JPH09500526A

JPH09500526A - テトラサイクリン反応性プロモーターによる真核細胞の遺伝子発現の厳密な制御

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Publication number: JPH09500526A
Application number: JP7502191A
Authority: JP
Inventors: ブヤルト，ヘルマン; ゴセン，マンフレート; ザルフェルト，ヨッヘン，ゲー．; ボース，ジェフリー，ダブリュー．
Original assignee: ベーアーエスエフアクツィエンゲゼルシャフト; ブヤルト，ヘルマン; ゴセン，マンフレート
Priority date: 1993-06-14
Filing date: 1994-06-14
Publication date: 1997-01-21
Also published as: WO1994029442A3; AU684524B2; EP0705334A1; ES2140359T1; DE705334T1; US20020086426A1; US6914124B2; CA2165162A1; US5650298A; WO1994029442A2; CA2165162C; US5922927A; AU7108194A

Abstract

(57)【要約】２つのトランスジーン（ｔｅｔリプレッサー及び真核細胞において直接又は間接に活性化するポリペプチドを含むトランスアクチベーター融合蛋白質をコードする第１のトランスジーン、並びに、少なくとも１つのｔｅｔオペレーターに作動的に結合された最小プロモーターに作動的に結合された遺伝子を含む第２のトランスジーン）を有するトランスジェニック動物を開示する。この発明のトランスアクチベーターをコードするポリヌクレオチド配列を、相同組換えにより、第２の標的ＤＮＡ分子中の予め決めた位置を標的とするための単離されたＤＮＡ分子（例えば、ターゲッティングベクター）も開示する。この発明のＤＮＡ分子を相同組換えにより染色体中の予め決めた位置にインテグレートして有するトランスジェニック動物もこの発明に含まれる。ｔｅｔオペレーターに結合した関心ある遺伝子の発現を、この発明の動物にテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログを投与することによって制御する方法も又開示する。この発明の制御系は、宿主細胞又は動物中での関心ある遺伝子の発現の条件付不活性化又は調節を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】テトラサイクリン反応性プロモーターによる真核細胞の遺伝子発現の厳密な制御発明の背景真核細胞のような複雑な発生環境における遺伝子の機能の研究には、個々の遺伝子の発現の厳密な制御を可能にする系から利益を得るところが多いであろう。こうした系は遺伝子発現のオン／オフ状態を媒介するだけでなく、更に限定されたレベルでの制限された発現を可能にすることが理想とされる。重金属イオン（Mayo et al.，Cell 29:99-108(1982)；Brinster et al.，Natu re（London）296:39-42(1982)；Searle et al.，Nouer，L.，CRC Boca Raton FL (1991)，pp．167-220）又はホルモン（Lee et al.，Nature（London）294:228-2 32(1981)；Hynes et al.，Proc．Natl．Ac-ad．Sci．USA 78:2038-2042(1981)； Klock et al.．Nature（London）329:734-736(1987)；Israel & Kaufman，Nucle ic Acids Res．17:2589-2604(1999)）等に対して反応性の各種の誘導性真核プロモーターにより遺伝子の活性を制御する試みは、一般に不活性状態のプロモーター漏出性（例えばメタロチオネインプロモーター(Mayo et al.，Cell 29:99-108 (1982))又は上昇した温度やグルココルチコイドホルモン作用（Lee et al.，Proc．Natl．Acad．Sci，USA 85:1204-1208(1988)）等の誘導原理自体による多面性効果の問題を有する。内在制御因子に依存しない制御系の研究で、いくつかの研究グループが、大腸菌のラクトース（ｌａｃ）リプレッサー／オペレーター誘導系が真核細胞中で機能することを示した。３種の方法が記載されており、それらは（ｉ）プロモーター部位に適正に置かれたｌａｃオペレーターによる転写の防止（Hu & Davidson ，Cell 48:555-566(1987)；Brown et al.，Cell 49:603-612(1987)；Figge at a l，Cell 52:713-722(1988)；Fuerst et al.，Proc．Nati．Acad．Scl．USA 86:2 549-2553(1989)，Deutschle et al.，Proc．Natl．Acad．Sci，USA 86:5400-540 5(1989)）、（ii）ｌａｃリプレッサー・オペレーター複合体による伸長中のＲＮＡポリメラーゼの転写のブロック(1ac R/O：Deuschle et al.，Science 248:4 90-483(1990))、及び（iii）ｌａｃＲと単純性発疹ウイルス（ＨＳＶ）のウイルス粒子の活性化領域との間の融合に応答するプロモーターの活性化(Labow et al .，Mol．Cell．Biol．10:3343-3356(1990)；Baim et al.，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 89:5072-5076(1991))である。しかし現在のところ、真核細胞中のｌａｃＲ／Ｏ系の利用は制限されている。なぜなら、誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）はその迅速な吸収と細胞内安定性にもかかわらず(Wyborski & Short，Nucleic Acids Res．19:4647-4653)作用が遅く且つ低効率であり、そのため中位の誘導しか生じないからである。それにもかかわらずｌａｃＲ−ＶＰ１６融合の興味ある条件的突然変異株が記載されている(Baim et al.．Proc．Nati．Acad．Sci．U SA 88:5072-5076(1991))。この変異株は誘導物質ＩＰＴＧの存在下に高い温度で最小プロモーターを１０００倍活性化する。温度依存性及びＩＰＴＧに関連した固有の問題点はしかしこのアプローチを制限する。発明の概要本発明は、原核生物のｔｅｔリプレッサー／オペレーター／誘導物質の成分を使用する真核遺伝子の発現を制御するための手段に関する。本発明では、少なくとも一種のｔｅｔオペレーター配列に結合したヌクレオチド配列の転写はテトラサイクリン（Ｔｃ）により制御可能な転写アクチベーター融合蛋白質（ｔＴＡと称する）により剌激される。このｔＴＡは２種のポリペプチドより構成される。第１のポリペプチドはＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ。例えばＴｎ１０誘導ＴｅｔＲ）であり、Ｔｃの不在下にｔｅｔオペレーター配列に結合するが、存在下には結合しない。第２のポリペプチドは真核細胞中で転写を直接又は間接に活性化する。例えば、第２のポリペプチドは単純性発疹ウイルス（ＨＳＶ）粒子蛋白質１６からの転写活性化領域、又は酸性、プロリンリッチ、セリン／トレオニンリッチ、グルタミンリッチの転写活性化領域を有する他の領域であり得る。別法として、第２ポリペプチドは転写活性化物質（例えば内在アクチベーター）を集めて、蛋白質−蛋白質相互作用（例えば非共有相互作用）によりｔＴＡ融合蛋白質と相互作用する領域（例えば２量体化領域）であり得る。ＴｃまたはＴｃアナログが存在しなければ、ｔＴＡ反応性のプロモーター（代表的には少なくとも一種のｔｅｔオペレーター配列及び最小プロモーターを含む）に作用的に結合した遺伝子の転写は本発明のｔＴＡにより刺激されるが、ＴｃまたはＴｃアナログが存在すれば、ｔＴＡ反応性のプロモーターに作用的に結合した遺伝子の転写は本発明のｔＴＡにより刺激されない。本書に記載したように、この系はトランスジェニック動物において効果的に機能する。従って、本発明はトランスジェニック動物の遺伝子発現を変調するためのテトラサイクリン制御可能な調節系を提供する。本発明は更に調整系の成分を動物の染色体中の所定の位置に結合させることができる同族組換え用のターゲティングベクターを提供する。本発明のこの具体例は遺伝子ターゲティング又は遺伝子ノックアウトと一般に呼ばれる分野での長期にわたる課題を解決することができる。ある種の遺伝子の構成的分断により致死的突然変異が発生し、例えばＲＢ遺伝子のノックアウトに関して記載されているように(Jacks，T．et al．（I 992）N aturc 359:295-300)ホモ接合胚の死滅を招く。この問題は多くの興味ある遺伝子に対するノックアウト動物の開発を阻害する。本発明の調節系はこの問題を解決するために適用できる。本発明のｔＴＡをコードするＤＮＡは関心ある遺伝子内に組み込んで、ｔＴＡの発現が関心ある遺伝子の内在調節要素により制御されるようにする（例えばｔＴＡは関心ある遺伝子と場所的及び時間的に同様な仕方で発現される）。関心ある遺伝子は次に少なくとも一種のｔｅｔオペレーター配列に作用的に結合される（相同組換えによる内在サイトでか、又はオペレーターに結合した関心ある遺伝子の第２のコピーは他のサイトに結合できる）。遺伝子に結合したｔｅｔオペレーターはこのようにしてｔＴＡの制御下に置かれ、その発現パターンは関心ある遺伝子のそれに類似する。Ｔｃが存在しなければ、ｔｅｔオペレーターに結合した関心ある遺伝子はｔＴＡにより刺激され、動物は変異のない野生型動物と同様に発達する。次に、発達の特定の段階で関心ある遺伝子の発現は動物にＴｃ（又はＴｃアナログ）を給餌或いは注射することにより動物の循環系内及び組織内のＴｃ（又はＴｃアナログ）のレベルを上げて停止させることができ、かくして、ｔＴＡの活動と関心ある遺伝子の転写を阻止することができる。この方法は、一般に条件付ノックアウトと呼ばれている。従って、本発明の一つの態様は、相同組換え用のターゲティングベクターを提供する。本発明の一つの実施例では、第２の標的ＤＮＡ分子の所定の部位にテトラサイクリン制御性のトランスアクチベーター（ｔＴＡ）をコードするポリヌクレオチド配列を組み込むための単離されたＤＮＡ分子を提供する。この分子中では、ｔＴＡをコードするポリペプチド配列は、５’及び３’端に、所定部位でＤＮＡ分子と第２の標的ＤＮＡ分子の間に相同組換えを行うに充分な長さの追加のポリヌクレオチドを結合している。典型的には、ｔＴＡをコードする配列が組み込まれる標的ＤＮＡ分子は、宿主細胞中の真核染色体内の関心ある遺伝子であるか、又はその調節領域である。例えば、ｔＴＡをコードする配列は酵母、カビ、昆虫、ほ乳類細胞に挿入することができる。さらに、ｔＴＡをコードする配列は宿主細胞中に存在するウイルス遺伝子例えば昆虫細胞のバキュロウイルスに挿入することができる。好ましい実施例では、ｔＴＡをコードする配列の関心ある遺伝子の所定部位への相同組換えによる挿入は、ｔＴＡをコードする配列を関心ある遺伝子の調節要素（例えば５’結合された調節要素）の制御下に置き、その結果ｔＴＡが関心ある遺伝子と同様にして場所的及び時間的に発現されるようにする。相同組換え用のターゲッティングベクターである本発明の他の実施例においては、単離したＤＮＡ分子は、ｔＴＡ及びｔＴＡ反応性プロモーターの両者をコードするポリヌクレオチド配列を、第２の標的ＤＮＡ分子の所定の関心ある遺伝子（図１３Ａ〜Ｂに例示した「シングルヒットベクター」）内に組み込むことを可能にする。この分子は、１）関心ある遺伝子の５’結合の調節領域を含む第１のポリヌクレオチド配列と、２）第１のポリヌクレオチド配列に作用的に結合されていて、ｔＴＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列と、３）ｔＴＡ反応性のプロモーターを含む第３のポリヌクレオチド配列と、４）第３のポリヌクレオチド配列に作用的に結合されていて、関心ある遺伝子のコード領域の少なくとも一部を含む第４のポリヌクレオチド配列とを含んでいる。第１及び第４のポリヌクレオチド配列はＤＮＡ分子と関心ある遺伝子との間に相同組換えが生じるに充分な長さを有し、それによりｔＴＡの発現が関心ある遺伝子の５’調節要素により制御され、また関心ある遺伝子の発現がｔＴＡ反応性プロモーターにより制御される（つまりｔＴＡがｔＴＡ反応性のプロモーターに結合する際に、関心ある遺伝子の発現が刺激される）ようにする。このターゲッティングベクターは更に調節配列に作用的に結合した選択性のマーカをコードするポリヌクレオチド配列を含む。典型的には、選択性マーカ発現範囲はｔＴＡをコードする配列（すなわち上記の第２のポリヌクレオチド配列）とｔＴＡ反応性プロモーター（すなわち上記第３のポリヌクレオチド配列）との間にある。加えて、或いはこれに代わり、このターゲティングベクターは更にｔＴＡ反応性プロモーターの代表的には上流（つまり５’端）（例えば選択性マーカ発現ユニットとｔＴＡ反応性プロモーターの問）に位置した配列であって、転写を終了するかまたは上流の調節要素の効果から下流の要素を遮断する配列を含むことができる。ｔＴＡ反応性プロモーターは典型的には少なくとも一つのｔｅｔオペレーター配列に結合された最小プロモーターを含む。この最小プロモーターは例えばサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター又は単純性発疹（ヘルペス）ウイルスチミジンニヂンキナーゼ遺伝子プロモーターから誘導される。本発明の他の態様は、ｔＴＡをコードするＤＮＡ分子を宿主細胞の第２の標的ＤＮＡ分子（例えば関心ある遺伝子）の所定の部位に組み込んだものを含有している真核宿主細胞に関する。このような真核細胞は、本発明のターゲッティングベクターを、ｔＴＡをコードするＤＮＡと第２の標的ＤＮＡ分子との間の相同組換えに適した条件下に多数の細胞中に導入し、次いでｔＴＡをコードするＤＮＡが第２の標的ＤＮＡ分子内の所定部位に結合した細胞を選択することにより創出できる。宿主細胞はほ乳動物（例えばヒト）の細胞であり得る。或いは、宿主細胞は酵母、カビ又は昆虫細胞であり得る（例えばｔＴＡをコードするＤＮＡは昆虫細胞中のバキュロウイルス遺伝子に組み込むことができる）。相同組換えに適した好ましい宿主細胞は、動物の染色体の所定位置に組み込まれたｔＴＡコード配列を担持した動物（ヒトでない）を創出するのに使用できる胎児幹細胞である。更に宿主細胞はｔＴＡ反応性転写プロモーターに作用的に結合した関心ある遺伝子を含むことができる。このｔＴＡ反応性転写プロモーターに作用的に結合した関心ある遺伝子はランダムに（例えば外来遺伝子の導入により）又は所定の位置で（例えば相同組換えのための内在性遺伝子を標的とすることにより）宿主細胞のＤＮＡに組み込むことができる。ｔＴＡ反応性転写プロモーターに作用的に結合した遺伝子はｔＴＡをコードするＤＮＡとは独立に宿主細胞に組み込むことができ、或いはその代わりに本発明のシングルヒットターゲッティングベクターはｔＴＡをコードする配列及びｔＴＡ反応性プロモーターの両者を宿主細胞のＤＮＡの所定部位に組み込むのに使用することができる。本発明の宿主細胞のｔＴＡ反応性プロモーターに作用的に結合した関心ある遺伝子の発現は、この細胞をテトラサイクリンまたはそのアナログに接触させることにより禁止できる。本発明の他の態様は、テトラサイクリン制御性トランスアクチベーター（ｔＴＡ）をコードするポリヌクレオチド配列を含むトランス遺伝子、又はｔＴＡ反応性プロモーターに結合した関心ある遺伝子をコードするトランス遺伝子を有するトランスジェニック動物（ヒトを除く）に関する。両者のトランス遺伝子（すなわち、ｔＴＡをコードするトランス遺伝子及びｔＴＡ反応性プロモーターに結合した関心ある遺伝子）を有する二重トランスジェニック動物も本発明の範囲にある。一つの実施例では、トランスジェニック動物はマウスである。他の実施例ではトランスジェニック動物は牛、山羊、羊、及び豚である。本発明のトランスジェニック動物は、例えばｔＴＡをコードするＤＮＡ分子、又はｔＴＡ反応性プロモーターに作用的に結合した関心ある遺伝子を受精卵母細胞中に導入し、その受精卵母細胞を疑似妊娠状態の養母に移植して、非ヒトトランスジェニック動物まで成長させることにより作成することが出来る。二重トランスジェニック動物は単独トランスジェニック動物の適当な交配により創出できる。本発明の二重トランスジェニック動物のｔＴＡ反応性プロモーターに作用的に結合した関心ある遺伝子の発現は、動物にテトラサイクリン又はそのアナログを投与することにより阻止できる。本発明の他の態様は、本発明のｔＴＡをコードするトランス遺伝子を有し、トランス遺伝子が動物の細胞の染色体内の所定部位に相同組換えにより組み込み得るトランスジェニック動物（本書では同相組換え動物とも言う）に関する。相同組換え動物はｔＴＡ反応性プロモーターに作用的に結合した関心ある遺伝子をコードする第２のトランス遺伝子を有し得る。第２のトランス遺伝子は染色体にランダムに、或いは組換え（例えば相同組換え）により、所定部位に組み込むことができる。例えば本発明のシングルヒットベクターは、ｔＴＡの関心ある遺伝子の発現が５’調節要素により制御され、また関心ある遺伝子の発現がｔＴＡ反応性プロモーターにより制御される（Ｔｃの不存在下に遺伝子の発現がｔＴＡ反応性プロモーターに結合するｔＴＡにより刺激される）トランスジェニック動物を創出するのに使用できる。本発明の、動物の細胞の染色体ＤＮＡ内の所定の部位に組み込んだｔＴＡをコードする配列を有する非ヒトトランスジェニック動物は、本発明のターゲッティングベクターをｔＴＡをコードするＤＮＡと細胞内の染色体ＤＮＡとの間の相同組換えに適した条件下に多数の胎児幹細胞に組み込み、次いでｔＴＡをコードする細胞が染色体ＤＮＡ内の所定の部位に組み込まれている胎児幹細胞を選択し、該胎児幹細胞を胚盤胞に移植し、この胚盤胞を疑似妊娠養母に移植し、次いで胚盤胞を非ヒトトランスジェニック動物まで成長させる。本発明の他の態様は、ｔＴＡをコードする配列を有する本発明の宿主細胞中のｔＴＡ反応性転写プロモーターに作用的に結合した関心ある遺伝子によりコードされた遺伝子産生物（例えば蛋白質）を製造する方法に関する。この方法ではまず宿主細胞をテトラサイクリン又はそのアナログの存在下に培地中で育成する（この条件では、関心ある遺伝子の発現が剌激される）。次に培地中のテトラサイクリン又はそのアナログの濃度を関心ある遺伝子の転写を剌激するように減じる。関心ある遺伝子によりコードされる遺伝子産生物の所望の量が得られるまで細胞を更に培養する。最後に、遺伝子産生物を得られた細胞又は培地から単離する。本方法で使用するのに適した好ましい細胞は酵母、カビ細胞である。本発明の調節系の成分を収容するキットもまた本発明の範囲にある。各種の本発明の追加の特徴、成分、及び他の態様は以下に詳しく説明する。図面の簡単な説明図１はプラスミドｐＵＨＤ１５−１及びｐＵＨＤ１５１−１によりコードされたｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合蛋白質（ｔＴＡＳ）、及びプラスミドｐＵＨＤ１３− ３によりコードされたｔＴＡ依存性転写ユニットを示す図である。図１Ａは２個のｔＴＡ蛋白質を示す。両融合蛋白質ｔＴＡ及びｔＴＡｓは、元の２０７個のアミノ酸配列を保存している。活性領域をコードする２種のＶＰ１６ａ配列はｔｅｔＲ遺伝子の３’端にイン・フレームで融合してｔＴＡ及びｔＴＡｓを生じる。太字は融合蛋白質のＮ末端、接合部、及びＣ末端の元のアミノ酸を示す。他の文字は特定系の配列抑制（constraint）により導入されたアミノ酸を指示している。数字はｔｅｔＲ内のアミノ酸位置をそれぞれ示す（Hillen and Wissman in Protein-Nucleic Acid Interaction，Topics in Molecular and St ructural Biology，Sacnger and Hcinemann(eds.)，Vol IO，pp．143-162(1989) ）or VP 1 6（Treizenberg et al.，Genes Dev．2:718- 729(1988)）。図１ＢはｔＴＡ依存性転写ユニットがサルウイルス（ＳＶ４０）ポリ（Ａ）サイト（Ａｎ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）、Ｐ_hCMV ^*−１又はＰ_hCMV ^*−２よりなることを示す。２つのプロモーターはＰ_hCMV ^*−２の＋７５及び−５３の間の配列を含み、１個の塩基対は−３１で交換し、ＳｔｕＩ開裂部位を形成する。−５３位置でＰＣＲで導入されたＸｈｏＩサイトは６量体化したｔｅｔＯ配列を挿入するのに使用される。この６量体配列は片側で１８ヌクレオチドポリリンカーに結合され、これによりＳａｌＩ／Ｋｈｏｌ断片として両方向にオペレーターを挿入することが可能となる。位置＋１に対するプロモーター近接オペレーターの中央Ｇ／Ｃ塩基対はＰ_hCMV ^*−１（上部構造）に対しては−９５、及びＰ_hCM _V ^* −２（下部構造）に対しては−７６である。４個の構造を含むプラスミドは最も右に示されている。図２はＨｅＬａ細胞内で産生したｔＴＡの同定及び特徴を示すウエスタンブロットを示す。ＨｅＬａ細胞は４０％集密まで成長されたものがリン酸カルシウム法により一時的にｐＵＨＤ１５−１で形質転換された。