JP2003515314A - 新規の、ｔｅｔリプレッサーに基づく転写調節タンパク質 - Google Patents

新規の、ｔｅｔリプレッサーに基づく転写調節タンパク質

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、テトラサイクリン制御トランス活性化因子タンパク質と逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子タンパク質の両方を含む1群のトランス活性化因子融合タンパク質を提供する。これらのトランス活性化因子は、ドキサイクリンの不在下での改変基礎転写活性、ドキサイクリンの存在下での改変誘導転写活性、又はテトラサイクリン又はその類似体による差次的誘導などの新規表現型を有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 TTn10にコード化されたTetリプレッサー(TetR)タンパク質は、テトラサイクリ
ン(Tc)に依存する態様では、グラム陰性菌、例えば大腸菌(Escherichia coli)の
テトラサイクリン耐性遺伝子の発現を調節する(Hillen & Berens、1994に評価さ
れている)。Tcの不在下では、TetRタンパク質の二量体はオペレーター配列(tetO
)に結合して、テトラサイクリン耐性遺伝子(tetA)の発現を抑制する。誘導物質T
cが細胞内に入り、TetRと結合すると、tetOの親和性が減少し、TetRがtetOから
単離して、tetAが発現する。TetR-[Mg-Tc]+複合体(Hinrichs et al., 1994；Kis
ker et al., 1995)と遊離TetR(Orth et al., 1998)の結晶構造、非誘発性TetR突
然変異体の解析(Muller et al., 1995)から、Tcの結合はTetRのコンフォメーシ
ョン変化を誘導することを暗示している。TetRの二量体化は4本らせん束によっ
て媒介され、二量体化の特異性を決定する残基はすでに特定されている(Schnapp
inger et al., 1998)。これによって、ヘテロ二量体化できないTetRに基づく調
節因子が導かれる。
【０００２】 哺乳動物(Bossen & Bujard 1992)、植物(Weinmann et al., 1994;Zeidler et
al., 1996)、及び両生類(Camacho-Vanegas et al., 1998)由来の各種細胞系、な
らびに真菌(Gari et al., 1997)、植物(Weinmann et al., 1994)、Drosophila(B
ello et al., 1998)、マウス(Kistner et al., 1996；Efrat et al., 1995；Ewa
ld et al., 1996)、及びラット(Fishman et al., 1994；Harding et al., 1998)
などあらゆる生物においてテトラサイクリン依存モードで適正に変更された遺伝
子(Gossen et al., 1995)の誘導性発現を可能にする、TetRベースの転写活性化
因子が開発された。
【０００３】 テトラサイクリン制御トランス活性化因子(tTA)は、TetRと転写活性化因子の
適切なドメインとの融合である。1つの上述のような融合タンパク質において、
単純ヘルペス(Herpes simplex)ウイルスタンパク質16(VP16)の主要部分が、DNA
レベルでTetRに融合された。なおまた、最低活性化ドメインの各種組合わせをTe
tRのC末端に結合させた結果から、他のtTA'sも段階的な転写活性化促進の可能性
を実証している。(Baron et al., 1997)。これらのキメラ「テトラサイクリン制
御トランス活性化因子」(tTA)によって、最小プロモーター-tetO融合(Ptet)の下
流にある、遺伝子の発現を調節できる。Tcの不在下ではPtetが活性化されるのに
対して、抗生物質の存在下ではPtetの活性化が阻害される。
【０００４】 「逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子」(rtTA)が開発された。この因
子は、ドキシサイクリン(Dox)又はアンヒドロテトラサイクリン(ATc)などのテト
ラサイクリン誘導体のある程度の存在下では、オペレーターDNAだけを結合し、
このためDoxを追加した時にPtetを活性化する因子である(Gossen et al., 1995)
。tTA及びrtTAの両方とも各種系の遺伝子発現を調節するために広く使用されて
いる(レビューにはFreundlieb et al., 1997参照)。
【０００５】 Tet系は、学術及び産業の研究分野、並びに高スループットのスクリーニング
及び発酵などの技術工程でも広範に使用されているが、トランス活性化因子の特
異的特性、及び誘発エフェクター物質に起因して、いくつかの分野でこれらの使
用の妨げとなる限界が存在する。これらの限界では、特に次のような点が問題に
なる。 ・ 誘導物質の不在下におけるtetO配列に対するrtTAの残存親和性 ・ Doxに対するrtTAの感受性が比較的低いこと ・ rTAとrtTAの異なるドメイン間の相互依存。これはトランス活性化因子/オペ
レーターの相互作用の特異性に影響することがある。 ・ 異なる真核系におけるrTAとrtTAの安定性 ・ rTA/rtTA機能の最適温度範囲が比較的狭いこと ・ いくつかの最良エフェクター分子の抗菌性 ・ テトラサイクリン系の物質に対するエフェクターの限界
【０００６】 例えば、上述の知られたrtTAは、ドキシサイクリン(Dox)不在下にtetOに対す
る残存親和性を保持する。このため、rtTA応答プロモーターの内因性基礎活性を
導くことがあり、実際に哺乳動物細胞系統ならびにS.クレビジエ(S.cerevisiae)
において、転写の基礎レベルの増加が観察されている。S.クレビジエ(S.cerevis
iae)においてrTA及びrtTAを使用した、Tc制御による発現が公開されている(Gall
ego et al., 1997；Gan et al., 1997；Belli et al., 1998a；Belli et al., 1
998b；Nagahashi et al., 1998；Nakayama et al., 1998；Colomina et al., 19
98)。tTAを用いた遺伝子調節はすでに達成されており、lacZの高発現及び低基礎
活性が示されている(Bari et al., 1997)。これに対して、rtTAは、遺伝子発現
の明らかな誘導が示されておらず、基礎発現が極端に高いため、Tcに応答する発
現を調節しなかった。このため、リプレッサーを調節して、その基礎発現を下げ
るためにさらに追加して導入した(Belli et al., 1998)。これまでのところ、S.
クレビジエ(S.cerevisiae)において唯一このデュアル制御系だけが相応の誘発因
子を産生した。加えて、Doxのレベルが比較的高い場合に限り、既知のrtTAが十
分に誘導される。
【０００７】 その上、トランスジェニック(tg)マウス、デュロソフィラ・メラノガスター(D
rosophila melanogaster)のB細胞を含むいくつかの系、及び植物では、活性rtTA
タンパクが合成されないことが明らかである。これは、RNA又はタンパク質のレ
ベル、或いはこの両レベルの不安性のためであるかどうかは全く明らかでない。
【０００８】 既知のトランス活性化因子は、またむしろ狭い最適温度範囲を呈する。哺乳動
物系では、これは特別問題にならない。対照的に、Tet調節を植物に応用するに
は、トランス活性化因子の温度許容度を拡張する必要がある。
【０００９】 これまで、TetR変異体を生産する最も効率的な方法は、ランダム又は指定突然
変異誘発、それ以後の大腸菌のTetR機能に依存したスクリーニング手順に基づい
ていた(Helbl & Hillen, 1998；Helbl et al., 1998；Muller et al., 1995；He
cht et al., 1993；Wissmann et al., 1991)。この後、この方法で特定されたTe
tR変異体が、真核系で特性を試験した、tTA又はrtTA(あるいはこの両方)融合タ
ンパク質に変換された。頻繁に、大腸菌で特定されたTetR変異体の特性が、真核
細胞中の対応するtTA又はrtTAの特性と相関していないような場合があろう。こ
の矛盾の主因は、(a) TetR変異体とアクチベータードメインの融合、又は突然変
異の導入、例えば逆表現型を付与する突然変異が、個別のTetR変異体の機能全体
に悪影響する可能性がある、(b) 安定性のようなtTA/rtTAの特性又はオペレータ
ー配列との相互作用が、大腸菌系と各種の真核系との細胞環境の相違による影響
を受けた、(c) テトラサイクリン及びその誘導体の多くは、本来タンパク質生合
成を抑制するように作用する原核生物には有毒があり、そのため、スクリーニン
グ手順がエフェクター分子の亜致死濃度までに限定されることなどが考えられる
。これに対して、テトラサイクリンは、真核細胞ではこれより高い濃度でも許容
される。
【００１０】 従って、Tetリプレッサーの有用な配列範囲を十分に試験する必要がある。最
終的には、ランダム、半ランダム、指定突然変異誘発によって生産された候補の
大きなプールの中から、tTA及びrtTAの新規変異体を高速かつ効率的に特定でき
るスクリーニング方法を開発することが望ましい。
【００１１】 各種真核系においてtTA及びrtTAの変異体を最適に応用するには、定義したタ
スクに特別に適応させた、トランス活性化因子の開発が必要である。従って、酵
母菌又はその他真菌のような真核生物で直接tTA/rtTA表現型を特定できるスクリ
ーニングシステムは、次のような理由から、現在のスクリーニング技術より大幅
に改善できるであろう。 ・ 特定された表現型は、真核系における転写活性化融合タンパク質(活性化ドメ
インに融合されたTetR)の特性を直接反映する。 ・ 全トランス活性化因子をコード化している遺伝子全体に突然変異誘発が生じ
ることがある。 ・ 活性化ドメイン内での突然変異が解析に含まれることがある。 ・ 酵母菌系又はその他真菌系を使用すると、大腸菌で得られた効率に匹敵する
スクリーニング効率が結果的に得られるであろう。
【００１２】 発明の概要 ある態様において、本発明は、ドキシサイクリン又はその類似体の不在化では
、改変した基礎転写活性を有する逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子(r
tTA)タンパク質の配列変異体を含む、単離ポリペプチドを提供する。別の態様に
おいて、本発明は、ドキシサイクリン又はその類似体存在下では、改変した誘導
転写活性を有するrtTAタンパク質の配列変異体を含む単離ポリペプチドを提供す
る。
【００１３】 ある実施例において、本発明は、DNA結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ
酸突然変異を有するrtTAタンパク質含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施
例において、前記のDNA結合ドメインは、SEQ ID NO:23のアミノ酸1〜45個を含む
。好適な実施例においては、前記の突然変異は、S12G、E19G、及びT26Aから成る
グループから選択される。また別の好適な実施例においては、ドキシサイクリン
又はその類似体の不在下では、前記の突然変異によりTetオペレーターに対する
基礎親和性が改変される。また別の好実施例において、本発明は、テトラサイク
リン結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有するrtTAタンパク
質を含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施例においては、本発明は、テト
ラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有するrtTA
タンパク質を含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施例において、前記のテ
トラサイクリン結合ドメインは、SEQ ID NO:23のアミノ酸46〜207個を含む。好
適な実施例においては、前記の突然変異は、A56P、R87S 、欠失88、D95G、G96R
、V99E、D148E、H179R、及びE204Kから成るグループから選択される。また別の
好適な実施例においては、前記の突然変異により、ドキシサイクリン又はその類
似体に対する感受性が改変される。
【００１４】 本発明は、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列に少なくとも50%相同を有するアミノ
酸配列を含むrtTAタンパク質を含む、単離ポリペプチド(この場合、ポリペプチ
ドは前記のDNA結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有する)を
提供する。ある実施例において、本発明は、ID NO:23のアミノ酸配列に少なくと
も50%相同を有するアミノ酸配列を含むrtTAタンパク質を含む単離ポリペプチド(
この場合、ポリペプチドは前記のテトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも
1つのアミノ酸突然変異を有する)を提供する。
【００１５】 別の態様において、本発明は、テトラサイクリン又はその類似体による差次的
調節を表示するテトラサイクリン制御トランス活性化因子(tTA)タンパク質の配
列変異体を含む、単離ポリペプチドを提供する。ある実施例において、本発明は
、テトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有す
るtTAタンパク質を含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施例において、前
記のテトラサイクリン結合ドメインは、SEQ ID NO:25のアミノ酸46〜207個を含
む。好適な実施例において、前記の突然変異は、A56V、F78S、S85G、S85R、Y110
C、L113H、Y132C、I164L、P167S、L170V、I174V、I174T、又はE183Kから成るグ
ループから選択される。また別の好適な実施例において、前記の突然変異は、テ
トラサイクリン又はその類似体に対する差次的感受性を付与する。別の実施例に
おいて、本発明は、DNA結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含
むtTAタンパク質を含む単離ポリペプチドである。ある実施例において、前記のD
NA結合ドメインは、SEQ ID NO:25のアミノ酸46〜207個を含む。
【００１６】 本発明は、ID NO:25のアミノ酸配列に少なくとも50%相同を有するアミノ酸配
列を含むtTAタンパク質を含む単離ポリペプチド(この場合、ポリペプチドは前記
のテトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有す
る)を提供する。
【００１７】 ある実施例において、本発明は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、1
9、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45を含むアミノ酸
配列を含む単離ポリペプチドを提供する。別の実施例において、本発明は、SEQ
ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、3
7、39、41、43、又は45を含むアミノ酸配列に少なくとも50%同一性を有する単離
ポリペプチドを提供する。
【００１８】 本発明の別の実施例では、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、
20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44を含む核酸配列によ
ってコード化された単離ポリペプチドを提供する。本発明の別の態様では、SEQ
ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34
、36、38、40、42、又は44に少なくとも50%同一性を有するポリヌクレオチドに
よってコード化された単離ポリペプチドを提供する。
【００１９】 ある態様において、本発明は、非相同アミノ酸配列に機能的に連結する発明の
ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
【００２０】 別の態様において、本発明は、以下から成るむグループから選択される単離多
核酸分子を提供する。 (a) SEQ ID NO:1、5、6、8、10、12、14、16、18、又は20のヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド (b) (a)のポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチド (c) (a)又は(b)のポリヌクレオチドに少なくとも50%同一性を有するポリヌク
レオチド (d) SEQ ID NO: 1、5、6、8、10、12、14、16、18、又は20のヌクレオチド配
列を含む核酸の少なくとも100の連続したヌクレオチドの断片を含むポリヌクレ
オチド (e) SEQ ID NO: 2、7、9、11、13、15、17、19、又は21のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド (f) SEQ ID NO: 2、7、9、11、13、15、17、19、又は21のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドの断片をコード化するポリヌクレオチド。この場合の断片は、SEQ
ID NO: 2、7、9、11、13、15、17、19、又は21のアミノ酸配列の少なくとも30の
連続したアミノ酸残基を含む。 (g) SEQ ID NO: 2、7、9、11、13、15、17、19、又は21のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドに少なくとも50%同一性を有するポリペプチドをコード化するポリ
ヌクレオチド (h) tetオペレーター由来の配列からの転写を調節することが可能なタンパク
質をコード化する(a)〜(g)の核酸に少なくとも50%同一性を有するポリヌクレオ
チド
【００２１】 別の態様において、本発明は、以下から成るグループから選択される単離多核
酸分子を提供する。 (a) SEQ ID NO:3、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44のヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチド (b) (a)のポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチド (c) (a)又は(b)のポリヌクレオチドに少なくとも50%同一性を有するポリヌク
レオチド (d) SEQ ID NO: 3、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44のヌクレオ
チド配列を含む核酸の少なくとも100の連続したヌクレオチドの断片を含むポリ
ヌクレオチド (e) SEQ ID NO: 4、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸
配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド (f) SEQ ID NO: 4、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸
配列を含むポリペプチドの断片をコード化するポリヌクレオチド。この場合、断
片はSEQ ID NO: 4、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配
列の少なくとも15の連続したアミノ酸残基を含む。 (g) SEQ ID NO: 4、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸
配列を含むポリペプチドに少なくとも50%同一性を有するポリペプチドをコード
化するポリヌクレオチド (h) tetオペレーター由来の配列から転写を調節することが可能なタンパク質
をコード化する(a)〜(g)の核酸に少なくとも50%同一性を有するポリヌクレオチ
【００２２】 また別の態様においては、本発明は、非相同ペプチドをコード化する核酸配列
に機能的に連結する発明のポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。
【００２３】 本発明のある態様では、本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。ある実
施例においては、前記のベクターは発現ベクターである。
【００２４】 本発明の別の態様では、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。
【００２５】 ある実施例において、本発明は、本発明の単離ポリペプチドを含む組換え細胞
を提供する。さらなる実施例において、本発明は、本発明の核酸分子を含む組換
え細胞を提供する。好実施例において、本発明は、本発明の発現ベクターを含む
組換え細胞を提供する。別の実施例において、前記の組換え細胞は、真核細胞、
原核細胞及びウイルスから成るグループから選択される。好適な実施例において
は、前記の組換え細胞は、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞、又は哺乳
動物細胞から成るグループから選択される。
【００２６】 本発明のある態様では、以下から成るグループから選択されたポリペプチドを
生産する方法を提供する。 (a) SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、27、29、31、33、35
、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配列を含むポリペプチド (b) SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、27、29、31、33、35
、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片。この場合
の断片は、SEQ ID NO: 4、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミ
ノ酸配列の少なくとも15の連続したアミノ酸残基を含む。 (c) SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、27、29、31、33、35
、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配列を含むポリペプチドの対立遺伝子変異
体。 上記の方法には、上記のポリペプチドが発現されるような条件下で、本発明の
ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含有する組
換え細胞の培養が含まれる。
【００２７】 本発明の別の態様では、細胞内のTetオペレーターと連結する遺伝子の転写を
調節するための方法を提供する。上記の方法は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、1
3、15、17、19、21、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸
配列を含む融合タンパク質をコード化する核酸分子を前記の細胞に導入し、さら
にその細胞と接触するテトラサイクリン又はその類似体の濃度を調製することか
ら成る。
【００２８】 本発明のさらなる態様では、細胞内のTetオペレーター由来の配列によって発
現を調節する遺伝子によってコード化されるタンパク質を生産するための方法を
提供する。上記の方法は、前記のタンパク質が生産されるように、SEQ ID NO2、
4、7、9、11、13、15、17、19、21、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又
は45のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコード化する核酸分子を細胞に導入
し、その細胞と接触するテトラサイクリン又はその類似体の濃度を調製すること
から成る。
【００２９】 また別の態様において、本発明は非ヒト・トランスジェニック生物を提供する
。本発明のある実施例では、非ヒト・トランスジェニック生物の細胞内のrtTAタ
ンパク質の発現に適した形質の本発明の核酸分子を含む導入遺伝子を含む非ヒト
・トランスジェニック生物である。本発明の別の態様では、非ヒト・トランスジ
ェニック生物の細胞内のtTAタンパク質の発現に適した形質の本発明の核酸分子
を含む導入遺伝子を含む非ヒト・トランスジェニック生物である。
【００３０】 本発明のある態様は、Tetオペレーターに連結する遺伝子の発現を調節するた
めの遺伝子治療も包含する。ある実施例において、遺伝子治療は、ドキシサイク
リン又はその配列変異体の不在時に基礎転写活性が低下する少なくとも1つのrtT
Aタンパク質から成るグループから選択されるタンパク質をコード化する第1核酸
分子、発現がTetオペレーター由来の配列によって調節される対象の遺伝子を含
む第2核酸分子、及びテトラサイクリン又はその類似体の治療的に有意な投与量
、から成る製薬組成物の供与で構成される。別の実施例において、遺伝子治療は
、ドキシサイクリン又はその配列変異体不在時に誘発転写活性が上昇する少なく
とも1つのrtTAタンパク質から成るグループから選択されるタンパク質をコード
化する最初の核酸分子、発現がTetオペレーター由来の配列によって調節される
対象の遺伝子を含む第2核酸分子、及びテトラサイクリン又はその類似体の治療
的に有意な投与量、から成る製薬組成物の供与で構成される。さらなる実施例に
おいて、遺伝子治療は、テトラサイクリン又はその類似体、或いはその配列変異
体により差次的に誘発された少なくとも1つのtTAタンパク質から成るグループか
ら選択されるタンパク質をコード化する第1核酸分子、発現がTetオペレーター由
来の配列によって調節される対象の遺伝子を含む第2核酸分子、及びテトラサイ
クリン又はその類似体の治療的に有意な投与量、から成る製薬組成物の投与で構
成される。
【００３１】 本発明は、Tetオペレーターに連結する遺伝子の発現を調節するための遺伝子
治療用組成物も提供する。ある実施例において、遺伝子治療の組成物は、ドキシ
サイクリン又はその配列変異体の不在時の基礎転写活性が低下する少なくとも1
つのrtTAタンパク質から成るグループから選択されるタンパク質をコード化する
遺伝子治療ベクター、発現がTetオペレーター由来の配列によって調節される対
象の遺伝子を含む第2遺伝子治療ベクター、及びテトラサイクリン又はその類似
体の治療的に有意な投与量、で構成される。別の実施例において、遺伝子治療の
組成物は、ドキシサイクリン又はその配列変異体の不在時に誘発転写活性が上昇
する少なくとも1つのrtTAタンパク質から成るグループから選択されるタンパク
質をコード化する遺伝子治療ベクター、発現がTetオペレーター由来の配列によ
って調節される対象の遺伝子を含む第2遺伝子治療ベクター、及びテトラサイク
リン又はその類似体の治療的に有意な投与量、で構成される。さらなる実施例に
おいて、遺伝子治療は、テトラサイクリン又はその類似体、あるいはその配列変
異体により差次的に誘発された少なくとも1つのtTAタンパク質から成るグループ
から選択されるタンパク質をコード化する遺伝子治療ベクター、発現がTetオペ
レーター由来の配列によって調節される対象の遺伝子を含む第2遺伝子治療ベク
ター、及びテトラサイクリン又はその類似体の治療的に有意な投与量、で構成さ
れる。
【００３２】 発明の詳細な説明 本発明は、テトラサイクリン制御トランス活性化因子タンパク質及び逆テトラ
サイクリン制御トランス活性化因子タンパク質の両方から成る、1群のトランス
活性化因子融合タンパク質を提供する。上述のトランス活性化因子は、ドキシサ
イクリンの不在時に基礎転写活性低下、ドキシサイクリンの存在時に誘導転写活
性上昇、又はテトラサイクリン及びテトラサイクリンの類似体による差次的誘導
などの、新規の表現型を有する。
【００３３】 本発明のある態様では、特定の突然変異又は改変が転写調節タンパク質の中に
導入される。別の態様では、多数の突然変異を転写調節タンパク質の中に導入す
るために、ランダム突然変異誘発技術は選択又はスクリーニングシステムと合わ
せて使用される。この後、前記のランダム突然変異した結果のタンパク質の集団
は、望ましい表現型についての選択か、又は望ましくない表現型を背景にして望
ましい表現型が観察できるスクリーンにかけられる。
【００３４】 前記の ランダム突然変異誘発に従って、本発明のある態様では、1分子全体を
突然変異誘発するか、若しくはカセット突然変異誘発によって処置することがで
きる。前例では、1分子のコーディング領域全体を、いくつかの方法(化学、PCR
、ドープ処理オリゴヌクレオチド合成)のどれかによって突然変異誘発させ、前
記のランダム突然変異した結果のタンパク質の集団を、選択又はスクリーニング
手順にかける。研究中の分子が比較的小さく、必然的に発生する突然変異の表現
型のクラス選別に強力で厳格な選択又はスクリーンを使用できる場合には、ラン
ダム突然変異誘発をこのような方式で応用することができる。
【００３５】 ランダム突然変異誘発は、以下を含む多くの手段によって達成されよう。 1. PCR突然変異誘発。この場合は、誤り傾性Taqポリメラーゼを利用して、転
写調節タンパク質の突然変異対立遺伝子を生成する。前記対立遺伝子のカップリ
ング能力を直接酵母菌で検定する。 2. 化学突然変異誘発。この場合は、転写調節タンパク質をコード化する発現
カセットを突然変異体に暴露し、そして突然変異配列のタンパク質産物のカップ
リング能力を直接酵母菌で検定する。 3. 転写調節タンパク質遺伝子の部分をコード化するオリゴヌクレオチドのド
