WO2004001047A1 - 新規プロモーター - Google Patents
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Classifications
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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Definitions
- the present invention relates to a novel promoter.
- ADATS AD isintegrin in Metalloprotease with Thrombospondin motif
- TSP-1 repeat thrombospondin type I repeat
- ADAMTS4 additivecanase-1
- ADAMTS11 ADAMTS4
- ADA1VITS2 procollagen I-proteinase
- ADA1VITS2 procollagen I-proteinase
- ADAMTS molecules are involved in metabolism such as degradation and maturation of extracellular matrices such as aggrecan and collagen.
- TGF- S Transforming growth factor 8 (TGF-) S) is known to be a differentiation and growth factor that exhibits a wide variety of physiological functions. It is also known to have effects related to qualitative changes and quantitative increases (Border, WA, N. Engl. J. Med., 331, 1286-1292, 1996; Rberts, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , et al.
- TGF-yS inhibitors have not been put on the market to date.
- tubular epithelial cells are activated by inflammatory cytokines such as IL-1; 5 produced and released by the glomerulus, and cell adhesion molecules and cells such as chemokines such as MGP-1, integrins, and osteopontin. Produces extracellular matrix and promotes cell infiltration. Infiltrated monocytes and T lymphocytes secrete new cytokines and act on ureteral epithelial cells and infiltrating cells to form inflammatory foci and extracellular matrix Tissue destruction occurs with the decomposition of components.
- cytokines such as IL-1
- 5 produced and released by the glomerulus
- cell adhesion molecules and cells such as chemokines such as MGP-1, integrins, and osteopontin.
- chemokines such as MGP-1, integrins, and osteopontin.
- Non-Patent Document 1 CDNA encoding a protein known to have high expression in the ovary, fluctuation in expression due to estrous period, and reduced presence in tumor cells, which are presumed to belong to the ADAMTS family based on homology analysis with known sequences, and its estimation
- the amino acid sequence is known (see Patent Document 1), and a genomic database containing sequences predicted to be ADAM family is used, Numerous nucleotide sequences predicted to code for proteases and deduced amino acid sequences encoded by them are known (see Patent Document 2).
- Patent Document 1 International Publication No.W002 / 31 163 Pamphlet
- Patent Document 2 International Publication No. W001 / 83782 Pamphlet Disclosure of the Invention
- TGF-yS is a differentiation and growth factor with a wide variety of physiological functions, inhibiting all physiological functions of TGF-yS poses a problem in the treatment of chronic renal failure where long-term administration is expected There is a risk.
- An object of the present invention is to provide a promoter of a novel protease that is induced by TGF-8 and is involved in extracellular matrix metabolism, which is useful as a drug screening tool.
- the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and found that a polynucleotide encoding a novel protease MDTS9 consisting of the first to 1224 sequences in the sequence represented by SEQ ID NO: 2 Then, the MDTS9 promoter was obtained from the human genome DMA. Further, the protease is considered to be (1) a protease involved in the metabolism of extracellular matrix by being classified into ADAMTS protease. (2) Actually, the expression in human kidney is Recognition,
- MDTS9 is a polypeptide that causes renal failure.
- the activity of the promoter of the present invention is attenuated in IL-1 which is one of the inflammatory cytokines that induces the expression of extracellular matrix-degrading enzymes such as matrix ⁇ meta ⁇ and proteases (P). That is, the expression of this protease is not induced during inflammation, but is specific to the process of renal fibrosis characterized by tissue repair and qualitative change and quantitative increase of extracellular matrix components.
- IL-1 extracellular matrix-degrading enzymes
- P matrix ⁇ meta ⁇ and proteases
- nucleotides 3253 to 5023 of SEQ ID NO: 17 or nucleotides represented by nucleotides 3253 to 5023 of SEQ ID NO: 17 A nucleotide having a promoter activity of the polypeptide of SEQ ID NO: 2, including a nucleotide sequence having substitution, deletion, and Z or an inserted nucleotide thereof,
- the test compound is a promoter of the polynucleotide according to any one of (1) to (3), comprising the steps of: contacting the cell described in (5) with a test compound; and 2 detecting the promoter activity.
- a method of analyzing whether to inhibit the activity (9) a method of screening for a substance that suppresses the expression of the polypeptide of SEQ ID NO: 2, including an analysis step according to the method of (8), and a step of selecting a substance that inhibits promoter activity;
- a method for producing a pharmaceutical composition for treating and / or preventing chronic renal failure comprising an analysis step according to the method of (8), and a formulation step,
- AG010269 discloses a sequence containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 as a part of 187084 bp.However, even if a sequence consisting of 187084 bp is connected upstream of the MDTS9 coding sequence, it does not exhibit MDTS9 promoter activity. Inconceivably, there is no disclosure of the promoter activity of MDTS9 or the screening of therapeutic or prophylactic agents for chronic renal failure.
- W002 / 31 163 describes a sequence that differs from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 by one amino acid, suggesting that a polypeptide having this sequence is involved in degradation and remodeling of the ovarian extracellular matrix . Also,
- W001 / 83782 describes a sequence that differs from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 by 2 amino acids.It is stated that a polypeptide having this sequence was obtained and that the activity and function were confirmed. It has not been. And the fact that the polypeptides having the sequences described in the above two publications are responsible for chronic renal failure, MDTS9 promoter, and screening for chronic renal failure treatment and / or preventive agent using MDTS9 promoter. There are no disclosures or suggestions regarding the logging.
- FIG. 1 is a diagram showing that in cells into which pGV-B2-MDTS9pro5k has been introduced, the addition of TGF- increases luciferase activity.
- the vertical axis shows the measured values of the luciferase activity of the transfected pGV-B2 (empty vector) transfected with the TGF- ⁇ -untreated pGV-B2 (empty vector).
- the relative value with the correction value set as 1 and the horizontal axis is the concentration of TGF- ⁇ .
- FIG. 2 is a graph showing that the addition of IL-1 attenuates the luciferase activity in cells into which pGV-B2-MDTS9pro5k has been introduced.
- the vertical axis indicates the value of luciferase activity simultaneously introduced.
- Polynucleotide, expression vector, and cell which are the promoter of the present invention are proteases involved in the metabolism of extracellular matrix, and are expressed in human kidney, A polynucleotide encoding MDTS9 (Metal loprotease and Disintegr in with Thrombospondin type-1 repeats 9) and its promoter were obtained, and the nucleotide sequence was determined (SEQ ID NO: 1). 7). The full length and partial fragment of the obtained promoter (positions 3253 to 5023 of SEQ ID NO: 17) were subcloned into an appropriate plasmid, specifically, a plasmid pGV-B2 containing a luciferase gene as a reporter gene.
- MDTS9 Metal loprotease and Disintegr in with Thrombospondin type-1 repeats 9
- SEQ ID NO: 7 The full length and partial fragment of the obtained promoter (positions 3253 to 5023 of SEQ ID NO: 17) were subcloned into an appropriate plasmi
- the polynucleotide of SEQ ID NO: 17 has its promoter activity increased by TGF-jS, and its promoter activity is attenuated by IL-1.
- the promoter of the present invention is useful for screening inhibitors.
- the sequence containing the TGF-; 8 response region in SEQ ID NO: 17 must be included. It is not necessary to use the method, and for example, screening can be performed by the method described in Example 7 using SEQ ID NO: 17 from positions 3253 to 5023.
- the promoter of the present invention contains the nucleotide sequence from 3253 to 5203 of SEQ ID NO: 17, and if it has the MDTS9 promoter activity, any nucleotide sequence of the 5 ′ region can be used. Further, it may be included. More preferably, it is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 and having the MDTS9 promoter activity, even more preferably a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17.
- any one of 1 to 10 (preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) of the nucleotide sequence from the 3rd to the 5th to the 23rd base of SEQ ID NO: 17 In the site, a nucleotide sequence in which one or more (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to 3) bases have been substituted, deleted, and / or inserted. And a polynucleotide having an MDTS9 promoter activity, more preferably, 1 to 10 (preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) of any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 17.
- Promoter activity refers to an activity that acts as a start site for transcription of DNA strand information into an RNA strand
- having MDTS9 promoter activity means that promoter activity can be confirmed by the method described in Example 2. Yes, and more preferably means that the promoter activity is enhanced by TGF- by the method described in Example 3.
- the polynucleotide of the present invention can be produced by the following method in addition to the method described in the Examples.
- PGR is performed using primers and human genome DMA to produce a DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17.
- allelic variants are well known.
- DNA is produced by this method, a base is substituted, deleted, and / or inserted at any site in the base sequence of SEQ ID NO: 17.
- a DMA containing the nucleotide sequence of the present invention and having the MDTS9 promoter activity can be obtained, which is also included in the promoter of the present invention.
- sequence described in SEQ ID NO: 17 and its complementary strand can also be prepared by dividing it into several pieces and producing them by a chemical synthesis method, and joining these DNA fragments.
- Each DNA fragment can be synthesized using a DNA synthesizer (for example, Oligo 1000 DNA Synthesizer (Beckman) or 394 DNA / RNA Synthesizer (App Ied Biosystems)).
- Example 2 Whether or not the produced polynucleotide has MDTS9 promoter activity can be confirmed, for example, by the method described in Example 2 or Example 3.
- a part of the base sequence of the promoter sequence present in the natural form may be substituted with another base, or the base may be deleted, and the natural promoter promoter polynucleotide may be modified by modification such as Z or addition. It is possible to prepare a polynucleotide having the same promoter activity.
- a polynucleotide having a base sequence in which a base is substituted, deleted, or Z or added in a natural base sequence and having a promoter activity equivalent to that of the natural promoter polynucleotide is also a polynucleotide of the present invention. include.
- Modification of bases can be performed, for example, by introducing a deletion using a restriction enzyme or DNA exonuclease, introducing a mutation using site-directed mutagenesis (Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982)), or using a PGR method using a mutated primer. can be carried out by a method such as modification, direct introduction of synthetic mutant DNA sequence (Man iatis, T. et al ( 1989):. "Molecular Cloning - a Laboratory Manual 2 nd Edt Roh 'Cold Spring Harbor Laboratory, NY) .
- the polynucleotide that is the MDTS9 promoter of the present invention can also be used for treating or preventing MDTS9 protein deficiency or abnormal expression caused by mutation in vivo.
- the MDTS9 gene containing the MDTS9 promoter and MDTS9 coding region of the present invention is inserted into a vector such as a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, or encapsulated in a liposome or the like and introduced into somatic cells.
- the MDTS9 protein can be expressed under normal transcriptional control, which makes it possible to improve MDTS9 protein deficiency or abnormal expression.
- the DNA containing at least a part of the DNA of SEQ ID NO: 17 antagonizes the binding between the MDTS9 promoter of the present invention and a protein (for example, a transcription factor) capable of binding to the MDTS9 promoter, regardless of whether or not it has promoter activity. Can inhibit. Therefore, when the DNA corresponds to a binding site of a protein that inhibits the activity of the promoter of the present invention, the administration of this DNA can promote the promoter activity, and conversely promote the promoter activity. In the case where it corresponds to a protein binding site, promoter activity can be inhibited by administering this DMA.
- DNA used for competitive inhibition usually has a chain length of at least 6 bases or more, preferably 10 bases or more.
- the recombinant vector of the present invention can be produced by incorporating the polynucleotide of the present invention into a vector appropriately selected according to the purpose.
- the polynucleotide of the present invention should be incorporated into a vector incorporating a reporter gene such as luciferase. It is preferable to manufacture with.
- the promoter of the present invention and the DNA of the MDTS9 coding region may be integrated into a vector such as a retrovirus, an adenovirus, or an adeno-associated virus. Can be remanufactured.
- the transformant of the present invention can be produced by incorporating the polynucleotide of the present invention into a host cell appropriately selected according to the purpose.
- a host cell appropriately selected according to the purpose.
- the purpose is to construct a screening system for a substance that regulates the MDTS9 promoter activity
- MDTS9 is considered to be an ADAMTS protease based on its sequence, it is considered to be a protease involved in extracellular matrix metabolism, and is expressed in human kidney as shown in Reference Examples 5 and 7 below. And its gene expression level is increased in renal failure model animals as shown in Reference Example 6, and induced by TGF- ⁇ as shown in Example 3 below. And ADAMTS protease whose expression is suppressed by IL-1.
