明 細 新規な ADAMT Sフアミリーポリぺプチドおよびそれをコードする遺伝子 技術分野
本発明は、 新規な ADAMTSファミリーポリペプチド又はタンパク質、 及び 該ポリぺプチド又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものであ る。 さらに詳しくは、 該ポリペプチド若しくはタンパク質のアミノ酸配列の全部 若しくは一部を有するぺプチド、 該ぺプチド又はポリぺプチドをコ一ドするポリ ヌクレオチド、 該ポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一、 該組換えべクタ 一で形質転換された形質転換体、 該ペプチド又はポリペプチドに対する抗体、 こ れらを利用した化合物のスクリーニング方法でスクリーニングされた化合物、 該 ポリぺプチド若しくは該ポリヌクレオチドに作用する活性阻害化合物又は活性賦 活化合物、 これらに関係する医薬組成物、 及びこれらに関係する疾病診断方法、 当該形質転換体を使ったペプチド又はポリペプチドの製造方法、 当該スクリー二 ング方法に関する。 背景技術
近年、 レプロリシン型 (reprolys in t pe)亜鉛メ夕口プロテ ァ一ゼドメイン (Z II— me t a 11 o p r o t e a s e) (H 0 0 p e r N. M. FEB S L e t t . ( 1994) 354 : 1— 6)、 デイスインテグリン 様 (dis int egrin— l ike) ドメイン及び TS P I (t hr omb ospondin t pe 1 repeat s ) ドメインを有するユニーク なタンパク質が見い出されており (Kuno Κ·, e t al., J. Bio 1. Chem. ( 1997) 272 : 556-562 ; Vazque s. F., e t al, J. Bio l. Chem. (1999) 274 : 23349-2 3357等)、 これらの特徴的なドメインを有するタンパク質は ADAMTS (a
d i s int egr in and me t al l opr o t eas e wi t h t hr omb o s p ond i n mo t i f s)フアミリ一と総称されている(T ang B. L., e t 1.
3 FEB S Le t t. (1999) 445 : 2
レプロリシン型亜鉛メタ口プロテアーゼドメインは、 ADAMTS及び ADA M ( a d i s int egr in and me t a l l opr o t e as e) フアミリ一等に含まれ、活性中心はー般に11£ 1 211 10 1 110(通 常、 XI ;疎水性ァミノ酸、 X 2 ;グリシンあるいは疎水性ァミノ酸) であり、 3つのヒスチジン残基が 1つの亜鉛分子に配位していると考えられている (Ho o p e r N. M. FEB S Let t. (1994) 354 : 1-6 )0
TSP 1 ドメインは、 トロンボスポンジン 1 (t hr ombo spond in — 1) が有する繰り返し配列として見い出され、 その CSVTCGモチーフは CD 36 ZL IMP II受容体に結合し、 WSXWモチーフは細胞表面のへパラン 硫酸フ。口テオグリカン (heparan sulf at e pr o t e o g ly can) に結合することが知られている。
ディスィンテグリン様ドメインは、 システィンに富み抗血液凝固作用を有する へビ毒のディスインテグリン (d i s int egr in) に 40%程度の相同性 を有している。 機能的にへビ毒のディスィンテグリンと同等あるいは同様の作用 を有するかは未解明である。
現在、 ADAMTSファミリ一として ADAMTS— 1~10、 12〜13の 12種類 (AD AMT S 11も報告されているが、 AD AMT S 5と同一分子で あった) が報告されている。 その中には、 細胞外マトリックスのァグリカン (Aggr e c an) 切断活性を持つ AD AMT S— 4 (Aggr e canas e- 1), ADAMTS-5 (Aggr e c ana s e-2)やプロコラーゲン切 断活性をもつ ADAMTS— 2 (pr o c o 11 agen I /II ami no pr op ep t i da s e) のように従来のマトリヅクスメタ口プロテア一ゼ (mat r ix met a l l opro t eas e) とよく似た酵素活性をもつ
ものが認められている反面、 ADAMT S— 1 (METH 1) や ADAMT S_ 8 (METH2) のようにエンドス夕チン (endo s t at in) や TSPと いう従来知られていた血管新生阻害因子よりも強い血管新生阻害作用を持つもの も発見されている (Vazque s. F., e t a 1, J. Bi o l. Che m. (1999) 274 : 23349-23357 )0
ADAMTS— 1については、 血管新生阻害作用の他、 炎症組織での発現上昇 (Kuno K., e t a 1.3 J. B i o l. Chem. ( 1997) 272 : 556 - 562)、性周期による発現変動と排卵への関与(Robker R. L., e t a l., Pr o c. Nat l. Acad. S c i. USA. (2000) 97 : 4689-4694 ; Robke r R. L., e t a l., S t e r o ids (2000) 65: 559 - 570) 等が報告されている。 基質として は、 ァグリカン (Kuno K., e t a l., FEB S Let t. (200 0) 478 : 241-245)及びバ一ジカン (Ve r s i c an) (Sandy J. D.5 e t al., J. B i o l. Chem. (2001) 276 : 133 72— 13378) が報告されている。
ADAMTS— 2は、 その欠損が、 プロコラーゲン Iの蓄積による皮膚の形成 異常を特徴とする E h 1 e r s— D a n 10 s syndr ome t p e VIICの原因であることが報告されている (Co l i ge A., e t a l., Am. J. Hum. Gene t. (1999) 65 : 308-317 ; L i S. W., e t a l., B i o chem. J. (2001) 355 : 271-278 )c ADAMT S— 3は、 ドメイン構造及び活性中心の配列が AD AMT S— 2と非 常に似ており、 ADAMTS— 2とともにプロコラーゲン IIを基質とすることが 報告されている (F e rnand e s R. J., e t al., J. B i o l. Chem. (2001) 276 : 31502-31509 )0
ADAMT S— 4及び ADAMTS— 5は、 基質としてァグリカンの 373番 目のグルタミン酸残基と 374番目のァラニン残基間 (Glu373— Al a3 74 b ond)を切断することが報告されている(T 0 r t o r e 11 a M.
D -, e t al., Science ( 1999) 284 : 1664-1666 ; Abbaszade I., et a 1 J. Bio l. Chem. ( 1999) 274 : 23443-23450)o同部位の切断は慢性関節リゥマチや変形性関 節症のような関節軟骨破壊を伴う関節疾患の初期徴候の一つであり (Sandy J. D., J. Cl in. Invest. ( 1992) 89 : 1512 - 151 6)、ADAMTS— 4及び AD AM TS-5の阻害剤がその治療薬として着目さ れている。 また、 生体内における ADAMTS— 4及ぴ ADAMTS— 5の強力 な阻害剤として T IMP— 3が報告されている(Hashimot o G., et a 1., FEB S Let t. (2001) 494 : 192-195 ; Kash iwagi M., et a 1.5 J. Bio l. Chem. (2001) 276 : 12501-12504)o ADAMT S— 4については、ァグリカン以外の基質 として、プレビカン(b r e V i c an) (Ma t t hews R. T., e t a 1., J. Bio l. Chem. (2000) 275 : 22695 - 22703)、 パージカン(Sandy J. D., et a 1 J. Bio l. Chem. (2 001) 276 : 13372-13378) が報告されている。
最近同定された ADAMT S— 13については、 血液凝固に閧与するフォンビ ルブランドファクタ一 (V o n Wi l lebrand f act or) の切断 活性が認められている (Fu j ikawa K.} e t a 1., B l ood (2001) 98 : 1662— 1666 ; Zheng X., et al., J. Bio l. Chem. (2001) Sep l 3 [epub ahead o f p rint]; Soej ima K. , e t al., J. Biochem. (To ky o) (2001) 130 : 475— 480)。 同酵素活性の欠損は、 血栓性血 小板減少性紫斑病 (thro mb ot i c thro mb ocyt openi c purpura) の原因とされており、 AD AMT S— 13が着目されている。 発明の開示
本発明が解決しょうとする課題のひとつは、 上記のように多様な作用の原因物
質となり得る AD AMT Sファミ リ一夕ンパク質に関する新規な物質を見い出し、 生体内における ADAMT Sファミリータンパク質の制御を可能にすることであ る。 より具体的には、 本発明の課題は新規な特性をもつ新規な ADAMT Sファ ミリ一夕ンパク質を提供することであり、 それに伴い有用性ある新規な AD AM T Sファミリ一夕ンパク質由来のぺプチド又はポリぺプチドを提供することであ る。 また本発明の別の課題は、 新規な ADAMTSファミリータンパク質由来の ぺプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することであり、 さらにこれを利用して遺伝子工学手法による新規な A D AM T Sファミリ一タン ノ ク質の製造法を提供することである。 さらに本発明の別の課題は、 新規な AD AMTSファミリ一タンパク質、 ペプチド又はポリペプチドに対する抗体を提供 することである。 その他の本発明の課題は、 上記のものを利用して新規な ADA MTSファミリ一タンパク質の有する作用の阻害剤 ·拮抗剤 ·賦活剤のスクリ一 ニングを行なうことであり、スクリーニングされた化合物を提供することであり、 またこれらを利用した医薬組成物及び診断方法を提供することである。
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 ヒト脳細胞中の mRNA由来の cDN Aライブラリ一から新規な ADAMTSフアミリ一タンパク質をコードする cD NAを単離し、 全塩基配列を解析することに成功した。 そして、 この塩基配列を アミノ酸配列に翻訳したところ、 当該タンパク質は N末端側にレプロリシン ( repro lys in)様の亜鉛メタ口プロテア一ゼドメイン (Z n— me t a 11 op r o t e a s e) を 1個、 C末端側に T S P 1ドメインを 5回繰り返し て保持し、その中間にデイスインテグリン様ドメインを 1個有することを確認し、 これらの cDNAにコードされるタンパク質が新規な ADAMT Sタンパク質で あることを確認した。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重 ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明の 1態様は、 下記の群より選ばれる ADAMTSファミリ一 に属するポリぺプチド又は該ポリべプチドを有するタンパク質である; ①配列表の配列番号 1又は配列番号 4又は配列番号 8に記載のアミノ酸配列から
なるポリべプチド、
②前記①のポリぺプチドを含有するポリぺプチド、
③前記①のポリぺプチドと少なくとも約 5 0 %のアミノ酸配列上の相同性を有す るポリべプチド、
及び
④前記①〜③のポリペプチドにおいて、 そのアミノ酸配列に 1ないし数個のアミ ノ酸の欠失、 置換、 付加あるいは揷入といった変異を有するポリペプチド。 本発明の 1態様は、 配列表の配列番号 1又は配列番号 4又は配列番号 8に記載 のアミノ酸配列の一部を有する部分ペプチドであって、 少なくとも約 8個の連続 するアミノ酸配列を有するペプチドである。
本発明の 1態様は、 上記ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド又はその 相補鎖である。
本発明の 1態様は、 配列表の配列番号 2又は配列番号 3又は配列番号 7に記載 の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖である。
本発明の 1態様は、 上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジヱント な条件下でハイブリダイゼ一シヨンするポリヌクレオチドである。
本発明の 1態様は、 上記べプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補 鎖である。
本発明の 1態様は、 配列表の配列番号 2又は配列番号 3又は配列番号 7に記載 の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補的塩基配列の少なくとも約 1 5個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明の 1態様は、 上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジヱント な条件下でハイブリダィゼ一シヨンするポリヌクレオチドである。
本発明の 1態様は、 上記いずれか 1つのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含 有する組換えベクターである。
本発明の 1態様は、 上記組換えべクタ一で形質転換された形質転換体である。 本発明の 1態様は、 上記形質転換体を培養する工程を含む、 上記ポリペプチド
若しくは該ポリぺプチドを有する夕ンパク質又はべプチドの製造方法である。 本発明の 1態様は、 上記ポリぺプチド若しくは該ポリぺプチドを有する夕ンパ ク質又はべプチドを免疫学的に認識する抗体である。
本発明の 1態様は、 少なくとも AD AM T Sファミ リ一ポリぺプチドを認識す る、 上記抗体である。
本発明の 1態様は、 上記ポリぺプチド又は該ポリぺプチドを有するタンパク質 と相互作用してその活性を阻害若しくは促進する作用を有する化合物、 及び/又 は上記いずれかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進 する作用を有する化合物のスクリ一ニング方法であって、 上記ポリぺプチド若し くは該ポリぺプチドを有する夕ンパク質又はぺプチド、 上記いずれかのポリヌク レオチド、 上記べクタ一、 上記形質転換体、 上記抗体のうちの少なくともいずれ か一つを用いることを特徴とするスクリ一ニング方法である。
本発明の 1態様は、 上記ポリぺプチド又は該ポリぺプチドを有する夕ンパク質 と相互作用してその活性を阻害若しくは活性化する化合物、 又は上記いずれかの ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する化合物のスク リーニング方法であって、 化合物とポリぺプチド又はタンパク質との間の相互作 用を可能にする条件下で、 ポリペプチド又はタンパク質とスクリーニングすべき 化合物とを接触させて化合物の相互作用を評価し (かかる相互作用はポリぺプチ ド又はタンパク質と化合物との相互作用に応答した検出可能シグナルを提供し得 る第 2の成分に関連したものである)、次いで、化合物とポリペプチド又はタンパ ク質との相互作用により生じるシグナルの存在又は不存在又は変化を検出するこ とにより、 化合物がポリペプチド又はタンパク質と相互作用して、 その活性を活 性化又は阻害するかどうかを決定することを含む方法である。
本発明の 1態様は、 上記方法でスクリーニングされる化合物であって、 上記ポ リぺプチド又は該ポリべプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻 害又は促進する化合物又はその塩である。
本発明の 1態様は、 上記方法でスクリーニングされる化合物であって、 上記い
ずれかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する化合 物又はその塩である。
本発明の 1態様は、 上記ポリぺプチド若しくは該ポリぺプチドを有する夕ンパ ク質又はペプチド、 上記いずれかのポリヌクレオチド、 上記べクタ一、 上記形質 転換体、 上記抗体、 又は上記化合物のうちの少なくともいずれか一つを含有する ことを特徴とする医薬組成物である。
本発明の 1態様は、 上記ポリぺプチド又は該ポリぺプチドを有する夕ンパク質 の発現又は活性に関連した疾病の診断方法であって、 (a)該ポリべプチド又は夕 ンパク質をコードしている核酸、 及び,又は ( b ) 個体由来の試料中の該ポリべ プチド又は夕ンパク質をマーカ一として分析することを含む方法である。
本発明の 1態様は、 上記ポリぺプチド若しくは該ポリぺプチドを有する夕ンパ ク質又はペプチド、 上記いずれか 1つのポリヌクレオチド、 又は上記抗体のうち の少なくともいずれか 1つを含んでなる、 (a )該ポリぺプチド又はタンパク質を コードしている核酸、 及び/又は (b ) 試料中の該ポリペプチド又はタンパク質 をマ一力一として分析することを含む方法に使用する試薬キヅトである。
本発明の 1態様は、 上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖をェクソンとして含 有するヒトゲノム遺伝子断片たるポリヌクレオチドである。
本発明の 1態様は、 上記ヒトゲノム遺伝子断片の塩基配列又はその相補配列の 少なくとも 1 5個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明の 1態様は、 上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジヱント な条件下でノ、イブリダィゼ一シヨンするポリヌクレオチドである。
本発明の 1態様は、 上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖をマーカー又はブラ イマ一として用いることを特徴とする疾病の診断方法である。 図面の簡単な説明
図 1はヒト P J 0 1 2 5 6を有するベクタ一 p C MH O 1— P J 0 1 2 5 6を 示す模式図である。
図 2はヒト PJ01256を有するベクタ一を形質導入した哺乳動物細胞での ヒト P J 01256タンパク質の発現を示す。
図 3はヒト PJ01256遺伝子の発現組織解析の結果を示す。
図 4はヒト PJ01256遺伝子の発現組織解析の結果を示す。
図 5は正常卵巣及び腫瘍卵巣でのヒト P J 01256発現量を示す。
図 6は正常脳及び脳腫瘍でのヒト P J 01256発現量を示す。
図 7は正常副腎及び腫瘍副腎でのヒト P J 01256発現量を示す。
図 8はヒト PJ01256とマウス P J 01256のアミノ酸配列を比較して 示す。
図 9はヒト P J 01256とマウス P J 01256のアミノ酸配列を比較して 示す。
図 10はマウス P J 01256遺伝子の発現組織解析の結果を示す。
図 11はマウス P JO 1256遺伝子のマウス胎児における発現を示す。 図 12はマウス PJ01256 mRN Aの性周期変動を示す。 グリセルアルデ ヒド 3—リン酸脱水素酵素 (G3PDH) mRN Aの性周期変動を対照として 示す。 図中、 各数字はマウスの個体番号であり、 それそれのマウスの性周期は次 のように判定された; 1 =発情期; 2 =発情後期〜休止期; 3 =発情後期; 4 = 発情前期〜発情期; 5 =発情後期。
図 13は COS 7細胞で発現させたヒト P J 01256タンパク質の細胞外マ トリックス (E CM)への局在を示す。 図中、 Cは pCMHO 1をトランスフエ クトした COS 7細胞、 P Jは pCMHO 1— PJ01256をトランスフエク トした COS 7細胞についての結果である。
図 14はヒト染色体クローン A CO 10269. 5上のヒト PJ01256ェ クソンの位置を示す。
図 15はヒト染色体クローン AC 010269. 5が 5番染色体短腕 15. 3 1 (5 15. 31) に存在することを示す。
図 16はヒト P J 01256遺伝子を揷入した組換えバキュロウィルス DNA
調製用プラスミドベクタ一 pFas t Bac 1—HTのクロ一ニング部位を示す。 図中、 イタリック文字は合成 DN A挿入部分を示す。
図 17はプラスミド pFastBac l—HT— PJ01256の構造を示す 模式図である。
図 18はプラスミド pFastBac 1-MS/HT-P J 01256— 2の 構造を示す模式図である。
図 19はプラスミド pFastBac 1 -MS/HT-P J 01256— 1の 構造を示す模式図である。
図 20はヒト P J 01256の昆虫細胞/バキュロウィルス系での発現結果を 示す。 図中、 HTは Bacmid— HT— PJ01256、 MSHT 1は: Bac mi d-MS/HT-P J 01256— 1、 及び M S H T 2は B a c m i d— M S/HT-P J 01256— 2を遺伝子導入した Sf 9細胞の培養上清を示す。 それそれ 2クローンずつ遺伝子導入し、 No. 1及び No. 2として表示した。 発明を実施するための最良の形態
(新規な ADAMT Sフアミリータンパク質)
本発明において提供される新規な ADAMTSフアミリ一タンパク質は、 ヒト 脳細胞中の mRNA由来の cDNAライブラリ一から発現配列タグ (EST)分 析(Adams, M. D., e t al., Science (1991) 252: 1651— 1656 ; Ad ams, M. D. e t al., Nature (19 92) 355 : 632— 634 ; Adams, M. D., et al., Nat ure ( 1995 ) 377 Supp: 3-174) を用いて TSP 1ドメイン をマーカ一として釣上げられた cDN Aクローン (配列表の配列番号 2) の塩基 配列から特異的に作成したプライマーを使用して、 さらに 5' RACE (Rap id ampl if icat ion o f cDNA end)法で取得された 全長 cDNA (配列番号 3) がコードする新規なアミノ酸配列を有するものであ る。当該 cDNAクローンにコードされるァミノ酸配列は配列表の配列番号 1に、
