JP2002507895A - 段階的なトランス活性化能を有する転写活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 その転写能が３桁を超える大きさで変化する転写活性化因子が提供される。このトランス活性化因子は、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｔｅｔリプレッサー）と、単純ヘルペスウイルスのタンパク質１６（ＶＰ１６）に由来する最小の転写活性化ドメインとの融合物である。この最小のＶＰ１６ドメイン内のアミノ酸位４４２における置換変異により、トランス活性化能が変化したトランス活性化因子が提供される。さらに、野生型および変異型の両方の最小のＶＰ１６ドメインを含むキメラ状の活性化ドメインにより、トランス活性化能が変化したさらなる変化体が提供される。本発明の様々な局面は、核酸分子、ベクター、宿主細胞、融合タンパク質、トランスジェニック生物および相同組換え生物、ならびに遺伝子の転写調節方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 段階的なトランス活性化能を有する転写活性化因子発明の背景 遺伝子発現を調節できることは、組換えタンパク質の製造、遺伝子治療、なら びに細胞の発達および分化の分析を含む様々な状況において望ましい。広範囲の 遺伝子調節システムが明らかにされているが、そのいくつかは遺伝子発現を構成 的な様式で刺激し、またそのいくつかは遺伝子発現を誘導的な様式で刺激する。 遺伝子発現を調節することに対する一般的な方法は、特定の標的ＤＮＡ結合部位 に特異性を有するＤＮＡ結合ドメインと、転写活性化ドメインとからなる転写活 性化因子融合タンパク質（これはまた、本明細書中においては「トランス活性化 因子」として示される）を作製することである。目的とする遺伝子の発現を調節 するために、遺伝子が標的ＤＮＡ結合部位に機能的に連結され、次いで、遺伝子 と、トランス活性化因子融合タンパク質をコードする発現ベクターとの両方の発 現が宿主細胞で同時に行われる。トランス活性化因子融合タンパク質が標的ＤＮ Ａ結合部位に結合したときに、目的とする遺伝子の発現が刺激される。 構成的な転写活性化因子は、ＤＮＡ結合ドメインがその標的部位に構成的に（ すなわち、ＤＮＡ結合を調節するための誘導剤を必要とすることなく）結合する 場合に作製される。そのような構成的なトランス活性化因子の１つの例は、単純 ヘルペスウイルスのビリオンタンパク質１６（Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｊ ．他、（１９８８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２：７１８〜７２９）のＣ端領域に連 結された酵母ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインからなるＧＡＬ４−ＶＰ１６（Ｓａ ｄｏｗｓｋｉ，Ｉ．他、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３５：５６３〜５６４） である。これに対して、ＤＮＡ結合ドメインのみが誘導剤の存在下または非存在 下でその標的部位に結合する場合に、誘導的な転写活性化因子が作製される。そ のような誘導的な転写活性化因子の例は、ＶＰ１６に連結された細菌のＴｅｔリ プレッサーからなるＴｅｔＲ−ＶＰ１６（これは、テトラサイクリンの非存在下 でｔｅｔＯ配列に結合するが、テトラサイクリンの存在下ではｔｅｔＯ配列に結 合しない）（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９、５５４７〜５５５１）、 およびＶＰ１６に連結された変異型ＴｅｔリプレッサーからなるｒＴｅｔＲ−Ｖ Ｐ１６（これは、テトラサイクリンの存在下でｔｅｔＯ配列に結合するが、テト ラサイクリンの非存在下ではｔｅｔＯ配列に結合しない）（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ． 他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８、１７６６〜１７６９）である。 ＨＳＶ ＶＰ１６のＣ端の転写活性化ドメインは、真核生物細胞におけるその 強い転写刺激能のために、トランス活性化因子融合タンパク質の活性化因子成分 として頻繁に使用されている。しかし、転写因子の過剰発現により「鎮圧」が生 じ得ることが明らかにされている（Ｇｉｌｌ，Ｇ．およびＰｔａｓｈｎｅ．Ｍ． （１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４、７２１〜７２４）。これは、転写装置の成 分がそのそれぞれの細胞内プールから輸送される結果として理解されている。Ｖ Ｐ１６に関して、これは最も強力なトランス活性化因子の１つとして知られてい るが、例えば、ＧＡＬ４との融合タンパク質としてのその過剰発現は、細胞には 耐えられないことが明らかにされている（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．他、（１９９ ２）Ｃｅｌｌ ７０、２５１〜２６５；Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，Ｒ．Ｊ．他、（１９ ９０）Ｃｅｌｌ ６１、１２０９〜１２１５）。ＶＰ１６が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅにおけるアダプター／同時活性化因子タンパク質ＡＤＡ２（Ｓｉｌｖｅ ｒｍａｎ，Ｎ．他（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ ．Ａ．９１、１１６６５〜１１６６８）およびそのヒトホモログ（Ｃａｎｄａｕ ，Ｒ．他、（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６、５９３〜６０２） を含む転写装置の様々な必須成分と、ＴＦＩＩＢ（Ｌｉｎ，Ｙ．Ｓ．他（１９９ １）Ｎａｔｕｒｅ ３５３、５６９〜５７１）、ＴＦＩＩＤ（Ｓｔｒｉｎｇｅｒ ，Ｋ．Ｆ．他（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４５、７８３〜７８６）、ＴＦＩＩＨ （Ｘｉａｏ，Ｈ．他（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４、７０１３ 〜７０２４）およびｄＴＡＦＩＩ４０（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｊ．Ａ．他（１９９ ３）Ｃｅｌｌ ７５、５１９〜５３０）と相互作用することを考慮すれば、これ は驚くべきことではない。Ｇｉｌｂｅｒｔおよび共同研究者（Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｄ．Ｍ．他（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３、４６２〜４７２ ）は、活性化ドメインの細胞内濃度および強度が重要なパラメーターである場合 、鎮圧による毒性は量的な問題であることを示す鎮圧と増殖停止との相関を見出 した。 従って、ＶＰ１６の強力な転写活性化能は、ＶＰ１６を、トランス活性化因子 融合タンパク質における使用に関して魅力的な成分にするが、いくつかの場合、 野生型ＶＰ１６によって得られる転写活性化能よりも低い転写活性化能を有する 融合タンパク質を得ることは望ましいことであり得る。あるいは、他の状況にお いては、野生型ＶＰ１６によって得られる転写活性化能よりもさらに大きな転写 活性化能を有する融合タンパク質を得ることは望ましいことであり得る。従って 、段階的なトランス活性化能を有するさらなるトランス活性化因子融合タンパク 質が必要である。発明の開示 本発明により、ＶＰ１６に由来する最小の活性化ドメインを含有し、そして大 きさが少なくとも３桁の範囲に及ぶ段階的なトランス活性化能を有する一群の融 合タンパク質のトランス活性化因子が提供される。このようなトランス活性化因 子は、細胞において高濃度で許容され、そして遺伝子の発現レベルを非常に精密 な様式で調節できるという利点を有する。 本発明の１つの局面は、本発明の転写活性化因子融合タンパク質をコードする 核酸分子に関する。１つの実施形態において、この核酸分子は、転写を活性化す る融合タンパク質、すなわち、転写活性化ドメインを含む第２のポリペプチドに 機能的に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む第１のポリペプチドを含む融合タ ンパク質をコードする。この場合、転写活性化ドメインは、単純ヘルペスウイル スのビリオンタンパク質ＶＰ１６（ＨＳＶ ＶＰ１６）の変異した酸性領域を少 なくとも１コピー含み、その変異した酸性領域は、ＨＳＶ ＶＰ１６のアミノ酸 位４３６〜４４７からなり、かつ野生型ＨＳＶ ＶＰ１６と比較して、４４２位 におけるアミノ酸置換を有する。ＨＳＶ ＶＰ１６の変異した酸性領域は、例え ば、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る（その配列において、野生型ＶＰ１６ の４４２位におけるフェニルアラニンはグリシンに変異され、本明細書中ではＶ Ｐ１６［Ｇ］として示される）。あるいは、ＨＳＶ ＶＰ１６の変異した酸性領 域は、例えば、配列番号３のアミノ酸配列を有し得る（その配列において、野生 型ＶＰ１６の４４２位におけるフェニルアラニンはチロシンに変異され、本明細 書中ではＶＰ１６［Ｙ］として示される）。 本発明の他の実施形態において、融合タンパク質の転写活性化ドメインは、Ｖ Ｐ１６の最小活性化ドメインの２コピー以上からなり、その少なくとも１つは、 ４４２位に変異を有する。例えば、１つの実施形態において、転写活性化ドメイ ンは、２コピーのＶＰ１６［Ｇ］（配列番号４のアミノ酸配列を有する）を含む 。別の実施形態において、転写活性化ドメインは、Ｎ端からＣ端の方向で、１コ ピーの野生型ＶＰ１６の最小活性化ドメイン（ＶＰ１６［Ｆ］として示す）と、 １コピーのＶＰ１６［Ｇ］（配列番号５のアミノ酸配列を有する）とを含む。さ らに別の実施形態において、転写活性化ドメインは、Ｎ端からＣ端の方向で、１ コピーのＶＰ１６［Ｇ］と、１コピーのＶＰ１６［Ｆ］（配列番号６のアミノ酸 配列を有する）とを含む。さらに別の実施形態において、転写活性化ドメインは 、Ｎ端からＣ端の方向で、１コピーのＶＰ１６［Ｆ］と、１コピーのＶＰ１６［ Ｇ］と、１コピーのＶＰ１６［Ｙ］（配列番号７のアミノ酸配列を有する）とを 含む。さらに別の実施形態において、転写活性化ドメインは、Ｎ端からＣ端の方 向で、１コピーのＶＰ１６［Ｇ］と、１コピーのＶＰ１６［Ｆ］と、１コピーの ＶＰ１６［Ｙ］（配列番号８のアミノ酸配列を有する）とを含む。 別の実施形態において、本発明の核酸分子は、転写を活性化する融合タンパク 質、すなわち、転写活性化ドメインを含む第２のポリペプチドに機能的に連結さ れたＤＮＡ結合ドメインを含む第１のポリペプチドを含む融合タンパク質をコー ドする。この場合、転写活性化ドメインは、単純ヘルペスウイルスのビリオンタ ンパク質１６（ＨＳＶ ＶＰ１６）の酸性領域の３コピーからなり、その酸性領 域は、ＨＳＶ ＶＰ１６のアミノ酸位４３６〜４４７（配列番号１）からなる。 すなわち、この融合タンパク質は、３コピーの野生型ＶＰ１６［Ｆ］の最小活性 化ドメインを含有する。 さらに別の実施形態において、本発明の核酸分子は、転写を活性化する融合タ ンパク質、すなわち、転写活性化ドメインを含む第２のポリペプチドに機能的に 連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む第１のポリペプチドを含む融合タンパク質 をコードする。この場合、転写活性化ドメインは、単純ヘルペスウイルスのビリ オンタンパク質１６（ＨＳＶ ＶＰ１６）の酸性領域の４コピーからなり、その 酸性領域は、ＨＳＶ ＶＰ１６のアミノ酸位４３６〜４４７（配列番号１）から なる。すなわち、この融合タンパク質は、４コピーの野生型ＶＰ１６［Ｆ］の最 小活性化ドメインを含有する。 本発明の核酸分子によってコードされる融合タンパク質の第１のポリペプチド は、本質的には、特定の標的ＤＮＡ結合部位に対する特異性を有する任意のＤＮ Ａ結合ドメインであり得る。好ましい実施形態において、第１のポリペプチドは Ｔｅｔリプレッサーである。別の好ましい実施形態において、第１のポリペプチ ドは、テトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログ（類似体）の存在下で ｔｅｔＯオペレーターに結合するが、その非存在下ではｔｅｔＯオペレーターに 結合しない変異したＴｅｔリプレッサーである。さらに他の実施形態において、 第１のポリペプチドは、ＧＡＬ４、ＬｅｘＡ、ＬａｃＲまたはステロイドホルモ ンレセプターである。 本発明の核酸分子は、宿主細胞における融合タンパク質の発現を可能にする組 換えベクターに組み込むことができる。従って、本発明の他の局面は、本発明の 核酸分子を有するベクターおよびそのようなベクターが導入された宿主細胞に関 する。本発明のさらに別の実施形態は、本発明の核酸分子によってコードされる トランス活性化因子融合タンパク質に関する。 本発明のトランス活性化因子融合タンパク質を使用して遺伝子発現を調節する ために、融合タンパク質をコードし、そして融合タンパク質の標的ＤＮＡ結合部 位に機能的に連結された目的とする遺伝子を含有する（または含有するように改 変されている）発現ベクターが宿主細胞に導入される。この融合タンパク質を発 現させたとき、あるいは適切な誘導剤の存在下または非存在下でこの融合タンパ ク質を発現させたときに、目的とする遺伝子の発現が刺激される。従って、本発 明の融合タンパク質を使用して遺伝子発現を調節する方法もまた本発明の範囲に 含まれる。本発明の調節システムを使用して目的とするタンパク質の製造および 単離を行うためのプロセスもまた本発明により包含される。 本発明の融合タンパク質をコードする核酸もまた、トランスジェニック生物に 組み込むことができる（例えば、相同組換えによってゲノム内に無作為に、また は所定の位置に組み込むことができる）。従って、そのような生物もまた本発明 により包含される。図面の説明 図１は、ＴｅｔＲと、ＶＰ１６に由来する最小の酸性活性化ドメインとの融合 物の概略図である。ドメインのアミノ酸配列を右側に示す：［Ｆ］（これはまた 配列番号１として示される）は、４４２位にフェニルアラニンを含有するＶＰ１ ６の４３６位〜４４７位の間の野生型配列を表す。変異した最小のドメイン［Ｇ ］（これはまた配列番号２として示される）またはドメイン［Ｙ］（これはまた 配列番号３として示される）において、Ｐｈｅ４４２は、それぞれ、グリシンま たはチロシンによって置換されている。最小のドメインの様々な組合せをＴｅｔ Ｒに融合させて、左側に示される一群の融合タンパク質が得られた。 図２Ａおよび図２Ｂは、様々なＴｅｔＲ融合物を特徴づける電気泳動移動度シ フトアッセイの写真である。１０ｃｍ培養ディッシュで４０％コンフルエンスに 増殖させたＨｅＬａ細胞を、ＴｅｔＲまたは図１に示す融合タンパク質の１つの いずれかをコードするプラスミドＤＮＡを用いて一過性でトランスフェクション した。３６時間後に調製した細胞抽出物を、放射能標識したｔｅｔＯ ＤＮＡと ともにテトラサイクリンの存在下または非存在下で一緒にした。タンパク質−Ｄ ＮＡ複合体を電気泳動的に分離し、リン光画像化装置を使用して検出した。図２ Ａは、ＴｅｔＲ−［Ｆ］融合物の移動度シフトである。図２Ｂは、ＴｅｔＲドメ インと、［Ｆ］ドメイン、［Ｇ］ドメインおよび［Ｙ］ドメインとの間の融合物 の移動度シフトである。モックトランスフェクション細胞は、ｔＴＡをコードす る挿入物を有さないベクターＤＮＡを含有した。 図３Ａおよび図３Ｂは、トランス活性化因子の細胞内濃度を比較する電気泳動 移動度シフトアッセイの写真である。様々なトランス活性化因子を安定的に発現 する細胞から調節したタンパク質抽出物を、放射能標識したｔｅｔオペレーター ＤＮＡとともに電気泳動移動度シフトアッセイに供した。タンパク質およびＤＮ Ａをテトラサイクリンの存在下（＋Ｔｃ）または非存在下で混合し、その後、比 較できるほどの量をポリアクリルアミドゲルに負荷した。図３Ａは、ＰｈＣＭｖ の制御下で、それぞれ、ｔＴＡ、ｔＴＡ２、ｔＴＡ３またはｔＴＡ４をコードす るＤＮＡを用いて安定的にトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞集団から得ら れた抽出物を示す。図３Ｂは、ｔＴＡまたはｔＴＡ３を産生するそれぞれのクロ ーンの分析を示す。図３ＢにおけるｔＴＡのレーンに関して、レーン１はＸ１／ ５細胞から得られた抽出物を示し；レーン２は、表２のＸ１／６−ｔＴＡ細胞株 の抽出物を示し；レーン３は、ｔＴＡでトランスフェクションされた図３Ａに示 すＨｅＬａ細胞の集団から選択されたクローンの抽出物を示す。図３Ｂにおける ｔＴＡ３のレーンに関して、レーン１およびレーン２は、表２のｔＴＡ３産生細 胞株の抽出物を示し；レーン３は、ｔＴＡ３を産生する図３Ａに示すＨｅＬａ細 胞集団から選択されたクローンの抽出物を示す。(^*)は、シグナルの定量のため に使用したマーカーを示す。発明の詳細な説明 下記の節において、段階的な転写活性化能を有する本発明のトランス活性化因 子融合タンパク質は、ＶＰ１６に由来する活性化ドメインを使用するシステムの 代表的な例として、テトラサイクリンによって制御される転写活性化システムに 関連して主に記載される。しかし、当業者により理解されているように、ＶＰ１ ６に由来する本発明の新規な活性化ドメインは、本発明のｔｅｔシステムに関し て本明細書中に記載されている同じ手順を適用することによって、他のＤＮＡ結 合ドメインと組み合わせて使用することができる。