ープ処理合成 4. in vivo突然変異誘発。この場合は、ランダム突然変異が、大腸菌の突然変
異誘発株XL1-Red (mutD5 mutS mutT) による培養(Stratagene, Menasa, WI)によ
って、転写調節タンパク質のコーディング領域に導入される。
【００３６】 転写調節タンパク質中の機能ドメインに対応する突然変異ペプチド配列の置換
によって、機能達成のための特定配列要件の判別が可能になる。
【００３７】 本発明の前記特定突然変異誘発の態様に従って、定義された構造決定子(即ち
、αらせん、βシート、回転、表面ループ)又は機能決定子(例えば、DNA結合決
定子、転写調節ドメイン)のどちらかに対応する、タンパク質の個別領域を、飽
和又は半ランダム突然変異誘発に暴露する。前記の突然変異誘発された結果のカ
セットを、それ以外の野生型対立遺伝子のコンテクストに再導入する。1分子の
領域に対応する特定機能を示唆するために役立つ実験的証拠があり、さらに対象
の突然変異体と非対象の突然変異体を区分するために役立つ選択又はスクリーニ
ング或いはこの両方の方法があるとき、カセット突然変異誘発は有用である。前
記の両親分子が比較的大きく、要望は分子の機能ドメイン地図を作成することで
あり、段階的に分子の突然変異誘発させる方式、即ちまず残基の1つの線状カセ
ットを突然変異させてから機能を検定する方式が用いられるときにも、カセット
突然変異誘発は有用である。
【００３８】 tTAをコード化する配列の突然変異誘発によって、異なるエフェクター分子と
差次的に相互作用するトランス活性化因子が簡単に特定できるようになる。例え
ば、突然変異誘発エフェクター結合ポケットの形成を担う配列部分だけに突然変
異誘発を限定することができる。このような特性を利用して、トランス活性化因
子とエフェクターの特定セットを用いて異なる遺伝子を制御することができる(B
aron et al., 1999参照)。エフェクター結合ポケットの修飾は、骨組織に沈着し
ないテトラサイクリンの検出のためのほぼ必須条件になっている。遺伝子治療に
は、人間の医療に使用されるテトラサイクリンに対して感受性のないトランス活
性化因子を使用すると有効であろう。
【００３９】 tTAに対して10〜30 ng/mlのDox濃度のフルエフェクター機能が、特にトランス
ジェニック動物が含まれる実験や遺伝子治療では非常に望ましい。従って、本発
明はDoxに対してより高い感受性をもつrtTA変異体のスクリーニングに対処する
。
【００４０】 さらに、rTA及びrtTAに対応する新しいエフェクター分子を特定できるかもしれ
ない。例えば、現在より低濃度でもrtTAを完全に誘導するエフェクター物質を特
定できる可能性がある。本発明に従ったスクリーニング方法を用いると、優れた
エフェクター特性と無視し得る抗菌性をもつ新しいエフェクターについて、高ス
ループット形式で優位に物質ライブラリーの試験を簡単に行うことができる。ス
クリーニング候補として次のようなものがある。 ・ 抗菌性がなくなったテトラサイクリン ・ 低濃度でrtTA転写促進を媒介するテトラサイクリン ・ 骨組織に沈着しないようなテトラサイクリン ・ 組織浸透性を向上させたテトラサイクリン ・ テトラサイクリンのアンタゴニスト ・ rTA又はrtTA或いはこの両方に対してエフェクターの役目をする非テトラサイ
クリン化合物。
【００４１】 同様に、DNA結合ドメイン内のrTA及びrtTAをコード化する配列の突然変異誘発
によって、テトラサイクリン又はその類似体の存在・不在に関係なくTetオペレ
ーター配列に対してより低い残存親和性を有するトランス活性化因子タンパク質
を簡単に同定できるであろう。tetリプレッサーに基づく転写調節タンパク質の
構造・機能解析によっても、温度許容範囲がより広い改良されたトランス活性化
因子を特定できそうである。
【００４２】 定義 発明の詳細の前に、本明細書、例及び請求項で使用されるいくつかの用語を参
考のために下記にまとめた。
【００４３】 「トランス活性化因子融合タンパク質の対立遺伝子変異体」という用語は、機
能及び非機能トランス活性化因子融合タンパク質を含むものとして意図されてい
る。機能対立遺伝子変異体は、転写を調節する能力を維持するトランス活性化因
子融合タンパク質のアミノ酸配列変異体である。非機能対立遺伝子変異体は、転
写を調節する能力をもたないトランス活性化因子融合タンパク質のアミノ酸配列
変異体である。
【００４４】 本書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブ
リン分子の免疫的活性部、即ちトランス活性化因子融合タンパク質のような抗原
を特異的に結合する(抗原と免疫反応する)抗原結合部位をもつ分子を含むものと
して意図されている。免疫グロブリン分子の免疫的活性部の例には、ペプシンの
ような酵素で抗体を処理すると生成できるF(ab)及びF(ab')2断片も含まれる。本
発明は、トランス活性化因子融合タンパク質を結合するポリクローナル及びモノ
クローナル抗体を提供する。本書で使用される、「モノクローナル抗体」又は「
モノクローナル抗体組成物」という用語は、トランス活性化因子融合タンパク質
の特定エピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を一種だけ含む抗体分子の集団
を指す。モノクローナル抗体組成物は、従って一般に抗体が免疫反応する特定の
トランス活性化因子融合タンパク質に対し単一結合親和性を呈示する。
【００４５】 本書で使用される、トランス活性化因子融合タンパク質の「生物学的活性部」
は、トランス活性化因子融合タンパク質の転写調節機能を実行するトランス活性
化因子融合タンパク質の断片を含むものとして意図されている。
【００４６】 本書で使用される、キメラトランス活性化因子融合タンパク質は、さらに非相
同ポリペプチドに機能的に連結するトランス活性化因子融合タンパク質ポリペプ
チドを含む。「トランス活性化因子融合タンパク質ポリペプチド」は、トランス
活性化因子融合タンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す
のに対し、「非相同ポリペプチド」はトランス活性化因子融合タンパク質に安定
的に相同でないタンパク質(例えば、トランス活性化因子融合タンパク質と異な
っても同一又は異なる生物由来のタンパク質)に対応するアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを指す。キメラトランス活性化因子融合タンパク質内では、前記の
トランス活性化因子融合タンパク質ポリペプチドはトランス活性化因子融合タン
パク質の全体又は部分に対応することができる。
【００４７】 「由来」という用語は、配列が別の配列と同一であるかその配列から修飾され
たことを意味するものとして意図されている。ポリペプチド又はタンパク質誘導
物は、アミノ酸配列に記述されているか又は既知である配列と異なるか、若しく
は配列に関わりない方式である(このどちらか或いは両方)ポリペプチド又はタン
パク質配列を含み、なおかつポリペプチド又はタンパク質の活性も保持している
。アミノ酸配列の誘導物は、単体又は複数のアミノ酸が、異種の天然アミノ酸、
アミノ酸誘導物、又は非天然アミノ酸と置換されるときに生成される。一部の実
施例においては、タンパク質誘導物には、単一又は複数の連続アミノ酸置換によ
って野生型配列と異なる配列をもつが、これらがタンパク質又はペプチドの二次
構造及び疎水性に与える作用は一般に最小限である、自然発生したポリペプチド
又はタンパク質、或いはこれらの生物学的活性断片が含まれる。誘導物には、ポ
リペプチド又はタンパク質の生物学的活性を完全に消失しない単一又は複数の非
連続アミノ酸置換、除去又は挿入によって異なる配列をもつものもある。
【００４８】 保存的置換(置換基)には、一般的に、1つのアミノ酸と同様の性質(例えば、電
荷、サイズ、形状、及びその他生物学的特性)をもつ別のアミノ酸との置換が含
まれる。例えば、バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシ
ン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレ
オニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシンなどのグループ
内での置換が含まれる。非極性(疎水)アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソ
ロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニ
ンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システ
イン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。正電荷をもつ(塩
基性)アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれる。負電荷
をもつ(酸性)アミノ酸には、アスパラギン酸とグルタミン酸が含まれる。
【００４９】 本発明の前記ポリペプチド及びタンパク質は、保存的又は非保存的のいずれか
で導入、除去及び置換などの各種変更によって修飾できる場合がある。この場合
、このような変更によってこれらの用途になんらかの利点が備わるであろう。
【００５０】 その他の実施例において、余り保存的でないアミノ酸置換による誘導物が、例
えば、電荷、コンフォメーション、その他の生物学的特性を変更させることによ
って、結果的に望ましい誘導物になる場合もある。このような置換には、例えば
、親水残基を疎水残基に置換、システイン又はプロリンを別の残基に置換、小さ
な側鎖をもつ残基を大きな側鎖をもつ残基に置換、或いは実効正電荷をもつ残基
を実効負電荷をもつ残基に置換、などが含まれよう。所定の置換の結果を確実に
予測できないとき、本書に開示されている方法に従って誘導物を検定して要望の
性質の有無を容易に判別できるかもしれない。
【００５１】 本発明の前記適用範囲内の誘導物にはポリヌクレオチド誘導物も含まれる。ポ
リヌクレオチド又は核酸の誘導物は、ヌクレオチド配列に記述されているか又は
既知である配列と異なる。例えば、ポリヌクレオチド誘導物は、単一又は複数の
ヌクレオチドの置換、挿入、又は除去によって特徴付けられる場合がある。
【００５２】 「DNA結合タンパク質」という用語は、遺伝子の調節配列内にある、特にコグ
ネートDNA配列と相互作用する任意のタンパク質又はその機能ドメイン、若しく
は応答配列を含むものとして意図されている。転写調節タンパク質のDNA結合ド
メインは、基本らせん・ループ・らせんドメイン、ロイシンジッパードメイン、
ジンクフィンガードメイン、及びらせん・回転・らせんドメイン/ホメオドメイ
ンを含む(ただし、これらドメインに限定されない)構造ファミリーに分類できる
。本発明の融合タンパク質には、DNA結合タンパク質、又はこれらの機能DNA結合
ドメインで構成されるポリペプチドが含まれる。そのコグネートDNA配列に対す
るDNA結合タンパク質の認識及び結合は、モジュレータ分子又はリガンドの結合
によって与えられたDNA結合タンパク質自体の中のコンフォメーションの変化に
よって調節できる。同様に、クロマチン内のコグネートDNA配列のコンフォメー
ション、例えばヌクレオソームに形成されたコンフォメーションは、DNA結合タ
ンパク質とそのコグネートDNA配列の結合にも影響する。
【００５３】 本書で使用される、「遺伝子」及び「組換え遺伝子」という用語は、トランス
活性化因子融合タンパク質をコード化するオープンリーディングのフレームが組
み込まれた核酸分子を含むものとして意図されている。
【００５４】 「遺伝子調節配列」又は「調節配列」という用語は、隣接遺伝子の転写を制御
するDNA配列を含むものとして意図されている。遺伝子調節配列には、転写を開
始するためRNAポリメラーゼを結合する転写開始部位に近接する遺伝子の5'領域
で見つけられるプロモーター配列が含まれるが、これに限定されはしない。遺伝
子調節配列には、プロモーターの利用を変調するため、プロモーターに関して任
意の位置でどちらか一方の方向に機能できるエンハンサー配列も含まれる。転写
制御配列には、プロモーター、エンハンサー、及びリプレッサーならびにアクチ
ベーター結合部位が含まれるが、これに限定されはしない。本発明の遺伝子調節
配列は、転写調節タンパク質に対応する結合部位を含有している。好適な実施例
においては、遺伝子調節配列はtetリプレッサータンパク質を結合するtetオペレ
ーター(tetO)由来の配列を含む。
【００５５】 本書で使用される「相同組換え生物」という用語は、遺伝子と、動物の細胞(
例えば胚細胞)内に導入されたDNA分子との相同組換えによって修飾された遺伝子
を含有する生物、例えば動物や植物を含むものとして意図されている。
【００５６】 「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は、本書では互換的に使用さ
れている。「宿主細胞」には、非相同DNAの導入によって修飾できる任意の培養
可能な細胞が含まれる。できれば、宿主細胞は、転写調節タンパク質が安定的に
発現でき、翻訳後に修飾でき、適切な細胞細部の区画を突き止めることができ、
さらに適正な転写機構を使用できるように作製できる細胞であることが望ましい
。適正な宿主細胞の選択は、検出シグナルの選択によっても影響される。例えば
、上述されているように、レポーター構成体は、転写調節タンパク質に応答して
遺伝子転写の促進又は抑制の際に選択可能又はスクリーニング可能な形質を提供
する。従って、最適の選択又はスクリーニングを実現するため、宿主細胞の表現
型が考慮される。このような用語は、特定の当該細胞だけでなく、このような細
胞の子孫又は潜在的子孫も指すものと理解されている。突然変異又は環境の影響
のため後続世代でなんらかの修飾が発生する場合があるので、後代が実際には親
細胞と同一でない場合があるが、それでも本書で使用される用語の前記適用範囲
内に含まれている。
【００５７】 本発明の宿主細胞には原核細胞と真核細胞が含まれる。原核細胞には、グラム
陰性菌又はグラム陽性菌、例えば大腸菌(E.Coli)又は桿菌(Bacilli)が含まれる
。形式転換に適した原核宿主細胞には、例えば、大腸菌(E.Coli)、枯草菌(Bacil
lus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、及び緑膿菌(Pseudo
monas)、ストレプトミセス(Streptomyces)、及びスタヒロコッカス［ブドウ球菌
］(Staphylococcus)属のその他多様な種が含まれる。真核細胞には、酵母菌、植
物細胞、真菌、昆虫細胞(例えばバキュロウイルス(baculovirus))、哺乳動物細
胞、及び寄生生物、例えばトリパノソーマ(trypanosomes)の細胞が含まれるが、
これに限定されはしない。
【００５８】 本書で使用される、「酵母」という用語は、厳密に分類学的な意味の酵母、即
ち単細胞生物だけでなく、糸状菌の酵母様の多細胞菌も含まれる。典型的な種に
は、クリュベレイ・ラクティス(Kluyverei lactis)、シゾサッカロミセス・ポン
ベ(Schizosaccharomyces pombe)、及びウスチラコ・マイデス(Ustilaqo maydis)
が含まれ、サッカロミセス・クレビシエ(Saccharomyces cerevisiae )も好適で
ある。本発明の実施に使用できるその他酵母として、ニューロスポラ・クラッサ
(Neurospora crassa)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペル
ギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)、ピキア・パストリス(Pichia pa
storis)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、及びハンセヌラ・ポ
リモルフ(Hansenula polymorpha)などがある。
【００５９】 哺乳動物の宿主細胞培養系には、Cos細胞、L細胞、3T3細胞、中国ハムスター
卵巣(CHO)細胞、胚幹細胞などの既成の細胞系統が含まれ、HeLa細胞も好適であ
る。
【００６０】 本書で使用される、「単離」又は「精製」タンパク質又はこれらの生物学的活
性部分は、細胞質又はトランス活性化因子融合タンパク質の由来細胞又は組織を
ソースとするその他の汚染タンパク質が実質的にないか、化学合成されたときに
化学的前駆物質又はその他化学物質が実質的にないタンパク質を含むものとして
意図されている。
【００６１】 「細胞質が実質的にない」という語は、タンパク質が単離されたか又は遺伝子
組換えで産生された起原の細胞の細胞構成体から分離されたトランス活性化因子
融合タンパク質作用因子を含むものとして意図されている。ある実施例において
は、前記のトランス活性化因子融合タンパク質又はその生物学的活性部分が遺伝
子組換えで産生されたとき、「細胞状物質が実質的にない」という語には、培養
基が実質的にないトランス活性化因子融合タンパク質作用因子が含まれる。培養
基が実質的にないとは、培養基約20％未満、もっと望ましいのは約10％未満、そ
して最も望ましいのは約5％未満を表す。
【００６２】 「化学的前駆物質又はその他化学物質が実質的にない」という語は、タンパク
質の合成に関わるなかの化学的前駆物質又はその他化学物質からタンパク質が分
離されたそのトランス活性化因子融合タンパク質作用因子を含むものとして意図
されている。ある実施例においては、「化学的前駆物質又はその他化学物質が実
質的にない」という語は、化学的前駆物質又は非トランス活性化因子融合タンパ
ク質化学物質を約30％未満(重量で)、もっと望ましいのは化学的前駆物質又は非
トランス活性化因子融合タンパク質化学物質を約20％未満、さらに化学的前駆物
質又は非トランス活性化因子融合タンパク質化学物質を約10％未満、そして最も
望ましいのは化学的前駆物質又は非トランス活性化因子融合タンパク質化学物質
を約5％未満含有するトランス活性化因子融合タンパク質作用因子が含まれる。
【００６３】 本書で使用される「最小活性化ドメイン」は、転写調節タンパク質の潜在トラ
ンス活性化因子で構成されるポリペプチド配列又は断片を含むものとして意図さ
れている。最小活性化ドメインをコード化するポリペプチドは自然発生するポリ
ペプチドであると言える。例えば、天然に存在するタンパク質内で見つかる場合
、又は自然発生するタンパク質内に存在しない組成物をもつポリペプチドである
場合がある。本発明との関連では、最小活性化ドメインは遺伝子転写を促進する
能力を非相同タンパク質に十分与えられるドメインである。好適な実施例におい
ては、最小活性化ドメインは、VP16の「酸性活性化ドメイン」で構成される12の
アミノ酸分節、残基436〜447個から由来する。
【００６４】 「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を改変させることなく、トランス活
性化因子融合タンパク質の野生型配列(即ち、SEQ ID NO:23又は25)から改変でで
きた残基を含むものとして意図されている。これに対し、「必須」アミノ酸残基
は生物学的活性に不可欠である。
【００６５】 本書で使用される「核酸分子」という用語は、DNA分子(例: cDNA)及びRNA分子
(例: mRNA)、及びヌクレオチド類似体を使用して生成されたDNA又はRNAの類似体
を含むものとして意図されている。核酸分子は一本鎖又は二本鎖のものがあるが
、できれば二本鎖DNAが望ましい。
【００６６】 「単離核酸分子」という用語は、他の核酸分子から分離され、かつ細胞質、又
は組換え技術によって産生されたときに培養基が実質的にないか、又は化学合成
されたときに化学的前駆物質又はその他化学物質が実質的にない核酸分子を含む
ものとして意図されている。
【００６７】 「機能的に連結する」は、ある分子の活性又は状態の変化が他の分子の活性又
は状態によって作用されるように分子が機能的に相互に連結されることを意味す
るものとして意図されている。調節配列が対象のポリペプチド又はタンパク質を
コード化するDNA配列と機能的に関連するとき、ヌクレオチド配列は機能的に連
結する。例えば、プロモーターヌクレオチド配列が対象のポリペプチド又はタン
パク質をコード化するDNA配列の転写を制御する場合は、プロモーターヌクレオ
チド配列は対象のポリペプチド又はタンパク質をコード化するDNA配列に機能的
に連結する。一般に、機能的に連結する2個のポリペプチドはペプチド結合によ
って共有結合している。
【００６８】 本書で使用される「真核細胞内で転写を活性化するポリペプチド」は、直接的
又は間接的のどちらかに転写を活性化するポリペプチドを含むものとして意図さ
れている。
【００６９】 本書で使用される、「逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子」即ち「rt
TA」は、活性化ドメインと機能的に連結する、いくつかのテトラサイクリン誘導
体、又はドキシサイクリン(Dox)又はアンヒドロテトラサイクリン(ATc)などの類
似体の存在下でのみオペレーターDNAを結合するTetR突然変異体で構成される融
合タンパク質を含むものとして意図されている。従って、rtTAタンパク質は、Do
xの付加時にPtetによって駆動された遺伝子発現を促進することになる(Gossen e
t al., 1995)。
【００７０】 「配列変異体」又は「変異対立遺伝子」という用語は野生型対立遺伝子に相対
する少なくとも1つの突然変異で構成されるポリペプチド又はタンパク質をコー
ド化するポリヌクレオチドを含むものとして意図されている。ポリヌクレオチド
配列における突然変異は、前記ポリヌクレオチドによってコード化されるアミノ
酸配列における突然変異に転移され、このためタンパク質の構造及び機能に影響
が及ぶ場合がある。突然変異の型には、サイレント、ミスセンス及びナンセンス
突然変異、並びに挿入及び除去突然変異も含まれる。
【００７１】 「テトラサイクリン類似体」は、テトラサイクリンと密接に関連しており、少
なくと106M-1のKaによってtetリプレッサーに結合するいくつかの化合物のいず
れか1つである。できれば、テトラサイクリン類似体は、約106M-1又はそれより
大きい親和体(例えば109M-1)によって結合する。(Hlavka and Boothe, "The Tetr
acyclines," in Handbook of Experimental Pharmacology 78, R.K.. Blackwood
et al. (eds.), SpringerVerlag, Berlin-New York, 1985、L.A. Mitscher "Th
e Chemistry of the Tetracycline Antibiotics, Medicinal Research 9, Dekke
r, New York, 1978、Noyee Development Corporation, "Tetracycline Manufact
uring Processes," Chemical Process Reviews, Park Ridge, N.J., 2 volumes,
1969、R.C. Evans, "The Technology of the Tetracyclines," Biochemical Re
ference Series 1, Quadrangle Press, New York, 1968、及び H.F. Dowling, "
Tetracycline," Antibiotics Monographs, no. 3, Medical Encyclopedia, New
York, 1955によって開示されたものがあげられるが、これに限定されはしない。
これらのそれぞれの内容は全て本書の参考文献に収録されている)。テトラサイ
クリン類似体の例には、アンヒドロテトラサイクリン、ドキシサイクリン、クロ
ロテトラサイクリン、エポキシテトラサイクリン、シアノテトラサイクリンなど
が含まれる。アンヒドロテトラサイクリンやエポキシテトラサイクリンなど一部
のTc類似体は、Tcに比べて抗菌性が低下している。
【００７２】 本書で使用される、「テトラサイクリン制御トランス活性化因子」即ち「tTA
ｓ」は、TetRと転写活性化因子適切なドメインとの融合である。
【００７３】 「トランス活性化因子融合タンパク質」及び「転写活性化因子タンパク質」と
いう用語は、遺伝子の遺伝子調節配列と直接的又は間接的のいずれかに接触する
ことによって、遺伝子の転写を促進できる任意のタンパク質を含むものとして意
図されている。一般に、転写調節タンパク質のDNA結合及び転写促進機能、即ち
転写因子は、このタンパク質の個別モジューラドメイン内に含有されている。本
発明のトランス活性化因子融合タンパク質には、活性化ドメイン由来のアミノ酸
配列で構成されたポリペプチドと機能的に連結する、例えば機能的にカップリン
グされたDNA結合タンパク質で構成されたポリペプチドで構成された融合タンパ
ク質が含まれる。
【００７４】 「転写調節ドメイン」という用語は、遺伝子の転写を変調する転写調節タンパ
ク質の個別ドメインを含むものとして意図されている。転写調節ドメインが転写
を変調するための機構には、基礎転写複合体、例えばRNAポリメラーゼ及びTATA
結合タンパク質の配列との直接的又は間接的相互作用、他の転写調節タンパク質
との直接的又は間接的相互作用、及び遺伝子調節配列のコンフォメーションの改
変が含まれるが、これに限定されはしない。転写調節ドメインは転写を促進する
か抑制するかのどちらかが可能である。
【００７５】 単純ヘルペス(Herpes simplex)ビリオンタンパク質16は、高い負帯電環境に位
置する塊状の疎水アミノ酸によって特徴付けられた2つの活性化ドメインを含有
する(Regier, J. L., Shen, F., and Triezenberg, S. J. (1993) Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 90, 883-887)。GAL4の1つのような非相同DNA結合ドメイン
と融合されるとき、転写を促進するための各ドメインが呈示される(Seipel, K.,
Georgiev, O.、及びSchaffner, W. (1992) EMBO-J 11, 4961-4968)。単純ヘル
ペスビリオンタンパク質16のC末端活性化ドメインは、真核細胞で転写を刺激す
る能力が強力であるので、トランス活性化因子融合タンパク質の転写促進構成体
として頻繁に使用される。
【００７６】 ある実施例においては、本発明の転写調節ドメインは、単純ヘルペス(Herpes
simplex)ビリオンタンパク質16由来のポリペプチドである。別の実施例において
は、転写調節ドメインは単純ヘルペス(Herpes simplex)ビリオンタンパク質16の
最小促進ドメインの少なくとも1つのコピーを含む。別の好適な実施例において
は、転写調節ドメインは、単純ヘルペスビリオンタンパク質16の436〜447のアミ
ノ酸残基で構成された酸性領域で構成される。
【００７７】 「転写調節タンパク質」及び「転写調節因子」という用語は、互換的に使用さ
れ、遺伝子の遺伝子調節配列と、直接的又は間接的のいずれかに接触させること
によって、遺伝子の転写を変調できる任意のタンパク質を含むものとして意図さ
れている。一般に、転写調節タンパク質のDNA結合及び転写促進又は抑制機能、
即ち転写因子は、このタンパク質の個別モジューラドメイン内に含有されている
。
【００７８】 本発明の転写調節タンパク質には、転写調節ドメイン由来のアミノ酸配列で構
成されたポリペプチドと機能的に連結する、例えば機能的にカップリングされた
DNA結合タンパク質で構成されたポリペプチドを含む融合タンパク質が含まれる
。
【００７９】 本書で使用される、「ベクター」という用語は、自身が連結された別の核酸を
運搬することが可能な核酸分子を含むものとして意図されている。ベクターは、
このようなDNA配列がベクターの必須の生物学的機能を喪失することなく決定的
な態様で切断される場合、及び複製及びクローニングを生じさせるためにDNA断
片がスプライシングされて入れられる場合がある、1つ又は少数の制限エンドヌ
クレアーゼ部位によって特徴が付けられる場合がある。ベクターは、さらにその
ベクターによって形質転換された細胞の識別に使用に適したマーカーを含有する
。ベクターの一種が「プラスミド」である。プラスミドとは、付加DNA部分が再
結合されてできる環状二本鎖DNAループを指す。ベクターの別の種類がウイルス
ベクターである。この場合は付加DNA部分が再結合されてウイルスゲノムになる
。一部のベクターは、自身が導入される宿主細胞に自律的に複製できる能力をも
つ(例えば、複製及びエピソーム哺乳動物ベクターの細菌起源をもつ細菌ベクタ
ー)。その他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞
へ導入されるときに宿主細胞のゲノムに統合され、これによって宿主ゲノムとと
もに複製される。さらに、一部のベクターは、自身が機能的に連結される先の遺
伝子の発現を命令する能力をもつ。このようなベクターは本書では「発現ベクタ
ー」と言う。一般に、組換えDNA技術において使用される発現ベクターは、「プ
ラスミド」の形を取ることが多い。プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用
される形であるので、本明細書中では、「プラスミド」と「ベクター」とは互換
可能に用いられる。ただし、本発明は、同等の機能を有する、ウイルスベクター
(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスな
ど)のような発現ベクターのその他の形も包含するものと意図されている。
【００８０】 本発明は、高度に制御される態様でin vitro又はin vivoに遺伝子の発現を調
節するために使用できる核酸分子及びタンパク質に関連している。本発明の様々
の態様は、tetオペレーター(tetO)配列に結合されているときに遺伝子の転写を
活性化する能力をもち、テトラサイクリン、又はその類似体の存在時、又は不在
時のどちらか代替的にtetオペレーター配列に結合される融合タンパク質に関連
している。従って、宿主細胞では、宿主細胞と接触するテトラサイクリン(又は
類似体)の濃度を変化させることによって(例えば、培養基からテトラサイクリン
の追加又は除去、或いは宿主生物へのテトラサイクリンの供与又は供与中止など
)、tetオペレーター配列に機能的に連結する遺伝子の転写が、本発明の融合タン
