JP2004500884A - 遺伝子発現の調節方法及び手段 - Google Patents
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Abstract
ＤＮＡ結合ドメインと転写アクチベータまたは転写リプレッサードメインと場合によってはリガンド依存性ＤＮＡ結合及び／または転写因子による転写活性化もしくは転写抑制の調節ドメインとから成り、転写アクチベータまたは転写リプレッサーとして作用する転写因子が提供される。該転写因子の特徴は、キメラ転写因子であり、ＨＮＦ１ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインと、異なるポリペプチドの転写アクチベータまたは転写リプレッサードメインとを含んでいること、但し、転写因子が転写アクチベータドメインを含む転写アクチベータであるときは、転写因子が、アシルＨＳＬと結合してＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合機能を活性化するようなアシルＨＳＬまたはその類似体に結合する調節ドメインを含まないことである。転写アクチベータは、ヒトＨＮＦ１ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインと、Ｇ５２１Ｒ突然変異体を含むヒトエストロゲン受容体α調節ドメインと、ヒトｐ６５活性ドメインとから成る。
Description
【０００１】
本発明は組織に送達された導入遺伝子（トランスジーン）を制御するために有用な転写因子に関する。より特定的には本発明は、免疫原性の低いキメラ転写因子を作製するためにＨＮＦ１転写因子（例えばＨＮＦ１及びｖＨＮＦ１）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を使用することに関する。このようなキメラ転写因子は内在性ＨＮＦ１またはｖＨＮＦ１を発現しない組織に導入遺伝子を送達するのに役立つ。本発明はまた、真核細胞中及び生物体内の遺伝子発現を調節するために有用な核酸分子及びタンパク質に関する。ＨＮＦ１ ＤＢＤを含有する構造的に活性なリガンド依存性トランスアクチベータ及びトランスリプレッサーが提供される。
【０００２】
本発明の調節系において、ヌクレオチド配列の転写は、選択されたＤＮＡ配列に高い選択性で結合する哺乳類のＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインと、該ＤＮＡ結合ドメインに融合しトランスアクチベータのリガンド依存性活性及びその転写活性を担当する種々のポリペプチドとから構成された転写アクチベータ融合タンパク質によって活性化される。本発明の融合タンパク質は、選択されたＨＮＦ１ ＤＮＡ結合部位に連結された任意の標的遺伝子の転写レベルを調節するために役立つ。該融合タンパク質は、筋肉、脳、膵臓及び肺のような内在性ＨＮＦ１及びｖＨＮＦ１タンパク質の欠如した組織中のＨＮＦ１反応性プロモーターによってコントロールされる遺伝子からの転写を特異的に活性化するために使用できる。本発明の融合タンパク質は、哺乳類の要素だけから構成され、これらはヒトタンパク質に由来してもよい。完全ヒトタンパク質はトランスアクチベータによる免疫認識の危険を軽減する。同様にしてリプレッサーも提供される。
【０００３】
ヒトの遺伝子治療の開発中に遭遇する重要な問題は、治療用遺伝子発現の調節である。このために幾つかの調節系が開発された。一般に、これらの系は３つの要素、即ち、（１）標的遺伝子、即ち、特定のＤＮＡ標的配列に作動的に連結されており発現調節が必要とされる遺伝子と、（２）調節タンパク質即ち標的遺伝子の活性を調節するタンパク質をコードしている遺伝子と、（３）外部から系に付加できる好ましくは低分子量の調節分子とから成り、（２）の遺伝子は一般に、調節分子に制御され調節分子と複合体化してＤＮＡ標的配列に結合し得るＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に作動的に連結された転写活性ドメイン（ＡＤ）を含む。適切な調節分子を例えば細胞培養培地に添加してもよくまたは動物の体内に導入してもよい。
【０００４】
現在まで、遺伝子発現を調節するためにほぼ常用であった４つの系は、テトラサイクリン依存性の系（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ．ら，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９）、ステロイドホルモン受容体及びプロゲステロンアンタゴニストＲＵ４８６の使用に基づくＲＵ４８６依存性の系（Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ ｏｒ Ｍｉｆｅｇｙｎｅ，Ｗａｎｇ Ｙ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：８１８０−８１８４）、エクジソン（Ｅｃ）依存性の系（Ｎｏ Ｄ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３；３３４６−３３５１）及びラパマイシン依存性の系（Ｒｉｖｅｒａ Ｖ．Ｍ．ら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，２：１０２８−１０３２）である。
【０００５】
これらの全部の系が、原核生物的またはヒト以外の要素を含み、従ってヒトまたはその他の免疫応答性宿主の体内で免疫原性になり易い。
【０００６】
Ｔｅｔ−系では、大腸菌Ｔｅｔ−リプレッサー（ＴｅｔＲ）の天然のＴｅｔに制御されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が、異種の転写活性ドメイン（ＡＤ）、通常はヘルペスウイルスＶＰ１６に融合している。従って、最小プロモーター及びＴｅｔＲ結合配列の下流にクローニングされた遺伝子の転写は、テトラサイクリンまたはその類似体例えばドキシサイクリンによって制御され得る。以前使用されていた薬物で転写を不活性化するＴｅｔ−ｏｆｆ系（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１）に代わって、薬物で転写を活性化するＴｅｔ−ｏｎ系（Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ．ら，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９）の使用が主流になっている。
【０００７】
ＥｃＢ−依存性の系の場合、ショウジョウバエＥｃ受容体の天然のＥｃ依存性ＤＢＤをＶＰ１６に結合させる。このキメラを別のステロイド受容体（ＲＸＲ）と同時発現させるとＥｃ依存性転写が得られる（Ｎｏ Ｄ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１）。
【０００８】
ヒトのプロゲステロン受容体に基づいてもっと“ヒト化した”系が作製された。ヒトプロゲステロン受容体のカルボキシ末端欠失突然変異体が同定された。この突然変異体は合成プロゲステロンアンタゴニストＲＵ４８６結合能を保持しているがプロゲステロンには結合しない（Ｗａｎｇ Ｙ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：８１８０−８１８４）。この突然変異体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＢＤ及びＶＰ１６活性ドメインに融合させた人工転写因子が構築された。このキメラはＲＵ４８６によって活性化されたがプロゲステロンによって活性化されず、ＧＡＬ−４反応性プロモーターによって制御された遺伝子からｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの転写を誘発した（Ｗａｎｇ Ｙ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：８１８０−８１８４）。この系のより新しい形態では、ＶＰ１６ ＡＤに代替してヒトｐ６５タンパク質のＡＤが使用されている（Ｂｕｒｃｉｎ Ｍ．Ｍ．ら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５５−３６０；Ａｂｒｕｚｚｅｓｅ Ｒ．Ｖ．ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１４９９−１５０７）。
【０００９】
部分的にヒト化した別の系は、ラパマイシン及びその類似体がダイマー化する特性を利用して作製された。この系では、転写因子がヘテロダイマーに基づく。１つのモノマーはヒトタンパク質ＦＫＢＰ１２に融合した非哺乳類タンパク質ＺＦＨＤ−１のＤＮＡ結合ドメインから構成されている。第二のモノマーはヒトのｐ６５タンパク質のＡＤに融合した別のヒトタンパク質ＦＲＡＰから構成されている（Ｒｉｖｅｒａ Ｖ．Ｍ．ら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，２：１０２８−１０３２；Ｒｉｖｅｒａ Ｖ．Ｍ．ら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：８６５７−８６６２）。ＦＲＡＰ及びＦＫＢＰ１２の双方がラパマイシンに結合する。従って、ラパマイシンの存在下で、ヘテロダイマー転写因子が形成され、ＺＦＨＤ−１認識部位を含有するプロモーターからラパマイシン依存性転写が行われる。
【００１０】
本発明は、真核細胞中または動物体内で遺伝子発現を調節するために使用できる核酸分子及びタンパク質に関する。本発明の系による遺伝子発現の調節には少なくとも２つの成分、即ち、調節配列に作動可能にまたは作動的に連結されており転写されかつ場合によっては（タンパク質をコードしているときは）翻訳されるべき配列と、調節配列に結合しており遺伝子転写を調節するタンパク質とが関与する。
【００１１】
本発明では、転写因子、好ましくはヒト体内で免疫原性を低下させたと考えられる“ヒト化した”転写因子を十分に産生するために肝臓に富化されたヒト転写因子ＨＮＦ１のＤＢＤを使用する。本発明の転写因子はＨＮＦ１結合部位を含むＨＮＦ１依存性プロモーターに結合すると転写を活性化するかまたは抑制する。
【００１２】
従って１つの観点によれば本発明は、ＤＮＡ結合ドメインと転写アクチベータまたは転写リプレッサードメインと場合によってはリガンド依存性ＤＮＡ結合及び／または転写因子による転写活性化もしくは転写抑制の調節ドメインとから成り、ＤＮＡ結合ドメインがＨＮＦ１ポリペプチドに由来し、転写アクチベータまたはリプレッサードメインが異なるポリペプチドに由来するような転写アクチベータまたは転写リプレッサーとして作用する転写因子を提供する。但し、転写因子が転写アクチベータドメインを含む転写アクチベータであるときは、転写因子が、アシルＨＳＬまたはその類似体に結合しアシルＨＳＬとの結合によってＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合機能を活性化する調節ドメインを含まない。
【００１３】
好ましくは、ヒトＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトの転写アクチベータまたは転写リプレッサードメイン及び場合によってはヒト調節ドメイン即ちヒトポリペプチドの適切なドメインと共に使用される。
【００１４】
リプレッサーまたはアクチベータドメインとＤＮＡ結合ドメインとが融合タンパク質の内部に設けられてもよく、該融合タンパク質が更に調節ドメインを含んでもよい。あるいは、ＤＮＡ結合ドメインと調節ドメインとが融合タンパク質の内部に設けられてもよく、該融合タンパク質が転写アクチベータまたはリプレッサードメインと会合して機能性転写因子を提供してもよい。
【００１５】
適当な調節ドメインに関して以下により詳細に検討する。本発明の幾つかの実施態様では（特に転写因子が転写アクチベータである場合には）、ＬｕｘＲ調節ドメイン及びＮ−アシル−ホモセリン−ラクトン（アシルＨＳＬ）に反応性のその他のドメインを使用しないほうがよい。従って、ＬｕｘＲ型転写因子、即ち、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ菌のＬｕｘＲタンパク質（Ｆｕｑｕａら；１９９４；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：２６９−２７５）は排除し得る。Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．らの一般的教示（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，Ｗａｌｌａｃｅ，ＪＣ．，Ｂｒｏｗｎ，ＪＰ．，１９９０；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｉｍｏｌ．１８３：１１１−１３２）及びＦｕｑｕａら（Ｆｕｑｕａら；１９９４；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：２６９−２７５；Ｆｕｑｕａ，Ｃ．ら；１９９６；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０：７２７−７５１）のより特定的な教示によれば、ＬｕｘＲ型転写因子のＬｕｘＲスーパーファミリーに属する因子は以下の特性によって定義される：
（１）Ｎ−アシルホモセリンラクトンに基づく遺伝子調節系の１つの成分となるＤＮＡ結合タンパク質である；
（２）ＬｕｘＲの推定アシルＨＳＬ結合領域に位置合せされる領域に第一の配列相同クラスターを含む；
（３）それらのカルボキシ末端の三分の一が、ＤＮＡ結合ドメイン内部に含まれているヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフとして定義された領域に第二の配列相同クラスターを含む。このヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフは、多数の転写因子中のタンパク質−ＤＮＡ主溝相互作用に関与すると推定されるプローブヘリックスであると定義されるモチーフを含有することが確認されている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．１９９３；ＥＭＢＯ Ｊ．，８：３２２１−３２２６）。配列相同性は一般に、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのＥｘＰＡＳＹパブリックサーバを使用して認識される。ＰＲＯＳＩＴＥ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１，Ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ−Ｓｅｒｖｅｔ，１２１１，Ｇｅｎｅｖｅ，４ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって定義されたＬｕｘＲファミリーのメンバーであることを定義する識別パターン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐａｔｔｅｒｎ）は以下の通りである：
［ＧＤＣ］−ｘ（２）−［ＮＳＴＡＶＹ］−ｘ（２）−［ＩＶ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ（２）−［ＬＩＶＭＦＹＷＣＴ］−ｘ−［ＬＩＶＭＦＹＷＣＲ］−ｘ（３）−［ＮＳＴ］−［ＬＩＶＭ］−ｘ（５）−［ＮＲＨＳＡ］−［ＬＩＶＭＳＴＡ］−ｘ（２）−［ＫＲ］。
【００１６】
他のＬｕｘＲ識別パターンは、Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｉｎ Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡまたはＷｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｉｓｒａｅｌの“Ｂｌｏｃｋｓ”データベースを参照して定義し得る。
【００１７】
ＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインは、適切な転写活性化または転写抑制のドメインを介して転写の活性化または抑制を行わせるために核酸分子内部、より特定的にはプロモーター領域内部のＨＮＦ１結合部位に結合し得る。
【００１８】
指定がない限り、本明細書を通じて頭字語ＨＮＦ１は、ＨＮＦ１、ｖＨＮＦ１−Ａ及びｖＨＮＦ１−Ｂのような公知形態の任意のＨＮＦ１を含意しており、“ＨＮＦ１結合部位”という用語は、公知形態の任意のＨＮＦ１に特異的に結合する任意の結合部位を意味する（参考文献は後出）。
【００１９】
天然のＨＮＦ１ポリペプチドは肝細胞中で高レベルで発現される転写因子であり、アルブミン及びα１−抗トリプシンのような幾つかの肝特異的遺伝子の転写を担当する。これらはまた、腎臓、腸、胃及び膵臓のような肝臓以外の組織中で発現される。しかしながら、ＨＮＦ１タンパク質は幾つかの細胞系及び組織中では天然に発現されない。特に、ＨＮＦ１が筋肉中で発現されないという事実は本発明の遺伝子治療の目的に関連性を有している。
【００２０】
ウイルス性または非ウイルス性のベクターの直接筋肉内注入は導入遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ送達の好ましいモードの１つである。特に、筋肉内に直接注入されるウイルス性または非ウイルス性ベクターは、（ｉ）対応する病原体による以後の攻撃を防御すべくウイルス、細菌または原生動物に由来の抗原をコードするか、（ｉｉ）対応する抗原を発現する腫瘍発生細胞による攻撃からマウスを保護すべく腫瘍特異的抗原をコードしているか、（ｉｉｉ）血流中に送達すべく分泌タンパク質をコードしている（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｅｉｄｅｎ，Ｊ．Ｍ．，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，８，３６０−３６５）。
【００２１】
ＨＮＦ１依存性プロモーターの下流にクローニングされた導入遺伝子は、内在性ＨＮＦ１の欠如した細胞に送達されたときには転写されない（Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９０，ＥＭＢＯ Ｊ．，９，４４６７−４４７５）。ＨＮＦ１は筋肉中に存在しないので、ＨＮＦ１依存性プロモーターの下流にクローニングされた導入遺伝子は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの筋肉細胞に送達されたときにはサイレントであろう。しかしながらこれまでにｉｎ ｖｉｔｒｏで得られた結果は、ＨＮＦ１をコードしている発現ベクターを筋肉に同時に送達するとこのような導入遺伝子が活性化され得ることを示した（（Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９０，ＥＭＢＯ Ｊ．，９，４４６７−４４７５）。
【００２２】
ＨＮＦ１の種々の機能性ドメインが当業界で公知である（Ｃｈｏｕａｒｄ Ｔ．ら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５８５３−５８６３；Ｎｉｃｏｓｉａ Ａ．ら，１９９０，Ｃｅｌｌ，１２２５−１２３６；Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９３，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，１９９−２０８）。
【００２３】
ＨＮＦ１（ＬＦ−Ｂ１またはＨＮＦ１αとも呼ばれる）は幾つかの遺伝子の肝細胞特異的転写の主要決定基であると考えられてきた６２８アミノ酸から成る長いＤＮＡ結合タンパク質である（Ｆｒａｉｎ Ｍ．１９９０，Ｃｅｌｌ，５９，１４５−１５７）。これらの配列に由来のコンセンサス結合部位はパリンドロームＧＧＴＴＡＡＴ（Ｎ）ＡＴＴＡＡＴＡである（Ｔｒｏｎｃｈｅ Ｆ．ら，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２６６：２３１−２４５）。この部位の二回対称性に一致してＨＮＦ１はＤＮＡにダイマーとして結合する。ＨＮＦ１の機能性ドメインは部位特異的突然変異誘発によって分析された（Ｃｈｏｕａｒｄ Ｔ．ら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５８５３−５８６３；Ｎｉｃｏｓｉａ Ａ．ら，１９９０，Ｃｅｌｌ，１２２５−１２３６；Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９３，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，１９９−２０８）。分子の転写活性に必要な残基はＣ末端部に局在しており（アミノ酸２８２−６２８）、ＤＮＡ結合活性はＮ末端の最初の２８１アミノ酸（ＤＢＤ＝１−２８１）に存在する。ＨＮＦ１のＤＮＡ結合ドメインの内部で３つの領域、即ち、領域Ａ、Ｂ及びＣが同定された（Ｎｉｃｏｓｉａ Ａ．ら，１９９０，Ｃｅｌｌ，１２２５−１２３６）。領域Ａ（アミノ酸１−３２）は、α−ヘリカル構造を介してタンパク質のダイマー化を生じさせるために必要十分な領域であることが証明された（Ｄｅ Ｆｒａｎｓｃｅｓｃｏ Ｒ．ら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１４３−１４７；Ｐａｓｔｏｒｅ Ａ．ら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１４８−１５３）。領域Ｂ（アミノ酸１００−１８４）及び領域Ｃ（アミノ酸１９８−２８１）はそれぞれＰＯＵタンパク質のＰＯＵ−Ａボックス及びＰＯＵ−ホモドメインに有限の相同性を示す。（Ｈｅｒｒ Ｗ．，１９８８，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２，１５１３−１５１６；ＲＥＦ）。ＨＮＦ１ ＤＢＤのホモドメイン様構造は、基準形（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）のホメオボックスに比べてヘリックスＩＩとヘリックスＩＩＩとの間に２１個のアミノ酸が挿入されている（Ｆｉｎｎｅｙ，Ｍ．，１９９０，Ｃｅｌｌ，６０−５−６；Ｃｅｓｋａ Ｔ．Ａ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２，１８０５−１８１０）。
【００２４】
ＨＮＦ１に対して高度な一次配列相同性を有しているタンパク質もまたクローニングされ（Ｒｅｙ−Ｃａｍｐｏｓ Ｊ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，１４４５−１４５７；Ｄｅ Ｓｉｍｏｎｅ Ｖ．ら，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，１４３５−１４４３）、変異体ＨＮＦ１（ｖＨＮＦ１）またはＬＦ−Ｂ３またはＨＮＦ１βと呼ばれている。ＨＮＦ１及びｖＨＮＦ１はそれらのＤＢＤ中のアミノ酸レベルで高度な相同性を共有している（Ａ、Ｂ及びＣ領域；Ｒｅｙ−Ｃａｍｐｏｓ Ｊ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，１４４５−１４５７；Ｆｒａｉｎ Ｍ．１９９０，Ｃｅｌｌ，５９，１４５−１５７）。ＨＮＦ１とｖＨＮＦ１との配列相同性は、ＡＤの存在が判明した配列のＣ末端部に向かって減衰している。ラット、マウス及びヒトではｖＨＮＦ１をコードする異なる２つのｃＤＮＡが選択的スプライシングによって作製され、ｖＨＮＦ１Ａ及びｖＨＮＶ１Ｂと命名された。ｖＨＮＦ１Ａは５５９アミノ酸長であり、５３３アミノ酸長であるｖＨＮＦ１Ｂには存在しない他の２６アミノ酸長のセグメントを含んでいる。この配列はＤＢＤのＢドメイン及びＣドメインに局在し、ＨＮＦ１には存在しない。本出願では、ｖＨＮＦ１ＡとｖＨＮＦ１Ｂとを集合的にｖＨＮＦ１という名称で表す。
【００２５】
ｖＨＮＦ１のＤＢＤとＨＮＦ１のＤＢＤとが高度な配列相同性を共有しているという事実に一致して、２つのタンパク質は同じＤＮＡ結合特異性を有しており、溶液中及びＤＮＡ上でヘテロダイマーを形成し得る（Ｔｒｏｎｃｈｅ Ｆ．ら，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２６６：２３１−２４５）。マウスまたはラットの発生中に、ｖＨＮＦ１の発現は系統的にＨＮＦ１の発現に先行する（Ｌａｚｚａｒｏ Ｄ．ら，１９９２，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１４，４６９−４７９；Ｃｅｒｅｇｈｉｎｉ，Ｓ．，１９９２，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１６，７８３−７９７）。これらのタンパク質は幾つかの肝特異的遺伝子の転写を担うと考えられているが、双方ともが腎臓、腸、胃及び膵臓のような肝臓以外の組織中でも発現される。ＨＮＦ１ ｍＲＮＡはまた脾臓及び精巣中で検出され、ｖＨＮＦ１ ｍＲＮＡはまた肺及び卵巣中で検出された（Ｄｅ Ｓｉｍｏｎｅ Ｖ．ら，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，１４３５−１４４３；Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄ Ｍ．，１９９１，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１３，５８９−５９９；Ｅｍｅｎｓ Ｌ．Ａ．ら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，７３００−７３０４）。
【００２６】
本発明の発明者らは、ＨＮＦ１以外の活性ドメインまたはリプレッサードメインを場合によってはリガンド依存性調節ドメインと共に含む機能性キメラ転写因子を構築するためにＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインを初めて使用した。従って本発明のトランスアクチベータは、内在性ＨＮＦ１を発現しない細胞及び組織中でＨＮＦ１反応性プロモーターの下流にクローニングされ同時に送達された導入遺伝子からの転写を特異的かつ効果的に調節するために使用できる。
【００２７】
融合タンパク質及び転写因子、本発明のアクチベータ及びリプレッサーに関して本文中で使用された“キメリック”または“キメラ”という用語は、異なる起原の成分から成る組成物、特に異なる親タンパク質成分から成る組成物を意味する。従って、ＨＮＦ１ ＤＢＤとｐ６５ ＡＤ（後記参照）とから構成された転写因子はキメリックであると考えられる。これは種間のキメラ性には全く無関係であり、実際、好ましい実施態様では本発明のキメラ転写因子がヒトタンパク質成分だけから構成されている。
【００２８】
脊椎動物の遺伝子治療に有用なベクターを開発するため、及び、ヒト以外の哺乳類細胞中の遺伝子発現をコントロールするために、ヒト起原でなく動物のＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインを使用できる。本発明はヒトＨＮＦ１ ＤＢＤに限定されることなく、更に、ヒト以外の哺乳動物種のＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１ ＤＢＤを含む任意のキメラ転写因子に関する。
【００２９】
本発明の融合タンパク質を含む転写アクチベータは天然発生ＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１タンパク質の一部分を含んでいてもよく、その例については記載した。更に、既知の天然アミノ酸配列に比べて１つまたは複数のアミノ酸残基が異なっているアミノ酸配列から成る１つまたは複数のポリペプチド成分を使用し得る。このアミノ酸配列は、特定配列の突然変異体、対立遺伝子、アイソフォーム、変異体または誘導体のいずれでもよい。本発明の転写アクチベータは、野生型ＤＢＤの代わりに、１つまたは複数のアミノ酸の１つまたは複数の付加、挿入、欠失及び置換によって１つまたは複数のアミノ酸残基が野生型アミノ酸配列とは異なっているアミノ酸配列を有しているが同じ結合特異性を維持しているＤＢＤを含んでもよい。