十分に特徴づけられたＤＮＡ 結合特異性を有し、そしてキメラ状のトランス活性化因子融合タンパク質におい て以前に使用された他のＤＮＡ結合ドメイン／タンパク質の非限定的な例には、 ＧＡＬ４（例えば、Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｉ．他（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３ ５：５６３〜５６４を参照のこと）、ＬｅｘＡ（例えば、Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．およ びＰｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９８５）Ｃｅｌｌ ４３、７２９〜３６を参照のこ と）、ＬａｃＲ（例えば、Ｌａｂｏｗ他、（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ ｏｌ．１０：３３４３〜３３５６；Ｂａｉｍ他、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５０７２〜５０７６を参照のこと）、お よびステロイドホルモンレセプター（Ｅｌｌｌｉｓｔｏｎ，Ｊ．Ｆ．他（１９９ ０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、１１５１７〜１１５２１）が含まれる。 さらに、本発明の成分および方法は、Ｗａｎｇ Ｙ．他（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９：８１８０〜８１８４に記載されてい る調節システムに適用することができる。このシステムは、ＧＡＬ４、ホルモン レセプターおよびＶＰ１６の融合物を利用する。 テトラサイクリンによって制御される転写活性化システムは、以前に記載され ている（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５５４７〜５５５１）。この システムは、哺乳動物細胞（Ｒｅｓｎｉｔｚｋｙ，Ｄ．他（１９９４）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４、１６６９〜１６７９）および植物細胞（Ｗｅｉｎｍ ａｎｎ，Ｐ．他（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊ．５、５５９〜５６９）および酵母 細胞を含む様々な真核生物細胞の効率的な遺伝子スイッチとして機能する。この システムはまた、植物（Ｗｅｉｎｍａｎｎ，Ｐ．他（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊ ．５、５５９〜５６９）、マウス（Ｋｉｓｔｎｅｒ，Ａ．他（１９９６）Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３、１０９３３〜１０９３８ ）およびショウジョウバエにおいて示されているような生物のレベルにおける遺 伝子活性の効果的な調節を可能にする。 このｔｅｔシステムの重要な成分の１つは、テトラサイクリンにより制御され るトランス活性化因子（ｔＴＡ）、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉの（ｔｎ１０）テト ラサイクリン耐性オペロンリプレッサーと、転写を活性化し得るドメイン（Ｔｒ ｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｊ．他（１９８８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２、７１８ 〜７２９）を含有するＶＰ１６のＣ端部分との融合タンパク質である。エフェク ターであるテトラサイクリン（Ｔｃ）の非存在下において、ｔＴＡは、適切に操 作された最小のプロモーターからの転写を、上流に配置された一連のｔｅｔオペ レーター（ｔｅｔＯ）配列に結合することにより活性化する。Ｔｃの存在下では 、ｔＴＡは、その標的に結合することが妨げられ、従って、転写が停止させられ る。 ＴｅｔＲの変異体を使用すると、復帰表現型を有するトランス活性化因子（ｒ ｔＴＡ）が作製される。これは、ｔＴＡと比較した場合、逆の様式で機能する： このトランス活性化因子は、そのオペレーターに結合するためにドキシサイクリ ン（Ｄｏｘ）またはアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）のようなＴｃ誘導体 を必要とし、従って、そのようなエフェクターの存在下でのみ転写を活性化する が、その非存在下では転写を活性化しない。このようなシステムは、本明細書中 では「逆ｔｅｔシステム」として示され、この逆トランス活性化因子は「ｒｔＴ Ａ」と略記される。ｒｔＴＡによる転写調節は、哺乳動物細胞（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ．他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８、１７６６〜１７６９）およびマウ ス（Ｋｉｓｔｎｅｒ，Ａ．他（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３、１０９３３〜１０９３８）において明らかにされている 。 ｔｅｔシステムおよび逆ｔｅｔシステムに関しては、米国特許第５，４６４， ７５８号、米国特許第５，５８９，３６２号、国際特許公開ＰＣＴ ＷＯ９４／ ２９４４２、国際特許公開ＰＣＴ ＷＯ９６／０１３１３および国際特許公開Ｐ ＣＴ ＷＯ９６／４０８９２においてさらに詳しく記載されている。 その広範な適用にもかかわらず、ｔｅｔ調節システムおよび逆ｔｅｔ調節シス テムは、特定の実験的な必要条件を満たすためになおさらに発展させることがで きる。ＶＰ１６の活性化ドメインの使用は、いくつかの状況においては「鎮圧」 （背景を参照のこと）を伴うが、本発明者らは、ｔＴＡおよびｒｔＴＡが、それ にもかかわらず、非常に多くのシステムにおいて十分に機能することが明らかに されたという事実は、Ｔｅｔリプレッサー／オペレーターの相互作用の異常な特 異性に起因すると考える（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．他（１９８８）Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７、１０９４〜１１０４）。このような特異性によっ て、トランス活性化因子によるｔｅｔＯ配列の高い占有がｔＴＡ／ｒｔＴＡの低 い細胞内濃度において可能になる。次いで、ｔＴＡ／ｒｔＴＡの発現ユニットが 染色体に無作為に組み込まれることによって、ｔＴＡ／ｒｔＴＡの合成が十分な 活性化には十分に高く、鎮圧による有害作用の防止には十分に低いときに、組み 込み部位のスクリーニングが可能になる。例えば、本発明者らは、本発明者らの ＨｅＬａＸ１細胞株におけるｔＴＡの濃度を約４０００分子／細胞であると推定 する（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．論文、ハイデルベルグ大学） 。これは、基礎的な転写因子のプールに重大な影響を及ぼすには全く不十分であ り、しかし、それにもかかわらず、染色体に組み込まれたｔＴＡ応答性プロモー ターを１０⁵倍以上活性化することができる。多数の他の細胞株と同様に、この 細胞株ならびにｔＴＡおよびｒｔＴＡを産生するいくつかのマウス株は、本発明 者らの実験室において数年間にわたり申し分がないほど安定している。このこと は、トランス活性化因子のそれぞれの細胞内濃度が「生理学的な枠」内におさま っていることを示している。 しかし、トランス活性化因子の適切な細胞内濃度に関してスクリーニングまた は選抜が不可能な実験的取り組みがある。例えば、トランスジェニック生物にお いて遺伝子を細胞タイプ特異的に調節するために、相同組換えによって、ｔＴＡ ／ｒｔＴＡ遺伝子を、目的とする遺伝子の発現を導くプロモーターの制御下に置 くことは興味深いと考えられる。組換えのために使用されるベクターが適切に設 計されている場合、組換え事象は、同時に、標的遺伝子を不活性化する；ｔＴＡ ／ｒｔＴＡ応答性プロモーターにより制御されるそのコード配列は独立して提供 され得る。そのような実験的な「ノックイン／ノックオウト」法は、ｔＴＡ／ｒ ｔＴＡの細胞タイプ特異的な発現を可能にし、従って、目的とする遺伝子の特異 的なＴｃ制御による同等な調節が可能になる。トランス活性化因子の効果的な細 胞内濃度は、主として、特定の遺伝子座の転写活性の関数であり、これは予想す ることも、制御することもできないようなパラメーターである。このような限界 を解決する１つの方法は、トランス活性化因子の活性化能を特定の遺伝子座の発 現レベルに適合させることである。 次に、本発明者らは、一連の新規なＴｃ制御のトランス活性化因子を説明する 。このトランス活性化因子は、ＶＰ１６に由来する最小の活性化ドメインを含有 し、３桁を超える範囲の大きさを有する段階的なトランス活性化能を有する。こ のようなトランス活性化因子は、より高い濃度で細胞において寛容であり、従っ て、上記の実験方法に適すると考えられる。 実施例に記載されている転写トランス活性化因子は、Ｔｅｔリプレッサーと、 ＶＰ１６の「酸性活性化ドメイン」を含む１２アミノ酸のセグメントに由来する 最小の活性化ドメインとの融合物である。この１２アミノ酸のセグメントは、Ｖ Ｐ１６のアミノ酸位４３６〜４４７に広がっている。本発明のいくつかの実施形 態において、転写活性化因子融合タンパク質は、この領域を３コピーまたは４コ ピー含有する。この領域を３コピー含有する融合タンパク質は、ＴｅｔＲ−ＶＰ １６（すなわち、ＶＰ１６の約１２７個のＣ端アミノ酸に融合したＴｅｔＲ）の 約１００％の転写活性化能を有する。この領域を４コピー含有する融合タンパク 質は、ＴｅｔＲ−ＶＰ１６の約２３０％の転写活性化能を有する。 ＶＰ１６の酸性活性化ドメインの変異分析により、４４２位のフェニルアラニ ンが機能に重要であることが明らかにされた（Ｒｅｇｉｅｒ，Ｊ．Ｌ．他（１９ ９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、８８３〜８８７ ）。ＴｙｐまたはＴｒｐのような芳香族アミノ酸による置換、あるいはＬｅｕ、 ＩｌｅまたはＡｌａなどの疎水性アミノ酸による置換が行われた場合、短縮型Ｖ Ｐ１６の活性化能は、それぞれ、約３分の１あるいは１０分の１に低下した。他 のすべての置換は、さらに大きな活性の低下が生じた。実施例に記載されている ように、ＶＰ１６の変異した酸性ドメインを含むトランス活性化因子融合タンパ ク質により、段階的なトランス活性化能を有する一連の融合タンパク質が得られ る。本発明の１つの実施形態において、トランス活性化因子融合タンパク質は、 ４４２位におけるフェニルアラニンが変異したアミノ酸位４３６〜４４７を少な くとも１コピー含有する。１つの実施形態において、４４２位のフェニルアラニ ンはグリシンに変更されている。別の実施形態において、４４２位のフェニルア ラニンはチロシンに変更されている。さらに他の実施形態において、４４２位の フェニルアラニンは、トリプトファン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニン に変更されている。野生型および変異型の酸性領域の様々な組合せもまた本発明 により包含される。そのような例には、ＶＰ１６［Ｇ］［Ｇ］（配列番号４）、 ＶＰ１６［Ｆ］［Ｇ］（配列番号５）、ＶＰ１６［Ｇ］［Ｆ］（配列番号６）、 ＶＰ１６［Ｆ］［Ｇ］［Ｙ］（配列番号７）およびＶＰ１６［Ｇ］［Ｆ］［Ｙ］ （配列番号８）（これらにおいて、括弧内の文字は４４２位のアミノ酸を標準的 な１文字表記で示す）が含まれる。 野生型ならびに変異型の配列を使用するこれらの最小のドメインをいくつか組 み合わせることによって、一連のトランス活性化因子（ｔＴＡ１〜ｔＴＡ７、表 １）が得られた。これらは、その活性化能が、３桁を超える大きさで変化し、そ れによって、ｔＴＡ１は、前記のｔＴＡの活性化強度を２．３倍にする。この新 規なトランス活性化因子は、細胞の転写因子と相互作用することが知られている 部位が多数除去されているという事実にもかかわらず、前記のｔＴＡ応答性プロ モーターＰ_{hCMV ★-1}を活性化する（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、５５４ ７〜５５５１）。従って、ＶＰ１６と比較した場合、ｔＴＡ１〜ｔＴＡ７は、Ｏ ｃｔ−１（Ｈａｙｅｓ，Ｓ．およびＯ’Ｈａｒｅ，Ｐ．（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒ ｏｌ．６７、８５２〜８６２）および宿主細胞の因子であるＨＣＦ（Ｗｕ，Ｔ． Ｊ．他（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４、３４８４〜３４９３） と接触する部位を欠失している：この両者は、Ｏｃｔ−ＬＨＣＦ、ＶＰ１６およ びＤＮＡを含むＣ１複合体を形成するために必要である（Ｈａｙｅｓ，Ｓ．およ びＯ’Ｈａｒｅ，Ｐ．（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、８５２〜８６２）。 同様に、ＴＡＦＩＩ４０（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｊ．Ａ．他（１９９３）Ｃｅｌｌ ７５、５１９〜５３０）およびＡＤＡ２（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｎ．他（１９ ９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１、１１６６５〜１ １６６８）と接触することが知られているＶＰ１６の第２のＣ端の酸性活性化ド メインの欠失は、新規のトランス活性化因子とそのような因子との相互作用をさ らに低下させることが予想される。従って、本発明者らは、これらのｔＴＡタン パク質は、その鎮圧能を低下させる一方で、特異性を獲得していると考える。こ のような考えは、ｔＴＡ２が、ＨｅＬａ細胞において、元のＴｅｔＲ−ＶＰ１６ 融合物（ｔＴＡ）よりも３倍大きな濃度で寛容であるが、この２つのトランス活 性化因子は同じ活性化能（表１）を有するという発見によって支持される。従っ て、発現をより低いレベルに限定するＶＰ１６のエレメントが除かれていること が考えられる。ｔＴＡ２、ｔＴＡ３およびｔＴＡ４の細胞内濃度を比較した場合 、それぞれの活性化能と逆の相関が明らかにされる。従って、異なる強度の発現 シグナルに対してトランス活性化能を調節するために、本明細書中に記載され ている一連のトランス活性化因子を使用することができると考えられる。 酸性ドメインを本明細書中に記載されているＤＮＡ結合タンパク質に融合させ ることによって、分子の負電荷が大きくなり、従って、ＤＮＡに対するその親和 性を変化させることができる。しかし、本明細書中に示されているＤＮＡ遅延実 験により、様々な結合定数の小さな違いはこのアッセイにより明らかにされてい ないが、すべてのＴｅｔ融合物が、比較できる効率でｔｅｔＯ配列に結合するこ とが明らかにされている。 １個の［Ｆ］ドメインをＴｅｔＲに融合することによって、転写を活性化しな いタンパク質が得られた。もう１つの最小の活性化ドメインをＴｅｔＲ−Ｆに融 合して、ＴｅｔＲ−ＦＦ（ｔＴＡ３）を得ることによって、ｔＴＡの約４０％の 活性に達するトランス活性化因子が得られる。［Ｆ］ドメインをｔＴＡ３にさら に付加すると、活性化能は、ｔＴＡ２およびｔＴＡ１に関して明らかなように、 ドメインあたり、約２．５倍増大した。 ＴｅｔＲ−ＦをＴｅｔＲ−ＧＦ（ｔＴＡ６）と比較することにより、ＴｅｔＲ −［Ｇ］［Ｇ］が効果的でないために、それ自身は転写不活性である［Ｇ］ドメ インを付加することは、機能的なトランス活性化因子であるｔＴＡ６を作製する ためには十分であることが示される。２つの最小ドメインの並びが逆になってい るトランス活性化因子のＴｅｔＲ−ＦＧ（ＴＡ７）は、ｔＴＡ６よりも活性が小 さい。これは、立体的な要因が活性化ドメインの機能的な配置に寄与しているこ とを示す。それにもかかわらず、ｔＴＡ７は測定可能な活性を有するので、本発 明者らは、［Ｇ］ドメインの負電荷もまた転写活性に寄与していると結論しなけ ればならない。ｔＴＡ６およびｔＴＡ７は、事実、非常に弱いトランス活性化因 子である。グリシンをフェニルアラニンに単に交換することによって、得られる トランス活性化因子（ｔＴＡ３）の活性化能は、（ｔＴＡ６の）約６０倍に増大 するか、あるいは（ｔＴＡ７の）１０００倍以上にさえ増大する。このことから 、本発明者らは、本発明者らのシステムにおいては、相乗的に作用する少なくと も２つの最小の活性化モジュールが、転写の効率的な刺激には必要であると結論 する。ｔＴＡ５およびｔＴＡ４の活性化特性は、さらにまた、それぞれの最小ド メインの組合せによって生じる立体的で相乗的な作用により説明することができ る。従って、［Ｙ］ドメインをｔＴＡ６およびｔＴＡ７の両者に付加することに よって、活性化能は２０倍増大する。 本明細書中に記載されている一連のＴｃ制御のトランス活性化因子により、多 数の利点が得られる。第１に、トランス活性化因子の能力を、与えられたプロモ ーターの強度に適合させることができる。これにより、相同組換えを介してｔＴ Ａのコード配列を細胞プロモーターの制御下に置くことによって、トランスジェ ニック生物において細胞タイプに限定されたＴｃ制御の調節を達成するための新 しい可能性が開かれる。標的化されたプロモーターの強度、またはそのような遺 伝子座から生じる細胞内のｔＴＡ濃度はいずれも、容易に予測することができな いので、強度が異なるトランス活性化因子を選択することによって、適切なプロ モーター／トランス活性化因子の組合せを見出すためのさらなる自由度が得られ る。第２は、その増大した特異性およびその低下した鎮圧能のために、新しいｔ ＴＡ類は、ｔＴＡを適正な量で構成的に産生する細胞株およびトランスジェニッ ク動物の作製を容易にし得る。