- the substance that inhibits the activity of the oral motor of the present invention has a high possibility of inhibiting or inhibiting only the part related to the qualitative change and the quantitative increase of the extracellular matrix component in the physiological action of TGF-.
- it is useful as an active ingredient of a therapeutic agent for chronic renal failure which is expected to be administered for a long period of time.
- Cells expressing the promoter of the present invention can be treated with substances that inhibit the activity of the promoter of the present invention, or for treating chronic renal failure. And / or can be used as a screening tool for prophylactic substances.
- test compound that can be subjected to the analysis method or screening method of the present invention is not particularly limited.
- various known compounds including peptides registered in a chemical file, combinatorial ⁇ A group of compounds obtained by a chemistry technique (Terrett, NK et al., Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995) or a conventional synthesis technique, or a phage display method (Felici, F. et al.
- a random peptide group created by applying Mol. Bio to 222, 301-310, 1991 can be used.
- the known compounds include, for example, compounds (including peptides) which are known to have promoter inhibitory activity, but whether or not the activity of the promoter of the present invention is inhibited is unknown.
- culture supernatants of microorganisms, natural components derived from plants or marine organisms, or animal tissue extracts can also be used as test compounds for screening.
- a compound (including a peptide) obtained by chemically or biologically modifying a compound (including a peptide) selected by the screening method of the present invention can be used.
- the method for detecting the promoter activity is not particularly limited, but a method using a reporter gene plasmid containing the sequence of SEQ ID NO: 17 as described in Example 2 or Example 3 is convenient.
- Reporter gene refers to a gene that encodes a protein that can be quantified by ordinary means (for example, a quantification method known to those skilled in the art, such as measurement of enzyme activity), and includes chloramphenicol acetyltransferase, luciferase, and the like.
- jS-galactosidase and alkaline phosphatase genes are often used, but are not limited thereto.
- reporter gene plasmid there is no restriction on the vector from which the reporter gene plasmid is constructed, and commercially available plasmid vectors such as PGV-B2 (Toyo Ink) and PSEAP2-Basic (Ciontech) can be used. it can.
- a reporter gene plasmid having the sequence inserted in the forward direction upstream of the reporter gene of these vectors is constructed, and the amount of reporter protein expressed in cells transformed with this plasmid is determined by a method suitable for each.
- the presence or absence and the strength of the promoter activity of the sequence can be determined by the measurement, and the addition of the test compound to the culture of the above transformed cells has an effect on the promoter activity of the test compound. The effect can be analyzed.
- the present invention also provides a method for screening for a substance that suppresses the expression of the polypeptide of SEQ ID NO: 2 (MDTS9), comprising: (1) the above-described analysis step; and (2) a step of selecting a substance that inhibits promoter activity.
- a method for screening a substance for treating and / or preventing chronic renal failure is also included.
- the substance that inhibits the promoter activity selected in the above screening method is preferably a substance that becomes 90% or less of the promoter activity in the case of only TGF-S treatment by the method described in Example 3 described below. Those which are equal to or less than the treatment are more preferred.
- a method for producing a pharmaceutical composition for treating and preventing chronic renal failure of the present invention also includes a method for producing a pharmaceutical composition for treating and / or preventing chronic renal failure, which comprises an analysis step by the analysis method of the present invention described in (2) and a formulation step.
- the method for producing a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of chronic renal failure of the present invention includes a method for confirming the quality standard of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of chronic renal failure by the analysis method of the present invention.
- a method for producing a pharmaceutical composition for treating and / or preventing chronic renal failure which comprises a step of analyzing whether or not the activity of the protease of the present invention is inhibited, and a step of formulating.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for treating and / or preventing chronic renal failure, comprising a substance that inhibits the activity of the protease of the present invention as an active ingredient, which is selected by the screening method of the present invention, and a protea of the present invention.
- Chronic renal failure treatment and Z or prophylactic methods comprising administering a substance that inhibits the activity of isase are included.
- a method for producing a pharmaceutical composition for treating and / or preventing chronic renal failure which comprises formulating the substance obtained by the screening method of the present invention including the analyzing step of the present invention described in the present invention. It is included in the method for producing a pharmaceutical composition for treating and preventing chronic renal failure or Z or prophylaxis.
- the preparation containing a substance that inhibits the activity of the protease of the present invention as an active ingredient uses a carrier, an excipient, and / or other additives that are commonly used in the formulation of the active ingredient according to the type of the active ingredient. Can be prepared.
- Administration may be, for example, oral administration of tablets, pills, capsules, granules, fine granules, powders, or oral solutions, or injections such as intravenous injection or intramuscular injection, suppositories, transdermal Parenteral administration using an agent for administration or an agent for transmucosal administration can be mentioned.
- parenteral administration using an agent for administration or an agent for transmucosal administration
- a preparation method that does not undergo parenteral administration such as intravenous injection or digestion, for example, a preparation method described in WO 95/28 963 pamphlet It is preferably applied.
- one or more active substances and at least one inert diluent such as lactose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, hydroxypropylcellulose, starch, polyvinyl It can be mixed with pyrrolidone or magnesium aluminate metasilicate.
- the product can contain additives other than the inert diluent, for example, a lubricant, a disintegrant, a stabilizer, or a solubilizing or solubilizing agent, according to a conventional method.
- the tablets or pills can be coated with a sugar coating or a film of a gastric or enteric substance, if necessary.
- Liquid compositions for oral use can include, for example, emulsions, solutions, suspensions, syrups, or elixirs; commonly used inert diluents, such as purified water Or it may include ethanol.
- the composition can contain additives other than inert diluents, for example, wetting agents, suspending agents, sweetening agents, fragrances, or preservatives.
- Parenteral injections may include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, or emulsions.
- the water-soluble solution or suspension may contain, as a diluent, for example, distilled water for injection or physiological saline.
- examples of the diluent for the water-insoluble solution or suspension include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil (eg, olive oil), alcohols (eg, ethanol), and polysorbate. Etc. can be included.
- the composition may further include a wetting agent, an emulsifying agent, a dispersing agent, a stabilizer, a solubilizing or solubilizing agent, or a preservative.
- the composition can be sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericide, or irradiation.
- a sterile solid composition can be produced and dissolved in sterile water or another sterile injectable medium before use.
- the dose can be appropriately determined in consideration of the activity intensity, symptom, age, sex, etc. of the active ingredient selected by the screening method.
- the dose is usually about 0.01 to 1000 mg, preferably 0.01 to 100 mg per day for an adult (assuming a body weight of 60 kg).
- the dosage is 0.01 to 1000 mg, preferably 0.01 to 100 mg per day in the form of injection.
- Plasmid pGEP4 (manufactured by Invitrogen) is digested with restriction enzymes Glal and Nsil, blunt-ended, and self-ligated to prepare an expression vector pCEP4d from which Epstein-Barr virus-derived EBNA1 expression unit has been removed. did.
- the resulting expression vector pGEP4d was digested with restriction enzymes Nhel and BamHI, and then extracted with agarose gel. The DNA fragment of about 7.7 kbp was added with an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3.
- An expression vector pGEP4d-FLAG was prepared by inserting a double-stranded oligonucleotide obtained by annealing the oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 with an oligonucleotide.
- the nucleotide sequence confirmed that the obtained expression vector had the target sequence.
- the obtained expression vector pGEP4d-FLAG was designated as type II, and a combination of an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 was used as a primer in Pyropest ( PCR was performed using PyroBest TM) DNA polymerase (Takara Shuzo).
- Pyropest PCR was performed using PyroBest TM) DNA polymerase (Takara Shuzo).
- pGEPdE2-FLAG the Xbal recognition sequence, hel recognition sequence, Notl recognition sequence, BamHI recognition sequence, and FLAG tag, which are cloning sites, are arranged in this order from the promoter downstream.
- Reference Example 2 Cloning of full-length 0RF gene of novel protease gene NIDTS9 Oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 (SpeI recognition sequence and Kozak sequence are added on the 5 'side) and SEQ ID NO: 8 The combination with an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by (with a Notl recognition sequence added to the 5 'side) was used as a primer, and human fetal kidney GDNA (Marathon-Ready TM cDNA; manufactured by Clontech) was used.
- PGR was performed using DNA polymerase (TaKaRa LA Taq TM; manufactured by Takara Shuzo) as type III. In the PGR, heat denaturation was first performed at 94 ° C (2 minutes), and then a cycle consisting of 98 ° C (10 seconds) and 68 ° C (2 minutes 30 seconds) was repeated 40 times. The extension reaction was performed at 68 ° C (for 7 minutes). An approximately 2.2 kbp DNA fragment (with a Spel recognition sequence and a Kozak sequence added to the 5 ′ side and a Notl recognition sequence added to the 3 side) generated by the PGR was ligated to plasmid PGR2.1 (Invitrogen). Was cloned into a clone pMDTS9Gys1.
- the obtained plasmid pMDTS9Gys1 was cleaved with restriction enzymes Spel and Notl, and a DNA fragment of about 2.2 kbp was inserted into the Xbal and Notl sites of pGEPdE2-FLAG constructed in Reference Example 1 above.
- the plasmid pGEPdE2-MDTS9Gys1-FLAG was constructed.
- PGR was performed using cDNA (TaKaRa LA Tag TM; Takara Shuzo) using cDNA (Marathon-Ready TM cDNA; manufactured by Kuguchi Tech) as type II.
- heat denaturation was first performed at 94 ° C (2 minutes), then a cycle consisting of 98 ° C (10 seconds) and 68 ° C (30 seconds) was repeated 45 times, and finally 68 ° C. C (7 minutes) extension reaction was performed.
- pMDTS9 5S2-12 was obtained.
- the inserted fragment is a DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and encodes a sequence consisting of the 1st to 124th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
- Plasmid pGEPdE2-MDTS9Gys2-FLAG was inserted by inserting the NGO Notl DNA fragment B of about 1. Okbp, which had been produced by digestion with the above, into the Xbal site and Motl site of pGEPdE2-FLAG constructed in Reference Example 1 above. Was built.
- plasmid pZErO-MDTS9Gys2 was constructed by inserting the DNA fragment A and the DMA fragment B into the Spel and otl sites of plasmid pZEr0-2 (manufactured by Invitrogen).
- Plasmid pGEPdE2-WIDTS9Gys2-FLAG contains a gene consisting of nucleotides 1 to 250 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 of novel protease gene MDTS9, and is represented by SEQ ID NO: 2.
- a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 added to the G-terminal of the amino acid sequence consisting of amino acids 1 to 75 in the amino acid sequence Can be expressed.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is considered to be ADAMTS protease.
- Reference Example 3 Expression of MDTS9 short protein (MDTS9Gys2)
- Plasmid pGEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG prepared in Reference Example 2 or plasmid pGEPdE2-FLAG prepared in Reference Example 1 was used as a control, and a commercially available transfection reagent (FuGENE TM 6 Transfection on Reageent; Boehringer Mannheim) was used. And serum medium [DMEM (GI BGO-BRL), 10% fetal bovine serum, lOOju g / n penicillin, 100 jU g / mL streptomycin, and 250 g ZmL-G418 (Nacalai Tesque) ] Into HEK293-EBNA (Invitrogen).
- DMEM GI BGO-BRL
- 10% fetal bovine serum 10% fetal bovine serum
- lOOju g / n penicillin 100 jU g / mL streptomycin
- 250 g ZmL-G418 Nacalai Tesque
- the cells are cultured for 48 hours (hereinafter referred to as serum culture), or after the introduction of the plasmid, the cells are cultured for 16 hours and washed twice with PBS, and then the serum-free medium [DMEM ( GIBC0-BRL), 100 g / mL penicillin, 100 // g / mL streptomycin, 250 g / mL-G418 (manufactured by Nacalai Tesque)] for 32 hours (hereinafter referred to as serum-free culture).
- serum-free medium DMEM ( GIBC0-BRL), 100 g / mL penicillin, 100 // g / mL streptomycin, 250 g / mL-G418 (manufactured by Nacalai Tesque)
- the culture supernatant obtained by centrifugation (3000 rptn, 10 minutes) of each culture solution obtained by the serum culture or the serum-free culture using a centrifuge (Type 8800; manufactured by Kubota Seisakusho) is obtained. Obtained.
