JPWO2002031163A1 - 新規なadamtsファミリーポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子 - Google Patents
新規なadamtsファミリーポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2002031163A1 JPWO2002031163A1 JP2002534530A JP2002534530A JPWO2002031163A1 JP WO2002031163 A1 JPWO2002031163 A1 JP WO2002031163A1 JP 2002534530 A JP2002534530 A JP 2002534530A JP 2002534530 A JP2002534530 A JP 2002534530A JP WO2002031163 A1 JPWO2002031163 A1 JP WO2002031163A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- protein
- polynucleotide
- seq
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
ヒト脳由来の新規なタンパク質をコードするcDNAを単離し、公知配列との相同性分析からADAMTSファミリーに属し、レプロリシン(reprolysin)型亜鉛メタロプロテアーゼドメイン(Zn−metalloprotease)、ディスインテグリン様(disintegrin−like)ドメイン及びTSP1(thrombospondin type 1)ドメインを保存している新規なADAMTSファミリータンパク質を得た。特性は、卵巣での高発現及び性周期における発現量の変動、腫瘍細胞における存在の低下及び当該遺伝子の染色体上の位置が5P−症候群の欠失部位に位置することを特徴とする。この特性を利用して、該cDNA、該タンパク質及びその由来物であるポリペプチドもしくはペプチド、該タンパク質に対する抗体、該タンパク質の有する作用の阻害剤・拮抗剤・賦活剤のスクリーニング方法、スクリーニングされた化合物等を提供し、これらを利用した医薬組成物、診断・治療方法を提供する。
Description
技術分野
本発明は、新規なADAMTSファミリーポリペプチド又はタンパク質、及び該ポリペプチド又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものである。さらに詳しくは、該ポリペプチド若しくはタンパク質のアミノ酸配列の全部若しくは一部を有するペプチド、該ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体、該ペプチド又はポリペプチドに対する抗体、これらを利用した化合物のスクリーニング方法でスクリーニングされた化合物、該ポリペプチド若しくは該ポリヌクレオチドに作用する活性阻害化合物又は活性賦活化合物、これらに関係する医薬組成物、及びこれらに関係する疾病診断方法、当該形質転換体を使ったペプチド又はポリペプチドの製造方法、当該スクリーニング方法に関する。
背景技術
近年、レプロリシン型(reprolysin type)亜鉛メタロプロテアーゼドメイン(Zn−metalloprotease)(Hooper N.M. FEBS Lett.(1994)354:1−6)、ディスインテグリン様(disintegrin−like)ドメイン及びTSP1(thrombospondin type 1 repeats)ドメインを有するユニークなタンパク質が見い出されており(Kuno K.,et al., J.Biol.Chem.(1997)272:556−562;Vazques.F.,et al, J.Biol.Chem.(1999)274:23349−23357等)、これらの特徴的なドメインを有するタンパク質はADAMTS(adisintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs)ファミリーと総称されている(Tang B.L.,et al., FEBS Lett.(1999)445:223−225)。
レプロリシン型亜鉛メタロプロテアーゼドメインは、ADAMTS及びADAM(a disintegrin and metalloprotease)ファミリー等に含まれ、活性中心は一般にHEX1X2HXX1GX1XHD(通常、X1;疎水性アミノ酸、X2;グリシンあるいは疎水性アミノ酸)であり、3つのヒスチジン残基が1つの亜鉛分子に配位していると考えられている(Hooper N.M. FEBS Lett.(1994)354:1−6)。
TSP1ドメインは、トロンボスポンジン1(thrombospondin−1)が有する繰り返し配列として見い出され、そのCSVTCGモチーフはCD36/LIMPII受容体に結合し、WSXWモチーフは細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカン(heparan sulfate proteoglycan)に結合することが知られている。
ディスインテグリン様ドメインは、システインに富み抗血液凝固作用を有するヘビ毒のディスインテグリン(disintegrin)に40%程度の相同性を有している。機能的にヘビ毒のディスインテグリンと同等あるいは同様の作用を有するかは未解明である。
現在、ADAMTSファミリーとしてADAMTS−1〜10、12〜13の12種類(ADAMTS11も報告されているが、ADAMTS5と同一分子であった)が報告されている。その中には、細胞外マトリックスのアグリカン(Aggrecan)切断活性を持つADAMTS−4(Aggrecanase−1)、ADAMTS−5(Aggrecanase−2)やプロコラーゲン切断活性をもつADAMTS−2(procollagen I/II aminopropeptidase)のように従来のマトリックスメタロプロテアーゼ(matrix metalloprotease)とよく似た酵素活性をもつものが認められている反面、ADAMTS−1(METH1)やADAMTS−8(METH2)のようにエンドスタチン(endostatin)やTSPという従来知られていた血管新生阻害因子よりも強い血管新生阻害作用を持つものも発見されている(Vazques.F.,et al, J.Biol.Chem.(1999)274:23349−23357)。
ADAMTS−1については、血管新生阻害作用の他、炎症組織での発現上昇(Kuno K.,et al., J.Biol.Chem.(1997)272:556−562)、性周期による発現変動と排卵への関与(Robker R.L.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(2000)97:4689−4694;Robker R.L.,et al., Steroids(2000)65:559−570)等が報告されている。基質としては、アグリカン(Kuno K.,et al., FEBS Lett.(2000)478:241−245)及びバージカン(Versican)(Sandy J.D.,et al., J.Biol.Chem.(2001)276:13372−13378)が報告されている。
ADAMTS−2は、その欠損が、プロコラーゲンIの蓄積による皮膚の形成異常を特徴とするEhlers−Danlos syndrome type VIICの原因であることが報告されている(Colige A.,et al.,Am.J.Hum.Genet.(1999)65:308−317;Li S.W.,et al., Biochem.J.(2001)355:271−278)。ADAMTS−3は、ドメイン構造及び活性中心の配列がADAMTS−2と非常に似ており、ADAMTS−2とともにプロコラーゲンIIを基質とすることが報告されている(Fernandes R.J.,et al., J.Biol.Chem.(2001)276:31502−31509)。
ADAMTS−4及びADAMTS−5は、基質としてアグリカンの373番目のグルタミン酸残基と374番目のアラニン残基間(Glu373−Ala374 bond)を切断することが報告されている(Tortorella M.D.,et al.,Science(1999)284:1664−1666;Abbaszade I.,et al., J.Biol.Chem.(1999)274:23443−23450)。同部位の切断は慢性関節リウマチや変形性関節症のような関節軟骨破壊を伴う関節疾患の初期徴候の一つであり(Sandy J.D., J.Clin.Invest.(1992)89:1512−1516)、ADAMTS−4及びADAMTS−5の阻害剤がその治療薬として着目されている。また、生体内におけるADAMTS−4及びADAMTS−5の強力な阻害剤としてTIMP−3が報告されている(Hashimoto G.,et al., FEBS Lett.(2001)494:192−195;Kashiwagi M.,et al., J.Biol.Chem.(2001)276:12501−12504)。ADAMTS−4については、アグリカン以外の基質として、ブレビカン(brevican)(Matthews R.T.,et al., J.Biol.Chem.(2000)275:22695−22703)、バージカン(Sandy J.D.,et al., J.Biol.Chem.(2001)276:13372−13378)が報告されている。
最近同定されたADAMTS−13については、血液凝固に関与するフォンビルブランドファクター(von Willebrand factor)の切断活性が認められている(Fujikawa K.,et al., Blood(2001)98:1662−1666;Zheng X.,et al., J.Biol.Chem.(2001)Sep13[epub ahead of print];Soejima K.,et al., J.Biochem.(Tokyo)(2001)130:475−480)。同酵素活性の欠損は、血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura)の原因とされており、ADAMTS−13が着目されている。
発明の開示
本発明が解決しようとする課題のひとつは、上記のように多様な作用の原因物質となり得るADAMTSファミリータンパク質に関する新規な物質を見い出し、生体内におけるADAMTSファミリータンパク質の制御を可能にすることである。より具体的には、本発明の課題は新規な特性をもつ新規なADAMTSファミリータンパク質を提供することであり、それに伴い有用性ある新規なADAMTSファミリータンパク質由来のペプチド又はポリペプチドを提供することである。また本発明の別の課題は、新規なADAMTSファミリータンパク質由来のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することであり、さらにこれを利用して遺伝子工学手法による新規なADAMTSファミリータンパク質の製造法を提供することである。さらに本発明の別の課題は、新規なADAMTSファミリータンパク質、ペプチド又はポリペプチドに対する抗体を提供することである。その他の本発明の課題は、上記のものを利用して新規なADAMTSファミリータンパク質の有する作用の阻害剤・拮抗剤・賦活剤のスクリーニングを行なうことであり、スクリーニングされた化合物を提供することであり、またこれらを利用した医薬組成物及び診断方法を提供することである。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト脳細胞中のmRNA由来のcDNAライブラリーから新規なADAMTSファミリータンパク質をコードするcDNAを単離し、全塩基配列を解析することに成功した。そして、この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、当該タンパク質はN末端側にレプロリシン(reprolysin)様の亜鉛メタロプロテアーゼドメイン(Zn−metalloprotease)を1個、C末端側にTSP1ドメインを5回繰り返して保持し、その中間にディスインテグリン様ドメインを1個有することを確認し、これらのcDNAにコードされるタンパク質が新規なADAMTSタンパク質であることを確認した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の1態様は、下記の群より選ばれるADAMTSファミリーに属するポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質である;
▲1▼配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
▲2▼前記▲1▼のポリペプチドを含有するポリペプチド、
▲3▼前記▲1▼のポリペプチドと少なくとも約50%のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
及び
▲4▼前記▲1▼〜▲3▼のポリペプチドにおいて、そのアミノ酸配列に1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するポリペプチド。
本発明の1態様は、配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列の一部を有する部分ペプチドであって、少なくとも約8個の連続するアミノ酸配列を有するペプチドである。
本発明の1態様は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖である。
本発明の1態様は、配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖である。
本発明の1態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
本発明の1態様は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖である。
本発明の1態様は、配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補的塩基配列の少なくとも約15個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明の1態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
本発明の1態様は、上記いずれか1つのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有する組換えベクターである。
本発明の1態様は、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体である。
本発明の1態様は、上記形質転換体を培養する工程を含む、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチドの製造方法である。
本発明の1態様は、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチドを免疫学的に認識する抗体である。
本発明の1態様は、少なくともADAMTSファミリーポリペプチドを認識する、上記抗体である。
本発明の1態様は、上記ポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害若しくは促進する作用を有する化合物、及び/又は上記いずれかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、上記いずれかのポリヌクレオチド、上記ベクター、上記形質転換体、上記抗体のうちの少なくともいずれか一つを用いることを特徴とするスクリーニング方法である。
本発明の1態様は、上記ポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害若しくは活性化する化合物、又は上記いずれかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する化合物のスクリーニング方法であって、化合物とポリペプチド又はタンパク質との間の相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチド又はタンパク質とスクリーニングすべき化合物とを接触させて化合物の相互作用を評価し(かかる相互作用はポリペプチド又はタンパク質と化合物との相互作用に応答した検出可能シグナルを提供し得る第2の成分に関連したものである)、次いで、化合物とポリペプチド又はタンパク質との相互作用により生じるシグナルの存在又は不存在又は変化を検出することにより、化合物がポリペプチド又はタンパク質と相互作用して、その活性を活性化又は阻害するかどうかを決定することを含む方法である。
本発明の1態様は、上記方法でスクリーニングされる化合物であって、上記ポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害又は促進する化合物又はその塩である。
本発明の1態様は、上記方法でスクリーニングされる化合物であって、上記いずれかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する化合物又はその塩である。
本発明の1態様は、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、上記いずれかのポリヌクレオチド、上記ベクター、上記形質転換体、上記抗体、又は上記化合物のうちの少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする医薬組成物である。
本発明の1態様は、上記ポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質の発現又は活性に関連した疾病の診断方法であって、(a)該ポリペプチド又はタンパク質をコードしている核酸、及び/又は(b)個体由来の試料中の該ポリペプチド又はタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法である。
本発明の1態様は、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、上記いずれか1つのポリヌクレオチド、又は上記抗体のうちの少なくともいずれか1つを含んでなる、(a)該ポリペプチド又はタンパク質をコードしている核酸、及び/又は(b)試料中の該ポリペプチド又はタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法に使用する試薬キットである。
本発明の1態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖をエクソンとして含有するヒトゲノム遺伝子断片たるポリヌクレオチドである。
本発明の1態様は、上記ヒトゲノム遺伝子断片の塩基配列又はその相補配列の少なくとも15個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明の1態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
本発明の1態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖をマーカー又はプライマーとして用いることを特徴とする疾病の診断方法である。
発明を実施するための最良の形態
(新規なADAMTSファミリータンパク質)
本発明において提供される新規なADAMTSファミリータンパク質は、ヒト脳細胞中のmRNA由来のcDNAライブラリーから発現配列タグ(EST)分析(Adams,M.D.,et al., Science(1991)252:1651−1656;Adams,M.D.et al., Nature(1992)355:632−634;Adams,M.D.,et al., Nature(1995)377 Supp:3−174)を用いてTSP1ドメインをマーカーとして釣上げられたcDNAクローン(配列表の配列番号2)の塩基配列から特異的に作成したプライマーを使用して、さらに5′RACE(Rapid amplification of cDNA end)法で取得された全長cDNA(配列番号3)がコードする新規なアミノ酸配列を有するものである。当該cDNAクローンにコードされるアミノ酸配列は配列表の配列番号1に、該全長cDNAにコードされるアミノ酸配列は配列表の配列番号4に記載した。この新規なADAMTSファミリータンパク質のmRNAは、ヒトの卵巣で発現が高く、ついで腎臓、肺、胃、精巣、副腎、膵臓で発現量が高かった。また、脳、小腸、骨格筋、皮膚において中程度に発現していた。卵巣での発現が特に高かったことから、同タンパク質は卵の分化・成熟あるいは排卵ひいては受精等に関与することが考えられる。また、卵巣・心臓及び腎臓の腫瘍組織ではmRNAの発現量が正常組織に比べ著しく低下していたことから腫瘍に関連する遺伝子であることが推定された。さらに、この新規遺伝子が、第5染色体短腕15.2−15.3(5p15.2−15.3)に存在することを見い出した。5p15.2−15.3は5P−症候群(Cri−du−chat syndrome)の欠失部位であることが報告されていることから(Overhauser J,et al,Hum.Mol.Genet.(1994)2:247−252)、該遺伝子と同症候群との関連が示唆された。また、本発明においては、上記新規なヒトADAMTSファミリータンパク質のマウスのカウンターパートをも見い出し、これを提供する。このマウスADAMTSファミリータンパク質のcDNAの塩基配列は配列表の配列番号7に、該cDNAがコードするアミノ酸配列は配列番号8に記載した。
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質は、公知データベース登録配列との相同性分析からADAMTSファミリーに属し、TSP1ドメイン及びレプロリシン型亜鉛メタロプロテアーゼ(Zn−metalloprotease)ドメインを有し、システイン−リッチ リージョン(Cysteine−rich region)を有することが判明した。
本タンパク質がADAMTSファミリータンパク質であること、またTSP1ドメインを有することから、ADAMTS1及びADAMTS8で報告されているのと同様に血管新生阻害作用を有することが示唆される。また、レプロリシン型亜鉛メタロプロテアーゼを有し、かつ卵巣で性周期に応じて発現が変動することから、卵巣の細胞外マトリックスを基質として、その分解及び再構築に関与していると考えられる。
(タンパク質、ポリペプチド又はペプチド)
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質は、配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列と同一、又は実質的に同一なアミノ酸配列を含有するタンパク質である。当該新規なADAMTSファミリー含有タンパク質は、ヒトや哺乳動物のあらゆる細胞、又はそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、実施例6及び7にみられる発現特性を保持する限りは特に限定されず、例えば、配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
また、配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、さらに配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質等が例示される。実質的に同質の活性として、例えば同一ファミリーに属するADAMTS1及びADAMTS8で報告されているように、本発明に係る新規なタンパク質が血管新生阻害活性を有することも考えられるが、その活性測定方法としては、インビボ(in vivo)法として、ニワトリ胚の漿尿膜(chorioallantoic membrane)を用いるCAM法(Moses M.A.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96:2645−2650)、ウサギやラットの目の角膜に少し切り目をつけて試料を入れ、そこに向かって近くの細静脈から伸びてくる新生血管を観察する角膜法(Gaudric A.,et al., Ophthalmic Res.(1992)24:181−188)等を、インビトロ(in vitro)法として、培養血管内皮細胞を用いてボイデンチャンバーで遊走を、単層培養で細胞の増殖を観察し、管腔形成は三次元のコラーゲンゲルやマトリゲル(IV型コラーゲン、ラミニン、ニドゲン/エンタクチン及びヘパラン硫酸よりなる再構成基底膜ゲル)で培養して観察する方法(Haas T.L.,et al., J.Biol.Chem.(1998)273:3604−3610)等をそれぞれ挙げることができる。
アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、cDNAの塩基配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等が可能である。
本発明に係る新規なADAMTSファミリーポリペプチドを含むタンパク質は「成熟」タンパク質の形態であってもよく、あるいは融合タンパク質のごとき大型のタンパク質の一部であってもよい。分泌又はリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基のごとき精製を促進する配列、又は組換え生産を行っている間の安定性のためのさらなる配列を含むものであってもよい。
本発明に係るポリペプチド又はペプチドは、配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列を有するポリペプチド又はペプチドを包含し、これらは例えば試薬・標準物質・免疫原として利用できる。その最小単位としては8個以上のアミノ酸、好ましくは10個以上のアミノ酸、より好ましくは12個以上、さらに好ましくは15個以上の連続するアミノ酸で構成されるアミノ酸配列からなり、好ましくは免疫学的に同定し得るポリペプチド又はペプチドを本発明の対象とする。これらのペプチドは、試薬若しくは標準物質、又は後述するように本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質に特異的な抗体を作製するための抗原として単独又はキャリア(例えば、キーホールリンペイトヘモシアニン又は卵白アルブミン)と結合して使用できるが、これらのように別種のタンパク質又は物質を結合したものも本発明の範囲に包含される。部分配列は、「独立して存在するもの(free standing)」であるか、あるいはより大きなポリペプチド内に含まれていてもよく、その中で部分配列は一部分若しくはある領域を形成していてもよい。最も好ましくは、単一の連続した領域としてより大きなポリペプチドに含まれる。
さらに、このように特定されたポリペプチド又はペプチドを基にして、その生理活性(例えば血管新生抑制能)を指標とすることにより、1以上、例えば1ないし100個、好ましくは1ないし30個、より好ましくは1ないし20個、さらに好ましくは1ないし10個で、特に好ましくは1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はペプチドも提供される。欠失、置換、付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はポリメラーゼ連鎖増幅法(PCR)を単独又は適宜組み合わせて、例えば、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第2版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年;[ラボマニュアル遺伝子工学]、村松正實編、丸善株式会社、1988年;[PCRテク1989年等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばUlmerの技術(Science(1983)219:666)を利用できる。例えば、N末端を含む一連の残基が欠失、又はC末端を含む一連の残基が欠失、あるいは一方がN末端でもう一方がC末端を含む2種の一連の残基が欠失していること以外は上記新規なADAMTSファミリータンパク質のアミノ酸配列を有する末端切断ポリペプチドを包含する。
また、構造的又は機能的属性により特徴づけられる部分配列、例えばアルファーヘリックス及びアルファーヘリックス形成領域、ベータシート及びベータシート形成領域、ターン及びターン形成領域、コイル及びコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、及び高抗原性指標領域を含む部分配列等も好ましい。また、生物学的に活性な領域も好ましく、類似の活性若しくは改善された活性のある、又は望ましくない活性を減じた部分配列等がある。動物、とりわけヒトにおいて抗原的又は免疫原的な部分配列もまた含まれる。
本発明に係るタンパク質、ポリペプチド及びそれらの部分配列ペプチドのアミノ酸配列は保存的アミノ酸置換により変化したものも含まれている。かかる典型的な置換は、Ala、Val、Leu及びIle間;Ser及びThr間;Asp及びGlu間;Asn及びGln間;並びに塩基性残基Lys及びArg間;あるいは芳香族残基Phe、Trp及びTyr間におけるものである。数個、5ないし10個、1ないし5個、又は1ないし2個のアミノ酸がいずれかの組み合わせで置換、欠失又は付加されているものが特に好ましい。
上記のような変異の導入において、当該タンパク質の基本的な性質(物性、活性、又は免疫学的活性等)を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸(極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等)の間での相互置換は容易に想定される。
なお、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質はペプチド結合又は修飾されたペプチド結合により互いに結合している2個又はそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドを意味する。また、本明細書において、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称する短鎖をポリペプチド、また、長鎖のものをタンパク質ということもある。
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質は、20種の遺伝子によりコードされたアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有することもできる。「タンパク質」には、プロセッシング及びその他の翻訳後修飾のような天然のプロセッシングにより修飾されたものが含まれるが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾される。このような修飾は基礎的な参考書及びさらに詳細な論文並びに多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に周知である。
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びN末端側又はC末端側等のポリペプチドの任意の部位で行われ得る。同一の型の修飾は該ポリペプチドの幾つかの部位で、同一又は異なる程度で存在し得る。また、タンパク質は多くの型の修飾をも含み得る。タンパク質は、ユビキチネーションの結果として分枝状であってもよく、分枝を伴う又は伴わない環状のものであってもよい。環状、分枝状及び分枝状かつ環状のタンパク質は翻訳後の天然プロセッシングにより生じるものであってもよく、あるいは合成法により製造されるものであってもよい。
修飾には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、及びセレノイル化、アルギニル化のようなトランスファーRNA媒介のタンパク質へのアミノ酸の添加、並びにユビキチネーション等がある。
例えば、Proteins−Structure and Molecular Properties、第2版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク、1993年及びPost−translational Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレス、ニューヨーク、1983年のWold,F.,Posttranslational Protein Modifications:Perspective and Prospects、1−12頁;Seifter et al.,Meth.Enzymol.(1990)182:626−646及びRattan et al., Protein Synthesis:Post−translational Modifications and Aging, Ann.N.Y.Acad.Sci.(1992)663:48−62参照。
さらに、本発明に係るポリペプチド等の検出若しくは精製を容易にするために、又は別の機能を付加するために、N末端側やC末端側に別のタンパク質、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、IgG等の免疫グロブリンFc断片、Myc−tag、His−tag、又はFLAG−tag等のペプチドを直接又はリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することは当業者には容易であり、これらの別の物質を結合したポリペプチド等も本発明の範囲に包含される。なお、ヒト以外の動物種の相同遺伝子産物も当然本発明の範囲に包含される。
(ポリヌクレオチド)
一つの態様において、本発明に係るポリヌクレオチド及びその相補鎖は、本発明に係るポリペプチド等、例えば配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドに対する相補鎖を意味する。好ましいポリヌクレオチドの塩基配列は、配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7に記載した。
別の態様において本発明は、本発明に係るポリペプチド又はペプチドのアミノ酸配列、例えば配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、好ましくは配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖の対応する領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第2版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年等に従うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものであるが、その一例としては、50%ホルムアミド、5×SSC(150mM NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウム,pH7.6、5×デンハーツ溶液、10%デキストラン硫酸、及び20μg/mlの変性剪断サケ・精子DNAを含む溶液中、42℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で2×SSC・0.1%SDS中で一次洗浄し、次いで、約65℃において0.1×SSC・0.1%SDSで二次洗浄といった条件であってもよい。
これらのポリヌクレオチドは目的のポリヌクレオチド、特に配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖にハイブリダイズするものであれば必ずしも相補的配列でなくとも良い。例えば、配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7の塩基配列又はその相補的配列に対する相同性において、少なくとも約40%、例えば、約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95%以上である。また本発明に係るポリヌクレオチドは、指定された塩基配列の領域に対応する連続する10個以上の、好ましくは15個以上の、より好ましくは20個以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド及びこれらの相補鎖を包含する。ここで、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質又はこれと同様の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、例えば公知のタンパク質発現系を利用して発現タンパク質の確認を行い、その生理活性を指標にして選別することにより行なうことができる。無細胞タンパク質発現系を利用する場合は、例えば胚芽、家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用できる(Nature(1957)179:160−161)。
