JPH08217796A - ヒトプロテアソームサブユニット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明はヒト２６Ｓプロテアソームの構成成
分のサブユニットＰ４５の同定および機能を明らかに
し、さらに該サブユニットＰ４５のポリペプチドのアミ
ノ酸配列を提供することを目的とし、さらにサブユニッ
トＰ４５のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
を提供することを目的とするものである。 【構成】 ヒト２６Ｓプロテアソームの構成成分のサブ
ユニットＰ４５の同定し、機能を明らかにし、さらに該
サブユニットＰ４５のポリペプチドのアミノ酸配列を明
らかにする。さらに上記ヒトプロテアソームの構成成分
のうちサブユニットＰ４５のポリペプチドをコードする
遺伝子の塩基配列を明らかにする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト２６Ｓプロテアソ
ームに関するものであり、さらに詳しくは該プロテアソ
ームのサブユニットＰ４５のポリペプチド、および該サ
ブユニットの各ポリペプチドをコードする遺伝子に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】プロテアソームは、別名、多機能性プロ
テアーゼと呼ばれ、不活性型で細胞内に局在し、エネル
ギー依存性蛋白質分解系を構成する主要酵素である。本
酵素は、酵母からヒトに至る真核生物に広く存在してお
り、またすべての組織に存在し、なかでも肝臓では、全
可溶性蛋白質の１％も占める。

【０００３】該酵素は同一分子内に複数の触媒活性部位
を持ち、トリプシン型酵素の基質である塩基性アミノ
酸、キモトリプシン型酵素の基質である中性アミノ酸、
そしてプロテアーゼとしては稀な酸性アミノ酸を含む合
成ペプチドのカルボキシ末端のペプチド結合を切断する
活性がある。

【０００４】しかしながら、種々の既知の阻害剤の中で
特異的で有効に作用するものがないことから、該酵素
は、既知のプロテアーゼとは異なる触媒活性部位を持つ
と推定されている。

【０００５】また、該酵素は構造的には、１４種類（α
型７種類、β型７種類）の異なるサブユニットのダイマ
ーからなる総数２８個の多成分複合体である。

【０００６】また、沈降係数２０Ｓ、分子量は約７５万
と推定され、プロテアーゼとしては例外的に大きい。

【０００７】また、該酵素を電子顕微鏡で観察すると７
種類のサブユニットが環状構造を形成し、これがα(1-
7) β(1-7) β(1-7) α(1-7) の４層構造をとる特異的
な分子形状を有していることが認められた（臨床免疫、
25、1578-1589 、1993）。

【０００８】さらに、ヒトプロテアソームは、少なくと
も１４種類のサブユニットより、構成されていることが
わかり、このうちα型サブユニット群として、HC2 、HC
3, HC8, HC9 (Biochim. Biophys. Acta., 1089, 95-10
2, 1991),β型サブユニット群として、HC5 (Biochim. B
iophys. Acta., 1089, 95-102, 1991), HC7-I, HC-10I
I, HN3 (Biochim. Biophys. Acta.,1219 , 361-368, 19
94), hLMP7 (Nature, 353, 357-360, 1991), hLMP2 (
Nature, 353, 667-668, 1991),X ,Y (Science, 265,123
1-1234, 1994) 等の１次構造が明かになった。

【０００９】かかるプロテアソームは、非リソゾーム系
蛋白質分解経路における主要酵素であり、蛋白質の修飾
による機能制御や蛋白質の代謝回転の調節など多彩な生
理作用を有していると推定される。

【００１０】さらに、最近、プロテアソームが内在性抗
原のプロセシング酵素であると考えられており、注目さ
れている。これは、クラスI MHC 抗原の提示に欠陥をも
つB細胞変異株が分離され、それらがクラスII MHC領域
約200kb に欠失のあることが判明したことによる。この
領域には、、TAP1,TAP2 とよばれるペプチドを細胞質か
ら小胞体へ移送させるトランスポーター蛋白質の遺伝子
がコードされており、その近傍には、LMP2,LMP7 とよば
れるプロテアソームのサブユニットをコードする遺伝子
が存在することが判明し、プロテアソームの内在性抗原
のプロセシングにおける重要性が高まっている(Trends
in Cell Biol., 2, 81,1992)。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】プロテアソームは、こ
のような２０Ｓ型複合体として見いだされた。

【００１２】さらに、本発明者等は最近、多数の制御因
子群がこの２０Ｓプロテアソームに可逆的に結合し、分
子量約２００万、沈降係数２６Ｓの巨大な複合体を形成
していることを見いだし、２６Ｓプロテアソームと命名
した( 特開平5-292964、特開平6-022759）。

【００１３】しかしながら、ヒトプロテアソームを構成
するサブユニットのうち、この２６Ｓプロテアソーム制
御因子群の詳細は明かにされておらず、そのサブユニッ
トの詳細を明かにし、各種病態の診断、および治療法を
確立することが強く要請されている。

【００１４】そこで、本願発明者らは、このような状況
を踏まえ、上記２６Ｓプロテアソームについて、その構
成成分である個々のサブユニットの構造、機能等につい
て鋭意研究を重ねた結果、新規な多機能プロテアーゼ、
すなわち、ヒトのプロテアソームの構成成分であるサブ
ユニットＰ４５について解明し、本発明を完成するに至
った。

【００１５】すなわち、本発明はヒト２６Ｓプロテアソ
ームの構成成分のサブユニットＰ４５の同定および機能
を明らかにし、さらに該サブユニットＰ４５のポリペプ
チドのアミノ酸配列を提供することを目的とするもので
ある。

【００１６】また、本発明は上記ヒトプロテアソームの
構成成分のうちサブユニットＰ４５のポリペプチドをコ
ードする遺伝子の塩基配列を提供することを目的とする
ものである。

【００１７】さらに、本発明は、該ヒトプロテアソーム
の酵素機能の解明に使用可能な方法および、免疫疾患を
はじめ各種病態の診断治療の方法を提供することを目的
とするものである。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、上記目
的を達成可能とするため、前記プロテアソームについ
て、その構成成分である個々のサブユニットの構造、機
能等について詳細に研究を重ねた結果、ヒトの２６Ｓプ
ロテアソームの構成成分であるサブユニットＰ４５につ
いて解明した。

【００１９】さらに、上記の知見に基づき、各種病態の
診断、および治療法を提供することが可能となった。

【００２０】すなわち、本発明においては、上記サブユ
ニットＰ４５を同定すること、上記サブユニットＰ４５
のポリペプチドのアミノ酸配列を決定すること、さらに
上記サブユニットＰ４５のポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドの塩基配列を決定することからなる。

【００２１】さらに本発明においては、上記ポリペプチ
ドＰ４５の相補的ポリヌクレオチドをプローブとして用
いることにより各種ヒト臓器での該サブユニットのｍＲ
ＮＡ発現量を定量可能とする。

【００２２】また、本発明においてはサブユニットＰ４
５の抗体を作製可能とし、上記抗体を用いた各種細胞に
おけるこれらのサブユニットを免疫測定により定量可能
とする。

【００２３】より詳しくは、本発明は、上記の目的を達
成するため、本発明者等の方法( 特開平5-292964、特開
平6-022759）を用いて、ヒト２６Ｓプロテアソームサブ
ユニットＰ４５を電気泳動法で分離同定し、得られるポ
リペプチドのフラグメントのアミノ酸配列からサブユニ
ットＰ４５のアミノ酸配列のポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドの全塩基配列を決定し、さらに上記の
知見に基づき、サブユニットＰ４５の全アミノ酸配列を
推定するものである。

【００２４】さらに本発明は、サブユニットＰ４５のポ
リペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチ
ドの相補的ポリヌクレオチドを作製可能とし、これを用
いて各種ヒト臓器におけるプロテアソームｍＲＮＡの発
現量を定量することを可能にし、免疫疾患等の診断方法
に使用可能とするものである。

【００２５】さらに本発明においては、ヒトプロテアソ
ームサブユニットＰ４５に対する抗体を作成可能とし、
これらの抗体を用いて、各種細胞中のそれぞれのサブユ
ニットを定量することを可能にし、免疫疾患等の診断方
法に使用可能とするものである。

【００２６】なお、本明細書および図面において、塩基
やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ- Ｉ
ＵＢ、による略号あるいは当該分野における慣用の略号
を使用した。

【００２７】 ＤＮＡ デオキシリボ核酸 Ａ アデニン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ａｌａ （Ａ） アラニン Ａｒｇ （Ｒ） アルギニン Ａｓｎ （Ｎ） アスパラギン Ａｓｐ （Ｄ） アスパラギン酸 Ｃｙｓ （Ｃ） システイン Ｇｌｎ （Ｑ） グルタミン Ｇｌｕ （Ｅ） グルタミン酸 Ｇｌｙ （Ｇ） グリシン Ｈｉｓ （Ｈ） ヒスチジン Ｉｌｅ （Ｉ） イシロイシン Ｌｅｕ （Ｌ） ロイシン Ｌｙｓ （Ｋ） リジン Ｍｅｔ （Ｍ） メチオニン Ｐｈｅ （Ｆ） フェニルアラニン Ｐｒｏ （Ｐ） プロリン Ｓｅｒ （Ｓ） セリン Ｔｈｒ （Ｔ） スレオニン Ｔｒｐ （Ｗ） トリプトファン Ｔｙｒ （Ｙ） チロシン Ｖａｌ （Ｖ） バリン 以下本発明を詳細に説明する。

【００２８】（ヒト２６Ｓプロテアソームのサブユニッ
トＰ４５のポリペプチド）以下で説明する方法により塩
基配列が決定されたヒト２６Ｓプロテアソームのサブユ
ニットＰ４５のポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドから推定される、サブユニットＰ４５のポリペプチ
ドのアミノ酸配列は次式（１）で表される。