- each cell remaining after removing the culture solution was extracted with an extract [20 countries ol / L-HEPES (pH 7.4), 1% Triton X-100, 1W reseal, 0.1% ⁇ After treatment with serum albumin (BSA)] for 15 minutes, the cells are detached from the culture plate by pipetting, and the resulting cell suspension is centrifuged using a centrifuge (Type 8800; manufactured by Kubota Seisakusho). Separation (3000 rpm, 10 minutes) fractionated into a cell membrane-bound fraction (supernatant) and a cell fraction ('precipitation).
- each of the obtained fractions (that is, the culture supernatant, the cell membrane-bound fraction, and the cell fraction) is based on the antibody against the FLAG tag added to the G-terminal (mouse anti-FLAG monoclonal antibody M2; Sigma Western blotting using the following method. That is, each of the above fractions was subjected to electrophoresis using SDS / 10% to 20 »/ 0 acrylamide gel (manufactured by Daiichi Kagaku) under reducing conditions using 2-IE, and then subjected to a blotting apparatus. Was used to transfer to polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane.
- PVDF polyvinylidene difluoride
- a blocking agent (Block Ace; manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to the PVDF membrane after the transfer, and blocking was performed. Or Tago Co., Ltd.).
- a biotinylated M2 antibody manufactured by Sigma
- a horseradish peroxidase-labeled streptavidin manufactured by Amersham Pharmacia Biotech
- ECL western plotting detection system manufactured by Amersham Pharmacia Biotech
- SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the protein (i.e., MDTS9 short-length protein) detected in each fraction obtained by serum-free culturing of cells into which plasmid pGEPdE2-MDTS9Gys2-FLAG was introduced
- the apparent molecular mass in PAGE was about 55-65 KDa in the culture supernatant, about 55-65 KDa in the cell membrane-bound fraction, and 80-95 KDa in the cell fraction.
- Reference Example 4 Confirmation of protease activity of MDTS9 short protein
- GIu (glutamic acid) of His-Glu-Ser-Gly-His (SEQ ID NO: 12), which is considered to be the active center, using a QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) according to the attached instructions.
- a plasmid pZErO-MDTS9Gys2E / Q containing the gene MDTS9Cys2E / Q in which was replaced with GIn (glutamine) was prepared.
- the plasmid pZErO-MDTS9Gys2 prepared in Reference Example 2 was used, and as the primer set, an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 was used.
- the obtained plasmid pZErO-MDTS9Gys2E / Q is digested with restriction enzymes Spel and Notl, and a DNA fragment of about 2.3 kbp is inserted into the XbaI and NotI sites of the plasmid pGEPdE2-FLAG constructed in Reference Example 1 above.
- a plasmid pGEPdE2-DTS9Cys2E / Q-FLAG was obtained.
- a blocking agent (Block Ace; manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to the PVDF membrane after the transfer to perform blocking, and then a goat anti- 2 -macroglobulin antibody [manufactured by GEDARLANE] and horseradish parr Oxidase-labeled rabbit heron anti-goat IgG polyclonal antibody [Zymed Laboratories] was sequentially reacted. After the reaction, use a commercially available Western blotting detection system. The expression of the target protein was confirmed using a system (ECL Western Plotting Detection System; manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).
- Plasmid transflector Ekushi was a culture supernatant of cells derived from blood culture supernatants Yon in pCEPdE2-MDTS9Gys2-FLAG, each serum from cells Bok lance off Ekushi Yon plasmid P GEPdE2-MDTS9Gys2E / Q-FLAG or plasmid pCEPdE2-FLAG A band of about 250 KDa, which was not detected in the culture supernatant of the culture, was detected.
- MDTS9 short protein MDTS9Cys2
- 2- macroglobulin thus confirming that the MDTS9 short protein (MDTS9Gys2) has protease activity.
- Reference Example 5 Confirmation of tissue expression distribution of MDTS9 gene
- a combination of an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 and an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 was used as a primer, (TaKaRa LA Taq TM; manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.).
- heat denaturation was first performed at 94 ° C (2 minutes), and then a cycle consisting of 98 ° C (10 seconds) and 68 ° C (1 minute 30 seconds) was repeated 44 times.
- agarose gel electrophoresis of the reaction solution was performed to detect a DNA fragment of about 1.1 kbp derived from MDTS9 gene mRNA. As a result, it was found that the mRNA of the MDTS9 gene was expressed in the kidney.
- Reference Example 6 MDTS9 gene expression fluctuation in renal failure model
- RNA purification reagent (IS0GEN; manufactured by Nippon Gene).
- Total RNA was prepared.
- the extracted total RNA was reacted at 37 ° C. for 90 minutes using DNase (manufactured by Futaba Gene). 0.25 // g of total RNA treated with DNase was converted to cDNA by Superscript II First Strand System (for RT-PGR; GI BG0-BRL).
- Detector manufactured by Applied Biosystems.
- An oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 30 and an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 31 were used as a primer set.
- PGR was performed using a commercially available PGR reagent [SYBR Green PGR core reagent (manufactured by Applied Biosystems)] at 95 ° C (10 minutes), followed by an initial denaturation reaction at 94 ° C ( A cycle reaction consisting of 15 seconds), 60 ° C (30 seconds) and 72 ° C (60 seconds) was repeated 45 times.
- An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 33 was subjected to PGR under the same conditions as a primer set.
- rat genomic DNA (Clontech PCR was performed under the same conditions using the primer set.
- the expression level of rat MDTS9 gene mRNA under each condition was It is shown as a percentage of the G3PDH gene expression level.
- the gene of rat MDTS9 gene is expressed about 5-fold higher than in the sham-operated rat one week after the operation, and the amount of urinary protein is significantly increased. 3 weeks after surgery, 6 weeks after surgery when renal weight starts to increase markedly compared to normal kidney weight, and 8 weeks after surgery when disease condition worsens, each time about twice as many genes are expressed It has been found.
- plasmid pGEX-6P-1 manufactured by Amersham Pharmacia Biotech
- experimental manual edited by Masato Okada and Kaoru Miyazaki, "Revised Protein Experiment Note", Yodosha, p. 162-179
- a fusion protein of a peptide consisting of amino acids 280 to 410 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and daltathione S-transferase (GST) GST-NIDTS9A was produced in the inclusion body fraction using E. coli.
- the obtained GST-MDTS9A protein was immunized 5 times at intervals of 10 to 14 days with a egret (Japanese white species), and then an antiserum was prepared.
- the IgG fraction was purified from this antiserum.
- G Sepharose FF column manufactured by Amersham Pharmacia Biotech
- peptide purification consisting of amino acids 280 to 410 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
- affinity purification was performed on a column (MBP-MDTS9A column) on which a fusion protein (MBP-MDTS9A) with mannose-binding protein (MBP) was immobilized to obtain an anti-human MDTS9 antibody.
- Affinity purification on protein G Sepharose FF column, immobilization of MBP-MDTS9A on GNBr-activated Sepharose FF column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) and affinity purification on MBP-MDTS9A column are as follows. According to the attached instructions. For production and purification of MBP-NIDTS9A in E. coli, pWIAL-G2E (New England, manufactured by Biolab) was used as an expression vector and the instructions for the company's pMAL protein fusion and purification system were followed. .
- MDTS9 protein is expressed in human kidney.
- Example 1 Cloning of 5 'upstream region gene of MDTS9 gene
- This DNA fragment was treated with the restriction enzymes Sacl and Hindi II, inserted into the Sac and Hindlll site of a luciferase atsushi system vector (PicaGene Vector 2 basic vector; Toyo Ink) to obtain pGV-B2-MDTS9pro2k. .
- a set of an oligo DNA represented by SEQ ID NO: 22 having a Mlul recognition sequence added to the 5 'side and an oligo DNA represented by SEQ ID NO: 23, and a set of oligo DNA represented by SEQ ID NOS: 24 and 25 were prepared.
- Primers and human genomic DNA (Clontech) were used as type II, and PyroBest TM DNA polymerase (Takara Shuzo) was used at 96 ° C for 2 minutes.
- PGR was performed under the conditions of 20 cycles of 97 ° C for 20 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute 40 times, followed by 72 ° C for 7 minutes.
- the thus generated fragment of about 600 bp and 1 kbp was subcloned into pGR4Blunt-T0P0 (Invitrogen; E) to obtain subclones pGR4BIunt-T0P05k-1 and pCR4Blunt-T0P05k-3.
- human genomic DNA (Genomic DNA; Clontech) was used as type II, PyroBest TM DNA
- PGR was performed under the conditions of 96 ° C for 2 minutes, 40 cycles of 97 ° C for 20 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 2 minutes, followed by 72 ° C for 7 minutes.
- the fragments of about 1.6 kb and 1.9 kb thus generated were subcloned into pGR4B Iunt-T0P0 (Invitrogen) to obtain subclones pGR4Blunt-T0P05k-2 and pGR4Blunt-T0P05k-4.
- the plasmid pGV-B2-MDTS9pro2k or pGV-B2-MDTS9pro5k obtained in Example 1 was introduced into HEK293-EBNA cells according to the method described in Reference Example 3, and DMEM (GI BG0-BRL), 10% fetal calf After culturing with serum, 100 ig / ml penicillin, 100 g / ml streptomycin, 250 g / ml G418 (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) for 48 hours, luciferase activity was measured using PicaGene Color Kit (Toyo Ink). It was measured. At this time, the measured value was corrected with the activity value of ⁇ -gal expressed from the co-introduced -gal expression plasmid (pGH110; Amersham Pharmacia Biotech). j8-gal activity measurement
- Example 1 The plasmid pGV-B2-MDTS9pro5k obtained in Example 1 was
- DMEM 100 g / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 250 / g / ml G418 (Nacalai Tesque) were substituted and cultured for 6 hours (hereinafter, serum-free culture). Subsequently, TGF-yS (Sigma) or IL-1 (Sigma) is added and cultured for 24 hours. Later luciferase activity was measured. The measured value was corrected with the yS-gal activity value as in Example 2.
- the promoter of the present invention has an increased gene expression level in renal failure model animals, and is expressed in human kidney induced by TGF-S, inhibited by IL-1 and involved in extracellular matrix metabolism. Since the protease is a promoter of the protease TS9, the substance that inhibits the activity of the promoter of the present invention is one of the physiological actions of TGF-j8. It inhibits or suppresses only the part related to qualitative change and quantitative increase of extracellular matrix components. It is useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for chronic renal failure in which long-term administration is expected.
- the polynucleotide, the expression vector, and the cell that are the promoter of the present invention are useful as a screening tool for a therapeutic and / or prophylactic agent for chronic renal failure.
- each base sequence represented by the sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing is an artificially synthesized linker sequence.
- the base sequences represented by the sequences of SEQ ID NOS: 5 to 9, 13 and 14, and 20 to 22 were synthesized artificially. It is a primer sequence.
- the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing is an amino acid sequence obtained by expression of a DNA containing a nucleotide sequence encoding a restriction enzyme Notl recognition nucleotide sequence and a FLAG tag amino acid sequence. .