第３は、元のｔＴＡの活性化ドメインの大きさを 小さくすることによって、細胞性免疫応答を誘発し得る可能性を有する数多くの 配列モチーフが除去された。従って、本明細書中の特徴を有するトランス活性化 因子は、細胞性免疫応答との競合が予想される場合には常に好ましい因子であり 得る。しかし、そのような応答は、マウスモデルにおいてｔＴＡ／ｒｔＴＡに関 してこれまで認められていない。最後に、大きさが小さい新しいトランス活性化 因子は、外部配列の収容能が限定されたベクターシステムへの組み込みが考えら れる場合には有利であり得る。 本発明のさらなる局面を下記においてさらに詳しく記載する。Ｉ．転写活性化因子融合タンパク質 本発明の１つの局面は、融合タンパク質および融合タンパク質をコードする核 酸（例えば、ＤＮＡ）に関する。用語「融合タンパク質」は、典型的には異なる 供給源に由来し、機能的に連結された少なくとも２つのポリペプチドを表すこと を目的とする。ポリペプチドに関して、用語「機能的に連結された」は、２つの ポリペプチドが、それぞれのポリペプチドがその意図された機能を示すことがで きるような様式で連結されていることを意味するものとする。典型的には、２つ のポリペプチドは、ペプチド結合を介して共有結合している。融合タンパク質は 、好ましくは、標準的な組換えＤＮＡ技術により製造される。例えば、第１のポ リペプチドをコードするＤＮＡ分子は、第２のポリペプチドをコードする別のＤ ＮＡ分子に連結され、そして得られたハイブリッドＤＮＡ分子を宿主細胞で発現 させて、融合タンパク質が製造される。ＤＮＡ分子は、連結後において、コード されているポリペプチドの翻訳フレームが変化しないように５’から３’の方向 で互いに連結される（すなわち、ＤＮＡ分子は読み枠を合わせて互いに連結され る）。 本発明のトランス活性化因子融合タンパク質は、部分的には、ＤＮＡに結合す る第１のポリペプチド（すなわち、ＤＮＡ結合ドメインを含む第１のポリペプチ ド）からなる。好ましいＤＮＡ結合ドメインには、Ｔｅｔリプレッサー、および テトラサイクリン（Ｔｃ）またはそのアナログの存在下でｔｅｔオペレーター配 列に結合するが、その非存在下ではｔｅｔオペレーター配列に結合しない変異し たＴｅｔリプレッサーが含まれる。（ｔＴＡを作製するための）ＶＰ１６に対す るＴｅｔＲの融合物、および（ｒｔＴＡを作製するための）ＶＰ１６に対する変 異ＴｅｔＲの融合物を作製するための組成物および方法は、米国特許第５，４６ ４，７５８号、米国特許第５，５８９，３６２号、国際特許公開ＰＣＴ ＷＯ９ ４／２９４４２、国際特許公開ＰＣＴ ＷＯ９６／０１３１３、および国際特許 公開ＰＣＴ ＷＯ９６／４Ｏ８９２に記載されている。これらの組成物および方 法は、例示において提供されているような標準的な分子生物学の技術および指針 を使用して本発明の融合物を作製するために適用することができる。他の適切な ＤＮＡ結合ドメインには、ＧＡＬ４、ＬｅｘＡ、ＬａｃＲおよびホルモンレセプ ターが含まれ、これらもまた、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、ＶＰ１６ に由来する本発明の最小の活性化ドメインに融合させることができる。 トランス活性化因子融合タンパク質の第１のポリペプチドは、ＶＰ１６の最小 の活性化ドメインに由来する第２のポリペプチドに機能的に連結される。第１の ポリペプチドおよび第２のポリペプチドを機能的に連結するために、典型的には 、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 が、読み枠を合わせて互いに連結され、融合タンパク質をコードするキメラ遺伝 子が作製される。しかし、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、そ れぞれのポリペプチドの機能が保持される他の手段（例えば、化学的な架橋）に より機能的に連結することができる。ＶＰ１６に由来する本発明の最小の活性化 ドメインを、実施例においてさらに詳しく示す。ＩＩ．トランス活性化因子融合タンパク質の発現 Ａ．発現ベクター トランス活性化因子融合タンパク質をコードする本発明の核酸は、上記のよう に、宿主細胞における融合タンパク質の発現に適切な形態で組換え発現ベクター に組み込むことができる。用語「宿主細胞における融合タンパク質の発現に適切 な形態で」は、組換え発現ベクターが、核酸のｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡ の融合タンパク質への翻訳を可能にする方法で融合タンパク質をコードする核酸 に機能的に連結された１つまたは複数の調節配列を含むことを意味するものとす る。用語「調節配列」はこの分野で認識されており、プロモーター、エンハンサ ーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むも のとする。そのような調節配列は、当業者に知られており、ＧｏｅｄｄｅｌのＧ ｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄ ｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。発現ベクターの設計は、トラン スフェクションされ得る宿主細胞の選択および／または発現され得る融合タンパ ク質の量のような要因に依存し得ることを理解しなければならない。 哺乳動物細胞において使用される場合、組換え発現ベクターの制御機能は、ウ イルスの遺伝物質によって提供されることが多い。例えば、一般的に使用されて いるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスお よびシミアンウイルス４０から得られている。融合タンパク質を発現させるため にウイルスの調節エレメントを使用することにより、様々な宿主細胞において融 合タンパク質を高レベルで構成的に発現させることができる。好ましい組換え発 現ベクターにおいて、融合タンパク質をコードする配列は、ヒトサイトメガロウ イルスのＩＥプロモーターが上流（すなわち、５’）に隣接し、そして下流（す なわち、３’）にはＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルが隣接している。例えば、実施 例１に記載されている発現ベクターに類似する発現ベクターを使用することがで きる。ヒトサイトメガロウイルスのＩＥプロモーターは、Ｂｏｓｈａｒｔ他（１ ９９５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１〜５３０に記載されている。使用することがで きる他の遍在的に発現するプロモーターには、ＨＳＶ−Ｔｋプロモーター（これ は、ＭｃＫｎｉｇｈｔ他（１９８４）Ｃｅｌｌ ３７：２５３〜２６２に開示さ れている）およびβ−アクチンプロモーター（例えば、Ｎｇ他（１９８５）Ｍｏ ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２７２０〜２７３２によって記載されているヒト β−アクチンプロモーター）が含まれる。 あるいは、組換え発現ベクターの調節配列は、特定の細胞タイプにおいて、優 先的に融合タンパク質の発現を誘導することができる：すなわち、組織特異的な 調節エレメントを使用することができる。使用することができる組織特異的なプ ロモーターの非限定的な例には、下記のプロモーターが含まれる：アルブミンプ ロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ他（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １：２６８〜２７７）、リンパ系に特異的なプロモーター（Ｃａｌａｍｅおよび Ｅａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５〜２７５）、特 にＴ細胞レセプターのプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（ １９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９〜７３３）および免疫グロブリンのプロモ ーター（Ｂａｎｅｒｊｉ他（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７２９〜７４０；Ｑｕ ｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７４１〜７４８ ）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター； ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌ ｕｎｄ他（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２〜９１６）、ならびに乳 腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３ １６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）。発達段階で調節されるプ ロモーターもまた含まれる：例えば、ネズミ類のｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓ ｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４〜３７９） およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａ ｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７〜５４６）。 あるいは、トランス活性化因子融合タンパク質をコードする自己調節性構築物 を作製することができる。このような構築物を作製するために、融合タンパク質 をコードする核酸は、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが結合するＤＮＡ結 合部位を含む調節配列に機能的に連結される。例えば、ｔｅｔシステムに関して 、ｔＴＡまたはｒｔＴＡをコードする配列は、最小のプロモーター配列および少 なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に連結され得る。 １つの実施形態において、本発明の組換え発現ベクターはプラスミドである。 あるいは、本発明の組換え発現ベクターは、ウイルスの核酸内に導入された核酸 の発現を可能にするウイルスまたはその一部であり得る。例えば、複製が不完全 なレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスを使用することが できる。組換えレトロウイルスの作製およびそのようなウイルスによるインビト ロまたはインビボでの細胞への感染に関するプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅ ｌ，Ｆ．Ｍ．他（編）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａ ｔｅｓ（１９８９）、９．１０節〜９．１４節）および他の標準的な実験室マニ ュアルに見出すことができる。適切なレトロウイルスの例には、当業者によく知 られているｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＷが含まれる。適切なパッキン グウイルス株の例には、ψＣｒｉｐ、ψＣｒｅ，ψ２およびψＡｍが含まれる。 アデノウイルスのゲノムは、トランス活性化因子融合タンパク質をコードして発 現するが、正常な溶解性ウイルスの生活環におけるその複製能に関して不活性化 されているように操作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ他（１９８８ ）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他（１９９１ ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１〜４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ他（１ ９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３〜１５５を参照のこと。アデノウイルスＡｄ株 ５型ｄｌ３２４およびアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターが当業者に知られている。あ るいは、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ他（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５： ３２５１〜３２６０に記載されているウイルスベクターなどのアデノ関連ウイル スベクターを使用して、トランス活性化因子融合タンパク質を発現させることが できる。 Ｂ．宿主細胞 本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする核酸で、宿主細胞に おける融合タンパク質の発現に適切な形態にある核酸を宿主細胞に導入すること により真核生物細胞において発現する。例えば、融合タンパク質をコードする本 発明の組換え発現ベクターが、宿主細胞に導入される。あるいは、調節配列（例 えば、プロモーター配列）に機能的に連結された融合タンパク質をコードするが 、さらなるベクター配列を有さない核酸を宿主細胞に導入することができる。本 明細書中で使用されている用語「宿主細胞」には、細胞または細胞株が、発現さ れ得るタンパク質、選択される選抜システムまたは用いられる発酵システムと不 適合性でない限り、任意の真核生物の細胞または細胞株が含まれるものとする。 使用することができる哺乳動物細胞株の非限定的な例には、ＣＨＯｄｈｆｒ^-細 胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６〜４２２０）、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ 他（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９頁）、あるいはＳＰ２また はＮＳＯのようなミエローマ細胞（ＧａｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９ ８１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（Ｂ）：３〜４６）が含まれる。 細胞株に加えて、本発明は、遺伝子治療目的のために改変され得る細胞などの 正常な細胞、あるいはトランスジェニック動物または相同組換え動物を作製する ために改変される胚細胞に適用することができる。遺伝子治療目的のために特に 注目されている細胞タイプの例には、造血幹細胞、筋芽細胞、肝細胞、リンパ球 、神経細胞ならびに皮膚上皮細胞および気道上皮細胞が含まれる。さらに、トラ ンスジェニック動物または相同組換え動物に関して、胚幹細胞および受精卵母細 胞を、トランス活性化因子融合タンパク質をコードする核酸を含有するように改 変することができる。さらに、植物細胞を、トランスジェニック植物を作製する ために改変することができる。 本発明は広範囲に適用することができ、そして哺乳動物以外の真核生物細胞も 同様に包含する。このような細胞には、昆虫細胞（例えば、Ｓｐ．ｆｒｕｇｉｐ ｅｒｄａ）、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ；これらはＦ ｌｅｅｒ，Ｒ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（５）：４８６〜４９６により概説されている）、カビ および植物細胞が含まれる。酵母Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現用ベクタ ーの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ他（１９８７）Ｅｍｂｏ Ｊ． ６：２２９〜２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（ １９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ 他（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３〜１２３）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖ ｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が含ま れる。融合タンパク質は、バキュロウイルス発現ベクター（例えば、Ｏ’Ｒｅｉ ｌｌｙ他（１９８２）Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃ ｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒ ｅｓｓに記載されているようなベクター）を使用して昆虫細胞で発現させること ができる。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におおてタンパク質を発 現させるために入手可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓ ｍｉｔｈ他（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６〜２１６５ ）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ ．Ｄ．（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１〜３９）が含まれる。 Ｃ．宿主細胞への核酸の導入 融合タンパク質をコードする核酸は、真核生物細胞のトランスフェクションに 関する標準的な技術により宿主細胞に導入することができる。用語「トランスフ ェクションする」または「トランスフェクション」は、宿主細胞に核酸を導入す ることに関するすべての従来技術を包含するものとする。これには、リン酸カル シウム共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェク チン、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションが含まれる。宿 主細胞のトランスフェクションに関する適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ ｒｅｓｓ（１９８９））および他の実験室書籍において見出すことができる。 本発明の核酸で形質転換される宿主細胞の数は、少なくとも一部は、使用され る組換え発現ベクターのタイプおよび使用されるトランスフェクション技術のタ イプに依存する。核酸は、一時的に宿主細胞に導入することができる。あるいは より典型的には、遺伝子発現を長期間調節するために、核酸は、宿主細胞のゲノ ムに安定的に組み込まれるか、または安定なエピソームとして宿主細胞内に残留 する。哺乳動物細胞に導入されるプラスミドベクターは、典型的には、低い頻度 でしか宿主細胞のＤＮＡに組み込まれない。このような組込み体を同定するため には、選択マーカー（例えば、薬物耐性）を含有する遺伝子が、一般には、目的 とする遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択マーカーには、Ｇ４ １８およびハイグロマイシンなどのいくつかの薬物に対する耐性を付与する遺伝 子が含まれる。選択マーカーは、目的とする核酸とは別個のプラスミドで導入す ることができ、あるいは同じプラスミドで導入される。本発明の核酸（例えば、 組換え発現ベクター）および選択マーカー遺伝子でトランスフェクションされた 宿主細胞は、選択マーカーを使用する細胞選抜によって同定することができる。 例えば、選択マーカーがネオマイシン耐性を付与する遺伝子をコードする場合、 核酸を取り込んだ宿主細胞を、Ｇ４１８を用いて選抜することができる。選択マ ーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生存するが、それ以外の細胞は死滅する。 本発明の融合タンパク質をコードする核酸でトランスフェクションされた宿主 細胞は、融合タンパク質の標的として役に立つ１つまたは複数の核酸でさらにト ランスフェクションすることができる。例えば、ｔｅｔシステムに関して、標的 核酸は、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に連結された転写さ れ得るヌクレオチド配列を含む。 本発明の融合タンパク質をコードする核酸は、従来のトランスフェクション技 術（例えば、リン酸カルシウム沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクシ ョン、エレクトロポレーションなど）によって、インビトロの培養で増殖中の真 核生物細胞に導入することができる。核酸はまた、例えば、核酸をインビボで細 胞に導入するために適する送達機構を適用することによってインビボで細胞に移 すことができる。例えば、レトロウイルスベクター（例えば、Ｆｅｒｒｙ，Ｎ． 他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７ 〜８３８１；およびＫａｙ，Ｍ．Ａ．他（１９９２）Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＴｈ ｅｒａｐｙ ３：６４１〜６４７を参照のこと）、アデノウイルスベクター（例 えば、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３〜１ ５５；およびＨｅｒｚ，Ｊ．およびＧｅｒａｒｄ，Ｒ．Ｄ．（１９９３）Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２８１２〜２８１６を参照の こと）、レセプター媒介ＤＮＡ取り込み（例えば、Ｗｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ． Ｈ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎ 他（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７；および米国 特許第５，１６６，３２０号を参照のこと）、直接的なＤＮＡ注入（例えば、Ａ ｃｓａｄｉ他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：８１５〜８１８；およびＷｏ ｌｆｆ他（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５〜１４６８を参照のこ と）、またはパーティクルボンバードメント（例えば、Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．他（１ ９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４４５５〜４ ４５９；およびＺｅｌｅｎｉｎ，Ａ．Ｖ．他（１９９３）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅ ｒｓ ３１５：２９〜３２を参照のこと）などによる。従って、遺伝子治療目的 のために、細胞をインビトロで改変して被験者に投与することができ、あるいは 細胞をインビボで直接改変することができる。 Ｄ．トランスジェニック生物 トランス活性化因子融合タンパク質をコードする核酸は、本発明の融合タンパ ク質が１つまたは複数の細胞タイプで発現するトランスジェニック動物を作製す るために、ヒト以外の動物の受精した卵母細胞に入れることができる。トランス ジェニック動物は、出生前の段階（例えば、胚の段階）で動物または動物の祖先 に導入されているトランスジーンを含有する細胞を有する動物である。トランス ジーンは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれ、そし て成熟した動物のゲノムに残留し、それによって、コードされた遺伝子産物の発 現をトランスジェニック動物の１つまたは複数の細胞タイプまたは組織でもたら すＤＮＡである。１つの実施形態において、ヒト以外の動物はマウスであるが、 本発明はマウスに限定されない。他の実施形態において、トランスジェニック動 物は、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシまたは他の家畜である。そのようなトランスジ ェニック動物は、タンパク質の大規模な生産（いわゆる、「遺伝子農場」）に有 用である。 トランスジェニック動物は、例えば、融合タンパク質をコードする核酸（典型 的には、構成的または組織特異的なエンハンサーなどの適切な調節エレメントに 連結された核酸）を、受精した卵母細胞の雄性前核に、例えば、マイクロインジ ェクションによって導入し、そしてその卵母細胞を偽妊娠の雌性里親動物で発育 させることにより作製することができる。イントロン配列およびポリアデニル化 シグナルもまた、トランスジーンの発現効率を増大させるためにトランスジーン に含めることができる。トランスジェニック動物、特に、マウスなどの動物を作 製するための方法は、この分野で一般的になってきており、例えば、米国特許第 ４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号ならびにＨｏｇａｎ，Ｂ ．他（１９８６）Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている。トランスジェニック始祖動物は 、トランスジーンを有するさらなる動物を繁殖させるために使用することができ る。本発明の融合タンパク質をコードするトランスジーンを有するトランスジェ ニック動物は、トランス活性化因子融合タンパク質が結合する標的ＤＮＡ部位に 機能的に連結された目的の遺伝子を含むトランスジーンを有する他のトランスジ エニック動物とさらに交配させることができる。例えば、ｔｅｔシステムに関し て、ｔＴＡトランスジェニック動物またはｒｔＴＡトランスジェニック動物は、 ｔｅｔオペレーター配列に機能的に連結された遺伝子を含有するトランスジェニ ック動物と交配させることができる。 トランスジェニック動物に加えて、本明細書中に記載されている調節システム は、トランスジェニック植物などの他の生物に適用され得ることが理解される。 トランスジェニック植物は、この分野で知られている従来の技術により作製する ことができる。従って、本発明は、動物および植物を含み、本発明のトランス活 性化因子融合タンパク質を発現する細胞を含有するヒト以外のトランスジェニッ ク生物を包含する（すなわち、トランス活性化因子をコードする核酸は、トラン スジェニック生物の細胞において１つまたは複数の染色体に取り込まれている） 。 Ｅ．相同組換え生物 本発明はまた、本発明の融合タンパク質を発現するヒト以外の相同組換え生物 を提供する。本明細書中で使用されている用語「相同組換え生物」は、遺伝子と 、動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）に導入されるＤＮＡ分子との間での相同 組換えによって改変された遺伝子を含有する生物（例えば、動物または植物）を 表すことを目的とする。１つの実施形態において、ヒト以外の動物はマウスであ るが、本発明はマウスに限定されない。融合タンパク質をコードする核酸がゲノ ムの特定部位に導入された動物を作製することができる：すなわち、核酸は内在 遺伝子と相同的に組換えられる。 そのような相同組換え動物を作製するために、相同組換えが起こり得る真核生 物遺伝子のさらなる核酸がその５’および３’において隣接する融合タンパク質 をコードするＤＮＡを含有するベクターが調製される。融合タンパク質をコード する核酸に隣接するさらなる核酸は、真核生物遺伝子との相同組換えがうまく生 じるのに十分な長さである。典型的には、数キロベースの隣接するＤＮＡが（５ ’端および３’端の両方において）ベクターに含まれる（相同組換えベクターの 説明に関しては、例えば、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｓ．およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照のこと）。ベクターは胚幹細 胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、そして導入され たＤＮＡが内在のＤＮＡと相同的に組み換えられた細胞が選抜される（例えば、 Ｌｉ，Ｅ．他（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照のこと）。次いで、選 抜された細胞を動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入して、凝集キメラを得る （例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐ ｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８ ７）１１３頁〜１５２頁を参照のこと）。次いで、キメラ状の胚を適切な偽妊娠 の雌性里親動物に移植して、胚を成熟させる。相同的に組換えられたＤＮＡを生 殖細胞に有する子孫は、動物のすべての細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含 有する動物を繁殖させるために使用することができる。このような「生殖系列伝 搬」動物は、トランス活性化因子融合タンパク質が結合する標的ＤＮＡ部位に機 能的に連結された遺伝子を有する動物とさらに交配することができる。例えば、 ｔｅｔシステムに関して、「生殖系列伝搬」動物は、少なくとも１つのｔｅｔオ ペレーター配列に機能的に連結された遺伝子を有する動物とさらに交配すること ができる。 上記の相同組換え方法に加えて、酵素支援による部位特異的組み込みシステム がこの分野で知られている。これは、第２の標的ＤＮＡ分子内の所定位置にＤＮ Ａ分子を組み込むために、本発明の調節システムの成分に適用することができる 。そのような酵素支援組み込みシステムの例には、Ｃｒｅリコンビナーゼ−ｌｏ ｘ標的システム（例えば、Ｂａｕｂｏｎｉｓ，Ｗ．およびＳａｕｅｒ，Ｂ．（１ ９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２０２５〜２０２９；およびＦ ｕｋｕｓｈｉｇｅ，Ｓ．およびＳａｕｅｒ，Ｂ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７９０５〜７９０９に記載されているシ ステム）、およびＦＬＰリコンビナーゼ−ＦＲＴ標的システム（例えば、Ｄａｎ ｇ，Ｄ．Ｔ．およびＰｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．（１９９２）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ． １３：３６７〜３７５；およびＦｉｅｒｉｎｇ，Ｓ．他（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８４６９〜８４７３に記載されて いるシステム）が含まれる。ＩＩＩ．本発明のキット 本発明の別の局面は、本発明の調節システムの成分を含むキットに関する。そ のようなキットは、目的とする遺伝子（すなわち、転写され得る目的のヌクレオ チド配列）の発現を調節するために使用することができる。このキットは、転写 活性化因子融合タンパク質をコードする核酸を含み得る。あるいは、トランス活 性化因子融合タンパク質が真核生物細胞で発現するようにトランス活性化因子融 合タンパク質をコードする核酸がその中に安定に取り込まれている真核生物細胞 が、キットにおいて提供され得る。 １つの実施形態において、キットは、その内部できつく閉じ込められた状態で 少なくとも２つの容器手段を有する運搬手段を含む：本発明のトランス活性化因 子融合タンパク質をコードする第１の核酸（例えば、ＤＮＡ）を含有する第１の 容器手段、および目的とするヌクレオチド配列がクローニングされ得るトランス 活性化因子に関する第２の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）を含有する第２の容器手 段。第２の核酸は、典型的には、転写され得るヌクレオチド配列（機能的に連結 された最小のプロモーター配列を必要に応じて含む）および融合タンパク質が結 合する少なくとも１つの機能的に連結されたＤＮＡ結合部位を導入するためのク ローニング部位を含む。用語「クローニング部位」は、少なくとも１つの制限エ ンドヌクレアーゼ部位を包含するものとする。典型的には、多数の異なる制限エ ンドヌクレアーゼ部位（例えば、ポリリンカー）が、核酸の内部に含有される。 キットの成分を使用して目的のヌクレオチド配列の発現を調節するために、目 的のヌクレオチド配列が、従来の組換えＤＮＡ技術によってキットの標的ベクタ ーのクローニング部位にクローニングされ、次いで、第１の核酸および第２の核 酸が宿主細胞または動物に導入される。次いで、宿主細胞または動物で発現した トランス活性化因子融合タンパク質によって、目的とするヌクレオチド配列の転 写が（融合タンパク質においてどのようなＤＮＡ結合ドメインが使用されている かに依存して、構成的に、あるいは適切な誘導剤の存在下または非存在下で）調 節される。 あるいは、別の実施形態において、キットは、トランス活性化因子が細胞で発 現されるように本発明のトランス活性化因子融合タンパク質をコードする核酸で 安定的にトランスフェクションされる真核生物細胞を含む。従って、上記の第１ の容器手段は、核酸のみを含有するよりも、トランス活性化因子をコードする第 １の核酸が（例えば、リン酸カルシウム沈澱またはエレクトロポレーションなど の従来の方法による安定的なトランスフェクションによって）安定的に導入され た真核生物細胞株を含有する。この実施形態においては、目的のヌクレオチドが キットの標的ベクターのクローニング部位にクローニングされ、次いで、標的ベ クターが、トランス活性化因子融合タンパク質を発現する真核生物細胞に導入さ れる。ＩＶ．テトラサイクリンまたはそのアナログによる遺伝子発現の調節 ｔｅｔシステムまたは逆ｔｅｔシステムに基づく本発明のトランス活性化因子 融合タンパク質をコードする核酸、ならびにｔｅｔオペレーター配列に機能的に 連結されたヌクレオチド配列（すなわち、転写され得る目的の遺伝子）を有する 宿主細胞において、ｔｅｔオペレーター配列に機能的に連結されたヌクレオチド 配列の高レベルの転写は、（ｔｅｔシステムまたは逆ｔｅｔシステムが使用され ているかどうかに依存して）テトラサイクリンの有無に依存する。宿主細胞での 転写を誘導するために、宿主細胞は、（ｔｅｔシステムに関しては）Ｔｃの非存 在下で培養されるか、あるいは（逆ｔｅｔシステムに関しては）テトラサイクリ ンまたはテトラサイクリンアナログと接触させられる。従って、本発明の別の局 面は、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質を発現する宿主細胞または動 物において、ｔｅｔオペレーター配列に機能的に連結されたヌクレオチド配列の 転写を調節するための方法に関する。