JP2001520170A - Ｎｆ−ａｔ３機能に関連した心肥大動物モデルと治療法 - Google Patents
Ｎｆ−ａｔ３機能に関連した心肥大動物モデルと治療法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は心肥大に関する。さらに詳細には、本発明は心肥大に対するカルシウム刺激をリンクする分子出来事を定義する。さらに詳細には、本発明は肥大型応答のCa++刺激がNF-AT3により仲介されることを示す。したがって、本発明はトランスジェニック動物を作成するためのトランスジェニック構築物だけでなく、心肥大を治療する方法を提供する。さらに、心肥大に向かう治療上の活性を有する化合物の検出のために、本発明のトランスジェニック動物、あるいはそれから分離した細胞を使用する方法が提供される。
Description
【０００１】 発明の背景 １．発明の技術分野 本発明は一般的には分子生物学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は心肥
大に関する中心的なメディエーターの発見に関する。
大に関する中心的なメディエーターの発見に関する。
【０００２】 ２．関連先行技術の記載 心肥大は、高血圧、機械的負荷、心筋梗塞、心律動異常、内分泌障害、心収縮性
タンパク質遺伝子における遺伝的な突然変異から生起するものを含めた、実質的
に心疾患のすべての形態に対する心臓の1つの適応応答である。心肥大型応答は 当初、心拍出を増加する代償性メカニズムであるが、心肥大が継続すると拡張性
心筋症、心不全、突然死に繋がる可能性がある。米国では、毎年およそ50万人が
心不全と診断され、死亡率は50%近くに上る。
タンパク質遺伝子における遺伝的な突然変異から生起するものを含めた、実質的
に心疾患のすべての形態に対する心臓の1つの適応応答である。心肥大型応答は 当初、心拍出を増加する代償性メカニズムであるが、心肥大が継続すると拡張性
心筋症、心不全、突然死に繋がる可能性がある。米国では、毎年およそ50万人が
心不全と診断され、死亡率は50%近くに上る。
【０００３】 心肥大に繋がる様々な刺激があるが、細胞の大きさとタンパク質合成の増加、
サルコメア組織の促進、胎児性心臓遺伝子のアップレギュレーション、c−fosや
c−mycなどの遺伝子の誘導を含めた心肥大型シグナルに対する心筋細胞のプロト
タイプの分子応答が1つある（Chienら、1993に総説；SadoshimaとIzumo,1997） 。心肥大の原因と影響は数多くの論文で敷衍されて報告されているが、心筋細胞
遺伝子の発現のプログラムを作り直すように細胞膜で開始される心肥大型シグナ
ルを結び付ける、根源的な分子メカニズムはほとんど分かっていない。これらの
メカニズムの解明は心血管生物学では中心となる問題であり、心肥大と心不全の
予防あるいは治療に対する新しい方策の設計においては最も重要なものである。
サルコメア組織の促進、胎児性心臓遺伝子のアップレギュレーション、c−fosや
c−mycなどの遺伝子の誘導を含めた心肥大型シグナルに対する心筋細胞のプロト
タイプの分子応答が1つある（Chienら、1993に総説；SadoshimaとIzumo,1997） 。心肥大の原因と影響は数多くの論文で敷衍されて報告されているが、心筋細胞
遺伝子の発現のプログラムを作り直すように細胞膜で開始される心肥大型シグナ
ルを結び付ける、根源的な分子メカニズムはほとんど分かっていない。これらの
メカニズムの解明は心血管生物学では中心となる問題であり、心肥大と心不全の
予防あるいは治療に対する新しい方策の設計においては最も重要なものである。
【０００４】 数多くの研究で、心肥大に対するシグナルとして、細胞内Ca++をが暗に示され
ている。心筋細胞伸展あるいは作動心臓製剤への負荷の増加に対する応答では、
細胞内Ca++濃度が増加する（Marbanら、1987；Bustamanteら、1991；Hongoら、1
995）。これは、心拍出量増加への調整的生理学的応答におけるCa++の役割と一 致している。心筋細胞における心肥大型応答を誘導するアンギオテンシンII（An
gII）、フェニレフリン（PE）、エンドセリン−1（ET−1）を含めた様々な体液 性因子はまた細胞内Ca2+濃度を上昇させる能力を分かち合う。
ている。心筋細胞伸展あるいは作動心臓製剤への負荷の増加に対する応答では、
細胞内Ca++濃度が増加する（Marbanら、1987；Bustamanteら、1991；Hongoら、1
995）。これは、心拍出量増加への調整的生理学的応答におけるCa++の役割と一 致している。心筋細胞における心肥大型応答を誘導するアンギオテンシンII（An
gII）、フェニレフリン（PE）、エンドセリン−1（ET−1）を含めた様々な体液 性因子はまた細胞内Ca2+濃度を上昇させる能力を分かち合う。
【０００５】 心肥大刺激の結果として、β−ミオシン重鎖（MHC）とα−骨格アクチンのよ うな胎児性タンパク質イソ型をコードする遺伝子がアップレギュレートされ、一
方では、それに対応する成人イソ型、α−MHCとα−心臓アクチンがダウンレギ ュレーションされるように、成人心筋層における遺伝子発現のプログラムの作り
直しがなされるということになる。血管拡張とナトリウム利尿により血圧を下げ
るナトリウム利尿性ペプチドである、心房性ナトリウム利尿因子（ANF）とβ− 型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）はまた、心肥大型シグナルに応答して心臓で は急速にアップレギュレーションされる（KomuroとYazaki,1993に総説）。血清 応答因子（SRF）、TEF−1、AP−1、Sp1を含む、いくつかの転写因子に対する結 合部位は心肥大に応答する胎児性心臓遺伝子の活性化のために重要であるが、心
肥大の間にこれらの同調して調節する心臓遺伝子に関わっているメカニズムは分
かっていない（SadoshimaとIzumo,1993a；1993b；Kariyaら,1994；Karnsら、199
5；Kovacic−Milivojevicら,1996）。ごく最近、心臓制限ジンクフィンガー転写
因子GATA4もまた、肥大の間にAngII型1α受容体とβ−MHCに対する遺伝子の転写
活性化が必要であることが示された（Herzigら、1997；Hasegawaら、1997；Molk
entinとOlson,1997に総説）。
方では、それに対応する成人イソ型、α−MHCとα−心臓アクチンがダウンレギ ュレーションされるように、成人心筋層における遺伝子発現のプログラムの作り
直しがなされるということになる。血管拡張とナトリウム利尿により血圧を下げ
るナトリウム利尿性ペプチドである、心房性ナトリウム利尿因子（ANF）とβ− 型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）はまた、心肥大型シグナルに応答して心臓で は急速にアップレギュレーションされる（KomuroとYazaki,1993に総説）。血清 応答因子（SRF）、TEF−1、AP−1、Sp1を含む、いくつかの転写因子に対する結 合部位は心肥大に応答する胎児性心臓遺伝子の活性化のために重要であるが、心
肥大の間にこれらの同調して調節する心臓遺伝子に関わっているメカニズムは分
かっていない（SadoshimaとIzumo,1993a；1993b；Kariyaら,1994；Karnsら、199
5；Kovacic−Milivojevicら,1996）。ごく最近、心臓制限ジンクフィンガー転写
因子GATA4もまた、肥大の間にAngII型1α受容体とβ−MHCに対する遺伝子の転写