Abstract
慢性腎不全治療及び／又は予防剤のスクリーニングツールとして有用な、TGF-βにより誘導され、細胞外マトリクスの代謝に関与し、腎不全モデル動物においてその遺伝子発現量が増加しているプロテアーゼMDTS9のプロモーター、本プロモーターの阻害剤を選択することによる、慢性腎不全治療及び／又は予防剤のスクリーニング方法を開示する。
Description
明細書 新規プロモーター 技術分野
本発明は、 新規なプロモーターに関する。 背景技術
ADA TS (A D i s i ntegr i n and Metal loprotease with Thrombospondin motif)は、 デイスインテグリン様ドメイン、 金属プロテアーゼ様ドメイン、 及び卜ロンボス ポンジン I型繰り返し配列 （以下、 TSP-1繰り返し配列と称する） を含む分子群 である。
前記ヒト ADAMTS分子の中で、 ADAMTS4 (ァダリカナーゼー 1 ) 及び ADAMTS11
(ァダリカナーゼー 2) では、 細胞外基質ァグリカンを選択的に切断する活性が 示され、 関節炎や変形性関節症における軟骨細胞外基質ァグリカンの分解の本体 の酵素である可能性が示唆されていた（Tortorella M. D.ら， Science, 284， 1664- 1666, 1999； 及び Abbaszade に ら， J.Biol. Chem. , 274, 23443-23450, 1999) 0 また. ADA1VITS2 (プロコラーゲン I Ν—プロティナーゼ） は、 I型コラーゲンプロ体の Ν末部の切断除去酵素として、 I型コラーゲンのプロ体から成熟型への転換に関 与し、 コラーゲン線維の形成に重要な役割を果たしておリ、 その遺伝子の異常と VI IG型エーラース■ダンロス（Ehlers-Danlos)症候群との関連性が示されている (Go I i ge A.ら， Am. J. Hum. Genet. , 65， 308-317， 1999)。
すなわち、 ADAMTS分子は、 ァグリカンやコラーゲン等の細胞外マトリクスの分 解及び成熟といった代謝に関与することが示されている。
一方、 慢性腎不全は、 糸球体硬化及び腎間質線維化を特徴とする疾患であり、 細胞外マ卜リクス成分の質的変化及び/又は量的増加が主要な発病及び進行機序 とされている。 トランスフォーミング増殖因子 ;8 (TGF-)S)は、 多種多様の生理機 能を示す分化及び成長因子であることが知られており、 細胞外マトリクス成分の
質的変化及び量的増加に係わる作用を持つことも知られている （Border, W. A ,N. Engl. J. Med. ,331,1286-1292， 1996； Rberts, Α· Β·ら，
Proc. Nat I · Acad. Sci.U. S. A.， 83, 4167-4171 ,1986； Fukabor i ' Y
, Int. J.Urol. ,4,597-602, 1997;Lohr, M , Cancer Res. , 61, 550-555, 2001) 。 腎不全疾患モデルを用いた実験において、 TGF -^ の特異的な作用抑制タンパク質 であるデコリンの遺伝子導入（Isaka Y.ら， Nature Med.， 2, 418-423， 1996)ゃ抗
TGF-yS 投与（Ziyadeh F.N. , Proc. Nat I - Acad. Sc i . U. S. A. , 97, 8015-
8020, 2000 ;Sharma K.ら， Diabetes, 45， 522 - 530, 1996;及び Border W. A.
ら， Nature, 346, 371-374, 1990)が有効性を示したことより、 TGF-j8 の生理機能を 抑制又は阻害することが慢性腎不全の治療に繋がると考えられている。
し力、し、 満足のいぐ匱性腎不全治療薬がない現状のもと、 期待されているにも かかわらず、 現在までに TGF-yS 阻害剤は上市されていない。
また、 間質の炎症、 ひいては繊維化を生じる機序に関しては様々な検討がなさ れている。 腎臓では糸球体で産生■放出された IL- 1；5 などの炎症性サイ トカイン により尿細管上皮細胞が活性化され、 MGP-1などのケモカイン、 インテグリン、 ォステ才ポンチンなどの細胞接着分子や細胞外基質を生産して細胞浸潤を促進し. 浸潤してきた単球や Tリンパ球は更に新たなサイトカインを分泌することで尿管 上皮細胞や浸潤細胞に作用して炎症巣が生じ、 細胞外マトリクス成分の分解を伴 う組織破壊が起こる。 破壊された組織の修復の過程での過修復、 繊維芽細胞や筋 繊維芽細胞 (myofibroblast)の関与により、 細胞外マトリクス成分の質的変化及び 量的増加が起こることも繊維化の機序として考えられている （岡田浩一，別冊■医 学のあゆみ 糸球体腎炎の発症と治療, 120-123, 2001) 。
NCBIデータベースにおいて AG010269として、 187084bpのヒ卜染色体 5クロー ン GTG-485I21の配列が開示されている （非特許文献 1参照） 。 公知配列との相同 性分析に基づき ADAMTSファミリーに属すると推定される、 卵巣での高発現、 性周 期による発現変動、 及び腫瘍細胞における存在低下が知られているタンパク質を コードする cDNA 及びその推定アミノ酸配列が知られている （特許文献 1参照） ， また、 ADAMファミリーと推定される配列を含む、 ゲノムデータベースを利用し、
プロテア一ゼをコードすると推定される多数の塩基配列、 及び、 それがコードす る推定アミノ酸配列が知られている （特許文献 2参照） 。
非特許文献 1
http： //www. ncb i . n lm. n i h. gov/entrez/query. fGg i ?Gmd=Retr i eve&db=nuc l eot i de& I i st— u i ds=15281 193&dopt=GenBank AC010269
特許文献 1 国際公開第 W002/31 163号パンフレツト
特許文献 2 国際公開第 W001 /83782号パンフレツト 発明の開示
TGF-yS は、 多種多様の生理機能を示す分化及び成長因子であるため、 TGF- ySの 生理機能全てを阻害することは、 長期投与が想定される慢性腎不全の治療におい ては問題が生じるおそれがある。 TGF- ;3 の生理作用のうち、 細胞外マトリクス成 分の質的変化及び量的増加に係わる部分だけを抑制又は阻害することが望ましい ( 本発明の課題は、 慢性腎不全治療及び Z又は予防剤のスクリーニングツールと して有用な、 TGF- 8 により誘導され、 細胞外マトリクスの代謝に関与する新規プ 口テアーゼのプロモータ一を提供することにある。
本発明者は、 前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、 配列番号 2 で表される配列における第 1番〜第 1 2 2 4番の配列からなる新規プロテアーゼ MDTS9をコードするポリヌクレオチドを取得し、 続いてヒトゲノム DMAより MDTS9 のプロモータ一を取得した。 また、 前記プロテアーゼは、 （1 ) ADAMTSプロテア ーゼに分類されることより、 細胞外マトリックスの代謝に関与するプロテアーゼ であると考えられること、 （2 ) 実際に、 ヒ卜の腎臓での発現が認められること,
( 3 ) 腎不全モデル動物において、 その遺伝子発現量が増加していることを見出 し、 更に （4 ) TGF- によりプロモーター活性が亢進 （すなわちプロテア一ゼ発 現誘導） されることを確認した。 これらにより、 MDTS9は、 腎不全の原因となる ポリペプチドであり、 本ポリペプチドのプロモーターを用いて、 MDTS9の発現を 抑制する物質をスクリーニングすることにより、 TGF-yS の生理作用のうち、 細胞 外マ卜リクス成分の質的変化及び量的増加に関わる部分だけを抑制又は阻害する
慢性腎不全治療及びノ又は予防剤として有用な物質をスクリーニングできること を明らかにした。 また、 マトリクス■メタ口 ■プロテア一ゼ （國 P) などの細胞外 マトリクス分解酵素の発現を誘導する炎症性サイトカインの一つである IL-1では 本発明のプロモーターの活性が減弱する （すなわちプロテアーゼ発現が抑制され る） こと、 すなわち、 本プロテアーゼの発現誘導が炎症時ではなく、 組織の修復 や細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加を特徴とする腎繊維化の過程に 特異的であることを見出し、 本発明のプロモーター阻害剤が慢性腎不全治療及び Z又は予防剤として有用であることをさらに明らかにし、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、
(1 ) 配列番号 1 7の 3253番目から 5023番目で表される塩基配列、 ある いは、 配列番号 1 7の 3253番目から 5023番目で表される塩基配列の中に おいて、 1〜10個の塩基が置換、 欠失、 及び Z又は挿入されている塩基配列を 含み、 配列番号 2記載のポリべプチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオ チド、
(2) 配列番号 1 7で表される塩基配列、 あるいは、 配列番号 1 7記載の塩基配 列の中において、 1 ~10個の塩基が置換、 欠失、 及び Z又は挿入されている塩 基配列を含む、 （1 ) 記載のポリヌクレオチド、
(3) 配列番号 1 7の 3253番目から 5023番目で表される塩基配列、 又は, 配列番号 1 7で表される塩基配列を含む、 （ 1 ) 記載のポリヌクレオチド、
(4) (1 ) 乃至 （3) 記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
(5) (4) 記載の発現ベクターでトランスフエクシヨンされた細胞、
(6) (1 ) 記載のポリヌクレオチド、 又は、 （5) 記載の細胞からなる慢性腎 不全治療及び 又は予防用物質スクリーニングツール、
(7) (1 ) 記載のポリヌクレオチド、 又は、 （ 5 ) 記載の細胞の慢性腎不全治 療及びノ又は予防用物質スクリーニングのための使用、
(8) ① （5) 記載の細胞と、 試験化合物とを接触させる工程、 及び、 ②プロモ 一ター活性を検出する工程を含む、 試験化合物が （1 ) 乃至 （3) 記載のポリヌ クレオチドのプロモーター活性を阻害するか否かを分析する方法、
( 9 ) ( 8 ) 記載の方法による分析工程、 及びプロモーター活性を阻害する物質 を選択する工程を含む、 配列番号 2記載のポリべプチドの発現を抑制する物質を スクリーニングする方法、
( 1 0 ) ( 9 ) 記載の方法により、 慢性腎不全治療及び/又は予防用物質をスク リーニングする方法、 及び
( 1 1 ) ( 8 ) 記載の方法による分析工程、 及び製剤化工程を含む、 慢性腎不全 治療及び 又は予防用医薬組成物の製造方法、
に関する。
なお、 AG010269には、 187084bpの一部分として配列番号 1 7記載の塩基配列を 含む配列を開示しているが、 187084bp からなる配列を MDTS9コーディング配列の 上流につなげても、 MDTS9プロモーター活性を示すとは考えがたく、 MDTS9のプロ モーター活性があることや、 慢性腎不全治療及ぴノ又は予防剤のスクリーニング に関しては何ら開示されていない。 W002/31 163には、 配列番号 2記載のアミノ酸 配列と 1アミノ酸違う配列が記載され、 該配列を有するポリペプチドは、 卵巣の 細胞外マトリックスの分解及び再構築に関与することを示唆している。 また、
W001 /83782には、 配列番号 2記載のァミノ酸配列と 2ァミノ酸違う配列が記載さ れているが、 該配列を有するポリペプチドを取得したこと、 及び活性や機能を確 認したことは記載されていない。 そして、 前記 2件の公報に記載された配列を有 するポリペプチドが慢性腎不全の原因であること、 MDTS9 のプロモーター、 及び, MDTS9のプロモーターを用いた慢性腎不全治療及び 又は予防剤のスクリーニン グに関しては開示も示唆もない。