パク質によって刺激される。
【００８１】 本発明の転写調節タンパク質は、tetオペレーター由来の配列の制御下で遺伝
子の転写を刺激するトランス活性化因子である。本発明の前記トランス活性化因
子は融合タンパク質である。従って、本発明のある態様は、融合タンパク質をコ
ード化する融合タンパク質及び核酸(例えばDNA)に関連している。「融合タンパ
ク質」という用語は、機能的に連結する、一般に別のソースからの少なくとも2
つのポリペプチドを指すものとして意図されている。一般に、機能的に連結する
2つのポリペプチドはペプチド結合によって共有結合している。融合タンパク質
は、できれば標準組換えDNA技術によって生産されることが望ましい。例えば、
第1ポリペプチドをコード化するDNA分子が第2ポリペプチドをコード化する別のD
NA分子に再結合され、結果えられた前記ハイブリッドDNA分子が宿主細胞内で発
現されて融合タンパク質が産生される。DNA分子は、コード化されたポリペプチ
ドの翻訳フレームが再結合後に改変されないように、相互に5'〜3'の方向で再結
合される(即ち、DNA分子がフレーム単位で相互に再結合される)。
【００８２】 トランス活性化因子融合タンパク質の第1ポリペプチド 本発明のトランス活性化因子融合タンパク質は、一部分、テトラサイクリン又
はその類似体の存在時又は不在時にtetオペレーター配列を結合する第1ポリペプ
チドで組成されている。前記融合タンパク質の第1ポリペプチドはTetリプレッサ
ーである。好適な実施例においては、前記融合タンパク質の第1ポリペプチドはT
etリプレッサーの配列変異体である。この突然変異したTetリプレッサーは、野
生型Tetリプレッサーに類似しているが、野生型Tetリプレッサーと異なるアミノ
酸を少なくとも1つ有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むものとして
意図されている。「野生型Tetリプレッサー」という用語は、Tcの不在時に原核
細胞内でtetオペレーター配列からの転写を抑制する、天然のタンパク質を指す
ものとして意図されている。「tetリプレッサー」という用語は、例えばクラスA
、B、C、D、E、又はGのtetリプレッサーのように異なるクラス型のリプレッサー
を含むものとして意図されている。突然変異したTetリプレッサーと野生型Tetリ
プレッサーのアミノ酸の相違は、単一又は複数のアミノ酸の置換、単一又は複数
のアミノ酸の除去、又は単一又は複数のアミノ酸の追加であるの場合がある。
【００８３】 トランス活性化因子融合タンパク質の第1ポリペプチド(例えばTetリプレッサ
ー)は、特定的にtetオペレーター配列に結合する特性をもつ。Tetリプレッサー
の各クラスは対応する標的tetオペレーター配列を有する。従って、「tetオペレ
ーター配列」という用語は、例えばクラスA、B、C、D、E、又はGの全クラスのte
tオペレーター配列を包含するものとして意図されている。好適な実施例におい
ては、突然変異したTetリプレッサーは、Tn10にコード化されたリプレッサー(即
ちクラスB)であり、tetオペレーター配列はクラスBtetオペレーター配列である
。他方、突然変異したクラスAのTetリプレッサーはクラスAのtetオペレーターと
ともに使用でき、他のクラスのTetリプレッサー/オペレーターについても同様で
ある。
【００８４】 トランス活性化因子融合タンパク質の第2ポリペプチド トランス活性化因子融合タンパク質の第1ポリペプチドは、真核細胞内で直接
的又は間接的に転写を促進する第2ポリペプチドと機能的に連結される。第1と第
2のポリペプチドを機能的に連結するには、一般的に第1と第2のポリペプチドを
コード化するヌクレオチド配列をフレーム単位で相互に再結合し、融合タンパク
質をコード化するキメラ遺伝子を作製する。ただし、第1と第2のポリペプチドは
、各ポリペプチドの機能を保持している他の手段により機能的に連結できる(例
えば、化学的に架橋される)。好適な実施例においては、トランス活性化因子の
第2ポリペプチドは、自身が転写促進の働きを保有している(第2ポリペプチドは
直接転写を促進する)。別の実施例においては、第2ポリペプチドは、この融合タ
ンパク質と相互作用させるため転写活性化タンパク質を補充する間接的メカニズ
ムによって転写を活性化する。
【００８５】 真核細胞内で転写を活性化する機能をもつポリペプチドはよく知られた技術で
ある。特に、多数のDNAを結合するタンパク質の活性化ドメインについては、ド
メインが非相同タンパク質に転移されるときに転写活性化機能を保有することが
前述されている。本発明の融合タンパク質での使用に好適なポリペプチドは、単
純ヘルペスウイルスビリオンタンパク質16である(本書ではVP16と言われ、その
アミノ酸配列は、Triezenberg, S.J. et al. (1988) Genes Dev. 2:718-729)に
開示されている)。ある実施例においては、融合タンパク質の第2ポリペプチドは
、単純ヘルペス(Herpes simplex)ウイルスタンパク質16(VP16)由来のポリペプチ
ドである。別の実施例においては、融合タンパク質の第2ポリペプチドは単純ヘ
ルペス(Herpes simplex)VP16の最小活性化ドメインの少なくとも1つのコピーを
含む。別の好適な実施例においては、融合タンパク質の第2ポリペプチドは、単
純ヘルペス(Herpes simplex)VP16の436〜447のアミノ酸残基を含む酸性領域の少
なくとも1つのコピーを含む。
【００８６】 真核細胞内で転写促進能力があるその他のポリペプチドも、本発明の前記融合
タンパク質で使用することができる。様々のタンパク質内に見られる活性化ドメ
インは、類似の構造素性に基づいてカテゴリー別にグループ化されている。活性
化ドメインの型には、酸性活性化ドメイン、プロリンの多い活性化ドメイン、セ
リン/トレオニンの多い活性化ドメイン及びグルタミンの多い活性化ドメインが
ある。酸性活性化ドメインの例として、前述のVP16領域及びGAL4の753〜881のア
ミノ酸残基があげられる。プロリンの多い活性化ドメインの例として、CTF/NF1
の399〜499のアミノ酸残基及びAP2の31〜76のアミノ酸残基があげられる。セリ
ン/トレオニンの多い活性化ドメインとして、ITF1の1〜427のアミノ酸及びITF2
の2〜451のアミノ酸残基があげられる。グルタミンの多い活性化ドメインOct1の
175〜269のアミノ酸残基及びSp1の132〜243のアミノ酸残基があげられる。上記
の各領域、及びその他の有用な活性化ドメインのアミノ酸配列については、Seip
el, K. et al. (EMBO J. (1992) 13:4961-4968)に開示されている。
【００８７】 前記の活性化ドメインに加え、標準技術によって特定できる新規活性化ドメイ
ンも、本発明の前記適用範囲内に含まれる。前記のポリペプチドの転写活性化能
力は、上記のポリペプチドとDNA結合性を有する別のポリペプチドを連結し、そ
の融合タンパク質によって刺激される標的配列の転写量を判別することによって
、検定することができる。例えば、この技術に使用される標準検定は、推定活性
化ドメイン及びGAL4 DNA結合ドメインの融合タンパク質を利用する(例えば、1〜
93のアミノ酸残基)。この融合タンパク質は、次にGAL4結合部位に連結されたレ
ポーター遺伝子の発現を刺激するために使用される(例えば、Seipel, K. et al.
(1992) EMBO J. 11:4961-4968及び本書に引用した参考文献を参照)。
【００８８】 別の実施例においては、融合タンパク質の第2ポリペプチドは、この融合タン
パク質と相互作用させるため転写促進因子を補充することによって間接的に転写
を促進する。例えば、本発明のtetRは、宿主細胞に存在する内在性転写促進因子
のような転写促進タンパク質によってタンパク質相互の作用を媒介することが可
能なポリペプチドドメイン(例えば、二量体化ドメイン)に融合できる。DNA結合
ドメインと活性化ドメイン間の機能的関連は共有結合である必要はないことはす
でに実証されている(例えば、Fields and Song (1989) Nature 340:245-247; Ch
ien et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582; Gyuris et al.
(1993) Cell 75:791-803; and Zervos, A.S. (1993) Cell 72:223-232参照)。
従って、融合タンパク質の第2ポリペプチドは直接転写を促進しないどころか、
適合性のタンパク質相互作用ドメイン及び活性化ドメインを担う内在性ポリペプ
チドと安定的相互作用を形成することもある。好適な相互作用(二量体化)ドメイ
ンの例として、ロイシンジッパー(Landschulz et al. (1989) Science 243:1681
-1688)、らせん・ループ・らせんドメイン(Murre, C. et al. (1989) Cell 58:5
37-544)及びジンクフィンガードメイン(Frankel, A.D. et al. (1988) Science
240:70-73)があげられる。内生的核因子をもつ融合タンパク質に存在する二量体
化ドメインの相互作用の結果、核因子の活性化ドメインが融合タンパク質に補充
され、それによって融合タンパク質が結合されているtetオペレーター配列にも
補充される。
【００８９】 別の好適な実施例においては、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質は
テトラサイクリン制御トランス活性化因子タンパク質である。キメラ「テトラサ
イクリン制御トランス活性化因子」(tTA)によって、最小プロモーター-tetO融合
(Ptet)の下流にある遺伝子の発現を調節できる。Tcの不在下には、Ptetが活性化
されるのに対して、抗生物質が存在下ではPtetの活性化が阻害される。ある実施
例においては、単純ヘルペス(Herpes simplex)ウイルスタンパク質16(VP16)由来
のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、DNAからTetRのレベルで融
合される。別の実施例においては、単純ヘルペス(Herpes simplex)VP16の最小活
性化ドメインの少なくとも1つのコピーをコード化するポリヌクレオチドが、機
能的にTetRに連結する。さらなる実施例においては、単純ヘルペス(Herpes simp
lex)VP16の436〜447のアミノ酸残基を含む酸性領域の少なくとも1つのコピーを
コード化するポリヌクレオチドが、機能的にTetRに連結する。
【００９０】 さらなる好適な実施例においては、本発明のトランス活性化因子融合タンパク
質は逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子タンパク質である。ある実施例
においては、rtTAタンパク質の活性化ドメインは、単純ヘルペス(Herpes simple
x)ウイルスタンパク質16(VP16)由来のポリペプチドである。別の実施例において
は、単純ヘルペス(Herpes simplex)VP16の最小活性化ドメインの少なくとも1つ
のコピーを含むrtTAタンパク質の活性化ドメインは、機能的にTetRに連結する。
さらなる実施例においては、単純ヘルペス(Herpes simplex)VP16の436〜447のア
ミノ酸残基を含む酸性領域の少なくとも1つのコピーを含むrtTAタンパク質の活
性化ドメインは、機能的にTetRに連結する。
【００９１】 本発明のある態様においては、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質はrt
TAタンパク質の配列変異体(即ち、SEQ ID NO:22又は23における参考rtTA配列と
比較されるような)である。rtTAタンパク質の配列変異体は、このタンパク質に
新規の表現型を付与する少なくとも1つの突然変異を含有しているであろう。
【００９２】 ある実施例においては、突然変異したrtTAタンパク質は、ドキシサイクリン又
はこれらの類似体の不在下で基礎転写活性を改変した。好適な実施例においては
、rtTAタンパク質は、前記のDNA結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸を有
する。ある実施例においては、前記のDNA結合ドメインはSEQ ID NO:23の1〜45の
アミノ酸位置を含む。好適な実施例においては、突然変異はS12G、E19G、及びT2
6Aから成るグループから選択される。別の実施例においては、前記のDNA結合ド
メイン内の突然変異は、ドキシサイクリン又はその類似体の不在時のtetオペレ
ーターに対する基礎親和性を増加又は減少させる。
【００９３】 別の実施例においては、突然変異したrtTAタンパク質は、ドキシサイクリン又
はその類似体の存在下で誘発転写活性が増加又は減少する。好適な実施例におい
ては、本発明のrtTAタンパク質は、テトラサイクリン結合ドメイン内に少なくと
も1つのアミノ酸突然変異を有する。ある実施例においては、テトラサイクリン
結合ドメインはSEQ ID NO:23の46〜207のアミノ酸位置を含む。好適な実施例に
おいては、突然変異はA56P、R87S、欠失C88、D95G、G96R、V99E、D148E、H179R
、及びE204Kで構成されるグループから選択される。別の実施例においては、前
記のテトラサイクリン結合ドメイン内の突然変異は、ドキシサイクリン又はその
類似体に対する感受性を増加又は減少させる。
【００９４】 表1は、本発明の新規rtTA融合タンパク質内に発生する突然変異を特定したも
のである。rtTAタンパク質は、できればこれらの位置の少なくとも1つで突然変
異されることが望ましい。突然変異させたrtTAタンパク質の前記望ましい機能的
特性を保持するこれら又はその他のアミノ酸位置における、その他のアミノ酸置
換、除去又は付加は、本発明の前記適用範囲内である。
【００９５】 本発明の別の態様においては、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質は
tTAタンパク質の配列変異体(即ち、SEQ ID NO:24又は25における参考rtTA配列と
比較されるような)である。tTAタンパク質の配列変異体は、このタンパク質に新
規の表現型を与える少なくとも1つの突然変異を含有しているであろう。
【００９６】 ある実施例においては、前記の突然変異したtTAタンパク質は、テトラサイク
リン又はこれらの類似体によって異なる誘導を表示した。好適な実施例において
は、tTAタンパク質はテトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ
酸を有する。ある実施例においては、前記のテトラサイクリン結合ドメインは、
SEQ ID NO:25の46〜207のアミノ酸位置を含む。好適な実施例においては、前記
の突然変異はA56V、F78S、S85G、S85R、Y110C、L113H、Y132C、I164L、P167S、L
170V、I174V、I174T、又はE183Kから成るグループから選択される。別の実施例
においては、テトラサイクリン結合ドメイン内の突然変異は、テトラサイクリン
又はその類似体に対する感受性を増加若しくは減少させる。
【００９７】 別の実施例においては、tTAタンパク質は、前記のDNA結合ドメイン内に少なく
とも1つのアミノ酸突然変異を有する。ある実施例においては、前記のDNA結合ド
メインはSEQ ID NO:25の1〜45のアミノ酸位置を含む。
【００９８】 表2は、本発明の新規tTA融合タンパク質内に発生する突然変異を特定したも
のである。tTAタンパク質は、できればこれらの位置の少なくとも1つで突然変異
されることが望ましい。これらのアミノ酸位置、又は突然変異させたrtTAタンパ
ク質の望ましい機能的特性を保持するこれら又はその他のアミノ酸位置における
、その他のアミノ酸置換、除去又は付加は、本発明の前記適用範囲内である。
【００９９】 本発明の技術に従って、さらなる突然変異したトランス活性化因子融合タンパ
ク質を創造することもできる。いくつかのクラス別のTetリプレッサー、例えばA
、B、C、D、E、又はGについては前述されている。このクラス別のTetリプレッサ
ーのアミノ酸配列は、上述の突然変異が含まれる領域を含めた、高度の相同(即
ち、このタンパク質の全長の40〜60％)を共有する。各クラス別のTetリプレッサ
ーのアミノ酸配列については、Tovar, K. et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 215
:76-80に説明されている。従って、表1及び2に説明されているこれらアミノ酸配
列での突然変異は、他のクラスのTetリプレッサーでも本発明の融合タンパク質
に組み入れる作製することができる。さらなる好適な等価物の突然変異は、現在
では当業者には明らかであろろし、創造して機能性を試験することができる。A
、B、C、D、及びEクラスのTetリプレッサーのヌクレオチド及びアミノ酸配列に
ついては、Waters, S.H. et al. (1983) Nucl. Acids Res 11:6089-6105, Unger
, B. et al. (1984) Gene 31: 103-108, Unger, B. et al. (1984) Nucl Acids
Res. 12:7693-7703 and Tovar, K. et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 215:76-8
0にそれぞれ開示されている。これらの野生型配列も、遺伝子転写の誘導可能調
節に使用するため本発明の教示に従って突然変異させることができる。
【０１００】 本発明に従って、さらなる好例の突然変異したrtTA及びtTAタンパク質(即ち、
上述の望ましい機能的特性を有する)を、野生型rtTA又はtTAタンパク質の突然変
異誘発によって個別に創造することができる。野生型rtTA及びtTAタンパク質の
ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、本書に表示されている(図8及び9)。突然変異
したrtTA及びtTAタンパク質は、例えば、次の方法で創造及び選択することがで
きる。その方法とは、野生型rtTAをコード化する核酸(例: DNA)はランダム突然
変異誘発に支配され、その結果として突然変異した核酸を発現ベクターに組み込
み、スクリーニングのために宿主細胞に導入する(例えば、「例1」参照)。ドキ
シサイクリンの存在下でのみtetオペレーター配列に結合するrtTAの選別をでき
るようなスクリーニング検定が使用される。例えば、発現ベクター内の突然変異
した核酸のライブラリーを、タンパク内部のtetオペレーター配列が緑蛍光色の
タンパク質をコード化する遺伝子(GFP)の発現を調節する酵母菌株に導入するこ
とができる。酵母菌内のtetオペレーターとrtTAタンパク質の結合によって、GFP
遺伝子の発現が刺激されよう。GFPを発現する細胞は、蛍光色に基づいて選別さ
れる。野生型rtTAでは、GFPの発現がドキシサイクリンの存在下で起きるであろ
う。突然変異したrtTAをコード化する核酸は、ドキシサイクリンの不在下に酵母
菌の内GFP遺伝子の発現が減少する核酸の能力に基づいたこの系を使って選別さ
れる。特定の突然変異(例えば、19、56、148 及び179の位置で)を有する突然変
異したrtTAタンパク質は、標準分子生物学技術(例えば、ヌクレオチド突然変異
を取り込んだオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、部位特異的突然変異誘
発又はPCRの媒介による突然変異誘発)によって、野生型リプレッサーをコード化
する核酸の中にヌクレオチド変更を導入することにより創造することができる。
これに代り、ライブラリーからの選択により突然変異したTetリプレッサーが特
定されたときは、そのライブラリーベクターから前記の突然変異した核酸を回収
することができる。
【０１０１】 現在では当業者には、突然変異したトランス活性化因子融合タンパク質の遺伝
子配列結果から決定されたヌクレオチド配列によって、相同遺伝子内に比較可能
なトランス活性化因子融合タンパク質突然変異を生成させることが可能であると
理解されている。
【０１０２】 単離核酸分子 本発明のある態様は、トランス活性化因子融合タンパク質又はこれらの生物学
的活性部分をコード化する単離核酸分子、並びにトランス活性化因子融合タンパ
ク質をコード化するする核酸分子(例えば、トランス活性化因子融合タンパク質m
RNA)を特定するハイブリダイゼーションプローブとして十分使用できる核酸断片
、及びトランス活性化因子融合タンパク質核酸分子の増幅又は突然変異のための
PCRプライマーとして使用するための断片に関連している。
【０１０３】 本発明の核酸分子、例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18
、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44の核酸配列を有す
る核酸分子、又はこれらの部分は、標準分子生物学技術及び本書に提供されてい
る配列情報を使用して生成できる。
【０１０４】 好適な実施例においては、本発明の単離核酸分子は、SEQ ID NO:1、3、5、6、
8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、
又は44に示されたヌクレオチド配列を含む。
【０１０５】 また別の好適な実施例においては、本発明の単離核酸分子は、SEQ ID NO: 1、
3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、
40、42、又は44に示されたヌクレオチド配列の全長に少なくとも約80％、85％、
90％、95％、98％又はそれ以上の相同であるヌクレオチド配列を含む。
【０１０６】 さらに、本発明の単離核酸分子は、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、
16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44の核酸配列
の部分だけ、例えば、プライマーとして使用できる断片又はトランス活性化因子
融合タンパク質の部分をコード化する断片、例えば、トランス活性化因子融合タ
ンパク質の生物学的活性部分を含むことができる。好適な実施例においては、核
酸分子は、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、
28、30、32、34、36、38、40、42、又は44を含む核酸の少なくとも100の連続し
たヌクレオチドを含む。
【０１０７】 トランス活性化因子融合タンパク質のヌクレオチド配列に基づいたプローブは
、同一又は相同タンパク質をコード化する転写産物を検出するために使用できる
。上述のプローブは、被験体から標本細胞中のトランス活性化因子融合タンパク
質をコード化する核酸のレベルを測定することによって(例えば、トランス活性
化因子融合タンパク質mRNAを検出するなど)、本発明のトランス活性化因子融合
タンパク質を発現する細胞又は組織を特定するための診断テストキットの一部と
して使用できる。
【０１０８】 トランス活性化因子融合タンパク質の「生物学的活性部分」をコード化する核
酸断片は、トランス活性化因子融合タンパク質のコード化部分を発現し(例えば
、in vitroの組換え発現による)そのトランス活性化因子融合タンパク質のコー
ド化部分の活動(例えば、転写を調節するためのトランス活性化因子融合タンパ
ク質の活性)を検定する、トランス活性化因子融合タンパク質の生物学的活性を
有するポリヌクレオチドをコード化するする、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、
12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44の
ヌクレオチド配列の部分を単離することによって、準備できる。好適な実施例に
おいては、本発明のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:2、4、7、9、11、13、15、
17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45のアミノ酸
配列の連続したアミノ酸残基を少なくとも30含む断片をコード化する。
【０１０９】 さらに、本発明は、遺伝子コードの縮重のため、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、
10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は
44に示されたヌクレオチド配列と異なっており、そのためSEQ ID NO: 1、3、5、
6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42
、又は44に示されたヌクレオチド配列によってコード化されたものと同じトラン
ス活性化因子融合タンパク質をコード化する核酸分子も包含する。ある実施例に
おいては、本発明の単離核酸分子は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17
、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45に示されたア
ミノ酸配列を有するタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を有する。別の
実施例においては、本発明の単離核酸分子は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13
、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45に少
なくとも約80％、85％、90％、95％、98％又はそれ以上の同一性を有するタンパ
ク質、又はそれらの断片をコード化するヌクレオチド配列を有する。
【０１１０】 SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、
32、34、36、38、40、42、又は44に示されたトランス活性化因子融合タンパク質
のヌクレオチド配列に加え、現在では当業者によって、トランス活性化因子融合
タンパク質のポリペプチド構成体のアミノ酸配列で変更を起こさせるDNA配列多
型性が、集団内に存在する場合があることが正当に評価されるであろう。トラン
ス活性化因子融合タンパク質遺伝子のポリペプチドにおける上述のような遺伝子
の多型性が、天然の対立遺伝子変異体のために、集団内に存在する場合がある。
【０１１１】 機能的対立遺伝子変異体は、一般に、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、1
7、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45の単一又は複
数のアミノ酸の保存的置換、或いは上述のタンパク質の非クリティカル領域にあ
る非クリティカル残基の置換、除去又は挿入を含有しているであろう。
【０１１２】 非機能的対立遺伝子変異体は、一般に、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15
、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45の単一又
は複数のアミノ酸配列の非保存的置換、除去、又は挿入、又は早すぎる切端、或
いは上述のタンパク質のクリティカル残基又はクリティカル領域における置換、
挿入、又は除去を含有しているであろう。
【０１１３】 SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33
、35、37、39、41、43 又は45のトランス活性化因子融合タンパク質と相同の上
述タンパク質をコード化する単離核酸分子は、単一又は複数のアミノ酸の置換、
付加又は除去が上述のコード化されたタンパク質に導入されるように、SEQ ID N
O: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36
、38、40、42、又は44のヌクレオチド配列の中に単一又は複数のヌクレオチドの
置換、付加又は除去を導入することによって創造することができる。突然変異は
、部位特異的突然変異誘発又はPCR媒介による突然変異誘発などの標準技術によ
っても導入できる。できれば、保存的アミノ酸の置換は、単一又は複数の予測さ
れる非必須アミノ酸残基で起きることが望ましい。
【０１１４】 従って、トランス活性化因子融合タンパク質中の1個の予測される非必須アミ
ノ酸残基が同一部位鎖族からの別のアミノ酸残基と置換されることが望ましい。
これに代り、別の実施例においては、飽和突然変異誘発のような、トランス活性
化因子融合タンパク質をコード化する配列の全部又は一部に沿って、突然変異を
ランダムに導入することができ、さらに転写調節活性を保持する突然変異体を特
定するため、トランス活性化因子タンパク質の生物学的活性について、結果の突
然変異をスクリーニングすることができる。SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12
、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44の突
然変異誘発に後続して、コード化されたタンパク質を組替え的に発現させること
ができ、そのタンパク質の転写調節活性を判別することができる。
【０１１５】 相同又は同一性 2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列の同一性のパーセントを判別するには、
最適比較をするため上述の配列を整列させる(例えば、最適整列目的には最初及
び2番目のアミノ酸配列又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入すること
ができ、比較目的には非相同配列を無視することができる)。好適な実施例にお
いては、比較目的で整列された照合配列の長さは、その照合配列の長さの少なく
とも30％であり、少なくとも40％ならば好適であり、少なくとも50％ならばより
好適であり、少なくとも60％ならばよりいっそう好適であり、少なくとも70％、
