc acg gcc ggc agc tgc ctg cgc 192 Glu Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly Thr Ala Gly Ser Cys Leu Arg 50 55 60 aag ttc agc aca atg ccc ttc ctg ttc tgc aat att aac aac gtg tgc 240 Lys Phe Ser Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Ile Asn Asn Val Cys 65 70 75 80 aac ttt gca tca cga aat gac tac tcg tac tgg ctg tcc acc cct gag 288 Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Glu 85 90 95 ccc atg ccc atg tca atg gca ccc atc acg ggg gaa aac ata aga cca 336 Pro Met Pro Met Ser Met Ala Pro Ile Thr Gly Glu Asn Ile Arg Pro 100 105 110 ttt att agt agg tgt gct gtg tgt gag gcg cct gcc atg gtg atg gcc 384 Phe Ile Ser Arg Cys Ala Val Cys Glu Ala Pro Ala Met Val Met Ala 115 120 125 gtg cac agc cag acc att cag atc cca ccg tgc ccc agc ggg tgg tcc 432 Val His Ser Gln Thr Ile Gln Ile Pro Pro Cys Pro Ser Gly Trp Ser 130 135 140 tcg ctg tgg atc ggc tac tct ttt gtg atg cac acc agc gct ggt gca 480 Ser Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Phe Val Met His Thr Ser Ala Gly Ala 145 150 155 160 gaa ggc tct ggc caa gcc ctg gcg tcc ccc ggc tcc tgc ctg gag gag 528 Glu Gly Ser Gly Gln Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Cys Leu Glu Glu 165 170 175 ttt aga agt gcg cca ttc atc gag tgt cac ggc cgt ggg acc tgc aat 576 Phe Arg Ser Ala Pro Phe Ile Glu Cys His Gly Arg Gly Thr Cys Asn 180 185 190 tac tac gca aac gct tac agc ttt tgg ctc gcc acc ata gag agg agc 624 Tyr Tyr Ala Asn Ala Tyr Ser Phe Trp Leu Ala Thr Ile Glu Arg Ser 195 200 205 gag atg ttc aag aag cct acg ccg tcc acc ttg aag gca ggg gag ctg 672 Glu Met Phe Lys Lys Pro Thr Pro Ser Thr Leu Lys Ala Gly Glu Leu 210 215 220 cgc acg cac gtc agc cgc tgc caa gtc tgt atg aga aga aca taa 717 Arg Thr His Val Ser Arg Cys Gln Val Cys Met Arg Arg Thr 225 230 235 gaagcctgac tcagctaatg tcacaacatg gtgctacttc ttcttctttt tgttaacagc 777 aacgaaccct agaaatatat cctgtgtacc tcactgtcca atatgaaaac cgtaaagtgc 837 cttataggaa tttgcgtaac taacacaccc tgcttcattg acctctactt gctgaaggag 897 aaaaagacag cgataagctt 917 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized oligonuclotide <400> 2 tctaccccca gagataaatg tttg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized oligonuclotide <400> 3 aatgacggcc tttaaggttg ttgc 24 <210> 4 <211> 1613 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (7)..