活性化が必要であることが示された（Herzigら、1997；Hasegawaら、1997；Molk
entinとOlson,1997に総説）。
【０００６】 心肥大型応答は何らかの方法でCa++依存性経路により開始されることが明らか
である。しかし、肥大型応答を仲介する遺伝子（単数/複数）の正確な同定はは っきりしないままである。本発明は、心肥大についての利得のある効果を達成す
るために操作することが可能な肥大型経路の正確なその点の解明に向けられてい
る。ヒトにおける心肥大の治療の薬理学的な方策を開発するために、その疾患の
病理学的プロフィールを正確に反映する動物モデルを確立することが重要となる
。
である。しかし、肥大型応答を仲介する遺伝子（単数/複数）の正確な同定はは っきりしないままである。本発明は、心肥大についての利得のある効果を達成す
るために操作することが可能な肥大型経路の正確なその点の解明に向けられてい
る。ヒトにおける心肥大の治療の薬理学的な方策を開発するために、その疾患の
病理学的プロフィールを正確に反映する動物モデルを確立することが重要となる
。
【０００７】 発明の概要 本発明は、心肥大とそれに関連する心不全の動物モデルと治療法を提供するこ
とを意図している。このように、1つの好適な形態では、本発明はNF-AT3機能を 阻害する工程を含む心筋細胞における肥大を治療する方法を提供する。とくに好
適な実施形態では、NF-AT3機能の阻害はNF-AT3の脱リン酸化を阻害することを含
む。他の好適な実施形態では、NF-AT3機能の阻害はNF-AT3の発現を減らすことを
含む。さらに他の好適な実施形態では、NF-AT3機能の阻害はNF-AT3に結合し、ま
た不活性化する薬剤とNF-AT3を接触させることを含む。他の実施形態では、NF-A
T3機能の阻害はNF-AT3とGATA4との相互作用を阻害することを含む。
とを意図している。このように、1つの好適な形態では、本発明はNF-AT3機能を 阻害する工程を含む心筋細胞における肥大を治療する方法を提供する。とくに好
適な実施形態では、NF-AT3機能の阻害はNF-AT3の脱リン酸化を阻害することを含
む。他の好適な実施形態では、NF-AT3機能の阻害はNF-AT3の発現を減らすことを
含む。さらに他の好適な実施形態では、NF-AT3機能の阻害はNF-AT3に結合し、ま
た不活性化する薬剤とNF-AT3を接触させることを含む。他の実施形態では、NF-A
T3機能の阻害はNF-AT3とGATA4との相互作用を阻害することを含む。
【０００８】 さらなる実施形態では、本方法はさらに、NF-AT3により調節される遺伝子のア
ップレギュレーションを阻害することから成り、そこではその遺伝子は心房性ナ
トリウム利尿因子遺伝子、β-ミオシン重鎖遺伝子、β-型ナトリウム利尿ペプチ
ド、α-骨格アクチン遺伝子から構成されるグループから選択される。とくに好 適な実施形態では、遺伝子（複数）の機能を阻害する薬剤はアンチセンス構築物
であることがある。
ップレギュレーションを阻害することから成り、そこではその遺伝子は心房性ナ
トリウム利尿因子遺伝子、β-ミオシン重鎖遺伝子、β-型ナトリウム利尿ペプチ
ド、α-骨格アクチン遺伝子から構成されるグループから選択される。とくに好 適な実施形態では、遺伝子（複数）の機能を阻害する薬剤はアンチセンス構築物
であることがある。
【０００９】 NF-AT3の脱リン酸化の阻害を含むそれらの実施形態では、脱リン酸化を阻害す
る薬剤はシクロスポリンAあるいはFK506であることがある。もちろん、タンパク
質の脱リン酸化を阻害する何らかの他の薬剤も有用であることが証明される可能
性がある。
る薬剤はシクロスポリンAあるいはFK506であることがある。もちろん、タンパク
質の脱リン酸化を阻害する何らかの他の薬剤も有用であることが証明される可能
性がある。
【００１０】 NF-AT3の発現を減らす詳細な実施形態では、NF-AT3の発現を減少させる薬剤は
アンチセンス構築物であることがある。他の実施形態では、NF-AT3の活性化はNF
-AT3に結合しまた不活性化する薬剤により阻害されるが、その薬剤は抗体製剤あ
るいは小さな分子阻害剤であることがある。とくに好適な実施形態では、その抗
体製剤は単鎖抗体を含む。他の好適な実施形態では、その抗体製剤はモノクロー
ナル抗体から主に構成される。
アンチセンス構築物であることがある。他の実施形態では、NF-AT3の活性化はNF
-AT3に結合しまた不活性化する薬剤により阻害されるが、その薬剤は抗体製剤あ
るいは小さな分子阻害剤であることがある。とくに好適な実施形態では、その抗
体製剤は単鎖抗体を含む。他の好適な実施形態では、その抗体製剤はモノクロー
ナル抗体から主に構成される。
【００１１】 本発明はさらに、真核細胞において活性であるプロモーターの制御下で異種NF
−AT3を含むもののトランスジェニック非ヒト哺乳動物、細胞を企図している。 具体的な実施形態では、その哺乳動物はマウスである。他の実施形態では、異種
NF−AT3遺伝子にはリン酸化部位を破壊する少なくとも1つの突然変異が含まれる
。とくに好適な実施形態では、異種NF−AT3遺伝子はヒトのものである。
−AT3を含むもののトランスジェニック非ヒト哺乳動物、細胞を企図している。 具体的な実施形態では、その哺乳動物はマウスである。他の実施形態では、異種
NF−AT3遺伝子にはリン酸化部位を破壊する少なくとも1つの突然変異が含まれる
。とくに好適な実施形態では、異種NF−AT3遺伝子はヒトのものである。
【００１２】 とくに特定の実施形態では、トランスジェニック動物は野生型NF−AT3の1つない
しはそれ以上のリン酸化部位を欠くタンパク質をコードするNF−AT3遺伝子を含 む。他の実施形態では、NF−AT3遺伝子は野生型NF−AT3のすべてのリン酸化部位
を欠くタンパク質をコードする。なおさらなる実施形態では、NF−AT3遺伝子は 野生型NF−AT3のアミノ酸1〜137を欠くタンパク質をコードする。
しはそれ以上のリン酸化部位を欠くタンパク質をコードするNF−AT3遺伝子を含 む。他の実施形態では、NF−AT3遺伝子は野生型NF−AT3のすべてのリン酸化部位
を欠くタンパク質をコードする。なおさらなる実施形態では、NF−AT3遺伝子は 野生型NF−AT3のアミノ酸1〜137を欠くタンパク質をコードする。
【００１３】 ある特定の実施形態では、使用されているプロモーターは組織特異的プロモータ
ーであることがある。さらに具体的な形態では、組織特異的プロモーターは心筋
細胞特異的プロモーターである。好適な実施形態では、心筋細胞特異的プロモー
ターはBNP、β−MHC、心臓トロポニンI、α−MHC、SM22α、α−骨格アクチンプ
ロモーターから構成されるグループから選択されることがある。もちろん、心臓
特異的遺伝子に関連している何らかの他のプロモーターもまた本明細書で説明さ
れているように用いることができる。
ーであることがある。さらに具体的な形態では、組織特異的プロモーターは心筋
細胞特異的プロモーターである。好適な実施形態では、心筋細胞特異的プロモー
ターはBNP、β−MHC、心臓トロポニンI、α−MHC、SM22α、α−骨格アクチンプ
ロモーターから構成されるグループから選択されることがある。もちろん、心臓
特異的遺伝子に関連している何らかの他のプロモーターもまた本明細書で説明さ
れているように用いることができる。
【００１４】 本発明のさらなる実施形態は、1つないしはそれ以上のリン酸化部位を欠く突然 変異NF−AT3遺伝子を有する細胞を提供する工程、すなわち、候補的活性調節因 子と細胞を接触させる工程と、その細胞が候補となる活性調節因子により治療さ