80％、90％又は95％ならばさらによりいっそう好適である。その後に、対応する
アミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドが、比
較される。最初の配列中の位置が、2番目の配列中の対応する位置と同じアミノ
酸残基又はヌクレオチドによって占有されているときは、その位置にある分子は
同一である(本書で使用されるアミノ酸又はヌクレオチドの「同一性」は、アミ
ノ酸又はヌクレオチド「相同」に相当する)。2つの配列間の同一性のパーセント
は、2つの配列の最適整列のために導入する必要があるギャップ数の数、及び各
ギャップ長が考慮に入れられた、これらの配列によって共有される同一位置の数
の関数である。
【０１１６】 2つの配列の比較及び2つの配列間の同一性パーセントの算定は、数学的アルゴ
リスムを使って達成することができる。好適な実施例においては、2つのアミノ
酸配列間の前記同一性パーセントは、Blossom 62マトリクス又はPAM250マトリク
スのどちらか一方、及び16、14、12、10、8、6、又は4のギャップウェイト及び1
、2、3、4、5、又は6のレングスウェイトを使って、GCGソフトウェアパッケージ
(http://www.gcg.comで入手可能)に入っているGAPプログラムに組み込まれてい
るニードルマン・ブンシュ(Needleman and Wunsch)(J. Mol. Biol. (48):444-45
3 (1970))アルゴリスムを使って算定される。また別の好適な実施例においては
、2つのヌクレオチド配列間の前記同一性パーセントは、NWSgapdna.CMPマトリク
ス、及び40、50、60、70、又は80のギャップウェイト及び1、2、3、4、5、又は6
のレングスウェイトを使って、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.com
で入手可能)に入っているGAPプログラムを使って算定される。別の実施例におい
ては、2つのアミノ酸配列間又はヌクレオチド配列間の前記同一性パーセントは
、PAM120重み残基表、12のギャップ長ペナルティー及び4のペナルティーを使っ
て、ALIGNプログラム(バージョン2.0) (http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-gu
ess.cgiで入手可能)に組み込まれているE.マイヤーズ・W.ミラー(原語: E. Meye
rs and W. Miller) (Comput. Appl. Biosci.、4:11-17 (1988)のアルゴリズムを
使って算定される。
【０１１７】 核酸配列及びタンパク質配列はさらに「照会配列」としても使用でき、例えば
、その他のファミリーのメンバー又は関連配列を識別するため公共のデータベー
スに対して検索を実行するためにも使用できる。上述のような検索は、Altschul
, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLAST及びXBLASTプログラム(バ
ージョン2.0)を使って実行できる。BLASTヌクレオチドの検索は、NBLASTプログ
ラム、score = 100、wordlength = 12を用いて実行し、相同ヌクレオチド配列を
取得することができる。BLASTタンパク質の検索は、XBLASTプログラム、score =
50、wordlength = 3を用いて実行し、相同アミノ酸配列を取得することができ
る。比較目的のためギャップのある整列を取得するには、Altschul et al., (19
97) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に説明されているように、Gapped BL
ASTを利用できる。BLAST及びGapped BLASTプログラムを利用するときには、それ
ぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST) のデフォルトパラメーターを使
用できる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。
【０１１８】 さらに、「クラスタル」方法(Higgins and Sharp, Gene, 73:237-44、1988)及
び「メガリーン」プログラム(Clewley and Arnold, Methods Mol. Biol, 70:119
-29、1997) も、配列を整列するため、及び類似性、同一性、又は相同を判別す
るために使用できる。
【０１１９】 単離トランス活性化因子融合タンパク質及び抗トランス活性化因子融合タンパク
質抗体 本発明のある態様は、単離トランス活性化因子融合タンパク質、これらの生物
学的活性部分、並びに抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体を高めるためイ
ムノゲンとして使用するために好適なポリペプチド断片に関連している。ある実
施例においては、トランス活性化因子融合タンパク質は組換えDNA技術によって
生産される。組換え発現と代替して、トランス活性化因子融合タンパク質又はポ
リペプチドは、化学的に標準ペプチド合成技術を使って合成できる。
【０１２０】 トランス活性化因子融合タンパク質の生物学的活性部分には、このトランス活
性化因子融合タンパク質のアミノ酸配列(例えば、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、
13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45に
示されたアミノ酸配列)と十分に相同のアミノ酸を含むか、若しくはこのタンパ
ク質のアミノ酸配列に由来するペプチドが含まれる。上述のトランス活性化因子
融合タンパク質は、全長トランス活性化因子融合タンパク質より少ないアミノ酸
を含み、トランス活性化因子融合タンパク質の少なくとも1つの活性を示す。ト
ランス活性化因子融合タンパク質の生物学的活性部分は、例えば、10、25、50、
100、200又はそれ以上の長さのアミノ酸であるポリペプチドであると言える。ト
ランス活性化因子融合タンパク質の生物学的活性部分は、トランス活性化因子融
合タンパク質の媒介による活性(例えば、遺伝子発現の調節)を変調する医薬品を
開発するための標的として使用できる。
【０１２１】 好適な実施例においては、このトランス活性化因子融合タンパク質は、SEQ ID
NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37
、39、41、43 又は45に示されたアミノ酸配列を有する。別の実施例においては
、このトランス活性化因子融合タンパク質は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13
、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45と実
質的に相同であり、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25
、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45の上述タンパク質の機能的活性
を保持しているが、天然の対立遺伝子の変異体又は突然変異誘発のためにアミノ
酸配列に相違がある。従って、別の実施例においては、トランス活性化因子融合
タンパク質は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27
、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45に少なくとも約80％、85％、90％、9
5％、98％又はそれ以上の相同のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【０１２２】 ある実施例においては、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質は、SED
ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34
、36、38、40、42、又は44の核酸配列によってコード化される。別の実施例にお
いては、トランス活性化因子融合タンパク質は、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10
、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44
と80％の同一性を有する核酸分子によってコード化される。
【０１２３】 本発明は、またキメラトランス活性化因子融合タンパク質も提供する。好適な
実施例においては、キメラトランス活性化因子融合タンパクは、トランス活性化
因子融合タンパク質の少なくとも1つの生物学的活性部分を含む。この融合タン
パク質内では、「機能的に連結する」は、トランス活性化因子融合タンパク質ポ
リペプチド及び非トランス活性化因子融合タンパク質ポリペプチドがフレームで
相互に融合されていることを示すものとして意図されている。非トランス活性化
因子融合タンパク質ポリペプチドは、このトランス活性化因子融合タンパク質ポ
リペプチドのN末端又はC末端に融合することができる。
【０１２４】 例えば、ある実施例においては、キメラタンパク質は、GST配列のC末端に融合
される。上述の融合タンパク質は、組換えトランス活性化因子融合タンパク質の
精製を簡便にする。
【０１２５】 別の実施例においては、前記キメラタンパク質は、そのN端末に相同シグナル
配列を含有するトランス活性化因子融合タンパク質である。一部の宿主細胞(哺
乳動物の宿主細胞)では、発現及び分泌、或いは発現又は分泌トランス活性化因
子融合タンパク質が、非相同シグナル配列の使用により増加する可能性がある。
【０１２６】 本発明の前記キメラトランス活性化因子融合タンパク質は、製薬組成物に混入
でき、in vivoで被験体に供与できる。さらに、前記キメラトランス活性化因子
融合タンパク質を使用して、トランス活性化因子融合タンパク質基質のバイオア
ベイラビリティ(生物学的利用能)に影響を与えることができる。さらに、本発明
の前記キメラトランス活性化因子融合タンパク質はイムノゲンとして使用して、
被験体内に抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体を産生させ、トランス活性
化因子融合タンパク質のエフェクター分子を精製し、さらにスクリーニングアッ
セイにおいて、トランス活性化因子融合タンパク質と作用する分子を特定するこ
とができる。
【０１２７】 本発明のキメラトランス活性化因子融合タンパク質を、標準組換えDNA技術に
よって産生できるに超したことはない。例えば、ポリペプチド配列別にコーディ
ングするDNA断片は、従来の技術に従って、フレームで一緒に再連結される。前
記の従来技術とは、例えば、再連結のため平滑末端又は付着末端、適応する末端
に対応するため制限酵素消化、適応する接着末端のフィルイン、不適な接合を回
避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素による再連結を利用する技
術である。別の実施例においては、前記の融合遺伝子は、自動DNA合成装置も含
めた従来の技術によって合成することができる。また代って、遺伝子断片のPCR
増幅は、その後にキメラ遺伝子配列を生成するためアニーリング及び再増幅する
ことができる2つの連続遺伝子断片間に相補的張り出しを生じさせるアンカープ
ライマーを使って実行できる(例えば、Current Protocols in Molecular Biolog
y, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992参照)。さらに、すでに融合
成分をコード化する多くの発現ベクターが市販されている(例えば、GSTポリペプ
チド)。トランス活性化因子融合タンパク質をコード化する核酸は、非相同成分
がフレームでそのトランス活性化因子融合タンパク質に連結するように、上述の
ような発現ベクターにクローニングできる。
【０１２８】 本発明は、トランス活性化因子融合タンパク質作用薬(擬態)又はトランス活性
化因子融合タンパク質拮抗薬のどちらか一方として機能する前記トランス活性化
因子融合タンパク質の変異体に関連している。前記トランス活性化因子融合タン
パク質の変異体は、突然変異誘発、例えば、トランス活性化因子融合タンパク質
の分散した点突然変異又は切除によって生成することができる。トランス活性化
因子融合タンパク質の作用薬は、トランス活性化因子融合タンパク質の自然発生
形態の生物学的活性の、本質的に同じ活性、又はサブセットの活性を保持するこ
とができる。トランス活性化因子融合タンパク質の拮抗薬は、例えば、トランス
活性化因子融合タンパク質のトランス活性化因子融合タンパク質媒介活性を競合
的に変調することによって、前記トランス活性化因子融合タンパク質の原形の単
一又は複数の活性を抑制することができる。このように、限定された機能の変異
体を用いた処理によって、特定の生物学的作用を誘発することができる。ある実
施例においては、前記タンパク質の原形の生物学的活性のサブセットを有する変
異体を用いた被験体の処理は、前記トランス活性化因子融合タンパク質の原形を
用いた処理と比較してより大きな有意な作用を有する。
【０１２９】 トランス活性化因子融合タンパク質をコーディングする配列の断片のライブラ
リーは、トランス活性化因子融合タンパク質の変異体のスクリーニング及びその
後の選別のために、トランス活性化因子融合タンパク質のふ入りの集団を生成す
るために使用することができる。ある実施例においては、次の条件、即ち分子ご
とにほぼ1回だけニックが起きる・2本鎖DNAをを変性する・各種のニックされた
産物からのセンス/アンチセンス対を組み込むことができる2本鎖DNAを形成する
ために2本鎖DNAを再生する・S1ヌクレアーゼ処理によってリフォーム済み複式か
ら1本鎖部分を除去する・及び結果の断片ライブラリーを発現ベクターの中に再
結合する、という条件下で、ヌクレアーゼを用いてトランス活性化因子融合タン
パク質の2本鎖PCR断片を処理することによって、コーディング配列断片のライブ
ラリーを生成することができる。この方法によって、各種サイズの前記トランス
活性化因子融合タンパク質のN末端、C末端及び内在断片をコード化する発現ライ
ブラリーを引き出すことができる。
【０１３０】 点突然変異又は切除によって作製されたコンビナトリアル・ライブラリの遺伝
子産物のスクリーニング、及び選択された特性を有する遺伝子産物対応のcDNAラ
イブラリーのスクリーニングための技術分野には、いくつか知られた技術がある
。上述の技術は、トランス活性化因子融合タンパク質の組み合わせ突然変異誘発
によって生成された遺伝子ライブラリーを高速スクリーニングできるように改良
可能である。大型遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループ
ット解析に対応可能である最も広範に使用されている技術には、一般に、遺伝子
ライブラリーを複製可能な発現ベクターにするためのクローニング、その結果の
ベクターライブラリーを用いた適正な細胞の形質変換、及び組み合わせ遺伝子の
発現(希望の活性の検出によって検出産物の遺伝子をコード化するベクターの単
離が簡便になるという条件下で)が含まれる。ライブラリー中の機能的突然変異
体の頻度を高める新技術である、リクルーシブ・アンサンブル変異誘発(REM)を
、前記スクリーニングアッセイと組み合せて使用して、トランス活性化因子融合
タンパク質変異体を特定することができる(Arkin and Yourvan (1992) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineer
ing 6(3):327-331)。
【０１３１】 単離トランス活性化因子融合タンパク質、又はそれらの断片をイムノゲンとし
て使用して、ポリクロナール及びモノクロナール抗体調製のための標準技術を使
って、前記トランス活性化因子融合タンパク質を結合する抗体を産生することが
できる。全長トランス活性化因子融合タンパク質を使用することができるが、若
しくはそれ代り、本発明は、イムノゲンとして使用できる、前記トランス活性化
因子融合タンパク質の抗原ペプチド断片を提供する。トランス活性化因子融合タ
ンパク質の抗原ペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21
、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45 に示されたアミノ酸配
列の少なくとも8つのアミノ酸残基を含み、前記ペプチドに対して高まる抗体は
トランス活性化因子融合タンパク質と結合して特定の免疫複合体を形成し、前記
トランス活性化因子融合タンパク質のエピトープを包含する。できれば、抗原ペ
プチドは少なくとも10のアミノ酸残基を含むことが望ましく、少なくとも15のア
ミノ酸残基を含めばさらに望ましく、少なくとも20のアミノ酸残基を含めばなお
いっそう望ましく、さらに少なくとも30のアミノ酸残基を含めば最も望ましい。
【０１３２】 トランス活性化因子融合タンパク質のイムノゲンは、一般に、このイムノゲン
を用いて適当な被験体(例えば、うさぎ、やぎ、マウス又はその他哺乳動物)に免
疫性をもたせることによって抗体を作らせるために使用することができる。適切
な免疫抗原作用因子には、例えば、組換えにより発現されたトランス活性化因子
融合タンパク質又は合成トランス活性化因子融合タンパク質ポリペプチドが含ま
れる。この作用因子には、さらにFreundの完全又は不完全なアジュバントなどの
アジュバント、又は免疫刺激作用因子が含まれる。免疫抗原性トランス活性化因
子融合タンパク質作用因子により適当な被験体の免疫には、抗トランス活性化因
子融合タンパク質抗体反応も含まれる。
【０１３３】 本発明の別の態様は、抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体に関連してい
る。
【０１３４】 本発明に準拠した抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体は、トランス活性
化因子融合タンパク質のイムノゲンを用いて、適当な被験体に免疫性をもたせる
ことにより、抗体を作らせるために使用できる。固定化トランス活性化因子融合
タンパク質を使用する酵素連結によるイムノソルベントアッセイ(ELISA)を用い
るなどの標準技術によって、免疫をもたせた被験体内の前記抗トランス活性化因
子融合タンパク質抗体の滴定量を時間経過に従ってモニターすることができる。
要求に応じて、哺乳動物から(例えば、その血液から)、トランス活性化因子融合
タンパク質と反対方向の前記抗体分子を単離することでき、さらに、IgG分屑を
得るためのタンパク質クロマトグラフィーなど、よく知られた技術によって精製
することができる。免疫化した後の適切な時点、例えば、抗トランス活性化因子
融合タンパク質抗体の滴定量が最高になったときに、Kohler及びMilstein(1975)
Nature 256:495-497) によって最初に発表されたハイブリドーマ技術(Brown et
al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem .
255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; an
d Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75も参照)、さらに新しいヒトB細
胞ハイブリドーマ技術 (Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72)、EBVハイ
ブリドーマ技術 (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer The
rapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) 又はトリオマ技術などの標準技術によ
って、その被験体から抗体産生細胞を採取し、さらにモノクロナール抗体を作ら
せるためにも使用することができる。モノクロナール抗体ハイブリドーマを産生
するための技術はよく知られている(通常 R. H. Kenneth, in Monoclonal Antib
odies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp.,
New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:38
7-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36を参照) 。
不滅細胞系統(一般に骨髄腫)は、前述のトランス活性化因子融合タンパク質のイ
ムノゲンを用いて免疫化した哺乳動物からのリンパ球(一般に脾細胞)と融合させ
、その結果のハイブリドーマ細胞の培養上澄みをスクリーニングして、トランス
活性化因子融合タンパク質を結合するモノクロナール抗体を産生するハイブリド
ーマを特定するのが、簡便である。
【０１３５】 抗トランス活性化因子融合タンパク質モノクロナール抗体を生成する目的には
、リンパ球及び不滅細胞系統の融合に使用される多くの周知の任意プロトコルを
適用することができる(例えば、G. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; G
efter et al. Somatic Cell Genet., cited supra; Lerner, Yale J. Biol. Med
., cited supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, cited supra参照)。さらに
、一般当業者は、上述のような方法の変形がたくさんあり、それらも有用と思わ
れることを認めるであろう。一般に、不滅細胞系統(例えば、骨髄腫細胞系統)は
、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、ネズミのハイブリドーマは、
マウスの不滅細胞系統を用いた本発明の免疫抗原作用因子により免疫化したマウ
スからのリンパ球を融合することによって作ることができる。
【０１３６】 好適な不滅細胞系統は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン(「H
AT培地」)を含む倍地に感受性をもつマウスの骨肉腫細胞系統である。標準技術
に準拠する融合相手として、任意数の骨肉腫細胞系統、例えばP3-NS1/1-Ag4-1,
P3-x63-Ag8.653 or Sp2/O-Ag14骨肉腫系統を使用することができる。これらの骨
肉腫細胞系統は、ATCCから入手可能である。一般に、HAT感受性をもつマウス骨
肉腫細胞系統は、ポリエチレングリコール(「PEG」)を使ってマウスの脾細胞と
融合される。前記の融合で得られたハイブリドーマ細胞は、不融合の細胞及び繁
殖力のない融合細胞を死滅させるHAT倍地を使って選別される(不融合の細胞は、
形質変換されていないので、数日後に死亡する)。本発明のモノクロナール抗体
を産生するハイブリドーマ細胞は、このトランス活性化因子融合タンパク質を結
合する抗体のハイブリドーマ培養上澄みのスクリーニングによって検出される(
例えば、標準ELISAアッセイの使用による)。
【０１３７】 加えて、標準組換えDNA技術を使って作製できるヒト部分と非ヒト部分の両方
を含んだ、キメラ及びヒト化モノクロナール抗体などの、組換え抗トランス活性
化因子融合タンパク質抗体は、本発明の前記適用範囲内である。上述のキメラ及
びヒト化モノクロナール抗体は、例えば、Robinson et al. International Appl
ication No. PCT/US86/02269; Akira, et al. European Patent Application 18
4,187; Taniguchi, M., European Patent Application 171,496; Morrison et a
l. European Patent Application 173,494; Neuberger et al. PCT Internation
al Publication No. WO 86/01533; Cabilly et al. U.S. Patent No. 4,816,567
; Cabilly et al. European Patent Application 125,023; Better et al. (198
8) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
4:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (19
87) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc.
Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al
. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Sc
ience 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter U.S. P
atent 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al
. (1988) Science 239:1534; and Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:405
3-4060に記載される方法を使う、現在知られている組換えDNA技術によって産生
することができる。
【０１３８】 抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体(例えば、モノクロナール抗体)は、
アフィニティー・クロマトグラフィー又は免疫沈降などの標準技術によって、ト
ランス活性化因子融合タンパク質を単離するために使用できる。抗トランス活性
化因子融合タンパク質抗体は、宿主細胞に発現される組み換えによって産生され
たトランス活性化因子融合タンパク質の精製を簡便にできる。さらに、抗トラン
ス活性化因子融合タンパク質抗体は、このトランス活性化因子融合タンパク質の
発現の存在比及びパターンを評価するために、(例えば、細胞の溶解質又は細胞
の上澄みで)トランス活性化因子融合タンパク質を検出するためにも使用するこ
とができる。抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体は、診断上、臨床検査手
順の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターするため、例えば、所定の
治療法の臨床応用を判断するためにも使用できる。検出可能な物質に対する抗体
のカップリング(物理的連結)によって、検出を簡便にできる。検出可能な物質の
例として、各種の酵素、人工グループ、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及
び放射性物質があげられる。適当な酵素の例として、ホースラディシュ・ペルオ
キシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、又はアセチル
コリンエステラーゼがあげられ、適当な人工グループ複合体として、ストレプタ
ビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンがあげられ、適当な蛍光物質の例として
、アンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアン酸塩、ロ
ーダミン、ジクロロトリアジニラミンフルオレセイン、ダンシルクロライド又は
フィコエリトリンがあげられ、発光物質の例として、ノミノールがあげられ、生
物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンがあげ
られ、そして適当な放射性物質として、125I、131I、35S又は3Hがあげられる。
【０１３９】 組換え発現ベクター 本発明の別の態様は、トランス活性化因子融合タンパク質(又は、これらの部
分)をコード化する核酸を含む、ベクター、望ましい発現ベクターに関連してい
る。
【０１４０】 本発明の組換え発現ベクターとは、ウイルスの核酸に導入される核酸の発現に
対応するウイルス、又はこれらの部分である。例えば、複製欠損レトロウイルス
、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスが使用できる。上述のウイルスを用い
て組換えレトロウイルスを産生するためのプロトコル及びin vitro又はin vivo
の細胞を感染させるプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology,
Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sectio
ns 9.10-9.14 及びその他の標準実験マニュアルに記載されている。適当なレト
ロウイルスの例として、現在では当業者によく知られているレトロウイルスとし
て周知であるpLJ、pZIP、pWE及びpEMがあげられる。適当なパッケージングウイ
ルス系統の例として、ΨCrip、ΨCre、Ψ2及びΨAmがあげられる。アデノウイル
スのゲノムは、転写調節タンパク質をコード化し発現するが、通常の溶菌ウイル
スの生活環で複製する能力に関して不活性化されるように操作できる。例えば、
Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Scien
ce 252:431-434; and Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155を参照のこと
。アデノウイルス株Ad型5 dl324又はその他のアデノウイルス株 (例えば、Ad2、
Ad3、Ad7など)に由来する適当なアデノウイルスのベクターは、現在では当業者
によく知られている。これに代り、Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol.