核及び細胞質抽出物は３６時間の後に調製された。図２ＡはｔｅｔＲ特異的な抗体による電気泳動分離抽出物（６％アクリルアミド／０．１％ＳＤＳゲル）のウエスタンブロット分析を示し、ｐＵＨＤ１５−１で形質転換された細胞（＋）であって擬形質転換細胞（−）には存在しない細胞質抽出物（Ｃ）及び核抽出物（Ｎ）内の約３７ｋＤａの蛋白質（ｔＴＡ）を示す。図２ＢはＨｅＬａ細胞核抽出物からのｔＴＡ結合によるｔｅｔＯＤＮＡの移動度変化を示す。放射性ラベルしたｔｅｔＯＤＮＡを、擬形質転換した（レーン２及び３）及びｐＵＨＤ１５−１で形質転換した（レーン４、５）ＨｅＬａ細胞からの抽出物と、１ｍｌ当たり１μｇのテトラサイクリンの不存在下（レーン２、４）及び存在下（レーン３、５）に混合した（オペレーターの添加２分前）。レーン１はラベルしたオペレーターＤＮＡ単独である。図３はｔＴＡのテトラサイクリン依存性を示すグラフである。図３Ａはテトラサイクリン濃度に対するルシフェラーゼ（ｌｕｃ）活性依存性を示す。予めテトラサイクリンの存在しない培地で成長させておいたＨｅＬａ細胞のクローンＸＩ（点線）及びＴ１２を２３ｍｍの皿当たり５０００細胞の密度で接種し、表示のテトラサイクリン濃度で保温育成した。約９０％の集密に達した後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を試験した。得られたデータは３回の実験の平均±ＳＤを表す。図３Ｂはテトラサイクリンの動的特性を示す。ＸＩ細胞をテトラサイクリンの不存在下及び存在下（０．１μｇ／ｍｌ）１００ｍｍの皿中で約８０％の集密が達成されるまで成長させた。細胞をリン酸塩緩衝塩水で洗浄し、培地小皿に分割した（３５ｍｍ皿の初期培養物の１／２０）。テトラサイクリンが存在しない培地中に残る培養物の半分、及び他の半分を、テトラサイクリンの存在下（１μｇ／ｍｌ、□）に保温育成した。テトラサイクリンを含む培地で成長したＸＩ培養物は同様に分割し、半分を皿にテトラサイクリンの存在下に培養し（●）、他の半分をテトラサイクリンの不存在下に培養し（○）。表示の時間に分画を回収し、ルシフェラーゼ活性を調べた。テトラサイクリンを含有する培地（●）中で４時間監視したルシフェラーゼ活性のわずかな上昇は再現性が良く、洗浄中のルシフェラーゼ誘導を反映している。図４はｔＴＡ転写アクチベーターに対するコードをするポリヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．１）を示す。図５はｔＴＡｓ転写アクチベーターに対するコードをするポリヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．３）を示す。図６はＰ_hCMV ^*−１のポリヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．５）を示す。図示の配列にはｔｅｔオペレーター配列（傾斜文字）及びｈＣＭＶ最小プロモーターを包含し、そのうち転写開始部位から測った位置−５３、ＴＡＴＡボックス、及び位置＋７５は下線で示した。図７はＰ_hCMV ^*−２のポリヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．６）を示す。図示の配列にはｔｅｔオペレーター配列（傾斜文字）及びｈＣＭＶ最小プロモーターを包含し、そのうち転写開始部位から測った位置−５３、ＴＡＴＡボックス、及び位置＋７５は下線で示した。図８はＰＴｋ^*−１のポリヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．７）を示す。図示の配列にはｔｅｔオペレーター配列（傾斜文字）及びＰＳＶ−Ｔｋ最小プロモーターを包含し、そのうち転写開始部位から測った位置−８１、ＴＡＴＡボックス、及び位置＋７は下線で示した。図９Ａ〜９ＣはＰ_hCMV ^*−１の制御下にラビットのプロゲステロンリセプターのためのコードをするｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．８）を示す。図１０Ａ〜ＢはＰ_hCMV ^*−１の制御下にラビットのプロゲステロンリセプターのためのコードをするｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．９）を示す。図１１は条件付ノックアウト法１の概略図であり、Ｅ．Ｇ．５’は内在性遺伝子に対するコード配列の５’からの隣接配列を表す。Ｅ．Ｇ．３’は内在性遺伝子に対するコード配列の３’からの隣接配列を表す。ｔＴＡＲＥは関心ある内在性遺伝子のコピーのすぐ上流側に挿入されたｔＴＡ反応性要素を表す（他の実施例ではｔＹＴＡに結合された遺伝子は外来性遺伝子である）。図１２は条件付ノックアウト法２の概略図であり、ｔＴＡＲＥはｔＴＡ反応性要素を表し、Ｅ．Ｇ．は内在性遺伝子を表し、Ｅ．Ｇ．５’は内在性遺伝子に対するコード配列の５’からの隣接配列を表し、Ｅ．Ｇ．３’は内在性遺伝子に対するコード配列の３’からの隣接配列を表し、またＴＫはチミジンキナーゼ配列を表す。図１３Ａ〜図１３Ｂは条件付ノックアウト法３のベクター設計の概略図であり、略号は上に定義した通りである。Ｎｅｏ^Rはネオマイシン耐性遺伝子を表し、ｐＰＫＧはホスホグリセラートキナーゼ配列を示す。図１４はＰ_hCMV−ｔＴＡ及びＰ_hCMV ^*−１−ｌｕｃトランス遺伝子の両者を有する二重トランスジェニックマウスにおけるドキシサイクリン依存性ルシフェラーゼ活性を表すグラフである。白い棒は２匹のマウスから得た種々の組織中のｔＴＡで活性化したルシフェラーゼの量を示す。暗い棒は飲料水中に溶かしたドキシサイクリン（２００ｍｇ／ｍｌｍ５％蔗糖）を７日間与えた２匹のマウスから得た種々の組織中のｔＴＡで活性化したルシフェラーゼの量を示す。点々の棒（対照）はＰ_hCMV ^*−１−ｌｕｃトランス遺伝子のみを担持するＬ７系統からの５個体の平均のルシフェラーゼ背景活性を表す。発明の詳細な説明定義下記の説明においては、組換えＤＮＡ技術で用いる幾つかの用語を使用する。かかる用語が指し示す範囲を含む明細書及び請求の範囲の明確且つ一貫した理解を与えるために、下記の定義を与える。クローニングベクター宿主細胞中で自律的に複製することが出来且つ、１つ又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位により特徴付けられるプラスミッド若しくはファージＤＮＡ又は他のＤＮＡ配列（上記の認識部位において、かかるＤＮＡ配列は、確定し得る様式でベクターの本質的な生物学的機能の喪失を伴わずに切断され且つ、該部位にＤＮＡ断片をその複製及びクローン化を達成するために挿入することが出来る）。クローニングベクターは、更に、そのクローニングベクターでトランスフォームした細胞の同定において使用するのに適したマーカーを含むことが出来る。発現ベクタークローニングベクターに似たベクターであるが、その中にクローン化された遺伝子の発現を、宿主細胞中へのトランスフォーメーション後に増大させることの出来るベクター。クローン化した遺伝子を、通常、ある種の制御配列例えばプロモーター配列等の制御下に置く（即ち、該配列に制御可能に結合する）。プロモーター配列は、構成的であっても誘導可能であってもよい。真核宿主細胞真核宿主細胞は、この発明により、制限はしないが、酵母細胞、植物細胞、カビ細胞、昆虫細胞例えば Schneider及びsF9 細胞、哺乳動物細胞例えばＨｅＬａ細胞（ヒト）、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス）、ＲＫ１３（ウサギ）細胞、胚細胞株例えばＤ３及びＪ１、並びに造血幹細胞、骨髄芽細胞、肝細胞、リンパ球、気管上皮及び皮膚上皮等の細胞型を含む任意の細胞であってよい。組換え真核宿主組換え真核宿主は、この発明により、発現ベクター又はクローニングベクター上の本発明のポリヌクレオチド分子を含む任意の真核細胞であってよい。この用語は又、染色体、ゲノム又はエピゾーム中に所望のポリヌクレオチド分子を含むように遺伝子操作された真核細胞を含むことをも意味する。従って、この組換え真核宿主細胞は、安定に又は一時的に蛋白質を発現することが出来る。組換えベクターこの発明のポリヌクレオチド分子を含む任意のクローニングベクター又は又は発現ベクター。宿主複製可能ベクターの受容者である任意の原核又は真核細胞。用語「宿主」は、ここで用いる場合、染色体又はゲノム上に所望の遺伝子を含むように周知技術によって遺伝子操作することの出来る原核又は真核細胞をも含む。かかる宿主の例については、Sambrook等、Molecular Cloning： A Laboratory Manual，第２版、 Cold Spring Harbor Laboratory，ニユーヨーク、Cold Spring Habor 在（1989 ）を参照されたい。プロモーター一般に、開始コドンに隣接して位置し、遺伝子の５’領域として記載されるＤＮＡ配列。隣接する遺伝子の転写は、プロモーター領域にて開始される。プロモーターが誘導可能なプロモーターであれば、転写速度は、誘導因子に応答して増大する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターであれば、転写速度は、誘導因子によって制御されない。最小プロモーター転写開始部位を規定するが、それ自身によっては効率的に転写を開始することが出来ない部分的プロモーター配列。かかる最小プロモーターの活性は、テトラサイクリン制御されたトランスアクチベーター等のアクチベーターの結合部位へ操作可能に結合される結合性（bindiny）に依存する。遺伝子ポリペプチド又は蛋白質を発現するために必要な情報を含むＤＮＡ配列。構造遺伝子メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、次いで、特異的ポリペプチドの特性を有するアミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡ配列。ポリヌクレオチド分子ポリヌクレオチド分子は、ポリデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）又はポリリボ核酸分子（ＲＮＡ）であってよい。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）「相補的ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」遺伝子は、ｍＲＮＡの逆転写によって合成され、インタービーニング配列（イントロン）の除去された組換え遺伝子を含む。発現「発現」は、ポリペプチドが構造遺伝子から生成されるプロセスである。このプロセスは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写及びかかるｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含む。断片分子の「断片」とは、その分子の任意のポリペプチドサブセットのことをいう意味である。ｔｅｔリプレッサー「ｔｅｔリプレッサー」とは、テトラサイクリンの不在においてｔｅｔオペレーター配列に結合するがテトラサイクリン存在下では結合しない原核生物蛋白質のことをいう。この用語「ｔｅｔリプレッサー」は、種々のクラスの型のリプレッサー例えばＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥｔｅｔリプレッサーを含むことを意図している。テトラサイクリンアナログ「テトラサイクリンアナログ」とは、テトラサイクリン（Ｔｃ）と密接に関連していて且つｔｅｔリプレッサーと少なくとも１０⁶ Ｍ^-1のＫａで結合する幾つかの化合物の内の任意のものである。好ましくは、テトラサイクリンアナログは、約１０⁹Ｍ^-1以上例えば１０⁹Ｍ^-1で結合する。かかるテトラサイクリンアナログの例には、限定はしないが、Hlavka及びBoothe，「The Tetracyclines」（Handbook of Experimental Pharmacology 78，R.K.,Bl ackwood 等編、Springer Verlag，Berlin-New York,1985 中）； L.A．Mitsher「The Chemistry of the Tetracycline Antibodies」Medicinal Re search 9，Dekker，ニューヨーク、1978；Noyee Development Corporation，「T etracycline Manufacturing Processes」Chemical Process Reviews，ニュージャージー、 Park Ridge,第２巻、1969；R.C．Evans,「The Technology of the Tetracycline s」、Biochemical Reference Series 1，Quadrangle Press，ニューヨーク、1968;H.F.D owling，「Tetracycline」Antibiotics Monographs no.3，Medical Encyclopedi a，ニューヨーク、1955 により開示されたものが含まれる（それぞれの内容を、すべて、参考として本明細書中に援用する）。テトラサイクリンアナログの例には、アンヒドロテトラサイクリン、デオキシサイクリン、クロロテトラサイクリン、エピオキシテトラサイクリン等が含まれる。ある種のＴｃアナログ例えばアンヒドロテトラサイクリン及びエピオキシテトラサイクリンは、Ｔｃに比べて低下した抗生物質活性を有する。トランスジェニック動物トランスジェニック動物は、トランスジーンを含む細胞を有する動物であり、トランスジーンは、その動物又はその動物の先祖に出生前例えば胎児期に導入されたものである。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中にインテグレートされて、成熟動物のゲノム中に維持され、それにより、トランスジェニック動物の１種以上の細胞型又は組織においてコードされた遺伝子生成物の発現を指示するＤＮＡである。当分野で公知の技術によってトランスジーンを導入することの出来る非ヒト動物には、マウス、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシその他の家畜が含まれる。トランスジェニック動物を、例えば、関心ある蛋白質をコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核に例えばマイクロインジェクションにより導入し（典型的には、適当な制御要素例えば構成的又は組織特異的エンハンサーにリンクさせる）、その卵母細胞を偽妊娠雌養育動物中で発生させることによって創ることが出来る。イントロン配列及びポリアデニル化シグナルをトランスジーンに含ませてそのトランスジーンの発現効率を増大させることも出来る。トランスジェニック動物（特に、マウス等）を生成する方法は、当分野において慣用技術となっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号及び４，８７０，００９号及びHoga n,B.等(1986) A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ニューヨーク、 Cold Spring Harbor 在に記載されている。トランスジェニック創出動物を用いて、トランスジーンを有する更なる動物を繁殖させることが出来る。１つのトランスジーンを有するトランスジェニック動物を、更に、第２のトランスジーンを有する他のトランスジェニック動物と交配させて２つのトランスジーンを有するいわゆる「二重トランスジェニック」動物を創ることが出来る。相同組換え動物用語「相同組換え動物」は、ここで用いる場合、遺伝子と動物（又はその先祖）の胚細胞中に導入されたＤＮＡ分子との間の相同組換えにより改変された遺伝子を含む動物を記載することを意図している。従って、相同組換え動物は、トランスジーンが相同組換えによりその動物のゲノムにおいて予め決めた染色体上の位置に導入されたトランスジェニック動物の一種である。かかる相同組換え動物を創るために、関心あるＤＮＡ（例えば、この発明のｔＴＡをコードするＤＮＡ）及びその５’及び３’末端で隣接する関心ある真核生物遺伝子の付加的核酸（ここで相同組換えが起きる）を含むベクターを調製する。この隣接する核酸は、真核生物遺伝子の上首尾の相同組換えのために十分な長さのものとする。典型的には、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’及び３’末端の両方）がベクターに含まれる（相同組換えベクターについては、例えば、Thomas ，K.R.及びCapecchi,M.R.(1987)Cell 51:503 を参照されたい）。このベクターを、胎児幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同組換えした細胞を選択する（例えば、Li，E. 等(1992)Cell 69:915を参照されたい）。選択した細胞を、次いで、動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入して凝集キメラを形成する（例えば、Bradley，A.T eratocarcinomas and Embryonic Stem Cells 中：A Practical Approach，E.J.Robertson 編（IRL，Oxford,1987）113-152頁を参照されたい）。次いで、キメラ胎児を適当な偽妊娠雌養育動物中に移植して分娩日まで発育させることが出来る。生殖細胞中に相同組換えＤＮＡを有する子孫を用いて、いわゆる「生殖系列伝達（germline transmission）」により、すべての細胞が相同組換えＤＮＡを含む動物を繁殖させることが出来る。この組換え遺伝子を有する動物を用いて、ホモ接合に交配させ及び／又は他のトランスジーンを有する他の動物と交配させることが出来る。蛋白質の組換え発現は、一般に、ヒトＣＭＶの様な構成的プロモーター（Bosh art,M.等 1985,Cell Vol.41,521-530）又は後述のアデノウイルス主要後期プロモーター若しくはＳＶ４０初期プロモーター（例えば、Kaufman,R.J.1990 Meth Enzymol.Vol.185:537-566 及びBenoist C.等(1981)Nature Vol.290:304ffも参照されたい）を用いて為される。しかしながら、ある種のプロテアーゼ等の蛋白質の場合には、細胞膜を害する細胞毒性若しくは細胞増殖抑制蛋白質又はある種のレセプターの様な蛋白質［その正常な生物学的機能は、蛋白質の宿主細胞での発現に有害な宿主細胞環境（培地成分、温度等）に対する応答の引き金を引く］は、宿主細胞の生理に負の効果を有し得る。他の場合において、所望遺伝子の過剰発現は、産生細胞対して過度に負担となるだけである。かかる場合には、最適細胞密度が達成されるまで所望遺伝子の発現を阻止し、イン・ビトロでの細胞培養又はイン・ビボでの細胞成長及び発生（経験的に測定）の最適期間の後にのみ、細胞中での遺伝子発現を誘導して十分な量の蛋白質を生成するのが望ましい。幾つかの系が提案され、試みられた（Yarranton,G.T．1992 Current Opinion in Biotechnology Vol.3:506 -511に一般的に総説されている）が、多くのかかる系は、厳重な抑制及びそれに続く完全な活性化を与えない。他のものは、大規模発酵又は全動物において有用であると予想されない実際的でない活性化ステップを採用している。しかしながら、本発明は、原核生物の制御要素を用いて、真核生物発現系においてこれらのすべての基準を満たしている。遺伝子転写を制御するためにこの発明で用いられている厳格に調節可能な遺伝的スイッチの性状は、Gossen及びBujard,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547 -5551 及び米国特許出願第０８／０７６，７２６号（表題「Tight Control of G ene Expression in Eucaryotic Cells by Tetracycline-responsive Promoters 」１９９３年６月１４日出願）に記載されている（両者の全内容を参考として本明細書中に援用する）。この発明で採用する遺伝的スイッチは、２つの構成要素を含む：（i）テトラサイクリン制御可能な転写アクチベーター（ここでは、「トランスアクチベーター」又はｔＴＡとも呼ぶ）をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）部分及び(ii)この転写アクチベーターに反応性のプロモーターに操作可能に結合（即ち、該プロモーターの転写制御下に配置）した関心ある遺伝子。テトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーター（ｔＴＡ）は、直接又は間接に真核細胞における転写を活性化するポリペプチド（第２のポリペプチドとも呼ぶ）に操作可能に結合した原核生物のｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）（第１のポリペプチドとも呼ぶ）からなる。第１及び第２のポリペプチドを各ペプチドの機能を保存する他の手段（例えば、化学的架橋）を用いて操作可能に結合することも出来るが、典型的には、第１及び第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を相互にイン・フレームでライゲートして融合蛋白質をコードするキメラ遺伝子を創ることが出来る。