JP2010540534A

JP2010540534A - 生体治療分子の発現のための治療遺伝子スイッチ構築物およびバイオリアクター、ならびにその使用

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Publication number: JP2010540534A
Application number: JP2010526971A
Authority: JP
Inventors: ベサニーリンメレニック; ロバートピー．ビーチ; トーマスディー．リード; アナピー．ツレティアコヴァ; リチャードイー．ピーターソン
Original assignee: イントレキソンコーポレーション
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2008-09-29
Publication date: 2010-12-24
Also published as: EP2205249A2; AU2008307643B9; NZ584848A; RU2010116781A; IL204731A0; CN101868241A; KR20100087303A; US20090136465A1; US20160114059A1; CA2715080A1; RU2499599C2; WO2009045370A3; AU2008307643A1; US20180126007A1; US20190343967A1; JP2015038102A; EP2205249B1; WO2009045370A2; US10314926B2; ZA201002848B

Abstract

本発明は、1つまたは複数の治療産物の発現を制御する治療遺伝子スイッチ構築物を対象の細胞に導入することによって、対象における疾患または障害を処置、改善、または予防するための方法および組成物に関する。

Description

発明の分野
本発明は、1つまたは複数の治療産物の発現を制御する治療遺伝子スイッチ構築物を対象に導入することによって、対象における疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防するための方法および組成物に関する。さらなる態様において、本発明は、治療タンパク質を分泌する1つまたは複数の細胞で構成される治療インプラントである「バイオリアクター」を対象に導入することによって、対象における疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防するための方法および組成物に関する。バイオリアクターは、カプセル封入によって免疫学的に孤立させてもよく、または免疫学的に孤立していなくてもよい。特定の態様において、バイオリアクターは、治療遺伝子スイッチ構築物を含む。

発明の背景
治療分子、たとえば治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを対象の細胞に導入することを通して、または治療分子を分泌するように操作された改変細胞を対象に導入することを通して、対象における疾患を処置または予防するという概念は何年も前から存在する。この概念の実際の局面において困難がいくつかあるために、治療の成功に向けての進歩が妨害されている。処置される対象に遺伝子材料を直接導入することは、送達の安全性、十分な期間にわたり治療産物の十分な発現レベルを得ること、治療産物の発現を所望の細胞に限定すること、および、もはや必要ではない場合に治療産物の発現を停止できることを含む、治療産物の発現をモジュレートまたはパルスできる能力を維持すること、などの問題点を示す。細胞に基づく治療は対象の免疫応答による拒絶を受け、したがって、埋め込まれた細胞の寿命を増加させて、異種細胞、すなわち異なる種からの細胞を用いることができるようにするために、細胞カプセル封入法などの免疫学的孤立戦略が開発されている。現在のカプセル封入細胞治療および非カプセル封入細胞治療は、治療タンパク質を構成的に分泌するように操作されている。一度埋め込まれると、タンパク質分泌を調節することができない。直接または細胞媒介性のバイオリアクター治療タンパク質送達の安全性および臨床応用を改善するために、タンパク質産生を停止できれば、またはタンパク質産生が起こる速度を調節できれば有利であろう。

このように、これらの所望の特徴を提供する新規治療法および組成物が当技術分野において必要である。

本発明は、対象における疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防するための方法および組成物に関する。

1つの態様において、本発明は、以下を含む、対象における疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防するための方法を提供する：
（a）（1）構成的に活性である治療スイッチプロモーターとの機能的結合を通してリガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードする、第一のポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子によって活性化される因子調節プロモーターに機能的に結合した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドを、対象に導入する段階であって、該第一および第二のポリヌクレオチドがリガンドの存在下でそれらが発現されるように導入される、段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために対象にリガンドを投与する段階。

本発明のさらなる態様は、以下を含む、対象における治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現させるための方法を提供する：
（a）（1）処置される疾患、障害、または状態に関連する条件下で活性化される治療スイッチプロモーターとの機能的結合を通してリガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードする、第一のポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子によって活性化される因子調節プロモーターに機能的に結合した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドを、対象に導入する段階であって、該第一および第二のポリヌクレオチドが、疾患、障害、または状態に関連する条件下で対象においてそれらが発現されるように導入される、段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために対象にリガンドを投与する段階。

本発明のさらなる態様は、以下を含む、対象における治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現させるための方法を提供する：
（a）（1）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドによって処置可能な疾患、障害、または状態に関連する条件下で活性化される治療スイッチプロモーターとの機能的結合を通してリガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードする、第一のポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子によって活性化される因子調節プロモーターに機能的に結合した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドを、対象に導入する段階であって、該第二のポリヌクレオチドが、疾患、障害、または状態に関連する条件下で第一のポリヌクレオチドが発現されるように導入される、段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために対象にリガンドを投与する段階。

先に記載した方法において、1つの態様において、治療遺伝子スイッチをコードする第一のポリヌクレオチド、および因子調節プロモーターに連結された治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドは、より大きな1つのポリヌクレオチド、たとえばベクターの一部である。もう1つの態様において、治療遺伝子スイッチをコードする第一のポリヌクレオチドおよび因子調節プロモーターに連結された治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドは、個別のポリヌクレオチドであり、これらは核酸組成物として投与されてもよい。

本発明はさらに、開示された方法において有用である治療遺伝子スイッチ構築物に関する。

本発明は加えて、本発明の治療遺伝子スイッチ構築物を含むベクターに関する。

本発明はさらに、以下の段階を含む、1つまたは複数の改変細胞において治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現させるための方法を提供する：
（a）（1）疾患、障害、または状態に関連する条件下で活性化される治療スイッチプロモーターとの機能的結合を通してリガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードする、第一のポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子によって活性化される因子調節プロモーターとの機能的結合を通して治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドを細胞に導入して、それによって改変細胞を産生する段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために改変細胞にリガンドを投与する段階。

本発明はさらに、本発明の治療遺伝子スイッチ構築物を含む改変細胞に関する。

本発明はまた、対象の免疫系から細胞を遮蔽するようにカプセル封入されていないまたはカプセル封入された本発明の改変細胞を含むバイオリアクターデバイスにも関する。そのようなバイオリアクターは、たとえば、コーティングされた細胞、マイクロカプセル封入細胞、またはマクロカプセル封入細胞の形であってもよい。

本発明はまた、たとえば遺伝子スイッチ構築物、ベクター、リガンド等を含む、本発明の方法を実行するためのキットにも関する。

リガンド依存的転写因子複合体の個別の2つの部分をコードする2つの転写因子配列が、1つのプロモーターの制御下に存在する、本発明の治療遺伝子スイッチの態様を示す。「AD」は、トランス活性化ドメインを表す；「HP」は、ヘテロ二量体化パートナードメインを表す。ADおよびHPドメインは、「共活性化タンパク質」または「CAP」と呼ばれる融合タンパク質として発現する。「DBD」はDNA結合ドメインを表し：「LBD」はリガンド結合ドメインを表す。DBDおよびLBDは、「リガンド依存的転写因子」または「LTF」と呼ばれる融合タンパク質として発現する。「転写リンカー」は、IRES（リボソーム内部進入部位）を表すか、または1つのオープンリーディングフレームからの2つの個別のタンパク質産物を生成する意味である。「治療産物配列」は、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを表し；「治療産物」は、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを表し；および「TSP-1」は、構成的治療スイッチプロモーターまたは疾患、障害、もしくは状態に関連する条件下で活性化される治療スイッチプロモーターのいずれかを表す。CAPおよびLTFは共にリガンド依存的転写因子複合体（LDTFC）を形成して、これはリガンドと共に調節プロモーター（FRP）を活性化する。リガンド依存的転写因子複合体の個別の2つの部分をコードする2つの転写因子配列（CAPおよびLTF）が、異なるプロモーターの制御下に存在する、本発明の治療遺伝子スイッチの態様を示す。AD、HP、CAP、DBD、LBD、LTF、「治療産物配列」、「治療産物」、TSP、LDTFC、およびFRPという用語は、図1の説明文において定義されている。「TSP-1」および「TSP-2」は、その各々が独立して構成的プロモーターであるか、または疾患、障害、もしくは状態に関連する条件下で活性化されるプロモーターのいずれかである、異なる2つの治療スイッチプロモーターを表す。1つの態様において、TSP-1は、構成的プロモーターであり、TSP-2は疾患、障害、または状態に関連する条件下で活性化されるプロモーターである。CAPおよびLTFは共にLDTFCを形成して、これはリガンドと共にFRPを活性化する。 3つの転写因子配列（CAP、LTF-1、およびLTF-2）が、異なるプロモーターの制御下で、共に2つの個別のLDTFCを形成してもよい、本発明の治療遺伝子スイッチの態様を示す。AD、HP、CAP、DBD、LBD、LTF、「治療産物配列」、「治療産物」、TSP、LDTFC、およびFRPという用語は、図1の説明文において定義されている。DBD-Aは、LBDと融合してLTF-1を形成する第一のDNA結合ドメインを表し、DBD-Bは、LBDと融合してLTF-2を形成する第二のDNA結合ドメインを表す。「治療産物A」は、第一の治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを表し；「治療産物B」は、第二の治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを表し；ならびにTSP-1、TSP-2、およびTSP-3は、その各々が独立して構成的プロモーターであるか、または疾患、障害、もしくは状態に関連する条件下で活性化されるプロモーターのいずれかである、異なる3つの治療スイッチプロモーターを表す。1つの態様において、TSP-1は、構成的治療スイッチプロモーターであり、TSP-2およびTSP-3は、その各々が疾患、障害、または状態に関連する条件下で独立して活性化される異なる治療スイッチプロモーターである。CAPおよびLTF-1は共にLDTFC-1を形成し、これはリガンドと共にFRP-1を活性化する。CAPおよびLTF-2は共にLDTFC-2を形成し、これはリガンドと共にFRP-2を活性化する。リガンド依存的転写因子複合体のCAPと2つの個別のLTF部分をコードする3つの転写因子配列が、異なるプロモーターの制御下に存在する、本発明の治療遺伝子スイッチの態様を示す。AD、HP、CAP、DBD、LBD、LTF、「治療産物配列」、「治療産物」、TSP、LDTFC、およびFRPという用語は、図1の説明文において定義されている。TSP-1、TSP-2、およびTSP-3は、その各々が独立して、構成的プロモーターであるか、または疾患、障害、もしくは状態に関連する条件下で活性化されるプロモーターのいずれかである、異なる3つの治療スイッチプロモーターを表す。1つの態様において、TSP-1は構成的プロモーターであり、TSP-2およびTSP-3はその各々が疾患、障害、または状態に関連する条件下で独立して活性化される異なるプロモーターである。LTF-1またはLTF-2のいずれかがCAPと共にLDTFC-1またはLDTFC-2を形成してもよい。LDTFC-1またはLDTFC-2のいずれかがリガンドと共にFRPを活性化する。図1で示されたスキームの下で構築され、心虚血などの低酸素条件下でインスリン増殖因子-1（IGF-1）を発現するように操作されたベクターの図である。図2で示されたスキームの下で構築され、心虚血などの低酸素条件下で塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を発現するように操作されたベクターの図である。図2で示されたスキームの下で構築され、心虚血などの低酸素条件下でエリスロポエチン（EPO）を発現するように操作されたベクターの図である。図2で示されたスキームの下で構築され、心虚血などの低酸素条件下でヒトB-型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）を発現するように操作されたベクターの図である。図2で示されたスキームの下で構築され、心虚血などの炎症条件下で組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）を発現するように操作されたベクターの図である。図3で示されたスキームの下で構築され、いずれも心虚血に関連する条件である、炎症条件下でリラキシンを、および／または低酸素条件下で肝細胞増殖因子を発現するように操作されたベクターの図である。図2で示されたスキームの下で構築され、その発現が心筋細胞に限定される、心虚血などの低酸素条件下でEPOを発現するように操作されたベクターの図である。図4で示されたスキームの下で構築され、その発現が心筋細胞に限定される、心虚血などの炎症条件または低酸素条件下のいずれかでIGF-1を発現するように操作されたベクターの図である。図1で示されたスキームの下で構築され、リウマチ性関節炎などの炎症条件下で腫瘍壊死因子結合タンパク質2（Enbrel（登録商標））を発現するように操作されたベクターの図である。図4で示されたスキームの下で構築され、いずれもリウマチ性関節炎に関連する条件である、TNFα発現に応答してまたは炎症条件下のいずれかで、腫瘍壊死因子結合タンパク質2（Enbrel（登録商標））を発現するように操作されたベクターの図である。図3で示されたスキームの下で構築され、いずれもリウマチ性関節炎に関連する条件である、炎症条件下で腫瘍壊死因子結合タンパク質2（Enbrel（登録商標））を、および／またはHIF駆動低酸素条件下でEPOを発現するように操作されたベクターの図である。図1で示されたスキームの下で構築され、ヒト第VIII因子：Cを構成的に発現するように操作されたベクターの図である。図2で示されたスキームの下で構築され、血友病に関連する低酸素条件下でヒト第VIII因子：Cを発現するように操作されたベクターの図である。

発明の詳細な説明
本発明は、細胞において治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現させるために遺伝子スイッチを用いるための方法および組成物に関する。本方法および組成物は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで用いられてもよい。本発明はさらに、対象における疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防するために、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を制御する遺伝子スイッチを用いるための方法および組成物に関する。本発明の方法は、エクスビボ（対象の単離細胞または非自己細胞に遺伝子スイッチを導入することによって、および対象または異なる対象に改変細胞を導入することによって）、またはインビボ（対象の細胞に遺伝子スイッチを直接導入することによって）のいずれかで実行されうる。本発明の方法は、リガンド依存的転写因子の発現が1つまたは複数の治療スイッチプロモーターの制御下にある遺伝子スイッチを用いることを伴う。本方法にはまた、処置される対象への非カプセル封入細胞およびカプセル封入細胞治療の直接導入における遺伝子スイッチ技術の適用が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本明細書において記載される方法および組成物は、治療産物の発現レベルおよび時期が、遺伝子スイッチを含む細胞に対するリガンドの投与によって制御される、非常に特異的で、厳密に調節された治療技術を提供する。

以下の定義が提供され、それらは本発明の範囲および実践の理解において有用となるはずである。

本発明の目的に関して「単離された」という用語は、その当初の環境（それが天然に存在する環境）から除去されている生物材料（細胞、核酸、またはタンパク質）を明示する。たとえば、植物または動物において天然の状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、天然に存在する近接する核酸から分離された同じポリヌクレオチドは、「単離された」と見なされる。

生物材料に適用される場合の「精製された」という用語は、他の化合物の存在を除いて、絶対的な純度を示す形で材料が存在する必要はない。これはむしろ相対的な定義である。

「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は、互換的に用いられ、一本鎖型または二本鎖らせんのいずれかでの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン；「RNA分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「DNA分子」）のリン酸エステルポリマー型、またはホスホロチオエートおよびチオエステルなどのその任意のホスホエステル類似体を指す。二本鎖DNA-DNA、DNA-RNA、およびRNA-RNAらせんが可能である。核酸分子、特にDNAまたはRNA分子という用語は、分子の一次構造および二次構造のみを指し、任意の特定の三次型にそれを限定しない。このように、この用語には、中でも直線状または環状DNA分子（たとえば、制限断片）、プラスミド、スーパーコイルDNAおよび染色体において見いだされる二本鎖DNAが含まれる。特定の二本鎖DNA分子の構造を考察する場合、配列は本明細書において、DNAの転写されない鎖（すなわち、mRNAと相同な配列を有する鎖）に沿って5'から3'方向の配列のみを与える通常の慣例に従って記載される。「組み換え型DNA分子」は、分子生物学操作を受けているDNA分子である。DNAには、cDNA、ゲノムDNA、プラスミドDNA、合成DNA、および半合成DNAが含まれるがこれらに限定されるわけではない。本発明の「核酸組成物」は、本明細書において記載される1つまたは複数の核酸を含む。

ポリヌクレオチド配列に適用される場合の「断片」という用語は、参照核酸に対して低減された長さで、共通の部分にわたって、参照核酸と同一のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を指す。本発明に従うそのような核酸断片は、適当であれば、それが構成成分であるより大きなポリヌクレオチドに含まれてもよい。そのような断片は、長さの範囲が、本発明に従う核酸の少なくとも6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000個、またはそれより多い連続ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む、またはそれらからなる。

本明細書において用いられるように、「単離核酸断片」は、任意で合成、非天然、または変更されたヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖であるRNAまたはDNAのポリマーを指す。DNAのポリマーの形での単離された核酸断片は、cDNA、ゲノムDNA、または合成DNAの1つまたは複数のセグメントを含んでもよい。

「遺伝子」は、転写のみ（たとえば、生物活性RNA種）または転写および翻訳（たとえば、ポリペプチド）によって産生された機能的分子が含まれる機能的分子をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。「遺伝子」という用語は、cDNAおよびゲノムDNA核酸を包含する。「遺伝子」はまた、コード配列の前（5'非コード配列）および後（3'非コード配列）の調節配列が含まれる、特異的RNA、タンパク質、またはポリペプチドを発現する核酸断片を指す。「天然の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然で見いだされる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然では共に見いだされない調節および／またはコード配列を含む、天然の遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが天然に見いだされるものとは異なる様式で整列している調節配列およびコード配列を含んでもよい。キメラ遺伝子は、異なる起源に由来するコード配列および／または異なる起源に由来する調節配列を含んでもよい。「内因性の遺伝子」は、生物のゲノムにおいてその天然の位置に存在する天然の遺伝子を指す。「外来」遺伝子または「異種」遺伝子は、宿主生物において通常見いだされないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然の生物に挿入された天然の遺伝子またはキメラ遺伝子を含みうる。「トランスジーン」は、形質転換技法によってゲノムに導入されている遺伝子である。

「異種DNA」は、細胞においてまたは細胞の染色体部位に本来位置しないDNAを指す。異種DNAには、細胞に対して外来である遺伝子が含まれてもよい。

「ゲノム」という用語には、染色体のみならずミトコンドリア、葉緑体、およびウイルスのDNAまたはRNAが含まれる。

核酸分子は、核酸分子の一本鎖型が温度および溶液イオン強度に関する適当な条件下で他の核酸分子にアニールすることができる場合に、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAなどのもう1つの核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)において、特にその中の第11章および表11.1において例示されている（参照により本明細書に完全に組み入れられる）。温度およびイオン強度に関する条件により、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決定される。

ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物由来の相同な配列などの中等度に類似の断片、近縁の生物由来の機能的酵素を複製する遺伝子などの高度に類似の断片に関してスクリーニングするために調整することができる。相同な核酸に関する予備スクリーニングに関して、55℃のT_mに対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、たとえば5×SSC、0.1％SDS、0.25％乳汁、およびホルムアミドなし；または30％ホルムアミド、5×SSC、0.5％SDSを用いることができる。中等度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いT_mに対応し、たとえば40％ホルムアミドで5×または6×SSCである。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最も高いT_mに対応し、たとえば50％ホルムアミド、5×または6×SSCである。

ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存するものの、塩基間のミスマッチが可能である。「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を説明するために用いられる。たとえば、DNAに関して、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。したがって、本発明にはまた、本明細書において開示または用いられる完全な配列のみならず、実質的に類似の核酸配列と相補的である単離された核酸断片が含まれる。

本発明の1つの態様において、ポリヌクレオチドは、T_m 55℃でのハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を使用する段階、および先に記載した条件を利用する段階によって検出される。別の態様において、T_mは60℃、63℃、または65℃である。

ハイブリダイゼーション後の洗浄もまたストリンジェンシー条件を決定する。ある1組の条件は、6×SSC、0.5％SDS、室温で15分から始まり、次に2×SSC、0.5％SDS、45℃で30分を繰り返し、次に、0.2×SSC、0.5％SDS、50℃で30分間を2回繰り返す一連の洗浄を用いる。好ましい組のストリンジェントな条件はより高い温度を用いるが、0.2×SSC、0.5％SDSでの最後の2回の30分間の洗浄の温度を60℃に増加させたことを除き、洗浄は上記と同一である。もう1つの好ましい組の高ストリンジェント条件は、65℃で0.1×SSC、0.1％SDSにおける2回の最後の洗浄を用いる。

核酸をハイブリダイズするための適当なストリンジェンシーは、当技術分野において周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きければ、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに関するT_mの値はより大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いT_mに対応する）は、以下の順に減少する：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。長さが100ヌクレオチドより大きいハイブリッドに関して、T_mを計算するための等式が誘導されている（Sambrook et al.、前記、9.50-0.51を参照されたい）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置はより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Sambrook et al.、前記11.7-11.8を参照されたい）。

本発明の1つの態様において、ポリヌクレオチドは、500 mM未満の塩における少なくとも37℃でのハイブリダイゼーション段階、および少なくとも63℃の温度での2×SSPEにおける洗浄段階を含む。もう1つの態様において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション段階に関して200 mM未満の塩および少なくとも37℃を含む。さらなる態様において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄段階の双方に関して2×SSPEおよび63℃を含む。

もう1つの態様において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約10ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは少なくとも約15ヌクレオチド、たとえば少なくとも約20ヌクレオチド、たとえば少なくとも30ヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液の塩濃度が、プローブの長さなどの要因に従って必要に応じて調整されてもよいことを認識するであろう。

「プローブ」という用語は、相補的一本鎖標的核酸と塩基対を形成して、二本鎖分子を形成することができる一本鎖核酸分子を指す。

本明細書において用いられるように、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ゲノムDNA分子、cDNA分子、プラスミドDNA、またはmRNA分子とハイブリダイズ可能である短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、たとえば³²P-ヌクレオチドによって、またはビオチンなどの標識が共有的に共役されているヌクレオチドによって標識されうる。標識オリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして用いることができる。オリゴヌクレオチド（その1つまたは複数を標識してもよい）を、核酸の完全長もしくは断片をクローニングするため、DNAシークエンシングのため、または核酸の存在を検出するための、PCRプライマーとして用いることができる。オリゴヌクレオチドはまた、DNA分子と三本らせんを形成するためにも用いられうる。一般的に、オリゴヌクレオチドは、合成によって、好ましくは核酸シンセサイザーにおいて調製される。したがって、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合等などの非天然のホスホエステル類似体結合によって調製されうる。

「プライマー」は、適した条件下でDNA合成のための開始点として役立ちうる二本鎖核酸領域を作製するために標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す。そのようなプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応またはDNA分子シークエンシングのために用いられてもよい。

「ポリメラーゼ連鎖反応」はPCRと省略されて、特異的核酸配列を酵素的に増幅するためのインビトロ方法を指す。PCRは、各サイクルが3つの段階：標的分子の鎖を分離するための鋳型核酸の変性、一本鎖PCRオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型核酸へのアニーリング、およびアニールしたプライマーのDNAポリメラーゼによる伸長を含む、一連の温度サイクルの反復を伴う。PCRは、標的分子の存在を検出するための手段、および定量的または半定量的条件下で核酸の開始プール内での標的分子の相対量を決定するための手段を提供する。

「逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応」はRT-PCRと省略されるが、先に記載された1つまたは複数の標的cDNA分子内での1つまたは複数の特異的核酸配列の酵素的増幅が後に続く、1つまたは複数のRNA分子から1つまたは複数の標的cDNA分子を酵素的に産生するためのインビトロ方法を指す。RT-PCRはまた、標的分子の存在を検出するための手段、および定量的もしくは半定量的条件で核酸の開始プール内で標的分子の相対量を決定するための手段を提供する。

DNA「コード配列」は、ポリペプチドをコードして、適した調節配列の制御下に置かれた場合にインビトロまたはインビボで細胞においてポリペプチドに転写および翻訳されうる二本鎖DNA配列を指す。「適した調節配列」は、コード配列の上流（5'非コード配列）、コード配列内、または下流（3'非コード配列）に位置して、関連するコード配列の転写、RNAプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチドを指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造が含まれてもよい。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端での開始コドンおよび3'（カルボキシル）末端での翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には原核生物配列、mRNAからのcDNA、ゲノムDNA配列、および合成DNA配列でさえも含まれうるが、これらに限定されない。コード配列が真核細胞における発現に関して意図される場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終止シグナルは通常、コード配列の3'に位置するであろう。

「オープンリーディングフレーム」は、ORFと省略されて、ATGもしくはAUGなどの翻訳開始シグナルまたは開始コドンと終止コドンとを含み、おそらくポリペプチド配列に翻訳されうる、DNA、cDNA、またはRNAのいずれかである一定の長さの核酸配列を指す。

「頭-頭」という用語は、本明細書において、2つのポリヌクレオチド配列の互いに対する方向を記載するために用いられる。2つのポリヌクレオチド配列は、1つのポリヌクレオチドのコード鎖の5'端が、他のポリヌクレオチドのコード鎖の5'端に接している場合に、頭-頭方向に配置され、それによって各ポリヌクレオチドの転写方向は、他のポリヌクレオチドの5'端から離れるように進行する。「頭-頭」という用語は、(5')-(5')と省略されてもよく、同様に記号（←→）または（3'←5' 5'→3'）によって示されてもよい。

「尾-尾」という用語は、本明細書において、2つのポリヌクレオチド配列の互いに対する方向を記載するために用いられる。2つのポリヌクレオチドは、1つのポリヌクレオチドのコード鎖の3'端が、他のポリヌクレオチドのコード鎖の3'端に接している場合に、尾-尾方向に配置され、それによって各ポリヌクレオチドの転写方向は、他のポリヌクレオチドに向かって進行する。「尾-尾」という用語は、(3')-(3')と省略されてもよく、同様に記号（→←）または（5'→3' 3'←5'）によって示されてもよい。

「頭-尾」という用語は、本明細書において2つのポリヌクレオチド配列の互いに対する方向を記載するために用いられる。2つのポリヌクレオチドは、1つのポリヌクレオチドのコード鎖の5'端が、他のポリヌクレオチドのコード鎖の3'端に接している場合に、頭-尾方向に配置され、それによって各ポリヌクレオチドの転写方向は、他のポリヌクレオチドの方向と同じ方向に進行する。「頭-尾」という用語は、(5')-(3')と省略されてもよく、同様に記号（→→）または（5'→3' 5'→3'）によって示されてもよい。

「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して3'に位置するヌクレオチド配列を指す。特に、下流のヌクレオチド配列は一般的に、転写の開始点の後に続く配列に関する。たとえば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。

「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して5'に位置するヌクレオチド配列を指す。特に上流のヌクレオチド配列は一般的に、コード配列または転写開始点の5'側に位置する配列を指す。たとえば、ほとんどのプロモーターは、転写開始部位の上流に位置する。

「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、互換的に用いられ、二本鎖DNA内の特異的ヌクレオチド配列内で結合して切断する酵素を指す。

「相同組み換え」は、外来DNA配列のもう1つのDNA分子への挿入、たとえば染色体へのベクターの挿入を指す。好ましくは、ベクターは、相同組み換えのための特異的染色体部位を標的とする。特異的相同組み換えの場合、ベクターは、ベクターを染色体に相補的に結合させて組み入れさせるために、染色体の配列に対して十分に長い相同性領域を含有するであろう。より長い相同性領域、およびより大きな程度の配列類似性は、相同組み換えの効率を増加させる可能性がある。

当技術分野において公知のいくつかの方法を用いて、本発明に従うポリヌクレオチドを増やしてもよい。適した宿主システムおよび生育条件が確立されると、組み換え型発現ベクターを大量に増やすおよび調製することができる。本明細書において記載されるように、用いることができる発現ベクターには、いくつか例を挙げれば、以下のベクターまたはその誘導体が含まれるがこれらに限定されるわけではない：ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスなどのヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（たとえば、λ）、ならびにプラスミドおよびコスミドDNAベクター。

「ベクター」は、宿主細胞に核酸をクローニングおよび／または移入するための任意の媒体を指す。ベクターは、付着したセグメントの複製を生じるために、それに対してもう1つのDNAセグメントが付着してもよいレプリコンであってもよい。「レプリコン」は、インビボでDNA複製の自立単位として機能する、すなわちそれ自体の制御下で複製することができる任意の遺伝エレメント（たとえば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。「ベクター」という用語には、核酸をインビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞に導入するためのウイルスおよび非ウイルス媒体の双方が含まれる。当技術分野において公知の多数のベクターを用いて核酸を操作してもよく、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に組み入れてもよい。可能性があるベクターには、たとえば、λ誘導体などのバクテリオファージ、pBR322もしくはpUCプラスミド誘導体などのプラスミド、またはBluescriptベクターが含まれる、プラスミド、または改変ウイルスが含まれる。本発明において有用なベクターのもう1つの例は、参照により本明細書に組み入れられるWO 2007/038276において記載されるUltra Vector（商標）産生システム（Intrexon Corp., Blacksburg, VA）である。たとえば、応答エレメントおよびプロモーターに対応するDNA分子断片を適したベクターに挿入することは、適当なDNA断片を、相補的付着末端を有する選ばれたベクターにライゲーションすることによって成就されうる。または、DNA分子の端部を酵素的に改変してもよく、またはヌクレオチド配列（リンカー）をDNA末端にライゲーションすることによって任意の部位を産生してもよい。そのようなベクターは、細胞ゲノムの中にマーカーを組み入れた細胞の選択を提供する選択可能なマーカー遺伝子を含有するように操作されてもよい。そのようなマーカーは、マーカーにコードされるタンパク質を取り込んで発現する宿主細胞の同定および／または選択を許容する。

ウイルスベクター、および特にレトロウイルスベクターは、細胞のみならず生きている動物対象における広く多様な遺伝子送達用途において用いられている。用いることができるウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、アデノウイルス、ゲミニウイルス、およびカリモウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されるわけではない。非ウイルスベクターには、プラスミド、リポソーム、電気的に荷電した脂質（サイトフェクチン）、DNA-タンパク質複合体、およびバイオポリマーが含まれる。核酸のほかに、ベクターは、1つまたは複数の調節領域、および／または核酸の移入結果（どの組織への移入、発現期間等）を選択、測定、およびモニターするために有用な選択可能なマーカーも同様に含んでもよい。

「プラスミド」という用語は、細胞の中心的な代謝の一部ではない遺伝子を包含することが多く、通常環状の二本鎖DNA分子の形である染色体外エレメントを指す。そのようなエレメントは、任意の起源に由来する、直線状、環状、またはスーパーコイル型の一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAの、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列であってよく、ここでいくつかのヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物用のプロモーター断片およびDNA配列を適当な3'非翻訳配列によって細胞に導入することができる独自の構築へと連結または組み換えされている。

「クローニングベクター」は、付着したセグメントの複製を生じるために、それに対してもう1つの核酸セグメントを付着させてもよいプラスミド、ファージまたはコスミドなどの、連続的に複製して複製開始点を含む核酸、好ましくはDNAの単位長さである「レプリコン」を指す。クローニングベクターは、1つの細胞タイプにおいて複製することができ、もう1つのタイプにおいて発現することができてもよい（「シャトルベクター」）。クローニングベクターは、ベクターおよび／または関心対象配列を挿入するための1つまたは複数のマルチクローニングサイトを含む細胞を選択するために用いることができる1つまたは複数の配列を含んでもよい。

「発現ベクター」という用語は、形質転換後に挿入された核酸配列を宿主において発現させることができるように設計されたベクター、プラスミド、または媒体を指す。クローニングされた遺伝子、すなわち挿入された核酸配列は通常、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー等などの制御エレメントの制御下に置かれる。所望の宿主細胞における核酸の発現を駆動するために有用である開始制御領域またはプロモーターは、多数あり、当業者によく知られている。これらの遺伝子の発現を駆動することができる実質的にいかなるプロモーターも、発現ベクターにおいて用いることができ、これらには以下が含まれるがこれらに限定されるわけではない：ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、病因または疾患関連プロモーター、発達特異的プロモーター、誘導型プロモーター、光調節プロモーター；CYC1、HIS3、GALl、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、アルカリホスファターゼプロモーター（酵母（Saccharomyces）における発現にとって有用）；AOX1プロモーター（ピチア（Pichia）における発現にとって有用）；β-ラクタマーゼ、lac、ara、tet、trp、lP_L、lP_R、T7、tac、およびtrcプロモーター（大腸菌（Escherichia coli）における発現にとって有用）；光調節、種子特異的、花粉特異的、子房特異的、カリフラワーモザイクウイルス35S、CMV 35S最小、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（CsVMV）、葉緑素a/b結合タンパク質、リブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼ、苗条特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導型、イネツングロ病桿状（rice tungro bacilliform）ウイルス、植物スーパープロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、硝酸塩レダクターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼインタンパク質、およびアントシアニンプロモーター（植物細胞における発現にとって有用）；SV40初期（SV40e）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（RSV）の3'長末端反復（LTR）に含有されるプロモーター、アデノウイルス（Ad）のE1Aまたは主要後期プロモーター（MLP）遺伝子のプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼ（TK）プロモーター、バキュロウイルスIE1プロモーター、伸長因子1α（EF1）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）プロモーター、ユビキチン（Ubc）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン-Lプロモーターの調節配列、および転写制御領域、汎存するプロモーター（HPRT、ビメンチン、α-アクチン、チューブリン等）、中間フィラメントのプロモーター（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAP等）、治療遺伝子のプロモーター（MDR、CFTR、または第VIII因子型等の）、病因または疾患関連プロモーター、および膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼI遺伝子制御領域などの、組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されているプロモーター、が含まれるがこれらに限定されるわけではない、当技術分野において公知の動物および哺乳動物プロモーター；膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域、リンパ様細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳腺、リンパおよび肥満細胞において活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域；アルブミン遺伝子、肝臓において活性なApo AIおよびApo AII制御領域、肝臓において活性なα-フェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓において活性なα1-アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄細胞において活性なβ-グロビン遺伝子制御領域、脳における乏突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋において活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域、および視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞α-アクチンプロモーター等。加えて、これらの発現配列は、エンハンサーまたは調節配列を加えること等によって改変されてもよい。

ベクターは、当技術分野において公知の方法、たとえばトランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（ライソゾーム融合）、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター輸送体によって所望の宿主細胞に導入されてもよい（たとえば、Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963 (1992)；Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621 (1988)；およびHartmut et al., カナダ国特許出願第2,012,311号を参照されたい）。

本発明に従うポリヌクレオチドはまた、インビボでリポフェクションによって導入されうる。過去十年間のあいだに、インビトロで核酸をカプセル封入およびトランスフェクションするためにリポソームがますます用いられてきている。リポソーム媒介トランスフェクションの際に遭遇する困難および危険を制限するように設計された合成陽イオン脂質を、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために用いることができる（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA. 84:7413 (1987)；Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:8027 (1988)；およびUlmer et al., Science 259:1745 (1993)）。陽イオン脂質を用いることは、陰性荷電核酸のカプセル封入を促進する可能性があり、同様に陰性荷電細胞膜との融合を促進する可能性がある（Felgner et al., Science 337:387 (1989)）。核酸の移入のために特に有用な脂質化合物および組成物は、WO95/18863、WO96/17823、およびU.S. 5,459,127において記載されている。インビボで特異的臓器に外来遺伝子を導入するためにリポフェクションを用いることは、一定の実際的な長所を有する。特異的細胞に対するリポソームの分子ターゲティングは、1つの有益な領域を表す。特定の細胞タイプにトランスフェクションを向けることは、膵臓、肝臓、腎臓、および脳などの細胞不均一性を有する組織において特に好ましいであろうことは明確である。脂質を、ターゲティング目的のために他の分子に化学的にカップリングさせてもよい（Mackey et al. 1988、前記）。ターゲティングされるペプチド、たとえばホルモンまたは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質または非ペプチド分子を、リポソームに化学的にカップリングさせることができる。

陽イオンオリゴペプチド（たとえば、WO95/21931）、DNA結合タンパク質に由来するペプチド（たとえば、WO96/25508）、または陽イオンポリマー（たとえば、WO95/21931）などの他の分子も同様に、インビボで核酸のトランスフェクションを容易にするために有用である。

同様に、裸のDNAプラスミドとしてインビボでベクターを導入することも可能である（米国特許第5,693,622号、第5,589,466号、および第5,580,859号を参照されたい）。受容体媒介DNA送達アプローチも同様に用いることができる（Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147 (1992)；およびWu et al., J. Biol. Chem. 262:4429 (1987））。