上記本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチド等の製造において、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質をコードする核酸、例えばその遺伝子若しくはmRNAの検出用プローブ若しくはプライマー(primer)として、又は遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド等として有用である。その意味で、本発明に係るポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものも包含する。例えば、アンチセンスによって本発明に係る新規なADAMTSファミリー含有タンパク質の発現を特異的に阻害するためには、当該ADAMTSファミリータンパク質に固有な領域の塩基配列を用いることが想定される。一方、保存配列を用いることにより当該ADAMTSファミリータンパク質を含む複数のADAMTSファミリータンパク質又はTSP1含有タンパク質の発現を同時に抑制することも可能と考えられる。
本発明に係るポリヌクレオチドは、一般的には、修飾されていないRNA若しくはDNA、又は修飾されたRNA若しくはDNAであってもよい。「修飾されたRNA若しくはDNA」は、安定性又はその他の理由により、修飾された塩基を有するDNA又はRNA、並びに修飾された骨格を有するDNA又はRNAを包含する。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基及びイノシンのごとき通常的でない塩基を包含する。また、「修飾された」骨格は、フォスフォジエステル骨格が、例えばフォスフォロチオエート(phosphorothioate)骨格及びモルフォリノ(morpholino)骨格のごとき通常でない骨格を包含する。種々の修飾がDNA及びRNAについて行われており、典型的に天然において見いだされるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞に特徴的なDNA及びRNAの化学的形態を包含する。また、「RNA若しくはDNA」は、しばしば「オリゴヌクレオチド」と称する短いポリヌクレオチドを包含する。
本発明に係るポリヌクレオチドは、対象のRNA、DNAによりコードされるアミノ酸配列を変化させるものであってもよく、対象配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠損、融合及び末端切断を招く場合があるが、本発明はこれらのものも包含する。これらの変化は1又はそれ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起こることにより、アミノ酸配列が変化し得るものであり、これらの変化は、突然変異技術、直接的合成、及び当業者に既知のその他の組換え技術により製造できる。
本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列及びポリペプチドのアミノ酸配列の同一性は、本発明に係るRNA、DNA又は本発明に係るタンパク質の同一性の尺度である。一般的には、最高の合致が得られるように配列を並置する。同一性はそれ自体当該分野において認識された意味を有し、公表された方法を用いて算出できる。
例えば、Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年;Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993年;Computer Analysis of Sequence Data,パートI,Griffin,A.M.及びGriffin,H.G.編、ヒューマン・プレス、ニュージャージー、1994年;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heijne,G.、アカデミック・プレス、1987年;及びSequence Analysis Primer, Gribskov,M.及びDevereux,J.編、エム・ストックトン・プレス、ニューヨーク、1994年に記載の方法が利用できる。二つの配列の同一性を測定する方法は多くあるが、用語「同一性」は当業者によく知られている(Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heijne,G.、アカデミック・プレス、1987年;Sequence Analysis Primer, Gribskov,M.及びDevereux,J.編、Mストックトン・プレス、ニューヨーク、1991年;並びにCarillo,H.and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.(1988)48:1073)。
配列間の同一性又は類似性を測定するために通常用いられる方法はCarillo,H. and Lipman,D., SIAM J.Applied Math.(1998)48:1073等に開示されているが、これらに限定するものではない。同一性及び類似性を決定する方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに集成されている。二つの配列間の同一性及び類似性を測定する好ましいコンピュータープログラム法には、GCGプログラムパッケージ(Devereux,J.,et al., Nucleic Acids Research(1984)12(1):387)、BLASTP、BLASTN、及びFASTA(Atschul,S.F.et al., J.Molec.Biol.(1990)215:403)等があるが、これらに限定するものではない。
さらにまた、本発明におけるポリヌクレオチドの別の態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖をエクソンとして含有するヒトゲノム遺伝子断片たるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチド又はその相補鎖をなす塩基配列の少なくとも約15個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを包含する。
上記本発明に係るポリヌクレオチドは、例えば上記新規なADAMTSファミリータンパク質の製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸に関する試薬・標準品としても利用できる。例えば、上記ポリヌクレオチドをマーカー又はプライマーとして、後述するように、上記ポリヌクレオチドの変異や発現に関連する疾病の診断方法に使用できる。また、後述するように、当該疾病の防止及び/又は治療に用いる医薬組成物の成分の一つとして用いることができる。
(形質転換体)
本発明は、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞、並びにカイコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ等の実験動物等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術によっても、又は本発明に係るDNA由来のRNAを用いた無細胞タンパク質合成法により、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドは提供可能である。後述する実施例では、哺乳動物由来のCOS7細胞及び昆虫細胞系を宿主として利用し、上記ポリペプチドを遺伝子工学的に発現した。
形質転換は、自体公知の手段が応用され、例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換が行われる。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法であるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系の利用である。ベクターは、選択した宿主の種類により選別され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。組合せは原核細胞、真核細胞によって分別され、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー、マーカー配列、転写配列、非翻訳配列、スプライシング及びポリアデニル化シグナル、mRNAを安定化する配列のごとき非コーディング5′及び3′配列等を自体公知の方法によって組合せ利用できる。なお、マーカー配列は、pQEベクター(QIAGEN社製)中に提供されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド(Gentz et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA(1989)86:821−824に記載される)又はHAタグ(Wilson et al., Cell(1984)37:767)が好適に例示される。
DNAの宿主細胞への導入は、例えば、Davisら、Basic Methods in Molecular Biology、1986年;Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第2版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年の如き多くの標準的な実験マニュアルに記載される方法により行なうことができ、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷(scrape loading)、バリスティック導入(ballistic in troduction)及び感染等がある。
適当な宿主の代表的なものには、細菌細胞、例えば連鎖球菌属(streptococci)、ブドウ球菌属(staphylococci)、大腸菌(E.coli)、ストレプトミセス(Streptomyces)及び枯草菌(Bacillus subtilis)細胞;真菌細胞、例えば酵母細胞及びアスペルギルス属(Aspergillus)細胞;昆虫細胞、例えばドロソフィラS2(Drosophila S2)及びスポドプテラSf9(Spodoptera Sf9)細胞;動物細胞例えばCHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293及びボウズ(Bows)メラノーマ細胞;並びに植物細胞等がある。
ベクターには、染色体、エピソーム及びウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミド及びバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミド及びファージミド等がある。
発現系の構築物には発現を制御及び引き起こす調節領域を含有させることができる。通常、宿主中にDNAを保持、伸長又は発現するためには、タンパク質を発現するのに適した任意の系又はベクターを選択することが必要となる。これらは周知の技術により適当なDNA配列を発現系に挿入することができ、例えば、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第2版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年に記載されている。また、翻訳タンパク質を、小胞体内腔、ペリプラスミックスペース又は細胞外環境へ分泌させるために、適当な分泌シグナルを発現するタンパク質に組み込むことができる。これらのシグナルはタンパク質に本来的なものであってもよく、あるいは異種性のシグナルであってもよい。
形質転換体は、各宿主の培養に最適な自体公知の条件を選択して培養される。培養は、発現産生される本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドの生物活性をマーカーにして行なってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養又はバッチ培養によって行ってもよい。
目的とするタンパク質、ポリペプチド又はペプチドが上記形質転換体の培養培地中に分泌される場合は、該培地を回収し、該培地から精製することによりそれらを得ることができる。さらに、それらが上記形質転換体の細胞内に生成される場合は、まず細胞を溶解し、次いで、タンパク質を回収することによって目的のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを得ることができる。また、目的とするタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをスクリーニングアッセイのために発現させる場合、一般的には、細胞表面にタンパク質を生産させるのが好ましい。この場合、スクリーニングアッセイに使用する前に細胞を集めてもよい。
また、カイコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ等の実験動物等に本発明に係る遺伝子を導入して組換え動物を作製し、目的とするタンパク質を当該動物の生体内で発現させることも可能である。このような技術は、当該分野においては公知である。
(新規なADAMTSファミリードメイン含有タンパク質及びその由来物の精製・回収)
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドは、ヒトやその他哺乳動物の細胞、組織、培養された該細胞若しくはその培養培地(細胞培養物)、上記遺伝子組換え技術により作製した細胞又はその培養物、又は上記遺伝子組み換え技術により作製した組換え動物由来の試料、例えば細胞、組織、乳汁、血液、尿等から周知の精製方法により得ることができる。その方法には例えば硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー等がある。これらの方法は適宜組み合わせて行ってもよい。好ましくは、アミノ酸配列の情報に基づき、該アミノ酸配列を認識する抗体を作成し、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。また、高速液体クロマトグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。簡便には、ヘパリンを利用した親和性クロマトグラフィーが利用できる。さらに、精製過程において、生理活性(例えば血管新生抑制能)を指標にして、精製の確認を行うこともできる。タンパク質が単離及び/又は精製中に変性した場合、再び活性な立体配座にするために、タンパク再生のための周知の技法を用いることができる。
(抗体)
抗体は、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド、あるいはそれらの抗原決定基を含むペプチドから選択したものを抗原として用いて作製する。抗原は当該ADAMTSファミリータンパク質自体又はその断片でもよく、少なくとも8個、好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも12個、さらに好ましくは15個以上のアミノ酸で構成される。当該ADAMTSファミリータンパク質に免疫特異的な抗体を作製するためには、新規なADAMTSファミリータンパク質に固有な配列からなる領域を用いることが好ましい。このアミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8と相同である必要はなく、タンパク質の立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位がアミノ酸の一次配列上で不連続部位であったとしても当該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は、当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを免疫学的に結合又は認識する限り特に限定されない。この結合又は認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定される。「免疫特異的」とは、先行技術の他の関連タンパク質に対する親和性よりも、当該ADAMTSファミリータンパク質に対する親和性が実質的に大きいことを意味する。
抗体の生産は、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質、その由来物からなるペプチド又はポリペプチドを、アジュバントの存在又は非存在下で、単独又は担体に結合して、動物に対して体液性応答及び/又は細胞性応答等の免疫誘導を行なうことによって行われる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清からの抗体回収法によって取得される。好ましい手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法である。
モノクローナル抗体の生産は、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞(例えば、脾臓又はリンパ節由来)を回収し、自体公知の永久増殖性細胞(例えば、P3−X63−Ag8株等のミエローマ株)への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、上記抗体産生細胞と永久増殖性細胞とから作成されたハイブリドーマをクローン化し、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質を特異的に認識する抗体を産生しているハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。実例としては、ハイブリドーマ法(Kohler,G.and Milstein,C., Nature(1975)256:495−497);トリオーマ法(Kozbor et al., Immunology Today(1983)4:72);及びEBV−ハイブリドーマ法(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss,Inc.,(1985):77−96)に記載されるような種々の技法がある。
一本鎖抗体の産生のために記載された技術(米国特許第4946778号)は、本発明に係るタンパク質に対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。また、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物を包含する他の生物を用いて、哺乳動物における免疫学的反応を誘起する方法によりヒト化抗体を発現させてもよい。
上記抗体は、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質を発現するクローンの単離又は同定、あるいは親和性クロマトグラフィーによる該タンパク質の精製に使用できる。
また、上記抗体を用いて、当該新規なADAMTSファミリータンパク質が関与する疾患の診断及び治療に使用できる。
(スクリーニング及びスクリーニングされた化合物)
かくして調製された新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド及びその相補鎖、これらのアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、又はこれらを用いるタンパク質合成系並びに当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独又は複数手段を組合せることによって、当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドに対する活性阻害剤又は活性賦活剤のスクリーニングに有効な手段を提供する。例えば、ペプチド又はポリペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、タンパク質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を利用した抗体認識物質の選別等を、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施可能である。ADAMTSファミリータンパク質は哺乳動物宿主に広く存在し、多くの生物学的機能に関与しており、多くの疾患にも関わっている。したがって、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質を、その活性を阻害又は促進する作用を有する化合物を見い出すためのスクリーニングに用いることは有用である。
具体的には、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを用いて、スクリーニングの対象とされる化合物とこれらペプチド又はポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条件を選別し、この相互作用の有無を検出することのできるシグナル及び/又はマーカー(第2の成分)を使用する系を導入し、次いで、このシグナル及び/又はマーカーの存在又は不存在又はその変化(量的変化及び/又は質的変化を含む)を検出することにより、当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドの活性を賦活又は阻害する化合物をスクリーニング可能である。例えば、当該ADAMTSファミリータンパク質を用いて、スクリーニングの対象とされる化合物中で小型分子基質及びリガンドの結合を評価してもよい。これらの基質及びリガンドは天然の基質及びリガンドであってもよく、あるいは構造又は機能を模倣したものであってもよい(Coligan et al., Current Protocols in Immunology(1991)1(2):Chapter5参照)。
さらにまた、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質のcDNA、タンパク質及び該タンパク質に対する抗体を用いて、細胞における当該ADAMTSファミリータンパク質のmRNA及びタンパク質の産生に対する添加化合物の影響を調べるためのスクリーニングアッセイを行ってもよい。例えば、当該分野で知られた一般的方法により、モノクローナル及びポリクローナル抗体を用いて、当該ADAMTSファミリー含有タンパク質の分泌又は細胞結合レベルを測定するための酵素免疫固相法(Enzyme Linked Immuno Sorvent Assay)(ELISA)を構築してもよく、また、これを用いて当該ADAMTSファミリータンパク質の産生を阻害又は促進し得る因子を適当に処理された細胞又は組織から見い出すこともできる。スクリーニングアッセイを行なうための一般的方法は当該分野においてよく知られたものである。
スクリーニングの対象とされる化合物としては、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー及び天然産物混合物等が挙げられる。
このようにしてスクリーニングされた化合物は、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドについての活性阻害剤、活性拮抗剤、活性賦活剤の候補化合物として利用可能である。また、遺伝子レベルでの当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物に対する発現阻害剤、発現拮抗剤、発現賦活剤の候補化合物としても利用可能である。それらは、ADAMTSファミリータンパク質に由来する各種症状の予防・治療効果を期待できる。上記スクリーニング方法により選別された候補化合物は、生物学的有用性と毒性とのバランスを考慮してさらに選別することによって、医薬組成物として調製可能である。
(医薬組成物)
本発明において提供される新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド及びその相補鎖、これらの塩基配列を含むベクター、当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを免疫学的に認識する抗体、並びに上記スクリーニング方法により選別された化合物は、当該ADAMTSファミリー含有タンパク質の活性阻害・拮抗・賦活等の機能を利用した治療薬等の医薬手段として使用可能である。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチド又はポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、又は抗体等それぞれに応じた製剤化方法を導入すればよい。
例えば、本発明は、抗体及び/又はT細胞を産生させるに十分な上記新規なADAMTSファミリータンパク質又はその断片を哺乳動物に接種して、哺乳動物における免疫学的反応を誘起する方法による治療にも使用できる。
本発明はさらに、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質をインビボで発現させるための核酸ベクターを送達して、かかる免疫学的応答を誘導し、該動物を疾患から保護する抗体を生じさせることに使用できる。
さらに、本発明は、哺乳動物宿主中に導入された場合、上記新規なADAMTSファミリータンパク質に対する哺乳動物の免疫学的応答を誘導させる免疫学的ワクチン処方(組成物)に使用できる。該組成物は当該新規なADAMTSファミリータンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる。ワクチン処方は、さらに適当な担体を含んでいてもよい。当該ADAMTSファミリータンパク質は胃で分解される可能性があるので、好ましくは非経口投与する。非経口投与としては、例えば皮下筋肉内、静脈、皮内等への注射による投与が挙げられる。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、バッファー、制細菌剤及び処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでいてもよい水性又は非水性滅菌注射用溶液;並びに懸濁剤又は増粘剤を含んでいてもよい水性又は非水性滅菌懸濁液を包含する。処方を1回量又は複数回量として容器に入れて提供してもよく、例えば、密封アンプル及びバイアルに入れて提供してもよく、また使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として保存してもよい。またワクチン処方は、水中油系及び当該分野で知られた他の系のごとき処方の免疫原性を高めるためのアジュバント系を含んでいてもよい。用量は、個々のワクチンの活性に左右され、通常の実験により容易に決定できる。
本発明は、ADAMTSファミリータンパク質の関与する生体機能の解明、例えば、卵の成熟及び排卵・受精のプロセスの解明、癌化のプロセスの解明、血管新生のプロセス解明や血管新生に関連する疾患(血管新生病又は血管新生不全症等)の解明、予防、治療及び診断を可能とする上で非常に有用なものになると期待される。また、本発明は、血管新生が原因となる疾患(いわゆる血管新生病)、例えば固形悪性新生物、眼科的疾患(増殖性糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虹彩ルベオーシス、鎌状赤血球網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、老人性円板状黄斑変性症、その他虚血をきたす眼科疾患)、慢性関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、尋常性乾癬、粥状動脈硬化巣外膜の異常毛細血管網等、また逆に血管新生が不十分である血管新生不全症、例えば虚血性心疾患、下肢の閉塞性動脈硬化症での側副血行路形成不全や、創傷治癒過程での血管新生が不十分なことによる難治性皮膚潰瘍、難治性胃潰瘍、手術後の癒合不全等の治療方法を提供する。さらに、本発明遺伝子の発現が性周期と関連しており、排卵に伴う卵巣の細胞外マトリックスの分解及び再構築に関与することが示唆されたことから、該細胞外マトリックスの分解及び再構築に関連する疾患の解明、防止及び/又は診断・治療にも有用である。すなわち、排卵障害による不妊症の解明、防止及び/又は診断・治療に有用であり、また逆に避妊にも有用である。また、本発明遺伝子が第5染色体短腕15.2−15.3(5p15.2−15.3)に存在することを確認したこと、5p15.2−15.3は5P−症候群(Cri−du−chat syndrome)の欠失部位であることが報告されていることから、本発明遺伝子は5P−症候群の解明、防止及び/又は診断・治療にも有用である。
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその活性が過剰な場合、有効量の上記阻害剤化合物を医薬上許容される担体とともに対象に投与して、当該ADAMTSファミリータンパク質の活性を阻害し、そのことにより異常な症状を改善することもできる。
さらに、発現ブロック法を用いて内在性の上記ADAMTSファミリータンパク質をコードしている遺伝子の発現を阻害してもよい。細胞内で生成した、あるいは別個に投与されたアンチセンス配列を、かかる知られた方法に使用する(例えば、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression ,CRCPress,Boca Raton,FL(1988)中、O’Coccor,J.Neurochem(1991)56:560参照)。別法として、遺伝子とともに三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを用いてもよい(例えば、Lee et al., Nucleic Acids Res(1979)6:3073;Cooney et al., Science(1988)241:456;Dervan et al., Science(1991)251:1360参照)。これらのオリゴヌクレオチドはそれ自体投与することができ、あるいは関連オリゴマーをインビボで発現させることもできる。
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその活性の発現不足に関連する異常な症状の治療には、1つの方法として当該ADAMTSファミリータンパク質自体あるいはこのタンパク質をコードする遺伝子を活性化する治療上有効量の化合物(促進剤)を医薬上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙げられる。別法として、遺伝子治療を用いて、対象中の細胞による当該ADAMTSファミリータンパク質の細胞内での生成を有効ならしめてもよい。例えば、上記のごとく本発明に係るポリヌクレオチドを処理加工して複製欠損レトロウイルスベクターに入れて発現するようにしてもよい。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質をコードしているRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージング細胞中に導入して、今度はパッケージング細胞が目的遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生成するようにしてもよい。インビボでの細胞の処理加工及びインビボでのタンパク質の発現のために、これらのプロデューサー細胞を対象に投与してもよい。遺伝子治療の概説としては、Human Molecular Genetics,T. Strachan and A.P.Read,BIOS Scientific Publishers Ltd(1986)中、第20章、Gene Therapy and other Molecular Genetic−based Therapeutic Approaches(及びその中の引用文献)参照。もう1つの方法は、適当な医薬担体と混合して治療量の上記新規なADAMTSファミリータンパク質を投与することである。
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドあるいは化合物の処方及び投与形態は、適当な医薬担体と組み合わせて処方することが好ましい。かかる処方は、治療上有効量のタンパク質又は化合物、及び医薬上許容される担体又は賦形剤を含む。かかる担体としては、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。処方は投与経路に適したものとすべきであり、当業者によく知られている。さらに本発明は、上記本発明成分の1種又はそれ以上を充填した、1個又はそれ以上の容器を含んでなる医薬パック及びキットにも関する。
本発明に係るタンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド及び化合物は単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身投与の好ましい形態は、注射であり、とりわけ静脈注射である。皮下、筋肉内又は腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。全身投与の別の手段としては、胆汁酸塩又はフシジン酸又は他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜又は経皮投与が挙げられる。さらに、腸溶処方又はカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。これらのタンパク質又は化合物の投与は局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の形態であってもよい。
必要な用量範囲は、ペプチド、投与経路、処方の性質、対象の症状の性質、及び担当医師の判断による。しかしながら、適当な用量は対象の体重1kgあたり0.1ないし100μgの範囲である。しかしながら、種々の使用タンパク質及び化合物、種々の投与経路のさまざまな有効性を考慮すれば、必要な用量はさらに広範囲なものである。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用量が必要である。当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行なうことができる。
遺伝子治療において、治療に使用するタンパク質を対象中において生成させることもできる。例えば、タンパク質をコードしているDNA又はRNAを用いて、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いることによりエクスビボ(exvivo)において対象由来の細胞を処理加工し、次いで、細胞を対象に導入することもできる。
(診断薬及び診断方法)
また本発明からなる新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド及びその相補鎖、並びに当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用可能である。また、これらのうちの1種又はそれ以上を充填した、1個又はそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチド又はポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、又は抗体等それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
診断方法としては、例えば本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドをコードしている核酸との相互作用・反応性を利用して、相応する核酸の存在量、及び/又は当該タンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドについて個体中の生体内分布、及び/又は個体由来の試料中の存在、及び/又は個体由来の試料中の存在量を、自体公知の方法を利用して測定し、それらの存在の有無及び/又は存在量の変化(増加又は減少)により、本発明に係る当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドの発現又は活性に関連する疾患の有無及び/又はその変化(増悪又は軽減)を判定できる。すなわち、当該ADAMTSファミリータンパク質及び/又は核酸をマーカーとして検査するのである。その測定法は、自体公知の抗原抗体反応系、酵素反応系、又はPCR反応系等を利用すればよい。