【００３０】
好ましくは、アミノ酸配列が適切なタンパク質のフラグメントと好ましくは少なくとも約３０％または４０％または５０％または６０％または７０％または７５％または８０％または８５％、９０％または９５％の相同性を共有している。従ってタンパク質成分は、野生型配列に対して、１、２、３、４、５個、５よりも多い数、または、１０よりも多い数のアミノ酸の変化、例えば置換を含み得る。
【００３１】
アミノ酸レベルの相同性が一般にアミノ酸の類似性または同一性によって表されることは理解されよう。類似性は“保存性変異”を許容する。即ち、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの疎水性残基によって別の残基が置換されてもよく、または、１つの極性残基によって別の残基が置換されてもよい。例えば、アルギニンによるリシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、もしくは、グルタミンによるアスパラギンの置換が許容される。
【００３２】
類似性は、当業界で標準使用されているＡｌｔｓｈｕｌら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−１０によるＴＢＬＡＳＴＮもしくはその他のＢＬＡＳＴプログラムによって，または、好ましくはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９４の一部を成す標準プログラムＢｅｓｔＦｉｔ及びＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７１１）のいずれかによって定義及び決定され得る。ＢｅｓｔＦｉｔは２つの配列間で最良の類似セグメントを最適に位置合せする。最適位置合せは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局部相同アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ（１９８１）２，ｐｐ．４８２−４８９）を使用し整合の数を最大にするギャップを挿入することによって見出される。ＧＡＰは、整合の数を最大にしギャップの数を最小にするように２つの完全配列を位置合せするＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用する。一般には、デフォールトパラメーターをギャップ発生ペナルティ＝１２及びギャップ延長ペナルティ＝４で使用する。一般には関連する配列の全長について相同性を適切な野生型アミノ酸配列に比較する。
【００３３】
配列間の類似性または相同性を定義する別の方法では緊縮性条件下での核酸のハイブリダイズ能を考慮する。より詳細に後述するように、本発明の融合タンパク質及びそのポリペプチド成分は一般に、コーディング核酸からの発現によって生じる。ハイブリダイゼーション実験にこのようなコーディング核酸を使用してもよい。
【００３４】
低緊縮性条件下でハイブリダイズさせることによって予備実験を行ってもよい。好ましい条件は、詳細な試験の対象になり得る陽性と同定された少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンを得るために十分な緊縮条件である。
【００３５】
例えばハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ（ここで“ＳＳＣ”＝０．１５Ｍの塩化ナトリウム；０．１５Ｍのクエン酸ナトリウム；ｐＨ７）、５×デンハルト試薬、０．５−１．０％のＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡフラグメント、０．０５％のピロリン酸ナトリウム及び５０％以下のホルムアルデヒド、から成るハイブリダイゼーション溶液を使用してＳａｍｂｒｏｏｋらの方法（後出）に従って行うとよい。ハイブリダイゼーションは３７−４２℃で少なくとも６時間行う。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、（１）２×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中に室温で５分間；（２）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中に室温で１５分間；（３）１×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中に３７℃で３０分−１時間；（４）１×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中に４２−６５℃で２時間のサイクルで３０分毎に溶液を交換しながら洗浄する。
【００３６】
特定された配列相同性をもつ核酸分子間のハイブリダイゼーションの遂行に必要な緊縮条件を計算するための常用の公式は、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／二重鎖中の＃ｂｐである。
【００３７】
上記公式の代表例として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミドを、ＧＣ含量４２％及び平均プローブサイズ２００塩基で使用するとき、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは相同性が１％減少する毎に１−１．５℃低下する。従って、約７５％を上回る配列同一性をもつ標的は４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用して観察されるであろう。
【００３８】
陽性クローンを少数にするまでハイブリダイゼーションの緊縮性を徐々に強化することは当業界で公知である。別の適当な条件としては、例えば、約８０−９０％の同一性をもつ配列を検出するためには０．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２、６．５％のＳＤＳ、１０％の硫酸デキストラン中、４２℃で一夜ハイブリダイゼーションし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃で最終洗浄する。約９０％を上回る同一性をもつ配列を検出するための適当な条件は０．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２、６．５％のＳＤＳ、１０％の硫酸デキストラン中、６５℃で一夜ハイブリダイゼーションし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃で最終洗浄する。
【００３９】
上記のように、本発明は、（１）ＤＮＡ中のオペレーター配列に配列特異的に結合する第一のポリペプチド成分、即ち、ＨＮＦ１ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインと、（２）真核細胞中の転写を活性または抑制する第二のポリペプチド成分とを含む転写因子を提供する。該転写因子は更に、コグネイトリガンドに結合する調節ドメインを含んでもよく、これによって調節ドメインとリガンドとが結合するとＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合機能が変化するか、及び／または、転写の活性化または抑制が活性化されるかまたは抑制される。
【００４０】
本発明の系による遺伝子発現の調節には少なくとも２つの成分、即ち、ＨＮＦ１依存性プロモーターに作動可能にまたは作動的に連結された核酸と、ＨＮＦ１のＤＮＡ結合ドメインを１つ以上含んでおり遺伝子の転写を調節するためにプロモーター配列に結合するキメラ転写因子とが関与する。
【００４１】
本発明の調節系においては、ヌクレオチド配列の転写が、少なくとも２つのポリペプチド成分、即ち、（ｉ）ＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）転写の活性化または抑制ドメインと、場合によっては（ｉｉｉ）少なくとも１つのリガンド依存性調節ドメインとを含む転写アクチベータによって活性化される。
【００４２】
本発明の１つの好ましい実施態様では、ＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトＨＮＦ１の残基１−２８２（Ｂａｃｈら（１９９０），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，８（１）：１５５−１６４（配列登録番号Ｐ２０８２３）、もしくは、これらの残基の内部に包含されたＤＮＡ結合部分を含むかまたは該残基もしくは該部分から構成されている。別の好ましい実施態様では、ＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトｖＨＮＦ１Ａの残基１−３１４もしくはこれらの残基の内部に包含されたＤＮＡ結合部分を含むかまたは該残基もしくは部分から構成されている。別の好ましい実施態様では、ＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインがｖＨＮＦ１Ｂの残基１−２８９（Ｒｅｙ−Ｃａｍｐｏｓ Ｊ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，１４４５−１４５７；Ｄｅ Ｓｉｍｏｎｅ Ｖ．ら，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，１４３５−１４４３）、もしくは、これらの残基の内部に包含されたＤＮＡ結合部分を含むかまたは該残基もしくは該部分から構成されている。
【００４３】
１つの観点によれば、本発明の転写アクチベータは、真核細胞中で転写を直接または間接に活性化する転写アクチベータドメインに融合したＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインを含み得る。本発明のこの観点によれば転写アクチベータは構造的に活性である。
【００４４】
あるいは、本発明の転写因子が条件的に活性でもよく、詳細に後述するようなリガンド依存性調節ドメインを含んでもよい。
【００４５】
転写アクチベータまたはリプレッサードメインは当業者には入手容易であろう。真核細胞中での転写を活性化するポリペプチドは当業界で公知である。特に、多くのＤＮＡ結合タンパク質の転写活性ドメインは、該ドメインが異種タンパク質に転移されたときにそれらの活性化機能を維持していることは記載及び証明されている。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様では、転写アクチベータドメインが、ヒトｐ６５タンパク質（Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｂａｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３８０５−３８１７）の活性ドメイン（ＡＤ）であり、より好ましくはヒトｐ６５のアミノ酸２８３−５５１に及ぶ領域もしくは該領域に包含される転写活性化部分を含むかまたは該領域もしくは該部分から構成される。別の実施態様では、ｐ６５ ＡＤのマルチマーを使用し得る。別の実施態様では、ｐ６５ ＡＤの部分のマルチマーを使用し得る。
【００４７】
本発明の別の好ましい実施態様では、転写アクチベータが単純疱疹ウイルスのビリオンタンパク質１６（本文中ではＶＰ１６として表す、そのアミノ酸配列はＴｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｊ．ら，（１９８８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２：７１８−７２９）に開示されている）を含む。より好ましくはＶＰ１６のＣ末端の約１２７個のアミノ酸を使用する。より好ましくはＶＰ１６のＣ末端の約１１個のアミノ酸（アミノ酸４３７−４４７）を使用する。好ましくはこの領域のマルチマー（２−４個のモノマー）を使用する。好ましくは、この領域のダイマー（即ち、約２２アミノ酸）を使用する。ＶＰ１６の適当なＣ末端ペプチド部分はＳｅｉｐｅｌ，Ｋ．ら，（ＥＭＢＯ Ｊ．１９９２ １３：４９６１−４９６８）に記載されている。例えば、アミノ酸配列ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬを有するペプチドのダイマーを使用できる。
【００４８】
本発明の別の実施態様では、転写アクチベータが、ＰＰＡＲγ−１コアクチベータ（ＰＧＣ−１）のＡＤを含むかまたは該ＡＤから構成されている。ＰＧＣ−１の配列はＰｕｉｇｓｅｒｖｅｒ Ｐ．ら，１９９８，Ｃｅｌｌ，９２，８２９に開示されている。１つの実施態様では、ＰＧＣ−１のＮ末端のアミノ酸１−１７０に及ぶ領域を使用する（Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，１３６８−１３７１）。別の実施態様では、ＰＧＣ−１のＮ末端のアミノ酸１−６５に及ぶ領域を使用する。別の実施態様では、ＰＧＣ−１ ＡＤのマルチマーを使用し得る。別の実施態様では、ＰＧＣ−１ ＡＤの部分のマルチマーを使用し得る。
【００４９】
別の実施態様では、転写を抑制し得るキメラ転写因子を作製する（転写リプレッサー）。この場合、転写因子は真核細胞中の転写を直接または間接に抑制するリプレッサードメインを含む。転写を活性化する代わりに抑制し得るこのようなドメインの一例は、ヒトＫｏｘ１ジンクフィンガータンパク質のＫＲＡＢリプレッサードメインである（Ｍａｒｇｏｌｉｎ Ｊ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４５０９−４５１３）。
【００５０】
真核細胞中で転写活性能を有している別のポリペプチドを本発明の転写アクチベータ中に使用できる。種々のタンパク質中に見出された転写活性ドメインを同様の構造的特徴に基づいてグループに分類した。転写活性ドメインの種類としては、酸性転写活性ドメイン、プロリン富化転写活性ドメイン、セリン／トレオニン富化転写活性ドメイン及びグルタミン富化転写活性ドメインがある。酸性転写活性ドメインの例としては、前述のＶＰ１６領域、ＧＡＬ４のアミノ酸残基７５３−８８１がある。プロリン富化活性ドメインの例としては、ＣＴＦ／ＮＦ１のアミノ酸残基３９９−４９９及びＡＰ２のアミノ酸残基３１−７６がある。セリン／トレオニン富化転写活性ドメインの例としては、ＩＴＦ１のアミノ酸残基１−４２７及びＩＴＦ２のアミノ酸残基２−４５１がある。グルタミン富化活性ドメインの例としては、Ｏｃｔ１のアミノ酸残基１７５−２６９及びＳｐ１のアミノ酸残基１３２−２４３がある。上記の各領域のアミノ酸配列及び別の有用な転写活性ドメインのアミノ酸配列は、Ｓｅｉｐｅｌ，Ｋ．ら（ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９２ １２：４９６１−４９６８）に開示されている。
【００５１】
１つのポリペプチドの転写活性能は、該ポリペプチドとＤＮＡ結合活性をもつ別のポリペプチドとを連結する段階と、融合タンパク質によって刺激される標的配列の転写量を測定する段階とを含むアッセイによって検定できる。例えば、当業界で使用される標準アッセイは、推定転写活性ドメインとＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（例えばアミノ酸残基１−９３）との融合タンパク質を利用する。次にこの融合タンパク質を使用して、ＧＡＬ４結合部位に連結されたリポーター遺伝子の発現を刺激する（例えば、Ｓｅｉｐｅｌ，Ｋら，１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４９６１−４９６８及び該文献に引用された参考文献を参照するとよい）。
【００５２】
真核細胞中の転写を直接または間接に抑制する転写リプレッサードメインは本発明に使用できる。転写を活性化する代わりに抑制し得るこのようなドメインの例は、ヒトＫｏｘ１ジンクフィンガータンパク質のＫＲＡＢリプレッサードメインである（Ｍａｒｇｏｌｉｎ Ｊ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，４５０９−４５１３）。このドメインを単一ドメインとしてまたはマルチマー形態で使用し得る。
【００５３】
真核細胞中の転写を抑制するポリペプチドは当業界で公知である。特に、多くのＤＮＡ結合タンパク質の転写抑制ドメインは、該ドメインが異種タンパク質に転移されたときにそれらの活性機能を保持していることが記載され証明されている（Ｄｅｕｓｃｈｌｅら，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，１９０７−１９１４；Ｆｒｅｕｎｄｌｉｅｂ Ｓ．ら，１９９９，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１，１）。
【００５４】
リガンド依存性調節ドメインは、特異的リガンドに結合したときにトランスアクチベータ分子またはトランスリプレッサー分子の活性を調節するトランスアクチベータまたはトランスリプレッサーのドメインである。このような調節ドメインの最もよく知られた例はステロイド受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）である。ステロイド受容体は、それらのＬＢＤを介してそれらの同系のリガンドに結合したときにのみ転写を活性化する転写因子である。
【００５５】
リガンド依存性調節ドメインの例は、Ｇ５２１Ｒ突然変異体を含むヒトエストロゲン受容体αの突然変異体である。この突然変異体はエストラジオールに対する親和性の低下を示すが、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）、タモキシフェンの代謝産物（ＴＡＭ）及びその他のいくつかの物質（例えばラロキシフェン）のような合成エストロゲンアンタゴニストに対しては高い親和性を維持している（Ｄａｎｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．ら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７：２３２−２４０；Ｆｅｉｌ Ｒ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１０８８７−１０８９０）。
【００５６】
別の例は、ヒトプロゲステロン受容体のＲＵ４８６依存性Ｃ末端欠失体である。これはプロゲステロンに結合しないで合成類似体ＲＵ４８６にだけ結合する（Ｖｅｇｅｔｏ Ｅ．ら，１９９２，Ｃｅｌｌ，６９：７０３−７１３）。
【００５７】
調節ドメインはまた、特異的リガンドの存在下でヘテロダイマー化するタンパク質ドメインを使用することによって構築できる。例えば、ＨＮＦ１ ＤＢＤをヒトタンパク質ＦＫＢＰ１２のラパマイシン結合ドメインに融合させ得る。このキメラは、ヒトの転写調節ドメインに融合した第二の薬物結合ドメイン例えばＦＲＡＰタンパク質の薬物結合ドメインとラパマイシンの存在下でダイマー化するであろう。このラパマイシン媒介ダイマーはＨＮＦ１反応性プロモーターの転写活性能を有しているであろう。
【００５８】
上記のすべての場合に、活性転写因子（即ち、ＤＮＡ結合ドメインと転写調節ドメインとの双方を含む転写因子）の濃度はリガンド濃度に比例するであろう。
【００５９】
リガンドという用語は、ステロイドに構造的に近縁でなくてもよく、キメラ転写因子の調節ドメインのリガンドとして使用できる化合物を意味する。
【００６０】
別の観点によれば、本発明のキメラ転写因子は、ＨＮＦ１ ＤＢＤと、（ｉ）リガンド依存性調節ドメインを含むポリペプチド（例えば、ステロイド、ステロイドのアゴニスト及びアンタゴニストの結合を担当するステロイド受容体またはその突然変異形態のＬＢＤ）と、（ｉｉ）真核細胞中の転写を直接または間接に活性化する転写アクチベータドメインとから成る。この観点によって提供される本発明の転写因子の活性及び結果的に得られる導入遺伝子の転写は、特異的リガンドを添加するかまたは除去することによって選択的に調節できる。
【００６１】
本発明の好ましい実施態様では、ＨＮＦ１のＤＢＤを含むリガンド依存性転写因子がタモキシフェン依存性キメラとして構築される。このキメラは、ヒトエストロゲン受容体α（Ｄａｎｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．ら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７：２３２−２４０；Ｆｅｉｌ Ｒ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１０８８７−１０８９０）の突然変異体（５２１のＧｌｙがＡｒｇに変異）に融合したＨＮＦ１のＤＮＡ結合ドメインとｐ６５活性ドメインとによって構成されている。ヒトエストロゲン受容体の突然変異体は、エストラジオールに対する結合親和性が顕著に低下しているが、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）、タモキシフェンの代謝産物（ＴＡＭ）及びその他のいくつかの物質（例えばラロキシフェン）のようなエストラジオールアンタゴニストに対する高い親和性は維持している（Ｄａｎｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．ら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７：２３２−２４０；Ｆｅｉｌ Ｒ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１０８８７−１０８９０）。
【００６２】
本発明の別の実施態様では、ＨＮＦ１ ＤＢＤを、プロゲステロンには結合せずその合成類似体ＲＵ４８６（Ｖｅｇｅｔｏ Ｅ．ら，１９９２，Ｃｅｌｌ，６９：７０３−７１３）にだけ結合するヒトプロゲステロン受容体のＣ末端欠失体にフレーム内で融合させ、次いで、転写のアクチベータまたはリプレッサードメインがフレーム内に連結されたＲＵ４８６依存性トランスアクチベータを使用する。
【００６３】
別の実施態様では、転写を抑制し得るキメラタンパク質を作製する（転写リプレッサー）。１つの実施態様では、融合タンパク質が、（ｉ）ＨＮＦ１ ＤＢＤと、（ｉｉ）（ｉ）に連結されたヒトエストロゲン受容体α（Ｄａｎｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．ら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７：２３２−２４０；Ｆｅｉｌ Ｒ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１０８８７−１０８９０）の突然変異体（５２１のＧｌｙがＡｒｇに変異）と、（ｉｉｉ）（ｉｉ）に連結されたヒトＫｏｘ１ジンクフィンガータンパク質（Ｍａｒｇｏｌｉｎ Ｊ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．ＵＳＡ，９１，４５０９−４５１３）のＫＲＡＢリプレッサードメインとを含む。
【００６４】
リガンド結合依存性転写因子の３つの必須成分、即ち、ＤＮＡ結合ドメインとリガンド依存性調節ドメインと転写調節ドメインとが本発明のトランスアクチベータ／トランスリプレッサー融合タンパク質中でいかなる順序または配列に編成されてもよいことに注目されたい。
【００６５】
別の実施態様では、ＨＮＦ１ ＤＢＤと転写調節ドメインとを個別の２つの融合タンパク質として別々に提供してもよい。この場合、これらの融合タンパク質は活性転写因子を提供するために相互作用する。例えば、哺乳類のＨＮＦ１ ＤＢＤを、ヒト転写調節ドメインに融合した別のリガンド結合ドメイン（例えばＦＲＡＰ）にリガンド（例えばラパマイシン）の存在下でダイマー化できるリガンド結合ドメイン（例えばＦＫＢＰ１２）と融合させてもよい。この場合、活性転写因子（即ち、ＤＮＡ結合ドメインと転写調節ドメインとの双方を含む転写因子）の濃度はリガンドの濃度に比例するであろう。
【００６６】
別の実施態様では、ＤＢＤと調節ドメインとから成る融合タンパク質と相互作用する転写活性化タンパク質の補充による間接メカニズムによって転写を活性化する。これは例えば、宿主細胞中に存在する内在性アクチベータのような転写アクチベータタンパク質とのタンパク質−タンパク質相互作用を媒介するポリペプチドドメイン（例えばダイマー化ドメイン）によって行われてもよい。適当な相互作用（またはダイマー化）ドメインの例としては、ロイシンジッパー（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６８１−１６８８）、ヘリックス・ループ・ヘリックスドメイン（Ｍｕｒｒｅ，Ｃ．ら，（１９８９）Ｃｅｌｌ ５８：５３７−５４４）及びジンクフィンガードメイン（Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．ら，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：７０−７３）がある。
【００６７】
本発明の転写因子（これは単一融合タンパク質でもよい）はまた、細胞核への輸送を促進する第四のポリペプチド成分例えば核局在化シグナル（ＮＬＳ）のような１つまたは複数の他のポリペプチド成分を含み得る。核局在化シグナルは典型的には、塩基性アミノ酸の連鎖から構成されている。異種タンパク質（例えば本発明の融合タンパク質）に付着したとき、核局在化シグナルは細胞核へのタンパク質の輸送を促進する。核局在化シグナルは異種タンパク質に付着するとタンパク質表面に露出し、タンパク質の機能を妨害することはない。好ましくは、ＮＬＳがタンパク質の一端例えばＮ末端に付着する。本発明の融合タンパク質に含ませることができるＮＬＳの非限定例のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏである。好ましくは、核局在化シグナルをコードしている核酸を標準組換えＤＮＡ技術によって、融合タンパク質をコードしている核酸にフレーム内に（例えば５′端に）スプライスする。
【００６８】
本発明のＤＢＤを含有している転写因子は、ＨＮＦ１反応性プロモーターによってコントロールされる配列の転写を特異的に活性化（または抑制）する。ＨＮＦ１ ＤＢＤを含有する融合タンパク質は、内在性ＨＮＦ１を発現しない組織中で、選択されたＨＮＦ１ ＤＮＡ結合部位に連結された任意の標的遺伝子の転写レベルを調節するために有用である。
【００６９】
ＨＮＦ１依存性プロモーターは単一のまたは多数のＨＮＦ１結合部位を含み得る。
【００７０】
本発明の実施態様に使用するためには、ＨＮＦ１依存性プロモーターが少なくとも１つのＨＮＦ１結合部位と１つまたは複数の異なる転写因子に対する１つまたは複数の結合部位とを含むであろう。
【００７１】
好ましい実施態様では、１つまたは多数のＨＮＦ１結合部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１結合部位）を含む人工のＨＮＦ１依存性プロモーターから転写を活性化するためにＨＮＦ１に基づくアクチベータを使用する。
【００７２】
別の好ましい実施態様では、１つまたは複数の天然または人工的に導入されたＨＮＦ１結合部位を同時に含む本質的に活性なプロモーターからの転写を抑制するためにＨＮＦ１に基づくリプレッサーを使用する。これらのプロモーターは、ＨＮＦ１転写因子の非存在下で本質的に活性であるが、ＨＮＦ１に基づくリプレッサーによって特異的に抑制される。
【００７３】
本発明は、遺伝子発現のオンとオフとの切替えが可能であることまたは遺伝子発現のレベル調節が可能であることが望まれる様々な場合に広く適用し得る。唯一の前提要件は、標的細胞または組織が内在性ＨＮＦ１に基づく活性転写因子を含有しないことである。
【００７４】
本発明は、遺伝子治療の目的に、例えば、遺伝性または後天性疾患の治療、特に、長期治療が必要でトランスアクチベータに対する免疫応答を回避することが好ましい症例の治療（例えば遺伝的慢性疾患の治療）に好ましく使用される。
【００７５】
遺伝子治療を目的とする本発明の系に使用するためには、遺伝子治療を必要とする患者の細胞が、（１）ＨＮＦ１に基づくトランスアクチベータまたはトランスリプレッサーをコードしており宿主細胞中の発現に適した形態を有する核酸と、（２）ＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１依存性プロモーターに作動的に連結された有益な配列（例えば治療目的に有益な配列）とを含有するように修飾される。