「トランスフェクション」という用語は、外因性または異種のRNAまたはDNAの細胞による取り込みを指す。細胞は、そのようなRNAまたはDNAが細胞内部に導入されている場合に、外因性または異種のRNAまたはDNAによって「トランスフェクト」されている。トランスフェクトされたRNAまたはDNAが表現型の変化をもたらす場合、細胞は、外因性または異種のRNAまたはDNAによって「形質転換」されている。形質転換RNAまたはDNAは、細胞のゲノムを構成する染色体DNAの中に組み込まれうる（共有的に連結されうる）。

「形質転換」は、宿主生物のゲノムへの核酸断片の移入を指し、それによって遺伝的に安定な遺伝が起こる。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」、または「組み換え型」、または「形質転換された」生物と呼ばれる。

加えて、本発明に従うポリヌクレオチドを含む組み換え型ベクターには、その増幅または発現が求められる細胞宿主中での複製に必要な1つまたは複数の開始点、マーカーまたは選択可能なマーカーが含まれてもよい。

「選択可能なマーカー」という用語は、関心対象核酸の遺伝を追跡するため、および／または関心対象核酸が遺伝した細胞または生物を同定するために、その効果が用いられる、マーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質に対する耐性、除草剤に対する耐性、比色定量マーカー、酵素、蛍光マーカー等に基づいて選択することができる同定因子、通常抗生物質または化学物質耐性遺伝子を指す。当技術分野において公知であり、用いられる選択可能なマーカー遺伝子の例には：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミド等に対する耐性を提供する遺伝子；および表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわちアントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子等が含まれる。

「レポーター遺伝子」という用語は、関心対象の核酸の遺伝を追跡するため、関心対象核酸が遺伝した細胞または生物を同定するため、および／または遺伝子発現の誘導または転写を測定するために、その効果が用いられる、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定することができる同定因子をコードする核酸を指す。当技術分野において公知であり用いられるレポーター遺伝子の例には：ルシフェラーゼ（Luc）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β-ガラクトシダーゼ（LacZ）、β-グルクロニダーゼ（Gus）等が含まれる。選択可能なマーカー遺伝子もまたレポーター遺伝子であると見なされてもよい。

「プロモーター」および「プロモーター配列」は互換的に用いられ、コード配列または機能的RNAの発現を制御することができるDNA配列を指す。一般的に、コード配列は、プロモーター配列の3'に位置する。プロモーターは、その全体が天然の遺伝子に由来してもよく、または天然において見いだされる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されてもよく、または合成DNAセグメントさえ含んでもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞タイプにおいて、異なる発達段階で、または異なる環境もしくは生理的条件に応答して、1つの遺伝子の発現を指示する可能性があることは、当業者によって理解される。ほとんどの細胞タイプにおいてほとんどの時期に遺伝子を発現させるプロモーターは一般的に「構成的プロモーター」と呼ばれる。特異的細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターは一般的に、「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。発達または細胞分化の特異的段階で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「発達特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する物質、生体分子、化学物質、リガンド、光等による細胞の曝露または処置後に誘導されて遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「誘導型プロモーター」または「調節可能プロモーター」と呼ばれる。さらに、ほとんどの場合において、調節配列の正確な境界は完全には定義されていないことから、異なる長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有する可能性があると認識される。

プロモーター配列は典型的に、転写開始部位によってその3'末端で境界を定められ、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するために必要な塩基またはエレメントの最小数を含めるように上流（5'方向）に伸長する。プロモーター配列内には、転写開始部位（たとえば、ヌクレアーゼS1によるマッピングによって簡便に定義される）のみならずRNAポリメラーゼの結合の原因となるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見いだされるであろう。

「治療スイッチプロモーター」（「TSP」）は、遺伝子スイッチ成分の発現を制御するプロモーターを指す。遺伝子スイッチおよびその様々な成分は本明細書において他所で詳細に記載される。特定の態様において、TSPは構成的、すなわち連続的に活性である。構成的TSPは、構成的-汎在性（すなわち一般的に任意の組織または細胞において追加の因子または調節物質を必要とすることなく機能する）、構成的-組織または細胞特異的（すなわち、特異的組織タイプまたは細胞タイプにおいて追加の因子または調節物質を必要とすることなく機能する）のいずれかであってもよい。特定の態様において、本発明のTSPは、疾患、障害、または状態に関連する条件下で活性化される。2つまたはそれより多いTSPが関係する本発明の特定の態様において、プロモーターは、構成的プロモーターと活性化可能なプロモーターの組み合わせであってもよい。本明細書において用いられるように、「疾患、障害、または状態に関連する条件下で活性化されるプロモーター」には、疾患特異的プロモーター、特定の生理的、発達的、分化、または病理的条件に応答するプロモーター、特異的生体分子に応答するプロモーター、および疾患、障害、または状態に関連する特定の組織または細胞タイプ、たとえば腫瘍組織または悪性細胞に対して特異的なプロモーターが含まれるがこれらに限定されるわけではない。TSPは、天然に存在するプロモーター、天然に存在するプロモーターに由来する改変配列、または合成配列（たとえば、プロモーターの応答性を変更するために最小プロモーター配列への応答エレメントの挿入）を含みうる。

コード配列は、RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAへと転写して、次にこれがトランスRNAスプライシングされ（コード配列がイントロンを含有する場合）、コード配列にコードされるタンパク質に翻訳される場合に、細胞において転写および翻訳制御配列の「制御下」に存在する。

「転写および翻訳制御配列」は、宿主細胞においてコード配列の発現を提供するプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等などのDNA調節配列を指す。真核細胞において、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。

「応答エレメント」（「RE」）という用語は、転写因子のDNA結合ドメインとの相互作用を通して媒介されるプロモーターに応答性を付与する1つまたは複数のシス作用DNAエレメントを指す。このDNAエレメントは、その配列が回文構造（完全または不完全）であってもよく、または多様な数のヌクレオチドによって分離される配列モチーフもしくはハーフサイト（half site）で構成されてもよい。ハーフサイトは、類似または同一でありえて、直接もしくは逆位反復として、または単一のハーフサイトもしくは近接するハーフサイトの直列の多量体として整列させることができる。応答エレメントは、応答エレメントが組み入れられる細胞または生物の性質に応じて、異なる生物から単離された最小のプロモーターを含んでもよい。転写因子のDNA結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下で応答エレメントのDNA配列に結合して、この応答エレメントの調節下で下流の遺伝子の転写を開始または抑制する。天然のエクジソン受容体の応答エレメントに関するDNA配列の例には、

（Cherbas et. al., Genes Dev. 5:120 (1991)を参照されたい）；N_(n)が1つまたは複数のスペーサーヌクレオチド（SEQ ID NO:2）であるAGGTCAN_(n)AGGTCA（D'Avino et al., Mol. Cell. Endocrinol. 113:1 (1995)を参照されたい）；および

（Antoniewski et al., Mol. Cell Biol. 14:4465 (1994)を参照されたい）が含まれる。

「因子調節プロモーター」（「FRP」）は、本発明の遺伝子スイッチにコードされるリガンド依存的転写因子のDNA結合ドメインによって認識される少なくとも1つの応答エレメントを含むプロモーターを指す。

「機能的に連結された」、「機能的に結合した」、「機能的結合を通して」等の用語は、1つの機能が他の機能によって影響を受けるような、1つの核酸断片上での核酸配列の結合を指す。たとえば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）に、コード配列に機能的に連結している。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向に調節配列に機能的に連結されうる。

本明細書において用いられるように「発現」という用語は、核酸またはポリヌクレオチドに由来するセンスRNA（mRNA）またはアンチセンスRNAの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、mRNAのタンパク質またはポリペプチドへの翻訳を指してもよい。

「カセット」、「発現カセット」、および「遺伝子発現カセット」という用語は、特異的制限部位でまたは相同組み換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるDNAのセグメントを指す。DNAのセグメントは、関心対象ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳に関して適切な読み取り枠でカセットを確実に挿入するように設計される。「形質転換カセット」は、関心対象ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドのほかに特定の宿主細胞の形質転換を容易にするエレメントを有する特異的ベクターを指す。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセットおよび形質転換カセットはまた、宿主細胞において関心対象ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を増強させるエレメントを含んでもよい。これらのエレメントには、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等が含まれてもよいがこれらに限定されるわけではない。

本発明の目的に関して、「遺伝子スイッチ」という用語は、プロモーターに結合する応答エレメントと、1つまたは複数のリガンドの存在下で、応答エレメントとプロモーターとが組み入れられる遺伝子の発現をモジュレートするリガンド依存的転写因子に基づくシステムとの組み合わせを指す。

遺伝子スイッチに関して「エクジソン受容体に基づく」という用語は、天然に存在するまたは合成のエクジソン受容体リガンド結合ドメインの少なくとも機能的部分を含み、エクジソン受容体リガンド結合ドメインに結合するリガンドに応答して遺伝子発現を調節する遺伝子スイッチを指す。

本明細書において用いられるように、「バイオリアクター」または「バイオリアクターデバイス」という用語には、治療タンパク質または治療ポリヌクレオチドを分泌することを意図される1つまたは複数の細胞が含まれる。特定の非制限的な態様において、バイオリアクターは、本明細書において他所で記載されるように改変細胞を含む。特定のしかし全てではない態様において、バイオリアクター細胞は、「免疫学的に孤立」してもよい。バイオリアクター細胞は、対象に導入または埋め込まれた場合に、細胞が対象の免疫系から保護されるように細胞が処理された場合に、対象から「免疫学的に孤立した」と見なされる。たとえば、免疫学的に孤立したバイオリアクター細胞は、治療タンパク質または治療ポリヌクレオチドの散在を許容するが、バイオリアクター細胞と対象の免疫系の細胞との直接の接触を防止するバリアシステム内に、含有されてもよい。免疫学的に孤立した細胞は、たとえばコーティングまたはカプセル封入されてもよい。免疫学的孤立法には、細胞のコンフォーマルコーティング、細胞が生体適合性の材料に懸濁されて球状の塊に分離されるマイクロカプセル封入、または細胞を閉じこめるために用いられる天然もしくは合成ポリマーで構成されるデバイスの中に細胞が閉じこめられるマクロカプセル封入が含まれるがこれらに限定されるわけではない。

「モジュレート」という用語は、核酸または遺伝子発現を誘導、低減、または阻害して、それによってタンパク質またはポリペプチド産生のそれぞれの誘導、低減、または阻害が起こることを意味する。

本発明に従うポリヌクレオチドまたはベクターはさらに、改変細胞における遺伝子の発現を駆動するために適した少なくとも1つのプロモーターを含んでもよい。

本発明の態様において用いられてもよいエンハンサーには、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー、伸長因子1（EF1）エンハンサー、酵母エンハンサー、ウイルス遺伝子エンハンサー等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。

本明細書において定義される「3' reg」は、遺伝子または転写物のコード領域に対して3'に存在する発現モジュレートエレメントである。そのようなエレメントには、一次転写物コードスプライシングエレメント、プロセシングされた転写物からのUTR、ポリアデニル化シグナル、またはDNAコード転写終止ドメインが含まれるがこれらに限定されるわけではない。

終止制御領域、すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化ヌクレオチド配列はまた、好ましい宿主天然の様々な遺伝子に由来してもよい。任意で、終止部位は不要であってもよいが、含まれることが最も好ましい。本発明の1つの態様において、終止制御領域は、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、SV40後期ポリアデニル化シグナル、SV40ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化シグナル、ウイルスターミネーター配列等に含まれてもよく、または由来してもよい。

「3'-非コード配列」または「3'非翻訳領域（UTR）」という用語は、コード配列の下流（3'）に位置するDNA配列を指し、ポリアデニル化[poly(A)]認識配列およびmRNAプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列を含んでもよい。ポリアデニル化シグナルは通常、mRNA前駆体の3'端に対するポリアデニル酸路の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。

「調節領域」は、第二の核酸配列の発現を調節する核酸配列を指す。調節領域には、特定の核酸（相同領域）の発現を天然に起こす配列が含まれてもよく、異なるタンパク質またはさらに合成タンパク質（異種領域）までの発現の原因である異なる起源の配列が含まれてもよい。特に、配列は、原核生物、真核生物、もしくはウイルス遺伝子の配列でありうるか、または特異的もしくは非特異的に、および誘導的もしくは非誘導的に、遺伝子の転写を刺激または抑制する誘導配列でありうる。調節領域には、複製開始点、RNAスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終止配列、および標的細胞の分泌経路にポリペプチドを向けるシグナル配列が含まれる。

「異種起源」からの調節領域は、発現した核酸に天然では結合しない調節領域を指す。異種調節領域には、異なる種からの調節領域、異なる遺伝子からの調節領域、ハイブリッド調節配列、および天然に存在しないが、当業者によって設計される調節配列が含まれる。

「RNA転写物」は、DNA配列のRNAポリメラーゼ触媒転写に起因する産物を指す。RNA転写物がDNA配列の完全に相補的なコピーである場合、これは一次転写物と呼ばれ、または一次転写物の転写後プロセシングに由来するRNA配列であってもよく、この場合成熟RNAと呼ばれる。「メッセンジャーRNA（mRNA）」は、イントロンを有しない、細胞によってタンパク質に翻訳されうるRNAを指す。「cDNA」は、mRNAに対して相補的であって、これに由来する二本鎖DNAを指す。「センス」RNAは、mRNAが含まれ、細胞によってタンパク質に翻訳されうるRNA転写物を指す。「アンチセンスRNA」は、標的一次転写物またはmRNAの全てまたは一部と相補的であり、標的遺伝子の発現を遮断するRNA転写物を指す。アンチセンスRNAの相補性は、標的遺伝子転写物の任意の部分、すなわち5'非コード配列、3'非コード配列、またはコード配列との相補性であってもよい。「機能的RNA」は、アンチセンスRNA、リボザイムRNA、または翻訳されないが細胞プロセスになおも効果を有する他のRNAを指す。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、互換的に用いられ、共有的に連結したアミノ酸残基を含むポリマー化合物を指す。

「単離ポリペプチド」、「単離ペプチド」、または「単離タンパク質」は、その天然の状態で通常結合するそれらの化合物（たとえば、他のタンパク質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたはタンパク質を指す。「単離された」は、他の化合物との人工的なもしくは合成の混合物、または生物活性を妨害しない、およびたとえば不完全な精製、安定剤の付加、または薬学的に許容される調製物への化合により存在する可能性がある不純物の存在を除外することを意味しない。

「置換変異体ポリペプチド」または「置換変異体」は、少なくとも1つの野生型または天然に存在するアミノ酸を、野生型または天然に存在するポリペプチドと比較して異なるアミノ酸に置換することを含む変異体ポリペプチドを意味すると理解されるであろう。置換変異体ポリペプチドは、1つのみの野生型または天然に存在するアミノ酸置換を含んでもよく、「点突然変異体」または「1点変異体」ポリペプチドと呼ばれてもよい。または置換変異体ポリペプチドは、2つまたはそれより多い野生型または天然に存在するアミノ酸の、野生型または天然に存在するポリペプチドと比較して2つまたはそれより多いアミノ酸の置換を含んでもよい。本発明に従って、置換変異を含むグループH核受容体リガンド結合ドメインポリペプチドは、野生型または天然に存在するグループH核受容体リガンド結合ドメインポリペプチドと比較して異なるアミノ酸への、少なくとも1つの野生型または天然に存在するアミノ酸の置換を含む。

置換変異体ポリペプチドが、2つまたはそれより多い野生型または天然に存在するアミノ酸の置換を含む場合、この置換は、置換のために欠失される、野生型もしくは天然に存在するアミノ酸の同等数、すなわち非野生型もしくは天然に存在しないアミノ酸2個に交換された野生型もしくは天然に存在するアミノ酸2個、または置換のために欠失された野生型アミノ酸の非同等数、すなわち、非野生型アミノ酸1個に交換された野生型アミノ酸2個（置換＋欠失変異）もしくは非野生型アミノ酸3個に交換された野生型アミノ酸2個（置換＋挿入変異）を含んでもよい。

置換変異体は、略名の命名法を用いて、参照ポリペプチド配列および新しく置換されたアミノ酸残基内で交換されたアミノ酸残基および番号を示すように記載されてもよい。たとえば、ポリペプチドの20位（20番目）のアミノ酸残基が置換されている置換変異体は、「x20z」と省略されてもよく、ここで「x」は、交換されるアミノ酸であり、「20」はポリペプチド内のアミノ酸残基の位置または番号であり、および「z」は、新しく置換されたアミノ酸である。ゆえに、「E20A」または「Glu20Ala」として互換的に省略された置換変異体は、変異体が、ポリペプチドの20位でグルタミン酸（一般的に当技術分野において「E」または「Glu」と省略される）の代わりにアラニン残基（一般的に当技術分野において「A」または「Ala」と省略される）を含むことを示している。

置換変異は、インビトロ部位特異的変異誘発（Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 253:6551 (1978)；Zoller et al., DNA 3:479 (1984)；Oliphant et al., Gene 44:177 (1986)；Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:710 (1986)）、TAB（登録商標）リンカー（Pharmacia）の使用、制限エンドヌクレアーゼ消化／断片欠失および置換、PCR媒介／オリゴヌクレオチド特異的変異誘発等が含まれるがこれらに限定されるわけではない、当技術分野において公知の任意の変異誘発技術によって作出されてもよい。PCRに基づく技術が部位特異的変異誘発にとって好ましい（Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70を参照されたい）。

ポリペプチドに適用される場合の「断片」という用語は、そのアミノ酸配列が参照ポリペプチドの配列より短く、これらの参照ポリペプチドの全部分に対して同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。そのような断片は、適当であれば、それらが一部であるより大きなポリペプチドに含まれてもよい。本発明に従うポリペプチドのそのような断片は、アミノ酸少なくとも2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240、または300個の長さを有してもよい。

ポリペプチドまたはタンパク質の「変種」は、ポリペプチドまたはタンパク質に由来し、ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも1つの生物学的特性を保持する任意の類似体、断片、誘導体、または変異体を指す。ポリペプチドまたはタンパク質の異なる変種は天然に存在する可能性がある。これらの変種は、タンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の差を特徴とする対立遺伝子の変種であってもよく、または異なるスプライシングもしくは翻訳後改変を伴ってもよい。当業者は、1つまたは多数のアミノ酸置換、欠失、付加、または交換を有する変種を産生することができる。これらの変種には、中でも：（a）1つまたは複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸に置換されている変種、（b）1つまたは複数のアミノ酸がポリペプチドまたはタンパク質に付加されている変種、（c）1つまたは複数のアミノ酸に置換基が含まれる変種、および（d）ポリペプチドまたはタンパク質が血清アルブミンなどのもう1つのポリペプチドに融合されている変種、が含まれてもよい。遺伝子的技術（抑制、欠失、変異等）、化学的技術、および酵素的技術が含まれるこれらの変種を得るための技術は、当業者に公知である。1つの態様において、変種ポリペプチドは、アミノ酸少なくとも約14個を含む。

「相同性」という用語は、2つのポリヌクレオチドまたは2つのポリペプチド部分のあいだの同一性の百分率を指す。1つの部分からもう1つの部分までの配列のあいだの対応は、当技術分野において公知の技術によって決定されうる。たとえば、相同性は、配列情報を整列させることによる、および容易に利用可能なコンピュータープログラムを用いることによる、2つのポリペプチド分子のあいだの配列情報の直接比較によって決定されうる。または、相同性は、相同な領域のあいだで安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの後に、一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および消化された断片のサイズ決定を行うことによって決定されうる。

本明細書において用いられるように、その全ての文法型および綴りの変動における「相同な」という用語は、スーパーファミリー（たとえば、免疫グロブリンスーパーファミリー）からのタンパク質および異なる種からの相同なタンパク質（たとえば、ミオシン軽鎖等）が含まれる、「共通の進化起源」を保有するタンパク質のあいだの関係を指す（Reeck et al., Cell 50:667 (1987)）。そのようなタンパク質（およびそのコード遺伝子）は、その高い程度の配列類似性によって反映されるように配列相同性を有する。しかし、一般的な使用においておよび本発明の応用において、「高度に」などの副詞によって修飾された場合の「相同な」という用語は、配列類似性を指してもよく、共通の進化的起源でなくてもよい。

したがって、その全ての文法型での「配列類似性」という用語は、共通の進化的起源を共有してもよく共有しなくてもよいタンパク質の核酸またはアミノ酸配列のあいだの同一性または対応の程度を指す（Reeck et al., Cell 50:667 (1987)を参照されたい）。1つの態様において、2つのDNA分子配列は、DNA配列の既定の長さに対してヌクレオチドの少なくとも約50％（たとえば、少なくとも約75％、90％、または95％）がマッチする場合に、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相同である配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを用いて、またはたとえばその特定のシステムに関して定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験において配列を比較することによって同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当業者の範囲内である（たとえば、Sambrook et al., 1989、前記を参照されたい）。

本明細書において用いられるように、「実質的に類似」とは、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化によって1つまたは複数のアミノ酸の置換が起こるが、DNA配列にコードされるタンパク質の機能的特性に影響を及ぼさない核酸断片を指す。「実質的に類似」はまた、1つまたは複数のヌクレオチド塩基における変化が、核酸断片の、アンチセンスまたは共抑制技術による遺伝子発現の変更の媒介能に影響を及ぼさない核酸断片を指す。「実質的に類似」はまた、得られた転写物の機能的特性に実質的に影響を及ぼさない1つまたは複数のヌクレオチド塩基の欠失または挿入などの、本発明の核酸断片の改変を指す。ゆえに、本発明は、特異的例示的配列より多くを包含すると理解される。提唱される改変のそれぞれは、コードされる産物の生物活性の保持の決定と同様に、当技術分野における技術の範囲内である。

その上、当業者は、本発明によって包含される実質的に類似の配列が同様に、ストリンジェントな条件（0.1×SSC、0.1％SDS、65℃および2×SSC、0.1％SDSの後に0.1×SSC、0.1％SDSでの洗浄）で、本明細書において例示される配列とのそのハイブリダイズ能によって定義されることを認識する。本発明の実質的に類似の核酸断片は、そのDNA配列が、本明細書において報告された核酸断片のDNA配列と少なくとも約70％、80％、90％、または95％同一である核酸断片である。

2つのアミノ酸配列は、アミノ酸の約40％より多くが同一である、または60％より多くが類似である（機能的に同一である）場合に「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似または相同な配列は、たとえばGCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアッププログラムを用いるアラインメントによって同定される。

「対応する」という用語は本明細書において、正確な位置が、類似性または相同性を測定する対象の分子と同一であるか異なるかに関わらず、類似または相同な配列を指すために用いられる。核酸またはアミノ酸配列アラインメントには、空白が含まれてもよい。このように、「対応する」という用語は、配列類似性を指し、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けを指すのではない。

アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」とは、当業者による配列の手動での評価によって、またはBLAST（Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1993))；ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/において利用可能）などのアルゴリズムを用いるコンピューター自動配列比較および同定のいずれかによってポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分な、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般的に、ポリペプチドまたは核酸配列を公知のタンパク質または遺伝子に対して相同であると推定に同定するためには、10個もしくはそれより多い近接アミノ酸、または30個もしくはそれより多いヌクレオチドの配列が必要である。その上、ヌクレオチド配列に関して、近接ヌクレオチド20〜30個を含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、配列依存的遺伝子同定法（たとえば、サザンハイブリダイゼーション）および単離法（たとえば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチューハイブリダイゼーション）法において用いてもよい。加えて、12〜15塩基の短いオリゴヌクレオチドを、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、PCRにおける増幅プライマーとして用いてもよい。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するのに十分な配列を含む。

当技術分野において公知であるように、「％同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される2つもしくはそれより多いポリペプチド配列または2つもしくはそれより多いポリヌクレオチド配列のあいだの関係である。当技術分野において、「同一性」はまた、場合によっては、一連のそのような配列のあいだのマッチによって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列のあいだの配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988)；Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)；およびSequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)において記載される方法が含まれるがこれらに限定されるわけではない、公知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験された配列のあいだの最善のマッチを与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共に利用可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、LASERGENEバイオインフォマティクス計算スイートのMegalignプログラム（DNASTAR Inc., Madison, WI）などの配列分析ソフトウェアを用いて行ってもよい。配列の多数のアラインメントは、デフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝10、ギャップ長ペナルティ＝10）を用いるClustalアラインメント法（Higgins et al., CABIOS. 5:151 (1989)）を用いて行ってもよい。Clustal法を用いる対応のあるアラインメントに関してデフォルトパラメータを選択してもよい：KTUPLE 1、ギャップペナルティ＝3、ウィンドウ＝5、およびDIAGONALS SAVED＝5。

「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析にとって有用である任意のコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販されていてもよく、独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、GCGプログラムスイート（Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI）、BLASTP、BLASTN、BLASTX（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)）、およびDNASTAR（DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本出願の文脈において、配列分析ソフトウェアを分析のために用いる場合、分析結果は、特に明記されなければ、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくと理解されるであろう。本明細書において用いられるように、「デフォルト値」は、最初に初期化した場合にソフトウェアによって当初からローディングされた任意の組の値またはパラメータを意味するであろう。

DNAの配列に関連して「化学合成された」とは、成分ヌクレオチドがインビトロでアセンブルされたことを意味する。手動でのDNA分子の化学合成は、十分に確立された技法を用いて成就されてもよく、または多数の市販の機器の1つを用いて自動化学合成を行うことができる。したがって、宿主細胞のコドンバイアスを反映するように、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適な遺伝子発現となるように遺伝子を作製することができる。当業者は、コドン使用が宿主によって都合がよいコドンに偏るならば、遺伝子発現が成功しうることを認識するであろう。好ましいコドンの決定は、配列情報を得ることができる宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。

本明細書において用いられるように、2つまたはそれより多い個々に操作可能な遺伝子調節システムは、以下である場合に「直交」であると言われる：a）選ばれた濃度でのそのそれぞれのリガンドによる所定のシステムの各々のモジュレーションによって、そのシステムの遺伝子の発現の程度に測定可能な変化が起こる場合、およびb）実際のモジュレーションの同時性または連続性によらず、変化が、細胞、組織、または生物において同時に操作可能である他の全てのシステムの発現の変化とは統計学的に有意に異なる場合。好ましくは、各個々に操作可能な遺伝子調節システムのモジュレーションは、細胞、組織、または生物における他の全ての操作可能なシステムより少なくとも2倍大きい、たとえば少なくとも5倍、10倍、100倍、または500倍大きい遺伝子発現の変化をもたらす。理想的には、そのそれぞれのリガンドによる選ばれた濃度での所定のシステムの各々のモジュレーションによって、そのシステムの遺伝子の発現の程度に測定可能な変化が起こり、細胞、組織、または生物において操作可能な他の全てのシステムの発現に測定可能な変化は起こらない。そのような場合、多数の誘導可能な遺伝子調節システムは、「完全に直交である」と言われる。本発明は、その全文が参照により本明細書に組み入れられる、US 2002/0110861 Alにおいて記載されるシステムなどの直交リガンドおよび直交受容体に基づく遺伝子発現システムを検索するために有用である。

「外因性の遺伝子」という用語は、対象にとって外来性である遺伝子、すなわち形質転換プロセスを通して対象に導入される遺伝子、内因性の変異遺伝子の非変異型、または内因性の非変異遺伝子の変異型を意味する。形質転換法は、本発明にとって重大ではなく、対象にとって適した当技術分野において公知の任意の方法であってもよい。外因性の遺伝子は、逆転写酵素によるなどのDNA中間体を通して機能する可能性があるDNAまたはRNAの形で対象に導入される天然または合成遺伝子のいずれかでありうる。そのような遺伝子は、標的細胞に導入されうるか、対象に直接導入されうるか、または対象への形質転換細胞の移入によって間接的に導入されうる。

本明細書において用いられる「治療産物」および「治療分子」という用語は、処置される対象に有益な機能を付与する治療ポリペプチド（「TP」；「治療タンパク質配列」（「TPSQ」）にコードされる）、または治療ポリヌクレオチドを指す。治療ポリペプチドには、3アミノ酸長程度の小さなペプチド、単鎖または多重鎖タンパク質、および融合タンパク質が含まれてもよいがこれらに限定されるわけではない。治療ポリヌクレオチドには、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA、リボザイム、およびRNA外部ガイド配列が含まれてもよいがこれらに限定されるわけではない。治療産物の非制限的な例は、本明細書において他所で開示されている。治療産物は、天然に存在する配列、合成配列、または天然配列と合成配列の組み合わせを含んでもよい。

「リガンド依存的転写因子複合体」または「LDTFC」という用語は、複合体が、本明細書において定義される「因子調節プロモーター」によって駆動される遺伝子発現を調節することができる、1つまたは複数のタンパク質サブユニットを含む転写因子を指す。モデルLDTFCは、「エクジソン受容体複合体」であり、これは一般的に核受容体ファミリーの少なくとも2つのメンバー、すなわちエクジソン受容体（「EcR」）とウルトラスピラクルタンパク質（ultraspiracle protein（「USP」）（Yao et al., Nature 366:476 (1993)）；Yao et al., Cell 71:63 (1992)を参照されたい）とを有するヘテロ二量体タンパク質複合体を指す。EcR複合体などの機能的LDTFCにはまた、イムノフィリンなどの追加のタンパク質が含まれてもよい。転写因子（DHR38、βFTZ-1、または昆虫相同体）として知られるタンパク質の核受容体ファミリーの追加のメンバーも同様に、EcRおよび／またはUSPのリガンド依存的または非依存的パートナーであってもよい。EcR複合体などのLDTFCはまた、EcRタンパク質と、ウルトラスピラクルタンパク質の脊椎動物相同体、レチン酸X-受容体（「RXR」）タンパク質、またはUSPとRXRのキメラのヘテロ二量体でありうる。「LDTFC」および「EcR複合体」という用語はまた、EcRタンパク質またはUSPのホモ二量体複合体のみならず、単一のポリペプチドまたは三量体、四量体、および同じ機能を供給する他の多量体を包含する。

EcR複合体などのLDTFCは、EcRを含むが該複合体の他のタンパク質を除外しないような、該複合体のタンパク質の1つに結合した活性なエクジステロイドまたは非ステロイドリガンドによって活性化されうる。本明細書において用いられるように、「リガンド」という用語は、LDTFCに基づく遺伝子スイッチ、たとえばEcD複合体に基づく遺伝子スイッチに適用された場合に、その中にコードされるポリペプチドの発現を刺激するように遺伝子スイッチを活性化する能力を有する小さい可溶性の分子を説明するものである。リガンドの例には、エクジソン、20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA、ムリステロンA等などのエクジステロイド、9-シス-レチン酸、レチン酸の合成類似体、その各々が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,013,836号；第5,117,057号；第5,530,028号；および第5,378,726号、ならびに米国特許出願公開第2005/0209283号および第2006/0020146号において開示されるようなN,N'-ジアシルヒドラジン；米国特許出願公開第2004/0171651号において記載されるオキサジアゾリン；欧州特許出願第461,809号において開示されるようなジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国特許第5,225,443号において開示されるようなN-アルキル-N,N'-ジアロイルヒドラジン；欧州特許出願第234,994号において開示されるようなN-アシル-N-アルキルカルボニルヒドラジン；米国特許第4,985,461号において記載されるようなN-アロイル-N-アルキル-N'-アロイルヒドラジン；米国特許出願公開第2004/0049037号において記載されるようなアミドケトン、ならびに3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ-N-イソブチル-ベンズアミド、8-O-アセチルハルパジド（acetylharpagide）、オキシステロール、22(R)ヒドロキシコレステロール、24(S)ヒドロキシコレステロール、25-エポキシコレステロール、T0901317、5-α-6-α-エポキシコレステロール-3-スルフェート（ECHS）、7-ケトコレステロール-3-スルフェート、ファメソール、胆汁酸、1,1-ビホスホネートエステル、幼弱ホルモンIII等が含まれる他の類似の材料が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本発明において有用なジアシルヒドラジンリガンドの例には、RG-115819（3,5-ジメチル安息香酸N-(l-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N'-(2-メチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド）、RG-115932（(R)-3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N'-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド）、およびRG-115830（3,5-ジメチル-安息香酸N-(l-tert-ブチル-ブチル)-N'-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド）が含まれる。たとえば、そのいずれも全文が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第12/155,111号、およびPCT出願第PCT/US2008/006757号を参照されたい。

EcR複合体などのLDTFCには、全てのメンバーが、アミノ末端トランス活性化ドメイン（「AD」、「TD」、または「TA」、本明細書において互換的に用いられる）、DNA分子結合ドメイン（「DBD」）、およびリガンド結合ドメイン（「LBD」）を含む1つまたは複数のポリペプチドサブユニットの存在を特徴とする核受容体スーパーファミリーメンバーであるタンパク質が含まれる。ADは、「ヘテロ二量体化パートナー」または「HP」との融合として存在してもよい。本発明のADおよびHPを含む融合タンパク質は、本明細書において「共活性化タンパク質」または「CAP」と呼ばれる。DBDおよびLBDは、本明細書において「リガンド誘導可能転写因子（「LTF」）」と呼ばれる融合タンパク質として発現してもよい。融合パートナーは、リンカー、たとえばヒンジ領域によって分離されてもよい。LTFファミリーのいくつかのメンバーはまた、LBDのカルボキシ末端側面においてもう1つのトランス活性化ドメインを有してもよい。DBDは、2つのアミノ酸モチーフ、P-ボックスとD-ボックスのあいだの2つのシステイン亜鉛フィンガーの存在を特徴とし、これは、エクジソン応答エレメントに対する特異性を付与する。これらのドメインは、異種受容体タンパク質の異なるドメインの天然型、改変型、またはキメラのいずれかであってもよい。

外因性遺伝子、応答エレメント、およびLDTFC、たとえばEcR複合体を構成するDNA配列は、古細菌、大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）、もしくは他の腸細菌などの原核細胞、または植物もしくは動物細胞などの真核細胞に組み入れられてもよい。しかし、遺伝子が発現するタンパク質の多くは細菌内では不正確にプロセシングされることから、真核細胞が好ましい。細胞は、単細胞生物または多細胞生物の形であってもよい。外因性遺伝子、応答エレメント、および受容体複合体のヌクレオチド配列はまた、好ましくはタバコモザイクウイルスなどの機能的ウイルスRNAの形でRNA分子として組み入れられうる。真核細胞の中でも、脊椎動物細胞はEcRに関する本発明のリガンドに対する応答を付与する分子を天然に欠損していることから、脊椎動物細胞が好ましい。その結果、それらは本発明のリガンドに対して「実質的に非感受性」である。このように、本発明において有用なリガンドは、形質転換細胞または生物全体において無視できるほどの生理学的または他の効果を有するであろう。ゆえに、細胞は、生育して、リガンド自体の存在によって実質的に影響を受けることなく所望の産物を発現することができる。

「対象」という用語は無傷の昆虫、植物、または動物を意味する。同様に、リガンドは、対象が真菌または酵母である場合に等しく作用するであろうと予想される。対象が無傷の動物である場合、好ましくは動物は脊椎動物であり、最も好ましくは哺乳動物である。