該全長 cDNAにコードされるァミノ酸配列は配列表の配列番号 4に記載した。 この新規な ADAMTSフアミリ一タンパク質の mRNAは、 ヒトの卵巣で発現 が高く、 ついで腎臓、 肺、 胃、 精巣、 副腎、 滕臓で発現量が高かった。 また、 脳、 小腸、 骨格筋、 皮膚において中程度に発現していた。 卵巣での発現が特に高かつ たことから、 同タンパク質は卵の分ィ匕 ·成熟あるいは排卵ひいては受精等に関与 することが考えられる。 また、 卵巣 ·心臓及び腎臓の腫瘍組織では mRNAの発 現量が正常組織に比べ著しく低下していたことから腫瘍に関連する遺伝子である ことが推定された。 さらに、 この新規遺伝子が、第 5染色体短腕 15. 2- 15. 3 (5 p 15. 2- 15. 3) に存在することを見い出した。 5p l 5. 2— 1 5. 3は 5P—症候群 (Cr i— du— chat s y nd r ome) の欠失部 位であることが報告されていることから (Ove rhaus er J, e t a 1, Hum. Mo 1. Gene t. ( 1994) 2 : 247— 252)、 該遺伝子 と同症候群との関連が示唆された。 また、 本発明においては、 上記新規なヒト A DAMTSフアミリ一タンパク質のマウスのカウンターパ一トをも見い出し、 こ れを提供する。 このマウス ADAMT Sファミリ一タンパク質の cDNAの塩基 配列は配列表の配列番号 7に、 該 cDNAがコードするァミノ酸配列は配列番号 8に言己載した。
本発明に係る新規な ADAMT Sフアミリータンパク質は、 公知データベース 登録配列との相同性分析から ADAMT Sフアミリーに属し、 TSP 1ドメイン 及びレプロリシン型亜鉛メタ口プロテア一ゼ (Z n— me t al l opr o t e a s e) ドメインを有し、 システィン一リッチ リ一ジョン (Cy s t e i ne -r i ch r e g i on) を有することが判明した。
本タンパク質が ADAMT Sフアミリータンパク質であること、 また T SP 1 ドメインを有することから、 ADAMT S 1及び ADAMT S 8で報告されてい るのと同様に血管新生阻害作用を有することが示唆される。 また、 レプロリシン 型亜鉛メ夕口プロテア一ゼを有し、 かつ卵巣で性周期に応じて発現が変動するこ とから、 卵巣の細胞外マトリックスを基質として、 その分解及び再構築に関与し
ていると考えられる。
(タンパク質、 ポリペプチド又はペプチド)
本発明に係る新規な ADAMTSフアミリータンパク質は、 配列表の配列番号 1又は配列番号 4又は配列番号 8に記載のアミノ酸配列と同一、 又は実質的に同 一なアミノ酸配列を含有するタンパク質である。 当該新規な ADAMTSフアミ リ一含有タンパク質は、 ヒトゃ哺乳動物のあらゆる細胞、 又はそれらの細胞が存 在するあらゆる組織に由来するタンパク質であってもよく、 また合成タンパク質 であってもよい。
配列表の配列番号 1又は配列番号 4又は配列番号 8に記載のアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列としては、 実施例 6及び 7にみられる発現特性を保持 する限りは特に限定されず、 例えば、 配列表の配列番号 1又は配列番号 4又は配 列番号 8に記載のアミノ酸配列と約 50 %以上、 好ましくは約 70 %以上、 より 好ましくは約 80 %以上、 さらに好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
また、 配列表の配列番号 1又は配列番号 4又は配列番号 8に記載のァミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列 表の配列番号 1又は配列番号 4又は配列番号 8に記載のアミノ酸配列と実質的に 同一のアミノ酸配列を含有し、 さらに配列表の配列番号 1又は配列番号 4又は配 列番号 8に記載のァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパ ク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質等が例示される。 実質的に同質の 活性として、 例えば同一ファミリ一に属する ADAM T S 1及び ADAMT S 8 で報告されているように、 本発明に係る新規な夕ンパク質が血管新生阻害活性を 有することも考えられるが、 その活性測定方法としては、 インビボ (in vi v o)法として、 ニヮトリ胚の漿尿膜 (chorioal lant oic me mb r an e) を用いる CAM法 (Moses M. A., e t a 1. , P r o c. Nat l. Acad. Sc i. USA ( 1999) 96 : 2645-26 50)、ゥサギゃラヅトの目の角膜に少し切り目をつけて試料を入れ、そこに向か
つて近くの細静脈から伸びてくる新生血管を観察する角膜法 (Gaudr i c A., et a 1 Ophthalmic Res. (1992) 24 : 181 -188) 等を、 インビトロ (in vit ro)法として、 培養血管内皮細胞 を用いてボイデンチヤンバーで遊走を、 単層培養で細胞の増殖を観察し、 管腔形 成は三次元のコラ一ゲンゲルやマトリゲル (IV型コラーゲン、 ラミニン、 ニドゲ ン /エンククチン及びへパラン硫酸よりなる再構成基底膜ゲル) で培養して観察 する方法(Haas T. L., et al., J. Bio l. Chem. ( 19 98) 273 : 3604-3610)等をそれそれ挙げることができる。
アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、 自体公知であり、 例えばアミノ酸配 列を直接決定する方法、 cDNAの塩基配列を決定後これにコードされるァミノ 酸配列を推定する方法等が可能である。
本発明に係る新規な A D A M T Sファミリ一ポリペプチドを含むタンパク質は 「成熟」 タンパク質の形態であってもよく、 あるいは融合タンパク質のごとき大 型のタンパク質の一部であってもよい。 分泌又はリーダー配列、 プロ配列、 複数 のヒスチジン残基のごとき精製を促進する配列、 又は組換え生産を行っている間 の安定性のためのさらなる配列を含むものであってもよい。
本発明に係るポリぺプチド又はべプチドは、 配列表の配列番号 1又は配列番号 4又は配列番号 8に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドの部分配列を有す るポリべプチド又はぺプチドを包含し、 これらは例えば試薬 ·標準物質 ·免疫原 として利用できる。 その最小単位としては 8個以上のアミノ酸、 好ましくは 10 個以上のアミノ酸、 より好ましくは 12個以上、 さらに好ましくは 15個以上の 連続するアミノ酸で構成されるアミノ酸配列からなり、 好ましくは免疫学的に同 定し得るポリぺプチド又はぺプチドを本発明の対象とする。これらのぺプチドは、 試薬若しくは標準物質、 又は後述するように本発明に係る新規な A D A M T Sフ アミリータンパク質に特異的な抗体を作製するための抗原として単独又はキヤリ ァ (例えば、 キーホールリンぺイトへモシァニン又は卵白アルブミン) と結合し て使用できるが、 これらのように別種のタンパク質又は物質を結合したものも本
発明の範囲に包含される。部分配列は、 「独立して存在するもの(f ree st and ing)」であるか、あるいはより大きなポリペプチド内に含まれていても よく、 その中で部分配列は一部分若しくはある領域を形成していてもよい。 最も 好ましくは、 単一の連続した領域としてより大きなポリぺプチドに含まれる。 さらに、 このように特定されたポリペプチド又はペプチドを基にして、 その生 理活性 (例えば血管新生抑制能) を指標とすることにより、 1以上、 例えば 1な いし 100個、 好ましくは 1ないし 30個、 より好ましくは 1ないし 20個、 さ らに好ましくは 1ないし 10個で、 特に好ましくは 1ないし数個のアミノ酸の欠 失、 置換、 付加あるいは揷入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリべ プチド又はペプチドも提供される。 欠失、 置換、 付加あるいは挿入の手段は自体 公知であり、 例えば、 部位特異的変異導入法、 遺伝子相同組換え法、 プライマ一 伸長法又はポリメラ一ゼ連鎖増幅法 (PCR) を単独又は適宜組み合わせて、 例 えば、 Mo lecular Cloning ; A Laborat ory Ma nual、 第 2版、 Sambrookら編、 コールド 'スプリング 'ハーバ一 ' ラボラトリー 'プレス、 コールド 'スプリング 'ハーバ一、 ニューヨーク、 19 89年; [ラボマニュアル遺伝子工学]、村松正實編、丸善株式会社、 1988年; [PCRテク 1989年等の成書に記載の方法に準じて、 あるいはそれらの方法 を改変して実施することができ、 例えば U lme rの技術 (S c i enc e ( 1 983) 219 : 666) を利用できる。 例えば、 N末端を含む一連の残基が欠 失、 又は C末端を含む一連の残基が欠失、 あるいは一方が N末端でもう一方が C 末端を含む 2種の一連の残基が欠失していること以外は上記新規な AD AM T S フアミリ一タンパク質のアミノ酸配列を有する末端切断ポリペプチドを包含する。 また、 構造的又は機能的属性により特徴づけられる部分配列、 例えばアルファ 一ヘリックス及びアルファ一ヘリックス形成領域、 ベ一夕シート及びべ一夕シー ト形成領域、 ターン及び夕一ン形成領域、 コイル及びコイル形成領域、 親水性領 域、 疎水性領域、 アルファ一両親媒性領域、 ベー夕両親媒性領域、 可変領域、 表 面形成領域、基質結合領域、及び高抗原性指標領域を含む部分配列等も好ましい。
また、 生物学的に活性な領域も好ましく、 類似の活性若しくは改善された活性の ある、 又は望ましくない活性を減じた部分配列等がある。 動物、 とりわけヒトに おいて抗原的又は免疫原的な部分配列もまた含まれる。
本発明に係るタンパク質、 ポリべプチド及びそれらの部分配列べプチドのアミ ノ酸配列は保存的アミノ酸置換により変化したものも含まれている。 かかる典型 的な置換は、 A l a、 V a l、 L e u及び I 1 e間; S e r及び T h r間; A s p及び G l u間; 3 11及び& 1 11間;並びに塩基性残基 L y s及び A r g間; あるいは芳香族残基 P h e、 T r p及び T y r間におけるものである。 数個、 5 ないし 1 0個、 1ないし 5個、 又は 1ないし 2個のアミノ酸がいずれかの組み合 わせで置換、 欠失又は付加されているものが特に好ましい。
上記のような変異の導入において、 当該タンパク質の基本的な性質 (物性、 活 性、 又は免疫学的活性等) を変化させないという観点からは、 例えば、 同族アミ ノ酸 (極性ァミノ酸、 非極性ァミノ酸、 疎水性ァミノ酸、 親水性ァミノ酸、 陽性 荷電アミノ酸、 陰性荷電アミノ酸、 芳香族アミノ酸等) の間での相互置換は容易 に想定される。
なお、 本発明に係る新規な AD AM T Sファミリ一夕ンパク質はべプチド結合 又は修飾されたペプチド結合により互いに結合している 2個又はそれ以上のアミ ノ酸を含む任意のペプチドを意味する。 また、 本明細書において、 ペプチド、 ォ リゴペプチド及びオリゴマーとも称する短鎖をポリペプチド、 また、 長鎖のもの をタンパク質ということもある。
本発明に係る新規な AD AM T Sフアミリ一タンパク質は、 2 0種の遺伝子に よりコードされたアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有することもできる。 「タン パク質」 には、 プロセヅシング及びその他の翻訳後修飾のような天然のプロセヅ シングにより ί参飾されたものが含まれるが、 当業者に周知の化学修飾技術によつ ても修飾される。 このような修飾は基礎的な参考書及びさらに詳細な論文並びに 多数の研究文献にも詳しく記載されており、 これらは当業者に周知である。 修飾は、 ペプチド骨格、 アミノ酸側鎖及び Ν末端側又は C末端側等のポリぺプ
チドの任意の部位で行われ得る。 同一の型の修飾は該ポリぺプチドの幾つかの部 位で、 同一又は異なる程度で存在し得る。 また、 タンパク質は多くの型の修飾を も含み得る。 タンパク質は、 ュビキチネ一シヨンの結果として分枝状であっても よく、 分枝を伴う又は伴わない環状のものであってもよい。 環状、 分枝状及び分 枝状かつ環状のタンパク質は翻訳後の天然プロセヅシングにより生じるものであ つてもよく、 あるいは合成法により製造されるものであってもよい。
多飾には、 ァセチル化、 ァシル化、 ADP—リボシル化、 アミド化、 フラビン の共有結合、 ヘム部分の共有結合、 ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有 結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシト一ルの共有結合、 交差架橋、 環化、 ジスルフィ ド結合形成、 脱メチル化、 交差架橋共有結合形成、 シスチン形成、 ピログルタメート形成、 ホルミル化、 ガンマ一カルボキシル化、 グリコシル化、 GPIアンカ一形成、 水酸化、 ヨウ素化、 メチル化、 ミリストイ ル化、 酸化、 タンパク加水分解プロセッシング、 リン酸化、 プレニル化、 ラセミ ィ匕、 グリコシル化、 脂質結合、 硫酸化、 及びセレノィル化、 アルギニル化のよう なトランスファー RNA媒介のタンパク質へのアミノ酸の添加、 並びにュビキチ ネ一シヨン等がある。
例えば、 Prot eins— St ructure and Mo lecula r Propert ies、 第 2版、 T. E. Cre ight on、 W. H. F r e e ma n and C o mp a ny ニューヨーク、 1993年及び Pos t— t rans lat ional Covalent Modif icat io n o f P r o t e i n s、 B. C. J o hn s o n編、 アカデミックプレス、 ニューヨーク、 1983年の Wo Id, F.3 Posttrans lat iona 1 Prot e in Mod if i cat i ons : Perspe ct ive and Prospect s、 1— 12頁; Se if t er e t a丄., Me t h.Enz ymo 1. ( 1990) 182 : 626— 646及び Ra t t an e t a 1. , Prot e in Synthes is :Post-t rans la t i o n a 1 Modif i cat ions and Aging, Ann.
N. Y. Acad. Sc i. ( 1992) 663 : 48 - 62参照。
さらに、本発明に係るポリぺプチド等の検出若しくは精製を容易にするために、 又は別の機能を付加するために、 N末端側や C末端側に別のタンパク質、 例えば アルカリホスファタ一ゼ、 ?一ガラクトシダ一ゼ、 I gG等の免疫グロブリン Fc断片、 Myc— t ag、 His— t ag、 又は F LAG— t a g等のぺプチ ドを直接又はリンカ一ぺプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて 付加することは当業者には容易であり、 これらの別の物質を結合したポリべプチ ド等も本発明の範囲に包含される。 なお、 ヒト以外の動物種の相同遺伝子産物も 当然本発明の範囲に包含される。
(ポリヌクレオチド)
一つの態様において、 本発明に係るポリヌクレオチド及びその相補鎖は、 本発 明に係るポリぺプチド等、 例えば配列表の配列番号 1又は配列番号 4又は配列番 号 8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド 及び該ポリヌクレオチドに対する相補鎖を意味する。 好ましいポリヌクレオチド の塩基配列は、 配列表の配列番号 2又は配列番号 3又は配列番号 7に記載した。 別の態様において本発明は、 本発明に係るポリぺプチド又はべプチドのァミノ 酸配列、 例えば配列表の配列番号 1又は配列番号 4又は配列番号 8のアミノ酸配 列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 好ましくは配列表の配 列番号 2又は配列番号 3又は配列番号 7の塩基配列からなるポリヌクレオチド又 はその相補鎖の対応する領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする ポリヌクレオチドを提供する。 ハイブリダイゼ一ションの条件は、 例えば、 M o 1 e c u 1 a r Cloning; A Laborat ory Manna丄、 第 2版、 Sambrookら編、 コールド 'スプリング'ハーバ一 'ラボラトリ 一'プレス、 コールド■スプリング 'ハーバ一、 ニューヨーク、 1989年等に 従うことができる。 ストリンジェントなハイプリダイゼーション条件は一般に知 られたものであるが、 その一例としては、 50%ホルムアミ ド、 5 XSSC ( 15 OmM NaCl、 15mM クェン酸三ナトリウム)、 50 mM リン酸
ナトリウム, pH7. 6、 5xデンハ一ヅ溶液、 10%デキストラン硫酸、 及び 20 /gZmlの変性剪断サケ '精子 DN Aを含む溶液中、 42 °Cでー晚ハイブ リダイゼーシヨンした後、 室温で 2XSSC .0. 1 %SD S中で一次洗浄し、 次いで、 約 65°Cにおいて 0. lxSSC ' O. 1%SDSで二次洗浄といった 条件であってもよい。
これらのポリヌクレオチドは目的のポリヌクレオチド、 特に配列表の配列番号 2又は配列番号 3又は配列番号 7の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその 相補鎖にハイプリダイズするものであれば必ずしも相補的配列でなくとも良い。 例えば、 配列表の配列番号 2又は配列番号 3又は配列番号 7の塩基配列又はその 相補的配列に対する相同性において、 少なくとも約 40%、 例えば、 約 70%以 上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 さらに好ましくは 約 95%以上である。 また本発明に係るポリヌクレオチドは、 指定された塩基配 列の領域に対応する連続する 10個以上の、 好ましくは 15個以上の、 より好ま しくは 20個以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオ チド及びこれらの相補鎖を包含する。 ここで、 本発明に係る新規な ADAMTS ファミリ一タンパク質又はこれと同様の活性を有するポリぺプチドをコードする ポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、 例えば公知の夕ンパク質発現系を利用し て発現夕ンパク質の確認を行い、 その生理活性を指標にして選別することにより 行なうことができる。 無細胞タンパク質発現系を利用する場合は、 例えば胚芽、 家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用できる (Nature (19 57) 179 : 160 - 161)。
上記本発明に係るポリヌクレオチドは、 本発明に係るポリぺプチド等の製造に おいて、 本発明に係る新規な ADAMT Sフアミリ一タンパク質をコードする核 酸、 例えばその遺伝子若しくは mRNAの検出用プロ一プ若しくはプライマ一 (primer) として、 又は遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴ ヌクレオチド等として有用である。 その意味で、 本発明に係るポリヌクレオチド 及びォリゴヌクレオチドは翻訳領域のみでなく、 非翻訳領域に対応するものも包
含する。 例えば、 アンチセンスによって本発明に係る新規な AD AMT Sフアミ リー含有タンパク質の発現を特異的に阻害するためには、 当該 ADAMT Sファ ミリ一タンパク質に固有な領域の塩基配列を用いることが想定される。 一方、 保 存配列を用いることにより当該 ADAMTSフアミリータンパク質を含む複数の ADAMTSフアミリータンパク質又は TSP 1含有タンパク質の発現を同時に 抑制することも可能と考えられる。 - 本発明に係るポリヌクレオチドは、 一般的には、 修飾されていない RN A若し くは D N A、又は ί 飾された RNA若しくは DNAであってもよい。「修飾された RNA若しくは DNA」 は、 安定性又はその他の理由により、 修飾された塩基を 有する: DNA又は RNA、 並びに修飾された骨格を有する D N A又は R N Aを包 含する。 「修飾された」塩基は、例えば、 トリチル化塩基及びィノシンのごとき通 常的でない塩基を包含する。また、 「修飾された」骨格は、 フォスフォジエステル 骨格が、 例えばフォスフォロチォェ一ト (phosphorothioat e) 骨格及びモルフォリノ (mo rpho 1 ino) 骨格のごとき通常でない骨格を 包含する。 種々の修飾が DN A及び RN Aについて行われており、 典型的に天然 において見いだされるポリヌクレオチドの化学的、 酵素的又は代謝的に修飾され た形態、 並びにゥィルス及び細胞に特徴的な D N A及び R N Aの化学的形態を包 含する。 また、 「RNA若しくは DNA」は、 しばしば「オリゴヌクレオチド」 と 称する短いポリヌクレオチドを包含する。
本発明に係るポリヌクレオチドは、 対象の RNA、 DNAによりコードされる アミノ酸配列を変化させるものであってもよく、 対象配列によりコードされるポ リペプチドにおけるアミノ酸の置換、 付加、 欠損、 融合及び末端切断を招く場合 があるが、 本発明はこれらのものも包含する。 これらの変化は 1又はそれ以上の 置換、 付加、 欠損が任意の組み合わせで起こることにより、 アミノ酸配列が変化 し得るものであり、 これらの変化は、 突然変異技術、 直接的合成、 及び当業者に 既知のその他の組換え技術により製造できる。
本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列及びポリぺプチドのァミノ酸配列の
同一性は、 本発明に係る RNA、 DNA又は本発明に係るタンパク質の同一性の 尺度である。 一般的には、 最高の合致が得られるように配列を並置する。 同一性 はそれ自体当該分野において認識された意味を有し、 公表された方法を用いて算 出できる。