【００２９】式（１） Met Ala Leu Asp Gly Pro Glu Gln Met Glu Leu Glu Glu Gly Lys Ala Gly Ser Gly Leu Arg Gln Tyr Tyr Leu Ser Lys Ile Glu Glu Leu Gln Leu Ile Val Asn Asp Lys Ser Gln Asn Leu Arg Arg Leu Gln Ala Gln Arg Asn Glu Leu Asn Ala Lys Val Arg Leu Leu Arg Arg Glu Leu Gln Leu Leu Gln Glu Gln Gly Ser Tyr Val Gly Glu Val Val Arg Ala Met Asp Lys Lys Lys Val Leu Val Lys Val His Pro Glu Gly Lys Phe Val Val Asp Val Asp Lys Asn Ile Asp Ile Asn Asp Val Thr Pro Asn Cys Arg Val Ala Leu Arg Asn Asp Ser Tyr Thr Leu His Lys Ile Leu Pro Asn Lys Val Asp Pro Leu Val Ser Leu Met Met Val Glu Lys Val Pro Asp Ser Thr Tyr Glu Met Ile Gly Asp Trp Thr Lys Gln Ile Lys Glu Ile Lys Glu Val Ile Glu Leu Pro Val Lys His Pro Glu Leu Phe Glu Ala Leu Gly Ile Ala Gln Pro Lys Gly Val Leu Leu Tyr Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Leu Leu Ala Arg Ala Val Ala His His Thr Asp Lys Thr Phe Ile Arg Val Ser Gly Ser Glu Leu Val Gln Lys Phe Ile Gly Glu Gly Ala Arg Met Val Arg Glu Leu Phe Val Met Ala Arg Glu His Ala Pro Ser Ile Ile Phe Met Asp Glu Ile Asp Ser Ile Gly Ser Ser Arg Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ser Glu Val Gln Arg Thr Met Leu Glu Leu Leu Asn Gln Leu Asp Gly Phe Glu Ala Thr Lys Asn Ile Lys Val Ile Met Ala Thr Asn Arg Ile Asp Ile Leu Asp Ser Ala Leu Leu Arg Pro Gly Arg Ile Asp Arg Lys Ile Glu Phe Pro Pro Pro Asn Glu Glu Ala Arg Leu Asp Ile Leu Lys Ile His Ser Arg Lys Met Asn Leu Thr Arg Gly Ile Asn Leu Arg Lys Ile Ala Glu Leu Met Pro Gly Ala Ser Gly Ala Glu Val Lys Gly Val Cys Thr Glu Ala Gly Met Tyr Ala Leu Arg Glu Arg Arg Val His Val Thr Gln Glu Asp Phe Glu Met Ala Val Ala Lys Val Met Gln Lys Asp Ser Glu Lys Asn Met Ser Ile Lys Lys Leu Trp Lys 本発明に係るサブユニットＰ４５は、上記のアミノ酸配
列のＮ末端にメチオニンが結合していないポリペプチ
ド、および上記アミノ酸配列のＮ末端にヒトプロテアソ
ームのサブユニットＰ４５のためのシグナルペプチドの
部分もしくは全部が結合または、欠損した中間体も含包
する。

【００３０】また、自然の変異により、または人工の変
異によりポリペプチドの主たる活性に変化を与えること
なく、ポリペプチドをコードするＤＮＡの構造の一部を
変化させることが可能である。

【００３１】本発明のヒトプロテアソームのサブユニッ
トＰ４５のポリペプチドは、前記アミノ酸配列を有する
相同変異体に相当する構造を有するポリペプチドも含包
する。

【００３２】（ヒトプロテアソームサブユニットＰ４５
のアミノ酸配列の決定）本発明に係るヒト２６Ｓプロテ
アソームは本発明者等の方法( 特開平5-292964) に準
じ、ヒト細胞、組織細胞等の各種動物細胞から、バイオ
ゲルーＡ、Ｑーセファロス、ハイドロキシアパタイトを
吸着体としたクロマトグラフィー、グリセロール密度勾
配遠心法等の操作で単一に精製することが可能である。

【００３３】さらに、２６Ｓプロテアソーム制御因子群
のみの精製は、以下の方法、すなわち、ヒト株化細胞、
組織細胞等をはじめ各種動物細胞から出発物質を調製
し、バイオゲル、ハイドロキシアパタイト、グリセロー
ルグラディエント等の方法により調製可能である。

【００３４】以下、その調製法を順に説明する。

【００３５】（１）ヒト細胞や組織等を25mM Tris-HCl
(ph7.5), 10mM β- メルカプトエタノール, 2mM ATP, 2
50mM, Sucrose を用いてホモジナイズし、さらに8000 r
pm, 30分間遠心する。

【００３６】（２）上記遠心で得られた上澄をさらに70
000 ｘｇで１時間遠心する。

【００３７】（３）得られた上澄をさらに70000 ｘｇで
５時間遠心する。

【００３８】（４）得られた沈殿物を25mM Tris-HCl (p
H7.5), 10mM β- メルカプトエタノール, 0.5mM ATP, 2
0%グリセロールの緩衝液（緩衝液Ａとする）に懸濁す
る。

【００３９】（５）得られた懸濁サンプルを緩衝液Ａで
平衡化したBio-Gel A （バイオラッド社） 1.5m カラム
により２６Ｓプロテアソーム画分を集める。２６Ｓ画分
の分画にはプロテアーゼ活性としてキモトリプシン様活
性、トリプシン様活性、Ｖ８プロテアーゼ様活性、ユビ
キチン分解活性（特開平５ー２９２９６４）を指標とす
ることが可能である。

【００４０】（６）上記画分を濃縮し、10mMリン酸緩衝
液(pH7.0), 10mM β- メルカプトエタノール, 0.5mM AT
P, 20%グリセロールで平衡化したハイドロキシアパタイ
トカラムにより、10-300 mM リン酸緩衝液(pH7.0) のグ
ラジエント（10mM β- メルカプトエタノール, 0.5mM
ATP, 20%グリセロール）により精製する。

【００４１】（７）得られた各分画を２６Ｓプロテアソ
ーム抗体（徳島大学酵素科学研究センターより入手可
能）を用いて、イムノブロティング法（Antibodies, A
Laboratory Manual, Ed., Harlow et al., p471-510, C
old Spring Harbor Laboratory,1988 ）により同定し、
反応画分を分離回収した後濃縮する。

【００４２】（８）さらに１０ー３０％のグリセロール
グラディエント（25mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM β- メ
ルカプトエタノール, 2mM ATP ）で25000 回転で２２時
間遠心による分画後、２６Ｓ制御因子群を含む画分を
（７）と同様にイムノブロティング法により同定し、制
御因子群を分離精製することが可能である。

【００４３】以上説明した方法の他にも、各種クロマト
グラフィーを組み合わせることにより、サブユニットＰ
４５を含むプロテアソームの精製は可能である。例えば
牛赤血球細胞からは、J. Biol.Chem.269,3539-3547,199
4 に記載の方法に準じて、硫酸アンモニウムによる沈殿
の後、セファクリルＳー３００Ｓ、DEAE Fractogel,ハ
イドロキシアパタイトカラム等による分離精製が可能で
ある。

【００４４】なお、これら精製した２６Ｓ制御因子画分
は２０Ｓプロテアソームのプロテアーゼの活性をアクチ
ベートする活性がある。

【００４５】精製したサブユニットＰ４５を含む２６Ｓ
プロテアソーム画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動法（ＳＤＳーＰＡＧＥ, Antibodies A Laborator
y Manual，Harlow David lane 著、Cold Spring Harbor
laboratory ，636-640 ，1988）や、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌ
ｌ等による２次元電気泳動（J.Biol.Chem.250,4007-402
1,1975）により分離した後、ゲルをクマシー染色する
と、分子量21-32 kDa の十数個の２０Ｓプロテアソーム
によるバンドとともに、分子量30-110kDa の制御因子群
が含まれたバンドが観察される。

【００４６】また精製しサブユニットＰ４５を含む制御
因子群はＳＤＳ−ＰＡＧＥや２次元電気泳動により、分
子量30-110kDa の制御因子群のみのバンドとして観察さ
れる。

【００４７】（サブユニットＰ４５の単離）上記ＳＤＳ
−ＰＡＧＥや２次元電気泳動によるバンドからサブユニ
ットＰ４５を単離するには、分子量約４５kDa のバンド
を選ぶことにより可能である。

【００４８】すなわち電気泳動法より分離同定されたサ
ブユニットＰ４５をポリビニリデンジフルオロダイド
（ＰＶＤＦ）等にトランスファーすることが可能であ
る。

【００４９】（プローブの作成）上記の処理後、リジル
エンドペプチダーゼなどによる各種酵素処理によりポリ
ペプチドフラグメントの混合物とし、得られたペプチド
フラグネントの混合物を高速液体クロマトグラフィーで
分離する。

【００５０】上記得られたポリペプチドフラグメントの
いくつかのフラグメントのアミノ酸配列を自動アミノ酸
シークエンサー等を用いて決定することが可能である。

【００５１】上記の解析によって得られたアミノ酸配列
の一部の情報をもとにポリヌクレオチドの検索に必要な
プローブは、得られたポリペプチドフラグメントのうち
縮重頻度の低いものを選択し、これに対応する相補的ポ
リヌクレオチドとして合成して作成することにより可能
である。

【００５２】また、複数のアミノ酸配列が得られた場合
は、対応する相補的ポリヌクレオチドを組み合わせて、
ヒトのｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法（例えば、Michae
l A.Innis et al., ed.,斎藤隆 監訳、ＰＣＲ実験マニ
ュアル、ＨＢＪ出版局、１９９１年）により、より長い
断片のＤＮＡプローブを得ることが可能である。

【００５３】以上のようにして、ヒトプロテソームのサ
ブユニットＰ４５をスクリーニングするためのＤＮＡプ
ローブが得られる。

【００５４】（相補鎖ＤＮＡライブラリーの作製および
スクリーニング）本発明においてポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドをスクリーニングするためのｃＤ
ＮＡライブラリーの作製は、一般的な方法を使用可能で
あり例えば次のステップにより可能である。

【００５５】すなわち、（ｉ）ヒトプロテアソーム産生
細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、
（ｉｉ）該ｍＲＮＡから、単鎖の相補鎖ポリヌクレオチ
ド（ｃＤＮＡ）を、次いで２重鎖ポリヌクレオチドを合
成し、（ｉｉｉ）２重鎖ポリヌクレオチドをプラスミド
またはファージに組み込み、（ｉＶ）得られた組換えプ
ラスミドまたはファージにより適当な宿主細胞を形質転
換し、（ｖ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体
から、適当な方法、例えばコロニーハイブリダイゼーシ
ョンまたはプラークハイブリダイゼーションにより、目
的とするポリヌクレオチドを含有するプラスミドまたは
ファージを単離し、（Ｖｉ）そのプラスミドまたはファ
ージから目的とするポリヌクレオチドを切り出し、（ｖ
ｉｉ）該クローン化ポリヌクレオチドを適当なプラスミ
ドにサブクローニングする、というステップである。