外因性の遺伝子（たとえば、レポーター遺伝子）に連結した応答エレメントに次に結合するLDTFC、たとえばEcR複合体と共に用いる場合、EcRリガンドは、外因性遺伝子の発現を外部から一時的に調節するための手段を提供する。様々な成分が互いに結合する順序、すなわちリガンドから受容体複合体および受容体複合体から応答エレメントという順序は重要ではない。典型的に、外因性遺伝子の発現のモジュレーションは、特異的制御DNAエレメントまたは調節DNAエレメントに対するLDTFC、たとえばEcR複合体の結合に応答する。EcRタンパク質は、核受容体ファミリーの他のメンバーと同様に、少なくとも3つのドメイン、AD、DBD、およびLBDを保有する。この受容体は、核受容体ファミリーのサブセットと同様に、ヘテロ二量体化特性の原因となるあまり定義されていない領域（本明細書において「ヘテロ二量体化パートナー」または「HP」と呼ばれる）を保有する。たとえばADおよび／またはHP、たとえばUSPまたはRXRタンパク質を含むCAPとのヘテロ二量体形成後の、LTF、たとえばEcRタンパク質のリガンド結合ドメインに対するリガンドの結合によって、ヘテロ二量体タンパク質のDNA分子結合ドメインが活性化型の応答エレメントに結合することができ、したがって外因性遺伝子の発現または抑制が起こる。この機序は、個々のサブユニット、たとえばLTFまたはCAP、たとえばEcRまたはUSPにリガンドが結合して、それによって活性なホモ二量体複合体が形成される可能性を除外しない（たとえば、EcR＋EcRまたはUSP＋USP）。1つの態様において、受容体ドメインの1つまたは複数を改変してキメラ遺伝子スイッチを産生することができる。典型的に、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合、および特異的応答エレメントの認識のために選ばれた宿主細胞または生物においてキメラ受容体が最適化されるように、3つのドメインの1つまたは複数は、他のドメイン源とは異なる起源から選ばれてもよい。加えて、応答エレメント自体は、キメラLDTFC、たとえばEcR複合体に適合させるために、酵母のGAL-4タンパク質（Sadowski et al., Nature 335:563 (1988)を参照されたい）、または大腸菌のLexAタンパク質（Brent et al., Cell 43:729 (1985)を参照されたい）などの他のDNA分子結合タンパク質ドメインに関する応答エレメントによって改変または置換されうる。キメラシステムのもう1つの長所は、所望の最終結果に従って外因性遺伝子を駆動するために用いられるプロモーターの選択が許容される点である。そのような二重制御は、特に細胞障害性タンパク質が産生される場合には、発現の時期のみならず発現が起こる細胞の双方を制御できることから、遺伝子治療領域では特に重要でありうる。適したプロモーターに機能的に連結された外因性遺伝子が対象の細胞に導入されると、外因性遺伝子の発現は、本発明のリガンドの存在によって制御される。プロモーターは、構成的もしくは誘導的に調節されてもよく、または組織特異的（特定の細胞タイプに限って発現する）であっても、生物の一定の発達段階に対して特異的であってもよい。

転写因子およびレポーター遺伝子などの多様なポリペプチドをコードする多数のゲノムおよびcDNA核酸配列が当技術分野において周知である。当業者は、実質的に全ての公知の遺伝子に関する核酸配列情報にアクセスして、配列を公開する施設である公共の寄託所から直接核酸分子を得ることができるか、または分子を調製するルーチンの方法を使用することができる。

インビボで用いるため、本明細書において記載されるリガンドは、たとえば溶液、懸濁液、錠剤、カプセル剤、軟膏、エリキシル剤、および注射用組成物などの薬学的に許容される担体に溶解させてもよい。薬学的組成物は、リガンドを0.01重量％〜99重量％含有してもよい。組成物は、1用量または多用量剤形のいずれかであってもよい。任意の特定の薬学的組成物におけるリガンドの量は、有効量に依存する、すなわち所望の遺伝子発現または抑制を誘発するために必要な用量に依存する。

薬学的調製物の適した投与経路には、経口、直腸内、局所適用（皮膚、口腔内、および舌下が含まれる）、膣内、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下腔、および硬膜外が含まれる）、および鼻-胃チューブが含まれる。好ましい投与経路は、処置される状態に依存して、レシピエントの状態などの要因によって変動する可能性があることは当業者によって理解されるであろう。

本発明の1つの態様は、以下を含む、対象における疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防するための方法を含む：
（a）（1）疾患、障害、または状態の際に活性化される治療スイッチプロモーターに機能的に連結したリガンド依存的転写因子複合体をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子複合体によって活性化されるプロモーターに連結された治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを対象の細胞に導入する段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドが疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防するために十分なレベルで発現する、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために対象にリガンドを投与する段階。

本発明の1つの態様は、以下を含む、対象における疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防するための方法を含む：
（a）（1）治療スイッチプロモーターとの機能的結合を通してリガンド依存的転写因子複合体をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードする、第一のポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子によって活性化される因子調節プロモーターに機能的に結合した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドを対象に導入する段階であって、該第一および第二のポリヌクレオチドがリガンド依存的転写因子複合体の発現を可能とするように導入される、段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために対象にリガンドを投与する段階。

本発明の1つの態様は、以下を含む、対象における治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現させるための方法を提供する：
（a）（1）治療スイッチプロモーターとの機能的結合を通してリガンド依存的転写因子複合体をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードする、第一のポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子によって活性化される因子調節プロモーターに機能的に結合した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドを対象に導入する段階であって、該第一および第二のポリヌクレオチドが、リガンド依存的転写因子複合体の発現を可能とするように導入される、段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために対象にリガンドを投与する段階。

特定の態様において、本方法において記載される治療スイッチプロモーターは、構成的である。特定の態様において、治療スイッチプロモーターは、疾患、障害、または状態に関連する条件下で活性化され、たとえばプロモーターは、疾患に応答して、特定の生理的、発達的、分化、または病理的条件に応答して、および／または1つもしくは複数の特異的生体分子に応答して活性化され；および／またはプロモーターは、特定の組織または細胞タイプにおいて活性化される。特定の態様において、疾患、障害、または状態は、治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに応答する。たとえば、特定の非制限的態様において、治療ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、疾患、障害、または状態を処置、予防、改善、症状を低減、進行を予防、または治癒するために有用であるが、これらの事柄の任意の1つまたは全てを成就する必要はない。特定の態様において、第一および第二のポリヌクレオチドは、疾患、障害、または状態に関連する条件下で、リガンド依存的転写因子複合体の発現を可能とするように導入される。1つの態様において、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドが、疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防するために十分なレベルで発現して、対象の中に散在するように、治療法が実行される。本明細書において用いられるように、「散在する」とは、対象において効果または活性を有するのに十分なほどにポリペプチドが発現して改変細胞から放出されることを意味する。散在は全身性、局所、またはそのあいだのいずれかであってもよい。たとえば、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドは、血流またはリンパ系を通して全身に散在してもよい。または、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドは、処置される組織または臓器に局所的に散在してもよい。

1つの態様において、治療法は、処置される対象の細胞によってポリヌクレオチドがインビボで取り込まれるように、先に記載された第一および第二のポリペプチドなどの本発明の組成物を、処置される対象に直接投与することによって実行され、1つまたは複数の治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書において他所で詳細に記載されるように、適当な条件下でそれらの細胞によって発現される。ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター、たとえばレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、たとえばワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、たとえば単純ヘルペスウイルスベクターまたはエプスタイン-バーウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ゲミニウイルスベクター、またはカリモウイルスベクター；たとえばリポソーム、電気的に荷電した脂質（サイトフェクチン）、バイオポリマーと複合体を形成して、またはDNA-タンパク質複合体として送達されてもよいプラスミドなどの非ウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されるわけではない多様な方法によって、処置される対象に直接送達されてもよい。

もう1つの態様において、治療法は、1つまたは複数の改変細胞に含有される先に記載した第一および第二のポリヌクレオチドなどの本発明の組成物を、処置される対象に導入することによって実行される。改変細胞の投与後、1つまたは複数の治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書において他所で詳細に記載されるように、適当な条件下で改変細胞によって発現される。「改変細胞」という用語は、先に記載された少なくとも第一および第二のポリヌクレオチドが挿入されている1つまたは複数の細胞を指す。そのため、「改変細胞」は、処置される対象からの細胞であってもなくてもよく、または関連してもしなくてもよい、第一および第二のポリペプチドを有する細胞を指す。そのような細胞は、本明細書において記載される「バイオリアクター」または「バイオリアクターデバイス」の定義に含まれる。しかし、本明細書において記載されるように、「バイオリアクター」または「バイオリアクターデバイス」は改変細胞である必要はなく、むしろ本明細書において記載されるバイオリアクターまたはバイオリアクターデバイスは、細胞が「改変細胞」であるか否かによらず、治療タンパク質または治療ポリヌクレオチドを分泌するように意図された任意の1つまたは複数の細胞である。

1つの態様において、治療法は、先に記載した第一および第二のポリヌクレオチドなどの本発明の組成物を、対象から単離されている細胞、すなわち自己細胞に導入して、改変細胞を産生することによって実行され、改変細胞は対象に再導入される。

または、先に記載した第一および第二のポリヌクレオチドなどの本発明の組成物を、対象から単離されていない細胞、すなわち対象に対して非自己である細胞に導入することによって、改変細胞を調製して、改変非自己（MNA）細胞を産生してもよい。そのようなMNA細胞は、処置される対象に対して異系であってもよく、すなわちそれらは対象と同じ種の遺伝的に非同一のメンバーに由来する。たとえば、ヒト対象を処置する場合、細胞はヒト細胞であるが、処置される対象に直接由来しなくてもよい。または、MNA細胞は、処置される対象に対して異種であってもよく、すなわちそれらは処置される対象とは異なる種に由来する。たとえば、ヒト対象を処置する場合、細胞は、マウス細胞、サル細胞、またはブタ細胞であってもよい。

本発明において用いるために適したMNA細胞は、不死化細胞、初代細胞、および最終分化を行うことができる細胞が含まれるがこれらに限定されるわけではない任意の数の細胞タイプから生成されてもよい。本発明のMNA改変細胞を生成するために適した細胞の非制限的な例には、C2C12マウス筋芽細胞、HEK293ヒト胎児腎細胞、ARPE-19細胞、hMSC細胞、膵島細胞、MDCK細胞、BHK細胞、ハイブリドーマ細胞、CHO細胞、星状細胞由来細胞、乏突起膠細胞由来細胞、筋芽細胞由来細胞、副甲状腺由来細胞が含まれる。ヒト対象を処置するために膵島細胞を用いて改変細胞を生成する特異的態様において、膵島細胞は、異種、たとえばブタ島細胞であってもよく、または同種異系、たとえば死体に由来するヒト島細胞であってもよい。

1つの態様において、治療法はインビボで実行される。

1つの態様において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド、およびプロモーターに連結した、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、より大きいポリヌクレオチド、たとえばベクターの一部である。別の態様において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドおよびプロモーターに連結された、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、個別のポリヌクレオチドであり、これらは共に「核酸組成物」を形成してもよい。

特定の態様において、本発明のバイオリアクターは、対象に導入される前にバリアによって取り囲まれた（たとえば、カプセル封入された）改変または非改変細胞を含む。そのようなバイオリアクターは、各個体からの自己細胞を改変しなければならない代わりに、任意の対象について用いられうる。細胞カプセル封入法は、選択的にまたは非選択的に所望の生物材料を放出させながら細胞を免疫学的に孤立させるために用いられている。改善された構造特徴および／または免疫保護を提供することができるカプセル封入組成物およびそれらを作出する方法を提供することが望ましいであろう。そのような組成物および方法は、カプセル封入された細胞が、処置される対象内での機械的、化学的、または免疫学的破壊に耐えることができる場合に有用であり得、かつこれによって、組織を維持するためおよび正常な代謝機能を支持するために必要な栄養、イオン、酸素、および他の物質に対する自由な透過性がさらに提供されうるが、免疫化学反応の原因となるタイプの細菌、リンパ球、および大きいタンパク質に対しては非透過性であろう。本発明において用いるために適したバリアは、バリア内に含有される改変または非改変細胞によって発現される治療タンパク質または治療ポリヌクレオチドを散在させるが、対象の免疫系の細胞との細胞の直接接触を防止する。バリアはまた、非自己または自己の改変または非改変細胞が導入部位から離脱することを防止するように、たとえば循環すると対象に害を引き起こす可能性がある細胞を除くように機能してもよい。1つの態様において、バリアは選択的に透過性のバリア、たとえばホルモンおよび低分子ペプチドなどの低分子に対して透過性であるが、抗体などのより大きいポリペプチドに対しては非透過性であるバリアである。たとえば、バリアは、約100,000、約50,000、約25,000、約10,000、約5,000、または約1,000ダルトンより大きい分子量を有する分子に対して非透過性であってもよい。

任意の数のバリアシステムが本発明において用いるために適している。1つの態様において、たとえば、バリアは、1つまたは複数の細胞を覆うコンフォーマルコーティングを含む。典型的に、コンフォーマルコーティングは、ポリマー材料、たとえばポリエチレングリコールまたはヒドロキシエチルメタクリレート-メチルメタクリレート（HEMA-MMA）から作出される。コンフォーマルコーティングは典型的に、少数の改変細胞、たとえば細胞1〜10個、細胞1〜20個、細胞1〜30個、細胞1〜50個、細胞1〜70個、または細胞1〜90個等を閉じ込める。たとえばその全文が参照により本明細書に組み入れられる、Shoichet MS, Winn SR., Adv Drug Delivery Rev. 42:81-102 (2000)を参照されたい。

他の態様において、本発明において用いるために適しているバリアシステムは、カプセル封入された細胞を含むバイオリアクターを含む。2つの非制限的なカプセル封入法、マイクロカプセル封入法およびマクロカプセル封入法が当技術分野において公知である。典型的に、マイクロカプセル封入において、細胞を、生物学的に適合性のカプセル封入材料に懸濁し、次に、ビーズ様構造に形成するが、マクロカプセル封入法では、デバイスは、一般的に細胞を付加する前に製造されて、1つまたは複数の合成膜で構成されうる。コンフォーマルコーティングと比較して、カプセル封入細胞を含むバリアシステムは、大きさがより均一となる傾向があり、および均一な孔径を有する傾向があり、タンパク質の散在をよりよく制御することができる。カプセル封入に関して、生きている細胞および他の感受性材料は、細胞または生物材料がカプセル封入プロセスによって実質的に影響を受けないままにする一方で、長期間にわたって存在するのに十分な強度のカプセルの形成を可能にする、十分に軽度の条件下で処置されうる。

生きている細胞をカプセル封入することができ、得られたカプセル封入細胞は、生物学的適合性の半透膜の中に細胞をカプセル封入することによってインビボ活性を長期間維持する。生物学的適合性を増加させる1つの様式は、生物学的適合性の陰性荷電材料の外部表面を付加することである。本明細書において用いられる「生物学的適合性」という用語は、無傷のカプセルおよびその内容物の双方を集合的に指す。具体的に、これは、埋め込まれた無傷のカプセル封入細胞が、免疫系または外来体線維形成反応（foreign body fibrotic response）などの体の様々な保護システムの有害な効果を回避して、有意な期間機能的であり続けることができることを指す。

本発明において用いるために適したカプセル封入細胞を含むバイオリアクターは、細胞に対する動物の免疫応答が最小限である動物に細胞を投与するために特に有用である。抗体、酵素、および他の生物活性材料を産生する細胞も同様に投与することができる。本発明の対象内で得られるカプセル封入細胞のサイズが小さいことから、対象への注射、埋め込みまたは移植によるマイクロカプセルの投与は容易となる。

処置される対象に埋め込まれるた場合に細胞を物理的に孤立させるための、埋め込み可能なビーズ様構造、たとえばマイクロビーズまたはマイクロスフェアを形成するために、生きている細胞を、多様なゲル、たとえばアルギネートにカプセル封入することができる。抗体および補体（分子量約150 kDa）などのより分子量の小さい物質がこれらのビーズ様構造の中に入ることを防止するために、それらを、制御された孔径を有する外皮を提供するポリ-L-リジン、キトサン、もしくはPAN-PVCなどの材料によってコーティングすることができ、またはその内部多孔性を制御するために、それらをたとえばクロスリンクによって処置することができる。有用な材料の追加の例には、ポリ-L-リジン-アルギネート、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、メチルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、MATRIGEL、VIRTOGEN、ポリビニルアルコール、アガロース、ポリエチレングリコール、ハイドロゲル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)、ポリヒドロキシブチレート-ポリヒドロキシバレレート、コポリマー、ポリ(ラクチド-コ-カプロラクトン)、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリ13-ヒドロキシ酪酸、ポリアンヒドリド、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリレート（pllyacrylates）（アクリル酸コポリマーが含まれる）、ポリビニリデン、ポリ塩化ビニルコポリマー、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリスルホン（ポリエーテルスルホンが含まれる）、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、およびポリ(アクリロニトリル／塩化コビニル)などの天然または合成のポリマーまたはコポリマーで構成される従来の生体適合性の材料が含まれる。

カプセル封入の1つの型はマイクロカプセル封入であり、これは液体またはゲル様カプセル封入材料中の細胞の懸濁物を伴い、次に支持微粒子マトリクス、たとえばハイドロゲルマトリクスに形成されて、ビーズ様構造を形成し、これは埋め込み可能なデバイスのコアとして役立つ。コアは、適度の細胞分布を維持して、強度を提供し、細胞の生存率、寿命、および機能を増強する。コアはまた、免疫学的孤立にも貢献しうる。コアはまた、ビーズ様構造に含有される内部細胞を、処置される対象において望ましくない免疫応答を誘発しうる直接の細胞-細胞相互作用から保護する。

バリアシステムは、たとえば各層が異なる目的（たとえば、支持、透過性の制御）を供給する多数の層を含有してもよい。バリアは、埋め込まれた細胞の適切な配置を確実にするために、バリアを撮像可能にする（たとえば、x-線、超音波等によって）造影剤または他の特性を含んでもよい。細胞の埋め込みにとって有用なバリアシステムの例は、その各々の全文が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,226,978号、RE第39,542号（アガロース）、第6,960,351号、第6,916,640号、第6,911,227号（ポリエチレングリコール）、第6,818,018号、第6,808,705号、第6,783,964号、第6,762,959号、第6,727,322号、第6,610,668号（ポリ--14-N-アセチルグルコサミン（p-GlcNAc）多糖類）、第6,558,665号、RE第38,027号、第6,495,161号、第6,368,612号、第6,365,385号、第6,337,008号、第6,306,454号（ポリアルキレン）、第6,303,355号、第6,287,558号（ゲルスーパーマトリクス）、第6,281,015号、第6,264,941号、第6,258,870号、第6,180,007号、第6,126,936号（ポリアミン酸）、第6,123,700号、第6,083,523号、第6,020,200号、第5,916,790号、第5,912,005号、第5,908,623号、第5,902,745号、第5,858,746号、第5,846,530号（多糖類）、第5,843,743号、第5,837,747号、第5,837,234号、第5,834,274号、第5,834,001号、第5,801,033号、第5,800,829号、第5,800,828号、第5,798,113号、第5,788,988号、第5,786,216号、第5,773,286号、第5,759,578号、第5,700,848号、第5,656,481号、第5,653,975号、第5,648,099号、第5,550,178号、第5,550,050号、第4,806,355号、第4,689,293号、第4,680,174号、第4,673,566号、第4,409,331号、第4,352,883号、ならびに米国特許出願公開第2006/0263405号（アルギネート／ポリマー）および第2004/0005302号（アルギネート-ポリ-L-リジン）において記載される。

特定の態様において、本発明において用いるために適したバリアシステムは、マイクロカプセル封入細胞を含む。マイクロカプセル封入は、ビーズ様構造が直径約100〜700μm、たとえば直径約100、200、300、400、500、600、または700μmである、カプセル封入細胞を含むほぼ球形で比較的均一なビーズ様構造を生成する。本発明のマイクロカプセル封入細胞は、先に記載された多様なカプセル封入材料を用いて産生してもよい。1つの態様において、カプセル封入材料はハイドロゲルを含む。もう1つの態様において、カプセル封入材料はポリマーを含む。適したポリマーには、セルロース、たとえば硫酸セルロース、およびアルギネートが含まれるがこれらに限定されるわけではない。たとえば、本発明の1つのマイクロカプセルは、相互作用して物理的選択透過性の膜バリアを形成する多価陰イオンアルギネートおよび多価陽イオンポリマーを含む。マイクロカプセル封入の代替法は、ポリ(L-ラクチド)酸（PLLA）またはポリ-L-オルニチン（PLO）アルギネートマイクロスフェアの形成を含む。たとえば、Darrabie, M.D. et al. Biomaterials 26:6846-6852 (2005)およびBlasi, P. et al. Int J Pharm. 324:27-36 (2006)を参照されたい。アルギネートに基づくマイクロカプセル封入材料は、生体分解性であってもよい超高粘度（UHV）ポリマーをさらに含有してもよい。たとえば、Zimmermann, U. et al. Ann N Y Acad Sci. 944: 199-215 (2001)を参照されたい。

マイクロカプセル封入細胞を含む本発明のバイオリアクターは、典型的に「ビーズ」あたり少なくとも1個〜約1000個の細胞、たとえば本明細書において記載される所望の治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを分泌するように意図された改変または非改変細胞を含む。たとえば、マイクロカプセル封入細胞を含む本発明のバイオリアクターによって、「ビーズ」あたり少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも200個、少なくとも400個、少なくとも500個、少なくとも800個〜約1000個またはそれより多い細胞が得られてもよい。

特定の態様において、本発明において用いるために適したバイオリアクターは、マクロカプセル封入デバイスに閉じこめられた細胞を含む。マイクロカプセル封入細胞を含むバイオリアクターと比較して、マクロカプセル封入デバイスを含むバイオリアクターは典型的により大きく、非球形のカプセル封入細胞実体であることが多く、同じ組成または異なる組成であってもよい、1つまたは複数の合成膜、たとえば1個、2個、3個、4個、8個、10個、またはそれより多い膜で構成されてもよい。名称に表されるように、マクロカプセル封入細胞デバイスは、個々の実体が容易に操作されるような大きさのデバイスである。たとえば、典型的なマクロカプセル封入デバイスは、楕円形状であってもよく、長さが約3 mm、4 mm、5 mm、6 mm、7 mm、8 mm、9 mm、10 mm、またはそれより長く、直径が約1 mm、2 mm、3 mm、4 mm、または5 mmもしくはそれより長くてもよい。本発明の例示的であるが非制限的なマクロカプセル封入デバイスは、長さが約6 mmで直径約1 mmである。

特定の態様において、本発明において用いるために適したマクロカプセル封入デバイスは、治療分子のデバイスの中の移動および環境への散在を調節するために異なる孔径を有する2つまたはそれより多い合成膜を含む。特定の態様において、本発明のマクロカプセル封入デバイスは、半透過性のポリマー外膜と、細胞を支持するための内部足場とを含む。非制限的な例において、外膜は、治療分子の栄養交換を許容するために約15 nmの孔を含む。内部足場は、任意の数の材料を含んでもよい。1つの非制限的な例において、足場は、ポリ(エチレンテレフタレート)ヤーン（Neurotech（www.neurotechusa.com）から入手可能）を含む。

もう1つの非制限的な例において、本発明において用いるために適したマクロカプセル封入デバイスは、内側のより小さな孔の0.45μM PTFE免疫バリア層（Theracyte（www.theracyte.com）から入手可能）の上で薄層を形成する5μmポリ(テトラフルオロエチレン)（PTFE）膜の外層を含む、ポリマー膜二重層を含む。そのようなマクロカプセル封入デバイスは、さらにポリマー膜二重層の外側に不織ポリメッシュ層を含んでもよい。なおもう1つの非制限的な例において、本発明において用いるために適したマクロカプセル封入デバイスは、ポリエーテルスルホン（PES）中空線維で構成される。たとえば、Li, Y., et al. J. Membrane Sci. 245:53-60 (2004)を参照されたい。

本発明において用いるために適したマクロカプセル封入デバイスは任意で、処置される対象に簡便に埋め込みおよび回収できるように追加の構造を含んでもよい。たとえば、マクロカプセル封入デバイスは、縫合クリップ、ローティング口、係留体、または使用を容易にするための他の構造を含んでもよいが、これらに限定されない。

本発明のマクロカプセル封入デバイスの内部空間は、典型的に少なくとも1個〜約10⁵個までの細胞、たとえば所望の治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを分泌するように意図される改変または非改変細胞を含むために適している。たとえば、本発明のマクロカプセル封入デバイスは、少なくとも500個、少なくとも1,000個、少なくとも2,000個、少なくとも4,000個、少なくとも5,000個、少なくとも8,000個〜10,000個、またはそれより多い細胞を含んでもよい。

いくつかのバイオリアクターデバイス、たとえば所望の治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを分泌するように意図される本発明のカプセル封入またはコーティングされた改変または非改変細胞はさらに、バリアまたはカプセル内に保護細胞を含んでもよく、ここで保護細胞は所望の治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを分泌するように意図される改変または非改変細胞に対する保護を提供することができる。そのような保護細胞の非制限的な例には、改変または非改変セルトリ細胞および赤血球が含まれる。加えて、いくつかのバイオリアクターデバイス、たとえば所望の治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを分泌するように意図される本発明のカプセル封入またはコーティングされた改変または非改変細胞は、より適合性のあるまたは保護的な微小環境を作製することができる外部コーティングを含んでもよい。作製されてもよい例示的な非制限的な微小環境には、抗炎症性微小環境および血管新生促進性微小環境が含まれる。

なお他の態様において、本発明のバイオリアクターデバイスには、「安全停止」機序を有する改変細胞が含まれてもよい。たとえば、バイオリアクターに含有される改変細胞は、致死的なポリペプチドをコードする調節された自殺遺伝子を含んでもよく、遺伝子は活性化されると、改変細胞自体の破壊を誘導する。たとえば、改変細胞は、それがバリアシステムから逃れた場合、または腫瘍形成性の変換を受けた場合に、死滅するようにプログラムされてもよい。本発明において用いるために適した致死性のポリペプチドの非制限的な例は、以下により詳細に記載される。

治療法が実行される対象は、処置または予防が望ましい任意の対象であってもよい。たとえば、対象は、疾患、障害、または状態の1つまたは複数の症状を示す対象であってもよい。対象はまた、遺伝学、家族の既往、または環境での曝露により、疾患、障害、または状態に対して素因を有する対象であってもよい。対象は、集団における疾患、障害、または状態に対する予防的免疫の一部として、一般大衆の一員であってもよい。

本発明の方法によって処置または予防される疾患、障害、または状態は、1つまたは複数の治療スイッチプロモーターが利用可能である任意の疾患、障害、または状態であってもよい。本発明の方法によって処置または予防される可能性がある疾患または障害の例には、過剰増殖性疾患、障害、または状態（たとえば、癌）、心血管疾患、障害、または状態、神経疾患、障害、または状態、自己免疫疾患、障害、または状態、骨疾患、障害、または状態、胃腸疾患、障害、または状態、血液疾患、障害、または状態、代謝疾患、障害、または状態、炎症疾患、障害、または状態、および感染性疾患、障害、または状態が含まれるがこれらに限定されるわけではない。

本発明の治療スイッチプロモーターは、特異的疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防するために有用である任意のプロモーターであってもよい。例には、特異的疾患、障害、または状態のあいだに限って発現の増加を示す遺伝子のプロモーター、および特異的細胞条件（たとえば、増殖、アポトーシス、pHの変化、酸化状態、酸素レベル）において発現の増加を示す遺伝子のプロモーターが含まれるがこれらに限定されるわけではない。遺伝子スイッチが転写因子配列を2つ以上含むいくつかの態様において、治療産物が発現する組織を限定するために疾患または状態特異的プロモーターを組織または細胞特異的プロモーターと組み合わせることによって、治療法の特異性を増加させることができる。このように、組織または細胞特異的プロモーターは、治療スイッチプロモーターの定義の中に包含される。

疾患特異的プロモーターの例として、癌を処置するために有用なプロモーターには、腫瘍遺伝子のプロモーターが含まれる。腫瘍遺伝子のクラスの例には、増殖因子、増殖因子受容体、タンパク質キナーゼ、プログラムされた細胞死調節因子および転写因子が含まれるがこれらに限定されるわけではない。腫瘍遺伝子の特異的な例には、sis、erb B、erb B-2、ras、abl、mycおよびbcl-2ならびにTERTが含まれるがこれらに限定されるわけではない。他の癌関連遺伝子の例には、腫瘍関連抗原遺伝子、および新生物細胞において過剰発現する他の遺伝子（たとえば、MAGE-1、癌胎児抗原、チロシナーゼ、前立腺特異抗原、前立腺特異的膜抗原、p53、MUC-1、MUC-2、MUC-4、HER-2/neu、T/Tn、MART-1、gp100、GM2、Tn、sTn、およびトンプソン-フリードライヒ抗原（TF））が含まれる。

当技術分野において公知であり、本発明における治療スイッチプロモーターとして有用であるプロモーター配列および他の調節エレメント（たとえば、エンハンサー）の例は、疾患／障害（表1）または各プロモーターに関連した組織特異性（表2）と共に、表1および2において記載される参考文献において開示される。これらの参考文献において開示されるプロモーター配列は、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。

（表１）

（表２）

特異的疾患または障害の際に発現レベルの変化を示し、ゆえに本発明において有用であるプロモーターを提供する可能性がある他の遺伝子には、表3において（関連する疾患／障害と共に）記載される遺伝子が含まれるがこれらに限定されるわけではない。

（表３）

疾患、障害、または状態の際にモジュレートされる発現パターンを有する遺伝子が同定されたら、該遺伝子のプロモーターを本発明の遺伝子スイッチにおいて用いてもよい。プロモーター領域が含まれる多くの遺伝子の配列が当技術分野において公知であり、公共のデータベース、たとえばGenBankにおいて入手可能である。このように、適当な遺伝子が同定されると、プロモーター配列を容易に同定および得ることができる。本発明のもう1つの局面は、そのプロモーターを単離して遺伝子スイッチの中に入れることができる適した遺伝子を同定することに向けられる。ゆえに、遺伝子の同一性は、プロモーターがその後の状況または環境で単離および用いることができる限り、本発明の特異的態様にとって重要ではない可能性がある。このように、本発明には、まだ同定されていない遺伝子からのプロモーターを用いることが含まれる。適した遺伝子が同定されれば、プロモーター機能にとって必要である遺伝子配列を決定することはルーチンの技術または実験の問題である。実際に、関心対象遺伝子のプロモーター領域の決定において役立ついくつかの市販のプロトコルが存在する。例として、Dingらは、最近、ヒトSprouty4遺伝子の5'隣接配列を段階的に欠失させることによって、新規Sprouty4遺伝子のプロモーター配列を解明した（参照により本明細書に組み入れられる、Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287: L52 (2004)）。簡単に説明すると、転写開始部位が決定された後、5'隣接セグメントのセグメントを非指向的にクローニングするために、一般的なPCRプライマーを用いてPCR断片を生成した。生成されたセグメントをルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングして、ルシフェラーゼ活性を測定して、ヒトSprouty4遺伝子のプロモーター領域を決定した。

遺伝子プロモーターを獲得およびバリデーションするためのプロトコルのもう1つの例には、以下の段階が含まれる：（1）類似／同じ組織タイプの疾患および非疾患細胞／組織試料を獲得する段階；（2）試料から総RNAまたはmRNAを単離する段階；（3）疾患および非疾患RNAの示差マイクロアレイ分析を行う段階；（4）候補となる疾患特異的転写物を同定する段階；（5）疾患特異的転写物に関連するゲノム配列を同定する段階；（6）疾患特異的転写物の予想転写開始部位の上流および下流のDNA配列を獲得または合成する段階；（7）段階6からのDNAの異なる長さを用いてプロモーターレポーターベクターを設計および産生する段階；ならびに（8）患部および被患部細胞／組織のみならず無関係の細胞／組織においてプロモーターレポーターベクターを試験する段階。

遺伝子スイッチに挿入されるプロモーター源は、天然または合成でありえて、プロモーター源は、本明細書において記載される本発明の範囲を制限すべきではない。言い換えれば、プロモーターは細胞から直接クローニングされてもよく、プロモーターは異なる起源から既にクローニングされていてもよく、またはプロモーターは合成されていてもよい。

遺伝子スイッチシステム
遺伝子スイッチは、特異的リガンドの付加または除去によって遺伝子発現を調節する任意の遺伝子スイッチであってもよい。1つの態様において、遺伝子スイッチは、遺伝子発現レベルが、存在するリガンドのレベルに依存するスイッチである。本発明の遺伝子スイッチにおいて用いられてもよいリガンド依存的転写因子複合体の例には、そのそれぞれのリガンドによって活性化される核受容体スーパーファミリーメンバー（たとえば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソン、ならびにその類似体および模倣体）、およびテトラサイクリンによって活性化されるrTTAが含まれるがこれらに限定されるわけではない。本発明の1つの局面において、遺伝子スイッチは、EcRに基づく遺伝子スイッチである。そのようなシステムの例には、米国特許第6,258,603号、第7,045,315号、米国特許出願公開第2006/0014711号、第2007/0161086号、および国際特許出願公開WO 01/70816において記載されるシステムが含まれるがこれらに限定されるわけではない。キメラエクジソン受容体システムの例は、その各々の全文が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,091,038号、米国特許出願公開第2002/0110861号、第2004/0033600号、第2004/0096942号、第2005/0266457号、および第2006/0100416号、ならびに国際特許出願公開WO 01/70816、WO 02/066612、WO 02/066613、WO 02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075、およびWO 2005/108617において記載される。非ステロイド性エクジソンアゴニスト調節システムの例は、RheoSwitch（登録商標）哺乳動物誘導型発現系（New England Biolabs, Ipswich, MA）である。本発明のもう1つの局面において、遺伝子スイッチは、FK506結合タンパク質（FKBP）とFKBPラパマイシン関連タンパク質（FRAP）とのヘテロ二量体形成に基づき、ラパマイシンまたはその非免疫抑制類似体を通して調節される。そのような系の例には、ARGENT（商標）転写技術（ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, MA）、および米国特許第6,015,709号、第6,117,680号、第6,479,653号、第6,187,757号、および第6,649,595号において記載される系が含まれるがこれらに限定されるわけではない。

1つの態様において、遺伝子スイッチは、治療スイッチプロモーターの制御下にリガンド依存的転写因子複合体をコードする1つの転写因子配列を含む。転写因子配列は、天然に存在するまたは人工のリガンド依存的転写因子複合体であるリガンド依存的転写因子複合体をコードしてもよい。人工転写因子は、転写因子の天然の配列が、たとえば配列の変異によって、または異なる転写因子からのドメインを組み合わせることによって変更されている転写因子である。1つの態様において、転写因子はグループH核受容体リガンド結合ドメインを含む。1つの態様において、グループH核受容体リガンド結合ドメインは、エクジソン受容体、汎存受容体（UR）、オーファン受容体1（OR-1）、ステロイドホルモン核受容体1（NER-1）、レチノイドX受容体相互作用タンパク質-15（RIP-15）、肝X受容体β（LXRβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（RLD-1）、肝X受容体（LXR）、肝X受容体α（LXRα）、ファルネソイドX受容体（FXR）、受容体相互作用タンパク質14（RIP-14）、またはファルネソル受容体（HRR-1）からのドメインである。もう1つの態様において、グループH核受容体LBDは、エクジソン受容体に由来する。

A．エクジソンに基づく遺伝子スイッチ
EcRおよび他のグループH核受容体は、全てのメンバーが、任意でヘテロ二量体化パートナー（HP）に融合して共活性化タンパク質（CAP）を形成するアミノ末端トランス活性化ドメイン（AD、互換的に「TA」または「TD」とも呼ばれる）、DNA結合ドメイン（DBD）、およびヒンジ領域を通してDBDに融合してリガンド依存的転写因子（LTF）を形成するLBDの存在を特徴とする、核受容体スーパーファミリーメンバーである。本明細書において用いられるように、「DNA結合ドメイン」という用語は、DNA結合ドメインが特定の応答エレメントに結合するように機能する限り、DNA結合タンパク質の最小ポリペプチド配列から、DNA結合タンパク質の完全長までを含む。核受容体スーパーファミリーメンバーはまた、4個または5個のドメインの存在を特徴とする：A/B、C、D、E、およびいくつかのメンバーにおいてF（US 4,981,784およびEvans, Science 240:889 (1988)を参照されたい）。「A/B」ドメインは、トランス活性化ドメインに対応して、「C」はDNA結合ドメインに対応し、「D」はヒンジ領域に対応し、および「E」は、リガンド結合ドメインに対応する。いくつかのファミリーメンバーは、「F」に対応するLBDのカルボキシ末端側にもう1つのトランス活性化ドメインを有してもよい。

以下のポリペプチド配列は、エクジソン受容体（エクジステロイド受容体）（20-ヒドロキシ-エクジソン受容体）（20E受容体）（EcRH）（核受容体スーパーファミリー1グループHメンバー1）のポリペプチド配列として報告され、Genbankにおいてアクセッション番号P34021を有する。

ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）（ショウジョウバエ）からのエクジソン受容体（アミノ酸878個）（SEQ ID NO:5）