一具体例において、第２のポリペプチドは、プラスミッドｐＵＨＤ１５−１又はｐＵＨＤ１５１−１中の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のビリオン蛋白質１６（ＶＰ１６）の酸性トランス活性化ドメイン等の転写活性化蛋白質である（図１１参照）。他のトランスアクチベーター（下記のような、酸性の、プロリン−又はセリン／スレオニン−又はグルタミン−リッチなトランスアクチベーター部分を含む）を、テトラサイクリン制御可能な融合トランスアクチベーター中のＶＰ１６トランスアクチベーターの代用とすることが出来ることは認められるべきである。この具体例において、融合蛋白質の第２のポリペプチドは、直接、転写を活性化することが出来る。他の具体例において、ｔＴＡ融合蛋白質の第２のポリペプチドは、ｔｅｔＲ融合蛋白質と相互作用する転写アクチベーターを補充することによって、間接的に転写を活性化する。例えば、ｔｅｔＲを、宿主細胞中の転写アクチベーター蛋白質例えば内在性アクチベーターを伴う蛋白質−蛋白質を媒介することの出来るポリペプチドドメイン（例えば、２量体化ドメイン）に融合させることが出来る。ＤＮＡ結合ドメインとトランス活性化ドメインとの間の機能的結合は共有結合である必要がないことが示されている（例えば、Fields及びSong(1989)Nature 340 :245-247；Chien 等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9578-9582；Gyuris等(19 93)Cell 75:791-803；及びZervos,A.S.(1993)Cell 72:223-232 を参照されたい）。従って、このｔＴＡ融合蛋白質の第２ポリペプチドは、直接、転写を活性化することは出来ないが、両立し得る蛋白質−蛋白質相互作用ドメイン及びトランス活性化ドメインを有する内在性ポリペプチドとの安定な相互作用を形成することが出来る。適当な相互作用（又は、２量体化）ドメインの例には、ロイシンジッパー（Landschulz等(1989)Science 243:1681-1688）、ヘリックス−ループ− ヘリックスドメイン（Murre,C.等(1989)Cell 58:537-544）及びジンクフィンガードメイン（Frankel,A.D.等(1988)Science 240:70-73）が含まれる。ｔＴＡ融合蛋白質中に存在する２量体化ドメインの内在性核因子との相互作用は、ｔＴＡに対する、それ故に、ｔＴＡが結合するｔｅｔオペレーター配列に対する核因子のトランス活性化ドメイン補充を生じる。このアプローチの変法は、ｔｅｔＲＤＮＡ結合配列のＴＡＴＡ結合蛋白質（ＴＢＰ）の非ＤＮＡ結合アミノ酸配列への融合体を構築することである（ＴＢＰは、Kao,C.C.等(1990)Science 248:1646-1650に記載されている）。ＴＢＰのＤＮＡ結合型は、ＴＦＩＩＤと呼ばれる蛋白質複合体の一部分である。この複合体中のＴＢＰの機能は、ＴＦＩＩＤ複合体の他の蛋白質成分を、ＴＡＴＡボックス（即ち、ＴＢＰ結合部位）を含む真核生物遺伝子の転写開始部位の近くの位置に補充することである。ＴＡＴＡボックスに結合した場合、ＴＦＩＩＤ複合体は、続いて、基本的転写開始複合体の他のメンバーの順次的補充を媒介して、転写の開始を生じる（Buratowski，S.等(1989)Cell 56:549-561に一層詳細に記載されている）。従って、ｔｅｔＲＤＮＡ結合配列に融合した場合、ＴＢＰは、基本的転写開始複合体の他のメンバーをｔｅｔオペレーターを含むＤＮＡ配列に補充することが出来る。更に、関心ある真核生物遺伝子中に存在するＴＡＴＡ配列をｔｅｔオペレーターで置換することにより、この部位を、Ｔｃ（又はそのアナログ）の存否に依存する様式でｔｅｔＲ／ＴＢＰ融合蛋白質の標的とすることが出来、Ｔｃ依存性の転写開始をもたらすことが出来る。このアプローチにおいては、ｔＴＡ（即ち、ｔｅｔＲ／ＴＢＰ融合蛋白質）により制御すベき関心ある遺伝子が機能的ＴＡＴＡ要素を欠くので、Ｔｃ（又はアナログ）の存在下での遺伝子発現の基礎レベルは、非常に低いと予想される。しかしながら、Ｔｃ（又はアナログ）の除去に際して、転写開始は、ｔｅｔＲ／ＴＢＰのｔｅｔオペレーターへの結合及び転写開始複合体の他の成分の補充によって回復される。ｔＴＡを、他の慣用の方法及び材料を用いて、慣用のプロモーターに操作可能に結合したｔＴＡをコードするＤＮＡ（本明細書の他所に記載）で宿主細胞をトランスフェクト又はトランスフォームすることにより、その宿主中で、例えば構成的に、発現させることが出来る。この遺伝的スイッチの第２の成分は、関心ある遺伝子を操作可能に結合したｔＴＡ反応性の転写プロモーターである。このプロモーターは、例えば、大腸菌のＴｎ１０中にコードされたテトラサイクリン耐性オペロン（Hillen及びWissmann 「Topics in Molecular and Structural biology」、Protein-Nucleic Acid Int eraction 中、Saeger及びHeinemann 編、Macmillan,London,1989,Vol.10,143-16 2）から誘導された少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に操作可能に結合されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターの一部分を含み、ｔＴＡの標的配列として働く最小プロモーターであってよい。他の適当な最小プロモーターには、ここに記載したＰｈＣＭＶ^*−１，ＰｈＣＭＶ^*−２及びＰｔＫ^*−１又はこの出願中の参考文献に記載され用いられている細胞株で典型的に用いられたプロモーター要素から誘導した他の最小プロモーターが含まれる。所定の細胞株に特に有用な最小プロモーター要素を、元のプロモーターヌクレオチド配列の一連の欠失変異体から、このシリーズの所定のメンバー（例えば、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩＩ断片としてプラスミッドｐＵＨＣ１３−３の対応する制限部位に置く）の、ｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合蛋白質を安定に発現する細胞株を用いる一時的トランスフェクション実験において活性化される能力に基づいて選択することが出来る。ｔｅｔＲと転写を活性化し得る蛋白質ドメインとの任意の他の融合体（下記参照）を安定に発現する細胞株を使用し得ることは認められよう。プラスミッドｐＵＨＣ１３−３を、特定の応用のために、ポリアデニル化部位又はスプライス部位のような遺伝的要素を問題の細胞株で機能するものに置き替えることによって改変することが出来ることも認められよう。特定の詳細は、この出願中の参考文献又はそこで引用されている参考文献中に見出し得る（それらの内容をすべて本明細書中に参考として援用する）。最適の最小プロモーターの選択のための第２の基準は、テトラサイクリン存在下における抑制の程度である（下記参照）。典型的には、下記のように、最高活性化因子を有する欠失変異体を選択する。プロモーター欠失変異体を、Rosen,C.等(1985)Cell Vol.41,813-823又はNelso n C．等(1986)Nature Vol.322,557-562 により一般的に記載されたようにして調製することが出来る。安定なｔｅｔ−ＶＰ１６細胞株の調製に有用な方法を含む他の方法は、本質的には、「Current Protocols in Molecular Biology」Ausube l,E.M.等（編）1989 Vol.1及び2 並びに現在までのすべての補足 Greene Publis hing Associates and Wiley-Interscience，John Wiley & Sons，New York に記載された通りであり（これらの全内容を本明細書中に参考として援用する）、又はこの出願中で引用された他の参考文献中に記載された通りである。ｔｅｔオペレーター要素の存在は、かかる組換えプロモーター部分を、この発明のｔＴＡに反応性にする。ＴｅｔＲ−ＶＰ１６ｔＴＡを構成的に発現するＨｅＬａ細胞において、かかる改変ＣＭＶプロモーター配列の制御下で、高レベルのルシフェラーゼ発現が達成された。ｔＴＡ内にｔｅｔＲドメインを取込むことは、この発現系をテトラサイクリンの存在に対して感受性にする。ｔＴＡのｔｅｔＲドメインへのテトラサイクリンの結合は、ｔＴＡがその活性化効果を発揮するのを阻止する。培養培地中のテトラサイクリン濃度（０〜１μｇ／ｍｌ）によって、前述の実施例において、ルシフェラーゼ活性を５段階の強度まで制御することが出来る。この系は、真核宿主中での遺伝子発現を制御するための可逆的なオン／オフスイッチと微分制御（所望であれば）の両方を提供する。ｔｅｔＲとの特異的な機能的相互作用をし得るテトラサイクリンアナログをテトラサイクリンの代わりに使用し得ることは、認められるべきでる。この発明の真核産生細胞株を、上記のデザインに従って調製する。これらの成分のアセンブリー及びそれらの真核宿主細胞への取込みは、Kriegler，M．（編）1990、Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual(Stockton Press )により一般的に記載されたような他の慣用方法によって行なう。望むときに又は望む程度に、十分低い基礎的発現を示す染色体部位への関心ある遺伝子のインテグレーションにつき選択するよう注意すべきである（例えば、表１を参照されたい）。得られた組換え宿主細胞を、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの存在下で、続く遺伝子発現の誘導を可能にする最適密度（経験的に測定）まで生育させる。所望の細胞密度に達した後に、希釈及び／又はテトラサイクリン若しくはそのアナログの除去により、遺伝子発現を誘導する。次いで、培養物を、最適発現レベルに達成するまで連続的に生育させる。次いで、組換え蛋白質を、標準的手順によって採取する。組換え蛋白質の発現のための宿主細胞としての真核細胞の利用は、M.Kriegler 1990「Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual」，Stockton Pre ssに、一般的に総説されている（本明細書中に参考として援用する）。通常、ＣＨＯ^dhfr-細胞（Urlaub，G.及びChasin(1980)Proc.Natl.A cad.Sci.USA 77:4216-4220）、２９３細胞（Graham,F.L．等（1977）J.Gen.Viro l．36:59頁）又はＳＰ２若しくはＮＳＯのようなミエローマ細胞（Galfre，G.及びMilstein,C.(1981)Meth Enzymol.73(B):3-46）が用いられるが、発現される蛋白質、選んだ選択システム又は採用した発酵システムと相容れないことのない限り、任意の真核細胞株を本発明の実施において使用し得ることは、当業者には明白である。この発明は、広く適用可能であり、前述の遺伝的スイッチの２成分を含み及び発現し得る昆虫（例えば、Sp.frugiperda）、酵母（例えば、S.cerevis iae，S.pombe，H.polymorpha）及びカビ細胞を含む非哺乳類真核細胞をも含む。従って、この発明において、制御された発現のために使用する真核宿主細胞は、制限はしないが、Fleer，R.(1992)，Current Opinion in Biotechnology Vol. 3,No.5:486-496 頁に一般的に総説されたように（該総説及びそこで引用された参考文献の全内容を本明細書中に参考として援用する）、Saccharomyces cerevi siae,Pichia pastoris，Kluyveromyces lactis 及びHansenula polymorphaを含む酵母細胞であってよい。他の具体例において、制御された発現のために使用する真核細胞は、染色体中に、テトラサイクリンリプレッサー及び宿主細胞中での転写を活性化し得る蛋白質を含むトランスアクチベーター融合蛋白質（ｔＴＡ）をコードする異質ＤＮＡ部分を有する昆虫細胞である。転写アクチベーターに反応性のプロモーターに操作可能に結合された関心ある遺伝子をコードする第２の組換えＤＮＡ部分は、バキュロウイルスゲノム上に運ばれる。この発明のこれらの面の実施において使用し得る適当な一般的方法は、O'Reilly等(1992)「Baculovirus expression vectors，A Laboratory Manual」Stockton Pressにより総説されている（その全内容を、本明細書中に参考として援用する）。関心ある遺伝子は異質遺伝子即ち親の宿主細胞ゲノム中に取込まなければ存在しない遺伝子であってよいが、この発明の重要な面は、関心ある内在性遺伝子の制御に関するものである。かかる場合には、宿主細胞を遺伝子操作してその宿主細胞ゲノム中にｔＴＡ反応性プロモーターを挿入して、所望の内在性遺伝子をｔＴＡ反応性プロモーターの転写制御下に置く。これは、例えば、内在性遺伝子のコピーをｔＴＡ反応性プロモーターに結合して宿主細胞をこの組換え構築物でトランスフェクト又はトランスフォームすることによって達成することが出来る。１つのアプローチにおいて、この構築物を相同組換えによって内在性遺伝子の遺伝子座に導入する。簡単にいえば、ｔＴＡ反応性プロモーターは、５’側で、内在性遺伝子の現実のプロモーター領域を除く上流領域からの十分なＤＮＡ配列と隣接し、３’末端で、その内在性遺伝子のコード領域を表す配列と隣接する。相同組換えに必要なＤＮＡ配列の相同性の程度は、下記において論じる。他のアプローチにおいては、構築物を、予め決めた他の遺伝子座に又はランダムに挿入する。何れの場合にも、ｔＴＡの発現を可能にするＤＮＡ構築物で真核細胞をトランスフォーム又はトランスフェクトすることが出来る。或は、ｔＴＡをコードするＤＮＡ構築物それ自身を関心ある内在性遺伝子の遺伝子座に挿入して、ｔＴＡ反応性プロモーターに操作可能に結合した関心ある遺伝子をコードするＤＮＡ部分をゲノムの他所に導入することが出来る。この具体例において、ｔＴＡベクターは、この構築物の遺伝子座中への相同組換えを可能にする内在性遺伝子の遺伝子座のＤＮＡ配列に隣接したｔＴＡをコードするＤＮＡ部分を含む。所望の遺伝子座中への相同組換えを可能にする隣接ＤＮＡ配列の利用は、当分野で公知である。存在する場合、数キロベースまで又はそれ以上の隣接ＤＮＡが染色体挿入部位に対応してベクター中にｔＴＡコード配列（又は、相同組換えにより染色体位置に挿入すべきこの発明の任意の他の配列）の両側に存在して染色体配列の外来ＤＮＡでの正確な置換を確実にするのが好ましい。例えば、Deng等 1993、Mol.Cell.Biol 13(4):2134-40;Deng等 1992、Mol Cell Biol 12(8):3365-7 1;及びThomas等、1992、Mol Cell Biol 12(7):2919-23 を参照されたい。この発明の真核細胞は、例えば慣用の遺伝的増幅によって、ｔＴＡ反応性プロモーターにそれぞれ操作可能に結合した関心ある遺伝子の複数コピーを含むことが出来ることにも注意すべきである。上記より、ｔＴＡをコードするＤＮＡ部分を宿主細胞ゲノム中に導入する目的及びｔＴＡ反応性プロモーター構築物を所望の遺伝子と操作可能に結合して導入する目的を達成するためには、下記の原理に基づくベクターが必要であることは、明らかである。第１に、ｔＴＡをコードする構築物を宿主細胞のゲノム中に導入して、その発現が関心ある遺伝子について改変してない宿主細胞において観られる制御された発現パターンに従うようにするためには、関心ある遺伝子と関連する転写調節要素を条件として発現が為されるようにｔＴＡをコードする構築物を導入することが必要である。そうするための１つの方法は、ｔＴＡをコードする構築物を相同組換えによって関心ある遺伝子の遺伝子座に導入することである。かかる導入のためのベクターは、所望の相同組換え事象を可能にする宿主ゲノム中の関心ある遺伝子の遺伝子座からの十分なＤＮＡ配列と隣接したｔＴＡをコードするＤＮＡ配列を含み、該相同組換え事象において、ｔＴＡ及び隣接するＤＮＡは、宿主細胞ゲノム内で、隣接ＤＮＡコピー及びその間に含まれるＤＮＡについて効果的に交換される。内在性遺伝子のＤＮＡ配列に操作可能に結合されたｔＴＡ反応性プロモーターが、この出願中の参考文献に記載されたように、隣接する相同配列の助成なしでランダムな部位にインテグレートされ得ることは認められよう。或は、ｔＴＡ反応性プロモーター又はｔｅｔＯ制御要素を含むＤＮＡ配列を所望遺伝子の上流に挿入するために、ｔＴＡ反応性プロモーターを含むＤＮＡを、宿主ゲノム中の所望の挿入部位に隣接するＤＮＡ配列間の所望遺伝子のコピーの上流にライゲートして構築物を組み立てる。何れかの事象において、ｔＴＡ構築物を前述のように導入することが出来る。前述の遺伝的構築物及び工作した（engineered）真核細胞を用いて、この発明は、更に、関心ある遺伝子の発現を制御する方法を提供する。この方法の１つの面において、上記のように工作した真核宿主細胞を、細胞成長及び増殖に適した別の慣用の条件下で、但し、テトラサイクリンリプレッサー部分に結合し及び転写活性化をブロック若しくは阻止することの出来る物質を含む培養培地中で培養する。テトラサイクリンは、かかる典型的物質である。しかしながら、ｔｅｔＲに結合して転写を活性化しない複合体を形成するテトラサイクリンアナログは、勿論、テトラサイクリンの代用となり得る。テトラサイクリン又は他のかかる物質の正確な濃度は、その物質のｔｅｔＲドメインに対する親和性及び／又はその物質の特異的阻害活性並びに細胞密度及びｔＴＡのコピー数及び遺伝子発現の所望のレベルに依存する。それにもかかわらず、所望の阻害レベルのための阻害物質の適当なレベルは、過度の努力を伴わず容易に経験的に決定することが出来る。上記の方法に従って、細胞培養を負の制御をする（即ち、関心ある遺伝子の発現を完全に又は部分的に阻害する）。これらの細胞の、その後の、（初期濃度に比較して）低濃度のｔｅｔＲ結合物質を含む培地での培養は、遺伝子発現を開始し又は現在の一層高レベルでの発現を確実にすることを可能にする。結合物質（例えば、テトラサイクリン）の初期濃度を、遺伝子転写を実質的に完全に阻害する（例えば、転写が、慣用のノーザンブロッティング条件下で認められない）のに十分に選択し、且つその後の細胞培養フェーズにおいて結合物質を実質的に培地から除去するならば、遺伝子発現は、オン／オフ様式で制御されるということが出来る。幾つかの応用においては、発現の中間レベルが望ましい。この目的のために、結合物質の濃度を、経験的データに基づいて選択して予め決めた中間レベルの遺伝子転写を与えることが出来る。培地からの結合物質の除去は、結合物質を含む培養培地を、徐々に、段階的に、連続的に又は全面的に、結合物質を含まないか又は減少したレベルでのみ含む培地で置き替えることにより達成し得ることは理解されるべきである。この発明によって工作した真核細胞を、例えばトランスジェニック生物を創るために宿主細胞に取込む場合、この発明は、関心ある遺伝子を制御可能に発現し得る遺伝子操作された非ヒト動物を提供する。かかる動物は、広い意昧で、転写アクチベーターに反応性の異質プロモーターの転写制御下で、前に規定したｔＴＡをコードする異質ＤＮＡ部分及び関心ある遺伝子を含むＤＮＡ部分を含み及び発現することの出来る細胞を含む。従って、この発明は、更に、この発明の１つ以上のポリヌクレオチド分子のゲノム中の特定の標的部位への相同組換えにより誘導された非ヒト動物、かかる動物の子孫並びに標的遺伝子の条件付き方法での発現の阻止又は促進のための方法に関係する。この発明の具体例は、一般に遺伝子ターゲティング又はノックアウトとして記載された（Capecchi，M.R.(1989)Science Vol244，1288-1292頁、Bradley，A.(1 991)Current opinion in Biotechnology Vol.2 823-829頁）変異するとホモ接合の胎児の死を生じる遺伝子に関連して、例えば、ＲＢ遺伝子のノックアウトについて記載された(Jacks,T.等(1992)Nature359:295-300)この分野の長年にわたる問題を解決することが出来る。もしこの発明の主題の遺伝的スイッチを下記のように適用するならば、ｔｅｔオペレーター配列に操作可能に結合された関心ある内在性遺伝子の発現をこの発明のテトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーター（ｔＴＡ）によって刺激することが出来、動物は、変異してない野生型動物のように発生する。その後、特定の発生ステージにおいて、関心ある内在性遺伝子の発現を、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログをその動物に食べさせ又は注射することによりその動物の循環系及び組織内のテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログのレベルを上げることによってスイッチオフすることが出来、それにより、ｔＴＡの活性及び関心ある遺伝子の転写を阻止することが出来る。ここでは、この方法を、一般に、「条件付きノックアウト」と呼ぶ。下記より明らかとなるが、この発明の遺伝的スイッチを、内在性遺伝子の時間的空間的に正確な発現を与える方法で非ヒト動物のゲノムに適用するための２つの主な異なるアプローチが工夫された。