例えば、 C o mp u t a t i o n a 1 Mo lecular Bio log , Lesk, A. M. 編、 オックスフォード 'ユニバーシティー 'プレス、 ニュー ヨーク、 1988年; Biocomput ing : Inf ormat ics a n d Genome Proj ect s, Smith, D. W. 編、 ァカデミ ック ·プレス、 ニューヨーク、 1993年; Comput er Ana 1 y s i s of Sequence D a t a , パート I , G r i f f i n, A. M. 及び Grif f in, H. G. 編、 ヒューマン .プレス、 二ユージャ一ジ一、 1 994年; Sequence Analys is in Mo l e cular Bio logy, on Heijne, G.、 ァカデミヅク ·プレス、 198 7年;及び Sequence Analys is Primer, G r i b s k o v, M. 及び D eve r e ux, J. 編、 ェム 'ストックトン 'プレス、 二 ユーヨーク、 1994年に記載の方法が利用できる。 二つの配列の同一性を測定 する方法は多くあるが、 用語「同一性」 は当業者によく知られている (Sequ e n c e Analys i s in Mo l ecul ar Bi o logy, von He i j ne, G.ヽ ァカデミヅク .プレス、 1987年; Sequen c e Analys is Primer, Gr ibskov, M. 及び D e v e r eux, J. 編、 Mストヅクトン ·プレス、 ニューヨーク、 1991年;並 びに C a r i 110 , H. and Lipman, D., S I AM J. App l i ed Math. (1988) 48 : 1073 )0
配列間の同一性又は類似性を測定するために通常用いられる方法は Car i 1 Ιο, Η. and Lipman, D., S I AM J. Appl ied M at h. (1998) 48 : 1073等に開示されているが、 これらに限定するも のではない。 同一性及び類似性を決定する方法は、 公に入手できるコンピュータ
—プログラムに集成されている。 二つの配列間の同一性及び類似性を測定する好 ましいコンピュータ一プログラム法には、 GCGプログラムパッケージ (Dev e r e x, J., e t a 1. , N c l e i c Ac ids R e s e a r ch ( 1984) 12 (1) : 387)、 BLAST P、 BLAST N、 及び FA STA (At s chul, S. F. e t a 1.3 J. Mo l e c. B i o l. ( 1990) 215 : 403) 等があるが、 これらに限定するものではない。 さらにまた、 本発明におけるポリヌクレオチドの別の態様は、 上記ポリヌクレ ォチド又はその相補鎖をェクソンとして含有するヒトゲノム遺伝子断片たるポリ ヌクレオチド、 該ポリヌクレオチド又はその相補鎖をなす塩基配列の少なくとも 約 15個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド、 該ポリヌクレオチド又 はその相補鎖とストリンジヱントな条件下でハイブリダイゼーシヨンするポリヌ クレオチドを包含する。
上記本発明に係るポリヌクレオチドは、 例えば上記新規な ADAMTSフアミ リータンパク質の製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、 あるいは核酸 に関する試薬 ·標準品としても利用できる。 例えば、 上記ポリヌクレオチドをマ —カー又はプライマ一として、 後述するように、 上記ポリヌクレオチドの変異や 発現に関連する疾病の診断方法に使用できる。 また、 後述するように、 当該疾病 の防止及び Z又は治療に用いる医薬組成物の成分の一つとして用いることができ o
(形質転換体)
本発明は、 大腸菌、 酵母、 枯草菌、 昆虫細胞、 動物細胞、 並びにカイコ、 マウ ス、 ラヅト、 ゥシ、 ヒヅジ、 ゥマ等の実験動物等の自体公知の宿主を利用した遺 伝子組換え技術によっても、 又は本発明に係る DN A由来の RN Aを用いた無細 胞夕ンパク質合成法により、 本発明に係る新規な AD AMT Sファミリ一夕ンパ ク質及びその由来物からなるぺプチド及びポリぺプチドは提供可能である。 後述 する実施例では、 哺乳動物由来の COS 7細胞及び昆虫細胞系を宿主として利用 し、 上記ポリぺプチドを遺伝子工学的に発現した。
形質転換は、 自体公知の手段が応用され、 例えばレブリコンとして、 プラスミ ド、 染色体、 ウィルス等を利用して宿主の形質転換が行われる。 より好ましい系 としては、 遺伝子の安定性を考慮するならば、 染色体内へのインテグレート法で あるが、 簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系の利用である。 ベクターは、 選択した宿主の種類により選別され、 発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に 関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。 組合せは原核細胞、 真核 細胞によって分別され、 プロモ一夕一、 リボソーム結合部位、 夕一ミネ一夕一、 シグナル配列、 ェンハンサ一、 マーカ一配列、 転写配列、 非翻訳配列、 スプライ シング及びポリァデニル化シグナル、 m R N Aを安定ィ匕する配列のごとき非コ一 デイング 5'及び 3'配列等を自体公知の方法によって組合せ利用できる。なお、 マーカ一配列は、 pQEベクタ一 (QIAGEN社製) 中に提供されるようなへ キサ一ヒスチジンペプチド (Ge nt z e t a 1 Proc. Nat l. Acad. S c i.5 USA ( 1989) 86 : 821 -824に記載される)又 は HAタグ(Wi lson Θ t al., Cel l (1984) 37 : 767) が好適に例示される。
DN Aの宿主細胞への導入は、 例えば、 Davisら、 Bas ic Me t h o d s in Mo lecular B io logy、 1986年; Mo lec u 1 a r Cloning;A Laborat ory Manual、第 2版、 S amb rookら編、 コールド ·スプリング ·ハーバ一 ·ラボラトリ一 'プレ ス、 コ一ルド 'スプリング 'ハーバ一、 ニューヨーク、 1989年の如き多くの 標準的な実験マニュアルに記載される方法により行なうことができ、 例えばリン 酸カルシウムトランスフエクシヨン、 DEAE—デキストラン媒介トランスフエ クシヨン、 トランスべクシヨン、 マイクロインジェクション、 陽イオン脂質媒介 トランスフエクシヨン、エレクトロポレーシヨン、形質導入、スクレープ負荷(s cra e 1 o a d i n g)、ノ リスティック導入(b a 11 i s t i c in troduct i on)及び感染等がある。
適当な宿主の代表的なものには、 細菌細胞、 例えば連鎖球菌属 (st rept
o c o c c i )、 ブドゥ球菌属 (staphylococci )、 大腸菌 (E . c o l i)、 ストレプトミセス (Strept omyces)及び枯草菌(Bac i 1 lus subt i l is)細胞;真菌細胞、 例えば酵母細胞及びァスペルギ ルス属(Aspergi l lus)細胞;昆虫細胞、例えばドロソフイラ S 2 (D rosophi la S 2 )及びスポドプテラ S f 9 ( S p o d o p t e r a S f 9)細胞;動物細胞例えば CHO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 B HK、 293及びボウズ(Bows)メラノ一マ細胞;並びに植物細胞等がある。 ベクターには、 染色体、 ェビゾーム及びウィルス由来のベクター、 例えば細菌 プラスミ ド由来、 バクチリオファージ由来、 トランスポゾン由来、 酵母ェピソ一 厶由来、 揷入エレメント由来、 酵母染色体エレメント由来、 例えばバキュロウィ ルス、 パポバウィルス、 例えば SV40、 ワクシニアウィルス、 アデノウイルス、 鶏痘ウィルス、 仮性狂犬病ウィルス及びレトロウイルス等のウィルス由来のべク 夕一、 並びにそれらを組み合わせたベクタ一、 例えばプラスミ ド及びパクテリオ ファージの遺伝学的エレメント由来のベクタ一、 例えばコスミ ド及びファージミ ド等がある。
発現系の構築物には発現を制御及び引き起こす調節領域を含有させることがで きる。 通常、 宿主中に DNAを保持、 伸長又は発現するためには、 タンパク質を 発現するのに適した任意の系又はべク夕一を選択することが必要となる。 これら は周知の技術により適当な DNA配列を発現系に揷入することができ、 例えば、 Molecular Cloning ; A Laborat ory Manna 1、 第 2版、 Sambrookら編、 コールド 'スプリング 'ハーバー 'ラボラ トリー 'プレス、 コールド 'スプリング ·ハーバ一、 ニューヨーク、 1989年 に記載されている。 また、 翻訳タンパク質を、 小胞体内腔、 ペリプラスミックス ペース又は細胞外璟境へ分泌させるために、 適当な分泌シグナルを発現するタン パク質に組み込むことができる。 これらのシグナルはタンパク質に本来的なもの であってもよく、 あるいは異種性のシグナルであってもよい。
形質転換体は、 各宿主の培養に最適な自体公知の条件を選択して培養される。
培養は、 発現産生される本発明に係る新規な AD AM T Sファミリ一タンパク質 及びその由来物からなるぺプチド及びポリぺプチドの生物活性をマーカ一にして 行なってもよいが、 培地中の形質転換体量を指標にして継代培養又はバヅチ培養 によって行ってもよい。
目的とするタンパク質、 ポリペプチド又はペプチドが上記形質転換体の培養培 地中に分泌される場合は、 該培地を回収し、 該培地から精製することによりそれ らを得ることができる。 さらに、 それらが上言 3形質転換体の細胞内に生成される 場合は、 まず細胞を溶解し、 次いで、 タンパク質を回収することによって目的の タンパク質、 ポリペプチド又はペプチドを得ることができる。 また、 目的とする タンパク質、 ポリペプチド又はペプチドをスクリーニングアツセィのために発現 させる場合、 一般的には、 細胞表面にタンパク質を生産させるのが好ましい。 こ の場合、 スクリーニングァヅセィに使用する前に細胞を集めてもよい。
また、 カイコ、 マウス、 ラット、 ゥシ、 ヒヅジ、 ゥマ等の実験動物等に本発明 に係る遺伝子を導入して組換え動物を作製し、 目的とするタンパク質を当該動物 の生体内で発現させることも可能である。 このような技術は、 当該分野において は公知である。
(新規な A D AM T Sフアミリードメイン含有タンパク質及びその由来物の精 製 -回収)
本発明に係る新規な AD AM T Sファミリータンパク質及びその由来物からな るペプチド及びポリペプチドは、 ヒトやその他哺乳動物の細胞、 組織、 培養され た該細胞若しくはその培養培地(細胞培養物)、上記遺伝子組換え技術により作製 した細胞又はその培養物、 又は上記遺伝子組み換え技術により作製した組換え動 物由来の試料、 例えば細胞、 組織、 乳汁、 血液、 尿等から周知の精製方法により 得ることができる。 その方法には例えば硫酸アンモニゥム又はエタノール沈殿、 酸抽出、 陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、 ホスホセルロースクロ マトグラフィー、 疎水性相互作用クロマトグラフィー、 親和性ク口マトグラフィ ―、 ヒドロキシルァパタイ トクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィ
—等がある。 これらの方法は適宜組み合わせて行ってもよい。 好ましくは、 アミ ノ酸配列の情報に基づき、 該アミノ酸配列を認識する抗体を作成し、 ポリクロ一 ナル抗体又はモノクローナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。 また、高速液体クロマトグラフィ一を精製に用いるのが最も好ましい。簡便には、 へパリンを利用した親和性クロマトグラフィーが利用できる。 さらに、 精製過程 において、 生理活性 (例えば血管新生抑制能) を指標にして、 精製の確認を行う こともできる。 タンパク質が単離及び/又は精製中に変性した場合、 再び活性な 立体配座にするために、タンパク再生のための周知の技法を用いることができる。 (抗体)
抗体は、 本発明に係る新規な ADAMTSファミリ一タンパク質及びその由来 物からなるぺプチド又はポリぺプチド、 あるいはそれらの抗原決定基を含むぺプ チドから選択したものを抗原として用いて作製する。 抗原は当該 ADAMT Sフ ァミリ一タンパク質自体又はその断片でもよく、 少なくとも 8個、 好ましくは少 なくとも 10個、 より好ましくは少なくとも 12個、 さらに好ましくは 15個以 上のアミノ酸で構成される。 当該 ADAMTSファミリ一タンパク質に免疫特異 的な抗体を作製するためには、 新規な ADAMTSフアミリ一タンパク質に固有 な配列からなる領域を用いることが好ましい。 このアミノ酸配列は、 必ずしも配 列表の配列番号 1又は配列番号 4又は配列番号 8と相同である必要はなく、 タン パク質の立体構造上の外部への露出部位が好ましく、 露出部位がアミノ酸の一次 配列上で不連続部位であつたとしても当該露出部位について連続的なアミノ酸配 列であればよい。 抗体は、 当該 ADAMTSファミリ一タンパク質及びその由来 物からなるぺプチド又はポリべプチドを免疫学的に結合又は認識する限り特に限 定されない。 この結合又は認識の有無は、 公知の抗原抗体結合反応によって決定 される。 「免疫特異的」とは、先行技術の他の関連タンパク質に対する親和性より も、 当該 ADAMTSファミリータンパク質に対する親和性が実質的に大きいこ とを意味する。
抗体の生産は、 本発明に係る新規な ADAMTSファミリータンパク質、 その
由来物からなるぺプチド又はポリぺプチドを、 アジュバントの存在又は非存在下 で、 単独又は担体に結合して、 動物に対して体液性応答及び Z又は細胞性応答等 の免疫誘導を行なうことによって行われる。 担体は、 それ自体が宿主に対して有 害作用をおこさなければ、 特に限定されず例えばセルロース、 重合アミノ酸、 ァ ルブミン等が例示される。 免疫される動物は、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ャギ、 ゥマ等が好適に用いられる。 ポリクロ一ナル抗体は、 自体公知の血清からの抗体 回収法によって取得される。 好ましい手段としては、 免疫ァフィ二ティークロマ トグラフィ一法である。
モノクローナル抗体の生産は、 上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細 胞 (例えば、 脾臓又はリンパ節由来) を回収し、 自体公知の永久増殖性細胞 (例 えば、 P 3—X63— Ag8株等のミエローマ株) への形質転換手段を導入する ことによって行われる。 例えば、 上記抗体産生細胞と永久増殖性細胞とから作成 されたハイプリド一マをクロ一ン化し、 本発明に係る新規な ADAMT Sフアミ リータンパク質を特異的に認識する抗体を産生しているハイプリド一マを選別し、 該ハイプリドーマの培養液から抗体を回収する。 実例としては、 ハイプリドーマ 法(Kohl e r, G. and Mi l st ein, C., Nature (19 75) 256 : 495 - 497);トリオ一マ法(K o z b o r e t a 1 I mmuno log Today (1983) 4 : 72 );及び E B V—ハイブリ ドーマ法 (Co l e e t a 1. , Monoc lonal Ant ibodi e s and Cancer Therapy, Alan R L i s s , In c., (1985) : 77 - 96) に記載されるような種々の技法がある。
一本鎖抗体の産生のために記載された技術(米国特許第 4946778号)は、 本発明に係るタンパク質に対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。 また、 トランスジエニックマウス、 又は他の哺乳動物を包含する他の生物を用いて、 哺 乳動物における免疫学的反応を誘起する方法によりヒト化抗体を発現させてもよ い。
上記抗体は、 本発明に係る新規な A D A M T Sファミリ一タンパク質を発現す
るクローンの単離又は同定、 あるいは親和性クロマトグラフィーによる該タンパ ク質の精製に使用できる。
また、 上記抗体を用いて、 当該新規な AD AM T Sファミリータンパク質が関 与する疾患の診断及び治療に使用できる。
(スクリ一ニング及びスクリ一ニングされた化合物)
かくして調製された新規な AD AM T Sフアミリ一タンパク質及びその由来物 からなるぺプチド又はポリべプチド、 これらをコードするポリヌクレオチド及び その相補鎖、 これらのアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づき形質転換させた 細胞、 又はこれらを用いるタンパク質合成系並びに当該 AD AM T Sフアミリー タンパク質及びその由来物からなるぺプチド又はポリべプチドを免疫学的に認識 する抗体は、 単独又は複数手段を組合せることによって、 当該 AD AM T Sファ ミリ一タンパク質及びその由来物からなるぺプチド及びポリべプチドに対する活 性阻害剤又は活性賦活剤のスクリーニングに有効な手段を提供する。 例えば、 ぺ プチド又はポリぺプチドの立体構造に基づく ドラヅグデザィンによる拮抗剤の選 別、 タンパク質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、 抗体を利 用した抗体認識物質の選別等を、 自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利 用して実施可能である。 AD AM T Sフアミリ一タンパク質は哺乳動物宿主に広 く存在し、 多くの生物学的機能に関与しており、 多くの疾患にも関わっている。 したがって、 本発明に係る新規な AD AM T Sファミリータンパク質を、 その活 性を阻害又は促進する作用を有する化合物を見い出すためのスクリーニングに用 いることは有用である。
具体的には、 本発明に係る新規な AD AM T Sフアミリ一タンパク質及びその 由来物からなるぺプチド又はポリべプチドを用いて、 スクリーニングの対象とさ れる化合物とこれらペプチド又はポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条 件を選別し、 この相互作用の有無を検出することのできるシグナル及び Z又はマ —カー (第 2の成分) を使用する系を導入し、 次いで、 このシグナル及び Z又は マーカ一の存在又は不存在又はその変化 (量的変化及び/又は質的変化を含む)
を検出することにより、 当該 ADAMTSフアミリ一タンパク質及びその由来物 からなるぺプチド及びポリぺプチドの活性を賦活又は阻害する化合物をスクリ一 ニング可能である。 例えば、 当該 ADAMTSファミリ一タンパク質を用いて、 スクリーニングの対象とされる化合物中で小型分子基質及びリガンドの結合を評 価してもよい。 これらの基質及びリガンドは天然の基質及びリガンドであっても よく、 あるいは構造又は機能を模倣したものであってもよい (Co l igan e t a 1. , Current Prot ocol s in I mmu no lo gy (1991) 1 (2): Chap t e r 5参照)。
さらにまた、 本発明に係る新規な ADAMTSフアミリータンパク質の cDN A、 タンパク質及び該タンパク質に対する抗体を用いて、 細胞における当該 AD AMT Sファミ リ一夕ンパク質の mRN A及び夕ンパク質の産生に対する添加化 合物の影響を調べるためのスクリーニングァヅセィを行ってもよい。 例えば、 当 該分野で知られた一般的方法により、 モノクロ一ナル及びポリク口一ナル抗体を 用いて、 当該 AD AMT Sファミリ一含有夕ンパク質の分泌又は細胞結合レベル を測定するための酵素免疫固相法 (En z yme Linked I mmu no S o r vent As say) (ELI S A)を構築してもよく、 また、 これを用 いて当該 ADAMTSフアミリータンパク質の産生を阻害又は促進し得る因子を 適当に処理された細胞又は組織から見い出すこともできる。 スクリーニングアツ セィを行なうための一般的方法は当該分野においてよく知られたものである。 スクリーニングの対象とされる化合物としては、 例えば細胞、 無細胞調製物、 化学ライブラリ一及び天然産物混合物等が挙げられる。
このようにしてスクリーニングされた化合物は、 本発明に係る新規な ADAM T Sフアミリ一タンパク質及びその由来物からなるぺプチド及びポリぺプチドに ついての活性阻害剤、 活性拮抗剤、 活性賦活剤の候補化合物として利用可能であ る。 また、 遺伝子レベルでの当該 ADAMTSファミリ一タンパク質及びその由 来物に対する発現阻害剤、 発現拮抗剤、 発現賦活剤の候補化合物としても利用可 能である。 それらは、 ADAMTSファミリ一タンパク質に由来する各種症状の
予防 ·治療効果を期待できる。 上記スクリーニング方法により選別された候補化 合物は、 生物学的有用性と毒性とのバランスを考慮してさらに選別することによ つて、 医薬組成物として調製可能である。
(医薬組成物)
本発明において提供される新規な AD AM T Sフアミリータンパク質及びその 由来物からなるぺプチド又はポリぺプチド、 これらをコードするポリヌクレオチ ド及びその相補鎖、 これらの塩基配列を含むベクター、 当該 AD AM T Sフアミ リ一タンパク質及びその由来物からなるぺプチド又はポリべプチドを免疫学的に 認識する抗体、 並びに上記スクリーニング方法により選別された化合物は、 当該 AD AM T Sフアミリ一含有夕ンパク質の活性阻害 ·拮抗 ·賦活等の機能を利用 した治療薬等の医薬手段として使用可能である。 なお、 製剤化にあたっては、 自 体公知のペプチド又はポリペプチド、 タンパク質、 ポリヌクレオチド、 又は抗体 等それそれに応じた製剤化方法を導入すればよい。
例えば、 本発明は、 抗体及び/又は T細胞を産生させるに十分な上記新規な AD AM T Sファミリ一タンパク質又はその断片を哺乳動物に接種して、 哺乳動 物における免疫学的反応を誘起する方法による治療にも使用できる。
本発明はさらに、 本発明に係る新規な AD AM T Sファミリ一夕ンパク質をィ ンビボで発現させるための核酸ベクターを送達して、 かかる免疫学的応答を誘導 し、 該動物を疾患から保護する抗体を生じさせることに使用できる。
さらに、 本発明は、 哺乳動物宿主中に導入された場合、 上記新規な AD AM T Sフアミリータンパク質に対する哺乳動物の免疫学的応答を誘導させる免疫学的 ワクチン処方 (組成物) に使用できる。 該組成物は当該新規な AD AM T Sファ ミリータンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる。 ワクチン 処方は、 さらに適当な担体を含んでいてもよい。 当該 AD AM T Sファミリ一夕 ンパク質は胃で分解される可能性があるので、 好ましくは非経口投与する。 非経 口投与としては、 例えば皮下筋肉内、 静脈、 皮内等への注射による投与が挙げら れる。 非経口投与に適した処方は、 抗酸化剤、 ノ ッファー、 制細菌剤及び処方を