(1413) <400> 4 gaatta att cct gga tcc aaa gga gag caa gga ttc atg ggt cct ccg 48 Ile Pro Gly Ser Lys Gly Glu Gln Gly Phe Met Gly Pro Pro 1 5 10 ggg ccc cag gga cag ccg ggg tta ccg gga tcc cca ggc cat gcc acg 96 Gly Pro Gln Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly His Ala Thr 15 20 25 30 gag ggg ccc aaa gga gac cgc gga cct cag ggc cag cct ggc ctg cca 144 Glu Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Pro Gln Gly Gln Pro Gly Leu Pro 35 40 45 gga ctt ccg gga ccc atg ggg cct cca ggg ctt cct ggg att gat gga 192 Gly Leu Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Ile Asp Gly 50 55 60 gtt aaa ggt gac aaa gga aat cca ggc tgg cca gga gca ccc ggt gtc 240 Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro Gly Val 65 70 75 cca ggg ccc aag gga gac cct gga ttc cag ggc atg cct ggt att ggt 288 Pro Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly Phe Gln Gly Met Pro Gly Ile Gly 80 85 90 ggc tct cca gga atc aca ggc tct aag ggt gat atg ggg cct cca gga 336 Gly Ser Pro Gly Ile Thr Gly Ser Lys Gly Asp Met Gly Pro Pro Gly 95 100 105 110 gtt cca gga ttt caa ggt cca aaa ggt ctt cct ggc ctc cag gga att 384 Val Pro Gly Phe Gln Gly Pro Lys Gly Leu Pro Gly Leu Gln Gly Ile 115 120 125 aaa ggt gat caa ggc gat caa ggc gtc ccg gga gct aaa ggt ctc ccg 432 Lys Gly Asp Gln Gly Asp Gln Gly Val Pro Gly Ala Lys Gly Leu Pro 130 135 140 ggt cct cct ggc ccc cca ggt cct tac gac atc atc aaa ggg gag ccc 480 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Tyr Asp Ile Ile Lys Gly Glu Pro 145 150 155 ggg ctc cct ggt cct gag ggc ccc cca ggg ctg aaa ggg ctt cag gga 528 Gly Leu Pro Gly Pro Glu Gly Pro Pro Gly Leu Lys Gly Leu Gln Gly 160 165 170 ctg cca ggc ccg aaa ggc cag caa ggt gtt aca gga ttg gtg ggt ata 576 Leu Pro Gly Pro Lys Gly Gln Gln Gly Val Thr Gly Leu Val Gly Ile 175 180 185 190 cct gga cct cca ggt att cct ggg ttt gac ggt gcc cct ggc cag aaa 624 Pro Gly Pro Pro Gly Ile Pro Gly Phe Asp Gly Ala Pro Gly Gln Lys 195 200 205 gga gag atg gga cct gcc ggg cct act ggt cca aga gga ttt cca ggt 672 Gly Glu Met Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly 210 215 220 cca cca ggc ccc gat ggg ttg cca gga tcc atg ggg ccc cca ggc acc 720 Pro Pro Gly Pro Asp Gly Leu Pro Gly Ser Met Gly Pro Pro Gly Thr 225 230 235 cca tct gtt gat cac ggc ttc ctt gtg acc agg cat agt caa aca ata 768 Pro Ser Val Asp His Gly Phe Leu Val Thr Arg His Ser Gln Thr Ile 240 245 250 gat gac cca cag tgt cct tct ggg acc aaa att ctt tac cac ggg tac 816 Asp Asp Pro Gln Cys Pro Ser Gly Thr Lys Ile Leu Tyr His Gly Tyr 255 260 265 270 tct ttg ctc tac gtg caa ggc aat gaa cgg gcc cat gga cag gac ttg 864 Ser Leu Leu Tyr Val Gln Gly Asn Glu Arg Ala His Gly Gln Asp Leu 275 280 285 ggc acg gcc ggc agc tgc ctg cgc aag ttc agc aca atg ccc ttc ctg 912 Gly Thr Ala Gly Ser Cys Leu Arg Lys Phe Ser Thr Met Pro Phe Leu 290 295 300 ttc tgc aat att aac aac gtg tgc aac ttt gca tca cga aat gac tac 960 Phe Cys Asn Ile Asn Asn Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr 305 310 315 tcg tac tgg ctg tcc acc cct gag ccc atg ccc atg tca atg gca ccc 1008 Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Glu Pro Met Pro Met Ser Met Ala Pro 320 325 330 atc acg ggg gaa aac ata aga cca ttt att agt agg tgt gct gtg tgt 1056 Ile Thr Gly Glu Asn Ile Arg Pro Phe Ile Ser Arg Cys Ala Val Cys 335 340 345 350 gag gcg cct gcc atg gtg atg gcc gtg cac agc cag acc att cag atc 1104 Glu Ala Pro Ala Met Val Met Ala Val His Ser Gln Thr Ile Gln Ile 355 360 365 cca ccg tgc ccc agc ggg tgg tcc tcg ctg tgg atc ggc tac tct ttt 1152 Pro Pro Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Phe 370 375 380 gtg atg cac acc agc gct ggt gca gaa ggc tct ggc caa gcc ctg gcg 1200 Val Met His Thr Ser Ala Gly Ala Glu Gly Ser Gly Gln Ala Leu Ala 385 390 395 tcc ccc ggc tcc tgc ctg gag gag ttt aga agt gcg cca ttc atc gag 1248 Ser Pro Gly Ser Cys Leu Glu Glu Phe Arg Ser Ala Pro Phe Ile Glu 400 405 410 tgt cac ggc cgt ggg acc tgc aat tac tac gca aac gct tac agc ttt 1296 Cys His Gly Arg Gly Thr Cys Asn Tyr Tyr Ala Asn Ala Tyr Ser Phe 415 420 425 430 tgg ctc gcc acc ata gag agg agc gag atg ttc aag aag cct acg ccg 1344 Trp Leu Ala Thr Ile Glu Arg Ser Glu Met Phe Lys Lys Pro Thr Pro 435 440 445 tcc acc ttg aag gca ggg gag ctg cgc acg cac gtc agc cgc tgc caa 1392 Ser Thr Leu Lys Ala Gly Glu Leu Arg Thr His Val Ser Arg Cys Gln 450 455 460 gtc tgt atg aga aga aca taa gaagcctgac tcagctaatg tcacaacatg 1443 Val Cys Met Arg Arg Thr 465 gtgctacttc ttcttctttt tgttaacagc aacgaaccct agaaatatat cctgtgtacc 1503 tcactgtcca atatgaaaac cgtaaagtgc cttataggaa tttgcgtaac taacacaccc 1563 tgcttcattg acctctactt gctgaaggag aaaaagacag cgataagctt 1613 <210> 5 <211> 1136 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (4)..(936) <400> 5 tcg ggg ctc cct ggt cct gag ggc ccc cca ggg ctg aaa ggg ctt cag 48 Gly Leu Pro Gly Pro Glu Gly Pro Pro Gly Leu Lys Gly Leu Gln 1 5 10 15 gga ctg cca ggc ccg aaa ggc cag caa ggt gtt aca gga ttg gtg ggt 96 Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Gln Gln Gly Val Thr Gly Leu Val Gly 20 25 30 ata cct gga cct cca ggt att cct ggg ttt gac ggt gcc cct ggc cag 144 Ile Pro Gly Pro Pro Gly Ile Pro Gly Phe Asp Gly Ala Pro Gly Gln 35 40 45 aaa gga gag atg gga cct gcc ggg cct act ggt cca aga gga ttt cca 192 Lys Gly Glu Met Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Phe Pro 50 55 60 ggt cca cca ggc ccc gat ggg ttg cca gga tcc atg ggg ccc cca ggc 240 Gly Pro Pro Gly Pro Asp Gly Leu Pro Gly Ser Met Gly Pro Pro Gly 65 70 75 acc cca tct gtt gat cac ggc ttc ctt gtg acc agg cat agt caa aca 288 Thr Pro Ser Val Asp His Gly Phe Leu Val Thr Arg His Ser