１つのアプローチにおいては、遺伝的スイッチの２つの要素は、染色体中の別々の位置に存在して、２つのインテグレーションステップを要し、他の１つは、所望の結果を１ステップで達成する。この発明の一具体例の第１ステップにおいて、非ヒト動物を、ｔＴＡのＤＮＡ配列の、関心ある内在性遺伝子のヌクレオチド配列を含む特異的ＤＮＡ部位への、内在性遺伝子のコード配列の部分又は全部をｔＴＡ遺伝子で置き替えるやり方での相同組換えによって誘導する。これは、下記のステップにて達成することが出来る（図１１を参照されたい）：（1）この発明の第１の（即ち、ｔＴＡ）ポリヌクレオチド分子が関心ある遺伝子からのＤＮＡ配列と隣接しているキメラ遺伝子を、そのキメラ遺伝子を宿主ゲノム中に取込む際に通常は標的遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列がｔＴＡに対するＤＮＡ配列と融合してその発現を制御するように組み立て、（2）このキメラ遺伝子を関心ある種からの胎児幹細胞株中に導入し、その結果生成した候補の胎児細胞クローンをスクリーニングして、関心ある遺伝子座で相同組換えが起きた細胞を同定して回収し、（3）このようにして同定され回収された組換え体細胞を、関心ある種からの胚盤胞中に導入してキメラ胎児を産出し、（4）このキメラ胎児を、偽妊娠のレシピエント母親の子宮内に移植して相同組換え子孫の発生及び誕生を容易にする。このプロセスは、ｔＴＡＤＮＡが関心ある遺伝子と類似又は同一のパターンで発現されるように、ゲノムが、関心ある遺伝子の場所に挿入されたｔＴＡをコードするＤＮＡ配列を含んだ子孫を生成する。これらのプロセス及びそれらの結果は、ひとまとめにして、一般的に、「遺伝子ノックアウト」と呼ばれる。これらの技術は、十分確立されており、Wood等 Proc.Natl.Acad.Sci．90:4582-4585，S imon等 Nature Genetics 1:92-97及びSoriano等Cell 64:693-702並びにこれらの中での参照文献に記載されている（これらの全内容を、参考として本明細書中に援用する）。この発明のこの具体例における第２のステップは、ゲノム中に関心ある遺伝子を、テトラサイクリン（Ｔｃ）反応性プロモーター要素の転写制御下で含む第２のトランスジェニック動物の調製に関係する。これは、下記の方法を用いて達成することが出来る：（1）関心ある内在性遺伝子をコードするＤＮＡ配列の５’側にＴｃ反応性プロモーター要素（少なくとも１つのｔｅｔオペレーター及び最小プロモーターを含む）をクローン化したキメラＤＮＡ配列を調製する。これを達成する１つの方法は、プラスミッドｐＵＨＣ１３−３又はｐＵＨＣ１３−４中のルシフェラーゼコード配列及びすべてのポリアデニル化要素を、内在性遺伝子の完全なコード配列及び適当なポリアデニル化を与えるのに十分な３’非コード配列を含むＤＮＡ配列で置き替えることである。内在性遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ（例として、ｐＵＨＣ１３−３又はｐＵＨＣ１３−４中にルシフェラーゼ遺伝子を正確に置換するやり方でクローン化）であってもよく、或は、ゲノムＤＮＡと完全なコード配列与えるようにデザインされたｃＤＮＡ、イントロン配列中に存在し得又は完全なｃＤＮＡ中に含まれない任意の制御要素及びポリアデニル化シグナル又は他の典型的に内在性遺伝子と関連する要素の任意の組合せであってよいことは、認められよう。一般的なクローニング及びＤＮＡ操作法は、この明細書中で引用した参考文献に記載されている。（2）このキメラＤＮＡ配列（「キメラトランスジーン」とも呼ぶ）を受精卵に注入し、その受精卵を偽妊娠レシピエント母親に移植して、成体に発生させる。特に、数百のＤＮＡ分子を受精した一細胞卵の前核に注入する。このマイクロインジェクションした卵を、次いで、偽妊娠養育母親の卵管中に移して発生させる。発生するマウスの約２５％がマイクロインジェクションされたＤＮＡの１つ以上のコピーを受け継ぐことが、Brinster等（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA V ol.83:9065-9069により報告されている（その全内容を参考として本明細書中に援用する）。かかるトランスジェニック動物を作成するためのプロトコール（Cr enshaw等 Genes 3:Dev 9:959-972及びそこで引用された参考文献）は、十分確立された技術であり、組換え及び雑種動物の育種である。この発明のこの具体例の第１及び第２ステップから生じる動物の繁殖は、関心ある置換遺伝子及びキメラトランスジーンの両者を含む子孫を生成する。好適具体例において、この発明のこの具体例の第１ステップから生じる内在性遺伝子のノックアウトについてヘテロ接合の（その代わりに、ｔＴＡ遺伝子を発現する）動物を用いて、この発明のこの具体例の第２ステップから生じるキメラトランスジーンについてホモ接合である動物と交配させる。その結果生じた子孫を、この出願中の参考文献に記載されたテールブロット分析を含む標準的技術により分析し、両方の特徴についてホモ接合の動物を選択する。典型的には、約５０％の子孫が、両方の特徴を有する。これらの動物において、関心ある遺伝子のコード配列のｔＴＡのＤＮＡ配列のものでの置換は、ｔＴＡが、関心ある遺伝子と時間空間的に類似又は同一のパターンで発現され、今や、Ｔｅｔオペレーター及び５’末端に挿入された最小プロモーターのＤＮＡ配列の転写制御下の（即ち、該ＤＮＡ配列に操作可能に結合された）関心ある遺伝子の発現をトランスに制御するものである。特定の繁殖ストラテジーが、関心ある遺伝子の性質に依存することは、認められよう。もし、ｔＴＡコード配列を伴う内在性遺伝子の「ノックアウト」が致死的でなく且つ全計画が成体中の関心ある遺伝子の機能を「オン」又は「オフ」状態で研究出来る動物を創ることであるならば、この発明のこの具体例の第１ステップからの動物をホモ接合に交配し、次いで、第２ステップからのホモ接合マウスと交配することが出来る。この組合せにおいて、関心ある遺伝子を、下記のように、動物への餌及び水の供給により、テトラサイクリン又はそのアナログの加減によって制御する。この発明の他の具体例において、胎児幹（ＥＳ）細胞技術を用いて、条件付き様式で、関心ある遺伝子の発現を阻止し又は促進する（図１２）。この発明のこの具体例の第１のステップにおいて、ｔｅｔオペレーター及び関心ある遺伝子をコードするＤＮＡ配列の５’側に挿入された適当な最小プロモーターのＤＮＡ配列からなるＤＮＡ配列（一般に、キメラトランスジーンという）を、ＥＳ細胞ゲノム中のランダムな部位への安定な非相同組換えにより導入する。インテグレートされたＤＮＡ構築物を有する細胞クローンを有しない細胞から選択することを可能にする選択可能マーカーを、このキメラ構築物と同時導入する。ＥＳ細胞の成長を支持するフィーダー細胞が選択ステップで使用される同じ耐性遺伝子を発現しなければならないことは認められよう。例えば、選んだ選択可能マーカーがヒグロマイシン耐性遺伝子であるならば、ＥＳ細胞培養用に用いるフィーダー層細胞は、この出願中で引用されたトランスジェニック動物の作成のための標準的手順によって調製したヒグロマイシン耐性遺伝子についてトランスジェニックな動物から誘導することが出来る。「Current Protocols in Mol ecular Biology」Ausubel,E.M.等（編）1989 Vol.1及び2並びに現在までのすべての補足 Greene Publishing Associａteｓ and Wiley-Interscience，John Wil ey & Sons，New York（これらの全内容を参考として本明細書中に援用する）に記載されたように、又は、この出願中で引用された他の参考文献に記載されたように、慣用の検出方法例えばトランスジーンのｍＲＮＡレベルの評価を用いて、キメラトランスジーンの低い基礎発現について、ＥＳ細胞クローンを選択する。トランスジーンの発現を検出する他の方法は、活性のアッセイ又は蛋白質発現を検出するためにデザインされたアッセイを含んでよい。トランスジーンの低い基礎的発現を、トランスフェクトしてない細胞と比較して測定する。或は、ｔｅｔオペレーターに結合したトランスジーンの低い基礎発現を、胎児幹細胞から誘導した動物の種々の組織において評価することが出来る。例えば、ＥＳ細胞を、培養中でトランスジーンでトランスフェクトし、それらのクローンを発達させて選択し、胚盤胞に注入してトランスジェニック動物を創ることが出来る。標準的同定及びすべての組織にトランスジーンを有する動物を創るための交配の後に、ｔｅｔオペレーターに結合したトランスジーンの基礎発現を関心ある種々の組織において測定することが出来る（例えば、ｍＲＮＡ発現を分析するための慣用技術、例えば、ノーザンブロッティング、Ｓｌヌクレアーゼマッピング又は逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応による）。更に、トランスジーンの基礎的発現を、動物の種々の組織から誘導した初代細胞培養（例えば、培養皮膚細胞）にて試験することが出来る。安定なクローンの選択のための第２の基準は、ｔｅｔオペレーター結合トランスジーンの、ｐＵＨＤ１５−１又はｐＵＨＤ１５１−１のようなｔＴＡ発現プラスミッドのトランスフェクションの際にｔＴＡの一時的又は安定な発現に応答する能力である。これらのプラスミッドは単に例として引用したのであり、ＥＳ細胞において十分量のｔＴＡを発現する他のものを工夫し得ることは認められよう。ＥＳ細胞クローン中に安定にトランスフェクトされたｔｅｔオペレーター結合トランスジーンの発現を誘導するｔＴＡの能力を、そのＥＳ細胞クローンをｔＴＡ発現プラスミッドでスーパートランスフェクトしてそのトランスジーンの発現をアッセイすることによって調べることが出来る。或は、ｔｅｔオペレーター結合トランスジーンの誘導可能性を、そのトランスジーンを有するトランスジェニック動物の種々の組織から誘導した細胞において、その動物から初代細胞培養（例えば、皮膚細胞培養）を調製し、その細胞にｔＴＡ発現プラスミッドをトランスフェクトして、その細胞におけるトランスジーンの発現を標準的技術によりアッセイすることによって調べることが出来る。上記の基準を満たすクローンを選択して数を拡大する。次いで、このクローンを、下記のステップよりなる遺伝子ノックアウト手順のレシピエントとして使用する：（1）この発明のｔＴＡをコードするポリヌクレオチド分子の配列を関心ある第２の遺伝子からのＤＮＡ配列と、通常は関心ある第２の標的遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列をｔＴＡをコードするＤＮＡ配列に融合させてその発現を制御するように隣接させ、（2）このキメラ遺伝子を、関心ある種からの胎児細胞株中に導入して、上記のように改変し、候補の胎児細胞クローンを関心ある遺伝子座で相同組換えが起きたものについてスクリーニングし、（3）これらの組換え細胞を関心ある種からの胚盤胞に導入し、（4）キメラ胎児を偽妊娠レシピエント母親の卵管中に移植して、相同組換え動物の発生及び誕生を容易にする。このプロセスは、ｔＴＡコード配列が関心ある内在性の第２の遺伝子と時間空間的に類似のパターンで発現されるような、関心ある第２の遺伝子のアミノ酸コード配列のｔＴＡのＤＮＡ配列での置換を含む子孫を生じる。この場合において、ｔＴＡコード配列をインテグレートさせた標的配列の両コピーが中断されるように、組換え動物を自己交雑（又は、ホモ接合に交配）することが必要である。この手順も又、ｔｅｔオペレーター結合トランスジーンのホモ接合へ導く（即ち、ここに記載の遺伝的スイッチの両成分についてホモ接合の動物を生成することが出来る）。これらの技術は十分確立されており、Wood等 Proc.Natl.Acad.Sci ．90:4582-4585，Simon等 Nature Genetics 1:92-97 及びSoriano 等Cell 64:693-702並びにこれらの中での参照文献に記載されている。この発明の更に別の具体例においては、胎児幹（ＥＳ）細胞技術を再び用いて、条件付き様式で関心ある遺伝子の発現を、図１３に示したインテグレートされたコピーを生じる単一の相同組換えステップを用いて阻止し又は促進する。この方法において、通常は関心ある遺伝子に５’末端で隣接する（そして、一般に、プロモーターと呼ばれる配列を含む）配列の融合体を含むＤＮＡ構築物を、ｔＴＡ分子をコードするＤＮＡ配列と融合させる。選択可能マーカーに対する耐性をコードするＤＮＡ配列は、典型的に、ｔＴＡコード配列の３’末端に含まれる。例えば、構成的制御要素（例えば、図１３Ａに示したｐＰＧＫプロモーター）又はｔｅｔオペレーター配列（図１３Ｂに示しす）の何れかに融合し得るネオマイシン耐性遺伝子を、ｔＴＡコード配列の３’末端に挿入することが出来る。選択可能マーカーを操作可能にｔｅｔオペレーター配列に結合した場合は、その発現をｔＴＡによって制御する（例えば、耐性表現型は、Ｔｃの不在において発現されるが、存在下では発現されない）。最後に、このＤＮＡ構築物中の選択可能マーカー配列の３’に、関心ある内在性遺伝子をコードするＤＮＡ配列を挿入し、それも又、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター及び最小プロモーターに融合する。慣用的にターゲティングベクターと呼ばれるＤＮＡ分子の構成において、ｔＴＡのコード配列、選択可能マーカー及び関心ある内在性遺伝子は、すべて、関心ある内在性遺伝子と通常隣接する配列と隣接されるので、このＤＮＡ構築物は、制限はしないがＥＳ細胞等の細胞中に導入した際に関心ある内在性遺伝子の遺伝子座との相同組換えの潜在能力を有する。この型の相同組換えは、関心ある遺伝子がｔＴＡの制御下に入り、従って、テトラサイクリン又はその誘導体の存否による制御下に入るように天然の遺伝子座を変化させる。他方、このｔＴＡ蛋白質の発現は、関心ある遺伝子の正常な発現パターンに従う。次いで、この型の組換えＥＳ細胞を用いて、記載されたように完全な生物を生成することが出来（Wood 等Proc.Natl.Acad.Sci．90:4582-4585，Simon 等 Nature Genetics 1:92-97及び Soriano 等 Cell 64:693-702）、それを更にホモ接合に交配させることが出来る。この相同組換えに用いるＤＮＡ構築物の特殊な構成におけるプロモーター要素の近接性が、内在性遺伝子に操作可能に結合された下流のｔｅｔオペレーター／最小プロモーターを、ｔＴＡコード配列に操作可能に結合した内在性プロモーターの長い範囲の効果から隔離して、必要な内在性遺伝子の低レベルの基礎的発現を達成する特別の考慮を要求することがあり得ることは認められよう。幾つかの可能な解決は、当業者に公知の強い転写ターミネーター、これらの要素間の距離を増すＤＮＡ要素又はその他のエンハンサー配列の効果を制限するもの（例えば、マトリックス付着領域を含む転写インシュレーター）であり、これらのすべては、選択可能マーカー発現ユニット（例えば、プロモーターと結合されたネオマイシン耐性遺伝子）及びｔＴＡ反応性転写プロモーター配列間に単独で又は組み合わせてクローン化されるものである（図１３参照）。適当な転写ターミネーター、転写インシュレーター、マトリックス付着領域及び／又はその他の「シングルヒット」ターゲティングベクター中に含まれてオペレーター結合内在性遺伝子の基礎的転写を阻止することの出来る配列は、Sato,K．等(1986)Mol.Cell.Biol.6:1032-1043；Michel,D.等(1993)Cell.Mol .Biol.Res.39:131-140；Chung，J.H.等(1993)Cell 74:505-514；Neznanov，N.等 (1993)Mol.Cell.Biol.13:2214-2223;及びThorey，I.S.等(1993)Mol.Cell.Biol.1 3:6742-6751に記載されている。任意の上述の具体例から生成した種々の動物を、他のトランスジェニック動物について下記に説明するように、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの不在（内在性遺伝子スイッチ「オン」）又は存在下（内在性遺伝子スイッチ「オフ」）で研究することが出来る。かかる動物を用いて、関心ある遺伝子生成物の作用と相互作用し、依存し又は由来する物質の活性を同定し、比較し及び特性決定することが出来る。本発明は、真核細胞において個々の遺伝子の発現の制御を５段階の強度で可能にする制御系に関係する。この系は、テトラサイクリン耐性オペロンの制御要素、例えば、大腸菌のＴｎ１０に基づき（Hillen及びWissmann「Topics in Molecu lar and Structural biology」、Protein-Nucleic Acid Interaction中、Saeger 及びHeinemann編、Macmillan，London,1989,Vol.10,143-162）、耐性媒介遺伝子の転写は、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）によって負に制御される。テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの存在下において、ｔｅｔＲは、そのオペロンのプロモーター領域内に位置するオペレーターに結合せず、転写を与える。ｔｅｔＲと真核生物において転写を活性化し得る蛋白質例えばＨＳＶからのＶＰ１６のＣ末端ドメイン（前初期活性遺伝子の転写に必須であることが知られている（Triezenberg 等(1988)Genes Dev.2:718-729）との結合により、テトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）配列に融合された最小プロモーターを刺激するハイブリッドのトランスアクチベーターが生成される。これらのプロモーターは、実際は、低濃度のテトラサイクリンの存在下ではサイレントであり、これは、テトラサイクリン制御されたトランスアクチベーター（ｔＴＡ）がｔｅｔｏ配列に結合するのを妨げる。ｔｅｔＲのそのオペレーター配列に対する特異性（Hillen及びWissmann「Topi cs in Molecular and Structural biology」、Protein-Nucleic Acid Interaction 中、Saeger及びHei nemann 編、Macmillan,London,1989,Vol.10,143-162）並びにテトラサイクリンのｔｅｔＲに対する親和性（Takahashi等、J.Mol.Biol.187:341-348(1986)及びテトラサイクリンの十分研究された化学的及び生理学的特性は、ｌａｃＲ／Ｏ／ＩＰＴＧ系より遥かに優れた真核細胞における誘導可能発現系の基礎を構成する。これは、既に、植物細胞において示されており、プロモーター部位における直接的リプレッサー作用は、抗生物質により効率的に逆転される（Gatz及びQuail, (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:1394-1397，Gatz等（1991）Mol.Gen.Genet.2 27:229-237）。しかしながら、これらの以前の系は、遺伝子発現を阻止するためにｔｅｔリプレッサーを単独で用いたものであって、不十分であり又は効果的に機能するには細胞内に高濃度のリプレッサーを必要とするであろう。対照的に、本発明のｔＴＡは、ｔｅｔオペレーター結合遺伝子の発現を剌激する転写アクチベーターとして機能する。特に、この発明は、ｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）及び直接又は間接に真核生物における転写を活性化することの出来る蛋白質を含むアクチベーター融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド分子に関係する。ｔｅｔＲをコードするポリヌクレオチド分子の部分を、Altschmied等 EMBO J.7:4011-4017(1988)（その全内容を参考として本明細書中に援用する）に従って得ることが出来る。他のｔｅｔＲ配列は、Genbank から入手出来及び／又はWaters，S.H.等(1983)Nucl.Acids Res ．11:6089-6105; Unger，B.等（1984）Gene 31:103-108,Unger,B.等（1984）Nuc l.Acids Res.12:7693-7703;Tovar,K.等（1988）Mol.Gen.Genet.215:76-80；Hill en,W.及びSchollmeier,K.(1983)Nucl.Acids Res．11:525-539並びにPostle，K. 等（1984）Nucl.Acids Res．12:4849-4863 に開示されている（各内容をすべて参考として本明細書中に援用する）。ＨＳＶ−１６の負に帯電したＣ末端をコードするポリヌクレオチド分子の部分（真核生物におけるトランス活性化に必須であることが知られている）を、Trie zenberg等（1988）Genes Dev.2:718-729（この内容をすべて参考として本明細書中に援用する）に従って得ることが出来る。好ましくは、活性化ドメインは、ビリオン蛋白質１６のＣ末端の１３０アミノ酸を含む。或は、真核細胞中の転写活性化能力を有する他の分子を、この発明のｔＴＡにおいて用いることが出来る。種々の蛋白質中で見出された転写活性化ドメインは、類似する構造上の特徴に基づいてカテゴリーにグループ分けされた。