診断用の核酸は、個体由来の試料、例えば細胞、血液、尿、唾液、組織生検又は剖検材料等から得られる。ゲノムDNAを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にPCR若しくはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。RNA又はcDNAを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失及び挿入を検出できる。増幅DNAを標識した上記ADAMTSファミリータンパク質をコードするDNAにハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。RNアーゼ消化により、又は融解温度の差により、完全に対合した配列を誤対合二重らせんから区別できる。DNA配列の相違はまた、変性物質を含有する又は含有しないゲル中のDNA断片の電気泳動における移動度の変化を検出することにより、又は直接的なDNA配列決定により検出できる(例えば、Meyers et al., Sciehce(1985)230:1242参照)。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばRNアーゼ及びS1保護又は化学的切断法によっても明らかにすることができる(例えば、Cotton et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA(1985)85:4397−4401参照)。また、上記ADAMTSファミリータンパク質をコードするDNA又はその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイ(array)を構築して、例えば遺伝学的変異の効果的なスクリーニングを行なうことができる。アレイ法はよく知られており、広い適用範囲を有し、遺伝子発現、遺伝学的連関、及び遺伝学的変異可能性を包含する分子遺伝学における種々の問題を調べるために用いられ得る(例えば、M.Chee et al., Science(1996)274:610参照)。
また、本明細書記載の方法によって上記ADAMTSファミリータンパク質をコードするDNAの変異・減少・増加を検出することにより、細胞・組織の癌化のレベルを診断する方法を提供する。また、本発明遺伝子が5p15.2−15.3に存在することを確認したこと、5p15.2−15.3は5P−症候群(Cri−du−chat syndrome)の欠失部位であることが報告されていることから、本発明に係るDNAの変異・減少・増加を検出することで、5P−症候群の診断方法も提供する。さらに、本発明に係るDNAの変異・減少・増加を検出することで、血管新生が原因となる疾患(いわゆる血管新生病)として固形悪性新生物、眼科的疾患(増殖性糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虹彩ルベオーシス、鎌状赤血球網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、老人性円板状黄斑変性症、その他虚血をきたす眼科疾患)、慢性関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、尋常性乾癬、粥状動脈硬化巣外膜の異常毛細血管網等、また、逆に血管新生が不十分である血管新生不全症として虚血性心疾患、下肢の閉塞性動脈硬化症での側副血行路形成不全や、創傷治癒過程での血管新生が不十分なことによる難治性皮膚潰瘍、難治性胃潰瘍、手術後の癒合不全等の診断方法又はかかる疾病に対する感受性の診断方法を提供する。
さらに、対象由来の試料について上記ADAMTSファミリータンパク質又は当該ADAMTSファミリータンパク質のmRNAレベルを調べることを特徴とする方法によって、細胞・組織の癌化のレベルを診断する方法を提供する。また、本発明遺伝子が5p15.2−15.3に存在することを確認したこと、5p15.2−15.3は5P−症候群(Cri−du−chat syndrome)の欠失部位であることが報告されていることから、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質のmRNAレベルを検出することで、5P−症候群の診断方法を提供する。さらに本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質のmRNAレベルを検出することで、血管新生が原因となる疾患(いわゆる血管新生病)として固形悪性新生物、眼科的疾患(増殖性糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虹彩ルベオーシス、鎌状赤血球網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、老人性円板状黄斑変性症、その他虚血をきたす眼科疾患)、慢性関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、尋常性乾癬、粥状動脈硬化巣外膜の異常毛細血管網等、また、逆に血管新生が不十分である血管新生不全症として虚血性心疾患、下肢の閉塞性動脈硬化症での側副血行路形成不全や、創傷治癒過程での血管新生が不十分なことによる難治性皮膚潰瘍、難治性胃潰瘍、手術後の癒合不全等を診断することができる。また、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質のmRNAのレベルを検出することで、細胞・組織の癌化のレベルを診断する方法を提供する。
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質をコードするDNAの発現の増加又は低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野では周知方法の任意の方法、例えば増幅、PCR、RTPCR、RNアーゼ保護、ノーザンブロッティング及びその他のハイブリダイゼーション法を用いてRNAレベルで測定できる。また、試料中の当該ADAMTSファミリータンパク質レベルを決定するために用いることができるアッセイ法は当業者に周知である。このようなアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析及びELISAアッセイ等がある。
本発明に係るポリヌクレオチドの染色体の同定(染色体アッセイ)にも価値がある。該ポリヌクレオチドの配列は、個々のヒト・染色体上の特定の位置を標的とし、これにハイブリダイゼーションし得る。本発明による重要な配列の染色体へのマッピングは、それらの配列を遺伝子関連疾病と関連づける重要な第1工程である。配列を正確な染色体位置にマッピングしたならば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデータと関連づけることができる。かかるデータは、例えば、V.McKusick,Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで利用できる)に見いだされる。次いで、連関(物理的に近接した遺伝子の同時遺伝)の分析により、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との関係を同定する。罹病個体と未罹病個体との間のcDNA又はゲノム配列の相違も調べることができる。罹病個体のいくつか又は全部において変異が観察されるが正常個体においては観察されない場合、その変異は疾病の原因である可能性がある。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
実施例1
(ヒト脳由来cDNAライブラリーの構築と遺伝子の分取)
市販ヒト脳、胎児脳、及び脳海馬由来のpolyA+RNA(クロンテック社製:カタログNo.6516−1、6525−1、及び6578−1)を出発原料として常法によりcDNAライブラリーを構築し、dbEST(database of Expressed Sequence Tags)分析によりcDNA断片を単離して塩基配列を決定し、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質をコードする塩基配列を担持するDNAを得た。
具体的には、小原らの方法(DNA Research(1997)4:53)に従って調製した上記ヒト脳由来のcDNAライブラリーから、約50,000個の組換え体をランダムに選択し、このうち約30,000個のクローンのcDNAについて、その5′末端及び3′末端の塩基配列を決定した。さらに約1,100個を主にインビトロの転写翻訳実験によって選択し、それらのcDNAの塩基配列を小原らの方法(同上)に従って決定した。全塩基配列の決定を行ったcDNAクローンについて、コンピュータプログラムを用いた汎用解析方法によってタンパク質コード領域(ORF)を予想し、この領域についてPfam HMM Search(HMMPFAM)によりドメイン検索を行い、TSP1ドメイン(TSP1)を有するcDNAを同定した。
この様にして本発明者は、TSP1を担持する配列表の配列番号1に記載した推定アミノ酸配列(全アミノ酸数1021個)からなる新規なADAMTSファミリータンパク質をコードするcDNA(配列表の配列番号2)を有するクローンPJ01256(ヒト脳由来cDNAクローンPJ01256)を得た。なお、配列は、UPAC−IUB Commision on Biochemical Nomenclatureによる略号或いは当該技術分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体が有り得る場合は、特に明示しない限りL体を示すものとする。
実施例2
(ヒトPJ01256全長cDNA取得)
ヒトPJ01256の全長アミノ酸コード領域を有するcDNA(以下、ヒトPJ01256全長cDNA)は、配列番号2に記載したヒト脳由来cDNAクローンPJ01256の塩基配列から特異的に作製したプライマーあるいはプローブを用いて、5′RACE(Rapid amplification of cDNA end)法あるいはライブラリスクリーニング法等を行なうことで取得できる。ここでは、5′RACE法によるヒトPJ01256全長cDNAの取得を記述する。
(1)まず、ヒト脳由来cDNAクローンPJ01256特異的に合成したmRNAに対しアンチセンス方向の2本のプライマー(例えば以下のPJ−A01・PJ−A03等)と、鋳型cDNAに連結させたアダプター配列特異的な2本のプライマー(例えば以下のAP1・AP2等)を組み合わせて用い、一般的に行われているように2回のPCRを行なう。
鋳型cDNAには、例えば市販の「Marathon−ReadyTM cDNA Human Ovary;既知配列のアダプターが連結されたヒト卵巣由来二本鎖cDNA、Clontech社製」等を用いることが可能である。あるいはmRNAから、二本鎖cDNAを合成し、任意の配列からなるアダプターを連結したものも、鋳型cDNAとして使用できる。
5′RACE法で用いる耐熱性酵素は、例えば「KOD PLUS、東洋紡製」等を利用できる。「KOD PLUS」及び「Marathon−ReadyTM cDNA Human Ovary」を用いた場合の第一次及び第二次PCRの条件を以下に記述する。
5′RACE産物は、例えば「Zero BluntTM TOPOTM PCRCloning Kit、Invitrogen社製」等を用いて、プラスミドベクター(「Zero BluntTM TOPOTM PCR Cloning Kit」の場合にはpCRTM−BluntII−TOPO)に連結し、大腸菌コンピテントセルに形質導入することで、5′RACE産物を含むプラスミドベクターを有する大腸菌形質転換体としてクローン化できる。5′RACE産物を分子量で分画する場合には、アガロース電気泳動後、DNAのバンドをゲルから切り出し、例えば「QIA Quick Gel Extraction Kit、QIAGEN社製」等を用いて回収することで分画し、上記の方法で同様にクローン化できる。
クローン化した5′RACE産物は、使用したプラスミドベクターに適応した抗生物質(pCRTM−BluntII−TOPOの場合には、「硫酸カナマイシン、ナカライテスク社製等」)を含む大腸菌生育培地(例えばTerrific Broth等)で大腸菌形質転換体を培養し、プラスミドを、例えば「QIAprepTM Spin Miniprep Kit、QIAGEN社製」等で抽出することで得られる。
5′RACE産物の塩基配列データは、鋳型として抽出したプラスミド、使用したプラスミドベクターに適応したプライマー(pCRTM−BluntII−TOPOの場合には、SP6プライマー、T7プライマー等)、必要に応じてPJ01256特異的プライマー(PJ−A01等)を用い、「BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit、PE Biosystems社製」等にて調製したサンプルを、電気泳動式塩基配列解析装置(サンプル調製に「BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit」を用いた場合には「ABI PRISMTM 310 ジェネティックアナライザ、PE Biosystems社製」等)で解析することにより得られる。得られた塩基配列データを、シーケンスアセンブリングソフト(例えば「Sequencher3.1、Gene Codes社製」)等を用いて連結することで、クローンごとの塩基配列が得られる。
ヒトPJ01256全長cDNAの塩基配列は、上記5′RACE産物のクローンごとの塩基配列と実施例1に記載したヒト脳由来cDNAクローンPJ01256の塩基配列(配列番号2)を、互いのオーバーラップを5′RACEに使用したプライマー以外の部分で確認した後、連結することで得られる。
(2)ヒトPJ01256全アミノ酸コード領域の塩基配列を明らかにするため、ヒト脳由来cDNAクローンPJ01256塩基配列(配列番号2)特異的に合成した上記プライマー(AP1、AP2、PJ−A01、及びPJ−A03)を用いて5′RACE法を行なった。
5′RACEの鋳型cDNAには、市販の「Marathon−ReadyTM cDNA Human Ovary;既知配列のアダプターが連結されたヒト卵巣由来二本鎖cDNA、クロンテック社製、Code No.7417−1」を用いた。PCR用耐熱性酵素には「KOD PLUS、東洋紡製」を用い、以下の条件で第一次PCRを行なった。
第一次PCR反応液組成は、上記のものと同一である。
第一次PCR反応終了後、脱塩及び脱プライマーするため、反応液を「Suprec−02、宝酒造製」を用いて精製した。精製したPCR産物は100μl(50μl×2回)のTE緩衝液で回収し、以下の第二次PCRの鋳型として用いた。
第二次PCR反応液組成は、上記のものと同一である。
5′RACE産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結し、大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。得られた5′RACE産物の塩基配列から、上記と同様に、特異的プライマーを作製して5′RACE法を繰り返すことにより、ヒトPJ01256全長cDNA塩基配列(配列番号3)を得た。
ヒトPJ01256全長cDNA塩基配列(配列番号3)は、総塩基数がポリA(polyA)配列を除いて5,610であり、3,672塩基からなるアミノ酸コード領域(配列番号3の770−4,441番目)を有していた。該領域にコードされるアミノ酸配列を配列番号4に示す。また、5′非翻訳領域上にアミノ酸コード領域と同一フレーム上の終止コドンが2箇所(配列番号3の206−208番目;TAG、275−277番目;TGA)、3′非翻訳領域上にポリA付加シグナルが1箇所(配列番号3の5,586−5,591番目;AATAAA)存在した。
Marathon−ReadyTM cDNA Human Ovaryを鋳型として、アミノ酸コード領域を再度クローニングしたところ、2つの対立遺伝子がそれぞれ得られ、両者の比較で3箇所のSNPsが確認された(表1のSNPs 1〜3)。そのうち2つのSNPsはアミノ酸置換を伴っていた(表1のSNPs 2及び3)。また、ヒト脳由来PJ01256cDNAクローン(配列番号2)との比較では2箇所のSNPsが確認され(表1のSNPs 4及び5)、うち1つのSNPsはアミノ酸置換を伴っていた(表1のSNPs 4)。
実施例3
(ヒトPJ01256遺伝子発現ベクター作製)
ヒトPJ01256のC末端にMycHisタグ配列が融合されたものを発現する哺乳動物細胞用発現ベクターの作製は、以下のような操作で行なうことができる。
まず、ヒトPJ01256の終始コドンを除く全アミノ酸コード領域の両端にアニーリングするPCRプライマーペアを設計する。上流側プライマーには、ヒトPJ01256cDNAの開始コドン(ATG)の5′上流側に発現用ベクター(例えば、Invitrogen社製pcDNA3.1(−)/MycHisA)のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素部位(例えば、NheIあるいはNotI等)を付加して設計し、下流側プライマーにはヒトPJ01256cDNAがコードするC末端アミノ酸(ロイシン)コドンの下流に、同じく発現ベクターのマルチクローニングサイトに存在する制限酵素部位(例えばHindIIIあるいはKpnI等)を付加して設計する。なお、選択する制限酵素は可能なかぎりヒトPJ01256cDNAの全アミノ酸コード領域に認識部位が存在しない制限酵素を用いる。また制限酵素を用いたDNA断片の挿入により生じるアミノ酸フレームのずれを考慮してプライマーを設計する。例えばpcDNA3.1(−)/MycHisAの場合には、下流側に設定する制限酵素は、発現ベクターと連結した際にMycHis領域とフレームが合うよう塩基の数を調整して設計する。以上のように設計したプライマーを用い、ヒトPJ01256cDNA断片を含むプラスミドを鋳型として、耐熱性DNAポリメラーゼKOD PLUS(東洋紡)等でPCR反応を行ない、発現ベクターに挿入可能な制限酵素部位を有する全長cDNA断片を取得できる。
適当な哺乳動物細胞発現用ベクター(例えば、pcDNA3.1(−)/MycHisA、Invitrogen社製)及び増幅した全長ヒトPJ01256cDNAを、プライマーに付加した制限酵素で消化した後、アガロースゲル電気泳動し、それぞれ目的のDNA断片を、例えばQIA Quick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)等を用いてアガロースゲル中から回収する。ゲル中から回収した全長ヒトPJ01256cDNA及びpcDNA3.1(−)/MycHisA断片は、例えばReady−To−Go T4 DNA ligase(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)を用いて連結できる。連結したプラスミドを大腸菌コンピテントセル(例えば、DH5αコンピテント細胞、東洋紡製)に導入し、形質転換体を得る。得られた大腸菌形質転換体は、用いた発現ベクターの選択マーカー(例えばアンピシリン等)を含むTerrific Broth培地等で培養し、当該DNAを含むプラスミドをQIAprepTM Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製)等の市販のDNA抽出キットで精製できる。
作製したプラスミドのDNA塩基配列は以下のようにして確認できる。発現ベクター由来の配列から設計したプライマー(例えば、pcDNA3.1(−)/MycHisAを用いた場合には、pcDNA−S1:CACTGCTTACTGGCTTATCG及びpcDNA−A1:ACTAGAAGGCACAGTCGAGG等のプライマー)と、ヒトPJ01256cDNA配列上で約300bp程度ごとに適当なプライマーを設計し、例えば、「BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit」(PE Biosystems社製)等の塩基配列決定用サンプル調製試薬を用いて、抽出したプラスミドの塩基配列決定用サンプルを調製する。サンプル調製に「BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit」を用いた場合には、キャピラリー電気泳動式塩基配列解析装置ABI PRISMTM 310ジェネティックアナライザ(PE Biosystems社製)等で解析する。得られた塩基配列データは、例えばSequencher3.1(Gene Codes社製)等のシーケンスアセンブリングソフトを用いて1本に連結し、作製したプラスミドのDNA塩基配列を得る。
このようにして得られたプラスミドのDNA塩基配列から目的の塩基配列を有するプラスミドを選択して、ヒトPJ01256発現ベクターを作製できる。
実施例4
(ヒトPJ01256遺伝子発現ベクター作製)
ヒト全長PJ01256のC末端にHisタグ配列を融合発現する哺乳動物細胞用発現ベクターを作製するため、以下のプライマーを合成した(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社に発注)。
なお、BHPJ−S01は、制限酵素消化のためのスペーサー(4塩基;GAAA)、制限酵素BamHIの認識配列(6塩基;GGATCC)、ヒトPJ01256cDNAへのアニーリング配列(20塩基;CGGAGCGCTCCTGGATGAAG:配列番号3の756−775番目に完全一致)から成る。また、HDPJ−A01は、制限酵素消化のためのスペーサー(4塩基;GAAA)、制限酵素HindIIIの認識配列6塩基AAGCTT)、ヒトPJ01256cDNAへのアニーリング配列(20塩基;CAAGTTGGACTTAGAGCAAG:配列番号3の4,422−4,441番目の相補鎖に完全一致)から成る。
BHPJ−S01及びHDPJ−A01をプライマーとして用い、PCR法によってヒトPJ01256全アミノ酸コード領域の増幅を試みた。鋳型cDNAは、市販の「Marathon −ReadyTM cDNA Human Ovary;既知配列のアダプターが連結されたヒト卵巣由来二本鎖cDNA、Clontech社製、CodeNo.7417−1」を用いた。PCR用耐熱性酵素には「KOD PLUS、東洋紡製」を用い、以下の条件でPCRを行なった。
得られた約3.7KbpのPCR産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結して大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し、塩基配列を決定した。その結果、約3.7KbpのPCR産物は目的のPCR産物(スペーサー−BamHI認識配列−配列番号3の756〜4,441−HindIII認識配列−スペーサー)であった。
哺乳動物細胞発現用ベクターはpCMH01(図1のA;市販の「pcDNA3.1(−)/MycHisA、Invitrogen社製」のBGHポリA配列をチミジンキナーゼ(TK)ポリA配列に置換したもの)を用いた。すなわち、pcDNA3.1(−)/MycHisAの、BGHポリA配列(http://www.invitrogen.Com/vecseq gcg/pcdna3.1mychisa−.seqに提示されている塩基配列の1,116〜1,343番目)は、その両側に認識サイトを有する制限酵素AflII(認識サイト;CTTAAG、同配列の1,090〜1,095番目)及びPvuII(認識サイト;CAGCTG;同配列の1,363〜1,368番目)で消化することで除いた。TKポリA配列は「pREP10、Invitrogen社製」を鋳型として、プライマーペア(GAAACTTAAGGGGAGATGGGGGAGGCTAAC及びGGCCCACCAGACCCCACGCAAC)でPCR法により増幅したものをAflIIで消化することで調製した。BGHポリA配列を除いたpcDNA3.1(−)/MycHisA及びTKポリA配列は、常法に従い連結した後、大腸菌形質転換体としてクローン化し、プラスミドを抽出して塩基配列を確認した。
得られたヒトPJ01256cDNAクローン及び哺乳動物細胞発現用ベクターpCMH01は、BamHI及びHindIIIで消化し、常法に従い連結した。作製したプラスミドpCMH01−PJ01256は大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出して塩基配列を決定し、ヒトPJ01256cDNA下流にMycHisタグ配列が同一フレームで連結されたことを確認した(図1のB)。
実施例5
(ヒトPJ01256の哺乳動物細胞での発現)
ヒトPJ01256の哺乳動物細胞での発現を確認するため、実施例4で作製した哺乳動物細胞用発現ベクターpCMH01−PJ01256を用いて、以下の検討を行った。
φ10cm組織培養用ディッシュ「Falcon 3001、ベクトン・ディッキンソン社製」上に約50%コンフレント(confluent)に付着生育させたCOS7細胞に対し、1ディッシュあたり10μgのpCMH01−PJ01256を遺伝子導入した。対照としては1ディッシュあたり10μgのpCMH01を用いた。遺伝子導入は市販の「LipofectAMINE PLUS、Lifetechnologies社製」を用い、添付プロトコルに従って行った。
遺伝子導入48時間後、細胞を回収し、100μlの細胞溶解液(20mM Tris−HCl pH7.4、10% グリセロール、1% Triton X−100、0.1% SDS)で溶解させた。100μlのSDS電気泳動用緩衝液(100mM Tris−HCl pH6.8、20% グリセロール、12% 2−メルカプトエタノール、4% SDS、ブロモフェノールブルーで着色)を加えた後、100℃で2分間加熱したものをサンプルとして、ウェスタンブロッティング解析を行った。各サンプル0.2mlのうち30μlをSDS−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。SDS−ポリアクリルアミド電気泳動は、市販の「マルチゲル4/20、第一化学薬品社製」を「カセット電気泳動槽「第一」DPE−120」にセットし、40mA定電流で1時間行った。泳動用緩衝液は、「Tris−Glycine−SDS・Powder、宝酒造製」を用い、分子量マーカーは、「6×His Protein Ladder、QIAGEN社製」を用いた。泳動終了後、「ミニトランスブロット、BIO−RAD社製」を用いて、エレクトロトランスファー(Electro Transfer)によりPVDFメンブレン「TEFCO社製、Code.No.03−056」にブロッティングした。エレクトロトランスファーは、「Tris−Glycine Powder、宝酒造製」にメタノールを20%添加した緩衝液中で、150mA定電流で1.5時間行った。ブロッティングしたPVDFメンブレンは、「Penta His Antibody HRP Conjugate、QIAGEN社製」を用い、添付されていたプロトコルに従って抗体反応を行った。抗体にラベルされたホースラディシュ・パーオキシダーゼ(Horseradish peroxidase)の検出には「ECL Plus、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製」を用い、添付されていた標準プロトコルに従って行った。結果を図2に示した。
図2に示したように、pCMH01−PJ01256を導入したCOS7細胞では分子量100kDa以上のタンパク質のシグナル(図2の矢印)が確認された。対照としたpCMH01では該当するシグナルは検出されなかった。以上の検討より、ヒトPJ01256タンパク質の発現が哺乳動物細胞系で確認された。
実施例6
(ヒトPJ01256の発現組織解析)
(1)ヒトPJ01256遺伝子の発現組織を解析するため、下記のPCRプライマーを合成した。下記プライマーの組み合わせを用いてPCRにより、505bpのヒトPJ01256cDNA断片が増幅された。
次に24種のヒト臓器のmRNAに由来するcDNAを4種の濃度で96ウェルプレート中に調製した「ヒトRAPID−SCANTM GENE EXPRESSION PANEL」(OriGene Technologies,Inc.)を鋳型として、下記の酵素溶液(25μl/ウエル)を添加し、ミネラルオイルを適量(約25μL)重層した。
ミネラルオイルを重層後、プレートをプラスティックカバーシートで被い、15分間静置後、サーマルサイクラー(PCR Thermal Cycler MP:宝酒造)にセットし、以下のPCR運転プログラムで反応させた。
PCR反応終了後、PCR産物5μLを1μLの10×泳動用緩衝液(宝酒造の制限酵素に添付)と混合し、Mupid電気泳動槽(コスモバイオ)にセットした2%アガロースゲル(SeaKem GTG agarose:FMC BioProducts)に供し、トリス−ホウ酸緩衝液(宝酒造製)下、100Vの定電圧で約45分間泳動した。泳動後、500ng/mLの臭化エチジウム溶液で染色し、紫外線照射下で泳動像を観察した。その結果を図3に示す。
図3に示した結果から、ヒトPJ01256遺伝子は、特に卵巣で発現が高く、ついで腎臓、肺、胃、精巣、副腎、膵臓で、発現量が高かった。脳、小腸、骨格筋、皮膚で中程度に発現しており、心臓、大腸、胎盤、前立腺では弱い発現が観察された。脾臓、肝臓、唾液腺、甲状腺、子宮、白血球、骨髄では、ほとんど発現が観察されなかった。また、胎児組織については、脳で中程度に発現しており、肝臓では弱い発現が観察された。
(2)さらに、ノーザンハイブリダイゼーションにより、ヒトPJ01256遺伝子の発現組織分布及びmRNAの解析を行った。プローブは、ヒトPJ01256cDNAのKpnI/StuI消化断片(663bp)をアガロースゲル電気泳動法により分離・精製したものを用いた。プローブDNAのラベリングは、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製の「DNA Labelling Beads(−dCTP)、Cat.No.27−9240−01」と、「32P−dCTP、Cat.No.PB10205」を用いて行った。DNAに取り込まれなかった32P−dCTPの除去は、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製の「Probe QuantTM G−50 Micro Columns、Cat.No.27−5335−01」により行った。各種組織由来mRNAをブロットしたフィルターは、クロンテック社より購入したHuman MTN Blot(Cat.No.7760−1)、Human MTN BlotII(Cat.No.7759−1)、Human MTN BlotIII(Cat.No.7767−1)を用い、ハイブリダイゼーションの条件はクロンテック社のプロトコールに従って行った(図4)。
図4のA.に示した結果から、ヒトPJ01256遺伝子は卵巣において特異的に発現しており、次いで腎臓及び膵臓で弱く発現していることが示された。またmRNAの大きさは約5.5Kbで、全長cDNAの大きさと一致しており、明瞭なスプライシングバリアントは検出されなかった。また、5′末端側のDNA断片(SacII/SalI断片、746bp)をプローブとして用いた場合も上記と同様の結果が得られた。さらに長期間の露光により得られた結果(図4のB.)から、脳、肝臓、精巣、小腸、胃、副腎の各組織においてもわずかに発現していることが示された。また、図4のC.には、ノーザン解析の内部コントロールであるアクチン遺伝子のブロットの結果を示した。
実施例7
(ヒトPJ01256遺伝子のがん組織における発現解析)
PJ01256遺伝子と病態との関与を解析することを目的として、ヒトの腫瘍組織における発現量と正常組織における発現量とを比較検討した。PCR増幅用のプライマーとしては、実施例6で用いたPJ−S09(センスプライマー)及びPJ−A12(アンチセンスプライマー)を使用した。このプライマーセットによりPCRで505bpのヒトPJ01256cDNA断片が増幅された。コントロール遺伝子としてはグリセルアルデヒド 3−リン酸脱水素酵素(Glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase)(G3PDH)を用い、PCR増幅用のプライマーとしては、市販のプライマーセット(クロンテック社製,Code.No.5405−1)を用いた。このプライマーセットによりPCRで452bpのG3PDH cDNA断片が増幅された。
ヒト腫瘍組織及び正常組織(卵巣、脳、及び副腎)由来cDNAは、BioChain Institute(Hayward,CA,USA)より購入した、「Human Adult Tumor Ovary cDNA(Adenocarcinoma)、Code.No.0540016、Lot.No.A301017」及び「Human Adult Normal Ovary cDNA、Code.No.0510037、Lot.No.A303212」、「Human Brain Tumor cDNA(Meningioma)、Code.No.0540004、Lot.No.A304007」及び「Human Adult Normal Brain cDNA、Code.No.0510005、Lot.No.A301089」、「Human Adult Tumor Adrenal cDNA(Adenocarcinoma)、Code.No.0540001、Lot.No.A212030」及び「Human Adult Normal Adrenal cDNA、Code.No.0510001、Lot.No.A206095」を用いた。それぞれのcDNA原液をTE溶液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA,pH8.0)で10倍希釈した後に、さらに1/2倍希釈操作を順次7回繰り返して、濃度が1倍、1/2倍、(1/2)2倍、(1/2)3倍、(1/2)4倍、(1/2)5倍、(1/2)6倍、(1/2)7倍の希釈系列を作製し、各溶液5μlを鋳型cDNAとした。PCR反応は、宝酒造の「TaKaRa Ex TaqTM、CodeNo.RR001A」を用いて下記の条件で行った。
PCRチューブに各cDNA溶液を分注し、上記の酵素/プライマー溶液を添加後、サーマルサイクラー(PCR Thermal Cycler MP:宝酒造製)にセットし、以下のPCR運転プログラムで反応させた。
PCR反応終了後、PCR産物10μLを1μLの10×泳動用緩衝液(宝酒造の制限酵素に添付)と混合し、Mupid電気泳動槽(コスモバイオ:東京)にセットした2%アガロースゲル(SeaKem GTG agarose:FMC BioProducts, Rockland,ME,USA)に供し、トリス−ホウ酸緩衝液(宝酒造製)下、100Vの定電圧で約45分間泳動した。泳動後、アガロースゲルを500ng/mLの臭化エチジウム溶液で染色し、紫外線照射下で泳動像を観察してPJ01256遺伝子及びG3PDH遺伝子の発現量をPCR産物の濃度として可視的に判定した。その結果を図5(卵巣)、図6(脳)及び図7(副腎)に示す。
その結果、図5、6、及び7に示したように、いずれの組織においてもG3PDH遺伝子の発現量は、正常組織と腫瘍組織においてほぼ同じ発現量であるのに対し、腫瘍組織ではPJ01256遺伝子の発現量が著しく低下(約1/32〜1/64)していることが示された。この結果から、ヒトPJ01256遺伝子が卵巣、脳、副腎における腫瘍に関連する遺伝子であることが示唆された。
実施例8
(PJ01256マウスカウンターパートの取得)
PJ01256のマウスカウンターパートを取得するため、ヒトPJ01256cDNAのアミノ酸コード領域をクエリーとして公共データベースを検索したところ、2つのマウスゲノムDNA配列〔genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)のID AZ093080及びAZ119800〕がヒットした。AZ093080の塩基配列の146〜242番目及びAZ119800の塩基配列の418〜478番目が、それぞれヒトPJ01256全長cDNA配列(配列番号3)の2,373〜2,470番目及び2,621〜2,680番目に高い相同性を示した。両マウス配列の相同性の高かった部分から下記のプライマーを作製し、以下の検討に使用した。
マウスcDNA断片取得のため、市販の「Marathon−ReadyTM cDNA Mouse Testis;既知配列のアダプターが連結されたマウス精巣由来二本鎖cDNA、クロンテック社製、CodeNo.7455−1」を鋳型として、以下の条件でPCRを行なった。PCR用耐熱性酵素には「KOD Dash、東洋紡製」を用いた。
その結果、約230bpのPCR産物が得られた。PCR産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結し、大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。
塩基配列決定の結果、得られたPCR産物は233bpであり、ヒトPJ01256全長cDNA配列(配列番号3)の2,409〜2,641番目に対してDNAレベルで83.7%(195/233)、同部分の推定アミノ酸配列で93.5%(72/77)の相同性を有していた。
引き続き同一鋳型cDNAを用いて5′RACE法を行った。PCR用耐熱性酵素には「KOD PLUS、東洋紡製」を用い、以下の条件で第一次PCRを行なった。
第一次PCR反応終了後、脱塩及び脱プライマーするため、反応液を「Suprec−02、宝酒造製」を用いて精製した。精製したPCR産物は100μl(50μl×2回)のTE緩衝液で回収し、以下の第二次PCRの鋳型として用いた。