DBDは、応答エレメントに対する特異性を付与する2つのアミノ酸モチーフ、すなわちP-ボックスおよびD-ボックスのあいだに2つのシステイン亜鉛フィンガーが存在することを特徴とする。これらのドメインは、異種受容体タンパク質の様々なドメインの天然型、改変型またはキメラであってもよい。核受容体ファミリーのサブセットのようなEcRはまた、ヘテロ二量体化特性の原因であるあまり定義されていない領域も保有する。核受容体のドメインは天然においてモジュールであることから、LBD、DBD、およびADは相互交換されてもよい。

もう1つの態様において、転写因子は、AD、その発現がモジュレートされる治療タンパク質または治療ポリヌクレオチドに関連する応答エレメントを認識するDBD、およびグループH核受容体LBDを含む。特定の態様において、グループH核受容体LBDは置換変異を含む。

もう1つの態様において、遺伝子スイッチは、第一の治療スイッチプロモーター（TSP-1）の制御下に第一の転写因子配列、たとえばCAPを、および第二の治療スイッチプロモーター（TSP-2）の制御下に第二の転写因子配列、たとえばLTFを含み、該第一の転写因子配列および第二の転写因子配列にコードされるタンパク質は相互作用してタンパク質複合体（LDTFC）、すなわち「二重スイッチ」または「2ハイブリッド」に基づく遺伝子スイッチを形成する。第一および第二のTSPは同じでも異なってもよい。この態様において、治療分子発現にとって必要である遺伝子スイッチにおける2つの異なるTSPの存在は、治療法の特異性を増強する（図2を参照されたい）。図2はまた、適当なTSPを挿入するだけで、任意の疾患、障害、または状態を処置するために治療遺伝子スイッチを改変できることを証明する。

さらなる態様において、第一および第二の転写因子配列、たとえばCAPまたはLTFは1つの治療スイッチプロモーターの制御下に存在する（たとえば、図1におけるTSP-1）。このプロモーターの活性化により、1つのオープンリーディングフレームでCAPとLTFの双方が生成される。これは、IRES（リボソーム内部進入部位）などの転写リンカーを用いることによって達成されうる。この態様において、リガンド依存的転写因子複合体の双方の部分は、TSP-1の活性化の際に合成されるであろう。TSP-1は、構成的プロモーターでありうるか、または疾患、障害、もしくは状態に関連する条件下に限って活性化されうる。

さらなる態様において、1つの転写因子配列、たとえばLTFは疾患、障害、もしくは状態に関連する条件下に限って活性化される治療スイッチプロモーター（たとえば、図4におけるTSP-2またはTSP-3）の制御下に存在して、他の転写因子配列、たとえばCAPは構成的治療スイッチプロモーター（たとえば、図4におけるTSP-1）の制御下に存在する。この態様において、リガンド依存的転写因子複合体の1つの部分は構成的に存在するが、第二の部分は疾患、障害、もしくは状態に関連する条件下に限って合成されるであろう。

もう1つの態様において、1つの転写因子配列、たとえばCAPは第一のTSP（たとえば、図3におけるTSP-1）の制御下に存在して、2つまたはそれより多い異なる第二の転写因子配列、たとえばLTF-1およびLTF-2は異なるTSP（たとえば、図3におけるTSP-2およびTSP-3）の制御下に存在する。この態様において、LTFの各々は、異なる因子調節プロモーター配列を認識する異なるDBD（たとえば、DBD-Aは、因子調節プロモーター-1（FRP-1）に結合する応答エレメントに結合して、DBD-Bは因子調節プロモーター-2（FRP-2）に結合する応答エレメントに結合する）を有してもよい。因子調節プロモーターのそれぞれは、異なる治療遺伝子に機能的に連結してもよい。このようにして、多数の処置を同時に提供してもよい。

1つの態様において、第一の転写因子配列は、AD、発現がモジュレートされる治療産物配列に結合する応答エレメントを認識するDBD、およびグループH核受容体LBDを含むポリペプチドをコードして、第二の転写因子配列は、脊椎動物レチノイドX受容体（RXR）、無脊椎動物RXR、ウルトラスピラクルタンパク質（USP）からなる群より選択される核受容体LBD、または脊椎動物RXR、無脊椎動物RXRおよびUSPからなる群より選択される少なくとも2つの異なる核受容体リガンド結合ドメインポリペプチド断片を含むキメラ核受容体を含む転写因子をコードする（WO 01/70816 A2およびUS 2004/0096942 Alを参照されたい）。「パートナー」核受容体リガンド結合ドメインはさらに、切断変異、欠失変異、置換変異、またはもう1つの改変を含んでもよい。

もう1つの態様において、遺伝子スイッチは、核受容体LBDおよびその発現がモジュレートされる治療産物配列に結合する応答エレメントを認識するDBDを含む第一のポリペプチドをコードする第一の転写因子配列、および核受容体LBDの1つがグループH核受容体LBDである、ADと核受容体LBDとを含む第二のポリペプチドをコードする第二の転写因子配列を含む。好ましい態様において、第一のポリペプチドは、ADを実質的に含まず、第二のポリペプチドはDBDを実質的に含まない。本発明の目的に関して、「実質的に含まない」とは、当該タンパク質が活性化または結合活性を提供するために十分な当該ドメインの配列を含有しないことを意味する。

本発明のもう1つの局面において、第一の転写因子配列は、ヘテロ二量体化パートナーとADとを含むタンパク質（「CAP」）をコードして、第二の転写因子配列はDBDとLBDとを含むタンパク質（「LTF」）をコードする。

唯一の核受容体LBDがグループH LBDである場合、他の核受容体LBDはグループH LBDと二量体を形成する任意の他の核受容体に由来してもよい。たとえば、グループH核受容体LBDがEcR LBDである場合、他の核受容体LBD「パートナー」はEcR、脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR、ウルトラスピラクルタンパク質（USP）からのパートナーであってよく、または脊椎動物RXR、無脊椎動物RXRおよびUSPからなる群より選択される少なくとも2つの異なる核受容体LBDポリペプチド断片を含むキメラ核受容体からのパートナーであってもよい（その全文が参照により本明細書に組み入れられる、WO 01/70816 A2、国際特許出願公開PCT/US02/05235およびUS 2004/0096942 Alを参照されたい）。「パートナー」核受容体リガンド結合ドメインはさらに、切断変異、欠失変異、置換変異、またはもう1つの改変を含んでもよい。

1つの態様において、脊椎動物RXR LBDは、ヒト（Homo sapiens）、マウス（Mus musculus）、ラット（Rattus norvegicus）、ニワトリ（Gallus gallus）、ブタ（Sus scrofa domestica）、ツメカエル（Xenopus laevis）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）、ホヤ（Polyandrocarpa misakiensis）、またはクラゲ（Tripedalia cysophora）のRXRに由来する。

1つの態様において、無脊椎動物RXRリガンド結合ドメインは、バッタ（Locusta migratoria）ウルトラスピラクルポリペプチド（「LmUSP」）、マダニ（Amblyomma americanum）RXR相同体1（「AmaRXR1」）、マダニRXR相同体2（「AmaRXR2」）、シオマネキ（Celuca pugilator）RXR相同体（「CpRXR」）、ゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）RXR相同体（「TmRXR」）、ミツバチ（Apis mellifera）RXR相同体（「AmRXR」）、アリマキ（Myzus persicae）RXR相同体（「MpRXR」）、または非双翅目／非鱗翅目RXR相同体からのドメインである。

1つの態様において、キメラRXR LBDは、脊椎動物種RXRポリペプチド断片、無脊椎動物種RXRポリペプチド断片、および非双翅目／非鱗翅目無脊椎動物種RXR相同体ポリペプチド断片からなる群より選択される少なくとも2つのポリペプチド断片を含む。本発明において用いるためのキメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも2つの異なる種のRXRポリペプチド断片を含んでもよく、または種が同じである場合、2つもしくはそれより多いポリペプチド断片は、種のRXRポリペプチド断片の2つまたはそれより多い異なるイソ型に由来してもよい。

1つの態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動物種RXRポリペプチド断片と、1つの無脊椎動物種RXRポリペプチド断片とを含む。

もう1つの態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動物種RXRポリペプチド断片と、1つの非双翅目／非鱗翅目無脊椎動物種RXR相同体ポリペプチド断片とを含む。

リガンドを核受容体のLBDと組み合わせた場合、次に治療産物配列に関連するFRPの応答エレメントに結合して、治療産物配列の発現の外部一時的調節を提供する。本発明の様々な成分が互いに結合する結合機序または順序、たとえばリガンドからLBD、DBDから応答エレメント、ADからプロモーター等は重要ではない。

特異的な例において、グループH核受容体のLBDおよびその核受容体LBDパートナーに対するリガンドの結合は、治療産物配列の発現を可能にする。この機序は、グループH核受容体（GHNR）またはそのパートナーに対するリガンド結合の可能性、および得られた活性なホモ二量体複合体の形成（たとえば、GHNR＋GHNRまたはパートナー＋パートナー）を除外しない。好ましくは、受容体ドメインの1つまたは複数を変化させて、ハイブリッド遺伝子スイッチを産生する。典型的に、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合、および特異的応答エレメントの認識に関して、選ばれた宿主細胞または生物においてハイブリッド遺伝子および得られるハイブリッドタンパク質が最適化されるように、DBD、LBD、およびADの3つのドメインのうち1つまたは複数を他のドメイン源とは異なる起源から選んでもよい。加えて応答エレメント自体は、酵母由来のGAL-4タンパク質（Sadowski et al., Nature 335:563 (1988)を参照されたい）、もしくは大腸菌由来のLexAタンパク質（Brent et al., Cell 43:729 (1985)を参照されたい）などの他のDNA結合タンパク質ドメインに関する応答エレメントによって、またはハイブリッド受容体に適合させるためにそのような特異的相互作用のために設計、改変、および選択されたタンパク質との標的化相互作用にとって特異的な合成応答エレメント（たとえば、Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1997)を参照されたい）によって、改変または置換されうる。2-ハイブリッド系のもう1つの長所は、それらが、所望の最終結果に従って遺伝子発現を駆動するために用いられるプロモーターの選択を許容する点である。そのような二重制御は、遺伝子治療の領域において、特に細胞障害性タンパク質が産生される場合には、発現の時期のみならず発現が起こる細胞の双方が制御される可能性があることから、特に重要である可能性がある。適したプロモーターに機能的に連結された遺伝子を対象の細胞に導入すると、外因性の遺伝子の発現は、本発明のシステムの存在によって制御される。プロモーターは、構成的もしくは誘導的に調節されてもよく、または組織特異的（すなわち、特定の細胞タイプに限って発現する）もしくは生物の一定の発達段階に対して特異的であってもよい。

第一のハイブリッドタンパク質のDNA結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下で、応答エレメントのDNA配列に結合して、この応答エレメントの調節下で下流の遺伝子の転写を開始または抑制する。

機能的LDTFC、たとえばEcR複合体にはまた、イムノフィリンなどの追加のタンパク質が含まれてもよい。転写因子（DHR38またはβFTZ-1など）として知られる核受容体ファミリーのタンパク質の追加のメンバーはまた、EcR、USP、および／またはRXRのリガンド依存的または非依存的なパートナーであってもよい。加えて、共活性化因子（同様にアダプターまたはメディエータとも呼ばれる）として一般的に知られるタンパク質などの他の共因子を必要としてもよい。これらのタンパク質は、DNAに配列特異的に結合せず、基礎転写に関係しない。それらは、活性化因子のDNA結合の刺激、染色質構造に影響を及ぼすことによって、または活性化因子開始複合体相互作用を媒介することが含まれる様々な機序を通して、転写活性化に対してその効果を発揮する可能性がある。そのような共活性化因子の例には、RIP 140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIPのみならず雑多な共活性化因子C応答エレメントB結合タンパク質、CBP/p300が含まれる（論評に関しては、Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:222 (1997)を参照されたい）。同様に、一般的に共抑制因子（リプレッサー、サイレンサー、またはサイレンシングメディエータとしても知られる）として知られるタンパク質共因子は、リガンドの非存在下で転写活性化を有効に阻害するために必要である可能性がある。これらの共抑制因子は、応答エレメントの活性を沈黙化するために非リガンド結合EcRと相互作用してもよい。現在の証拠は、リガンドの結合が受容体のコンフォメーションを変化させて、その結果共抑制因子の放出および上記の共活性化因子の動員が起こり、それによってその沈黙化活性を完全に破壊することを示唆している。共抑制因子の例には、N-CoRおよびSMRTが含まれる（論評に関しては、Horwitz et al., Mol Endocrinol. 10:1167 (1996)を参照されたい）。これらの共因子は細胞もしくは生物内で内因性であってもよく、または調節されてもしくは調節されずに発現するトランスジーンとして外因性に加えられてもよい。

B．ラパマイシンに基づく遺伝子スイッチ
本発明は、さらにリガンド依存的転写因子複合体としてFK506結合タンパク質を、およびリガンドとしてラパマイシンを利用する遺伝子スイッチシステムを提供する。1つの態様において、遺伝子スイッチをコードする構築物は、以下を含む：
（a）ラパマイシンまたはその類似体に結合し、かつ少なくとも1つのFK506結合タンパク質（FKBP）ドメインとそれに対して異種の少なくとも1つのタンパク質ドメインとを含む、第一のキメラタンパク質をコードする第一のポリヌクレオチドであって、FKBPドメインが、
（1）天然に存在するFKBP、
（2）アミノ酸残基10個までが欠失、挿入、または置換アミノ酸に交換されている、天然に存在するFKBPの変種、および
（3）（1）または（2）のFKBPをコードするDNA配列に選択的にハイブリダイズするDNA配列にコードされるFKBP
から選択されるペプチド配列を含む、第一のポリヌクレオチド；
（b）（a）ラパマイシンまたはラパマイシン類似体および（b）第一のキメラタンパク質の双方と複合体を形成し、かつ少なくとも1つのFKBP：ラパマイシン結合（FRB）ドメインとそれに対して異種である少なくとも1つのタンパク質ドメインとを含む、第二のキメラタンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドであって、FRBドメインが、
（4）天然に存在するFRBドメイン；
（5）アミノ酸残基10個までが欠失、挿入、または置換アミノ酸に交換されている、天然に存在するFRBドメインの変種；および
（6）（4）または（5）のFRBをコードするDNA配列に選択的にハイブリダイズするDNA配列にコードされるFRBドメイン
から選択されるペプチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド。

この遺伝子スイッチシステムにおいて、第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドの各々は、本明細書において他所で記載されている1つまたは複数の治療スイッチプロモーターの制御下に存在する。さらに、特定の態様において、第一および第二のキメラタンパク質におけるFKBPおよび／またはFRBドメインに対して異種である少なくとも1つのタンパク質ドメインは、1つまたは複数の「作用」または「エフェクター」ドメインであってもよい。エフェクタードメインは、DNA結合ドメイン、転写活性化ドメイン、細胞局在化ドメイン、およびシグナル伝達ドメインが含まれる広く多様なタンパク質ドメイン（すなわち、クラスタ形成または多量体形成時に、細胞の生育、増殖、分化、アポトーシス、遺伝子転写等を誘発することができるドメイン）から選択されてもよい。

特定の態様において、1つの融合タンパク質は、少なくとも1つのDNA結合ドメイン（たとえば、GAL4またはZFHD1 DNA結合ドメイン）を含有し、もう1つの融合タンパク質は、少なくとも1つの転写活性化ドメイン（たとえば、VP16またはp65転写活性化ドメイン）を含有する。融合タンパク質のリガンド媒介結合は、転写因子複合体の形成を表し、融合タンパク質の1つにおけるDNA結合ドメインによって認識される（すなわち結合することができる）DNA配列に連結した標的遺伝子の転写の開始に至る。遺伝子発現系のみならずリガンドに関する情報は、米国特許第6,187,757号B1、第6,649,595号B1、第6,509,152号B1、第6,479,653号B1、および第6,117,680号B1において開示されている。

他の態様において、本発明は、（a）第一の融合タンパク質が、選択されたリガンドに結合する条件的凝集ドメインと転写活性化ドメインとを含み、（b）第二の融合タンパク質が、選択されたリガンドに結合する条件的凝集ドメインとDNA結合ドメインとを含み、および（c）リガンドの非存在下で、該DNA結合ドメインが結合する調節DNAに機能的に連結する遺伝子を細胞が発現する、リガンドの非存在下で自己凝集する2つの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子スイッチシステムを提供する。遺伝子スイッチシステムを含む改変細胞は、リガンドの存在下で、遺伝子の抑制のために十分な量で拡大される。リガンドの除去は、細胞死を引き起こすコードされたタンパク質の発現を誘導する。2つの融合タンパク質をコードする核酸は、少なくとも1つの条件的プロモーターの制御下に存在する。条件的凝集ドメインを利用する遺伝子発現システムは、米国特許出願公開第2002/0048792号において開示されている。

C．原核細胞リプレッサー／オペレーターに基づく遺伝子スイッチシステム
1つの態様において、本発明は、（a）原核細胞テトラサイクリン（「tet」）リプレッサーと真核細胞転写活性化因子タンパク質ドメインとを含むトランス活性化因子融合タンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド；および（b）最小プロモーターおよび少なくとも1つのtetオペレーター配列に機能的に連結する、治療タンパク質または治療ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、を含む、遺伝子スイッチシステムを提供する。トランス活性化因子融合タンパク質をコードする第一のポリヌクレオチドは、本明細書において他所で記載されているように治療スイッチプロモーターを含んでもよい。致死タンパク質の発現はテトラサイクリンの非存在下でアップレギュレートされる（たとえば、Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5547-5551；Gossen et al. (1993) TIBS 18 : 471-475；Furth et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci 91 : 9302-9306；およびShockett et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 6522-6526を参照されたい）。TetO発現システムは、米国特許第5,464,758号B1において開示されている。

もう1つの態様において、遺伝子スイッチシステムは、細菌である大腸菌由来の乳糖（「Lac」）リプレッサー-オペレーターシステムを含む。本発明の遺伝子スイッチシステムはまた、（a）原核細胞lac Iリプレッサーと真核細胞転写活性化因子タンパク質ドメインとを含むトランス活性化因子融合タンパク質をコードする第一のヌクレオチド；および（b）治療スイッチプロモーターに機能的に連結した、治療タンパク質または治療ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、を含んでもよい。Lacシステムにおいて、lacオペロンは、乳糖、またはイソプロピル-b-D-チオガラクトシドなどの合成類似体の非存在下で不活化される。

追加の遺伝子スイッチシステムには、以下において記載されるシステムが含まれる：US 7,091,038；WO2004078924；EP1266015；US20010044151；US20020110861；US20020119521；US20040033600；US20040197861；US20040235097；US20060020146；US20040049437；US20040096942；US20050228016；US20050266457；US20060100416；WO2001/70816；WO2002/29075；WO2002/066612；WO2002/066613；WO2002/066614；WO2002/066615；WO2005/108617；US 6,258,603；US20050209283；US20050228016；US20060020146；EP0965644；US 7,304,162；US 7,304,161；MX234742；KR10-0563143；AU765306；AU2002-248500；およびAU2002-306550。

D．遺伝子スイッチシステムの組み合わせ
本発明は、2つまたはそれより多い遺伝子スイッチシステムが第一の遺伝子スイッチと第二の遺伝子スイッチとを含み、その双方が1つまたは複数のリガンドに結合すると、1つまたは複数の治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を選択的に誘導する、1つまたは複数のリガンドの有効量によって活性化される異なるリガンド依存的転写因子複合体を含む2つまたはそれより多い遺伝子スイッチシステムを含む、核酸組成物、改変細胞、およびバイオリアクターを提供する。いかなる数および／または組み合わせの遺伝子スイッチシステムも本発明の範囲に含まれる。

1つの態様において、本発明は、以下を含む核酸組成物を提供する：
（c）以下を含む第一の遺伝子スイッチシステム：
i．
1．治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合した因子調節プロモーターを活性化するトランス活性化ドメイン；および
2．ヘテロ二量体パートナードメイン
を含む第一のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、第一の遺伝子発現カセット、
ii．
1．治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合する因子調節プロモーターを認識するDNA結合ドメイン；および
2．リガンド結合ドメイン
を含む第二のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、第二の遺伝子発現カセット、ならびに
iii．
1．第二のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化される因子調節プロモーター；および
2．治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド
を含む治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む、第三の遺伝子発現カセット；ならびに
b．以下を含む、第二の遺伝子発現システム：
i．
1．治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合した因子調節プロモーターを活性化するトランス活性化ドメイン；および
2．ヘテロ二量体パートナードメイン
を含む第一のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、第一の遺伝子発現カセット、
ii．
1．治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合した因子調節プロモーターを認識するDNA結合ドメイン；および
2．リガンド結合ドメイン
を含む第二のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、第二の遺伝子発現カセット、ならびに
iii．
1．第二のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化される因子調節プロモーター；および
2．治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド
を含む治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む、第三の遺伝子発現カセット。

多数の誘導可能な遺伝子発現システムは、異なる疾患、障害、もしくは状態に関連する条件下で所定の治療ポリヌクレオチドまたは治療ポリペプチドの発現、または同じ疾患、障害、もしくは状態に関連する同じ条件下で、または異なる疾患、障害、もしくは状態に関連する異なる条件下で、多数の治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を提供する。

特定の態様において、2つまたはそれより多い遺伝子スイッチシステムの組み合わせは、（1）二重スイッチエクジソン受容体に基づく遺伝子発現システムおよび（2）単スイッチエクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチ、であってもよい。他の態様において、組み合わせは、（1）単または二重スイッチエクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチと、（2）ラパマイシンに基づく遺伝子スイッチであってもよい。または、遺伝子スイッチシステムの組み合わせは、先に開示された2つの同一のラパマイシンに基づく遺伝子スイッチシステムであってもよい。遺伝子スイッチシステムの任意の可能性がある組み合わせが本発明の範囲に含まれる。

リガンド
本発明のリガンド依存的転写因子複合体のリガンドは、リガンド結合ドメイン、ヘテロ二量体パートナードメイン、DNA結合ドメイン、およびトランス活性化ドメインの1つまたは複数を含むタンパク質複合体に結合する。リガンド依存的転写因子複合体を活性化するためのリガンドの選択は、利用される遺伝子スイッチのタイプに依存する。

たとえば、エクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチのリガンドは、任意の適したリガンドから選択されてもよい。天然に存在するエクジソンまたはエクジソン類似体（たとえば、20ヒドロキシエクジソン、ムリステロンA、ポナステロンA、ポナステロンB、ポナステロンC、26-ヨードポナステロンA、イノコステロン、または26-メシルイノコステロン）および非ステロイド性誘発剤の双方を、本発明の遺伝子スイッチのリガンドとして用いてもよい。米国特許第6,379,945号Blは、ステロイド性および一定の非ステロイド性誘発剤の双方に対して応答性の遺伝子スイッチとして作用することができる、ヘリオチス・ビレッセンス（Heliothis virescens）から単離された昆虫ステロイド受容体（「HEcR」）を記載している。非ステロイド性誘発剤は、ステロイド性および非ステロイド性誘発剤の双方に対して応答性であるこのシステムおよび多くの他のシステムにおいて、たとえば製造コストの低さ、代謝的安定性、昆虫、植物、または哺乳動物に存在しないこと、および環境的容認性を含む多様な理由から、ステロイドに対して明確な長所を有する。米国特許第6,379,945号Blは、エクジソンに基づく遺伝子スイッチのためのリガンドとして、2つのジベンゾイルヒドラジン、すなわち1,2-ジベンゾイル-1-tert-ブチル-ヒドラジンおよびテブフェノジド（N-(4-エチルベンゾイル)-N'-(3,5-ジメチルベンゾイル)-N'-tert-ブチル-ヒドラジン）の有用性を記載している。同様に、米国特許第5,117,057号B1において開示されるヒドラジンなどの他のジベンゾイルヒドラジンも本発明においてリガンドとして含まれる。テブフェノジドを、ショウジョウバエのエクジソン受容体に関する化学リガンドとして用いることも同様に、米国特許第6,147,282号において開示されている。エクジソンリガンドの追加の非制限的な例は、3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ-N-イソブチル-ベンズアミド、8-O-アセチルハルパジド、1,2-ジアシルヒドラジン、N'-置換-N,N'-ジ置換ヒドラジン、ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、N-置換-N-アルキル-N,N-ジアロイルヒドラジン、N-置換-N-アシル-N-アルキル、カルボニルヒドラジン、またはN-アロイル-N'-アルキル-N'-アロイルヒドラジンである（米国特許第6,723,531号を参照されたい）。

1つの態様において、エクジソンに基づく遺伝子スイッチシステムのリガンドは、ジアシルヒドラジンリガンドまたはキラルジアシルヒドラジンリガンドである。遺伝子スイッチシステムにおいて用いられるリガンドは式Iの化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、結晶型、もしくは無定形型であってもよい：

式中、
Aは、アルコキシ、アリールアルキルオキシ、またはアリールオキシであり；
Bは、置換されてもよいアリールまたは置換されてもよいヘテロアリールであり；および
R¹およびR²は独立して、置換されてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルケニル、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいヘテロシクロ、置換されてもよいアリール、または置換されてもよいヘテロアリールである。

もう1つの態様において、リガンドは式IIのエナンチオマー濃縮化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、結晶型、もしくは無定形型であってもよい：

式中、
Aは、アルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、置換されてもよいアリール、または置換されてもよいヘテロアリールであり；
Bは、置換されてもよいアリールまたは置換されてもよいヘテロアリールであり；および
R¹およびR²は独立して、置換されてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルケニル、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいヘテロシクロ、置換されてもよいアリール、または置換されてもよいヘテロアリールであり；ただしR¹はR²と等しくなく；
R¹およびR²を担う不斉炭素原子での絶対立体配置は、主にSである。

特定の態様において、リガンドは、式IIIのエナンチオマー濃縮化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、結晶型、もしくは無定形型であってもよい：

式中、
Aは、アルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、置換されてもよいアリールまたは置換されてもよいヘテロアリールであり；
Bは、置換されてもよいアリール、または置換されてもよいヘテロアリールであり；および
R¹およびR²は独立して、置換されてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルケニル、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいヘテロシクロ、置換されてもよいアリール、または置換されてもよいヘテロアリールであり、ただし、R¹はR²に等しくなく；
R¹およびR²を担う不斉炭素原子での絶対立体配置は、主にRである。

1つの態様において、リガンドは、少なくとも95％エナンチオマー過剰を有する(R)-3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N'-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、またはその薬学的に許容される塩、水和物、結晶型、もしくは無定形型であってもよい。

式Iのジアシルヒドラジンリガンドおよび式IIまたはIIIのキラルジアシルヒドラジンリガンドは、エクジソンに基づく遺伝子スイッチシステムと共に用いられる場合、本発明の治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現の外部一時調節のための手段を提供する。

本発明において用いられるリガンドは、塩を形成してもよい。本明細書において用いられる「塩」という用語は、無機および／または有機酸および塩基によって形成された酸性および／または塩基性塩を示す。加えて、式I、II、またはIIIの化合物が塩基性部分と酸性部分の双方を含有する場合、両性イオン（「内塩」）を形成してもよく、それらも本明細書において用いられるように「塩」という用語に含まれる。薬学的に許容される（すなわち、非毒性の生理学的に許容される）塩が用いられるが、他の塩も同様に、たとえば調製の際に使用される可能性がある単離または精製段階において有用である。式I、II、またはIIIの化合物の塩は、たとえば化合物を、その中で塩が沈殿する培地またはその後に凍結乾燥を行う水性培地などの培地において等量などの酸または塩基の量と反応させることによって形成されてもよい。

塩基性部分を含有するリガンドは、多様な有機および無機酸と塩を形成してもよい。例示的な酸付加塩には、酢酸塩（酢酸またはトリハロ酢酸、たとえばトリフルオロ酢酸によって形成された塩などの）、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、カンフル酸塩、カンフルスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩（塩酸によって形成される）、臭化水素酸塩（臭化水素によって形成される）、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩（マレイン酸によって形成される）、メタンスルホン酸塩（メタンスルホン酸によって形成される）、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩（硫酸によって形成された塩など）、スルホン酸塩（本明細書において先に言及した塩など）、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレートなどのトルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩等などが含まれる。

酸性部分を含有するリガンドは、多様な有機および無機塩基と塩を形成してもよい。例示的な塩基性塩には、アンモニウム塩、ナトリウム、リチウム、およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ベンザチン、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラバミン（N,N-ビス(デヒドロアビエチル)エチレンジアミンによって形成される）、N-メチル-D-グルカミン、N-メチル-D-グルカミド、t-ブチルアミンなどの有機塩基（たとえば、有機アミン）との塩、ならびにアルギニン、リジン等などのアミノ酸との塩が含まれる。

FK506結合ドメインを利用する誘導型遺伝子発現システムのためのリガンドの非制限的な例は、FK506、シクロスポリンA、またはラパマイシンである。FK506、ラパマイシンおよびその類似体は、米国特許第6,649,595号B2および第6,187,757号において開示されている。同様に、米国特許第7,276,498号および第7,273,874号を参照されたい。

本明細書において記載されるリガンドは、単独で、または薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物の一部として投与されてもよい。1つの態様において、薬学的組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル剤、軟膏、エリキシル剤、または注射用組成物の剤形である。

薬学的組成物
薬学的に許容される担体には、たとえば乳糖または蔗糖などの糖類、マンニトールまたはソルビトール、セルロース調製物、および／またはリン酸カルシウム、たとえばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウムなどの増量剤のみならず、たとえばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプンを用いるデンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドンなどの結合剤が含まれる。望ましければ、上記のデンプンおよび同様にカルボキシメチル-デンプン、クロスリンクしたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を加えてもよい。補助剤は、流れを調節する物質および潤滑剤、たとえばシリカ、タルク、ステアリン酸、またはステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムなどのその塩、および／またはポリエチレングリコールである。1つの態様において、望ましければ胃液耐性のある適したコーティングを有する糖衣錠コアが提供される。この目的のために、任意でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適した有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい濃縮糖類溶液を用いてもよい。胃液耐性のコーティングを産生するために、フタル酸アセチルセルロースまたはフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの適したセルロース調製物の溶液を用いる。たとえば活性化合物の用量の組み合わせを同定するため、または特徴決定するために、染料原料または顔料も同様に、錠剤または糖衣錠コーティングに加えてもよい。

経口で用いることができる他の薬学的調製物には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセルのみならず、ゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で作出された軟密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、顆粒またはナノ粒子の形状で活性化合物を含有することができ、これを乳糖などの増量剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意で安定化剤と混合してもよい。1つの態様において、これは、任意で安定化剤と共に、脂肪油または液体パラフィンなどの適した液体に溶解または懸濁される。

脂肪油は、モノ-、ジ-、またはトリグリセリドを含んでもよい。モノ-、ジ-、およびトリグリセリドには、C₆、C₈、C₁₀、C₁₂、C₁₄、C₁₆、C₁₈、C₂₀、およびC₂₂酸に由来するものが含まれる。例示的なジグリセリドには、特にジオレイン、ジパルミトレイン、および混合カプリリン-カプリンジグリセリドが含まれる。トリグリセリドには、植物油、魚油、動物脂肪、水素添加植物油、部分的水素添加植物油、合成トリグリセリド、改変トリグリセリド、分画トリグリセリド、中鎖および長鎖トリグリセリド、構造トリグリセリド、およびその混合物が含まれる。例示的なトリグリセリドには；アーモンド油；ババスー油；ルリヂサ油；黒スグリ油；キャノーラ油；ヒマシ油；ココナツ油；コーン油；綿実油；マツヨイグサ油；ブドウ種油；アメリカホドイモ油；カラシ種油；オリーブ油；ヤシ油；ヤシカーネル油；落花生油；菜種油；紅花油；ゴマ油；サメ肝油；大豆油；ヒマワリ油；硬化ヒマシ油；硬化ココナツ油；硬化ヤシ油；硬化大豆油；硬化植物油；硬化綿実およびヒマシ油；部分硬化大豆油；部分硬化大豆綿実油；トリカプロン酸グリセリル；トリカプリル酸グリセリル；トリカプリン酸グリセリル；トリウンデカン酸グリセリル；トリラウリン酸グリセリル；トリオレイン酸グリセリル；トリリノール酸グリセリル；トリリノレン酸グリセリル；トリカプリル酸／カプリン酸グリセリル；トリカプリル酸／カプリン酸／ラウリン酸グリセリル；トリカプリル酸／カプリン酸／リノール酸グリセリル；およびトリカプリル酸／カプリン酸／ステアリン酸グリセリルが含まれる。

1つの態様において、トリグリセリドは、商品名LABRAFAC CCとして市販されている中鎖トリグリセリドである。他のトリグリセリドには、中性油、たとえば中性植物油、特に製品MIGLYOL 810；MIGLYOL 812；MIGLYOL 818が含まれる商品名MI0GLYOLとしておよびCAPTEX 355として公知で市販されている分画ココナツ油が含まれる。他のトリグリセリドは、製品MYRITOL 813が含まれる商品名MYRITOLとして公知で市販されているカプリル酸-カプリン酸トリグリセリドである。このクラスのさらなるトリグリセリドは、CAPMUL MCT、CAPTEX 200、CAPTEX 300、CAPTEX 800、NEOBEE M5、およびMAZOL 1400である。

トリグリセリドを含む薬学的組成物はさらに、水性溶媒に溶解すると透明な溶液を形成する可能性がある脂肪親和性および／または親水性界面活性剤を含んでもよい。そのような1つの界面活性剤は、コハク酸トコフェリルポリエチレングリコール1000（ビタミンE TPGS）である。そのような組成物の例は米国特許第6,267,985号において記載される。

もう1つの態様において、薬学的に許容される担体は、PEG-8カプリル酸／カプリン酸グリセリドであるLABRASOL（Gattefosse SA）を含む。もう1つの態様において、薬学的に許容される担体は、PL90G、ビタミンE TPGS、およびMiglyol 812Nを含む。

直腸内に用いることができる可能性がある薬学的調製物には、たとえば、坐剤基剤とリガンドの1つまたは複数の組み合わせからなる坐剤が含まれる。適した坐剤基剤は、たとえば中性もしくは合成トリグリセリドまたはパラフィン炭化水素である。加えて、同様に、リガンドと基剤との組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを用いることも可能である。可能性がある基剤材料には、たとえば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、またはパラフィン炭化水素が含まれる。

非経口投与のための適した製剤には、水溶性型のリガンドの水溶液、たとえば水溶性の塩およびアルカリ溶液が含まれる。加えて、適当な油性注射懸濁液としてのリガンドの懸濁液を投与してもよい。適した脂肪親和性溶媒または媒体には、脂肪油、たとえばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、たとえばオレイン酸エチル、トリグリセリド、またはポリエチレングリコール-400が含まれる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよく、これには、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランが含まれる。任意で懸濁液はまた安定化剤を含有してもよい。

局所適用組成物は、適当な担体を選ぶことによって、油、クリーム、ローション、軟膏等として製剤化されうる。適した担体には、植物油または鉱油、白色ワセリン（白色軟パラフィン）、分岐鎖脂肪または油、動物脂肪、および高分子量アルコール（C₁₂より大きい）が含まれる。乳化剤、安定化剤、湿潤剤、および抗酸化剤も同様に、望ましければ色または香りを付与する物質と共に含めてもよい。加えて、これらの局所製剤に経皮浸透増強剤を使用することができる。そのような増強剤の例は、米国特許第3,989,816号および第4,444,762号において見いだされうる。

クリームは、アーモンド油などの少量の油に溶解したリガンドが混合された、鉱油、自己乳化蜜ロウ、および水の混合物から製剤化されうる。そのようなクリームの典型的な例は、水約40、蜜ロウ約20、鉱油約40およびアーモンド油約1の割合が含まれるクリームである。

軟膏は、アーモンド油などの植物油におけるリガンドの懸濁液を温軟パラフィンと混合して、混合物を冷却させることによって製剤化されうる。そのような軟膏の典型的な例は、約30重量％アーモンド油および約70重量％白色軟パラフィンが含まれる軟膏である。

ローションは、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどの適した高分子量アルコールにおいてリガンドの懸濁液を調製することによって簡便に調製されてもよい。

薬学的組成物に加えられてもよい抗酸化剤の例には、BHAおよびBHTが含まれる。

1つの態様において、薬学的組成物は、硬ゼラチンカプセルにおいてLABRASOL 1 mlあたりリガンド30 mgを含む。もう1つの態様において、カプセルは、リガンド1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100 mgを含有する。