転写活性化ドメインの型には、酸性転写活性化ドメイン、プロリンリッチな転写活性化ドメイン、セリン／スレオニンリッチな転写活性化ドメイン及びグルタミンリッチな転写活性化ドメインが含まれる。酸性転写活性化ドメインの例には、既に記載したＶＰ１６領域及びＧＡＬ４のアミノ酸残基７５３〜８８１が含まれる。プロリンリッチな活性化ドメインの例には、ＣＴＦ／ＮＦ１のアミノ酸残基３９９〜４９９及びＡＰ２のアミノ酸残基３１〜７６が含まれる。セリン／スレオニンリッチな転写活性化ドメインの例には、ＩＴＦ１のアミノ酸残基１〜４２７及びＩＴＦ２のアミノ酸残基２〜４５１が含まれる。グルタミンリッチな活性化ドメインの例には、Ｏｃｔ１のアミノ酸残基１７５〜２６９及びＳｐ１のアミノ酸残基１３２〜２４３が含まれる。上記の各領域及び他の有用な転写活性化ドメインのアミノ酸配列は、Seipel，K.等(EMBO J.(1992)13 :4961-4968)に開示されている。ｔｅｔＲをコードするポリヌクレオチド分子を、活性化ドメイン（例えば、ＨＳＶＶＰ１６の）をコードするポリヌクレオチド分子に結合し、慣用の組換えＤＮＡ技術によってベクターＤＮＡと再結合することが出来る（該技術には、ライゲーションのための鈍端化又はジグザグ化末端、適当な末端を与えるための制限酵素消化、粘着末端の適当な充填、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び適当なリガーゼによるライゲーションが含まれる）。或は、リプレッサー及び活性化ドメインをコードする核酸断片を、リプレッサー又は活性化ドメインの何れかをコード（例えば、ＶＰ１６をコード）するテンプレートＤＮＡを用いる適当なヌクレオチド配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅によって得ることが出来る。増幅したＤＮＡ断片を、次いで、蛋白質コード配列がイン・フレームで存続するようにライゲートし、このようにして生成したキメラ遺伝子を適当な発現ベクター中にクローン化することが出来る。好ましくは、トランスアクチベーター融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド分子は、更に、操作可能に結合されたプロモーターを含む。このプロモーターは、誘導可能プロモーターであっても構成的プロモーターであってもよい。かかるプロモーターの例には、Boshart,M.等 1985,Cell Vol.41,521-530 により教示されたヒトサイトメガロウイルスプロモーターＩＥ、普遍的発現プロモーター例えばＨＳＶ−Ｔｋ（McKnight等 Cell 37:253-262(1984)）及びβ−アクチンプロモーター（例えば、Ng等 Mol.Cell.Biol.5:2720-2732(1985)に記載されたβ−アクチンプロモーター）、並びに、インテグレーション部位に依存しないトランスジーンの発現を与える制御領域と組み合わせたプロモーター（Grosveld等 Cell5 1:975-985(1987)）、並びにアルブミン等の組織特異的なプロモーター（肝特異的、Pinkert 等 Genes Dev．1:268-277(1987)）、リンホイド特異的プロモーター(Calame及びEaton，Adv.Immunol.43:235-275(1988))、特に、Ｔ細胞レセプターのプロモーター（Winoto及びBaltimore，EMBO J.8:729-733(1989)）及び免疫グロブリン；Banerji 等 Cell 33:729-740(1983)；Queen 及びBaltimore,同書 741-748 ）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Byrne 及び Ruddle，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5474-5477(1989)）、膵臓特異的プロモーター（Edlund等Science 230:912-916(1985)）又は乳腺特異的プロモーター（乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）、並びに発生的に制御されるプロモーター例えばマウスｈｏｘプロモーター（Kessel及びCruss，Science 249:374-379(1990)）又はα −フェトプロテインプロモーター（Campes及びTilghman，Genes Dev.3:537-546( 1989)）が含まれる（各内容をすべて参考として本明細書中に援用する）。好ましくは、プロモーターは、各細胞型において構成的である。この発明の一具体例において、トランスアクチベーターをコードするポリヌクレオチド分子を、ｔＴＡコード配列を内在性制御要素（例えば、ｔＴＡコード配列をインテグレートした関心ある標的遺伝子の５’制御領域）の制御下に置くように第２の標的ＤＮＡ分子内（例えば、染色体内の関心ある遺伝子）の予め決めた位置にインテグレートさせる。ｔＴＡコード配列をどの遺伝子にインテグレートさせるかによって、内在性制御要素は、多くの細胞型においてｔＴＡの構成的発現を与え、又はｔＴＡの発現を特定の細胞若しくは組織型に限定することが出来る。この発明は又、ｔＴＡ反応性プロモーターに操作可能に結合された、蛋白質をコードする他のポリヌクレオチド分子にも関係する。典型的には、このｔＴＡ反応性プロモーターは、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列に機能的に結合された最小プロモーターを含む。このｔｅｔＯ配列は、例えば、Hi llen及びWissmann「Topics in Molecular and Structural biology」、Protein- Nucleic Acid Interaction中、Saeger及びHeinemann編、Macmillan,London,1989 ,Vol.10,143-162（この内容をすべて参考として本明細書中に援用する）に従って得ることが出来る。この発明の実施において使用し得る他のｔｅｔＯ配列は、 Genbankから入手出来及び／又はWaters，S.H.等（1983）Nucl.Acids Res.11:608 9-6105；Hillen，W.及びSchollmeier,K.（1983）Nucl.Acids Res.11:525-539；S tuber，D.及びBujard,H.（1981）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:167-171；Unger,B .等(1984) Nucl.Acids Res.12:7693-7703;及びTovar,K.等（1988）Mol.Gen.Gene t.215:76-80に開示されている（各内容をすべて参考として本明細書中に援用する）。ｔｅｔオペレーター配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０又はそれより多くのコピーを用いることが出来、より多い数のかかる配列を用いれば、増大した範囲の制御を与える。実施例に示したように、複数コピーのｔｅｔオペレーター配列は、異質蛋白質の発現を制御する能力に共同的効果を与える。サイトメガロウイルスプロモーターを特定するポリヌクレオチド配列を、Bosh art 等 Cell 41:521-530(1985)（その内容をすべて参考として本明細書中に援用する）に従って得ることが出来る。好ましくは、プロモーター−エンハンサーの＋７５〜−５３〜＋７５〜−３１位置を最小プロモーターとして用いる。このプロモーターの後には、ポリリンカーを続け、それから、関心ある蛋白質をコードする遺伝子を続けることが出来る。ルシフェラーセ遺伝子又は他のレポーター遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ又はβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子）を用いて、この制御系の操作可能性を示すことが出来るが、この発明は、そのように限定はされない。かかる遺伝子の例には、制限はしないが、エストロゲンレセプター、ＧＡＢＡレセプター、プロゲステロンレセプター及びＨＢＶのＸ蛋白質が含まれる。本発明は又、本発明のポリヌクレオチド分子でトランスフェクトした真核細胞にも関係する。特に、この発明は、下記でトランスフェクトした真核細胞に関係する（a）原核生物のｔｅｔリプレッサー及び真核生物において転写活性化し得る蛋白質を含むトランスアクチベーター融合蛋白質をコードする第１のポリヌクレオチド分子、及び（b）蛋白質をコードする第２のポリヌクレオチド分子（該分子は、最小プロモーター及び少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に操作可能に結合している）。これらの２つのポリヌクレオチド分子は、同じ又は別々のベクター上に存在してよい。好適具体例においては、第１のポリヌクレオチドを真核細胞又はトランスジェニック動物の染色体中にインテグレートし、第２のポリヌクレオチドをベクターの一部として導入する。導入されたポリヌクレオチドと特定のゲノムの間で共有する相同性領域に交差がある場所で、インテグレーションを達成することが出来る。かかるトランスフェクトされた真核細胞からの異質蛋白質の発現を厳格に制御することが出来る。予想外のことには、本発明の発現系を用いて発現を約５段階の強度で制御することが出来ることが測定された。更に、本発明の発現系は、異質遺伝子の発現を、可逆的様式で、迅速に「オン」及び「オフ」を切り替えることを可能にすることが発見された。更に、この発明の発現系は、どの程度のテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログを用いたかによって所望のレベルの発現を達成することを可能にすることが発見された（図３参照）。従って、本発明の発現系は、この分野における偉大な進歩である。この発明は又、ｔＴＡをコードする本発明の少なくとも第１のポリヌクレオチド分子を含むトランスジェニック動物にも関係する。かかるトランスジェニック動物は、例えば、ポリヌクレオチドを受精卵に注入し、それを成体動物に発生させることによって得ることが出来る。特に、数百のＤＮＡ分子を受精した１細胞卵の前核中に注入する。マイクロインジェクションされた卵を、次いで、偽妊娠養育母親の卵管中に移して発生させる。それは、Brinster等 Proc.Natl.Acad.Sci.US A 82:4438-4442(1985)により報告されている。その内容をすべて参考として本明細書中に援用するが、発生するマウスの約２５％がマイクロインジェクションされたＤＮＡの１コピー以上を受け継ぐ。乳蛋白質プロモーターを含むポリヌクレオチド分子を調製して、そのＤＮＡを受精卵中にマイクロインジェクションして、発生した際に、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの不在時に乳中に異質蛋白質を産生し得るトランスジェニック哺乳動物を与えることも可能である。国際公開Ｎｏ．８８／００２３９及び欧州出願公開Ｎｏ．０２６４，１６６を参照されたい（これらの内容をすべて参考として本明細書中に援用する）。この発明は、この発明の第１のポリヌクレオチド分子のＤＮＡ配列の、標的遺伝子と呼ばれる遺伝子のヌクレオチド配列を含む特異的なＤＮＡ部位への相同組換えにより誘導した非ヒト動物及びそれらの子孫にも関係する。これは、下記のステップにより達成される：１）ｔＴＡをコードするこの発明の第１のポリヌクレオチド分子の配列を標的部位からのＤＮＡ配列と、通常は標的遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列がこの発明の第１のポリヌクレオチド分子のＤＮＡ配列と融合してその発現を制御するように隣接させ、２）このキメラ遺伝子を、関心ある種からの胎児細胞株に導入して、候補の胎児細胞クローンを標的遺伝子座で相同組換えが起きたものについてスクリーニングし、３）それらの組換え体細胞を関心ある種からの胚盤胞に導入し、４）キメラ胎児を偽妊娠レシピエント母親の子宮内に移植して発生及び誕生を容易にする。このプロセスは、標的遺伝子のアミノ酸コード配列の、この発明の第１のポリヌクレオチド分子のＤＮＡ配列での置換を、この対応アミノ酸配列が標的遺伝子と類似のパターンで発現されるように含む子孫を生じる。これらのプロセス及びそれらの結果を、ひとまとめに一般的に、「遺伝子ノックアウト」という。これらの技術は十分確立されており、Wood等 Proc．Natl.Acad．Sci．90:4582-4585，Simon等 Nature Gene tics 1:92-97及びSoriano 等 Cell 64:693-702並びにこれらの中での参照文献に記載されている。この発明は又、標的遺伝子の発現を条件付き様式で阻止し又は促進するための方法にも関係する。これは、標的遺伝子ノックアウト（前段落で概説）を含む動物を、下記の方法により誘導したトランスジェニック動物と交配させることによって達成することが出来る。トランスジェニック動物は、標的遺伝子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の５’側に挿入されたこの発明の第２のポリヌクレオチド分子のＤＮＡ配列からなるキメラＤＮＡ配列（一般に、キメラトランスジーンという）を、マイクロインジェクションにより、受精卵のゲノム中に挿入して、それを成体動物に発生させることによって作成される。かかるトランスジェニック動物の作成のためのプロトコールは、十分確立された技術であり（Brinster等 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:4432-4445,Crenshaw等 Genes & De v 3:959-972及びそれらにおける参考文献）、動物の交配である。この交配により、遺伝子ノックアウト及びキメラトランスジーンの両者を含む子孫が生じる。即ち、標的遺伝子のアミノ酸コード配列の、この発明の第１のポリヌクレオチド分子のＤＮＡ配列での、この対応アミノ酸配列が標的遺伝子と類似のパターンで発現されるような置換、及び、標的遺伝子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の５’側に挿入されたこの発明の第２のポリヌクレオチド分子のＤＮＡ配列。この組合せにおいて、動物の餌又は水にテトラサイクリン又はそのアナログを加え又は除くことにより、標的遺伝子を制御することが出来る。従って、この発明は又、本発明のトランスフェクトされた真核細胞をテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログを含む培地で培養することを含む、ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の発現を下方制御するための方法にも関係する。実施例に記載したように、培養培地中のテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの濃度を注意深く制御することによって、発現の程度を厳密に制御することが可能である。図３に示したように、パネルＡ（０．０００１μｇ／ｍｌの僅かなテトラサイクリン）では、ポリペプチド（ルシフェラーゼ）発現の減少を生じ始める。約０．１μｇ／ｍｌにおいて、発現は、本質的に停止する。発現レベルの制御に使用し得るテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの濃度は、約０．００１〜１μｇ／ｍｌに及び得る。この発明は又、本発明の真核細胞をテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログを欠く培地中で培養することを含む、ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の発現を上方制御する方法にも関係する。この発明は又、Yarranton,G.T.1992（この論文の全部を参考として本明細書中に援用する）により一般的に概説された組換え蛋白質の産生において制御された遺伝子発現を利用するための方法にも関係する。細胞毒性であるか又は細胞内の生理的プロセスを推論する組換え蛋白質の発現は、遺伝子発現を厳密に制御する適当な方法の欠如のために妨げられてきた。対照的に、本発明による産生細胞株を、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの存在下で適当な密度（その後の遺伝子発現の誘導を与えるために経験的に評価）まで成長させ、制御化合物の希釈により発現を誘導する。この培養物を、最適発現レベルに到達するまで、連続的に成長させる。次いで、この組換え蛋白質を、標準的手順によって採取する。好適具体例として、「Gene Transfer and Expression」（M.Kriegler 1990）（参考として本明細書中に援用）に一般的に概説されたように、組換え蛋白質の発現に真核細胞を利用する。通常、ＣＨＯ^dhfr-細胞（Urlaub,G.及びChasin 198 0）、２９３細胞（Graham，F.L.等1977）又はＳＰ２若しくはＮＳＯのようなミエローマ細胞（Galfre，G.及びMilstein,C．1981）が用いられるが、発現される蛋白質、選んだ選択システム又は採用した発酵システムに適している任意の真核細胞株を使用し得ることは、当業者には明白である。他の好適具体例において、制御された発現のために使用される細胞は、制限はしないが、Fleer，R．1992により一般的に総説されたように（該論文全体を本明細書中に参考として援用する）、Saccharomyces cerevisiae,Pichia pastoris， Kluyveromyces lactis 及びHansenula polymorphaを含む酵母細胞である。他の好適具体例において、制御された発現のために使用される細胞は、「Bacu lovirus expression vectors」（O'Reilly等 1992）により一般的に総説されている（その全内容を、本明細書中に参考として援用する）ように、バキュロウイルスゲノムにより運ばれる遺伝子及びプロモーター領域を有する昆虫細胞である。幾つかのプロモーターの組織特異性が、ｔｅｔオペレーター配列／プロモーター配列融合体は、この出願中の教示に従って、問題の細胞株について慣用されているプロモーター（これらのプロモーターの例は、上記の関連文献中に与えられている）を用いて、特定の適用及び考えている細胞株についてデザインされなければならないことを命じることは認められ得る。上記より、本発明において、産生細胞株をＴｅｔオペレーター／ＣＭＶプロモーター配列の制御下での遺伝子の非常に低い基礎的発現について選択することが重要であることは明らかである。組換え蛋白質をコードする遺伝子のインテグレーションに適していることが経験的に見出された染色体位置を繰り返し標的とするための、酵素的に補助された又はされない相同組換えを用いる、現在使用可能な多くの方法がある。既にここに記載した相同組換えアプローチに加えて、酵素補助部位特異的インテグレーション系が当業者に公知であり、この発明の制御系の成分に適用して、ＤＮＡ分子を第２の標的ＤＮＡ分子中の予め決めた位置にインテグレートさせることが出来る。かかる酵素補助インテグレーション系の例には、Ｃｒｅレコンビナーゼ−ｌｏｘ標的系（例えば、Baubonis，W.及びSauer，B .（1993）Nucl.Acids Res.21:2025-2029;及びFukushige，S．及びSauer，B.(199 2)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7905-7909）及びＦＬＰレコンビナーゼ−ＦＲＴ標的系（例えば、Dang，D.T.及びPerrimon，N.（1992）Dev.Genet.13:367-375; 及び Fiering，S．等（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8469-8473）が含まれる。この発明の実施に使用し得る培地には、本発明のトランスフェクトされた真核細胞に適合性である任意の培地が含まれる。かかる培地は、市販されている（例えば、Gibco/BRLから）。或は、本発明のトランスジェニック動物中で、蛋白質の発現を、その動物にテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログを投与することによって下方制御することが可能である。テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログは、意図した目的を達成する任意の手段、例えば、非経口、皮下、静脈、筋肉、腹腔内、経皮又は口内経路によって投与することが出来る。或は（又は、同時に）、投与は、経口経路であってよい（例えば、実施例２を参照されたい）。投与量は、動物の年齢、健康及び体重、併用する治療（ある場合）及び治療の頻度に依存する。蛋白質の発現を上方制御するために、次いで、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの投与を中断することが出来る。この発明は又、内部の閉じた領域に少なくとも２つの容器手段例えばチューブ、バイアル、ボトル等（各々は、この発明の実施に使用し得るポリヌクレオチド分子を含む）を有するキャリアー手段を含むキットにも関係する。