【００７６】
ＨＮＦ１に基づくリガンド依存性アクチベータを使用する場合、患者の細胞中で生じる有益な配列の発現は、適切なリガンド／誘発物質を患者に投与することによって刺激される。患者の細胞中で有益な遺伝子の発現を停止させるためには、誘発物質の投与を停止する。
【００７７】
ＨＮＦ１に基づくリガンド依存性リプレッサーを使用する場合、患者の細胞中の有益な配列の発現はリプレッサーの存在下で抑制され、次いでリプレッサーの除去によって刺激される。患者の細胞中の有益な遺伝子の発現を停止させるためにはリプレッサーを再投与する。
【００７８】
双方の場合に、遺伝子発現のレベルは、患者に投与するリガンドの用量を調節することによって調節できる。従って、宿主細胞中で、ＨＮＦ１依存性プロモーターに作動的に連結された配列の転写は、宿主細胞に接触している誘発リガンド（例えばＴＡＭ、４−ＯＨＴまたはその他のステロイド及びそれらの類似体）の濃度を変化させることによって（例えば、リガンドを培養培地に添加する、または、リガンドを宿主生物に投与する、などによって）コントロールし得る。
【００７９】
ｉｎ ｖｉｖｏ転写を誘発または抑制するためには、リガンドを身体または対象組織に（例えば注射によって）投与するとよい。治療すべき身体は、動物、特に、ヒトまたはヒト以外の哺乳類、例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスもしくはその他の齧歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシもしくはウマでもよく、または、ニワトリのような鳥類でもよい。適当な投与経路は、経口、腹腔内、筋肉内、静注（ｉ．ｖ．）である。
【００８０】
上述のように本発明では、ヒト起原のＨＮＦ１ ＤＢＤを使用でき、従って完全にヒト化されたトランスアクチベータの構築が可能であるため、他の入手可能な調節系に比べて免疫原性の危険が最も少ないという利点をもつ調節系の構築が提案される。
【００８１】
既出の幾つかの文節に概略的に記載した遺伝子治療の用途以外にも、本発明のＨＮＦ１ ＤＢＤを組込んだリガンド依存性転写因子は以下の目的に使用できる。
１．細胞中で自殺遺伝子を条件的に発現させ、これによって、所期の機能を遂行した後の細胞を除去する。例えば、ワクチン接種に使用した細胞は、患者の免疫応答が生じた後に、特異的リガンドによって細胞中で自殺遺伝子の発現を誘発することによって患者の体内から除去できる。
２．組換えウイルスベクターに含有されており、産生プロセス中にパッケージング細胞系中のウイルスの増殖を妨害し得る遺伝子の発現を調節する。これらの組換えウイルスはアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ関連ウイルス、及び、当業者に自明のよく知られた他のウイルスの誘導体でもよい。
３．本発明のＤＢＤを含むトランスアクチベータを該トランスアクチベータの細胞内発現に適した形態でコードしている内在性ＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１非含有の核酸と、ＨＮＦ１依存性プロモーターに作動的に連結された有益なタンパク質をコードする遺伝子と、を含有するように修飾されたｉｎ ｖｉｔｒｏの培養細胞を使用して有益な毒性タンパク質を大規模生産する。
【００８２】
本発明によるポリペプチドまたは融合タンパク質を産生するための簡便な方法は、該ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードしている核酸を発現系中の核酸の使用によって発現させる方法である。
従って多様な観点によれば本発明はまた、本発明の転写アクチベータまたはリプレッサーをコードする核酸を提供する。このような核酸はコードされたタンパク質を産生するために使用され得る。
【００８３】
本発明のタンパク質をコードしているかまたはその成分をコードしているかに関わりなく、一般的に核酸は単離物として単離物及び／または精製物で提供されるか、または、場合によっては１つまたは複数の発現調節配列を含有する以外は、核酸が天然に会合する材料を含有しないかもしくは実質的に含有しない形態、例えば、ヒトゲノム中で遺伝子にフランキング（隣接）する核酸を含有しないかもしくは実質的に含有しない形態で提供される。核酸は完全合成または部分合成でよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡなどである。本発明の核酸がＲＮＡである場合、示した配列に関する記載は、ＵによってＴが置換されたＲＮＡ等価物を包含すると理解されたい。
【００８４】
本発明によるポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配列は、利用可能な核酸の配列及びクローンが与えられれば、本文中に含まれている情報及び参考文献と当業界で公知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，（１９９４）参照）とを使用して当業者が容易に作製し得る。これらの技術としては、（ｉ）例えばゲノムソースから得られたこのような核酸のサンプルを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成、または、（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の作製、がある。当業者に公知の任意の適当な方法で全長配列の部分をコードするＤＮＡ（場合により例えばＤＮＡ結合ドメインまたは調節ドメイン）を作製し、使用し得る。例えば、コードしているＤＮＡを採取し、発現されるべき部分の両側の適当な制限酵素認識部位を同定し、該部分をＤＮＡから切り離す、などの段階を使用する。次に該部分を市販の標準発現系中で適当なプロモーターに作動可能に連結し得る。別の組換え方法では、ＤＮＡの適切な部分を適当なＰＣＲプライマーで増幅させる。修飾ペプチドを発現させるため、または、核酸の発現に使用した宿主細胞中のコドン選択性に対処するために、例えば部位特異的突然変異誘発を使用して適切な配列を修飾してもよい。
【００８５】
核酸配列の発現を得るために、核酸配列の発現を制御すべく核酸に作動可能に連結された１つまたは複数の制御配列を有しているベクターに核酸配列を組込んでもよい。ベクターは別の配列、例えば、挿入された核酸の発現を励起するプロモーターまたはエンハンサーを含んでもよく、ポリペプチドまたはペプチドを融合物として産生させる核酸配列を含んでもよく、及び／または、宿主細胞中で産生されたポリペプチドが細胞から分泌されるように分泌シグナルをコードする核酸を含んでもよい。次いで、ベクターを機能性に維持する宿主細胞をベクターで形質転換させ、ポリペプチドが産生されるように宿主細胞を培養し、宿主細胞または周囲培地からポリペプチドを回収することによってポリペプチドが得られる。当業界ではこのために、原核細胞及び真核細胞、例えば、大腸菌の複数の菌株、酵母、及び、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞のような真核細胞を使用する。
【００８６】
従って本発明はまた、開示したようなポリペプチドまたは融合タンパク質の製造方法を包含する。該方法は、産生物をコードする核酸（通常は本発明の核酸）の発現段階を含む。この発現は、このようなベクターを含む培養宿主細胞をポリペプチドの発現が惹起または許容される適正条件下で増殖させることによって簡便に行うことができる。また、網状赤血球溶解液のようなｉｎ ｖｉｔｒｏの系でポリペプチドを発現させてもよい。
【００８７】
異なる多様な宿主細胞中でポリペプチドをクローニングし発現させる系は公知である。適当な宿主細胞としては、細菌、哺乳類及び酵母のような真核細胞並びにバキュロウイルス系がある。異種ポリペプチドを発現させるために当業界で利用可能な哺乳類細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＣＯＳ細胞及びその他の多くの細胞がある。常用の好ましい細菌宿主は大腸菌である。
【００８８】
プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子のような適当な調節配列及び適宜にその他の配列を含む適当なベクターを選択または構築できる。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス例えば“ファージ”またはファージミドが適宜使用され得る。詳細に関しては例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照するとよい。例えば核酸構築物の産生、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞内導入及び遺伝子発現のような核酸操作並びにタンパク質の分析に関する多くの公知技術及びプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。
【００８９】
哺乳類細胞中で使用される組換え発現ベクターのコントロール機能がウイルス性遺伝材料によって提供されてもよい。代表的なプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２型、サイトメガロウイルス及びＳＶ４０に由来のプロモーターである。
【００９０】
本発明に使用される組換え発現ベクターの調節配列が、ポリペプチドまたは融合タンパク質を特定種類の細胞中で優先的に直接発現させてもよい。即ち、組織特異的調節要素を使用し得る。１つの実施態様では、本発明の組換え発現ベクターがプラスミドである。あるいは、本発明の組換え発現ベクターは、ウイルス核酸に導入された核酸を発現させ得るウイルスまたはその一部分でもよい。例えば、複製欠陥のあるレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスを使用できる。組換えレトロウイルスを作製しこのようなウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの細胞に感染させるプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌらの著作（前出）に見出される。アデノウイルスのようなウイルスのゲノムは、該ゲノムがトランスアクチベータまたはリプレッサータンパク質をコードし発現するが溶菌性ウイルスの正常な生活サイクルでは複製能力が不活性化されるように操作され得る。
【００９１】
従って、別の観点によれば本発明は、本文中に開示したような異種核酸を含有している宿主細胞を提供する。
【００９２】
宿主細胞は例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）、酵母細胞、菌類細胞または昆虫細胞でよい。更に、宿主細胞はヒト以外の受胎卵母細胞でもよい。この場合、宿主細胞は、転写阻害性融合タンパク質を発現する細胞を有しているトランスジェニック生物を創製するために使用できる。更に、組換え発現ベクターは、トランスアクチベータまたはリプレッサーをコードする核酸と宿主細胞中の標的遺伝子との間の相同的組換えを許容するように設計できる。このような相同的組換えベクターは、本発明の融合タンパク質を発現する相同的組換え動物を創製するために使用できる。
【００９３】
本発明の核酸が宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に組込まれてもよい。標準技術に従って組換えを促進する配列をゲノムと共に混在させることによって組込みを促進し得る。核酸は、細胞内部の染色体外ベクターに存在してもよくまたは細胞に対して異種または異種であることが確認された核酸であってもよい。
【００９４】
使用し得る哺乳類細胞系の例は、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０）、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら（１９９７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：ｐｐ５９）及びＳＰ２またはＮＳ０のような骨髄腫細胞（Ｇａｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（Ｂ）：３−４６）である。細胞系に加えて、本発明は、遺伝子治療の目的で修飾される細胞またはトランスジェニック動物もしくは相同的組換え動物を創製するために修飾された胚細胞のような正常細胞に適用し得る。遺伝子治療の目的に特に有益な種類の細胞の例は、造血幹細胞、筋芽細胞、肝細胞、リンパ球、筋肉細胞、ニューロン細胞並びに皮膚上皮細胞及び気道上皮細胞である。更に、トランスジェニック動物または相同的組換え動物の場合には、胚幹細胞及び受胎卵母細胞を、トランスアクチベータまたはリプレッサー融合タンパク質をコードする核酸を含有するように修飾できる。
【００９５】
トランスアクチベータまたはリプレッサー融合タンパク質をコードする核酸をヒト以外の動物の受胎卵母細胞に移入して、１つまたは複数の種類の細胞中で本発明の融合タンパク質を発現するトランスジェニック動物を作製できる。
【００９６】
更に別の観点によれば本発明は、本発明の転写アクチベータまたはリプレッサータンパク質を発現する細胞を含有するヒト以外の動物も含めたトランスジェニック生物を提供する（即ち、トランスアクチベータまたはリプレッサーをコードする核酸がトランスジェニック生物の細胞の１つまたは複数の染色体に取り込まれている）。
【００９７】
また別の観点によれば本発明は、核酸を宿主細胞に導入する段階を含む方法を提供する。（特にｉｎ ｖｉｖｏ導入の場合には）限定なしで普遍的に“形質転換”と呼ぶことができる該導入のために利用可能ないかなる技術も使用し得る。真核細胞の場合、適当な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクションがあり、また、レトロウイルスまたはその他のウイルス例えばワクシニアウイルスを使用するかまたは昆虫細胞に対してはバキュロウイルスを使用する形質導入がある。細菌細胞の場合、適当な技術としては、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔及びバクテリオファージを使用するトランスフェクションがある。代替技術として、核酸の直接注入も使用できる。
【００９８】
有益な核酸を含有するクローンを同定するためには、当業界で公知のように、抗生物質抵抗性遺伝子または抗生物質感受性遺伝子などのマーカー遺伝子を使用し得る。
【００９９】
導入後、例えば遺伝子が発現する条件下で宿主細胞（宿主細胞は実際に形質転換された細胞自体でもよいが、形質転換された細胞の後代が使用される場合が多い）を培養することによって核酸からの発現を惹起または許容し、その結果として、コードされた産物を産生させる。ポリペプチドが適当なシグナルリーダーペプチドに結合された状態で発現されるならば、該ポリペプチドは細胞から培養培地に分泌され得る。発現による産生の後で、ポリペプチドを場合に応じて宿主細胞及び／または培養培地から単離及び／または精製し、その後に所望の用途に使用し得る。例えば、１種または複数の医薬として許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体を含む医薬組成物のような１種または複数の追加成分を含有し得る組成物の製剤化に使用し得る（後記参照）。
【０１００】
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、遺伝子治療によって生体内に導入され得る。１つの方法では、核酸を生体外で細胞に導入し、次いでこれらの細胞を移植またはその他の方法で個体に投与する。このような細胞が個体から採取され、本発明の核酸によって処理した後で該個体に戻されてもよい。
【０１０１】
従って、本発明の核酸を含む宿主細胞は、例えば核酸を細胞もしくはその祖先細胞に導入した結果として及び／または細胞もしくはその祖先細胞に内在性の配列の遺伝的変異の結果として（このような導入または変異は生体内または生体外で生じ得る）、生物の体内（例えば細胞体）に含まれる。生物としては、動物、特にヒトまたはヒト以外の哺乳類、例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスもしくはその他の齧歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはウマ、または、ニワトリのような鳥類がある。別の観点によれば本発明はまた、このような細胞を含む遺伝的に修飾された動物及び鳥類またはトランスジェニックな動物及び鳥類を提供する。
【０１０２】
本発明の転写アクチベータまたは転写リプレッサー（例えばコーディング核酸で宿主細胞を形質転換させることによって得られた融合タンパク質）を含有する宿主細胞は更に、（例えば形質転換の結果として）転写アクチベータの標的として機能する１つまたは複数の核酸を含有し得る。標的核酸は、転写されるべきヌクレオチド配列から成り、少なくとも１つのオペレーター配列に作動的に連結されている。
【０１０３】
本発明による転写アクチベータまたはリプレッサーは、転写アクチベータまたはリプレッサーが結合する調節配列に作動的にまたは作動可能に連結されている標的ヌクレオチド配列の転写を調節するために使用し得る。転写されるべきヌクレオチド配列は典型的には、それ自体は転写されないが転写機構を転写用に位置決めする機能を（少なくとも部分的に）果たす最小プロモーター配列を含む。最小プロモーター配列は、転写された配列の上流に局在し、隣接ヌクレオチド配列を形成する。このような最小プロモーターの活性は、作動的に連結された調節用オペレーター配列に対する転写アクチベータまたはリプレッサーの結合に依存性である。該最小プロモーターは、（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０に記載されているように）ヒトのサイトメガロウイルスに由来し得るが、当業者は別の適当な最小プロモーターを利用することが可能であろう。
【０１０４】
標的ヌクレオチド配列は、本発明の転写アクチベータが結合する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列、例えばＨＮＦ１オペレーター配列に作動的に連結されている。該オペレーターは通常は、転写されるべき配列及び適当な場合には最小プロモーターの５′側に存在する。オペレーター配列は転写されるべきヌクレオチド配列の下流（即ち３′側）に作動的に連結されてもよい。
【０１０５】
プロモーター配列及びオペレーター配列に作動可能に連結された別の配列はポリペプチドまたはペプチドをコードする配列、アンチセンス配列またはリボザイムでよい。
【０１０６】
本発明を使用してその発現がコントロールされ得るポリペプチドは、本発明を実施する技術者の要望及び目的に従って選択されることができ、治療用タンパク質でもよくまたは細胞傷害性タンパク質でもよい。
【０１０７】
アンチセンス調節によって発現に影響を及ぼす適当な核酸を使用することによってポリペプチド発現を阻害してもよい。アンチセンス配列は本発明の転写コントロール下に配置され得る。遺伝子発現を下方調節するためにアンチセンス遺伝子または部分的遺伝子配列を使用することはいまや確立した技術である。二重鎖ＤＮＡを“逆配向”でプロモーターのコントロール下に配置し、ＤＮＡの“アンチセンス”鎖の転写によって標的遺伝子の“センス”鎖から転写された正常ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡが生じるようにする。このとき相補的アンチセンスＲＮＡ配列はｍＲＮＡに結合して二重鎖を形成し、標的遺伝子の内在性ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されることを阻止すると考えられる。これが実際の作用モードであるか否かは未確認である。しかしながら、この技術が有用であることは確認された。
【０１０８】
別の可能性は、転写によってリボザイムを産生するように核酸を使用できること、また、特定部位で核酸を切断でき、従って、遺伝子発現を操作するために使用できることである。リボザイムに関する従来文献は、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ａｎｄ Ｓｃａｎｌｏｎ（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２，（３）２１３−２２３及びＭｅｒｃｏｌａ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２，（１）４７−５９である。
【０１０９】
本発明の転写ユニットを組換えベクター（例えばプラスミドまたはウイルスベクター）に組込んでもよく、場合によっては、開示された転写アクチベータまたはそのコーディング核酸と共に、宿主細胞または動物に導入し得る。
【０１１０】
別の観点によれば、本発明は、
（ｉ）開示された転写アクチベータまたは開示された転写アクチベータをコードする第一核酸と、
（ｉｉ）転写されるべきヌクレオチド配列から成り転写ユニットに作動的に連結された第二核酸と、
を含む組成物を提供する。
【０１１１】
第一核酸と第二核酸との双方が含まれる１つの実施態様においては第一及び第二の核酸が別々の分子（例えば２つの異なるベクター）である。この場合、宿主細胞に２つの核酸分子を同時にトランスフェクトするか、または、先ず一方の核酸分子、次いで他方の核酸分子という順序で順次トランスフェクトする。更に、ＤＢＤ成分とリガンド結合成分とから成る融合タンパク質を含む転写アクチベータの成分と、トランスアクチベータまたはトランスリプレッサーを生じるために融合タンパク質と相互作用する転写活性化用または抑制用の別のポリペプチドとを別々の分子として提供してもよい。別の実施態様では、複数の核酸を同一分子（例えば単一ベクター）中に連結（例えば、同一直線上に（ｃｏｌｉｎｅａｒ）に連結）する。この場合、宿主細胞に単一核酸分子をトランスフェクトし得る。
【０１１２】
本発明は更に、（ｉ）本発明の転写因子またはこのような融合タンパク質をコードする核酸と、及び／または、（ｉｉ）開示されたような転写ユニットと、から成る薬剤を患者に投与することから成る治療方法を提供する。本発明は更に、個体に投与する医薬を製造するためのこのような成分（ｉ）及び（ｉｉ）の使用を提案する。
【０１１３】
本発明の転写アクチベータまたはリプレッサーは、転写されるべき配列に作動可能に連結されたオペレーター配列を介して配列の転写を調節するために使用され得る。本文中で検討したように、このオペレーター／転写配列構築物を宿主細胞に導入し得る。代替方法では、転写されるべき配列が宿主細胞に内在性でもよい。内在性配列は相同的組換えを介して適正な転写ユニットに作動的に連結され得る。例えば、少なくとも１つのＨＮＦ１オペレーター配列と最小プロモーター配列とを含む相同的組換えベクターを調製し得る。内在性遺伝子の実際のプロモーター領域を除去することによって、最小プロモーターの３′端に内在性遺伝子のコーディング領域を表す配列がフランキング（隣接）し、５′端に内在性遺伝子の上流領域の配列がフランキングしている。これらのフランキング配列は、ベクターＤＮＡと内在性遺伝子との相同的組換えが行われるように十分な長さを有している。好ましくは、フランキングＤＮＡの数キロ塩基が相同的組換えベクターに含まれている。ベクターＤＮＡと宿主細胞の内在性遺伝子との間の相同的組換えが生じる際に、内在性プロモーターの領域が、最小プロモーターに作動可能に連結された１つまたは複数のＨＮＦ１オペレーター配列を含有するベクターＤＮＡによって置換される。従って、内在性遺伝子の発現は、もはやそれ自体の内在性プロモーターの制御をはなれ、本発明の転写ユニットに制御される。
【０１１４】
別の実施態様では、オペレーター配列を内在性遺伝子の内部の別の場所、好ましくは５′または３′の調節領域に相同的組換えを介して挿入し、本文中に記載された転写アクチベータまたはリプレッサーによってその発現を調節できる内在性遺伝子を作製してもよい。例えば、１つまたは複数のＨＮＦ１結合配列を内在性遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー領域に、プロモーターまたはエンハンサー機能が維持されるように挿入することができる。
【０１１５】
“ＨＮＦ１結合部位”または“ＨＮＦ１結合配列”という用語は、ＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１トランスアクチベータによって結合される天然または人工のＤＮＡ配列を意味する（Ｔｒｏｎｃｈｅ Ｆ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６６，２３１−２４５）。転写されるべきヌクレオチド配列は、別の転写因子との結合部位と混在するかまたは混在しない単一または多数のＨＮＦ／ｖＨＮＦ１結合部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のＨＮＦ／ｖＨＮＦ１結合部位）から構成され得るＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１依存性プロモーターに作動的に連結され得る。
【０１１６】
少なくとも１つのＨＮＦ１結合部位が少なくとも１つの別の転写因子結合部位に連結されたキメラプロモーターを使用できる。
【０１１７】
個体に投与されるべき本発明の組成物は、場合に応じて“予防有効量”または“治療有効量”で投与されるのが好ましい。予防も治療方法であると考えてよい。有効量は、個体に対して有効性を示すために十分な量である。実際の投与量、速度及び時間に関する投与クールは治療される疾患の特性及び重篤度に従属するであろう。治療の処方、例えば投薬に関する決定などは、一般開業医及びその他の臨床医の職務である。組成物は単独で投与されてもよく、または、治療される病態次第では、別の治療薬と同時的または順次的に併用投与されてもよい。
【０１１８】
本発明に従って製造される医薬組成物及び本発明に従って使用される医薬組成物は、有効成分に加えて、医薬として許容される賦形剤、担体、バッファ、安定剤または当業者に公知のその他の材料を含有し得る。このような材料は、無毒性でなければならない。また、有効成分の有効性を妨害してはならない。担体またはその他の材料の詳細な特性は投与経路に従属する。投与経路は、経口投与でもよく、または、皮内注射、皮下注射もしくは静注のような注射による投与でもよい。
【０１１９】
経口投与される医薬組成物は錠剤、カプセル、粉末または液体の形態でよい。錠剤はゼラチンまたアジュバントのような固体担体を含み得る。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物油、植物油、鉱油または合成油のような液体担体を含んでいる。生理的塩類溶液、デキストロースもしくはその他の糖類溶液、または、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのようなグリコール類が含まれてもよい。
【０１２０】
静注、皮内注射もしくは皮下注射で使用するためまたは罹患部位に注入するためには、有効成分が、発熱源非含有で適正なｐＨ、等張性及び安定性を有している非経口的に許容される水溶液の形態であろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸化リンゲル注射液のような等張性ビヒクルを使用して適当な溶液を調製することができるであろう。必要に応じて保存剤、安定剤、バッファ、抗酸化剤及び／またはその他の添加剤も含有させ得る。
【０１２１】
リポソーム、特にカチオン性リポソームを担体配合物に使用してもよい。
【０１２２】
上述の技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に見出すことができる。
【０１２３】
薬物は、腫瘍部位もしくはその他の所望の部位に局在的に投与されてもよく、または、薬剤が腫瘍もしくはその他の細胞を標的とするように送達されてもよい。
【０１２４】
ターゲッティング療法は抗体または細胞特異的リガンドのようなターゲッティング系の使用によって有効薬物をある種の細胞にいっそう特異的に送達するために使用され得る。ターゲッティングは様々な理由で望ましい。例えば、薬物が許容できないほど毒性が強い、他の療法では投薬量が多くなり過ぎる、または、他の療法では標的細胞に侵入できない、などの理由がある。