5′RACE増幅産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結し、大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。
5′RACE産物の塩基配列は、先のマウスPJ01256部分cDNA塩基配列とのオーバーラップを確認した後、連結した。その結果、得られたマウスPJ01256部分cDNA塩基配列(配列番号5)は422bpであり、ヒトPJ01256全長cDNA配列(配列番号3)の2,220〜2,641番目に対してDNAレベルで85.3%(360/422)の相同性を有していた。また、マウスPJ01256部分cDNA推定アミノ酸配列(配列番号6)は140残基であり、ヒトPJ01256全長cDNA推定アミノ酸配列(配列番号4)の485〜624番目に95.0%(133/140)の相同性を有していた(図8)。
実施例9
(ヒトPJ01256のホモロジー検索)
ヒト脳由来PJ01256cDNAクローンのアミノ酸配列(配列番号1)を既知配列に対して解析プログラム(BLAST2.0)(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),”Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res.25:3389−3402.)を用いて検索したところ、表2(ヒトPJ01256のアミノ酸配列を既知配列に対して解析プログラムBLAST2.0を用いて検索した結果で、E−valueがe−40以下のもの)に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。さらに、ヒトPJ01256全長アミノ酸配列(配列番号4)を既知配列に対して解析プログラム(BLAST2.1)(同上)を用いて検索したところ、表3(ヒトPJ01256の全長アミノ酸配列を既知配列に対して解析プログラムBLAST2.1を用いて検索した結果で、E−valueがe−140以下のもの)に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。ヒトPJ01256はADAMTSファミリーと相同性を有するクローンであることが判明した。
実施例10
(ヒトPJ01256の解析)
ヒトPJ01256全長アミノ酸配列(配列番号4)をクエリーとし、検索ツールPfam HMM Search(HMMPFAM)(Sonnhammer EL,Eddy SR,Birney E,Bateman A,Durbin Pfam:multiple sequence alignments and HMM−profiles of protein domains. Nucleic Acids Res.(1998)Jan1;26(1):320−322)を用いて検索した。HMMPFAMのアルゴリズムにはHMMER2.1(http://hmmer.wustl.edu/)を、データベースにはPFAM6.0(http://pfam.wustl.edu/)を用いた。その結果、ヒトPJ01256はTSP1ドメイン(tsp 1)、及びレプロリシン型亜鉛メタロプロテアーゼドメイン及びレプロリシンファミリーペプチド(Pep M12Bpropep)を有することが判明した(表4)。
実施例11
(マウスPJ01256カウンターパートのホモロジー検索)
マウスPJ01256のアミノ酸配列を既知配列に対して解析プログラム(BLAST2.1)(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),”Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of protein database search programs”,Nucleic Acids Res. 25:3389−3402.)(ftp://ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nr 2001年2月23日更新分)を用いて検索したところ、表5に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。マウスPJ01256はADAMTSファミリーと相同性を有するクローンであることが判明した。
実施例12
(マウスPJ01256カウンターパートの解析)
マウスPJ01256のアミノ酸配列をクエリーとし、HMMPFAM(HMMER2.1、PFAM6.0)(http://hmmer.wustl.edu/)(http://pfam.wustl.edu/を用いて実施例10と同様に検索した。その結果、マウスPJ01256はTSP1ドメイン(tsp 1)を有することが判明した(表6)。
実施例13
(ヒト及びマウスPJ01256とADAMTSファミリーのアライメント)
Clustalw1.81(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.and Gibson,T.J.(1994)CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressivemultiple sequence Alignment through sequence weighting,positions−specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research,22:4673−4680.)を用いてヒト及びマウスPJ01256と既知のADAMTSファミリーとのアミノ酸配列のアライメントを行なった(表7〜表31)。表7〜表31は、ヒト及びマウスPJ01256と既知のADAMTSファミリー遺伝子のアミノ酸配列を、N末端側からC末端側までアライメントした一連の表である。表中、「*」はその位置で全ての配列で完全に保存されていることを意味する。また、「:」はその位置で、{STA}、{NEQK}、{NHQK}、{NDBQ}、{QHRK}、{MILV}、{MILF}、{HY}、{FYW}のようなグループのうちのいずれかが保存されている事を意味する。さらに、「.」はその位置で{CSA}、{ATV}、{SAG}、{STNK}、{STPA}、{SGND}、{SNDEQK}{NDEQHK}、{NEQHRK}のようなグループのうちのいずれかが保存されている事を意味する。ADAMTSファミリーは、TSP1ドメイン、zinc metalloproteaseドメイン及びCystein−richregion(disintegrin−like)からなることが知られており(M.D.Tortorella,et al., Science(1999)284:1664−1666;F.Vazquez et al, J.Biol.Chem.(1999)274:23349−23357)、アライメントの結果から、303から376番目のアミノ酸(太字、#で印をつけた部分)はディスインテグリン様領域(disintegrin−like region)であることが判明した。この結果得られたドメインと実施例10又は実施例12にて同定したドメインを、ヒトPJ01256については表32に、マウスPJ01256については表33にまとめた。
実施例14
(解析プログラムによる解析)
実施例10及び実施例13でヒトPJ01256について同定したドメインのアミノ酸配列(表34:検索したドメインとクエリーに用いた配列)を既知配列に対して解析プログラム(BLAST2.1)を用いて検索したところ、表35(検索したクエリーに対してヒットした既知配列:最も相同性の高いもの)に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。また、実施例12及び実施例13でマウスPJ01256について同定したドメインのアミノ酸配列(表36)について同様に検索を行ったところ、表37に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。
実施例15
(PJ01256マウスカウンターパートの取得)
実施例8で得たPJ01256マウスカウンターパートは部分cDNAであったため、引き続きPJ01256のマウスカウンターパート取得を試みた。その際、後述する実施例17に示したようにマウスPJ01256の発現量が高かった発情期マウス卵巣より「TRIZOL登録商標 Regent Invitrogen社製」を用いて抽出したRNAを鋳型としてRT−PCRを行なった。
RT反応は、「TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)Ver1.1;宝酒造製」を用い下記の条件で行なった。
PCR反応は、ヒトPJ01256特異的プライマーPJ−S02(下記参照)と前述のマウスPJ01256特異的プライマーmPJ−A03を用い、「KOD Dash、東洋紡製」にて下記の条件で行なった。
その結果、約550bpのPCR産物が得られた。PCR産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結し、大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。
塩基配列決定の結果、得られたPCR産物はヒト特異的プライマーであるPJ−S02の20bpを除いて525bpであった。マウスPJ01256部分cDNA塩基配列(配列番号7)は、ヒトPJ01256全長cDNA配列(配列番号3)の2,117−2,641番目に対してDNAレベルで84.7%(445/525)一致していた。また、コードされる推定アミノ酸配列(配列番号8)は175残基であり、ヒトPJ01256全長cDNA推定アミノ酸配列(配列番号4)の450−624番目に94.8%(166/175)一致していた(図9)。
実施例16
(マウスPJ01256遺伝子の発現組織解析)
(1)マウスPJ01256遺伝子の発現組織を解析するため、下記のPCRプライマーを合成した。下記プライマーの組み合わせで、412bpのマウスPJ01256cDNA断片が増幅される。
24種のマウス臓器由来mRNAよりcDNAを調製した「マウスRAPID−SCANTM GENE EXPRESSION PANEL、OriGene Technologies社製」を鋳型として、下記の条件でPCRを行なった。
PCR産物を電気泳動し、臭化エチジウムで染色した後、紫外光照射下で画像を取り込み、各バンド濃度を比較した(図10)。
図10に示した結果から、マウスPJ01256遺伝子は、腎臓、精巣、卵巣、子宮で発現が高く、脳、脾臓、胃、皮膚で弱い発現が観察された。脳では、サイズの異なるバンドが観察され、スプライシングバリアントの存在が示唆される。また、9.5日、12.5日、19日の胎児で発現が観察され、発生にしたがって発現量が増加していた。このことより、PJ01256は発生に関与していることが示唆された。
(2)さらに、ノーザンハイブリダイゼーションにより、マウスPJ01256遺伝子のmRNA解析を行った。プローブは、アガロースゲル電気泳動法により分離・精製したマウスPJ01256cDNAの部分断片(422bp、配列番号5)を用いた。プローブDNAのラベリングは、アマシャム ファルマシア バイオテク社の「DNA Labelling Beads(−dCTP)、Cat.No.27−9240−01」と、「32P−dCTP、Cat.No.PB10205」を用いて行った。DNAに取り込まれなかった32P−dCTPの除去は、アマシャム ファルマシア バイオテク社の「Probe QuantTM G−50 Micro Columns、Cat.No.27−5335−01」により行った。マウス胎児由来mRNAをブロットしたフィルターは、クローンテック社より購入したMouse Embryo MTN Blot(Cat.No.7763−1,Lot.0120805)を用い、ハイブリダイゼーションの条件はクローンテック社のプロトコールに従って行った(図11)。
図11で示した結果から、マウスPJ01256遺伝子は7日、11日、15日、17日めの胎児いずれの時期にも発現していることが示され、その発現量は発生にしたがって発現量が増加していた。このことより、PJ01256は発生に関与していることが示唆された。またmRNAの大きさは約5.5Kbで、明瞭なスプライシングバリアントは検出されなかった。
実施例17
(PJ01256の性周期による発現変動)
PJ01256の主な発現部位は実施例6に示したノーザンハイブリダイゼーション及びRT−PCRの結果から卵巣であった。卵巣は、性周期に従って排卵を繰り返すことで、組織形態が変化している。その過程では、細胞外マトリックスの分解及び再構築が繰り返されており、分解系及び合成系の種々の酵素が性周期に従って変動していると考えられる。PJ01256と同じADAMTSファミリーであるADAMTS1は、プロゲステロンの制御下で性周期に従って発現が変動することが報告されている(R.L.Robker et al, Steroids.(2000)65(10−11):559−570;R.L.Robker et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(2000)97(9):4689−4694.)。
以下、マウスPJ01256の卵巣での性周期による発現変動を検討した。対照組織として、腎臓での検討も同様に行なった。
RT−PCR及び定量的PCRによる検討を行なうために、以下のプライマー及び定量的PCR用プローブを作製した。mPJ−がマウスPJ01256用、G3PDH−及びmGDH−が内部標準遺伝子として用いたマウスグリセルアルデヒド 3−燐酸脱水素酵素(G3PDH)用であり、Sはセンスプライマー、Aはアンチセンスプライマーを示す。
RT−PCR用プライマー
定量的PCR用プライマー
定量的PCR用プローブ(TaqMan プローブ)
マウスはSlcICR系メス9週齢を5個体使用した。性周期は、採取当日及び前日にスメアーテストを行ない判定した(表38)。卵巣及び腎臓を採取後、「TRIZOL登録商標 Regent、Invitrogen社製」を用いて、添付プロトコルに従いRNAを抽出した。
RT−PCRの第一次反応である逆転写反応(RT反応)は、上記で抽出したRNAを鋳型として、「TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)Ver1.1;宝酒造製」を用い、下記の条件で行なった。
RT−PCRの第二次反応であるPCRは、上記のRT反応で調製したcDNAを鋳型として、以下の条件で行なった。
PCR産物を電気泳動し、臭化エチジウムで染色した後、紫外光照射下で画像を取り込み、各バンド濃度を比較した(図12、表38)。G3PDHのバンドが各個体及び卵巣、腎臓でほとんど同じだったのに対し、PJ01256のバンド濃度は発情期である個体1の卵巣で特に強く、個体1及び個体3の腎臓、個体4の卵巣で若干強かった。
性周期による発現変動の更なる検討のため、定量的PCRによる解析を行なった。定量的PCR反応溶液は、「TaqMan登録商標Universal PCR Master Mix、Applied Biosystems社製」を用い、前記のRT反応で調製したcDNAを鋳型として、以下の通り調製した。
反応は、定量的PCR装置「GenneAmp5700登録商標 Sequence Detection System、Applied Biosystems社製」に上記の反応溶液を入れたチューブを1サンプル当たり2本ずつセットし、以下の運転プログラムにて行なった。
定量的PCR装置で得られた増幅曲線より、G3PDH及びPJ01256の相対濃度を得た。続いて、PJ01256の相対濃度を内部標準遺伝子であるG3PDHの相対濃度で除算し、補正した。補正値を組織及び遺伝子ごとの最低値で除算し、相対濃度比を算出した(表38)。その結果、発情期である個体1の卵巣でのみ、PJ01256の発現が高くなっていることが確認された。
RT−PCR及び定量的PCRの結果から、共に発情期卵巣ではPJ01256の発現が亢進していることが示された。このことより、PJ01256は性周期に従って卵巣での発現が変動しており、排卵に伴う卵巣の細胞外マトリックスの分解及び再構築に関与していることが示唆された。
実施例18
(組換えヒトPJ01256タンパク質の細胞外マトリックス局在化の検討)
実施例5においてCOS7細胞で発現させたヒトPJ01256タンパク質が細胞外マトリックス(ECM)に局在していることを確認するため、論文(Kuno,K.and Matsushima,K. J.Biol.Chem.(1998)273,13912−13917)の方法に準じて以下の検討を行った。
75cm2組織培養用フラスコに約50%コンフレントに付着生育させたCOS7細胞に対し、10μgのpCMH01−PJ01256を遺伝子導入した。対照には10μgのpCMH01を用いた。遺伝子導入は市販の「LipofectAMINE PLUS、Lifetechnologies社製」を用い、添付プロトコルに従って行った。遺伝子導入3日後、培養上清液(12ml)を回収し、等量の2×SDS電気泳動用緩衝液(100mM Tris−HCl pH6.8、20% グリセロール、12% 2−メルカプトエタノール、4% SDS、ブロモフェノールブルーにより染色)を添加後、100℃で5分間加熱して培地画分(Medium Fraction)とした。フラスコに付着した細胞をPBS(Phosphate Buffered Saline)で2回洗浄した後、5mMのEDTA(pH7.5)を添加したPBSで細胞を遊離させた。懸濁した細胞液を遠心分離(1,000×g、5分、室温)して細胞を沈殿させ、氷冷したPBSで洗浄後、0.05mlのRIPAバッファー(50mM Tris−HCl pH8.0、150mM NaCl、1.0% NP40、0.5% デオキシコーレート、0.1% SDS、1mM フェニルメチルスルフォニルフルオリド)に懸濁して細胞を破砕した。細胞破砕液に等量の2×SDS電気泳動用緩衝液を添加後、100℃で5分間加熱して細胞画分(Cell Fraction)とした。細胞を遊離させた後にフラスコに付着したECM画分を、1.0mlの1×SDS電気泳動用緩衝液に懸濁し、100℃で5分間加熱して細胞外マトリックス画分(ECM Fraction)とした。
各画分サンプル5μlをSDS−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。SDS−ポリアクリルアミド電気泳動は、市販の「マルチゲル4/20、第一化学薬品社製」を「カセット電気泳動槽「第一」DPE−120」にセットし、40mA定電流で1時間行った。泳動用緩衝液は、「Tris−Glycine−SDS Powder、宝酒造製」を用い、分子量マーカーは、「Precision Protein Standards、BIO−RAD社製、Code.No.161−0372」を用いた。泳動終了後、「ミニトランスブロット、BIO−RAD社製」を用いてエレクトロトランスファーによりPVDF膜「TEFCO社製、Code.No.03−056」にブロッティングした。エレクトロトランスファーは、「Tris−Glycine Powder、宝酒造製」にメタノールを20%添加した緩衝液中で、150mA定電流で1.5時間行った。ブロッティングしたPVDF膜は、「抗C−Myc(9E10)抗体、Santa Cruz Biotechnology社製、Code.No.SC−40」を1次抗体として反応させ、「Anti−Mouse IgG−POX、Sigma社製」を2次抗体として反応させた。抗体にラベルされたホースラディシュパーオキシダーゼの検出には「ECL Plus、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製」を用い、添付されていた標準プロトコルに従って行った。結果を図13に示した。
図13に示したように、抗Myc抗体を用いたウェスタンブロッティング解析の結果、pCMH01−PJ01256をトランスフェクトしたCOS7細胞では、発現したPJ01256タンパク質のシグナルは主にECM画分に検出された。対照としたpCMH01では該当するシグナルは検出されなかった。以上の結果より、COS7細胞で発現したヒトPJ01256タンパク質は主にECMに局在していることが示された。
実施例19
(PJ01256のエクソン部位決定と染色体マッピング)
PJ01256のゲノム配列及び疾患との関わりを調べるため、ゲノム配列を検索し、染色体マッピングを行なった。
ヒトPJ01256全長cDNA(配列番号3)で公共データベースであるGenBankを検索したところ、染色体クローンAC010269.5がヒットした。同配列に対しヒトPJ01256cDNAをGT−AGルールにあてはめ、エクソン部位を決定した。その結果、ヒトPJ01256全長cDNA 5610bp中1−3558bpが、エクソン1〜18としてAC010269.5上に存在した。エクソン19以降はAC010269.5上には存在しなかった(表39、図14)。
NCBIのHuman Genome Map Viewer(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi−bin/Entrez/hum srch?chr=hum chr.inf&query)を用いて、ヒトPJ01256のゲノム配列であるAC010296.5の染色体上の位置をデータベース上で調べ、染色体マッピングを行なった。その結果、2001年9月19日現在AC010269.5は、5番染色体短腕15.31(5p15.31)に存在していた(図15)。なお、同ゲノム配列は2001年5月8日には5p15.33、同年5月10日には5p15.2に存在していた。
染色体マッピングの結果から、PJ01256は5p15.2−15.3に存在することが示された。5p15.2−15.3は、5P−症候群(Cri−du−chat syndrome)の欠失部位であり(Overhauser J,et al.,Hum.Mol.Genet.(1994)3(2):247−252)、同症候群との関連が示唆される。
実施例20
(ヒトPJ01256の昆虫細胞系での大量発現)
ヒトPJ01256の大量発現を行なうため、昆虫細胞/バキュロウィルスでの発現系を構築した。発現系構築には「Bac−To−Bac登録商標 Baclovirus Expression System、Life tecnologies社(現Invitrogen社)製」を使用した。
発現させたヒトPJ01256のC末端にMycHisタグ配列を付加するため、組換えバキュロウィルスDNAプラスミド(Bacmid)調製用ベクター「pFastBac1、Life tecnologies社(現Invitrogen社)製」を改変した。すなわち、下記の合成DNA(MEHT−1、MEHT−2、MEHT−3、及びMEHT−4)をアニーリングさせ連結したものを、pFastBac1のSphI及びHindIIIサイト間に挿入した。作製したpFastBac1−HTのクローニング部位を図16に示す。
ヒトPJ01256cDNAは実施例4で作成したpCMH01−PJ01256から制限酵素BamHI及びHindIIIで切り出し、pFastBac1−HTの同サイトに挿入した。作製したプラスミドpFastBac1−HT−PJ01256は、塩基配列を決定しPJ01256cDNA下流にMycHisタグ配列が同一フレームで連結されたことを確認した(図17、配列番号9)。
昆虫細胞/バキュロウィルス発現系において効率良くPJ01256を分泌させるため、ミツバチ メリチン(Honeybee Melittin)由来シグナル配列(以下、メリチンシグナル、Tessier D.C.et al, Gene(1991)98(2):177−183)を付加した。すなわち、下記の合成DNAをアニーリングさせたものを、pFastBac1−HT−PJ01256のBamHIサイトに挿入した。
作製したプラスミドpFastBac1−MS/HT−PJ01256‐2は、塩基配列を決定しPJ01256cDNA上流にメリチンシグナル配列が同一フレームで連結されたことを確認した(図18、配列番号10)。
また、活性型PJ01256を高効率で得る目的で、PJ01256自体のシグナル配列及びメタロプロテアーゼ活性を抑制すると考えられるプロ領域を除いたものも作製した。すなわち、下記のプライマーで増幅される257bpのヒトPJ01256断片をBamHI及びXbaIで消化し、pFastBac1−MS/HT−PJ01256‐2の両サイト間に連結した。なお、BHPJ−S05は、5’側9merがBamHIの認識配列と同酵素での消化を可能とするスペーサー配列であり、3’側21merはヒトPJ01256全長cDNA配列(配列番号3)の1593〜1613番目に完全一致する配列よりなるプライマーである。PJ−A25はヒトPJ01256全長cDNA配列(配列番号3)の1811〜1840番目の相補鎖に完全一致する配列よりなるプライマーである。
作製したプラスミドpFastBac1−MS/HT−PJ01256‐1は、塩基配列を決定しメリチンシグナル配列下流にヒトPJ01256cDNAのメタロプロテアーゼドメインが同一フレームで連結されたことを確認した(図19、配列番号11)。
作製した組換えBacmid調製用ベクターpFastBac1−HT−PJ01256、pFastBac1−MS/HT−PJ01256‐1及びpFastBac1−MS/HT−PJ01256‐2で、組換えBacmid調製用大腸菌;「E.coli DH10 Bacコンピテントセル、菌体内にBacmidを有する、Life tecnologies社(現Invitrogen社)製」をそれぞれ形質転換した。その結果、Tn7部位特異的トランスポジションによって、それぞれのPJ01256の発現ユニットが組換えられたBacmid(Bacmid−HT−PJ01256、Bacmid−MS/HT−PJ01256‐1及びBacmid−MS/HT−PJ01256‐2)を得た。
Bacmid−HT−PJ01256、Bacmid−MS/HT−PJ01256‐1及びBacmid−MS/HT−PJ01256‐2をそれぞれ2クローンずつSf9細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入はリポソーム法にて行なった。4日後、培養上清を0.2μmのフィルターでろ過し、それぞれのPJ01256組換えバキュロウィルス液(BV sol.PJ01256−HT No.1、BV sol.PJ01256−HT No.2、BV sol.PJ01256−MSHT1 No.1、BV sol.PJ01256−MSHT1 No.2、BV sol.PJ01256−MSHT2 No.1及びBV sol.PJ01256−MSHT2 No.2)として回収した。
回収したそれぞれのPJ01256組換えバキュロウィルス液を3×106個のSf9細胞に約moi10で感染させた。3日後、細胞を10mM Tris(pH8)、1mM EDTAで懸濁し、等量の2×サンプルバッファーを加え、約5分間煮沸させた後、1/100量をウェスタンブロッティングに供した。ウェスタンブロッティングは、「Penta−His HRP Conjugate、QIAGEN社製」と「ECL PLUS、Amersham Pharmacia Biotech社製」を用いて、それぞれの添付プロトコルに従って行なった。
ウェスタンブロッティングの結果を図20に示した。昆虫細胞/バキュロウィルス系での発現の結果、それぞれの分子量に応じたPJ01256の発現産物が得られた。本発現系の構築により、PJ01256の大量調製が可能となった。
産業上の利用可能性
以上説明したように本発明は、新規なADAMTSファミリータンパク質及びそれをコードする新規遺伝子を提供するものであり、卵巣での高発現及び性周期における発現量の変動、腫瘍細胞における存在の低下、及び当該遺伝子の染色体上の位置が5P−症候群の欠失部位に位置することを特徴とする。この特性を利用した新規医薬組成物、診断・治療手段の提供はADAMTSファミリータンパク質関連の臨床・基礎の医用領域において大きな有用性を提供する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1はヒトPJ01256を有するベクターpCMH01−PJ01256を示す模式図である。
図2はヒトPJ01256を有するベクターを形質導入した哺乳動物細胞でのヒトPJ01256タンパク質の発現を示す。
図3はヒトPJ01256遺伝子の発現組織解析の結果を示す。
図4はヒトPJ01256遺伝子の発現組織解析の結果を示す。
図5は正常卵巣及び腫瘍卵巣でのヒトPJ01256発現量を示す。
図6は正常脳及び脳腫瘍でのヒトPJ01256発現量を示す。
図7は正常副腎及び腫瘍副腎でのヒトPJ01256発現量を示す。
図8はヒトPJ01256とマウスPJ01256のアミノ酸配列を比較して示す。
図9はヒトPJ01256とマウスPJ01256のアミノ酸配列を比較して示す。
図10はマウスPJ01256遺伝子の発現組織解析の結果を示す。
図11はマウスPJ01256遺伝子のマウス胎児における発現を示す。
図12はマウスPJ01256mRNAの性周期変動を示す。グリセルアルデヒド 3−リン酸脱水素酵素(G3PDH)mRNAの性周期変動を対照として示す。図中、各数字はマウスの個体番号であり、それぞれのマウスの性周期は次のように判定された;1=発情期;2=発情後期〜休止期;3=発情後期;4=発情前期〜発情期;5=発情後期。
図13はCOS7細胞で発現させたヒトPJ01256タンパク質の細胞外マトリックス(ECM)への局在を示す。図中、CはpCMH01をトランスフェクトしたCOS7細胞、PJはpCMH01−PJ01256をトランスフェクトしたCOS7細胞についての結果である。
図14はヒト染色体クローンAC010269.5上のヒトPJ01256エクソンの位置を示す。
図15はヒト染色体クローンAC010269.5が5番染色体短腕15.31(5p15.31)に存在することを示す。
図16はヒトPJ01256遺伝子を挿入した組換えバキュロウイルスDNA調製用プラスミドベクターpFastBac1−HTのクローニング部位を示す。図中、イタリック文字は合成DNA挿入部分を示す。
図17はプラスミドpFastBac1−HT−PJ01256の構造を示す模式図である。
図18はプラスミドpFastBac1−MS/HT−PJ01256−2の構造を示す模式図である。
図19はプラスミドpFastBac1−MS/HT−PJ01256−1の構造を示す模式図である。
図20はヒトPJ01256の昆虫細胞/バキュロウイルス系での発現結果を示す。図中、HTはBacmid−HT−PJ01256、MSHT1はBacmid−MS/HT−PJ01256−1、及びMSHT2はBacmid−MS/HT−PJ01256−2を遺伝子導入したSf9細胞の培養上清を示す。それぞれ2クローンずつ遺伝子導入し、No.1及びNo.2として表示した。
本発明は、新規なADAMTSファミリーポリペプチド又はタンパク質、及び該ポリペプチド又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものである。さらに詳しくは、該ポリペプチド若しくはタンパク質のアミノ酸配列の全部若しくは一部を有するペプチド、該ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体、該ペプチド又はポリペプチドに対する抗体、これらを利用した化合物のスクリーニング方法でスクリーニングされた化合物、該ポリペプチド若しくは該ポリヌクレオチドに作用する活性阻害化合物又は活性賦活化合物、これらに関係する医薬組成物、及びこれらに関係する疾病診断方法、当該形質転換体を使ったペプチド又はポリペプチドの製造方法、当該スクリーニング方法に関する。
背景技術
近年、レプロリシン型(reprolysin type)亜鉛メタロプロテアーゼドメイン(Zn−metalloprotease)(Hooper N.M. FEBS Lett.(1994)354:1−6)、ディスインテグリン様(disintegrin−like)ドメイン及びTSP1(thrombospondin type 1 repeats)ドメインを有するユニークなタンパク質が見い出されており(Kuno K.,et al., J.Biol.Chem.(1997)272:556−562;Vazques.F.,et al, J.Biol.Chem.(1999)274:23349−23357等)、これらの特徴的なドメインを有するタンパク質はADAMTS(adisintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs)ファミリーと総称されている(Tang B.L.,et al., FEBS Lett.(1999)445:223−225)。
レプロリシン型亜鉛メタロプロテアーゼドメインは、ADAMTS及びADAM(a disintegrin and metalloprotease)ファミリー等に含まれ、活性中心は一般にHEX1X2HXX1GX1XHD(通常、X1;疎水性アミノ酸、X2;グリシンあるいは疎水性アミノ酸)であり、3つのヒスチジン残基が1つの亜鉛分子に配位していると考えられている(Hooper N.M. FEBS Lett.(1994)354:1−6)。
TSP1ドメインは、トロンボスポンジン1(thrombospondin−1)が有する繰り返し配列として見い出され、そのCSVTCGモチーフはCD36/LIMPII受容体に結合し、WSXWモチーフは細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカン(heparan sulfate proteoglycan)に結合することが知られている。
ディスインテグリン様ドメインは、システインに富み抗血液凝固作用を有するヘビ毒のディスインテグリン(disintegrin)に40%程度の相同性を有している。機能的にヘビ毒のディスインテグリンと同等あるいは同様の作用を有するかは未解明である。
現在、ADAMTSファミリーとしてADAMTS−1〜10、12〜13の12種類(ADAMTS11も報告されているが、ADAMTS5と同一分子であった)が報告されている。その中には、細胞外マトリックスのアグリカン(Aggrecan)切断活性を持つADAMTS−4(Aggrecanase−1)、ADAMTS−5(Aggrecanase−2)やプロコラーゲン切断活性をもつADAMTS−2(procollagen I/II aminopropeptidase)のように従来のマトリックスメタロプロテアーゼ(matrix metalloprotease)とよく似た酵素活性をもつものが認められている反面、ADAMTS−1(METH1)やADAMTS−8(METH2)のようにエンドスタチン(endostatin)やTSPという従来知られていた血管新生阻害因子よりも強い血管新生阻害作用を持つものも発見されている(Vazques.F.,et al, J.Biol.Chem.(1999)274:23349−23357)。
ADAMTS−1については、血管新生阻害作用の他、炎症組織での発現上昇(Kuno K.,et al., J.Biol.Chem.(1997)272:556−562)、性周期による発現変動と排卵への関与(Robker R.L.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(2000)97:4689−4694;Robker R.L.,et al., Steroids(2000)65:559−570)等が報告されている。基質としては、アグリカン(Kuno K.,et al., FEBS Lett.(2000)478:241−245)及びバージカン(Versican)(Sandy J.D.,et al., J.Biol.Chem.(2001)276:13372−13378)が報告されている。
ADAMTS−2は、その欠損が、プロコラーゲンIの蓄積による皮膚の形成異常を特徴とするEhlers−Danlos syndrome type VIICの原因であることが報告されている(Colige A.,et al.,Am.J.Hum.Genet.(1999)65:308−317;Li S.W.,et al., Biochem.J.(2001)355:271−278)。ADAMTS−3は、ドメイン構造及び活性中心の配列がADAMTS−2と非常に似ており、ADAMTS−2とともにプロコラーゲンIIを基質とすることが報告されている(Fernandes R.J.,et al., J.Biol.Chem.(2001)276:31502−31509)。
ADAMTS−4及びADAMTS−5は、基質としてアグリカンの373番目のグルタミン酸残基と374番目のアラニン残基間(Glu373−Ala374 bond)を切断することが報告されている(Tortorella M.D.,et al.,Science(1999)284:1664−1666;Abbaszade I.,et al., J.Biol.Chem.(1999)274:23443−23450)。同部位の切断は慢性関節リウマチや変形性関節症のような関節軟骨破壊を伴う関節疾患の初期徴候の一つであり(Sandy J.D., J.Clin.Invest.(1992)89:1512−1516)、ADAMTS−4及びADAMTS−5の阻害剤がその治療薬として着目されている。また、生体内におけるADAMTS−4及びADAMTS−5の強力な阻害剤としてTIMP−3が報告されている(Hashimoto G.,et al., FEBS Lett.(2001)494:192−195;Kashiwagi M.,et al., J.Biol.Chem.(2001)276:12501−12504)。ADAMTS−4については、アグリカン以外の基質として、ブレビカン(brevican)(Matthews R.T.,et al., J.Biol.Chem.(2000)275:22695−22703)、バージカン(Sandy J.D.,et al., J.Biol.Chem.(2001)276:13372−13378)が報告されている。