Gln Thr 80 85 90 95 ata gat gac cca cag tgt cct tct ggg acc aaa att ctt tac cac ggg 336 Ile Asp Asp Pro Gln Cys Pro Ser Gly Thr Lys Ile Leu Tyr His Gly 100 105 110 tac tct ttg ctc tac gtg caa ggc aat gaa cgg gcc cat gga cag gac 384 Tyr Ser Leu Leu Tyr Val Gln Gly Asn Glu Arg Ala His Gly Gln Asp 115 120 125 ttg ggc acg gcc ggc agc tgc ctg cgc aag ttc agc aca atg ccc ttc 432 Leu Gly Thr Ala Gly Ser Cys Leu Arg Lys Phe Ser Thr Met Pro Phe 130 135 140 ctg ttc tgc aat att aac aac gtg tgc aac ttt gca tca cga aat gac 480 Leu Phe Cys Asn Ile Asn Asn Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp 145 150 155 tac tcg tac tgg ctg tcc acc cct gag ccc atg ccc atg tca atg gca 528 Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Glu Pro Met Pro Met Ser Met Ala 160 165 170 175 ccc atc acg ggg gaa aac ata aga cca ttt att agt agg tgt gct gtg 576 Pro Ile Thr Gly Glu Asn Ile Arg Pro Phe Ile Ser Arg Cys Ala Val 180 185 190 tgt gag gcg cct gcc atg gtg atg gcc gtg cac agc cag acc att cag 624 Cys Glu Ala Pro Ala Met Val Met Ala Val His Ser Gln Thr Ile Gln 195 200 205 atc cca ccg tgc ccc agc ggg tgg tcc tcg ctg tgg atc ggc tac tct 672 Ile Pro Pro Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Leu Trp Ile Gly Tyr Ser 210 215 220 ttt gtg atg cac acc agc gct ggt gca gaa ggc tct ggc caa gcc ctg 720 Phe Val Met His Thr Ser Ala Gly Ala Glu Gly Ser Gly Gln Ala Leu 225 230 235 gcg tcc ccc ggc tcc tgc ctg gag gag ttt aga agt gcg cca ttc atc 768 Ala Ser Pro Gly Ser Cys Leu Glu Glu Phe Arg Ser Ala Pro Phe Ile 240 245 250 255 gag tgt cac ggc cgt ggg acc tgc aat tac tac gca aac gct tac agc 816 Glu Cys His Gly Arg Gly Thr Cys Asn Tyr Tyr Ala Asn Ala Tyr Ser 260 265 270 ttt tgg ctc gcc acc ata gag agg agc gag atg ttc aag aag cct acg 864 Phe Trp Leu Ala Thr Ile Glu Arg Ser Glu Met Phe Lys Lys Pro Thr 275 280 285 ccg tcc acc ttg aag gca ggg gag ctg cgc acg cac gtc agc cgc tgc 912 Pro Ser Thr Leu Lys Ala Gly Glu Leu Arg Thr His Val Ser Arg Cys 290 295 300 caa gtc tgt atg aga aga aca taa gaagcctgac tcagctaatg tcacaacatg 966 Gln Val Cys Met Arg Arg Thr 305 310 gtgctacttc ttcttctttt tgttaacagc aacgaaccct agaaatatat cctgtgtacc 1026 tcactgtcca atatgaaaac cgtaaagtgc cttataggaa tttgcgtaac taacacaccc 1086 tgcttcattg acctctactt gctgaaggag aaaaagacag cgataagctt 1136 <210> 6 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (4)..