レシピエントの血液と等張にする溶質を含んでいてもよい水性又は非水性滅菌注 射用溶液;並びに懸濁剤又は増粘剤を含んでいてもよい水性又は非水性滅菌懸濁 液を包含する。 処方を 1回量又は複数回量として容器に入れて提供してもよく、 例えば、 密封アンプル及びバイアルに入れて提供してもよく、 また使用直前に滅 菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として保存してもよい。 またヮ クチン処方は、 水中油系及び当該分野で知られた他の系のごとき処方の免疫原性 を高めるためのアジュバント系を含んでいてもよい。 用量は、 個々のワクチンの 活性に左右され、 通常の実験により容易に決定できる。
本発明は、 AD AM T Sファミリ一タンパク質の関与する生体機能の解明、 例 えば、 卵の成熟及び排卵■受精のプロセスの解明、 癌化のプロセスの解明、 血管 新生のプロセス解明や血管新生に関連する疾患 (血管新生病又は血管新生不全症 等) の解明、 予防、 治療及び診断を可能とする上で非常に有用なものになると期 待される。 また、 本発明は、血管新生が原因となる疾患(いわゆる血管新生病)、 例えば固形悪性新生物、 眼科的疾患 (増殖性糖尿病性網膜症、 未熟児網膜症、 虹 彩ルべォ一シス、鎌状赤血球網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、 網膜中心動脈閉塞症、老人性円板状黄斑変性症、その他虚血をきたす眼科疾患)、 慢性関節リウマチ、 血管腫、 血管線維腫、 尋常性乾癬、 粥状動脈硬化巣外膜の異 常毛細血管網等、 また逆に血管新生が不十分である血管新生不全症、 例えば虚血 性心疾患、 下肢の閉塞性動脈硬化症での側副血行路形成不全や、 創傷治癒過程で の血管新生が不十分なことによる難治性皮膚潰瘍、 難治性胃潰瘍、 手術後の癒合 不全等の治療方法を提供する。 さらに、 本発明遺伝子の発現が性周期と関連して おり、 排卵に伴う卵巣の細胞外マトリックスの分解及び再構築に関与することが 示唆されたことから、 該細胞外マトリックスの分解及び再構築に関連する疾患の 解明、 防止及び Z又は診断,治療にも有用である。 すなわち、 排卵障害による不 妊症の解明、 防止及び Z又は診断 ·治療に有用であり、 また逆に避妊にも有用で ある。 また、 本発明遺伝子が第 5染色体短腕 1 5 . 2 - 1 5 . 3 ( 5 p 1 5 . 2 - 1 5 . 3 ) に存在することを確認したこと、 5 p l 5 . 2— 1 5 . 3は 5 P
—症候群 (Cr i— du—chat s ndr ome) の欠失部位であること が報告されていることから、 本発明遺伝子は 5 P—症候群の解明、 防止及び/又 は診断 ·治療にも有用である。
本発明に係る新規な ADAMTSファミリ一タンパク質及びその活性が過剰な 場合、 有効量の上記阻害剤化合物を医薬上許容される担体とともに対象に投与し て、 当該 ADAMTSファミリ一タンパク質の活性を阻害し、 そのことにより異 常な症状を改善することもできる。
さらに、 発現プロヅク法を用いて内在性の上記 AD AM T Sファミリ一タンパ ク質をコードしている遺伝子の発現を阻害してもよい。 細胞内で生成した、 ある いは別個に投与されたアンチセンス配列を、 かかる知られた方法に使用する (例 え fe、 O l i goae oxynuc l e o t ide s as Ant i s ens e Inhib i t o r s of Gene Expre s s i on , CRC Pr e s s, Bo c a Rat on, F L ( 1988) 中、 O ' Co c c o r, J. Neur o chem (1991) 56 : 560参照)。別法として、遺伝子と ともに三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを用いてもよい (例えば、 Le e e t a 1 Nuc l e i c Ac ids Re s (1979) 6 : 30 73 ; Co oney e t a 1 S c i enc e (1988) 241 : 45 6 ; D e r van e t a l., S c i enc e (1991) 251 : 136 0参照)。これらのオリゴヌクレオチドはそれ自体投与することができ、あるいは 関連オリゴマーをインビボで発現させることもできる。
本発明に係る新規な ADAMT Sフアミリ一タンパク質及びその活性の発現不 足に関連する異常な症状の治療には、 1つの方法として当該 AD AMT Sフアミ リータンパク質自体あるいはこのタンパク質をコードする遺伝子を活性化する治 療上有効量の化合物 (促進剤) を医薬上許容される担体とともに投与し、 そのこ とにより異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙げられる。別法として、 遺伝子治療を用いて、 対象中の細胞による当該 ADAMTSフアミリータンパク 質の細胞内での生成を有効ならしめてもよい。 例えば、 上記のごとく本発明に係
るポリヌクレオチドを処理加工して複製欠損レトロウイルスべク夕一に入れて発 現するようにしてもよい。 次いで、 レトロウイルス発現構築物を単離し、 本発明 に係る新規な AD AMT Sファミリ一夕ンパク質をコ一ドしている RN Aを含む レトロウイルスプラスミドベクタ一で形質導入したパッケージング細胞中に導入 して、 今度はパッケージング細胞が目的遺伝子を含む感染性ウィルス粒子を生成 するようにしてもよい。 インビボでの細胞の処理加工及びインビボでのタンパク 質の発現のために、 これらのプロデューサ一細胞を対象に投与してもよい。 遺伝 子治療の概説としては、 Human Mo lecular Genet ics, T. Strachan and A. P. Read, BIOS Scient if ic Publ ishers L t d( 1986 )中、第 20章、 G e n e T h e r a p y and other Mo lecular Genet i c— b a s e d Therapeut ic Approaches (及びその中の引用 文献) 参照。 もう 1つの方法は、 適当な医薬担体と混合して治療量の上記新規な ADAMTSフアミリータンパク質を投与することである。
本発明に係る新規な ADAMT Sフアミリータンパク質及びその由来物からな るべプチド又はポリぺプチドあるいは化合物の処方及び投与形態は、 適当な医薬 担体と組み合わせて処方することが好ましい。 かかる処方は、 治療上有効量の夕 ンパク質又は化合物、 及び医薬上許容される担体又は賦形剤を含む。 かかる担体 としては、 セィライン、 緩衝化セィライン、 デキストロ一ス、水、 グリセロール、 エタノール、 及びそれらの混合物が挙げられるが、 これらに限らない。 処方は投 与経路に適したものとすべきであり、 当業者によく知られている。 さらに本発明 は、 上記本発明成分の 1種又はそれ以上を充填した、 1個又はそれ以上の容器を 含んでなる医薬パック及びキットにも関する。
本発明に係るタンパク質及びその由来物からなるぺプチド又はポリべプチド及 び化合物は単独で使用してもよく、 あるいは治療に必要な他の化合物と一緒に使 用してもよい。 医薬組成物の全身投与の好ましい形態は、 注射であり、 とりわけ 静脈注射である。 皮下、 筋肉内又は腹腔内のような他の注射経路を用いることも
できる。 全身投与の別の手段としては、 胆汁酸塩又はフシジン酸又は他の界面活 性剤のような浸透剤を用いる経粘膜又は絰皮投与が挙げられる。 さらに、 腸溶処 方又はカプセル処方がうまく処方されるならば、 経口投与も可能である。 これら のタンパク質又は化合物の投与は局所的なものであってもよく、 膏薬、 パスタ、 ゲル等の形態であってもよい。
必要な用量範囲は、 ぺプチド、 投与経路、 処方の性質、 '対象の症状の性質、 及 び担当医師の判断による。 しかしながら、 適当な用量は対象の体重 1 k gあたり 0 . 1ないし 1 0 0〃gの範囲である。 しかしながら、 種々の使用タンパク質及 び化合物、 種々の投与経路のさまざまな有効性を考慮すれば、 必要な用量はさら に広範囲なものである。 例えば、 経口投与には静脈注射よりも多い用量が必要で ある。 当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用い てこれらの用量の変更を行なうことができる。
遺伝子治療において、 治療に使用するタンパク質を対象中において生成させる こともできる。例えば、タンパク質をコードしている D N A又は R N Aを用いて、 例えばレトロウィルスプラスミドベクターを用いることによりェクスビボ (e x v i v o ) において対象由来の細胞を処理加工し、 次いで、 細胞を対象に導入す ることもできる。
(診断薬及び診断方法)
また本発明からなる新規な AD AM T Sフアミリータンパク質及びその由来物 からなるペプチド又はポリペプチド、 これらをコードするポリヌクレオチド及び その相補鎖、 並びに当該 AD AM T Sファミリ一タンパク質及びその由来物から なるぺプチド又はポリべプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、 診断マ一カーや試薬等として使用可能である。 また、 これらのうちの 1種又はそ れ以上を充填した、 1個又はそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。 なお、製剤化にあたっては、 自体公知のぺプチド又はポリぺプチド、 夕ンパク質、 ポリヌクレオチド、 又は抗体等それそれに応じた製剤化手段を導入すればよい。 診断方法としては、 例えば本発明に係る新規な A D A M T Sファミリ一タンパ
ク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドをコードしている核酸と の相互作用 ·反応性を利用して、 相応する核酸の存在量、 及び/又は当該タンパ ク質及びその由来物からなるぺプチド又はポリべプチドについて個体中の生体内 分布、 及び Z又は個体由来の試料中の存在、 及び/又は個体由来の試料中の存在 量を、 自体公知の方法を利用して測定し、 それらの存在の有無及び/又は存在量 の変化 (増加又は減少) により、 本発明に係る当該 ADAMTSファミリ一タン パク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドの発現又は活性に関連 する疾患の有無及び/又はその変化 (増悪又は軽減) を判定できる。 すなわち、 当該 AD AMT Sファミリ一夕ンパク質及び'/又は核酸をマ一カーとして検査す るのである。 その測定法は、 自体公知の抗原抗体反応系、 酵素反応系、 又は PC R反応系等を利用すればよい。
診断用の核酸は、 個体由来の試料、 例えば細胞、 血液、 尿、 唾液、 組織生検又 は剖検材料等から得られる。 ゲノム DNAを検出に直接使用してもよく、 あるい は分析前に P C R若しくはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅して もよい。 RNA又は cDNAを同様に用いてもよい。 正常遺伝子型との比較にお いて、 増幅生成物のサイズ変化により欠失及び挿入を検出できる。 増幅 DNAを 標識した上記 A D AM T Sファミリ一夕ンパク質をコードする D N Aにハイプリ ダイゼーシヨンさせることにより点突然変異を同定できる。 R Nァ一ゼ消化によ り、 又は融解温度の差により、 完全に対合した配列を誤対合二重らせんから区別 できる。 DNA配列の相違はまた、 変性物質を含有する又は含有しないゲル中の DNA断片の電気泳動における移動度の変化を検出することにより、 又は直接的 な DNA配列決定により検出できる (例えば、 Me y e r s e t al., Sc ience (1985) 230 : 1242参照)。特異的な位置での配列の変 化はまた、 ヌクレアーゼ保護ァヅセィ、 例えば ァ一ゼ及び S 1保護又は化学 的切断法によっても明らかにすることができる (例えば、 C o t t on e t al., Pr o c. Nat l. Acad. Sc i., USA ( 1985) 85 : 4397-4401参照)。また、上記 ADAMTSフアミリ一タンパク質をコー
ドする DN A又はその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイ (a r r ay) を構築して、 例えば遺伝学的変異の効果的なスクリーニングを行なうこと ができる。 アレイ法はよく知られており、 広い適用範囲を有し、 遺伝子発現、 遺 伝学的連関、 及び遺伝学的変異可能性を包含する分子遺伝学における種々の問題 を調べるために用いられ得る (例えば、 M. Che e e t al., Sc ie n c e ( 1996) 274 : 610参照)。
また、 本明細書記載の方法によって上記 AD AMTSフアミリータンパク質を コードする D N Aの変異 ·減少 '増加を検出することにより、 細胞 ·組織の癌化 のレベルを診断する方法を提供する。また、本発明遺伝子が 5 p 15. 2— 15. 3に存在することを確認したこと、 5 p l 5. 2- 15. 3は 5 P—症候群 (Cr i-du-chat syndrome) の欠失部位であることが報告さ れていることから、 本発明に係る DN Aの変異 ·減少 ·増加を検出することで、 5 P—症候群の診断方法も提供する。さらに、本発明に係る D N Aの変異'減少 · 増加を検出することで、 血管新生が原因となる疾患 (いわゆる血管新生病) とし て固形悪性新生物、 眼科的疾患 (増殖性糖尿病性網膜症、 未熟児網膜症、 虹彩ル べォ一シス、 鎌状赤血球網膜症、 網膜中心静脈閉塞症、 網膜静脈分枝閉塞症、 網 膜中心動脈閉塞症、老人性円板状黄斑変性症、 その他虚血をきたす眼科疾患)、慢 性関節リウマチ、 血管腫、 血管線維腫、 尋常性乾癬、 粥状動脈硬化巣外膜の異常 毛細血管網等、 また、 逆に血管新生が不十分である血管新生不全症として虚血性 心疾患、 下肢の閉塞性動脈硬化症での側副血行路形成不全や、 創傷治癒過程での 血管新生が不十分なことによる難治性皮膚潰瘍、 難治性胃潰瘍、 手術後の癒合不 全等の診断方法又はかかる疾病に対する感受性の診断方法を提供する。
さらに、 対象由来の試料について上記 ADAMTSフアミリ一タンパク質又は 当該 ADAMT Sフアミリ一タンパク質の mRN Aレベルを調べることを特徴と する方法によって、細胞 '組織の癌化のレベルを診断する方法を提供する。また、 本発明遺伝子が 5 p i 5. 2- 15. 3に存在することを確認したこと、 5p 15. 2-15. 3は 5P—症候群 (Cr i一 du— chat syndrom
e ) の欠失部位であることが報告されていることから、 本発明に係る新規な AD AM T Sフアミリ一タンパク質の mR N Aレベルを検出することで、 5 P—症候 群の診断方法を提供する。 さらに本発明に係る新規な A D A M T Sファミリ一夕 ンパク質の mR N Aレベルを検出することで、 血管新生が原因となる疾患 (いわ ゆる血管新生病) として固形悪性新生物、 眼科的疾患 (増殖性糖尿病性網膜症、 未熟児網膜症、 虹彩ルべォ一シス、 鎌状赤血球網膜症、 網膜中心静脈閉塞症、 網 膜静脈分枝閉塞症、 網膜中心動脈閉塞症、 老人性円板状黄斑変性症、 その他虚血 をきたす眼科疾患)、慢性関節リウマチ、 血管腫、 血管線維腫、 尋常性乾癬、 粥状 動脈硬化巣外膜の異常毛細血管網等、 また、 逆に血管新生が不十分である血管新 生不全症として虚血性心疾患、 下肢の閉塞性動脈硬化症での側副血行路形成不全 や、 創傷治癒過程での血管新生が不十分なことによる難治性皮膚潰瘍、 難治性胃 潰瘍、 手術後の癒合不全等を診断することができる。 また、 本発明に係る新規な AD AM T Sフアミリータンパク質の mR N Aのレベルを検出することで、 細 胞 ·組織の癌化のレベルを診断する方法を提供する。
本発明に係る新規な AD AM T Sフアミリータンパク質をコードする D N Aの 発現の増加又は低下は、 ポリヌクレオチドの定量法として当該分野では周知方法 の任意の方法、 例えば増幅、 P C R、 R T P C R、 R Nァ一ゼ保護、 ノーザンプ ロッテイング及びその他のハイブリダイゼーシヨン法を用いて R N Aレベルで測 定できる。 また、 試料中の当該 AD AM T Sファミリ一タンパク質レベルを決定 するために用いることができるアツセィ法は当業者に周知である。 このようなァ ヅセィ法には、 ラジオィムノアツセィ、 競争結合アツセィ、 ウエスタンプロット 分析及び E L I S Aアツセィ等がある。
本発明に係るポリヌクレオチドの染色体の同定 (染色体アツセィ) にも価値が ある。 該ポリヌクレオチドの配列は、 個々のヒト ·染色体上の特定の位置を標的 とし、 これにハイプリダイゼーシヨンし得る。 本発明による重要な配列の染色体 へのマッピングは、 それらの配列を遺伝子関連疾病と関連づける重要な第 1工程 である。 配列を正確な染色体位置にマッピングしたならば、 染色体上の配列の物
理的位置を遺伝学的地図のデータと関連づけることができる。 かかるデータは、 例えば、 V. McKus i ck, Mende l ian Inheritance in Man (Johns Ho kins Univers ity We 1 c h Medical L i b r a r yからオンラインで利用できる) に見いださ れる。 次いで、 連関 (物理的に近接した遺伝子の同時遺伝) の分析により、 同じ 染色体領域にマツピングされた遺伝子と疾病との関係を同定する。 罹病個体と未 罹病個体との間の c D N A又はゲノム配列の相違も調べることができる。 罹病個 体のいくつか又は全部において変異が観察されるが正常個体においては観察され ない場合、 その変異は疾病の原因である可能性がある。 実施例
以下、 実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、 本発明は下記の実施例に 限定されない。
実施例 1
(ヒト脳由来 cDNAライブラリ一の構築と遺伝子の分取)
市販ヒト脳、 胎児脳、 及び脳海馬由来の po lyA + RNA (クロンテック社 製:カタログ No. 6516— 1、 6525— 1、 及び 6578— 1) を出発原 料として常法により cDNAライブラリ一を構築し、 dbEST (da t aba s e o f Expressed Sequence Tags)分析により c D N A断片を単離して塩基配列を決定し、 本発明に係る新規な A D A M T Sファ ミリ一タンパク質をコ一ドする塩基配列を担持する DN Aを得た。
具体的には、 小原らの方法(DNA Research (1997) 4 : 53) に従って調製した上記ヒト脳由来の cDNAライブラリ一から、 約 50, 000 個の組換え体をランダムに選択し、 このうち約 30, 000個のクローンの cD N Aについて、 その 5'末端及び 3'末端の塩基配列を決定した。 さらに約 1,
100個を主にインビトロの転写翻訳実験によって選択し、 それらの cDNAの 塩基配列を小原らの方法 (同上) に従って決定した。 全塩基配列の決定を行った
cDNAクローンについて、 コンビュ一夕プログラムを用いた汎用解析方法によ つてタンパク質コード領域 (ORF) を予想し、 この領域について Pf am H MM S e ar ch (HMMPFAM) によりドメイン検索を行い、 TSP 1ド メイン (TSP 1) を有する cDNAを同定した。
この様にして本発明者は、 TSP 1を担持する配列表の配列番号 1に記載した 推定アミノ酸配列 (全アミノ酸数 1021個) からなる新規な ADAMTSファ ミリ一タンパク質をコードする cDNA (配列表の配列番号 2) を有するクロー ン P J 01256 (ヒト脳由来 cDNAクローン P J 01256)を得た。なお、 配列は、 UPAC—IUB Commi s ion on Biochemi ca 1 No me nc 1 at ur eによる略号或いは当該技術分野における慣用略号 に基づくものであり、 またアミノ酸に関し光学異性体が有り得る場合は、 特に明 示しない限り L体を示すものとする。 実施例 2
(ヒト P J 01256全長 cDNA取得)
ヒト P J 01256の全長アミノ酸コード領域を有する cDN A (以下、 ヒト P J 01256全長 cDNA) は、 配列番号 2に記載したヒト脳由来 cDNAク ローン P J 01256の塩基配列から特異的に作製したプライマーあるいはプロ —ブを用いて、 5' RACE (Rapid ampl if icat ion o f cDNA end)法あるいはライブラリスクリーニング法等を行なうことで取 得できる。 ここでは、 5' RACE法によるヒト P J 01256全長 cDNAの 取得を記述する。
(1) まず、 ヒト脳由来 cDNAクローン P J 01256特異的に合成した mR N Aに対しアンチセンス方向の 2本のプライマ一 (例えば以下の PJ— AO 1 · P J— AO 3等) と、 鎵型 cDN Aに連結させたアダプタ一配列特異的な 2本の プライマ一 (例えば以下の AP I .AP2等) を組み合わせて用い、 一般的に行 われているように 2回の PCRを行なう。
P J-AO 1 ; 5 ' -CATGTCCTTGAGGTCACCAG-3 ' P J-AO 3 ; 5 ' -TCAGACCTACAATTGCAATG-3 ' AP I ; 5 T -CCATCCTAATACGACTCACTA
TAGGGC- 3 ' AP 2 ; 5 T -ACT CACTATAGGGCTCGAGCGGC- 3 ' 錡型 cDNAには、 例えば市販の 「Mar a t hon— Re adyTM cDN A Human 0 v a r y ;既知配列のアダプタ一が連結されたヒト卵巣由来 二本鎖 cDNA、 C 1 ont e ch社製」 等を用いることが可能である。 あるい は mRNAから、 二本鎖 cDNAを合成し、 任意の配列からなるアダプターを連 結したものも、 錡型 cDNAとして使用できる。
5' RACE法で用いる耐熱性酵素は、例えば「KOD PLUS,東洋紡製」 等を利用できる。 「KOD PLUSj 及び 「Mar at hon_Re adyTM cDNA Human Ovary」 を用いた場合の第一次及び第二次 P C Rの 条件を以下に記述する。 第一次 PC R反応液組成
5 il Mar at hon-Re adyl cDNA
27^1 蒸留水
5 1 10 x KOD PLUS バッファ一 1 X
5j l dNTP (各 2mM) 0 2mM 3〃 1 MgS04 (25mM) 5 mM 2〃1 AP 1プライマ一 ( 1 0〃M) 0 4j U
l P J-AO 3 ( 10 zM) 0 4 zM
計 50 /1
第一次 P C R運転プログラム
98°C, 2分/ 1サイクゾレ
98°C, 20秒
60°C, 20秒 > 30サイクゾレ
75°C, 2分
75°C, 1
第二次 PC R反応液組成
容量 終濃度 j l 第一次 P GR産物
62j l 蒸留水
l Oj l 10 x KOD PLUS バッファー l x l Oj l dNTP (各 2mM) 0. 2mM
jul AP 2プライマ一 (10〃M) 0.