この方法は、細胞をテトラサイクリンまた はテトラサイクリンアナログと接触させること、あるいはテトラサイクリンまた はテトラサイクリンアナログを、そのような細胞を含有する被験体に投与するこ とを含む。 用語「テトラサイクリンアナログ」は、テトラサイクリンに構造的に関連する 化合物で、少なくとも約１０⁶Ｍ^-1のＫ_aでＴｅｔリプレッサーに結合する化合物 を含むものとする。好ましくは、テトラサイクリンアナログは、約１０⁹Ｍ^-1以 上の親和性で結合する。そのようなテトラサイクリンアナログの例には、アンヒ ドロテトラサイクリン、ドキシサイクリン、クロロテトラサイクリン、オキシテ トラサイクリン、および下記によって開示されるアナログが含まれるが、これら に限定されない：ＨｌａｖｋａおよびＢｏｏｔｈｅ、「テトラサイクリン」、Ｈ ａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７８、Ｒ．Ｋ．Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ他（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ ｇ、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５；Ｌ．Ａ．Ｍｉｔｓｃｈｅｒ、 「テトラサイクリン抗生物質の化学」、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１９７８；Ｎｏｙｅｅ Ｄｅｖｅｌｏ ｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、「テトラサイクリン製造プロセス」、Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ、Ｎ Ｊ、２巻、１９６９；Ｒ．Ｃ．Ｅｖａｎｓ、「テトラサイクリンの科学」、Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ １、Ｑｕａｄｒａｎ ｇｌｅ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９６８；およびＨ．Ｆ．Ｄｏｗｌｉ ｎｇ、「テトラサイクリン」、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ、 第３号、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９ ５５。高レベルの転写刺激に好ましいＴｃアナログは、アンヒドロテトラサイク リンおよびドキシサイクリンである。Ｔｃと比較して低い抗生物質活性を有する Ｔｃアナログを選択することができる。そのようなＴｃアナログの例は、アンヒ ドロテトラサイクリン、エピオキシテトラサイクリンおよびシアノテトラサイク リンである。 インビトロで細胞における遺伝子発現を調節するために、細胞は、Ｔｃまたは Ｔｃアナログと、そのような化合物を含有する培地で細胞を培養することによっ て接触させられる。ＴｃまたはＴｃアナログの存在下で細胞をインビトロで培養 する場合、好ましい濃度範囲は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの間 である。ＴｃまたはＴｃアナログは、細胞が既に培養されている培地に直接加え ることができ、あるいは、より好ましくは、高レベルの遺伝子誘導を行うために 、Ｔｃを含まない培地から細胞を集め、そして細胞を、Ｔｃまたはそのアナログ を含有する新しい培地で培養する。 インビボでの遺伝子発現を誘導するために、被験体内の細胞は、ＴｃまたはＴ ｃアナログと、そのような化合物を被験体に投与することによって接触させられ る。用語「被験体」は、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物を含むものとする：ヒト 以外の哺乳動物には、サル、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ラット、マウ ス、ならびにそれらのトランスジェニック種および相同組換え種が含まれる。さ らに、用語「被験体」は、トランスジェニック植物などの植物を含むものとする 。誘導剤がヒトまたは動物の被験体に投与される場合、投与量は、好ましくは約 ０．０５μｇ／ｍｌ〜１．０μｇ／ｍｌの間の血清濃度が達成されるように調節 される。ＴｃまたはＴｃアナログは、遺伝子の誘導に十分なインビボ濃度を達成 するために効果的な任意の手段によって被験体に投与することができる。適切な 投与形式の例には、経口投与（例えば、誘導剤を飲料水に溶解すること）、徐放 性ペレットおよび拡散ポンプの埋め込みが含まれる。ＴｃまたはＴｃアナログを トランスジェニック植物に投与するために、誘導剤を、植物に投与される水に溶 解することができる。ＶＩ．本発明の適用 本発明は、多面発現作用または細胞傷害性を引き起こすことなく迅速かつ効率 的に制御された方法で、遺伝子発現の開始および停止を行うことができ、あるい は遺伝子発現のレベルを調節できることが望ましい様々な状況に広く適用するこ とができる。従って、本発明のシステムは、真核生物細胞、植物および動物にお ける細胞発達および細胞分化の研究に幅広く適用することができる。例えば、ガ ン遺伝子の発現は、その機能を研究するために、細胞において制御された方法で 調節することができる。さらに、このシステムを使用して、ＣＲＥまたはＦＬＰ などの部位特異的なリコンビナーゼの発現を調節することができ、それによって トランスジェニック生物の遺伝子型の不可逆的な改変が、特定の発達段階におい て制御された条件下で可能になる。例えば、トランスジェニック植物のゲノムに 挿入され、特定のトランスジェニック植物の選択を可能にする薬物耐性マーカー は、Ｔｃにより調節される部位特異的なリコンビナーゼによって不可逆的に取り 除くことができる。本発明の調節システムの他の適用を下記に示す： Ａ．遺伝子治療 本発明は、遺伝子的疾患または後天的疾患のいずれかの処置における遺伝子治 療目的に特に有用であり得る。遺伝子治療の一般的な方法には、機能的な活性の 回復または増強のために、導入される遺伝物質によってコードされる１つまたは 複数の遺伝子産物が細胞内で産生されるように核酸を細胞に導入することが含ま れる。遺伝子治療法の総説に関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．（１９９２ ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８〜８１３；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９ ２）Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５〜４６０；Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｔ．（１９ ８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２７５〜１２８１；およびＣｏｕｒｎｏｙ ｅｒ，Ｄ．他（１９９０）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１：１９６〜 ２０８を参照のこと。しかし、現在の遺伝子治療ベクターは、典型的には、内在 性の転写因子に応答し得る構成的な調節エレメントを利用している。このような ベクターシステムでは、被験体における遺伝子の発現レベルを調節し得ることは 考慮されていない。これに対して、本発明の誘導性の調節エレメントはこのよう な調節能を提供する。 遺伝子治療目的に本発明の逆ｔｅｔシステムを使用するために、１つの実施形 態において、遺伝子治療を必要とする被験体の細胞は、１）宿主細胞におけるト ランス活性化因子の発現に適切な形態で本発明のトランス活性化因子融合タンパ ク質をコードする核酸、および２）ｔｅｔオペレーター配列に機能的に連結され た目的の遺伝子（例えば、治療目的の遺伝子）を含有するように改変される。被 験体の細胞はエクスビボで改変され、次いで、被験体に導入することができ、あ るいは、細胞はインビボで直接改変することができる。次いで、被験体の細胞に おける目的遺伝子の発現が、ＴｃまたはＴｃアナログを患者に投与することによ って刺激される。遺伝子の発現レベルは、誘導剤としてどのような特定のＴｃア ナログが使用されているかに依存して変化し得る。遺伝子の発現レベルはまた、 患者に投与されるテトラサイクリンまたはそのアナログの用量を調節し、それに よって循環および目的とする組織において達成される濃度を調節することによっ て調整することができる。 酵素結合免疫吸着アッセイなどのこの分野で知られている従来の検出方法は、 宿主細胞において調節された目的タンパク質の発現をモニターするために使用す ることができる。そして、ＴｃまたはＴｃアナログの濃度は、目的とするタンパ ク質の所望する発現レベルが得られるまで変化させることができる。従って、目 的とするタンパク質の発現は、個々の生涯にわたって変化し得る個々の医学的な 必要に従って調節することができる。被験体の細胞において目的とする遺伝子の 発現を停止させるために、誘導剤の投与が停止される。従って、本発明の調節シ ステムは、治療的状況の必要性に依存して遺伝子の発現レベルの調整を可能にす るという、構成的な調節システムよりも大きな利点を提供する。 遺伝子的疾患または後天的疾患の処置のために被験体の細胞において発現され 得る特に注目される遺伝子には、アデノシンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第 ＩＸ因子、ジストロフィン、β−グロビン、ＬＤＬレセプター、ＣＦＴＲ、イン スリン、エリスロポイエチン、抗血管形成因子、成長ホルモン、グルコセレブロ シダーゼ、β−グルクロニダーゼ、α１−アンチトリプシン、フェニルアラニン ヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、オルニチントランスカルバミラ ーゼ、アルギノコハク酸シンセターゼ、ＵＤＰ−グルクロニシルトランスフェラ ーゼ、アポＡｌ、ＴＮＦ、可溶性ＴＮＦレセプター、インターロイキン（例えば 、ＩＬ−２）、インターフェロン（例えば、α−ＩＦＮまたはβ−ＩＦＮ）、な らびに他のサイトカインおよび成長因子をコードする遺伝子が含まれる。遺伝子 治療目的のために改変され得る細胞タイプには、造血幹細胞、筋原細胞、肝細胞 、リンパ球、皮膚上皮細胞および気道上皮細胞が含まれる。遺伝子治療に関する 細胞タイプ、遺伝子および方法のさらなる説明に関しては下記を参照のこと：例 えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．他（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０１４〜３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ，Ｄ．他（１ ９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１〜６ １４５；Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．他（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６ ５〜１４６８；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｊ．Ｒ．他（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２〜１８０５；Ｆｅｒｔｙ，Ｎ．他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７〜８３８１；Ｗｉｌｓｏｎ， Ｊ．Ｍ．他（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７；Ｑ ｕａｎｔｉｎ，Ｂ．他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ８９：２５８１〜２５８４；Ｄａｉ，Ｙ．他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８９２〜１０８９５；ｖａｎ Ｂ ｅｕｓｅｃｈｅｍ，Ｖ．Ｗ．他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０〜７６４４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．他（ １９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３〜１５５：Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．他（１９９２） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１〜６４７；Ｃｒｉｓｔｉａ ｎｏ，Ｒ．Ｊ．他（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２１２２〜２１２６；Ｈｗｕ，Ｐ．他（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．１５０：４１０４〜４１１５；およびＨｅｒｚ，Ｊ．およびＧｅｒａｒｄ，Ｒ ．Ｄ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２ ８１２〜２８１６。 ガンの処置において特に注目される遺伝子治療の適用には、サイトカイン遺伝 子（例えば、ＴＮＦ−α）の腫瘍浸潤性リンパ球での過剰発現、または腫瘍部位 での抗腫瘍免疫応答を誘導するサイトカインの腫瘍細胞における異所性発現、非 毒性剤を毒性剤に変換し得る酵素の腫瘍細胞での発現、抗腫瘍免疫応答を誘導す る腫瘍特異的抗原の発現、腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、ｐ５３またはＲｂ ）の腫瘍細胞での発現、骨髄細胞を化学療法の毒性から保護するための多薬剤耐 性遺伝子（例えば、ＭＤＲ１および／またはＭＲＰ）の骨髄細胞での発現が含ま れる。 ウイルス疾患の処置において特に注目される遺伝子治療の適用には、ＨＩＶト ランス優性ネガティブのｔａｔ変異体またはｒｅｖ変異体あるいはＨＳＶトラン ス優性ＩＣｐ４変異体（例えば、Ｂａｌｂｏｎｉ，Ｐ．Ｇ．他（１９９３）Ｊ． Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４１：２８９〜２９５；Ｌｉｅｍ，Ｓ．Ｅ．他（１９９３ ）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：６２５〜６３４；Ｍａｌｉｍ，Ｍ．Ｈ．他 （１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９７〜１２０１；Ｄａｌｙ，Ｔ ．Ｊ．他（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：８９４５〜８９５４； およびＳｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１：５８１〜 ５８８を参照のこと）などのトランス優性ネガティブのウイルス性トランス活性 化因子タンパク質の発現、ＨＩＶのｅｎｖ変異体などのトランス優性ネガティブ エンベロープタンパク質の発現（例えば、Ｓｔｅｆｆｙ，Ｋ．Ｒ．他（１９９３ ）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１８５４〜１８５９を参照のこと）、ウイルス産物に 対する抗体またはそのフラグメントの細胞内発現（「内部免疫化」、例えば、Ｍ ａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．他（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ９０：７８８９〜７８９３）、および可溶性ＣＤ４などの可溶性ウイ ルスレセプターの発現が含まれる。さらに、本発明のシステムを使用して、細胞 において自殺遺伝子を条件に応じて発現させることができ、それによって、細胞 の除去が、意図された機能を細胞が果たした後で可能になる。例えば、ワクチン 化のために使用される細胞は、ＴｃまたはＴｃアナログの被験体への投与により 細胞内で自殺遺伝子の発現が誘導されることによって免疫応答が被験体に得られ た後で被験体内で除去することができる。 本発明のＴｃ制御による調節システムは、それが遺伝子治療への適用に特に適 するという数多くの有利な特性を有する。例えば、本発明のシステムにより、被 験体における遺伝子産物の調節された投薬を可能にする遺伝子発現に関する「オ ン」／「オフ」のスイッチが提供される。いくつかの状況においては、設定され たレベルで遺伝子産物が単に構成的に発現されるというよりは、調節された方法 で、遺伝子産物を特定のレベルおよび／または時期に提供できることは望ましい ことであり得る。例えば、目的の遺伝子は、目的遺伝子産物の最も効果的なレベ ルが最も効果的な時期に得られるように一定の間隔（例えば、毎日、１日おき、 毎週など）で発現のスイッチを「オン」にすることができる。被験体内で産生さ れる遺伝子産物のレベルは標準的な方法でモニターすることができる（例えば、 ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡなどの免疫学的アッセイを使用する直接的なモニター、 あるいは目的とする遺伝子産物の機能に依存する実験室パラメーター（例えば、 血中グルコースレベルなど）の間接的なモニターによって行うことができる）。 