(225) <400> 6 tcg ggg ctc cct ggt cct gag ggc ccc cca ggg ctg aaa ggg ctt cag 48 Gly Leu Pro Gly Pro Glu Gly Pro Pro Gly Leu Lys Gly Leu Gln 1 5 10 15 gga ctg cca ggc ccg aaa ggc cag caa ggt gtt aca gga ttg gtg ggt 96 Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Gln Gln Gly Val Thr Gly Leu Val Gly 20 25 30 ata cct gga cct cca ggt att cct ggg ttt gac ggt gcc cct ggc cag 144 Ile Pro Gly Pro Pro Gly Ile Pro Gly Phe Asp Gly Ala Pro Gly Gln 35 40 45 aaa gga gag atg gga cct gcc ggg cct act ggt cca aga gga ttt cca 192 Lys Gly Glu Met Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Phe Pro 50 55 60 ggt cca cca ggc ccc gat ggg ttg cca gga tca gcttggcact ggccgtcgtt 245 Gly Pro Pro Gly Pro Asp Gly Leu Pro Gly Ser 65 70 ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 305 ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag 365 ttgcgcagcc tga 378

【図面の簡単な説明】

【図1】pMalcへのcolA1(IV)のクローニング工程の１例
を示した模式図である。

【図2】形質転換大腸菌による融合タンパク質の発現結
果である。レーン１、２、３、４はそれぞれIPTG添加直
後のCBB染色像、IPTG添加２時間後のCBB染色像、IPTG添
加直後のウエスタンブロッティング像、およびIPTG添加
２時間後のウエスタンブロッティング像である。

【図３】colA1(IV)にコードされるペプチドとマルトー
ス結合タンパク質（MBP）との融合タンパク質のリンカ
ー部分をプロテアーゼ切断した結果である。各サンプル
を同一のSDS PAGEゲル上に解析した。レーン１、２、３
はそれぞれファクターXaを25℃で８時間インキュベート
したサンプル、簡易精製した融合タンパク質を25℃で８
時間インキュベートした対照サンプル、簡易精製融合タ
ンパク質にファクターXaを加え25℃で８時間インキュベ
ートしたサンプルである。矢印で示したバンドはファク
ターXa処理により分子量の変化した融合タンパク質由来
のペプチドを示す。これらのうち、Aで示したものはイ
ンタクトの融合タンパク質、Bは精製過程ないし前述の
インキュベーション過程で低分子化した融合タンパク
質、黒丸はMBP、黒三角はIV型コラーゲンペプチドを示
す。

【図4】さまざまな長さのコラーゲン領域をもつヒトIV
型コラーゲン断片の発現を示した電気泳動像である。A
は78のGly-Xaa-Yaaリピートと２ケ所の不規則配列をふ
くむコラーゲン領域とNC1領域を含むヒトIV型コラーゲ
ン断片をMBPとの融合タンパク質として発現させた時の
結果である。レーン１、２はそれぞれIPTG誘導前、誘導
後の大腸菌タンパク質のSDS PAGEの結果である。矢印
は、誘導によって蓄積したバンドを示す。Bは、27のGly
-Xaa-Yaaリピートのコラーゲン領域とNC1領域を含むヒ
トIV型コラーゲン断片をMBPとの融合タンパク質として
発現させた時の結果である。レーン１、２、矢印はAと
同様。Cは、25のGly-Xaa-Yaaリピートをコードするコラ
ーゲン領域をMBPとの融合タンパク質として発現させた
時の結果である。レーン１、２、矢印はAと同様。

【図5】この発明で発現させたキメラヒトIV型コラーゲ
ンペプチドの構成を示す。MBPはマルトース結合タンパ
ク質、NC1はヒトIV型コラーゲンC末端親水性領域を示
す。制限酵素地図の記号は図１に同じ。図３で示したコ
ラーゲンペプチドは、ファクターXa処理によりMBPを除
去している。図４Cで示したコラーゲンペプチドは、内
在性の親水性NC1領域を欠落させて発現させたもの。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 原 慶明 山形県山形市飯田西３−４−１−105 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA11 DA06 HA17 4B064 AG01 CA19 CC24 CD11 DA01 4C081 AA12 AB19 AB21 AB31 BA06 CD121 DA02 DA06 DB01 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 EA34 FA74

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトIV型コラーゲンをコードするポリヌ
   クレオチドと、非ヒトコラーゲン親水性ペプチドをコー
   ドするポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドによ
   って大腸菌を形質転換し、この形質転換大腸菌にヒトIV
   型コラーゲンと非ヒトコラーゲン親水性ペプチドとのキ
   メラタンパク質を発現させることを特徴とする組換えヒ
   トIV型コラーゲンペプチドの製造方法。
2. 【請求項２】 ヒトIV型コラーゲンをコードするポリヌ
   クレオチドが、ヒトIV型コラーゲンcDNAの少なくともコ
   ラーゲン領域の一部分をカバーするポリヌクレオチドで
   ある請求項１の方法。
3. 【請求項３】 ヒトIV型コラーゲンをコードするポリヌ
   クレオチドが、ヒトIV型コラーゲンcDNAのすくなくとも
   IV型コラーゲン領域内のGly-Xaa-Yaaリピートに対する
   不規則アミノ酸配列を含むコラーゲン領域の一部分をカ
   バーするポリヌクレオチドである請求項１の方法。
4. 【請求項４】 請求項1または2または３の方法によって
   製造される組換えヒトIV型コラーゲンペプチド。