【００５６】各ステップについてさらに詳しく説明す
る。

【００５７】ステップ（ｉ）：ヒトプロテアソームのサ
ブユニットＰ４５のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
は、種々の動物の組織、器官、産生細胞から、より具体
的には、肝臓、腎臓、心臓、脳、肺、胸腺、肝癌細胞
株、腎臓癌細胞株などから得ることができる。

【００５８】また該酵素産生細胞から全ＲＮＡを調製す
る方法としては、グアニジウム／セシウムクロライド法
(Guanidiumu/Cesiumu Chroroide method, Maniatis,
T.,Fritsch E. F., and Sambrook, J., Molecular Clon
ing, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 194-196,
1982) やグアニジウムチオシアネート法 (Chomczynsk
i,P. et al., Analytical Biochemistry, 162, 156-15
9, 1987) 等が一般に用いられる。

【００５９】上記操作により得られる全ＲＮＡからのｍ
ＲＮＡの分離、精製は例えば、オリゴｄＴーセルロース
（コラボレイティブ リサーチ社（Ｃｏｌｌａｂｏｒａ
ｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社））やオリゴテックスー
ｄＴ３０（タカラ社）等を用いて吸着カラム法またはバ
ッチ法により実施できる。

【００６０】ステップ（ｉｉ）：このようにして得られ
たｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて、例えばオ
カヤマーバーグ法 (Okayama, H. and Berg, P., Molecu
larand Cellular Bology, 3, 280, 1983)やグブラーと
ホフマンの方法 (Gubler ,V.and Hoffman, B.J., Gene,
25, 263-269, 1983)等に従いｃＤＮＡを合成する。

【００６１】ステップ（ｉｉｉ）：得られたｃＤＮＡを
プラスミドやファージに組み込み、ｃＤＮＡのライブラ
リーを調製する。

【００６２】ｃＤＮＡを組み込むプラスミドベクターと
しては、例えば、PBR322 (Gene, 2,95,1977) 、PBR325
(Gene, 4, 121, 1978), PUC12 (Gene, 19, 259, 1982),
PUC13 (Gene,19,259,1982), PUC18 (Gene, 33, 103, 1
985), PUC19 (Gene, 33,103,1985), PUC118 (Methods i
n Enzymology, 153, 3, 1987), PUC119 (Methods in E
nzymology, 153, 3, 1987), Bluescript II(Nucleic Ac
ids. Res.,17,9494,1989 ）、などが挙げられるが、そ
の他のものであっても、宿主内で複製保持されるもので
あれば、いずれも用いることができる。

【００６３】また、ｃＤＮＡを組み込むファージベクタ
ーとしては、例えば、λｇｔ１０(Huynh,T.V., Young,
R.A. and Davis, R.W.,DNA cloning, A Practical Appr
oach, IRL Press, Oxford, 1, 49, 1985) 、λｇｔ１１
(Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80, 1194, 1983)ま
たはλZAPII (Nucleic Acids. Res.,17,9494,1989)、な
どが使用可能であるが、その他のベクターであっても、
適当な宿主内で増殖できるものであれば良い。

【００６４】プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、例えば、サンブルーク(Sambrook, J.)らの方法(M
olecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1.53-1.73, 1989)などが挙
げられる。

【００６５】また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み
込む方法としては、例えば、Hyunh,T.V. 等の方法 ( DN
A cloning, A Practical Approach, IRL Press, Oxfor
d, 1, 49, 1985) などが使用可能である。

【００６６】ステップ（ｉｖ）：上記の方法により得ら
れたプラスミドやファージベクターは、これを適当な宿
主たとえば、エシェリヒア コリ(Escherichia Coli)、
バチルススブチリス(Bacillus subtilis) 、サッカロミ
セス セレビシアエ (Saccharomyces cerevisiae) 等に
導入して、これを形質転換できる。

【００６７】プラスミドベクターで宿主を形質転換する
方法としては、例えば、モレキュラー. クローニング
(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1.74-1.84, 1989)記載のエレクトロポーレーシ
ョン法あるいはカルシウムクロライド法などが挙げられ
る。また、ファージ. ベクターにはたとえば、増殖させ
た大腸菌にイン. ビトロパッケージング法を用いて導入
することができる。

【００６８】ステップ（ｖ）：上記方法によるｃＤＮＡ
から目的のヒトプロテアソームのサブユニットＰ４５の
ｃＤＮＡを選択するには、例えばラベル化したプローブ
を用いたコロニーハイブリダイゼーション法または、プ
ラークハイブリダイゼーション法 (Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.85-1.104or
2.112-2.120, 1989)などが使用可能である。

【００６９】上記のハイブリダイゼーションにおけるプ
ローブとして用いるポリヌクレオチドとしては、サブユ
ニットＰ４５とハイブリダイズするポリヌクレオチドで
あれば、何でもよく、例えばサブユニットＰ４５のアミ
ノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレオチド，
あるいはプロテアソームの他のコンポーネントをコード
するｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、および
これらの部分ＤＮＡ等が使用可能である。

【００７０】さらに、プロテアソームの他のコンポーネ
ントをコー ドするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成Ｄ
ＮＡ、およびこれらの部分ＤＮＡも、サブユニットとハ
イブリダイズ可能であるかぎり使用可能である。

【００７１】以上のようにして、ヒトプロテアソームの
サブユニットＰ４５をコードするポリヌクレオチドが調
製可能となる。

【００７２】（塩基配列の決定）上記に従い得られたｃ
ＤＮＡの塩基配列の決定は、例えば、マキサムーギルバ
ート(Maxiam-Gilbert)法 (Methods in Enzymology, 65,
499-560, 1980) 、ジデオキシ法 (Messing, J. et a
l., Nucleic Acids Research, 9, 309, 1981)、蛍光色
素を用いたTaq サイクルシークエンシング法等(Biotech
niques,7,494-499,1989)により可能である。

【００７３】決定されたヒトプロテアソームのサブユニ
ットＰ４５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドの塩基配列の全部または一部を含有するポリヌクレオ
チドは、式（２）で表される。

【００７４】式（２） ATGGCGCTTG ACGGACCAGA GCAGATGGAG CTGGAGGAGG GGAAGGCAGG CAGCGGACTC CGCCAATATT ATCTGTCCAA GATTGAAGAA CTCCAGCTGA TTGTGAATGA TAAGAGCCAA AACCTCCGGA GGCTGCAGGC ACAGAGGAAC GAACTAAATG CTAAAGTTCG CCTATTGCGG AGGGAGCTAC AGCTGCTGCA GGAGCAGGGC TCCTATGTGG GGGAAGTAGT CCGGGCCATG GATAAGAAGA AAGTGTTGGT CAAGGTACAT CCTGAAGGTA AATTTGTTGT AGACGTGGAC AAAAACATTG ACATCAATGA TGTGACACCC AATTGCCGGG TGGCTCTAAG GAATGACAGC TACACTCTGC ACAAGATCCT GCCCAACAAG GTAGACCCAT TAGTGTCACT GATGATGGTG GAGAAAGTAC CAGATTCAAC TTATGAGATG ATTGGTGACT GGACAAAACA GATCAAGGAG ATCAAAGAAG TGATCGAGCT GCCTGTTAAG CATCCTGAGC TCTTCGAAGC ACTGGGCATT GCTCAGCCCA AGGGAGTGCT GCTGTATGGA CCTCCAGGCA CTGGGAAGAC ACTGTTGGCC CGGGCTGTGG CTCATCATAC GGACTGTACC TTTATTCGTG TCTCTGGCTC TGAATTGGTA CAGAAATTCA TAGGGGAAGG GGCAAGAATG GTGAGGGAGC TGTTTGTCAT GGCACGGGAA CATGCTCCAT CAATCATCTT CATGGACGAA ATCGACTCCA TCGGCTCCTC GCGGCTGGAG GGGGGTTCTG GAGGGGACAG TGAAGTGCAG CGCACGATGC TGGAGTTGCT CAACCAGCTC GACGGCTTTG AGGCCACCAA GAACATCAAG GTTATCATGG CTACTAATAG GATTGATATC CTGGACTCGG CACTGCTTCG CCCAGGGCGC ATTGACAGAA AAATTGAATT CCCACCCCCC AATGAGGAGG CCCGGCTGGA CATTTTGAAG ATTCATTCTC GGAAGATGAA CCTGACCCGG GGGATCAACC TGAGAAAAAT TGCTGAGCTC ATGCCAGGAG CATCAGGGGC TGAAGTGAAG GGCGTGTGCA CAGAAGCTGG CATGTATGCC CTGCGAGAAC GGCGAGTCCA TGTCACTCAG GAGGACTTTG AGATGGCAGT AGCCAAGGTC ATGCAGAAGG ACAGTGAGAA AAACATGTCC ATCAAGAAAT TATGGAAG 本発明に係る上記ポリヌクレオチドは、前記式（２）の
５’末端にＡＴＧが結合していない塩基配列からなるポ
リヌクレオチドを含む。

【００７５】本発明のポリヌクレオチドはまた、ヒトプ
ロテアソームのサブユニットＰ４５のシグナルペプチド
の部分または全部をコードする５’フランキングポリヌ
クレオチドを含むＤＮＡも含む。

【００７６】さらに、自然の変異により、または人工的
変異により、主たる活性に変化を与えることなく、ポリ
ヌクレオチドの構造およびそれから演繹されるポリペプ
チドの構造の一部を変異せしめることが可能である。

【００７７】従って、本発明に係るポリヌクレオチド
は、前述のすべてのポリペプチドの相同異性体に相当す
る構造を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含
有することも可能である。

【００７８】さらに、遺伝暗号の縮重に従い、ポリヌク
レオチドから生産されるポリペプチドのアミノ酸配列を
変えることなくそのポリヌクレオチドの塩基配列の少な
くとも一つの塩基を他の種類の塩基に置換することがで
きる。

【００７９】従って、本発明のポリヌクレオチドはま
た、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって、変換された
塩基配列を含有することも可能である。 この場合、上
記置換により得られた塩基配列より、演繹されるアミノ
酸配列は前記に定義した式（１）のアミノ酸配列と一致
する。

【００８０】本発明のヒトプロテアソームサブユニット
Ｐ４５のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含むポリ
ヌクレオチドは、上記の方法の他に、ヒト、ラット、マ
ウスなどのゲノムＤＮＡのライブラリーからのクローニ
ングによっても得ることができる。