最近同定されたADAMTS−13については、血液凝固に関与するフォンビルブランドファクター(von Willebrand factor)の切断活性が認められている(Fujikawa K.,et al., Blood(2001)98:1662−1666;Zheng X.,et al., J.Biol.Chem.(2001)Sep13[epub ahead of print];Soejima K.,et al., J.Biochem.(Tokyo)(2001)130:475−480)。同酵素活性の欠損は、血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura)の原因とされており、ADAMTS−13が着目されている。
発明の開示
本発明が解決しようとする課題のひとつは、上記のように多様な作用の原因物質となり得るADAMTSファミリータンパク質に関する新規な物質を見い出し、生体内におけるADAMTSファミリータンパク質の制御を可能にすることである。より具体的には、本発明の課題は新規な特性をもつ新規なADAMTSファミリータンパク質を提供することであり、それに伴い有用性ある新規なADAMTSファミリータンパク質由来のペプチド又はポリペプチドを提供することである。また本発明の別の課題は、新規なADAMTSファミリータンパク質由来のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することであり、さらにこれを利用して遺伝子工学手法による新規なADAMTSファミリータンパク質の製造法を提供することである。さらに本発明の別の課題は、新規なADAMTSファミリータンパク質、ペプチド又はポリペプチドに対する抗体を提供することである。その他の本発明の課題は、上記のものを利用して新規なADAMTSファミリータンパク質の有する作用の阻害剤・拮抗剤・賦活剤のスクリーニングを行なうことであり、スクリーニングされた化合物を提供することであり、またこれらを利用した医薬組成物及び診断方法を提供することである。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト脳細胞中のmRNA由来のcDNAライブラリーから新規なADAMTSファミリータンパク質をコードするcDNAを単離し、全塩基配列を解析することに成功した。そして、この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、当該タンパク質はN末端側にレプロリシン(reprolysin)様の亜鉛メタロプロテアーゼドメイン(Zn−metalloprotease)を1個、C末端側にTSP1ドメインを5回繰り返して保持し、その中間にディスインテグリン様ドメインを1個有することを確認し、これらのcDNAにコードされるタンパク質が新規なADAMTSタンパク質であることを確認した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の1態様は、下記の群より選ばれるADAMTSファミリーに属するポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質である;
▲1▼配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
▲2▼前記▲1▼のポリペプチドを含有するポリペプチド、
▲3▼前記▲1▼のポリペプチドと少なくとも約50%のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
及び
▲4▼前記▲1▼〜▲3▼のポリペプチドにおいて、そのアミノ酸配列に1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するポリペプチド。
本発明の1態様は、配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列の一部を有する部分ペプチドであって、少なくとも約8個の連続するアミノ酸配列を有するペプチドである。
本発明の1態様は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖である。
本発明の1態様は、配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖である。
本発明の1態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
本発明の1態様は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖である。
本発明の1態様は、配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補的塩基配列の少なくとも約15個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明の1態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
本発明の1態様は、上記いずれか1つのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有する組換えベクターである。
本発明の1態様は、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体である。
本発明の1態様は、上記形質転換体を培養する工程を含む、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチドの製造方法である。
本発明の1態様は、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチドを免疫学的に認識する抗体である。
本発明の1態様は、少なくともADAMTSファミリーポリペプチドを認識する、上記抗体である。
本発明の1態様は、上記ポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害若しくは促進する作用を有する化合物、及び/又は上記いずれかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、上記いずれかのポリヌクレオチド、上記ベクター、上記形質転換体、上記抗体のうちの少なくともいずれか一つを用いることを特徴とするスクリーニング方法である。
本発明の1態様は、上記ポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害若しくは活性化する化合物、又は上記いずれかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する化合物のスクリーニング方法であって、化合物とポリペプチド又はタンパク質との間の相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチド又はタンパク質とスクリーニングすべき化合物とを接触させて化合物の相互作用を評価し(かかる相互作用はポリペプチド又はタンパク質と化合物との相互作用に応答した検出可能シグナルを提供し得る第2の成分に関連したものである)、次いで、化合物とポリペプチド又はタンパク質との相互作用により生じるシグナルの存在又は不存在又は変化を検出することにより、化合物がポリペプチド又はタンパク質と相互作用して、その活性を活性化又は阻害するかどうかを決定することを含む方法である。
本発明の1態様は、上記方法でスクリーニングされる化合物であって、上記ポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害又は促進する化合物又はその塩である。
本発明の1態様は、上記方法でスクリーニングされる化合物であって、上記いずれかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する化合物又はその塩である。
本発明の1態様は、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、上記いずれかのポリヌクレオチド、上記ベクター、上記形質転換体、上記抗体、又は上記化合物のうちの少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする医薬組成物である。
本発明の1態様は、上記ポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質の発現又は活性に関連した疾病の診断方法であって、(a)該ポリペプチド又はタンパク質をコードしている核酸、及び/又は(b)個体由来の試料中の該ポリペプチド又はタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法である。
本発明の1態様は、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、上記いずれか1つのポリヌクレオチド、又は上記抗体のうちの少なくともいずれか1つを含んでなる、(a)該ポリペプチド又はタンパク質をコードしている核酸、及び/又は(b)試料中の該ポリペプチド又はタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法に使用する試薬キットである。
本発明の1態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖をエクソンとして含有するヒトゲノム遺伝子断片たるポリヌクレオチドである。
本発明の1態様は、上記ヒトゲノム遺伝子断片の塩基配列又はその相補配列の少なくとも15個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明の1態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
本発明の1態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖をマーカー又はプライマーとして用いることを特徴とする疾病の診断方法である。
発明を実施するための最良の形態
(新規なADAMTSファミリータンパク質)
本発明において提供される新規なADAMTSファミリータンパク質は、ヒト脳細胞中のmRNA由来のcDNAライブラリーから発現配列タグ(EST)分析(Adams,M.D.,et al., Science(1991)252:1651−1656;Adams,M.D.et al., Nature(1992)355:632−634;Adams,M.D.,et al., Nature(1995)377 Supp:3−174)を用いてTSP1ドメインをマーカーとして釣上げられたcDNAクローン(配列表の配列番号2)の塩基配列から特異的に作成したプライマーを使用して、さらに5′RACE(Rapid amplification of cDNA end)法で取得された全長cDNA(配列番号3)がコードする新規なアミノ酸配列を有するものである。当該cDNAクローンにコードされるアミノ酸配列は配列表の配列番号1に、該全長cDNAにコードされるアミノ酸配列は配列表の配列番号4に記載した。この新規なADAMTSファミリータンパク質のmRNAは、ヒトの卵巣で発現が高く、ついで腎臓、肺、胃、精巣、副腎、膵臓で発現量が高かった。また、脳、小腸、骨格筋、皮膚において中程度に発現していた。卵巣での発現が特に高かったことから、同タンパク質は卵の分化・成熟あるいは排卵ひいては受精等に関与することが考えられる。また、卵巣・心臓及び腎臓の腫瘍組織ではmRNAの発現量が正常組織に比べ著しく低下していたことから腫瘍に関連する遺伝子であることが推定された。さらに、この新規遺伝子が、第5染色体短腕15.2−15.3(5p15.2−15.3)に存在することを見い出した。5p15.2−15.3は5P−症候群(Cri−du−chat syndrome)の欠失部位であることが報告されていることから(Overhauser J,et al,Hum.Mol.Genet.(1994)2:247−252)、該遺伝子と同症候群との関連が示唆された。また、本発明においては、上記新規なヒトADAMTSファミリータンパク質のマウスのカウンターパートをも見い出し、これを提供する。このマウスADAMTSファミリータンパク質のcDNAの塩基配列は配列表の配列番号7に、該cDNAがコードするアミノ酸配列は配列番号8に記載した。
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質は、公知データベース登録配列との相同性分析からADAMTSファミリーに属し、TSP1ドメイン及びレプロリシン型亜鉛メタロプロテアーゼ(Zn−metalloprotease)ドメインを有し、システイン−リッチ リージョン(Cysteine−rich region)を有することが判明した。
本タンパク質がADAMTSファミリータンパク質であること、またTSP1ドメインを有することから、ADAMTS1及びADAMTS8で報告されているのと同様に血管新生阻害作用を有することが示唆される。また、レプロリシン型亜鉛メタロプロテアーゼを有し、かつ卵巣で性周期に応じて発現が変動することから、卵巣の細胞外マトリックスを基質として、その分解及び再構築に関与していると考えられる。
(タンパク質、ポリペプチド又はペプチド)
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質は、配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列と同一、又は実質的に同一なアミノ酸配列を含有するタンパク質である。当該新規なADAMTSファミリー含有タンパク質は、ヒトや哺乳動物のあらゆる細胞、又はそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、実施例6及び7にみられる発現特性を保持する限りは特に限定されず、例えば、配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
また、配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、さらに配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質等が例示される。実質的に同質の活性として、例えば同一ファミリーに属するADAMTS1及びADAMTS8で報告されているように、本発明に係る新規なタンパク質が血管新生阻害活性を有することも考えられるが、その活性測定方法としては、インビボ(in vivo)法として、ニワトリ胚の漿尿膜(chorioallantoic membrane)を用いるCAM法(Moses M.A.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96:2645−2650)、ウサギやラットの目の角膜に少し切り目をつけて試料を入れ、そこに向かって近くの細静脈から伸びてくる新生血管を観察する角膜法(Gaudric A.,et al., Ophthalmic Res.(1992)24:181−188)等を、インビトロ(in vitro)法として、培養血管内皮細胞を用いてボイデンチャンバーで遊走を、単層培養で細胞の増殖を観察し、管腔形成は三次元のコラーゲンゲルやマトリゲル(IV型コラーゲン、ラミニン、ニドゲン/エンタクチン及びヘパラン硫酸よりなる再構成基底膜ゲル)で培養して観察する方法(Haas T.L.,et al., J.Biol.Chem.(1998)273:3604−3610)等をそれぞれ挙げることができる。
アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、cDNAの塩基配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等が可能である。
本発明に係る新規なADAMTSファミリーポリペプチドを含むタンパク質は「成熟」タンパク質の形態であってもよく、あるいは融合タンパク質のごとき大型のタンパク質の一部であってもよい。分泌又はリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基のごとき精製を促進する配列、又は組換え生産を行っている間の安定性のためのさらなる配列を含むものであってもよい。
本発明に係るポリペプチド又はペプチドは、配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列を有するポリペプチド又はペプチドを包含し、これらは例えば試薬・標準物質・免疫原として利用できる。その最小単位としては8個以上のアミノ酸、好ましくは10個以上のアミノ酸、より好ましくは12個以上、さらに好ましくは15個以上の連続するアミノ酸で構成されるアミノ酸配列からなり、好ましくは免疫学的に同定し得るポリペプチド又はペプチドを本発明の対象とする。これらのペプチドは、試薬若しくは標準物質、又は後述するように本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質に特異的な抗体を作製するための抗原として単独又はキャリア(例えば、キーホールリンペイトヘモシアニン又は卵白アルブミン)と結合して使用できるが、これらのように別種のタンパク質又は物質を結合したものも本発明の範囲に包含される。部分配列は、「独立して存在するもの(free standing)」であるか、あるいはより大きなポリペプチド内に含まれていてもよく、その中で部分配列は一部分若しくはある領域を形成していてもよい。最も好ましくは、単一の連続した領域としてより大きなポリペプチドに含まれる。
さらに、このように特定されたポリペプチド又はペプチドを基にして、その生理活性(例えば血管新生抑制能)を指標とすることにより、1以上、例えば1ないし100個、好ましくは1ないし30個、より好ましくは1ないし20個、さらに好ましくは1ないし10個で、特に好ましくは1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はペプチドも提供される。欠失、置換、付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はポリメラーゼ連鎖増幅法(PCR)を単独又は適宜組み合わせて、例えば、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第2版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年;[ラボマニュアル遺伝子工学]、村松正實編、丸善株式会社、1988年;[PCRテク1989年等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばUlmerの技術(Science(1983)219:666)を利用できる。例えば、N末端を含む一連の残基が欠失、又はC末端を含む一連の残基が欠失、あるいは一方がN末端でもう一方がC末端を含む2種の一連の残基が欠失していること以外は上記新規なADAMTSファミリータンパク質のアミノ酸配列を有する末端切断ポリペプチドを包含する。
また、構造的又は機能的属性により特徴づけられる部分配列、例えばアルファーヘリックス及びアルファーヘリックス形成領域、ベータシート及びベータシート形成領域、ターン及びターン形成領域、コイル及びコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、及び高抗原性指標領域を含む部分配列等も好ましい。また、生物学的に活性な領域も好ましく、類似の活性若しくは改善された活性のある、又は望ましくない活性を減じた部分配列等がある。動物、とりわけヒトにおいて抗原的又は免疫原的な部分配列もまた含まれる。
本発明に係るタンパク質、ポリペプチド及びそれらの部分配列ペプチドのアミノ酸配列は保存的アミノ酸置換により変化したものも含まれている。かかる典型的な置換は、Ala、Val、Leu及びIle間;Ser及びThr間;Asp及びGlu間;Asn及びGln間;並びに塩基性残基Lys及びArg間;あるいは芳香族残基Phe、Trp及びTyr間におけるものである。数個、5ないし10個、1ないし5個、又は1ないし2個のアミノ酸がいずれかの組み合わせで置換、欠失又は付加されているものが特に好ましい。
上記のような変異の導入において、当該タンパク質の基本的な性質(物性、活性、又は免疫学的活性等)を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸(極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等)の間での相互置換は容易に想定される。
なお、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質はペプチド結合又は修飾されたペプチド結合により互いに結合している2個又はそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドを意味する。また、本明細書において、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称する短鎖をポリペプチド、また、長鎖のものをタンパク質ということもある。
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質は、20種の遺伝子によりコードされたアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有することもできる。「タンパク質」には、プロセッシング及びその他の翻訳後修飾のような天然のプロセッシングにより修飾されたものが含まれるが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾される。このような修飾は基礎的な参考書及びさらに詳細な論文並びに多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に周知である。
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びN末端側又はC末端側等のポリペプチドの任意の部位で行われ得る。同一の型の修飾は該ポリペプチドの幾つかの部位で、同一又は異なる程度で存在し得る。また、タンパク質は多くの型の修飾をも含み得る。タンパク質は、ユビキチネーションの結果として分枝状であってもよく、分枝を伴う又は伴わない環状のものであってもよい。環状、分枝状及び分枝状かつ環状のタンパク質は翻訳後の天然プロセッシングにより生じるものであってもよく、あるいは合成法により製造されるものであってもよい。
修飾には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、及びセレノイル化、アルギニル化のようなトランスファーRNA媒介のタンパク質へのアミノ酸の添加、並びにユビキチネーション等がある。
例えば、Proteins−Structure and Molecular Properties、第2版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク、1993年及びPost−translational Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレス、ニューヨーク、1983年のWold,F.,Posttranslational Protein Modifications:Perspective and Prospects、1−12頁;Seifter et al.,Meth.Enzymol.(1990)182:626−646及びRattan et al., Protein Synthesis:Post−translational Modifications and Aging, Ann.N.Y.Acad.Sci.(1992)663:48−62参照。
さらに、本発明に係るポリペプチド等の検出若しくは精製を容易にするために、又は別の機能を付加するために、N末端側やC末端側に別のタンパク質、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、IgG等の免疫グロブリンFc断片、Myc−tag、His−tag、又はFLAG−tag等のペプチドを直接又はリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することは当業者には容易であり、これらの別の物質を結合したポリペプチド等も本発明の範囲に包含される。なお、ヒト以外の動物種の相同遺伝子産物も当然本発明の範囲に包含される。
(ポリヌクレオチド)
一つの態様において、本発明に係るポリヌクレオチド及びその相補鎖は、本発明に係るポリペプチド等、例えば配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドに対する相補鎖を意味する。好ましいポリヌクレオチドの塩基配列は、配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7に記載した。
別の態様において本発明は、本発明に係るポリペプチド又はペプチドのアミノ酸配列、例えば配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、好ましくは配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖の対応する領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第2版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年等に従うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものであるが、その一例としては、50%ホルムアミド、5×SSC(150mM NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウム,pH7.6、5×デンハーツ溶液、10%デキストラン硫酸、及び20μg/mlの変性剪断サケ・精子DNAを含む溶液中、42℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で2×SSC・0.1%SDS中で一次洗浄し、次いで、約65℃において0.1×SSC・0.1%SDSで二次洗浄といった条件であってもよい。
これらのポリヌクレオチドは目的のポリヌクレオチド、特に配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖にハイブリダイズするものであれば必ずしも相補的配列でなくとも良い。例えば、配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7の塩基配列又はその相補的配列に対する相同性において、少なくとも約40%、例えば、約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95%以上である。また本発明に係るポリヌクレオチドは、指定された塩基配列の領域に対応する連続する10個以上の、好ましくは15個以上の、より好ましくは20個以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド及びこれらの相補鎖を包含する。ここで、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質又はこれと同様の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、例えば公知のタンパク質発現系を利用して発現タンパク質の確認を行い、その生理活性を指標にして選別することにより行なうことができる。無細胞タンパク質発現系を利用する場合は、例えば胚芽、家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用できる(Nature(1957)179:160−161)。
上記本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチド等の製造において、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質をコードする核酸、例えばその遺伝子若しくはmRNAの検出用プローブ若しくはプライマー(primer)として、又は遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド等として有用である。その意味で、本発明に係るポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものも包含する。例えば、アンチセンスによって本発明に係る新規なADAMTSファミリー含有タンパク質の発現を特異的に阻害するためには、当該ADAMTSファミリータンパク質に固有な領域の塩基配列を用いることが想定される。一方、保存配列を用いることにより当該ADAMTSファミリータンパク質を含む複数のADAMTSファミリータンパク質又はTSP1含有タンパク質の発現を同時に抑制することも可能と考えられる。
本発明に係るポリヌクレオチドは、一般的には、修飾されていないRNA若しくはDNA、又は修飾されたRNA若しくはDNAであってもよい。「修飾されたRNA若しくはDNA」は、安定性又はその他の理由により、修飾された塩基を有するDNA又はRNA、並びに修飾された骨格を有するDNA又はRNAを包含する。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基及びイノシンのごとき通常的でない塩基を包含する。また、「修飾された」骨格は、フォスフォジエステル骨格が、例えばフォスフォロチオエート(phosphorothioate)骨格及びモルフォリノ(morpholino)骨格のごとき通常でない骨格を包含する。種々の修飾がDNA及びRNAについて行われており、典型的に天然において見いだされるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞に特徴的なDNA及びRNAの化学的形態を包含する。また、「RNA若しくはDNA」は、しばしば「オリゴヌクレオチド」と称する短いポリヌクレオチドを包含する。
本発明に係るポリヌクレオチドは、対象のRNA、DNAによりコードされるアミノ酸配列を変化させるものであってもよく、対象配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠損、融合及び末端切断を招く場合があるが、本発明はこれらのものも包含する。これらの変化は1又はそれ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起こることにより、アミノ酸配列が変化し得るものであり、これらの変化は、突然変異技術、直接的合成、及び当業者に既知のその他の組換え技術により製造できる。
本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列及びポリペプチドのアミノ酸配列の同一性は、本発明に係るRNA、DNA又は本発明に係るタンパク質の同一性の尺度である。一般的には、最高の合致が得られるように配列を並置する。同一性はそれ自体当該分野において認識された意味を有し、公表された方法を用いて算出できる。
例えば、Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年;Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993年;Computer Analysis of Sequence Data,パートI,Griffin,A.M.及びGriffin,H.G.編、ヒューマン・プレス、ニュージャージー、1994年;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heijne,G.、アカデミック・プレス、1987年;及びSequence Analysis Primer, Gribskov,M.及びDevereux,J.編、エム・ストックトン・プレス、ニューヨーク、1994年に記載の方法が利用できる。二つの配列の同一性を測定する方法は多くあるが、用語「同一性」は当業者によく知られている(Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heijne,G.、アカデミック・プレス、1987年;Sequence Analysis Primer, Gribskov,M.及びDevereux,J.編、Mストックトン・プレス、ニューヨーク、1991年;並びにCarillo,H.and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.(1988)48:1073)。
配列間の同一性又は類似性を測定するために通常用いられる方法はCarillo,H. and Lipman,D., SIAM J.Applied Math.(1998)48:1073等に開示されているが、これらに限定するものではない。同一性及び類似性を決定する方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに集成されている。二つの配列間の同一性及び類似性を測定する好ましいコンピュータープログラム法には、GCGプログラムパッケージ(Devereux,J.,et al., Nucleic Acids Research(1984)12(1):387)、BLASTP、BLASTN、及びFASTA(Atschul,S.F.et al., J.Molec.Biol.(1990)215:403)等があるが、これらに限定するものではない。
さらにまた、本発明におけるポリヌクレオチドの別の態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖をエクソンとして含有するヒトゲノム遺伝子断片たるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチド又はその相補鎖をなす塩基配列の少なくとも約15個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを包含する。
上記本発明に係るポリヌクレオチドは、例えば上記新規なADAMTSファミリータンパク質の製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸に関する試薬・標準品としても利用できる。例えば、上記ポリヌクレオチドをマーカー又はプライマーとして、後述するように、上記ポリヌクレオチドの変異や発現に関連する疾病の診断方法に使用できる。また、後述するように、当該疾病の防止及び/又は治療に用いる医薬組成物の成分の一つとして用いることができる。
(形質転換体)
本発明は、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞、並びにカイコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ等の実験動物等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術によっても、又は本発明に係るDNA由来のRNAを用いた無細胞タンパク質合成法により、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドは提供可能である。後述する実施例では、哺乳動物由来のCOS7細胞及び昆虫細胞系を宿主として利用し、上記ポリペプチドを遺伝子工学的に発現した。
形質転換は、自体公知の手段が応用され、例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換が行われる。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法であるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系の利用である。ベクターは、選択した宿主の種類により選別され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。組合せは原核細胞、真核細胞によって分別され、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー、マーカー配列、転写配列、非翻訳配列、スプライシング及びポリアデニル化シグナル、mRNAを安定化する配列のごとき非コーディング5′及び3′配列等を自体公知の方法によって組合せ利用できる。なお、マーカー配列は、pQEベクター(QIAGEN社製)中に提供されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド(Gentz et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA(1989)86:821−824に記載される)又はHAタグ(Wilson et al., Cell(1984)37:767)が好適に例示される。