れない場合には存在しない効果に関してその細胞をモニターする工程と、を含む
心肥大の活性調節因子をスクリーニングする方法を提供する。具体的な形態では
、細胞は心筋細胞の細胞系から誘導される。他の形態では、細胞は初代心筋細胞
から誘導される。特定の実施形態では、接触はin vitroで行われる。
れない場合には存在しない効果に関してその細胞をモニターする工程と、を含む
心肥大の活性調節因子をスクリーニングする方法を提供する。具体的な形態では
、細胞は心筋細胞の細胞系から誘導される。他の形態では、細胞は初代心筋細胞
から誘導される。特定の実施形態では、接触はin vitroで行われる。
【００１５】 具体的な実施形態では、モニタリングは活性、あるいは心房性ナトリウム利尿因
子遺伝子、β−ミオシン重鎖遺伝子、心臓アクチン遺伝子、α−骨格アクチン遺
伝子から構成されるグループから選択される遺伝子の発現を測定することを含む
。他の実施形態では、モニタリングは細胞の大きさないしは質量を測定すること
を含む。なお他の代替的な実施形態では、モニタリングは細胞におけるCa++応答
をモニタリングすることを含む。さらに詳細には、Ca++応答をモニタリングする
ことは細胞におけるCa++依存遺伝子発現をモニタリングすることを含む。ある具
体的な形態では、接触はin vivoに行われる。ある実施形態では、細胞はトラン スジェニック非ヒト哺乳動物の一部であることがある。具体的な形態では、モニ
タリングは心肥大を測定することを含む。本発明の本形態のある実施形態では、
NF−AT3遺伝子は野生型NF−AT3の1つないしはそれ以上のリン酸化部位を欠くタ ンパク質をコードする。他の好適な実施形態では、NF−AT3遺伝子は野生型NF−A
T3のすべてのリン酸化部位を欠くタンパク質をコードする。なおさらなる実施形
態では、NF−AT3遺伝子は野生型NF−AT3のアミノ酸1〜137を欠くタンパク質をコ
ードする。特定の実施形態では、候補となる活性調節因子は独立に、アンチセン
ス構築物、小さな分子ライブラリーから得た薬物、抗体、ないしは単鎖抗体であ
ることがある。
子遺伝子、β−ミオシン重鎖遺伝子、心臓アクチン遺伝子、α−骨格アクチン遺
伝子から構成されるグループから選択される遺伝子の発現を測定することを含む
。他の実施形態では、モニタリングは細胞の大きさないしは質量を測定すること
を含む。なお他の代替的な実施形態では、モニタリングは細胞におけるCa++応答
をモニタリングすることを含む。さらに詳細には、Ca++応答をモニタリングする
ことは細胞におけるCa++依存遺伝子発現をモニタリングすることを含む。ある具
体的な形態では、接触はin vivoに行われる。ある実施形態では、細胞はトラン スジェニック非ヒト哺乳動物の一部であることがある。具体的な形態では、モニ
タリングは心肥大を測定することを含む。本発明の本形態のある実施形態では、
NF−AT3遺伝子は野生型NF−AT3の1つないしはそれ以上のリン酸化部位を欠くタ ンパク質をコードする。他の好適な実施形態では、NF−AT3遺伝子は野生型NF−A
T3のすべてのリン酸化部位を欠くタンパク質をコードする。なおさらなる実施形
態では、NF−AT3遺伝子は野生型NF−AT3のアミノ酸1〜137を欠くタンパク質をコ
ードする。特定の実施形態では、候補となる活性調節因子は独立に、アンチセン
ス構築物、小さな分子ライブラリーから得た薬物、抗体、ないしは単鎖抗体であ
ることがある。
【００１６】 本発明の他の目的、特徴、長所は以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
本発明の好適な実施形態を示しているが、しかし、本発明の精神と範囲内のさま
ざまな変化と修正についてはこの詳細な説明から当業者には明らかになるであろ
うため、詳細な説明と特定例は図示説明のみを例として付与されることを理解す
べきである。
本発明の好適な実施形態を示しているが、しかし、本発明の精神と範囲内のさま
ざまな変化と修正についてはこの詳細な説明から当業者には明らかになるであろ
うため、詳細な説明と特定例は図示説明のみを例として付与されることを理解す
べきである。
【００１７】 以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明のある形態をさらに示すことを含
む。本発明は、ここに提示された詳細な実施形態の詳細な説明と組み合わせてこ
れらの図の1つないしはそれ以上に参照することにより、より良く理解されうる 。
む。本発明は、ここに提示された詳細な実施形態の詳細な説明と組み合わせてこ
れらの図の1つないしはそれ以上に参照することにより、より良く理解されうる 。
【００１８】 実例実施形態の説明 結果的に心不全となる心肥大は、米国では高い罹病率の主な原因の1つとなっ ているが、しかし潜在的な分子メカニズムは分かっていない。肥大型心筋症は家
族性と散発性の形態の両方で起こる。心筋症のこの型は左心室の肥大により特徴
付けられる。肥大型心筋症は収縮期機能の亢進、拡張期弛緩不全と心室硬化増加
傾向により後続される、延長され、異常に力強い等尺性収縮期によって特徴付け
られる。
族性と散発性の形態の両方で起こる。心筋症のこの型は左心室の肥大により特徴
付けられる。肥大型心筋症は収縮期機能の亢進、拡張期弛緩不全と心室硬化増加
傾向により後続される、延長され、異常に力強い等尺性収縮期によって特徴付け
られる。
【００１９】 心臓に負荷される作業負荷の増加に応答する心肥大は、基本的な適応メカニズ
ムである。神経、内分泌あるいは機械的な刺激のいずれかあるいは組み合わせの
結果として、（細胞数よりも）細胞の大きさと質量の量的増加を反映する特殊化
されたプロセスである。心肥大に関わるその他の因子は高血圧であり、うっ血性
心不全によくみられる前兆の1つである。心不全が起こると、左心室は通常肥大 化され、拡張され、また駆出率などの収縮期機能の指数は減少する。明らかに、
心肥大の応答は複合的な症候群であり、心肥大に繋がる経路の解明は様々な刺激
から結果的に生じる心疾患の治療において便益がある。
ムである。神経、内分泌あるいは機械的な刺激のいずれかあるいは組み合わせの
結果として、（細胞数よりも）細胞の大きさと質量の量的増加を反映する特殊化
されたプロセスである。心肥大に関わるその他の因子は高血圧であり、うっ血性
心不全によくみられる前兆の1つである。心不全が起こると、左心室は通常肥大 化され、拡張され、また駆出率などの収縮期機能の指数は減少する。明らかに、
心肥大の応答は複合的な症候群であり、心肥大に繋がる経路の解明は様々な刺激
から結果的に生じる心疾患の治療において便益がある。
【００２０】 １．本発明 細胞内Ca++における上昇は機械的な、あるいはアゴニスト誘導性心肥大の開始
と関連していることが非常にはっきりしている（Marbanら、1987；Bustamanteら
、1991；Hongoら、1995；Le Guennecら、1991；Perreaultら、1994；Saekiら、1
993）。さらに、心肥大は数多くの細胞においてほとんどあるいはまったく増加 しない心筋細胞のタンパク質内容の増加に繋がるある種の遺伝子のアップレギュ
レーションから結果的に生じることは公知のことである。本発明に先立つこれら
の観察結果にもかかわらず、心肥大に典型的なものであるタンパク質内容と最終
的な心筋層質量におけるこの増加を引き起こす細胞出来事についてはほとんど何
も分かっていなかった。
と関連していることが非常にはっきりしている（Marbanら、1987；Bustamanteら
、1991；Hongoら、1995；Le Guennecら、1991；Perreaultら、1994；Saekiら、1