5:3251-3260に記載されているようなアデノ関連ウイルスベクターを使って、本
発明のトランス活性化因子融合タンパク質を発現することができる。
【０１４１】 本発明の前記組換え発現ベクターは、宿主細胞内にの核酸の発現に適した形質
で本発明の核酸を含む。このことは、前記組換え発現ベクターには、発現される
核酸配列と機能的に連結する、発現のために使用される宿主細胞を基にして選択
される、単一又は複数の調節配列が含まれることを意味する。組換え発現ベクタ
ー内では、「機能的に連結する」は、対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド
配列の発現に対応するように調節配列と連結することを意味するものとして意図
されている(例えば、in vitro転写/翻訳系で又は、このベクターが宿主細胞に導
入されたときに宿主細胞で)。「調節配列」という用語は、プロモーター、エン
ハンサー及びその他の発現制御配列(例えば、ポリアデニレーションシグナル)が
含まれる。上述の調節配列については、例えば、Goeddel; Gene Expression Tec
hnology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990
)に記載されている。調節配列として、多くの型の宿主細胞でヌクレオチド配列
の連続発現を命令する調節配列、及び一部の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の
発現を命令する調節配列(例えば、組織特異調節配列)があげられる。発現ベクタ
ーの設計は、形質変換される宿主細胞の選択、要望するタンパク質の発現レベル
などのような因子に依存できることが、現在では当業者に知られた技術よって認
識されるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入することができ、
これによって、本書に記載されている核酸によってコード化された、融合タンパ
ク質又はペプチドも含めた、タンパク質及びペプチド(例えば、トランス活性化
因子融合タンパク質、トランス活性化因子融合タンパク質の突然変異形質、融合
タンパク質など)を産生することができる。
【０１４２】 本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞又は真核細胞中のトランス活性化因
子融合タンパク質の発現に対応するように設計させることができる。例えば、ト
ランス活性化因子融合タンパク質は、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞(バキ
ュロウイルス)、酵母菌細胞、哺乳動物細胞、又は植物細胞で発現させることが
できる。細菌、真菌、酵母菌、植物、及び哺乳動物の細胞の宿主に使用するに適
したクローニング及び発現ベクターは現在の技術では既知であり、例えば、Powe
ls et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 198
5)に記載されている。原核細胞及び真核細胞の両方に適した発現系については、
Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harb
or Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の第16章及び第17章を参
照のこと。さらに、適当な宿主細胞については、Goeddel, Gene Expression Tec
hnology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990
)に論じられている。これに代り、組換え発現ベクターは、例えば、T7プロモー
ター調節配列及びT7ポリメラーゼを使って、in vitroで翻訳させることができる
。
【０１４３】 原核生物中のタンパク質の発現は、融合又は非融合のどちらかのタンパク質の
発現を命令する組成物又は誘導可能プロモーターを含むベクターを用いて、大腸
菌で最も頻繁に実行される。融合ベクターは、このベクターにコード化されたタ
ンパク質、通常、その組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付
加する。上述の融合ベクターは、一般に1)組換えタンパク質の発現を増加させる
、2) 組換えタンパク質の溶解性を増加させる、及びアフィニティ精製において
リガンドとして作用させることにより組換えタンパク質の精製で補助する、の3
つの目的に利用できる。融合発現ベクターでは、しばしば、融合タンパク質の精
製の後に融合成分から組換えタンパク質を分離できるように、融合成分から組換
えタンパク質の結合時に、蛋白質分解切断部位が導入される。上述の酵素、及び
これらのコグネート認識配列として、Xa因子、トロンビン及びエンテロキナーゼ
があげられる。一般融合発現ベクターとして、グルタチオンS転移酵素(GST)マル
トースE結合タンパク質、又はタンパク質Aをそれぞれ標的の組換えタンパク質に
融合する、pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (19
88) Gene 67:31-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) 及びpRIT5 (P
harmacia, Piscataway, NJ) があげられる。精製されたキメラタンパク質は、ト
ランス活性化因子融合タンパク質の活性アッセイ、又は例えば、トランス活性化
因子融合タンパク質特異抗体を産生させるために利用できる。
【０１４４】 適当な誘導可能な非融合大腸菌発現ベクターの例として、pTrc (Amann et al.
, (1988) Gene 69:301-315)及びpET 11d (Studier et al., Gene Expression Te
chnology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Californ
ia (1990) 60-89)があげられる。pTrc発現ベクターからの標的遺伝子発現は、ハ
イブリドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に基づく。pE
T 11dベクターからの標的遺伝子発現は、共発現したウイルスRNAポリメラーゼ(T
7 gn1)によって媒介されたT7 gn10-lac融合プロモーターからの転写に基づく。
このウイルスポリメラーゼは、lacUV 5プロモーターの転写制御下でT7 gn1遺伝
子を宿す残存プロファージからの宿主菌株BL21(DE3)又はHMS174(DE3)によって供
与される。
【０１４５】 大腸菌の組換えタンパク質の発現を最大にするための1つの戦略は、その組換
えタンパク質を分解により分割する能力に異常がある宿主細菌中のタンパク質を
発現させることである(Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods
in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128)
。別の戦略は、各アミノ酸に対応する個別コドンが大腸菌で選択的に利用される
ようにするため、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変することであ
る(Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118)。上述のような、
本発明の核酸配列の改変は、標準DNA合成技術によって実行することができる。
【０１４６】 酵母菌には組換えタンパク質の発現に対応するベクターがいくつか存在する。
酵母菌S．セリビサエ(S. cerivisae)の発現に対応するベクターの例として、pYe
pSec1 (Baldari. et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Hers
kowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:
113-123), and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)。さらに、 YE
P24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2、又はYRP17は、遺伝子構成体のS．セリビサエ
(S. cerevisae)に導入に有用なクローニング及び発現手段である(例えば、Broac
h et al. (1983) in Experimental Manipulation of Gene Expression, ed.
M. Inouye Academic Press, p. 83, incorporated by reference herein参照)。
これらのベクターは、pBR322 oriの存在により大腸菌(E. coli)内で複製するこ
とが可能で、また酵母2ミクロンプラスミドの複製決定子によりS．セリビサエ(S
. cerevisae)内で複製することが可能である。さらに、薬剤耐性マーカー、例え
ば、真菌系で耐性を付与する抗生物質を使用することも可能である。酵母菌内の
機能に適したプロモーターには、メタロチオネイン、3ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)又は、その他、エノ
ラーゼ、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース6-リン酸イソメ
ラーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸
イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、及びグルコキナーゼなどの解糖
酵素 (Hess et al., J. Adv. Enzyme Req. 7, 149 (1968); and Holland et al.
Biochemistry 17, 4900 (1978))が含まれる。酵母発現に適したベクター及びプ
ロモーターについては、さらにR. Hitzeman et al., EPO Publication. No. 73,
657に記載されている。成長条件によって制御される転写のさらなる利点を有す
る、その他のプロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロ
ムC、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、及び前述のメタロチ
オネイン及びグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース
及びガラクトースの利用に反応可能な酵素に対応するプロモーター領域である。
最後に、2つの半数性交配型の一方だけに活性をもつプロモーターがある環境に
適している場合がある。これらの半数体に特異的なプロモーターのうち、フェロ
モンプロモーターMFal及びMFα1は特に重要である。
【０１４７】 別の好適な実施例においては、本発明の前記組換え発現ベクターは、pCM190GF
P+、pUHD 15-1、pREP9、及びpUHDから成るグループから選択されたプラスミドで
ある。
【０１４８】 これに代り、トランス活性化因子融合タンパク質は、バキュロウイルスの発現
ベクターを使って昆虫細胞で発現させることができる。培養された昆虫細胞(例
えば、Sf 9細胞)でタンパク質の発現に使用可能なバキュロウイルスには、pAcシ
リーズ(Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165)及びpVLシリーズ(L
ucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39)が含まれる。
【０１４９】 また別の実施例においては、本発明の核酸は、哺乳動物の発現ベクターを使っ
て哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物の発現ベクターには、複製起点のような
非転写配列、発現される遺伝子と連結する適当なプロモーター及びエンハンサー
、及びその他、5'又は3' にフランキングする非転写配列、及び5'又は3' 非翻訳
配列(必須のリボソーム結合部位、ポリアデニレーション部位、スプライス供与
体及び受容体部位など)、及び転写終結配列が含まれよう。哺乳動物細胞で使用
されたとき、組換え発現ベクターの制御機能がウイルスの遺伝物質によって提供
されることがよくある。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、
アデノウイルス2、サイトメガロウイルス及びシミアンウイルス40に由来する。
この融合タンパク質の発現の命令にウイルス調節配列を使用すると、各種の宿主
細胞でこの融合タンパク質の高レベル連続発現を可能にできる。哺乳動物の発現
ベクターの例には、pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840)及びpMT2PC (Kauf
man et al. (1987) EMBO J. 6:187-195)が含まれる。
【０１５０】 別の実施例においては、前記の組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の種類の
細胞に選択的に核酸の発現を命令する能力を有する(例えば、組織特異調節配列
を使用してその核酸を発現させる)。組織特異調節配列は、現在の技術では既知
である。適当な組織特異なプロモーターには以下があるが、アルブミンプロモー
ター(liver-specific; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277)、リンパ
球特異プロモーター (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275)、
特にT細胞受容体のプロモーター(Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-
733) 及び免疫グロブリン (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen an
d Baltimore (1983) Cell 33:741-748)、ニューロン特異プロモーター (e.g., t
he neurofilament promoter; Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 86:5473-5477)、膵臓特異プロモーター (Edlund et al. (1985) Science
230:912-916)、及び乳腺特異プロモーター (e.g., milk whey promoter; U.S. P
atent No. 4,873,316 and European Application Publication No. 264,166)が
含まれる。発生的に調節されるプロモーター、例えば、マウスhoxプロモーター(
Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379) 及びαフェトプロテインプロ
モーター (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546)、これに限って
はいない。
【０１５１】 本発明は、さらにアンチセンス方向に発現ベクターにクローニングされた本発
明のDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、このDNA分子は、トラ
ンス活性化因子融合タンパク質mRNAのアンチセンスであるRNA分子の発現を可能
にするような(DNA分子の転写によって)様態で、機能的に調節配列に連結する。
アンチセンス方向にクローニングされた核酸に機能的に連結する調節配列が選択
されると、各種の細胞でアンチセンスRNA分子の連続発現を命令させることがで
き、例えば、ウイルスプロモーター又はエンハンサー、或いはこの両方、若しく
は調節配列が選択されると、アンチセンスRNAの連続発現、組織特異発現又は細
胞の種類特異発現を命令させることができる。アンチセンス発現ベクターは、組
換えプラスミド、ファージミド又は弱毒化ウイルスの形をとることができる。こ
れらではアンチセンス核酸は高効率調節領域の制御下で産生され、これらの活性
は、このベクターが導入される細胞の種類によって決定される。アンチセンス遺
伝子を使った遺伝子発現の調節についての解説は、Weintraub, H. et al., Anti
sense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in
Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【０１５２】 宿主細胞 本発明の別の態様は、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質の核酸分子
が導入される宿主細胞、例えば、組換え発現ベクター内のトランス活性化因子融
合タンパク質核酸分子、又はその分子を相同的に宿主細胞のゲノムの特定部位に
組み換えることが可能な配列を含んでいるトランス活性化因子融合タンパク質核
酸分子が導入される宿主細胞に関連している。
【０１５３】 上記の融合タンパク質をコード化する核酸は、真核細胞をトランスフェクトす
るための標準技術によって宿主細胞に導入することが可能である。「トランスフ
ェクト」又は「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム共沈、
DEAEデキストラン媒介によるトランスフェクション、リポフェクション、エレク
トロポレーション(電気穿孔法)及びマイクロインジェクション(微量注入法)が含
まれる、従来の技術を全て含有するものとして意図されている。宿主細胞をトラ
ンスフェクトさせるのに適した方法については、Sambrook et al. (Molecular C
loning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
press (1989))、及びその他の実験用教科書に掲載されている。例えば、レトロ
ウイルスベクター(例えば、Ferry, N et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 88:8377-8381; and Kay, M.A. et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-64
7参照)、アデノウイルスベクター(例えば、Rosenfeld, M.A. (1992) Cell 68:14
3-155; and Herz, J. and Gerard, R.D. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
0:2812-2816参照)、受容体媒介DNAの取込み(例えば、Wu, G. and Wu, C.H. (198
8) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963
-967; and U.S. Patent No. 5,166,320参照)、DNAの直接注入 (例えば、Acsadi
et al. (1991) Nature 332: 815-818; and Wolff et al. (1990) Science 247:1
465-1468参照) 又は粒子の衝撃的投与(例えば、Cheng, L. et al. (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:4455-4459; and Zelenin, A.V. et al. (1993) FEBS
Letters 315:29-32参照)などの、in vivoの細胞への核酸の導入に適したデリバ
リー(送達)メカニズムの応用によって、in vivoで核酸を細胞に転移させること
ができる。このように、遺伝子治療目的のため、in vivoで細胞を修飾し被験体
に供与することができ、これに代り、in vivoで細胞を直接修飾することもでき
る。
【０１５４】 本発明の核酸を用いて形質転換される宿主細胞の数は、少なくとも一部、使用
される組換え発現ベクターの型及び使用されるトランスフェクション技術の型に
よって異なってくるであろう。核酸を一過的に宿主細胞に導入することができ、
若しくはもっと一般に、遺伝子発現の長期的調節のため、核酸を宿主細胞のゲノ
ムの中に安定的に組み込むか、又は宿主細胞の中に安定したエピソームとして残
存する。哺乳動物細胞に導入されるプラスミドが宿主細胞DNAに組み込まれる頻
度は一般に低い。これらの構成体を特定するため、選択可能マーカー(例えば、
薬剤耐性)を含有する遺伝子は、一般には対象の核酸と一緒に宿主細胞に導入さ
れる。好適な選択可能マーカーには、G418及びヒグロマイシンのようないくつか
の薬剤に対する耐性を付与するマーカーが含まれる。選択可能マーカーは、対象
の核酸からの分離プラスミドに付けて導入するか、又は同じプラスミドに付けて
導入することが可能である。本発明の核酸(例えば、組換え発現ベクター)選択可
能マーカー対応の遺伝子を用いてトランスフェクトされた宿主細胞は、この選択
可能マーカーを使って細胞のために選択を行って特定することができる。例えば
、この選択可能マーカーがネオマイシン耐性を付与する遺伝子をコード化する場
合、核酸を取り込んだ宿主細胞をG418を用いて選択することができる(選択可能
マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残るであろうが、他の細胞は死滅する)
。
【０１５５】 本発明の融合タンパク質をコード化する核酸を用いてトランスフェクトされた
宿主細胞は、融合タンパク質に対して標的の役目をする、単一又は複数の核酸を
用いてさらにトランスフェクトすることが可能である。この標的核酸は、少なく
とも1つのtetオペレーター配列に機能的に連結するヌクレオチドを含む。
【０１５６】 培養中の原核又は真核宿主細胞のような、本発明の宿主細胞は、トランス活性
化因子融合タンパク質を産生する(即ち、発現させる)ために使用することが可能
である。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を使ってトランス活性化因子融合
タンパク質を産生するための方法をさらに提供する。ある実施例においては、本
発明は、トランス活性化因子融合タンパク質を産生するために適した培地で、(
トランス活性化因子融合タンパク質をコード化する組換え発現ベクターが導入さ
れた)本発明の宿主細胞を培養することを含む。
【０１５７】 トランス活性化因子融合タンパク質の発現 本発明の融合タンパク質をコード化する核酸を宿主細胞内に導入すると、その
核酸が、宿主細胞中のその融合タンパク質の発現に適した形質である場合には、
本発明の融合タンパク質が原核細胞内に発現される。例えば、この融合タンパク
質をコード化する、本発明の組換え発現ベクターが、宿主細胞内に導入される。
これに代り、調節配列(例えば、プロモーター配列)に機能的に連結するが付加ベ
クター配列のない、融合タンパク質をコード化する核酸を、宿主細胞に導入する
ことができる。
【０１５８】 細胞系統に加えて、本発明は、遺伝子治療目的で修飾される細胞、又はトラン
スジェニック又は相同組換え動物を創造するために修飾された胚細胞などのよう
な、正常(例えば、プライマー)にも応用可能である。遺伝子治療目的に特に対象
細胞の種類の例には、造血幹細胞、筋芽細胞、膵臓のβ細胞、肝細胞、リンパ球
、神経細胞及び皮膚の上皮及び気道の上皮が含まれる。対象のなプライマー細胞
には、細胞サイクル制御に関与する遺伝子がtTA/rtTA調節下に置かれている細胞
系統も含まれる。上述の新規細胞系統は条件に因っては増殖することもあり、テ
トラサイクリンの追加又は除去による成長停止に際して鎮静期の分化状態を回復
することができ、そして薬理学及び遺伝子治療に役に立つであろう。さらに、ト
ランスジェニック又は相同組換え動物において、トランス活性化因子融合タンパ
ク質をコード化する核酸を含ませるため、造血幹細胞及び受精卵母細胞を修飾す
ることができる。さらに、トランスジェニック植物を創造するため、植物細胞を
修飾することもできる。
【０１５９】 トランスジェニック生物 単一又は複数の細胞の種類で、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質を
発現するトランスジェニック動物を創造するため、この融合タンパク質の核酸を
非ヒト動物の受精卵母細胞に転移させることができる。トランスジェニック動物
は、導入遺伝子がこの動物又は出生前にこの動物の先祖に導入された場合、導入
遺伝子を含有する細胞を有する動物である。導入遺伝子は、トランスジェニック
動物が開発された起原の細胞のゲノムに組み込まれ、成熟動物のゲノムに残存し
ているDNAであり、これによって、トランスジェニック動物の単一又は複数の細
胞の種類又は組織中のコード化遺伝子産物の発現を命令する。ある実施例におい
ては、非ヒト動物はマウスであるが、本発明がこれに限定されることはない。あ
る実施例においては、トランスジェニック動物は、やぎ、羊、豚、牛又はその他
の家畜である。上述のようなトランスジェニック動物は、タンパク質の大量生産
(いわゆる「遺伝子ファーミング(gene pharming)」)に有用である。
【０１６０】 トランスジェニック動物は、例えば、上述の融合タンパク質をコード化する核
酸(一般に、構成体又は組織特異エンハンサーなどの適切な調節配列に連結する)
を、受精卵母細胞の雄の前核に導入させ(例えば、マイクロインジェクションに
よって)、この受精卵母細胞を擬似妊娠雌で発育させる方法によって、創造する
ことができる。この導入遺伝子の発現の効率を向上させるため、イントロンの配
列及びポリアデニレーションシグナルもこの導入遺伝子に組み込むことができる
。トランスジェニック動物を誕生させる方法、特にマウスのような動物は、現在
では既成技術になっており、例えば、U.S. Patent Nos. 4,736,866 and 4,870,0
09 and Hogan, B. et al., (1986) A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,
New York, Cold Spring Harbor Laboratoryに記載されている。トランスジェニ
ック初代動物は、導入遺伝子を保有するさらなる動物を繁殖させるために使用で
きる。本発明のこの融合タンパク質をコード化する導入遺伝子を保有するトラン
スジェニック動物は、さらに他の導入遺伝子を保有する他のトランスジェニック
動物、例えば、機能的にtetオペレーター配列に連結する遺伝子を含有するトラ
ンスジェニック動物(第3章に詳述されている)と交配させることができる。
【０１６１】 本書に記載されている調節系は、トランスジェニック動物に加えて、トランス
ジェニック植物のような他のトランスジェニック生物にも応用させることができ
る。トランスジェニック植物は、現在では知られた既成技術によって作製するこ
とができる。従って、本発明には、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質
を包含する細胞を含有する、動植物を含めた非ヒトトランスジェニック生物が包
含される(このトランス活性化因子をコード化する核酸は、トランスジェニック
生物の細胞内の単一又は複数の染色体に組み込まれる)。
【０１６２】 相同組換え生物 本発明は、本発明の上述の融合タンパク質を発現する相同組換え非ヒト生物を
提供する。ある実施例においては、非ヒト動物はマウスであるが、本発明がこれ
に限定されることはない。この融合タンパク質をコード化する核酸が、ゲノムの
特定物に導入された、例えば、その核酸は内生的遺伝子を用いて相同的に組み換
えられた、動物を創造することができる。
【０１６３】 上述のような組換え動物を創造するため、相同組換えが発生する真核遺伝子の
追加核酸によって、5'及び3'末端に隣接する融合タンパク質をコード化するDNA
を含有するベクターを作製する。この融合タンパク質をコード化する追加核酸は
、真核遺伝子を用いて正常に相同組み換えできる十分な長さであるものとする。
一般に、上記ベクターには数キロベースのフランキングDNA(5'及び3'末端の両方
に)が含まれている(相同組換えベクターの説明については、例えば、Thomas, K.