4jul P J - AO 1 (10〃M) 0. 4 M
計 100 z 1
第二次 P C R運転プログラム
98°C, 2分 1サイクル
98°C5 20秒ヽ
60。C, 20秒 Y 30サイクル
75°C, 2分
75°C, 10分/ 1サイクル
5' RACE産物は、例えば「Z e r o Blunt™ TOPO™ P CR Cloning Kit, I n v i t r o g e n社製」等を用いて、 プラスミド ベクタ一 (「Z e ro B l nt™ TOPO™ P CR C loning Kit」 の場合には pCRTM— B lunt II— T〇P〇) に連結し、 大腸菌コン ピテントセルに形質導入することで、 5' RACE産物を含むプラスミドベクタ 一を有する大腸菌形質転換体としてクローン化できる。 5' RACE産物を分子 量で分画する場合には、 ァガロース電気泳動後、 DNAのバンドをゲルから切り 出し、 例えば「QIA Quick Gel Ext ract ion Kit, QIAGEN社製」 等を用いて回収することで分画し、 上記の方法で同様にクロ —ン化できる。
クローン化した 5' RACE産物は、 使用したプラスミドベクターに適応した 抗生物質(p CRTM— B lunt II— TOPOの場合には、 「硫酸カナマイシン、 ナカライテスク社製等」)を含む大腸菌生育培地(例えば T e r r i f i c Br o t h等) で大腸菌形質転換体を培養し、 プラスミドを、 例えば「Q I Ap r e p™ Spin Minipr ep K i t、 Q I AG E N社製」等で抽出する ことで得られる。
5' RACE産物の塩基配列データは、 鎵型として抽出したプラスミド、 使用 したプラスミドベクタ一に適応したプライマ一(pCRTM— B lunt II— TO POの場合には、 SP6プライマ一、 T 7プライマー等)、必要に応じて P J 01 256特異的プライマ一(P J— AO 1等)を用い、「B i gDye T e rmi n a t o r C c le Sequencing F S Read R e a c t i on Kit、 PE B i o s y s t e m s社製」等にて調製したサンプル を、 電気泳動式塩基配列解析装置 (サンプル調製に 「BigDye Termi n a t o r Cyc le Sequenc ing F S Read R e a c t i on K i t」 を用いた場合には「AB I PR I SM™ 310 ジエネ ティヅクアナライザ、 PE B i 0 s y s t ems社製」等) で解析することに より得られる。得られた塩基配列デ一夕を、シーケンスァセンブリングソフト(例
えば「Sequencher3. 1、 Gene C o d e s社製」)等を用いて連 結することで、 クローンごとの塩基配列が得られる。
ヒト P JO 1256全長 cDN Aの塩基配列は、 上記 5' RACE産物のクロ —ンごとの塩基配列と実施例 1に記載したヒト脳由来 cDNAクロ一ン P J 01 256の塩基配列 (配列番号 2) を、 互いのオーバ一ラップを 5' RACEに使 用したプライマ一以外の部分で確認した後、 連結することで得られる。
(2)ヒト P J 01256全アミノ酸コード領域の塩基配列を明らかにするため、 ヒト脳由来 cDNAクローン P J 01256塩基配列 (配列番号 2)特異的に合 成した上記プライマー (AP 1、 AP 2、 P J— AO 1、 及び: P J— AO 3) を 用いて 5' RACE法を行なった。
5 ' RACEの鎵型cDNAには、 市販の「Mar at hon— Ready TM cDNA Human Ovary;既知配列のアダプタ一が連結されたヒト卵 巣由来二本鎖 cDN A、 クロンテック社製、 Code No. 7417— 1」 を 用いた。 PCR用耐熱性酵素には 「KOD PLUS、 東洋紡製」 を用い、 以下 の条件で第一次: P CRを行なった。 第一次 PC R反応液組成は、 上記のものと同一である。 第一次 P CR運転プログラム
98°C, 2分/ 1サイクル
98。C, 10秒
60°C, 10秒 ト 30サイクル
75°C, 2分
75°C, 10分 Z1サイクル 第一次 PCR反応終了後、 脱塩及び脱プライマ一するため、 反応液を 「Sup r e c— 02、 宝酒造製」 を用いて精製した。 精製した PCR産物は 100〃1
(50 /1X2回) の TE緩衝液で回収し、 以下の第二次 PCRの鎵型として用 いた。 第二次 P C R反応液組成は、 上記のものと同一である。 第二次 PC R運転プログラム
98°C, 2分 1サイクル
98°C,
60°C, 30サイクル
75°C,
75。C, 10分.
5' RACE産物は、 常法に従いプラスミドベクタ一に連結し、 大腸菌形質転 換体としてクローン化した後、 プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。 得られ た 5' RACE産物の塩基配列から、 上記と同様に、 特異的プライマ一を作製し て 5' RACE法を繰り返すことにより、 ヒト PJ01256全長 cDNA塩基 配列 (配列番号 3) を得た。
ヒト P J 01256全長 cDNA塩基配列 (配列番号 3) は、 総塩基数がポリ A (po lyA)配列を除いて 5, 610であり、 3, 672塩基からなるアミ ノ酸コード領域 (配列番号 3の 770— 4, 441番目) を有していた。 該領域 にコードされるアミノ酸配列を配列番号 4に示す。 また、 5'非翻訳領域上にァ ミノ酸コード領域と同一フレーム上の終止コドンが 2箇所 (配列番号 3の 206 — 208番目; TAG、 275— 277番目; TGA)、 3'非翻訳領域上にポリ A付加シグナルが 1箇所 (配列番号 3の 5, 586 - 5, 591番目; AATA AA)存在した。
Marat hon-Ready™ c D NA Human Ovaryを錶 型として、 アミノ酸コード領域を再度クロ一ニングしたところ、 2つの対立遺伝
子がそれそれ得られ、 両者の比較で 3箇所の SNP sが確認された (表 1の SN P s 1〜3)。そのうち 2つの SNP sはアミノ酸置換を伴っていた(表 1の S NP s 2及び 3)。また、 ヒト脳由来 P J 01256 cDNAクロ一ン(配列番 号 2)との比較では 2箇所の SNP sが確認され(表 1の SNP s 4及び 5)、 うち 1つの SNP sはアミノ酸置換を伴っていた (表 1の SNPs 4)。
SNPs cDNA配列 (配列番号 3) アミノ酸配列 (配列番号 4) 位置 ドン 位置 アミノ酸
1 821 C, τ CTG, TTG 18 Leu
2 1,079 C, τ CCC, TCC 104 Pro, Ser
3 1,097 A, G ATG, GTG 110 Met, Val
4 1,620 C, A TCC, TAC 284 Ser, Tyr
5 2,119 T, C TGT, TGC 450 Cys 実施例 3
(ヒト P J 01256遺伝子発現ベクター作製)
ヒト P J 01256の C末端に My cH i sタグ配列が融合されたものを発現 する哺乳動物細胞用発現べク夕一の作製は、 以下のような操作で行なうことがで ぎる。
まず、 ヒト P J 01256の終始コドンを除く全アミノ酸コード領域の両端に アニーリングする PCRプライマ一ペアを設計する。 上流側プライマ一には、 ヒ ト P J 01256 cDNAの開始コドン (ATG) の 5'上流側に発現用べクタ — (例えば、 Invit rogen社製 pcDNA3. 1 (-) /My cH i s A) のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素部位 (例えば、 Nhe Iあ るいは Not I等) を付加して設計し、 下流側プライマーにはヒト P J 0125 6 cDNAがコードする C末端アミノ酸 (ロイシン) コドンの下流に、 同じく発
現ベクターのマルチクローニングサイ トに存在する制限酵素部位 (例えば H in dillあるいは Kpnl等) を付加して設計する。 なお、 選択する制限酵素は可能 なかぎりヒト P J 01256 c DNAの全アミノ酸コード領域に認識部位が存在 しない制限酵素を用いる。 また制限酵素を用いた DNA断片の挿入により生じる アミノ酸フレームのずれを考慮してプライマ一を設計する。例えば p CDNA3. 1 (-) ZMy cHi s Aの場合には、 下流側に設定する制限酵素は、 発現べク ターと連結した際に My cH i s領域とフレームが合うよう塩基の数を調整して 設計する。 以上のように設計したプライマ一を用い、 ヒト PJ01256 cDN A断片を含むプラスミドを鍩型として、 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ KOD PL US (東洋紡) 等で PCR反応を行ない、 発現ベクターに挿入可能な制限酵素部 位を有する全長 cDNA断片を取得できる。
適当な哺乳動物細胞発現用べクタ一 (例えば、 pcDNA3. 1 (-) /My cHisA、 Invitroge n社製) 及び増幅した全長ヒト P J 01256 cDNAを、 プライマーに付加した制限酵素で消化した後、 ァガロースゲル電気 泳動し、 それそれ目的の DNA断片を、 例えば QI A Quick Ge l E xt ract ion Kit (Q I AGEN社製) 等を用いてァガロースゲル中 から回収する。 ゲル中から回収した全長ヒト P J 01256 cDNA及び p cD NA3. 1 (― ) /My cHi s A断片は、 例えば Ready— To— Go T
4 DNA 1 i ga s e (アマシャム ·フアルマシア 'バイオテク社製) を用 いて連結できる。 連結したプラスミ ドを大腸菌コンビテントセル (例えば、 DH
5 αコンビテント細胞、 東洋紡製) に導入し、 形質転換体を得る。 得られた大腸 菌形質転換体は、 用いた発現べクタ一の選択マーカ一 (例えばアンピシリン等) を含む Τ θ r r i f i c Brot h培地等で培養し、 当該 DNAを含むプラス ミ ドを QIAprepTM Spin M i n i p r e p Kit (Q I AGE N社製) 等の市販の DNA抽出キッ卜で精製できる。
作製したプラスミドの DNA塩基配列は以下のようにして確認できる。 発現べ クタ一由来の配列から設計したプライマ一 (例えば、 pcDNA3. 1 (-) /
My cHi sAを用いた場合には、 pcDNA— S I : CACTGCTTACT 00〇117八11〇&及び 00 八—八 1 : ACTAGAAGGCACAGTC GAGG等のプライマ一) と、 ヒト P J 01256 cDNA配列上で約 30 Ob P程度ごとに適当なプライマ一を設計し、例えば、「BigDye T e rmin a t o r C c le Sequenc ing F S Read React ion Kit」 (PE Biosyst ems社製)等の塩基配列決定用サンプ ル調製試薬を用いて、抽出したプラスミ ドの塩基配列決定用サンプルを調製する。 サンプル調製に 「: B i gD y e Terminat or C c le S e qu encing F S Ready React ion Kit」 を用いた場合に は、 キヤビラリ一電気泳動式塩基配列解析装置 AB I PR I SMTM 310 ジエネティックアナライザ (PE Biosyst ems社製) 等で解析する。 得られた塩基配列デ一夕は、 例えば Se quencher 3. 1 (Gene C odes社製) 等のシーケンスァセンプリングソフトを用いて 1本に連結し、 作 製したプラスミ ドの D N A塩基配列を得る。
このようにして得られたプラスミ ドの DN A塩基配列から目的の塩基配列を有 するプラスミ ドを選択して、 ヒト P J 01256発現べクタ一を作製できる。 実施例 4
(ヒト P J 01256遺伝子発現べクタ一作製)
ヒト全長 P J 01256の C末端に H i s夕グ配列を融合発現する哺乳動物細 胞用発現ベクターを作製するため、 以下のプライマ一を合成した (アマシャム ' フアルマシア■バイオテク社に発注)。
BHP J.-S 01 ; 5 ' -GAAAGGATCCCGGAGCGCTC
CTGGATGAAG- 3 '
HDP J-A01 ; 5 ' -GAAAAAGCTTCAAGTTGGAC
T TAGAGCAAG- 3 '
なお、 BHP J_S 0 1は、 制限酵素消化のためのスぺーサ一 (4塩基; GA AA)、 制限酵素 BamHIの認識配列 ( 6塩基; G G A T C C)、 ヒト P J 01 256 cDNAへのアニーリング配列 (20塩基; C G G A G C G C T C C T G GATGAAG:配列番号 3の 756 - 775番目に完全一致)から成る。また、 HDP J-A0 1は、制限酵素消化のためのスぺ一サ一(4塩基; GAAA)、制 限酵素 H indlllの認識配列 6塩基 AAGCTT)、ヒト P J 0 1256 cDNA へのァニーリング配列(20塩基; CAAGTTGGACTTAGAGCAAG: 配列番号 3の 4, 422— 4, 441番目の相補鎖に完全一致) から成る。
BHP J-S 0 1及び HDP J— AO 1をプライマーとして用い、 PCR法に よってヒト P J 0 1256全アミノ酸コード領域の増幅を試みた。 錶型 cDNA は、 市販の 「Ma r a t ho n -Re ady™ cDNA Human 0 v ar y;既知配列のアダプタ一が連結されたヒト卵巣由来二本鎖 c D N A、 C 1 ont e ch社製、 Co deNo. 74 17— 1」 を用いた。 PCR用耐熱性酵 素には「KOD PLUS, 東洋紡製」を用い、以下の条件で PCRを行なった。
PCR反応液組成
容量 試薬
2 /1 Mar at hon-Re ady™ cDNA
58 l 蒸留水
10 l 10 x KOD PLUS バッファー 1 x
20j l dNTP (各 2mM) 0. 4mM
MgS 04 (25mM) 1. 5mM
I jUL l BHP J-S 01 (50 zM) 0. 5 U
1/UL l HDP J— AO 1 (5 O JLLM) 0. 5 uM
2ul KOD PLUS
計 100 zl
P CR運転プログラム
98°C, 3分 /1サイクル
98°C, 20秒
60°C, 20秒 40サイクゾレ
75°C, 5分
75°C, 10分 1サイクゾレ 得られた約 3. 7Kbpの PCR産物は、 常法に従いプラスミ ドベクタ一に連 結して大腸菌形質転換体としてクローン化した後、 プラスミドを抽出し、 塩基配 列を決定した。 その結果、 約 3. 7 の卩。1産物は目的の?〇1産物 (ス ぺ―サ—― B amH I認識配列一配列番号 3の 756〜4, 441— Hind III 認識配列一スぺ一サ一) であった。
哺乳動物細胞発現用ベクターは pCMHO 1 (図 1の A;市販の 「pcDNA 3. 1 (-) /My cHi s A, I n v i t r o g e n社製」 の B GHポリ A配 列をチミジンキナーゼ(TK)ポリ A配列に置換したもの) を用いた。すなわち、 p cDNA3. 1 (一) /My cHi s Aの、 BGHポリ A配列 (ht t p: / / www. inv i t r o gen. C o m./ v e c s e q― g c / p c d n a 3. lmy chi s a-, s e qに提示されている塩基配列の 1, 116〜1, 343番目)は、その両側に認識サイトを有する制限酵素 Af 1 II (認識サイト; CTTAAG、 同配列の 1, 090〜1, 095番目) 及び P v u II (認識サイ ト ; CAGCTG;同配列の 1, 363〜1, 368番目) で消化することで除 いた。 TKポリ A配列は 「pREP 10、 Invit r o g e n社製」 を錡型と して、 プライマ一ペア (GAAACTTAAGGGGAGATGGGGGAGG より増幅したものを Af IIIで消化することで調製した。 BGHポリ A配列を除 いた p cDNA3. 1 (一) ノ MycHi sA及び TKポリ A配列は、 常法に従 い連結した後、 大腸菌形質転換体としてクローン化し、 プラスミドを抽出して塩
基配列を確認した。
得られたヒト P J 01256 cDNAクローン及び哺乳動物細胞発現用べクタ — pCMHO lは、 B amH I及び H i ndlllで消化し、 常法に従い連結した。 作製したプラスミド pCMHO 1 -P J 01256は大腸菌形質転換体としてク ローンィ匕した後、 プラスミドを抽出して塩基配列を決定し、 ヒト PJ01256 c D N A下流に My c H i s夕グ配列が同一フレームで連結されたことを確認し た (図 1の B)。 実施例 5
(ヒト PJ01256の哺乳動物細胞での発現)
ヒト PJ" 01256の哺乳動物細胞での発現を確認するため、 実施例 4で作製 した哺乳動物細胞用発現べクタ一 pCMHO 1-P JO 1256を用いて、 以下 の検討を行った。
010c m組織培養用ディヅシュ 「F a 1 c o n 3001、 べクトン 'ディ ヅキンソン社製」 上に約 50%コンフレント (conf luent) に付着生育 させた COS 7細胞に対し、 1ディヅシュあたり 10 /gの pCMHO 1 -P J 01256を遺伝子導入した。 対照としては 1ディッシュあたり 10〃 の 〇 MHO 1を用いた。 遺伝子導入は市販の 「Lipof ect AMINE PLU S、 Lif et echno logie s社製」 を用い、 添付プロトコルに従って 行った。
遺伝子導入 48時間後、 細胞を回収し、 100 /1の細胞溶解液 (2 OmM Tr i s— HC1 pH7. 4、 10% グリセロール、 1% Tr i t on X— 100、 0. 1% SDS) で溶解させた。 100〃1の SDS電気泳動用 緩衝液 (l O OmM Tr i s-HC 1 pH6. 8、 20% グリセロール、 12% 2—メルカプトエタノール、 4% SDS、 ブロモフエノールブルーで 着色) を加えた後、 100°Cで 2分間加熱したものをサンプルとして、 ウェス夕 ンブロヅティング解析を行った。 各サンプル 0. 2mlのうち 30 zlを SDS
—ポリアクリルアミド電気泳動に供した。 SDS—ポリアクリルアミド電気泳動 は、 市販の 「マルチゲル 4/20、 第一化学薬品社製」 を 「力セヅト電気泳動槽 「第一」 DPE— 120」 にセヅトし、 40 mA定電流で 1時間行つた。 泳動用 緩衝液は、 「Tr is— Glycine— SDS 'Powder、宝酒造製」を用 い、分子量マ一カーは、 「6 xH i s Prot e in Ladder, QI AG EN社製」を用いた。泳動終了後、 「ミニトランスブロヅト、 B I 0— RAD社製」 を用いて、 エレクト口トランスファ一 (Elect ro Transf er) に より PVDFメンブレン 「TEFC0社製、 Code. No. 03— 056」 に ブロヅティングした。エレクトロトランスファ一は、「Tri s - Glyc ine Powder, 宝酒造製」 にメタノールを 20 %添加した緩衝液中で、 150m A定電流で 1. 5時間行った。プロヅティングした PVDFメンプレンは、「Pe nta His Ant ibody HRP Conjugat e, Q I AGE N社製」 を用い、 添付されていたプロトコルに従って抗体反応を行った。 抗体に ラベルされたホースラディシュ 'パーォキシダーゼ(H o rseradish p e r o x i d a s e) の検出には 「E C L P 1 u s、 アマシャム ·フアルマシ ァ 'バイオテク社製」 を用い、 添付されていた標準プロトコルに従って行った。 結果を図 2に示した。