993）。さらに、心肥大は数多くの細胞においてほとんどあるいはまったく増加 しない心筋細胞のタンパク質内容の増加に繋がるある種の遺伝子のアップレギュ
レーションから結果的に生じることは公知のことである。本発明に先立つこれら
の観察結果にもかかわらず、心肥大に典型的なものであるタンパク質内容と最終
的な心筋層質量におけるこの増加を引き起こす細胞出来事についてはほとんど何
も分かっていなかった。
【００２１】 本発明は、心臓遺伝子発現での変化を伴う細胞質におけるCa++シグナルを送る
ことに結び付く心肥大の誘導のための細胞内経路の解明に由来する。この肥大経
路の活性化は、カルシニューリンないしはNF-AT3により、細胞質かあるいは核か
のいずれかで、それぞれ、分子的ならびに病理生理学的変化を生じるという結果
になる。これらの相互作用を用いることが、診断的、治療的な文脈の両方におい
て、本明細書で以下に説明するように、本発明の基本となっている。
ことに結び付く心肥大の誘導のための細胞内経路の解明に由来する。この肥大経
路の活性化は、カルシニューリンないしはNF-AT3により、細胞質かあるいは核か
のいずれかで、それぞれ、分子的ならびに病理生理学的変化を生じるという結果
になる。これらの相互作用を用いることが、診断的、治療的な文脈の両方におい
て、本明細書で以下に説明するように、本発明の基本となっている。
【００２２】 本発明はNF-AT3タンパク質の活性化形態を構成的に発現させるトランスジェニ
ックマウスを初めて提供する。さらに詳細には、発現したNF-AT3タンパク質は野
生型NF-AT3のリン酸化部位を欠いており、またカルシニューリンにより仲介され
るCa++仲介脱リン酸化による活性化を必要としない。この突然変異体がリン酸化
部位を欠いているため、正常では肥大型シグナルに応答する遺伝子のアップレギ
ュレーションを仲介するような構成的なやり方で変異体がGATA4を結合する場所 である核に変異体は局在化する。
ックマウスを初めて提供する。さらに詳細には、発現したNF-AT3タンパク質は野
生型NF-AT3のリン酸化部位を欠いており、またカルシニューリンにより仲介され
るCa++仲介脱リン酸化による活性化を必要としない。この突然変異体がリン酸化
部位を欠いているため、正常では肥大型シグナルに応答する遺伝子のアップレギ
ュレーションを仲介するような構成的なやり方で変異体がGATA4を結合する場所 である核に変異体は局在化する。
【００２３】 心臓においてNF-AT3の活性化形態を発現するトランスジェニックマウスはヒト
の心臓疾患を模した心肥大や心不全を発症する。このように、ある実施形態では
、これらのマウスは、心肥大やヒトの心疾患を改善するのに用いられる可能性が
ある薬剤や遺伝子を同定する際に有用となる。
の心臓疾患を模した心肥大や心不全を発症する。このように、ある実施形態では
、これらのマウスは、心肥大やヒトの心疾患を改善するのに用いられる可能性が
ある薬剤や遺伝子を同定する際に有用となる。
【００２４】 さらには、哺乳動物におけるCa++依存性心肥大型応答は、NF-AT3の活性化によ
り仲介されることを本発明が示す場合には、本発明はNF-AT3の機能を阻害するこ
とによって心肥大を治療する方法を提供する。この阻害は数多くのレベルで起こ
りうることであり、最初の例では、NF-AT3の阻害はNF-AT3の活性化の阻害から生
じることがある。広範な意味では、これは細胞質のNF-AT3タンパク質の脱リン酸
化を阻害することを必然的に伴う。これはシクロスポリンA（CsA）あるいはFK-5
06などのカルシニューリンの特異的な阻害薬を使用して、あるいはNF-AT3キナー
ゼの活性化により達成される可能性がある。もう1つの代替的なものでは、NF-AT
3阻害は例えば、アンチセンス方法論、単鎖抗体、小さな分子阻害薬などを使用 してNF-AT3活性の阻害を含む。さらにもう1つのアプローチでは、NF-AT3タンパ ク質あるいは遺伝子を標的にするというよりも、NF-AT3がNF-AT3の標的、例えば
、GATA4との相互作用を防ぐことにより心肥大を仲介することを阻害することが 可能である。本実施形態では、NF-AT3標的を除去するであろうアンチセンス構築
物、単鎖抗体などを生成する可能性があり、それによってNF-AT3の効果を阻止す
る。潜在的に利得のある結果を達成するための方法と組成は以下に非常に詳細に
説明される。
り仲介されることを本発明が示す場合には、本発明はNF-AT3の機能を阻害するこ
とによって心肥大を治療する方法を提供する。この阻害は数多くのレベルで起こ
りうることであり、最初の例では、NF-AT3の阻害はNF-AT3の活性化の阻害から生
じることがある。広範な意味では、これは細胞質のNF-AT3タンパク質の脱リン酸
化を阻害することを必然的に伴う。これはシクロスポリンA（CsA）あるいはFK-5
06などのカルシニューリンの特異的な阻害薬を使用して、あるいはNF-AT3キナー
ゼの活性化により達成される可能性がある。もう1つの代替的なものでは、NF-AT
3阻害は例えば、アンチセンス方法論、単鎖抗体、小さな分子阻害薬などを使用 してNF-AT3活性の阻害を含む。さらにもう1つのアプローチでは、NF-AT3タンパ ク質あるいは遺伝子を標的にするというよりも、NF-AT3がNF-AT3の標的、例えば
、GATA4との相互作用を防ぐことにより心肥大を仲介することを阻害することが 可能である。本実施形態では、NF-AT3標的を除去するであろうアンチセンス構築
物、単鎖抗体などを生成する可能性があり、それによってNF-AT3の効果を阻止す
る。潜在的に利得のある結果を達成するための方法と組成は以下に非常に詳細に
説明される。
【００２５】 ２．心肥大に関する転写経路 上記のように、Ca++活性化が心肥大に著しく関連していることが知られている
が、カルシニューリンが心筋細胞における肥大型シグナルの形質導入に参加する
可能性が以前には研究調査されていなかった。本発明は心肥大に関するカルシニ
ューリン依存性経路を説明するが、この経路は図8に図示されている。心肥大に それらが関連しているために、この経路の個々の組成物（成分）はここに以下に
さらに詳細に論議される。
が、カルシニューリンが心筋細胞における肥大型シグナルの形質導入に参加する
可能性が以前には研究調査されていなかった。本発明は心肥大に関するカルシニ
ューリン依存性経路を説明するが、この経路は図8に図示されている。心肥大に それらが関連しているために、この経路の個々の組成物（成分）はここに以下に
さらに詳細に論議される。
【００２６】 a．カルシニューリン カルシニューリンは59 kDカルモジュリン結合触媒Aサブユニットおよび19 kD
Ca++結合調節Bサブユニットから成るヘテロダイマーとして存在する、いたると ころで発現されるセリン/スレオニンホスファターゼである（StemmerとKlee、19
94；Suら、1995）。カルシニューリンは、その酵素が維持されたCa++プラトーに
より活性化され、また心筋細胞収縮に応答して起こるように、一過性Ca++代謝速
度に感受性がないので、Ca++シグナリングに対する心筋細胞の延長肥大型応答を
仲介することに唯一適している（Dolmetschら、1997）。
Ca++結合調節Bサブユニットから成るヘテロダイマーとして存在する、いたると ころで発現されるセリン/スレオニンホスファターゼである（StemmerとKlee、19
94；Suら、1995）。カルシニューリンは、その酵素が維持されたCa++プラトーに
より活性化され、また心筋細胞収縮に応答して起こるように、一過性Ca++代謝速