R. and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503 を参照のこと)。このベクターは
、胚幹細胞系統に導入され(例えば、エレクトロポレーション)、導入されたDNA
が内生的DNAと相同的に組み換えられた細胞が選択される(Li, E. et al. (1992)
Cell 69:915)。選択された細胞は、その後動物の杯盤胞に注入されて、集合キ
メラを形成する(例えば、Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Ste
m Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) p
p. 113-152参照)。キメラ胚は、適当な擬似妊娠雌養育動物の中に移植され、こ
の胚を出産に至らせる。生殖細胞内に相同的に組み換えられたDNAを宿す子孫を
使って、動物の全細胞に相同的に組み換えられたDNAを含有する、動物を繁殖さ
せることができる。これらの「生殖細胞系伝達」動物を、さらに少なくとも1つ
のtetオペレーター配列に機能的に連結する遺伝子を保有する動物と交配させる
ことができる(第3章に詳述されている)。
【０１６４】 上述の相同組換えアプローチのほか、酵素の助成による部位特異組込み系が、
現在の技術では知られており、これを本発明の調節系の構成体に応用して、2番
目の標的DNA分子中のあらかじめ決定した位置にあるDNA細胞に組み込むことがで
きる。上述の、酵素の助成による部位特異組込み系の例については、Cre recomb
inase-lox標的系(例えば、Baubonis, W. and Sauer, B. (1993) Nucl. Acids Re
s. 21:2025-2029; and Fukushige, S. and Sauer, B. (1992) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 89:7905-7909に記載されている)及びFLP recombinase-FRT標的系(例
えば、Dang, D.T. and Perrimon, N. (1992) Dev. Genet. 13:367-375; and Fie
ring, S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8469-8473に記載され
ている)。
【０１６５】 tetオペレーター連結によるヌクレオチド配列の発現の調節 tetオペレーター連結によるヌクレオチド配列は、本発明のトランス活性化因
子融合タンパク質によって調節される。従って、この融合タンパク質と標的核酸
は、どちらも宿主細胞即ち生物に存在する。同じ宿主細胞即ち生物にトランス活
性化因子融合タンパク質と標的転写単位の両方を存在させることは、いくつかの
異なった方法によって達成することができる。例えば、この発現系の1つの核酸
を用いて、宿主細胞をトランスフェクトさせ(例えば、トランス活性化因子融合
タンパク質のコード化)、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択し、そし
てそのトランスフェクトした細胞を、その発現系の他の核酸に対応する核酸(転
写される標的の核酸)を用いて再トランスフェクトする(「スーパートランスフェ
クト(supertransfect)する」とも言う)ことができる。2つの区別される選択可能
なマーカーは、選択に使用することができる。例えば、最初の核酸の取込みはG4
18を用いて選択し、2番目核酸の取込みはヒグロマイシンを用いて選択すること
ができる。これに代り、1つの細胞集団を、この系の両方の構成体に対応する核
酸を用いてトランスフェクトすることもできる。
【０１６６】 この宿主細胞は、in vivoで培養された細胞であるか、若しくはin vivoに存在
する場合がある(例えば、遺伝子治療のための標的にされる細胞)。この宿主細胞
は、さらに非ヒトトランスジェニック動物又は相同組換え動物の創造に使用され
る、受精卵母細胞、胚幹細胞又はその他の胚細胞でも可能である。この発現系の
両方の核酸構成体を含むトランスジェニック動物又は相同組換え動物は、両方の
核酸を胚の時期にある同じ細胞に導入することによって創造することもできるが
、もっと好適な場合は、このゲノムの中にこの系の1つの核酸構成体を保有する
動物を、このゲノムの中にこの系の1その他の核酸構成体を保有する動物と交配
されることである。両方の核酸構成体を継承した子孫は、この後標準技術によっ
て識別することができる。
【０１６７】 本発明のトランス活性化因子融合タンパク質をコード化する核酸を保有する宿
主細胞、及びtetオペレーター配列に機能的に連結するヌクレオチド配列(即ち、
転写される対象の遺伝子)では、テトラサイクリン又はその類似体によって、tet
オペレーター配列に機能的に連結するヌクレオチド配列を調節することができる
。従って、本発明の別の態様は、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質を
発現する、宿主細胞又は動物中のtetオペレーター配列に機能的に連結するヌク
レオチド配列の転写を刺激する方法に関連している。この方法には、テトラサイ
クリン及びその類似体を用いて上記細胞を接触させること、又はテトラサイクリ
ン又はその類似体をその細胞が含まれる被験体に投与することが必然的に含まれ
る。
【０１６８】 in vivoの細胞内の遺伝子発現を誘導するためには、Tc又はその類似体の化合
物を含有する倍地でその細胞を培養することによって、この細胞をTc又はその類
似体と接触させる。in vivoで遺伝子発現を誘導するためには、上述の化合物を
この被験体に投与することによって、被験体内の細胞をTc又はその類似体に接触
させる。「被験体」という用語は、去る、牛、やぎ、羊、犬、猫、うさぎ、ラッ
ト、マウス、及びこれらのトランスジェニック又は相同組換え種が含まれるもの
として意図されている。さらに、「被験体」という用語は、トランスジェニック
植物のような植物も含まれるものとして意図されている。Tc又はTc類似体は、遺
伝子の誘導に十分なin vivo濃度に達するために有効な任意手段によって、被験
体に投与することが可能である。適当な投与方式の例には、経口投与(例えば、
飲料水に誘導剤を溶解させる)、緩慢放出ペレット及び拡散ポンプの埋め込みが
含まれる。トランスジェニック植物にTc又はTc類似体を植物に投与するためには
、植物にかける水に誘導剤を溶解することができる。
【０１６９】 この系における誘導剤として別のTc類似体を使用できる能力があれば、tetオペ
レーター連結によるヌクレオチド配列の発現レベルを変調することが可能である
。このため、所望の遺伝子発現の誘導レベルに基づいて、類似体を誘導剤として
適切なテトラサイクリンを選択する。時間経過に伴って、類似体を誘導剤として
使用されるTc類似体を変更することにより、宿主細胞内又は動物体内の遺伝子発
現レベルを変えることも可能である。例えば、最初に強く突発的に遺伝子発現さ
せ、その後遺伝子発現を低レベルに持続させることが望ましい状況もあり得る。
このような場合、最初に高レベルの転写を刺激する類似体を誘導剤として使用し
、その後その誘導剤を低レベルの転写を刺激する誘導剤に切り替えることも可能
である。さらに、複数のヌクレオチド配列の発現を調節するとき(例えば、ある
配列はあるクラスのtetオペレーター配列によって調節され、別のクラスのtetオ
ペレーター配列によって調節されるとき)は、転写の調節に使用されるトランス
活性化因子融合タンパク質に応じて、及び誘導剤として使用されるTc類似体に応
じて、各配列の発現レベルを独立的に変化させることも可能かもしれない。トラ
ンス活性化因子融合タンパク質の違いによって、Tc類似体に対する応答レベルを
異なる可能性がある。特定の組み合わせのトランス活性化因子融合タンパク質と
誘導剤(Tc又はTc類似体)による遺伝子発現の誘導剤レベルは、本書に前述した技
術によって決定することができる。さらに、遺伝子発現のレベルは、誘導剤の濃
度の変化によっても変調することができる。このため、本発明の発現系は、遺伝
子発現のオン/オフを切り替えるためだけでなく、使用される誘導剤の種類及び
濃度に応じて、遺伝子発現のレベルを中間レベルに「微調整」するためのメカニ
ズムも提供する。
【０１７０】 本発明の応用 本発明は、発現のオン/オフを切り替える能力、又は多相遺伝性又は細胞毒性
のない高速かつ効率的かつ制御された態様で遺伝子発現のレベルを調節する能力
をもつことが望ましい多様な状況に広く応用可能である。例えば、本発明の核酸
及びタンパク質は、真核細胞、植動物での細胞の発達及び分化の研究に使用する
用途がある。オンコジーン(癌遺伝子)の機序を研究するため、オンコジーンの発
現を細胞で制御下の態様で調節することが可能である。さらに、この系は、特定
の発育期に制御条件下でトランスジェニック生物の遺伝子型を不可逆的に修飾で
きるように、CRE又はFLPのような部位特異レコンビナーゼ(原語: recombinase)
を調節するために使用することができる。例えば、特定のトランスジェニック植
物の選別能力をもつ、トランスジェニック植物のゲノムに挿入された薬剤耐性マ
ーカーを、Tcで調節した部位特異リコンビナーゼによって不可逆的に除去できる
かもしれない。本発明の調節系の応用には、その他、以下が含まれる。
【０１７１】 A. 遺伝子治療 本発明は、とりわけ遺伝病又は後天的疾患のどちらかの治療で、遺伝子治療目
的に有用であるかもしれない。遺伝子治療の一般アプローチには、導入された遺
伝物質によってコード化された単一又は複数の遺伝子産物を細胞内で産生して、
機能的活性を回復又は向上させるように、核酸を細胞内に導入することが必然的
に含まれる。遺伝子治療アプローチに関するレビューについては、Anderson, W.
F. (1992) Science 256:808-813; Miller, A.D. (1992) Nature 357:455-460; F
riedmann, T. (1989) Science 244:1275-1281; and Cournoyer, D., et al. (19
90) Curr. Opin. Biotech. 1:196-208を参照のこと。ただし、現在の遺伝子治療
ベクターは、内生的転写因子に応答可能である構成調節配列を利用する。これら
のベクター系では、被験体での遺伝子発現のレベルを変調する能力は考慮されて
いない。これに対し、本発明の方法によって特定される、上記のタンパク質、モ
ジュレーター分子及び遺伝子調節配列は、in vitro又はin vivoで細胞内の遺伝
子発現を変調する能力を提供する。
【０１７２】 ある実施例において、遺伝子治療目的で本発明の系を使用するため、遺伝子治
療に必要とする被験体の細胞は、1) この宿主細胞でトランス活性化因子の発現
に適した形質で、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質をコード化する核
酸、2) tetオペレーター配列に機能的に連結する対象の遺伝子(例えば、治療目
的で)、を含有するように修飾される。その被験体の細胞をex vivoで修飾した後
、被験体内に導入するか、若しくは、in vivoでその細胞を直接修飾することも
できる。この被験体の細胞内の対象の遺伝子の発現は、Tc又はTc類似体をその患
者に投与することによって刺激される。遺伝子発現のレベルは、どの特定Tc類似
体を誘導剤として使用するかによって、変化させることができる。その患者に投
与するテトラサイクリン又はその類似体の供与量を調節し、それによって対象の
循環及び組織で達する濃度を調製することによっても、遺伝子発現のレベルは変
調できる。
【０１７３】 本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用す
ることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与(U.S. Pa
tent 5,328,470参照) によるか、又は定位注射(例えば、Chen et al. (1994) Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057参照)によって、被験体に送達すること
ができる。遺伝子治療ベクターの調剤には、受容希釈剤中の遺伝子治療ベクター
が含めれるか、若しくは遺伝子デリバリ手段が埋め込まれている緩慢放出基質を
含むことができる。これに代り、完全な遺伝子デリバリーベクターは、組換え細
胞、例えばレトロウイルスベクターから、完全なまま産生することができる。調
剤には、遺伝子デリバリー系を産生する単一又は複数の細胞を含めることができ
る。製薬組成物は、容器、包み、又はディスペンサーに入れ、それに処方箋を付
けることができる。
【０１７４】 宿主細胞内の対象の調節された部分の発現をモニターするには、イムノソルベ
ントなど、現在の技術では知られた既成の検出方法することができ、Tc又はTc類
似体の濃度は、対象の部分の発現レベルが要望レベルに達するまで変えることが
できる。従って、対象の部分の発現は、個人の寿命ごとに変わり得る、個人の医
学的ニーズに従って調整することができる。被験体の細胞内の対象の遺伝子の発
現を停止するには、誘導剤の投与が停止される。このため、本発明の調節系は、
治療状況の要件に応じて、遺伝子発現のレベルの調整に対応能力に関して構成調
節系より多くの利点を有する。
【０１７５】 遺伝病又は後天的疾患の治療のため被験体の細胞内に発現される対象の遺伝子
には、アデノシンデアミナーゼ、VIII因子、IX因子、ジストロフィン、βグロビ
ン、LDL受容体、CFTR、インシュリン、エリスロポエチン、抗脈管形成因子、成
長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、βグルクロニダーゼ、α1抗トリプシン
、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、オルニチン
トランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、UDP-グルクロニシ
ルトランスフェラーゼ、apoA1、TNF、溶解TNF受容体、インターロイキン(例えば
、IL-2)、インターフェロン(例えば、α又はγIFN)及びその他のサイトカイン及
び成長因子、をコード化するものが含まれる。遺伝子治療目的のため修飾できる
細胞の種類には、造血幹細胞、筋芽細胞、肝細胞、リンパ球、皮膚の上皮及び気
道の上皮が含まれる。細胞の種類、遺伝子及び遺伝子治療法の詳細については、
Wilson, J.M et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armen
tano, D. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Wolff, J
.A. et al. (1990) Science 247:1465-1468; Chowdhury, J.R. et al. (1991) S
cience 254:1802-1805; Ferry, N. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:8377-8381; Wilson, J.M. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; Qu
antin, B. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584; Dai, Y.
et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; van Beusechem,
V.W. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Rosenfeld,
M.A. et al. (1992) Cell 68:143-155; Kay, M.A. et al. (1992) Human Gene T
herapy 3:641-647; Cristiano, R.J. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 90:2122-2126; Hwu, P. et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; and He
rz, J. and Gerard, R.D. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816を
参照のこと。
【０１７６】 癌治療で特に重要な遺伝子治療応用には、腫瘍部位で抗腫瘍免疫応答を誘導す
るための腫瘍浸潤リンパ球中のサイトカイン遺伝子の過発現(例えば、TNF-α)又
は腫瘍細胞中のサイトカインの異所性発現、無毒物を毒物に変換できる腫瘍細胞
中の酵素の発現、抗腫瘍免疫応答を誘導するための腫瘍特異抗原の発現、腫瘍細
胞中の腫瘍抑制遺伝子(例えば、p53又はRb) 、化学療法の毒性から骨髄細胞を保
護するための骨髄細胞中の多剤耐性遺伝子(例えば、MDR1又はMRP、或いはこの両
方) の発現が含まれる。
【０１７７】 ウイルス性の病気の治療特に重要な遺伝子治療応用には、HIVに関してトラン
ス−ドミナントネガティブtat及びrev変異体又はHSVに関しトランス−ドミナン
トなICp4変異体などのトランス−ドミナント・ネガティブウィルストランス活性
化たんぱくの発現 (例えば、Balboni, P.G. et al. (1993) J. Med. Virol. 41:
289-295; Liem, S.E. et al. (1993) Hum. Gene Ther. 4:625-634; Malim, M.H.
et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1197-1201; Daly, T.J. et al. (1993) Bioc
hemistry 32:8945-8954; and Smith, C.A. et al. (1992) Virology 191:581-58
8参照) 、HIVに対するenv突然変異体などの優生転移外膜タンパク質の発現(例え
ば、Steffy, K.R. et al. (1993) J. Virol. 67:1854-1859参照)、ウイルス産物
を標的とする抗体又はその断片の細胞内発現(「内部免疫」、及び可溶性WCD4に
ついて、例えば、 Marasco, W.A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:7889-7893参照) 、可溶性CD4などの可溶性ウイルス受容体の表現などが含ま
れる。さらに、本発明の系は、細胞内の適当な遺伝子を条件付きで発現させ、そ
れによって目的の機能が提供された後に細胞の除去するためにも使用することが
できる。例えば、ワクチン接種に使用される細胞は、Tc又はTc類似体を前記被験
体に投与してその細胞内の遺伝子の発現を誘導することによって、その被験体に
免疫応答を生じさせた後に除去することができる。
【０１７８】 本発明のTcに制御された調節系は、特に遺伝子治療への応用に適している数々
の優位特性を有する。例えば、この系は、被験体内の遺伝子産生物の供与を調節
することができる、遺伝子発現の「オン/オフ」スイッチを提供する。例えば、
群レベルで単純に連続的遺伝子産物を提供するだけでなく、特定のレベル又は特
定の時間(或いはこの両方)の定期的な態様に遺伝子産物を供与できたら望ましい
と思われる状況がいくつかある。例えば、最も効果的な時間に重要な遺伝子産物
を最も有効なレベルで、一定の間隔に対象の遺伝子をオンに切り替えることがで
きる。被験体内で産生された遺伝子産物のレベルは、標準方法によってモニター
することができる(ELISA又はRIAなどの免疫学的検定を使って直接モニターする
か、対象の遺伝子産物の機能、例えば血糖レベルなどに応じて間接的に実験室パ
ラメータをモニターすることによって)。被験体内の遺伝子の発現を個別の時間
間隔に「オン」に入れ、他方その他の時にはその遺伝子を「オフ」に保つことが
できると、対象の遺伝子産物の供与を断続的に続ける必要がなくなる。苦痛を与
えるか副作用が生じるか、若しくはこの両方が生じる上、医者へ通院し続ける必
要がありそうなを遺伝子産物の注射を反復する必要は、このアプローチによって
なくなる。これと対照的に、本発明の前記系はこれらの欠点がなくなる。その上
、被験体内の遺伝子の発現が個々の時間間隔に「オン」に入る能力があるため、
苦痛を伴い顕著な徴候があり治療の必要がある急性期の時機だけ、「突発的」活
性を必要とする、疾病の治療に専念することができる。上述のような病気が寛解
した時には、前記発現系を「オフ」状態に保つことができる。
【０１７９】 個別の時間間隔中に体内の遺伝子の発現を変調できるこの能力から特に便宜を
得る可能性がある遺伝子治療応用には、下記の例が含まれるが、これに限っては
いない。
【０１８０】 リウマチ様関節炎 - 炎症性サイトカインの産生を阻害する遺伝子産物をコー
ド化する遺伝子(例えば、TNF, IL-1及びIL-12)は、被験体で発現させることがで
きる。上述の阻害剤の例には、サイトカインに対する受容体の溶解形質が含まれ
る。さらに若しくはこれに代り、サイトカインIL-10又はIL-4或いはこの両方(保
護的Th2型応答を刺激する)を発現することができる。その上、グルココルチコミ
メトリック受容体(GCMR)を発現することができる。
【０１８１】 下垂体機能低下症 - ヒト成長ホルモンに対する遺伝子は、遺伝子発現が必要
なとき、正常な発達が達成されるまで、若年幼児期だけ上述の被験体で発現させ
ることができる。正常な発達が達成されたときには、遺伝子発現を抑制するよう
に調節することができる。
【０１８２】 創傷治癒/組織再生 - 治癒プロセスに必要な因子(例えば、成長因子、脈管形
成因子など)は、必要とするときだけ発現させ、その後、抑制するように調節す
ることができる。
【０１８３】 抗がん治療 - 抗がん治療に有用な遺伝子産物の発現は、腫瘍成長の制止が達
成されるまで、治療段階に限定することができる。その後、遺伝子産物の発現を
抑制するように調節することができる。可能な全身性抗がん治療には、免疫活性
化分子(例えば、IL-2, IL-12 など)を発現する腫瘍浸潤リンパ球、脈管形成阻害
剤(PF4、IL-12など)、ヘルレグリン(原語: Her-regulin)、ロイコレグリン(原語
: Leukoregulin)(PCT Publication No. WO 85/04662参照)、及びG-CSF、GM-CSF
及びM-CSFのような骨髄補助療法のための成長因子、の使用が含まれる。このう
ち最後に関して、骨髄補助療法のための因子を発現するために、本発明の調節系
を使用すると、定期的間隔に簡単に化学療法から骨髄補助療法に切り替えること
ができる(同様に、上述のようなアプローチはAIDS治療にも応用でき、例えば、
簡単に抗ウイルス治療から骨髄補助療法へ切り替えることができる)。さらに、
抗がん治療の被制御局部ターゲッティングも可能である。例えば、本発明の調節
因子による自殺遺伝子の発現の場合、この調節因子自体が、例えば腫瘍特異プロ
モーター又は放射線誘導プロモーターによって制御される。
【０１８４】 別の実施例においては、本発明の前記調節タンパク質を使用すると、本発明の
前記系を用いて調節された導入遺伝子によって腫瘍中の脈管形成阻害剤が発現さ
れる。この態様における脈管形成阻害剤の発現は、この阻害剤の全身投与より効
率がよい場合があり、全身投与に伴うことがあるいかなる有害な副作用を解消さ
せるかもしれない。とりわけ、腫瘍内部への脈管形成阻害剤の発現の抑制は、と
りわけ正常の細胞成長に関連してまだ脈管形成中である小児のがん治療に有用で
ある。
【０１８５】 別の実施例においては、サイトカインの高レベル発現調節は、患者自身の免疫
応答を腫瘍細胞に集中させるための方法の代表である。腫瘍細胞の形質導入によ
って、個人の自然免疫応答の増加に重要な化学誘引物質及び成長促進サイトカイ
ンを発現することができる。腫瘍の近位にサイトカインの濃度が最高になるので
、腫瘍抗原に対する免疫学的応答を誘い出す可能性が増大する。このタイプの療
法における潜在的問題は、サイトカインを産生するこれらの腫瘍細胞も免疫応答
の標的になり、このために全ての腫瘍細胞の根絶が確認される前に、サイトカイ
ンのソースが除去されることになる。これに対処するため、免疫系から感染細胞
をマスキングすることで知られたウイルスタンパク質の発現を、同じ細胞中のサ
イトカイン遺伝子とともに、調節下に置くことができる。上述のようなタンパク
質の1つがアデノウイルスからのE19タンパク質(例えば、Cox, Science 247:715
参照)である。このタンパク質は、クラスＩHLA抗原がこの細胞に移入されるのを
阻止し、それによって宿主の細胞傷害性T細胞によるこの細胞の認識及び溶解を
阻止する。従って、腫瘍細胞におけるE19の調節された発現は、サイトカイン発
現によって誘発された免疫応答がオンの状態中に傷害性T細胞からサイトカイン
産生細胞を遮蔽できるであろう。E19を発現するものを除く全ての腫瘍細胞を根
絶するだけの十分な期間の経過後、E19はオフに切り替えられて、これらの細胞
が以後、誘発された抗腫瘍免疫応答のとりこになるようにする。
【０１８６】 良性前立腺肥大症 - 上述と同様に、自殺遺伝子は、本発明の調節因子によっ
て調節することができる。この場合、この調節因子自体は、例えば、前立腺特異
プロモーターによって制御される。
【０１８７】 本発明の前記調節系を使って、制御態様下で自殺遺伝子(例えば、アポトーシ
ス遺伝子、TK遺伝子など)を発現させる能力は、この系の全般的安全性及び有用
性をさらに補足する。例えば、要望する療法の終わりに、自殺遺伝子の発現の引
き金を引き、生体不活性移植組織中の細胞、意図した元来の位置から外に広がっ
た細胞など、遺伝子療法ベクターを保有する細胞を除去することができる。さら
に、移植組織が発癌性になるか、又は副作用があった場合には、自殺遺伝子の誘
導によってこれらの細胞を素早く除去することができる。1つの細胞内で、Tcに
制御された「オン」/「オフ」スイッチを複数使うと、治療上重要な1つの遺伝子
の調節に比べて、自殺遺伝子の調節を完全に独立して行うことができる(本書に
前述されている)。
【０１８８】 さらに、本発明の調節タンパク質は、被験体内で対象の1つの遺伝子産物に対
する治療に関連した発現レベルを設定するのと対照して、達成できた遺伝子産物
発現レベルにフレキシビリティを与えない構成発現の調節を解除するための能力
を提供する。生理学的に関連がある遺伝子産物発現のレベルは、その被験体の特
定の医療ニーズに基づいて、例えば、関連した遺伝子産物レベルをモニターする
実験室テスト(上述の方法を使って)に基づいて、設定することができる。遺伝子
産物を供与する遺伝子を用いた上述の臨床例及び遺伝子に加えて、要望時間に要
望レベルで発現できる、治療に関連するその他遺伝子産物には次のものが含まれ
る。即ち、血友病におけるVIII因子及びIX因子(例えば、スポーツなど傷害のリ
スクがある間は発現を上昇させることができる)、糖尿病におけるインシュリン
又はアミリン(必要に応じて、その被験体の病状によって、食餌療法など)、赤血
球減少症におけるエリスロポエチン(必要に応じて、例えば、末期の腎不全)、肝
臓におけるアテローム性動脈硬化症又は遺伝子治療のための低濃度リポ蛋白受容
体(LDLr)又は非常に低濃度リポ蛋白受容体(VLDLr)(例えば、ex vivo移植組織を
使用)などがある。中枢神経系障害の治療への応用も包含されている。例えば、
アルツハイマー病において、アセチルコリンのレベルを回復するためのコリンア
セチルトランスフェラーゼ(ChAT)の「微調整」発現、神経栄養因子(例えば、NGF
、BDNGFなど)又は補体抑制因子(例えば、sCR1、sMCP、sDAF、sCD59など)、 或い
はこの両方、を達成することができる。上述のような遺伝子産物は、例えば、本
発明の前記系を使って調節された態様で遺伝子産物を発現する移植された細胞に
よって、供給することができる。さらに、パーキンソン病は、レボドパ及びドー
パミンのレベルを増加させるためのチロシン水酸化酵素の「微調整」発現によっ
て治療することができる。
【０１８９】 上述のプロティナーゼの遺伝子産物に加え、機能的RNA分子(アンチセンスRNA
及びリボザイムなど)は、治療目的のため被験体内に制御態様下で発現させるこ
とができる。例えば、突然変異形質の遺伝子と野生型の遺伝子とを判別するリボ
ザイムを設計することができる。従って、「適切なの」遺伝子(例えば、野生型p
53遺伝子)を細胞内に導入し、並行して内生的遺伝子から発現された欠損mRNAを
取り除くため遺伝子(例えば、突然変異した内生的p53遺伝子)の突然変異形質に
特異的な、調節されたリボザイムを導入することができる。このアプローチは、
欠損遺伝子からの遺伝子産物が内生的野生型遺伝子の作用を阻害するような状況
において特に有効である。
【０１９０】 本発明の調節タンパク質を使った被験体での遺伝子産物の発現は、テトラサイ
クリン及びその類似体を使って変調される。このような薬物は、要望する作用部
位への薬物のデリバリー(調節される発現の遺伝子を含有する細胞へのデリバリ
ー)に適切な任意の経路によって投与することができる。関わる特定の細胞の種
類によって、投与の好適な経路は、経口投与、静脈投与及び局所投与が含まれよ
う(例えば、ケラチノサイトなど、皮下の局在移植組織の細胞に達するための経
皮貼布を使う一方、全身治療からいかなる副作用の可能性もなくす)。
【０１９１】 ある遺伝子治療状況においては、治療を受けた被験体に意に反した免疫応答を
なくすか、若しくは抑制するための処置をとる必要があるか、若しくは望ましい
場合がある。治療用遺伝子産物を発現する細胞と逆の反応がないように、可能な
ときは、通常被験体自身の細胞を使って、治療遺伝子産物を発現させる。そのに
は、その被験体から細胞をin vivoで修飾するか、若しくはその被験体から細胞
を採取し、ex vivoでその細胞を修飾し、それらをその被験体に戻すかのどちら
かの方法が使われる。異質遺伝子型又は異種の細胞を使用して、対象の遺伝子産
物を発現させる状況には、治療遺伝子の調節に加えて、本発明の調節系も使用し
て、異物細胞に対する免疫防御反応を下方調節するために、その細胞の免疫認識
に関わる単一又は複数の遺伝子を調節することができる。例えば、細胞表面分子
をコード化するmRNAをはがすリボザイムの異物細胞における発現の調節によって
、治療用遺伝子産物のデリバリーのために使用される異物細胞の表面で、Tリン
パ球による異物細胞の認識に関わる細胞面分子の反応を下方調節することができ
る。意に反する免疫応答を抑制するため、上記の態様で反応を下方調節できる特
に好適な細胞表面分子には、クラスＩ又はII或いはこの両クラスの主要組織適合
複合体(MHC)分子、補刺激活性分子(例えば、B7-1又はB7-2或いはこの両方)、CD4
0、及びICAM-1又はICAM-2のような各種の「接着」分子が含まれる。同じ細胞内
の複数遺伝子の独立的かつ協調的調節のための、本書に記載したアプローチを使