図面の簡単な説明
図 1は、 pGV-B2-MDTS9pro5kを導入した細胞において、 TGF- 添加によリルシ フェラーゼ活性が上昇することを示す図である。
図中、 縦軸は、 ルシフェラーゼ活性測定値を同時導入した j8- gal発現プラスミ ドょリ発現した - galの活性値で補正し、 TGF -^非処理の pGV - B2(空ベクター） 導入細胞の補正値を 1として示した相対値、 横軸は、 TGF -^の濃度である。
図 2は、 pGV-B2-MDTS9pro5kを導入した細胞において、 IL-1添加によリルシフ エラーゼ活性が減弱することを示す図である。
図中、 縦軸は、 ルシフェラーゼ活性測定値を同時導入した )S- gal発現プラスミ ドょリ発現した S - galの活性値で補正し、 IL- 1非処理の pGV - B2(空ベクター)導 入細胞の補正値を 1として示した相対値、 横軸は、 IL-1の濃度である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
(1 ) 本発明のプロモーターであるポリヌクレオチド、 発現ベクター、 細胞 本発明者らは、 細胞外マトリックスの代謝に関与するプロテアーゼであり、 ヒ 卜の腎臓での発現が認められ、 腎不全モデル動物において、 その遺伝子発現量が 増カロしてしゝる MDTS9 (Metal loprotease and Disintegr in with Thrombospondin type - 1 repeats 9)をコードするポリヌクレオチド及びそのプロモータ一を得、 塩 基配列を決定した（配列番号 1 7)。 取得したプロモーターの全長及び部分断片 (配 列番号 1 7の 3253番目から 5023番目）を適当なプラスミド、 具体的には、 レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミド pGV-B2内にサブ クローニングした。 この融合プラスミドのレポーター遺伝子の発現、 すなわち、 活性によリルシフエラーゼの発現を検出することにより、 得られたポリヌクレオ チドがプロモーター活性を有していることを確認した。 また、 本発明者らは、 配 列番号 1 7記載のポリヌクレオチドが、 TGF - jS によりプロモーター活性が上昇し, IL-1によりプロモーター活性が減弱することを見出した。
前述のとおり、 MDTS9の発現を抑制 （プロモーター阻害） する物質が慢性腎不 全治療及び 又は予防剤として有用であるので、 本発明のプロモーターは、 阻害 剤をスクリーニングするためには、 有用である。 MDTS9プロモーター阻害剤をス クリーニングするためには、 配列番号 1 7中の TGF- ;8応答領域を含む配列を必ず
しも用いる必要はなく、 例えば、 配列番号 1 7の 3 2 5 3番目から 5 0 2 3番目 を用いて、 実施例 7記載の方法でスクリーニングすることも可能である。 したが つて、 本発明のプロモーターは、 配列番号 1 7の 3 2 5 3番目から 5 0 2 3番目 の塩基配列を含み、 MDTS9プロモーター活性を有していれば、 5 '領域のいかなる 塩基配列をさらに含んでいても良い。 より好ましくは、 配列番号 1 7の塩基配列 を含み、 MDTS9プロモーター活性を有しているポリヌクレオチドであり、 更に好 ましくは、 配列番号 1 7の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。 また、 配 列番号 1 7の 3 2 5 3番目から 5 0 2 3番目の塩基配列の中のいずれかの 1〜 1 0個（好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜3個）の部位において、 1乃至複 数個（好ましくは 1 ~ 1 0個、 より好ましくは 1 ~ 5個、 さらに好ましくは 1 ~ 3 個）の塩基が置換、 欠失、 及び 又は挿入されている塩基配列を含み、 MDTS9プロ モーター活性を有するポリヌクレオチドも、 より好ましくは、 配列番号 1 7記載 の塩基配列の中のいずれかの 1 ~ 1 0個（好ましくは 1〜 5個、 より好ましくは 1 〜3個）の部位において、 1乃至複数個（好ましくは 1〜 1 0個、 より好ましくは 1〜5個、 さらに好ましくは 1〜3個）の塩基が置換、 欠失、 及びノ又は挿入され ている塩基配列を含み、 MDTS9プロモーター活性を有するポリヌクレオチドも、 本発明のプロモーターに含まれる。 「プロモーター活性」 とは DNA鎖の情報を RNA鎖に転写するための開始部位として働く活性を意味し、 「MDTS9プロモーター 活性を有する」 とは、 実施例 2記載の方法でプロモーター活性を確認できること であり、 より好ましくは、 実施例 3記載の方法で TGF- によりプロモーター活性 が亢進することを意味する。
本発明のポリヌクレオチドは、 実施例記載の方法で製造する以外に、 下記の方 法で製造することもできる。
① PGR法を用いた製造
実施例 1記載のように、 プライマーとヒトゲノム DMAを用いて PGRを行い、 配 列番号 1 7の塩基配列を含む DNAを製造することができる。 一般に、 アレル変異 体の存在は良く知られている。 本方法で DNAを製造した場合に、 配列番号 1 7の 塩基配列の中のいずれかの部位において、 塩基が置換、 欠失、 及び 又は挿入さ
れている塩基配列を含み、 MDTS9プロモーター活性を有する DMAが得られる場合 もあるが、 これも本発明のプロモーターに含まれる。
② DNA合成を用いた製造
配列番号 1 7記載の配列及びその相補鎖を、 何本かに分割して化学合成法によ つて製造し、 これらの DNA断片を結合することによつても製造できる。 各 DNA断 片は、 DNA合成機 (例えば、 Ol igo 1000 DNA Synthesizer (Beckman社）、 あるい は、 394 DNA/RNA Synthesizer (App I ied Biosystems社）など）を用いて合成するこ とができる。
製造したポリヌクレオチドが MDTS9プロモーター活性を有するか否かは、 例え ば、 実施例 2又は実施例 3記載の方法で確認することができる。
当業者であれば、 天然型に存在するプロモーター配列の塩基配列の一部を他の 塩基への置換や塩基の欠失、 及び Z又は付加などの改変により、 天然型のプロモ 一ターポリヌクレオチドと同等のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを 調製することが可能である。 このように天然型の塩基配列において塩基が置換、 欠失、 及び Z又は付加した塩基配列を有し、 天然型のプロモーターポリヌクレオ チドと同等のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドもまた本発明のポリヌ クレオチドに含まれる。 塩基の改変は、 例えば、 制限酵素あるいは DNAェキソヌ クレアーゼによる欠失導入、 部位特異的変異誘発法による変異導入 (Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982))、 変異プライマーを用いた PGR法によるプロモータ一配列 の改変、 合成変異 DNAの直接導入などの方法により行うことができる（Man iatis, T. et al. (1989) ： "Molecular Cloning - A Laboratory Manual 2nd Edtノ' Cold Spring Harbor Laboratory, NY)。
本発明の MDTS9プロモーターであるポリヌクレオチドは、 生体内における変異 に由来した MDTS9蛋白質の欠損又は発現異常症の治療や予防に利用することも可 能である。 例えば、 本発明の MDTS9プロモーターと MDTS9コーディング領域を含 む MDTS9遺伝子を、 レトロウイルス、 アデノウイルス、 アデノ随伴ウィルス等の べクターに挿入し、 又はリポソームなどに封入して体細胞に導入することにより
正常な転写制御下に MDTS9蛋白質を発現させることができ、 これにより MDTS9蛋 白質の欠損又は発現異常症などに対する改善を図ることが可能となる。
配列番号 1 7記載の DNAの少なくとも一部分を含む DNAは、 プロモーター活性 を有するか否かを問わず、 本発明の MDTS9プロモーターとこれに結合しうる蛋白 質 (例えば、 転写因子）との結合を拮抗阻害しうる。 このため該 DNAが、 本発明の プロモーターの活性を阻害する蛋白質の結合部位に相当する場合には、 この DNA を投与することによりプロモーター活性を促進することができ、 逆にプロモータ 一活性を促進する蛋白質の結合部位に相当する場合には、 この DMAを投与するこ とによりプロモーター活性を阻害することができる。 拮抗阻害に用いる DNAは、 通常少なくとも 6塩基以上、 好ましくは 10塩基以上の鎖長を有する。
本発明の組換えベクターは、 目的に応じ適宜選択したベクターに、 本発明のポ リヌクレオチドを組み込むことにより製造できる。 例えば、 MDTS9プロモーター 活性を調節する物質のスクリーニング系構築を目的とする場合は、 実施例に記載 したように、 ルシフエラーゼ等のレポ一タ一遺伝子を組み込んだべクターに本発 明のポリヌクレオチドを組み込んで製造することが好ましい。 また、 MDTS9蛋白 質の欠損又は発現異常症の遺伝子治療を目的とする場合は、 レトロウイルス、 ァ デノウィルス、 アデノ随伴ウィルス等のベクターに、 本発明のプロモーターと MDTS9コーディング領域の DNAを組み込むことによリ製造できる。
本発明の形質転換体は、 目的に応じ適宜選択した宿主細胞に、 本発明のポ リヌクレオチドを組み込むことにより製造できる。 例えば、 MDTS9プロモーター 活性を調節する物質のスクリーニング系構築を目的とする場合は、 ヒトあるいは マウス、 ラットなどの哺乳動物由来で、 腎臓組織由来の細胞を用いることが好ま しい。
( 2 ) 本発明の分析方法及びスクリーニング方法
本発明のプロモーターを用いることにより、 試験化合物が、 MDTS9のプロモー ター活性を阻害するか否かを分析することができる。 また、 この本発明の分析方 法を用いると、 MDTS9プロモーター活性を阻害する物質をスクリーニングするこ
とができる。 MDTS9はその配列より ADAMTSプロテアーゼであると考えられること から、 細胞外マトリクスの代謝に関与するプロテアーゼであると考えられ、 後述 の参考例 5及び参考例 7に示すように、 ヒ卜の腎臓で発現しているタンパク質で あり、 参考例 6で示すように腎不全モデル動物において、 その遺伝子発現量が増 加しているおリ、 しかも、 後述の実施例 3に示すように、 TGF -^ により誘導され、 I L-1により発現が抑制される ADAMTSプロテアーゼである。 従って、 本発明のプ 口モーターの活性を阻害する物質は、 TGF- の生理作用のうち、 細胞外マトリク ス成分の質的変化及び量的増加に係わる部分だけを抑制又は阻害する可能性が高 く、 長期投与が想定される慢性腎不全治療剤の有効成分として有用であり、 本発 明のプロモーターを発現する細胞を、 本発明のプロモーターの活性を阻害する物 質、 あるいは、 慢性腎不全治療及び 又は予防用物質のスクリーニングツールと して使用することができる。
本発明の分析方法又はスクリーニング方法にかけることのできる試験化合物と しては、 特に限定されるものではないが、 例えば、 ケミカルファイルに登録され ている種々の公知化合物（ぺプチドを含む）、 コンビナトリアル■ケミストリー技 術 (Terrett, N. K.ら， Tetrahedron, 51， 8135-8137, 1995)又は通常の合成技術によつ て得られた化合物群、 あるいは、 ファージ 'ディスプレイ法 (Fe l i c i，F.