【０１２５】
これらの薬物は、直接投与する代わりに、例えばウイルスベクターに入れたコーディング遺伝子を細胞に導入し、これを発現させることによって標的細胞中で直接産生させてもよい。ベクターが治療すべき特定細胞を標的とするようにしてもよく、または、ベクターが標的細胞によって多少とも選択的にスイッチオンされる調節要素を含有するようにしてもよい。
【０１２６】
組成物は単独で投与されてもよく、または、癌、ウイルス感染のような治療すべき病態次第でもしくは融合タンパク質の活性によって媒介される効果が望まれる別の病態次第で別の治療と併用して同時的または順次的に投与されてもよい。
【０１２７】
転写アクチベータまたはリプレッサーをコードしている本発明の核酸は遺伝子治療の方法に、例えば、障害の予防もしくは（全面的または部分的な）治癒を目的としてまたは本文中の他の箇所で検討するような別の目的をもって個体の治療に使用され得る。
【０１２８】
ウイルスベクターのようなベクターは多様な異なる標的細胞の核酸を導入するために従来技術で使用されてきた。典型的には、ベクターを標的細胞に接触させ、細胞が所望のポリペプチドの発現によって有効な治療効果または予防効果を与えるように十分な割合の細胞にトランスフェクションを生じさせる。トランスフェクトされた核酸が標的となった各細胞のゲノムに永久的に取込まれ、長期間持続効果を与えるようにしてもよく、そうでないときは治療が周期的に必要になるであろう。
【０１２９】
ウイルスベクター及びプラスミドベクターの双方について多様なベクターが当業界で公知である。米国特許第５，２５２，４７９号及び国際特許ＷＯ９３／０７２８２参照。特に、ＳＶ４０のようなパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶ及びＥＢＶのようなヘルペスウイルス並びにレトロウイルスなどの多くのウイルスが遺伝子導入ベクターとして使用されてきた。従来技術の多くの遺伝子治療プロトコルでは無能力にしたネズミのレトロウイルスを使用していた。
【０１３０】
ウイルスベクターの使用に代替して核酸を細胞に導入するために使用できる別の公知の方法としては、電気穿孔、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクションのような機械的技術、リポソーム及び直接ＤＮＡ摂取によって媒介される導入、受容体に媒介されるＤＮＡ導入、がある。
【０１３１】
標的細胞の表面に存在する受容体に特異的なリガンドを使用しポリリシンを介して核酸をタンパク質リガンドに連結する受容体媒介遺伝子導入は、核酸を特定細胞に特異的にターゲッティングする技術の一例である。
【０１３２】
（図面の簡単な説明）
図１はエストロゲン受容体αの構造の概略図である。
【０１３３】
図２は４−ＯＨＴ依存性転写因子ＨＥＡ−１の構造の概略図である。
【０１３４】
図３は、ＨＥＡ−１の転写特性を試験するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで使用されるリポーターｍＥｐｏ１遺伝子の構造の概略図である。
【０１３５】
図４はｍＥｐｏの産生によって測定したＨＥＡ−１の４−ＯＨＴ、ＴＡＭ及びＥ２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏの反応性を表す。Ｅ２（下方の四角記号）、ＴＡＭ（三角記号）及び４−ＯＨＴ（上方の四角記号）を使用したときのｍＥｐｏ活性（ｍＵ／ｍｌ）をホルモン（ｎＭ）の関数としてプロットする。
【０１３６】
図５はマウスにＨＥＡ−１及びｍＥｐｏ−１を使用することによって得られたｉｎ ｖｉｖｏの結果を表す。白抜きの四角記号はｍＥｐｏ１／ＨＥＡ（５μｇ／１μｇ）：ｗ／ｏＴＡＭ；黒塗りの四角記号はｍＥｐｏ１／ＨＥＡ−１（５μｇ／１μｇ）：ｗ／ＴＡＭである。
【０１３７】
図６は構築物ＨＥＡ−３及びＨＥＡ−４の構造の概略図である。
【０１３８】
図７はＨＥＡ−１、ＨＥＡ−３及びＨＥＡ−４の４−ＯＨＴ及びＥ２に対する反応性を証明するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を表す。円記号：白抜き−ＨＥＡ−１（Ｅ２）、黒塗り−ＨＥＡ−１（４−ＯＨＴ）；四角記号：白抜き−ＨＥＡ−３（Ｅ２）、黒塗り−ＨＥＡ−３（４−ＯＨＴ）；三角記号：白抜き−ＨＥＡ−４（Ｅ２）、黒塗り−ＨＥＡ４（４−ＯＨＴ）。ＨＥＡ−３は最も高い活性及び誘発性を示す。
【０１３９】
図８はＨＥＡ−３を使用して調節期間を証明するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を、ヘマトクリット（％）を時間（日）の関数としてプロットしたグラフで表す。黒塗りの四角記号はｍＥｐｏ−１／ＨＥＡ−３（１μｇ／１μｇ）：ｗ／ＴＡＭ（１ｍｇ／ｋｇ）の場合である。白抜きの四角記号はｍＥｐｏ−１／ＨＥＡ−３（１μｇ／１μｇ）：ｗ／ｏＴＡＭの場合である。
【０１４０】
図９は誘導の可逆性を証明するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を表す。ｍＥｐｏ−１／ＨＥＡ−３（１μｇ／１μｇ）：ｗ／及びｗ／ｏＴＡＭ（１ｍｇ／ｋｇ）の場合のヘマトクリット（％）を時間（日）の関数としてプロットする。
【０１４１】
実験
以下の実施例はより詳細な指針を当業者に提供するものであり、本発明はこれらの実施例に全く限定されないことを理解されたい。別の観点及び実施態様が当業者に明らかになるであろう。
【０１４２】
実施例１
ＨＥＡ−１の構築
ＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１のＤＢＤを含むリガンド依存性転写因子を作製する可能性の一例として、発明者らは、タモキシフェン依存性キメラを構築した。ＨＥＡ−１と呼ばれるこのキメラは、ヒトエストロゲン受容体α（図１）の突然変異形に融合したＨＮＦ１のＤＮＡ結合ドメインとｐ６５ ＡＤとから構成されている。ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）の突然変異形はＧ５２１Ｒ突然変異体を含んでいる。これは、野生型ＥＲに比べてエストラジオール（Ｅ２）親和性が少なくとも１，０００分の１に低下しているが、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）、タモキシフェンの代謝産物（ＴＡＭ）及びその他の幾つかの誘導体（例えばラロキシフェン）のような合成誘導体には効率的に結合する。発明者らは、このトランスアクチベータがＨＮＦ１依存性プロモーターの下流にクローニングされた遺伝子の転写をリガンド依存的に活性化する能力をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで試験した。ｉｎ ｖｉｖｏ実験は、プラスミドＤＮＡをマウス筋肉に電気注入することによって行った。トランスアクチベータのリーク性（例えば、リガンド非依存性転写活性）及びその誘発性の程度も評価した。
【０１４３】
ＨＥＡ−１は、ヒトＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメイン、ヒトＥＲαの突然変異ＬＢＤ、ヒトｐ６５タンパク質のＡＤをそれぞれコードする核酸を標準クローニング技術（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に従ってフレーム内に融合させることによって得られた。このキメラタンパク質はそのＮ末端からＣ末端に向かって、以下の諸要素、即ち、ヒトＨＮＦ−１のＤＢＤ（アミノ酸１−２８２，［Ｆｒａｉｎ Ｍ．１９９０，Ｃｅｌｌ，５９，１４５−１５７；Ｎｉｃｏｓｉａ Ａ．ら，１９９０，Ｃｅｌｌ，１２２５−１２３６］）、２つのアミノ酸（Ｄ−Ｉ，アスパラギン酸塩−イソロイシン）から成るリンカー、ヒトエストロゲン受容体のアミノ酸３０３−５９５に及びＧ５２１Ｒ突然変異体を含むヒトエストロゲン受容体のＨＢＤ（Ｄａｎｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．ら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７：２３２−２４０；Ｆｅｉｌ Ｒ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３；１０８８７−１０８９０）、及び、ヒトＮＦ−κＢ ｐ６５タンパク質のアミノ酸２８３−５５１に及ぶｐ６５活性ドメイン（Ｂｕｒｃｉｎら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，３５５−３６０；Ａｂｒｕｚｚｅｓｅら，１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１４９９−１５０７）から構成されている。全タンパク質をコードするｃＤＮＡをＣＭＶエンハンサー／プロモーター要素及びイントロンＡ配列の下流でプラスミドｐｖｉＪｎｓＡにクローニングし（Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙ Ｄ．ら，１９９３，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２，７７７−７８３）、発現ベクターｐＣＭＶ／ＨＥＡ−１を作製した。
【０１４４】
プラスミドｐＣＭＶ／ＨＥＡ−１は以下の手順で構築した。ＰＣＲ反応の鋳型となるプラスミドＨＡ（Ｙａｎｉｖ Ｍ．１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．，ｖｏｌ １２，ｎｏ．１１）上の適当なプライマーを使用し、ヒトＨＮＦ−１のＤＢＤ（アミノ酸１−２８２）をコードする核酸をＰＣＲフラグメントとして作製した。得られたフラグメントの５′及び３′を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＶのそれぞれによって消化した。消化したフラグメントをＣＭＶエンハンサー／プロモーター要素及びイントロンＡ配列の下流で、制限酵素ＢｇｌＩＩ（５′）及びＥｃｏＲＶ（３′）で消化したプラスミドｐＶｉＪｎｓＡにクローニングした（Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙ Ｄ．ら，１９９３，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２，７７７−７８３）。Ｇ５２１Ｒ ＥＲ−ＨＢＤ（Ｇ５２１Ｒ突然変異体を含むヒトエストロゲン受容体の３０３−５９５領域）をＨＮＦ−１ ＤＢＤのＥｃｏＲＶ部位の処でフレーム内にクローニングした。特に、ヒトＥＲ−ＨＢＤがプラスミドｐｈＥＲａｌｐｈａ（ＬＢＤ）／ＴＧＥＭ（Ｚｈｏｕ Ｇ．ら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：１５９４−１６０４）に含まれている場合には、Ｇ５２１Ｒ ＥＲ−ＨＢＤは野生型ヒトＥＲ−ＨＢＤの部位特異的突然変異誘発によって得られた。Ｇ５２１Ｒ ＥＲ−ＨＢＤを含有しているプラスミドをＰＣＲ増幅用鋳型として適当なプライマーと共に使用して、Ｇ５２１Ｒ ＥＲ−ＨＢＤを含有しているフラグメントを作製し、５′端を制限酵素ＥｃｏＲＶ、３′端を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、（ＨＮＦ−１ ＤＢＤの３′端及びＧ５２１Ｒ ＥＲ−ＨＢＤの５′端に局在する）ＥｃｏＲＶ部位の処でＨＮＦ−１ ＤＢＤとフレーム内にクローニングした。最後に、翻訳終結コドンを含むｐ６５活性ドメインをプラスミドｐＧＳ１１５８（Ａｂｒｕｚｚｅｓｅら，１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１４９９−１５０７）からＥｃｏＲＩフラグメントとして取出し、ＨＢＤの３′に局在するＥｃｏＲＩ部位でＧ５２１Ｒ ＨＢＤとフレーム内に導入した。
【０１４５】
ＨＮＦ１反応性プロモーターは、最小プロモーター要素の上流にクローニングされたマルチマー化ＨＮＦ１結合部位から構成されていた。この特定実施例で該プロモーターは、ラットアルブミンプロモーターに由来のＨＮＦ１結合部位の７個のタンデム反復配列とＣ反応性タンパク質の最小プロモーター要素とから構成されていた。このＨＮＦ１反応性プロモーターの構築は文献（Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９０，ＥＭＢＯ Ｊ．，９，４４６７−４４７５）に記載されている。
【０１４６】
ｍＥｐｏコーディング領域は、文献（Ｒｉｚｚｕｔｏら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６４１７−６４２２；Ｍａｉｏｎｅら，２０００，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：８５９−８６８）に記載の手順で合成オリゴヌクレオチドから組立てた。ｍＥｐｏ ｃＤＮＡをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（Ｍａｉｏｎｅら，２０００，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：８５９−８６８）のポリリンカーのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ｐｃＤＮＡ２ベクターのヌクレオチド９８３−１２４９に由来のウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化配列（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＶ Ｌｅｅｋ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をｍＥｐｏ ｃＤＮＡの３′のＸｂａＩ−ＮｏｔＩ部位にクローニングして、ポリアデニル化シグナルを形成した。このプラスミドをｐＢＳＫＳ／ｍＥｐｏ−ｐｏｌｙＡと命名した。ＨＮＦ−１反応性プロモーターをプラスミド７ｘＨＮＦ−１／ＣＲＰ−ＣＡＴ（Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９０，ＥＭＢＯ Ｊ．，９，４４６７−４４７５）から（クレノウで埋め戻した）５′−ＥｃｏＲＩ及び３′−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして切り出し、５′を（クレノウで埋め戻した）制限酵素ＳａｌＩ及び３′を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって予め消化したプラスミドｐＢＳＫＳ／ｍＥｐｏ−ｐｏｌｙＡのｍＥｐｏ遺伝子の上流にクローニングした。このプラスミドをｐＢＳ／７ｘＢ１／ｍＥｐｏ−ｐｏｌｙＡと命名した。ＨＮＦ−１反応性プロモーターとｍＥｐｏ ｃＤＮＡとｂＧＨポリアデニル化配列とを含むカセットをプラスミドｐＢＳ／７ｘＢ１／ｍＥｐｏ−ｐｏｌｙＡから（Ｔ４エキソヌクレアーゼによって粘着末端にした）５′−ＫｐｎＩ及び３′−ＮｏｔＩフラグメントとして切り出し、プラスミドｐＶｉＪ／ＰＬのＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩ部位に挿入し、このようにしてプラスミドｐＶｉＪ／７ｘＢ１／ｍＥｐｏ−ｐｏｌｙＡを作製した。これはまたプラスミドｍＥｐｏ−１とも呼ばれる。プラスミドｐＶｉＪ／ＰＬはプラスミドｐＶｉＪｎｓＡの誘導体であり（Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙ Ｄ．ら，１９９３，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２，７７７−７８３）であり、プラスミドｐＶｉＪｎｓＡ中に最初に存在したＣＭＶエンハンサー−プロモーター要素及びイントロンＡがポリリンカー配列によって置換されている。
【０１４７】
実施例２
ＨＥＡ−１活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ＨＥＡ−１活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験（図４）
エストラジオール（Ｅ２）、タモキシフェン（ＴＡＭ）または４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）で処理するかまたは非処理の内在性ＨＮＦ−１（Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９０，ＥＭＢＯ Ｊ．，９，４４６７−４４７５）を含有しないＨｅＬａ細胞中のトランスフェクションによってＨＥＡ−１を試験した。ＨｅＬａ細胞を１０％のウシ胎仔血清とグルタミン及び抗生物質を補給したダルベッコの改質イーグル培地で５％ＣＯ２中、３７℃で増殖させた。トランスフェクション実験のために、３×１０５の細胞を６０ｍｍ径の皿に播種した。２０時間後、これらの細胞を０．５μｇのＣＭＶ／ＨＥＡ−１発現ベクター及び４．５μｇのｍＥｐｏ−１リポーター遺伝子と共にコトランスフェクトした。トランスフェクションはリン酸カルシウム法（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）を使用して行った。１５時間後、細胞を洗浄し、Ｅ２またはＴＡＭまたは４−ＯＨＴを種々の濃度で培養培地に加えた。３６時間後、培養培地を収集し、培養培地に分泌されたｍＥｐｏタンパク質を、ｍＥｐｏと交差反応性のヒトＥｐｏ用の市販のＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、既知量の組換えｍＥｐｏ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を標準対照として測定した（Ｒｉｚｚｕｔｏら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６４１７−６４２２）。結果（図４）は、ＨＥＡ−１が４−ＯＨＴに顕著に感受性であり、Ｅ２による活性化は極めて弱いことを示した。従って、融合に関連してＬＢＤは予測された結合特性を保持していた。
【０１４８】
実施例３
ＨＥＡ−１活性のｉｎ ｖｉｖｏ試験
マウスの筋肉に、１μｇのＨＥＡ−１発現ベクターＣＭＶ／ＨＥＡ−１と、ＨＮＦ１結合部位の７個のタンデム反復配列の下流にクローニングされたｍＥｐｏ ｃＤＮＡ（プラスミドｍＥｐｏ−１）を含む５μｇのリポータープラスミドとを電気注入した。Ｒｉｚｚｕｔｏら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６４１７−６４２２に詳細に記載された電気注入技術を使用し、７週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスの大腿四頭筋に予め指定された量のＤＮＡを電気注入した。
【０１４９】
電気注入したマウスを１日あたり５．６ｍｇ／ＫｇのＴＡＭの経口投与によって処理したグループと非処理グループとに分けた（各グループ４匹）。Ｈｃｔレベル及び血漿ｍＥｐｏレベルを１４日後にモニターした。ＴＡＭによって活性化されたｍＥｐｏ遺伝子の転写活性化はマウス体内のＨｃｔを増加させる。
【０１５０】
結果を図５に示す。１日あたり５．６ｍｇ／ＫｇのＴＡＭの経口投与によって処理したマウスの体内でのみ顕著なＨｃｔ増加が観察された。注入したＤＮＡの量ではリーク性（即ち、ＴＡＭ非依存性Ｈｃｔ増加）は全く観察されなかった。
【０１５１】
これは、（１）ＨＮＦ−１反応性プロモーターが独占的にリガンド活性化ＨＥＡ−１転写因子によって刺激されること、及び、（２）ＮＨＦ−１反応性プロモーターがＨＮＦ−１以外の内在性転写因子によって活性化されないこと、を示す。
【０１５２】
実施例４
ＨＥＡ−３及びＨＥＡ−４の構築及びｉｎ ｖｉｖｏ試験
ＨＥＡ−１は受容体のアミノ酸３０３−５９５に及ぶＥＲ−ＨＢＤに関連したＧ５２１Ｒ突然変異体を含んでいる。ＥＲ−αのＤ領域に含まれているアミノ酸残基（図１）が付加された別の構築物を作製した。
【０１５３】
アミノ酸２８２−５９５に及ぶＥＲ−ＨＢＤに関連したＧ５２１Ｒ突然変異体を含むＨＥＡ−３、及び、アミノ酸２５２−５９５に及ぶＨＢＤ中に同じ突然変異を有しているＨＥＡ−４を構築した。これらの突然変異体をコードするｃＤＮＡは実施例１のＨＥＡ−１に関して記載した手順と同じ手順で構築した。
【０１５４】
ＨＥＡ−３のｃＤＮＡ及びＨＥＡ−４のｃＤＮＡを個別に、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター要素及びイントロンＡ配列の下流でプラスミドｐＶ１ＪｎｓＡにクローニングし、このようにして発現ベクターｐＣＭＶ／ＨＥＡ−３及びｐＣＭＶ／ＨＥＡ−４を作製した。この場合にも、ｐＣＭＶ／ＨＥＡ−１の構築（実施例１）の場合と同じ戦略を使用した。
【０１５５】
次に、ＨＥＡ−３及びＨＥＡ−４を実施例２に記載したようにＨｅＬａ細胞中でｉｎ ｖｉｔｒｏ試験した。トランスフェクトした細胞をエストラジオール（Ｅ２）及び４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）で処理したグループと非処理のグループとに分けた。図７に示す結果は、ＨＥＡ−３のほうが４−ＯＨＴに対する感受性が若干強いこと、及び、ＨＥＡ−１及びＨＥＡ−４に比べてより高い最大活性を有していることを示した。
【０１５６】
次に、ＨＥＡ−１に関して実施例３に記載した手順と全く同様の手順でＨＥＡ−３をｉｎ ｖｉｖｏ試験した。マウスの筋肉に１μｇのｐＣＭＶ／ＨＥＡ−３と１μｇのＥｐｏリポータープラスミドとを電気注入した。電気注入技術（実施例３参照）を使用し、７週齢の雌のＢａｌｃ／ｃマウスの大腿四頭筋に予め指定された量のＤＮＡ（図８参照）を電気注入した。電気注入したマウスを、１ｍｇ／ｋｇのＴＡＭを５日／週の割合で経口投与した処理グループと非処理グループとに分けた（各グループ４匹のマウス）。Ｈｃｔレベル及び血漿Ｅｐｏレベルを２週毎にモニターした。結果を図８に示す。図８の結果は、注入の１４、２８、１００、１４０及び１８０日後のマウスのＨｃｔレベル及びＥｐｏレベルの測定値を示す。注目すべきは、処理マウスが注入の２４０日後までＨｃＴレベルの顕著な増加及びｍＥｐｏレベルの有意な上昇を示したことである。これはトランスアクチベータがマウス体内で免疫原性でないことを表す。非処理のマウスではＨｃｔ増加が全く検出されなかった。
【０１５７】
次に、ＴＡＭを除去したときのＴＡＭ依存性誘発の可逆性を試験した。８匹の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢）に１μｇのｐＣＭＶ／ＨＥＡ−３及び１μｇの上述のＥｐｏリポータープラスミドを電気注入した。次にマウスをＴＡＭ（１ｍｇ／ｋｇ、経口、５日／週）によって１４日間処理した。血清Ｅｐｏ及びＨｃｔは予想通りに増加した。ＴＡＭ処理が存在しないとき、Ｈｃｔはマウス体内の既知の赤血球半減期に適合する速度で基底レベルに戻った。これらの動物に再度ＴＡＭを抗原投与すると、ヘマトクリットは高いレベルを回復した。これは、リガンドに対する反応性が経時的に維持されることを証明する。
【０１５８】
本明細書に引用した全部の文献は参照によって本文中に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
エストロゲン受容体αの構造の概略図である。
【図２】
４−ＯＨＴ依存性転写因子ＨＥＡ−１の構造の概略図である。
【図３】
ＨＥＡ−１の転写特性を試験するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで使用されるリポーターｍＥｐｏ１遺伝子の構造の概略図である。
【図４】
ｍＥｐｏの産生によって測定したＨＥＡ−１の４−ＯＨＴ、ＴＡＭ及びＥ２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏの反応性を表す。
【図５】
マウスにＨＥＡ−１及びｍＥｐｏ−１を使用することによって得られたｉｎ ｖｉｖｏの結果を表す。
【図６】
構築物ＨＥＡ−３及びＨＥＡ−４の構造の概略図である。
【図７】
ＨＥＡ−１、ＨＥＡ−３及びＨＥＡ−４の４−ＯＨＴ及びＥ２に対する反応性を証明するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を表す。
【図８】
ＨＥＡ−３を使用して調節期間を証明するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を、ヘマトクリット（％）を時間（日）の関数としてプロットしたグラフで表す。
【図９】
誘導の可逆性を証明するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を表す。ｍＥｐｏ−１／ＨＥＡ−３（１μｇ／１μｇ）：ｗ／及びｗ／ｏＴＡＭ（１ｍｇ／ｋｇ）の場合のヘマトクリット（％）を時間（日）の関数としてプロットする。
本発明は組織に送達された導入遺伝子（トランスジーン）を制御するために有用な転写因子に関する。より特定的には本発明は、免疫原性の低いキメラ転写因子を作製するためにＨＮＦ１転写因子（例えばＨＮＦ１及びｖＨＮＦ１）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を使用することに関する。このようなキメラ転写因子は内在性ＨＮＦ１またはｖＨＮＦ１を発現しない組織に導入遺伝子を送達するのに役立つ。本発明はまた、真核細胞中及び生物体内の遺伝子発現を調節するために有用な核酸分子及びタンパク質に関する。ＨＮＦ１ ＤＢＤを含有する構造的に活性なリガンド依存性トランスアクチベータ及びトランスリプレッサーが提供される。
【０００２】
本発明の調節系において、ヌクレオチド配列の転写は、選択されたＤＮＡ配列に高い選択性で結合する哺乳類のＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインと、該ＤＮＡ結合ドメインに融合しトランスアクチベータのリガンド依存性活性及びその転写活性を担当する種々のポリペプチドとから構成された転写アクチベータ融合タンパク質によって活性化される。本発明の融合タンパク質は、選択されたＨＮＦ１ ＤＮＡ結合部位に連結された任意の標的遺伝子の転写レベルを調節するために役立つ。該融合タンパク質は、筋肉、脳、膵臓及び肺のような内在性ＨＮＦ１及びｖＨＮＦ１タンパク質の欠如した組織中のＨＮＦ１反応性プロモーターによってコントロールされる遺伝子からの転写を特異的に活性化するために使用できる。本発明の融合タンパク質は、哺乳類の要素だけから構成され、これらはヒトタンパク質に由来してもよい。完全ヒトタンパク質はトランスアクチベータによる免疫認識の危険を軽減する。同様にしてリプレッサーも提供される。
【０００３】
ヒトの遺伝子治療の開発中に遭遇する重要な問題は、治療用遺伝子発現の調節である。このために幾つかの調節系が開発された。一般に、これらの系は３つの要素、即ち、（１）標的遺伝子、即ち、特定のＤＮＡ標的配列に作動的に連結されており発現調節が必要とされる遺伝子と、（２）調節タンパク質即ち標的遺伝子の活性を調節するタンパク質をコードしている遺伝子と、（３）外部から系に付加できる好ましくは低分子量の調節分子とから成り、（２）の遺伝子は一般に、調節分子に制御され調節分子と複合体化してＤＮＡ標的配列に結合し得るＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に作動的に連結された転写活性ドメイン（ＡＤ）を含む。適切な調節分子を例えば細胞培養培地に添加してもよくまたは動物の体内に導入してもよい。
【０００４】
現在まで、遺伝子発現を調節するためにほぼ常用であった４つの系は、テトラサイクリン依存性の系（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ．ら，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９）、ステロイドホルモン受容体及びプロゲステロンアンタゴニストＲＵ４８６の使用に基づくＲＵ４８６依存性の系（Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ ｏｒ Ｍｉｆｅｇｙｎｅ，Ｗａｎｇ Ｙ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：８１８０−８１８４）、エクジソン（Ｅｃ）依存性の系（Ｎｏ Ｄ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３；３３４６−３３５１）及びラパマイシン依存性の系（Ｒｉｖｅｒａ Ｖ．Ｍ．ら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，２：１０２８−１０３２）である。