被験体において異なる時間間隔で遺伝子の発現を「オン」にし、そして遺伝子を 他の時期において「オフ」状態に保つことを可能にするこのような能力により、 断続的な間隔で目的とする遺伝子産物を継続的に投与しなければならないことが 避けられる。この方法は、苦痛的であり、かつ／または副作用をもたらすことが あり、そして医師のところに継続的に行かなければならないような遺伝子産物の 反復的な注射を必要としない。これに対して、本発明のシステムはそのような不 利益を回避する。さらに、被験体において異なる時間間隔で遺伝子発現を「オン 」にできることは、痛みおよび症状が現れる急性期の間の処置が必要とされると きにだけ、活性の「急上昇」を含む疾患（例えば、多くの自己免疫疾患）の集中 した処置を可能する。そのような疾患が鎮静しているときには、発現システムを 「オフ」状態に保つことができる。 異なる時間間隔で遺伝子発現を調節するこのような能力から特に有用であり得 る遺伝子治療適用には、下記の非限定的な例が含まれる。 慢性関節リウマチ−炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１およびＩ Ｌ−１２）の産生を阻害する遺伝子産物をコードする遺伝子を、被験体において 発現させることができる。そのような阻害剤の例には、サイトカインの可溶性形 態のレセプターが含まれる。さらにまたはその代わりに、サイトカインＩＬ−１ ０および／またはＩＬ−４（これらは保護的なＴｈ２型の応答を刺激する）を発 現させることができる。さらに、グルココルチコミメティックレセプター（ＧＣ ＭＲ）を発現させることができる。 下垂体機能不全症−ヒト成長ホルモンの遺伝子を、遺伝子発現がダウンレギュ レーションされ得るときに、正常な身長が得られるまで、遺伝子発現が必要とさ れる年少期に限ってそのような被験体において発現させることができる。 外傷治癒／組織再生−治癒過程に必要な因子（例えば、成長因子、血管形成因 子など）が必要であり、次いでダウンレギュレーションされるときに限って、そ れらを発現させることができる。 抗ガン処置−抗ガン処置において有用な遺伝子産物の発現は、腫瘍増殖の遅延 が達成されるまでの治療期に限定され得る。そのようなときに、遺伝子産物の発 現がダウンレギュレーションされ得る。可能な全身的な抗ガン処置には、免疫刺 激性分子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２など）、血管形成阻害剤（ＰＦ４、Ｉ Ｌ−１２など）、Ｈｅｒレグリン、ロイコレグリン（国際特許公開ＰＣＴ ＷＯ ８５／０４６６２を参照のこと）、ならびにＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ −ＣＳＦなどの骨髄支援治療に必要な成長因子を発現する腫瘍浸潤性リンパ球の 使用が含まれる。骨髄支援治療に関して、本発明の調節システムを使用して、骨 髄支援治療に必要な因子を発現させることによって、定期的な間隔で、化学療法 から骨髄支援治療への簡略化された治療の変更が可能になる（同様に、そのよう な方法はまた、ＡＩＤＳの処置に適用することができる：例えば、抗ウイルス処 置から骨髄支援処置への単純化された切換）。さらに、抗ガン処置の制御された 局所的な標的化もまた可能である。例えば、本発明の調節因子による自殺遺伝子 の発現がある。この場合、調節因子自身が、例えば、腫瘍特異的プロモーターま たは放射線誘導プロモーターによって制御される。 別の実施形態において、本発明の調節システムを使用して、血管形成阻害剤が 、本発明のシステムにより調節されるトランスジーンによって腫瘍内部から発現 させられる。血管形成阻害剤のこのような発現は、阻害剤の全身的な投与よりも 効率的であり得るし、そして全身的な投与に付随し得る何らかの有害な副作用を 回避する。特に、腫瘍内に限定された血管形成阻害剤の発現は、正常な細胞の成 長を伴って血管形成が依然行われている小児でのガン処置において特に有用であ り得る。 別の実施形態において、サイトカインの高レベルの調節された発現を行うこと により、患者自身の免疫応答を腫瘍細胞に集中させるための方法が示され得る。 腫瘍細胞は、個々の自然の免疫応答を増大させるときに重要な化学誘引性で増殖 促進性のサイトカインが発現するように形質導入され得る。サイトカインは腫瘍 の近くにおいて最も高い濃度で存在するので、腫瘍抗原に対する免疫学的応答が 誘導される可能性が高まる。このタイプの治療に伴う考えられる問題は、そのよ うなサイトカインを産生する腫瘍細胞もまた免疫応答の標的であり、従って、す べての腫瘍細胞の根絶が確実になり得る前に、サイトカインの供給源が排除され ることである。この問題を解決するために、免疫系から感染細胞を遮蔽すること が知られているウイルスタンパク質の発現を、同じ細胞内で、サイトカイン遺伝 子とともに調節下に置くことができる。そのような１つのタンパク質は、アデノ ウイルス由来のＥ１９タンパク質である（例えば、Ｃｏｘ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ４７：７１５を参照のこと）。このタンパク質は、Ｉ型ＨＬＡ抗原の細胞表面へ の輸送を妨げ、これにより、宿主の細胞傷害性Ｔ細胞による細胞認識および細胞 溶解を妨げる。従って、腫瘍細胞内でＥ１９の調節された発現を行うことにより 、サイトカイン産生細胞は、免疫応答の攻撃がサイトカインの発現によって惹起 されている間、細胞傷害性Ｔ細胞から遮蔽され得る。Ｅ１９を発現する細胞を除 くすべての腫瘍細胞を根絶させるために十分な時間が経過した後に、Ｅ１９の発 現を停止させることができ、これによって、Ｅ１９発現細胞が、次に、惹起され た抗腫瘍免疫応答の犠牲となる。 良性の前立腺肥大−上記と同様に、自殺遺伝子を、本発明の調節因子によって 調節することができる。この場合、調節因子自身が、例えば、前立腺特異的プロ モーターによって制御される。 自殺遺伝子（例えば、アポトーシス遺伝子、ＴＫ遺伝子など）の発現を、本発 明の調節システムを使用する制御された方法で行い得ることは、本発明のシステ ムの全般的な安全性および有用性を高める。例えば、所望の治療の最後において 、自殺遺伝子の発現を、生体不活性インプラント内の細胞、意図された最初の部 位を超えて散らばった細胞などの遺伝子治療ベクターを有する細胞を除くために 開始させることができる。さらに、移植組織が腫瘍状になるか、または副作用を 有する場合、そのような細胞は、自殺遺伝子を導入することにより迅速に除くこ とができる。Ｔｃ制御された２つ以上の「オン」／「オフ」スイッチを１つの細 胞内で使用することによって、（本明細書中に詳しく記載されている）治療目的 の遺伝子の調節と比較される自殺遺伝子の完全に独立した調節が可能になる。 本発明の調節システムは、達成され得る遺伝子産物の発現レベルにおける自由 度が全くない調節されない構成的な発現とは対照的に、被験体における目的とす る遺伝子産物の治療的に関連した発現レベルをさらに確立することができる。遺 伝子産物の生理学的に関連する発現レベルは、被験体の特定の医学的必要性に基 づいて、例えば、関連する遺伝子産物のレベルを（上記の方法を使用して）モニ ターする実験室試験に基づいて確立することができる。臨床例、および遺伝子産 物の投薬に対する遺伝子に関して上記で既に議論した遺伝子産物に加えて、所望 するレベルおよび所望する時期で発現させることができる他の治療的に関連する 遺伝子産物には下記が含まれる：血友病者における第ＸＩＩＩ因子および第ＩＸ 因子（例えば、運動中などの傷害の危険性があるときに発現を高めることができ る）；糖尿病者におけるインスリンまたはアミリン（被験体における疾患状態、 食事などに依存して必要とされる時）；赤血球減少症を処置するためのエリスロ ポイエチン（例えば、末期の腎不全において必要とされる時）；アテローム性動 脈硬化症または肝臓の遺伝子治療に関する低密度リポタンパク質レセプター（Ｌ ＤＬｒ）または超低密度リポタンパク質レセプター（ＶＬＤＬｒ）（例えば、エ クスビボ移植組織の使用）。中枢神経系疾患の処置に対する適用もまた包含され る。例えば、アルツハイマー病においては、コリンアセチルトランスフェラーゼ （ＣｈＡＴ）の発現を「微調節」して、アセチルコリンのレベル、神経栄養因子 （例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦなど）および／または補体阻害剤（例えば、ｓＣＲ １、ｓＭＣＰ、ｓＤＡＦ、ｓＣＤ５９など）を回復させることができる。そのよ うな遺伝子産物は、例えば、本発明のシステムを使用して調節される方法で遺伝 子産物を発現する移植された細胞によりもたらされ得る。さらに、パーキンソン 病は、レボドーパおよびドーパミンのレベルを増大させるためにチロシンヒドロ キシラーゼ（ＴＨ）の発現を「微調節」することにより処置することができる。 上記のタンパク質性の遺伝子産物に加えて、機能的なＲＮＡ分子（アンチセン スＲＮＡおよびリボザイムなど）である遺伝子産物を、治療目的のために被験体 において制御された方法で発現させることができる。例えば、変異型遺伝子と野 生型遺伝子とを区別するリボザイムを設計することができる。従って、「正しい 」遺伝子（例えば、野生型のｐ５３遺伝子）を、変異型遺伝子（例えば、変異し た内在性ｐ５３遺伝子）に特異的な調節されたリボザイムの導入と同時に細胞に 導入して、内在性遺伝子から発現した不完全なｍＲＮＡを除くことができる。こ の方法は、不完全な遺伝子に由来する遺伝子産物が、外因性の野生型遺伝子の作 用と競合するする状況において特に有利である。 本発明の調節システムを使用する被験体における遺伝子産物の発現は、テトラ サイクリンまたはそのアナログを使用して調節される。そのような薬物は、所望 の作用部位への薬物送達（例えば、その発現が調節され得る遺伝子を含有する細 胞への送達）に適切な任意の経路によって投与することができる。関与する特定 の細胞タイプに依存して、好ましい投与経路には、経口投与、静脈内投与および 局所投与（例えば、全身的な処置に由来する考えられる何らかの副作用を避けな がら、ケラチノサイトなどの皮膚内に位置する移植片の細胞に到達させるための 経皮パッチの使用）が含まれる。 いくつかの遺伝子治療状況において、処置を受けている被験体において望まし くない免疫反応の回避または阻害を行うための手段を取ることは必要または望ま しいことであり得る。治療的な遺伝子産物を発現する細胞に対する反応を避ける ために、一般には、被験体自身の細胞を使用して、可能である場合には、被験体 の細胞をインビボで改変するか、または被験体から細胞を採取し、細胞をエクス ビボで改変して、被験体に戻すことのいずれかによって、治療的な遺伝子産物の 発現が行われる。異種同系または外因性の細胞を使用して、目的とする遺伝子の 発現が行われる状況において、本発明の調節システムもまた、治療遺伝子を調節 することに加えて、細胞の免疫認識に関与する１つまたは複数の遺伝子を調節し て、外来細胞に対する免疫応答を阻害するために使用することができる。例えば 、Ｔリンパ球による外来細胞の認識に関与している細胞表面分子は、治療的な遺 伝子産物を送達するために使用された外来細胞の表面で、細胞表面分子をコード するｍＲＮＡを切断するリボザイムの外来細胞での発現を調節するなどによって ダウンレギュレーションすることができる。望ましくない免疫応答を阻害するた めにこのようにダウンレギュレーションされ得る特に好ましい細胞表面分子には 、Ｉ型および／またはＩＩ型の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、補助 的刺激分子（例えば、Ｂ７−１および／またはＢ７−２）、ＣＤ４０、およびＩ ＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−２などの様々な「接着」分子が含まれる。同じ細胞 において多数の遺伝子の独立しているが、調和した調節を行うために本明細書中 に記載されている方法を使用して、宿主細胞における細胞表面分子の発現のダウ ンレギュレーションを調和させることができる。従って、治療が完了して、治療 遺伝子の発現を停止させた後で、内在性の細胞表面分子の発現を正常状態に戻す ことができる。さらに、抗ガン処置に関して上記に記載されているように、ＭＨ Ｃ抗原の発現をダウンレギュレーションするウイルスタンパク質（例えば、アデ ノウイルスＥ１９タンパク質）を、望ましくない免疫学的反応を避ける手段とし て、本発明のシステムを使用して宿主細胞において調節することができる。 前記に加えて、被験体における免疫応答を全体的または特異的にダウンレギュ レーションすることに関するすべての従来の方法は、免疫応答の阻害が所望され る状況において、本発明の調節システムの使用と組み合わせることができる。シ クロスポリンＡおよび／またはＦＫ５０６などの一般的な免疫抑制剤を被験体に 投与することができる。あるいは、より特異的な免疫抑制を可能にし得る免疫調 節剤を使用することができる。そのような薬剤には、補助的刺激分子の阻害剤（ 例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質、可溶性ＣＤ４、抗ＣＤ４抗体、抗Ｂ７ −１抗体および／または抗Ｂ７−２抗体または抗ｇｐ３９抗体）が含まれ得る。 最後に、いくつかの状況において、治療的な遺伝子を発現する細胞の送達ビヒ クルで、移植された細胞が免疫系に曝されることを最小限にする送達ビヒクルを 選択することができる。例えば、細胞は、（小島細胞移植に適用されているよう に）タンパク質（例えば、目的とする治療的な遺伝子産物）のインプラントから の拡散と、栄養物および酸素のインプラント内への拡散とを可能にするが、免疫 細胞の進入を妨げ、それによって移植された細胞が免疫系に曝されることを回避 する空孔を有する生体不活性なカプセル／生体適合性メンブランに埋め込むこと ができる。 Ｂ．タンパク質のインビトロでの生産 目的とするタンパク質の大規模な生産は、１）細胞におけるトランス活性化因 子の発現に適する形態で本発明のトランス活性化因子融合タンパク質をコードす る核酸、および２）ｔｅｔオペレーター配列に機能的に連結された目的タンパク 質をコードする遺伝子を含有するように改変された細胞のインビトロ培養物を使 用して行うことができる。例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞または真菌細胞を改 変して、本明細書中に記載されているこのような核酸成分を含有させることがで きる。次いで、改変された哺乳動物細胞、酵母細胞または真菌細胞は、遺伝子発 現を誘導させて目的タンパク質を産生させるために、Ｔｃまたはそのアナログの 存在下で標準的な発酵技術によって培養することができる。従って、本発明によ り、目的のタンパク質を単離するための製造プロセスが提供される。このプロセ スにおいて、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質をコードする核酸と、 少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に連結された目的タンパク質 をコードする核酸との両方が導入された宿主細胞（例えば、酵母または真菌）を 、テトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログが存在する培養培地におい て生産規模で増殖させて、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列（す なわち、ｔｅｔオペレーター配列に機能的に連結されたヌクレオチド配列）の転 写を刺激し、そして目的とするタンパク質を、集めた宿主細胞または培養培地か ら単離する。標準的なタンパク質精製技術を使用して、目的とするタンパク質を 培地または集めた細胞から単離することができる。 Ｃ．タンパク質のインビボでの生産 本発明により、トランスジェニック農場動物などの動物において目的とするタ ンパク質の大規模な生産もまた行われる。トランスジェニック技術での進歩によ り、ウシ、ヤギ、ブタおよびヒツジなどのトランスジェニック家畜の作製が可能 になっている（Ｗａｌｌ，Ｒ．Ｊ．他（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．４９：１１３〜１２０；およびＣｌａｒｋ，Ａ．Ｊ．他（１９８７）Ｔｒｅ ｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２０〜２４における総説を参 照のこと）。従って、本発明の誘導性調節システムの成分をそのゲノムに有する トランスジェニック家畜を作製することができる。この場合、目的とするタンパ ク質をコードする遺伝子は、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的 に連結されている。遺伝子の発現、従ってタンパク質の生産は、Ｔｃ（またはそ のアナログ）をトランスジェニック動物に投与することによって誘導される。タ ンパク質の生産は、トランス活性化因子の発現をある種の細胞に限定する適切な 組織特異的調節エレメントに連結することによって、トランス活性化因子融合タ ンパク質をコードする核酸を特定の組織に標的化することができる。例えば、乳 清プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２ ６４，１６６号）などの乳腺に特異的な調節エレメントをトランス活性化因子ト ランスジーンに連結して、トランス活性化因子の発現を乳腺組織に限定すること ができる。従って、Ｔｃ（またはアナログ）の存在下において、目的のタンパク 質は、トランスジェニック動物の乳腺組織で産生される。タンパク質は、トラン スジェニック動物の乳汁に分泌させるように設計することができ、そして所望す る場合には、次いで、タンパク質を乳汁から単離することができる。 Ｄ．ヒトの疾患の動物モデル 本発明の転写活性化因子タンパク質を使用して、ヒトの疾患の病理学を模倣す るために動物の特定遺伝子の発現を刺激し、それによってヒト疾患の動物モデル を作製することができる。