DNAの宿主細胞への導入は、例えば、Davisら、Basic Methods in Molecular Biology、1986年;Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第2版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年の如き多くの標準的な実験マニュアルに記載される方法により行なうことができ、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷(scrape loading)、バリスティック導入(ballistic in troduction)及び感染等がある。
適当な宿主の代表的なものには、細菌細胞、例えば連鎖球菌属(streptococci)、ブドウ球菌属(staphylococci)、大腸菌(E.coli)、ストレプトミセス(Streptomyces)及び枯草菌(Bacillus subtilis)細胞;真菌細胞、例えば酵母細胞及びアスペルギルス属(Aspergillus)細胞;昆虫細胞、例えばドロソフィラS2(Drosophila S2)及びスポドプテラSf9(Spodoptera Sf9)細胞;動物細胞例えばCHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293及びボウズ(Bows)メラノーマ細胞;並びに植物細胞等がある。
ベクターには、染色体、エピソーム及びウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミド及びバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミド及びファージミド等がある。
発現系の構築物には発現を制御及び引き起こす調節領域を含有させることができる。通常、宿主中にDNAを保持、伸長又は発現するためには、タンパク質を発現するのに適した任意の系又はベクターを選択することが必要となる。これらは周知の技術により適当なDNA配列を発現系に挿入することができ、例えば、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第2版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年に記載されている。また、翻訳タンパク質を、小胞体内腔、ペリプラスミックスペース又は細胞外環境へ分泌させるために、適当な分泌シグナルを発現するタンパク質に組み込むことができる。これらのシグナルはタンパク質に本来的なものであってもよく、あるいは異種性のシグナルであってもよい。
形質転換体は、各宿主の培養に最適な自体公知の条件を選択して培養される。培養は、発現産生される本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドの生物活性をマーカーにして行なってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養又はバッチ培養によって行ってもよい。
目的とするタンパク質、ポリペプチド又はペプチドが上記形質転換体の培養培地中に分泌される場合は、該培地を回収し、該培地から精製することによりそれらを得ることができる。さらに、それらが上記形質転換体の細胞内に生成される場合は、まず細胞を溶解し、次いで、タンパク質を回収することによって目的のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを得ることができる。また、目的とするタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをスクリーニングアッセイのために発現させる場合、一般的には、細胞表面にタンパク質を生産させるのが好ましい。この場合、スクリーニングアッセイに使用する前に細胞を集めてもよい。
また、カイコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ等の実験動物等に本発明に係る遺伝子を導入して組換え動物を作製し、目的とするタンパク質を当該動物の生体内で発現させることも可能である。このような技術は、当該分野においては公知である。
(新規なADAMTSファミリードメイン含有タンパク質及びその由来物の精製・回収)
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドは、ヒトやその他哺乳動物の細胞、組織、培養された該細胞若しくはその培養培地(細胞培養物)、上記遺伝子組換え技術により作製した細胞又はその培養物、又は上記遺伝子組み換え技術により作製した組換え動物由来の試料、例えば細胞、組織、乳汁、血液、尿等から周知の精製方法により得ることができる。その方法には例えば硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー等がある。これらの方法は適宜組み合わせて行ってもよい。好ましくは、アミノ酸配列の情報に基づき、該アミノ酸配列を認識する抗体を作成し、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。また、高速液体クロマトグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。簡便には、ヘパリンを利用した親和性クロマトグラフィーが利用できる。さらに、精製過程において、生理活性(例えば血管新生抑制能)を指標にして、精製の確認を行うこともできる。タンパク質が単離及び/又は精製中に変性した場合、再び活性な立体配座にするために、タンパク再生のための周知の技法を用いることができる。
(抗体)
抗体は、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド、あるいはそれらの抗原決定基を含むペプチドから選択したものを抗原として用いて作製する。抗原は当該ADAMTSファミリータンパク質自体又はその断片でもよく、少なくとも8個、好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも12個、さらに好ましくは15個以上のアミノ酸で構成される。当該ADAMTSファミリータンパク質に免疫特異的な抗体を作製するためには、新規なADAMTSファミリータンパク質に固有な配列からなる領域を用いることが好ましい。このアミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8と相同である必要はなく、タンパク質の立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位がアミノ酸の一次配列上で不連続部位であったとしても当該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は、当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを免疫学的に結合又は認識する限り特に限定されない。この結合又は認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定される。「免疫特異的」とは、先行技術の他の関連タンパク質に対する親和性よりも、当該ADAMTSファミリータンパク質に対する親和性が実質的に大きいことを意味する。
抗体の生産は、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質、その由来物からなるペプチド又はポリペプチドを、アジュバントの存在又は非存在下で、単独又は担体に結合して、動物に対して体液性応答及び/又は細胞性応答等の免疫誘導を行なうことによって行われる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清からの抗体回収法によって取得される。好ましい手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法である。
モノクローナル抗体の生産は、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞(例えば、脾臓又はリンパ節由来)を回収し、自体公知の永久増殖性細胞(例えば、P3−X63−Ag8株等のミエローマ株)への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、上記抗体産生細胞と永久増殖性細胞とから作成されたハイブリドーマをクローン化し、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質を特異的に認識する抗体を産生しているハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。実例としては、ハイブリドーマ法(Kohler,G.and Milstein,C., Nature(1975)256:495−497);トリオーマ法(Kozbor et al., Immunology Today(1983)4:72);及びEBV−ハイブリドーマ法(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss,Inc.,(1985):77−96)に記載されるような種々の技法がある。
一本鎖抗体の産生のために記載された技術(米国特許第4946778号)は、本発明に係るタンパク質に対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。また、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物を包含する他の生物を用いて、哺乳動物における免疫学的反応を誘起する方法によりヒト化抗体を発現させてもよい。
上記抗体は、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質を発現するクローンの単離又は同定、あるいは親和性クロマトグラフィーによる該タンパク質の精製に使用できる。
また、上記抗体を用いて、当該新規なADAMTSファミリータンパク質が関与する疾患の診断及び治療に使用できる。
(スクリーニング及びスクリーニングされた化合物)
かくして調製された新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド及びその相補鎖、これらのアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、又はこれらを用いるタンパク質合成系並びに当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独又は複数手段を組合せることによって、当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドに対する活性阻害剤又は活性賦活剤のスクリーニングに有効な手段を提供する。例えば、ペプチド又はポリペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、タンパク質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を利用した抗体認識物質の選別等を、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施可能である。ADAMTSファミリータンパク質は哺乳動物宿主に広く存在し、多くの生物学的機能に関与しており、多くの疾患にも関わっている。したがって、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質を、その活性を阻害又は促進する作用を有する化合物を見い出すためのスクリーニングに用いることは有用である。
具体的には、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを用いて、スクリーニングの対象とされる化合物とこれらペプチド又はポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条件を選別し、この相互作用の有無を検出することのできるシグナル及び/又はマーカー(第2の成分)を使用する系を導入し、次いで、このシグナル及び/又はマーカーの存在又は不存在又はその変化(量的変化及び/又は質的変化を含む)を検出することにより、当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドの活性を賦活又は阻害する化合物をスクリーニング可能である。例えば、当該ADAMTSファミリータンパク質を用いて、スクリーニングの対象とされる化合物中で小型分子基質及びリガンドの結合を評価してもよい。これらの基質及びリガンドは天然の基質及びリガンドであってもよく、あるいは構造又は機能を模倣したものであってもよい(Coligan et al., Current Protocols in Immunology(1991)1(2):Chapter5参照)。
さらにまた、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質のcDNA、タンパク質及び該タンパク質に対する抗体を用いて、細胞における当該ADAMTSファミリータンパク質のmRNA及びタンパク質の産生に対する添加化合物の影響を調べるためのスクリーニングアッセイを行ってもよい。例えば、当該分野で知られた一般的方法により、モノクローナル及びポリクローナル抗体を用いて、当該ADAMTSファミリー含有タンパク質の分泌又は細胞結合レベルを測定するための酵素免疫固相法(Enzyme Linked Immuno Sorvent Assay)(ELISA)を構築してもよく、また、これを用いて当該ADAMTSファミリータンパク質の産生を阻害又は促進し得る因子を適当に処理された細胞又は組織から見い出すこともできる。スクリーニングアッセイを行なうための一般的方法は当該分野においてよく知られたものである。
スクリーニングの対象とされる化合物としては、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー及び天然産物混合物等が挙げられる。
このようにしてスクリーニングされた化合物は、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドについての活性阻害剤、活性拮抗剤、活性賦活剤の候補化合物として利用可能である。また、遺伝子レベルでの当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物に対する発現阻害剤、発現拮抗剤、発現賦活剤の候補化合物としても利用可能である。それらは、ADAMTSファミリータンパク質に由来する各種症状の予防・治療効果を期待できる。上記スクリーニング方法により選別された候補化合物は、生物学的有用性と毒性とのバランスを考慮してさらに選別することによって、医薬組成物として調製可能である。
(医薬組成物)
本発明において提供される新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド及びその相補鎖、これらの塩基配列を含むベクター、当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを免疫学的に認識する抗体、並びに上記スクリーニング方法により選別された化合物は、当該ADAMTSファミリー含有タンパク質の活性阻害・拮抗・賦活等の機能を利用した治療薬等の医薬手段として使用可能である。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチド又はポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、又は抗体等それぞれに応じた製剤化方法を導入すればよい。
例えば、本発明は、抗体及び/又はT細胞を産生させるに十分な上記新規なADAMTSファミリータンパク質又はその断片を哺乳動物に接種して、哺乳動物における免疫学的反応を誘起する方法による治療にも使用できる。
本発明はさらに、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質をインビボで発現させるための核酸ベクターを送達して、かかる免疫学的応答を誘導し、該動物を疾患から保護する抗体を生じさせることに使用できる。
さらに、本発明は、哺乳動物宿主中に導入された場合、上記新規なADAMTSファミリータンパク質に対する哺乳動物の免疫学的応答を誘導させる免疫学的ワクチン処方(組成物)に使用できる。該組成物は当該新規なADAMTSファミリータンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる。ワクチン処方は、さらに適当な担体を含んでいてもよい。当該ADAMTSファミリータンパク質は胃で分解される可能性があるので、好ましくは非経口投与する。非経口投与としては、例えば皮下筋肉内、静脈、皮内等への注射による投与が挙げられる。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、バッファー、制細菌剤及び処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでいてもよい水性又は非水性滅菌注射用溶液;並びに懸濁剤又は増粘剤を含んでいてもよい水性又は非水性滅菌懸濁液を包含する。処方を1回量又は複数回量として容器に入れて提供してもよく、例えば、密封アンプル及びバイアルに入れて提供してもよく、また使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として保存してもよい。またワクチン処方は、水中油系及び当該分野で知られた他の系のごとき処方の免疫原性を高めるためのアジュバント系を含んでいてもよい。用量は、個々のワクチンの活性に左右され、通常の実験により容易に決定できる。
本発明は、ADAMTSファミリータンパク質の関与する生体機能の解明、例えば、卵の成熟及び排卵・受精のプロセスの解明、癌化のプロセスの解明、血管新生のプロセス解明や血管新生に関連する疾患(血管新生病又は血管新生不全症等)の解明、予防、治療及び診断を可能とする上で非常に有用なものになると期待される。また、本発明は、血管新生が原因となる疾患(いわゆる血管新生病)、例えば固形悪性新生物、眼科的疾患(増殖性糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虹彩ルベオーシス、鎌状赤血球網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、老人性円板状黄斑変性症、その他虚血をきたす眼科疾患)、慢性関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、尋常性乾癬、粥状動脈硬化巣外膜の異常毛細血管網等、また逆に血管新生が不十分である血管新生不全症、例えば虚血性心疾患、下肢の閉塞性動脈硬化症での側副血行路形成不全や、創傷治癒過程での血管新生が不十分なことによる難治性皮膚潰瘍、難治性胃潰瘍、手術後の癒合不全等の治療方法を提供する。さらに、本発明遺伝子の発現が性周期と関連しており、排卵に伴う卵巣の細胞外マトリックスの分解及び再構築に関与することが示唆されたことから、該細胞外マトリックスの分解及び再構築に関連する疾患の解明、防止及び/又は診断・治療にも有用である。すなわち、排卵障害による不妊症の解明、防止及び/又は診断・治療に有用であり、また逆に避妊にも有用である。また、本発明遺伝子が第5染色体短腕15.2−15.3(5p15.2−15.3)に存在することを確認したこと、5p15.2−15.3は5P−症候群(Cri−du−chat syndrome)の欠失部位であることが報告されていることから、本発明遺伝子は5P−症候群の解明、防止及び/又は診断・治療にも有用である。
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその活性が過剰な場合、有効量の上記阻害剤化合物を医薬上許容される担体とともに対象に投与して、当該ADAMTSファミリータンパク質の活性を阻害し、そのことにより異常な症状を改善することもできる。
さらに、発現ブロック法を用いて内在性の上記ADAMTSファミリータンパク質をコードしている遺伝子の発現を阻害してもよい。細胞内で生成した、あるいは別個に投与されたアンチセンス配列を、かかる知られた方法に使用する(例えば、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression ,CRCPress,Boca Raton,FL(1988)中、O’Coccor,J.Neurochem(1991)56:560参照)。別法として、遺伝子とともに三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを用いてもよい(例えば、Lee et al., Nucleic Acids Res(1979)6:3073;Cooney et al., Science(1988)241:456;Dervan et al., Science(1991)251:1360参照)。これらのオリゴヌクレオチドはそれ自体投与することができ、あるいは関連オリゴマーをインビボで発現させることもできる。
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその活性の発現不足に関連する異常な症状の治療には、1つの方法として当該ADAMTSファミリータンパク質自体あるいはこのタンパク質をコードする遺伝子を活性化する治療上有効量の化合物(促進剤)を医薬上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙げられる。別法として、遺伝子治療を用いて、対象中の細胞による当該ADAMTSファミリータンパク質の細胞内での生成を有効ならしめてもよい。例えば、上記のごとく本発明に係るポリヌクレオチドを処理加工して複製欠損レトロウイルスベクターに入れて発現するようにしてもよい。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質をコードしているRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージング細胞中に導入して、今度はパッケージング細胞が目的遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生成するようにしてもよい。インビボでの細胞の処理加工及びインビボでのタンパク質の発現のために、これらのプロデューサー細胞を対象に投与してもよい。遺伝子治療の概説としては、Human Molecular Genetics,T. Strachan and A.P.Read,BIOS Scientific Publishers Ltd(1986)中、第20章、Gene Therapy and other Molecular Genetic−based Therapeutic Approaches(及びその中の引用文献)参照。もう1つの方法は、適当な医薬担体と混合して治療量の上記新規なADAMTSファミリータンパク質を投与することである。
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドあるいは化合物の処方及び投与形態は、適当な医薬担体と組み合わせて処方することが好ましい。かかる処方は、治療上有効量のタンパク質又は化合物、及び医薬上許容される担体又は賦形剤を含む。かかる担体としては、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。処方は投与経路に適したものとすべきであり、当業者によく知られている。さらに本発明は、上記本発明成分の1種又はそれ以上を充填した、1個又はそれ以上の容器を含んでなる医薬パック及びキットにも関する。
本発明に係るタンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド及び化合物は単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身投与の好ましい形態は、注射であり、とりわけ静脈注射である。皮下、筋肉内又は腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。全身投与の別の手段としては、胆汁酸塩又はフシジン酸又は他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜又は経皮投与が挙げられる。さらに、腸溶処方又はカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。これらのタンパク質又は化合物の投与は局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の形態であってもよい。
必要な用量範囲は、ペプチド、投与経路、処方の性質、対象の症状の性質、及び担当医師の判断による。しかしながら、適当な用量は対象の体重1kgあたり0.1ないし100μgの範囲である。しかしながら、種々の使用タンパク質及び化合物、種々の投与経路のさまざまな有効性を考慮すれば、必要な用量はさらに広範囲なものである。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用量が必要である。当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行なうことができる。
遺伝子治療において、治療に使用するタンパク質を対象中において生成させることもできる。例えば、タンパク質をコードしているDNA又はRNAを用いて、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いることによりエクスビボ(exvivo)において対象由来の細胞を処理加工し、次いで、細胞を対象に導入することもできる。
(診断薬及び診断方法)
また本発明からなる新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド及びその相補鎖、並びに当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用可能である。また、これらのうちの1種又はそれ以上を充填した、1個又はそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチド又はポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、又は抗体等それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
診断方法としては、例えば本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドをコードしている核酸との相互作用・反応性を利用して、相応する核酸の存在量、及び/又は当該タンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドについて個体中の生体内分布、及び/又は個体由来の試料中の存在、及び/又は個体由来の試料中の存在量を、自体公知の方法を利用して測定し、それらの存在の有無及び/又は存在量の変化(増加又は減少)により、本発明に係る当該ADAMTSファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドの発現又は活性に関連する疾患の有無及び/又はその変化(増悪又は軽減)を判定できる。すなわち、当該ADAMTSファミリータンパク質及び/又は核酸をマーカーとして検査するのである。その測定法は、自体公知の抗原抗体反応系、酵素反応系、又はPCR反応系等を利用すればよい。
診断用の核酸は、個体由来の試料、例えば細胞、血液、尿、唾液、組織生検又は剖検材料等から得られる。ゲノムDNAを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にPCR若しくはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。RNA又はcDNAを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失及び挿入を検出できる。増幅DNAを標識した上記ADAMTSファミリータンパク質をコードするDNAにハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。RNアーゼ消化により、又は融解温度の差により、完全に対合した配列を誤対合二重らせんから区別できる。DNA配列の相違はまた、変性物質を含有する又は含有しないゲル中のDNA断片の電気泳動における移動度の変化を検出することにより、又は直接的なDNA配列決定により検出できる(例えば、Meyers et al., Sciehce(1985)230:1242参照)。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばRNアーゼ及びS1保護又は化学的切断法によっても明らかにすることができる(例えば、Cotton et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA(1985)85:4397−4401参照)。また、上記ADAMTSファミリータンパク質をコードするDNA又はその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイ(array)を構築して、例えば遺伝学的変異の効果的なスクリーニングを行なうことができる。アレイ法はよく知られており、広い適用範囲を有し、遺伝子発現、遺伝学的連関、及び遺伝学的変異可能性を包含する分子遺伝学における種々の問題を調べるために用いられ得る(例えば、M.Chee et al., Science(1996)274:610参照)。
また、本明細書記載の方法によって上記ADAMTSファミリータンパク質をコードするDNAの変異・減少・増加を検出することにより、細胞・組織の癌化のレベルを診断する方法を提供する。また、本発明遺伝子が5p15.2−15.3に存在することを確認したこと、5p15.2−15.3は5P−症候群(Cri−du−chat syndrome)の欠失部位であることが報告されていることから、本発明に係るDNAの変異・減少・増加を検出することで、5P−症候群の診断方法も提供する。さらに、本発明に係るDNAの変異・減少・増加を検出することで、血管新生が原因となる疾患(いわゆる血管新生病)として固形悪性新生物、眼科的疾患(増殖性糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虹彩ルベオーシス、鎌状赤血球網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、老人性円板状黄斑変性症、その他虚血をきたす眼科疾患)、慢性関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、尋常性乾癬、粥状動脈硬化巣外膜の異常毛細血管網等、また、逆に血管新生が不十分である血管新生不全症として虚血性心疾患、下肢の閉塞性動脈硬化症での側副血行路形成不全や、創傷治癒過程での血管新生が不十分なことによる難治性皮膚潰瘍、難治性胃潰瘍、手術後の癒合不全等の診断方法又はかかる疾病に対する感受性の診断方法を提供する。
さらに、対象由来の試料について上記ADAMTSファミリータンパク質又は当該ADAMTSファミリータンパク質のmRNAレベルを調べることを特徴とする方法によって、細胞・組織の癌化のレベルを診断する方法を提供する。また、本発明遺伝子が5p15.2−15.3に存在することを確認したこと、5p15.2−15.3は5P−症候群(Cri−du−chat syndrome)の欠失部位であることが報告されていることから、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質のmRNAレベルを検出することで、5P−症候群の診断方法を提供する。さらに本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質のmRNAレベルを検出することで、血管新生が原因となる疾患(いわゆる血管新生病)として固形悪性新生物、眼科的疾患(増殖性糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虹彩ルベオーシス、鎌状赤血球網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、老人性円板状黄斑変性症、その他虚血をきたす眼科疾患)、慢性関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、尋常性乾癬、粥状動脈硬化巣外膜の異常毛細血管網等、また、逆に血管新生が不十分である血管新生不全症として虚血性心疾患、下肢の閉塞性動脈硬化症での側副血行路形成不全や、創傷治癒過程での血管新生が不十分なことによる難治性皮膚潰瘍、難治性胃潰瘍、手術後の癒合不全等を診断することができる。また、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質のmRNAのレベルを検出することで、細胞・組織の癌化のレベルを診断する方法を提供する。
本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質をコードするDNAの発現の増加又は低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野では周知方法の任意の方法、例えば増幅、PCR、RTPCR、RNアーゼ保護、ノーザンブロッティング及びその他のハイブリダイゼーション法を用いてRNAレベルで測定できる。また、試料中の当該ADAMTSファミリータンパク質レベルを決定するために用いることができるアッセイ法は当業者に周知である。このようなアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析及びELISAアッセイ等がある。
本発明に係るポリヌクレオチドの染色体の同定(染色体アッセイ)にも価値がある。該ポリヌクレオチドの配列は、個々のヒト・染色体上の特定の位置を標的とし、これにハイブリダイゼーションし得る。本発明による重要な配列の染色体へのマッピングは、それらの配列を遺伝子関連疾病と関連づける重要な第1工程である。配列を正確な染色体位置にマッピングしたならば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデータと関連づけることができる。かかるデータは、例えば、V.McKusick,Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで利用できる)に見いだされる。次いで、連関(物理的に近接した遺伝子の同時遺伝)の分析により、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との関係を同定する。罹病個体と未罹病個体との間のcDNA又はゲノム配列の相違も調べることができる。罹病個体のいくつか又は全部において変異が観察されるが正常個体においては観察されない場合、その変異は疾病の原因である可能性がある。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
実施例1
(ヒト脳由来cDNAライブラリーの構築と遺伝子の分取)
市販ヒト脳、胎児脳、及び脳海馬由来のpolyA+RNA(クロンテック社製:カタログNo.6516−1、6525−1、及び6578−1)を出発原料として常法によりcDNAライブラリーを構築し、dbEST(database of Expressed Sequence Tags)分析によりcDNA断片を単離して塩基配列を決定し、本発明に係る新規なADAMTSファミリータンパク質をコードする塩基配列を担持するDNAを得た。
具体的には、小原らの方法(DNA Research(1997)4:53)に従って調製した上記ヒト脳由来のcDNAライブラリーから、約50,000個の組換え体をランダムに選択し、このうち約30,000個のクローンのcDNAについて、その5′末端及び3′末端の塩基配列を決定した。さらに約1,100個を主にインビトロの転写翻訳実験によって選択し、それらのcDNAの塩基配列を小原らの方法(同上)に従って決定した。全塩基配列の決定を行ったcDNAクローンについて、コンピュータプログラムを用いた汎用解析方法によってタンパク質コード領域(ORF)を予想し、この領域についてPfam HMM Search(HMMPFAM)によりドメイン検索を行い、TSP1ドメイン(TSP1)を有するcDNAを同定した。
この様にして本発明者は、TSP1を担持する配列表の配列番号1に記載した推定アミノ酸配列(全アミノ酸数1021個)からなる新規なADAMTSファミリータンパク質をコードするcDNA(配列表の配列番号2)を有するクローンPJ01256(ヒト脳由来cDNAクローンPJ01256)を得た。なお、配列は、UPAC−IUB Commision on Biochemical Nomenclatureによる略号或いは当該技術分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体が有り得る場合は、特に明示しない限りL体を示すものとする。