【００８１】これら、サブユニットＰ４５をコードする
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡは、目的により、そのまま
あるいは制限酵素で切断して使用することが可能であ
る。

【００８２】本発明により得られたサブユニットＰ４５
のｃＤＮＡの構造は図２に示されるように、１２８７残
基からなり、オープンリーディングフレームは1218残基
であり、４０６アミノ酸をコードする。

【００８３】計算上の分子量は、45770 であり、等電点
は、8.35である。

【００８４】（免疫疾患等の診断用測定方法）上記得ら
れたポリヌクレオチドをプローブとして用いることは、
各種疾患の診断等にも有効な手段を与える。

【００８５】さらにヒトプロテアソームサブユニットＰ
４５の遺伝的多型性を調べることにより、各種疾患との
関連も明らかにでき、ポリヌクレオチド診断に有効に使
用可能となる。

【００８６】また、本発明で得られたプロテアソームサ
ブユニットＰ４５の相補鎖ポリヌクレオチドをプローブ
として用いることにより、各種ヒト臓器のｍＲＮＡ発現
量を例えばノザンブロット解析やＲＴ−ＰＣＲ解析（例
えば、Michael A.Innis et al., ed.,斎藤隆 監訳、Ｐ
ＣＲ実験マニュアル、ＨＢＪ出版局、１９９１年）を行
うことにより定量的に測定可能となり、上記各種疾患の
診断手段を与えるものである。

【００８７】さらに本発明において得られたサブユニッ
トＰ４５に対するポリクロナールまたはモノクロナール
抗体を作成することが可能であり（例えば、Antibodie
s, ALaboratory Manual, Ed., Harlow et.al., Cold Sp
ring Harbor Laboratory,1988 に記載の方法に準じて可
能である）。

【００８８】得られた抗体を用いた免疫的測定法によ
り、各種細胞中の該サブユニットの変化を定量的に測定
する手段が与えられる。

【００８９】（ホモロジー検索およびその利用）本発明
のサブユニットＰ４５のホモロジー検索の結果、ヒト２
６Ｓプロテアソーム制御因子群のATPase活性ををもつサ
ブユニット、TBP1(Science, 248, 1650-1653), TBP7 (P
roc. Natl.Acad. Sci., 90, 138-142,1993), S4 (J. Bi
ol.Chem., 267, 22699-22702, 1992), MSS1(Nature, 35
7, 700-702, 1992, FEBS Lett.,323, 276-278, 1993)
とATPaseドメイン（図４中、星印）を中心にしてホモロ
ジーがある（図４）が、Ｎ末端側やＣ末端側のホモロジ
ーは低いことが示される。

【００９０】また、サブユニットＰ４５については、等
電点が8.45と高いが、他のサブユニットの等電点は５か
ら６までと低い。

【００９１】さらに、これらのサブユニットは、進化的
にも保存されていることが示され、例えば出芽酵母に
も、それぞれホモロジーが認められる。

【００９２】すなわち、サブユニットＰ４５は、SUG1(N
ature, 357, 698-700,1992) と、TBP-1 はYTA1, TBP-7
はYTA2, S4はYTA5, (Yeast, 39, 1141-1155,1994), MSS
-1はCIM5 (Nature, 366, 358-362, 1993) とホモロジー
が認められる（表１）。

【００９３】

【表１】

【００９４】酵母については、２６Ｓプロテアソームサ
ブユニットが細胞周期のG2-M期の進行に必須であること
が知られている。すなわち分裂酵母の染色体分配異常に
よって細胞周期がＭ期で停止している細胞の変異を相補
する遺伝子遺伝子MTS2 (出芽酵母YTA5、ヒトＳ４のホモ
ローグ）を分離すると、これが２６Ｓプロテアソームの
調節サブユニット群を構成するATPaseであることが判明
した（Nature,366,355-357,1993)。一方、Ｇ２ーＭ期の
転移異常を示す変異型出芽酵母の解析からCIM5（ヒトMS
S-1 のホモローグ）とCIM3と名付けた２種の遺伝子を単
離したところ、これも２６Ｓプロテアソームを構成する
ATPaseであることが判明し、またMTS2やCIM5の変異細胞
株ではユビキチン依存性の蛋白分解システムに異常があ
ることがわかり（(Nature, 366, 358-362, 1993)これら
の遺伝子変異に伴う細胞周期の停止には２６Ｓプロテア
ソームの蛋白分解機能の異常が関係していると考えられ
る。

【００９５】特にSUG1については、サブユニットＰ４５
と７７％のホモロジーがある。

【００９６】SUG1は、最初、真核生物に存在する転写因
子のGAL4の酸性ドメインの変異を抑制する遺伝子として
同定された(Nature, 357, 698-700,1992) が、最近、RN
A ポリメラーゼIIに結合するTATAバインディング蛋白に
結合する２０種類のコンポーネントの一つであることが
判明している(Cell,77,599-608,1994)。

【００９７】また、ヒトＴＢＰ（Tat binding protein)
ー１と７（ＴＢＰー１、ＴＢＰー７）はヒト免疫不全症
侯群（エイズ）ウイルスＨＩＶ(human immunodeficienc
y virus)転写因子Tat に結合する蛋白である。

【００９８】従ってこれらの蛋白は、エイズウイルスの
発現調節に密接に関連する。

【００９９】すなわち、これらの蛋白とホモロジーのあ
るヒトサブユニットＰ４５は遺伝子の転写あるいは、細
胞増殖に必須であることが示唆される。

【０１００】以上のホモロジー検索結果から、本発明に
係るヒトプロテソームサブユニットＰ４５は、ヒトの転
写調節因子の異常による炎症や、ウィルス感染および代
謝異常等の疾患の診断法、治療法に適用可能となる。

【０１０１】さらに、プロテアソームの遺伝子はヒト肝
癌細胞、ヒト腎癌細胞(Cancer Res., 51, 6677-6685, 1
991) 、ヒト白血病細胞などの悪性腫瘍細胞 (Proc. Nat
l.Acad. Sci. U.S.A., 88, 139-143, 1990) において正
常細胞に比較して異常に高く発現し、さらに、これらの
腫瘍細胞の核にプロテアソームが、異常蓄積することが
知られており、従って本発明に係るプロテアソームのサ
ブユニットＰ４５をヒトの癌化のメカニズムの解明や癌
の診断および治療に有効に使用可能となる。

【０１０２】さらに、アルツハイマー病患者の脳内には
ユビキチンが異常蓄積し、少なくともこの疾患の原因の
一つに細胞内における蛋白質分解系の異常のあることが
示唆されており、さらにこの疾患の発現にかかわる遺伝
子の機能ドメインにはプロテアーゼ阻害剤がコードされ
ていることが知られており(Nature, 331, 530-532, 198
8)、非リソソーム系の蛋白分解に関与すると考えられる
プロテアソームがアルツハイマー病に本質的に関係して
いることが示唆されている。

【０１０３】従って、本発明に係るヒトプロテアソーム
のサブユニットＰ４５は、その機能および阻害メカニズ
ムの解明、およびアルツハイマー病と本酵素との関係や
異常の生じるメカニズムの解明、および治療に有効に使
用可能となる。

【０１０４】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【０１０５】（実施例１） ヒトプロテアソームのサブ
ユニットＰ４５の遺伝子配列の決定 Ｐ４５サブユニットを含む２６Ｓプロテアソームの制御
因子群の調製 （１）プローブの調製 （１ー１）出発物質の調製 牛赤血球細胞の２６Ｓプロテアソーム制御因子群はJ. B
iol.Chem.269,3539-3547,1994 に記載の方法に準じて精
製可能である。以下説明する。

【０１０６】牛血液をヘパリン存在下で収集し、2000xg
で１時間遠心し赤血球細胞を集めた後、得られた沈殿を
４倍体積のリン酸緩衝液に懸濁し、再沈殿することによ
り洗浄した。 この操作を４回繰り返した。

【０１０７】なを、以下のステップは特に述べない限り
４℃で行った。

【０１０８】赤血球細胞に３倍体積の溶解バッファー
（バッファーＨ：20mMTris-HCl, pH7.6, 20mM NaCl, 1m
M EDTA, 1mM βーメルカプトエタノール）を加えて１０
分間撹拌して溶解した。

【０１０９】これを13,000g で６０分間遠心し、上清を
除去して、保存した。

【０１１０】沈殿は再度バッファーＨに懸濁し、遠心し
た後上清を最初の上清に加えた。

【０１１１】この上清画分を20mM Tris-HCl, pH7.6, 20
mM NaCl, 0.5mM MgCl ₂ , 0.1mM EDTA, 5mM βーメルカ
プトエタノール、10% グリセロールに対して透析処理を
行った。

【０１１２】（１ー２）ＤＥ５２による調製 上記の透析画分5ml に対し、バッファーＨで平衡化した
ＤＥ５２（Whatman 社）1ml を添加した。

【０１１３】該レジンに結合している蛋白を0.5M NaCl
を含むバッファーＨ（Whatman 社）で１０分間緩やかに
撹拌することにより溶出した（レジン：0.5M NaCl/バッ
ファーＨ＝１：１）。 さらに少量の0.5M NaCl を含む
バッファーＨで溶出し、ヘモグロビンを含まない赤血球
細胞からの抽出画分を得た。

【０１１４】（１ー３）硫安沈殿 上記得られた画分に38% 飽和になるまで３０分間ゆっく
りと撹拌しながら硫安（硫酸アンモニウム）を添加し
た。

【０１１５】さらに３０分間撹拌して沈殿した蛋白を遠
心により集めた。

【０１１６】この沈殿をダンス（DOUNCE) ホモジナイザ
ーを用いて大量のバッファーで再懸濁し、さらに遠心し
沈殿蛋白を得た。

【０１１７】沈殿は少量のバッファーＨに溶解し、100m
M になるようにNaClを添加し、100mM NaCl/ バッファー
Ｈに対して１６時間透析した。

【０１１８】透析後、不溶物を30,000xg、３０分間遠心
して除き、上清画分を得た。

【０１１９】（１ー４）セファクリルＳ−３００ セファクリルＳ−３００（Pharmacia 社、100x5 cm) カ
ラムをバッファーＨで平衡化後、（１ー３）で得た画分
をアプライし、100mM NaClを含むバッファーＨで溶出
し、11mlずつフラクションを集めた。