薬学的組成物はリガンドを0.01重量％〜99重量％まで含有してもよい。組成物は、1回用量または多用量剤形であってもよい。任意の特定の薬学的組成物におけるリガンドの量は、有効量、すなわち所望の遺伝子発現または抑制を誘発するために必要な用量に依存するであろう。1つの態様において、0.1〜7.5 mg/kgが対象に投与される。もう1つの態様において、0.1〜3 mg/kgが対象に投与される。もう1つの態様において、0.1〜3 mg/kgが対象に投与される。

薬学的組成物を投与する適した経路には、経口、直腸内、局所適用（皮膚、口腔内、および舌下が含まれる）、膣内、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下腔、腫瘍内、および硬膜外が含まれる）、および鼻-胃チューブが含まれる。投与経路は処置される状態に依存すること、およびレシピエントの状態などの要因によって変化する可能性があることは当業者に理解されるであろう。薬学的組成物は1日に1回または複数回投与されてもよい。

治療分子
治療分子、たとえば治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、疾患、障害、または状態の処置、改善、または予防にとって有用であるポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードする任意の配列であってもよい。治療ポリペプチドは、疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防するために有効であることが知られている任意のポリペプチドであってもよい。本発明において用いられてもよい治療ポリペプチドのクラスの例には、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、操作された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫共刺激分子、免疫調節分子、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ変異体、毒素、条件的毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質、増殖因子、膜タンパク質、血管活性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質またはその変種が含まれるがこれらに限定されるわけではない。治療ポリヌクレオチドには、アンチセンス配列、低分子干渉RNA、リボザイム、およびRNA外部ガイド配列が含まれるがこれらに限定されるわけではない。治療ポリヌクレオチドは、特定の疾患、障害、または状態に関連して、発現を減少または消失させることが望ましい任意の転写物に標的化されてもよい。先の表1〜3において記載される遺伝子が含まれる、疾患、障害、または状態の際に発現の上昇を示す多数の遺伝子が当技術分野において公知である。

治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを、遺伝子スイッチにコードされるリガンド依存的転写因子複合体のDBDによって認識される少なくとも1つの応答エレメントを含む因子調節プロモーターに機能的に連結または機能的に結合する。1つの態様において、プロモーターは、応答エレメントの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多いコピーを含む。所望の応答エレメントを含むプロモーターは、天然に存在するプロモーターまたは当技術分野において周知である技術を用いて作製された人工プロモーター、たとえば最小プロモーターに機能的に連結された1つまたは複数の応答エレメントであってもよい。

治療遺伝子スイッチを用いて発現される可能性がある特異的治療ポリペプチドには、モノクローナル抗体、最小抗体が含まれる抗体、融合タンパク質、内因性のタンパク質模倣体、酵素、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、およびそのような任意のポリペプチドの断片、変種、または誘導体が含まれるがこれらに限定されるわけではない。非制限的な代表的な治療分子を以下に記載する。特許出願公開、科学論文、ならびにポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列アクセッション番号が含まれるこれらの分子に対する参照は全て、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。

モノクローナル抗体
本発明の治療遺伝子スイッチ構築物を用いて、治療モノクローナル抗体、またはその断片、変種、もしくは類似体（集合的に「モノクローナル抗体」）を発現させてもよい。そのようなモノクローナル抗体は、癌、自己免疫疾患（たとえば、MS、クローン病、リウマチ性関節炎）、癌、感染性疾患、炎症疾患、アレルギー、心疾患および移植拒絶が含まれるがこれらに限定されるわけではない疾患および障害の処置にとって有用である。本発明において用いるための抗体には、以下に記載される抗体、任意の公知のモノクローナル抗体と同じエピトープまたは標的に結合するモノクローナル抗体が含まれるがこれらに限定されるわけではない任意の公知の治療モノクローナル抗体が含まれる。治療遺伝子スイッチ構築物による発現にとって適したモノクローナル抗体構築物には、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、たとえばFab、Fab'、およびF(ab')₂、Fd、Fv、一本鎖Fv（scFv）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Fv（sdFv）、およびVLまたはVHドメインのいずれかを含む断片が含まれる。ScFv分子は当技術分野において公知であり、たとえば米国特許第5,892,019号において記載される。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（たとえば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY）、クラス（たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2）、またはサブクラスの分子でありうる。一本鎖抗体が含まれる抗体断片は、単独でまたは以下の全てもしくは一部と組み合わせた可変領域を含んでもよい：ヒンジ領域、CH1、CH2、およびCH3ドメイン。同様に、可変領域とヒンジ領域、CH1、CH2、およびCH3ドメインの任意の組み合わせを含む抗原結合断片も本発明に含まれる。

特定の態様において、本発明には、CTLA4、CD25、HER-2/neu（ErbB2）、CD20、TNFα、EGFR、およびVEGFが含まれるがこれらに限定されるわけではない抗原に対するモノクローナル抗体をコードする治療遺伝子スイッチ構築物が含まれる。

本発明において使用可能な抗CTLA4抗体、およびそれらを産生する方法は、2000年6月29日にWO 00/37504（たとえば、11.2.1およびCP-675,206としても知られるチシリムマブ）として公開された国際特許出願公開番号PCT/US99/30895、2002年4月12日に公開された欧州特許出願第1262193号A1、現在米国特許第6,682,736号として公布されている米国特許出願第09/472,087号、現在米国特許出願公開第2002/0086014号（たとえば、10D1およびMDX-010としても知られるイピリムマブ、Medarex, Princeton, NJ)として公開されている、米国特許出願第09/948,939号において記載される。

本発明において使用可能な抗CD25抗体には、ダクリズマブが含まれるがこれらに限定されるわけではない。たとえば米国特許第5,530,101号を参照されたい。ダクリズマブ（商品名；Zenapax（登録商標）、Rocheから販売）は、CD25（IL-2受容体）に対するヒト化IgG1モノクローナル抗体である。これはIL-2受容体アンタゴニストとして機能して、高親和性IL-2受容体複合体のTacサブユニットに対して高親和性で結合する。ダクリズマブは、シクロスポリンおよびコルチコステロイドと併用して用いた場合に腎移植患者における急性臓器拒絶の予防のために適応されている。

本発明において使用可能な抗HER-2/neu（ErbB2）抗体には、トラスツズマブが含まれるがこれらに限定されるわけではない。たとえば米国特許第5,677,171号を参照されたい。トラスツズマブ（商品名Herceptin（登録商標）、Genentechから販売）は、一定のタイプの乳癌において過剰発現する膜貫通受容体タンパク質（構造的に上皮細胞増殖因子受容体に関連する）であるc-erbB2/HER2/neuタンパク質の細胞外ドメインに対して標的化されるヒト化モノクローナル抗体である。抗体依存的細胞障害性のメディエータとして、トラスツズマブは、HER2-発現癌細胞に対して優先的に毒性である。

本発明において使用可能な抗CD20抗体には、リツキシマブが含まれるがこれらに限定されるわけではない（たとえば、米国特許第5,736,137号を参照されたい）。リツキシマブ（商品名：Rituxan（登録商標）、Biogen IdecおよびGenentechから販売）は、キメラ（ネズミ／ヒト）モノクローナルIgG1κ抗体である。リツキシマブは、当初、非ホジキンリンパ腫の処置のために設計されて認可されたが、より最近は、抗TNF不応性リウマチ性関節炎の処置に関して認可されている。

本発明において使用可能な抗TNFα抗体には、アダリムマブ（たとえば、米国特許第7,223,394号を参照されたい）、インフリキシマブ（たとえば、米国特許第7138118号を参照されたい）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。アダリムマブ（商品名；Humira（登録商標）、Abbottから販売）は、TNFαに特異的に結合して、それによってTNFαとp55およびp75表面TNF受容体との相互作用を遮断する組み換え型ヒトIgG1κモノクローナル抗体である。アダリムマブは、リウマチ性関節炎および若年性特発性関節炎における使用が認可されている。アダリムマブの追加の適応には、クローン病、斑状乾癬、乾癬性関節炎、および強直性脊椎炎が含まれる。インフリキシマブ（商品名：Remicade、Centocorから販売）は、TNFαに特異的に結合して、それによってTNFαとp55およびp75表面TNF受容体との相互作用を遮断する組み換え型キメラIgG1κモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、クローン病において用いるために認可されている。追加の適応には、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、重度慢性斑状乾癬、および強直性脊椎炎が含まれる。

本発明において使用可能な抗EGFR（上皮細胞増殖因子受容体）抗体には、セツキシマブ（米国特許第6,217,866号を参照されたい）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。セツキシマブ（商品名：Erbitux（登録商標）、Imclone and Bristol-Meyers Squibb（北米）およびMerck KGaA（その他の地域）によって販売）は、EGFRに特異的に結合するキメラモノクローナル抗体である。セツキシマブは、転移性結腸直腸癌および頭頚部癌に適応される。

本発明において使用可能な抗VEGF抗体には、ベバシズマブ（たとえば、米国特許第6,383,486号を参照されたい）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。ベバシズマブ（商品名：Avastin（登録商標）、Genentechから販売）は、血管内皮増殖因子（VEGF）の機能を阻害して、したがって腫瘍の血管新生を阻害するヒトモノクローナル抗体である。ベバシズマブは、転移性結腸直腸癌患者の第一および第二選択処置として、および再発性または転移性非扁平上皮性非小細胞肺癌（NSCLC）患者の第一選択処置として、他の抗癌化学療法剤と併用した処置のために適応されている。

融合タンパク質
本発明の治療遺伝子スイッチ構築物は、キメラTNFα結合タンパク質2などの治療融合タンパク質を発現するために用いられてもよい。腫瘍壊死因子結合タンパク質2（Enbrel）は、タンパク質分解プロセシングによって膜型から産生される。Enbrelは、ヒトIgG1分子のFc断片によって接続された2つの可溶性TNF受容体からなる組み換え型融合タンパク質である。これはTNF-αに結合して、TNF-αとその受容体との相互作用を遮断する。Enbrelは、中等度から重度のリウマチ性関節炎を処置するために用いられる。Enbrelをコードするアミノ酸配列は、アクセッション番号P20333として公共のデータベースから入手可能である。

Enbrelのポリヌクレオチド配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号DD292498およびDD 292499として公共のデータベースから入手可能である。

酵素
本発明の治療遺伝子スイッチ構築物は、組織プラスミノーゲン活性化因子が含まれる治療酵素を発現するために用いられてもよい。プラスミノーゲン活性化因子である組織型イソ型3プレプロタンパク質（tPA）は、プロ酵素であるプラスミノーゲンを線維素溶解酵素であるプラスミンに変換する分泌型セリンプロテアーゼである。この酵素は細胞の遊走および組織のリモデリングにおいて役割を果たす。tPAをコードするアミノ酸配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号NP_127509およびNP_000921（いずれもヒト）として公共のデータベースから入手可能である。

tPAをコードするポリヌクレオチド配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号NM_033011およびNM_000930（いずれもヒト）として公共のデータベースから入手可能である。

内因性のタンパク質模倣体
本発明の治療遺伝子スイッチ構築物は、以下のような内因性のタンパク質の治療模倣体を発現するために用いられてもよい。

アルファネート（凝固第III因子）は、カルシウムおよびリン脂質と共に、第X因子を活性化型の第Xa因子へと変換する場合の第IXa因子の共因子として作用する。アルファネートは、精製第VIII因子（抗血友病因子として知られる）およびフォンヴィレブランド因子である。アルファネートは、血友病Aによる第VIII因子欠損症または後天性第VIII因子欠損症患者における出血の予防および制御のために承認されている。第VIII因子をコードするアミノ酸配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号AAA52485（ヒト）およびAAA37385（マウス）として公共のデータベースから入手可能である。

第VIII因子をコードするポリヌクレオチド配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号M14113（ヒト）およびL05573（マウス）として公共のデータベースから入手可能である。

アララスト（α1プロテナーゼ阻害剤）アミノ酸配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号AAB59375（ヒトα1-アンチトリプシン）；AAC28869（マウスα-1プロテアーゼ阻害剤）；およびAAA40788（ラットα-1-アンチトリプシン）として公共のデータベースから入手可能である。

α-1プロテナーゼ阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号K01396（ヒト）；M75721（マウス）；およびM32247（ラット）として公共のデータベースから入手可能である。

ネシリチド（Natrecor（登録商標））は、安静時または最小の活動時に呼吸困難を有する急性代償性うっ血性心不全（CHF）患者の静脈内処置のために承認されているヒトB型ナトリウム利尿ペプチド（hBNP）の組み換え型である。脳性ナトリウム利尿性ペプチドをコードするアミノ酸配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号NP_002512として公共のデータベースから入手可能である。

脳性ナトリウム利尿ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる。アクセッション番号NM_002521として公共のデータベースから入手可能である。

ヒトインスリンをコードするアミノ酸配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号AAH05255として公共のデータベースから入手可能である。

ヒトインスリンをコードするポリヌクレオチド配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号BC005255として公共のデータベースから入手可能である。

顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）は、白血球細胞増殖因子として機能して、幹細胞を刺激して、顆粒球（好中球、好酸球、および抗塩基球）および単球を産生するサイトカインである。顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）をコードするアミノ酸配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号AAA52122（ヒト）；NP_034099（マウス）；NP_001032749（ラットCsf2ra）；およびNP_598239（Csf2rb）として公共のデータベースから入手可能である。

GM-CSFをコードするポリヌクレオチド配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号M11734（ヒト）；NM_009969（マウス）；NM_001037660（ラットCsf2ra）；およびNM_133555（ラットCsf2rb）として公共のデータベースから入手可能である。

エリスロポエチンをコードするアミノ酸配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号AAH93628（ヒト）；AAI19266（マウス）；およびBAA01593（ラット）として公共のデータベースから入手可能である。

エリスロポエチンをコードするポリヌクレオチド配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号BC093628（ヒト）；BC119265（マウス）；およびD10763（ラット）として公共のデータベースから入手可能である。

成長ホルモンをコードするアミノ酸配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号AAA98618（ヒト）；NP_032143（マウス）；およびNP_001030020（ラット）として公共のデータベースから入手可能である。

成長ホルモンをコードするポリヌクレオチド配列は、その配列が参照により本明細書に組み入れられる、アクセッション番号M13438（ヒト）；NM_008117（マウス）；およびNM_001034848（ラット）として公共のデータベースから入手可能である。

組み換え型タンパク質
本発明の治療遺伝子スイッチ構築物は、ボツリヌス毒素などの組み換え型治療タンパク質を発現させるために用いられてもよい。ボツリヌス毒素は、神経終末で神経伝達物質であるアセチルコリンの放出を阻害し、これは失調および頚部失調に関連する斜視および眼瞼痙攣の処置のために商品名BOTOXとして入手可能である。BOTOXはまた、片側顔面の痙縮および異常な筋収縮を特徴とする多くの他の神経障害の処置のために用いられている。ボツリヌス神経毒素A型前駆体（BoNT/A）（Bontoxilysin-A）（BOTOX）は、アクセッション番号P10845として公共のデータベースから入手可能である。

心血管疾患の処置
本発明はさらに、先に参照したスイッチタンパク質の制御下で心血管関連疾患を改善、予防、または処置する治療遺伝子産物を、そのような処置を必要とする対象に投与する段階を含む、心血管疾患を処置、改善、または予防する方法に向けられる。そのような処置は処置される対象に直接送達されてもよく、または本明細書において他所で記載される1つもしくは複数の治療タンパク質もしくは治療ポリペプチドを分泌するカプセル封入もしくは非カプセル封入の非改変細胞もしくは遺伝子改変細胞を含有するバイオリアクターによって送達されてもよい。この態様に従って、細胞は、対象に、たとえば心血管疾患患者の梗塞域に移植された場合に、心血管疾患の処置において有効である1つまたは複数の治療遺伝子産物を発現するであろう。そのような治療遺伝子産物の例を、以下により詳細に記載する。特定の態様において、本発明の遺伝子改変細胞は、1つまたは複数の治療遺伝子産物を構成的に発現する、すなわち1つまたは複数の異種治療遺伝子産物が細胞において持続的に発現する。または、細胞によって発現される1つ、2つ、3つ、またはそれより多くの異種治療遺伝子産物の発現は、治療遺伝子スイッチによって制御される。特定の局面において、心血管疾患の処置、改善、または予防のためのバイオリアクターは、カプセル封入細胞を含み、たとえば細胞はアルギネートに基づく製剤においてカプセル封入される。たとえば処置される対象からの物理的または免疫学的バリアを提供するための細胞カプセル封入の例および方法は、本明細書において他所で詳細に記載される。

本発明はさらに、プロモーターとの機能的結合を通して心血管疾患の処置、改善、または予防にとって有用な治療遺伝子産物、たとえば治療ポリペプチドおよび／または治療ポリヌクレオチドを発現する1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む核酸組成物を提供する。特定の態様において、治療遺伝子産物の発現を制御するプロモーターは、リガンド依存的転写因子複合体によって活性化され、この場合、転写因子の少なくとも一部が1つまたは複数の治療スイッチプロモーターとの機能的連結によって発現し、治療スイッチプロモーターの活性は構成的であるか、および／または組織タイプに関連するまたは疾患、障害、もしくは状態に関連する条件下でモジュレートされる。心血管疾患の処置、改善、または予防に関する態様において、治療スイッチプロモーターは、たとえば心臓特異的プロモーターでありうるか、またはうっ血性心不全、虚血性心疾患、高血圧性心疾患、冠動脈疾患、末梢血管疾患、および虚血性心事象、たとえば心筋梗塞、心臓発作、心不全、不整脈、心筋破裂、心膜炎、および心原性ショックなどの状態の際に活性化されるプロモーターでありうる。例示的なプロモーターは表1〜3において提示される。追加のプロモーターは、本明細書において他所で、たとえば実施例1〜8において記載される。追加のプロモーターはまた、本明細書において記載される方法によって容易に同定されうる。

心細胞において、または心疾患、障害、もしくは状態に関連する条件下で調節された遺伝子スイッチ発現にとって有用な治療スイッチプロモーターの例には、心筋細胞に対して組織特異的であるS100A6プロモーター（Tsoporis et al., J. Biol. Chem. (2008)（印刷前電子出版；PMID: 18753141））；その全てが心筋細胞に対して組織特異的である、心房性ナトリウム利尿因子（ANF）プロモーター、αミオシン重鎖プロモーター、c-fosプロモーター、BNPプロモーター、またはαアクチンプロモーター（Nelson et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 39(3):479 (2005)）；虚血条件下の心筋層において活性化されるエリスロポエチンプロモーター（Su et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99(14):9480 (2002)）；たとえば、脊椎動物の眼の水晶体に対して組織特異的であるBRG1応答エレメントが含まれるαB-クリスタリン（CRYAB）プロモーター（Duncan B. and Zhao K. DNA Cell. Biol. 26(10):745 (2007)）；骨格筋に対して組織特異的である、シス作用調節エレメントを有するαB-クリスタリン（CRYAB）プロモーター、たとえばαBE-1、αBE-2、αBE-3、およびMRF（Gopal-Srivastava et al., J. Mol. Cell Biol. 15(12):7081 (1995)）；心筋細胞に対して組織特異的であるNCX1プロモーター（Xu et al., J. Biol. Chem. 281(45):34430 (2006)）；心筋細胞に対して組織特異的であるβミオシン重鎖プロモーター（Nelson et al., J. Mol. Cell Cardiol. 39(3):479 (2005)、Ross et al., Development. 122(6):1799 (1996)、およびLee et al., Mol. Cell. Biol. 14(2):1220 (1994)）、HF-1a/HF-1b/MEF-2組み合わせエレメントが含まれるミオシン軽鎖-2心室プロモーター（Ross et al., Development. 122(6): 1799 (1996)）、または心室に対して組織特異的であるHF-1a/HF-1bエレメントおよびHF-3調節エレメント（Lee et al., Mol Cell. Biol. 14(2): 1220 (1994)）；骨格筋発達の際に異なるように活性化されるミオシン軽鎖プロモーター、たとえばMLC1FおよびMLC3F（Kelly et al., J. Cell. Biol. 129(2):383 (1995)）；心筋に対して組織特異的であるミオシン軽鎖2v（MLC- 2v）プロモーター（Su et al., Proc. Natl Acad. Sci. U S A. 101(46): 16280 (2004)）；および心筋において組織特異的であり、発達段階特異的である心トロポニンI（TnIc）プロモーター（Bhavsar et al., J. Mol. Cell Cardiol. 32(1):95 (2000)）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。

本発明はさらに、上記の核酸組成物を含む1つまたは複数のベクター、およびそのようなベクターを含む1つまたは複数の遺伝子改変細胞を提供する。そのような細胞は、処置される対象に対して同種異系、自己、または異種であってもよい。本発明はさらに、細胞が対象に導入された際に対象の免疫系から保護されるように処理されている前述の改変細胞を含む、心血管疾患の処置、改善、または予防のための1つまたは複数のカプセル封入方法論を提供する。そのような処置には、コンフォーマルコーティング、マイクロカプセル封入、またはマクロカプセル封入の提供が含まれるがこれらに限定されるわけではない。

心血管疾患には、うっ血性心不全、虚血性心疾患、高血圧性心疾患、冠動脈疾患、末梢血管疾患、および虚血性心事象、たとえば、心筋梗塞、心臓発作、心不全、不整脈、心筋破裂、心膜炎、および心原性ショックが含まれるがこれらに限定されるわけではない。そのような事象の原因には、血栓症、塞栓、アテローム性動脈硬化症、および狭窄が含まれるがこれらに限定されるわけではない。素因を有する集団には、喫煙者、糖尿病、高血圧症、または脂質異常血症を有する人が含まれるがこれらに限定されるわけではない。

心血管疾患の処置、改善、または予防のための適した治療分子には、前血管新生因子、心保護因子、および心再生因子が含まれるがこれらに限定されるわけではない。

心血管疾患を予防、処置、または改善するために本発明にとって有用な治療分子には、心房性ナトリウム利尿因子（ANF）、カルペリチド、脳性ナトリウム利尿因子（BNP）、ネシリチド、リラキシン、血管内皮増殖因子（VEGF 165）、肝細胞増殖因子（HGF）、アンジオポエチン-1（Ang-1）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、線維芽細胞増殖因子4（FGF-4）、インスリン様増殖因子1（IGF-1）、低酸素誘導因子1-α（HIF1-α）、エリスリポエチン、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）、成長ホルモン、間質由来因子-1（SDF-1）、筋小胞体Ca2+ ATPアーゼ（SERCA2a）、アデニルシクラーゼVI型（AC6）、S100A1、パルブアルブミン、ホスファターゼ阻害剤2、およびホスファターゼ阻害剤1が含まれるがこれらに限定されるわけではない。これらの分子は、様々な機序、たとえば血行力学、血管新生、心再生、抗線維症、および／または心修復を通して心組織に対して効果を発揮することが知られている。これらの治療分子は、多数の治療作用を提供する可能性があり、互いに、または公共に公知である他の分子と併用して用いられてもよい。

1つの態様において、心血管疾患の処置、改善、または予防に関する前血管新生遺伝子治療の臨床試験が、新生血管形成を促進するために有用な治療タンパク質を用いて現在行われている。これらには、VEGF、HGF、bFGF、Ang-1、FGF-4、IGF-1、およびHIF1-αのみならずその断片、変種、および誘導体などの前血管新生因子が含まれるがこれらに限定されるわけではない。新生血管形成を促進するために適した分子の同定は、十分に当業者の能力範囲内である。そのような前血管新生因子は、梗塞域内で酸素および栄養を供給するために新生血管形成を刺激する。これは、梗塞域の拡大を制限して、梗塞に遊走する任意の心前駆体を維持するであろう。

実際に、前血管新生因子VEGF 165は新生血管形成を誘導することが知られている（Benest et al., Microcirculation. 13(6):423 (2006)；Riley et al., Biomaterials. 27(35):5935 (2006)；Shyu et al., Life Sci 73(5):563 (2003)；Arsic et al., Mol Ther. 7(4):450 (2003)；Ye et al., J. Heart Lung Transplant. 24(9): 1393 (2005)；Lubiatowski et al., Plast. Reconstr. Surg. 110(1): 149 (2002)（誤り：Plast. Reconstr. Surg. 111(3): 1380 (2003)）；Kim et al., Ann. Thorac. Surg. 83(2):640 (2007)（Ann. Thorac. Surg. 83(2):646 (2007)において注釈）；Thurston G., J. Anat. 200(6):575 (2002)；Ryu et al., Mol. Ther. 13(4):705 (2006)；Chae et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20(12):2573 (2000)；およびChen et al., Acta. Pharmacol. Sin. 28(4):493 (2007)）。治療的新生血管形成における初期臨床試験の欠点は一部、増殖因子の高用量の1回投与に起因している。Zacchigna et al., Hum. Gene Ther. 18(6):515 (2007)およびYla-Herttuala et al., J Am Coll Cardiol. 49(10):1015 (2007)（J Am Coll Cardiol. 50(2): 186 (2007)において注釈）を参照されたい。それ以降、VEGF発現および放出に関する前臨床データから、持続的な曝露によって安定な血管の形成が得られるが、短期間の送達では単に容易に退縮する漏れやすい血管を産生するに過ぎないことが示唆された。たとえば、VEGF-A産生筋芽細胞によってもたらされる高い局所濃度によって、漏れやすい異常な血管が得られたが、一方で中等度の量の増殖因子によって健康な血管の成長が開始された。Arsic et al., Mol Ther. 7(4):450 (2003)；Benest et al., Microcirculation. 13(6):423 (2006)；Yamauchi et al., J Gene Med. 5(11):994 (2003)；Jiang et al., Acta Cardiol. 61(2): 145 (2006)；Ozawa et al., J Clin Invest. 113(4):516 (2004)を参照されたい。加えて、VEGF（血管新生の開始）とAng-1（血管の成熟）の組み合わせによって、より安定な血管の成長が起こることが示されている。Thurston G., J Anat. 200(6):575 (2002)；Jiang et al., Acta Cardiol. 61(2): 145 (2006)；Benest et al., Microcirculation. 13(6):423 (2006)；Zhou et al., Gene Ther. 12(3):196 (2005)（誤り：Gene Ther. 12(6):552 (2005)；Liu et al., Scand Cardiovasc J. 41(2):95 (2007)；Shyu et al., Life Sci. 73(5):563 (2003)；Yamauchi et al., J Gene Med. 5(11):994 (2003)；Arsic et al., Mol Ther. 7(4):450 (2003)；Ye et al., J Heart Lung Transplant. 24(9):1393 (2005)；Ye et al., Eur J Heart Fail 9(1):15 (2007)；Lubiatowski et al., Plast Reconstr Surg. 110(1): 149 (2002)（誤り：Plast Reconstr Surg. 111(3):1380 (2003)）；Ryu et al., Mol Ther. 13(4):705 (2006)；Chen et al., Eur J Pharmacol. 568(l-3):222 (2007)；Chae et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20(12):2573 (2000)；およびChen et al., Acta Pharmacol Sin. 28(4):493 (2007)を参照されたい。

ゆえに、前血管新生因子VEGF 165は、心筋梗塞（Zhou et al., Gene Ther. 12(3): 196 (2005)（誤り：Gene Ther. 12(6):552 (2005)；Ye et al., Circulation. 116(11 Suppl):I113 (2007)；Liu et al., Scand Cardiovasc J. 41(2):95 (2007)；Ye et al., Eur. J. Heart Fail. 7(6):945 (2005)；Zhang et al., Cell Transplant. 14(10):787 (2005)；Bonaros et al., Interact. Cardiovasc. Thorac. Surg. 7(2):249 (2008)；Shyu et al., J. Biomed. Sci. 13(1):47 (2006)；Ventura et al., J Biol Chem. 282(19):14243 (2007)；Sugimoto et al., Jpn. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 51(5): 192 (2003)；Yau et al., Ann. Thorac. Surg. 83(3):1110 (2007)（Ann Thorac Surg. 83(3):1119 (2007)において注釈）；Rong et al., Chin. Med. J. (Engl). 121(4):347 (2008)；Yang et al., Cardiology. 107(1): 17 (2007)；Wang et al., J. Mol. Cell Cardiol. 40(5):736 (2006)；Chen et al., Eur J Clin Invest. 35(11):677 (2005)；Suzuki et al., Circulation. 104(12 Suppl l):I207 (2001)；Ye et al., Ann. Acad. Med. Singapore. 32(5 Suppl):S21 (2003)；およびHaider et al., J Mol Med. 82(8):539 (2004)（注釈：J Mol Med. 82(8):485 (2004))）または虚血もしくは再灌流損傷（Becker et al., Int J Cardiol. 113(3):348 (2006)；Gao et al., Can. J. Cardiol. 23(11):891 (2007)；Ye et al. Eur J Heart Fail 9(1):15 (2007)；Chen et al., Eur. J. Pharmacol 568(l-3):222 (2007)；およびJiang et al., Acta Cardiol 61(2): 145 (2006)）が含まれるがこれらに限定されるわけではない、様々な心血管疾患（Yamauchi et al., J Gene Med. 5(11):994 (2003)およびXu et al., Cytotherapy. 6(3):204 (2004)（Cytotherapy. 7(1):74 (2005)において注釈））を予防、処置、または改善することが知られている。

さらに、多能性作用を提供するもう1つの前血管新生因子HGF（ヒトヌクレオチド配列アクセッション番号M29145、ヒトアミノ酸配列アクセッション番号NP_ 000592.3）は、本発明にとって有用である。c-Met受容体によって媒介されるHGFは、内皮細胞に対するマイトゲン活性による前血管新生効果、心筋細胞に対する心保護的抗アポトーシス効果、TGF-β1シグナル伝達の抑制による抗線維症効果を提供し、これは、虚血心筋層へのCD117(+)/c-Met(+)幹細胞の動員によるI型コラーゲン再生因子である。Li et al., Chin Med J (Engl) 121(4):336 (2008)；Guo et al., Arch. Med. Res. 39(2): 179 (2008)；Ventura et al., J. Biol. Chem. 282(19): 14243 (2007)；Yang et al., Gene Ther. 13(22): 1564 (2006)；Tambara et al., Circulation. 112(9 Suppl):I129 (2005)；Zhang et al., Tissue Eng. Part A. 14(6):1025 (2008)；およびSakaguchi et al., Ann. Thorac. Surg. 79(5):1627 (2005)を参照されたい。

同様に、bFGF（アミノ酸配列アクセッション番号NP_001997）は、血管新生、新生血管形成、および組織再生を促進することによって追加の心保護効果を有することが示されている（Doi et al., Heart Vessels. 22(2): 104 (2007)；Fujita et al., J. Surg. Res. 126(1):27 (2005)；Fujita et al., Wound Repair Regen. 15(1):58 (2007)；Hosaka et al., Circulation. 110(21):3322 (2004)；Iwakura et al., Heart Vessels. 18(2):93 (2003)；Lai et al., Tissue Eng. 12(9):2499 (2006)；Nakajima et al., J. Artif. Organs. 7(2):58 (2004)；Perets et al., J. Biomed. Mater. Res. A. 65(4):489 (2003)；Pike et al., Biomaterials. 27(30):5242 (2006)；Sakakibara et al., J Thorac Cardiovasc Surg. 124(l):50 (2002)；Sakakibara et al., Eur J Cardiothorac Surg. 24(1): 105 (2003)；Shao et al., Circ J. 70(4):471 (2006)；Tabata Y. and Ikada Y., Biomaterials. 20(22):2169 (1999)；Yamamoto et al., Artif. Organs. 27(2):181 (2003)；Yamamoto et al., Jpn. Circ. J. 65(5):439 (2001)；Yang et al., Ophthalmic Res. 32(1): 19 (2000)；およびZhu et al., Chin. Med. Sci. J. 15(4):210 (2000)）。特定の態様において、bFGFは、変形性関節症を予防、処置、または改善するために用いられてもよい。Inoue et al., Arthritis Rheum. 54(1):264 (2006)を参照されたい。

IGF-1（ヒトアミノ酸配列アクセション番号NP_001104753.1）も同様に、アポトーシスからの心筋細胞の保護および新生血管新生の増強という多能性機能を発揮することが知られており（Su et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284(4):H1429 (2003)；Chao et al., J. Gene Med. (4):277 (2003)；Rabinovsky E.D. and Draghia-Akli R., Mol Ther. 9(1):46 (2004)；およびBarton et al., Circulation. 112(9 Suppl):I46 (2005)）、本発明において用いられてもよい。

加えて、FGF-4は、心筋の血管／動脈形成を誘導することによって慢性虚血性心疾患を予防、処置、または改善するための治療分子として用いてもよい（Kapur N.K. and Rade J. J., Trends Cardiovasc. Med. 18(4): 133 (2008)；Henry et al., J. Am. Coll. Cardiol. 50(11): 1038 (2007)；Grines et al；Am. J. Cardiol 92(9B):24N (2003)；（著者は記載されていない）BioDrugs. 16(1):75 (2002)）

さらに、HIF1-α遺伝子治療、たとえば、HIF1-α（アミノ酸l〜390)/VP16 （アミノ酸413〜490）は、BNP遺伝子発現を増強することによって、虚血疾患を処置、予防、もしくは改善する（Rajagopalan et al., Circulation. 115(10): 1234 (2007)（Circulation. 115(10):1180 (2007)において注釈）；Wilhide M.E. and Jones W.K., Mol Pharmacol. 69(6): 1773 (2006)（Mol Pharmacol. 69(6): 1953 (2006)に関して注釈)；Luo et al., Mol Pharmacol 69(6): 1953 (2006)（Mol. Pharmacol 69(6): 1773 (2006)において注釈））、または心筋梗塞における血管新生を改善する（Shyu et al., Cardiovasc Res. 54(3):576 (2002)；Vincent et al., Circulation. 102(18):2255 (2000)）ことが知られている。

特定の態様において、心血管疾患の処置、改善、または予防のための心保護因子は、単独で、または血管新生因子および／または心再生因子と併用して提供される。心保護分子は、内在する心筋細胞に対して抗線維症で抗アポトーシス性のシグナルを提供して、梗塞域の大きさを制限し、かつ遊走する幹細胞に生存シグナルを供給する。特定の態様において、心保護因子は、エリスロポエチンα（EPO）（ヒトアミノ酸アクセッション番号CAA26095.1）、たとえばヒトエリスロポエチンαまたはAmgenによって製造されるEPOGEN（登録商標）である。エリスロポエチンは、心保護、血管新生、および神経保護効果を有することが示されている（Ben-Dor et al., Cardiovasc Drugs Ther. 21(5):339 (2007)；Lin et al., Circ J. 71(1):132 (2007)；Prunier et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292(1):H522 (2007)）。

実験的心筋虚血-再灌流損傷に対して保護的であることが証明された他の心保護ホルモンには、アドレノメジュリン、ブラジキニン、リラキシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP、ヒトヌクレオチド配列アクセッション番号NM_ 006172、ヒトアミノ酸配列アクセッション番号NP_006163）としても知られるANF、B-型ナトリウム利尿ペプチドまたはGC-Bとしても知られるBNP（ヒトアミノ酸配列アクセッション番号NP_002512.1；ヒトヌクレオチド配列アクセッション番号M25296）、C-型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）、カルペリチド、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）、およびウロコルチンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。多くはまた、線維症を低減させて、血行力学を媒介することも示されている。ネシリチド（Sciosによって販売されている商品名Natrecor（登録商標））、ヒトB-型ナトリウム利尿ペプチドの組み換え型、ANF、およびカルペリチドは、急性代償性心不全の処置、改善、または予防において用いられ、同様に本発明においても用いられてもよい（Burnett J.C. Jr., J. Cardiol. 48(5):235 (2006)）。