特に、この発明は、内部の閉じた領域に少なくとも２つの容器手段を有するキャリアー手段を含むキットに関係し、ここに、第１の容器手段は、原核生物のｔｅｔリプレッサー及び真核生物における転写活性化し得る蛋白質を相同組換えに適した形態で含むトランスアクチベーター融合蛋白質をコードする第１のポリヌクレオチド分子を含み、第２の容器手段は、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に操作可能に結合した最小プロモーターを含む第２のポリヌクレオチド分子を含む（ここに、第２のポリヌクレオチド分子は、ポリペプチドをコードする異質遺伝子配列にライゲートして、その異質蛋白質の発現を活性化することが出来る）。この発明は又、内部の閉じた領域に少なくとも２つの容器手段を有するキャリアー手段を含むキットに関係し、ここに、第１の容器手段は、原核生物のｔｅｔリプレッサー及び真核生物における転写活性化し得る蛋白質を相同組換えに適した形態で含むトランスアクチベーター融合蛋白質をコードする第１のポリヌクレオチド分子でトランスフェクトした真核細胞を含み、第２の容器手段は、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に操作可能に結合した最小プロモーターを含む第２のポリヌクレオチド分子を含む（ここに、第２のポリヌクレオチド分子は、ポリペプチドをコードする異質遺伝子配列にライゲートして、そのポリペプチドの発現を活性化することが出来る）。この発明は、多面発現性効果を引き起こさず又は細胞毒性を伴わずに遺伝子発現の「オン」と「オフ」の切り替えをし、又は遺伝子発現のレベルを迅速、効率的且つ制御された様式で制御し得ることが望ましい種々の研究に広く適用可能である。この発明は、遺伝病又は後天的疾患の治療の何れかにおいて、ヒトにおける遺伝子治療目的に特に有用であり得る。遺伝子治療の一般的アプローチには、１種以上の核酸分子を、導入された遺伝物質によりコードされた１種以上の遺伝子生成物が細胞中に生成されて機能的活性を回復し又は増大するように、細胞に導入することが含まれる。遺伝子治療アプローチについて概観するために、Anderson，W.F.（1992）Science256 :808-813；Miller，A.D．（1992）Nature 357:455-460；Friedmann，T.（1989） Science 244:1275-1281；Cournoyer，D．等（1990）Curr.Opin.Biotech.1:196-2 08を参照されたい。しかしながら、現在の遺伝子治療用のベクターは、典型的には、内在性転写因子に反応性の構成的制御要素を利用している。これらのベクター系は、患者における遺伝子発現のレベルを改変する能力を与えない。対照的に、この発明の制御系は、この能力を提供する。この発明の系を遺伝子治療目的に利用するためには、少なくとも１種のＤＮＡ分子を、遺伝子治療を必要とする患者（例えば、遺伝病又は後天的疾患を患っているヒト患者）の細胞内に導入して、それらの細胞を改変する。これらの細胞は、１）宿主細胞におけるｔＴＡの発現に適した形態のこの発明のｔＴＡをコードする核酸及び２）ｔＴＡ反応性プロモーター（例えば、ｔｅｔオペレーター配列及び最小プロモーター）に操作可能に結合された関心ある遺伝子（例えば、治療目的のためのもの）を含むように改変される。好ましくは、これらのＤＮＡ分子の一方又は両方を、ヒト細胞の染色体中の予め決めた位置に相同組換えによってインテグレートする。この発明の制御系の両成分をコードする単一ＤＮＡ分子を用いるか、又は、各成分をコードする別々のＤＮＡ分子を用いることが出来る。患者の細胞を、生体外で改変し、次いで、その患者に導入し、又は、これらの細胞を、核酸を細胞に導入するための慣用技術によりイン・ビボで直接改変することが出来る。患者の細胞中での関心ある遺伝子の発現はＴｃ又はＴｃアナログの不在において刺激され、他方、Ｔｃ又はＴｃアナログを患者に投与することによって発現が阻止される。遺伝子発現のレベルを、どの特定のＴｃアナログを誘導剤として使用するかによって変えることが出来る。更に、関心ある遺伝子の発現を、その個人の医療の必要に応じて調節することが出来、それは、その個人の生涯を通じて変化し得る。従って、この発明の制御系は、構成的制御系を超える、治療状況の要求に応じた遺伝子発現のレベルの調節を与える利点を提供する。遺伝病又は後天的疾患の治療について、患者の細胞内で発現される特に関心ある遺伝子には、アデノシンデアミナーゼ、VIII因子、IX因子、ジストロフィン、 β−グロビン、ＬＤＬレセプター、ＣＦＴＲ、インシュリン、エリスロポエチン、抗−血管形成誘導因子、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α１−アンチトリプシン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、トリプシンヒドロキシラーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、ＵＤＰ−グルクロニシルトランスフェラーゼ、アポＡ１、ＭＤＲ１及びＭＲＰ多剤耐性遺伝子、ＴＮＦ、可溶性ＴＮＦレセプター、インターロイキン類（例えば、ＩＬ−２）、インターフェロン類（例えば、α−又はγ−ＩＦＮ）並びに他のサイトカイン及び成長因子をコードするものが含まれる。癌の治療において特に輿味深い遺伝子治療応用には、腫瘍浸潤性リンパ球におけるサイトカイン遺伝子（例えば、ＴＮＦ−α）の過剰発現、又は腫瘍部位における抗腫瘍免疫応答を誘導するサイトカインの腫瘍細胞における異所性発現、非毒性因子を毒性因子に変換し得る酵素の腫瘍細胞における発現、抗腫瘍免疫応答を誘導する腫瘍特異的抗原の発現、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐ５３又はＲｂ）の腫瘍細胞における発現、骨髄細胞を化学療法の毒性から保護するための多剤耐性遺伝子（例えば、ＭＤＲｌ及び／又はＭＲＰ）の骨髄細胞における発現が含まれる。ウイルス疾患の治療において特に輿味深い遺伝子治療応用には、トランス優性の負のウイルス性トランス活性化蛋白質、例えば、ＨＩＶのトランス優性の負のｔａｔ及びｒａｖ変異体又はＨＳＶのトランス優性のＩＣｐ４変異体の発現（例えば、Balboni，P.G．等（1993 ）J.Med.Virol．41:289-295；Liem，S.E.等(1993)Hum.Gene Ther.4:625-634；Ma lim，M.H.等（1992）J.Exp.Med.176:1197-1201；Daly．T.J.等(1993)Biochemist ry 32:8945-8954；及びSmith，C.A．等（1992）Virology 191:581-588参照）、トランス優性の負のエンベロープ蛋白質例えばＨＩＶのｅｎｖ変異体の発現（例えば、Steffy，K.R.等（1993）J.Virol.67:1854-1859参照）、ウイルス性生成物に対する抗体又はその断片の細胞内発現（「内部免疫」、例えば、Marasco，W.A ．等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7889-7893参照）及び可溶性ウイルスレセプター、例えば可溶性ＣＤの発現が含まれる。この発明の制御系を用いて、自殺遺伝子（リシン又はＨＳＶのｔｋ遺伝子等）を、特定の治療の後に、細胞中で条件付様式で発現させて細胞を破壊する（例えば、イン・ビボ）ことも出来る。例えば、自殺遺伝子を抗癌免疫化に用いるための腫瘍細胞に導入し、又は、ワクチンとして使用するための弱毒化生ウイルスのウイルスゲノム中に導入することが出来る。これらの自殺遺伝子を有する腫瘍細胞又はウイルスワクチンを、Ｔｃ（又は、そのアナログ）の存在下で患者に投与する。免疫化の後に、その薬物を除去し（例えば、投与を停止する）、それにより、自殺遺伝子の発現を誘導して、これらの腫瘍細胞又は生ウイルスを有する細胞を破壊する。遺伝子治療目的につき改変し得る細胞型には、造血幹細胞、骨髄芽細胞、肝細胞、リンパ球、気道上皮及び皮膚上皮が含まれる。遺伝子治療のための細胞型、遺伝子及び方法の更なる説明については、例えば、Wilson，J.M.等（1988）Proc .Natl.Acad.Sci.USA 85:3014-3018；Armentano，D．等（1990）Proc.Natl.Acad. Sci．USA 87:6141-6145；Wolff，J.A.等（1990）Science 247:1465-1468；Chowd hury，J.R．等（1991）Science 254:1802-1805；Ferry，N．等（1991）Proc.Nat l.Acad.Sci.USA88:8377-8381；Wilson；J.M.等（1992）J.Biol.Chem.267:963-96 7；Quantin，B.等（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2581-2584；Dai，Y．等（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892-10895；van Beusechem，V.W.等（19 92）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7640-7644；Rosenfeld，M.A．等（1992）Cell 68 :143-155；Kay,M.A.等（1992）Human Gene Therapy 3:641-647；Cristiano，R .J.等（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2122-2126；Hwu，P．等（1993）J.Im munol.150:4104-4115；及びHerz，J.及びGerard，R.D.（1993）Proc.Nat1.Acad. Sci.USA 90:2812-2816を参照されたい。この発明の制御系を用いて、関心ある遺伝子生成物（例えば、蛋白質）を生成し、単離することも出来る。１）宿主細胞での発現に適した形態のこの発明のｔＴＡをコードする核酸及び２）ｔＴＡ反応性プロモーター（例えば、ｔｅｔオペレーター配列及び最小プロモーター）に操作可能に結合された関心ある遺伝子（例えば、関心ある蛋白質をコードするもの）を含むように改変した培養細胞を用いてイン・ビトロで、関心ある蛋白質の大規模生成を達成することが出来る。例えば、ここに記載のように、哺乳動物、酵母又はカビ細胞を、これらの核酸成分を含有するように改変することが出来る。或は、昆虫細胞／バキュロウイルス発現系を用いることが出来る。関心ある遺伝子生成物を生成し、単離するために、この発明の制御系の２つの成分（例えば、ｔＴＡをコードする核酸及びｔＴＡ反応性プロモーターに結合された、関心ある遺伝子生成物をコードする関心ある遺伝子）を有する宿主細胞（例えば、哺乳動物、酵母又はカビ細胞）を、先ず、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの存在下にて培地中で生育させる。これらの条件下で、関心ある遺伝子の発現は抑制される。次いで、培養培地中のテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの濃度を減少させて、関心ある遺伝子の転写を刺激する。次いで、これらの細胞を、更に、関心ある遺伝子によりコードされる遺伝子生成物の所望の量が細胞により生成されるまで、Ｔｃ（又はそのアナログ）の不在において培養する。次いで、この遺伝子生成物を、採取した細胞又は培養培地から、標準的技術によって単離することが出来る。この発明は又、動物（例えばトランスジェニック家畜）における関心ある蛋白質の大規模生成をも提供する。トランスジェニック技術の進歩は、ウシ、ヤギ、ブタ及びヒツジ等のトランスジェニック家畜を生成することを可能にした（Wall ，R.J.等（1992）J.Cell.Biochem.49:113-120；及びClark，A.J．等（1987）Tre nds in Biotechnology 5:20-24に概説されている）。従って、この発明の制御系の成分をゲノム中に有するトランスジェニック家畜を作成することが出来る。従って、適当な交配により、この発明のｔＴＡをコードするトランスジーンと関心ある遺伝子に結合したｔＴＡ反応性プロモーターを含むトランスジーンとを有する二重トランスジェニック動物を得ることが出来る（関心ある遺伝子は、外来性遺伝子又は内在性遺伝子の何れかであってよい）。Ｔｃ（又はアナログ）の不在において、関心ある遺伝子の発現がこれらのトランスジェニック動物中で刺激される。Ｔｃ（又はアナログ）を動物に投与することにより、関心ある遺伝子の発現を阻止することが出来る。ｔＴＡをコードする核酸を、トランスアクチベーターの発現をある種の細胞に限定する適当な組織特異的制御要素に結合することによって、蛋白質生成を特定の組織を標的とすることが出来る。例えば、乳腺特異的制御要素例えば乳清プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）を、ｔＴＡをコードするトランスジーンに結合して、トランスアクチベーターの発現を乳組織に限定することが出来る。従って、Ｔｃ（又はアナログ）の不在において、関心ある蛋白質は、このトランスジェニック動物の乳組織において生成されるが、Ｔｃ又はＴｃアナログを投与することにより蛋白質発現を下方調節することが出来る。この蛋白質をこのトランスジェニック動物の乳中に分泌されるようにデザインすることが出来、所望であれば、次いで、その蛋白質を該乳より単離することが出来る。今や、この発明を一般的に説明したので、それは、下記の実施例を参照することにより理解されよう。これらの実施例は、説明の目的で与えるものであり、制限又は特定することを意図するものではない。この出願中で引用したすべての刊行物、参考文献、特許及び公表された特許出願を、参考として本明細書中に援用する。実施例１：細胞中での遺伝子発現のｔＴＡによる調節材料と方法トランスアクチベーターｔＴＡ及びｔＴＡ_sの構築。ｔｅｔＲ配列は、初め、ｐＷＨ５１０からＰＣＲにより回収され（Altschmied等 EMBO J.7:4011-4017(19 88)、その開示をすべて参考として本明細書中に援用する）、ｐＵＨＤ１０−１に挿入されて（Deustchle 等 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5400-5404(1989)）、ｐＵＨＤ１４−１が生成された（Manfred Gossenの学位論文「Prokaryotic Repr essor Operator Systems in the Control of Eucaryotic Gene Expression」，H eidelberg大学、1993を参照されたい。その内容をすべて参考として本明細書中に援用する）。このプラスミッド構築物中のｔｅｔＲ停止コドンと重複するユニークなＡｆｌＩＩ開裂部位は、コード配列のイン・フレームでの挿入を可能にする。ｔＴＡを生成するために、ｐＭＳＶＰ１６の３９７塩基対（ｂｐ）のＭｌｕＩ／ＦｏｋＩ断片（ＨＳＶのＶＰ１６のＣ末端の１３０アミノ酸をコードする）（Triezenberg 等 Genes Dev.2:718-729(1988)、その開示をすべて参考として本明細書中に援用する）をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて突出末端を埋めて鈍端化した。このＤＮＡを予めＡｆｌＩＩで開裂してヤエナリ（mung bean）ヌクレアーゼで鈍端化したｐＵＨＤ１４−１に挿入した。その結果生成したプラスミッドｐＵＨＤ１５−１は、ｔＴＡ配列（図１、パネルａ）をＰ_hCMV（ヒトサイトメガロウイルスＩＥ；下記参照）の制御下でコードする。ＶＰ１６の９７アミノ酸Ｃ末端部分をコードするＤＮＡ断片を、ＰＣＲ媒介のクローニングによってｔｅｔＲに融合させた。その結果生成したプラスミッドｐＵＨＤ１５１−１は、このトランスアクチベーターの一層小さいバージョンであるｔＴＡ_sをコードする（図１、パネルａ）。Ｐ_hCMV ^*及びルシフェラーゼレポータープラスミッドの構築プラスミッドｐＵＨＣ１３−１は、ｐＵＨＤ１０−１の誘導体である（Deusch le等 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5400-5404(1989)）。それは、位置＋７５〜− ６７５に及ぶＰｈＣＭＶのプロモーター−エンハンサー配列を含む（Boshart 等 Cell 41:521-530(1985)）。このプロモーターの後にポリリンカー及びＳＶ４０小型ｔイントロンに融合させたPhotinus pyralisのルシフェラーゼ遺伝子及びポリ（Ａ）シグナルが続く。後者の要素及びルシフェラーゼ遺伝子は、ｐＳＶ２Ｌ、ＡΔ５’（DeWit等 Mol.Cell.Biol.7:725-737(1987)）からトランスファーした。このトランスファーにより、ルシフェラーゼのＮ末端は、記載されたように改変された（Deuschle等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5400-5404(1989)）。Ｐ_hCM _V のエンハンサー領域を、ＰＣＲ媒介のクローニングによって除去し、それにより、ＸｈｏＩ部位を位置−５３の隣に導入した。その結果生成した最小プロモーターＰ_hCMV ^*（図１、パネルｂ）は、レポータープラスミッドｐＵＨＣ１３−２の部分である。Ｐ_hCMV ^*−１及びＰ_hCMV ^*−２の構築Ｐ_hCMV ^*をｔｅｔオペレーターと結合するために、Ｔｎ１０のオペレーター０２の１９ｂｐの逆方向反復配列（Triezenberg 等 Genes Dev.2:718-729(1988)）を４２ｂｐのＤＮＡ断片［SEQ ID NO:１０］：（上側鎖：5'TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG 3’）の部分として合成した。アニーリングにおいて、２つの相補鎖は、ＸｈｏＩ及びＳａｌＩ開裂部位の両立し得る突出末端をそれぞれ５’及び３’末端に露出した。この断片の、ｐＴ８１−ｌｕｃ（Nordeen，S.K.,BioTechniques 6:454-457(1988)）のポリリンカーのＸｈｏＩ部位へのライゲーションは、クローニングに際して、ｐＴ８１−ｌｕｃに含まれるＨＳＶからのチミジンキナーゼ（ｔｋ）最小プロモーターの上流にオペレーター配列の１つ並びに複数の挿入を造った。１、２及び７個のオペレーター配列を含むｔｋプロモーターを、それらの一時的発現実験において活性化される能力について、ＨｅＬａ細胞株ＨｔＴａ−１を用いて試験した（下記参照）。すべての構築物は、ｔＴＡ産生細胞において、テトラサイクリン依存様式にて活性であった。ｔｅｔＯ配列の７量体バージョンは、全Ｐｔｋ−ｔｅｔＯ構築物の遥かに高い最高の活性化を引き起こした。それ故、それをＸｈｏＩ／Ｓａｌ断片として取り出してｐＵＨＣ１３−２中にトランスファーした。ｐＴ８１−ｌｕｃのポリリンカー中のｔｅｔＯの非対照位置のために、生成プラスミッドｐＵＨＣ１３−３及びｐＵＨＣ１３−４は、７量体ｔｅｔＯを、Ｐ_hCMVのオペレーターと位置＋１の間の距離が１９ｂｐだけ異なる２つの位置付けにて含む。これらのｔｅｔＯ含有プロモーターを、Ｐ_hCMV ^*−１及びＰ_hCMV ^*−２と命名した（図１、パネルｂ）。バンド−シフトアッセイ約２×１０⁶細胞からの細胞質及び核抽出物を、Andrews 及びFaller，Nucl.Ac ids Res.19:2499(1991)により記載されたようにして調製した。但し、細胞質蛋白質画分を、もう一度遠心分離した（１時間、１００，０００×ｇ）。核蛋白質を、２０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、２５％グリセロール、４２０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭジチオスレイトール及び０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含む緩衝液で抽出した。核抽出物のアリコート（５μｌ）を、２０μｇの仔ウシ胸腺ＤＮＡ、５μｇのウシ血清アルブミン及び２ｆモルの³²Ｐ標識したｔｅｔＯＤＮＡを含む１５μｌの結合用緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５／１０ｍＭＭｇＣｌ₂）と混合した。ｔｅｔＯＤＮＡを、ｐＵＨＣ１３−３から、４２ｂｐのＴａｑＩ断片として単離した（その突出末端は、［α−³² Ｐ］ｄＣＴＰの存在下でクレノー酵素によって満たした）。室温で２０分経過後に、結合用反応混合物のアリコートを、５％ポリアクリルアミド／０．０７％ビスアクリルアミドゲル上に載せた。電気泳動を、９０ｍＭトリスベース／９０ｍＭホウ酸／３ｍＭＥＤＴＡにて、５Ｖ／ｃｍで行なった。ルシフェラーゼアッセイ３５ｍｍ皿中でイーグル最小必須培地にて約８０％集密度まで生育させた細胞を、２ｍｌのリン酸緩衝塩溶液で洗ってから、２５ｍＭトリスホスフェート（ｐＨ７．８）／２ｍＭジチオスレイトール／２ｍＭジアミノシクロヘキサン四酢酸／１０％グリセロール／１％トリトンＸ−１００にて、室温で１０分間溶解させた。溶解物を培養皿から掻き取って、エッペンドルフ遠心機にて１０秒間遠心分離した。次に、上清のアリコート（１０μｌ）を、２５０μｌの２５ｍＭグリシルグリシン／１５ｍＭＭｇＳＯ₄／５ｍＭＡＴＰと混合して、ルシフェラーゼ活性について、インテグラルモード（１０秒間）を用いて、Lumat LB 9501（Berthold，東独Wildbad 在）にてアッセイした。