【０１２０】フラクションのうち２０Ｓプロテアーゼ活
性促進の高い画分を集めた。活性画分の測定は（１ー
７）に記載した。

【０１２１】（１ー５）ＤＥＡＥ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ （１ー４）の活性画分はバッファーＨで平衡化したＤＥ
ＡＥ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（EM Separation, 10x2.5 c
m) にアプライし100mM-300mM NaCl/ バッファーＨによ
るリリアグラジエントで溶出し、11mlずつフラクション
を集めた。

【０１２２】得られたフラクションのうち、活性画分の
高い画分を集め20mMリン酸緩衝液(pH 7.6)に対して透析
を行った。

【０１２３】（１ー６）ハイドロキシアパタイト （１ー５）で得られた画分をバッファーＨで平衡化した
ハイドロキシアパタイト(BioRad 社、7x25cm) にアプラ
イし、リン酸緩衝液(20-200ml)のリニアグラジエントに
より8ml ずつ各フラクションを溶出し集めた。

【０１２４】上記各フラクションの活性画分を集め、バ
ッファーＨで透析し、1mg/mlの濃度になるまでアミコン
ＰＭ１０メンブランで濃縮した。

【０１２５】（１ー７）活性画分の測定方法 ２６Ｓプロテアソーム制御因子群の活性の測定は、２０
Ｓプロテアソームと制御因子群を混合して２０Ｓプロテ
アソームのペプチダーゼ活性を測定する方法により可能
である。

【０１２６】反応は、5mM Tris-HCl(pH8.0), 5mMジチオ
スレイトール(DTT), 60 μM ATP, 10mM MgCl₂ 中、0.3
μg ２０Ｓプロテアソームと精製各段階の制御因子群を
添加して最終容積 50 μl で行った。

【０１２７】この反応液を、３７℃で４５分間プレイン
キュベートし、50mM Tris-HCl(pH8.0), 5mM βーメルカ
プトエタノール、50μM ２０Ｓプロテアソーム、Suc-Le
u-Leu-Val-Tyr-AMC ( キモトリプシン様活性を測定する
ための合成基質）に添加し１０分間インキュベートし
て、蛍光を測定した。

【０１２８】制御因子群にアクチベート活性があれば、
２０Ｓプロテアソームによる合成基質の分解活性が上昇
することから、活性画分を同定可能となる。

【０１２９】（２）Ｐ４５サブユニットのアミノ酸配列
の決定 （２ー１）Ｐ４５サブユニットの単離 （１）の処理で得られた２６Ｓプロテアソーム制御因子
群蛋白を逆相高速液体クロマトグラフィー(Shodex RS P
ak D4-613 カラム 6x150mm) を使用し以下の条件で分離
した。

【０１３０】分離条件：流速 0.75ml/min、温度５０
℃、溶媒Ａ、0.06% トリフルオロ酢酸（TFA)；溶媒Ｂ，
0.05%TFA/70%アセトニトリル/30%水。

【０１３１】64% Ａ，36% Ｂによりカラムを平衡化し、
36-70%のＢ溶媒を用いたグラジエントで溶出した。

【０１３２】214nm の波長で検出し、ピーク画分をスピ
ードバックコンセントレータ（Savant Instruments社)
で乾燥した。

【０１３３】（２ー２）電気泳動による分離 上記得られた乾燥サンプルはＳＤＳサンプルバファーに
溶解し、10% ＳＤＳーＰＡＧＥ（ Antibodies A Labora
tory Manual ，Harlow David lane 著、Cold Spring Ha
rbor laboratory ，636-640 ，1988）により分離した。

【０１３４】電気泳動が終わったゲルは、イモビロン−
ＰＶＤＦメンブラン（ミリポア社製）にセミドライエレ
クトロブロティング装置ザルトブロットＩＩ−Ｓ（ザル
トリウス社製）を用いてトランスファーした。

【０１３５】蛋白質をブロットした膜フィルターは、蒸
留水で洗浄した後、クマシーブルー染色液（0.2 ％クマ
シーブリリアントブルーＲ250 を含む40％メタノール、
１０％酢酸溶液）で染色後、脱色液（６０％メタノール
溶液）に浸し、振とうしてバックグラウンドを脱色し
た。

【０１３６】このメンブラン上の45kDa の位置のスポッ
トを切出し、in situ でL-1-tosylamido-2-phenyl chlo
romethyl ketone 処理トリプシン(Worthington Enzymes
社）、またはLys-C プロテアーゼ（ベーリンガーマンハ
イム社）により酵素処理した。 生成したペプチドはHP
LC（パーキンエルマー社製）によって分離精製した（流
速50μl/min, 0.1%TFAを溶媒とし0-70% のアセトニトリ
ルによるグラジエント、RP300 カラム(2.1x100mm))。

【０１３７】得られたポリペプチドフラグメントのいく
つかをペプチドシークエンサー（パーキンエルマー社製
プロテインシークエンサー４９７型分析装置）により解
析を行った。

【０１３８】以上のアミノ酸解析により次の７種類のプ
プチドフラグメントのアミノ酸配列を決定した(J.Biol.
Chem.269,20878-20884,1994)。

【０１３９】 フラグメント１；IEELQLIVNXK, フラグメント２；LLREELQLLQEQGSYVGEVV, フラグメント３； FVVDVDKNIDIDVTPN, フラグメント４；ILPNKVDPLVELMMVEXVPDXXY, フラグメント５；EVIELPVKHPELFEALCIAQ, フラグメント６; EHAPSIIFMDEIDR, フラグメント７；IDILDSALLRPGR ただし、Ｘは、決定できなかったアミノ酸を示す。

【０１４０】（３） （３ー１）プライマーの合成 得られた以上のペプチドフラグメントの配列から縮重度
の低い配列として、フラグメント２からEELQLLEQG 、フ
ラグメント６からPSIIFMDEIDの配列を選択した。

【０１４１】次に、これら選択したポリペプチドに対応
する相補的オリゴヌクレオチドとして、フォワードプラ
イマーとして5'-GAGGAG(T/C)TTCAG(T/C)TT(T/C)T(T/G)C
AGGAGCAGGG-3' を選び, リバースプライマーとして5'-T
CGATTTCGTCCATGAAGATGATT(C/G)(A/T)TGG-3' をＤＮＡ合
成機３８０Ｂ（アプライド. バイオシステムズ社製）で
合成した。

【０１４２】得られたオリゴヌクレオチドをオリゴヌク
レオチド. カートリッジ（アプライド. バイオシステム
ズ社製）を使用して精製した。

【０１４３】（３ー２）ＰＣＲ用ｍＲＮＡ調製 牛肝臓５ｇからの全ＲＮＡはグアニジンチオシアネイト
法 (Anal. Biochem.,162, 156-159, 1987) により以下
のようにして分離精製した。

【０１４４】５ｇの試料をグアニジンチオシアネイト溶
液（sol D 溶液; 6Mのグアニジンチオシアネート、0.5%
のザルコシル、 10mM のクエン酸ナトリウム（pH7), 10
0mMの２ーメルカプトエタノール, 0.1%のアンチフォー
ムＡ）中で超音波処理し、変性させた後遠心して上澄を
得た。

【０１４５】これに(1/10)量の 2M 酢酸および等量のエ
タノール、(1/5) 量のクロロフォルムーイソアミルアル
コール（49:1 vol/vol) を加え、氷上で１５分間静置し
て、10,000g で１５分間４℃にて遠心処理して沈殿を得
た。

【０１４６】水相を別の試験管に移し、等量のイソプロ
パノールを添加し、ー２０℃で１時間静置し、10,000g
で２０分間４℃において遠心した。

【０１４７】得られた沈殿を sol D溶液に溶解し等量の
イソプロパノールを添加し、遠心して沈殿を 75%エタノ
ールで洗浄した。

【０１４８】次にこの沈殿をsol D 溶液に懸濁し、等量
のイソプロパノールを再度添加し、−２０℃で１時間冷
却した後、遠心処理を行った。

【０１４９】遠心分離により沈殿を集め、７５％エタノ
ールで洗浄し、遠心処理後、上清を除去し、これをＤＥ
ＰＣ処理（ジエチルピロカーボネート0.1%で５時間処理
後、オートクレーブ処理）したミリＱに溶解し、５４mg
の全ｍＲＮＡを得た。

【０１５０】上記の処理により得られた全ＲＮＡから、
オリゴ（dT）−ラテックス（タカラ社；oligotex-dT30)
を用いてｍＲＮＡを得た。

【０１５１】すなわち全ＲＮＡ１mgに対して反応緩衝液
(10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mMエチレンジアミン四酢酸(E
DTA), 0.1%SDS ）を加えて全量で1ml とした。

【０１５２】次に、これにOligotex-dT30 １mlを加え、
65℃で５分間熱変性し、氷上で３分間急冷した。

【０１５３】5M NaCl 0.2ml を加え撹拌後、３７℃で１
０分間インキュベートし、15,000rpm １０分間遠心した
後上清を除去した。

【０１５４】ペレットを洗浄液（10mM Tris-HCl(pH7.
5), 1mM EDTA, 0.1%SDS, 100mM NaCl)2.5ml に懸濁し、
３７℃で１０分間放置した。

【０１５５】これを15,000rpm,１０分間遠心分離した。

【０１５６】得られたペレットをTE緩衝液（10mM Tris-
HCl(pH8.0)、 EDTA 1mM ）1ml に懸濁し、６５℃、５分
間加熱し、ｍＲＮＡをOligotex-dT30 から溶出した。

【０１５７】さらに15,000rpm,１０分間遠心し、上清を
回収し、エタノール沈殿を行うため3M NaOAc（酢酸ナト
リウム、pH5.6)100 μl と冷エタノール2ml を加え、ー
８０℃で３０分間放置した。

【０１５８】15,000rpm,１０分間遠心分離し、得られた
ペレットを７０％エタノールで洗浄し、TE緩衝液50μl
に溶解した。

【０１５９】本実施例により、10mgの全ＲＮＡから４７
μg のｍＲＮＡを得ることができた。

【０１６０】（３ー３）ＰＣＲ用ｃＤＮＡ合成 得られたｍＲＮＡを鋳型としてpoly dT をプライマーと
して相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した（ファルマシ
ア社製、ｃＤＮＡ合成キット）。