図 2に示したように、 pCMHO 1— P J 01256を導入した COS 7細胞 では分子量 10 OkD a以上のタンパク質のシグナル (図 2の矢印) が確認され た。 対照とした pCMHO 1では該当するシグナルは検出されなかった。 以上の 検討より、ヒト P J 01256タンパク質の発現が哺乳動物細胞系で確認された。 実施例 6
(ヒト PJ01256の発現組織解析)
(1) ヒト P J 01256遺伝子の発現組織を解析するため、 下記の: PCRブラ イマ一を合成した。 下記プライマーの組み合わせを用いて PCRにより、 505 bpのヒト P J 01256 cDN A断片が増幅された。
P J— S 09センスプライマ一 (s ens e pr ime r) ;
5 ' -GGAAAGGCCATGAAATAAGG-3 ' P J— A 12アンチセンスフ。ライマ一 (ant i s ens e pr ime r);
5 ' -GCTGACGTCTGCTATAATAG-3 ' 次に 24種のヒト臓器の mRNAに由来する cDNAを 4種の濃度で 96ゥェ ルプレート中に調製した「ヒト RAP I D— S CANTM GENE EXPRE S S I ON P ANE L」 (0 r i G e n e Te chno l o gi e s, I n c.) を銪型として、 下記の酵素溶液(25〃1Zゥエル) を添加し、 ミネラルォ ィルを適量 (約 25 L) 重層した。 谷: j §式薬
2 D μ.1 10 X Ex T a q ノ ヅファ- 1 X
2 0 PL 1 dNTP (各 2. 5mM) 0. 2mM 1 0 PL 1 10 /M センスプライマ一 0. 4 /M
0 u 1 10 M アンチセンスプライマ、 0. 4 zM
8 25 1
0 25 / 1 Ex Taq ポリメラ一ゼ (5U/ zl)
計 25 ju ミネラルオイルを重層後、 プレートをプラスティヅクカバ一シートで被い、 1 5分間静置後、サ一マルサイクラ一(P CR The rmal Cyc l e r M P :宝酒造) にセヅトし、 以下の P 運転プログラムで反応させた。
(以下余白)
94°C, 2分 Zlサイクル
94°C, 30秒 、
60°C, 30秒 35サイクル
72°C3 30秒
72°C, 10分 Zlサイクル
P C R反応終了後、 PCR産物 5 /Lを 1 Lの 10 x泳動用緩衝液 (宝酒造 の制限酵素に添付) と混合し、 Mupid電気泳動槽 (コスモバイオ) にセット した 2%ァガロースゲル (S e aK em GTG agarose : FMC B ioPr oduct s) に供し、 トリス—ホウ酸緩衝液 (宝酒造製) 下、 100 Vの定電圧で約 45分間泳動した。 泳動後、 500 ng/mLの臭化工チジゥム 溶液で染色し、 紫外線照射下で泳動像を観察した。 その結果を図 3に示す。
図 3に示した結果から、 ヒト P J 01256遺伝子は、特に卵巣で発現が高く、 ついで腎臓、 肺、 胃、 精巣、 副腎、 滕臓で、 発現量が高かった。 脳、 小腸、 骨格 筋、 皮膚で中程度に発現しており、 心臓、 大腸、 胎盤、 前立腺では弱い発現が観 察された。 脾臓、 肝臓、 唾液腺、 甲状腺、 子宮、 白血球、 骨髄では、 ほとんど発 現が観察されなかった。また、胎児組織については、脳で中程度に発現しており、 肝臓では弱い発現が観察された。
(2) さらに、 ノーザンハイブリダィゼ一シヨンにより、 ヒト PJ 01256遺 伝子の発現組織分布及び mRN Aの解析を行った。 プローブは、 ヒト P J 012 56 cDNAの Kpn I/S t u I消化断片 ( 663 bp) をァガロースゲル電 気泳動法により分離 '精製したものを用いた。 プローブ DNAのラベリングは、 アマシャム 'フアルマシア'バイオテク社製の「DN A Label l ing B e ad s (— dCTP)ヽ Cat. No. 27— 9240— 01」 と、 「32P— d CTP、 Cat. No. PB 10205」 を用いて行った。 DNAに取り込まれ なかった32 P_dCTPの除去は、 アマシャム ·フアルマシア 'バイオテク社製 の「Probe Quant™ G— 50 Mi cro Columns、 Ca
t. No. 27— 5335— 01」 により行った。 各種組織由来 mRNAをプロ ヅトしたフィル夕一は、 クロンテヅク社より購入した Human MTN B 1 ot (Cat. No. 7760-1 Human MTN Blot II (Cat. No. 7759-1), Human MTN BlotIII (Cat. No. 776 7-1) を用い、 ハイブリダィゼ一シヨンの条件はクロンテック社のプロトコ一 ルに従って行った (図 4)。
図 4の A. に示した結果から、 ヒト P J 01256遺伝子は卵巣において特異 的に発現しており、 次いで腎臓及び脾臓で弱く発現していることが示された。 ま た mRNAの大きさは約 5. 5Kbで、 全長 c D N Aの大きさと一致しており、 明瞭なスプライシングバリアントは検出されなかった。 また、 5'末端側の DN A断片 (SacII/Sal I断片、 746 bp) をプローブとして用いた場合も 上記と同様の結果が得られた。 さらに長期間の露光により得られた結果 (図 4の B.)から、 脳、 肝臓、 精巣、 小腸、 胃、 副腎の各組織においてもわずかに発現し ていることが示された。 また、 図 4の C. には、 ノーザン解析の内部コントロー ルであるァクチン遺伝子のプロットの結果を示した。 実施例 7
(ヒト P J 01256遺伝子のがん組織における発現解析)
P J 01256遺伝子と病態との関与を解析することを目的として、 ヒトの腫 瘍組織における発現量と正常組織における発現量とを比較検討した。 P CR増幅 用のプライマ一としては、 実施例 6で用いた P J— S 09 (センスプライマ一) 及び PJ— A12 (アンチセンスプライマ一) を使用した。 このプライマ一セヅ トにより PCRで 505bpのヒト PJ 01256 c D N A断片が増幅された。 コントロール遺伝子としてはグリセルアルデヒド 3—リン酸脱水素酵素 (G 1 yceraldehyde 3— pho sphat e d e hyd r o g- e n a s e) (G3 PDH)を用い、 : P CR増幅用のプライマ一としては、市販のプライ マ一セット (クロンテック社製, Code. No. 5405- 1) を用いた。 こ
のプライマ一セヅトにより PCRで 452 bpの G3PDH cDNA断片が増 幅された。
ヒト腫瘍組織及び正常組織 (卵巣、 脳、 及び副腎) 由来 cDNAは、 BioC ha i II Inst itut e (Haywar d5 CA, USA)より購入した、 「Human Adult Tumor Ovar c DNA (Ad e n o c arcinoma)ヽ Code. No. 0540016、 Lot. No. A301 017」及び「Human Adult Normal Ovary cDNA、 Code. No. 0510037、 Lot. No. A303212」、 「Huma n Brain Tumor c D N A (M e n i n g i o ma)、 C o d e . N o. 0540004、 L o t . No. A304007」及び「Human Ad u 1 t Normal Brain cDNA、 Code. No. 051000 5、 L o t . No . A301089」、「Human Adult Tumor A d r e n a 1 cDNA (Adenocarcinoma ) Code. No. 0 540001、 L o t .No. A212030」及び「Human Adult N o rma 1 Adrenal cDNA、 Code. No. 0510001、 L ot. No. A206095」を用いた。それそれの c D N A原液を T E溶液( 1 OmM Tris— HC1、 ImM E D T A, p H 8. 0 ) で 10倍希釈した 後に、 さらに 1Z2倍希釈操作を順次 7回繰り返して、 濃度が 1倍、 1Z2倍、 (1/2) 2倍、 (1/2) 3倍、 (1/2) 4倍、 (1/2) 5倍、 (1/2) 6倍、 (1/2) 7倍の希釈系列を作製し、 各溶液 5〃1を錶型 cDNAとした。 PC R反応は、 宝酒造の「T aKaRa Ex Taq™, CodeNo. RR00 1A」 を用いて下記の条件で行った。
(以下余白)
P J 01256増幅用反応液組成
5 0 1 10 x Ex T aq バッファー 1 x
4 0 1 dNTP (各 2. 5mM) 0 2mM
0 2 j 1 P J-S 09 ( 50 /M) 0 2 uM
0 2 μ.1 P J— A 12 (50 zM) 0 2 zM
35 35 / 1
25 / 1 Ex T aq ポリメラーゼ ( 5 U/〃 1 )
S†45 1
G3PD H増幅用反応液組成
試薬
5. 0 u 1 10 X Ex T aq バッファ一 lx
4. 0 μ,Ι dNTP (各 2. 5 mM) 0. 2 mM
0. 1 j 1 GPDHS 2 ( 100 zM) 0. 2 zM
0. 1 j l GPDHA2 ( 100 j M) 0. 2 zM
35. 55〃 1 蒸留水
0. 25 l Ex Taq ポリメラーゼ ( 5 U/ z 1 )
0. 025 U/ 1 f†45 / 1
P CRチューブに各 cDNA溶液を分注し、 上記の酵素/プライマ一溶液を添 加後、 サ一マルサイクラ一 (PCR Thermal C cler MP :宝 酒造製) にセヅトし、 以下の P C R運転プログラムで反応させた。
P CR運転プログラム
94。C, 2分 1サイクル
94°C, 30秒
60°C, 30秒 25サイクル (G3 PDHのとき)
又は 35サイクル (P J 01256のとき)
72°C, 30秒
72°C, 10分/ サイクル
PCR反応終了後、 PCR産物 1 を 1 Lの 10 x泳動用緩衝液 (宝酒 造の制限酵素に添付) と混合し、 Mup i d電気泳動槽 (コスモバイオ:東京) にセットした 2 %ァガロースゲル (S e aK em GTG agarose: F MC BioProduct s, R o c k 1 a nd , ME , U S A) に供し、 トリス—ホウ酸緩衝液(宝酒造製)下、 100Vの定電圧で約 45分間泳動した。 泳動後、 ァガロースゲルを 50 OngZmLの臭化工チジゥム溶液で染色し、 紫 外線照射下で泳動像を観察して P J 01256遺伝子及び G 3 PDH遺伝子の発 現量を PCR産物の濃度として可視的に判定した。その結果を図 5 (卵巣)、図 6 (脳) 及び図 7 (副腎) に示す。
その結果、 図 5、 6、 及び 7に示したように、 いずれの組織においても G 3 P D H遺伝子の発現量は、 正常組織と腫瘍組織においてほぼ同じ発現量であるのに 対し、 腫瘍組織では P J 01256遺伝子の発現量が著しく低下 (約 1/32〜 1/64) していることが示された。 この結果から、 ヒト PJ01256遺伝子 が卵巣、 脳、 副腎における腫瘍に関連する遺伝子であることが示唆された。 実施例 8
(P J 01256マウスカウン夕一パートの取得)
P J 01256のマウスカウン夕一パートを取得するため、 ヒト P J 0125 6 cDNAのアミノ酸コード領域をクエリーとして公共データべ一スを検索した
ところ、 2つのマウスゲノム DNA配列 〔genbank (ht t p : //ww w. ncbi. n lm. n i h. gov) の ID AZ 093080及び AZ 1 19800〕 がヒットした。 AZ093080の塩基配列の 146〜 242番目 及び AZ 119800の塩基配列の 418〜478番目が、 それそれヒト P J 0 1256全長 cDN A配列 (配列番号 3) の 2, 373〜 2, 470番目及び 2, 621〜2, 680番目に高い相同性を示した。 両マウス配列の相同性の高 かった部分から下記のブラィマ一を作製し、 以下の検討に使用した。 mP J-S 02 ; 5 ' -GAAGGAAATGTGAGACCAAG-3 ' mP J-AO 1 ; 5 ' -CTTGGTCTCACATTTCCTTC-3 ' mP J-AO 2 ; 5 ' -CATGTCCTGCCCACACAGAG-3 ' mP J-AO 3 ; 5 ' -AAACTTCCCTCCATGAGATG-3 ' マウス c DNA断片取得のため、 市販の 「Marathon— ReadyTM cDNA Mouse T e s t i s;既知配列のアダプタ一が連結されたマウ ス精巣由来二本鎖 cDNA、 クロンテック社製、 CodeNo. 7455— 1」 を錄型として、 以下の条件で PCRを行なった。 PCR用耐熱性酵素には 「KO D Dash, 東洋紡製」 を用いた。
(以下余白)
PCR反応液組成
5 ju 1 Mar at hon-Re ady™ cDNA
6 1. Ajul 蒸留水
10 μ.1 10 x K〇D Dash バッファー l x
20 jjL 1 dNTP (各 2mM) 0. 2 mM
0. 8 z 1 mP J-S 02 ( 50/ M) 0. 4 M
0. 8 zl mP J-AO 3 (50/ M) 0. 4^M
2 u 1 KOD Dash
計 100 / 1
P CR運転プログラム
98°C, 3分/ 1サイクル
98°C, 20秒
60°C, 20秒 40サイクル
75°C, 5分
ノ
75°C3 1 0分 /1サイクル その結果、 約 23 Obpの PCR産物が得られた。 PCR産物は、 常法に従い プラスミドベクターに連結し、 大腸菌形質転換体としてクローン化した後、 ブラ スミドを抽出し塩基配列を決定した。
塩基配列決定の結果、 得られた PCR産物は 233 bpであり、 ヒト PJ 01 256全長 cDNA配列 (配列番号 3) の 2, 409-2, 641番目に対して DNAレベルで 83. 7% ( 195/233)、同部分の推定アミノ酸配列で 93. 5 % (72/77) の相同性を有していた。
弓 Iき続き同一錶型 cDNAを用いて 5' RACE法を行った。 PCR用耐熱性 酵素には 「KOD PLUS, 東洋紡製」 を用い、 以下の条件で第一次 PCRを
行なった。 第一次 PGR反応液組成
容量 終濃度
5 j l Mar at hon-Re adv™ cDNA
21 JUL I 蒸留水
5 zl 10 X KOD PLUS バッファ一 1
5 /1 dNTP (各 2mM) 0. 2mM
3 1 MgS 04 (25mM) 1. 5mM
2μ1 AP 1プライマー ( 10 M) 0. 4μ.Μ
2 1 mP J - AO 3 (1 QjuU) 0. 4j M
計 5 Oj 第一次 P C R運転プログラム
98°C, 2分 Zlサイクル
98。C, 20秒
5 5°C, 20秒 30サイクル
75°C, 4分
75°C, 10分 /1サイクル 第一次 PCR反応終了後、 脱塩及び脱プライマ一するため、 反応液を 「S\ip r e c-02. 宝酒造製」 を用いて精製した。 精製した P CR産物は 100〃 1 (50〃 l x 2回) の TE緩衝液で回収し、 以下の第二次 PCRの鏡型として用 いた。
第二次 PC R反応液組成
終濃度
2 zl 第一次 PCR産物
62 1 蒸留水
1 Oj l 10 X KOD PLUS バッファ' 1 x 10 /1 dNTP (各 2mM) 0 2mM
6/zl MgS04 (25mM) 1 5 mM
4j l AP 2プライマー ( 10〃M) 0 4uM
又は mP J— AO 2 ( 1 OuM) 0. 4uM
計 100 第二次 P C R運転プログラム
98°C, 2分 /1サイクル
98°C, 20秒、
55°C, 20秒 I 30サイクル
75°C, 4分
75°C3 10分/ 1サイクル
5' RACE増幅産物は、 常法に従いプラスミドベクターに連結し、 大腸菌形 質転換体としてクローン化した後、 プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。
5' RACE産物の塩基配列は、 先のマウス P J 0 1256部分 cDNA塩基 配列とのオーバ一ラップを確認した後、 連結した。 その結果、 得られたマウス P J 0 1256部分 cDNA塩基配列 (配列番号 5) は 422 bpであり、 ヒト P J 0 1256全長 c D N A配列 (配列番号 3) の 2, 220〜 2, 641番目に 対して DNAレベルで 85. 3% (360/422) の相同性を有していた。 ま
た、 マウス P J 01256部分 cDNA推定アミノ酸配列 (配列番号 6) は 14 0残基であり、 ヒト P J 01256全長 cDNA推定アミノ酸配列(配列番号 4) の 485〜 624番目に 95. 0 (133/140 )の相同性を有していた(図 8)。 実施例 9
(ヒト P J 01256のホモロジー検索)
ヒト脳由来 P J 01256 cDNAクローンのアミノ酸配列 (配列番号 1 ) を 既知配列に対して解析プログラム(BLAST 2. 0) (Al t s chu 1, St e p h Θ n F . , Thomas L. Madden, Alej andro A. Schaf f er, J i n g hu i Zhang, Zhen Zhang, W ebb Mi l ler, and David J. Lipman (1997), " Gapped BLAST and P S I -BLAS T: a new gen e r a t ion of prot ein database search p rograms " , Nuc leic Acids Res. 25 : 3389- 3402.)を用いて検索したところ、表 2 (ヒト PJ01256のアミノ酸配列 を既知配列に対して解析プログラム BLAST 2. 0を用いて検索した結果で、 E— va 1 lieが e— 40以下のもの) に示す配列とホモロジ一を有することが 明らかになった。 さらに、 ヒト P J 01256全長アミノ酸配列 (配列番号 4) を既知配列に対して解析プログラム(BLAST 2. 1) (同上)を用いて検索し たところ、 表 3 (ヒト P J 01256の全長アミノ酸配列を既知配列に対して解 析プログラム BLAST2. 1を用いて検索した結果で、 E— valueが e— 140以下のもの) に示す配列とホモロジ一を有することが明らかになった。 ヒ ト P J 01256は ADAMT Sフアミリーと相同性を有するクローンであるこ とが判明した。
2
ヒッ卜 E-va I ue 相同性% 説明
it (ID)
AF140675 e - 139 39% Homo sapiens zinc metal loprotease
ADAMTS7
CD
Z69360 e-134 31% gene: "F25H8.3"; Caenorhabd it is elegans cosmid F25H8
X96389 e-128 34% B. taurus mRNA for procol lagen 1 N - prote i nase
AJ003125 e-128 34% Homo sapiens mRNA for procollagen l~N prote i nase
AB002364 e - 127 33% Human mRNA for KIAA0366 gene, partial cds.