度に感受性がないので、Ca++シグナリングに対する心筋細胞の延長肥大型応答を
仲介することに唯一適している（Dolmetschら、1997）。
【００２７】 カルシニューリンの活性化は調節および触媒サブユニットにそれぞれCa++とカ
ルモジュリンが結合することにより、仲介される。以前の研究では、心臓におけ
る過剰発現がまた肥大という結果になることが示されたが、それに関与するメカ
ニズムは判明しなかった（Gruverら、1993）。本明細書に提示された観察結果の
場合は、カルモジュリンは肥大型応答を誘導するためにカルシニューリン経路に
より作用することが現在では判明している。
ルモジュリンが結合することにより、仲介される。以前の研究では、心臓におけ
る過剰発現がまた肥大という結果になることが示されたが、それに関与するメカ
ニズムは判明しなかった（Gruverら、1993）。本明細書に提示された観察結果の
場合は、カルモジュリンは肥大型応答を誘導するためにカルシニューリン経路に
より作用することが現在では判明している。
【００２８】 b．NF-AT3 NF-AT3は、四つのメンバーであるNF-ATc、NF-ATp、NF-AT3、NF-AT4を含む多重
遺伝子ファミリーのメンバーの1つである（McCafferyら、1993；Northrupら、19
94；Hoeyら、1995；Masudaら、1995；Parkら、1996；Hoら、1995）。これらの因
子はRel相同ドメイン（RHD）によりモノマーあるいはダイマーとして共通DNA配 列GGAAAATを結合する（Rooneyら、1994；Hoeyら、1995）。NF-AT遺伝子の3つはT
細胞と骨格筋に対しては発現を制限されているが、一方、NF-AT3は心臓を含む様
々な組織で発現させられる（Hoeyら、1995）。NF-ATタンパク質に関する付加的 な開示については、熟練した技術者であれば、本明細書に参照としてとくに記載
されている、米国特許第5,708,158号を参照する。
遺伝子ファミリーのメンバーの1つである（McCafferyら、1993；Northrupら、19
94；Hoeyら、1995；Masudaら、1995；Parkら、1996；Hoら、1995）。これらの因
子はRel相同ドメイン（RHD）によりモノマーあるいはダイマーとして共通DNA配 列GGAAAATを結合する（Rooneyら、1994；Hoeyら、1995）。NF-AT遺伝子の3つはT
細胞と骨格筋に対しては発現を制限されているが、一方、NF-AT3は心臓を含む様
々な組織で発現させられる（Hoeyら、1995）。NF-ATタンパク質に関する付加的 な開示については、熟練した技術者であれば、本明細書に参照としてとくに記載
されている、米国特許第5,708,158号を参照する。
【００２９】 NF-AT3は、核転位を仲介するアミノ末端にある調節ドメインと、DNA結合を仲介 するカルボキシル末端近くにあるRel相同ドメインを伴う902アミノ酸タンパク質
（例えば、配列識別番号：9によりコードされる配列識別番号：8）である（図1A
）。酵母2-ハイブリッドスクリーンから回収されたNF-AT3の領域は、Rel相同ド メインの真中近くにあるアミノ酸522からカルボキシル末端まで拡張していた。
（例えば、配列識別番号：9によりコードされる配列識別番号：8）である（図1A
）。酵母2-ハイブリッドスクリーンから回収されたNF-AT3の領域は、Rel相同ド メインの真中近くにあるアミノ酸522からカルボキシル末端まで拡張していた。
【００３０】 NF-ATタンパク質の活性化に関与する3つの異なった工程、すなわち、脱リン酸
化、核局在化、DNAに対する親和性の増大がある。休止細胞では、NFATタンパク 質はリン酸化され、細胞質に帰する。これらの細胞質NF-ATタンパク質はほとん どあるいはまったくDNA親和性を示さない。カルシウム動員を顕在化させる刺激 はNF-ATタンパク質の急速な脱リン酸化と、核への転移という結果を生じる。脱 リン酸化NF-ATタンパク質はDNAに対する親和性の増大を示す。活性化経路の各工
程はCsAあるいはFK506により阻止することが可能である。このことと本発明者の
研究調査により、カルシニューリンはNF-AT活性化に責を負っているタンパク質 であることが示されている。
化、核局在化、DNAに対する親和性の増大がある。休止細胞では、NFATタンパク 質はリン酸化され、細胞質に帰する。これらの細胞質NF-ATタンパク質はほとん どあるいはまったくDNA親和性を示さない。カルシウム動員を顕在化させる刺激 はNF-ATタンパク質の急速な脱リン酸化と、核への転移という結果を生じる。脱 リン酸化NF-ATタンパク質はDNAに対する親和性の増大を示す。活性化経路の各工
程はCsAあるいはFK506により阻止することが可能である。このことと本発明者の
研究調査により、カルシニューリンはNF-AT活性化に責を負っているタンパク質 であることが示されている。
【００３１】 このように、T細胞では、カルシニューリン活性化に応答した遺伝子発現での数 多くの変化は、カルシニューリンによる脱リン酸化後に核へ転移する、転写因子
のNF-ATファミリーのメンバーにより仲介される。本明細書に提示されている三 つの独立した観察結果は、NF-ATはまた、カルシニューリン活性化に応答する心 肥大の重要なメディエーターであるという結論を支持している。まず最初に、NF
-AT活性はAngIIとPEによる心筋細胞の治療により導入される。この導入は、カル
シニューリン依存性であることを示すCsAとFK-506によって阻止される。第2に、
NF-AT3は、GATA4との相乗作用を示し、心筋細胞における心臓特異的BNPプロモー
ターを活性化する。第3に、心臓における活性化NF-AT3の発現は、肥大型シグナ リング経路におけるすべての上流エレメントを迂回して、肥大性応答を引き起こ
すのには十分である。
のNF-ATファミリーのメンバーにより仲介される。本明細書に提示されている三 つの独立した観察結果は、NF-ATはまた、カルシニューリン活性化に応答する心 肥大の重要なメディエーターであるという結論を支持している。まず最初に、NF
-AT活性はAngIIとPEによる心筋細胞の治療により導入される。この導入は、カル
シニューリン依存性であることを示すCsAとFK-506によって阻止される。第2に、
NF-AT3は、GATA4との相乗作用を示し、心筋細胞における心臓特異的BNPプロモー
ターを活性化する。第3に、心臓における活性化NF-AT3の発現は、肥大型シグナ リング経路におけるすべての上流エレメントを迂回して、肥大性応答を引き起こ
すのには十分である。
【００３２】 本発明は、NF-AT3のRel相同ドメインのC-末端部分が、これまた心臓において発 現されているGATA5とGATA6の場合と同様に、GATA4の第二のジンクフィンガーと 相互作用することを示す。NF-ATcのDNA結合領域の結晶構造は、Rel相同ドメイン
のC-末端部分はDNA結合部位からは突出しており、また免疫細胞におけるAP-1と の相互作用を仲介していることを明らかにしている（Wolfeら、1997）。
のC-末端部分はDNA結合部位からは突出しており、また免疫細胞におけるAP-1と の相互作用を仲介していることを明らかにしている（Wolfeら、1997）。
【００３３】 T細胞でのCa++シグナリングに応答して遺伝子発現の変化を仲介するNF-AT因子の
能力が付与された場合は、本発明者の成績は、心臓遺伝子発現の公知のエフェク
ターであるGATA4とNF-AT3は相互作用することが可能であるという点でとくに興 味深い。この相互作用は、心肥大の間に起こることが知られているように、心臓