【０１６１】（３ー４）ＰＣＲによるｃＤＮＡプローブ
の調製 上記（３ー１）で得られたフォワードプライマーととも
にリバースプライマーを用い上記（３ー３）で得られた
牛肝臓のmRNAから合成されたｃＤＮＡを鋳型としＰＣＲ
を行った（例えば、Michael A.Innis et al., ed.,斎藤
隆 監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、ＨＢＪ出版局、１９
９１年）。

【０１６２】各プライマー濃度は20pm/ μl, TaqDNA ポ
リメラーゼは0.025U/ μl 、cDNA 1ng/ μl で３０サイ
クル、パーキンエルマー（シータス）社製ＤＮＡサーマ
ルサイクラーを用いて増幅し、約６００ｂｐのcDNAプロ
ーブを得た。

【０１６３】（４）ｃＤＮＡライブラリーの調製 （４ー１）ｃＤＮＡの調製 ヒト肝細胞癌HEPG2 （ＡＴＣＣから入手可能）から、
（３ー２）記載のグアニジウムチオシアネイト法 (Ana
l. Biochem., 162, 156-159, 1987) によって全ＲＮＡ
を分離した。

【０１６４】全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）ラテックス
（タカラ社；Oligotex-dT30 ）を用いて（３ー２）記載
の方法と同様にHEPG2 細胞からｍＲＮＡ１０μg を得
た。

【０１６５】上記の方法によって得られたポリ（Ａ）＋
ＲＮＡから、ファルマシア社製TimeSaver ｃDNA 合成キ
ットを用いてｃＤＮＡを得た。

【０１６６】より詳しくは、オリゴｄＴプライマーを上
記ｍＲＮＡのポリＡ部分にアニールさせ、逆転写酵素
（Murine Reverse Transcriptase) により、１本鎖ＤＮ
Ａを合成し、Ｅ. ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１によ
り、２本鎖ｃＤＮＡとして合成した。

【０１６７】得られた上記ｃＤＮＡの両端にNotI／EcoR
Iアダプターを付加するため、Ｔ４ＤＮＡライゲース処
理およびポリヌクレオチドキナーゼ処理を行ない、両端
にEcoR I制限酵素切断部位をもつｃＤＮＡを得た。

【０１６８】（４ー２）インビトロパッケージング反応 得られた両端にEcoR I制限酵素切断部位をもつｃＤＮＡ
をクローニングベクターであるλＺＡＰＩＩ（Stratage
ne社製、EcoRI/CIAP処理λＺＡＰＩＩを含むλＺＡＰＩ
Ｉクローニングキット）のＥｃｏＲＩ間にＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて挿入した。

【０１６９】ライゲーション反応溶液 1mlをGigapackII
Gold packaging extract (Stratagene 社）によりパッ
ケージングを行った。

【０１７０】パッケージングした組換えバクテリオファ
ージを含むパッケージング溶液と大腸菌 XL-1 Blueを３
７℃で１５分間培養した。

【０１７１】これを 2〜3 mlのトップアガー（４８℃）
に加えＮＺＹアガープレートへプレーティングして、３
７℃で１夜培養した。

【０１７２】150mm NZY プレートには約 50,000 個のプ
ラークを培養し、10枚のプレートにまいて、約 5x10 ⁵
/ 個のプラークをスクリーニング用に用いた。

【０１７３】（５）クローンの単離 （５ー１）スクリーン用フィルタの調製 NZY プレートを４℃で２時間冷却し、このプレート上に
ナイロンフィルタ（アマシャム社、ハイボンドＮ＋）を
のせ、２分間放置した。

【０１７４】これをはがしてフィルターペーパ上で乾燥
し、紫外線照射により固定してスクリーニング用フィル
ターを調製した。

【０１７５】これを用いて以下のハイブリダイゼーショ
ンを行った。

【０１７６】（５ー２）ハイブリダイゼーションのため
のプローブは（１）で得られたＤＮＡプローブを、ラン
ダムプライムラベリング法（タカラ社；ランダムプライ
マＤＮＡラベリングキットVer.2 ）で³²Ｐ-dCTP （アマ
シャム社）標識したものを使用した。

【０１７７】プレハイブリダイゼーション溶液として、
５ｘＳＳＣ（NaCl 0.15M, クエン酸ナトリウム（pH7.0)
0.015M），５０％フォルムアミド、1 ｘｄｅｎｈａｒｄ
ｔ（ウシ血清アルブミン（Fraction V） 0.2%,ポリビニ
ルピロリドン0.2%,Ficoll400 0.2%）溶液、０．１％Ｓ
ＤＳ，２００μｇ／ｍｌサーモンスパームＤＮＡを用い
た。

【０１７８】フィルターは４２℃、３時間、プレハイブ
リダイゼーション溶液でインキュベートし、続いて標識
プローブを加えたハイブリダイゼ−ション溶液（１０％
ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅを含むプレハイブリダ
イゼーション溶液）で４２℃、１６時間、インキュベー
トしてハイブリダイゼーションを行った。

【０１７９】以上の操作により４個のポジティブクロー
ンが得られた。

【０１８０】（６）in vivo excision（きりだし）によ
る大腸菌組換え体の作成 （５ー２）で得られたアガープレート中のポジティブZA
P ファージクローンのプラークの中心を竹くしでつき、
500 μl のＳＭ緩衝液と20μl のクロロフォルム混合液
中に溶出し、ボルテックスをした後、一夜放置した。

【０１８１】大腸菌XL-1 Blue 200 μl とポジティブフ
ァージクローン200 μl(>1x10 ⁵ ファージパーティク
ル）、ヘルパーファージ R408 1 μl(>1x10 ⁶ pfu/ml)
を50mlチューブにて混合し３７℃、１５分間で、ＺＡＰ
とヘルパーファージを感染させた。

【０１８２】5ml の２x ＹＴ培地(10g NaCl, 10g Bacto
Yeast Extract, 16g Bactotryptone/1l) を加え、３７
℃で３時間振とうし培養し、大腸菌よりファージミドを
分泌させた。

【０１８３】７０℃で２０分間熱処理した後、4000g で
５分間遠心し、菌体を死滅させた。

【０１８４】上清のファージミドを別の試験管に移し
た。

【０１８５】この上清にはpBluescriptSK(-)粒子が含ま
れており、この上清200 μl あるいは１００倍に希釈し
た溶液20μl とXL-1 Blue 200 μl(OD₆₀₀ =1.0) を混合
し３７℃で１５分間混合し感染させた。

【０１８６】1 〜100 μl の培養液をLB/Ampプレートに
プレーティングした後、３７℃で一晩培養した。

【０１８７】表れたコロニーはインサートＤＮＡを含む
２本鎖のpBluescriptSK(-)をもった大腸菌（ＸＬ−１
Ｂｌｕｅ）形質転換体である。

【０１８８】４個のポジティブクローンの大腸菌からプ
ラスミドを QIAprepPlasmid キット(Quiagen社) を用い
て調製し、制限酵素 NotI で切断して、そのうち最も長
いインサートをもつクローンについて以下のＤＮＡ塩基
配列の決定を行った。

【０１８９】なおこのヒトプロテアソームサブユニット
Ｐ４５の１．４ｋｂのインサートをもつ大腸菌ＸＬ−１
Ｂｌｕｅ形質転換体についてはＰＲＯ／ＸＬ−ｈＰ４５
と命名して、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成
７年１月２７日に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−
１４７４５）。

【０１９０】（７）塩基配列の決定 上記で得られた1.4 ｋｂのクローンの塩基配列を、パー
キンエルマー社製DNAシークエンサー373Aを用い、Taq
サイクルシークエンシング法により決定した。

【０１９１】得られたサブユニットＰ４５のｃＤＮＡの
制限酵素切断部位を図１に、また塩基配列の解析結果を
図２に示す。

【０１９２】決定した塩基数は１２８７残基で、オープ
ンリーディングフレームは１２１８残基であり、４０６
個のアミノ酸がコードされている。

【０１９３】計算上の分子量は４５７７０であり、等電
点は、8.35である。

【０１９４】図２の下線部は、（２ー２）記載の牛赤血
球より精製したＰ４５から決定されたペプチドシークエ
ンスと相同性のある部分を示すものである。

【０１９５】（８）ホモロジー検索 （８ー１）他の種間でのホモロジー 得られたＰ４５の遺伝子をホモロジー検索したところ、
図３に示すように、酵母のSUG1遺伝子と７７％のホモロ
ジーがあることがわかる。

【０１９６】（８ー２）プロテアソームサブユニット間
でのホモロジー 図４に示されるように、プロテアソームサブユニットＰ
４５は、２６Ｓプロテアソームのうち、ATPaseドメイン
をもつ他のサブユニットであるTBP1, TBP7, S4, MSS-1
ともホモロジーが認められる。

【０１９７】さらに、これに対応する酵母とヒトの２６
ＳプロテアソームのATPaseファミリーを形成するプロテ
アソームサブユニットの分子量と等電点をまとめた結果
を表１に示す。

【０１９８】実施例２ ヒトプロテアソームのサブユニットＰ４５の発現解析 ヒトプロテアソームサブユニットＰ４５に反応するポリ
クローナル抗体の作製 （１）サブユニットＰ４５の他のATPaseサブユニットと
ホモロジーのない部分であるｃ末端側１５アミノ酸(MQK
DSEKNMSIKKLWK ）を選択し、このペプチドのＮ末端にシ
ステインを付加したペプチドをＦ−Ｍｏｃ法（Solid Ph
ase Peptide synthesis,A practical approach, IRL Pr
ess ,Oxford,1989, Atherton,E., Sheppard,R.C.著）に
より、パーキンエルマー社製ペプチド合成機４３３Ａを
用いて合成した。

【０１９９】合成したポリペプチドの脱保護および精製
は、抗ペプチド抗体実験プロトコール、大海忍 他著、
秀潤社、２５- ４６ページに記載の方法で行った。

【０２００】なお脱保護基後のペプチドの精製はＣ₁₈Ｏ
ＤＳカラム（島津 Syn ProPep カラム、4.6x150mm, 0.1
%TFA, 0-80% アセトニトリルグラジエント）を用いた。

【０２０１】（２）上記ペプチドにヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）をイムジェクトアクチベイテッドイムノグロビンコ
ンジュゲイションキット（PIERCE社）を用いて結合させ
ペプチドにＫＬＨ複合体を上記のキット中のカラムによ
り調製した。