ら， Mo l . B i oに， 222, 301 -310, 1991 )などを応用して作成されたランダム■ぺプチ ド群を用いることができる。 前記公知化合物には、 例えば、 プロモーター阻害活 性を有することが知られているが、 本発明のプロモーターの活性を阻害するか否 かが不明な化合物（ペプチドを含む)が含まれる。 また、 微生物の培養上清、 植物 若しくは海洋生物由来の天然成分、 又は動物組織抽出物などもスクリーニングの 試験化合物として用いることができる。 更には、 本発明のスクリーニング方法に より選択された化合物 (ぺプチドを含む）を、 化学的又は生物学的に修飾した化合 物 (ぺプチドを含む）を用いることができる。
本発明の分析方法は、
①本発明のプロモーターを含む発現ベクターでトランスフエクシヨンされた細胞 と、 試験化合物とを接触させる工程、 及び、 ②プロモーター活性を検出する工程
を含む、 試験化合物が本発明のプロモーターの活性を阻害するか否かを分析する 方法を含む。
プロモーター活性を検出する方法としては、 特に限定されないが、 実施例 2又 は実施例 3に記載したような配列番号 1 7記載の配列を含むレポーター遺伝子プ ラスミドを用いる方法が簡便である。 レポーター遺伝子とは通常の手段 (例えば、 酵素活性の測定等、 当業者に既知の定量法）によって定量することができる蛋白を コ一ドする遺伝子を指し、 クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ、 ルシフェラーゼ、 jS -ガラクトシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ遺伝子がよく 用いられているがこれらに限定されない。 レポーター遺伝子プラスミ ドを構築す る基となるベクターに関しては制限はなく、 市販のプラスミドベクター、 例えば, PGV-B2 (東洋ィンキ社製）や PSEAP2- Bas i c (C I ontech社製）などを用いることができ る。 これらのベクターのレポーター遺伝子の上流に当該配列を順方向に挿入した レポーター遺伝子プラスミドを構築し、 このプラスミ ドで形質転換した細胞にお いて発現されるレポータ一蛋白の量をそれぞれに適した方法で測定することによ り当該配列のプロモーター活性の有無、 強度を知ることができ、 また、 上記形質 転換細胞の培養液に試験化合物を添加することにより、 試験化合物の当該プロモ -タ一活性に及ぼす作用を分析することができる。
また、 本発明には、 ①上記分析工程、 及び、 ②プロモーター活性を阻害する物 質を選択する工程を含む、 配列番号 2記載のポリペプチド （MDTS9) の発現を抑制 する物質をスクリーニングする方法、 又は慢性腎不全治療及び 又は予防用物質 をスクリーニングする方法も含まれる。
上記スクリーニング法で選択するプロモーター活性を阻害する物質としては、 後述の実施例 3に記載の方法で、 TGF- S処理のみの場合のプロモーター活性の 90%以下になる物が好ましく、 TGF- yS未処理と同等かそれ以下になる物がさらに 好ましい。
( 3 ) 本発明の慢性腎不全洽療及び Z又は予防用医薬組成物の製造方法
本発明には、 （2 ) 記載の本発明の分析方法による分析工程、 及び、 製剤化工 程を含む、 慢性腎不全治療及び 又は予防用医薬組成物の製造方法も含まれる。 本発明の慢性腎不全治療及びノ又は予防用医薬組成物の製造方法には、 慢性腎不 全治療及び 又は予防用医薬組成物の品質規格の確認試験において、 本発明の分 析方法によリ、 本発明のプロテアーゼの活性を阻害するか否かを分析する工程、 及び製剤化工程を含む、 慢性腎不全治療及び 又は予防用医薬組成物の製造方法 も含まれる。
また、 本発明には、 本発明のスクリーニング方法により選択される、 本発明の プロテアーゼの活性を阻害する物質を有効成分とする慢性腎不全治療及び 又は 予防用医薬組成物、 並びに、 本発明のプロテア一ゼの活性を阻害する物質を投与 することからなる慢性腎不全治療及び Z又は予防方法が包含される。 そして、
( 2 ) 記載の本発明の分析工程を含む本発明のスクリーニング方法で得られた物 質を製剤化することからなる、 慢性腎不全治療及び 又は予防用医薬組成物の製 造方法も本発明の慢性腎不全治療及び Z又は予防用医薬組成物の製造方法に含ま れる。
本発明のプロテアーゼの活性を阻害する物質を有効成分とする製剤は、 前記有 効成分のタイプに応じて、 それらの製剤化に通常用いられる担体、 賦形剤、 及び 又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 又 は経口用液剤などによる経口投与、 あるいは、 静注若しくは筋注などの注射剤、 坐剤、 経皮投与剤、 又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができ る。 特に胃で消化されるペプチドにあっては、 静注等の非経口投与又は消化を受 けない製剤化手段、 例えば、 W0 9 5 Z 2 8 9 6 3号パンフレツ卜に記載の製剤 化手段を適用するのが好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、 1又はそれ以上の活性物質と、 少な くとも一つの不活性な希釈剤、 例えば、 乳糖、 マンニトール、 ブドウ糖、 微結晶 セルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 デンプン、 ポリビニルピロリ ドン, 又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。 前記組成
物は、 常法に従って、 不活性な希釈剤以外の添加剤、 例えば、 滑沢剤、 崩壊剤、 安定化剤、 又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。 錠剤又は 丸剤は、 必要によリ糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆す ることができる。
経口のための液体組成物は、 例えば、 乳濁剤、 溶液剤、 懸濁剤、 シロップ剤、 又はエリキシル剤を含むことができ、 一般的に用いられる不活性な希釈剤、 例え ば、 精製水又はエタノールを含むことができる。 前記組成物は、 不活性な希釈剤 以外の添加剤、 例えば、 湿潤剤、 懸濁剤、 甘味剤、 芳香剤、 又は防腐剤を含有す ることができる。
非経口のための注射剤としては、 無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、 懸濁剤, 又は乳濁剤を含むことができる。 水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、 希釈剤として, 例えば、 注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。 非水溶性の溶 液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、 例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレ ングリコール、 植物油 （例えば、 オリ一ブ油） 、 アルコール類 （例えば、 ェタノ ール） 、 又はポリソルベー卜 8 0等を含むことができる。 前記組成物は、 更に湿 潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤、 溶解若しくは溶解補助剤、 又は防腐剤などを 含むことができる。 前記組成物は、 例えば、 バクテリア保留フィルタ一を通す濾 過、 殺菌剤の配合、 又は照射によって無菌化することができる。 また、 無菌の固 体組成物を製造し、 使用の際に、 無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し, 使用することもできる。
投与量は、 前記スクリーニング法により選択された有効成分の活性の強さ、 症 状、 投与対象の年齢、 又は性別等を考慮して適宜決定することができる。
例えば、 経口投与の場合、 その投与量は、 通常、 成人 (体重 60kgとして）において, 1 日につき約 0. 01〜1000mg、 好ましくは 0. 01〜100mgである。 また、 非経口投与 の場合、 注射剤の形では、 1 日につき 0. 01〜1000mg、 好ましくは 0. 01〜100mgで ある。 実施例
以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の範囲を 限定するものではない。 なお、 特に断らない限り、 公知の方法 (例えば、
Sambrook, J.ら，" Molecular Cloning - A Laboratory Manua I " , Cold Spring
Harbor Laboratory, NY, 1989)に従って実施した。 参考例 1 ： G末 FLAG付加型発現べクタ一の作製
プラスミド pGEP4(インビトロジェン社製）を、 制限酵素 Glal及び Nsilで切断 し、 平滑末端化した後、 自己連結反応を行なうことにより、 ェプスタイン 'バー ウィルス由来の EBNA1発現ュニッ卜を除去した発現ベクター pCEP4dを作製した。 得られた発現ベクター pGEP4dを、 制限酵素 Nhel及び BamHIで切断した後、 ァガ ロースゲル抽出することにより得られた約 7.7kbpの DNA断片に、 配列番号 3で表 される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号 4で表される塩基配列か らなるオリゴヌクレオチドとをァニールさせて得られた二重鎖オリゴヌクレオチ ドを挿入することによ-リ、 発現ベクター pGEP4d-FLAGを作成した。 なお、 得られ た発現べクタ一が目的の配列を有することは、 塩基配列によリ確認した。
得られた発現ベクター pGEP4d - FLAGを錶型とし、 配列番号 5で表される塩基配 列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号 6で表される塩基配列からなるオリゴ ヌクレオチドとの組み合わせをプライマーとして、 パイロペスト（PyroBest™)DNA ポリメラーゼ （宝酒造社製） を用いて PCRを行なった。 前記 PGRでは、 最初に
94°C (2分間）で熱変性を行なつた後、 94°C (30秒間）と 55°C (30秒間）と 72°C (30秒 間）とからなるサイクルを 15回繰り返し、 最後に 72°C(7分間）の伸長反応を行な つた。 前記 PGRにより生じた約 0.4kbpの DNA断片を制限酵素 Spel で切断した後, この DMA断片を、 制限酵素 Xba Iで切断した pGEP4d- FLAG (約 7.7kbp)に揷入するこ とにより、 発現ベクター pGEPdE2-FLAGを作成した。 得られた発現べクタ一
pGEPdE2- FLAGにおいては、 プロモータ一から下流に向かって、 クローニングサイ 卜である Xbal認識配列、 hel認識配列、 Notl認識配列、 及び BamHI認識配列、 並びに FLAGタグがこの順に配列されている。
参考例 2 ：新規プロテアーゼ遺伝子 NIDTS9の全長 0RF遺伝子のクローニング 配列番号 7で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5 ' 側に Spe l認 識配列及び Kozak配列が付加してある）と配列番号 8で表される塩基配列からなる オリゴヌクレオチド（5 ' 側に Not l認識配列が付加してある）との組み合わせをプ ライマーとし、 ヒ卜胎児腎臓 GDNA (Marathon-Ready™ cDNA；クロンテック社製）を 錶型として、 DNAポリメラーゼ (TaKaRa LA Taq™； 宝酒造社製）を用いて PGRを行 なった。 前記 PGRでは、 最初に 94°C (2分間）で熱変性を行なった後、 98°C (10秒 間）と 68°C (2分 30秒間）とからなるサイクルを 40回繰り返し、 最後に 68°C (7分 間）の伸長反応を行なった。 前記 PGRにより生成した約 2. 2kbpの DNA断片（5 ' 側 に Spe l認識配列及び Kozak配列が付加され、 3， 側に Not l認識配列が付加され ている）を、 プラスミド PGR2. 1 (インビトロジェン社製）にサブクローンすること により、 クローン pMDTS9Gys1を得た。
得られたプラスミド pMDTS9Gys1を制限酵素 Spe l及び Not lで切断して生成した 約 2. 2kbpの DNA断片を、 前記参考例 1で構築した pGEPdE2-FLAGの Xba l部位及び Not l部位に挿入することにより、 プラスミド pGEPdE2- MDTS9Gys1 - FLAGを構築し た。
配列番号 9で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（5 ' 側に Spe l認 識配列及び kozak配列が付加してある）と配列番号 1 0で表される塩基配列からな るオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーとし、 ヒト胎児腎臓
cDNA (Marathon-Ready™ cDNA；ク口ンテック社製）を錶型として、 DNAポリメラー ゼ (TaKaRa LA Tag™；宝酒造社製）を用いて PGRを行なった。 前記 PGRでは、 最初 に 94°C (2分間）で熱変性を行なった後、 98°C (10秒間）と 68°C (30秒間）とからな るサイクルを 45回繰り返し、 最後に 68°C (7分間）の伸長反応を行なった。 前記 PGRにより生成した約 0. 2kbpの DNA断片（5 ' 側に Spe l認識配列及び Kozak配列 が付加されている）を、 プラスミド PGR2. 1 (インビトロジェン社製）にサブクロ一 ンすることにより、 クローン pMDTS9 (5S2-12)を得た。 挿入断片は、 配列番号 1で 表される塩基配列からなる DNAであり、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列にお ける第 1番〜第 1 2 2 4番のアミノ酸からなる配列をコードする。