AF140674 37% Homo sapiens zinc metal loprotease
ADAMTS6
AF149118 e-121 34% Rattus norve icus a disintegr in and metal loproteinase with thrombospondin motifs 1 (ADAMTS-1 )
AB001735 e-119 37% Mus musculus DNA for ADAMTS-1
AF060152 e-116 35% Homo sapiens METH1 protein
AF 142099 e-101 32% Homo sapiens aggrecanase-2 (ADAMTS11 )
AF060153 1e- 97 32% Homo sapiens ETH2 protein ( ETH2)
AF140673 2e-97 32% Mus musculus putative secreted met a 11 oprotease
ADAMTS5
AB014588 le-96 36% Homo sapiens mRNA for K 1 AA0688 protein
AF148213 1e-96 36% Homo sapiens aggrecanase-1
AF 109907 4e-95 37% hypothetical protein ; Homo sapiens
S164 gene
U64857 8e-78 29% gene "C37C3.6a ; Caenorhabd it is elegans cosmid C37C3.
Z81086 9e-48 26% gene "F53B6.2"; Caenorhabd it is elegans cosmid F53B6,
AW643518 4e - 64 58% Xenopus laevis cDNA clone PBX0129F06
5' , mRNA sequence.
AB011177 3e-47 34% Homo sapiens mRNA for Kl AA0605 protein,
U42846 3e- 46 31% gene "T19D2.1"; Caenorhabd it is elegans cosmid T19D2.
Z50004 2e-45 28% gene "C02B4.1 ; Caenorhabd it is elegans cosmid C02B4
表 3
(ヒト P J 01256の解析)
ヒト PJ01256全長ァミノ酸配列 (配列番号 4 ) をクエリ一とし、 検索ヅ —ル Pf am HMM Search (HMMP F AM) (S onnhamme r EL, Eddy SR,Birney E,Bat eman A,D u r b in P f am : mu 1 t i 1 e sequence al ignment s and HMM— p r o f i les of prot ein domains. Nu c 1 e i c Acids Re s. (1998) Janl ; 26 (l) : 320-3 22) を用いて検索した。 HMMPFAMのァルゴリズムにはHMMER2. 1 (h t t p: limme r . wu s t 1. e d /) を、 データべ一スには P F AM6. 0 (h t t p: //p f am. wu s t 1. e du/) を用いた。 そ の結果、 ヒト PJ01256は TSP1ドメイン(t sp— 1)、及びレプロリシ ン型亜鉛メタ口プロテアーゼドメイン及びレプロリシンファミリ一ペプチド (P ep Ml 2Bpr opep) を有することが判明した (表 4)。
4
結果の見方:
Hit 検索の結果推定されるドメインの名前。
Score この値が高ければ高 ゝほど信頼度が高 、。
E x p e x七 この値が 0に近ければ近いほど信頼度が高い。
Q f rom 推定されたドメインの開始位置。
Q t o 推定されたドメインの終了位置。
sequence 推定されたドメインの配列。
(以下余白)
実施例 11
(マウス P J 01256カウンターパートのホモロジ一検索)
マウス: P J 01256のアミノ酸配列を既知配列に対して解析プログラム ( BLAST2. 1) (Alt sc ul3 St ephen F., Thomas L. Madden, Alej andro A. Schaf f er, Jinghui Z hang, Zheng Zhang, Webb Mi l ler, and D a v id J. Lipman (1997 )3 " Gapped BLAST and P SI— BLAST: a new generat ion o f prot e in dat abase search programs ", Nuclei c Ac ids Res. 25 : 3389-3402.) (f tp : //n c b i . n 1 m. n i h. g o v/b las t/db/nr 2001年 2月 23日更新分) を用いて検索したところ、 表 5に示す配列とホモロジ一を有することが明らかに なった。 マウス P J 01256は ADAMTSフアミリーと相同性を有するクロ —ンであることが判明した。
(以下余白)
表 5
(マウス P J 01256カウン夕一パートの解析)
マウス P J 01256のアミノ酸配列をクエリ一とし、 HMMPFAM (HM MER 2. 1、 P FAM6. 0) (h t t p ://hmme r . wu s t 1. e d
u/) (ht t p ://p f am. wu s t 1. e du/を用いて実施例 10と同 様に検索した。 その結果、 マウス P J 01256は TSP 1ドメイン (t sp_ 1) を有することが判明した (表 6)。 表 6
結果の見方:
Hi七 検索の結果推定されるドメインの名前。
Score この値が高ければ高いほど信頼度が高い。
E x p e x t この値が 0に近ければ近いほど信頼度が高い。
Q from 推定されたドメインの開始位置。
Q to 推定されたドメインの終了位置。
sequence 推定されたドメインの配列。 実施例 13
(ヒト及びマウス P J 01256と ADAMTSフアミリ一のァライメント)
Clustalwl. 81 (Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W : imp r o v i n g the sens it ivity o f progress ive mult ip le s equence Al ignment through sequence we ight ing, pos it ions— specii i c gap penalt ies and we ight matrix c h o i ce. Nuc le ic Ac ids Research, 22 : 4673 -4680.)を用いてヒト及びマウス P J 01256と既知の ADAMT Sファ ミリーとのアミノ酸配列のァライメントを行なった(表 7〜表 31)。表 7〜表 3
1は、 ヒト及びマウス P J 01256と既知の ADAMTSフアミリー遺伝子の アミノ酸配列を、 N末端側から C末端側までァライメントした一連の表である。 表中、 「*」はその位置で全ての配列で完全に保存されていることを意味する。ま た、 「:」 はその位置で、 {STA}、 {NEQKK {NHQK {NDBQ {Q HRK}、 {MILV} {MI LFK {HY}、 {F YW}のようなグループのうち のいずれかが保存されている事を意味する。さらに、 「-」はその位置で {CSA}、 {ATV {SAG} {STNK} {STPA} {SGND} {SNDEQK} {NDEQHK {NEQHRK}のようなグループのうちのいずれかが保存さ れている事を意味する。 ADAMTSファミリ一は、 TSP 1ドメイン、 z in c met a l l oprot eas eドメイン及び Cys t e in-r ich region (dis int egrin-l ike) からなることが知られてお り (M. D. T o r t o r e 11 a, e t a 1 Science (1999) 284: 1664-1666 ; F. Vazquez e t al, J. Bio 1. Chem. ( 1999) 274 : 23349 - 23357), ァライメントの 結果から、 303から 376番目のアミノ酸 (太字、 #で印をつけた部分) はデ イスィンテグリン様領域 (dis int egrin— l ike region) であることが判明した。 この結果得られたドメインと実施例 10又は実施例 12 にて同定したドメインを、 ヒト PJ01256については表 32に、 マウス P J 01256については表 33にまとめた。
(以下余白)
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表 1 Ί
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ADAMTS6 CRELWC--LSKSNRCV-TNS I PAAEGTLC QTGN— I EKGWCYQGDCVPFG-TWPQ
ADAMTS7 CEDMDN—VCHTLWCS-VGTTCHSKLDAA VDGTRGGENKWCLSGEGVPVG-FRPE
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ADAMTS3 CTAFRTFDPGKQLWGSHPDNPYFCKTKKG—- PPLDGTECAAGKWCYKGHC WKNANQQK
(以下余白)
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表 2 0
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ADAMTS6 PAV I DGTQCN— ADSLD I C I NGECKHVGCDN I LGSDAREDRCRVCGGGGSTCDA I EGFFN ADAMTS7 DAWDGTPCYQVRASRDLC I NG I CKNVGGDFE I DSGAMEDRCGVCHGNGSTCHTVSGTFE ADAMTS2 R VHDGTRCS-Y DAFSLCVRGDCRKVGCDGV I GSSKQEDKCGVCGGDNSHGKWKGTFT ADAMTS3 QLVHDGTHCS-YKDPYS I CVRGECVKVGCDKE I GSNKVEDKCGVCGGDNSHCRTVKGTFT
表 2 1
ADAMTS1 S— AKPGYHD I I T I PTGAT I EVKQRNQRGSRNNGSFLA I KAAD-GTY I LNGDYTLSTLE
ADAMTS4 K—FRYGYNNWT I PAGATH I LVRQQGNPGHRS— I YLALKLPD-GSYALNGEYTLMPSP
ADAMTS8 P—TNYGYND I VT I PAGATN I DVKQRSHPGVQNDGNYLALKTAD-GQYLLNGNLAI SAI E
ADAMTS5 K— KSKGYTDWR I PEGATH I KVRQFKAKDQTRFTAYLALKKKN-GEYL I NGKYM I STSE ADAMTS9 T— VHYGYNTWR I PAGATN I DVRQHSFSGETDDDNYLALSSSK-GEFLLNGNFWTMAK humanPJ01256 KHHHTNQYYHMVT I PSGARS I R I YEMNVS—— -TSY I SVRNAL-RRYYLNGHWTVDWPG mousePJ01256
ADAMTS6 DSLPRGGYMEWQ I PRGSVH I EVREVAMS KNY I ALKSEG-DDYY I NGAWT I DWPR
ADAMTS7 EAEGLG-YVDVGL I PAGARE I R I QEVAEA ANFLALRSEDPEKYFLNGGWT I QWNG ADAMTS2 RSPKKHGY I KMFE I PAGARHLL I QEVDAT SHHLAVKNLETGKF I LNEENDVDASS
ADA TS3 RTPRKLGYLKMFD I PPGARHVL I QEDEAS PH I LAI KNQATGHY I LNGKG-EEAKS
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32
表 33
(解析プログラムによる解析)
実施例 10及び実施例 13でヒト P J 01256について同定したドメインの アミノ酸配列 (表 34:検索したドメインとクエリ一に用いた配列) を既知配列 に対して解析プログラム (BLAST 2. 1) を用いて検索したところ、 表 35 (検索したクエリ一に対してヒヅトした既知配列:最も相同性の高いもの) に示 す配列とホモロジ一を有することが明らかになった。 また、 実施例 12及び実施 例 13でマウス P J 01256について同定したドメインのアミノ酸配列 (表 3 6) について同様に検索を行ったところ、 表 37に示す配列とホモロジ一を有す ることが明らかになった。
(以下余白)
表 34
ドメイン名 ヒッ トした既知配列 (ID:説明:相同性)
Pep— M12B一 propep P79331 : BOVIN ADA -TS 2: 41%
Repro lys in AF140o/5: Homo sapiens zinc metal loprotease ADAMTS /: (Zn- 53%
metal loprotease)
Gystein-r ich re ion D67076: mouse ADAMTS - 1 secretory protein containing (dis integr in-l ike) thrombospondin mot if s : 42%
TSP1—1 J250725: human a disi ntegr i n - 1 ike and meta 1 I oprotease
(reprolysin type) with thrombospondin type 1 mot IT : 55%
TSP1— 2 AF163762: Homo sapiens zinc meta I I oendopept i dase:
47%
TSP1— 3 AF109907: "hypothetical protein", Homo sapiens S164 gene, partial cds: 44%
TSP1— 4 Z69360:〃F25H8.3〃; Caenorhabdi is elegans cosmid
F25H8: 41%
TSP1— 5 AJ250725: a disintegr in-l ike and metal loprotease
(repro lys in type) ith thrombospondin type 1 motif Homo sapiens: 44%
表 36
(P J 01256マウスカウンターパ一トの取得)
実施例 8で得た P J 01256マウスカウンタ一パートは部分 cDNAであつ たため、 引き続き P J 01256のマウスカウン夕一パート取得を試みた。 その 際、 後述する実施例 17に示したようにマウス P J 01256の発現量が高かつ た発情期マウス卵巣より 「TR I ZOL® Re ent Invitrogen 社製」 を用いて抽出した RN Aを錡型として RT— P CRを行なった。
RT反応は、 「TaKaRa RNA LA PCR Kit (AMV) Ve r 1. 1 ;宝酒造製」 を用い下記の条件で行なった。
【下余白)
RT反応液組成
4^1 マウス卵巣由来 RNA溶液 (4〃g)
2〃1 RNas 6阻害剤 ( 40 U/ 1 )
4 /1 AMV リバ一ス トランスクリプターゼ XL (5U/ l)
16 z 1 MgC l2 (25mM) 5 mM
8^1 10 x RNA PCR バッファ一 1 x
8 zl dNTP (各 l OmM) 0. 4mM
2 ul Random 9 me r ( 50 μ.Μ) 1. 25^M
2j l オリゴ dT—アダプタ プライマ一 (2. 5 j M)
0. 0625 zM
34 zl 蒸留水
計 8 O zl
RT反応プログラム
30°C5 10分
42°C3 60分
99°C, 5分
PCR反応は、 ヒト P J 0 1256特異的プライマー P J— S 02 (下記参照) と前述のマウス P J 0 125 6特異的プライマ一 mP J— AO 3を用い、 「K〇 D Das h, 東洋紡製」 にて下記の条件で行なった。
P J-S 02 ; 5'— ATGATGGAGAAGGGAACATG— 3,
PCR反応液組成
終濃度
2n\ RT反応産物
65 il 蒸留水
10 1 10 X KOD Dash ノ ッファ一 lx
20 z 1 dNTP (各 2mM) 0. 4mM
1 1 KOD Dash
計 100
Ρ CRプログラム
94°C3 3分/ 1サイクル
94°C, 20秒、
60°C, 10秒 o サイクル
75°C3 30秒ノ
75°C, 1 その結果、 約 55 Obpの PCR産物が得られた。 PCR産物は、 常法に従い プラスミドベクタ一に連結し、 大腸菌形質転換体としてクローン化した後、 ブラ スミドを抽出し塩基配列を決定した。
塩基配列決定の結果、 得られた PCR産物はヒト特異的プライマーである P J — S 02の 20 bpを除いて 525 bpであった。 マウス P J 01256部分 c D N A塩基配列 (配列番号 7) は、 ヒト PJ01256全長 c D N A配列 (配列 番号 3) の 2, 117— 2, 641番目に対して DN Aレベルで 84. 7% (4 45/525)一致していた。 また、 コードされる推定アミノ酸配列 (配列番号 8)は 175残基であり、ヒト P J 01256全長 c D N A推定アミノ酸配列(配
列番号 4) の 450— 624番目に 94. 8% ( 166/175) 一致していた (図 9)。 実施例 1 6
(マウス P J 01256遺伝子の発現組織解析)
(1) マウス P J O 1256遺伝子の発現組織を解析するため、 下記の PCRプ ライマ一を合成した。 下記プライマーの組み合わせで、 412 bpのマウス PJ 0 125 6 cDN A断片が増幅される。 mP J-S 07 ; 5'-AGCGATATGT CTTGCTGAT C-3' mP J-A03 ; 5'-AAACTT CCCT CCATGAGATG-3'
24種のマウス臓器由来 mRNAより cDNAを調製した 「マウス RAP ID -S CAN™ GENE EXPRE S S I ON PANEL, Or i Gene T e chno l o gi e s社製」を鎵型として、下記の条件で P CRを行なった。
P CR反応液組成
2. 5 PL 1 10 X Ex T a q バッファ一
2. 0 .1 dNTP (各 2. 5 mM)
0. 2 j 1 10 zM セン: ¾プライマー
0. 2 u 1 I O J M アンチセンスプライマ一
19. 85〃 1 蒸留水 - 0. 25 /1 Ex Taq ポリメラ一ゼ ( 5 U/ / 1 )
計 25
P CR運転プログラム
94°C, 2分 /1サイクル
94°C, 30秒
60°C, 30秒 35 サイクル
72°C, 30秒 ノ
72°C, 10分 サイクル
PCR産物を電気泳動し、 臭化工チジゥムで染色した後、 紫外光照射下で画像 を取り込み、 各バンド濃度を比較した (図 10)。
図 10に示した結果から、 マウス P J 01256遺伝子は、 腎臓、精巣、 卵巣、 子宮で発現が高く、 脳、 脾臓、 胃、 皮膚で弱い発現が観察された。 脳では、 サイ ズの異なるバンドが観察され、 スプライシングバリアントの存在が示唆される。 また、 9. 5曰、 12. 5日、 19日の胎児で発現が観察され、 発生にしたがつ て発現量が増加していた。 このことより、 P J 01256は発生に関与している ことが示唆された。
(2) さらに、 ノーザンハイブリダィゼ一シヨンにより、 マウス P J 01256 遺伝子の mRN A解析を行った。 プローブは、 ァガロースゲル電気泳動法により 分離'精製したマウス P J 01256 cDNAの部分断片 (422 bp、 配列番 号 5 )を用いた。プローブ DN Aのラベリングは、アマシャム フアルマシア バ ィォテク社の「DNA Labe l l ing Beads (-dCTP), Cat. No. 27— 9240— 01」 と、 「32P— dCTP、 Cat. No. PB 10 205」 を用いて行った。 DNAに取り込まれなかった32 P— dCTPの除去は、 アマシャム フアルマシア バイオテク社の「P r 0 b e Quant™ G— 50 Micro Columns, Cat. No. 27— 5335— 01」 に より行った。 マウス胎児由来 mRNAをブロヅトしたフィル夕一は、 クロ一ンテ ック社より購入した Mous e Embryo MTN Blot (Cat. N o. 7763- 1, Lot. 0120805) を用い、 ハイプリダイゼーシヨン
の条件はクローンテック社のプロトコ一ルに従って行った (図 11)。
図 11で示した結果から、 マウス P J 01256遺伝子は 7日、 11日、 15 日、 17日めの胎児いずれの時期にも発現していることが示され、 その発現量は 発生にしたがって発現量が増加していた。 このことより、 PJ 01256は発生 に関与していることが示唆された。 また mRNAの大きさは約 5. 5 Kbで、 明 暸なスブライシングパリアントは検出されなかった。 実施例 17
(P J 01256の性周期による発現変動)