Ｄ−ルシフェリン（L688 2、Sigma）を０．５ｍＭにて使用した。ルシフェラーゼ遺伝子を含まないＨｅＬａ細胞の抽出物にて測定されたバックグラウンドシグナルを、機器バックグラウンド［８０〜１２０相対光単位（ｒｌｕ）／１０秒］と区別することが出来た。溶解物の蛋白質含量を、 Bradford（Bradford，M.M.,Anal.Biochem.72:248-254(1976)）に従って測定した。結果ｔＴＡの構築及び特性決定原核生物のｔｅｔリプレッサーを真核生物用トランスアクチベーターに変換するために、それを、トランス活性化に必須であることが知られているＨＳＶ−ＶＰ１６の負に帯電したＣ末端ドメインに融合した（Triezenberg等 Genes Dev.2: 718-729(1988)）。ＶＰ１６の９７又は１２７アミノ酸のＣ末端部分をコードする配列をｔｅｔＲ遺伝子に融合して、それぞれｔＴＡＳ及びｔＴＡのコード配列を生成した（図１、パネルａ）。ｔＴＡ（ｐＵＨＤ１５−ｔＴＡｓ（ｐＵＨＤ１５１−１）をコードするプラスミッドにおいて、トランスアクチベーター配列は、その上流でＰ_hCMVと、下流でＳＶ４０ポリ（Ａ）部位と隣接している。これらの２つの融合蛋白質は、イン・ビボでの機能特性において差異がなかった。ｐＵＨＤ１５−１で一時的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞は、予想分子量（３７ｋＤａ）の融合蛋白質を生成した（電気泳動で分離した細胞質及び核抽出物のイムノブロットにて表示）（図２、パネルａ）。核抽出物をｔｅｔＯＤＮＡと混合した場合、そのＤＮＡの電気泳動移動度は減少した。ｔＴＡとオペレーターＤＮＡの間の相互作用の特異性は、特異的インデューサーのテトラサイクリンの存在下ではｔｅｔＯＤＮＡの移動度の変化が検出されないという発見により確実となった（図２、パネルｂ）。ｔＴＡ依存性プロモーターの構築ｔＴＡによって活性化し得るプロモーターを生成するために、ｔｅｔＯを最小プロモーター配列の上流に挿入した。Ｐ_hCMVについて、上流エンハンサー領域をＰＣＲによって除去し、ＸｈｏＩ開裂部位を位置−５３の隣に導入した。この最小プロモーター（Ｐ_hCMV ^*と命名）は、最初のＰ_hCMV配列＋７５から−５３まで及び（＋１は、転写される最初のヌクレオチドである）、更に、−３１付近にＳｔｕＩ部位を含む（図１、パネルｂ）。ｔｅｔＯ配列を、このコアプロモーターに、ＸｈｏＩ部位への挿入によって融合した（図１）。Ｔｎ１０のｔｅｔＯ配列０２は、１９ｂｐの逆方向反復であり、そこに、ｔｅｔＲは、４６ｋＤａの２量体として結合する（Hillen及びWissmann「Topics in Molecular and Structural biology」、Protein-Nucleic Acid Interaction中、 Saeger及びHeinemann編、Macmillan,London,1989,Vol.10,143-162）。それを化学合成して、プラスミッドｐＴ８１−ｌｕｃ中の最小ｔｋプロモーターの上流に位置するポリリンカーのＸｈｏＩ開裂部位にライゲートした（Nordeen，S.K.,Bi oTechniques 6:454-457(1988)）。ｔｅｔＯの複数の挿入は、ｔｋプロモーターの位置−８１の上流の１〜７ｔｅｔＯ配列間に含まれるプロモーターのセットを造った。ヘッドトゥーテイル（head to tail）で７ｔｅｔＯを含むＸｈｏＩ／ＳａｌＩ断片を、これらの構築物の１つから回収して、Ｐ_hCMV ^*の上流のＸｈｏＩ部位にトランスファーした。ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ断片の非対称性のために、２つのＰ_hCMV ^*−ｔｅｔＯ構築物が得られたが、それらは、Ｐ_hCMVのオペレーターと位置＋１の間の距離が異なっており、それは、Ｐ_hCMV ^*−１については９５ｂｐであり、Ｐ_hCMV ^*−２については７６ｂｐである。これらのプロモーターを含むプラスミッドを、それぞれ、ｐＵＨＣ１３−３及びｐＵＨＣ１３−４と命名した（図１、パネルｂ）。ＨｅＬａ細胞をこれらのプラスミッドで一時的にトランスフェクトした場合に、それらの細胞をｐＵＨＤ１５−１（ｔＴＡのコード配列を供給）で同時トランスフェクトしたときはいつでも高レベルのルシフェラーゼ活性がモニターされた。テトラサイクリン（１．０μｇ／ｍｌ）の存在下で生育した培養物又はＰ_hCMV ^*のみを含むプラスミッドと共に生育した培養物では、殆ど活性は認められなかった。Ｐ_hC _MV ^* −１及びＰ_hCMV ^*−２は、ｔＴＡによって、如何なるＰｔｋ構築物より有意に高い程度に活性化されたので、後者は、それ以上研究されなかった。ｔＴＡによるＰ_hCMV ^*−１及びＰ_hCMV ^*−２活性化の定量Ｐ_hCMV ^*−ｔｅｔＯ構築物のｔＴＡによる刺激を定量するために、Ｐ_hCMV ^*−１−又はＰ_hCMV ^*−２−ルシフェラーゼ並びに安定にインテグレートされたＰ_hCMV−ｔＴＡ発現単位を含んだＨｅＬａ細胞株を樹立した。細胞を培養し及び選択するための条件は、記載されている（Deuschle等 Proc.N atl.Acad.Sci.USA 86:5400-5404(1989)）。第１ステップにおいて、細胞をｐＵＨＤ１５−１及びｐＳＶ２ｎｅｏ（Southern及びBerg，J.Mol.Appl.Genet.1:327 -341(1982)）で同時トランスフェクトした。Ｇ４１８に耐性のクローンを、Ｐ_hC _MV ^* −１の活性化について、ｐＵＨＣ１３−３での一時的トランスフェクションによりアッセイした。テトラサイクリン反応性プロモーターが活性であるすべてのＨｅＬａ細胞クローンにおいて、ｔＴＡは、ウエスタンブロット又は免疫蛍光法によっては検出不能であった。その存在は、高度標識ｔｅｔＯＤＮＡの電気泳動の移動度シフト実験にてかろうじて可視化された。これは、ｔＴＡの非常に低い細胞内濃度を示し、一層高濃度のＶＰ１６−活性化ドメインにより引き起こされる鎮静（squelching）効果に対する選択を反映し得る（Gill及びPtashne，Nat ure(London)334:721-724(1988)）。陽性クローンの１つであるＨｔＴＡ−１を、次いで、ヒグロマイシン耐性遺伝子（ｐＨＭＲ２７２；Bernrd等Exp.Cell Res.158:237-243(1985)）及びｐＵＨＣ１３−３又はｐＵＨＣ１３−４を有するプラスミッドで同時トランスフェクトして、それぞれ、クローンのＸ及びＴシリーズを生成した。ヒグロマイシン及びＧ４１８に耐性のクローンを、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。下記の表１に示すように、テトラサイクリンの不在において、この活性は、個々のクローンにおいて、殆ど４段階の強度だけ異なった。しかしながら、すべての場合に、ルシフェラーゼ活性は、培養物中のテトラサイクリンに感受性であった。これは、ルシフェラーゼの発現が、明らかに、プロモーター構築物Ｐ_hCMV ^*−１及びＰ_hCMV ^*−２を活性化し得るｔＴＡの機能に依存することを示している。種々のクローンにおけるルシフェラーゼ活性を、テトラサイクリン塩酸塩（Si gma）の存在下又は非存在下でモニターした場合、２つの顕著な結果が明らかとなった。（i）試験したすべてのクローンにおいて、ｔＴＡは、プロモーター活性を大いに刺激し、クローンＸ１においては５段階の強度にまで達した。（ii）クローンＴ１４、Ｔ１６、Ｘ１及びＸ２（表１）においては、テトラサイクリンは、ルシフェラーゼ活性を、高蛋白質濃度の抽出物においてさえ、機器の限界のために定量出来ない値にまで減少させた（即ち、ｒｌｕ／μｇ蛋白質＞２）。これは、Ｐ_hCMV ^*−１及びＰ_hCMV ^*−２が、適当なゲノム環境にインテグレートされた場合に、事実上サイレントであり、それらの活性が、専らｔＴＡの作用に依存することを示す。ｔＴＡ不活性化の研究を、培養培地において、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを用いて行なった。しかしながら、ｔＴＡの部分的不活性化は、図３、パネルａに示すように、０．１μｇ／ｍｌより低いテトラサイクリン濃度で容易に達成される。分析した２つのクローン（Ｔ１２及びＸ１）において、培地中のテトラサイクリン濃度の段階的減少は、ルシフェラーゼ活性を、徐々に増大させた。これらの結果は、再び、クローンＸ１の場合、ルシフェラーゼ活性によりモニターして、ｔＴＡが、５段階の強度にわたって転写活性を制御し得ることを示す。更に、ｔＴＡの完全な不活性化に十分なテトラサイクリン濃度（０．１μｇ／ｍｌ）においては、ＨｅＬａ細胞の生育挙動又は形態の変化は生じない。かかる変化は、１０μｇ／ｍｌより十分高いテトラサイクリン濃度においてのみ、長期のインキュベーションにおいて認められた。テトラサイクリン作用の動力学テトラサイクリン作用のタイムコースを、テトラサイクリンの存在下又は非存在下で生育させた培養物において分析した。時刻０において、この抗生物質を、テトラサイクリンを含まない培養物に加え（終濃度１μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン含有培養物をすすいで、新鮮な抗生物質を含まない培地中でインキュベートした（図３パネルｂ）。種々の時間に、細胞を採取してルシフェラーゼ活性を分析した。図３、パネルｂに示したように、テトラサイクリンの涸渇は、ルシフェラーゼ活性の迅速な誘導（１２時間以内に、完全誘導レベルの２０％より高レベルに到達）へと導く。ルシフェラーゼ活性の同様に迅速な減少が、完全に活性なテトラサイクリンを含まない系にテトラサイクリンを加えたときに認められた（８時間以内に、約１０％活性が落ち、１２時間後に初期値の２％未満に達した）。大腸菌ｔｅｔＲ由来のＴｎ１０とＨＳＶからのＶＰ１６の活性化ドメインとの融合体は、真核細胞における個々の遺伝子の特異的且つ厳重な制御に必要なすべての特性を示すトランスアクチベーターを生成した。ＨｅＬａ細胞中で生成されたトランスアクチベーターｔＴＡは、イン・ビトロで、ｔｅｔＯ配列に特異的に結合する。この結合は、テトラサイクリンによって阻害される。最小プロモーターの上流に位置したｔｅｔＯに結合した場合、ｔＴＡは、かかるプロモーターからの転写を、イン・ビボで、テトラサイクリン依存様式で、効率的に活性化する。このトランスアクチベーターは、強力な転写活性化に十分なだけ高い量で、しかし検出可能な鎮静効果を回避するだけ十分低い量で、ＨｅＬａ細胞内で産生される（Gill及びPtashne，Nature(London)334:721-724 (1988)）。ここに記載したような異質制御系の有用性は、量的パラメーター例えば不活性化の程度及び遺伝子発現の活性化の効率並びにある状態から別の状態への変化の動力学に決定的に依存する。このｔｅｔ系については、これらのパラメーターを、ｔＴＡを構成的に発現し且つ安定にインテグレートされてｔＴＡ依存性プロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子をも含むＨｅＬａ細胞株において測定した。これまでに特性決定されたクローンは、ルシフェラーゼ遺伝子を様々な程度に発現する。これは、インテグレーション部位及びインテグレートされた転写単位の数における差異が予想されたので驚くことではない。しかしながら、すべての場合に、ルシフェラーゼの発現はテトラサイクリンに感受性である。幾つかのクローンにおいて、テトラサイクリンは、ルシフェラーゼ活性を、幾つかの強度段階にわたる高レベルからバックグラウンドに減少させる最も劇的な効果を有する。これは、ＨｅＬａ細胞、Ｐ_hCMV ^*−１及びＰ_hCMV ^* −２が測定可能な固有の活性を有しないことを示す。それらの機能は、厳密にｔＴＡに依存している。それ故、テトラサイクリンの存在下で幾つかのクローンで認められた残余のルシフェラーゼ活性は、位置効果のために違いない。このｔＴＡ依存性プロモーターは、低濃度のテトラサイクリンによって、特に活性化された状態に維持することが出来る。図３、パネルａに示したように、テトラサイクリン濃度を０〜０．１μｇ／ｍｌで変化させることは、プロモーター活性を数段階の強度の範囲内で調節することを可能にする。これは、イン・ビボでの遺伝子機能の量的パラメーターの評価をも与えることが出来る。ｔＴＡの抗生物質による活性化及び不活性化は、十分なだけでなく迅速な方法でもあることが分かった。テトラサイクリン含有培地からの細胞をテトラサイクリンを含まない培地へ移した場合は、有意のルシフェラーゼ活性が４時間以内に誘導され、定常状態レベルの２０％より多くが移行後１２時間以内に達成される。興味深いことには、テトラサイクリン含有培地にて再インキュベーションする前に洗浄手順中にテトラサイクリンを含まない培地にさらしただけの培養物でさえ、４時間後にまだ検出され得る少量のしかし再現可能なルシフェラーゼ活性の増加を示す（図３ｂ）。テトラサイクリンをＸ１細胞の培養物に加えた場合には、ルシフェラーゼ活性は、８時間以内に約１０倍減少し、１２時間以内に５０倍よりも減少する。この減少は、真核細胞について報告された約３時間のルシフェラーゼの半減期を考慮するならば、顕著に早く（サイクロヘキシミド阻害により測定；Ilguyen 等 J.B iol.Chem.264:10487-10492(1989)；Thompson 等 Gene 103:171-177(1991)）、ＨｅＬａ細胞によるテトラサイクリンの迅速な取り込みとその後の転写の早く且つ効率的な停止を示す。ルシフェラーゼの半減期及びそのｍＲＮＡがこの系内で測定されるままであるにもかかわらず、これらの結論は、植物細胞における観察によって支持され、そこでは、テトラサイクリンは３０分かからずにｔｅｔＲを不活性化する（Gatz等 Mol.Gen.Genet 227:229-237(1991)）。これらのデータを総合すると、テトラサイクリンは、真核生物のｌａｃＲ／Ｏ系におけるＩＰＴＧと異なり、真核細胞の培養において速く作用することが出来る。ｔＴＡ依存性プロモーターの活性を迅速に切り替える可能性は、遺伝子機能それ自身の研究において興味深いだけでなく、生理学的条件下での個々の遺伝子のｍＲＮＡの崩壊速度の分析をも可能にする。クローンＸ１において、テトラサイクリンは、ルシフェラーゼ活性を、再現可能に、５段階の強度で減少させる。これは、テトラサイクリンのｔＴＡへの結合が、トランスアクチベーターとそのオペレーターの間の結合定数を、ｔｅｔＲについて測定され（Takahashi 等 J.Mol.Biol.187:341-348(1986)）及びｌａｃＲ／Ｏ系におけるＩＰＴＧについて記載されたもの（この場合、結合定数ｋ_ROはインデューサーにより１０００倍減少するだけである）（Barkley 及びBourgeois The Operon中、Miller及びReznik off（編）、Cold Spring Harbor Laboratory，ニューヨーク、Cold Spring Ha rbor在、1980、177-220頁）より遥かに低下させることを示唆する。他方、単一の、２量体の及び７量体のｔｅｔＯ配列に融合した最小ｔｋプロモーターを用いる一時的実験において得られた結果は、複数のｔＴＡ結合部位の共同効果を強く示唆する。それ故、テトラサイクリンによるｔＴＡの効率的な不活性化は、恐らく、ｔｅｔＯに対するｔＴＡとｔＴＡ／テトラサイクリンの結合定数の大きな違い及び協同的プロセスを邪魔するテトラサイクリンの非線形性効果のためである。結論として、これらの結果は、ここに記載したプロモーター活性化系が、幾つかの理由により、一層高等な真核細胞中で個々の遺伝子を制御するための最も有望なものであるを示している。（i）アクチベーターについては、特に協同的機構により活性化する場合、細胞内濃度を低く維持して、エフェクター（この場合、テトラサイクリン）による効率的不活性化を確実にすることが出来る。対照してみると、リプレッサーは、一般に、転写因子及び／又はＲＮＡポリメラーゼがプロモーター領域内に結合するのを直接終了する。しかしながら、協同性のない場合には、リプレッサー濃度が厳重な発現のために十分高く、しかも尚効率的誘導のために十分低い領域が狭く、種々の系において容易に調節出来ないであろう。（ii）ここに記載した活性化系において、ｔＴＡの合成は、組織特異的プロモーターにより駆動されるが、ｔＴＡ依存性プロモーターは、ｔＴＡに加えて一般的転写因子を必要とするだけであるから、組織非依存的に機能すると予想される。対照してみると、オペレーターがプロモーター配列の脈絡に置かれなければならないリプレッサーベースの系においては、プロモーター特異性に対する影響を排除し得ない。（iii）このｔｅｔ系は、熱心に研究されたｌａｃ系と比較して、特別の利点を提供する。例えば、ｔｅｔＲは、ｌａｃＲがＩＰＴＧと複合体化する（ｋａ１０⁶Ｍ^-1；Barkley 及びBourgeois The Operon中、Mille r及び Reznikoff（編）、Cold Spring Harbor Laboratory，ニューヨーク、Cold Sprin g Harbor在、1980、177-220頁）よりも、テトラサイクリンとずっと堅く結合する（ｋａ約１０⁹Ｍ^-1;Takahashi等 J.Mol.Biol.187:341-348(1986)）。従って、非常に低い、非毒性のテトラサイクリン濃度が有効に機能する。更に、多数のテトラサイクリンアナログが公知であり、それらの幾つかは、テトラサイクリン自身よりもエフェクターとして遙かに優れた特性を有するらしい。この脈絡において、テトラサイクリンの薬理学的特性、特に薬物動力学的パラメーターについての詳細な情報を入手し得ることに注意することは興味深いことであり、該情報は、トランスジェニック動物におけるこの系の適用を容易にするであろう。実施例２：トランスジェニック動物における遺伝子発現のｔＴＡによる調節イン・ビボでの遺伝子発現を制御するｔＴＡの能力を試験するために、ｔＴＡ発現単位又はレポーター遺伝子に操作可能に結合されたｔＴＡ反応性プロモーターの異質染色体挿入物を含むマウスのトランスジェニック系統を作成した。ｔＴＡ発現単位又はｔＴＡ反応性レポーター単位を含む単一トランスジェニックの系統を、次いで、交雑して、二重トランスジェニックの子孫を同定した。これらの二重トランスジェニック動物を、次いで、ｔＴＡのレポーター遺伝子の発現をテトラサイクリン依存様式で制御する能力について特性決定した。この実施例は、ｔＴＡが、これらの動物の多くの組織において、イン・ビボで、テトラサイクリン（又はアナログ）の不在時に、ｔＴＡ反応性プロモーターに操作可能に結合された遺伝子の発現を効果的に刺激し、テトラサイクリン又はそのアナログをこれらの動物に投与した場合には、それらの動物の多くの組織において、ｔＴＡ反応性遺伝子の発現が効果的に阻止されることを示す。これらの結果は、ここに記載のテトラサイクリン制御された転写制御系が、イン・ビトロの細胞株に加えて、動物内においても効果的に機能することを示す。Ｐ_hCMV−ｔＴＡ発現単位についてトランスジェニックなマウスの生成ｔＴＡ蛋白質を発現するマウスを、受精した卵母細胞中への、プラスミッドｐＵＨＧ１５−１から切り出した２．７ｋｂのＸｈｏＩ−ＰｆｍＩ断片の前核注入により得た。このＤＮＡ断片は、ヒトＣＭＶＩＥプロモーター（位置＋７５〜 −６７５）の転写制御下にあるｔＴＡ遺伝子（SEQ ID NO:１に示した）を、イントロンを含むウサギβ−グロビンポリアデニル化部位と共に含んだ。このヒトＣＭＶＩＥプロモーターは、多くの細胞株においてｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合蛋白質の発現を与える構成的プロモーターであり、該株においては、ｔＴＡをコードするＤＮＡ配列の染色体挿入が起きており、該配列は、トランスジェニック動物の種々の組織において機能的であることが知られている。ＤＮＡを、受精卵母細胞に、約５ｎｇ／μｌの濃度で、標準的技術により注入した。この注入した受精卵母細胞から、トランスジェニックマウスを、標準的手順によって生成した。トランスジェニック創出マウスを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びサザーンハイブリダイゼーションを用いて分析して、これらのマウスの染色体ＤＮＡ中のｔＴＡトランスジーンの存在を検出した。Ｐ_hCMV ^* _-1ルシフェラーゼレポーター単位についてトランスジェニックなマウスの生成Ｐ_hCMV ^* _-1ｌｕｃレポーター遺伝子発現単位を有するマウスを、プラスミッドｐＵＨＣ１３−３から切り出した３．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＥａｅＩ断片の、受精卵母細胞への前核注入により生成した。このＤＮＡ断片は、テトラサイクリン反応性Ｐ_hCMV ^* _-1プロモーター（SEQ ID NO:5）の転写制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子を、イントロンを含むＳＶ４０ｔ初期ポリアデニル化部位と共に含む。ＤＮＡを、卵母細胞に、約５ｎｇ／μｌの濃度で注入し、トランスジェニックマウスを、標準的手順によって生成した。トランスジェニック創出マウスを、サザーンハイブリダイゼーションを用いて分析して、これらのマウスの染色体ＤＮＡ中のＰ_hCMV ^* _-1ｌｕｃトランスジーンの存在を検出した。