【０２０２】（３）初回約１５０μg をフロインドの完
全アジュバント（FCA 、キャペル社)とともにエマルジ
ョンにし、ラビット（ジャパニーズホワイト、北山ラベ
ス社）の背中に免疫した。その後２週間おきに３回不完
全アジュバント（FIA)により同様に免疫した。

【０２０３】初回免疫後、７、８、９週目にELISA 法に
より抗体価を測定し、後抗体価の上昇を確認後全採血を
行なった。

【０２０４】（４） ウサギ血液は、室温で３時間静置
後、セパラピッドチューブ（積水化学）にアプライし、
3000回転で３０分間の遠心によりサブユニットＰ４５に
対する血清を得た。

【０２０５】（５） また、ヒト腎臓から精製したヒト
２０Ｓ（図５Ａレーン１）および２６Ｓプロテアソーム
（図５Ａレーン２）( 特開平5-292964、特開平6-02275
9）をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（Antibodie
s A Laboratory Manual，HarlowDavid lane 著、Cold S
pring Harbor laboratory ，636-640 ，1988）で分離
し、これをクマシー染色した。

【０２０６】その結果、２０Ｓプロテアソームは、分子
量 20kDa〜30kDa のバンドとして観察され、２６Ｓプロ
テアソームは２０Ｓプロテアソームと 30 〜110 kDa の
制御因子が結合した複合体であることがわかる。

【０２０７】また図５Ｂは２６Ｓヒトプロテアソーム制
御因子群のみを精製し、SDS-PAGE後クマシー染色（図５
Ｂレーン３）したものとＰ４５の抗体を用いてイムノブ
ロットした結果を示したものである（図５Ｂレーン
４）。

【０２０８】イムノブロットの結果から、Ｐ４５抗体が
４５ｋＤａのバンドを認識して反応することが明かとな
った。

【０２０９】従って、Ｐ４５サブユニットから作成され
る抗体を用いれば、ヒトの組織でもＰ４５の発現を解析
することが可能である。

【０２１０】（実施例３）プロテアソームサブユニット
Ｐ４５の相補鎖ポリヌクレオチドをプローブに用いて、
各種ヒト臓器でのｍＲＮＡ発現量のノザンブロット解析
を行った（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１５，２５７，１
９９４）。

【０２１１】プローブとしては、実施例１（４）で得ら
れた組み換え体を使用し、プラスミドＤＮＡを大腸菌XL
-1Blueより、ＱＩＡｗｅｌｌ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ社）
にて調製した。このプラスミドを制限酵素Not1（タカラ
社）で処理後、２％アゲロースゲル電気泳動で分離し
て、1.4kbpのサブユニットＰ４５のプローブをＱＩＡ
ｑｕｉｃｋ ＧＥＩ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
（ＱＩＡＧＥＮ社）で調製した。

【０２１２】これをマルチプライムＤＮＡ標識システム
（アマシャム社）で³²Ｐ標識してプローブとして用い
た。

【０２１３】フィルターは、各種ヒト臓器（心臓、脳、
胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓）より抽出したｍ
ＲＮＡ( ２μg)がブロットされたポジチィブチャージド
ナイロンフィルター（Human Multi Tissue Northern Bl
ot, クローンテック社）を用いた。

【０２１４】プレハイブリダイゼーション溶液として、
５ｘＳＳＣ（NaCl 0.15M, クエン酸ナトリウム（pH7.0)
0.015M），５０％フォルムアミド、1 ｘｄｅｎｈａｒｄ
ｔ（ウシ血清アルブミン（Fraction V） 0.2%,ポリビニ
ルピロリドン0.2%,Ficoll400 0.2%）溶液、０．１％Ｓ
ＤＳ，２００μｇ／ｍｌサーモンスパームＤＮＡを用い
た。

【０２１５】フィルターは４２℃、３時間、プレハイブ
リダイゼーション溶液でインキュベートし、続いて標識
プローブを加えたハイブリダイゼ−ション溶液（１０％
ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅを含むプレハイブリダ
イゼーション溶液）で４２℃、１６時間、インキュベー
トしてハイブリダイゼーションを行った。

【０２１６】フィルターは２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ
で４２℃、１５分間で４回洗浄し、さらに１ｘＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳで３０分間１回洗浄した。

【０２１７】オートラジグラフィーは、Ｋｏｄａｌ Ｘ
ＡＲ−５フィルムを用いて、−７０℃で行った。

【０２１８】オートラジオグラフィーの結果、プロテア
ソームサブユニットＰ４５は、約１．８ｋｂのｍＲＮＡ
と反応し、その発現量は、心臓、骨格筋で高く、腎臓、
肺では低い発現であることが明確に定量可能であり、本
発明のプローブを用いることにより、ｍＲＮＡ発現量を
測定することが可能である。

【０２１９】

【発明の効果】ヒトプロテアソームを構成する個々のサ
ブユニット特にサブユニットＰ４５のポリペプチドのア
ミノ酸配列、およびサブユニットＰ４５のポリペプチド
のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配
列を決定することにより、抗体による免疫反応による方
法、さらに相補的ポリヌクレオチドを利用する方法で、
各種免疫疾患等の診断および治療が可能となる。

【０２２０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４０６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Leu Asp Gly Pro Glu Gln Met Glu Leu Glu Glu Gly Lys Ala 5 10 15 Gly Ser Gly Leu Arg Gln Tyr Tyr Leu Ser Lys Ile Glu Glu Leu Gln 20 25 30 Leu Ile Val Asn Asp Lys Ser Gln Asn Leu Arg Arg Leu Gln Ala Gln 35 40 45 Arg Asn Glu Leu Asn Ala Lys Val Arg Leu Leu Arg Arg Glu Leu Gln 50 55 60 Leu Leu Gln Glu Gln Gly Ser Tyr Val Gly Glu Val Val Arg Ala Met 65 70 75 80 Asp Lys Lys Lys Val Leu Val Lys Val His Pro Glu Gly Lys Phe Val 85 90 95 Val Asp Val Asp Lys Asn Ile Asp Ile Asn Asp Val Thr Pro Asn Cys 100 105 110 Arg Val Ala Leu Arg Asn Asp Ser Tyr Thr Leu His Lys Ile Leu Pro 115 120 125 Asn Lys Val Asp Pro Leu Val Ser Leu Met Met Val Glu Lys Val Pro 130 135 140 Asp Ser Thr Tyr Glu Met Ile Gly Asp Trp Thr Lys Gln Ile Lys Glu 145 150 155 160 Ile Lys Glu Val Ile Glu Leu Pro Val Lys His Pro Glu Leu Phe Glu 165 170 175 Ala Leu Gly Ile Ala Gln Pro Lys Gly Val Leu Leu Tyr Gly Pro Pro 180 185 190 Gly Thr Gly Lys Thr Leu Leu Ala Arg Ala Val Ala His His Thr Asp 195 200 205 Cys Thr Phe Ile Arg Val Ser Gly Ser Glu Leu Val Gln Lys Phe Ile 210 215 220 Gly Glu Gly Ala Arg Met Val Arg Glu Leu Phe Val Met Ala Arg Glu 225 230 235 240 His Ala Pro Ser Ile Ile Phe Met Asp Glu Ile Asp Ser Ile Gly Ser 245 250 255 Ser Arg Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ser Glu Val Gln Arg Thr 260 265 270 Met Leu Glu Leu Leu Asn Gln Leu Asp Gly Phe Glu Ala Thr Lys Asn 275 280 285 Ile Lys Val Ile Met Ala Thr Asn Arg Ile Asp Ile Leu Asp Ser Ala 290 295 300 Leu Leu Arg Pro Gly Arg Ile Asp Arg Lys Ile Glu Phe Pro Pro Pro 305 310 315 320 Asn Glu Glu Ala Arg Leu Asp Ile Leu Lys Ile His Ser Arg Lys Met 325 330 335 Asn Leu Thr Arg Gly Ile Asn Leu Arg Lys Ile Ala Glu Leu Met Pro 340 345 350 Gly Ala Ser Gly Ala Glu Val Lys Gly Val Cys Thr Glu Ala Gly Met 355 360 365 Tyr Ala Leu Arg Glu Arg Arg Val His Val Thr Gln Glu Asp Phe Glu 370 375 380 Met Ala Val Ala Lys Val Met Gln Lys Asp Ser Glu Lys Asn Met Ser 385 390 395 400 Ile Lys Lys Leu Trp Lys 405 配列番号：２ 配列の長さ：１２１８ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATGGCGCTTG ACGGACCAGA GCAGATGGAG CTGGAGGAGG GGAAGGCAGG CAGCGGACTC CGCCAATATT ATCTGTCCAA GATTGAAGAA CTCCAGCTGA TTGTGAATGA TAAGAGCCAA AACCTCCGGA GGCTGCAGGC ACAGAGGAAC GAACTAAATG CTAAAGTTCG CCTATTGCGG AGGGAGCTAC AGCTGCTGCA GGAGCAGGGC TCCTATGTGG GGGAAGTAGT CCGGGCCATG GATAAGAAGA AAGTGTTGGT CAAGGTACAT CCTGAAGGTA AATTTGTTGT AGACGTGGAC AAAAACATTG ACATCAATGA TGTGACACCC AATTGCCGGG TGGCTCTAAG GAATGACAGC TACACTCTGC ACAAGATCCT GCCCAACAAG GTAGACCCAT TAGTGTCACT GATGATGGTG GAGAAAGTAC CAGATTCAAC TTATGAGATG ATTGGTGACT GGACAAAACA GATCAAGGAG ATCAAAGAAG TGATCGAGCT GCCTGTTAAG CATCCTGAGC TCTTCGAAGC ACTGGGCATT GCTCAGCCCA AGGGAGTGCT GCTGTATGGA CCTCCAGGCA CTGGGAAGAC ACTGTTGGCC CGGGCTGTGG CTCATCATAC GGACTGTACC TTTATTCGTG TCTCTGGCTC TGAATTGGTA CAGAAATTCA TAGGGGAAGG GGCAAGAATG GTGAGGGAGC TGTTTGTCAT GGCACGGGAA CATGCTCCAT CAATCATCTT CATGGACGAA ATCGACTCCA TCGGCTCCTC GCGGCTGGAG GGGGGTTCTG GAGGGGACAG TGAAGTGCAG CGCACGATGC TGGAGTTGCT CAACCAGCTC GACGGCTTTG AGGCCACCAA GAACATCAAG GTTATCATGG CTACTAATAG GATTGATATC CTGGACTCGG CACTGCTTCG CCCAGGGCGC ATTGACAGAA AAATTGAATT CCCACCCCCC AATGAGGAGG CCCGGCTGGA CATTTTGAAG ATTCATTCTC GGAAGATGAA CCTGACCCGG GGGATCAACC TGAGAAAAAT TGCTGAGCTC ATGCCAGGAG CATCAGGGGC TGAAGTGAAG GGCGTGTGCA CAGAAGCTGG CATGTATGCC CTGCGAGAAC GGCGAGTCCA TGTCACTCAG GAGGACTTTG AGATGGCAGT AGCCAAGGTC ATGCAGAAGG ACAGTGAGAA AAACATGTCC ATCAAGAAAT TATGGAAG