転写にCa++シグナリングを結び付けるための潜在的なメカニズムであることを示
唆している。
能力が付与された場合は、本発明者の成績は、心臓遺伝子発現の公知のエフェク
ターであるGATA4とNF-AT3は相互作用することが可能であるという点でとくに興 味深い。この相互作用は、心肥大の間に起こることが知られているように、心臓
転写にCa++シグナリングを結び付けるための潜在的なメカニズムであることを示
唆している。
【００３４】 本明細書で提示されている成績は、図8に示されているように、心肥大の分子経 路と合致している。本モデルにより、細胞内Ca++の上昇に繋がるAngIIとPEなど の肥大刺激は、カルシニューリンの活性化という結果を生じる。細胞質内のNF-A
T3はカルシニューリンにより脱リン酸化され、GATA4と相互作用することができ る場所である核にNF-AT3が転移することを可能にする。
T3はカルシニューリンにより脱リン酸化され、GATA4と相互作用することができ る場所である核にNF-AT3が転移することを可能にする。
【００３５】 本研究の成績は、NF-AT3のカルシニューリン活性化は様々な病理学的刺激に応答
して肥大を調節し、また変更されたサルコメア機能のための感知メカニズムを示
唆していることを示す。注目すべきことは、収縮性タンパク質遺伝子における突
然変異により引き起こされる家族性肥大型心筋症（FHC）が数例あり、それがサ ルコメアの細い結晶様構造で微細な組織崩壊を生じる結果となっていることであ
る（Watkinsら、1995；VikstromとLeinwand、1996）。サルコメアの組織崩壊が どのようにして心筋細胞によって感知されるのかは分かっていないが、しかし、
これが変更されるCa++の操作に繋がることは明らかである（PalmiterとSolaro、
1997；Botinelliら、1997；Linら、1996）。カルシニューリンは、心肥大や心不
全と、FHCに関連して変更されるCa++の操作とを結び付ける分子を感知すること を呈示できた。
して肥大を調節し、また変更されたサルコメア機能のための感知メカニズムを示
唆していることを示す。注目すべきことは、収縮性タンパク質遺伝子における突
然変異により引き起こされる家族性肥大型心筋症（FHC）が数例あり、それがサ ルコメアの細い結晶様構造で微細な組織崩壊を生じる結果となっていることであ
る（Watkinsら、1995；VikstromとLeinwand、1996）。サルコメアの組織崩壊が どのようにして心筋細胞によって感知されるのかは分かっていないが、しかし、
これが変更されるCa++の操作に繋がることは明らかである（PalmiterとSolaro、
1997；Botinelliら、1997；Linら、1996）。カルシニューリンは、心肥大や心不
全と、FHCに関連して変更されるCa++の操作とを結び付ける分子を感知すること を呈示できた。
【００３６】 本発明の成績はさらに、CsAないしはFK506などのカルシニューリンの阻害薬がヒ
トにおける心肥大と心不全の治療に有用であるのかどうかという問題を提起して
いる。これらの免疫抑制薬は移植患者では組織拒絶反応を予防するために日常的
に使用されているが、しかし、移植患者における心機能とCsA治療を相関させる 臨床データは確定的なものではない（Haverichら、1994）。しかしながら、心臓
移植患者の研究では、CsAが心機能と左心室駆出率を増加させ、虚血性のエピソ ードはほとんどないという結果を出していることを報告している（ReidとYanoco
ub、1988）。
トにおける心肥大と心不全の治療に有用であるのかどうかという問題を提起して
いる。これらの免疫抑制薬は移植患者では組織拒絶反応を予防するために日常的
に使用されているが、しかし、移植患者における心機能とCsA治療を相関させる 臨床データは確定的なものではない（Haverichら、1994）。しかしながら、心臓
移植患者の研究では、CsAが心機能と左心室駆出率を増加させ、虚血性のエピソ ードはほとんどないという結果を出していることを報告している（ReidとYanoco
ub、1988）。
【００３７】 c．GATA4 TEF-1（Karnsら、1995；Kariyaら、1994）、SRF（SadoshimaとIzumo、1993a；19
93b）、AP-1（Kovacic-Milivojevicら、1996）、GATA4（Herzigら、1997；Haseg
awaら、1997）を含む様々な転写因子が心肥大に関係していると言われてきた。T
細胞遺伝子発現の制御におけるNF-ATとAP-1の間の協同作用に照らしてみると、 同様のメカニズムが肥大に応答してある種の心臓遺伝子を調節しているのではな
いかと思われる。
93b）、AP-1（Kovacic-Milivojevicら、1996）、GATA4（Herzigら、1997；Haseg
awaら、1997）を含む様々な転写因子が心肥大に関係していると言われてきた。T
細胞遺伝子発現の制御におけるNF-ATとAP-1の間の協同作用に照らしてみると、 同様のメカニズムが肥大に応答してある種の心臓遺伝子を調節しているのではな
いかと思われる。
【００３８】 6つのGATA転写因子が脊椎動物種で同定されているが、それぞれにはモチーフCys
-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cysの2つのジンクフィンガーから成る高度に保存的なDNA結
合ドメインが含まれている（Evans1997に総説）。配列相同性と発現パターンを ベースにして、GATAタンパク質は2つのサブファミリーに分けることができる。G
ATA1/2/3は造血細胞で発現するが、一方、GATA4/5/6は内臓内胚葉誘導体におけ るのと同様に、心臓と血管系において主に発現する。造血細胞におけるGATA1/2/
3ならびにT細胞におけるNF-ATタンパク質に関するよく報告されている役割の重 要性を論ずる場合には、転写因子のこれら2つのファミリーがこれらの細胞で相 互作用できるかどうかの判定が興味の的となるであろう。
-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cysの2つのジンクフィンガーから成る高度に保存的なDNA結
合ドメインが含まれている（Evans1997に総説）。配列相同性と発現パターンを ベースにして、GATAタンパク質は2つのサブファミリーに分けることができる。G
ATA1/2/3は造血細胞で発現するが、一方、GATA4/5/6は内臓内胚葉誘導体におけ るのと同様に、心臓と血管系において主に発現する。造血細胞におけるGATA1/2/
3ならびにT細胞におけるNF-ATタンパク質に関するよく報告されている役割の重 要性を論ずる場合には、転写因子のこれら2つのファミリーがこれらの細胞で相 互作用できるかどうかの判定が興味の的となるであろう。
【００３９】 NF-AT3とGATA4によるβ-ナトリウム利尿ペプチド（BNP）プロモーターと肥大型 応答遺伝子の協同活性化は、BNP上流領域での標的配列に対するNF-AT結合を必要
とする。以前の研究では、基部BNPプロモーターの近くに位置するGATA4結合部位
はまたその遺伝子の活性化を必要とする（Grepinら、1994）。このように、この
特異的肥大型応答遺伝子については、おそらく他の、こうした因子が転写を活性
化するために組合わせ結合性に作用する。NF-ATタンパク質はAP-1とともに複合D
NA配列を結合することによってある種のT細胞を調節する（Wolfeら、1997）。BN