得られたプラスミド pMDTS9 (5S2 - 12)を制限酵素 Spel及び Ncolで切断して生成 した約 0. 2kbpの Spe卜 Ncol DNA断片 Aと、 先に得られたプラスミ ド pMDTS9Gys1 を制限酵素 NGO I及び Notlで切断して生成した約 1. Okbpの NGO卜 Notl DNA断片 B とを、 前記参考例 1で構築した pGEPdE2-FLAGの Xba l部位及び Motl部位に挿入す ることにより、 プラスミド pGEPdE2 - MDTS9Gys2- FLAGを構築した。 同様に、 前記 DNA断片 Aと前記 DMA断片 Bとを、 プラスミド pZEr0-2 (インビトロジェン社製）の Spel及び ot l部位に挿入することにより、 プラスミド pZErO-MDTS9Gys2を構築 した。
プラスミド pGEPdE2-WIDTS9Gys2- FLAGは、 新規プロテア一ゼ遺伝子 MDTS9の配列 番号 1で表される塩基配列における第 1番〜第 2 2 5 0番の塩基からなる遺伝子 を含有し、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列における第 1番〜第 7 5 0番のァ ミノ酸からなる配列の G末端に、 配列番号 1 1で表されるアミノ酸配列が付加し たポリペプチドを、 動物細胞を宿主として、 発現することができる。 なお、 配列 番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドは、 ADAMTSプロテアーゼで あると考えられる。 参考例 3 ： MDTS9短長タンパク質 (MDTS9Gys2)の発現
参考例 2で作製したプラスミド pGEPdE2 - MDTS9Cys2-FLAG又は対照として、 参考 例 1で作製したプラスミド pGEPdE2 - FLAGを、 市販のトランスフエクション試薬 (FuGENE™6 Transfect i on Reageent；ベーリンガー■マンハイム社製）を用いて、 添付指示書に従い、 血清培地 [DMEM (GI BGO- BRL社）、 10%牛胎児血清、 lOOju g/n ペニシリン、 100 jU g/mLストレプトマイシン、 及び 250 gZmL-G418 (ナカラィテ スク社製) ] で培養していた HEK293- EBNA (ィンビトロジェン社製）に導入した。 プラスミ ド導入後、 そのまま 48時間培養する（以下、 血清培養と称する）か、 あ るいは、 前記プラスミド導入後、 そのまま 16時間培養し、 PBSで 2回洗浄した後 に、 無血清培地 [DMEM (GIBC0- BRL社） 、 100 g/mLペニシリン、 100// g/mLスト レブトマイシン、 250 g/mL- G418 (ナカライテスク社製） ] にて 32時間培養した (以下、 無血清培養と称する）。
前記血清培養又は無血清培養で得られた各培養液を、 遠心分離器 (8800型；久 保田製作所社製)によリ遠心分離 (3000rptn, 10分間)することによリ、 培養上清を 得た。 また、 前記培養液を除去した後に残った各細胞を、 抽出液 [20國 ol/L - HEPES (pH7. 4)、 1 %トリトン X-100、 1 Wリセ口ール、 0, 1 %ゥシ血清アルブミン (BSA) ] にて 1 5分間処理した後、 ピペッティングにより細胞を培養プレートより 剥離し、 得られた細胞懸濁液を遠心分離器 (8800型；久保田製作所社製）により遠 心分離 (3000rpm， 10分間）することにより、 細胞膜結合画分 (上清）と細胞画分 ('沈 澱）とに分画した。
得られた各画分 (すなわち、 培養上清、 細胞膜結合画分、 及び細胞画分）におけ る目的タンパク質の発現は、 G末端に付加した FLAGタグに対する抗体 (マウス抗 FLAGモノクローナル抗体 M2； シグマ社製）を用いたウェスタンプロッティングで 確認した。 すなわち、 前記の各画分を、 2- IEを用いた還元条件下、 SDS/10%〜20»/0 アクリルアミ ドゲル (第一化学薬品社製）を用いて電気泳動した後、 ブロッテイン グ装置を用いてポリビニリデンジフルオリ ド (PVDF)膜に転写した。 転写後の PVDF 膜に、 ブロッキング剤（ブロックエース；大日本製薬社製）を添加してブロッキン グした後、 前記マウス抗 FLAGモノクローナル抗体 M2と、 西洋わさびパーォキシ ダーゼ標識ゥサギ抗マウス IgGポリクローナル抗体 (ザィメッド社製又はタゴ社 製）とを、 順次反応させた。 あるいは、 前記ブロッキングに続いて、 ビォチン化 M2抗体（シグマ社製）と、 西洋わさびパ一ォキシダーゼ標識ストレプトアビジン (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）とを、 順次反応させた。 反応後、 市販 のウェスタンブロッティング検出システム（ECLウェスタンプロッティング検出シ ステム；アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いて、 目的タンパク質の発 現を確認した。
プラスミド pGEPdE2 - MDTS9Gys2-FLAGを導入した細胞を無血清培養することによ リ得られた各画分において検出されたタンパク質 (すなわち、 MDTS9短長タンパク 質）の SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)における見かけ上の分子 質量は、 培養上清において約 55〜65KDaであり、 細胞膜結合画分において約 55〜 65KDaであり、 細胞画分において 80〜95KDaであった。
参考例 4 ： MDTS9短長タンパク質のプロテアーゼ活性の確認
(1 ) プラスミド pGEPdE2- MDTS9Gys2E/Q-FLAGの構築
クイックチェンジ■サイ 卜ダイレクテド■ ミュータジエネシス■キット
(QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit；ス卜ラタジーン社製）を用い、 添付の指示書に従って、 活性中心と考えられる His-Glu - Ser - Gly- His (配列番号 1 2 )の G I u (グルタミン酸）を G I n (グルタミン）に置換した遺伝子 MDTS9Cys2E/Qを含 有するプラスミド pZErO-MDTS9Gys2E/Qを作製した。 なお、 錶型としては、 参考例 2で作製したプラスミド pZErO-MDTS9Gys2を用い、 プライマーセットとしては、 配列番号 1 3で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号 1 4 で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
得られたプラスミド pZErO-MDTS9Gys2E/Qを制限酵素 Spel及び Notlで切断して 生成した約 2.3kbpの DNA断片を、 前記参考例 1で構築したプラスミド pGEPdE2- FLAGの Xba I及び Not I部位に挿入することにより、 プラスミド pGEPdE2- DTS9Cys2E/Q-FLAGを得た。
(2) 0?2—マクログロプリンとの複合体形成を指標としたプロテアーゼ活性の 確認
参考例 2で作製したプラスミド pGEPdE2-MDTS9Gys2-FLAG、 参考例 4 (1 ) で作 製したプラスミド pGEPdE2-MDTS9Gys2E/Q-FLAG又は、 対照として、 参考例 1で作 製したプラスミド pCEPdE2-FLAGでトランスフエクシヨンした各細胞の血清培養の 培養上清を、 參考例 3で示した手順と同様にして、 2-MEを用いた還元条件下、 SDS-PAGEし、 PVDF膜に転写した。 転写後の PVDF膜に、 ブロッキング剤（ブロック エース；大日本製薬社製）を添加してブロッキングした後、 ャギ抗 2—マクログ ロブリン抗体 [セダーレ一ン (GEDARLANE)社製] と、 西洋わさびパーォキシダーゼ 標識ゥサギ抗ャギ I gGポリク口ーナル抗体 [ザィメッド (Zymed Laborator i es)社 製] とを、 順次反応させた。 反応後、 市販のウェスタンブロッテイング検出シス
テム（ECLウェスタンプロッティング検出システム；アマシャムフアルマシアバイ ォテク社製）を用いて、 目的タンパク質の発現を確認した。
プラスミド pCEPdE2-MDTS9Gys2-FLAGでトランスフエクシヨンした細胞由来の血 清培養の培養上清では、 プラスミド PGEPdE2-MDTS9Gys2E/Q-FLAG又はプラスミ ド pCEPdE2-FLAGで卜ランスフエクシヨンした細胞由来の各血清培養の培養上清で検 出されない約 250KDaのバンドが検出された。 この結果は、 MDTS9短長タンパク質 (MDTS9Cys2)が 2—マクログロブリンと複合体を形成したことを示しており、 従 つて、 MDTS9短長タンパク質 (MDTS9Gys2)にプロテアーゼ活性があることが確認さ れた。 参考例 5 ： MDTS9遺伝子の組織発現分布の確認
市販の cDNAパネル [Clontech社製の Multiple Tissue cDNA (MTC™) Pane I の内, Human MTC Panel I (カタログ番号： K1420-1)、 Human MTG Panel 11 (カタログ番 号： K1421-1)、 Human Fetal MTC Panel (カタログ番号： K1425-1)、 及び Human Tumor MTG Panel (カタログ番号： K1422- 1)] を用いて、 MDTS9遺伝子の組織発現 分布を以下の手順で解析した。
すなわち、 配列番号 1 5で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配 列番号 1 6で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプ ライマーとし、 前記 cDNAパネルを錶型として、 DNAポリメラーゼ (TaKaRa LA Taq™；宝酒造社製）を用いて PGRを行なった。 前記 PGRでは、 最初に 94°C(2分間） で熱変性を行なった後、 98°C(10秒間）と 68°C(1分 30秒間）とからなるサイクル を 44回繰り返した。 続いて、 反応液のァガロースゲル電気泳動を行ない、 MDTS9 遺伝子の mRNAに由来する約 1.1kbpの DNA断片を検出した。 その結果、 MDTS9遺 伝子の mRNAは、 腎臓に発現していることが判明した。 参考例 6 ：腎不全モデルにおける MDTS9遺伝子の発現変動
( 1 ) 錶型 cDNAの調製
cDNAの調製は、 ラット 5/6腎摘モデル (木村健ニ郎， Γ腎と透析 j 1991臨時増 刊号， 431- 439)の腎臓より調製した。 5/6腎摘終了後、 1週、 2週、 3週、 4週、 6 週、 8週、 及び 10週に、 5/6腎摘ラット及び偽手術ラッ卜を各々 5匹ずつ解剖し、 腎臓を摘出し、 その後直ちに - 80°Cにて凍結保存した。 これら各群の腎臓を液体窒 素凍結下、 細胞破砕機（クライオプレス GP-100；マイクロテック 'ニチオン社製） を用いて破砕後、 総 RNA精製試薬（I S0GEN； 日本ジーン社製）を用いて総 RNAを調 製した。 抽出した総 RNAを DNァーゼ (二ツボンジーン社製）を用い、 37°Cで 90分 間反応させた。 DNァーゼ処理した総 RNA0. 25 // gをスーパースクリプト I I ファー ストストランドシステム (RT-PGR用； G I BG0- BRL社製）にて cDNAに変換した。
( 2 ) ラッ卜腎不全モデルにおける MDTS9遺伝子の発現変動
ラット腎不全モデルにおける腎臓での発現変動解析は、 参考例 6 ( 1 ) で調製 した cDNAを錶型にして、 シークェンスディテクター（Pr i sm7700 Sequence
Detector；アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行なった。 配列番号 3 0で 表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、 配列番号 3 1で表される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドとを、 プライマーセットとして用いた。 PGR は、 市販の PGR試薬 [サイバーグリーン PGRコアリエージェント（SYBR Green PGR core reagent) アプライドバイオシステムズ社製] を用い、 95°C (10分間）の初 期変性反応を実施した後、 94°C (15秒間）と 60°C (30秒間）と 72°C (60秒間）とから なるサイクル反応を 45回繰リ返すことによリ実施した。
また、 内部標準としてヒトグリセルアルデヒド 3-リン酸脱水素酵素 (G3PDH)の 遺伝子発現量を算出するため、 前記 cDNAを錶型として、 配列番号 3 2で表される 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、 配列番号 3 3で表される塩基配列から なるオリゴヌクレオチドとを、 プライマーセットとして同条件の PGR を行なった c 更に、 mRNA発現量算出に用いる標準曲線を得るために、 ラットゲノム DNA (クロン テック社製）を錶型として、 前記プライマ一セットを用いて同条件の PCRを行なつ た。 各群における一定量の総 RNA当たりのラット MDTS9遺伝子の mRNAの発現量を 比較するため、 各条件でのラット MDTS9遺伝子の mRNAの発現量は、 各条件での
G3PDH遺伝子発現量に対する割合で示した。 その結果、 ラット MDTS9遺伝子の mRNAは、 5/6腎摘モデルにおいて、 偽手術ラットに比べ、 術後 1週で約 5倍の遺 伝子が発現しており、 尿タンパク質量が顕著に増加する術後 3週、 正常腎重量と 比べ著明に腎重量が増加し始める術後 6週、 更に病態が悪化する術後 8週で、 そ れぞれ、 約 2倍の遺伝子が発現していることが判明した。
( 3 ) マウス 5/6腎摘モデルにおける MDTS9遺伝子の発現変動
マウス 5/6腎摘モデルにおいても、 参考例 6 ( 1 ) と同様に錶型 c DNAを作成 し、 参考例 6 ( 2 ) と同様にラッ卜 MDTS9カウンターパー卜の mRNAの定量を行つ た。 蛋白尿及び病理組織切片の観察から、 重症例と判断されるマウスに関して約 4倍の遺伝子発現 （発現量の増加） が認められた。 本参考例により、 腎不全モデルでは、 MDTS9の遺伝子が発現誘導されること が明らかとなった。 参考例 7 ： ヒト腎臓組織切片の免疫組織染色
( 1 ) 抗ヒ卜 MDTS9抗体の作製