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られたヒトプロテアソームのサブ
ユニットＰ４５のｃＤＮＡの制限酵素切断部位を示す図
である。

【図２】実施例１で得られたヒトプロテアソームのサブ
ユニットＰ４５の決定された塩基配列と塩基配列から推
定したアミノ酸配列（Ｐ４５の１次構造）を示すもので
ある。下線は、ペプチドシークエンスの結果得たアミノ
酸配列と相同性のある部分を示す図である。

【図３】ヒトプロテアソームサブユニットと酵母のSUG1
遺伝子とのホモロジーアライメントの比較結果を示す図
である。

【図４】ヒトプロテアソームサブユニットＰ４５とTBP-
1, TBP7, S4, MSS-1とホモロジーアライメンとの比較を
示す図である。

【図５】［Ａ］は、ヒト２０Ｓプロテアソーム（レーン
１）と２６Ｓプロテアソーム（レーン２）を電気泳動後
クマシー染色したものであり、［Ｂ］は、ヒト２６Ｓ制
御因子群を電気泳動後クマシー染色したもの（レーン
３）と、これをＰ４５の抗体を用いてイムノブロットし
たもの（レーン４）の電気泳動パターンを示す図であ
る。

【図６】ヒトプロテアソームサブユニットＰ４５の相補
鎖ポリヌクレオチドをプローブに用いた各種ヒト臓器で
のｍＲＮＡ発現量のノザンブロット解析の結果の生物の
形態を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＢＡ 33/573 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分子中に少なくとも、 Met Ala Leu Asp Gly Pro Glu Gln Met Glu Leu Glu Glu Gly Lys Ala 5 10 15 Gly Ser Gly Leu Arg Gln Tyr Tyr Leu Ser Lys Ile Glu Glu Leu Gln 20 25 30 Leu Ile Val Asn Asp Lys Ser Gln Asn Leu Arg Arg Leu Gln Ala Gln 35 40 45 Arg Asn Glu Leu Asn Ala Lys Val Arg Leu Leu Arg Arg Glu Leu Gln 50 55 60 Leu Leu Gln Glu Gln Gly Ser Tyr Val Gly Glu Val Val Arg Ala Met 65 70 75 80 Asp Lys Lys Lys Val Leu Val Lys Val His Pro Glu Gly Lys Phe Val 85 90 95 Val Asp Val Asp Lys Asn Ile Asp Ile Asn Asp Val Thr Pro Asn Cys 100 105 110 Arg Val Ala Leu Arg Asn Asp Ser Tyr Thr Leu His Lys Ile Leu Pro 115 120 125 Asn Lys Val Asp Pro Leu Val Ser Leu Met Met Val Glu Lys Val Pro 130 135 140 Asp Ser Thr Tyr Glu Met Ile Gly Asp Trp Thr Lys Gln Ile Lys Glu 145 150 155 160 Ile Lys Glu Val Ile Glu Leu Pro Val Lys His Pro Glu Leu Phe Glu 165 170 175 Ala Leu Gly Ile Ala Gln Pro Lys Gly Val Leu Leu Tyr Gly Pro Pro 180 185 190 Gly Thr Gly Lys Thr Leu Leu Ala Arg Ala Val Ala His His Thr Asp 195 200 205 Cys Thr Phe Ile Arg Val Ser Gly Ser Glu Leu Val Gln Lys Phe Ile 210 215 220 Gly Glu Gly Ala Arg Met Val Arg Glu Leu Phe Val Met Ala Arg Glu 225 230 235 240 His Ala Pro Ser Ile Ile Phe Met Asp Glu Ile Asp Ser Ile Gly Ser 245 250 255 Ser Arg Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ser Glu Val Gln Arg Thr 260 265 270 Met Leu Glu Leu Leu Asn Gln Leu Asp Gly Phe Glu Ala Thr Lys Asn 275 280 285 Ile Lys Val Ile Met Ala Thr Asn Arg Ile Asp Ile Leu Asp Ser Ala 290 295 300 Leu Leu Arg Pro Gly Arg Ile Asp Arg Lys Ile Glu Phe Pro Pro Pro 305 310 315 320 Asn Glu Glu Ala Arg Leu Asp Ile Leu Lys Ile His Ser Arg Lys Met 325 330 335 Asn Leu Thr Arg Gly Ile Asn Leu Arg Lys Ile Ala Glu Leu Met Pro 340 345 350 Gly Ala Ser Gly Ala Glu Val Lys Gly Val Cys Thr Glu Ala Gly Met 355 360 365 Tyr Ala Leu Arg Glu Arg Arg Val His Val Thr Gln Glu Asp Phe Glu 370 375 380 Met Ala Val Ala Lys Val Met Gln Lys Asp Ser Glu Lys Asn Met Ser 385 390 395 400 Ile Lys Lys Leu Trp Lys 405 のアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のアミノ酸配列をコード
   するポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 分子中に少なくとも、 ATGGCGCTTG ACGGACCAGA GCAGATGGAG CTGGAGGAGG GGAAGGCAGG CAGCGGACTC CGCCAATATT ATCTGTCCAA GATTGAAGAA CTCCAGCTGA TTGTGAATGA TAAGAGCCAA AACCTCCGGA GGCTGCAGGC ACAGAGGAAC GAACTAAATG CTAAAGTTCG CCTATTGCGG AGGGAGCTAC AGCTGCTGCA GGAGCAGGGC TCCTATGTGG GGGAAGTAGT CCGGGCCATG GATAAGAAGA AAGTGTTGGT CAAGGTACAT CCTGAAGGTA AATTTGTTGT AGACGTGGAC AAAAACATTG ACATCAATGA TGTGACACCC AATTGCCGGG TGGCTCTAAG GAATGACAGC TACACTCTGC ACAAGATCCT GCCCAACAAG GTAGACCCAT TAGTGTCACT GATGATGGTG GAGAAAGTAC CAGATTCAAC TTATGAGATG ATTGGTGACT GGACAAAACA GATCAAGGAG ATCAAAGAAG TGATCGAGCT GCCTGTTAAG CATCCTGAGC TCTTCGAAGC ACTGGGCATT GCTCAGCCCA AGGGAGTGCT GCTGTATGGA CCTCCAGGCA CTGGGAAGAC ACTGTTGGCC CGGGCTGTGG CTCATCATAC GGACTGTACC TTTATTCGTG TCTCTGGCTC TGAATTGGTA CAGAAATTCA TAGGGGAAGG GGCAAGAATG GTGAGGGAGC TGTTTGTCAT GGCACGGGAA CATGCTCCAT CAATCATCTT CATGGACGAA ATCGACTCCA TCGGCTCCTC GCGGCTGGAG GGGGGTTCTG GAGGGGACAG TGAAGTGCAG CGCACGATGC TGGAGTTGCT CAACCAGCTC GACGGCTTTG AGGCCACCAA GAACATCAAG GTTATCATGG CTACTAATAG GATTGATATC CTGGACTCGG CACTGCTTCG CCCAGGGCGC ATTGACAGAA AAATTGAATT CCCACCCCCC AATGAGGAGG CCCGGCTGGA CATTTTGAAG ATTCATTCTC GGAAGATGAA CCTGACCCGG GGGATCAACC TGAGAAAAAT TGCTGAGCTC ATGCCAGGAG CATCAGGGGC TGAAGTGAAG GGCGTGTGCA CAGAAGCTGG CATGTATGCC CTGCGAGAAC GGCGAGTCCA TGTCACTCAG GAGGACTTTG AGATGGCAGT AGCCAAGGTC ATGCAGAAGG ACAGTGAGAA AAACATGTCC ATCAAGAAAT TATGGAAG の塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 変異したまたは変異せしめた請求項１に
   記載のポリペプチドのアミノ酸配列であって、上記ポリ
   ペプチドを含むプロテアソームがプロテアーゼ活性を実
   質的に有するアミノ酸配列のポリペプチド。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のポリペプチドとの相同
   異性体であって、上記ポリペプチドを含むプロテアソー
   ムがプロテアーゼ活性を実質的に有するアミノ酸配列の
   ポリペプチド。
6. 【請求項６】 変異したまたは変異せしめた請求項１に
   記載のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同
   性を有し、プロテアーゼ活性を実質的に有するアミノ酸
   配列のポリペプチド。
7. 【請求項７】 請求項４，５、または６に記載のポリペ
   プチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 変異したまたは変異せしめた請求項２ま
   たは３に記載のポリヌクレオチドであって、塩基配列が
   ８０％以上の相同性を保持し、且つ該ポリヌクレオチド
   でコードされるプロテアソームサブユニットＰ４５を含
   むプロテアソームがプロテアーゼ活性を実質的に有する
   ポリヌクレオチド。
9. 【請求項９】 請求項１記載のポリペプチドを構成する
   アミノ酸配列であって、連続する少なくとも４のアミノ
   酸からなるポリペプチド。
10. 【請求項１０】 請求項３記載のポリヌクレオチドを構
    成する塩基配列であって、連続する少なくとも１５の塩
    基からなるポリヌクレオチドまたは相補的ポリヌクレオ
    チド。
11. 【請求項１１】 プロテアソームサブユニットＰ４５
    を、該サブユニットとその抗体との特異性を利用して測
    定することを特徴とする免疫疾患診断用キット。
12. 【請求項１２】 プロテアソームサブユニットＰ４５の
    相補鎖ポリヌクレオチドを用いてｍＲＮＡを測定するこ
    とを特徴とする免疫疾患診断用キット。
13. 【請求項１３】 プロテアソームサブユニットＰ４５の
    ポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドによって形質
    転換された組換え微生物細胞。
14. 【請求項１４】 上記組み換え微生物細胞が大腸菌であ
    る請求項１３に記載の微生物細胞。