例えば、宿主動物において疾患に関与していると考え られる目的の遺伝子を、（例えば、本明細書中に記載されている相同組換えによ って）１つまたは複数のｔｅｔオペレーター配列の転写制御下に置くことができ る。そのような動物は、トランス活性化因子融合タンパク質のトランスジーンを 有する第２の動物と交配して、テトラサイクリンにより調節される融合タンパク 質遺伝子およびｔｅｔにより調節される標的配列の両方を有する子孫を作製する ことができる。このような子孫における目的とする遺伝子の発現は、テトラサイ クリン（またはアナログ）を使用して調節することができる。 例示 本発明は、いかなる点においても限定として解釈すべきではない下記の実施例 によりさらに例示される。本出願を通して引用されている参考文献、発行された 特許、公開された特許出願を含むすべての引用物の内容は、それにより特に参考 として援用される。本発明の実施には、別途示されていない限り、当業者の範囲 に含まれる細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微 生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術が用いられる。そのような技術 は文献に十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒ ｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 第１巻および第２巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃ ｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕ ｌｌｉｓ他、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈ ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、 １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ Ｒ ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａ ｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、 Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ ｎｇ（１９８４）；項目的な専門書のＭｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒ ａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（ Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ 第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕ他編）；Ｉｍｍｕｎｏｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ ｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉ ｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒお よびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 Ｎ．Ｙ．、１９８６）を参照のこと。 下記の実施例において使用されている特定の材料および方法を下記に示す：最小の活性化因子ドメインをコードするオリゴヌクレオチド 本研究の最小の活性化ドメインはＶＰ１６から得られた。これは、Ｓｅｉｐｅ １，Ｋ．、Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，Ｏ．およびＳｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｗ．（１９９２ ）ＥＭＢＯ Ｊ １１、４９６１〜４９６８による４３６位〜４４７位を含む。 このドメインおよびその変化体をコードする合成オリゴヌクレオチドを、それぞ れ、［Ｆ］、［ＧＦ］、［ＦＧ］、［ＧＧ］および［Ｙ］と名付けた：この場合 、文字は、４４２位のアミノ酸を示す（下線を付したトリプレット）。コード鎖 の配列を（４４２位のコドンに対応するトリプレットに下線を付けて）下記に示 す。オリゴヌクレオチドは、括弧内の文字によって示されるように１つまたは複 数の最小ドメインをコードする。 オリゴ［Ｆ］：５’−ＣＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＡ ＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧ−３’（配列番号９） オリゴ［ＧＦ］：５’−ＣＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧ ＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＡＴＧＡＴＴ ＴＣ ＧＡＴＣＴＣＧＡＴＡＴＧＣＴＣＣ−３’（配列番号１０） オリゴ［ＦＧ］：５’−ＣＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧ ＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＡＴＧＡＴＧ ＧＣ ＧＡＴＣＴＣＧＡＴＡＴＧＣＴＣＣ−３’（配列番号１１） オリゴ［ＧＧ］：５’−ＣＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧ ＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＡＴＧＡＴＧ ＧＣ ＧＡＴＣＴＣＧＡＴＡＴＧＣＴＣＣ−３’（配列番号１２） オリゴ［Ｙ］：５’−ＣＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＴＡＣＧＡ ＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＣＴＣ−３’（配列番号１３） 二本鎖オリゴヌクレオチドの突出５’末端は、制限エンドヌクレアーゼＸｍａ Ｉの切断部位と適合する。 プラスミド Ｃｏ１Ｅ１型プラスミドのｐＵＨＤ１４１−１（Ｋｉｓｔｎｅｒ，Ａ．（１９ ９２）学位論文、ハイデルベルグ大学）は、翻訳の効率的な開始のために５’末 端で最適化されているＴｅｔＲのコード配列を含有する（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．（１ ９８３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ４７、１〜４５）。ｔｅｔＲ遺伝子の転 写は、ヒトサイトメガロウイルスのＩＥプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ，Ｍ．他 （１９８５）Ｃｅｌｌ ４１、５２１〜５３０）によって制御されている。Ｘｍ ａＩ切断によってｔｅｔＲのオープンリーディングフレームの３’末端との読み 枠を合わせてＤＮＡを挿入するために、ｐＵＨＤ１４１−１を、ｔｅｔＲの停止 コドンと重なっているＡｆＩＩＩで線状化した。突出した５’ＤＮＡ末端をマン グビーンヌクレアーゼによって除き、そして合成オリゴヌクレオチド５’−ＣＣ ＣＧＧＧＴＡＡＣＴＡＡＧＴＡＡ−３’（配列番号１４）を、標準的なクローニ ング手順を使用してベクターに連結した。ＸｍａＩ切断部位をｔｅｔＲ遺伝子の すぐ３’末端に含有する得られたプラスミドｐＵＨＤ１４１−１／Ｘを配列分析 によって確認した。細胞培養および一過性トランスフェクション ルシフェラーゼのレポーター構築物ｐＵＨＣ１３−３が染色体に組み込まれた ＨｅＬａＸ１／６細胞（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．論文、ハイ デルベルグ大学）およびＨｅＬａ（ｗｔ）細胞を、３７℃および５％ＣＯ₂で、 １０％ウシ胎児血清を補充したアール改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯから得られ るＥ−ＭＥＭ）において維持した。リン酸カルシウム共沈澱によるトランスフェ クションを、下記の改変を加えた標準的なプロトコルに従って行った：ＨｅＬａ Ｘ１／６細胞を３５ｍｍ培養ディッシュで５０％〜６０％のコンフルエンスに増 殖させた。トランスフェクションする１時間前に、培養培地を新しい培地に変え て、細胞を３７℃および６％ＣＯ₂でインキュベーションした。リン酸カルシウ ム／ＤＮＡの沈澱物は１．５μｇのプラスミドＤＮＡを含有する（これは、０． ５μｇのトランス活性化因子構築物、トランスフェクション効率を正規化するた めに含められた０．４μｇのｌａｃＺ発現ベクター（ｐＵＨＤ１６−１）、およ び非特異的なキャリアＤＮＡとして０．６μｇのｐＵＣ１８からなる）。沈澱物 （培養ディッシュあたり１００μｌ）をＸ１／６細胞に加え、次いで細胞を３７ ℃および６％ＣＯ₂で３０時間さらにインキュベーションした。同時に行われて いる培養物のインシチウβ−ガラクトシダーゼ染色によって測定されたトランス フェクション効率は、６０％〜８０％の間であった。ルシフェラーゼアッセイ トランスフェクションされたＸ１／６細胞を含有する３５ｍｍ培養ディッシュ を３ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２５ｍＭＴｒｉｓ−リ ン酸塩（ｐＨ７．８）、２ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭジアミノシクロヘキ サン四酢酸、１０％グリセロールおよび１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する １２５μｌの溶解緩衝液において室温で１０分間溶解した。溶解物を培養ディッ シュから掻き取り、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離器で１０秒間遠心分離した。こ れらの抽出物におけるルシフェラーゼ活性を、Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊ ａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８ ９、５５４７〜５５５１の記載に従って測定した。ルシフェラーゼの値は、標準 的な液体のＯ−ニトロフェニルβ−ガラクトピラノシドアッセイを行うことによ ってβ−ガラクトシダーゼ活性に正規化した（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．（１９７ ２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）。ＤＮＡ遅延アッセイ ＨｅＬａ細胞を、１０ｃｍ培養ディッシュで５０％〜６０％のコンフルエンス に増殖させ、そして、様々なｔＴＡをコードするプラスミドＤＮＡの２０μｇを 用いるリン酸カルシウム手順によりトランスフェクションした。トランスフェク ションの３０時間後に全細胞抽出物を下記のように調製した：細胞（約２×１０⁶ ）をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭＭｇＣ ｌ₂、１０ｍＭＫＣｌ、０．５ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭフェニルメ チルスルホニルフルオリドを含有する緩衝液の２５０μｌに再懸濁し、そして０ ℃で２０分間インキュベーションし、その後、素早く凍結および融解を行った。 ＮａＣｌを２５０ｍＭの最終濃度に加え、そして０℃で２０分間のインキュベー ションを行った後に、サンプルをＢｅｃｋｍａｎＴＬ−１００超遠心分離器にお いて４３５０００ｇおよび０℃で１０分間遠心分離した。抽出部の一部（１０μ ｌ）を、１０μｌの結合緩衝液（２０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、１０％グリセロール、２ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、および１ｍｇ ／ｍｌウシ血清アルブミン）、およびｐＵＨＣ１３−３（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．お よびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９、５５４７〜５５５１）から４２塩基対のＴａｑＩフラグメントと して単離して［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰの存在下でＴ４−ＤＮＡポリメラーゼによっ て突出末端を埋めた後の２ｆｍｏｌの³²Ｐ標識したｔｅｔＯ ＤＮＡと混合した 。２５分後、反応混合物を、５％グリセロールを含有する５％ポリアクリルアミ ド／０．１３％ビスアクリルアミドのゲルに負荷した。電気泳動を、４５ｍＭＴ ｒｉｓ塩基、４５ｍＭホウ酸および１ｍＭＥＤＴＡにおいて７Ｖ／ｃｍで行った 。安定的にトランスフェクションされた細胞株の作製 ＨｅＬａＸ１／６細胞を３５ｍｍ培養ディッシュで増殖させ、そして上記のよ うに、２μｇの線状化プラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクションした。ト ランスフェクション混合物は、ハイグロマイシン遺伝子を有するプラスミドｐＨ ＭＲ２７２（Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｈ．Ｕ．他（１９８５）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅ ｓ．１５８、２３７〜２４３）、およびｐＵＨＤ１５−１、ｐＵＨＤ１９−１ま たはｐＵＨＤ２６−１（これらはｔＴＡ遺伝子の上流にＫｏｚａｋ配列を含有す る）をそれぞれ含有する。検討したプラスミドと選択マーカーとのモル比は４０ ：１であった。２４時間後、細胞を１０ｃｍ培養ディッシュに移し、３００μｇ ／ｍｌのハイグロマイシンを含有する培地で維持した。耐性クローンを単離し、 個々に拡大培養して、ルシフェラーゼ活性について分析した（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ８９、５５４７〜５５５１）。耐性クローンのルシフェラーゼ遺伝 子のｔＴＡに依存した活性化をさらに調べるために、細胞を、１００００細胞／ ３５ｍｍ培養ディッシュの密度で播種し、Ｔｃ（１μｇ／ｍｌ）の存在下または 非存在下で増殖させた。５日後、細胞抽出物を上記のように調製して、ルシフェ ラーゼ活性を測定した。溶解物のタンパク質含有量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｒ ａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７２、２４８ 〜２５４）に従って測定した。 様々なトランス活性化因子を安定に発現する細胞集団の作製および相対的な細胞 内ｔＴＡ濃度の定量 プラスミドｐＵＨＤ１５−１、ｐＵＨＤ１９−１、ｐＵＨＤ２０−１およびｐ ＵＨＤ２６−１を、選択マーカー遺伝子を挿入することによって改変した。それ ぞれの場合において、ｎｅｏ遺伝子を含有する発現カセットを、ＰｈＣＭｖ（１ ）の上流に位置するＸｈｏＩ部位に挿入した。得られたプラスミドを、それぞれ 、ｐＵＨＤ１５−１ｎｅｏ、ｐＵＨＤ１９−１ｎｅｏ、ｐＵＨＤ２０−１ｎｅｏ およびｐＵＨＤ２６−１ｎｅｏとした。 ＨｅＬａ細胞を１０ｃｍ培養ディッシュで５０％コンフルエンスに増殖させ、 そして上記のように、２０μｇの線状化プラスミドＤＮＡを用いてトランスフェ クションした。２４時間後、細胞を１４．５ｃｍ培養ディッシュに移し、５００ μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培地で維持した。次いで、耐性クローンをまと め、１４．５ｃｍ培養ディッシュに播種して、コンフルエンスに達するまで選択 圧の存在下で増殖させた。細胞集団から得られた抽出物を調製し、ＤＮＡ遅延ア ッセイを上記のように行った。抽出物の総タンパク質含有量を、Ｂｒａｄｆｏｒ ｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７２ 、２４８〜２５４）に従って測定した。タンパク質−ＤＮＡ複合体を、リン光画 像化装置によって検出して定量した。すべてのＨｅＬａ細胞抽出物において、ｔ ｅｔオペレーターＤＮＡに対していくらかの親和性を有するタンパク質が認めら れる。星印で印を付けたこのタンパク質（図３Ａ）を、様々なトランス活性化因 子を定量するための内部マーカーとして使用した。実施例１ ：ＴｅｔＲとＶＰ１６に由来する最小の活性化ドメインとの融合物の構 築 ＶＰ１６は、大きな負電荷の周囲に位置する嵩張った疎水性アミノ酸を特徴と する２つの異なる転写活性化ドメインを含有する（Ｒｅｇｉｅｒ，Ｊ．Ｌ．、Ｓ ｈｅｎ，Ｆ．およびＴｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｊ．（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０、８８３〜８８７）。それぞれ のドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインなどの異種のＤＮＡ結合ドメイ ンに融合させた場合、転写を活性化することが示された（Ｓｅｉｐｅｌ，Ｋ．