【０００５】
これらの全部の系が、原核生物的またはヒト以外の要素を含み、従ってヒトまたはその他の免疫応答性宿主の体内で免疫原性になり易い。
【０００６】
Ｔｅｔ−系では、大腸菌Ｔｅｔ−リプレッサー（ＴｅｔＲ）の天然のＴｅｔに制御されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が、異種の転写活性ドメイン（ＡＤ）、通常はヘルペスウイルスＶＰ１６に融合している。従って、最小プロモーター及びＴｅｔＲ結合配列の下流にクローニングされた遺伝子の転写は、テトラサイクリンまたはその類似体例えばドキシサイクリンによって制御され得る。以前使用されていた薬物で転写を不活性化するＴｅｔ−ｏｆｆ系（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１）に代わって、薬物で転写を活性化するＴｅｔ−ｏｎ系（Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ．ら，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９）の使用が主流になっている。
【０００７】
ＥｃＢ−依存性の系の場合、ショウジョウバエＥｃ受容体の天然のＥｃ依存性ＤＢＤをＶＰ１６に結合させる。このキメラを別のステロイド受容体（ＲＸＲ）と同時発現させるとＥｃ依存性転写が得られる（Ｎｏ Ｄ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１）。
【０００８】
ヒトのプロゲステロン受容体に基づいてもっと“ヒト化した”系が作製された。ヒトプロゲステロン受容体のカルボキシ末端欠失突然変異体が同定された。この突然変異体は合成プロゲステロンアンタゴニストＲＵ４８６結合能を保持しているがプロゲステロンには結合しない（Ｗａｎｇ Ｙ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：８１８０−８１８４）。この突然変異体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＢＤ及びＶＰ１６活性ドメインに融合させた人工転写因子が構築された。このキメラはＲＵ４８６によって活性化されたがプロゲステロンによって活性化されず、ＧＡＬ−４反応性プロモーターによって制御された遺伝子からｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの転写を誘発した（Ｗａｎｇ Ｙ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：８１８０−８１８４）。この系のより新しい形態では、ＶＰ１６ ＡＤに代替してヒトｐ６５タンパク質のＡＤが使用されている（Ｂｕｒｃｉｎ Ｍ．Ｍ．ら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５５−３６０；Ａｂｒｕｚｚｅｓｅ Ｒ．Ｖ．ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１４９９−１５０７）。
【０００９】
部分的にヒト化した別の系は、ラパマイシン及びその類似体がダイマー化する特性を利用して作製された。この系では、転写因子がヘテロダイマーに基づく。１つのモノマーはヒトタンパク質ＦＫＢＰ１２に融合した非哺乳類タンパク質ＺＦＨＤ−１のＤＮＡ結合ドメインから構成されている。第二のモノマーはヒトのｐ６５タンパク質のＡＤに融合した別のヒトタンパク質ＦＲＡＰから構成されている（Ｒｉｖｅｒａ Ｖ．Ｍ．ら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，２：１０２８−１０３２；Ｒｉｖｅｒａ Ｖ．Ｍ．ら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：８６５７−８６６２）。ＦＲＡＰ及びＦＫＢＰ１２の双方がラパマイシンに結合する。従って、ラパマイシンの存在下で、ヘテロダイマー転写因子が形成され、ＺＦＨＤ−１認識部位を含有するプロモーターからラパマイシン依存性転写が行われる。
【００１０】
本発明は、真核細胞中または動物体内で遺伝子発現を調節するために使用できる核酸分子及びタンパク質に関する。本発明の系による遺伝子発現の調節には少なくとも２つの成分、即ち、調節配列に作動可能にまたは作動的に連結されており転写されかつ場合によっては（タンパク質をコードしているときは）翻訳されるべき配列と、調節配列に結合しており遺伝子転写を調節するタンパク質とが関与する。
【００１１】
本発明では、転写因子、好ましくはヒト体内で免疫原性を低下させたと考えられる“ヒト化した”転写因子を十分に産生するために肝臓に富化されたヒト転写因子ＨＮＦ１のＤＢＤを使用する。本発明の転写因子はＨＮＦ１結合部位を含むＨＮＦ１依存性プロモーターに結合すると転写を活性化するかまたは抑制する。
【００１２】
従って１つの観点によれば本発明は、ＤＮＡ結合ドメインと転写アクチベータまたは転写リプレッサードメインと場合によってはリガンド依存性ＤＮＡ結合及び／または転写因子による転写活性化もしくは転写抑制の調節ドメインとから成り、ＤＮＡ結合ドメインがＨＮＦ１ポリペプチドに由来し、転写アクチベータまたはリプレッサードメインが異なるポリペプチドに由来するような転写アクチベータまたは転写リプレッサーとして作用する転写因子を提供する。但し、転写因子が転写アクチベータドメインを含む転写アクチベータであるときは、転写因子が、アシルＨＳＬまたはその類似体に結合しアシルＨＳＬとの結合によってＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合機能を活性化する調節ドメインを含まない。
【００１３】
好ましくは、ヒトＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトの転写アクチベータまたは転写リプレッサードメイン及び場合によってはヒト調節ドメイン即ちヒトポリペプチドの適切なドメインと共に使用される。
【００１４】
リプレッサーまたはアクチベータドメインとＤＮＡ結合ドメインとが融合タンパク質の内部に設けられてもよく、該融合タンパク質が更に調節ドメインを含んでもよい。あるいは、ＤＮＡ結合ドメインと調節ドメインとが融合タンパク質の内部に設けられてもよく、該融合タンパク質が転写アクチベータまたはリプレッサードメインと会合して機能性転写因子を提供してもよい。
【００１５】
適当な調節ドメインに関して以下により詳細に検討する。本発明の幾つかの実施態様では（特に転写因子が転写アクチベータである場合には）、ＬｕｘＲ調節ドメイン及びＮ−アシル−ホモセリン−ラクトン（アシルＨＳＬ）に反応性のその他のドメインを使用しないほうがよい。従って、ＬｕｘＲ型転写因子、即ち、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ菌のＬｕｘＲタンパク質（Ｆｕｑｕａら；１９９４；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：２６９−２７５）は排除し得る。Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．らの一般的教示（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，Ｗａｌｌａｃｅ，ＪＣ．，Ｂｒｏｗｎ，ＪＰ．，１９９０；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｉｍｏｌ．１８３：１１１−１３２）及びＦｕｑｕａら（Ｆｕｑｕａら；１９９４；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：２６９−２７５；Ｆｕｑｕａ，Ｃ．ら；１９９６；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０：７２７−７５１）のより特定的な教示によれば、ＬｕｘＲ型転写因子のＬｕｘＲスーパーファミリーに属する因子は以下の特性によって定義される：
（１）Ｎ−アシルホモセリンラクトンに基づく遺伝子調節系の１つの成分となるＤＮＡ結合タンパク質である；
（２）ＬｕｘＲの推定アシルＨＳＬ結合領域に位置合せされる領域に第一の配列相同クラスターを含む；
（３）それらのカルボキシ末端の三分の一が、ＤＮＡ結合ドメイン内部に含まれているヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフとして定義された領域に第二の配列相同クラスターを含む。このヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフは、多数の転写因子中のタンパク質−ＤＮＡ主溝相互作用に関与すると推定されるプローブヘリックスであると定義されるモチーフを含有することが確認されている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．１９９３；ＥＭＢＯ Ｊ．，８：３２２１−３２２６）。配列相同性は一般に、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのＥｘＰＡＳＹパブリックサーバを使用して認識される。ＰＲＯＳＩＴＥ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１，Ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ−Ｓｅｒｖｅｔ，１２１１，Ｇｅｎｅｖｅ，４ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって定義されたＬｕｘＲファミリーのメンバーであることを定義する識別パターン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐａｔｔｅｒｎ）は以下の通りである：
［ＧＤＣ］−ｘ（２）−［ＮＳＴＡＶＹ］−ｘ（２）−［ＩＶ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ（２）−［ＬＩＶＭＦＹＷＣＴ］−ｘ−［ＬＩＶＭＦＹＷＣＲ］−ｘ（３）−［ＮＳＴ］−［ＬＩＶＭ］−ｘ（５）−［ＮＲＨＳＡ］−［ＬＩＶＭＳＴＡ］−ｘ（２）−［ＫＲ］。
【００１６】
他のＬｕｘＲ識別パターンは、Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｉｎ Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡまたはＷｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｉｓｒａｅｌの“Ｂｌｏｃｋｓ”データベースを参照して定義し得る。
【００１７】
ＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインは、適切な転写活性化または転写抑制のドメインを介して転写の活性化または抑制を行わせるために核酸分子内部、より特定的にはプロモーター領域内部のＨＮＦ１結合部位に結合し得る。
【００１８】
指定がない限り、本明細書を通じて頭字語ＨＮＦ１は、ＨＮＦ１、ｖＨＮＦ１−Ａ及びｖＨＮＦ１−Ｂのような公知形態の任意のＨＮＦ１を含意しており、“ＨＮＦ１結合部位”という用語は、公知形態の任意のＨＮＦ１に特異的に結合する任意の結合部位を意味する（参考文献は後出）。
【００１９】
天然のＨＮＦ１ポリペプチドは肝細胞中で高レベルで発現される転写因子であり、アルブミン及びα１−抗トリプシンのような幾つかの肝特異的遺伝子の転写を担当する。これらはまた、腎臓、腸、胃及び膵臓のような肝臓以外の組織中で発現される。しかしながら、ＨＮＦ１タンパク質は幾つかの細胞系及び組織中では天然に発現されない。特に、ＨＮＦ１が筋肉中で発現されないという事実は本発明の遺伝子治療の目的に関連性を有している。
【００２０】
ウイルス性または非ウイルス性のベクターの直接筋肉内注入は導入遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ送達の好ましいモードの１つである。特に、筋肉内に直接注入されるウイルス性または非ウイルス性ベクターは、（ｉ）対応する病原体による以後の攻撃を防御すべくウイルス、細菌または原生動物に由来の抗原をコードするか、（ｉｉ）対応する抗原を発現する腫瘍発生細胞による攻撃からマウスを保護すべく腫瘍特異的抗原をコードしているか、（ｉｉｉ）血流中に送達すべく分泌タンパク質をコードしている（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｅｉｄｅｎ，Ｊ．Ｍ．，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，８，３６０−３６５）。
【００２１】
ＨＮＦ１依存性プロモーターの下流にクローニングされた導入遺伝子は、内在性ＨＮＦ１の欠如した細胞に送達されたときには転写されない（Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９０，ＥＭＢＯ Ｊ．，９，４４６７−４４７５）。ＨＮＦ１は筋肉中に存在しないので、ＨＮＦ１依存性プロモーターの下流にクローニングされた導入遺伝子は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの筋肉細胞に送達されたときにはサイレントであろう。しかしながらこれまでにｉｎ ｖｉｔｒｏで得られた結果は、ＨＮＦ１をコードしている発現ベクターを筋肉に同時に送達するとこのような導入遺伝子が活性化され得ることを示した（（Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９０，ＥＭＢＯ Ｊ．，９，４４６７−４４７５）。
【００２２】
ＨＮＦ１の種々の機能性ドメインが当業界で公知である（Ｃｈｏｕａｒｄ Ｔ．ら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５８５３−５８６３；Ｎｉｃｏｓｉａ Ａ．ら，１９９０，Ｃｅｌｌ，１２２５−１２３６；Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９３，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，１９９−２０８）。
【００２３】
ＨＮＦ１（ＬＦ−Ｂ１またはＨＮＦ１αとも呼ばれる）は幾つかの遺伝子の肝細胞特異的転写の主要決定基であると考えられてきた６２８アミノ酸から成る長いＤＮＡ結合タンパク質である（Ｆｒａｉｎ Ｍ．１９９０，Ｃｅｌｌ，５９，１４５−１５７）。これらの配列に由来のコンセンサス結合部位はパリンドロームＧＧＴＴＡＡＴ（Ｎ）ＡＴＴＡＡＴＡである（Ｔｒｏｎｃｈｅ Ｆ．ら，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２６６：２３１−２４５）。この部位の二回対称性に一致してＨＮＦ１はＤＮＡにダイマーとして結合する。ＨＮＦ１の機能性ドメインは部位特異的突然変異誘発によって分析された（Ｃｈｏｕａｒｄ Ｔ．ら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５８５３−５８６３；Ｎｉｃｏｓｉａ Ａ．ら，１９９０，Ｃｅｌｌ，１２２５−１２３６；Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９３，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，１９９−２０８）。分子の転写活性に必要な残基はＣ末端部に局在しており（アミノ酸２８２−６２８）、ＤＮＡ結合活性はＮ末端の最初の２８１アミノ酸（ＤＢＤ＝１−２８１）に存在する。ＨＮＦ１のＤＮＡ結合ドメインの内部で３つの領域、即ち、領域Ａ、Ｂ及びＣが同定された（Ｎｉｃｏｓｉａ Ａ．ら，１９９０，Ｃｅｌｌ，１２２５−１２３６）。領域Ａ（アミノ酸１−３２）は、α−ヘリカル構造を介してタンパク質のダイマー化を生じさせるために必要十分な領域であることが証明された（Ｄｅ Ｆｒａｎｓｃｅｓｃｏ Ｒ．ら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１４３−１４７；Ｐａｓｔｏｒｅ Ａ．ら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１４８−１５３）。領域Ｂ（アミノ酸１００−１８４）及び領域Ｃ（アミノ酸１９８−２８１）はそれぞれＰＯＵタンパク質のＰＯＵ−Ａボックス及びＰＯＵ−ホモドメインに有限の相同性を示す。（Ｈｅｒｒ Ｗ．，１９８８，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２，１５１３−１５１６；ＲＥＦ）。ＨＮＦ１ ＤＢＤのホモドメイン様構造は、基準形（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）のホメオボックスに比べてヘリックスＩＩとヘリックスＩＩＩとの間に２１個のアミノ酸が挿入されている（Ｆｉｎｎｅｙ，Ｍ．，１９９０，Ｃｅｌｌ，６０−５−６；Ｃｅｓｋａ Ｔ．Ａ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２，１８０５−１８１０）。
【００２４】
ＨＮＦ１に対して高度な一次配列相同性を有しているタンパク質もまたクローニングされ（Ｒｅｙ−Ｃａｍｐｏｓ Ｊ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，１４４５−１４５７；Ｄｅ Ｓｉｍｏｎｅ Ｖ．ら，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，１４３５−１４４３）、変異体ＨＮＦ１（ｖＨＮＦ１）またはＬＦ−Ｂ３またはＨＮＦ１βと呼ばれている。ＨＮＦ１及びｖＨＮＦ１はそれらのＤＢＤ中のアミノ酸レベルで高度な相同性を共有している（Ａ、Ｂ及びＣ領域；Ｒｅｙ−Ｃａｍｐｏｓ Ｊ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，１４４５−１４５７；Ｆｒａｉｎ Ｍ．１９９０，Ｃｅｌｌ，５９，１４５−１５７）。ＨＮＦ１とｖＨＮＦ１との配列相同性は、ＡＤの存在が判明した配列のＣ末端部に向かって減衰している。ラット、マウス及びヒトではｖＨＮＦ１をコードする異なる２つのｃＤＮＡが選択的スプライシングによって作製され、ｖＨＮＦ１Ａ及びｖＨＮＶ１Ｂと命名された。ｖＨＮＦ１Ａは５５９アミノ酸長であり、５３３アミノ酸長であるｖＨＮＦ１Ｂには存在しない他の２６アミノ酸長のセグメントを含んでいる。この配列はＤＢＤのＢドメイン及びＣドメインに局在し、ＨＮＦ１には存在しない。本出願では、ｖＨＮＦ１ＡとｖＨＮＦ１Ｂとを集合的にｖＨＮＦ１という名称で表す。
【００２５】
ｖＨＮＦ１のＤＢＤとＨＮＦ１のＤＢＤとが高度な配列相同性を共有しているという事実に一致して、２つのタンパク質は同じＤＮＡ結合特異性を有しており、溶液中及びＤＮＡ上でヘテロダイマーを形成し得る（Ｔｒｏｎｃｈｅ Ｆ．ら，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２６６：２３１−２４５）。マウスまたはラットの発生中に、ｖＨＮＦ１の発現は系統的にＨＮＦ１の発現に先行する（Ｌａｚｚａｒｏ Ｄ．ら，１９９２，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１４，４６９−４７９；Ｃｅｒｅｇｈｉｎｉ，Ｓ．，１９９２，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１６，７８３−７９７）。これらのタンパク質は幾つかの肝特異的遺伝子の転写を担うと考えられているが、双方ともが腎臓、腸、胃及び膵臓のような肝臓以外の組織中でも発現される。ＨＮＦ１ ｍＲＮＡはまた脾臓及び精巣中で検出され、ｖＨＮＦ１ ｍＲＮＡはまた肺及び卵巣中で検出された（Ｄｅ Ｓｉｍｏｎｅ Ｖ．ら，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，１４３５−１４４３；Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄ Ｍ．，１９９１，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１３，５８９−５９９；Ｅｍｅｎｓ Ｌ．Ａ．ら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，７３００−７３０４）。
【００２６】
本発明の発明者らは、ＨＮＦ１以外の活性ドメインまたはリプレッサードメインを場合によってはリガンド依存性調節ドメインと共に含む機能性キメラ転写因子を構築するためにＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインを初めて使用した。従って本発明のトランスアクチベータは、内在性ＨＮＦ１を発現しない細胞及び組織中でＨＮＦ１反応性プロモーターの下流にクローニングされ同時に送達された導入遺伝子からの転写を特異的かつ効果的に調節するために使用できる。
【００２７】
融合タンパク質及び転写因子、本発明のアクチベータ及びリプレッサーに関して本文中で使用された“キメリック”または“キメラ”という用語は、異なる起原の成分から成る組成物、特に異なる親タンパク質成分から成る組成物を意味する。従って、ＨＮＦ１ ＤＢＤとｐ６５ ＡＤ（後記参照）とから構成された転写因子はキメリックであると考えられる。これは種間のキメラ性には全く無関係であり、実際、好ましい実施態様では本発明のキメラ転写因子がヒトタンパク質成分だけから構成されている。
【００２８】
脊椎動物の遺伝子治療に有用なベクターを開発するため、及び、ヒト以外の哺乳類細胞中の遺伝子発現をコントロールするために、ヒト起原でなく動物のＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインを使用できる。本発明はヒトＨＮＦ１ ＤＢＤに限定されることなく、更に、ヒト以外の哺乳動物種のＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１ ＤＢＤを含む任意のキメラ転写因子に関する。
【００２９】
本発明の融合タンパク質を含む転写アクチベータは天然発生ＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１タンパク質の一部分を含んでいてもよく、その例については記載した。更に、既知の天然アミノ酸配列に比べて１つまたは複数のアミノ酸残基が異なっているアミノ酸配列から成る１つまたは複数のポリペプチド成分を使用し得る。このアミノ酸配列は、特定配列の突然変異体、対立遺伝子、アイソフォーム、変異体または誘導体のいずれでもよい。本発明の転写アクチベータは、野生型ＤＢＤの代わりに、１つまたは複数のアミノ酸の１つまたは複数の付加、挿入、欠失及び置換によって１つまたは複数のアミノ酸残基が野生型アミノ酸配列とは異なっているアミノ酸配列を有しているが同じ結合特異性を維持しているＤＢＤを含んでもよい。
【００３０】
好ましくは、アミノ酸配列が適切なタンパク質のフラグメントと好ましくは少なくとも約３０％または４０％または５０％または６０％または７０％または７５％または８０％または８５％、９０％または９５％の相同性を共有している。従ってタンパク質成分は、野生型配列に対して、１、２、３、４、５個、５よりも多い数、または、１０よりも多い数のアミノ酸の変化、例えば置換を含み得る。
【００３１】
アミノ酸レベルの相同性が一般にアミノ酸の類似性または同一性によって表されることは理解されよう。類似性は“保存性変異”を許容する。即ち、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの疎水性残基によって別の残基が置換されてもよく、または、１つの極性残基によって別の残基が置換されてもよい。例えば、アルギニンによるリシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、もしくは、グルタミンによるアスパラギンの置換が許容される。
【００３２】
類似性は、当業界で標準使用されているＡｌｔｓｈｕｌら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−１０によるＴＢＬＡＳＴＮもしくはその他のＢＬＡＳＴプログラムによって，または、好ましくはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９４の一部を成す標準プログラムＢｅｓｔＦｉｔ及びＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７１１）のいずれかによって定義及び決定され得る。ＢｅｓｔＦｉｔは２つの配列間で最良の類似セグメントを最適に位置合せする。最適位置合せは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局部相同アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ（１９８１）２，ｐｐ．４８２−４８９）を使用し整合の数を最大にするギャップを挿入することによって見出される。ＧＡＰは、整合の数を最大にしギャップの数を最小にするように２つの完全配列を位置合せするＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用する。一般には、デフォールトパラメーターをギャップ発生ペナルティ＝１２及びギャップ延長ペナルティ＝４で使用する。一般には関連する配列の全長について相同性を適切な野生型アミノ酸配列に比較する。
【００３３】
配列間の類似性または相同性を定義する別の方法では緊縮性条件下での核酸のハイブリダイズ能を考慮する。より詳細に後述するように、本発明の融合タンパク質及びそのポリペプチド成分は一般に、コーディング核酸からの発現によって生じる。ハイブリダイゼーション実験にこのようなコーディング核酸を使用してもよい。
【００３４】
低緊縮性条件下でハイブリダイズさせることによって予備実験を行ってもよい。好ましい条件は、詳細な試験の対象になり得る陽性と同定された少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンを得るために十分な緊縮条件である。
【００３５】
例えばハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ（ここで“ＳＳＣ”＝０．１５Ｍの塩化ナトリウム；０．１５Ｍのクエン酸ナトリウム；ｐＨ７）、５×デンハルト試薬、０．５−１．０％のＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡフラグメント、０．０５％のピロリン酸ナトリウム及び５０％以下のホルムアルデヒド、から成るハイブリダイゼーション溶液を使用してＳａｍｂｒｏｏｋらの方法（後出）に従って行うとよい。ハイブリダイゼーションは３７−４２℃で少なくとも６時間行う。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、（１）２×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中に室温で５分間；（２）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中に室温で１５分間；（３）１×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中に３７℃で３０分−１時間；（４）１×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中に４２−６５℃で２時間のサイクルで３０分毎に溶液を交換しながら洗浄する。
【００３６】