Ｐ_hCMV ^* _-1ｌｕｃ及びＰ_hCMvｔＴＡについてトランスジェニックなマウスの生成ｔＴＡを発現し又はＰ_hCMv ^*−１１ｕｃを有する単一トランスジェニックのマウスを作成したので、ｔＴＡ発現ベクター及びルシフェラーゼレポーター単位の両者を有する二重トランスジェニックマウスを、これらの２つのトランスジーンの１つについてトランスジェニックであるヘテロ接合のマウスを交雑することによって生成した。二重トランスジェニック動物を、標準的スクリーニング（例えば、ＰＣＲ及び／又はサザーンハイブリダイゼーション）により、これらのマウスの染色体ＤＮＡ中のｔＴＡトランスジーン及びＰ_hCMV ^* _-1ｌｕｃトランスジーンの両者の存在を検出することによって同定した。マウスからの組織試料におけるルシフェラーゼ活性の誘導及び分析経口投与のために、テトラサイクリン又はその誘導体のドキシサイクリンを、２００μｇ／ｍｌの濃度で、この抗生物質の苦みを隠すための５％ショ糖と共に飲料水に加えた。乳児期のマウスについては、濃度を２ｍｇ／ｍｌとし、その幼若動物によるミルクを介しての十分な取り込みを確実にするための１０％のショ糖を加えた。ルシフェラーゼ活性を分析するために、マウスを頚椎脱臼により殺して、組織試料を、５００μｌの溶解用緩衝液（２５ｍＭトリスホスフェート、ｐＨ７．８／２ｍＭＤＴＴ／２ｍＭＥＤＴＡ／１０％グリセロール／１％トリトンＸ１００）を含む２ｍｌのチューブにて、Ultra-Turraxを用いてホモジェナイズした。ホモジェネートを液体窒素中で凍結させ、解凍後、１５，０００ｇで、５分間、遠心分離した。２〜２０μｌの上清を、２５０μｌのルシフェラーゼアッセイ用緩衝液（２５ｍＭグリシルグリシン、ｐＨ７．５／１５ｍＭＭｇＳＯ₄／５ｍＭＡＴＰ）と混合し、ルシフェラーゼ活性を、１００μｌの１２５ μＭルシフェリン溶液の注入後、１０秒間、Berthold Lumat LB9501を用いて測定した。このホモジェネートの蛋白質濃度を、Bertholdアッセイを用いて測定し、ルシフェラーゼ活性を、総蛋白質μｇ当りの相対光単位（ｒｌｕ）として計算した。結果Ｐ_hCMV−ｔＴＡトランスジーンを有する４系統（ＣＴ１〜ＣＴ４）からのマウスを、Ｌ７系統（Ｐ_hCMV ^* _-1ｌｕｃについてトランスジェニック）からのマウスと交配させた。この系統は、恐らくインテグレーション部位の位置効果のために、種々の器官において、ルシフェラーゼ活性の非常に低いが有意のバックグラウンドを示す。二重トランスジェニックマウスの種々の組織におけるルシフェラーゼ活性（テトラサイクリンアナログのドキシサイクリンの存在下又は非存在下）を図１４にグラフ表示で示す。高ルシフェラーゼ活性が試験した二重トランスジェニックマウスの５つの組織：心臓、筋肉、膵臓、胸腺及び舌において検出可能であった。二重トランスジェニックマウスにおける活性化ルシフェラーゼレベルの（即ち、ドキシサイクリン不在時の）組織パターンは、文献に報告されたｈＣＭＶＩＥプロモーターの発現パターンと類似していた。これは、ｔＴＡにより制御されるｌｕｃレポーター遺伝子の発現と一致する（これは、マウスにおいて、ｈＣＭＶＩＥの制御下で発現される）。これらのマウスにドキシサイクリンを７日間投与した後、ルシフェラーゼ活性は、Ｐ_hCMV ^* _-1ｌｕｃレポーター単位のみを有する単一トランスジェニックマウス（即ち、Ｌ７系統）において観られたバックグラウンドレベル近くまで減少した。誘導及び非誘導ルシフェラーゼレベルの比較に用いた個々の動物によって、１０，０００倍までの制御因子を、例えば膵臓において評価することが出来た。これらの結果は、ここに記載したテトラサイクリン制御された転写調節系がトランスジェニック動物における遺伝子発現を効率的に制御するために使用し得ることを示している。同等物当業者は、ここに記載した発明の特定の具体例の多くの同等物を認識し、又は常例的実験のみを用いて確認することが出来よう。かかる同等物は、後述の請求の範囲に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ブヤルト，ヘルマンドイツ国デー69120 ハイデルベルク, レムラーシュトラーセ９ (72)発明者ゴセン，マンフレートアメリカ合衆国 94530 カリフォルニア, エルセリートー，アーリントンブルーバード 978 ナンバービー (72)発明者ザルフェルト，ヨッヘン，ゲー. アメリカ合衆国 01536 マサチューセッツ，ノースグラーフトン，オールドウエストボロロード 177 (72)発明者ボース，ジェフリー，ダブリュー. アメリカ合衆国 01701 マサチューセッツ，フレイミンガム，ジョージタウンロード 35，アパートメント10

Claims

【特許請求の範囲】１．テトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーター（ｔＴＡ）をコード化するポリヌクレオチド配列を、第二標的ＤＮＡ分子中の所定の位置に組み込むための分離されたＤＮＡ分子であって、ｔＴＡは、原核Ｔｅｔリプレッサーを、真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するポリペプチドに作動可能に結合させて含み、ＤＮＡ分子は、ｔＴＡをコード化するポリヌクレオチド配列の５ ’及び３’末端に側面に、所定の位置においてＤＮＡ分子と第二標的ＤＮＡ分子との間で相同的に組み換えるための十分な長さの更なるポリヌクレオチド配列を位置させてなる分離されたＤＮＡ分子。２．ｔＴＡをコード化するポリヌクレオチド配列を側面に位置させる更なるポリヌクレオチド配列が、ＤＮＡ分子が装入される関心ある遺伝子、或はその調節領域のものである請求項１のＤＮＡ分子。３．ＤＮＡ分子を関心ある遺伝子、或はその調節領域中に組み込む際に、ｔＴＡの発現を関心ある遺伝子の調節要素によって調節する請求項２のＤＮＡ分子。４．ｔＴＡのＴｅｔリプレッサーが、Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーである請求項１のＤＮＡ分子。５．真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するｔＴＡのポリペプチドが、単純ヘルペスウイルスビリオン蛋白質１６からのものである請求項１のＤＮＡ分子。６．真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するｔＴＡのポリペプチドを、酸性、プロリンリッチ、セリン／トレオニンリッチ及びグルタミンリッチ転写活性化ポリペプチドからなる群より選ぶ請求項１のＤＮＡ分子。７．真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するｔＴＡのポリペプチドが、ロイシンジッパードメイン、ヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン及び亜鉛フィンガードメインからなる群より選ぶ相互作用ドメインである請求項１のＤＮＡ分子。８．真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するｔＴＡのポリペプチドが、ＴＡＴＡ結合蛋白質からの相互作用ドメインである請求項１のＤＮＡ分子。９．更に、選択可能な標識をコード化するポリヌクレオチド配列を含む請求項１のＤＮＡ分子。１０．選択可能な標識をコード化するポリヌクレオチド配列が、ｔｋ遺伝子或はネオマイシン耐性遺伝子である請求項９のＤＮＡ分子。１１．ａ）関心ある遺伝子の５’隣接調節領域を、下記に作動可能に結合させてなる第一ポリヌクレオチド配列：ｂ）原核Ｔｅｔリプレッサーを、真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するポリペプチドに作動可能に結合させてなるｔＴＡをコード化する第二ポリヌクレオチド配列；及びｃ）ｔＴＡ反応性プロモーターを、下記に作動可能に結合させてなる第三ポリヌクレオチド配列：ｄ）関心ある遺伝子のコード化領域の少なくとも一部を含む第四ポリヌクレオチド配列を含み、第一及び第四ポリヌクレオチド配列は、第二標的ＤＮＡ分子においてＤＮＡ分子と関心ある遺伝子との間で相同的に組み換えるための十分な長さにし、それでｔＴＡの発現が関心ある遺伝子の５’調節要素によって調節されかつ関心ある遺伝子の発現がｔＴＡ反応性プロモーターによって調節されるようにする、テトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーター（ｔＴＡ）をコード化するポリヌクレオチド配列及びｔＴＡ反応性プロモーターを、第二標的ＤＮＡ分子中の所定の関心ある遺伝子内に組み込むための分離されたＤＮＡ分子。１２．更に、選択可能な標識をコード化する第五ポリヌクレオチド配列を調節配列に作動可能に結合させてなり、第五ポリヌクレオチド配列は、第二ポリヌクレオチド配列と第三ポリヌクレオチド配列との間に配置される請求項１１のＤＮＡ分子。１３．選択可能な標識をコード化する第五ポリヌクレオチド配列が、ｔｋ遺伝子或はネオマイシン耐性遺伝子である請求項１２のＤＮＡ分子。１４．更に、転写ターミネーターシグナル、転写インシュレーター或はマトリックス結合領域を含む第五ポリヌクレオチド配列を含み、第五ポリヌクレオチド配列は、第二ポリヌクレオチド配列と第三ポリヌクレオチド配列との間に配置される請求項１１のＤＮＡ分子。１５．更に、転写ターミネーターシグナル、転写インシュレーター或はマトリックス結合領域を含む第六ポリヌクレオチド配列を含み、第六ポリヌクレオチド配列は、第五ポリヌクレオチド配列と第三ポリヌクレオチド配列との間に配置される請求項１２のＤＮＡ分子。１６．ｔＴＡのＴｅｔリプレッサーが、Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーである請求項１１のＤＮＡ分子。１７．真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するｔＴＡのポリペプチドが、単純ヘルペスウイルスビリオン蛋白質１６からのものである請求項１１のＤＮＡ分子。１８．真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するｔＴＡのポリペプチドを、酸性、プロリンリッチ、セリン／トレオニンリッチ及びグルタミンリッチ転写活性化ポリペプチドからなる群より選ぶ請求項１１のＤＮＡ分子。１９．真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するｔＴＡのポリペプチドが、ロイシンジッパードメイン、ヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン及び亜鉛フィンガードメインからなる群より選ぶ相互作用ドメインである請求項１１のＤＮＡ分子。２０．真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するｔＴＡのポリペプチドが、ＴＡＴＡ結合蛋白質からの相互作用ドメインである請求項１１のＤＮＡ分子。２１．第三ヌクレオチド配列のｔＴＡ反応性プロモーターが、最小プロモーターを少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に作動可能に結合させてなる請求項１１のＤＮＡ分子。２２．最小プロモーターが、サイトメガロウイルス即時型初期遺伝子プロモーター或は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモーターに由来する請求項２１のＤＮＡ分子。２３．関心ある遺伝子が、ヒト遺伝子である請求項１１のＤＮＡ分子。２４．ヒト遺伝子が、アデノシンデアミナーゼ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ジストロフィン、β−グロビン、ＬＤＬ、レセプター、ＣＦＴＲ、インシュリン、エリトロポエチン、抗血管形成因子、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、β −グルコウロニダーゼ、α１−アンチトリプシン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンセターゼ、ＵＤＰ−グルクロニシルトランスフェラーゼ、ａｐｏＡ１、ＭＤＲ１、ＭＲＰ、ＴＮＦ、可溶性ＴＮＦレセプター、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイネ、成長因子及び腫瘍サプレッサー遺伝子からなる群より選ぶ遺伝子生成物をコード化する請求項２３のＤＮＡ分子。２５．ＤＮＡ分子が、宿主細胞における第二標的ＤＮＡ分子中の所定の位置に組み込まれる請求項１のＤＮＡ分子を含む真核宿主細胞。２６．更に、関心ある遺伝子をｔＴＡ反応性転写プロモーターに作動可能に結合させてなる請求項２５の宿主細胞。２７．ｔＴＡ反応性転写プロモーターが、最小プロモーターを少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に作動可能に結合させてなる請求項２６の宿主細胞。２８．最小プロモーターが、サイトメガロウイルス即時型初期遺伝子プロモーター或は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモーターに由来する請求項２７のＤＮＡ分子。２９．哺乳動物細胞である請求項２５の宿主細胞。３０．ヒト細胞である請求項２９の宿主細胞。３１．胎児幹細胞である請求項２９の宿主細胞。３２．酵母細胞或はカビ細胞である請求項２５の宿主細胞。３３．細胞が昆虫細胞であり、第二標的ＤＮＡ分子が昆虫遺伝子或はバキュロウイルス遺伝子である請求項２５の宿主細胞。３４．細胞にテトラサイクリン或はテトラサイクリン類似体を接触させることを含む、請求項２６の宿主細胞においてｔＴＡ反応性プロモーターに作動可能に結合された関心ある遺伝子の転写を抑制する方法。３５．核酸が、宿主細胞における第二標的ＤＮＡ分子中の所定の関心ある遺伝子に組み込まれる請求項１１の核酸を含む宿主細胞。３６．哺乳動物細胞である請求項３５の宿主細胞。３７．ヒト細胞である請求項３６の宿主細胞。３８．胎児幹細胞である請求項３６の宿主細胞。３９．酵母細胞或はカビ細胞である請求項３５の宿主細胞。４０．細胞が昆虫細胞であり、関心ある遺伝子が昆虫遺伝子或はバキュロウイルス遺伝子である請求項３５の宿主細胞。４１．細胞にテトラサイクリン或はテトラサイクリン類似体を接触させることを含む、請求項３５の宿主細胞において関心ある真核遺伝子の転写を抑制する方法。４２．テトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーター（ｔＴＡ）をコード化するポリヌクレオチド配列を含むトランスジーンを含み、ｔＴＡは、原核Ｔｅｔリプレッサーを、真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するポリペプチドに作動可能に結合させて含む非ヒトトランスジェニック動物。４３．ｔＴＡのＴｅｔリプレッサーが、Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーである請求項４２の動物。４４．真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するｔＴＡのポリペプチドが、単純ヘルペスウイルスビリオン蛋白質１６からのものである請求項４２の動物。４５．真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するｔＴＡのポリペプチドを、酸性、プロリンリッチ、セリン／トレオニンリッチ及びグルタミンリッチ転写活性化ポリペプチドからなる群より選ぶ請求項４２の動物。４６．真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するｔＴＡのポリペプチドが、ロイシンジッパードメイン、ヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン及び亜鉛フィンガードメインからなる群より選ぶ相互作用ドメインである請求項４２の動物。４７．真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するｔＴＡのポリペプチドが、ＴＡＴＡ結合蛋白質からの相互作用ドメインである請求項４２の動物。４８．更に、関心ある遺伝子をｔＴＡ反応性転写プロモーターに作動可能に結合させてなる第二トランスジーンを有する請求項４２の動物。４９．マウスである請求項４２の動物。５０．牛、山羊、羊及び豚からなる群より選ぶ請求項４２の動物。５１．テトラサイクリン或はテトラサイクリン類似体を動物に投与することを含む、請求項４８のトランスジェニック動物において第二トランスジーンの転写を抑制する方法。５２．テトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーター（ｔＴＡ）をコード化するポリヌクレオチド配列を含むトランスジーンを有し、ｔＴＡは、原核Ｔｅｔリプレッサーを、真核細胞において転写を間接に或は直接に活性化するポリペプチドに作動可能に結合させてなり、トランスジーンは、動物の細胞内の染色体内の所定の位置に相同的組み換えによって組み込まれる非ヒトトランスジェニック動物。５３．更に、ｔＴＡ反応性転写プロモーターに作動可能に結合された関心ある遺伝子を含む第二トランスジーンを有する請求項５２の動物。５４．テトラサイクリン或はテトラサイクリン類似体を動物に投与することを含む、請求項５３の動物において第二トランスジーンの転写を抑制する方法。５５．テトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーター（ｔＴＡ）をコード化するポリヌクレオチド配列を含むトランス遺伝子及びｔＴＡ反応性プロモーターを有し、ｔＴＡの発現が関心ある遺伝子の５’調節要素によって調節されかつ関心ある遺伝子の発現がｔＴＡ反応性プロモーターによって調節されるように、トランスジーンは、動物の細胞内の関心ある遺伝子内の所定の位置に相同的組み換えによって組み込まれるトランスジェニック動物。５６．テトラサイクリン或はテトラサイクリン類似体を動物に投与することを含む、請求項５５の動物において関心ある遺伝子の転写を抑制する方法。５７．請求項２６の細胞においてｔＴＡ反応性転写プロモーターに作動可能に結合された関心ある遺伝子によってコード化された遺伝子生成物を産生しかつ分離する方法であって、ａ）細胞を培地中でテトラサイクリン或はテトラサイクリン類似体の存在において増殖させ；ｂ）テトラサイクリン或はテトラサイクリン類似体の濃度を減少させて関心ある遺伝子の転写を剌激し；ｃ）更に、関心ある遺伝子によってコード化される遺伝子生成物が細胞によって所望の量で産生されるまで細胞を培養し：及びｄ）収穫した細胞から或は培地から遺伝子生成物を分離することを含む方法。５８．細胞が哺乳動物細胞である請求項５７の方法。５９．細胞が酵母或はカビ細胞である請求項５７の方法。６０．請求項４２の非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法であって、ａ）ｔＴＡをコード化するＤＮＡ分子を受精された卵母細胞に導入し；ｂ）受精された卵母細胞を偽妊娠養育母親に移植し；及びｃ）受精された卵母細胞を非ヒトトランスジェニック動物に成長させてそれにより非ヒトトランスジェニック動物を産生することを含む方法。６１．細胞内の第二標的ＤＮＡ分子中の所定の位置に組み込んだテトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーター（ｔＴＡ）をコード化するＤＮＡ分子を有する宿主細胞を産生する方法であって、ａ）請求項１のＤＮＡ分子を細胞の集団中に、ｔＴＡをコード化するＤＮＡと第二標的ＤＮＡ分子との間で相同的に組み換えるのに適した条件下で導入し；及びｂ）ｔＴＡをコード化するＤＮＡが、第二標的ＤＮＡ分子内の所定の位置において合体している細胞を選ぶことを含む方法。６２．動物の細胞の染色体ＤＮＡ内の所定の位置に組み込んだテトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーター（ｔＴＡ）をコード化するトランスジーンを有する非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法であって、ａ）請求項１のＤＮＡ分子を胎児幹細胞の集団中に、ｔＴＡをコード化するＤＮＡと細胞内の染色体ＤＮＡとの間で相同的に組み換えるのに適した条件下で導入し；ｂ）ｔＴＡをコード化するＤＮＡが、細胞の染色体ＤＮＡ内の所定の位置において合体している胎児幹細胞を選び；ｃ）胎児幹細胞を胚盤胞に移植し；及びｄ）胚盤胞を偽妊娠養育母親に移植し；及びｅ）胚盤胞を非ヒトトランスジェニック動物に成長させてそれにより非ヒトトランスジェニック動物を産生することを含む方法。６３．動物の細胞の関心ある遺伝子内の所定の位置に組み込んだテトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーター（ｔＴＡ）をコード化するトランス遺伝子及びｔＴＡ反応性プロモーターを有する非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法であって、ａ）請求項１１のＤＮＡ分子を胎児幹細胞の集団中に、ｔＴＡをコード化するＤＮＡと細胞内の関心ある遺伝子との間で相同的に組み換えるのに適した条件下で導入し；ｂ）ｔＴＡをコード化するＤＮＡが、細胞中の関心ある遺伝子内の所定の位置において合体している胎児幹細胞を選び；ｃ）胎児幹細胞を胚盤胞に移植し；及びｄ）胚盤胞を偽妊娠養育母親に移植し；及びｅ）胚盤胞を非ヒトトランスジェニック動物に成長させてそれにより非ヒトトランスジェニック動物を産生することを含む方法。