雌性生殖システムに対するその効果が知られているリラキシン（ヒトアミノ酸配列アクセッション番号NP_604390.1）はまた、酸化窒素を伴う作用機序による全身および冠動脈循環の強力な血管拡張剤でもあり、心拍数に影響を及ぼす。リラキシンはまた、虚血性心疾患（急性および慢性心筋梗塞）、心線維症、および閉塞性末梢動脈疾患を予防、処置、または改善する可能性があり、細胞移植において心機能を回復する可能性がある心血管薬として知られている（Nistri et al., Pharmacol. Res. 57(1):43 (2008)；Samuel et al., Adv. Exp. Med. Biol. 612:88 (2007)；Du XJ., J. Cell Mol. Med. 11(5):1101 (2007)；Formigli et al., J. Cell Mol. Med. 11(5):1087 (2007)；Bathgate et al., Mol. Cell Endocrinol. 280(l-2):30 (2008)；Nistri et al., Cardiovasc. Hematol. Agents Med. Chem. 5(2):101 (2007)；Moore et al., Endocrinology. 148(4):1582 (2007)；Lekgabe et al., Endocrinology. 147(12):5575 (2006)；Samuel et al., Pharmacol. Ther. 112(2):529 (2006)；Zhang et al., Peptides. 26(9):1632 (2005)；Perna et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041:431 (2005)；Perna et al., FASEB J. 19(11):1525 (2005)；Samuel et al., Endocrinology. 145(9):4125 (2004)；Masini et al., Br J Pharmacol. 137(3):337 (2002)；Ndisang et al., Inflamm. Res. 50 Suppl. 2:S122-3 (2001)；Dschietzig et al., FASEB. J. 15(12):2187 (2001)；Bani et al., Am J Pathol. 152(5):1367 (1998)；およびMasini et al., Inflamm. Res. 45 Suppl 1 :S27 (1996)）。

特定の態様において、心血管疾患の処置、改善、または予防にとって有用な本発明の治療タンパク質は、多数の治療恩典を有する。たとえば、心筋梗塞後の初期相において、梗塞域において上昇した（SDF-1、ヒトヌクレオチド配列アクセッション番号U16752、ヒトアミノ酸配列アクセッション番号NP_954637）レベルが報告されている。これは、天然の修復プロセスの一部としてBMニッシェから損傷部位への幹細胞の動員にとって必要な刺激を提供する。SDF-1は、骨髄造血幹細胞（主にCD31⁺、C-kit⁺、およびCD34⁺細胞）を梗塞心臓に動員して、それによって新血管新生および心保護活性の双方が得られる。さらに、SDF-1は、Gタンパク質カップリング受容体CXCR4再生因子により細胞生存因子タンパク質キナーゼB（PKB/Akt）を活性化する。同様に、米国特許出願公開第20060111290号Al；Elmadbouh et al., J Mol Cell Cardiol. 42(4):792 (2007)；Bonaros et al., Interact Cardiovasc Thorac Surg. 7(2):249 (2008)；Zhang et al., J Mol Cell Cardiol. 44(2):281 (2008)；Ma et al., Basic Res Cardiol. 100(3):217 (2005)；およびZhang et al., Tissue Eng. 13(8):2063 (2007)も参照されたい。

加えて、tPA（ヒトアミノ酸配列アクセッション番号28274638）、たとえばヒト組織プラスミノーゲン活性化因子、またはPDL BioPharma, Inc. によって製造されるRetavase（登録商標）は、移植片のアテローム性動脈硬化症を阻害することによって、心移植後の合併症を予防、処置、または改善することが知られている（Scholl et al., J Heart Lung Transplant. 20(3):322 (2001)；Dunn et al., Circulation. 93(7):1439 (1996)（Circulation. 93(7):1319 (1996)において注釈）；およびGong et al., Gene Ther. 14(21):1537 (2007)）。さらに、成長ホルモンも同様に、血管新生を促進して、アポトーシスを減弱させることによって（Rong et al., Chin Med J (Engl). 121(4): 347 (2008)）、心血管疾患を予防、処置、または改善することが知られており、本発明において用いられてもよい（Isgaard J. and Bergh C.H., BioDrugs. 12(4):245 (1999)；Fazio et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 92(11):4218 (2007)；Climent et al., Curr Med Chem. 14(13):1399 (2007)；Perez-Berbel et al., Int J Cardiol. 124(3):393 (2008)（Int J Cardiol. 110(3):313 (2006)に関して注釈）；およびLe Corvoisier et al., J Clin Endocrinol Metab. 92(l):180 (2007)）。

他の態様において、心機能を回復する治療分子が本発明に含まれる。心修復分子には、SERCA2a、AC6、S100A1、パルブアルブミン、ホスファターゼ阻害剤2、およびホスファターゼ阻害剤1が含まれるがこれらに限定されるわけではない。たとえば、SERCA2aは、インビボおよびインビトロで心収縮性、ならびに心不全における心機能を改善することが知られている（Asahi et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 101(25):9199 (2004)；Cavagna et al., J Physiol. 528 Pt 1:53 (2000)；Chaudhri et al., Mol Cell Biochem. 251(l-2):103 (2003)；Davia et al., J Mol Cell Cardiol. 33(5):1005 (2001)；del Monte et al., Circulation. 100(23):2308 (1999)（Circulation. 100(23):2303 (1999)において注釈）；del Monte et al., Circulation. 104(12):1424 (2001)；Hajjar et al., Circ Res. 81(2):145 (1997)（Circ Res. 88(4):373 (2001)およびCirculation. 101(7):790 (2000)において注釈）；Kawase et al., J Am Coll Cardiol 51(11):1112 (2008)；Maier et al., Cardiovasc Res. 67(4):636 (2005)（Cardiovasc Res. 67(4):581 (2005)において注釈）；Meyer M. and Dillmann W.H., Cardiovasc Res. 37(2):360 (1998)；Miyamoto et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 97(2):793 (2000)；Muller et al., Cardiovasc Res. 59(2):380 (2003)；Sakata et al., J Mol Cell Cardiol 42(4):852 (2007)；Sakata et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 292(2):H1204 (2007)；Schmidt et al., Circulation. 101(7):790 (2000)（Circulation. 101(7):738 (2000), Circ Res. 81(2):145 (1997), Circ Res. 83(9):889 (1998)、およびCirculation. 95(2):423 (1997)において注釈）Suarez et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287(5):H2164 (2004)；Terracciano et al., Cell Calcium. 31(6):299 (2002)；Trost et al., Diabetes. 51(4):1166 (2002)；およびVetter et al., FASEB J. 16(12):1657 (2002)）。

さらに、AC6は、SERCA2aのカルシウムに対する親和性、および心筋症における筋小胞体による心カルシウム取り込みの最大速度を回復することが知られている（Gao et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 95(3): 1038 (1998)；Roth et al., Circulation. 99(24):3099 (1999)；Lai et al., Circulation. 102(19):2396 (2000)；Roth et al., Circulation. 105(16): 1989 (2002)（Circulation. 105(16): 1876 (2002)において注釈）；Gao et al., Cardiovasc Res. 56(2):197 (2002)（Cardiovasc Res. 56(2):181 (2002)において注釈）；Roth et al., Basic Res Cardiol 98(6):380 (2003)；Roth et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 287(1):H172 (2004)；Gao et al., J Biol Chem. 279(37):38797 (2004)；Tang et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 287(5):H1906 (2004)；Lai et al., Circulation. 110(3):330 (2004)（Circulation. 110(3):242 (2004)において注釈；Roth et al., Hum Gene Ther. 15(10):989 (2004)；Timofeyev et al., J Mol Cell Cardiol. 41(l):170 (2006)（J Mol Cell Cardiol. 41(3):424 (2006)において注釈；Takahashi et al., Circulation. 114(5):388 (2006)（誤り：Circulation. 114(11):e497(2006)；Circulation. 114(5):365 (2006)において注釈；Sastry et al., J Am Coll Cardiol 48(3):559 (2006)；Rebolledo et al., Hum Gene Ther. 17(10):1043 (2006)；Hammond H.K., Ann N Y Acad Sci. 1080:426 (2006)；Phan et al., Trends Cardiovasc Med. 17(7):215 (2007)；Tang et al., Circulation. 117(1):61 (2008)；およびLai et al., J Am Coll Cardiol. 51(15):1490 (2008)）。

特定の態様において、Ca2+結合タンパク質S100A1は、心機能を回復する可能性があり、ゆえに、本発明において用いられてもよい。S100A1は、インビボで心筋収縮を増加させて、心筋梗塞後に心不全を起こしがちな傾向を低減させることが知られている（Most et al., J Clin Invest. 114(11): 1550 (2004)；Most et al., Circulation. 114(12):1258 (2006)；Pleger et al., Mol Ther. 12(6):1120 (2005)；Pleger et al., Eur J Med Res. 11(10):418 (2006)；Remppis et al., J Gene Med. 6(4):387 (2004)；Most et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 293(2):R568 (2007)；Remppis et al., Basic Res Cardiol. 97 Suppl 1:156 (2002)；Pleger et al., Circulation. 115(19):2506 (2007)；およびMost et al., J Biol Chem. 278(36):33809 (2003)）。心機能を改善または回復する治療分子の他の非制限的な例は：パルブアルブミン（Hirsch et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 286(6):H2314 (2004)；Michele et al., Mol Ther. 10(2):399 (2004)；およびSakata et al., J Mol Cell Cardiol. 42(4):852 (2007)）、ホスファターゼ阻害剤2（Yamada et al., FASEB J. 20(8):1197 (2006)；Gupta et al., Mol Cell Biochem. 269(l-2):49 (2005)；およびKirchhefer et al., Cardiovasc Res. 68(1):98 (2005)）、およびホスファターゼ阻害剤1（Gupta et al., Mol Cell Biochem. 269(l-2):49 (2005)およびGupta et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285(6):H2373 (2003)）である。

疾患または障害を予防、処置、または改善するために本発明にとって有用である可能性がある追加の治療分子には、モノクローナル抗体（たとえば、HERCEPTIN（登録商標）-HC、HERCEPTIN（登録商標）-LC、TICILIMUMAB（登録商標）-HC、TICILIMUMAB（登録商標）-LC、ZENAPAX（登録商標）-HC、ZENAPAX（登録商標）-LC、HUMIRA（登録商標）-HC、HUMIRA（登録商標）-LC、RlTUXAN（登録商標）-HC、RlTUXAN（登録商標）-LC、IPILIMUMAB（登録商標）-HC、IPILIMUMAB（登録商標）-LC、AVASTIN（登録商標）-HC、AVASTIN（登録商標）-LC、Erbitux（登録商標）-HC、およびERBITUX（登録商標）-LC）、組み換え型酵素（たとえば、RETAVASE（登録商標）、ACTRAPID（登録商標）-A鎖、ACTRAPID（登録商標）-B鎖、NEULASTA（登録商標）、プレプロインスリン、EPOGEN（登録商標）、およびNORDITROPIN（登録商標））、融合タンパク質（たとえば、ENBREL（登録商標））、または任意の精製タンパク質（たとえば、ALPHANATE（登録商標）およびARALAST（登録商標））が含まれるがこれらに限定されるわけではない。加えて、特定の疾患または障害を予防、処置、または改善するために適した治療分子の同定は、当業者の能力の範囲内である。

ベクターおよび宿主細胞
ポリヌクレオチドを細胞に導入するために、ベクターを用いることができる。ベクターは、たとえばプラスミドベクターまたは一本鎖もしくは二本鎖のRNAまたはDNAウイルスベクターであってもよい。そのようなベクターは、DNAおよびRNAを細胞に導入するために周知の技術によって細胞に導入されてもよい。ウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルスの増殖は一般的に、補足的なウイルスコンピテント細胞に限って起こるであろう。

したがって、ベクターには、最低限、本発明のポリヌクレオチドが含まれなければならない。ベクターの他の成分には、選択マーカー、染色質改変ドメイン、ベクターに同様に存在する可能性がある他のポリペプチド（たとえば、致死ポリペプチド）の発現を駆動する追加のプロモーター、ゲノム組み込み部位、組み換え部位、および分子挿入ピボットが含まれてもよいがこれらに限定されるわけではない。望ましい治療法の特異的目標に合わせてベクターを作ることができる限り、ベクターは、ポリヌクレオチド内に、またはポリヌクレオチド内ではないところで、任意の数のこれらの追加のエレメントを含んでもよい。

本発明の1つの態様において、細胞に導入されるベクターはさらに、発現した場合に、本発明の治療遺伝子スイッチ構築物が改変細胞のゲノムに組み入れられていることを示す「選択可能なマーカー遺伝子」を含む。このようにして、選択遺伝子は、ゲノム組み込みの陽性マーカーでありうる。本発明の方法にとって重大ではないが、選択可能なマーカー遺伝子が存在することにより、実施者は、細胞のゲノムにベクター構築物が組み入れられている生存細胞集団を選択することができる。したがって、本発明の特定の態様は、ベクターが首尾よく組み入れられている細胞を選択する段階を含む。本明細書において用いられるように、「選択する」という用語またはその変化形は、細胞に関連して用いる場合、特異的遺伝子構成または表現型を有する細胞を選ぶための標準的な周知の方法を意味すると意図される。典型的な方法には、G418、ネオマイシン、およびアンピシリンなどの抗生物質の存在下で細胞を培養する段階が含まれるがこれらに限定されるわけではない。選択可能なマーカー遺伝子の他の例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ヒグロマイシン、またはミコフェノール酸に対する耐性を付与する遺伝子が含まれるがこれらに限定されるわけではない。他の選択法には、チミジンキナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼまたはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼを選択物質として用いることができる選択可能なマーカー遺伝子が含まれるがこれらに限定されるわけではない。1つまたは複数の抗生物質耐性遺伝子を含むベクター構築物を含む細胞は、培養において抗生物質に耐えることができるであろう。同様に、1つまたは複数の抗生物質耐性遺伝子を含むベクター構築物を含まない細胞は、培養において抗生物質に耐えることができないであろう。

本明細書において用いられるように、「染色質改変ドメイン」（CMD）は、これに限定されるわけではないがDNAインスレータなどの染色質構造の維持および／または変更に関連する多様なタンパク質と相互作用するヌクレオチド配列を指す。参照により本明細書に組み入れられる、Ciavatta et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 103:9958 (2006)を参照されたい。CMDの例には、ニワトリβ-グロビンインスレータおよびニワトリ過敏性部位4（cHS4）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。1つまたは複数の遺伝子プログラムのあいだで異なるCMD配列を用いることは（すなわち、プロモーター、コード配列、および3'調節領域）、たとえば存在する多遺伝子性および単一遺伝子性シャトルベクターのあいだで遺伝子プログラムを「交換する」ために、様々な微生物との組み合わせにおいて、またはインビトロ組み換え技術において「ミニ相同性アーム」として示差CMD DNA配列を用いることを促進しうる。染色質改変ドメインの他の例は、当技術分野において公知であるか、または容易に同定されうる。

本発明と共に用いられる特定のベクターは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードする発現ベクターである。一般的に、そのようなベクターは、発現するポリヌクレオチドに機能的に連結された、改変細胞における発現にとって有効であるシス作用制御領域を含む。適当なトランス作用因子は、改変細胞によって供給されるか、相補的ベクターによって供給されるか、または細胞に導入された際にベクター自体によって供給される。

非常に多様な発現ベクターを、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現させるために用いることができる。そのようなベクターには、染色体、エピソーム、およびウイルス由来ベクター、たとえば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、SV40などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクター、ならびにコスミドおよびファージミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメントに由来するベクターなどのその組み合わせに由来するベクターが含まれる。全ては、本発明のこの局面に従う発現のために用いることができる。一般的に、細胞においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドを維持、増殖、または発現させるために適した任意のベクターを、この点において発現のために用いることができる。

発現ベクターにおけるポリヌクレオチド配列は、例として、mRNA転写を指示するためのプロモーターが含まれる適当な発現制御配列に機能的に連結する。追加のプロモーターの代表には、構成的プロモーターおよび組織特異的または誘導型プロモーターが含まれるがこれらに限定されるわけではない。構成的真核細胞プロモーターの例には、マウスメタロチオネインI遺伝子のプロモーター（Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273 (1982)）；ヘルペスウイルスのTKプロモーター（McKnight, Cell 31:355 (1982)）；SV40初期プロモーター（Benoist et al., Nature 290:304 (1981)）；およびワクシニアウイルスプロモーターが含まれるがこれらに限定されるわけではない。先に記載した参考文献は全て、参照により本明細書に組み入れられる。タンパク質またはポリヌクレオチドの発現を駆動するために用いることができるプロモーターの追加の例には、組織特異的プロモーター、およびアルブミンプロモーター（肝細胞）、プロインスリンプロモーター（膵臓β細胞）等などの特異的タンパク質に関する他の内因性のプロモーターが含まれるがこれらに限定されるわけではない。一般的に、発現構築物は、転写、開始、および終止のための部位を含有し、転写領域において翻訳のためのリボソーム結合部位を含有するであろう。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分には、始めに翻訳開始AUGが含まれてもよく、翻訳されるポリペプチドの端部に適当に配置された終止コドン（UAA、UGA、またはUAG）が含まれてもよい。

加えて、構築物は、発現を調節するのみならず発生させる制御領域を含有してもよい。一般的に、そのような領域は、中でもリプレッサー結合部位およびエンハンサーなどの転写を制御することによって作動するであろう。

真核細胞ベクターの例には、Stratageneから入手可能なpW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、およびpSG；Amersham Pharmacia Biotechから入手可能なpSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL；ならびにClontechから入手可能なpCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito、およびpCMV-EGFPが含まれるがこれらに限定されるわけではない。他の多くのベクターが周知であり、市販されている。

遺伝子プログラムのエレメントを迅速に挿入および除去するための分子挿入ピボットを含む特に有用なベクターは、その全てが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2004/0185556号、米国特許出願第11/233,246号および国際出願公開WO 2005/040336およびWO2005/116231において記載される。そのようなベクターの例は、参照により本明細書に組み入れられる、WO 2007/038276において記載されるUltraVector（商標）産生システム（Intrexon Corp., Blacksburg, VA）である。本明細書において用いられるように、「遺伝子プログラム」は、プロモーター（P）、発現配列（E）、および3'調節配列（3）を含む遺伝子エレメントの組み合わせであり、そのため「PE3」は遺伝子プログラムである。遺伝子プログラム内のエレメントは、遺伝子プログラムのエレメントの各々に隣接する分子ピボット間で容易に交換されうる。本明細書において用いられる分子ピボットは、一列に整列させた少なくとも2つのまれなまたは一般的でない（uncommon）非可変制限部位を含むポリヌクレオチドとして定義される。1つの態様において、分子ピボットは、一列に整列させた少なくとも3つのまれなまたは一般的でない非可変制限部位を含む。典型的に、全ての分子ピボットは、同じ遺伝子プログラム内の他のいずれかの分子ピボットのまれなまたは一般的ではない制限部位を含まない。所定の制限酵素が作用する6ヌクレオチドより大きい同源の配列は、「まれな」制限部位であると呼ばれる。しかし、統計学的に予想されるであろうよりも少ない頻度で起こる6 bpの制限部位が存在し、これらの部位およびこれらを切断するエンドヌクレアーゼは、「一般的でない」制限部位と呼ばれる。まれなまたは一般的でない制限酵素の例には、AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、AflIII、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、Sgf I、Srf I、およびSse8781 Iが含まれるがこれらに限定されるわけではない。

ベクターはまた、ホーミングエンドヌクレアーゼ（HE）酵素と呼ばれる第二のクラスの制限酵素のための制限部位を含んでもよい。HE酵素は、大きな、非対称の制限部位（12〜40塩基対）を有し、その制限部位は天然では希少である。たとえば、I-SceIとして知られるHEは、ランダム配列の7×10¹⁰塩基対毎に1回のみ起こると予想される18 bpの制限部位

を有する。この発生率は、哺乳動物ゲノムサイズの20倍であるゲノムにおける単一の部位に相当する。HE部位がクローニングベクタープラスミドにおける適当な位置に含まれる場合、HE部位のまれな性質により、遺伝子プログラムの完全性を破壊することなく遺伝子操作によって遺伝子プログラムを切断できる可能性が大きく増大する。

宿主細胞における発現のための適当なベクターおよびプロモーターの選択は、周知の技法であり、宿主細胞へのベクター構築および導入ならびに宿主細胞におけるその発現のための必須の技術は、当技術分野においてルーチンの技術である。

細胞へのポリヌクレオチドの導入は、一過性のトランスフェクションであっても、安定なトランスフェクションであっても、またはベクターの遺伝子座特異的挿入であってもよい。ベクターの宿主細胞への一過性および安定なトランスフェクションは、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染、または他の方法によって行われうる。そのような方法は、参照により本明細書に組み入れられる、Davis et al. , Basic Methods in Molecular Biology (1986)；Keown et al., 1990, Methods Enzymol. 185: 527-37；Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y.などの多くの標準的な研究室マニュアルにおいて記載されている。これらの安定なトランスフェクション法によって、細胞のゲノムへのベクターの無作為な挿入が得られる。さらに、一般的に言えば、ベクターのコピー数および方向も同様に無作為である。

もう1つの態様において、遺伝子座特異的挿入はリコンビナーゼ部位特異的遺伝子挿入によって実行されてもよい。簡単に説明すると、PhiC31インテグラーゼなどの、しかしこれに限定されない細菌リコンビナーゼ酵素は、ヒトゲノム内で「偽」組み換え部位として作用しうる。これらの偽組み換え部位は、リコンビナーゼを用いる遺伝子座特異的挿入の標的でありうる。リコンビナーゼ部位特異的遺伝子挿入は、参照により本明細書に組み入れられる、Thyagarajan et al., Mol. Cell Biol. 21:3926 (2001)において記載される。リコンビナーゼ部位特異的遺伝子挿入のために用いられてもよいリコンビナーゼおよびそのそれぞれの部位の他の例には、R4およびTP901-1などのセリンリコンビナーゼ、および参照により本明細書に組み入れられる、WO 2006/083253において記載されるリコンビナーゼが含まれるがこれらに限定されるわけではない。

改変細胞のゲノムにおいて1つまたは複数の遺伝子発現系を安定に組み入れるために、任意の公知の組み込み法を、本発明の目的のために用いてもよい。1つの態様において、遺伝子座特異的挿入は、リコンビナーゼ部位特異的遺伝子挿入によって実行されてもよい。簡単に説明すると、PhiC31インテグラーゼなどの、しかしこれに限定されない細菌のリコンビナーゼ酵素は、ヒトゲノム内の「偽」組み換え部位に作用する可能性がある。米国特許出願公開第2004/0003420号Al；Groth et al., Proc. Natl. Acad. Science, 97, 5995-6000 (2000)を参照されたい。これらの偽組み換え部位は、リコンビナーゼを用いる遺伝子座特異的挿入のための標的であってもよい。リコンビナーゼ部位特異的遺伝子挿入は、Thyagarajan, B. et al., Mol. Cell Biol. 21(12):3926-34 (2001)において記載される。

特定の態様において、第一の誘導遺伝子発現系はさらに、標的化遺伝子のゲノム内の偽部位に第一の遺伝子スイッチシステムを安定に組み入れるであろうインテグラーゼを含む。第二の遺伝子スイッチシステムも同様に、標的化細胞のゲノム内の偽部位に第二の遺伝子スイッチシステムを組み入れるであろうインテグラーゼを含んでもよい。第一の遺伝子スイッチシステムは、インテグラーゼアクセプター部位をさらに含んでもよく、これによって標的化細胞のゲノム内での予め配置されたアクセプター部位に第二の誘導型遺伝子スイッチシステムが組み込まれる可能性がある。

以下のポリペプチド配列は、ストレプトミセス（Streptomyces）ファージPhiC31インテグラーゼポリペプチド配列をコードするポリペプチド配列として報告され、Genbankにおいてアクセッション番号NP_047974を有する。

ストレプトミセスファージphiC31インテグラーゼ（アミノ酸605個）（SEQ ID NO:6）

リコンビナーゼ部位特異的遺伝子挿入のために用いられてもよいリコンビナーゼおよびそのそれぞれの部位の他の例には、R4およびTP901-1などのセリンリコンビナーゼが含まれるがこれらに限定されるわけではない。バクテリオファージP1由来Creリコンビナーゼなどの部位特異的リコンビナーゼ（SSR）は、特異的DNA配列（「認識部位」、「認識配列」、または「インテグラーゼアクセプター部位」）を認識して、2つの認識部位のあいだの組み換えを触媒する。たとえばCreリコンビナーゼは、34塩基対（bp）のloxPモチーフを認識する（Austin et al., Cell 25,729-736 (1981)）。2つの部位が同じDNA分子に同じ方向に位置する場合、介在するDNA配列は、閉鎖環として親分子からリコンビナーゼによって切除され、各々の反応産物において1つの認識部位を残す。2つの部位が逆方向である場合、認識部位隣接領域はリコンビナーゼ媒介組み換えを通して逆位となる。または、2つの組み換え部位が異なる分子に存在する場合、リコンビナーゼ媒介組み換えによって、2つの直線状分子のあいだで環状分子の組み込みまたはトランスロケーションが起こるであろう。

Creに加えていくつかのリコンビナーゼは、哺乳動物細胞において何らかの活性を示すことが示されている。最もよく特徴決定された例は、酵母由来FLPおよびKwリコンビナーゼであり、これらは30℃で最適な活性を示し、37℃では不安定である（Buchholz et al., Nature Biotech., 16,657-662 (1998)；Ringrose et al., Eur. J. Biochem., 248, 903-912）。哺乳動物細胞において何らかの活性を示す他のリコンビナーゼには、ファージλの変異体インテグラーゼ、ファージHK022のインテグラーゼ、変異体γδ-レゾルバーゼ、およびβ-リコンビナーゼが含まれる（Lorbach et al., J. Mol. Biol, 296, 1175-81 (2000)；Kolot et al., Moi Biol Rep. 26,207-213 (1999)；Schwikardi et al., FEBS Lett., 471,147-150 (2000)；Diaz et al., J. Biol Chem., 274, 6634-6640 (1999)）。その上、phiC31インテグラーゼの改善版が開発されている。この改変C31-Int（C31-Int（CNLS））は、C-末端核局在化シグナル（NLS）を包含し、哺乳動物細胞において、野生型に対して有意に増強されかつCreリコンビナーゼの効率と同等である組み換え効率を示す（EP 1205490；米国特許出願公開第2004/0003420号Al）。これによって、C31-Intは哺乳動物ゲノム改変のための貴重なツールとなる。

本発明の1つの態様において、ベクターは、ゲノム中の生物学的中立部位に挿入される。生物学的中立部位とは、ポリヌクレオチドの挿入による細胞の正常な機能の干渉がたとえあるとしても非常に少ない、ゲノム中の部位である。生物学的中立部位は、利用可能なバイオインフォマティクスを用いて分析されうる。多数の生物学的中立部位が当技術分野において公知であり、たとえばROSA相当部位が知られている。他の生物学的中立部位は、当技術分野において周知のルーチン技術を用いて同定されてもよい。ゲノム挿入部位の特徴決定は、当技術分野において公知の方法を用いて行われる。ベクターを細胞に導入する場合のポリヌクレオチドの位置、コピー数および／または方向を制御するために、遺伝子座特異的挿入法を用いてもよい。遺伝子座特異的挿入法は当技術分野において周知であり、これには相同的組み換えおよびリコンビナーゼ媒介ゲノム挿入が含まれるがこれらに限定されるわけではない。当然、遺伝子座特異的挿入法を本発明の方法において用いる場合、ベクターは、相同的組み換えなどの、しかしこれに限定されないこの遺伝子座特異的挿入を助けるエレメントを含んでもよい。たとえば、ベクターは、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれより多いゲノム組み込み部位（GIS）を含んでもよい。本明細書において用いられるように、「ゲノム組み込み部位」は、ゲノムへのベクターの挿入を許容する細胞内のゲノムの部分と同一またはほぼ同一であるヌクレオチド配列を有する、ベクター配列の一部として定義される。特に、ベクターは、少なくともポリヌクレオチドに隣接する2つのゲノム挿入部位を含んでもよい。当然、GISは、ベクター上に存在する追加のエレメントに、または全てのエレメントにさえ隣接しうる。

さらなる態様において、ベクターは、化学物質耐性遺伝子、たとえば多剤耐性遺伝子mdr1、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはO⁶-アルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェラーゼを含んでもよい。化学物質耐性遺伝子は、構成的（たとえば、CMV）または誘導型（たとえば、RheoSwitch（登録商標））プロモーターの制御下にあってもよい。この態様において、対象内で改変細胞を維持しながら対象における疾患を処置することが望ましい場合、医師が疾患細胞を破壊するために化学療法剤を適用してもよい一方で、改変細胞を、適した化学物質耐性遺伝子の発現により物質から保護して、疾患、障害、または状態の処置、改善、または予防のために用い続けることができる。化学物質耐性遺伝子を誘導型プロモーターの下に置くことによって、化学物質耐性遺伝子の不必要な発現を回避することができ、さらに、持続的な処置が必要な場合には利用可能であろう。改変細胞自体が疾患を有するようになった場合、以下に記載されるように致死ポリペプチドの発現を誘導することによってそれらを破壊することができるであろう。

本発明の方法は、遺伝子スイッチ、および治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを対象の細胞に導入することによって実行される。先に記載した方法などの、当技術分野において公知の細胞にポリヌクレオチドを導入するために公知の任意の方法を用いることができる。

ポリヌクレオチドをエクスビボで細胞に導入する場合、細胞を、生検、擦過標本、および外科組織除去が含まれるがこれらに限定されるわけではない当技術分野において公知の任意の技術によって対象から得てもよい。単離した細胞を、ポリヌクレオチドを細胞に導入するために十分な期間、たとえば2、4、6、8、10、12、18、24、36、48時間またはそれより長く培養してもよい。初代細胞を短期間培養するための方法は、当技術分野において周知である。たとえば、細胞を、プレート（たとえば、マイクロウェルプレート）に付着させてまたは浮遊させて培養してもよい。

エクスビボ治療法のためには、細胞を対象から単離して、ポリヌクレオチドを該細胞に導入するために適した条件下で培養する。ポリヌクレオチドが細胞に導入された後、細胞をリガンド依存的転写因子複合体が発現するために十分な期間、たとえば、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18、24時間、またはそれより長くインキュベートする。ポリヌクレオチドの細胞への導入後のいくつかの時点で（リガンド依存的転写因子複合体の有意なレベルが発現する前または後のいずれかで）、細胞を対象に再導入する。再導入は、当技術分野において公知の任意の方法によって、たとえば静脈内注入または組織もしくは体腔への直接注入によって実行されてもよい。1つの態様において、細胞におけるポリヌクレオチドの存在は、対象に細胞を再導入する前に判定される。もう1つの態様において、ポリヌクレオチドを含有する細胞を選択して（たとえば、ポリヌクレオチドにおける選択可能なマーカーの存在に基づいて）、ポリヌクレオチドを含有する細胞のみを対象に再導入する。細胞が対象に再導入された後、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するためにリガンドを対象に投与する。代替的態様において、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドが細胞の再導入の前に発現するように、細胞を対象に再導入する前にリガンドを該細胞に加えてもよい。リガンドは、全身（たとえば、経口、静脈内）、または局所（たとえば、腹腔内、クモ膜下腔、心室内、細胞が再導入される組織または臓器への直接注射）のいずれかによる任意の適した方法によって投与されてもよい。リガンド投与の最適な時期は、ルーチンの技術のみを用いて、各々のタイプの細胞、および疾患、障害、または状態に対して決定されうる。

異なる態様において、非自己細胞、たとえば対象からの自己細胞の代わりに対象に対して同種異系または異種である細胞を用いて、エクスビボ治療法を実行してもよい。改変細胞を産生するために、ポリヌクレオチドをエクスビボで非自己細胞に導入してもよく、次に改変細胞を対象に導入してもよい。非自己細胞とは、幹細胞（胚幹細胞または造血幹細胞などの）および線維芽細胞を含むがこれらに限定されるわけではない、対象への移植後に生存可能な任意の細胞であってもよい。

本発明のインビボ治療法は、対象の細胞へのポリヌクレオチドの直接のインビボ導入を伴う。ポリヌクレオチドは、対象に全身または局所的（たとえば、疾患、障害、または状態の部位）に導入されてもよい。ポリヌクレオチドが対象に導入された後、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために、リガンドを投与してもよい。リガンドは、全身（たとえば、経口、静脈内）、または局所（たとえば、腹腔内、クモ膜下腔、心室内、疾患、障害、または状態が起こっている組織または臓器への直接注射）のいずれかの任意の適した方法によって投与されてもよい。リガンド投与の最適な時期は、ルーチンの技術のみを用いて、各々のタイプの細胞、および疾患、障害、または状態に対して決定されうる。

1つの態様において、リガンドは対象に持続的または間欠的に投与されてもよく、リガンドの投与パターンは疾患、障害、または状態の状況に応じて必要であれば変更されてもよい。治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現レベルは、リガンドの投与スケジュールと投与されるリガンドの量の双方によって調節することができ、それによって、治療的処置を注意深く制御することができる。

本発明の治療法はまた、薬学的診断学または治療学として当技術分野において公知である様々なアプローチにおいて処置転帰を改善するために、診断技術と組み合わせてもよい。たとえば、リガンドの投与を、疾患、障害、または状態の状況または進行のモニタリングと連係させてもよい。1つの態様において、本発明のポリヌクレオチドは、疾患、障害、または状態を診断またはモニターするために設計された1つまたは複数のポリヌクレオチドと共に細胞に導入される。もう1つの態様において、診断ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドを含む同じベクターに存在する。この態様において、処置の有効性をモニターするための治療的処置および診断試験は、1つの単位として共に投与され、処置を受ける細胞全てが確実に診断試験を受けるようにする。1つの態様において、診断ポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子に機能的に連結した診断スイッチプロモーター（すなわち、その活性が疾患、障害、または状態の際にモジュレートされるプロモーター）を含み、および疾患、障害、または状態の状況のモニタリングは、レポーター遺伝子の発現レベルを検出する段階を伴う。

本発明のもう1つの治療的態様において、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現レベルは、レポーター遺伝子の発現レベルの検出を通してモニターされ、レポーターの発現レベルは、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現レベルに直接相関する。たとえば、インターロイキン-12などの治療タンパク質の発現レベルを、放射活性ソマトスタチン類似体によって撮像してもよいヒト2型ソマトスタチン受容体などの生物学的に中立のレポーターを通して様々な組織において非侵襲的にモニターしてもよい（たとえば、Zinn et al., J. Nucl. Med 47:887-895 (2000)を参照されたい）。レポーターは、治療ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドと同じプロモーターに連結されてもよく、または治療ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドによってモジュレートされる異なるプロモーターの下に置かれてもよい。

本発明の追加の態様は、以下を含む、対象における治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現するための方法に関する：
（a）（1）疾患、障害、または状態の際に活性化される治療スイッチプロモーターに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子複合体をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子複合体によって活性化されるプロモーターに連結された治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを対象の細胞に導入して、改変細胞を産生する段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために、対象にリガンドを投与する段階。

1つの態様において、対象において治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現させるための方法は、実験動物（たとえば、マウス、ラット、ネコ、イヌ、サル）、または農場動物（たとえば、ブタ、ヒツジ、ウシ）を用いて実行されてもよい。たとえば、動物において治療産物を発現させる方法は、研究目的のために、または治療ポリペプチドもしくは治療ポリヌクレオチドの大規模産生のために実行されてもよい。

本発明のさらなる態様は、以下を含む、細胞における治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現させるための方法に関する：
（a）（1）疾患、障害、または状態の際に活性化される治療スイッチプロモーターに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子複合体をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子複合体によって活性化されるプロモーターに連結された治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して、改変細胞を産生する段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために、改変細胞にリガンドを投与する段階。

本発明のもう1つの態様は、以下を含む、1つまたは複数の改変細胞において治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現させるための方法である：
（a）（1）疾患、障害、または状態に関連する条件下で活性化される治療スイッチプロモーターとの機能的結合を通してリガンド依存的転写因子複合体をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードする、第一のポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子複合体によって活性化される因子調節プロモーターに機能的に結合した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドを細胞に導入して、それによって改変細胞を産生する段階：ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために改変細胞にリガンドを投与する段階。

1つの態様において、細胞において治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現させるための方法は、インビトロで、たとえば培養中の細胞において実行されてもよい。たとえば、インビトロでの治療産物発現法は、研究に使用するために、または治療ポリペプチドもしくは治療ポリヌクレオチドの大規模産生のために実行されてもよい。