特定された配列相同性をもつ核酸分子間のハイブリダイゼーションの遂行に必要な緊縮条件を計算するための常用の公式は、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／二重鎖中の＃ｂｐである。
【００３７】
上記公式の代表例として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミドを、ＧＣ含量４２％及び平均プローブサイズ２００塩基で使用するとき、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは相同性が１％減少する毎に１−１．５℃低下する。従って、約７５％を上回る配列同一性をもつ標的は４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用して観察されるであろう。
【００３８】
陽性クローンを少数にするまでハイブリダイゼーションの緊縮性を徐々に強化することは当業界で公知である。別の適当な条件としては、例えば、約８０−９０％の同一性をもつ配列を検出するためには０．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２、６．５％のＳＤＳ、１０％の硫酸デキストラン中、４２℃で一夜ハイブリダイゼーションし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃で最終洗浄する。約９０％を上回る同一性をもつ配列を検出するための適当な条件は０．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２、６．５％のＳＤＳ、１０％の硫酸デキストラン中、６５℃で一夜ハイブリダイゼーションし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃で最終洗浄する。
【００３９】
上記のように、本発明は、（１）ＤＮＡ中のオペレーター配列に配列特異的に結合する第一のポリペプチド成分、即ち、ＨＮＦ１ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインと、（２）真核細胞中の転写を活性または抑制する第二のポリペプチド成分とを含む転写因子を提供する。該転写因子は更に、コグネイトリガンドに結合する調節ドメインを含んでもよく、これによって調節ドメインとリガンドとが結合するとＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合機能が変化するか、及び／または、転写の活性化または抑制が活性化されるかまたは抑制される。
【００４０】
本発明の系による遺伝子発現の調節には少なくとも２つの成分、即ち、ＨＮＦ１依存性プロモーターに作動可能にまたは作動的に連結された核酸と、ＨＮＦ１のＤＮＡ結合ドメインを１つ以上含んでおり遺伝子の転写を調節するためにプロモーター配列に結合するキメラ転写因子とが関与する。
【００４１】
本発明の調節系においては、ヌクレオチド配列の転写が、少なくとも２つのポリペプチド成分、即ち、（ｉ）ＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）転写の活性化または抑制ドメインと、場合によっては（ｉｉｉ）少なくとも１つのリガンド依存性調節ドメインとを含む転写アクチベータによって活性化される。
【００４２】
本発明の１つの好ましい実施態様では、ＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトＨＮＦ１の残基１−２８２（Ｂａｃｈら（１９９０），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，８（１）：１５５−１６４（配列登録番号Ｐ２０８２３）、もしくは、これらの残基の内部に包含されたＤＮＡ結合部分を含むかまたは該残基もしくは該部分から構成されている。別の好ましい実施態様では、ＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトｖＨＮＦ１Ａの残基１−３１４もしくはこれらの残基の内部に包含されたＤＮＡ結合部分を含むかまたは該残基もしくは部分から構成されている。別の好ましい実施態様では、ＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインがｖＨＮＦ１Ｂの残基１−２８９（Ｒｅｙ−Ｃａｍｐｏｓ Ｊ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，１４４５−１４５７；Ｄｅ Ｓｉｍｏｎｅ Ｖ．ら，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，１４３５−１４４３）、もしくは、これらの残基の内部に包含されたＤＮＡ結合部分を含むかまたは該残基もしくは該部分から構成されている。
【００４３】
１つの観点によれば、本発明の転写アクチベータは、真核細胞中で転写を直接または間接に活性化する転写アクチベータドメインに融合したＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインを含み得る。本発明のこの観点によれば転写アクチベータは構造的に活性である。
【００４４】
あるいは、本発明の転写因子が条件的に活性でもよく、詳細に後述するようなリガンド依存性調節ドメインを含んでもよい。
【００４５】
転写アクチベータまたはリプレッサードメインは当業者には入手容易であろう。真核細胞中での転写を活性化するポリペプチドは当業界で公知である。特に、多くのＤＮＡ結合タンパク質の転写活性ドメインは、該ドメインが異種タンパク質に転移されたときにそれらの活性化機能を維持していることは記載及び証明されている。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様では、転写アクチベータドメインが、ヒトｐ６５タンパク質（Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｂａｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３８０５−３８１７）の活性ドメイン（ＡＤ）であり、より好ましくはヒトｐ６５のアミノ酸２８３−５５１に及ぶ領域もしくは該領域に包含される転写活性化部分を含むかまたは該領域もしくは該部分から構成される。別の実施態様では、ｐ６５ ＡＤのマルチマーを使用し得る。別の実施態様では、ｐ６５ ＡＤの部分のマルチマーを使用し得る。
【００４７】
本発明の別の好ましい実施態様では、転写アクチベータが単純疱疹ウイルスのビリオンタンパク質１６（本文中ではＶＰ１６として表す、そのアミノ酸配列はＴｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｊ．ら，（１９８８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２：７１８−７２９）に開示されている）を含む。より好ましくはＶＰ１６のＣ末端の約１２７個のアミノ酸を使用する。より好ましくはＶＰ１６のＣ末端の約１１個のアミノ酸（アミノ酸４３７−４４７）を使用する。好ましくはこの領域のマルチマー（２−４個のモノマー）を使用する。好ましくは、この領域のダイマー（即ち、約２２アミノ酸）を使用する。ＶＰ１６の適当なＣ末端ペプチド部分はＳｅｉｐｅｌ，Ｋ．ら，（ＥＭＢＯ Ｊ．１９９２ １３：４９６１−４９６８）に記載されている。例えば、アミノ酸配列ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬを有するペプチドのダイマーを使用できる。
【００４８】
本発明の別の実施態様では、転写アクチベータが、ＰＰＡＲγ−１コアクチベータ（ＰＧＣ−１）のＡＤを含むかまたは該ＡＤから構成されている。ＰＧＣ−１の配列はＰｕｉｇｓｅｒｖｅｒ Ｐ．ら，１９９８，Ｃｅｌｌ，９２，８２９に開示されている。１つの実施態様では、ＰＧＣ−１のＮ末端のアミノ酸１−１７０に及ぶ領域を使用する（Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，１３６８−１３７１）。別の実施態様では、ＰＧＣ−１のＮ末端のアミノ酸１−６５に及ぶ領域を使用する。別の実施態様では、ＰＧＣ−１ ＡＤのマルチマーを使用し得る。別の実施態様では、ＰＧＣ−１ ＡＤの部分のマルチマーを使用し得る。
【００４９】
別の実施態様では、転写を抑制し得るキメラ転写因子を作製する（転写リプレッサー）。この場合、転写因子は真核細胞中の転写を直接または間接に抑制するリプレッサードメインを含む。転写を活性化する代わりに抑制し得るこのようなドメインの一例は、ヒトＫｏｘ１ジンクフィンガータンパク質のＫＲＡＢリプレッサードメインである（Ｍａｒｇｏｌｉｎ Ｊ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４５０９−４５１３）。
【００５０】
真核細胞中で転写活性能を有している別のポリペプチドを本発明の転写アクチベータ中に使用できる。種々のタンパク質中に見出された転写活性ドメインを同様の構造的特徴に基づいてグループに分類した。転写活性ドメインの種類としては、酸性転写活性ドメイン、プロリン富化転写活性ドメイン、セリン／トレオニン富化転写活性ドメイン及びグルタミン富化転写活性ドメインがある。酸性転写活性ドメインの例としては、前述のＶＰ１６領域、ＧＡＬ４のアミノ酸残基７５３−８８１がある。プロリン富化活性ドメインの例としては、ＣＴＦ／ＮＦ１のアミノ酸残基３９９−４９９及びＡＰ２のアミノ酸残基３１−７６がある。セリン／トレオニン富化転写活性ドメインの例としては、ＩＴＦ１のアミノ酸残基１−４２７及びＩＴＦ２のアミノ酸残基２−４５１がある。グルタミン富化活性ドメインの例としては、Ｏｃｔ１のアミノ酸残基１７５−２６９及びＳｐ１のアミノ酸残基１３２−２４３がある。上記の各領域のアミノ酸配列及び別の有用な転写活性ドメインのアミノ酸配列は、Ｓｅｉｐｅｌ，Ｋ．ら（ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９２ １２：４９６１−４９６８）に開示されている。
【００５１】
１つのポリペプチドの転写活性能は、該ポリペプチドとＤＮＡ結合活性をもつ別のポリペプチドとを連結する段階と、融合タンパク質によって刺激される標的配列の転写量を測定する段階とを含むアッセイによって検定できる。例えば、当業界で使用される標準アッセイは、推定転写活性ドメインとＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（例えばアミノ酸残基１−９３）との融合タンパク質を利用する。次にこの融合タンパク質を使用して、ＧＡＬ４結合部位に連結されたリポーター遺伝子の発現を刺激する（例えば、Ｓｅｉｐｅｌ，Ｋら，１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４９６１−４９６８及び該文献に引用された参考文献を参照するとよい）。
【００５２】
真核細胞中の転写を直接または間接に抑制する転写リプレッサードメインは本発明に使用できる。転写を活性化する代わりに抑制し得るこのようなドメインの例は、ヒトＫｏｘ１ジンクフィンガータンパク質のＫＲＡＢリプレッサードメインである（Ｍａｒｇｏｌｉｎ Ｊ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，４５０９−４５１３）。このドメインを単一ドメインとしてまたはマルチマー形態で使用し得る。
【００５３】
真核細胞中の転写を抑制するポリペプチドは当業界で公知である。特に、多くのＤＮＡ結合タンパク質の転写抑制ドメインは、該ドメインが異種タンパク質に転移されたときにそれらの活性機能を保持していることが記載され証明されている（Ｄｅｕｓｃｈｌｅら，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，１９０７−１９１４；Ｆｒｅｕｎｄｌｉｅｂ Ｓ．ら，１９９９，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１，１）。
【００５４】
リガンド依存性調節ドメインは、特異的リガンドに結合したときにトランスアクチベータ分子またはトランスリプレッサー分子の活性を調節するトランスアクチベータまたはトランスリプレッサーのドメインである。このような調節ドメインの最もよく知られた例はステロイド受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）である。ステロイド受容体は、それらのＬＢＤを介してそれらの同系のリガンドに結合したときにのみ転写を活性化する転写因子である。
【００５５】
リガンド依存性調節ドメインの例は、Ｇ５２１Ｒ突然変異体を含むヒトエストロゲン受容体αの突然変異体である。この突然変異体はエストラジオールに対する親和性の低下を示すが、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）、タモキシフェンの代謝産物（ＴＡＭ）及びその他のいくつかの物質（例えばラロキシフェン）のような合成エストロゲンアンタゴニストに対しては高い親和性を維持している（Ｄａｎｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．ら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７：２３２−２４０；Ｆｅｉｌ Ｒ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１０８８７−１０８９０）。
【００５６】
別の例は、ヒトプロゲステロン受容体のＲＵ４８６依存性Ｃ末端欠失体である。これはプロゲステロンに結合しないで合成類似体ＲＵ４８６にだけ結合する（Ｖｅｇｅｔｏ Ｅ．ら，１９９２，Ｃｅｌｌ，６９：７０３−７１３）。
【００５７】
調節ドメインはまた、特異的リガンドの存在下でヘテロダイマー化するタンパク質ドメインを使用することによって構築できる。例えば、ＨＮＦ１ ＤＢＤをヒトタンパク質ＦＫＢＰ１２のラパマイシン結合ドメインに融合させ得る。このキメラは、ヒトの転写調節ドメインに融合した第二の薬物結合ドメイン例えばＦＲＡＰタンパク質の薬物結合ドメインとラパマイシンの存在下でダイマー化するであろう。このラパマイシン媒介ダイマーはＨＮＦ１反応性プロモーターの転写活性能を有しているであろう。
【００５８】
上記のすべての場合に、活性転写因子（即ち、ＤＮＡ結合ドメインと転写調節ドメインとの双方を含む転写因子）の濃度はリガンド濃度に比例するであろう。
【００５９】
リガンドという用語は、ステロイドに構造的に近縁でなくてもよく、キメラ転写因子の調節ドメインのリガンドとして使用できる化合物を意味する。
【００６０】
別の観点によれば、本発明のキメラ転写因子は、ＨＮＦ１ ＤＢＤと、（ｉ）リガンド依存性調節ドメインを含むポリペプチド（例えば、ステロイド、ステロイドのアゴニスト及びアンタゴニストの結合を担当するステロイド受容体またはその突然変異形態のＬＢＤ）と、（ｉｉ）真核細胞中の転写を直接または間接に活性化する転写アクチベータドメインとから成る。この観点によって提供される本発明の転写因子の活性及び結果的に得られる導入遺伝子の転写は、特異的リガンドを添加するかまたは除去することによって選択的に調節できる。
【００６１】
本発明の好ましい実施態様では、ＨＮＦ１のＤＢＤを含むリガンド依存性転写因子がタモキシフェン依存性キメラとして構築される。このキメラは、ヒトエストロゲン受容体α（Ｄａｎｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．ら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７：２３２−２４０；Ｆｅｉｌ Ｒ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１０８８７−１０８９０）の突然変異体（５２１のＧｌｙがＡｒｇに変異）に融合したＨＮＦ１のＤＮＡ結合ドメインとｐ６５活性ドメインとによって構成されている。ヒトエストロゲン受容体の突然変異体は、エストラジオールに対する結合親和性が顕著に低下しているが、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）、タモキシフェンの代謝産物（ＴＡＭ）及びその他のいくつかの物質（例えばラロキシフェン）のようなエストラジオールアンタゴニストに対する高い親和性は維持している（Ｄａｎｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．ら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７：２３２−２４０；Ｆｅｉｌ Ｒ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１０８８７−１０８９０）。
【００６２】
本発明の別の実施態様では、ＨＮＦ１ ＤＢＤを、プロゲステロンには結合せずその合成類似体ＲＵ４８６（Ｖｅｇｅｔｏ Ｅ．ら，１９９２，Ｃｅｌｌ，６９：７０３−７１３）にだけ結合するヒトプロゲステロン受容体のＣ末端欠失体にフレーム内で融合させ、次いで、転写のアクチベータまたはリプレッサードメインがフレーム内に連結されたＲＵ４８６依存性トランスアクチベータを使用する。
【００６３】
別の実施態様では、転写を抑制し得るキメラタンパク質を作製する（転写リプレッサー）。１つの実施態様では、融合タンパク質が、（ｉ）ＨＮＦ１ ＤＢＤと、（ｉｉ）（ｉ）に連結されたヒトエストロゲン受容体α（Ｄａｎｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．ら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７：２３２−２４０；Ｆｅｉｌ Ｒ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１０８８７−１０８９０）の突然変異体（５２１のＧｌｙがＡｒｇに変異）と、（ｉｉｉ）（ｉｉ）に連結されたヒトＫｏｘ１ジンクフィンガータンパク質（Ｍａｒｇｏｌｉｎ Ｊ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．ＵＳＡ，９１，４５０９−４５１３）のＫＲＡＢリプレッサードメインとを含む。
【００６４】
リガンド結合依存性転写因子の３つの必須成分、即ち、ＤＮＡ結合ドメインとリガンド依存性調節ドメインと転写調節ドメインとが本発明のトランスアクチベータ／トランスリプレッサー融合タンパク質中でいかなる順序または配列に編成されてもよいことに注目されたい。
【００６５】
別の実施態様では、ＨＮＦ１ ＤＢＤと転写調節ドメインとを個別の２つの融合タンパク質として別々に提供してもよい。この場合、これらの融合タンパク質は活性転写因子を提供するために相互作用する。例えば、哺乳類のＨＮＦ１ ＤＢＤを、ヒト転写調節ドメインに融合した別のリガンド結合ドメイン（例えばＦＲＡＰ）にリガンド（例えばラパマイシン）の存在下でダイマー化できるリガンド結合ドメイン（例えばＦＫＢＰ１２）と融合させてもよい。この場合、活性転写因子（即ち、ＤＮＡ結合ドメインと転写調節ドメインとの双方を含む転写因子）の濃度はリガンドの濃度に比例するであろう。
【００６６】
別の実施態様では、ＤＢＤと調節ドメインとから成る融合タンパク質と相互作用する転写活性化タンパク質の補充による間接メカニズムによって転写を活性化する。これは例えば、宿主細胞中に存在する内在性アクチベータのような転写アクチベータタンパク質とのタンパク質−タンパク質相互作用を媒介するポリペプチドドメイン（例えばダイマー化ドメイン）によって行われてもよい。適当な相互作用（またはダイマー化）ドメインの例としては、ロイシンジッパー（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６８１−１６８８）、ヘリックス・ループ・ヘリックスドメイン（Ｍｕｒｒｅ，Ｃ．ら，（１９８９）Ｃｅｌｌ ５８：５３７−５４４）及びジンクフィンガードメイン（Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．ら，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：７０−７３）がある。
【００６７】
本発明の転写因子（これは単一融合タンパク質でもよい）はまた、細胞核への輸送を促進する第四のポリペプチド成分例えば核局在化シグナル（ＮＬＳ）のような１つまたは複数の他のポリペプチド成分を含み得る。核局在化シグナルは典型的には、塩基性アミノ酸の連鎖から構成されている。異種タンパク質（例えば本発明の融合タンパク質）に付着したとき、核局在化シグナルは細胞核へのタンパク質の輸送を促進する。核局在化シグナルは異種タンパク質に付着するとタンパク質表面に露出し、タンパク質の機能を妨害することはない。好ましくは、ＮＬＳがタンパク質の一端例えばＮ末端に付着する。本発明の融合タンパク質に含ませることができるＮＬＳの非限定例のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏである。好ましくは、核局在化シグナルをコードしている核酸を標準組換えＤＮＡ技術によって、融合タンパク質をコードしている核酸にフレーム内に（例えば５′端に）スプライスする。
【００６８】
本発明のＤＢＤを含有している転写因子は、ＨＮＦ１反応性プロモーターによってコントロールされる配列の転写を特異的に活性化（または抑制）する。ＨＮＦ１ ＤＢＤを含有する融合タンパク質は、内在性ＨＮＦ１を発現しない組織中で、選択されたＨＮＦ１ ＤＮＡ結合部位に連結された任意の標的遺伝子の転写レベルを調節するために有用である。
【００６９】
ＨＮＦ１依存性プロモーターは単一のまたは多数のＨＮＦ１結合部位を含み得る。
【００７０】
本発明の実施態様に使用するためには、ＨＮＦ１依存性プロモーターが少なくとも１つのＨＮＦ１結合部位と１つまたは複数の異なる転写因子に対する１つまたは複数の結合部位とを含むであろう。
【００７１】
好ましい実施態様では、１つまたは多数のＨＮＦ１結合部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１結合部位）を含む人工のＨＮＦ１依存性プロモーターから転写を活性化するためにＨＮＦ１に基づくアクチベータを使用する。
【００７２】
別の好ましい実施態様では、１つまたは複数の天然または人工的に導入されたＨＮＦ１結合部位を同時に含む本質的に活性なプロモーターからの転写を抑制するためにＨＮＦ１に基づくリプレッサーを使用する。これらのプロモーターは、ＨＮＦ１転写因子の非存在下で本質的に活性であるが、ＨＮＦ１に基づくリプレッサーによって特異的に抑制される。
【００７３】
本発明は、遺伝子発現のオンとオフとの切替えが可能であることまたは遺伝子発現のレベル調節が可能であることが望まれる様々な場合に広く適用し得る。唯一の前提要件は、標的細胞または組織が内在性ＨＮＦ１に基づく活性転写因子を含有しないことである。
【００７４】
本発明は、遺伝子治療の目的に、例えば、遺伝性または後天性疾患の治療、特に、長期治療が必要でトランスアクチベータに対する免疫応答を回避することが好ましい症例の治療（例えば遺伝的慢性疾患の治療）に好ましく使用される。
【００７５】
遺伝子治療を目的とする本発明の系に使用するためには、遺伝子治療を必要とする患者の細胞が、（１）ＨＮＦ１に基づくトランスアクチベータまたはトランスリプレッサーをコードしており宿主細胞中の発現に適した形態を有する核酸と、（２）ＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１依存性プロモーターに作動的に連結された有益な配列（例えば治療目的に有益な配列）とを含有するように修飾される。
【００７６】
ＨＮＦ１に基づくリガンド依存性アクチベータを使用する場合、患者の細胞中で生じる有益な配列の発現は、適切なリガンド／誘発物質を患者に投与することによって刺激される。患者の細胞中で有益な遺伝子の発現を停止させるためには、誘発物質の投与を停止する。
【００７７】
ＨＮＦ１に基づくリガンド依存性リプレッサーを使用する場合、患者の細胞中の有益な配列の発現はリプレッサーの存在下で抑制され、次いでリプレッサーの除去によって刺激される。患者の細胞中の有益な遺伝子の発現を停止させるためにはリプレッサーを再投与する。
【００７８】
双方の場合に、遺伝子発現のレベルは、患者に投与するリガンドの用量を調節することによって調節できる。従って、宿主細胞中で、ＨＮＦ１依存性プロモーターに作動的に連結された配列の転写は、宿主細胞に接触している誘発リガンド（例えばＴＡＭ、４−ＯＨＴまたはその他のステロイド及びそれらの類似体）の濃度を変化させることによって（例えば、リガンドを培養培地に添加する、または、リガンドを宿主生物に投与する、などによって）コントロールし得る。
【００７９】
ｉｎ ｖｉｖｏ転写を誘発または抑制するためには、リガンドを身体または対象組織に（例えば注射によって）投与するとよい。治療すべき身体は、動物、特に、ヒトまたはヒト以外の哺乳類、例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスもしくはその他の齧歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシもしくはウマでもよく、または、ニワトリのような鳥類でもよい。適当な投与経路は、経口、腹腔内、筋肉内、静注（ｉ．ｖ．）である。
【００８０】
上述のように本発明では、ヒト起原のＨＮＦ１ ＤＢＤを使用でき、従って完全にヒト化されたトランスアクチベータの構築が可能であるため、他の入手可能な調節系に比べて免疫原性の危険が最も少ないという利点をもつ調節系の構築が提案される。
【００８１】
既出の幾つかの文節に概略的に記載した遺伝子治療の用途以外にも、本発明のＨＮＦ１ ＤＢＤを組込んだリガンド依存性転写因子は以下の目的に使用できる。
１．細胞中で自殺遺伝子を条件的に発現させ、これによって、所期の機能を遂行した後の細胞を除去する。例えば、ワクチン接種に使用した細胞は、患者の免疫応答が生じた後に、特異的リガンドによって細胞中で自殺遺伝子の発現を誘発することによって患者の体内から除去できる。
２．組換えウイルスベクターに含有されており、産生プロセス中にパッケージング細胞系中のウイルスの増殖を妨害し得る遺伝子の発現を調節する。これらの組換えウイルスはアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ関連ウイルス、及び、当業者に自明のよく知られた他のウイルスの誘導体でもよい。
３．本発明のＤＢＤを含むトランスアクチベータを該トランスアクチベータの細胞内発現に適した形態でコードしている内在性ＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１非含有の核酸と、ＨＮＦ１依存性プロモーターに作動的に連結された有益なタンパク質をコードする遺伝子と、を含有するように修飾されたｉｎ ｖｉｔｒｏの培養細胞を使用して有益な毒性タンパク質を大規模生産する。
【００８２】
本発明によるポリペプチドまたは融合タンパク質を産生するための簡便な方法は、該ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードしている核酸を発現系中の核酸の使用によって発現させる方法である。
従って多様な観点によれば本発明はまた、本発明の転写アクチベータまたはリプレッサーをコードする核酸を提供する。このような核酸はコードされたタンパク質を産生するために使用され得る。
【００８３】
本発明のタンパク質をコードしているかまたはその成分をコードしているかに関わりなく、一般的に核酸は単離物として単離物及び／または精製物で提供されるか、または、場合によっては１つまたは複数の発現調節配列を含有する以外は、核酸が天然に会合する材料を含有しないかもしくは実質的に含有しない形態、例えば、ヒトゲノム中で遺伝子にフランキング（隣接）する核酸を含有しないかもしくは実質的に含有しない形態で提供される。核酸は完全合成または部分合成でよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡなどである。本発明の核酸がＲＮＡである場合、示した配列に関する記載は、ＵによってＴが置換されたＲＮＡ等価物を包含すると理解されたい。
【００８４】