実施例2
(ヒトPJ01256全長cDNA取得)
ヒトPJ01256の全長アミノ酸コード領域を有するcDNA(以下、ヒトPJ01256全長cDNA)は、配列番号2に記載したヒト脳由来cDNAクローンPJ01256の塩基配列から特異的に作製したプライマーあるいはプローブを用いて、5′RACE(Rapid amplification of cDNA end)法あるいはライブラリスクリーニング法等を行なうことで取得できる。ここでは、5′RACE法によるヒトPJ01256全長cDNAの取得を記述する。
(1)まず、ヒト脳由来cDNAクローンPJ01256特異的に合成したmRNAに対しアンチセンス方向の2本のプライマー(例えば以下のPJ−A01・PJ−A03等)と、鋳型cDNAに連結させたアダプター配列特異的な2本のプライマー(例えば以下のAP1・AP2等)を組み合わせて用い、一般的に行われているように2回のPCRを行なう。
鋳型cDNAには、例えば市販の「Marathon−ReadyTM cDNA Human Ovary;既知配列のアダプターが連結されたヒト卵巣由来二本鎖cDNA、Clontech社製」等を用いることが可能である。あるいはmRNAから、二本鎖cDNAを合成し、任意の配列からなるアダプターを連結したものも、鋳型cDNAとして使用できる。
5′RACE法で用いる耐熱性酵素は、例えば「KOD PLUS、東洋紡製」等を利用できる。「KOD PLUS」及び「Marathon−ReadyTM cDNA Human Ovary」を用いた場合の第一次及び第二次PCRの条件を以下に記述する。
5′RACE産物は、例えば「Zero BluntTM TOPOTM PCRCloning Kit、Invitrogen社製」等を用いて、プラスミドベクター(「Zero BluntTM TOPOTM PCR Cloning Kit」の場合にはpCRTM−BluntII−TOPO)に連結し、大腸菌コンピテントセルに形質導入することで、5′RACE産物を含むプラスミドベクターを有する大腸菌形質転換体としてクローン化できる。5′RACE産物を分子量で分画する場合には、アガロース電気泳動後、DNAのバンドをゲルから切り出し、例えば「QIA Quick Gel Extraction Kit、QIAGEN社製」等を用いて回収することで分画し、上記の方法で同様にクローン化できる。
クローン化した5′RACE産物は、使用したプラスミドベクターに適応した抗生物質(pCRTM−BluntII−TOPOの場合には、「硫酸カナマイシン、ナカライテスク社製等」)を含む大腸菌生育培地(例えばTerrific Broth等)で大腸菌形質転換体を培養し、プラスミドを、例えば「QIAprepTM Spin Miniprep Kit、QIAGEN社製」等で抽出することで得られる。
5′RACE産物の塩基配列データは、鋳型として抽出したプラスミド、使用したプラスミドベクターに適応したプライマー(pCRTM−BluntII−TOPOの場合には、SP6プライマー、T7プライマー等)、必要に応じてPJ01256特異的プライマー(PJ−A01等)を用い、「BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit、PE Biosystems社製」等にて調製したサンプルを、電気泳動式塩基配列解析装置(サンプル調製に「BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit」を用いた場合には「ABI PRISMTM 310 ジェネティックアナライザ、PE Biosystems社製」等)で解析することにより得られる。得られた塩基配列データを、シーケンスアセンブリングソフト(例えば「Sequencher3.1、Gene Codes社製」)等を用いて連結することで、クローンごとの塩基配列が得られる。
ヒトPJ01256全長cDNAの塩基配列は、上記5′RACE産物のクローンごとの塩基配列と実施例1に記載したヒト脳由来cDNAクローンPJ01256の塩基配列(配列番号2)を、互いのオーバーラップを5′RACEに使用したプライマー以外の部分で確認した後、連結することで得られる。
(2)ヒトPJ01256全アミノ酸コード領域の塩基配列を明らかにするため、ヒト脳由来cDNAクローンPJ01256塩基配列(配列番号2)特異的に合成した上記プライマー(AP1、AP2、PJ−A01、及びPJ−A03)を用いて5′RACE法を行なった。
5′RACEの鋳型cDNAには、市販の「Marathon−ReadyTM cDNA Human Ovary;既知配列のアダプターが連結されたヒト卵巣由来二本鎖cDNA、クロンテック社製、Code No.7417−1」を用いた。PCR用耐熱性酵素には「KOD PLUS、東洋紡製」を用い、以下の条件で第一次PCRを行なった。
第一次PCR反応液組成は、上記のものと同一である。
第一次PCR反応終了後、脱塩及び脱プライマーするため、反応液を「Suprec−02、宝酒造製」を用いて精製した。精製したPCR産物は100μl(50μl×2回)のTE緩衝液で回収し、以下の第二次PCRの鋳型として用いた。
第二次PCR反応液組成は、上記のものと同一である。
5′RACE産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結し、大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。得られた5′RACE産物の塩基配列から、上記と同様に、特異的プライマーを作製して5′RACE法を繰り返すことにより、ヒトPJ01256全長cDNA塩基配列(配列番号3)を得た。
ヒトPJ01256全長cDNA塩基配列(配列番号3)は、総塩基数がポリA(polyA)配列を除いて5,610であり、3,672塩基からなるアミノ酸コード領域(配列番号3の770−4,441番目)を有していた。該領域にコードされるアミノ酸配列を配列番号4に示す。また、5′非翻訳領域上にアミノ酸コード領域と同一フレーム上の終止コドンが2箇所(配列番号3の206−208番目;TAG、275−277番目;TGA)、3′非翻訳領域上にポリA付加シグナルが1箇所(配列番号3の5,586−5,591番目;AATAAA)存在した。
Marathon−ReadyTM cDNA Human Ovaryを鋳型として、アミノ酸コード領域を再度クローニングしたところ、2つの対立遺伝子がそれぞれ得られ、両者の比較で3箇所のSNPsが確認された(表1のSNPs 1〜3)。そのうち2つのSNPsはアミノ酸置換を伴っていた(表1のSNPs 2及び3)。また、ヒト脳由来PJ01256cDNAクローン(配列番号2)との比較では2箇所のSNPsが確認され(表1のSNPs 4及び5)、うち1つのSNPsはアミノ酸置換を伴っていた(表1のSNPs 4)。
実施例3
(ヒトPJ01256遺伝子発現ベクター作製)
ヒトPJ01256のC末端にMycHisタグ配列が融合されたものを発現する哺乳動物細胞用発現ベクターの作製は、以下のような操作で行なうことができる。
まず、ヒトPJ01256の終始コドンを除く全アミノ酸コード領域の両端にアニーリングするPCRプライマーペアを設計する。上流側プライマーには、ヒトPJ01256cDNAの開始コドン(ATG)の5′上流側に発現用ベクター(例えば、Invitrogen社製pcDNA3.1(−)/MycHisA)のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素部位(例えば、NheIあるいはNotI等)を付加して設計し、下流側プライマーにはヒトPJ01256cDNAがコードするC末端アミノ酸(ロイシン)コドンの下流に、同じく発現ベクターのマルチクローニングサイトに存在する制限酵素部位(例えばHindIIIあるいはKpnI等)を付加して設計する。なお、選択する制限酵素は可能なかぎりヒトPJ01256cDNAの全アミノ酸コード領域に認識部位が存在しない制限酵素を用いる。また制限酵素を用いたDNA断片の挿入により生じるアミノ酸フレームのずれを考慮してプライマーを設計する。例えばpcDNA3.1(−)/MycHisAの場合には、下流側に設定する制限酵素は、発現ベクターと連結した際にMycHis領域とフレームが合うよう塩基の数を調整して設計する。以上のように設計したプライマーを用い、ヒトPJ01256cDNA断片を含むプラスミドを鋳型として、耐熱性DNAポリメラーゼKOD PLUS(東洋紡)等でPCR反応を行ない、発現ベクターに挿入可能な制限酵素部位を有する全長cDNA断片を取得できる。
適当な哺乳動物細胞発現用ベクター(例えば、pcDNA3.1(−)/MycHisA、Invitrogen社製)及び増幅した全長ヒトPJ01256cDNAを、プライマーに付加した制限酵素で消化した後、アガロースゲル電気泳動し、それぞれ目的のDNA断片を、例えばQIA Quick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)等を用いてアガロースゲル中から回収する。ゲル中から回収した全長ヒトPJ01256cDNA及びpcDNA3.1(−)/MycHisA断片は、例えばReady−To−Go T4 DNA ligase(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)を用いて連結できる。連結したプラスミドを大腸菌コンピテントセル(例えば、DH5αコンピテント細胞、東洋紡製)に導入し、形質転換体を得る。得られた大腸菌形質転換体は、用いた発現ベクターの選択マーカー(例えばアンピシリン等)を含むTerrific Broth培地等で培養し、当該DNAを含むプラスミドをQIAprepTM Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製)等の市販のDNA抽出キットで精製できる。
作製したプラスミドのDNA塩基配列は以下のようにして確認できる。発現ベクター由来の配列から設計したプライマー(例えば、pcDNA3.1(−)/MycHisAを用いた場合には、pcDNA−S1:CACTGCTTACTGGCTTATCG及びpcDNA−A1:ACTAGAAGGCACAGTCGAGG等のプライマー)と、ヒトPJ01256cDNA配列上で約300bp程度ごとに適当なプライマーを設計し、例えば、「BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit」(PE Biosystems社製)等の塩基配列決定用サンプル調製試薬を用いて、抽出したプラスミドの塩基配列決定用サンプルを調製する。サンプル調製に「BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit」を用いた場合には、キャピラリー電気泳動式塩基配列解析装置ABI PRISMTM 310ジェネティックアナライザ(PE Biosystems社製)等で解析する。得られた塩基配列データは、例えばSequencher3.1(Gene Codes社製)等のシーケンスアセンブリングソフトを用いて1本に連結し、作製したプラスミドのDNA塩基配列を得る。
このようにして得られたプラスミドのDNA塩基配列から目的の塩基配列を有するプラスミドを選択して、ヒトPJ01256発現ベクターを作製できる。
実施例4
(ヒトPJ01256遺伝子発現ベクター作製)
ヒト全長PJ01256のC末端にHisタグ配列を融合発現する哺乳動物細胞用発現ベクターを作製するため、以下のプライマーを合成した(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社に発注)。
なお、BHPJ−S01は、制限酵素消化のためのスペーサー(4塩基;GAAA)、制限酵素BamHIの認識配列(6塩基;GGATCC)、ヒトPJ01256cDNAへのアニーリング配列(20塩基;CGGAGCGCTCCTGGATGAAG:配列番号3の756−775番目に完全一致)から成る。また、HDPJ−A01は、制限酵素消化のためのスペーサー(4塩基;GAAA)、制限酵素HindIIIの認識配列6塩基AAGCTT)、ヒトPJ01256cDNAへのアニーリング配列(20塩基;CAAGTTGGACTTAGAGCAAG:配列番号3の4,422−4,441番目の相補鎖に完全一致)から成る。
BHPJ−S01及びHDPJ−A01をプライマーとして用い、PCR法によってヒトPJ01256全アミノ酸コード領域の増幅を試みた。鋳型cDNAは、市販の「Marathon −ReadyTM cDNA Human Ovary;既知配列のアダプターが連結されたヒト卵巣由来二本鎖cDNA、Clontech社製、CodeNo.7417−1」を用いた。PCR用耐熱性酵素には「KOD PLUS、東洋紡製」を用い、以下の条件でPCRを行なった。
得られた約3.7KbpのPCR産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結して大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し、塩基配列を決定した。その結果、約3.7KbpのPCR産物は目的のPCR産物(スペーサー−BamHI認識配列−配列番号3の756〜4,441−HindIII認識配列−スペーサー)であった。
哺乳動物細胞発現用ベクターはpCMH01(図1のA;市販の「pcDNA3.1(−)/MycHisA、Invitrogen社製」のBGHポリA配列をチミジンキナーゼ(TK)ポリA配列に置換したもの)を用いた。すなわち、pcDNA3.1(−)/MycHisAの、BGHポリA配列(http://www.invitrogen.Com/vecseq gcg/pcdna3.1mychisa−.seqに提示されている塩基配列の1,116〜1,343番目)は、その両側に認識サイトを有する制限酵素AflII(認識サイト;CTTAAG、同配列の1,090〜1,095番目)及びPvuII(認識サイト;CAGCTG;同配列の1,363〜1,368番目)で消化することで除いた。TKポリA配列は「pREP10、Invitrogen社製」を鋳型として、プライマーペア(GAAACTTAAGGGGAGATGGGGGAGGCTAAC及びGGCCCACCAGACCCCACGCAAC)でPCR法により増幅したものをAflIIで消化することで調製した。BGHポリA配列を除いたpcDNA3.1(−)/MycHisA及びTKポリA配列は、常法に従い連結した後、大腸菌形質転換体としてクローン化し、プラスミドを抽出して塩基配列を確認した。
得られたヒトPJ01256cDNAクローン及び哺乳動物細胞発現用ベクターpCMH01は、BamHI及びHindIIIで消化し、常法に従い連結した。作製したプラスミドpCMH01−PJ01256は大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出して塩基配列を決定し、ヒトPJ01256cDNA下流にMycHisタグ配列が同一フレームで連結されたことを確認した(図1のB)。
実施例5
(ヒトPJ01256の哺乳動物細胞での発現)
ヒトPJ01256の哺乳動物細胞での発現を確認するため、実施例4で作製した哺乳動物細胞用発現ベクターpCMH01−PJ01256を用いて、以下の検討を行った。
φ10cm組織培養用ディッシュ「Falcon 3001、ベクトン・ディッキンソン社製」上に約50%コンフレント(confluent)に付着生育させたCOS7細胞に対し、1ディッシュあたり10μgのpCMH01−PJ01256を遺伝子導入した。対照としては1ディッシュあたり10μgのpCMH01を用いた。遺伝子導入は市販の「LipofectAMINE PLUS、Lifetechnologies社製」を用い、添付プロトコルに従って行った。
遺伝子導入48時間後、細胞を回収し、100μlの細胞溶解液(20mM Tris−HCl pH7.4、10% グリセロール、1% Triton X−100、0.1% SDS)で溶解させた。100μlのSDS電気泳動用緩衝液(100mM Tris−HCl pH6.8、20% グリセロール、12% 2−メルカプトエタノール、4% SDS、ブロモフェノールブルーで着色)を加えた後、100℃で2分間加熱したものをサンプルとして、ウェスタンブロッティング解析を行った。各サンプル0.2mlのうち30μlをSDS−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。SDS−ポリアクリルアミド電気泳動は、市販の「マルチゲル4/20、第一化学薬品社製」を「カセット電気泳動槽「第一」DPE−120」にセットし、40mA定電流で1時間行った。泳動用緩衝液は、「Tris−Glycine−SDS・Powder、宝酒造製」を用い、分子量マーカーは、「6×His Protein Ladder、QIAGEN社製」を用いた。泳動終了後、「ミニトランスブロット、BIO−RAD社製」を用いて、エレクトロトランスファー(Electro Transfer)によりPVDFメンブレン「TEFCO社製、Code.No.03−056」にブロッティングした。エレクトロトランスファーは、「Tris−Glycine Powder、宝酒造製」にメタノールを20%添加した緩衝液中で、150mA定電流で1.5時間行った。ブロッティングしたPVDFメンブレンは、「Penta His Antibody HRP Conjugate、QIAGEN社製」を用い、添付されていたプロトコルに従って抗体反応を行った。抗体にラベルされたホースラディシュ・パーオキシダーゼ(Horseradish peroxidase)の検出には「ECL Plus、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製」を用い、添付されていた標準プロトコルに従って行った。結果を図2に示した。
図2に示したように、pCMH01−PJ01256を導入したCOS7細胞では分子量100kDa以上のタンパク質のシグナル(図2の矢印)が確認された。対照としたpCMH01では該当するシグナルは検出されなかった。以上の検討より、ヒトPJ01256タンパク質の発現が哺乳動物細胞系で確認された。
実施例6
(ヒトPJ01256の発現組織解析)
(1)ヒトPJ01256遺伝子の発現組織を解析するため、下記のPCRプライマーを合成した。下記プライマーの組み合わせを用いてPCRにより、505bpのヒトPJ01256cDNA断片が増幅された。
次に24種のヒト臓器のmRNAに由来するcDNAを4種の濃度で96ウェルプレート中に調製した「ヒトRAPID−SCANTM GENE EXPRESSION PANEL」(OriGene Technologies,Inc.)を鋳型として、下記の酵素溶液(25μl/ウエル)を添加し、ミネラルオイルを適量(約25μL)重層した。
ミネラルオイルを重層後、プレートをプラスティックカバーシートで被い、15分間静置後、サーマルサイクラー(PCR Thermal Cycler MP:宝酒造)にセットし、以下のPCR運転プログラムで反応させた。
PCR反応終了後、PCR産物5μLを1μLの10×泳動用緩衝液(宝酒造の制限酵素に添付)と混合し、Mupid電気泳動槽(コスモバイオ)にセットした2%アガロースゲル(SeaKem GTG agarose:FMC BioProducts)に供し、トリス−ホウ酸緩衝液(宝酒造製)下、100Vの定電圧で約45分間泳動した。泳動後、500ng/mLの臭化エチジウム溶液で染色し、紫外線照射下で泳動像を観察した。その結果を図3に示す。
図3に示した結果から、ヒトPJ01256遺伝子は、特に卵巣で発現が高く、ついで腎臓、肺、胃、精巣、副腎、膵臓で、発現量が高かった。脳、小腸、骨格筋、皮膚で中程度に発現しており、心臓、大腸、胎盤、前立腺では弱い発現が観察された。脾臓、肝臓、唾液腺、甲状腺、子宮、白血球、骨髄では、ほとんど発現が観察されなかった。また、胎児組織については、脳で中程度に発現しており、肝臓では弱い発現が観察された。
(2)さらに、ノーザンハイブリダイゼーションにより、ヒトPJ01256遺伝子の発現組織分布及びmRNAの解析を行った。プローブは、ヒトPJ01256cDNAのKpnI/StuI消化断片(663bp)をアガロースゲル電気泳動法により分離・精製したものを用いた。プローブDNAのラベリングは、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製の「DNA Labelling Beads(−dCTP)、Cat.No.27−9240−01」と、「32P−dCTP、Cat.No.PB10205」を用いて行った。DNAに取り込まれなかった32P−dCTPの除去は、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製の「Probe QuantTM G−50 Micro Columns、Cat.No.27−5335−01」により行った。各種組織由来mRNAをブロットしたフィルターは、クロンテック社より購入したHuman MTN Blot(Cat.No.7760−1)、Human MTN BlotII(Cat.No.7759−1)、Human MTN BlotIII(Cat.No.7767−1)を用い、ハイブリダイゼーションの条件はクロンテック社のプロトコールに従って行った(図4)。
図4のA.に示した結果から、ヒトPJ01256遺伝子は卵巣において特異的に発現しており、次いで腎臓及び膵臓で弱く発現していることが示された。またmRNAの大きさは約5.5Kbで、全長cDNAの大きさと一致しており、明瞭なスプライシングバリアントは検出されなかった。また、5′末端側のDNA断片(SacII/SalI断片、746bp)をプローブとして用いた場合も上記と同様の結果が得られた。さらに長期間の露光により得られた結果(図4のB.)から、脳、肝臓、精巣、小腸、胃、副腎の各組織においてもわずかに発現していることが示された。また、図4のC.には、ノーザン解析の内部コントロールであるアクチン遺伝子のブロットの結果を示した。
実施例7
(ヒトPJ01256遺伝子のがん組織における発現解析)
PJ01256遺伝子と病態との関与を解析することを目的として、ヒトの腫瘍組織における発現量と正常組織における発現量とを比較検討した。PCR増幅用のプライマーとしては、実施例6で用いたPJ−S09(センスプライマー)及びPJ−A12(アンチセンスプライマー)を使用した。このプライマーセットによりPCRで505bpのヒトPJ01256cDNA断片が増幅された。コントロール遺伝子としてはグリセルアルデヒド 3−リン酸脱水素酵素(Glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase)(G3PDH)を用い、PCR増幅用のプライマーとしては、市販のプライマーセット(クロンテック社製,Code.No.5405−1)を用いた。このプライマーセットによりPCRで452bpのG3PDH cDNA断片が増幅された。
ヒト腫瘍組織及び正常組織(卵巣、脳、及び副腎)由来cDNAは、BioChain Institute(Hayward,CA,USA)より購入した、「Human Adult Tumor Ovary cDNA(Adenocarcinoma)、Code.No.0540016、Lot.No.A301017」及び「Human Adult Normal Ovary cDNA、Code.No.0510037、Lot.No.A303212」、「Human Brain Tumor cDNA(Meningioma)、Code.No.0540004、Lot.No.A304007」及び「Human Adult Normal Brain cDNA、Code.No.0510005、Lot.No.A301089」、「Human Adult Tumor Adrenal cDNA(Adenocarcinoma)、Code.No.0540001、Lot.No.A212030」及び「Human Adult Normal Adrenal cDNA、Code.No.0510001、Lot.No.A206095」を用いた。それぞれのcDNA原液をTE溶液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA,pH8.0)で10倍希釈した後に、さらに1/2倍希釈操作を順次7回繰り返して、濃度が1倍、1/2倍、(1/2)2倍、(1/2)3倍、(1/2)4倍、(1/2)5倍、(1/2)6倍、(1/2)7倍の希釈系列を作製し、各溶液5μlを鋳型cDNAとした。PCR反応は、宝酒造の「TaKaRa Ex TaqTM、CodeNo.RR001A」を用いて下記の条件で行った。
PCRチューブに各cDNA溶液を分注し、上記の酵素/プライマー溶液を添加後、サーマルサイクラー(PCR Thermal Cycler MP:宝酒造製)にセットし、以下のPCR運転プログラムで反応させた。
PCR反応終了後、PCR産物10μLを1μLの10×泳動用緩衝液(宝酒造の制限酵素に添付)と混合し、Mupid電気泳動槽(コスモバイオ:東京)にセットした2%アガロースゲル(SeaKem GTG agarose:FMC BioProducts, Rockland,ME,USA)に供し、トリス−ホウ酸緩衝液(宝酒造製)下、100Vの定電圧で約45分間泳動した。泳動後、アガロースゲルを500ng/mLの臭化エチジウム溶液で染色し、紫外線照射下で泳動像を観察してPJ01256遺伝子及びG3PDH遺伝子の発現量をPCR産物の濃度として可視的に判定した。その結果を図5(卵巣)、図6(脳)及び図7(副腎)に示す。
その結果、図5、6、及び7に示したように、いずれの組織においてもG3PDH遺伝子の発現量は、正常組織と腫瘍組織においてほぼ同じ発現量であるのに対し、腫瘍組織ではPJ01256遺伝子の発現量が著しく低下(約1/32〜1/64)していることが示された。この結果から、ヒトPJ01256遺伝子が卵巣、脳、副腎における腫瘍に関連する遺伝子であることが示唆された。
実施例8
(PJ01256マウスカウンターパートの取得)
PJ01256のマウスカウンターパートを取得するため、ヒトPJ01256cDNAのアミノ酸コード領域をクエリーとして公共データベースを検索したところ、2つのマウスゲノムDNA配列〔genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)のID AZ093080及びAZ119800〕がヒットした。AZ093080の塩基配列の146〜242番目及びAZ119800の塩基配列の418〜478番目が、それぞれヒトPJ01256全長cDNA配列(配列番号3)の2,373〜2,470番目及び2,621〜2,680番目に高い相同性を示した。両マウス配列の相同性の高かった部分から下記のプライマーを作製し、以下の検討に使用した。
マウスcDNA断片取得のため、市販の「Marathon−ReadyTM cDNA Mouse Testis;既知配列のアダプターが連結されたマウス精巣由来二本鎖cDNA、クロンテック社製、CodeNo.7455−1」を鋳型として、以下の条件でPCRを行なった。PCR用耐熱性酵素には「KOD Dash、東洋紡製」を用いた。
その結果、約230bpのPCR産物が得られた。PCR産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結し、大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。
塩基配列決定の結果、得られたPCR産物は233bpであり、ヒトPJ01256全長cDNA配列(配列番号3)の2,409〜2,641番目に対してDNAレベルで83.7%(195/233)、同部分の推定アミノ酸配列で93.5%(72/77)の相同性を有していた。
引き続き同一鋳型cDNAを用いて5′RACE法を行った。PCR用耐熱性酵素には「KOD PLUS、東洋紡製」を用い、以下の条件で第一次PCRを行なった。
第一次PCR反応終了後、脱塩及び脱プライマーするため、反応液を「Suprec−02、宝酒造製」を用いて精製した。精製したPCR産物は100μl(50μl×2回)のTE緩衝液で回収し、以下の第二次PCRの鋳型として用いた。
5′RACE増幅産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結し、大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。
5′RACE産物の塩基配列は、先のマウスPJ01256部分cDNA塩基配列とのオーバーラップを確認した後、連結した。その結果、得られたマウスPJ01256部分cDNA塩基配列(配列番号5)は422bpであり、ヒトPJ01256全長cDNA配列(配列番号3)の2,220〜2,641番目に対してDNAレベルで85.3%(360/422)の相同性を有していた。また、マウスPJ01256部分cDNA推定アミノ酸配列(配列番号6)は140残基であり、ヒトPJ01256全長cDNA推定アミノ酸配列(配列番号4)の485〜624番目に95.0%(133/140)の相同性を有していた(図8)。
実施例9
(ヒトPJ01256のホモロジー検索)
ヒト脳由来PJ01256cDNAクローンのアミノ酸配列(配列番号1)を既知配列に対して解析プログラム(BLAST2.0)(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),”Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res.25:3389−3402.)を用いて検索したところ、表2(ヒトPJ01256のアミノ酸配列を既知配列に対して解析プログラムBLAST2.0を用いて検索した結果で、E−valueがe−40以下のもの)に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。さらに、ヒトPJ01256全長アミノ酸配列(配列番号4)を既知配列に対して解析プログラム(BLAST2.1)(同上)を用いて検索したところ、表3(ヒトPJ01256の全長アミノ酸配列を既知配列に対して解析プログラムBLAST2.1を用いて検索した結果で、E−valueがe−140以下のもの)に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。ヒトPJ01256はADAMTSファミリーと相同性を有するクローンであることが判明した。
実施例10
(ヒトPJ01256の解析)
ヒトPJ01256全長アミノ酸配列(配列番号4)をクエリーとし、検索ツールPfam HMM Search(HMMPFAM)(Sonnhammer EL,Eddy SR,Birney E,Bateman A,Durbin Pfam:multiple sequence alignments and HMM−profiles of protein domains. Nucleic Acids Res.(1998)Jan1;26(1):320−322)を用いて検索した。HMMPFAMのアルゴリズムにはHMMER2.1(http://hmmer.wustl.edu/)を、データベースにはPFAM6.0(http://pfam.wustl.edu/)を用いた。その結果、ヒトPJ01256はTSP1ドメイン(tsp 1)、及びレプロリシン型亜鉛メタロプロテアーゼドメイン及びレプロリシンファミリーペプチド(Pep M12Bpropep)を有することが判明した(表4)。
実施例11
(マウスPJ01256カウンターパートのホモロジー検索)
マウスPJ01256のアミノ酸配列を既知配列に対して解析プログラム(BLAST2.1)(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),”Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of protein database search programs”,Nucleic Acids Res. 25:3389−3402.)(ftp://ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nr 2001年2月23日更新分)を用いて検索したところ、表5に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。マウスPJ01256はADAMTSファミリーと相同性を有するクローンであることが判明した。
実施例12
(マウスPJ01256カウンターパートの解析)
マウスPJ01256のアミノ酸配列をクエリーとし、HMMPFAM(HMMER2.1、PFAM6.0)(http://hmmer.wustl.edu/)(http://pfam.wustl.edu/を用いて実施例10と同様に検索した。その結果、マウスPJ01256はTSP1ドメイン(tsp 1)を有することが判明した(表6)。
実施例13
(ヒト及びマウスPJ01256とADAMTSファミリーのアライメント)
Clustalw1.81(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.and Gibson,T.J.(1994)CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressivemultiple sequence Alignment through sequence weighting,positions−specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research,22:4673−4680.)を用いてヒト及びマウスPJ01256と既知のADAMTSファミリーとのアミノ酸配列のアライメントを行なった(表7〜表31)。表7〜表31は、ヒト及びマウスPJ01256と既知のADAMTSファミリー遺伝子のアミノ酸配列を、N末端側からC末端側までアライメントした一連の表である。表中、「*」はその位置で全ての配列で完全に保存されていることを意味する。また、「:」はその位置で、{STA}、{NEQK}、{NHQK}、{NDBQ}、{QHRK}、{MILV}、{MILF}、{HY}、{FYW}のようなグループのうちのいずれかが保存されている事を意味する。さらに、「.」はその位置で{CSA}、{ATV}、{SAG}、{STNK}、{STPA}、{SGND}、{SNDEQK}{NDEQHK}、{NEQHRK}のようなグループのうちのいずれかが保存されている事を意味する。ADAMTSファミリーは、TSP1ドメイン、zinc metalloproteaseドメイン及びCystein−richregion(disintegrin−like)からなることが知られており(M.D.Tortorella,et al., Science(1999)284:1664−1666;F.Vazquez et al, J.Biol.Chem.(1999)274:23349−23357)、アライメントの結果から、303から376番目のアミノ酸(太字、#で印をつけた部分)はディスインテグリン様領域(disintegrin−like region)であることが判明した。この結果得られたドメインと実施例10又は実施例12にて同定したドメインを、ヒトPJ01256については表32に、マウスPJ01256については表33にまとめた。
実施例14
(解析プログラムによる解析)
実施例10及び実施例13でヒトPJ01256について同定したドメインのアミノ酸配列(表34:検索したドメインとクエリーに用いた配列)を既知配列に対して解析プログラム(BLAST2.1)を用いて検索したところ、表35(検索したクエリーに対してヒットした既知配列:最も相同性の高いもの)に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。また、実施例12及び実施例13でマウスPJ01256について同定したドメインのアミノ酸配列(表36)について同様に検索を行ったところ、表37に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。
実施例15
(PJ01256マウスカウンターパートの取得)
実施例8で得たPJ01256マウスカウンターパートは部分cDNAであったため、引き続きPJ01256のマウスカウンターパート取得を試みた。その際、後述する実施例17に示したようにマウスPJ01256の発現量が高かった発情期マウス卵巣より「TRIZOL登録商標 Regent Invitrogen社製」を用いて抽出したRNAを鋳型としてRT−PCRを行なった。
RT反応は、「TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)Ver1.1;宝酒造製」を用い下記の条件で行なった。
PCR反応は、ヒトPJ01256特異的プライマーPJ−S02(下記参照)と前述のマウスPJ01256特異的プライマーmPJ−A03を用い、「KOD Dash、東洋紡製」にて下記の条件で行なった。
その結果、約550bpのPCR産物が得られた。PCR産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結し、大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。