本明細書において記載される任意の態様において、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリヌクレオチドまたはベクターを含有する細胞を殺すであろう産物を発現するようにスイッチを入れることができる致死ポリペプチドをコードする配列を含んでもよい。致死ポリペプチド発現は、処置がもはや必要でない場合、または改変細胞に問題がある（たとえば、過剰増殖性または毒性）場合のいずれかのために対象から改変細胞を消失させるために用いることができる。本明細書において用いられる致死ポリペプチドとは、ポリペプチド自体が致死的であるか、またはポリペプチドが致死的である化合物を産生するかのいずれかのために、発現すると、該ポリペプチドを発現した細胞にとって致死的となるポリペプチドである。本明細書において用いられるように、致死ポリペプチドには、壊死、アポトーシス、および細胞障害性が含まれるがこれらに限定されるわけではない任意の様式で細胞死を誘導するポリペプチドが含まれる。致死ポリペプチドの例には、これらに限定されるわけではないがp53、Rb、およびBRCA-1などのアポトーシス誘導腫瘍抑制遺伝子、ジフテリア毒素（DTA）、赤痢菌神経毒素、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、コレラ毒素、CSE-V2および例を挙げればサソリタンパク質毒素の他の変種などの毒素、シトシンデアミナーゼおよびチミジンキナーゼなどの自殺遺伝子、ならびに細胞障害性遺伝子、たとえば腫瘍壊死因子、インターフェロンαが含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明は、致死ポリペプチドが、それを発現する細胞にとって致死的であることができる限り、致死ポリペプチドの特徴に限定されない。改変細胞が短命な細胞である場合（たとえば、限られた寿命を有する細胞（たとえば、樹状細胞のような約10日またはそれ未満））、細胞が短期間のあいだに自然に除去されることから、ポリヌクレオチドまたはベクターに致死ポリペプチドを含める必要はない可能性がある。

先に記載した方法の各々に関して、1つの態様において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド、および、プロモーターに連結された治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、より大きな1つのポリヌクレオチド、たとえばベクターの一部である。もう1つの態様において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターに連結した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドであり、組み合わせて「核酸組成物」を形成してもよい。

1つの局面において、本発明は、本発明の方法において用いられてもよいポリヌクレオチドに関する。1つの態様において、ポリヌクレオチドは遺伝子スイッチをコードし、該遺伝子スイッチは少なくとも1つの転写因子配列を含み、該少なくとも1つの転写因子配列は、治療スイッチプロモーターに機能的に連結されたリガンド依存的転写因子複合体をコードし、プロモーターの活性は、疾患、障害、または状態の際にモジュレートされる。もう1つの態様において、ポリヌクレオチドはさらに、リガンド依存的転写因子複合体によって活性化される因子調節プロモーターに連結した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードする。1つの態様において、遺伝子スイッチはEcRに基づく遺伝子スイッチである。もう1つの態様において、遺伝子スイッチは、第一の治療スイッチプロモーターの制御下の第一の転写因子配列、および第二の治療スイッチプロモーターの制御下の第二の転写因子配列を含み、ここで、第一の転写因子配列および第二の転写因子配列にコードされるタンパク質が相互作用して、リガンド依存的転写因子複合体として機能するタンパク質複合体を形成する。1つの態様において、第一の治療スイッチプロモーターと第二の治療スイッチプロモーターは異なる。もう1つの態様において、第一の治療スイッチプロモーターと第二の治療スイッチプロモーターは同じである。もう1つの態様において、第一の転写因子配列は、ヘテロ二量体パートナーとトランス活性化ドメインとを含むタンパク質をコードして、第二の転写因子配列は、DNA結合ドメインとリガンド結合ドメインとを含むタンパク質をコードする。さらなる態様において、ポリヌクレオチドはまた、誘導型プロモーターに機能的に連結された致死ポリペプチドをコードする。

本発明のもう1つの局面は、先に記載された任意のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。1つの態様において、ベクターはプラスミドベクターまたはウイルスベクターである。

もう1つの局面において、本発明は、本発明の方法と共に用いられてもよいキットを提供する。本発明のこの局面に従うキットは、1つまたは複数の核酸分子と、制限酵素と、そのような核酸分子を含む1つまたは複数の細胞とからなる群より選択される1つまたは複数の成分を含有してもよい、1つまたは複数の容器を含んでもよい。本発明のキットはさらに、本発明の細胞を培養において支持するために適した支持細胞を含有する1つまたは複数の容器、本発明の細胞を培養するために適した細胞培養培地を含有する1つまたは複数の容器、本発明の細胞の培養において用いるために適した抗生物質を含有する1つまたは複数の容器、緩衝液を含有する1つまたは複数の容器、トランスフェクション試薬を含有する1つまたは複数の容器、酵素反応のための基質を含有する1つまたは複数の容器、および／あるいは、遺伝子スイッチ活性化のための1つまたは複数のリガンドを含んでもよい。

本発明のキットは、本発明と共に用いることができる広く多様な核酸分子を含有してもよい。本発明のキットにおいて供給されうる核酸分子の例には、プロモーター、遺伝子スイッチをコードする配列、エンハンサー、リプレッサー、選択マーカー、転写シグナル、翻訳シグナル、プライマーハイブリダイゼーション部位（たとえば、シークエンシングまたはPCRのため）、組み換え部位、制限部位およびポリリンカー、サプレッサーtRNAの存在下で翻訳の終止を抑制する部位、サプレッサーtRNAコード配列、ドメインおよび／または領域をコードする配列、複製開始点、テロメア、セントロメア等を含有する核酸分子が含まれる。1つの態様において、キットは、いかなる治療スイッチプロモーターも有しない遺伝子スイッチを含むポリヌクレオチドを含んでもよく、該ポリヌクレオチドは、関心対象の任意の治療スイッチプロモーターの挿入に適している。本発明の核酸分子は、先に記載したようにポリヌクレオチドのほかに、これらの特色の任意の1つまたは複数を含んでもよい。

本発明のキットは、1つまたは複数の組み換えタンパク質を含有する容器を含んでもよい。適した組み換えタンパク質には、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、Cin、Tn3レゾルバーゼ、ΦC31、TndX、XerC、およびXerDが含まれるがこれらに限定されるわけではない。他の適した組み換え部位およびタンパク質は、 Invitrogen Corp., Carlsbad, CAから入手可能なGATEWAY（商標）クローニング技術に関連し、その全開示が参照により本明細書に組み入れられる、GATEWAY（商標）クローニング技術の製品文献（バージョンE、2003年9月22日）において記載されている部位およびタンパク質である。

本発明のキットはまた、プライマーと共に供給されうる。これらのプライマーは一般的に、特異的ヌクレオチド配列を有する分子にアニールするように設計されるであろう。たとえば、これらのプライマーは、特定の核酸分子を増幅するためのPCRにおいて用いるために設計されうる。シークエンシングプライマーも同様にキットと共に供給されてもよい。

1つまたは複数の緩衝液（たとえば、1、2、3、4、5、8、10、15種類）が本発明のキットにおいて供給されてもよい。これらの緩衝液は、作業濃度で供給されてもよく、または濃縮型で供給されて、その後作業濃度に希釈されてもよい。これらの緩衝液は、緩衝液自体もしくは緩衝液中の分子いずれかの活性を増強するためにまたはその安定化のために、塩、金属イオン、共因子、金属イオンキレート剤等を含有することが多い。さらに、これらの緩衝液は、乾燥型または水溶液型で供給されてもよい。緩衝液が乾燥型で供給される場合、それらは一般的に使用前に水に溶解されるであろう。

本発明のキットは、先に述べたまたは本明細書において他所で記載した成分の実質的にいかなる組み合わせも含有してもよい。当業者が認識するように、本発明のキットと共に供給される成分は、キットに関して意図される使用によって変化するであろう。したがって、キットは、本出願において述べた様々な機能を行うように設計されてもよく、そのようなキットの成分はそれに従って変化するであろう。

実施例
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、本発明の範囲に何らかの制限を加えると解釈されるべきではない。以下の実施例が含まれる本発明の実践は、特に明記していない限り、当業者の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、および組み換えDNAに関する従来の技術を使用するであろう。そのような技術は、文献において詳しく説明される。たとえば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set), J. Sambrook, D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)；Genes VIII, B. Lewin, Prentice Hall (2003)；PCR Primer, C.W. Dieffenbach and G.S. Dveksler, CSHL Press (2003)；DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985)；Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology), P. Herdewijn (Ed.), Humana Press (2004)；Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th edition, R. I. Freshney, Wiley-Liss (2000)；Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait (Ed.), (1984)；Mullis et. al 米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984)；Nucleic Acid Hybridization, M. L. M. Anderson, Springer (1999)；Animal Cell Culture and Technology, 2nd edition, M. Butler, BIOS Scientific Publishers (2004)；Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (Practical Approach Series), J. Woodward, IRL Press (1992)；Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins (Eds.) (1984)；Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987)；A Practical Guide To Molecular Cloning, 3rd edition, B. Perbal, John Wiley & Sons Inc. (1988)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987)；Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155, Wu et.al (Eds.)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, (Eds.), Academic Press, London (1987)；およびAusubel et.al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)を参照されたい。

実施例1
本実施例は、血管新生の促進を通して、虚血性心疾患の処置のために有用な遺伝子治療ベクターを記載する。インスリン様増殖因子1は、虚血性心疾患の処置において有用である可能性があるホルモンである（IGF-1、GenBankアクセッション番号NP_001104753.1、SEQ ID NO:20）。前臨床モデルにおけるIGF-1の使用は、改善された心機能、抗アポトーシス、新生血管形成、および心筋再生に関連する（Santini, M.P., et al. Novartis Found Symp. 274:228-38 (2006)において論評；考察239-43, 272-6；およびSaetrum Opgaard, O., and Wang, P.H. Growth Horm IGF Res. 15:89-94 (2005)）。この目的のために、虚血および／または炎症に応答する誘導型IGF-1発現の例を与える。虚血組織において起こる低酸素条件での、リガンド投与時のIGF-1の発現に関する誘導型発現システムを図5に示す。

図5で示された構築物の完全なヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:7として提示される。構築物の主なエレメントのヌクレオチドの座標を表4に示す。

（表４）

図5で示されたベクターは、図1で示された遺伝子スイッチシステムに従って設計される。このシステムにおいてリガンド依存的転写因子複合体（LDTFC）のCAPサブユニットおよびLTFサブユニットはいずれも、リボソーム内部進入部位（IRES）を用いることによって1つの治療スイッチプロモーター（TSP-1）との機能的結合を通して発現する。このシステムにおいて利用されるプロモーターは、UV適合合成低酸素症誘導型プロモーターである。

治療産物IGF-1のコード領域を、リガンドの存在下でLDTFCに接触すると活性化される因子調節プロモーター（FRP）に、機能的に結合する。

図5で示された構築物を、虚血性心疾患の処置を必要とする対象に送達するために、適したベクター系、たとえばウイルスベクターに挿入する。

ベクターは、対象に全身的に、たとえば静脈内注入によって送達されてもよく、またはたとえば血管形成術によって心組織に直接送達されてもよい。遺伝子治療ベクターの全身および／または局所投与のための方法は当技術分野において周知である。送達されるとベクターは、細胞、たとえば心細胞に取り込まれ、適当な生理的条件下で転写因子が発現する。ベクターにコードされるLTFは、たとえば心虚血に関連する低酸素条件で発現する。リガンドが、処置される対象に投与され、これは、因子調節プロモーターの制御下で、発現したLDTFCと結合してIGF-1の発現を駆動する。次に、IGF-1発現は、虚血組織における標的化血管新生を促進する。

実施例2
本実施例は、血管新生および心保護の促進を通して虚血性心血管疾患の処置のために有用なバイオリアクター／細胞治療ベクターを記載する。虚血組織において起こる低酸素条件下でリガンドを投与すると、図6で示されたベクターは、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、GenBankアクセッション番号NP_001997、SEQ ID NO:21）の発現を起こす。

図6で示された構築物の完全なヌクレオチド配列はSEQ ID NO:8として提示される。構築物の主なエレメントのヌクレオチドの座標を表5に示す。

（表５）

図6で示されたベクターは、図2で示された遺伝子スイッチシステムに従って設計される。このシステムにおいて、LDTFCのCAPサブユニットは、第一の構成的治療スイッチプロモーターTSP-1との機能的結合を通して発現し、LDTFCのLTFサブユニットは、第二の誘導型治療スイッチプロモーター（TSP-2）との機能的結合を通して発現する。本構築物において用いられるプロモーターは、低酸素症誘導型制御プロモーター1である。

治療産物bFGFのコード領域を、リガンドの存在下でLDTFCに接触すると活性化されるFRPに、機能的に結合する。

処置される対象に導入する前に、図6で示された構築物を、細胞に導入するために適したベクターにおいて調製してもよい。細胞は、処置される対象から採取した自己細胞であってもよく、または初代細胞もしくは培養において維持された細胞株のいずれかである、非自己の同種異系細胞もしくは異種細胞であってもよい。改変細胞を産生するために、ベクターを任意の標準的な方法、たとえばトランスフェクション、形質導入、リポフェクション、または電気穿孔によって細胞に導入する。ベクターの導入後、バリアシステムを産生するように改変細胞を処置してもよく、たとえば免疫学的孤立を提供するために細胞をコーティングまたはカプセル封入してもよい。改変細胞は次に、虚血性心疾患の処置を必要とする対象に投与するためにバイオリアクターとして製剤化されるであろう。

ベクターは、対象に全身的に、たとえば静脈内注入によって送達されてもよく、またはたとえば血管形成術によって心組織に直接送達されてもよい。細胞に基づく治療の全身および／または局所投与のための方法は、当技術分野において周知である。送達されると、ベクターは細胞、たとえば心細胞に取り込まれて、ベクターにコードされるLTFが、たとえば心虚血に関連する低酸素条件下で発現する。処置される対象にリガンドが投与され、これは、発現したLDTFCに結合して、FRPの制御下でbFGFの発現を駆動するであろう。bFGF発現は次に、虚血組織における標的化血管新生および／または心保護を促進する。

実施例3
本実施例は、心保護の促進を通して虚血性心疾患の処置にとって有用なバイオリアクター／細胞治療ベクターを記載する。虚血組織において起こる低酸素条件下で、リガンドを投与すると、図7で示されたベクターは、ヒトエリスロポエチン（EPO、GenBankアクセッション番号CAA26095.1、SEQ ID NO:22）の発現を起こす。エリスロポエチンは、虚血に応答して、心保護および抗リモデリングにおいて機能することが示されている。

図7で示された構築物の完全なヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:9として提示される。構築物の主なエレメントのヌクレオチドの座標を表6に示す。

（表６）

図7で示されたベクターは、図2で示された遺伝子スイッチシステムに従って設計される。このシステムにおいて、LDTFCのCAPサブユニットは、第一の構成的治療スイッチプロモーター（TSP-1）との機能的結合を通して発現し、LDTFCのLTFサブユニットは、第二の誘導型治療スイッチプロモーター（TSP-2）との機能的結合を通して発現する。このベクターにおいて用いられる誘導型治療スイッチプロモーターは、低酸素誘導型制御プロモーター1である。

治療産物EPOのコード領域を、リガンドの存在下でLDTFCに接触すると活性化されるFRPに、機能的に結合する。

処置される対象に導入する前に、図7で示された構築物を、細胞に導入するために適したベクターにおいて調製してもよい。細胞は、処置される対象から採取した自己細胞であってもよく、または初代細胞もしくは培養において維持された細胞株のいずれかである非自己の同種異系細胞もしくは異種細胞であってもよい。改変細胞を産生するために、ベクターを任意の標準的な方法、たとえばトランスフェクション、形質導入、リポフェクション、または電気穿孔によって細胞に導入する。ベクターの導入後、バリアシステムを産生するように改変細胞を処置してもよく、たとえば免疫学的孤立を提供するために細胞をコーティングまたはカプセル封入してもよい。改変細胞は次に、虚血性心疾患の処置を必要とする対象に投与するためにバイオリアクターとして製剤化されるであろう。

ベクターは、対象に全身的に、たとえば静脈内注入によって送達されてもよく、またはたとえば血管形成術によって心組織に直接送達されてもよい。細胞に基づく治療の全身および／または局所投与のための方法は、当技術分野において周知である。送達されると、ベクターは細胞、たとえば心細胞に取り込まれて、ベクターにコードされるLTFが、たとえば心虚血に関連する低酸素条件下で発現する。処置される対象にリガンドが投与され、これは、発現したLDTFCに結合して、FRPの制御下でEPOの発現を駆動するであろう。EPO発現は次に、虚血組織における標的化心保護を促進する。

実施例4
本実施例は、血管新生および血行力学の促進を通して虚血性心血管疾患の処置のために有用なバイオリアクター／細胞治療ベクターを記載する。虚血組織において起こる低酸素条件下でリガンドを投与すると、図8で示されたベクターは、ヒト脳性ナトリウム利尿因子（BNP、GenBankアクセッション番号NP_002512、SEQ ID NO:23）の発現を起こす。BNPのみならず、リラキシン、ANF、CNPおよびアドレノモジュリンなどの他のナトリウム利尿ペプチドは、心臓における心保護、血管拡張、および抗リモデリングにおいて機能することが示されている。この目的に関して、虚血に応答するBNPの誘導型発現の例を与える。

図8で示された構築物の完全なヌクレオチド配列はSEQ ID NO:10として提示される。構築物の主なエレメントのヌクレオチドの座標を表7に示す。

（表７）

図8で示されたベクターは、図2で示された遺伝子スイッチシステムに従って設計される。このシステムにおいて、LDTFCのCAPサブユニットは、第一の構成的治療スイッチプロモーター（TSP-1）との機能的結合を通して発現し、LDTFCのLTFサブユニットは、第二の誘導型治療スイッチプロモーター（TSP-2）との機能的結合を通して発現する。このベクターにおいて用いられる誘導型TSP-2プロモーターは、低酸素誘導型制御プロモーター1である。

治療産物BNPのコード領域を、リガンドの存在下でLDTFCに接触すると活性化されるFRPに、機能的に結合する。

処置される対象に導入する前に、図8で示された構築物を、細胞に導入するために適したベクターにおいて調製してもよい。細胞は、処置される対象から採取した自己細胞であってもよく、または初代細胞もしくは培養において維持された細胞株のいずれかである非自己の同種異系細胞もしくは異種細胞であってもよい。改変細胞を産生するために、ベクターを任意の標準的な方法、たとえばトランスフェクション、形質導入、リポフェクション、または電気穿孔によって細胞に導入する。ベクターの導入後、バリアシステムを産生するように改変細胞を処置してもよく、たとえば免疫学的孤立を提供するために細胞をコーティングまたはカプセル封入してもよい。改変細胞は次に、虚血性心疾患の処置を必要とする対象に投与するためにバイオリアクターとして製剤化されるであろう。

ベクターは、対象に全身的に、たとえば静脈内注入によって送達されてもよく、またはたとえば血管形成術によって心組織に直接送達されてもよい。細胞に基づく治療の全身および／または局所投与のための方法は、当技術分野において周知である。送達されると、ベクターは細胞、たとえば心細胞に取り込まれて、ベクターにコードされるLTFが、たとえば心虚血に関連する低酸素条件下で発現する。処置される対象にリガンドが投与され、これは、発現したLDTFCに結合して、FRPの制御下でBNPの発現を駆動するであろう。BNP発現は次に、虚血組織における標的化心保護、血管拡張、および抗リモデリングを促進する。

実施例5
本実施例は、心臓におけるフィブリン沈着の切断を通して虚血性心血管疾患を処置するために有用なバイオリアクター／細胞治療ベクターを記載する。虚血組織において起こる炎症条件下でリガンドを投与すると、図9で示されたベクターは、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA、GenBankアクセッション番号AAO34406、SEQ ID NO:24）の発現を起こす。組織プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンの、フィブリンを分解する活性化酵素プラスミンへの変換を触媒するセリンプロテアーゼである。組み換え型tPAを用いることは、肺動脈塞栓症、心筋梗塞、および卒中などの疾患におけるフィブリン凝塊を切断するために血栓溶解剤として有効であることが証明されている。凝塊形成に加えて、心臓および血管における過剰なフィブリン沈着は、インスリン抵抗性糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および炎症に応答する心筋梗塞に関連する。この目的に関して、虚血に応答したtPAの誘導型発現の例を与える。

図9で示された構築物の完全なヌクレオチド配列をSEQ ID NO:11として提示する。構築物の主なエレメントのヌクレオチドの座標を表8に示す。

（表８）

図9で示されたベクターは、図2で示された遺伝子スイッチシステムに従って設計される。このシステムにおいて、LDTFCのCAPサブユニットは、第一の構成的治療スイッチプロモーター（TSP-1）との機能的結合を通して発現し、LDTFCのLTFサブユニットは、第二の誘導型治療スイッチプロモーター（TSP-2）との機能的結合を通して発現する。このベクターにおいて用いられる誘導型治療スイッチプロモーターは、ヒトプレキシンD1プロモーターである。

治療産物tPAのコード領域を、リガンドの存在下でLDTFCに接触すると活性化されるFRPに、機能的に結合する。

処置される対象に導入する前に、図9で示された構築物を、細胞に導入するために適したベクターにおいて調製してもよい。細胞は、処置される対象から採取した自己細胞であってもよく、または初代細胞もしくは培養において維持された細胞株のいずれかである非自己の同種異系細胞もしくは異種細胞であってもよい。改変細胞を産生するために、ベクターを任意の標準的な方法、たとえばトランスフェクション、形質導入、リポフェクション、または電気穿孔によって細胞に導入する。ベクターの導入後、バリアシステムを産生するように改変細胞を処置してもよく、たとえば免疫学的孤立を提供するために細胞をコーティングまたはカプセル封入してもよい。改変細胞は次に、虚血性心疾患の処置を必要とする対象に投与するためにバイオリアクターとして製剤化されるであろう。

ベクターは、対象に全身的に、たとえば静脈内注入によって送達されてもよく、またはたとえば血管形成術によって心組織に直接送達されてもよい。細胞に基づく治療の全身および／または局所投与のための方法は、当技術分野において周知である。送達されると、ベクターは細胞、たとえば心細胞に取り込まれて、ベクターにコードされるLTFが、たとえば心虚血に関連する炎症応答の事象において発現する。処置される対象にリガンドが投与され、これは、発現したLDTFCに結合して、FRPの制御下でtPAの発現を駆動するであろう。tPA発現は次に、虚血組織におけるフィブリン沈着の標的化切断を促進する。

実施例6
本実施例は、心保護、血管新生、および血行力学の促進を通して虚血性心血管疾患の処置にとって有用であるバイオリアクター／細胞治療ベクターを記載する。図10において記載されるベクターは、いずれも虚血組織において起こる炎症条件および／または低酸素症それぞれにおいて、リガンドの投与時に、2つの治療ポリペプチド、すなわちヒトリラキシン（GenBankアクセッション番号NP_604390.1、SEQ ID NO:25）およびヒト肝細胞増殖因子（HGF、GenBankアクセッション番号NP_000592.3、SEQ ID NO:26）の発現を起こす。リラキシンは、酸化窒素を伴う作用機序による全身および冠動脈循環の強力な血管拡張因子であり、心拍数に影響を及ぼす。HGFは前血管新生効果、心保護抗アポトーシス効果、抗線維症効果を提供する、虚血心筋層におけるI型コラーゲン再生因子である。この目的に関して、虚血に応答して別々に制御される、リラキシンおよびHGFの誘導型発現の例を与える。

図10で示された構築物の完全なヌクレオチド配列はSEQ ID NO:13として提示される。構築物の主なエレメントのヌクレオチドの座標を表9に示す。

（表９）

図10で示されたベクターは、図3で示された遺伝子スイッチシステムに従って設計される。このシステムにおいて、LDTFCのCAPサブユニットは、第一の構成的治療スイッチプロモーター（TSP-1）との機能的結合を通して発現し、第一のLTF（LTF-1）サブユニットは、第二の誘導型治療スイッチプロモーター（TSP-2）との機能的結合を通して発現し、第二のLTF（LTF-2）サブユニットは第三の誘導型治療スイッチプロモーター（TSP-3）との機能的結合を通して発現する。このベクターにおけるTSP-2はヒトプレキシンD1プロモーターであり、このベクターにおけるTSP-3は低酸素誘導型制御プロモーター1である。

第一の治療産物リラキシンのコード領域を、LTF-1の第一のDNA結合ドメインDBD-Aを認識する応答エレメントを有する第一のFRP（FRP-1）に機能的に結合させ、第二の治療産物HGFのコード領域を、LTF-2の第二のDNA結合ドメイン（DBD-B）を認識する応答エレメントを有する第二のFRP（FRP-2）に機能的に結合する。いずれのFRPも、リガンドの存在下でそれぞれのLDTFCに接触すると活性化される。

処置される対象に導入する前に、図10で示された構築物を、細胞に導入するために適したベクターにおいて調製してもよい。細胞は、処置される対象から採取した自己細胞であってもよく、または初代細胞もしくは培養において維持された細胞株のいずれかである非自己の同種異系細胞もしくは異種細胞であってもよい。改変細胞を産生するために、ベクターを任意の標準的な方法、たとえばトランスフェクション、形質導入、リポフェクション、または電気穿孔によって細胞に導入する。ベクターの導入後、バリアシステムを産生するように改変細胞を処置してもよく、たとえば免疫学的孤立を提供するために細胞をコーティングまたはカプセル封入してもよい。改変細胞は次に、虚血性心疾患の処置を必要とする対象に投与するためにバイオリアクターとして製剤化されるであろう。

ベクターは、対象に全身的に、たとえば静脈内注入によって送達されてもよく、またはたとえば血管形成術によって心組織に直接送達されてもよい。細胞に基づく治療の全身および／または局所投与のための方法は、当技術分野において周知である。送達されると、ベクターは細胞、たとえば心細胞に取り込まれて、LTF-1および／またはLTF-2は、たとえば心虚血に関連する炎症応答および／または低酸素の事象において発現する。1つまたは複数のリガンドが、処置される対象に投与されて、これは、発現したLDTFCに結合して、FRPの制御下でリラキシンおよび／またはHGFの発現を駆動するであろう。

実施例7
本実施例は、心修復および心保護の促進を通して虚血性心血管疾患の処置のために有用なバイオリアクター／細胞治療ベクターを記載する。虚血組織において起こる低酸素条件下でリガンドを投与すると、図11において記載されるベクターは、ヒトEPO（実施例3を参照されたい）の発現を起こす。EPOは、虚血に応答して心保護および抗リモデリングにおいて機能することが示されている。この例において、EPO発現は心組織に特異的に限定される。

図11で示されたベクターは、図2で示された遺伝子スイッチシステムに従って設計される。このシステムにおいて、CAPサブユニットは、心組織に対して特異的であるプロモーター（Nxc1心筋細胞特異的プロモーター）との機能的結合を通して発現し、LTFサブユニットは、低酸素誘導型制御プロモーター-1との機能的結合を通して発現する。

図11で示された構築物の完全なヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:12として提示される。構築物の主なエレメントのヌクレオチドの座標を表10に示す。

（表１０）

図11で示された構築物は、虚血性心疾患の処置を必要とする対象に送達するために、適したベクターシステム、たとえばウイルスベクターに挿入される。

ベクターは、対象に全身的に、たとえば静脈内注入によって送達されてもよく、またはたとえば、血管形成術によって心組織に直接送達されてもよい。遺伝子治療ベクターの全身および／または局所投与法は当技術分野において周知である。送達されると、ベクターは細胞、たとえば心細胞に取り込まれて、LDTFCが、適当な生理条件下で発現しうる。ベクターにコードされるLDTFCは、たとえば心虚血に関連する低酸素条件で心筋細胞において特異的に発現する。処置される対象にリガンドが投与され、これは、発現したLDTFCに結合して、FRPの制御下でEPOの発現を駆動するであろう。EPO発現は次に、虚血組織における標的化心保護を促進する。

実施例8
本実施例は、心修復および血管新生の促進を通して虚血性心疾患の処置にとって有用である遺伝子治療ベクターを記載する。その双方が虚血組織において起こる可能性がある炎症応答における低酸素条件のいずれかでリガンドを投与すると、図12で示されたベクターはヒトIGF-1（実施例1を参照されたい）の発現を起こす。この目的に関して、低酸素および／または炎症応答に応答した誘導型IGF-1発現の例を与える。本実施例において、IGF-1の誘導型発現は心筋細胞に特異的に限定される。

図12で示されたベクターは、図4で示された遺伝子スイッチシステムに従って設計される。このシステムにおいて、CAPサブユニットは、心組織に対して特異的であるプロモーター（Nxc1心筋細胞特異的プロモーター）との機能的結合を通して発現し、LDTFCのLTFサブユニット（LTF-1およびLTF-2）は、2つの誘導型TSP、すなわち低酸素誘導制御プロモーター-1との機能的結合を通しての第一のTSP、およびヒトプレキシンD1プロモーターとの機能的結合を通しての第二のTSPのいずれかを通して発現する。

治療産物IGF-1のコード領域を、リガンドの存在下でLDTFCに接触すると活性化されるFRPに、機能的に結合する。

図12で示された構築物の完全なヌクレオチド配列はSEQ ID NO:14として提示される。構築物の主なエレメントのヌクレオチドの座標を表11に示す。

（表１１）

図12で示された構築物は、虚血性心疾患の処置を必要とする対象に送達するために、適したベクターシステム、たとえばウイルスベクターに挿入される。

ベクターは、対象に全身的に、たとえば静脈内注入によって送達されてもよく、またはたとえば、血管形成術によって心組織に直接送達されてもよい。遺伝子治療ベクターの全身および／または局所投与法は当技術分野において周知である。送達されると、ベクターは細胞、たとえば心細胞に取り込まれて、LDTFCが、適当な生理条件下で発現する。ベクターにコードされるLDTFCは、たとえば心虚血に関連する低酸素条件下でおよび／または炎症応答の事象において、心筋細胞において特異的に発現する。処置される対象にリガンドが投与され、これは、発現した転写因子に結合して、FRPの制御下でIGF-1の発現を駆動するであろう。IGF-1発現は次に、虚血組織における標的化血管新生を促進する。

実施例9
本実施例は、リウマチ性関節炎、活動性強直性脊椎炎、もしくは斑状乾癬を処置するために、または活動性関節炎（「RAまたは関連疾患」）による構造的損傷を阻害するために有用なバイオリアクター／細胞治療ベクターを記載する。RAおよび関連疾患の従来の処置には、伝統的な疾患修飾抗リウマチ薬（DMARD）のみならず、エタネルセプト、インフリキシマブ、およびアダリムマブなどの生物学的DMARDが含まれる。たとえば、Amgenによって製造されるエタネルセプト（Enbrel（登録商標））は、ヒンジペプチドによってFc部分に融合されたヒトTNF-α受容体2の2つの細胞外ドメインを含有する融合タンパク質である。米国特許第7,276,477号（その全文が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。エタネルセプトは、1週間に1回または2回、皮下投与されるべきである。ゆえに、炎症またはサイトカイン応答プロモーターを利用したエタネルセプト遺伝子スイッチシステムを用いることは、TNF活性化の非存在下でのエタネルセプトの全ての産生を制限することによって、簡便性および安全性を増加させる可能性がある。

図13で示された構築物の完全なヌクレオチド配列はSEQ ID NO:16として提示される。構築物の主なエレメントのヌクレオチドの座標を表12に示す。

（表１２）

図13で示されたベクターは、図1で示された遺伝子スイッチシステムに従って設計される。このシステムにおいて、LDTFCのCAPサブユニットおよびLTFサブユニットはいずれも、リボソーム内部進入部位（IRES）を用いることによって1つのTSP-1との機能的結合を通して発現する。このシステムにおいて利用されるプロモーターは、TNF-αによって活性化される血管細胞接着分子（VCAM1）プロモーターである。本発明において用いられてもよいTNF-α調節プロモーターのもう1つの例は、TNF-αまたはインターロイキン（IL）-1βに応答するヒトペントラキシン3（PTX3）プロモーターである。Basile et al., J. Biol. Chem. 272(13): 8172 (1997)を参照されたい。

治療産物エタネルセプトのコード領域を、リガンドの存在下でLDTFCに接触すると活性化されるFRPに、機能的に結合する。

処置される対象に導入する前に、図13で示された構築物を、細胞に導入するために適したベクターにおいて調製してもよい。細胞は、処置される対象から採取した自己細胞であってもよく、または初代細胞もしくは培養において維持された細胞株のいずれかである非自己の同種異系細胞もしくは異種細胞であってもよい。改変細胞を産生するために、ベクターを任意の標準的な方法、たとえばトランスフェクション、形質導入、リポフェクション、または電気穿孔によって細胞に導入する。ベクターの導入後、バリアシステムを産生するように改変細胞を処置してもよく、たとえば免疫学的孤立を提供するために細胞をコーティングまたはカプセル封入してもよい。改変細胞は次に、RAの処置を必要とする対象に投与するためにバイオリアクターとして製剤化されるであろう。

細胞は、対象に全身的に、たとえば静脈内注入によって送達されてもよく、またはたとえば関節に直接送達されてもよい。遺伝子治療細胞の全身および／または局所投与は、当技術分野において周知である。細胞が送達されると、LDTFCは適当な生理条件下で発現しうる。ベクターにコードされるLDTFCは、たとえばRAに関連するTNF-αの存在下で発現する。処置される対象にリガンドが投与され、これは、発現したLDTFCに結合して、TNF-α調節プロモーターの制御下でエタネルセプトの発現を駆動するであろう。エタネルセプト発現は次に、TNF-αを捕捉して、組織におけるTNF-α濃度を低減させる。

実施例10
本実施例は、TNF-αレベルの低減を通してRAおよび関連疾患の処置にとって有用なバイオリアクター／細胞治療ベクターを記載する。その双方がRAまたは関連疾患において起こる可能性があるTNF-αおよび／または重度の炎症のいずれかの存在下でリガンドを投与すると、図14で示されたベクターは、エタネルセプトの発現を起こす。この目的に関して、TNF-αの存在および／または炎症応答に応答した誘導型エタネルセプト発現の例を与える。

図14で示されたベクターは、図4で示された遺伝子スイッチシステムに従って設計される。このシステムにおいて、CAPサブユニットは、構成的プロモーター（TSP-1）との機能的結合を通して発現し、LDTFCのLTFサブユニットは、2つの誘導型転写カセット、すなわちヒトプラスミノーゲン活性化因子阻害剤2型（PAI2）プロモーター（TSP-2）との機能的結合を通しての第一のカセット（LTF-1）、およびヒト血清アミロイドA1（SAA1）プロモーター（TSP-3）との機能的結合を通しての第二のカセット（LTF-2）のいずれかによって発現する。ヒトPAI2プロモーターは、TNF-αの存在下で活性化される。Mahony et al. Eur. J. Biochem. 263(3) (1999)およびMatsuo et al., Biochem. J. 405: 605 (2007)を参照されたい。SAA1プロモーターは、TNF-αなどの前炎症性サイトカインによって直接アップレギュレートされないが、グルココルチコイドなどの他の急性の炎症シグナルによってアップレギュレートされる。Kumon et al., Scandinavian J. Immunol. 56: 504 (2002)を参照されたい。

図14で示された構築物の完全なヌクレオチド配列はSEQ ID NO:15として提示される。構築物の主なエレメントのヌクレオチドの座標を表13に示す。

（表１３）

処置される対象に導入する前に、図14で示された構築物を、細胞に導入するために適したベクターにおいて調製してもよい。細胞は、処置される対象から採取した自己細胞であってもよく、または初代細胞もしくは培養において維持された細胞株のいずれかである非自己の同種異系細胞もしくは異種細胞であってもよい。改変細胞を産生するために、ベクターを任意の標準的な方法、たとえばトランスフェクション、形質導入、リポフェクション、または電気穿孔によって細胞に導入する。ベクターの導入後、バリアシステムを産生するように改変細胞を処置してもよく、たとえば免疫学的孤立を提供するために細胞をコーティングまたはカプセル封入してもよい。改変細胞は次に、RAの処置を必要とする対象に投与するためにバイオリアクターとして製剤化されるであろう。