Pプロモーターの場合は、これらの因子の結合部位が直ぐ隣接しているわけでは なく、また両方の因子の部位は相乗活性化を必要としているので、GATA4とNF-AT
3の間のこのタイプのジョイントDNA結合に対する証拠はない。さらにDNA結合測 定では、本発明者はGATA4とNF-AT3を一緒にいずれかのタイプの部位に結合した という証拠は見出されなかった。
とする。以前の研究では、基部BNPプロモーターの近くに位置するGATA4結合部位
はまたその遺伝子の活性化を必要とする（Grepinら、1994）。このように、この
特異的肥大型応答遺伝子については、おそらく他の、こうした因子が転写を活性
化するために組合わせ結合性に作用する。NF-ATタンパク質はAP-1とともに複合D
NA配列を結合することによってある種のT細胞を調節する（Wolfeら、1997）。BN
Pプロモーターの場合は、これらの因子の結合部位が直ぐ隣接しているわけでは なく、また両方の因子の部位は相乗活性化を必要としているので、GATA4とNF-AT
3の間のこのタイプのジョイントDNA結合に対する証拠はない。さらにDNA結合測 定では、本発明者はGATA4とNF-AT3を一緒にいずれかのタイプの部位に結合した という証拠は見出されなかった。
【００４０】 以前の研究では、肥大型応答ではRas、MAPキナーゼ、PKCシグナリング経路の重 要な役割が示された。これらのシグナル形質導入経路のすべてが細胞内Ca++濃度
における変力増加に関連している。T細胞では、カルシニューリンシグナリング 経路は、Ras/MAPキナーゼとPKC経路に関して別々に活性化されるが、しかし、そ
れらは一緒に一体化される。IL-2転写の完全誘導は、NF-ATとAP-1それぞれの活 性化、また共通下流標的配列におけるそれらの収束という結果になるカルシニュ
ーリンとRas経路による共同刺激が必要となる（Raoら、1997に総説）。このタイ
プの一体化シグナリングは心肥大の誘導のためのメカニズムに明らかに類似した
ものを帯びている。これらの結果は、カルシニューリン-NF-AT3シグナリング経 路がin vivoに肥大を誘発するのに十分であることを示しているが、この経路とR
as/MAPキナーゼ経路は免疫細胞におけるのと同様、心筋細胞において互いに依存
的であるらしいとも考えられる。
における変力増加に関連している。T細胞では、カルシニューリンシグナリング 経路は、Ras/MAPキナーゼとPKC経路に関して別々に活性化されるが、しかし、そ
れらは一緒に一体化される。IL-2転写の完全誘導は、NF-ATとAP-1それぞれの活 性化、また共通下流標的配列におけるそれらの収束という結果になるカルシニュ
ーリンとRas経路による共同刺激が必要となる（Raoら、1997に総説）。このタイ
プの一体化シグナリングは心肥大の誘導のためのメカニズムに明らかに類似した
ものを帯びている。これらの結果は、カルシニューリン-NF-AT3シグナリング経 路がin vivoに肥大を誘発するのに十分であることを示しているが、この経路とR
as/MAPキナーゼ経路は免疫細胞におけるのと同様、心筋細胞において互いに依存
的であるらしいとも考えられる。
【００４１】 d．カルシニューリンの阻害薬 CsAとFK-506は、イムノフィリン、サイクロフィリン、FK-506-結合タンパク質（
FKBP12）それぞれを結合し、カルシニューリン触媒サブユニットを結合する複合
体を形成し、その活性を阻害する。本明細書に提示されている結果は、CsAとFK-
506がAngIIとPEに応答して肥大になる培養心筋細胞の能力を阻止することを示し
ている。これらの肥大型アゴニストは両方とも、PKCとMAPキナーゼシグナリング
経路の活性化という結果になる、細胞内Ca++を上昇させることによって作用する
ことを示している（SadoshimaとIzumo、1993a、1993b；Kudohら、1997；Yamazak
iら、1997；Zouら、1996）。CsAはPI回転置換、Ca++動員、あるいはPKC活性化な
どの、細胞膜における初期シグナリング出来事を干渉することはない（Emmelら 、1989）。このように、AngIIとPEの肥大型応答を排除するその能力は、カルシ ニューリン活性化がAngIIとPEシグナル形質導入経路における重要な工程である ことを示唆している。
FKBP12）それぞれを結合し、カルシニューリン触媒サブユニットを結合する複合
体を形成し、その活性を阻害する。本明細書に提示されている結果は、CsAとFK-
506がAngIIとPEに応答して肥大になる培養心筋細胞の能力を阻止することを示し
ている。これらの肥大型アゴニストは両方とも、PKCとMAPキナーゼシグナリング
経路の活性化という結果になる、細胞内Ca++を上昇させることによって作用する
ことを示している（SadoshimaとIzumo、1993a、1993b；Kudohら、1997；Yamazak
iら、1997；Zouら、1996）。CsAはPI回転置換、Ca++動員、あるいはPKC活性化な
どの、細胞膜における初期シグナリング出来事を干渉することはない（Emmelら 、1989）。このように、AngIIとPEの肥大型応答を排除するその能力は、カルシ ニューリン活性化がAngIIとPEシグナル形質導入経路における重要な工程である ことを示唆している。
【００４２】 このように、CsA、FK-506やその他の関連組成物などの薬剤は、心臓機能不全、 とくに心肥大誘導機能不全を予防し、阻止し、阻害する、あるいは排除するのに
使用される可能性がある。本明細書で使用されている用語である「心肥大-誘発 機能不全」は、心肥大に関連した状態、ないしは疾患の状態を記述するのに使用
され、心肥大、合成化合物心肥大、拡張型心肥大、代償性心肥大、心不全に限定
されるわけではないが、それらを含む。心肥大誘導肥大は、同心円状拡大心室塊
、離心性拡大心室塊、拡張型心筋症への進行、拡張型類線維性沈着物、心筋細胞
混乱やカルシウムイオン放出および摂取（すなわち、Ca2+代謝速度）ストローク
短縮、心室駆出量の減少、不整脈、頻脈、中央要求量における変化、心不全に限
定されないが、それらを含む1つないしはそれ以上の症状あるいは出来事のいず れかによって特徴付けられる。
使用される可能性がある。本明細書で使用されている用語である「心肥大-誘発 機能不全」は、心肥大に関連した状態、ないしは疾患の状態を記述するのに使用
され、心肥大、合成化合物心肥大、拡張型心肥大、代償性心肥大、心不全に限定
されるわけではないが、それらを含む。心肥大誘導肥大は、同心円状拡大心室塊
、離心性拡大心室塊、拡張型心筋症への進行、拡張型類線維性沈着物、心筋細胞
混乱やカルシウムイオン放出および摂取（すなわち、Ca2+代謝速度）ストローク
短縮、心室駆出量の減少、不整脈、頻脈、中央要求量における変化、心不全に限
定されないが、それらを含む1つないしはそれ以上の症状あるいは出来事のいず れかによって特徴付けられる。
【００４３】 e．肥大型遺伝子 ホルモン、遺伝子、機械的な刺激に応じて、心筋層は個々の筋細胞の肥大によ
り作業負荷の増加に適応する（Morganら、1987）。成人心筋細胞は最終的に分化
され、増殖する能力を失い、肥大プロセス間の心増大は個々の心筋細胞当たりの
タンパク質内容量の増加から主に生じ、筋細胞数における変化はほとんどないか
あるいはまったくないという結果になる。このように、心筋肥大型応答の中心と
なる特徴は、これらのタンパク質をコードする対応心臓遺伝子の転写の活性化に
大部分依存するようにみえる、収縮性タンパク質内容量、収縮性タンパク質イソ
型の誘導、胎児性マーカーの発現の増加である。
り作業負荷の増加に適応する（Morganら、1987）。成人心筋細胞は最終的に分化