本発明によるポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配列は、利用可能な核酸の配列及びクローンが与えられれば、本文中に含まれている情報及び参考文献と当業界で公知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，（１９９４）参照）とを使用して当業者が容易に作製し得る。これらの技術としては、（ｉ）例えばゲノムソースから得られたこのような核酸のサンプルを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成、または、（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の作製、がある。当業者に公知の任意の適当な方法で全長配列の部分をコードするＤＮＡ（場合により例えばＤＮＡ結合ドメインまたは調節ドメイン）を作製し、使用し得る。例えば、コードしているＤＮＡを採取し、発現されるべき部分の両側の適当な制限酵素認識部位を同定し、該部分をＤＮＡから切り離す、などの段階を使用する。次に該部分を市販の標準発現系中で適当なプロモーターに作動可能に連結し得る。別の組換え方法では、ＤＮＡの適切な部分を適当なＰＣＲプライマーで増幅させる。修飾ペプチドを発現させるため、または、核酸の発現に使用した宿主細胞中のコドン選択性に対処するために、例えば部位特異的突然変異誘発を使用して適切な配列を修飾してもよい。
【００８５】
核酸配列の発現を得るために、核酸配列の発現を制御すべく核酸に作動可能に連結された１つまたは複数の制御配列を有しているベクターに核酸配列を組込んでもよい。ベクターは別の配列、例えば、挿入された核酸の発現を励起するプロモーターまたはエンハンサーを含んでもよく、ポリペプチドまたはペプチドを融合物として産生させる核酸配列を含んでもよく、及び／または、宿主細胞中で産生されたポリペプチドが細胞から分泌されるように分泌シグナルをコードする核酸を含んでもよい。次いで、ベクターを機能性に維持する宿主細胞をベクターで形質転換させ、ポリペプチドが産生されるように宿主細胞を培養し、宿主細胞または周囲培地からポリペプチドを回収することによってポリペプチドが得られる。当業界ではこのために、原核細胞及び真核細胞、例えば、大腸菌の複数の菌株、酵母、及び、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞のような真核細胞を使用する。
【００８６】
従って本発明はまた、開示したようなポリペプチドまたは融合タンパク質の製造方法を包含する。該方法は、産生物をコードする核酸（通常は本発明の核酸）の発現段階を含む。この発現は、このようなベクターを含む培養宿主細胞をポリペプチドの発現が惹起または許容される適正条件下で増殖させることによって簡便に行うことができる。また、網状赤血球溶解液のようなｉｎ ｖｉｔｒｏの系でポリペプチドを発現させてもよい。
【００８７】
異なる多様な宿主細胞中でポリペプチドをクローニングし発現させる系は公知である。適当な宿主細胞としては、細菌、哺乳類及び酵母のような真核細胞並びにバキュロウイルス系がある。異種ポリペプチドを発現させるために当業界で利用可能な哺乳類細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＣＯＳ細胞及びその他の多くの細胞がある。常用の好ましい細菌宿主は大腸菌である。
【００８８】
プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子のような適当な調節配列及び適宜にその他の配列を含む適当なベクターを選択または構築できる。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス例えば“ファージ”またはファージミドが適宜使用され得る。詳細に関しては例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照するとよい。例えば核酸構築物の産生、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞内導入及び遺伝子発現のような核酸操作並びにタンパク質の分析に関する多くの公知技術及びプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。
【００８９】
哺乳類細胞中で使用される組換え発現ベクターのコントロール機能がウイルス性遺伝材料によって提供されてもよい。代表的なプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２型、サイトメガロウイルス及びＳＶ４０に由来のプロモーターである。
【００９０】
本発明に使用される組換え発現ベクターの調節配列が、ポリペプチドまたは融合タンパク質を特定種類の細胞中で優先的に直接発現させてもよい。即ち、組織特異的調節要素を使用し得る。１つの実施態様では、本発明の組換え発現ベクターがプラスミドである。あるいは、本発明の組換え発現ベクターは、ウイルス核酸に導入された核酸を発現させ得るウイルスまたはその一部分でもよい。例えば、複製欠陥のあるレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスを使用できる。組換えレトロウイルスを作製しこのようなウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの細胞に感染させるプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌらの著作（前出）に見出される。アデノウイルスのようなウイルスのゲノムは、該ゲノムがトランスアクチベータまたはリプレッサータンパク質をコードし発現するが溶菌性ウイルスの正常な生活サイクルでは複製能力が不活性化されるように操作され得る。
【００９１】
従って、別の観点によれば本発明は、本文中に開示したような異種核酸を含有している宿主細胞を提供する。
【００９２】
宿主細胞は例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）、酵母細胞、菌類細胞または昆虫細胞でよい。更に、宿主細胞はヒト以外の受胎卵母細胞でもよい。この場合、宿主細胞は、転写阻害性融合タンパク質を発現する細胞を有しているトランスジェニック生物を創製するために使用できる。更に、組換え発現ベクターは、トランスアクチベータまたはリプレッサーをコードする核酸と宿主細胞中の標的遺伝子との間の相同的組換えを許容するように設計できる。このような相同的組換えベクターは、本発明の融合タンパク質を発現する相同的組換え動物を創製するために使用できる。
【００９３】
本発明の核酸が宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に組込まれてもよい。標準技術に従って組換えを促進する配列をゲノムと共に混在させることによって組込みを促進し得る。核酸は、細胞内部の染色体外ベクターに存在してもよくまたは細胞に対して異種または異種であることが確認された核酸であってもよい。
【００９４】
使用し得る哺乳類細胞系の例は、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０）、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら（１９９７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：ｐｐ５９）及びＳＰ２またはＮＳ０のような骨髄腫細胞（Ｇａｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（Ｂ）：３−４６）である。細胞系に加えて、本発明は、遺伝子治療の目的で修飾される細胞またはトランスジェニック動物もしくは相同的組換え動物を創製するために修飾された胚細胞のような正常細胞に適用し得る。遺伝子治療の目的に特に有益な種類の細胞の例は、造血幹細胞、筋芽細胞、肝細胞、リンパ球、筋肉細胞、ニューロン細胞並びに皮膚上皮細胞及び気道上皮細胞である。更に、トランスジェニック動物または相同的組換え動物の場合には、胚幹細胞及び受胎卵母細胞を、トランスアクチベータまたはリプレッサー融合タンパク質をコードする核酸を含有するように修飾できる。
【００９５】
トランスアクチベータまたはリプレッサー融合タンパク質をコードする核酸をヒト以外の動物の受胎卵母細胞に移入して、１つまたは複数の種類の細胞中で本発明の融合タンパク質を発現するトランスジェニック動物を作製できる。
【００９６】
更に別の観点によれば本発明は、本発明の転写アクチベータまたはリプレッサータンパク質を発現する細胞を含有するヒト以外の動物も含めたトランスジェニック生物を提供する（即ち、トランスアクチベータまたはリプレッサーをコードする核酸がトランスジェニック生物の細胞の１つまたは複数の染色体に取り込まれている）。
【００９７】
また別の観点によれば本発明は、核酸を宿主細胞に導入する段階を含む方法を提供する。（特にｉｎ ｖｉｖｏ導入の場合には）限定なしで普遍的に“形質転換”と呼ぶことができる該導入のために利用可能ないかなる技術も使用し得る。真核細胞の場合、適当な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクションがあり、また、レトロウイルスまたはその他のウイルス例えばワクシニアウイルスを使用するかまたは昆虫細胞に対してはバキュロウイルスを使用する形質導入がある。細菌細胞の場合、適当な技術としては、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔及びバクテリオファージを使用するトランスフェクションがある。代替技術として、核酸の直接注入も使用できる。
【００９８】
有益な核酸を含有するクローンを同定するためには、当業界で公知のように、抗生物質抵抗性遺伝子または抗生物質感受性遺伝子などのマーカー遺伝子を使用し得る。
【００９９】
導入後、例えば遺伝子が発現する条件下で宿主細胞（宿主細胞は実際に形質転換された細胞自体でもよいが、形質転換された細胞の後代が使用される場合が多い）を培養することによって核酸からの発現を惹起または許容し、その結果として、コードされた産物を産生させる。ポリペプチドが適当なシグナルリーダーペプチドに結合された状態で発現されるならば、該ポリペプチドは細胞から培養培地に分泌され得る。発現による産生の後で、ポリペプチドを場合に応じて宿主細胞及び／または培養培地から単離及び／または精製し、その後に所望の用途に使用し得る。例えば、１種または複数の医薬として許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体を含む医薬組成物のような１種または複数の追加成分を含有し得る組成物の製剤化に使用し得る（後記参照）。
【０１００】
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、遺伝子治療によって生体内に導入され得る。１つの方法では、核酸を生体外で細胞に導入し、次いでこれらの細胞を移植またはその他の方法で個体に投与する。このような細胞が個体から採取され、本発明の核酸によって処理した後で該個体に戻されてもよい。
【０１０１】
従って、本発明の核酸を含む宿主細胞は、例えば核酸を細胞もしくはその祖先細胞に導入した結果として及び／または細胞もしくはその祖先細胞に内在性の配列の遺伝的変異の結果として（このような導入または変異は生体内または生体外で生じ得る）、生物の体内（例えば細胞体）に含まれる。生物としては、動物、特にヒトまたはヒト以外の哺乳類、例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスもしくはその他の齧歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはウマ、または、ニワトリのような鳥類がある。別の観点によれば本発明はまた、このような細胞を含む遺伝的に修飾された動物及び鳥類またはトランスジェニックな動物及び鳥類を提供する。
【０１０２】
本発明の転写アクチベータまたは転写リプレッサー（例えばコーディング核酸で宿主細胞を形質転換させることによって得られた融合タンパク質）を含有する宿主細胞は更に、（例えば形質転換の結果として）転写アクチベータの標的として機能する１つまたは複数の核酸を含有し得る。標的核酸は、転写されるべきヌクレオチド配列から成り、少なくとも１つのオペレーター配列に作動的に連結されている。
【０１０３】
本発明による転写アクチベータまたはリプレッサーは、転写アクチベータまたはリプレッサーが結合する調節配列に作動的にまたは作動可能に連結されている標的ヌクレオチド配列の転写を調節するために使用し得る。転写されるべきヌクレオチド配列は典型的には、それ自体は転写されないが転写機構を転写用に位置決めする機能を（少なくとも部分的に）果たす最小プロモーター配列を含む。最小プロモーター配列は、転写された配列の上流に局在し、隣接ヌクレオチド配列を形成する。このような最小プロモーターの活性は、作動的に連結された調節用オペレーター配列に対する転写アクチベータまたはリプレッサーの結合に依存性である。該最小プロモーターは、（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０に記載されているように）ヒトのサイトメガロウイルスに由来し得るが、当業者は別の適当な最小プロモーターを利用することが可能であろう。
【０１０４】
標的ヌクレオチド配列は、本発明の転写アクチベータが結合する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列、例えばＨＮＦ１オペレーター配列に作動的に連結されている。該オペレーターは通常は、転写されるべき配列及び適当な場合には最小プロモーターの５′側に存在する。オペレーター配列は転写されるべきヌクレオチド配列の下流（即ち３′側）に作動的に連結されてもよい。
【０１０５】
プロモーター配列及びオペレーター配列に作動可能に連結された別の配列はポリペプチドまたはペプチドをコードする配列、アンチセンス配列またはリボザイムでよい。
【０１０６】
本発明を使用してその発現がコントロールされ得るポリペプチドは、本発明を実施する技術者の要望及び目的に従って選択されることができ、治療用タンパク質でもよくまたは細胞傷害性タンパク質でもよい。
【０１０７】
アンチセンス調節によって発現に影響を及ぼす適当な核酸を使用することによってポリペプチド発現を阻害してもよい。アンチセンス配列は本発明の転写コントロール下に配置され得る。遺伝子発現を下方調節するためにアンチセンス遺伝子または部分的遺伝子配列を使用することはいまや確立した技術である。二重鎖ＤＮＡを“逆配向”でプロモーターのコントロール下に配置し、ＤＮＡの“アンチセンス”鎖の転写によって標的遺伝子の“センス”鎖から転写された正常ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡが生じるようにする。このとき相補的アンチセンスＲＮＡ配列はｍＲＮＡに結合して二重鎖を形成し、標的遺伝子の内在性ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されることを阻止すると考えられる。これが実際の作用モードであるか否かは未確認である。しかしながら、この技術が有用であることは確認された。
【０１０８】
別の可能性は、転写によってリボザイムを産生するように核酸を使用できること、また、特定部位で核酸を切断でき、従って、遺伝子発現を操作するために使用できることである。リボザイムに関する従来文献は、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ａｎｄ Ｓｃａｎｌｏｎ（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２，（３）２１３−２２３及びＭｅｒｃｏｌａ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２，（１）４７−５９である。
【０１０９】
本発明の転写ユニットを組換えベクター（例えばプラスミドまたはウイルスベクター）に組込んでもよく、場合によっては、開示された転写アクチベータまたはそのコーディング核酸と共に、宿主細胞または動物に導入し得る。
【０１１０】
別の観点によれば、本発明は、
（ｉ）開示された転写アクチベータまたは開示された転写アクチベータをコードする第一核酸と、
（ｉｉ）転写されるべきヌクレオチド配列から成り転写ユニットに作動的に連結された第二核酸と、
を含む組成物を提供する。
【０１１１】
第一核酸と第二核酸との双方が含まれる１つの実施態様においては第一及び第二の核酸が別々の分子（例えば２つの異なるベクター）である。この場合、宿主細胞に２つの核酸分子を同時にトランスフェクトするか、または、先ず一方の核酸分子、次いで他方の核酸分子という順序で順次トランスフェクトする。更に、ＤＢＤ成分とリガンド結合成分とから成る融合タンパク質を含む転写アクチベータの成分と、トランスアクチベータまたはトランスリプレッサーを生じるために融合タンパク質と相互作用する転写活性化用または抑制用の別のポリペプチドとを別々の分子として提供してもよい。別の実施態様では、複数の核酸を同一分子（例えば単一ベクター）中に連結（例えば、同一直線上に（ｃｏｌｉｎｅａｒ）に連結）する。この場合、宿主細胞に単一核酸分子をトランスフェクトし得る。
【０１１２】
本発明は更に、（ｉ）本発明の転写因子またはこのような融合タンパク質をコードする核酸と、及び／または、（ｉｉ）開示されたような転写ユニットと、から成る薬剤を患者に投与することから成る治療方法を提供する。本発明は更に、個体に投与する医薬を製造するためのこのような成分（ｉ）及び（ｉｉ）の使用を提案する。
【０１１３】
本発明の転写アクチベータまたはリプレッサーは、転写されるべき配列に作動可能に連結されたオペレーター配列を介して配列の転写を調節するために使用され得る。本文中で検討したように、このオペレーター／転写配列構築物を宿主細胞に導入し得る。代替方法では、転写されるべき配列が宿主細胞に内在性でもよい。内在性配列は相同的組換えを介して適正な転写ユニットに作動的に連結され得る。例えば、少なくとも１つのＨＮＦ１オペレーター配列と最小プロモーター配列とを含む相同的組換えベクターを調製し得る。内在性遺伝子の実際のプロモーター領域を除去することによって、最小プロモーターの３′端に内在性遺伝子のコーディング領域を表す配列がフランキング（隣接）し、５′端に内在性遺伝子の上流領域の配列がフランキングしている。これらのフランキング配列は、ベクターＤＮＡと内在性遺伝子との相同的組換えが行われるように十分な長さを有している。好ましくは、フランキングＤＮＡの数キロ塩基が相同的組換えベクターに含まれている。ベクターＤＮＡと宿主細胞の内在性遺伝子との間の相同的組換えが生じる際に、内在性プロモーターの領域が、最小プロモーターに作動可能に連結された１つまたは複数のＨＮＦ１オペレーター配列を含有するベクターＤＮＡによって置換される。従って、内在性遺伝子の発現は、もはやそれ自体の内在性プロモーターの制御をはなれ、本発明の転写ユニットに制御される。
【０１１４】
別の実施態様では、オペレーター配列を内在性遺伝子の内部の別の場所、好ましくは５′または３′の調節領域に相同的組換えを介して挿入し、本文中に記載された転写アクチベータまたはリプレッサーによってその発現を調節できる内在性遺伝子を作製してもよい。例えば、１つまたは複数のＨＮＦ１結合配列を内在性遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー領域に、プロモーターまたはエンハンサー機能が維持されるように挿入することができる。
【０１１５】
“ＨＮＦ１結合部位”または“ＨＮＦ１結合配列”という用語は、ＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１トランスアクチベータによって結合される天然または人工のＤＮＡ配列を意味する（Ｔｒｏｎｃｈｅ Ｆ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６６，２３１−２４５）。転写されるべきヌクレオチド配列は、別の転写因子との結合部位と混在するかまたは混在しない単一または多数のＨＮＦ／ｖＨＮＦ１結合部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のＨＮＦ／ｖＨＮＦ１結合部位）から構成され得るＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１依存性プロモーターに作動的に連結され得る。
【０１１６】
少なくとも１つのＨＮＦ１結合部位が少なくとも１つの別の転写因子結合部位に連結されたキメラプロモーターを使用できる。
【０１１７】
個体に投与されるべき本発明の組成物は、場合に応じて“予防有効量”または“治療有効量”で投与されるのが好ましい。予防も治療方法であると考えてよい。有効量は、個体に対して有効性を示すために十分な量である。実際の投与量、速度及び時間に関する投与クールは治療される疾患の特性及び重篤度に従属するであろう。治療の処方、例えば投薬に関する決定などは、一般開業医及びその他の臨床医の職務である。組成物は単独で投与されてもよく、または、治療される病態次第では、別の治療薬と同時的または順次的に併用投与されてもよい。
【０１１８】
本発明に従って製造される医薬組成物及び本発明に従って使用される医薬組成物は、有効成分に加えて、医薬として許容される賦形剤、担体、バッファ、安定剤または当業者に公知のその他の材料を含有し得る。このような材料は、無毒性でなければならない。また、有効成分の有効性を妨害してはならない。担体またはその他の材料の詳細な特性は投与経路に従属する。投与経路は、経口投与でもよく、または、皮内注射、皮下注射もしくは静注のような注射による投与でもよい。
【０１１９】
経口投与される医薬組成物は錠剤、カプセル、粉末または液体の形態でよい。錠剤はゼラチンまたアジュバントのような固体担体を含み得る。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物油、植物油、鉱油または合成油のような液体担体を含んでいる。生理的塩類溶液、デキストロースもしくはその他の糖類溶液、または、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのようなグリコール類が含まれてもよい。
【０１２０】
静注、皮内注射もしくは皮下注射で使用するためまたは罹患部位に注入するためには、有効成分が、発熱源非含有で適正なｐＨ、等張性及び安定性を有している非経口的に許容される水溶液の形態であろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸化リンゲル注射液のような等張性ビヒクルを使用して適当な溶液を調製することができるであろう。必要に応じて保存剤、安定剤、バッファ、抗酸化剤及び／またはその他の添加剤も含有させ得る。
【０１２１】
リポソーム、特にカチオン性リポソームを担体配合物に使用してもよい。
【０１２２】
上述の技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に見出すことができる。
【０１２３】
薬物は、腫瘍部位もしくはその他の所望の部位に局在的に投与されてもよく、または、薬剤が腫瘍もしくはその他の細胞を標的とするように送達されてもよい。
【０１２４】
ターゲッティング療法は抗体または細胞特異的リガンドのようなターゲッティング系の使用によって有効薬物をある種の細胞にいっそう特異的に送達するために使用され得る。ターゲッティングは様々な理由で望ましい。例えば、薬物が許容できないほど毒性が強い、他の療法では投薬量が多くなり過ぎる、または、他の療法では標的細胞に侵入できない、などの理由がある。
【０１２５】
これらの薬物は、直接投与する代わりに、例えばウイルスベクターに入れたコーディング遺伝子を細胞に導入し、これを発現させることによって標的細胞中で直接産生させてもよい。ベクターが治療すべき特定細胞を標的とするようにしてもよく、または、ベクターが標的細胞によって多少とも選択的にスイッチオンされる調節要素を含有するようにしてもよい。
【０１２６】
組成物は単独で投与されてもよく、または、癌、ウイルス感染のような治療すべき病態次第でもしくは融合タンパク質の活性によって媒介される効果が望まれる別の病態次第で別の治療と併用して同時的または順次的に投与されてもよい。
【０１２７】
転写アクチベータまたはリプレッサーをコードしている本発明の核酸は遺伝子治療の方法に、例えば、障害の予防もしくは（全面的または部分的な）治癒を目的としてまたは本文中の他の箇所で検討するような別の目的をもって個体の治療に使用され得る。
【０１２８】
ウイルスベクターのようなベクターは多様な異なる標的細胞の核酸を導入するために従来技術で使用されてきた。典型的には、ベクターを標的細胞に接触させ、細胞が所望のポリペプチドの発現によって有効な治療効果または予防効果を与えるように十分な割合の細胞にトランスフェクションを生じさせる。トランスフェクトされた核酸が標的となった各細胞のゲノムに永久的に取込まれ、長期間持続効果を与えるようにしてもよく、そうでないときは治療が周期的に必要になるであろう。
【０１２９】
ウイルスベクター及びプラスミドベクターの双方について多様なベクターが当業界で公知である。米国特許第５，２５２，４７９号及び国際特許ＷＯ９３／０７２８２参照。特に、ＳＶ４０のようなパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶ及びＥＢＶのようなヘルペスウイルス並びにレトロウイルスなどの多くのウイルスが遺伝子導入ベクターとして使用されてきた。従来技術の多くの遺伝子治療プロトコルでは無能力にしたネズミのレトロウイルスを使用していた。
【０１３０】
ウイルスベクターの使用に代替して核酸を細胞に導入するために使用できる別の公知の方法としては、電気穿孔、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクションのような機械的技術、リポソーム及び直接ＤＮＡ摂取によって媒介される導入、受容体に媒介されるＤＮＡ導入、がある。
【０１３１】
標的細胞の表面に存在する受容体に特異的なリガンドを使用しポリリシンを介して核酸をタンパク質リガンドに連結する受容体媒介遺伝子導入は、核酸を特定細胞に特異的にターゲッティングする技術の一例である。
【０１３２】
（図面の簡単な説明）
図１はエストロゲン受容体αの構造の概略図である。
【０１３３】
図２は４−ＯＨＴ依存性転写因子ＨＥＡ−１の構造の概略図である。
【０１３４】
図３は、ＨＥＡ−１の転写特性を試験するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで使用されるリポーターｍＥｐｏ１遺伝子の構造の概略図である。
【０１３５】
図４はｍＥｐｏの産生によって測定したＨＥＡ−１の４−ＯＨＴ、ＴＡＭ及びＥ２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏの反応性を表す。Ｅ２（下方の四角記号）、ＴＡＭ（三角記号）及び４−ＯＨＴ（上方の四角記号）を使用したときのｍＥｐｏ活性（ｍＵ／ｍｌ）をホルモン（ｎＭ）の関数としてプロットする。
【０１３６】
図５はマウスにＨＥＡ−１及びｍＥｐｏ−１を使用することによって得られたｉｎ ｖｉｖｏの結果を表す。白抜きの四角記号はｍＥｐｏ１／ＨＥＡ（５μｇ／１μｇ）：ｗ／ｏＴＡＭ；黒塗りの四角記号はｍＥｐｏ１／ＨＥＡ−１（５μｇ／１μｇ）：ｗ／ＴＡＭである。
【０１３７】
図６は構築物ＨＥＡ−３及びＨＥＡ−４の構造の概略図である。
【０１３８】
図７はＨＥＡ−１、ＨＥＡ−３及びＨＥＡ−４の４−ＯＨＴ及びＥ２に対する反応性を証明するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を表す。円記号：白抜き−ＨＥＡ−１（Ｅ２）、黒塗り−ＨＥＡ−１（４−ＯＨＴ）；四角記号：白抜き−ＨＥＡ−３（Ｅ２）、黒塗り−ＨＥＡ−３（４−ＯＨＴ）；三角記号：白抜き−ＨＥＡ−４（Ｅ２）、黒塗り−ＨＥＡ４（４−ＯＨＴ）。ＨＥＡ−３は最も高い活性及び誘発性を示す。
【０１３９】
図８はＨＥＡ−３を使用して調節期間を証明するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を、ヘマトクリット（％）を時間（日）の関数としてプロットしたグラフで表す。黒塗りの四角記号はｍＥｐｏ−１／ＨＥＡ−３（１μｇ／１μｇ）：ｗ／ＴＡＭ（１ｍｇ／ｋｇ）の場合である。白抜きの四角記号はｍＥｐｏ−１／ＨＥＡ−３（１μｇ／１μｇ）：ｗ／ｏＴＡＭの場合である。