細胞は、対象に全身的に、たとえば静脈内注入によって送達されてもよく、またはたとえば関節に直接送達されてもよい。遺伝子治療細胞の全身および／または局所投与のための方法は、当技術分野において周知である。細胞が送達されると、LDTFCは適当な生理条件下で発現しうる。ベクターにコードされるLDTFCは、TNF-αおよび／または重度の炎症の存在下で、投与された細胞において特異的に発現する。処置される対象にリガンドが投与され、これは、発現したLDTFCに結合して、FRPの制御下でエタネルセプトの発現を駆動するであろう。エタネルセプト発現は次に、TNF-αを捕捉して、組織におけるTNF-α濃度を低減させる。

実施例11
本実施例は、RAの処置にとって有用であるバイオリアクター／細胞治療ベクターを記載する。その双方がRA患者において起こるTNF-αおよび／または炎症状態の存在下でリガンドを投与すると、ベクターは、2つの治療ポリペプチド、エタネルセプトとヒトエリスロポエチン（EPO）の発現を起こす。EPOは、貧血RA患者において赤血球生成を誘発する。Mercuriali et al. Transfusion 34(6): 501 (2003)を参照されたい。この目的に関して、RAおよび貧血に応答してエタネルセプトおよびEPOの個々に制御された誘導型発現の例をそれぞれ与える。

図15で示された構築物の完全なヌクレオチド配列はSEQ ID NO:17として提示される。構築物の主なエレメントのヌクレオチドの座標を表14に示す。

（表１４）

図15で示されたベクターは、図3で示された遺伝子スイッチシステムに従って設計される。このシステムにおいて、LDTFCのCAPサブユニットは、第一の構成的TSP-1との機能的結合を通して発現し、LDTFCの第一のLTFサブユニット（LTF-1）は、第二の誘導型TSP-2との機能的結合を通して発現し、LDTFCの第二のLTFサブユニット（LTF-2）は、第三の誘導型TSP-3との機能的結合を通して発現する。このベクターにおいて用いられる第二の誘導型TSP-2は、ヒト血清アミロイドA1（SAA1）プロモーターであり、このベクターにおいて用いられる第三の誘導型TSP-3は、低酸素誘導制御プロモーター1である。

第一の治療産物であるエタネルセプトのコード領域を、LTF-1に結合する第一のDNA結合ドメイン（DBD-A）を認識する応答エレメントを有する第一のFRP-1に機能的に結合させ、第二の治療産物EPOのコード領域を、LTF-2に結合する第二のDNA結合ドメイン（DBD-B）を認識する応答エレメントを有する第二のFPR-2に機能的に結合する。因子調節プロモーターはいずれも、リガンドの存在下でそれぞれのLDTFCに接触すると活性化される。

処置される対象に導入する前に、図15で示された構築物を、細胞に導入するために適したベクターにおいて調製してもよい。細胞は、処置される対象から採取した自己細胞であってもよく、または初代細胞もしくは培養において維持された細胞株のいずれかである非自己の同種異系細胞もしくは異種細胞であってもよい。改変細胞を産生するために、ベクターを任意の標準的な方法、たとえばトランスフェクション、形質導入、リポフェクション、または電気穿孔によって細胞に導入する。ベクターの導入後、バリアシステムを産生するように改変細胞を処置してもよく、たとえば免疫学的孤立を提供するために細胞をコーティングまたはカプセル封入してもよい。改変細胞は次に、RAの処置を必要とする対象に投与するためにバイオリアクターとして製剤化されるであろう。

細胞は、対象に全身的に、たとえば静脈内注入によって送達されてもよく、または関節に直接送達されてもよい。遺伝子治療細胞の全身および／または局所投与のための方法は、当技術分野において周知である。細胞が送達されると、LDTFCは適当な生理条件下で発現しうる。1つまたは複数のリガンドが、処置される対象に投与され、これは発現したLDTFCに結合して、FRP-1またはFRP-2の制御下でエタネルセプトおよび／またはEPOの発現を駆動するであろう。エタネルセプト発現は次に、TNF-αを捕捉して組織におけるTNF-α濃度を低減させ、EPO発現は、赤血球生成を誘導して貧血を改善する。

実施例12
本実施例は、血友病の処置にとって有用なバイオリアクター／細胞治療ベクターを記載する。血友病は、第VIII因子または第IX因子のいずれかの欠損によって引き起こされる。第VIII因子の欠損は血友病Aと呼ばれ、第IX因子の欠損は、血友病Bと呼ばれる。血友病AまたはBは、組み換えによって産生された第VIII因子またはIX因子をそれぞれ投与することによって処置される可能性がある。Garcia-Martin et al., J. Gene Med. 4(2): 215 (2002)を参照されたい。たとえば、本発明において用いられてもよい組み換えによって産生された第VIII因子には、RECOMBINATE（登録商標）（Baxterによって販売）、BIOCLATE（登録商標）（Aventisによって販売）、KOGENATE（登録商標）（Bayerによって販売）、HELIXATE（登録商標）（Aventisによって販売）、またはADVATE（登録商標）（Baxterによって販売）などの完全長の第VIII因子、REFACTO（登録商標）およびXYNTHA（登録商標）（いずれもGenetics Institute and Wyethによって販売）などのB-ドメイン欠失第VIII因子、またはALPHANATE（登録商標）（Grifols Biologicals, Inc.によって販売）などの第VIII因子およびフォン・ヴィレブランド因子複合体が含まれるがこれらに限定されるわけではない。この目的に関して、リガンドの投与に応答したバイオリアクター／細胞治療のための誘導可能なALPHANATE（登録商標）発現の例を、図16に示す。バイオリアクター／細胞治療を用いることにより、安定性および持続的注入の問題が改善する。Pipe S.W., J. Thromb. Haemost. 3(8):1692 (2005)を参照されたい。

図16で示された構築物の完全なヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:18として提示される。構築物の主なエレメントのヌクレオチドの座標を表15に示す。

（表１５）

図16で示されたベクターは、図2で示された遺伝子スイッチシステムに従って設計される。このシステムにおいて、CAPサブユニットは、第一の構成的プロモーター（TSP-1）との機能的結合を通して発現し、LDTFCのLTFサブユニットは、第二の構成的プロモーター（TSP-2）との機能的結合を通して発現する。第一の構成的プロモーターのために利用されるプロモーターは、UbC（短い）プロモーターであり、第二の構成的プロモーターのために利用されるプロモーターはUbB（短い）プロモーターである。

治療産物ALPHANATE（登録商標）のコード領域を、リガンドの存在下でLDTFCに接触すると活性化されるFRPに、機能的に結合する。

処置される対象に導入する前に、図16で示された構築物を、細胞に導入するために適したベクターにおいて調製してもよい。細胞は、処置される対象から採取した自己細胞であってもよく、または初代細胞もしくは培養において維持された細胞株のいずれかである非自己の同種異系細胞もしくは異種細胞であってもよい。改変細胞を産生するために、ベクターを任意の標準的な方法、たとえばトランスフェクション、形質導入、リポフェクション、または電気穿孔によって細胞に導入する。ベクターの導入後、バリアシステムを産生するように改変細胞を処置してもよく、たとえば免疫学的孤立を提供するために細胞をコーティングまたはカプセル封入してもよい。改変細胞は次に、血友病の処置を必要とする対象に投与するためにバイオリアクターとして製剤化されるであろう。

細胞は、対象に全身的に、たとえば静脈内注入によって送達されてもよい。遺伝子治療細胞の全身および／または局所投与は、当技術分野において周知である。細胞が送達されると、LDTFCは構成的に発現しうる。処置される対象にリガンドが投与され、これは、発現したLDTFCに結合して、因子調節プロモーターの制御下でALPHANATE（登録商標）の発現を駆動するであろう。ALPHANATE（登録商標）発現は次に、血友病の症状を処置する。

実施例13
本実施例は、血友病を処置するために有用なバイオリアクター／細胞治療ベクターを記載する。図17で示されたベクターは、図1で示された遺伝子スイッチシステムに従って設計される。このシステムにおいて、LDTFCのCAPサブユニットおよびLTFサブユニットはいずれも、内部リボソーム進入部位（IRES）を用いることによって1つの構成的プロモーター（TSP-1）との機能的結合を通して発現する。構成的プロモーターは、UbC（短い）プロモーターである。

図17で示された構築物の完全なヌクレオチド配列はSEQ ID NO:19として提示される。構築物の主なエレメントのヌクレオチドの座標を表16に示す。

（表１６）（MOD 8361）

処置される対象に導入する前に、図17で示された構築物を、細胞に導入するために適したベクターにおいて調製してもよい。細胞は、処置される対象から採取した自己細胞であってもよく、または初代細胞もしくは培養において維持された細胞株のいずれかである非自己の同種異系細胞もしくは異種細胞であってもよい。改変細胞を産生するために、ベクターを任意の標準的な方法、たとえばトランスフェクション、形質導入、リポフェクション、または電気穿孔によって細胞に導入する。ベクターの導入後、バリアシステムを産生するように改変細胞を処置してもよく、たとえば免疫学的孤立を提供するために細胞をコーティングまたはカプセル封入してもよい。改変細胞は次に、血友病の処置を必要とする対象に投与するためにバイオリアクターとして製剤化されるであろう。

本発明の追加の態様には、以下が含まれる：
E1．以下を含む、対象における疾患、または障害を処置、改善、または予防するための方法：
（a）（1）疾患または障害の際に活性化される治療スイッチプロモーターに機能的に連結したリガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子によって活性化されるプロモーターに連結した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを対象の細胞に導入して、それによって改変細胞を産生する段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために対象にリガンドを投与する段階であって、該治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドが、疾患または障害を処置、改善、または予防するために十分なレベルで発現する、段階。

E2．以下を含む、対象において治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現させるための方法：
（a）（1）疾患または障害の際に活性化される治療スイッチプロモーターに機能的に連結したリガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子によって活性化されるプロモーターに連結した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを対象の細胞に導入して、改変細胞を産生する段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために対象にリガンドを投与する段階。

E3．ポリヌクレオチドが対象から単離されている細胞に導入されて改変細胞を産生し、改変細胞が対象に再導入される、E1またはE2記載の方法。

E4．インビボで実行される、E1またはE2記載の方法。

E5．遺伝子スイッチがエクジソン受容体（EcR）に基づく遺伝子スイッチである、E1またはE2記載の方法。

E6．リガンドがEcRリガンド結合ドメインに結合する、E5記載の方法。

E7．リガンドがジアシルヒドラジンである、E6記載の方法。

E8．リガンドがRG-115819、RG-115932、およびRG-115830からなる群より選択される、E7記載の方法。

E9．リガンドがアミドケトンまたはオキサジアゾリンである、E6記載の方法。

E10．遺伝子スイッチが、第一の治療スイッチプロモーターの制御下に第一の転写因子配列を、および第二の治療スイッチプロモーターの制御下に第二の転写因子配列を含み、該第一の転写因子配列および第二の転写因子配列にコードされるタンパク質が相互作用して、リガンド依存的転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、E1またはE2記載の方法。

E11．第一の治療スイッチプロモーターと第二の治療スイッチプロモーターが異なる、E10記載の方法。

E12．第一の治療スイッチプロモーターと第二の治療スイッチプロモーターが同じである、E10記載の方法。

E13．第一の転写因子配列がヘテロ二量体パートナーとトランス活性化ドメインとを含むタンパク質をコードする、E10記載の方法。

E14．第二の転写因子配列がDNA結合ドメインとリガンド結合ドメインとを含むタンパク質をコードする、E10記載の方法。

E15．ポリヌクレオチドの1つが誘導可能なプロモーターに機能的に連結された致死ポリペプチドをさらにコードする、E1またはE2記載の方法。

E16．以下を含む、細胞において治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現させるための方法：
（a）（1）疾患または障害の際に活性化される治療スイッチプロモーターに機能的に連結したリガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子によって活性化されるプロモーターに連結した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して、改変細胞を産生する段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために改変細胞にリガンドを投与する段階。

E17．インビトロで実行される、E16記載の方法。

E18．対象から単離されている細胞においてエクスビボで実行される、E16記載の方法。

E19．インビボで実行される、E16記載の方法。

E20．遺伝子スイッチがEcRに基づく遺伝子スイッチである、E16記載の方法。

E21．リガンドがEcRリガンド結合ドメインに結合する、E20記載の方法。

E22．リガンドがジアシルヒドラジンである、E21記載の方法。

E23．リガンドがRG-115819、RG-115932、およびRG-115830からなる群より選択される、E22記載の方法。

E24．リガンドがアミドケトンまたはオキサジアゾリンである、E21記載の方法。

E25．遺伝子スイッチが、第一の治療スイッチプロモーターの制御下に第一の転写因子配列を、および第二の治療スイッチプロモーターの制御下に第二の転写因子配列を含み、該第一の転写因子配列および第二の転写因子配列にコードされるタンパク質が相互作用して、リガンド依存的転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、E16記載の方法。

E26．第一の治療スイッチプロモーターと第二の治療スイッチプロモーターが異なる、E25記載の方法。

E27．第一の治療スイッチプロモーターと第二の治療スイッチプロモーターが同じである、E25記載の方法。

E28．第一の転写因子配列がヘテロ二量体パートナーとトランス活性化ドメインとを含むタンパク質をコードする、E25記載の方法。

E29．第二の転写因子配列がDNA結合ドメインとリガンド結合ドメインとを含むタンパク質をコードする、E25記載の方法。

E30．ポリヌクレオチドの1つが誘導可能なプロモーターに機能的に連結された致死ポリペプチドをさらにコードする、E16記載の方法。

E31．プロモーターの活性が疾患または障害の際にモジュレートされる、治療スイッチプロモーターに機能的に連結したリガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド。

E32．リガンド依存的転写因子によって活性化されるプロモーターに連結されたレポーター遺伝子をさらにコードする、E31記載のポリヌクレオチド。

E33．遺伝子スイッチがEcRに基づく遺伝子スイッチである、E31記載のポリヌクレオチド。

E34．遺伝子スイッチが、第一の治療スイッチプロモーターの制御下に第一の転写因子配列を、および第二の治療スイッチプロモーターの制御下に第二の転写因子配列を含み、該第一の転写因子配列および第二の転写因子配列にコードされるタンパク質が相互作用して、リガンド依存的転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、E31記載のポリヌクレオチド。

E35．第一の治療スイッチプロモーターと第二の治療スイッチプロモーターが異なる、E34記載のポリヌクレオチド。

E36．第一の治療スイッチプロモーターと第二の治療スイッチプロモーターが同じである、E34記載のポリヌクレオチド。

E37．第一の転写因子配列がヘテロ二量体パートナーとトランス活性化ドメインとを含むタンパク質をコードする、E34記載のポリヌクレオチド。

E38．第二の転写因子配列がDNA結合ドメインとリガンド結合ドメインとを含むタンパク質をコードする、E34記載のポリヌクレオチド。

E39．誘導可能なプロモーターに機能的に連結された致死ポリペプチドをさらにコードする、E31記載のポリヌクレオチド。

E40．E31記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

E41．プラスミドベクターである、E40記載のベクター。

E42．ウイルスベクターである、E40記載のベクター。

E43．E31記載のポリヌクレオチドを含むキット。

E44．E42記載のベクターを含むキット。

本発明はさらに、本発明の1つまたは複数の方法を行うための説明書に関する。そのような説明書は、本発明の方法を行うために適した条件をユーザーに教えることができる。本発明の説明書は、有形、たとえば書面での説明書（たとえば、紙にタイプされた）、または無形、たとえばコンピューターディスクによってもしくはインターネットによってアクセス可能な形でありうる。

本発明の方法を行うための説明書、または説明書がキットに含まれる場合にはキットを用いるための説明書の完全な本文が提供される必要はないことが認識されるであろう。本発明のキットがたとえばそのような完全な長さの説明書を含有しない状況の1つの例は、提供される指示によって、キットを用いることができる方法を実践するための説明書を得る場所をキットのユーザーに知らせる場合である。このように、本発明の方法を行うための説明書は、インターネットウェブページ、個別に販売されるもしくは流通しているマニュアル、または他の製品文献等から得ることができる。したがって本発明には、キットに直接封入されていないおよび／または配布されていない説明書を見いだすことができる1つまたは複数の場所をキットユーザーに指示するキットが含まれる。そのような説明書は、電子型または印刷型が含まれるがこれらに限定されるわけではない任意の形状でありうる。

本発明を十分に詳しく記載してきたが、同じことを広く同等の範囲の条件、処方、および他のパラメータ内で行うことができ、それらも本発明の範囲またはその任意の態様に影響を及ぼさないことは当業者に理解されるであろう。本明細書において引用された全ての特許、特許出願、および出版物は、その全文が参照により本明細書に十分に組み入れられる。

Claims

以下を含む、対象における疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防するための方法：
（a）（1）治療スイッチプロモーターとの機能的結合を通してリガンド依存的転写因子複合体（LDTFC）をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードする、第一のポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子複合体によって活性化される因子調節プロモーターに機能的に結合した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドを、対象に導入する段階であって、該第一および第二のポリヌクレオチドがリガンド依存的転写因子複合体の発現を可能とするように導入される、段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために対象にリガンドを投与する段階。
以下を含む、対象において治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現させるための方法：
（a）（1）治療スイッチプロモーターとの機能的結合を通してリガンド依存的転写因子複合体をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードする、第一のポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子複合体によって活性化される因子調節プロモーターに機能的に結合した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドを対象に導入する段階であって、該第一および第二のポリヌクレオチドがリガンド依存的転写因子複合体の発現を可能とするように導入される、段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために対象にリガンドを投与する段階。
治療スイッチプロモーターが構成的である、請求項1または2記載の方法。
治療スイッチプロモーターが、疾患、障害、または状態に関連する条件下でリガンド依存的転写因子複合体の発現を可能とするように、疾患、障害、または状態に関連する条件下で活性化される、請求項1または2記載の方法。
疾患、障害、または状態が、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドに対して応答性である、請求項4記載の方法。
治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドが、疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防するために十分なレベルで発現および散在する、請求項1または2記載の方法。
遺伝子スイッチがエクジソン受容体（EcR）に基づく遺伝子スイッチである、請求項1または2記載の方法。
リガンドがEcRリガンド結合ドメインに結合する、請求項7記載の方法。
リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項8記載の方法。
リガンドが、RG-115819、RG-115932、およびRG-115830からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
リガンドがアミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項8記載の方法。
遺伝子スイッチが、第一の治療スイッチプロモーターの制御下に第一の転写因子配列を、および第二の治療スイッチプロモーターの制御下に第二の転写因子配列を含み、該第一の転写因子配列および第二の転写因子配列にコードされるタンパク質が相互作用して、リガンド依存的転写因子複合体として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項1または2記載の方法。
第一の治療スイッチプロモーターと第二の治療スイッチプロモーターが異なる、請求項12記載の方法。
第一の治療スイッチプロモーターと第二の治療スイッチプロモーターが同じである、請求項12記載の方法。
第一の転写因子配列がヘテロ二量体パートナーとトランス活性化ドメインとを含むタンパク質をコードする、請求項12記載の方法。
第二の転写因子配列がDNA結合ドメインとリガンド結合ドメインとを含むタンパク質をコードする、請求項12記載の方法。
第一および第二のポリヌクレオチドが、1つまたは複数の改変細胞の状態で対象に導入される、請求項1または2記載の方法。
改変細胞が、改変自己細胞を産生するために、対象から単離されている細胞に第一および第二のポリヌクレオチドを導入することによって調製され、その後対象に再導入される、請求項17記載の方法。
改変細胞が、第一および第二のポリヌクレオチドが組み入れられている改変非自己（MNA）細胞である、請求項17記載の方法。
MNA細胞が対象に対して同種異系である、請求項19記載の方法。
MNA細胞が対象に対して異種である、請求項19記載の方法。
MNA細胞が、不死化細胞および最終分化を行うことができる初代細胞からなる群より選択される細胞タイプから生成される、請求項19記載の方法。
MNA細胞が、C2C12マウス筋芽細胞、HEK293ヒト胎児腎細胞、ARPE-19細胞、hMSC細胞、膵島細胞、MDCK細胞、CHO細胞、星状細胞由来細胞、乏突起膠細胞由来細胞、および筋芽細胞由来細胞からなる群より選択される細胞タイプから生成される、請求項22記載の方法。
膵島細胞がブタ島細胞である、請求項23記載の方法。
膵島細胞が、死体に由来するヒト島細胞である、請求項23記載の方法。
改変細胞が、対象に導入された場合に該細胞が対象の免疫系から保護されるように処理されている、請求項17記載の方法。
治療タンパク質または治療ポリヌクレオチドを散在させるが、改変細胞と対象の免疫系の細胞との直接接触を防止するバリアシステム内に、改変細胞が含有される、請求項26記載の方法。
バリアシステムがコンフォーマルコーティングを有する改変細胞を含む、請求項27記載の方法。
コンフォーマルコーティングがポリマーを含む、請求項28記載の方法。
ポリマーが、ポリエチレングリコールおよびヒドロキシエチルメタクリレート-メチルメタクリレート（HEMA-MMA）からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
バリアシステムがカプセル封入された改変細胞を含む、請求項27記載の方法。
改変細胞がマクロカプセル封入デバイスに含有される、請求項31記載の方法。
マクロカプセル封入デバイスが1つまたは複数の合成膜を含む、請求項32記載の方法。
マクロカプセル封入デバイスが、マクロカプセル封入デバイスを通しての物質の移動を調節するために異なる孔サイズを含む2つまたはそれより多い合成膜を含む、請求項33記載の方法。
マクロカプセル封入デバイスが、半透過性のポリマー外膜と、細胞を支持する内部足場とを含む、請求項32記載の方法。
マクロカプセル封入デバイスが長さ約6 mmおよび直径約1 mmである、請求項35記載の方法。
外膜が約15 nmの孔を含む、請求項35記載の方法。
内部足場がポリ(エチレンテレフタレート)ヤーンを含む、請求項35記載の方法。
マクロカプセル封入デバイスの内部空間が、改変細胞を少なくとも1個〜約10⁵個含む、請求項32記載の方法。
マクロカプセル封入デバイスが、内側のより小さな孔の0.45μM PFTE免疫バリア層の上に薄層を形成した5μm PTFE膜の外層を含むポリマー膜二重層を含む、請求項32記載の方法。
マクロカプセル封入デバイスが、ポリマー膜二重層の外側に不織ポリメッシュ層をさらに含む、請求項40記載の方法。
マクロカプセル封入デバイスがPES中空繊維デバイスを含む、請求項32記載の方法。
マクロカプセル封入デバイスが縫合クリップをさらに含む、請求項32記載の方法。
マクロカプセル封入デバイスが埋め込み可能で回収可能である、請求項32記載の方法。
改変細胞がマイクロカプセル封入される、請求項31記載の方法。
改変細胞が生物学的に適合性のカプセル封入材料に懸濁され、次にビーズ様構造に形成される、請求項45記載の方法。
カプセル封入材料がハイドロゲルを含む、請求項46記載の方法。
カプセル封入材料が、セルロースおよびアルギネートからなる群より選択されるポリマーを含む、請求項46記載の方法。
ポリマーが、相互作用して物理的選択透過性の膜バリアを形成するために、多価陰イオンアルギネートと多価陽イオンポリマーとを含む、請求項48記載の方法。
ビーズ様構造がそれぞれ、改変細胞を少なくとも1個〜約10³個含む、請求項46記載の方法。
ビーズ様構造がポリ(L-ラクチド)酸(PLLA)アルギネートミクロスフェアを含む、請求項46記載の方法。
ビーズ様構造が、ポリ-L-オルニチン（PLO）アルギネートコーティングをさらに含む、請求項48記載の方法。
カプセル封入材料が、アルギネートに基づく超高粘度（UHV）バイオポリマーを含む、請求項48記載の方法。
アルギネートに基づくUHVポリマーが生体分解性である、請求項53記載の方法。
ビーズ様構造がほぼ球形であり、直径約500μmである、請求項46記載の方法。
バリアシステムが改変細胞に対して保護を提供することができる保護細胞をさらに含み、保護細胞がセルトリ細胞および赤血球からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
バリアシステムが保護的微小環境を作製することができる外部コーティングをさらに含む、請求項27記載の方法。
保護的微小環境が抗炎症性である、請求項57記載の方法。
保護的微小環境が血管新生促進性である、請求項57記載の方法。
改変細胞が、活性化されると改変細胞の破壊を誘導する調節された自殺遺伝子をさらに含む、請求項17記載の方法。
自殺遺伝子が、バリアシステムからの離脱または腫瘍形成性変換の場合に活性化される、請求項60記載の方法。
以下を含む、1つまたは複数の改変細胞において治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを発現させるための方法：
（a）（1）治療スイッチプロモーターとの機能的結合を通してリガンド依存的転写因子複合体をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードする、第一のポリヌクレオチド、および（2）リガンド依存的転写因子複合体によって活性化される因子調節プロモーターに機能的に結合した治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドを細胞に導入して、それによって改変細胞を産生する段階；ならびに
（b）治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現を誘導するために改変細胞にリガンドを投与する段階。
治療スイッチプロモーターが構成的である、請求項62記載の方法。
治療スイッチプロモーターが、疾患、障害、または状態に関連する条件下でリガンド依存的転写因子複合体の発現を可能とするように、疾患、障害、または状態に関連する条件下で活性化される、請求項62記載の方法。
インビトロで実行される、請求項62記載の方法。
対象から単離されている細胞においてエクスビボで実行される、請求項62記載の方法。
インビボで実行される、請求項62記載の方法。
治療スイッチプロモーターとの機能的結合を通してリガンド依存的転写因子複合体をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードする第一のポリヌクレオチドを含む核酸組成物。
治療スイッチプロモーターが構成的である、請求項68記載の核酸組成物。
治療スイッチプロモーターが、疾患、障害、または状態に関連する条件下でリガンド依存的転写因子複合体の発現を可能とするように、疾患、障害、または状態に関連する条件下で活性化される、請求項68記載の核酸組成物。
リガンド依存的転写因子複合体によって活性化されるプロモーターとの機能的結合を通して、疾患、障害、または状態に関連するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項68記載の核酸組成物。
疾患、障害、または状態に関連するポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、疾患、障害、または状態を処置、改善、または予防することができる治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを含む、請求項71記載の核酸組成物。
遺伝子スイッチがEcRに基づく遺伝子スイッチである、請求項68〜72のいずれか1項記載の核酸組成物。
リガンドがEcRリガンド結合ドメインに結合する、請求項73記載の核酸組成物。
リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項74記載の核酸組成物。
リガンドが、RG-115819、RG-115932、およびRG-115830からなる群より選択される、請求項75記載の核酸組成物。
リガンドが、アミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項74記載の核酸組成物。
遺伝子スイッチが、第一の治療スイッチプロモーターの制御下に第一の転写因子配列を、および第二の治療スイッチプロモーターの制御下に第二の転写因子配列を含み、該第一の転写因子配列および第二の転写因子配列にコードされるタンパク質が相互作用して、リガンド依存的転写因子複合体として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項68〜72のいずれか1項記載の核酸組成物。
第一の治療スイッチプロモーターと第二の治療スイッチプロモーターが異なる、請求項78記載の核酸組成物。
第一の治療スイッチプロモーターと第二の治療スイッチプロモーターが同じである、請求項78記載の核酸組成物。
第一の転写因子配列がヘテロ二量体パートナーとトランス活性化ドメインとを含むタンパク質をコードする、請求項78記載の核酸組成物。
第二の転写因子配列がDNA結合ドメインとリガンド結合ドメインとを含むタンパク質をコードする、請求項78記載の核酸組成物。
誘導可能なプロモーターに機能的に連結された致死ポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項71記載の核酸組成物。
請求項71記載の核酸組成物を含むベクター。
プラスミドベクターである、請求項84記載のベクター。
ウイルスベクターである、請求項84記載のベクター。
請求項71のいずれか1項記載の核酸組成物を含むキット。
請求項84記載のベクターを含むキット。
請求項71のいずれか1項記載の核酸組成物を細胞に導入する段階を含む、改変細胞を産生する方法。
請求項84記載のベクターを細胞に導入する段階を含む、改変細胞を産生する方法。
請求項71のいずれか1項記載の核酸組成物を含む改変細胞。
請求項84記載のベクターを含む改変細胞。
対象に再導入するために適している、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを必要とする対象から単離された細胞に由来する改変自己細胞である請求項91記載の改変細胞。
不死化細胞および最終分化を行うことができる初代細胞からなる群より選択される細胞タイプに由来する、請求項91記載の改変細胞。
C2C12マウス筋芽細胞、HEK293ヒト胎児腎細胞、ARPE-19細胞、hMSC細胞、膵島細胞、MDCK細胞、CHO細胞、星状細胞由来細胞、乏突起膠細胞由来細胞、および筋芽細胞由来細胞からなる群より選択される細胞タイプに由来する、請求項94記載の改変細胞。
膵島細胞がブタ島細胞である、請求項95記載の改変細胞。
膵島細胞が、死体に由来するヒト島細胞である、請求項95記載の改変細胞。
活性化されると、改変細胞の破壊を誘導する調節された自殺遺伝子をさらに含む、請求項91記載の改変細胞。
自殺遺伝子がバリアシステムからの離脱または腫瘍形成性変換の場合に活性化される、請求項98記載の改変細胞。
請求項91〜99のいずれか1項記載の1つまたは複数の改変細胞を含むバイオリアクターデバイス。
改変細胞が、対象に導入された場合に該細胞が対象の免疫系から保護されるように処理されている、請求項100記載のバイオリアクターデバイス。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを散在させるが、対象の免疫系の細胞と改変細胞との直接接触を防止するバリアシステム内に、改変細胞が含有される、請求項100記載のバイオリアクターデバイス。
バリアシステムがコンフォーマルコーティングを有する改変細胞を含む、請求項102記載のバイオリアクターデバイス。
コンフォーマルコーティングがポリマーを含む、請求項103記載のバイオリアクターデバイス。
ポリマーがポリエチレングリコールおよびヒドロキシエチルメタクリレート-メチルメタクリレート（HEMA-MMA）からなる群より選択される、請求項104記載のバイオリアクターデバイス。
バリアシステムがカプセル封入された改変細胞を含む、請求項102記載のバイオリアクターデバイス。
改変細胞がマクロカプセル封入デバイスに含有される、請求項106記載のバイオリアクターデバイス。
マクロカプセル封入デバイスが1つまたは複数の合成膜を含む、請求項107記載のバイオリアクターデバイス。
マクロカプセル封入デバイスが、マクロカプセル封入デバイスを通しての物質移動を調節するために異なる孔サイズを含む2つまたはそれより多い合成膜を含む、請求項108記載のバイオリアクターデバイス。
マクロカプセル封入デバイスが、半透過性のポリマー外膜と細胞を支持する内部足場とを含む、請求項107記載のバイオリアクターデバイス。
マクロカプセル封入デバイスが長さ約6 mmで直径約1 mmである、請求項110記載のバイオリアクターデバイス。
外膜が約15 nmの孔を含む、請求項110記載のバイオリアクターデバイス。
内部足場がポリ(エチレンテレフタレート)ヤーンを含む、請求項110記載のバイオリアクターデバイス。
マクロカプセル封入デバイスの内部空間が、改変細胞を少なくとも1個〜約10⁵個含む、請求項107記載のバイオリアクターデバイス。
マクロカプセル封入デバイスが、内側のより小さな孔の0.45μM PFTE免疫バリア層の上に薄層を形成した5μm PTFE膜の外層を含むポリマー膜二重層を含む、請求項107記載のバイオリアクターデバイス。
マクロカプセル封入デバイスが、ポリマー膜二重層の外側に不織ポリメッシュ層をさらに含む、請求項115記載のバイオリアクターデバイス。
マクロカプセル封入デバイスがPES中空繊維デバイスを含む、請求項107記載のバイオリアクターデバイス。
マクロカプセル封入デバイスが縫合クリップをさらに含む、請求項107記載のバイオリアクターデバイス。
マクロカプセル封入デバイスが埋め込み可能で回収可能である、請求項107記載のバイオリアクターデバイス。
改変細胞がマイクロカプセル封入される、請求項106記載のバイオリアクターデバイス。
改変細胞が生物学的に適合性のカプセル封入材料に懸濁され、次にビーズ様構造に形成される、請求項120記載のバイオリアクターデバイス。
カプセル封入材料がハイドロゲルを含む、請求項121記載のバイオリアクターデバイス。
カプセル封入材料が、セルロースおよびアルギネートからなる群より選択されるポリマーを含む、請求項121記載のバイオリアクターデバイス。
ポリマーが、相互作用して物理的選択透過性の膜バリアを形成するために、多価陰イオンアルギネートと多価陽イオンポリマーとを含む、請求項123記載のバイオリアクターデバイス。
ビーズ様構造がそれぞれ、改変細胞を少なくとも1個〜約10³個含む、請求項121記載のバイオリアクターデバイス。
ビーズ様構造がポリ(L-ラクチド)酸(PLLA)アルギネートミクロスフェアを含む、請求項121記載のバイオリアクターデバイス。
ビーズ様構造がポリ-L-オルニチン（PLO）アルギネートコーティングをさらに含む、請求項121記載のバイオリアクターデバイス。
カプセル封入材料が、アルギネートに基づく超高粘度（UHV）バイオポリマーを含む、請求項123記載のバイオリアクターデバイス。
アルギネートに基づくUHVポリマーが生体分解性である、請求項128記載のバイオリアクターデバイス。
ビーズ様構造がほぼ球形であり、直径約500μmである、請求項121記載のバイオリアクターデバイス。
バリアシステムが改変細胞に対して保護を提供することができる保護細胞をカプセル内にさらに含み、保護細胞がセルトリ細胞および赤血球からなる群より選択される、請求項102記載のバイオリアクターデバイス。
バリアシステムが保護的微小環境を作製することができる外部コーティングをさらに含む、請求項102記載のバイオリアクターデバイス。
保護的微小環境が抗炎症性である、請求項132記載のバイオリアクターデバイス。
保護的微小環境が血管新生促進性である、請求項132記載のバイオリアクターデバイス。
疾患、障害、または状態を処置するための請求項68〜83のいずれか1項記載の核酸組成物の使用。
疾患、障害、または状態を処置するための請求項84〜86のいずれか1項記載のベクターの使用。
疾患、障害、または状態を処置するための請求項91〜99のいずれか1項記載の改変細胞の使用。
疾患、障害、または状態を処置するための請求項100〜134のいずれか1項記載のバイオリアクターデバイスの使用。
過剰増殖性疾患、障害、または状態、心血管疾患、障害、または状態、神経疾患、障害、または状態、自己免疫疾患、障害、または状態、骨疾患、障害、または状態、胃腸疾患、障害、または状態、血液疾患、障害、または状態、代謝疾患、障害、または状態、炎症疾患、障害、または状態、および感染性疾患、障害、または状態からなる群より選択される疾患、障害、または状態を処置するための薬剤の調製における、請求項68〜83のいずれか1項記載の核酸組成物の使用。
過剰増殖性疾患、障害、または状態、心血管疾患、障害、または状態、神経疾患、障害、または状態、自己免疫疾患、障害、または状態、骨疾患、障害、または状態、胃腸疾患、障害、または状態、血液疾患、障害、または状態、代謝疾患、障害、または状態、炎症疾患、障害、または状態、および感染性疾患、障害、または状態からなる群より選択される疾患、障害、または状態を処置するための薬剤の調製における、請求項84〜86のいずれか1項記載のベクターの使用。
過剰増殖性疾患、障害、または状態、心血管疾患、障害、または状態、神経疾患、障害、または状態、自己免疫疾患、障害、または状態、骨疾患、障害、または状態、胃腸疾患、障害、または状態、血液疾患、障害、または状態、代謝疾患、障害、または状態、炎症疾患、障害、または状態、および感染性疾患、障害、または状態からなる群より選択される疾患、障害、または状態を処置するための薬剤の調製における、請求項91〜99のいずれか1項記載の改変細胞の使用。
過剰増殖性疾患、障害、または状態、心血管疾患、障害、または状態、神経疾患、障害、または状態、自己免疫疾患、障害、または状態、骨疾患、障害、または状態、胃腸疾患、障害、または状態、血液疾患、障害、または状態、代謝疾患、障害、または状態、炎症疾患、障害、または状態、および感染性疾患、障害、または状態からなる群より選択される疾患、障害、または状態を処置するための薬剤の調製における、請求項100〜134のいずれか1項記載のバイオリアクターデバイスの使用。