、 Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，Ｏ．およびＳｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｗ．（１９９２）ＥＭＢＯ −Ｊ １１、４９６１〜４９６８）。４３６位〜４４７位（このアミノ酸配列を 配列番号１に示す）によって明らかにされる酸性ドメインをコードするオリゴヌ クレオチド［Ｆ］を合成して、ｔｅｔＲ遺伝子の３’末端との読み枠を合わせて プラスミドｐＵＨＤ１４１−１／Ｘに挿入した。多数の組み込みのために、１個 、２個、３個または４個の活性化モジュールを含有するトランス活性化因子をコ ードする配列が得られた。それらの配列を、それぞれ、ＴｅｔＲ−Ｆ、ＴｅｔＲ −ＦＦ、ＴｅｔＲ−ＦＦＦ、ＴｅｔＲ−ＦＦＦＦとした。これらの構築物の構造 を図１に図示する。反復ユニットによって誘導される構造的な制約の可能性を低 下させるために、それぞれのドメインをプロリンによって連結した：最初のドメ インもまたプロリンによりＴｅｔＲに結合する。それぞれのトランス活性化因子 構築物を配列分析によって確認した。 ＴｅｔＲとＶＰ１６由来の最小ドメインとの融合物の活性化能の範囲を広げる ために、ＰｈｅをそれぞれＧｌｙまたはＴｙｒで置換することによってＶＰ１６ 由来の最小ドメインの配列を変更した。変異型（Ｇ、Ｙ）ドメインおよび野生型 ドメインの様々な組合せを含有するＴｅｔＲ融合物をいくつか作製した。これら を図１に図示する。単純化するために、転写を活性化し得るこれらのＴｅｔＲ融 合物を、表１（実施例３を参照のこと）に示すように、ｔＴＡ１〜ｔＴＡ７とす る。実施例２ ：ｔｅｔＯ配列に対する新規のＴｅｔＲ融合タンパク質のＴｃに依存す る結合 本発明の新しいＴｅｔＲキメラのｔｅｔＯに対する結合をＤＮＡ遅延実験によ り調べた。様々なタンパク質を、ＨｅＬａ細胞でのプラスミドｐＵＨＤ１４１− １／ＸおよびｐＵＨＤ１８−１〜ｐＵＨＤ２１〜１の一過性発現により産生させ た。トランスフェクションの３０時間後に、抽出物を調製し、放射能標識したｔ ｅｔＯ ＤＮＡとインキュベーションした。タンパク質−ＤＮＡ複合体の電気泳 動分離により、本発明の新しい融合タンパク質は、ＴｅｔＲの効率と比較できる 効率でｔｅｔＯ ＤＮＡと結合し（図２Ａを参照のこと）、そしてそれぞれの融 合タンパク質の分子量に従って移動する複合体を形成することが明らかにされる 。結合アッセイにおけるＴｃの存在は、複合体の形成を妨げる。さらに、この分 析により、本発明の新しい融合タンパク質は、分解産物が検出できないほど安定 であることが示唆される。 ＶＰ１６の変異した最小の活性化ドメインを含有するＴｅｔＲ融合物を、その ｔｅｔＯ結合について同様に調べた。ＨｅＬａ細胞において産生される場合、す べての融合タンパク質は、ＤＮＡ遅延実験によって明らかにされたように効率的 にｔｅｔＯと結合するようである（図２Ｂを参照のこと）。実施例３ ：ＴｅｔＲ−［Ｆ］および変異型融合物の活性化能 本発明の新規なＴｅｔＲ融合物の活性化能を評価するために、ＨｅＬａＸ１／ ６細胞を、それぞれのタンパク質をコードするプラスミドで一過性にトランスフ ェクションして、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＨｅＬａ細胞株Ｘ１／６を３ ５ｍｍ培養ディッシュで５０％コンフルエンスまで増殖させた：この細胞は、染 色体に組み込まれ、ｔＴＡに依存するプロモーターＰ_{hCMV ★ー1}の転写制御下にあ るルシフェラーゼ遺伝子（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９ ９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、５５４７〜５５ ５１）を含有する。細胞を、ＴｅｔＲまたは新しい融合タンパク質の１つのいず れかをコードするＤＮＡで一過性にトランスフェクションした。培養物をテトラ サイクリン（１μｇのＴｃ／ｍｌ）の存在下または非存在下で３０時間インキュ ベーションし、その後、ルシフェラーゼ活性を測定して、（ｐＵＨＤ１６−１と の同時トランスフェクションによって導入される）β−ガラクトシダーゼ活性に 対して標準化した。２つの独立したトランスフェクション実験の測定値を下記の 表１に示す。これは、ｔＴＡ活性（１００％）に対する相対値である。ＨｅＬａＸ１／６細胞株におけるルシフェラーゼ活性はほとんど検出することが できないが、ｔＴＡをコードする遺伝子の一過性発現により大きく増大させるこ とができる；ルシフェラーゼ活性はＴｃにより抑制されている（表１）。ルシフ ェラーゼ遺伝子の誘導は、ＴｅｔＲ単独では効果がないために、ＴｅｔＲに融合 した活性化ドメインに完全に依存している（表１）。 様々なＴｅｔＲ−［Ｆ］融合物をこのアッセイで調べた場合、ルシフェラーゼ 活性の緩やかな増大が認められる：ＴｅｔＲ−ＦＦでは、ｔＴＡによりもたらさ れる活性の約４０％に達し、ＴｅｔＲ−ＦＦＦではほぼ１００％に達し、Ｔｅｔ Ｒ−ＦＦＦＦでは約２３０％に達する。驚くべきことに、最小ドメインを１個含 有するＴｅｔＲ−Ｆは、このような条件下では活性化しない。 変異型のＶＰ１６融合物の活性化能を分析した場合、ＴｅｔＲ−ＧＧの活性は 本質的には見出されなかった。しかし、［Ｇ］ドメインを［Ｆ］ドメインと組み 合わせることによって、それぞれ、ｔＴＡの活性化能の約０．０３％（ＴｅｔＲ −ＦＧ）および０．６％（ＴｅｔＲ−ＧＦ）に達する低いが、明確な活性化が認 められる。ｔＴＡ活性の４．６％および１４％に対応するより大きな活性化レベ ルが、ＦＧＹおよびＧＦＹの組合せにより得られる。上記のＴｅｔＲ融合物を含 有する［Ｆ］ドメインと一緒に、これらの組合せにより、活性化強度が３桁を超 える大きさの範囲にまたがる一連のＴｃ制御のトランス活性化因子が得られる。実施例４ ：ｔＴＡ３およびｔＴＡ４を構成的に産生するＨｅＬａＸ１／６細胞に おけるルシフェラーゼ活性の制御 安定的にトランスフェクションされた細胞における新規なトランス活性化因子 のいくつかの特性を特徴づけるために、ＰｈＣＭＶにより制御されるｔＴＡ、ｔ ＴＡ３またはｔＴＡ４をコードする遺伝子をＨｅＬａＸ１／６細胞に入れた。ｐ ＵＨＤ１９−１またはｐＵＨＤ２６−１（表１）、およびハイグロマイシン耐性 を有するｐＨＭＲ２７２（Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｈ．Ｕ．他（１９８５）Ｅｘｐ．Ｃ ｅｌｌ．Ｒｅｓ．１５８、２３７〜２４３）との同時トランスフェクションによ って耐性クローンを単離して、耐性クローンをＴｃの存在下および非存在下でル シフェラーゼ活性について調べた。効率的な調節に関して選択された４クローン の細胞を、１０，０００細胞／３５ｍｍ培養ディッシュの密度で播種して、テト ラサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で５日間増殖させた。結 果を下記の表２にまとめる。示す結果は、５つの独立した培養物の算術平均であ る。 これらの耐性クローンにおいて、Ｔｃ存在下のルシフェラーゼ活性は、トランス フェクションされていないＸ１／６細胞の活性と区別することができない（表２ ）。しかし、エフェクターの非存在下では、ルシフェラーゼ活性を１０⁴倍以上 に刺激することができる。これらの結果により、安定的な細胞条件下で、ｔＴＡ ３およびｔＴＡ４の２つの新しいトランス活性化因子の機能性が確認される。こ れらはともに、ｔＴＡ／ｒｔＴＡ応答性プロモーターによる転写を厳密に調節す ることができる。調べたクローンにおいて、ＴｅｔＲ−ＦＦおよびＴｅｔＲ−Ｇ ＦＹによりもたらされる活性化レベルは、一過性トランスフェクションで得られ た結果（表１）と比較することができないことを強調しておかなければならない 。その後の実験において、トランス活性化因子をコードする同じ量のＤＮＡを細 胞に導入すると、同じ位の細胞内濃度のｔＴＡタンパク質が得られた。従って、 異なる活性化レベルは、それぞれのＴｅｔＲ融合物の特性を反映している。これ に対して、安定的にトランスフェクションされた細胞では、トランス活性化因子 をコードする遺伝子はゲノムに無作為に組み込まれている。その発現は、コピー 数および遺伝子座の両方に依存し、その結果、その細胞内濃度はクローン毎に異 なる。従って、このような濃度の違いは、それぞれのトランス活性化因子の特性 というよりもむしろ、異なるレベルの活性化により引き起こされる。実施例５ ：トランス活性化因子の細胞内濃度 最小のドメインを有するトランス活性化因子が、ｔＴＡよりも大きな細胞内濃 度で寛容であるかどうかを調べるために、ＨｅＬａ細胞を、それぞれ、ｔＴＡ、 ｔＴＡ２、ｔＴＡ３およびｔＴＡ４をコードするプラスミドと同時にトランスフ ェクションした。対応するプラスミド（表１）は、Ｇ４１８耐性クローンもまた トランス活性化因子遺伝子を確実に発現するようにｎｅｏ耐性マーカーを備えた （上記の「方法」節を参照のこと）。Ｇ４１８耐性に関する選抜によって、３０ ０〜５００コロニーの集団が得られた。そのような集団を増殖させ、そしてタン パク質抽出物を、放射能標識したｔｅｔオペレーターＤＮＡを用いた電気泳動移 動度シフト実験によりトランス活性化因子タンパク質について分析した。図３Ａ に示すように、ＴｅｔＲおよび最小の活性化ドメインからなるトランス活性化因 子はすべて、ＴｅｔＲ−ＶＰ１６融合タンパク質であるｔＴＡよりも高い濃度で 細胞内に存在する。興味深いことに、ｔＴＡと同じ活性化能を有するｔＴＡ２（ 表１）は、それにもかかわらず、３倍高い濃度で寛容である。しかし、新しいト ランス活性化因子において、細胞内濃度は、それぞれの活性化能と反対に増大す る。従って、ｔＴＡ３およびｔＴＡ４の濃度は、ｔＴＡの濃度よりも、それぞれ 、５倍および９倍高い。ｔＴＡまたはｔＴＡ３のいずれかを産生するそれぞれの クローンをＤＮＡ遅延アッセイによりトランス活性化因子の相対量について分析 した場合、同じ結果が得られた：ｔＴＡ３の細胞内濃度は、再度ではあるが、ｔ ＴＡの細胞内濃度の約５倍高かった（図３Ｂ）。ｔＴＡを発現するＨｅＬａ細胞 から得られた抽出物により、ＤＮＡ遅延アッセイにおいて、ｔＴＡの分解産物で あると考えられる第２のタンパク質−ＤＮＡ複合体が明らかにされる（図３）。 この生成物は、他の細胞株においてもまた一定しない程度で見出されている。こ の複合体の移動度から、約４２アミノ酸が、最もありそうなこととしてＣ端から 切断されていることが推定され得る：なぜなら、Ｎ端からのこのような大きさの 欠失はトランス活性化因子のオペレーター結合能を損なうからである。従って、 この分解産物は、ＶＰ１６分子の第２の（Ｃ端側の）活性化ドメインを失ってい ることが十分に考えられる。そのような短縮型タンパク質が依然としてトランス 活性化因子として作用するかどうかは不明である。 均等物 当業者は、日常的な範囲を超えることのない実験を行うことによって、本明細 書中に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、 あるいはそのような均等物を見出すことができる。そのような均等物は、下記の 請求項により包含されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 バロン，ウド ドイツ国、Ｄ―69181、ザンクト、イルゲ ン、テーオドール―ホイス―シュトラー セ、４ (72)発明者 ゴセン，マンフレート アメリカ合衆国、カリフォルニア州 94530、エル セリット、アーリントン ブールバー ＃ビー、978 (72)発明者 ブヤルト，ヘルマン ドイツ国、Ｄ―69120、ハイデルベルク、 レムラー、シュトラーセ、９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．転写を活性化する融合タンパク質をコードする単離された核酸分子であって 、前記融合タンパク質がＤＮＡ結合ドメインを含む第１のポリペプチドと、これ に機能的に連結された、転写活性化ドメインを含む第２のポリペプチドとを含み 、前記転写活性化ドメインが単純ヘルペスウイルスのビリオンタンパク質１６（ ＨＳＶ ＶＰ１６）の変異した酸性領域の少なくとも１コピーを含み、前記変異 した酸性領域がＨＳＶ ＶＰ１６のアミノ酸位４３６〜４４７からなり、かつ野 生型のＨＳＶ ＶＰ１６と比較して、４４２位においてアミノ酸置換を有するこ とを特徴とする、転写を活性化する融合タンパク質をコードする単離された核酸 分子。 ２．ＨＳＶ ＶＰ１６の変異した酸性領域が配列番号２のアミノ酸配列を有する 、請求項１に記載の核酸分子。 ３．ＨＳＶ ＶＰ１６の変異した酸性領域が配列番号３のアミノ酸配列を有する 、請求項１に記載の核酸分子。 ４．前記転写活性化ドメインが配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記 載の核酸分子。 ５．前記転写活性化ドメインが配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記 載の核酸分子。 ６．前記転写活性化ドメインが配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記 載の核酸分子。 ７．前記転写活性化ドメインが配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記 載の核酸分子。 ８．前記転写活性化ドメインが配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項１に 記載の核酸分子。 ９．前記第１のポリペプチドがＴｅｔリプレッサーである、請求項１に記載の核 酸分子。 １０．前記の第１のポリペプチドが、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン 類似体の存在下ではｔｅｔＯ配列に結合するが、テトラサイクリンまたはテトラ サイクリンアナログの非存在下ではｔｅｔＯ配列に結合しない変異したＴｅｔリ プレッサーである、請求項１に記載の核酸分子。 １１．第１のポリペプチドが、ＧＡＬ４、ＬｅｘＡ、ＬａｃＲ、およびステロイ ドホルモンレセプターからなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。 １２．転写を活性化する融合タンパク質をコードする単離された核酸分子であっ て、前記融合タンパク質がＤＮＡ結合ドメインを含む第１のポリペプチドと、こ れに機能的に連結された、転写活性化ドメインを含む第２のポリペプチドとを含 み、前記転写活性化ドメインが単純ヘルペスウイルスのビリオンタンパク質１６ （ＨＳＶ ＶＰ１６）の酸性領域の３コピーからなり、前記酸性領域がＨＳＶＶ Ｐ１６のアミノ酸位４３６〜４４７（配列番号１）からなることを特徴とする、 転写を活性化する融合タンパク質をコードする単離された核酸分子。 １３．前記第１のポリペプチドはＴｅｔリプレッサーである、請求項１２に記載 の核酸分子。 １４．前記第１のポリペプチドは、テトラサイクリンまたはテトラサイクリンア ナログの存在下でｔｅｔＯ配列に結合するが、テトラサイクリンまたはテトラサ イクリンアナログの非存在下ではｔｅｔＯ配列に結合しない変異したＴｅｔリプ レッサーである、請求項１２に記載の核酸分子。 １５．第１のポリペプチドは、ＧＡＬ４、ＬｅｘＡ、ＬａｃＲ、およびステロイ ドホルモンレセプターからなる群から選択される、請求項１２に記載の核酸分子 。 １６．転写活性化ドメインを含む第２のポリペプチドに機能的に連結されたＤＮ Ａ結合ドメインを含む第１のポリペプチドを含み、そして転写を活性化する融合 タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、前記転写活性化ドメイン は単純ヘルペスウイルスのビリオンタンパク質１６（ＨＳＶ ＶＰ１６）の酸性 領域の４コピーからなり、前記酸性領域はＨＳＶ ＶＰ１６のアミノ酸位４３６ 〜４４７（配列番号１）からなる核酸分子。 １７．前記第１のポリペプチドがＴｅｔリプレッサーである、請求項１６に記載 の核酸分子。 １８．前記第１のポリペプチドが、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類 似体の存在下ではｔｅｔＯ配列に結合するが、テトラサイクリンまたはテトラサ イクリン類似体の非存在下ではｔｅｔＯ配列に結合しない変異したＴｅｔリプレ ッサーである、請求項１６に記載の核酸分子。 １９．第１のポリペプチドは、ＧＡＬ４、ＬｅｘＡ、ＬａｃＲ、およびステロイ ドホルモンレセプターからなる群から選択される、請求項１６に記載の核酸分子 。 ２０．宿主細胞における融合タンパク質の発現に適する形態で請求項１に記載の 核酸分子を含む組換えベクター。 ２１．宿主細胞における融合タンパク質の発現に適する形態で請求項１２に記載 の核酸分子を含む組換えベクター。 ２２．宿主細胞における融合タンパク質の発現に適する形態で請求項１６に記載 の核酸分子を含む組換えベクター。 ２３．請求項２０に記載のベクターを含む宿主細胞。 ２４．請求項２１に記載のベクターを含む宿主細胞。 ２５．請求項２２に記載のベクターを含む宿主細胞。 ２６．請求項１に記載の核酸分子によってコードされる、転写を活性化する融合 タンパク質。 ２７．請求項１２に記載の核酸分子によってコードされる、転写を活性化する融 合タンパク質。 ２８．請求項１６に記載の核酸分子によってコードされる、転写を活性化する融 合タンパク質。 ２９．ヒト以外のトランスジェニック生物の細胞における融合タンパク質の発現 に適する形態で、請求項１に記載の核酸分子を有するトランスジーンを含む、ヒ ト以外のトランスジェニック生物。 ３０．ヒト以外のトランスジェニック生物の細胞における融合タンパク質の発現 に適する形態で、請求項１２に記載の核酸分子を有するトランスジーンを含む、 ヒト以外のトランスジェニック生物。 ３１．ヒト以外のトランスジェニック生物の細胞における融合タンパク質の発現 に適する形態で、請求項１６に記載の核酸分子を有するトランスジーンを含む、 ヒト以外のトランスジェニック生物。