【０１４０】
図９は誘導の可逆性を証明するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を表す。ｍＥｐｏ−１／ＨＥＡ−３（１μｇ／１μｇ）：ｗ／及びｗ／ｏＴＡＭ（１ｍｇ／ｋｇ）の場合のヘマトクリット（％）を時間（日）の関数としてプロットする。
【０１４１】
実験
以下の実施例はより詳細な指針を当業者に提供するものであり、本発明はこれらの実施例に全く限定されないことを理解されたい。別の観点及び実施態様が当業者に明らかになるであろう。
【０１４２】
実施例１
ＨＥＡ−１の構築
ＨＮＦ１／ｖＨＮＦ１のＤＢＤを含むリガンド依存性転写因子を作製する可能性の一例として、発明者らは、タモキシフェン依存性キメラを構築した。ＨＥＡ−１と呼ばれるこのキメラは、ヒトエストロゲン受容体α（図１）の突然変異形に融合したＨＮＦ１のＤＮＡ結合ドメインとｐ６５ ＡＤとから構成されている。ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）の突然変異形はＧ５２１Ｒ突然変異体を含んでいる。これは、野生型ＥＲに比べてエストラジオール（Ｅ２）親和性が少なくとも１，０００分の１に低下しているが、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）、タモキシフェンの代謝産物（ＴＡＭ）及びその他の幾つかの誘導体（例えばラロキシフェン）のような合成誘導体には効率的に結合する。発明者らは、このトランスアクチベータがＨＮＦ１依存性プロモーターの下流にクローニングされた遺伝子の転写をリガンド依存的に活性化する能力をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで試験した。ｉｎ ｖｉｖｏ実験は、プラスミドＤＮＡをマウス筋肉に電気注入することによって行った。トランスアクチベータのリーク性（例えば、リガンド非依存性転写活性）及びその誘発性の程度も評価した。
【０１４３】
ＨＥＡ−１は、ヒトＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメイン、ヒトＥＲαの突然変異ＬＢＤ、ヒトｐ６５タンパク質のＡＤをそれぞれコードする核酸を標準クローニング技術（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に従ってフレーム内に融合させることによって得られた。このキメラタンパク質はそのＮ末端からＣ末端に向かって、以下の諸要素、即ち、ヒトＨＮＦ−１のＤＢＤ（アミノ酸１−２８２，［Ｆｒａｉｎ Ｍ．１９９０，Ｃｅｌｌ，５９，１４５−１５７；Ｎｉｃｏｓｉａ Ａ．ら，１９９０，Ｃｅｌｌ，１２２５−１２３６］）、２つのアミノ酸（Ｄ−Ｉ，アスパラギン酸塩−イソロイシン）から成るリンカー、ヒトエストロゲン受容体のアミノ酸３０３−５９５に及びＧ５２１Ｒ突然変異体を含むヒトエストロゲン受容体のＨＢＤ（Ｄａｎｅｌｉａｎ，Ｐ．Ｓ．ら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７：２３２−２４０；Ｆｅｉｌ Ｒ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３；１０８８７−１０８９０）、及び、ヒトＮＦ−κＢ ｐ６５タンパク質のアミノ酸２８３−５５１に及ぶｐ６５活性ドメイン（Ｂｕｒｃｉｎら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，３５５−３６０；Ａｂｒｕｚｚｅｓｅら，１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１４９９−１５０７）から構成されている。全タンパク質をコードするｃＤＮＡをＣＭＶエンハンサー／プロモーター要素及びイントロンＡ配列の下流でプラスミドｐｖｉＪｎｓＡにクローニングし（Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙ Ｄ．ら，１９９３，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２，７７７−７８３）、発現ベクターｐＣＭＶ／ＨＥＡ−１を作製した。
【０１４４】
プラスミドｐＣＭＶ／ＨＥＡ−１は以下の手順で構築した。ＰＣＲ反応の鋳型となるプラスミドＨＡ（Ｙａｎｉｖ Ｍ．１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．，ｖｏｌ １２，ｎｏ．１１）上の適当なプライマーを使用し、ヒトＨＮＦ−１のＤＢＤ（アミノ酸１−２８２）をコードする核酸をＰＣＲフラグメントとして作製した。得られたフラグメントの５′及び３′を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＶのそれぞれによって消化した。消化したフラグメントをＣＭＶエンハンサー／プロモーター要素及びイントロンＡ配列の下流で、制限酵素ＢｇｌＩＩ（５′）及びＥｃｏＲＶ（３′）で消化したプラスミドｐＶｉＪｎｓＡにクローニングした（Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙ Ｄ．ら，１９９３，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２，７７７−７８３）。Ｇ５２１Ｒ ＥＲ−ＨＢＤ（Ｇ５２１Ｒ突然変異体を含むヒトエストロゲン受容体の３０３−５９５領域）をＨＮＦ−１ ＤＢＤのＥｃｏＲＶ部位の処でフレーム内にクローニングした。特に、ヒトＥＲ−ＨＢＤがプラスミドｐｈＥＲａｌｐｈａ（ＬＢＤ）／ＴＧＥＭ（Ｚｈｏｕ Ｇ．ら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：１５９４−１６０４）に含まれている場合には、Ｇ５２１Ｒ ＥＲ−ＨＢＤは野生型ヒトＥＲ−ＨＢＤの部位特異的突然変異誘発によって得られた。Ｇ５２１Ｒ ＥＲ−ＨＢＤを含有しているプラスミドをＰＣＲ増幅用鋳型として適当なプライマーと共に使用して、Ｇ５２１Ｒ ＥＲ−ＨＢＤを含有しているフラグメントを作製し、５′端を制限酵素ＥｃｏＲＶ、３′端を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、（ＨＮＦ−１ ＤＢＤの３′端及びＧ５２１Ｒ ＥＲ−ＨＢＤの５′端に局在する）ＥｃｏＲＶ部位の処でＨＮＦ−１ ＤＢＤとフレーム内にクローニングした。最後に、翻訳終結コドンを含むｐ６５活性ドメインをプラスミドｐＧＳ１１５８（Ａｂｒｕｚｚｅｓｅら，１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１４９９−１５０７）からＥｃｏＲＩフラグメントとして取出し、ＨＢＤの３′に局在するＥｃｏＲＩ部位でＧ５２１Ｒ ＨＢＤとフレーム内に導入した。
【０１４５】
ＨＮＦ１反応性プロモーターは、最小プロモーター要素の上流にクローニングされたマルチマー化ＨＮＦ１結合部位から構成されていた。この特定実施例で該プロモーターは、ラットアルブミンプロモーターに由来のＨＮＦ１結合部位の７個のタンデム反復配列とＣ反応性タンパク質の最小プロモーター要素とから構成されていた。このＨＮＦ１反応性プロモーターの構築は文献（Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９０，ＥＭＢＯ Ｊ．，９，４４６７−４４７５）に記載されている。
【０１４６】
ｍＥｐｏコーディング領域は、文献（Ｒｉｚｚｕｔｏら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６４１７−６４２２；Ｍａｉｏｎｅら，２０００，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：８５９−８６８）に記載の手順で合成オリゴヌクレオチドから組立てた。ｍＥｐｏ ｃＤＮＡをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（Ｍａｉｏｎｅら，２０００，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：８５９−８６８）のポリリンカーのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ｐｃＤＮＡ２ベクターのヌクレオチド９８３−１２４９に由来のウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化配列（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＶ Ｌｅｅｋ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をｍＥｐｏ ｃＤＮＡの３′のＸｂａＩ−ＮｏｔＩ部位にクローニングして、ポリアデニル化シグナルを形成した。このプラスミドをｐＢＳＫＳ／ｍＥｐｏ−ｐｏｌｙＡと命名した。ＨＮＦ−１反応性プロモーターをプラスミド７ｘＨＮＦ−１／ＣＲＰ−ＣＡＴ（Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９０，ＥＭＢＯ Ｊ．，９，４４６７−４４７５）から（クレノウで埋め戻した）５′−ＥｃｏＲＩ及び３′−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして切り出し、５′を（クレノウで埋め戻した）制限酵素ＳａｌＩ及び３′を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって予め消化したプラスミドｐＢＳＫＳ／ｍＥｐｏ−ｐｏｌｙＡのｍＥｐｏ遺伝子の上流にクローニングした。このプラスミドをｐＢＳ／７ｘＢ１／ｍＥｐｏ−ｐｏｌｙＡと命名した。ＨＮＦ−１反応性プロモーターとｍＥｐｏ ｃＤＮＡとｂＧＨポリアデニル化配列とを含むカセットをプラスミドｐＢＳ／７ｘＢ１／ｍＥｐｏ−ｐｏｌｙＡから（Ｔ４エキソヌクレアーゼによって粘着末端にした）５′−ＫｐｎＩ及び３′−ＮｏｔＩフラグメントとして切り出し、プラスミドｐＶｉＪ／ＰＬのＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩ部位に挿入し、このようにしてプラスミドｐＶｉＪ／７ｘＢ１／ｍＥｐｏ−ｐｏｌｙＡを作製した。これはまたプラスミドｍＥｐｏ−１とも呼ばれる。プラスミドｐＶｉＪ／ＰＬはプラスミドｐＶｉＪｎｓＡの誘導体であり（Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙ Ｄ．ら，１９９３，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２，７７７−７８３）であり、プラスミドｐＶｉＪｎｓＡ中に最初に存在したＣＭＶエンハンサー−プロモーター要素及びイントロンＡがポリリンカー配列によって置換されている。
【０１４７】
実施例２
ＨＥＡ−１活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ＨＥＡ−１活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験（図４）
エストラジオール（Ｅ２）、タモキシフェン（ＴＡＭ）または４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）で処理するかまたは非処理の内在性ＨＮＦ−１（Ｔｏｎｉａｔｔｉ Ｃ．ら，１９９０，ＥＭＢＯ Ｊ．，９，４４６７−４４７５）を含有しないＨｅＬａ細胞中のトランスフェクションによってＨＥＡ−１を試験した。ＨｅＬａ細胞を１０％のウシ胎仔血清とグルタミン及び抗生物質を補給したダルベッコの改質イーグル培地で５％ＣＯ２中、３７℃で増殖させた。トランスフェクション実験のために、３×１０５の細胞を６０ｍｍ径の皿に播種した。２０時間後、これらの細胞を０．５μｇのＣＭＶ／ＨＥＡ−１発現ベクター及び４．５μｇのｍＥｐｏ−１リポーター遺伝子と共にコトランスフェクトした。トランスフェクションはリン酸カルシウム法（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）を使用して行った。１５時間後、細胞を洗浄し、Ｅ２またはＴＡＭまたは４−ＯＨＴを種々の濃度で培養培地に加えた。３６時間後、培養培地を収集し、培養培地に分泌されたｍＥｐｏタンパク質を、ｍＥｐｏと交差反応性のヒトＥｐｏ用の市販のＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、既知量の組換えｍＥｐｏ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を標準対照として測定した（Ｒｉｚｚｕｔｏら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６４１７−６４２２）。結果（図４）は、ＨＥＡ−１が４−ＯＨＴに顕著に感受性であり、Ｅ２による活性化は極めて弱いことを示した。従って、融合に関連してＬＢＤは予測された結合特性を保持していた。
【０１４８】
実施例３
ＨＥＡ−１活性のｉｎ ｖｉｖｏ試験
マウスの筋肉に、１μｇのＨＥＡ−１発現ベクターＣＭＶ／ＨＥＡ−１と、ＨＮＦ１結合部位の７個のタンデム反復配列の下流にクローニングされたｍＥｐｏ ｃＤＮＡ（プラスミドｍＥｐｏ−１）を含む５μｇのリポータープラスミドとを電気注入した。Ｒｉｚｚｕｔｏら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６４１７−６４２２に詳細に記載された電気注入技術を使用し、７週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスの大腿四頭筋に予め指定された量のＤＮＡを電気注入した。
【０１４９】
電気注入したマウスを１日あたり５．６ｍｇ／ＫｇのＴＡＭの経口投与によって処理したグループと非処理グループとに分けた（各グループ４匹）。Ｈｃｔレベル及び血漿ｍＥｐｏレベルを１４日後にモニターした。ＴＡＭによって活性化されたｍＥｐｏ遺伝子の転写活性化はマウス体内のＨｃｔを増加させる。
【０１５０】
結果を図５に示す。１日あたり５．６ｍｇ／ＫｇのＴＡＭの経口投与によって処理したマウスの体内でのみ顕著なＨｃｔ増加が観察された。注入したＤＮＡの量ではリーク性（即ち、ＴＡＭ非依存性Ｈｃｔ増加）は全く観察されなかった。
【０１５１】
これは、（１）ＨＮＦ−１反応性プロモーターが独占的にリガンド活性化ＨＥＡ−１転写因子によって刺激されること、及び、（２）ＮＨＦ−１反応性プロモーターがＨＮＦ−１以外の内在性転写因子によって活性化されないこと、を示す。
【０１５２】
実施例４
ＨＥＡ−３及びＨＥＡ−４の構築及びｉｎ ｖｉｖｏ試験
ＨＥＡ−１は受容体のアミノ酸３０３−５９５に及ぶＥＲ−ＨＢＤに関連したＧ５２１Ｒ突然変異体を含んでいる。ＥＲ−αのＤ領域に含まれているアミノ酸残基（図１）が付加された別の構築物を作製した。
【０１５３】
アミノ酸２８２−５９５に及ぶＥＲ−ＨＢＤに関連したＧ５２１Ｒ突然変異体を含むＨＥＡ−３、及び、アミノ酸２５２−５９５に及ぶＨＢＤ中に同じ突然変異を有しているＨＥＡ−４を構築した。これらの突然変異体をコードするｃＤＮＡは実施例１のＨＥＡ−１に関して記載した手順と同じ手順で構築した。
【０１５４】
ＨＥＡ−３のｃＤＮＡ及びＨＥＡ−４のｃＤＮＡを個別に、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター要素及びイントロンＡ配列の下流でプラスミドｐＶ１ＪｎｓＡにクローニングし、このようにして発現ベクターｐＣＭＶ／ＨＥＡ−３及びｐＣＭＶ／ＨＥＡ−４を作製した。この場合にも、ｐＣＭＶ／ＨＥＡ−１の構築（実施例１）の場合と同じ戦略を使用した。
【０１５５】
次に、ＨＥＡ−３及びＨＥＡ−４を実施例２に記載したようにＨｅＬａ細胞中でｉｎ ｖｉｔｒｏ試験した。トランスフェクトした細胞をエストラジオール（Ｅ２）及び４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）で処理したグループと非処理のグループとに分けた。図７に示す結果は、ＨＥＡ−３のほうが４−ＯＨＴに対する感受性が若干強いこと、及び、ＨＥＡ−１及びＨＥＡ−４に比べてより高い最大活性を有していることを示した。
【０１５６】
次に、ＨＥＡ−１に関して実施例３に記載した手順と全く同様の手順でＨＥＡ−３をｉｎ ｖｉｖｏ試験した。マウスの筋肉に１μｇのｐＣＭＶ／ＨＥＡ−３と１μｇのＥｐｏリポータープラスミドとを電気注入した。電気注入技術（実施例３参照）を使用し、７週齢の雌のＢａｌｃ／ｃマウスの大腿四頭筋に予め指定された量のＤＮＡ（図８参照）を電気注入した。電気注入したマウスを、１ｍｇ／ｋｇのＴＡＭを５日／週の割合で経口投与した処理グループと非処理グループとに分けた（各グループ４匹のマウス）。Ｈｃｔレベル及び血漿Ｅｐｏレベルを２週毎にモニターした。結果を図８に示す。図８の結果は、注入の１４、２８、１００、１４０及び１８０日後のマウスのＨｃｔレベル及びＥｐｏレベルの測定値を示す。注目すべきは、処理マウスが注入の２４０日後までＨｃＴレベルの顕著な増加及びｍＥｐｏレベルの有意な上昇を示したことである。これはトランスアクチベータがマウス体内で免疫原性でないことを表す。非処理のマウスではＨｃｔ増加が全く検出されなかった。
【０１５７】
次に、ＴＡＭを除去したときのＴＡＭ依存性誘発の可逆性を試験した。８匹の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢）に１μｇのｐＣＭＶ／ＨＥＡ−３及び１μｇの上述のＥｐｏリポータープラスミドを電気注入した。次にマウスをＴＡＭ（１ｍｇ／ｋｇ、経口、５日／週）によって１４日間処理した。血清Ｅｐｏ及びＨｃｔは予想通りに増加した。ＴＡＭ処理が存在しないとき、Ｈｃｔはマウス体内の既知の赤血球半減期に適合する速度で基底レベルに戻った。これらの動物に再度ＴＡＭを抗原投与すると、ヘマトクリットは高いレベルを回復した。これは、リガンドに対する反応性が経時的に維持されることを証明する。
【０１５８】
本明細書に引用した全部の文献は参照によって本文中に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
エストロゲン受容体αの構造の概略図である。
【図２】
４−ＯＨＴ依存性転写因子ＨＥＡ−１の構造の概略図である。
【図３】
ＨＥＡ−１の転写特性を試験するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで使用されるリポーターｍＥｐｏ１遺伝子の構造の概略図である。
【図４】
ｍＥｐｏの産生によって測定したＨＥＡ−１の４−ＯＨＴ、ＴＡＭ及びＥ２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏの反応性を表す。
【図５】
マウスにＨＥＡ−１及びｍＥｐｏ−１を使用することによって得られたｉｎ ｖｉｖｏの結果を表す。
【図６】
構築物ＨＥＡ−３及びＨＥＡ−４の構造の概略図である。
【図７】
ＨＥＡ−１、ＨＥＡ−３及びＨＥＡ−４の４−ＯＨＴ及びＥ２に対する反応性を証明するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を表す。
【図８】
ＨＥＡ−３を使用して調節期間を証明するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を、ヘマトクリット（％）を時間（日）の関数としてプロットしたグラフで表す。
【図９】
誘導の可逆性を証明するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を表す。ｍＥｐｏ−１／ＨＥＡ−３（１μｇ／１μｇ）：ｗ／及びｗ／ｏＴＡＭ（１ｍｇ／ｋｇ）の場合のヘマトクリット（％）を時間（日）の関数としてプロットする。
Claims (40)
- ＤＮＡ結合ドメインと、転写アクチベータまたは転写リプレッサードメインと、場合によっては転写因子によるリガンド依存性ＤＮＡ結合及び／または転写活性化もしくは転写抑制の調節ドメインとを含み、転写アクチベータまたは転写リプレッサーとして作用する転写因子であって、
前記転写因子が、ＨＮＥ１ポリペプチドＤＮＡ結合ドメインと、異なるポリペプチドの転写アクチベータまたは転写リプレッサードメインとを含むキメラ因子であり、
但し、転写因子が転写アクチベータドメインを含む転写アクチベータであるときは、前記転写因子が、アシルＨＳＬまたはその類似体に結合しアシルＨＳＬ結合によってＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合機能を活性化するような調節ドメインを含まないことを特徴とする転写因子。 - ヒトＨＮＦ１ ＤＮＡ結合ドメインとヒト転写アクチベータまたは転写リプレッサードメインと、場合によってはヒト調節ドメインとを含むことを特徴とする請求項１に記載の転写因子。
- 転写アクチベータまたは転写リプレッサードメインとＤＮＡ結合ドメインとが融合タンパク質の内部に含まれており、前記融合タンパク質が場合によっては前記調節ドメインを含んでいることを特徴とする請求項１または２に記載の転写因子。
- ＤＮＡ結合ドメインと調節ドメインとが融合タンパク質の内部に含まれており、前記融合タンパク質が転写アクチベータまたは転写リプレッサードメインと会合して転写因子を形成していることを特徴とする請求項１または２に記載の転写因子。
- ＨＮＦ１ポリペプチドＤＮＡ結合ドメインがヒトＨＮＦ１の残基１−２８２またはこれらの残基の内部に包含されているＤＮＡ結合部分を含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の転写因子。
- ＨＮＦ１ポリペプチドＤＮＡ結合ドメインがヒトｖＨＮＦ１Ａの残基１−３１４またはこれらの残基の内部に包含されているＤＮＡ結合部分を含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の転写因子。
- ＨＮＦ１ポリペプチドＤＮＡ結合ドメインがｖＨＮＦ１Ｂの残基１−２８９またはこれらの残基の内部に包含されているＤＮＡ結合部分を含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の転写因子。
- リガンド依存性調節ドメインを含むことを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の転写因子。
- リガンド依存性調節ドメインがＧ５２１Ｒ突然変異体を有しているヒトエストロゲン受容体α調節ドメインであることを特徴とする請求項８に記載の転写因子。
- Ｇ５２１Ｒ突然変異体を有しているヒトエストロゲン受容体のアミノ酸３０５−５９５を含むことを特徴とする請求項９に記載の転写因子。
- Ｇ５２１Ｒ突然変異体を有しているヒトエストロゲン受容体のアミノ酸２８２−５９５を含むことを特徴とする請求項１０に記載の転写因子。
- Ｇ５２１Ｒ突然変異体を有しているヒトエストロゲン受容体のアミノ酸２５２−５９５を含むことを特徴とする請求項１１に記載の転写因子。
- 転写アクチベータドメインを含む転写アクチベータであることを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載の転写因子。
- 転写アクチベータドメインに融合したＨＮＦ１ポリペプチドＤＮＡ結合ドメインを含むことを特徴とする請求項１３に記載の転写因子。
- 転写アクチベータドメインがヒトｐ６５タンパク質アクチベータドメインから成ることを特徴とする請求項１３または１４に記載の転写因子。
- 転写アクチベータドメインがヒトｐ６５の残基２８３−５５１またはこれらの残基の内部に包含されている転写活性化部分から成ることを特徴とする請求項１５に記載の転写因子。
- １つまたは複数の他のポリペプチド成分を含むことを特徴とする請求項１から１６のいずれか一項に記載の転写因子。
- 核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むことを特徴とする請求項１７に記載の転写因子。
- 請求項１から１８のいずれか一項に記載の転写因子をコードする核酸。
- 転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインと、転写アクチベータまたは転写リプレッサードメインと、リガンド依存性ＤＮＡ結合及び／または転写因子による転写活性化もしくは転写抑制の調節ドメインを含む融合タンパク質であることを特徴とする請求項１９に記載の核酸。
- 請求項１９または２０に記載の核酸を含む核酸ベクター。
- 転写因子をコードする核酸が転写因子の発現調節配列に制御されていることを特徴とする請求項２１に記載の核酸ベクター。
- 請求項２２に記載の核酸ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項２３に記載の宿主細胞を転写因子の産生条件下で培養する段階を含む転写因子の製造方法。
- 請求項１から１８のいずれか一項に記載の転写因子を標的ヌクレオチド配列に作動的に連結されたオペレーター配列に結合させる段階を含む転写の促進または抑制方法。
- 転写因子がリガンド依存性ＤＮＡ結合及び／または転写因子による転写の活性化もしくは抑制の調節ドメインを含んでおり、前記結合が宿主細胞内で発生する請求項２５に記載の方法において、転写因子とオペレーター配列との結合を活性化するために調節ドメインのリガンドによって宿主細胞を処理する段階を含むことを特徴とする方法。
- 前記宿主細胞をリガンド含有培地中でｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することを特徴とする請求項２６に記載の方法。
- 標的ヌクレオチド配列がポリペプチド産物をコードしていることを特徴とする請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが標的ヌクレオチド配列から発現によって産生され、更に、ポリペプチド産物を単離及び／または精製する段階を含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
- ポリペプチド産物が少なくとも１つの他の成分を含む組成物の形態に製剤化されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
- 標的ヌクレオチド配列が転写によってアンチセンス配列を生じさせることを特徴とする請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
- 標的ヌクレオチド配列が転写によってリボザイムを生じさせることを特徴とする請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
- （ｉ）請求項１から１８のいずれか一項に記載の転写因子または前記転写因子をコードする第一核酸と、
（ｉｉ）転写されるべき標的ヌクレオチド配列をＨＮＦ１結合部位を含むＨＮＦ１依存性プロモーターに作動的に連結された状態で含む第二核酸と、
から成る組成物。 - 前記第一核酸を含むことを特徴とする請求項３３に記載の組成物。
- 前記第一核酸が、転写アクチベータまたは転写リプレッサードメインとＤＮＡ結合ドメインとを含む融合タンパク質をコードしており、前記融合タンパク質が場合によっては前記調節ドメインを含むことを特徴とする請求項３４に記載の組成物。
- 前記第一核酸が、ＤＮＡ結合ドメインと調節ドメインとを含む融合タンパク質をコードしており、前記融合タンパク質が転写アクチベータまたは転写リプレッサードメインと会合して転写因子を形成することを特徴とする請求項３４に記載の組成物。
- 前記第一核酸が、（ｉ）前記ＤＮＡ結合ドメインと調節ドメインとを含む融合タンパク質、及び、（ｉｉ）転写因子を形成するために融合タンパク質と会合するポリペプチド、をそれぞれコードする個別配列を含むことを特徴とする請求項３６に記載の組成物。
- 前記個別配列が別々の核酸分子の内部に存在することを特徴とする請求項３７に記載の組成物。
- 前記第一及び第二の核酸が別々の分子であることを特徴とする請求項３４から３８のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項３３から３９のいずれか一項の組成物を含む宿主細胞。
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