まず、 実験解説書 (岡田雅人及び宮崎香編， 「改訂タンパク質実験ノート」 上， 羊土社， p. 162 - 179)に準じて、 プラスミド pGEX - 6P-1 (アマシャムフアルマシアバ ィォテク社製）を発現ベクターとして用い、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列に おける第 2 8 0番〜第 4 1 0番のアミノ酸からなるぺプチドと、 ダルタチオン S 一トランスフェラーゼ (GST)との融合タンパク質 (GST-NIDTS9A)を、 大腸菌を用いて 封入体画分に生産した。 続いて、 封入休画分について、 調製用 SDS-ポリアクリル アミ ドゲル電気泳動 (PAGE)を実施し、 ゲルから拡散法によって目的の GST- MDTS9A タンパク質を抽出した（岡田雅人及び宮崎香編， 「改訂タンパク質実験ノート」 下， 羊土社， p. 48-51)。
得られた GST-MDTS9Aタンパク質を、 ゥサギ（日本白色種）に 10~ 14日間隔で計 5回免疫した後、 抗血清を調製した。 この抗血清より、 まず I gG画分をプロ亍ィ
ン Gセファロース FFカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）でァフィ二 ティー精製し、 続いて、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 2 8 0番 〜第 4 1 0番のアミノ酸からなるペプチドと、 マンノース結合タンパク質 (MBP)と の融合タンパク質 (MBP- MDTS9A)を固定したカラム (MBP-MDTS9Aカラム）でァフィ二 ティー精製を行ない、 抗ヒ卜 MDTS9抗体とした。 プロテイン Gセファロース FF力 ラムでのァフィニティ一精製、 並びに GNBr活性化セファロース FFカラム（アマシ ャムフアルマシアバイオテク社製)への MBP- MDTS9Aの固定及び MBP-MDTS9Aカラム でのァフィ二ティ一精製は、 添付説明書に従った。 また、 MBP- NIDTS9Aの大腸菌で の生産及び精製は、 pWIAL- G2E (ニュー■イングランド 'バイオラボ社製）を発現べ クタ一として用い、 同社の 「pMAL蛋白融合及び精製システム」 の指示書に従った。
( 2 ) ヒト腎臓での MDTS9タンパク質の検出
スライドガラス上にホルマリン固定及びパラフィン包埋した組織切片に、 参考 例 7 ( 1 ) で調製した抗ヒト MDTS9抗体を反応させた後、 市販の染色キット（べク タスティン ABG-APキット， カタ口グ番号 AK-5000；ベクタ一社製）を用いて、 添 付説明書に従い、 染色した。 その際、 二次抗体としてピオチン標識抗ゥサギ抗体 (カタ口グ番号 BA- 1000；ベクタ一社製）、 発色基質としてアルカリフォスファタ ーゼ基質キッ卜 l (カタログ番号 SK-5100 ;ベクター社製）を用いた。 その結果、 健 常人及び糖尿病性腎症 (初期又は後期)患者の腎臓において、 上皮細胞、 中でも特 に糸球体上皮細胞（podocytes)での染色が認められた。
本参考例から、 MDTS9タンパク質がヒ卜腎臓で発現していることが明らかであ る。 実施例 1 ： MDTS9遺伝子 5'上流域遺伝子のクローニング
ヒトゲノム DNA (Genom i c DNA；クロンテック社）を錶型にし、 配列番号 1 8と配 列番号 1 9で示されるオリゴ DNAをプライマー、 PyroBest™ DNA po merase (宝酒 造社）を DNAポリメラーゼとして、 97°C3分の後、 96. 5°C30秒、 72°C2分のサイク ルを 5回、 続いて 96. 5°C30秒、 70°C2分のサイクルを 5回、 続いて 96. 5°C30秒,
68°C2分のサイクルを 5回、 続いて 96.5°C30秒、 63°C25秒、 72°C2分のサイクル を 25回、 続いて 72°C7分の条件で PGRを行い、 生成した約 2kbp断片を pZErO™- 2.1 (インビトロジェン社)の EcoRV認識部位にサブクローニングした。 ここで得ら れたサブクローンの塩基配列を確認した結果、 MTDS9遺伝子 5'上流域の配列であ ることが確認でき、 配列番号 1 7の 3253番目から 5023番目で示される遺 伝子であった。 このサブクローンを錶型、 配列番号 20と配列番号 21で示され るオリゴ DNA をプライマーとし、 PyroBest™ DNA polymerase (宝酒造社）を用いて、 95°C3分の後、 97°C20秒、 59°C30秒、 72°C2分のサイクルを 35回、 続いて 72°C3 分の条件で PGRを行い、 5'側に制限酵素 Sacl認識配列、 3'側に制限酵素 Hindi 11 認識配列を導入した約 1.8kbp断片を生成した。 この DNA断片を制限酵素 Sacl、 Hindi II処理し、 ルシフェラーゼアツセィシステム用ベクター（PicaGene Vector 2 ベ一シックベクター；東洋インキ社）の Sacし Hindlll部位に揷入し、 pGV - B2- MDTS9pro2kを得た。
また、 5'側に Mlul認識配列を付加した配列番号 22で示されるオリゴ DNAと配 列番号 23で示されたオリゴ DNAのセッ卜と、 配列番号 24と 25で示されるォ リゴ DNAのセットをプライマー、 ヒ卜ゲノム DNA (Genomic DNA；クロンテック社） を鎳型とし、 PyroBest™ DNA polymerase (宝酒造社）を用い、 96°C2分の後、
97°C20秒、 60°C30秒、 72°C1分のサイクルを 40回、 続いて 72°C7分の条件で PGR を行なった。 こうして生成した約 600bp、 1kbpの断片を pGR4Blunt - T0P0 (インビ トロジ; Eン社）にサブクロ一ニングし、 サブクローン pGR4B I unt-T0P05k-1、 pCR4Blunt-T0P05k-3を得た。 また、 配列番号 26と 27で示されるオリゴ DNAの セッ卜、 配列番号 28と 29で示されるオリゴ DNAのセッ卜をプライマーとし、 ヒトゲノム DNA (Genomic DNA；クロンテック社）を錶型、 PyroBest™ DNA
polymerase (宝酒造社）を用い、 96°C2分の後、 97°C20秒、 60°C30秒、 72°C2分の サイクルを 40回、 続いて 72°C7分の条件で PGRを行なった。 こうして生成した約 1.6kb、 1.9kbの断片を pGR4B I unt-T0P0 (インビ卜ロジヱン社）にサブクローニング し、 サブクローン pGR4Blunt- T0P05k-2、 pGR4Blunt-T0P05k-4を得た。 pCR4Blunt- T0P05k - 3を Kpnl、 Smal処理して生成した約 0.5kbpの断片と pCR4Blunt-T0P05k-4
を Smaし EGORI処理して生成した約 1.5kbpの断片を連結し、 pCR4Blunt - TOP0 (ィ ンビトロジェン社）の Kpnl、 EcoRI部位に揷入して pCR4B I unt-T0P05k-5を得た。 pGR4Blunt-T0P05k-1を し Sphl処理して得られる約 0.4kbpの断片、
pCR4Blunt-T0P05k-2を Sphし Kpnl処理して得られる約 1.5kbpの断片、
pCR4Blunt-T0P05k-5 を Kpnl、 EcoRI 処理して得られる約 2.1kbpの断片を連結し, PGV-B2 - MDTS9pro2kの Mluし EcoRI部位に挿入し、 pGV - B2 - MDTS9pro5kを得た。 こ こで得られたサブクローンの塩基配列を確認した結果、 配列番号 1 7で示される 遺伝子であった。 実施例 2 ： MDTS9プロモーター領域 DNA配列の解析
実施例 1で得られたプラスミド pGV-B2-MDTS9pro2k又は pGV-B2- MDTS9pro5kを 参考例 3に示す方法で HEK293-EBNA細胞に導入し、 そのまま、 DMEM (G I BG0- BRL 社）、 10%牛胎児血清、 100 ig/mlペニシリン、 100 g/mlストレプトマイシン、 250 g/ml G418(ナカライテスク社製）で、 48時間培養を継続した後、 PicaGene発 色キット（東洋インキ社）を用い、 ルシフヱラーゼ活性を測定した。 この際、 測定 値は同時導入した - gal発現プラスミド（pGH110；アマシャムフアルマシアバイ ォテック社）より発現した ^- galの活性値で補正した。 j8 - gal活性の測定は
Galacto-Light Plusキット（TR0PIX社）を用いた。 その結果、 pGV-B2-MDTS9pro2k では約 27倍の、 及び PGV-B2- MDTS9pro5kでは約 27〜40倍の、 もとのプラスミド である pGV-B2では認められないルシフェラーゼ活性の明らかな上昇が観察された c このことは上記 DNA断片中にプロモータ一活性が存在することを示している。 実施例 3 MDTS9プロモーター領域 DNA配列の TGF-yS、 I L - 1応答性
実施例 1で得られたプラスミド pGV- B2- MDTS9pro5kを参考例 3に示す方法で
HEK293 - EBNA細胞に導入し、 そのまま 16時間培養した後、 PBSで 2回洗浄し、
DMEM(GIBGO- BRL社）、 100 g/mlペニシリン、 100«g/mlストレプトマイシン、 250/ g/ml G418(ナカライテスク社）に置換し、 6時間培養した（以下、 無血清培 養)。 続いて、 TGF- yS (シグマ社製)又は IL- 1(シグマ社製）を添加し、 24時間培養
後のルシフェラーゼ活性を測定した。 測定値は、 実施例 2同様、 yS-galの活性値 で補正した。 その結果、 TGF- (1ng/ml)添加により約 1.7倍のルシフェラ一ゼ活 性上昇が、 IL-1 (Ing/ml)添加によリ約 0.7倍以下までルシフェラーゼ活性の減弱 が観察された（図 1、 図 2)。 このことは上記 DNA断片中に TGF-jS応答領域、 IL - 1 応答領域が存在することを示している。 一方、 pGV-B2 - MDTS9pro2kを導入した細 胞について、 同様に、 TGF- ;8 を添加してルシフェラーゼ活性を測定したところ、 ルシフエラーゼ活性はコントロールと同等であった。 産業上の利用可能性
本発明のプロモーターは、 腎不全モデル動物において遺伝子発現量が増加して おり、 TGF-S により誘導され、 IL- 1により阻害され、 細胞外マトリクスの代謝に 関与する、 ヒ卜の腎臓に発現しているプロテアーゼ TS9のプロモーターである ので、 本発明のプロモーターの活性を阻害する物質は、 TGF- j8 の生理作用のうち. 細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に関わる部分だけを抑制又は阻害 し、 長期投与が想定される慢性腎不全治療及び 又は予防剤として有用である。 したがって、 本発明のプロモーターであるポリヌクレオチド、 発現べクタ一、 細 胞は、 慢性腎不全治療及びノ又は予防剤のスクリーニングツールとして有用であ リ、 本発明のプロモーターであるポリヌクレオチド、 発現ベクター、 細胞を用い 慢性腎不全治療及び Z又は予防剤のスクリーニングが可能である。 また、 慢性腎 不全治療及び 又は予防用医薬組成物の品質規格の確認試験における本発明のプ 口テアーゼの活性を阻害するか否かを分析する工程、 及び製剤化工程を含む、 慢 性腎不全治療及び 又は予防用医薬組成物の製造も可能とした。 配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し <223>には、 「Ar" ficial Sequencej の説明を 記載する。 具体的には、 配列表の配列番号 3及び 4の配列で表される各塩基配列 は、 人工的に合成したリンカ一配列である。 また、 配列表の配列番号 5〜9、 1 3及び 1 4、 及び 20〜 22の配列で表される各塩基配列は、 人工的に合成した
プライマー配列である。 更に、 配列表の配列番号 1 1の配列で表されるアミノ酸 配列は、 制限酵素 Not l認識ヌクレオチド配列及び FLAGタグアミノ酸配列をコー ドするヌクレオチド配列を含む DNAの発現により得られるァミノ酸配列である。 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は本 発明の範囲に含まれる。
Claims
1 . 配列番号 1 7の 3 2 5 3番目から 5 0 2 3番目で表される塩基配列、 あるい は、 配列番号 1 7の 3 2 5 3番目から 5 0 2 3番目で表される塩基配列の中にお いて、 1〜 1 0個の塩基が置換、 欠失、 及び 又は挿入されている塩基配列を含 み、 配列番号 2記載のポリべプチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチ ド、。
2. 配列番号 1 7で表される塩基配列、 あるいは、 配列番号 1 7記載の塩基配列 の中において、 1〜 1 0個の塩基が置換、 欠失、 及びノ又は挿入されている塩基 配列を含む、 請求項 1記載のポリヌクレオチド。
3. 配列番号 1 7の 3 2 5 3番目から 5 0 2 3番目で表される塩基配列、 又は、 配列番号 1 7で表される塩基配列を含む、 請求項 1記載のポリヌクレオチド。
4. 請求項 1乃至請求項 3記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
5. 請求項 4記載の発現ベクターでトランスフヱクシヨンされた細胞。
6. 請求項 1記載のポリヌクレオチド、 又は、 請求項 5記載の細胞からなる慢性 腎不全治療及び Z又は予防用物質スクリ一ニングツール。
7 . 請求項 1記載のポリヌクレオチド、 又は、 請求項 5記載の細胞の慢性腎不全 治療及び 又は予防用物質スクリーニングのための使用。
8. ( 1 ) 請求項 5記載の細胞と、 試験化合物とを接触させる工程、 及び （2 ) プロモータ一活性を検出する工程を含む、 試験化合物が請求項 1乃至請求項 3記 載のポリヌクレオチドのプロモーター活性を阻害するか否かを分析する方法。
9. 請求項 8記載の 法による分析工程、 及びプロモーター活性を阻害する物質 を選択する工程を含む、 配列番号 2記載のポリべプチドの発現を抑制する物質を スクリーニングする方法。
1 0. 請求項 9記載の方法により、 慢性腎不全治療及び 又は予防用物質をスク リーニングする方法。
1 1 . 請求項 8記載の方法による分析工程、 及び製剤化工程を含む、 慢性腎不全 治療及び Z又は予防用医薬組成物の製造方法。
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