用すると、宿主細胞の細胞表面分子の発現の抑制的調節を、治療遺伝子の発現の
活性化調節と強調させることができる。従って、治療が完了し、治療遺伝子の発
現が止められた後、内生的細胞表面分子の発現を正常に回復させることができる
。
【０１９２】 さらに、前述したように、抗がん治療に関して、MHC抗原の発現を下方調節す
るウイルスタンパク質(アデノウイルスE19タンパク質)は、意に反する免疫反応
を避ける手段として、本発明の前記系を使って宿主細胞内で調節することができ
る。
【０１９３】 治療用遺伝子産物を送達する異物細胞に対する免疫防御反応をなくすか、若し
くは抑えるのに加えて、これらの融合タンパク質は、意に反する免疫反応を刺激
することがある非哺乳動物のポリペプチドを含有しているので、被験体に発現す
る、本発明の調節系の一部の構成体(例えば、本書に記載されている調節融合タ
ンパク質)に対する免疫防御反応をなくすか、若しくは抑える必要がある場合が
、状況によってはある。この点に関しては、宿主細胞の免疫応答を刺激する能力
を低下させるように、調節融合タンパク質を設計することができる。例えば、ト
ランス活性化因子ドメインを設計するか、若しくは選択するか、或いはこの両方
を行い、調節融合タンパク質に使用することができる。この点に関しては、単純
ヘルペスウイルスタンパク質VP16の野生型転写活性化ドメインは、哺乳動物の免
疫応答を刺激することがあるので、in vivoで使用するには好適な転写活性化ド
メインとは言えない。被験体の免疫原性の低下に基づいて、代替の転写活性化ド
メインを使用することができる。例えば、宿主と同じ種のタンパク質の転写活性
化ドメインが好適かもしれない(例えば、ヒトの調節融合タンパク質に使用する
には、ヒト蛋白からの転写活性化ドメイン)。これに代り、例えば、調節融合タ
ンパク質のポリペプチド(例えば、VP16ポリペプチドのような、Tetリプレッサー
の成分又は転写モジュレーターの成分)内の単一又は複数の優生T細胞エピトープ
を特定及び修飾することによって、被験体の免疫原性が低下するように、本発明
の調節融合タンパク質を修飾することができる。上記のような細胞エピトープは
、標準方法で特定することができ、再び、標準方法である突然変異誘発によって
改変することもできる。その後は、修飾されない融合タンパク質と比べれば、ま
だ被験体の免疫原性が低下を呈示する元の転写調節能力を保持している、修飾さ
れた形質の調節融合タンパク質を選択することができる。
【０１９４】 上記に加えて、免疫応答の抑制が望ましい状況には、被験体の免疫応答を全般
的又は特定的に下方調節するための従来の全ての方法を、本発明の調節系の使用
と組み合わせることもできる。サイクロスポリンA又はFK506或いはこの両方のよ
うな一般的免疫抑制剤を被験体に投与することができる。これに代り、より特定
の免疫抑制に対応できる免疫抑制剤を使用することができる。このような薬剤は
補刺激活性分子の抑制剤が含まれている可能性がある(例えば、CTLA4Ig 融合タ
ンパク、可溶性CD4、抗CD4抗体、抗B7-1又は抗B7-2抗体或いはこの両方、又は抗
体gp39抗体)。
【０１９５】 最後に、ある状況下では、移植された細胞の免疫系へ暴露を最小限にできる、
治療遺伝子を発現する細胞のデリバリー手段を選択することができる。例えば、
移植組織の中からタンパク質(例えば、対象の治療用遺伝子産物)の拡散及び移植
組織内への栄養素及び酸素の拡散に対応できる生体不活性カプセル/多孔性の生
物学的適合膜の中に細胞を移植し、このようにして、移植された細胞が免疫系に
暴露されないようにできる(すでに島細胞の移植に適用されている)。
【０１９６】 本発明のトランス活性化因子融合タンパク質の核酸分子、トランス活性化因子
融合タンパク質の断片、及び抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体(本書で
は「活性分子」とも言う)は、投与に適した製薬組成物に組み込むことができる
。上述のような組成物は、一般に核酸分子、タンパク質、又は抗体及び医薬的に
受容可能伝達体を含む。本書で使用される「医薬的に受容可能伝達体」という用
語は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、皮膜、抗菌剤及び抗真菌剤、等調及び吸収
遅延剤、及び医薬的投与と適合する同等のものが含まれる。医薬的活性物質とし
て上記のような媒体及び作用物質の使用は、現在ではよく知られた技術である。
いずれのか従来の媒体及び作用物質は活性化合物と不適合である場合を除き、製
薬組成物にこれらの使用は考慮に入れられる。補助活性化合物もこれらの組成物
に組み込まれることがある。本発明の製薬組成物は、その意図する投与経路と適
合するよう処方指示される。投与経路の例には、非経口(例えば、静脈、皮内、
皮下)、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)、経粘膜、及び直腸投与が含まれる。
【０１９７】 B. in vitroでのタンパク質の産生 対象のタンパク質の量産は、1) 細胞内でトランス活性化因子の発現に適した
形質で本発明のトランス活性化因子融合タンパク質をコード化する核酸、2) tet
オペレーターに機能的に連結する対象のタンパク質をコード化する遺伝子、を含
有するように修飾された、in vitroで培養された細胞を使って、達成することが
できる。例えば、哺乳動物、酵母菌又は真菌の細胞は、本書に記載されている、
これら核酸構成体を含有するように修飾することができる。これらの修飾された
哺乳動物、酵母菌又は真菌の細胞を、その後Tc又はその類似体の存在下で標準発
酵技術によって培養し、その遺伝子の発現を誘導し、対象のタンパク質を産生す
ることができる。従って、本発明は、対象のタンパク質を単離するための生産プ
ロセスを提供する。この目的で、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質を
コード化する核酸、及び少なくとも1つのtetオペレーター配列に機能的に連結す
る対象のタンパク質をコード化する核酸の両方を導入した宿主細胞(例えば、酵
母菌又は真菌)は、対象のタンパク質をコード化するヌクレオチド配列(即ち、te
tオペレーター配列に機能的に連結するヌクレオチド配列)の転写を刺激するため
に、テトラサイクリン又はその類似体の存在下の培地で生産規模で増殖され、対
象のタンパク質が収穫された宿主細胞からか、又はその培地から単離される。標
準タンパク質精製技術を使用して、この培地から又は収穫された細胞から対象の
タンパク質を単離することができる。
【０１９８】 C. B. in vivoでのタンパク質の産生 本発明は、トランスジェニック畜産動物のような動物により対象のタンパク質
の量産にも対処できる。トランスジェニック技術の進歩によって、牛、やぎ、豚
及び羊などのトランスジェニック家畜を生産することが可能になった(Wall, R.J
. et al. (1992) J. Cell. Biochem. 49:113-120; and Clark, A.J. et al. (19
87) Trends in Biotechnology 5:20-24でレビューされている)。従って、対象の
タンパク質をコード化する遺伝子が、tetオペレーターに機能的に連結する場合
は、そのゲノムの中に本発明の誘導可能調節系の構成体を保有するトランスジェ
ニック家畜を作成することができる。遺伝子の発現、及びその後のタンパク質の
産生は、そのトランスジェニック動物にTc(又はその類似体)を投与することによ
って誘導される。タンパク質の産生は、トランス活性化因子融合タンパク質をコ
ード化する核酸を、このトランス活性化因子の発現を一部の細胞に限定する、適
切な組織特異調節配列と連結することによって、特定組織を標的にすることがで
きる。例えば、乳漿プロモーター(U.S. Patent No. 4,873,316 and European Ap
plication Publication No. 264,166)のような哺乳動物の乳腺特異調節配列を、
このトランス活性化因子の移植遺伝子と連結させて、このトランス活性化因子の
発現を哺乳動物組織に限定させることができる。このように、Tc(又は類似体)の
存在下、タンパク質がトランスジェニック動物の哺乳動物組織で産生されること
になる。このタンパク質は、上記トランスジェニック動物の乳汁中に潜ませるよ
うに設計することができ、要望に応じて、このタンパク質を乳汁から単離するこ
ともできる。
【０１９９】 D. 人間のかかる病気の動物モデル 本発明のトランス活性化因子融合タンパク質は、人間のかかる病気の動物モデ
ルを創造することによ人間のかかる病気病理生理学を最小にするためり、動物の
特定遺伝子の発現を刺激するためにも、単体で又は組み合せて使用することがで
きる。例えば、宿主細胞では、病気に関わりがあると思われる対象の遺伝子を、
単一又は複数のtetオペレーター配列の転写制御下に置くことができる(本書に記
載されている、相同再組換えによる)。このような動物と、トランス活性化因子
融合タンパク質又は抑制因子融合タンパク質、或いはこの両方に対応する単一又
は複数の導入遺伝子を保有する第2世代とを交配して、テトラサイクリン調節に
よる融合タンパク質遺伝子とtet調節による標的配列の両方を保有する子孫を創
造することができる。これらの子孫における対象の遺伝子の発現は、テトラサイ
クリン(類似体)を使って変調させることができる。例えば、対象の遺伝子の発現
を転写抑制因子融合タンパク質を使って下方調節し、遺伝子発現とこれらの病気
の関係を検査することができる。上述のようなアプローチは、病気の動物モデル
を創造するには、相同組換えによる遺伝子の「ノックアウト」より利点がありそ
うである。その理由は、本書に記載されている、tet調節による系では、対象の
遺伝子の発現のレベルと遺伝子発現が抑制又は活性化調節されるタイミングの双
方について制御することができるからである。
【０２００】 E. 遺伝子クローニング及びその他の利用法のための安定した細胞系統の生産 本書に記載されている、トランス活性化因子タンパク質は、遺伝子の発現を調
節するために使用することができ、それによって、他の方法では生産することが
できないような安定した細胞系統の生産を可能にする。例えば、その細胞に細胞
毒性である遺伝子を保有する安定した細胞系統は、有毒遺伝子の発現で「漏出」
のために創造することが難しいか、不可能であろう。本発明のトランス活性化因
子融合タンパク質を使って、上述のような有毒遺伝子の遺伝子発現を厳格に調節
することにより、有毒遺伝子を保有する安定した細胞系統を創造することができ
よう。この後、上述のような安定した細胞系統は、上述のような有毒遺伝子をク
ローニングするためにも使用できる(Tc又は類似体を使って制御条件下で有毒遺
伝子の発現を誘導する)。遺伝子の発現クローニングの一般的方法は、現在では
知られた技術であるが、本発明の転写抑制因子系もこの方法に応用できる可能性
がある(例えば、 Edwards, C. P. and Aruffo, A. (1993) Curr. Opin. Biotech
. 4:558-563参照)。さらに、この転写調節タンパク質は、造血幹(ES)細胞などに
おいて、他細胞中の遺伝子の発現を変調するためにも使用することができる。ES
細胞に導入されたいくつかの遺伝子の残りの発現は、安定したトランスフェクト
されたクーロンを単離できない結果になろう。本書に記載されている、トランス
活性化因子融合タンパク質を使って上述のような遺伝子の転写を調節すると、こ
の問題の解消に有用であろう。
【０２０１】 実施例 本発明の多様な態様を図で示すため、以下の例を提供する。これらによって、
本発明が制限されると解釈してはならない。
【０２０２】 以下の例に掲載したスクリーニングは、アエクオローレ・ビクトリア(原語: a
equorae victoria)からの、tTA/rtTAに依存する緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現
に基づいている(Niedenthal et al., 1996; Wach et al., 1998; Oldenburg et
al., 1997, as optimized for enhanced fluorescence)。GFPタンパク質は、次
の突然変異、即ち、F99S、M153T、及びV163A (Crameri et al. (1996), Nature
Biotechnology 14, 315-319による)、F64L及びS65T (Cormack et al. (1996), G
ene 173, 33-38による)、及びQ80Rの挿入、並びにGFP+を産生する2'位へのアラ
ニンの挿入によって、最適化されている。GFPを発現する酵母菌コロニーの蛍光
は、UV光の照射下の適当な寒天プレートで都合よく検出でき、FACS又は蛍光分光
法で定量化することができる(Niedenthal et al., 1996)。
【０２０３】 このように、次の配列を含有するプラスミド、指定pCM 190GFP+が作製された
。 ・ tTA/rtTA応答可能プロモーターによって制御された、GFP対応のコーディング
配列 ・ 組成物分別に発現される、tTA/rtTAをコード化する配列 ・ 適切な酵母菌株で選別できる、URA3 ・ S.クレビジエ(S.cerevisiae)の2μエピソームの複製機能 適切なのエンドヌクレアーゼ切断部位によって、TetR、活性化ドメイン、又はtT
Aをコード化する配列全体を除去することができ、これらは、前述したように、
一般に獲得した突然変異誘発された対立遺伝子のプールによって置換される (Le
ung et al., 1989)。
【０２０４】 このプラスミド混合物はS.クレビジエ(S.cerevisiae)に形質転換され、形質転換
体をウラシル原栄養性によって選別された。結果の形質転換体は、次のような多
様な特性の試験が可能な寒天プレート上でスクリーニングされた。 ・ Tc誘導物又はその他の化学物質によるGFPの誘導 ・ 誘導因子の不在下の基礎発現を減少するrtTAの新規対立遺伝子 ・ 誘導因子の存在下の発現レベルの増大
【０２０５】 活性化ドメインをコード化する配列が適切な配列ライブラリーで置換された場
合は、スクリーニングにより、TetR変異体との融合に最適機能をもつ新規活性化
因子又はサイセンサーを識別できる。
【０２０６】 例1 向上した特性のrtTA変異体 遺伝子をコード化するGFPをpCM190の複数クローニング部位にクローニングし(
Gari et al., 1997) 、プラスミドpCM190GFP+を産生する、rtTA活性の標識とし
て使用した。tTAのTetR部分は、突然変異誘発のため、前述したベクターpCM190
からの、5'-GACCGATCCAGCCTCCGCGG (SEQ ID NO:46)と5'-CGTGTGTCCCGCGGGGAGAA
(SEQ ID NO:47)の2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅された(Leun
g et al., 1989)。PCR断片及びpCM190-GFP+ をXbalI及びBsiWIを用いて制限し、
精製した。PCRとこのベクターは再連結され、大腸菌DH5aに形質転換された。数
千の大腸菌クーロンが共存して培養され、これらのプラスミドプールが作製され
、LiAc法を使ってS.クレビジエ(S.cerevisiae)に形質転換された(Ito et al., 1
983)。このスクリーニングプロトコルには、S.クレビジエ(S.cerevisiae)のRS45
3株 (MATa; ade2-1; trp1-1; can1-100; leu2-3,112; his3-1;ura3-52) が使用
された。
【０２０７】 このプラスミドを酵母菌に形質転換すると、UV照射下に置かれたコロニーの直
接試験によって広範にわたるGFP活性の強度差を記録することができる。このよ
うにして、酵母菌細胞の大集団をスクリーニングして、有望tTA/rtTA候補を見つ
けることができる。GFPの蛍光色の差は、標識タンパク質の発現レベルの違いに
起因する。これで、一般的にトランス活性化因子の活性度の差が反映されよう。
通常のスクリーニングの後、少数の有力候補だけに絞って生化学的分析を実行す
ることができる。
【０２０８】 従って、この結果得られたウラシル・プロトトロフ(uracil-prototroph)酵母
菌クローンは、Tc又はDoxのどちらか或いはこの双方を含有するウラシルのない
最小培地にリプレカ平板され、30℃で2〜3日間増殖された後、GFP蛍光色を刺激
するため長波長のUV光を使って記録された。これによって、数種の新種rtTA対立
遺伝子34R、44R、MT1R、22R、52R、68R及び92Rを特定することができる。図1は
、Tc及びDoxを用いて刺激された、酵母菌中のrtTA-34R及びrtTA-44R対立遺伝子
の表現型を示したものである。図2は、Doxを用いて刺激された、酵母菌中の 34R
、44R、MT1R、22R、52R、68R及び92R対立遺伝子の表現型を示したものである。G
FPの蛍光は、左軸上の対数目盛りで示されている。誘導因子の不在下、10 μg/m
lのTcの存在下、又は10 μg/mlのDoxの存在下におけるトランス活性化因子別の
蛍光強度が示されている。tTA及びrtTAを用いて達成された活性が比較のため示
されている。
【０２０９】 rtTA-34R, rtTA-44R及びGFP株を含有するS.クレビジエ(S.cerevisiae)株、並
びにその起点のtTA及びrtTA株を含有するS.クレビジエ株が、最小培地で一夜増
殖された。これらの細胞の1 OD600 を含有する等価物を収穫し、PBSにより洗浄
し、2mlのPBS中に浮遊させた。490 nmの励起波長及び最高512 nmの照射を用いて
、これらの細胞の光の放射を蛍光メーターで記録した。rtTA-34R及びrtTA-44Rの
基礎活性は、rtTAに比べ明らかに低かった。図1に示すように、発現の活性は、
少なくとも一例では起原のrtTA又はtTAでそれぞれ達成された活性より僅かに高
かった。誘導因子は100倍〜300倍の変化があった。このように、新規rtTA対立遺
伝子は、40倍の発現の誘導にしか達しなかった起原のrtTAより、酵母菌における
遺伝子発現の調節に優れている。
【０２１０】 新規rtTA対立遺伝子の利点は、不誘導の状態の低い基礎活性と、Tc又はDoxの
付加時のに高レベルの誘導が組み合わされていることである。これは任意のリプ
レッサーの不在下でも達成されるので、S.クレビジエ(S.cerevisiae)でも広範囲
にわたり遺伝子発現の調節ができる可能性がある。
【０２１１】 S.クレビジエ(S.cerevisiae)からの個別プラスミドの単離に続いて、突然変異
誘発されたrtTA領域が配列された。下記の表1は、新規rtTA対立遺伝子の遺伝子
型を示したものである。両親rtTAの参照配列は図8に示されている。
【０２１２】
【表１】
【０２１３】 次にrtTA-34R及びrtTA-44Rは、tTAの各部分と置換され、 pUHD15-1に再クロー
ニングされた (Gossen & Bujard, 1992)。HeLa細胞は、Ptetによって制御される
ルシフェラーゼ遺伝子をコード化する、 pUHC13-3(Gossen & Bujard, 1992)、及
び個別トランス活性化因子の遺伝子を含有するプラスミドpUHD15-1を用いて一過
的にトランスフェクトされた。図3に示すように、5 μg/mlのテトラサイクリン
(Tc、淡いグレー)又はドキシサイクリン(Dox、濃いグレー)のエフェクターの不
在下(左欄)と存在下におけるルシフェラーゼの活性が測定された。X軸上、(-)は
DNAが中に転移されなかったコントロールHeLa細胞に対応する。図3に示した結果
は、rtTA-34Rが rtTAに比べてはるかに高いルシフェラーゼ活性の誘導に達した
ことを示している。観察された増加した調節因子は、より低い基礎活性とより高
い誘導活性から得られた結果である。このように、単離されたrtTA-34R は、HeL
a細胞だけでなくS.クレビジエ(S.cerevisiae)でも改善された逆表現型を呈示す
る(図3及び6)。S.クレビジエ(S.cerevisiae)では、突然変異体rtTA-44RもHeLa細
胞で逆表現型を示す。しかし、rtTAと比較すると、誘導レベルはrtTAより改善さ
れていない。
【０２１４】 このように、新規rtTA対立遺伝子についての上述スクリーニング手順により、
HeLa細胞でDoxの追加後に転写誘導を示す突然変異体を特定することができる。
さらに、ほとんどの突然変異体についてHeLa細胞で観察された表現型は、酵母菌
で見られる特性を忠実に反映している。 このことは、S.クレビジエ(S.cerevisi
ae)におけるスクリーニング手順は、哺乳動物細胞においてTetRに基づく新規活
性調節タンパク質を発見するための貴重なツールであることを実証している。
【０２１５】 例2 テトラサイクリン類似体を用いた差次的誘導によるtTA突然変異体の選択 テトラサイクリン類似体に対して異なる感受性をもつtTA突然変異を特定する
には、前に略述されているように、酵母菌でtTAのTetR部分の突然変異誘発、形
質転換及び選択を実行する。さらに分析するため、結果得られた候補は酵母菌に
形質転換され、10 μg/ml のテトラサイクリン、アンヒドロサイクリン、オキシ
テトラサイクリン、クロロテトラサイクリン又はドキシサイクリンのいずれかを
含有したウラシル不在下の最小培地プレートで繁殖された。この酵母菌は30℃で
2〜3日間増殖され、これらのGFP発現表現型が前述したように試験された。これ
によって、いくつかの新規tTA対立遺伝子、即ち2、11、19、22、23、24、31、36
、38、45、及び50が特定されるに至った。下記の表2は、新規tTA対立遺伝子の遺
伝子型を示したものである。両親tTAの参照配列は図9に示されている。
【０２１６】
【表２】
【０２１７】 このスクリーンから単離された1個の突然変異体、tTA-45を配列し、ロイシン
からバリン(L170V)まで170の位でアミノ酸交換を保有することが発見された。Tc
又はDoxの濃度の変化に対するtTA-45の応答の誘導効率は、HeLa細胞での一過性
トランスアフェクションアッセイで判別された。ルシフェラーゼ活性(IC50)の抑
制を50％に導く誘導因子濃度が判別され、下記の表3に示されている。
【０２１８】
【表３】
【０２１９】 突然変異体tTA-45はTcに対する感受性が100倍低いが、Doxに対する感受性は約
10倍低いだけである。
【０２２０】 従って、Tc依存性の真核トランス活性化因子に対するS.クレビジエ(S.cerevis
iae)に基づくスクリーンも、改変した誘導因子認識特性によりtTAの特定化に適
していると結論付けた。このことは実践的応用に重要である。その理由は、この
スクリーンを使用して、Tc依存性の転写因子の誘導特性を変更することができ、
それによって化学的に別個の誘導物質に異なる応答をする新規対立遺伝子の作製
が可能になるからである。Tc類似体の様々な組み合わせによって、相当数の異な
る遺伝子を異なるように調節できる場合には、これらのTc依存性の転写因子は、
さらに哺乳動物細胞系統又はトランスジェニック動物を作製するために使用でき
るかもしれない。
【０２２１】 5個の新規tTA対立遺伝子、即ちtTA-19、tTA-31、tTA-36、tTA-45及びtTA-50の
解析は、一過的にヒト上皮細胞にトランスフェクトすることによって実行された
。図4に示すように、2 μg/mlのドキシサイクリン (Dox、淡いグレー)又はテト
ラサイクリン(Tc、濃いグレー)のエフェクターの不在下(左欄)と存在下における
ルシフェラーゼの活性が測定された。X軸上、(-)はDNAが中に転移されなかった
コントロールヒト上皮細胞に対応する。
【０２２２】 例3 TetRに基づく新規トランス活性化因子: rtTA-34R 逆Dox誘導可能なトランス活性化因子rtTA-34Rをコード化する新規対立遺伝子r
tTA-34Rを配列し、以前の特徴をもつrtTAと異なる突然変異を含有することが発
見された。このことは、rtTA-Rの異なる領域にある突然変異によって、逆トラン
ス活性化因子表現型を獲得することができることを実証している。rtTA-34Rで発
見された突然変異は、E19G、A56P、H139H (silent)、A148E、及びH179Rである。
95、101、及び102の位置にあるアミノ酸は、起原rtTA内で突然変異してもので、
rtTA-34Rの野生型残基である。
【０２２３】 突然変異した残基の役割についてさらに情報を得るため、139、148及び179の
位置の突然変異から19及び56位置の突然変異が分離された。結果得られたタンパ
ク質は、rtTA-1956R及びrtTA-148179Rと言う。rtTA-1956R及びrtTA-148179Rの潜
在的活性を、一過的発現実験で検定した。個別rtTA変異体をコード化するプラス
ミドは、pUHC13-3ルシフェラーゼ標識プラスミドを用いてHeLa細胞に共にトラン
スフェクトされ、ルシフェラーゼ活性が判別された。図5に示す結果は、逆表現
型にはE19G及びA56Pの2つの交換で十分であることを示している。148及び179の
位置の突然変異は、これら自体で逆表現型を産生しないので、表現型の支えにす
ぎない。
【０２２４】 例4 エピソームに安定化されたプラスミドからrtTA-34Rを産生するHeLa細胞 このプラスミドをエピソームにより維持する細胞系統を生成し、これによって
、より長期にわたりトランス活性化因子を生産するには、hCMV プロモーターに
よって制御されたrtTA-34Rコーディング配列を含有する転写単位をpREP9に挿入
した (Invitrogen, Carlsbad, USA)。RSVプロモーターはこのpREP9の中から切り
取られた。この結果、Epstein Barrに基づくベクターpCEP4-rtTA-34Rが得られた
。プラスミドpCEP4-rtTA-34Rを用いてHeLa細胞をトランスフェクトし、G418選択
によりクーロンを単離した。安定的にトランス活性化因子を産生するクーロンを
選択して、一過的にトランスフェクトされたルシフェラーゼレポーター構成体UH
C13-3から転写を活性化する能力が、Doxの存在時及び不在時にあるかを試験した
。
【０２２５】 表4に示したデータは、各種のクーロン(0.34R-16、-33及び-36)由来の3つのHe
La細胞系統が、両親細胞系統よりわずかに高い類似のバックグラウンドの活性を
呈示した。5 μg/mlのDoxの追加時に、ルシフェラーゼ活性が最高600倍まで誘導
されている。rtTA遺伝子の染色体コピーを宿すHeLa細胞 HR5 (Gossen et al., 1
995)と比較して、背景レベルが低下する。さらに、誘導されたルシフェラーゼの
レベルが著しく上昇する。これによって、rtTA-34R クローンの場合は数百倍の
遺伝子誘導に達するのに対し、HeLa細胞ではこれらの条件下で僅か20〜30倍の誘
導しか達成できない。
【０２２６】
【表４】
【０２２７】 例5 最小活性化ドメインに融合されたrTA-34R対立遺伝子をコーディングする
遺伝子 プラスミドpUHrT61-1を生成するためrTetR-34Rのコーディング配列を適切なpUHD
ベクターの中に挿入することにより、rTetR-34Rのコーディング配列が、4つの
最小活性化ドメイン (FFFF)をコード化するDNAと融合された(Baron et al., 199
7)。 PhCMVの制御下で、rtTA-34R-FFFF遺伝子を保有するプラスミドpUHrT51-1
を用いて、HeLa細胞系統 X1/6をトランスフェクトした。この結果得られたHeLa
細胞系統 X1/6-34R-FFFF は、加えて、「サイレントであるが活性可能座位」に
Ptetルシフェラーゼ発現単位を含有する。
【０２２８】 ゲノムに安定的に挿入されそこで構成的に発現するたpUHrT51-1を含有する各
種のクーロン由来の細胞系統を、ヒグロマイシンB選別を用いて単離し、Dox依存
性ルシフェラーゼ活性について解析した。図6に示すように、Doxの不在下ではル
シフェラーゼ活性を検出されなかったのに対し、Doxの追加時には、最高50000倍
のルシフェラーゼ活性が誘導された。これに対し、前述したHR5-CL11細胞系統で
は(Gossen et al., 1995)、Doxの不在下で有意な背景ルシフェラーゼ活性が観察
され、Doxによる誘導は約700倍に達した。これはrtTA とtetO間の残存親和性に
よる可能性が最も大きい。
【０２２９】 例6 最小活性化ドメインに融合されたrTA-34Rをコーディングする合成遺伝子
(rtTA2-34Rs) さらにrtTA-34Rを改良するために、3つの最小活性化ドメイン(FFF)と融合され
たrtTA-34Rをコード化するDNA配列が、人体に見つかるコドン頻度でトランス活
性化因子をコード化するポリヌクレオチドに変換された。前述した各種の追加パ
ラメーターに関して、このrtTA2-34Rs 配列は最適化された(Pan et al., 1999)
。従って、この配列にはスプライス供与体部位もスプライス受容体部位も含まれ
ていない。この発現を制限する可能性があるその他の特質も同様に取り除かれた
。この合成遺伝子を用いると、rtTA媒介による遺伝子調節に現在従属しない各種
の真核細胞において、rtTA2-34Rs を安定的に産生することができると予測され
る。この点については、現在、肝細胞及び成熟B細胞でrtTA2-34Rs を産生すると
予想される、数種のトランスジェニックマウス系統の世代により試験中である。
【０２３０】 rtTA2-34Rをコード化する合成遺伝子を pUHD15-1 発現にクローニングし、HeL
a 細胞で試験した。機能的解読として相対光単位のルシフェラーゼ活性を使った
一過性トランスフェクション実験において、図6に示すように、Doxにより処理さ
れた細胞では最高20倍までの誘導が観察された。
【０２３１】
【表５】
【０２３２】 上述のようにトランスフェクトされた細胞からの細胞質をまた使用して、DNA
リターデイション実験で rtTA2-34Rs及びrtTA2の結合 (3つの最小活性化ドメイ
ンに融合されたrtTA)とオペレーターDNAの比較を行った。
【０２３３】 rtTA2及びrtTA2-34RsはHeLa細胞で産生され、Doxの存在下 (+) 及び存在下 (-
)で放射性標識したtetO DNAに暴露された。この複合体の電気泳動移入により、t
etOと2つのトランス活性化因子とは異なる親和性を有することが明らかになる。
図7に示したように、オペレーターDNAとのrtTA2-34Rs の残りの結合(Doxの不在
下の結合)が大幅に減少している。
【０２３４】 従って、新しいトランス活性化因子は、これまでの特徴をもつものと比較した
とき顕著な改善を示す。この結果について実行されたスクリーニングが完全であ
ると仮定する理由はほとんどないので、さらに改善した特性をもつその他のrtTA
を獲得できる可能性があると予測している。
【０２３５】 参考文献 Baron, U., Gossen, M. & Bujard, H. (1997) Tetracycline controlled tran
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2.