塩基配列決定の結果、得られたPCR産物はヒト特異的プライマーであるPJ−S02の20bpを除いて525bpであった。マウスPJ01256部分cDNA塩基配列(配列番号7)は、ヒトPJ01256全長cDNA配列(配列番号3)の2,117−2,641番目に対してDNAレベルで84.7%(445/525)一致していた。また、コードされる推定アミノ酸配列(配列番号8)は175残基であり、ヒトPJ01256全長cDNA推定アミノ酸配列(配列番号4)の450−624番目に94.8%(166/175)一致していた(図9)。
実施例16
(マウスPJ01256遺伝子の発現組織解析)
(1)マウスPJ01256遺伝子の発現組織を解析するため、下記のPCRプライマーを合成した。下記プライマーの組み合わせで、412bpのマウスPJ01256cDNA断片が増幅される。
24種のマウス臓器由来mRNAよりcDNAを調製した「マウスRAPID−SCANTM GENE EXPRESSION PANEL、OriGene Technologies社製」を鋳型として、下記の条件でPCRを行なった。
PCR産物を電気泳動し、臭化エチジウムで染色した後、紫外光照射下で画像を取り込み、各バンド濃度を比較した(図10)。
図10に示した結果から、マウスPJ01256遺伝子は、腎臓、精巣、卵巣、子宮で発現が高く、脳、脾臓、胃、皮膚で弱い発現が観察された。脳では、サイズの異なるバンドが観察され、スプライシングバリアントの存在が示唆される。また、9.5日、12.5日、19日の胎児で発現が観察され、発生にしたがって発現量が増加していた。このことより、PJ01256は発生に関与していることが示唆された。
(2)さらに、ノーザンハイブリダイゼーションにより、マウスPJ01256遺伝子のmRNA解析を行った。プローブは、アガロースゲル電気泳動法により分離・精製したマウスPJ01256cDNAの部分断片(422bp、配列番号5)を用いた。プローブDNAのラベリングは、アマシャム ファルマシア バイオテク社の「DNA Labelling Beads(−dCTP)、Cat.No.27−9240−01」と、「32P−dCTP、Cat.No.PB10205」を用いて行った。DNAに取り込まれなかった32P−dCTPの除去は、アマシャム ファルマシア バイオテク社の「Probe QuantTM G−50 Micro Columns、Cat.No.27−5335−01」により行った。マウス胎児由来mRNAをブロットしたフィルターは、クローンテック社より購入したMouse Embryo MTN Blot(Cat.No.7763−1,Lot.0120805)を用い、ハイブリダイゼーションの条件はクローンテック社のプロトコールに従って行った(図11)。
図11で示した結果から、マウスPJ01256遺伝子は7日、11日、15日、17日めの胎児いずれの時期にも発現していることが示され、その発現量は発生にしたがって発現量が増加していた。このことより、PJ01256は発生に関与していることが示唆された。またmRNAの大きさは約5.5Kbで、明瞭なスプライシングバリアントは検出されなかった。
実施例17
(PJ01256の性周期による発現変動)
PJ01256の主な発現部位は実施例6に示したノーザンハイブリダイゼーション及びRT−PCRの結果から卵巣であった。卵巣は、性周期に従って排卵を繰り返すことで、組織形態が変化している。その過程では、細胞外マトリックスの分解及び再構築が繰り返されており、分解系及び合成系の種々の酵素が性周期に従って変動していると考えられる。PJ01256と同じADAMTSファミリーであるADAMTS1は、プロゲステロンの制御下で性周期に従って発現が変動することが報告されている(R.L.Robker et al, Steroids.(2000)65(10−11):559−570;R.L.Robker et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(2000)97(9):4689−4694.)。
以下、マウスPJ01256の卵巣での性周期による発現変動を検討した。対照組織として、腎臓での検討も同様に行なった。
RT−PCR及び定量的PCRによる検討を行なうために、以下のプライマー及び定量的PCR用プローブを作製した。mPJ−がマウスPJ01256用、G3PDH−及びmGDH−が内部標準遺伝子として用いたマウスグリセルアルデヒド 3−燐酸脱水素酵素(G3PDH)用であり、Sはセンスプライマー、Aはアンチセンスプライマーを示す。
RT−PCR用プライマー
定量的PCR用プライマー
定量的PCR用プローブ(TaqMan プローブ)
マウスはSlcICR系メス9週齢を5個体使用した。性周期は、採取当日及び前日にスメアーテストを行ない判定した(表38)。卵巣及び腎臓を採取後、「TRIZOL登録商標 Regent、Invitrogen社製」を用いて、添付プロトコルに従いRNAを抽出した。
RT−PCRの第一次反応である逆転写反応(RT反応)は、上記で抽出したRNAを鋳型として、「TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)Ver1.1;宝酒造製」を用い、下記の条件で行なった。
RT−PCRの第二次反応であるPCRは、上記のRT反応で調製したcDNAを鋳型として、以下の条件で行なった。
PCR産物を電気泳動し、臭化エチジウムで染色した後、紫外光照射下で画像を取り込み、各バンド濃度を比較した(図12、表38)。G3PDHのバンドが各個体及び卵巣、腎臓でほとんど同じだったのに対し、PJ01256のバンド濃度は発情期である個体1の卵巣で特に強く、個体1及び個体3の腎臓、個体4の卵巣で若干強かった。
性周期による発現変動の更なる検討のため、定量的PCRによる解析を行なった。定量的PCR反応溶液は、「TaqMan登録商標Universal PCR Master Mix、Applied Biosystems社製」を用い、前記のRT反応で調製したcDNAを鋳型として、以下の通り調製した。
反応は、定量的PCR装置「GenneAmp5700登録商標 Sequence Detection System、Applied Biosystems社製」に上記の反応溶液を入れたチューブを1サンプル当たり2本ずつセットし、以下の運転プログラムにて行なった。
定量的PCR装置で得られた増幅曲線より、G3PDH及びPJ01256の相対濃度を得た。続いて、PJ01256の相対濃度を内部標準遺伝子であるG3PDHの相対濃度で除算し、補正した。補正値を組織及び遺伝子ごとの最低値で除算し、相対濃度比を算出した(表38)。その結果、発情期である個体1の卵巣でのみ、PJ01256の発現が高くなっていることが確認された。
RT−PCR及び定量的PCRの結果から、共に発情期卵巣ではPJ01256の発現が亢進していることが示された。このことより、PJ01256は性周期に従って卵巣での発現が変動しており、排卵に伴う卵巣の細胞外マトリックスの分解及び再構築に関与していることが示唆された。
実施例18
(組換えヒトPJ01256タンパク質の細胞外マトリックス局在化の検討)
実施例5においてCOS7細胞で発現させたヒトPJ01256タンパク質が細胞外マトリックス(ECM)に局在していることを確認するため、論文(Kuno,K.and Matsushima,K. J.Biol.Chem.(1998)273,13912−13917)の方法に準じて以下の検討を行った。
75cm2組織培養用フラスコに約50%コンフレントに付着生育させたCOS7細胞に対し、10μgのpCMH01−PJ01256を遺伝子導入した。対照には10μgのpCMH01を用いた。遺伝子導入は市販の「LipofectAMINE PLUS、Lifetechnologies社製」を用い、添付プロトコルに従って行った。遺伝子導入3日後、培養上清液(12ml)を回収し、等量の2×SDS電気泳動用緩衝液(100mM Tris−HCl pH6.8、20% グリセロール、12% 2−メルカプトエタノール、4% SDS、ブロモフェノールブルーにより染色)を添加後、100℃で5分間加熱して培地画分(Medium Fraction)とした。フラスコに付着した細胞をPBS(Phosphate Buffered Saline)で2回洗浄した後、5mMのEDTA(pH7.5)を添加したPBSで細胞を遊離させた。懸濁した細胞液を遠心分離(1,000×g、5分、室温)して細胞を沈殿させ、氷冷したPBSで洗浄後、0.05mlのRIPAバッファー(50mM Tris−HCl pH8.0、150mM NaCl、1.0% NP40、0.5% デオキシコーレート、0.1% SDS、1mM フェニルメチルスルフォニルフルオリド)に懸濁して細胞を破砕した。細胞破砕液に等量の2×SDS電気泳動用緩衝液を添加後、100℃で5分間加熱して細胞画分(Cell Fraction)とした。細胞を遊離させた後にフラスコに付着したECM画分を、1.0mlの1×SDS電気泳動用緩衝液に懸濁し、100℃で5分間加熱して細胞外マトリックス画分(ECM Fraction)とした。
各画分サンプル5μlをSDS−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。SDS−ポリアクリルアミド電気泳動は、市販の「マルチゲル4/20、第一化学薬品社製」を「カセット電気泳動槽「第一」DPE−120」にセットし、40mA定電流で1時間行った。泳動用緩衝液は、「Tris−Glycine−SDS Powder、宝酒造製」を用い、分子量マーカーは、「Precision Protein Standards、BIO−RAD社製、Code.No.161−0372」を用いた。泳動終了後、「ミニトランスブロット、BIO−RAD社製」を用いてエレクトロトランスファーによりPVDF膜「TEFCO社製、Code.No.03−056」にブロッティングした。エレクトロトランスファーは、「Tris−Glycine Powder、宝酒造製」にメタノールを20%添加した緩衝液中で、150mA定電流で1.5時間行った。ブロッティングしたPVDF膜は、「抗C−Myc(9E10)抗体、Santa Cruz Biotechnology社製、Code.No.SC−40」を1次抗体として反応させ、「Anti−Mouse IgG−POX、Sigma社製」を2次抗体として反応させた。抗体にラベルされたホースラディシュパーオキシダーゼの検出には「ECL Plus、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製」を用い、添付されていた標準プロトコルに従って行った。結果を図13に示した。
図13に示したように、抗Myc抗体を用いたウェスタンブロッティング解析の結果、pCMH01−PJ01256をトランスフェクトしたCOS7細胞では、発現したPJ01256タンパク質のシグナルは主にECM画分に検出された。対照としたpCMH01では該当するシグナルは検出されなかった。以上の結果より、COS7細胞で発現したヒトPJ01256タンパク質は主にECMに局在していることが示された。
実施例19
(PJ01256のエクソン部位決定と染色体マッピング)
PJ01256のゲノム配列及び疾患との関わりを調べるため、ゲノム配列を検索し、染色体マッピングを行なった。
ヒトPJ01256全長cDNA(配列番号3)で公共データベースであるGenBankを検索したところ、染色体クローンAC010269.5がヒットした。同配列に対しヒトPJ01256cDNAをGT−AGルールにあてはめ、エクソン部位を決定した。その結果、ヒトPJ01256全長cDNA 5610bp中1−3558bpが、エクソン1〜18としてAC010269.5上に存在した。エクソン19以降はAC010269.5上には存在しなかった(表39、図14)。
NCBIのHuman Genome Map Viewer(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi−bin/Entrez/hum srch?chr=hum chr.inf&query)を用いて、ヒトPJ01256のゲノム配列であるAC010296.5の染色体上の位置をデータベース上で調べ、染色体マッピングを行なった。その結果、2001年9月19日現在AC010269.5は、5番染色体短腕15.31(5p15.31)に存在していた(図15)。なお、同ゲノム配列は2001年5月8日には5p15.33、同年5月10日には5p15.2に存在していた。
染色体マッピングの結果から、PJ01256は5p15.2−15.3に存在することが示された。5p15.2−15.3は、5P−症候群(Cri−du−chat syndrome)の欠失部位であり(Overhauser J,et al.,Hum.Mol.Genet.(1994)3(2):247−252)、同症候群との関連が示唆される。
実施例20
(ヒトPJ01256の昆虫細胞系での大量発現)
ヒトPJ01256の大量発現を行なうため、昆虫細胞/バキュロウィルスでの発現系を構築した。発現系構築には「Bac−To−Bac登録商標 Baclovirus Expression System、Life tecnologies社(現Invitrogen社)製」を使用した。
発現させたヒトPJ01256のC末端にMycHisタグ配列を付加するため、組換えバキュロウィルスDNAプラスミド(Bacmid)調製用ベクター「pFastBac1、Life tecnologies社(現Invitrogen社)製」を改変した。すなわち、下記の合成DNA(MEHT−1、MEHT−2、MEHT−3、及びMEHT−4)をアニーリングさせ連結したものを、pFastBac1のSphI及びHindIIIサイト間に挿入した。作製したpFastBac1−HTのクローニング部位を図16に示す。
ヒトPJ01256cDNAは実施例4で作成したpCMH01−PJ01256から制限酵素BamHI及びHindIIIで切り出し、pFastBac1−HTの同サイトに挿入した。作製したプラスミドpFastBac1−HT−PJ01256は、塩基配列を決定しPJ01256cDNA下流にMycHisタグ配列が同一フレームで連結されたことを確認した(図17、配列番号9)。
昆虫細胞/バキュロウィルス発現系において効率良くPJ01256を分泌させるため、ミツバチ メリチン(Honeybee Melittin)由来シグナル配列(以下、メリチンシグナル、Tessier D.C.et al, Gene(1991)98(2):177−183)を付加した。すなわち、下記の合成DNAをアニーリングさせたものを、pFastBac1−HT−PJ01256のBamHIサイトに挿入した。
作製したプラスミドpFastBac1−MS/HT−PJ01256‐2は、塩基配列を決定しPJ01256cDNA上流にメリチンシグナル配列が同一フレームで連結されたことを確認した(図18、配列番号10)。
また、活性型PJ01256を高効率で得る目的で、PJ01256自体のシグナル配列及びメタロプロテアーゼ活性を抑制すると考えられるプロ領域を除いたものも作製した。すなわち、下記のプライマーで増幅される257bpのヒトPJ01256断片をBamHI及びXbaIで消化し、pFastBac1−MS/HT−PJ01256‐2の両サイト間に連結した。なお、BHPJ−S05は、5’側9merがBamHIの認識配列と同酵素での消化を可能とするスペーサー配列であり、3’側21merはヒトPJ01256全長cDNA配列(配列番号3)の1593〜1613番目に完全一致する配列よりなるプライマーである。PJ−A25はヒトPJ01256全長cDNA配列(配列番号3)の1811〜1840番目の相補鎖に完全一致する配列よりなるプライマーである。
作製したプラスミドpFastBac1−MS/HT−PJ01256‐1は、塩基配列を決定しメリチンシグナル配列下流にヒトPJ01256cDNAのメタロプロテアーゼドメインが同一フレームで連結されたことを確認した(図19、配列番号11)。
作製した組換えBacmid調製用ベクターpFastBac1−HT−PJ01256、pFastBac1−MS/HT−PJ01256‐1及びpFastBac1−MS/HT−PJ01256‐2で、組換えBacmid調製用大腸菌;「E.coli DH10 Bacコンピテントセル、菌体内にBacmidを有する、Life tecnologies社(現Invitrogen社)製」をそれぞれ形質転換した。その結果、Tn7部位特異的トランスポジションによって、それぞれのPJ01256の発現ユニットが組換えられたBacmid(Bacmid−HT−PJ01256、Bacmid−MS/HT−PJ01256‐1及びBacmid−MS/HT−PJ01256‐2)を得た。
Bacmid−HT−PJ01256、Bacmid−MS/HT−PJ01256‐1及びBacmid−MS/HT−PJ01256‐2をそれぞれ2クローンずつSf9細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入はリポソーム法にて行なった。4日後、培養上清を0.2μmのフィルターでろ過し、それぞれのPJ01256組換えバキュロウィルス液(BV sol.PJ01256−HT No.1、BV sol.PJ01256−HT No.2、BV sol.PJ01256−MSHT1 No.1、BV sol.PJ01256−MSHT1 No.2、BV sol.PJ01256−MSHT2 No.1及びBV sol.PJ01256−MSHT2 No.2)として回収した。
回収したそれぞれのPJ01256組換えバキュロウィルス液を3×106個のSf9細胞に約moi10で感染させた。3日後、細胞を10mM Tris(pH8)、1mM EDTAで懸濁し、等量の2×サンプルバッファーを加え、約5分間煮沸させた後、1/100量をウェスタンブロッティングに供した。ウェスタンブロッティングは、「Penta−His HRP Conjugate、QIAGEN社製」と「ECL PLUS、Amersham Pharmacia Biotech社製」を用いて、それぞれの添付プロトコルに従って行なった。
ウェスタンブロッティングの結果を図20に示した。昆虫細胞/バキュロウィルス系での発現の結果、それぞれの分子量に応じたPJ01256の発現産物が得られた。本発現系の構築により、PJ01256の大量調製が可能となった。
産業上の利用可能性
以上説明したように本発明は、新規なADAMTSファミリータンパク質及びそれをコードする新規遺伝子を提供するものであり、卵巣での高発現及び性周期における発現量の変動、腫瘍細胞における存在の低下、及び当該遺伝子の染色体上の位置が5P−症候群の欠失部位に位置することを特徴とする。この特性を利用した新規医薬組成物、診断・治療手段の提供はADAMTSファミリータンパク質関連の臨床・基礎の医用領域において大きな有用性を提供する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1はヒトPJ01256を有するベクターpCMH01−PJ01256を示す模式図である。
図2はヒトPJ01256を有するベクターを形質導入した哺乳動物細胞でのヒトPJ01256タンパク質の発現を示す。
図3はヒトPJ01256遺伝子の発現組織解析の結果を示す。
図4はヒトPJ01256遺伝子の発現組織解析の結果を示す。
図5は正常卵巣及び腫瘍卵巣でのヒトPJ01256発現量を示す。
図6は正常脳及び脳腫瘍でのヒトPJ01256発現量を示す。
図7は正常副腎及び腫瘍副腎でのヒトPJ01256発現量を示す。
図8はヒトPJ01256とマウスPJ01256のアミノ酸配列を比較して示す。
図9はヒトPJ01256とマウスPJ01256のアミノ酸配列を比較して示す。
図10はマウスPJ01256遺伝子の発現組織解析の結果を示す。
図11はマウスPJ01256遺伝子のマウス胎児における発現を示す。
図12はマウスPJ01256mRNAの性周期変動を示す。グリセルアルデヒド 3−リン酸脱水素酵素(G3PDH)mRNAの性周期変動を対照として示す。図中、各数字はマウスの個体番号であり、それぞれのマウスの性周期は次のように判定された;1=発情期;2=発情後期〜休止期;3=発情後期;4=発情前期〜発情期;5=発情後期。
図13はCOS7細胞で発現させたヒトPJ01256タンパク質の細胞外マトリックス(ECM)への局在を示す。図中、CはpCMH01をトランスフェクトしたCOS7細胞、PJはpCMH01−PJ01256をトランスフェクトしたCOS7細胞についての結果である。
図14はヒト染色体クローンAC010269.5上のヒトPJ01256エクソンの位置を示す。
図15はヒト染色体クローンAC010269.5が5番染色体短腕15.31(5p15.31)に存在することを示す。
図16はヒトPJ01256遺伝子を挿入した組換えバキュロウイルスDNA調製用プラスミドベクターpFastBac1−HTのクローニング部位を示す。図中、イタリック文字は合成DNA挿入部分を示す。
図17はプラスミドpFastBac1−HT−PJ01256の構造を示す模式図である。
図18はプラスミドpFastBac1−MS/HT−PJ01256−2の構造を示す模式図である。
図19はプラスミドpFastBac1−MS/HT−PJ01256−1の構造を示す模式図である。
図20はヒトPJ01256の昆虫細胞/バキュロウイルス系での発現結果を示す。図中、HTはBacmid−HT−PJ01256、MSHT1はBacmid−MS/HT−PJ01256−1、及びMSHT2はBacmid−MS/HT−PJ01256−2を遺伝子導入したSf9細胞の培養上清を示す。それぞれ2クローンずつ遺伝子導入し、No.1及びNo.2として表示した。
Claims (24)
- 下記の群より選ばれるADAMTSファミリーに属するポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質;
▲1▼配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
▲2▼前記▲1▼のポリペプチドを含有するポリペプチド、
▲3▼前記▲1▼のポリペプチドと少なくとも約50%のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
及び
▲4▼前記▲1▼〜▲3▼のポリペプチドにおいて、そのアミノ酸配列に1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するポリペプチド。 - 配列表の配列番号1又は配列番号4又は配列番号8に記載のアミノ酸配列の一部を有する部分ペプチドであって、少なくとも約8個の連続するアミノ酸配列を有するペプチド。
- 請求の範囲第1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖。
- 配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖。
- 請求の範囲第3項又は第4項に記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
- 請求の範囲第2項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖。
- 配列表の配列番号2又は配列番号3又は配列番号7に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補的塩基配列の少なくとも約15個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
- 請求の範囲第6項又は第7項に記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
- 請求の範囲第3項ないし第8項に記載のいずれか1つのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有する組換えベクター。
- 請求の範囲第9項に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求の範囲第10項に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求の範囲第1項又は第2項に記載のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチドの製造方法。
- 請求の範囲第1項又は第2項に記載のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチドを免疫学的に認識する抗体。
- 少なくともADAMTSファミリーポリペプチドを認識する、請求の範囲第12項に記載の抗体。
- 請求の範囲第1項に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害若しくは促進する作用を有する化合物、及び/又は請求の範囲第3項ないし第5項に記載のいずれか1つのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、請求の範囲第1項又は第2項に記載のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、請求の範囲第3項ないし第8項に記載のいずれか1つのポリヌクレオチド、請求の範囲第9項に記載のベクター、請求の範囲第10項に記載の形質転換体、請求の範囲第12項若しくは第13項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか1つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
- 請求の範囲第1項に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害若しくは活性化する化合物、又は請求の範囲第3項ないし第5項に記載のいずれか1つのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する化合物のスクリーニング方法であって、化合物とポリペプチド又はタンパク質との間の相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチド又はタンパク質とスクリーニングすべき化合物とを接触させて化合物の相互作用を評価し(かかる相互作用はポリペプチド又はタンパク質と化合物との相互作用に応答した検出可能シグナルを提供し得る第2の成分に関連したものである)、次いで、化合物とポリペプチド又はタンパク質との相互作用により生じるシグナルの存在又は不存在又は変化を検出することにより、化合物がポリペプチド又はタンパク質と相互作用して、その活性を活性化又は阻害するかどうかを決定することを含む方法。
- 請求の範囲第14項又は第15項に記載の方法でスクリーニングされる化合物であって、請求の範囲第1項に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害又は促進する化合物又はその塩。
- 請求の範囲第14項又は第15項に記載の方法でスクリーニングされる化合物であって、請求の範囲第3項ないし第5項に記載のいずれか1つのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する化合物又はその塩。
- 請求の範囲第1項又は第2項に記載のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、請求の範囲第3項ないし請求の範囲第8項に記載のいずれか1つのポリヌクレオチド、請求の範囲第9項に記載のベクター、請求の範囲第10項に記載の形質転換体、請求の範囲第12項若しくは第13項に記載の抗体、又は請求の範囲第16項若しくは第17項に記載の化合物のうちの少なくともいずれか1つを含有することを特徴とする医薬組成物。
- 請求の範囲第1項に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質の発現又は活性に関連した疾病の診断方法であって、(a)該ポリペプチド又はタンパク質をコードしている核酸、及び/又は(b)試料中の該ポリペプチド又はタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法。
- 請求の範囲第1項又は第2項に記載のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、請求の範囲第3項ないし第8項に記載のいずれか1つのポリヌクレオチド、又は請求の範囲第12項若しくは第13項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか1つを含んでなる、(a)該ポリペプチド又はタンパク質をコードしている核酸、及び/又は(b)試料中の該ポリペプチド又はタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法に使用する試薬キット。
- 請求の範囲第3項ないし第8項に記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖をエクソンとして含有するヒトゲノム遺伝子断片たるポリヌクレオチド。
- 請求の範囲第21項に記載のヒトゲノム遺伝子断片の塩基配列又はその相補配列の少なくとも15個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
- 請求の範囲第21項又は第22項に記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
- 請求の範囲第22項又は第23項記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖をマーカー又はプライマーとして用いることを特徴とする疾病の診断方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000311309 | 2000-10-11 | ||
JP2000311309 | 2000-10-11 | ||
JP2001102905 | 2001-04-02 | ||
JP2001102905 | 2001-04-02 | ||
PCT/JP2001/008913 WO2002031163A1 (fr) | 2000-10-11 | 2001-10-11 | Nouveau polypeptide de la famille adamts et gene codant pour ce polypeptide |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2002031163A1 true JPWO2002031163A1 (ja) | 2004-02-19 |
Family
ID=26601917
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002534530A Withdrawn JPWO2002031163A1 (ja) | 2000-10-11 | 2001-10-11 | 新規なadamtsファミリーポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPWO2002031163A1 (ja) |
AU (1) | AU2001294218A1 (ja) |
WO (1) | WO2002031163A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002033087A2 (en) * | 2000-10-17 | 2002-04-25 | Curagen Corporation | Proteins and nucleic acids encoding same |
US20030129658A1 (en) * | 2000-12-25 | 2003-07-10 | Noboru Yamaji | Novel protease |
JP2003180384A (ja) * | 2001-09-24 | 2003-07-02 | Daiichi Fine Chemical Co Ltd | Adamts−15,−16,−17,−18及び−19 |
US20060014931A1 (en) * | 2002-06-20 | 2006-01-19 | Masayoshi Takeda | Novel promoter |
US8945895B2 (en) * | 2009-07-31 | 2015-02-03 | Baxter International Inc. | Methods of purifying recombinant ADAMTS13 and other proteins and compositions thereof |
JP5399219B2 (ja) * | 2009-11-24 | 2014-01-29 | 株式会社ケイティーバイオ | 関節リウマチに対するヒト型抗TNFα抗体薬の薬効予測方法、及び薬効予測装置 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU3622600A (en) * | 1999-03-08 | 2000-09-28 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Metalloproteinases and methods of use therefor |
-
2001
- 2001-10-11 JP JP2002534530A patent/JPWO2002031163A1/ja not_active Withdrawn
- 2001-10-11 WO PCT/JP2001/008913 patent/WO2002031163A1/ja active Application Filing
- 2001-10-11 AU AU2001294218A patent/AU2001294218A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2002031163A1 (fr) | 2002-04-18 |
AU2001294218A1 (en) | 2002-04-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6870030B2 (en) | Asp2 | |
EP0848062A2 (en) | Aspartic protease ASP1 | |
JP2002191379A (ja) | Asp1 | |
JPH1175873A (ja) | 新規化合物 | |
EP0887414A2 (en) | Human serine proteases HGBAB90 | |
US20010012836A1 (en) | Human histone deacetylase gene HD4 | |
US20080318835A1 (en) | Novel Integrin Ligand ITGL-TSP | |
JPH1142092A (ja) | ヒト心臓/脳トロイド様タンパク質 | |
US6274717B1 (en) | Splicing variant of human membrane-type matrix metalloproteinease-5 (MT-MMP5-L) | |
JPWO2002031163A1 (ja) | 新規なadamtsファミリーポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子 | |
JPH11253183A (ja) | Frizzled−3ポリペプチドおよびポリヌクレオチド | |
US5837508A (en) | Membrane-type matrix metalloproteinase-5 gene | |
EP0874050A2 (en) | Integrin ligand ITGL-TSP | |
WO1999011783A2 (en) | T-box polypeptides | |
JP2002186492A (ja) | ヒトrce1 | |
JP2000060575A (ja) | Wnt―6ポリペプチドおよびWnt―6ポリヌクレオチド | |
EP0894856A1 (en) | A human sMAD3 splice variant | |
JPH1198992A (ja) | 新規化合物 | |
WO1999021885A1 (en) | A human abc transporter-7 (habc7) gene | |
EP0879886A2 (en) | Signal transduction protein HLDAT86, the human Wnt-4 homolog | |
JP2002085059A (ja) | 新規なtsp1ドメイン含有ポリペプチド | |
WO2000061598A2 (en) | Rat kidney specific gene profilin-3 | |
JPH1189586A (ja) | 新規化合物 | |
JPH11290086A (ja) | Hsscrg1ポリペプチドおよびポリヌクレオチド | |
WO2001023587A2 (en) | Serine protease |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20050104 |