P J 01256の主な発現部位は実施例 6に示したノ一ザンハイプリダイゼ一 シヨン及び RT— PCRの結果から卵巣であった。 卵巣は、 性周期に従って排卵 を繰り返すことで、 組織形態が変化している。 その過程では、 細胞外マトリヅク スの分解及び再構築が繰り返されており、 分解系及び合成系の種々の酵素が性周 期に従って変動していると考えられる。 P J 01256と同じ ADAMT Sファ ミリ一である ADAMT S 1は、 プロゲステロンの制御下で性周期に従って発現 が変動することが報告されている (R. L. Robker e t al, St e r o i d s. (2000) 65 (10-11) : 559-570 ; R. L. Ro bke r e t al, Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA. (2 000) 97 (9) : 4689— 4694.)。
以下、 マウス P J 01256の卵巣での性周期による発現変動を検討した。 対 照組織として、 腎臓での検討も同様に行なった。
RT— P CR及び定量的 P CRによる検討を行なうために、 以下のプライマ一 及び定量的 PCR用プローブを作製した。 mP J—がマウス P J 01256用、 G 3 PDH—及び mGDH—が内部標準遺伝子として用いたマウスグリセルアル デヒド 3—燐酸脱水素酵素 (G 3 PDH)用であり、 Sはセンスプライマ一、 Aはアンチセンスプライマーを示す。
RT— PGR用プライマ一
mP J-S 07; 5'-AGCGATATGT CTTGCTGAT C-3' mP J-AO 3 ; 5'-AAACTTCCCT CCATGAGATG- 3' G3 PDH-S; 5'-AC CACAGT CCATGC CATCAC - 3' G3 PDH-A; 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' 定量的 PCR用プライマ一
mP J-S 09 ; 5'-AAGGCCTTGTGGTGCCATCG-3' mP J-AO 7 ; 5'-CCTCCACGACACCACATGT CC-3' mGDH-S 01 ; 5 '- T G C AG T GG C AAAG T G G AG A T T - 3 ' mGDH-AO 1 ; 5 '- T T G A A T T T G C C G T G AG T G G A- 3 ' 定量的 PCR用プロ一ブ (TaqMan プローブ)
mP J-P 01 ; 5'-Fam-CCCT CTGCTGCTGGCAT
GAACTTGGTCTCA-Tamr a-3' mG3 PDH-P 01 ; 5 F am- C C A T C A A C G A C C C C
TTCATTGACCTC-Tamra-3' マウスは SI c ICR系メス 9週齢を 5個体使用した。 性周期は、 採取当日及 び前日にスメアーテストを行ない判定した(表 38)。卵巣及び腎臓を採取後、「T RI ZOL® Regent, I n v i t r o g e n社製」 を用いて、 添付プロト コルに従い RN Aを抽出した。
RT— PCRの第一次反応である逆転写反応 (RT反応) は、 上記で抽出した RNAを錡型として、 「TaKaRa RNA LA PCR Kit (AMV) Ver 1. 1 ;宝酒造製」 を用い、 下記の条件で行なった。
RT反応液組成
4 /I RNA溶液 (4〃g)
j l AMV リバース トランスクリプ夕一ゼ XL
16 /1 MgC l2 (25mM)
8 l 10 x RNA PCR バッファ一
8 Ail dNTP (各 1 OmM)
2 j l Random 9 me r ( 50 juM)
2JUL1 オリゴ dT—アダプター プライマ一
34 zl 蒸留水
計 80/ 1
RT反応プログラム
30。C, 10分
42°C, 60分
99°C, 5分
RT-PCRの第二次反応である P C Rは、 上記の R T反応で調製した c D N Aを錶型として、 以下の条件で行なった。
(以下余白)
PCR反応液組成
試薬
4 L 1 RT反応溶液
12 94 1
1 2 μ.1 MgC 12 (25mM)
1 6 u 1 10 x LA P CR バッファ一 II
0 Sul センスプライマ一 (5 O juM)
0 08 z 1 アンチセンスプライマー (50〃M)
0 1 1 LA Taq ( 5 U/ 1 )
計 20 zl
PCR運転プログラム
94°C, 2分/ 1サイク レ
94°C, 30秒ヽ
60。C, 30秒 35サイクル (mP J 01256の場合)
又は 20サイクル (G3PDHの場合)
72°C, 1分 ノ
72°C, 10分 /1サイクゾレ PCR産物を電気泳動し、 臭化工チジゥムで染色した後、 紫外光照射下で画像 を取り込み、各バンド濃度を比較した(図 12、表 38)。 G3 PDHのバンドが 各個体及び卵巣、 腎臓でほとんど同じだったのに対し、 P J 01256のバンド 濃度は発情期である個体 1の卵巣で特に強く、 個体 1及び個体 3の腎臓、 個体 4 の卵巣で若干強かった。
性周期による発現変動の更なる検討のため、 定量的 PCRによる解析を行なつ た。定量的 PC R反応溶液は、「TaqMan® Unive r s a l PCR M as t e r Mi x、 App l i ed B i o sys t ems社製」 を用い、 刖
記の R T反応で調製した c D N Aを錡型として、 以下の通り調製した 定量的 PC R反応液組成
ι¾\ι薬
5 RT反応産物
5. 蒸留水
0. 5 ^1 センスプライマ一 (50 /M)
0. 5 1 アンチセンスプライマ一 (50 zM)
12. 5 1 2 X T aqMan® ユニバーサル PCR マスター ミックス
1 u 1 TaaManプロ一ブ (5 M)
計 25 zl
* ;なお、 G3PDHについては、 !^ 反応産物を。. 5 l、 蒸留水を
10 1で行った。 反応は、 定量的 PCR装置 「GenneAmp 5700® Sequence Det ect ion Syst ems Appl ied Biosyst ems社 製」 に上記の反応溶液を入れたチューブを 1サンプル当たり 2本ずっセットし、 以下の運転プログラムにて行なった。 定量的 PC R運転プログラム
50°C, 2分/ 1サイクル
95°C, 10分/ 1サイクル
95°C, 20秒
50 サイクル
60。C, 1分
定量的 PCR装置で得られた増幅曲線より、 G3PDH及び P JO 1256の 相対濃度を得た。 続いて、 P J 01256の相対濃度を内部標準遺伝子である G 3 PDHの相対濃度で除算し、 補正した。 補正値を組織及び遺伝子ごとの最低値 で除算し、相対濃度比を算出した(表 38)。その結果、発情期である個体 1の卵 巣でのみ、 P J 01256の発現が高くなつていることが確認された。 表 38
!^丁ー ^^及び定量的?^^の結果から、 共に発情期卵巣では P J 0125 6の発現が亢進していることが示された。 このことより、 PJ 01256は性周 期に従って卵巣での発現が変動しており、 排卵に伴う卵巣の細胞外マトリックス の分解及び再構築に関与していることが示唆された。
実施例 18
(組換えヒト P J 01256タンパク質の細胞外マトリヅクス局在化の検討) 実施例 5において COS 7細胞で発現させたヒト P J 01256タンパク質が 細胞外マトリックス (ECM) に局在していることを確認するため、 論文 (Κιι no, K. and Mat s u s h ima, K. J. Bio l. Ch em. ( 1 998) 273 , 13912 - 13917) の方法に準じて以下の検討を行った。
75 cm2組織培養用フラスコに約 50%コンフレントに付着生育させた CO S 7細胞に対し、 10〃gのpCMH01 -P J 01256を遺伝子導入した。 対照には 10 /ぎの 〇1\ 1101を用いた。 遺伝子導入は市販の 「: Lipof e c t AMINE PLUS、 L i f e t e chno 1 o gi e s社製」 を用い、 添付プロトコルに従って行った。 遺伝子導入 3日後、 培養上清液 (12ml) を 回収し、 等量の 2 X SD S電気泳動用緩衝液 (100 mM Tr i s-HC 1 pH6. 8、 20% グリセロール、 12% 2一メルカプトエタノール、 4% SDS、 ブロモフエノールブル一により染色) を添加後、 100°Cで 5分間加熱 して培地画分 (Me d ium F r a c t i o n) とした。 フラスコに付着した 細胞を PBS (Pho sphat e Buf f ered Sal ine) で 2回 洗浄した後、 5mMの EDTA (pH7. 5) を添加した PB Sで細胞を遊離さ せた。 懸濁した細胞液を遠心分離 (1, 000 xg、 5分、 室温) して細胞を沈 殿させ、 氷冷した PB Sで洗浄後、 0. 05mlの R I P Aバッファ一 (50 mM Tr i s-HC 1 pH8. 0、 150 mM NaCl、 1. 0% NP 40、 0. 5 % デォキシコ一レート、 0. 1% SDS、 ImM フエニルメ チルスルフォニルフルオリド) に懸濁して細胞を破砕した。 細胞破砕液に等量の 2 xSD S電気泳動用緩衝液を添加後、 100 °Cで 5分間加熱して細胞画分 ( C e l l Fract ion) とした。 細胞を遊離させた後にフラスコに付着した E CM画分を、 1. 0mlの 1 XSDS電気泳動用緩衝液に懸濁し、 100°Cで 5分間加熱して細胞外マトリックス画分 (ECM Fract ion) とした。 各画分サンプル 5^ 1を SD S—ポリアクリルアミド電気泳動に供した。 SD
S—ポリアクリルアミド電気泳動は、 市販の 「マルチゲル 4/20、 第一化学薬 品社製」 を 「カセヅト電気泳動槽「第一」 D P E— 120」 にセットし、 40m A定電流で 1時間行った。泳動用緩衝液は、「Tr i s -Glycine - SDS P owd e r、宝酒造製」を用い、分子量マ一力一は、「Precis ion P r o t e i n Standards BIO— RAD社製、 Code. No. 1 61— 0372」を用いた。泳動終了後、 「ミニトランスブロヅト、 BI0— RA D社製」を用いてエレクトロトランスファ一により P VDF膜「TEFC0社製、 Code. No. 03— 056」 にブロッテイングした。 エレクトロトランスフ ァ一は、 「Tri s -Glyc ine Powder、宝酒造製」にメタノールを 20%添加した緩衝液中で、 150mA定電流で 1. 5時間行った。 プロッティ ングした PVDF膜は、 「抗 C— Myc (9 E 10)抗体、 S ant a Cruz Biot echno log y社製、 Code. No. SC— 40」 を 1次抗体と して反応させ、 「Ant i-Mous e I gG— P0X、 S i gma社製」を 2 次抗体として反応させた。 抗体にラベルされたホースラディシュパ一ォキシダ一 ゼの検出には「ECL P lus、 アマシャム 'フアルマシア 'バイオテク社製」 を用い、添付されていた標準プロトコルに従って行った。結果を図 13に示した。 図 13に示したように、 抗 My c抗体を用いたウエスタンプロッティング解析 の結果、 pCMHO 1-P J 01256をトランスフエクトした C 0 S 7細胞で は、 発現した P J 01256タンパク質のシグナルは主に E CM画分に検出され た。 対照とした pCMHO 1では該当するシグナルは検出されなかった。 以上の 結果より、 COS 7細胞で発現したヒト P J 01256タンパク質は主に: E CM に局在していることが示された。 実施例 19
. ( P J 01256のェクソン部位決定と染色体マヅビング)
P J 01256のゲノム配列及び疾患との関わりを調べるため、 ゲノム配列を 検索し、 染色体マッピングを行なった。
ヒト P J 01256全長 cDNA (配列番号 3) で公共データべ一スである G enBankを検索したところ、 染色体クローン AC 010269. 5がヒット した。同配列に対しヒト P J 01256 cDNAを GT— AGルールにあてはめ、 ェクソン部位を決定した。 その結果、 ヒト PJ 01256全長 cDNA 561 0 bp中 1— 3558 bpが、 ェクソン 1~ 18として AC 010269. 5上 に存在した。ェクソン 19以降は AC 0 10269. 5上には存在しなかった(表 39、 図 14)。
NCB Iの Human Genome Ma Vi ewer (h t t p : / / www. n c b i . n 1 m. n i h. g o v/ c g i— b i n/E n t r e z /hum一 s r ch? chr = hum― c h r . i n f &q u e r y)を用いて、 ヒト PJ 01256のゲノム配列である A C 010296. 5の染色体上の位置 をデータベース上で調べ、 染色体マッピングを行なった。 その結果、 2001年
9月 19日現在 A C 010269. 5は、 5番染色体短腕 15. 31 (5 p 15. 31) に存在していた (図 15)。 なお、 同ゲノム配列は 2001年 5月 8日には 5 p 15. 33、 同年 5月 10日には 5 p 15. 2に存在していた。
染色体マヅビングの結果から、 PJ 01256は 5p l 5. 2-15. 3に存 在することが示された。 5p l 5. 2- 15. 3は、 5P—症候群 ( Cri— d u-cha t s y i o;ne)の欠失部位であり (〇 v e r hau s e r J: e t a 1., Hum. Mo 1. Gene t. (1994) 3 (2) : 247 - 25 2)、 同症候群との関連が示唆される。
(以下余白)
表 39
P J 01256のェクソン部位
(ヒト P J 01256の昆虫細胞系での大量発現)
ヒト PJ01256の大量発現を行なうため、 昆虫細胞 Zバキュロウィルスで の発現系を構築した。 発現系構築には 「Bac— To— Bac® Bac 1 o v i r u s Express ion Syst ems Lir e t ecno l og ies社 (現 Invit rogen社) 製」 を使用した。
発現させたヒト P JO 1256の C末端に My cH isタグ配列を付カ卩するた め、 組換えバキュロウィルス DNAプラスミド (B a cmi d)調製用べクタ一 「pFastBac l、 Lif e t e cno logies社 (現 Invit r ogen社) 製」 を改変した。 すなわち、 下記の合成 DNA (MEHT— 1、 M
EHT— 2、 MEHT— 3、 及び MEHT— 4) をアニーリングさせ連結したも のを、 pFastBac 1の S p h I及び H i n d IIIサイト間に挿入した。 作製 した pF a s t B a c 1—H Tのクローニング部位を図 16に示す。 MEHT- 1 ;
AGAAGAGGATCTGAATAGC-3'
MEHT - 2 ;
5'-GCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA G- 3'
MEHT— 3;
ACCGCATG-3'
MEHT - 4;
5'-AGCTCTCAATGATGATGATGATGATGGTCG ACGGCGCTATTCAGATCCTC-3' ヒト PJ01256 cDNAは実施例 4で作成した pCMHO 1 -P J 012 56から制限酵素 BamHI及び Hi n dillで切り出し、 pFastBac l— HTの同サイトに揷入した。 作製したプラスミド pFastBac l— HT— P J 01256は、 塩基配列を決定し P J 01256 cDNA下流に My cH i s タグ配列が同一フレームで連結されたことを確認した (図 17、 配列番号 9)。 昆虫細胞/バキュロウィルス発現系において効率良く P J 01256を分泌さ せるため、 ミツバチ メリチン (H 0 n e yb e e Me l it t in) 由来シ グナル配列(以下、メリチンシグナル、' Tess ier D. C. et a 1, G ene (1991) 98 (2) : 177-183) を付加した。すなわち、 下記の 合成 DNAをァ二一リングさせたものを、 pFastBac l— HT— PJ01
256の BamH Iサイトに揷入した。
C 1 a— B amH
5,-
TTGTTTTTATGGTCGTGTACATTTCTTACAT CT ACGCGGG- 3'
B amH- C 1 a ;
5
AATTTCAT C -3' 作製したプラスミド pFastBac 1 -MS/HT-P J 01256 - 2は、 塩基配列を決定し P J 01256 cDNA上流にメリチンシグナル配列が同一フ レームで連結されたことを確認した (図 18、 配列番号 10)。
また、 活性型 P J 01256を高効率で得る目的で、 P J 01256自体のシ グナル配列及びメタ口プロテア一ゼ活性を抑制すると考えられるプロ領域を除い たものも作製した。 すなわち、 下記のプライマ一で増幅される 257 bpのヒト P J 01256断片を BamH I及び Xb a Iで消化し、 pFastBac 1— MS/HT-P J 01256 - 2の両サイト間に連結した。 なお、 BHP J— S 05は、 5'側 9 me rが BamH Iの認識配列と同酵素での消化を可能とするス ぺ一サ一配列であり、 3 '側 21 m e rはヒト P J 01256全長 c D N A配列 (配列番号 3) の 1593〜1613番目に完全一致する配列よりなるプライマ —である。 PJ— A25はヒト PJ01256全長 cDNA配列 (配列番号 3 ) の 1811〜1840番目の相補鎖に完全一致する配列よりなるプライマ一であ o
BHP J-S 05
5,—
一 3
P J-A25
5'- 一 3: 作製したプラスミ ド pFastBac l -MS/HT-P J 01256 - 1は、 塩基配列を決定しメリチンシグナル配列下流にヒト P J 01256 cDNAのメ 夕口プロテア一ゼドメインが同一フレームで連結されたことを確認した(図 19、 配列番号 11)。
作製した組換え Bacmi d調製用べクタ一 pFa s t Bac 1-HT-P J 01256、 pFas tBac 1 -MS/HT-P J 01256 - 1及び pFa st Bac 1 -MS/HT-P J 01256 - 2で、 組換え Bacmi d調製用 大腸菌;「E. co l i DH 10 B a cコンビテントセル、菌体内に B a c m idを有する、 L if e t e c n o 1 o g i e s社 (現 I n v i t r o g e n 社) 製」 をそれそれ形質転換した。 その結果、 Tn 7部位特異的トランスポジシ ヨンによって、 それそれの P J 01256の発現ュニットが,組換えられた: B a c mid (Bacmid - HT— P J 01256、 B a c m i d -M S/H T - P J 01256 - 1及び Bacmid—MS/HT— P J 01256 - 2)を得た。
Bacmid— HT - PJ01256、 B a c m i d -M S/H T - P J 01 256 - 1及び Bacmid—MS/HT— P J 01256 - 2をそれぞれ 2ク ローンずつ Sf 9細胞に遺伝子導入した。 遺伝子導入はリボソーム法にて行なつ た。 4日後、 培養上清を 0. 2〃mのフィル夕一でろ過し、 それそれの PJ01 256組換えバキュロウィルス液(BV so l. PJ01256 -HT No. 1、 BV so l. PJ01256 -HT No. 2, BV s ol. P J 01 256 -MSHT 1 No. 1、 B V so l. P J 01256 -MS HT 1
No. 2、 BV s o l. PJ 01256 -MSHT 2 No. 1及び BV sol. P J 01256 -MSHT2 No. 2) として回収した。
回収したそれぞれの P J 01256組換えバキュロウィルス液を 3 X 106個 の S f 9細胞に約 m o i 10で感染させた。 3日後、 細胞を 10 mM Tr i s (pH8)、 ImM E D T Aで懸濁し、等量の 2 xサンプルバッファーを加え、 約 5分間煮沸させた後、 1/100量をウエスタンブロッテイングに供した。 ゥ エスタンブロヅティングは、 「P e n t a— H i s HRP Conjugat e、 QI AGEN社製」 と 「ECL PLUS, Ame r sham Pharm a c i a Biot ec h社製」 を用いて、 それそれの添付プロトコルに従って 行なった。
ウエスタンブロッティングの結果を図 20に示した。 昆虫細胞/バキュロウィ ルス系での発現の結果、 それそれの分子量に応じた P J 01256の発現産物が 得られた。 本発現系の構築により、 P J 01256の大量調製が可能となった。
産業上の利用可能性
以上説明したように本発明は、 新規な ADAMTSファミリ一タンパク質及び それをコードする新規遺伝子を提供するものであり、 卵巣での高発現及び性周期 における発現量の変動、 腫瘍細胞における存在の低下、 及び当該遺伝子の染色体 上の位置が 5 P—症候群の欠失部位に位置することを特徴とする。 この特性を利 用した新規医薬組成物、 診断 '治療手段の提供は ADAMTSファミリ一タンパ ク質関連の臨床 ·基礎の医用領域において大きな有用性を提供する。