【０２３６】 言及による編入 ここに引用したすべての特許、公開された特許出願及び出版物を、言及により
ここに編入することとする。
【０２３７】 等価物 当業者であれば、ごく通常の実験を用いるだけで、ここに説明した具体的な方
法の等価物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような等価物
は、本発明の範囲内にあり、また以下の請求の範囲の網羅するところと見なされ
る。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】Tc及びドキシサイクリン(Dox)と依存関係にあるS.クレビジエ(S.cerevi
siae)におけるrtTA依存性のGFP蛍光を示したグラフである。
【図２】ドキシサイクリン(Dox)と依存関係にあるS.クレビジエ(S.cerevisiae)
におけるrtTA依存性のGFP蛍光を示したグラフである。
【図３】Tc又はDox或いはこの両方と依存関係にあるHeLa細胞における、tTAに依
存するルシフェラーゼの発現を示したグラフである。
【図４】Tc又はDox或いはこの両方と依存関係にある一過的に核酸が導入される
人体上皮細胞における、tTAに依存するルシフェラーゼの発現を示したグラフで
ある。
【図５】前記の逆表現型の一因である、rtTA-34Rにおける各種突然変異の寄与度
を示したグラフである。
【図６】安定的にトランスフェクトされたHeLa細胞における、rtTA及びrtTA-34R
-FFFFによるドキシサイクリン依存によるルシフェラーゼ調節を示したグラフで
ある。
【図７】rtTA2及びrtTA2-34Rの存在時のTetオペレーターDNAの可動性モビリティ
変化を示しているゲルである。
【図８】前記の両親rtTAタンパク質をコード化する核酸配列を示している。
【図９】前記の両親tTAタンパク質をコード化する核酸配列を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 31/12 ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 31/12 35/00 ４Ｈ０４５ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ブヤー ヘルマン ＢＵＪＡＲＤ Ｈｅｒｍａｎｎ ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69120 レムラーストラッセ ９ Ｒｅｍｌｅｒｓｔｒａｓｓｅ ９， Ｄ− 69120 Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｇｅｒｍ ａｎｙ (72)発明者 ハイレン ウォルフガング ドイツ連邦共和国 ウッテンロイス デー −91080 マリア−ゲバート−ストラッセ 17 (72)発明者 ブヤー ヘルマン ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69120 レムラーストラッセ ９ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA07 DA12 EA04 GA11 HA17 4B064 AG01 CA06 CA19 CC24 DA01 4B065 AA80X AA93Y AB01 AC14 CA24 CA44 4C084 AA06 AA07 AA13 BA22 DA01 MA02 MA66 NA10 NA14 ZB261 ZB331 4C086 AA01 AA02 DA29 MA06 NA05 NA14 ZB26 ZB33 4C087 AA01 BB65 BC30 BC83 CA04 MA02 MA66 NA10 NA14 ZB26 ZB33 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 DA86 EA28 FA74

Claims (65)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ドキシサイクリン又はその類似体が不在時の基礎転写活性を変
    更した逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）タンパク質の配
    列変異体を含む単離ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 ドキシサイクリン又はその類似体が存在時に誘導される転写活
    性を変更されたｒｔＴＡタンパク質の配列変異体を含む単離ポリペプチド。
  3. 【請求項３】 ＤＮＡ結合ドメイン内に、少なくとも１つのアミノ酸変異を有
    するｒｔＴＡタンパク質を含む単離ポリペプチド。
  4. 【請求項４】 テトラサイクリン結合ドメイン内に、少なくとも１つのアミノ
    酸変異を有するｒｔＴＡタンパク質を含む単離ポリペプチド。
  5. 【請求項５】 ＤＮＡ結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸
    １乃至４５が含まれる、請求項３に記載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】 前記変異が、アミノ酸の置換、欠失、及び挿入から選択される
    、請求項３、４、又は５に記載のポリペプチド。
  7. 【請求項７】 前記変異が、Ｓ１２Ｇ、Ｅ１９Ｇ、及びＴ２６Ａを含むグルー
    プから選択される、請求項３に記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 前記変異が、Ａ５６Ｐ、Ｒ８７Ｓ 、欠失Ｃ８８、Ｄ９５Ｇ、
    Ｇ９６Ｒ、Ｖ９９Ｅ、Ｄ１４８Ｅ、Ｈ１７９Ｒ、及びＥ２０４Ｋを含むグループ
    から選択される、請求項４に記載のポリペプチド。
  9. 【請求項９】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、７、９、１１、１３、１５、１
    ７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４
    １、４３又は４５のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
  10. 【請求項１０】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列との少なくとも５
    ０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むｒｔＴＡタンパク質を含む単離ポリペ
    プチドであって、前記ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン内に少なくとも１つ
    のアミノ酸変異を有する、単離ポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列との少なくとも５
    ０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むｒｔＴＡタンパク質を含む単離ポリペ
    プチドであって、前記ポリペプチドが、テトラサイクリン結合ドメイン内に少な
    くとも１つのアミノ酸変異を有する、単離ポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 テトラサイクリン及びその類似体により差次的調節を示すテ
    トラサイクリン制御トランス活性化因子（ｔＴＡ）タンパク質の配列変異体を含
    む単離ポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 テトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも１つのアミノ
    酸変異を有するｔＴＡタンパク質を含む単離ポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 ＤＮＡ結合ドメイン内に、少なくとも１つのアミノ酸変異を
    有するｔＴＡタンパク質を含む単離ポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 前記変異が、アミノ酸の置換、欠失、及び挿入から選択され
    る、請求項１３又は１４の単離ポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のアミノ酸配列との相同性を少な
    くとも５０％有するアミノ酸配列を含むｔＴＡタンパク質を含む単離ポリペプチ
    ドであって、テトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変異
    を有する、単離ポリペプチド。
  17. 【請求項１７】 単離多核酸分子であって、 （ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１
    ８、又は２０のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、 （ｂ） （ａ）のポリヌクレオチドのアンチセンスであるポリヌクレオチドと
    、 （ｃ） （ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドに対する同一性を少なくとも５
    ０％有するポリヌクレオチドと、 （ｄ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、５、６、８、１０、１２、１４、１６、
    １８、又は２０のヌクレオチド配列を含む核酸の少なくとも１００の連続したヌ
    クレオチドからなる断片を含むポリヌクレオチドと、 （ｅ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９
    又は２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドと
    、 （ｆ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９
    又は２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片をコード化するポリヌクレオ
    チドであって、前記断片が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、７、９、１１、１３、
    １５、１７、１９又は２１のアミノ酸配列の少なくとも３０の連続したアミノ酸
    残基を含む、ポリヌクレオチドと、 （ｇ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９
    及び２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドとの同一性を少なくとも５０％有す
    るポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドと、 （ｈ） ｔｅｔオペレーター由来の配列からの転写を調節することが可能なタ
    ンパク質をコード化する（ａ）乃至（ｇ）の核酸との同一性を少なくとも５０％
    有するポリヌクレオチドと、からなるグループから選択された単離多核酸分子。
  18. 【請求項１８】 単離多核酸分子であって、 （ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、
    ３８、４０、４２、又は４４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、 （ｂ） （ａ）のポリヌクレオチドのアンチセンスであるポリヌクレオチドと
    、 （ｃ） （ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドとの同一性を少なくとも５０％
    有するポリヌクレオチドと、 （ｄ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、２６、２８、３０、３２、３４、３６、
    ３８、４０、４２、又は４４のヌクレオチド配列を含む核酸の少なくとも１００
    の連続したヌクレオチドからなる断片を含むポリヌクレオチドと、 （ｅ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、
    ３９、４１、４３又は４５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化するポ
    リヌクレオチドと、 （ｆ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、
    ３９、４１、４３又は４５のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片をコード化
    するポリヌクレオチドであって、前記断片が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、２７
    、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３又は４５のアミノ酸配列の
    少なくとも１５の連続したアミノ酸残基を含む、ポリヌクレオチドと、 （ｇ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、
    ３９、４１、４３又は４５のアミノ酸配列を含むポリペプチドとの同一性を少な
    くとも５０％有するポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドと、 （ｈ） ｔｅｔオペレーター由来の配列からの転写を調節することが可能なタ
    ンパク質をコード化する（ａ）乃至（ｇ）の核酸との同一性を少なくとも５０％
    有するポリヌクレオチドと、からなるグループから選択された単離多核酸分子。
  19. 【請求項１９】 非相同ペプチドをコード化する核酸配列に機能的に連鎖した
    請求項１７又は１８に記載の核酸分子。
  20. 【請求項２０】 請求項１７、１８、又は１９の核酸分子を含むベクター。
  21. 【請求項２１】 前記ベクターが発現ベクターである、請求項２０に記載のベ
    クター。
  22. 【請求項２２】 前記ベクターが、ｐＣＭ１９０ＧＦＰ＋、ｐＵＨＤ１５−１
    、ｐＲＥＰ９、及びｐＵＨＤからなるグループから選択される、請求項２１に記
    載のベクター。
  23. 【請求項２３】 非相同アミノ酸配列に機能的に連結する、請求項９、１０、
    １１又は１６のポリペプチドを含む融合タンパク質。
  24. 【請求項２４】 請求項９、１０、１１、１６又は２３のポリペプチドを含む
    組換え細胞。
  25. 【請求項２５】 請求項９、１０、１１、１６又は２３のポリペプチドに結合
    する抗体。
  26. 【請求項２６】 請求項１７、１８、又は１９の核酸分子を含む組換え細胞。
  27. 【請求項２７】 請求項２１又は２２のベクターを含む組換え細胞。
  28. 【請求項２８】 前記細胞が、真核細胞、原核細胞及びウイルスからなるグル
    ープから選択される、請求項２４、２６、又は２７の組換え細胞。
  29. 【請求項２９】 前記細胞が、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞、又
    は哺乳動物細胞からなるグループから選択される、請求項２８の組換え細胞。
  30. 【請求項３０】 前記細胞が酵母菌である、請求項２９の組換え細胞。
  31. 【請求項３１】 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２９の組換え細胞。
  32. 【請求項３２】 （ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、７、９、１１、１
    ３、１５、１７、１９、２１、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４
    １、４３又は４５のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、 （ｂ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、７、９、１１、１３、１５、１７、
    １９、２１、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３又は４５
    のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２
    、４、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２７、２９、３１、３３
    、３５、３７、３９、４１、４３又は４５のアミノ酸配列の少なくとも１５の連
    続したアミノ酸残基を含む断片と、 （ｃ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、７、９、１１、１３、１５、１７、
    １９、２１、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３又は４５
    のアミノ酸配列を含むポリペプチドの対立遺伝子変異体と、からなるグループか
    ら選択されたポリペプチドを産生するための方法であって、 前記ポリペプチドが発現するような条件下で、請求項２７の組換え細胞を培
    養する段階を含む、ポリペプチド産生方法。
  33. 【請求項３３】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、３、５、６、８、１０、１２、
    １ ４、１６、１８、２０、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４
    ２、 又は４４の核酸配列によってコード化された単離ポリペプチド。
  34. 【請求項３４】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、３、５、６、８、１０、１２、
    １４、１６、１８、２０、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、
    ４２、又は４４との同一性を少なくとも５０％有するポリヌクレオチドによって
    コード化された単離ポリペプチド。
  35. 【請求項３５】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、７、９、１１、１３、１５
    、１７、１９、２１、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３
    又は４５のアミノ酸配列との同一性を少なくとも５０％有する単離ポリペプチド
    。
  36. 【請求項３６】 非ヒト・トランスジェニック生物の細胞内のｒｔＴＡタンパ
    ク質の発現に適した形で、請求項の核酸分子を含む導入遺伝子を含む非ヒト・ト
    ランスジェニック生物。
  37. 【請求項３７】 非ヒト・トランスジェニック生物の細胞内のｔＴＡタンパク
    質の発現に適した形で、請求項の核酸分子を含む導入遺伝子を含む非ヒト・トラ
    ンスジェニック生物。
  38. 【請求項３８】 細胞の中のｔｅｔオペレーター連結遺伝子の転写を調節する
    ための方法であって、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、
    ２１、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３又は４５のアミ
    ノ酸配列を含む融合タンパク質をコード化する核酸分子を細胞に導入する段階と
    、 前記細胞と接触しているテトラサイクリン又はその類似体の濃度の変調する
    段階とを含む、転写調節方法。
  39. 【請求項３９】 ｔｅｔオペレーター連結遺伝子の発現を調節するための遺伝
    子治療であって、 ドキシサイクリン又はその配列変異体が不在時の基礎転写活
    性を減少させた、少なくとも１つのｒｔＴＡタンパク質からなるグループから選
    択されたタンパク質をコー ド化する第１核酸分子と、発現が前記ｔｅｔオペレーター由来の配列によって調
    節される対象遺伝子を含む第２核酸分子と、テトラサイクリン又はその類似体の
    治療上有効な投与量と、を含む製薬組成物を投与する段階を含む、遺伝子治療。
  40. 【請求項４０】 ｔｅｔオペレーター連結遺伝子の発現を調節するための遺伝
    子治療であって、ドキシサイクリン又はその配列変異体が不在時に誘導される転
    写活性を増加させた少なくとも１つのｒｔＴＡタンパク質からなるグループから
    選択されたタンパク質を コード化する第１核酸分子と、発現が前記ｔｅｔオペレーター由来の配列によっ
    て調節される対象遺伝子を含む第２核酸分子と、テトラサイクリン又はその類似
    体の治療上有効な投与量と、を含む製薬組成物を投与する段階を含む、遺伝子治
    療。
  41. 【請求項４１】 ｔｅｔオペレーター連結遺伝子の発現を調節するための遺伝
    子治療であって、テトラサイクリン又はその類似体、又はその配列変異体により
    差次誘導された少なくとも１つのｔＴＡタンパク質からなるグループから選択さ
    れたタンパク質をコード化する第１核酸分子と、発現が前記ｔｅｔオペレーター
    由来の配列によって調節される対象遺伝子を含む第２核酸分子と、テトラサイク
    リン又はその類似体の治療上有効な投与量と、を含む製薬組成物を投与する段階
    を含む、遺伝子治療。
  42. 【請求項４２】 ドキシサイクリン又はその配列変異体が不在時の基礎転写活
    性を減少させた少なくとも１つのｒｔＴＡタンパク質からなるグループから選択
    されたタンパク質をコード化する遺伝子治療ベクターと、発現が前記ｔｅｔオペ
    レーター由来の配列によって調節される対象遺伝子を含む第２遺伝子治療ベクタ
    ーと、テトラサイクリン又はその類似体の治療上有効な投与量と、を含む、請求
    項３９に記載の遺伝子治療のための組成物。
  43. 【請求項４３】 ドキシサイクリン又はその配列変異体が不在時に誘導される
    転写活性を増加させた少なくとも１つのｒｔＴＡタンパク質からなるグループか
    ら選択されたタンパク質をコード化する遺伝子治療ベクターと、発現が前記ｔｅ
    ｔオペレーター由来の配列によって調節される対象遺伝子を含む第２遺伝子治療
    ベクターと、テトラサイクリン又はその類似体の治療上有効な投与量と、を含む
    、請求項４０に記載の遺伝子治療のための組成物。
  44. 【請求項４４】 テトラサイクリン又はその類似体、又はその配列変異体によ
    り差次誘導された少なくとも１つのｔＴＡタンパク質からなるグループから選択
    されたタンパク質をコード化する遺伝子治療ベクターと、発現が前記ｔｅｔオペ
    レーター由来の配列によって調節される対象遺伝子を含む第２遺伝子治療ベクタ
    ーと、テトラサイクリン又はその類似体の治療上有効な投与量と、を含む、請求
    項４１に記載の遺伝子治療のための組成物。
  45. 【請求項４５】 前記変異が、Ａ５６Ｖ、Ｆ７８Ｓ、Ｓ８５Ｇ、Ｓ８５Ｒ、Ｙ
    １１０Ｃ、Ｌ１１３Ｈ、Ｙ１３２Ｃ、Ｉ１６４Ｌ、Ｐ１６７Ｓ、Ｌ１７０Ｖ、Ｉ
    １７４Ｖ、Ｉ１７４Ｔ、又はＥ１８３Ｋを含むグループから選択される、請求項
    １３に記載のポリペプチド。
  46. 【請求項４６】 前記変異により、ドキシサイクリン又はその類似体が不在時
    のｔｅｔオペレーターに対する基礎親和性が変更されている、請求項３に記載の
    ポリペプチド。
  47. 【請求項４７】 テトラサイクリン結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
    ３のアミノ酸４６乃至２０７を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
  48. 【請求項４８】 前記変異により、ドキシサイクリン又はその類似体に対する
    感受性が変更されている、請求項４に記載のポリペプチド。
  49. 【請求項４９】 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のア
    ミノ酸１乃至４５を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
  50. 【請求項５０】 前記変異が、Ｓ１２Ｇ、Ｅ１９Ｇ、及びＴ２６Ａを含むグル
    ープから選択される、請求項１０に記載のポリペプチド。
  51. 【請求項５１】 前記変異が、Ａ５６Ｐ、Ｒ８７Ｓ 、欠失Ｃ８８、Ｄ９５Ｇ
    、Ｇ９６Ｒ、Ｖ９９Ｅ、Ｄ１４８Ｅ、Ｈ１７９Ｒ、及びＥ２０４Ｋを含むグルー
    プから選択される、請求項１１に記載のポリペプチド。
  52. 【請求項５２】 前記変異が、Ａ５６Ｖ、Ｆ７８Ｓ、Ｓ８５Ｇ、Ｓ８５Ｒ、Ｙ
    １１０Ｃ、Ｌ１１３Ｈ、Ｙ１３２Ｃ、Ｉ１６４Ｌ、Ｐ１６７Ｓ、Ｌ１７０Ｖ、Ｉ
    １７４Ｖ、Ｉ１７４Ｔ、又はＥ１８３Ｋを含むグループから選択される、請求項
    １３又は１６に記載のポリペプチド。
  53. 【請求項５３】 前記変異により、ドキシサイクリン又はその類似体の不在下
    でＴｅｔオペレーターに対する基礎親和性が変更されている、請求項１０に記載
    のポリペプチド。
  54. 【請求項５４】 前記テトラサイクリン結合ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
    ２３のアミノ酸４６乃至２０７を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
  55. 【請求項５５】 前記変異により、ドキシサイクリン又はその類似体に対する
    感受性が変更されている、請求項１１に記載のポリペプチド。
  56. 【請求項５６】 前記テトラサイクリン結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
    ：２５のアミノ酸４６乃至２０７を含む、請求項１３又は１６に記載のポリペプ
    チド。
  57. 【請求項５７】 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のア
    ミノ酸１乃至４５を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
  58. 【請求項５８】 前記変異が、テトラサイクリン又はその類似体に対して分差
    感を与える、請求項１３又は１６に記載のポリペプチド。
  59. 【請求項５９】 発現が細胞の中のｔｅｔオペレーター由来の配列によって調
    節される遺伝子によってコード化されたタンパク質を産生するための方法であっ
    て、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、
    ２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３又は４５のアミノ酸配
    列を含む融合タンパク質をコード化する核酸分子を前記細胞に導入する段階と、
    前記タンパク質を産生するために、前記細胞と接触しているテトラサイクリン又
    はその類似体の濃度を、変調する段階と、を含むタンパク質産生方法。
  60. 【請求項６０】 前記変異により、ドキシサイクリン又はその類似体の不在下
    で前記ｔｅｔオペレーターに対する基礎親和性が増加している、請求項４６又は
    ５３に記載のポリペプチド。
  61. 【請求項６１】 前記変異により、ドキシサイクリン又はその類似体の不在下
    で前記ｔｅｔオペレーターに対する基礎親和性が減少している、請求項４６又は
    ５３に記載のポリペプチド。
  62. 【請求項６２】 前記変異により、ドキシサイクリン又はその類似体に対する
    感受性が増加している、請求項４８又は５５に記載のポリペプチド。
  63. 【請求項６３】 前記変異により、ドキシサイクリン又はその類似体に対する
    感受性が減少している、請求項４８又は５５に記載のポリペプチド。
  64. 【請求項６４】 前記変異により、ドキシサイクリン又はその類似体に対する
    感受性が増加している、請求項５８に記載のポリペプチド。
  65. 【請求項６５】 前記変異により、ドキシサイクリン又はその類似体に対する
    感受性が減少している、請求項５８に記載のポリペプチド。
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