され、増殖する能力を失い、肥大プロセス間の心増大は個々の心筋細胞当たりの
タンパク質内容量の増加から主に生じ、筋細胞数における変化はほとんどないか
あるいはまったくないという結果になる。このように、心筋肥大型応答の中心と
なる特徴は、これらのタンパク質をコードする対応心臓遺伝子の転写の活性化に
大部分依存するようにみえる、収縮性タンパク質内容量、収縮性タンパク質イソ
型の誘導、胎児性マーカーの発現の増加である。
【００４４】 ラット心臓ミオシン軽鎖-2（MLC-2）遺伝子などの心筋層で構成的に発現される 収縮性タンパク質遺伝子のアップレギュレーションは、MLC-2値と個々の心筋細 胞でのこの収縮性タンパク質の対応する蓄積の量的増加という結果になる。心筋
細胞肥大はまた、胎児性発症、例えば、心肥大のげっ歯類や家兎のモデルでの骨
格α-アクチン（Schwartzら、1986）とβ-ミオシン重鎖（MHC）発現の再活性化 において正常に発現される収縮性タンパク質遺伝子の誘導を含む収縮性タンパク
質組成における質的変化にも関連がある。特異的な収縮性タンパク質組成物の誘
導に加えて、心室性肥大はまた非収縮性タンパク質遺伝子の発現での変更によっ
ても特徴付けられる。
細胞肥大はまた、胎児性発症、例えば、心肥大のげっ歯類や家兎のモデルでの骨
格α-アクチン（Schwartzら、1986）とβ-ミオシン重鎖（MHC）発現の再活性化 において正常に発現される収縮性タンパク質遺伝子の誘導を含む収縮性タンパク
質組成における質的変化にも関連がある。特異的な収縮性タンパク質組成物の誘
導に加えて、心室性肥大はまた非収縮性タンパク質遺伝子の発現での変更によっ
ても特徴付けられる。
【００４５】 心室性肥大の間にアップレギュレーションされる公知の非収縮性タンパク質遺伝
子に関しては、心房性ナトリウム利尿因子（ANF）発現の再活性化が最もよく特 徴付けられるものであろう。ANFは、心房性筋細胞により分泌される血管調節ペ プチドホルモンの1つであり、組織の伸張あるいはカテコラミンないしはエンド セリン（ET）などのホルモンに応答してエキソサイトーシスを蒙る分泌性顆粒内
に蓄えられる。血管拡張とナトリウム利尿により血圧下降させるβ型ナトリウム
利尿ペプチド（BNP）はまた、肥大型シグナルに応答して心臓で急速にアップレ ギュレーションされる（KomuroとYazaki、1993に総説）。
子に関しては、心房性ナトリウム利尿因子（ANF）発現の再活性化が最もよく特 徴付けられるものであろう。ANFは、心房性筋細胞により分泌される血管調節ペ プチドホルモンの1つであり、組織の伸張あるいはカテコラミンないしはエンド セリン（ET）などのホルモンに応答してエキソサイトーシスを蒙る分泌性顆粒内
に蓄えられる。血管拡張とナトリウム利尿により血圧下降させるβ型ナトリウム
利尿ペプチド（BNP）はまた、肥大型シグナルに応答して心臓で急速にアップレ ギュレーションされる（KomuroとYazaki、1993に総説）。
【００４６】 ３．トランスジェニックマウス作成方法 上述のように、本発明の1つの詳細な実施形態では活性NF-AT3を含むトランス ジェニック動物が提供される。これらの動物は心肥大の病理生理学と関連のある
特徴をすべて示す。NF-AT3トランス遺伝子、そうした動物およびトランスジェニ
ック胚から誘導された組換え細胞系を発現するトランスジェニック動物はNF-AT3
の機能を抑制する薬剤をスクリーニングし、また同定するための方法において有
用であり、それによって心肥大が緩和されると考えられる。
特徴をすべて示す。NF-AT3トランス遺伝子、そうした動物およびトランスジェニ
ック胚から誘導された組換え細胞系を発現するトランスジェニック動物はNF-AT3
の機能を抑制する薬剤をスクリーニングし、また同定するための方法において有
用であり、それによって心肥大が緩和されると考えられる。
【００４７】 一般的な形態の1つでは、トランスジェニック動物は、トランス遺伝子の発現 を可能にする方法でゲノムの中に任意のトランス遺伝子を組み込むことにより産
生される。トランスジェニック動物を産生するための方法は一般的には、Wagner
とHoppe（米国特許第4,873,191号；これは本明細書に参照として記載されている
）、Brinsterら、1985；これは全体として参照として本明細書に記載されている
）、また『マウス胚操作；ラボマニュアル（Manipulating the Mouse Embryo；A
Laboratory Manual）』、第2版（Hogan、Beddington、Costatimi、Long編、Col
d Spring Harbor Laboratory Press刊、1994年；これは全体として本明細書に参
照として記載されている）。
生される。トランスジェニック動物を産生するための方法は一般的には、Wagner
とHoppe（米国特許第4,873,191号；これは本明細書に参照として記載されている
）、Brinsterら、1985；これは全体として参照として本明細書に記載されている
）、また『マウス胚操作；ラボマニュアル（Manipulating the Mouse Embryo；A
Laboratory Manual）』、第2版（Hogan、Beddington、Costatimi、Long編、Col
d Spring Harbor Laboratory Press刊、1994年；これは全体として本明細書に参
照として記載されている）。
【００４８】 典型的には、ゲノム配列が側面に位置している1つの遺伝子は、受精卵の中に 顕微注射することにより転移させられる。顕微注射された卵は宿主雌の中に植え
付けられ、その子孫はトランス遺伝子の発現に関してスクリーニングされる。ト
ランスジェニック動物は爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類、魚類に限定されないが
、それらを含む数多くの動物から得られる受精卵から産生される可能性がある。
とくに好適な実施形態では、野生型NF-AT3のリン酸化ドメインを欠くNF-AT3ポリ
ペプチドの突然変異体形態を発現するトランスジェニックマウスが生成される。
付けられ、その子孫はトランス遺伝子の発現に関してスクリーニングされる。ト
ランスジェニック動物は爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類、魚類に限定されないが
、それらを含む数多くの動物から得られる受精卵から産生される可能性がある。
とくに好適な実施形態では、野生型NF-AT3のリン酸化ドメインを欠くNF-AT3ポリ
ペプチドの突然変異体形態を発現するトランスジェニックマウスが生成される。
【００４９】 顕微注射用DNAクローンは、当業者には公知のいずれかの手段により作成する ことができる。例えば、顕微注射用DNAクローンは、細菌プラスミド配列を取り 除くための適当な酵素により切断することができ、そのDNA断片は、標準的な技 術を使用して、TBE緩衝液において1%アガロースゲル上で電気泳動される。DNAバ
ンドは臭化エチジウムを使用した染色により視覚化され、発現配列を含むそのバ
ンドは切除される。切除されたバンドはその後0.3M酢酸ナトリウム、pH 7.0を含
む透析バッグの中に置かれる。DNAは透析バッグの中に電気溶離されて入れられ 、1：1フェノール：クロロホルム溶液で抽出され、エタノールの2容量により沈 殿される。DNAは低濃度塩緩衝液1ml（0.2 M NaCl、20 mM Tris、pH 7.4、1 mM E
DTA）で再溶解され、Elutip-DTMカラム上で精製される。カラムは最初、高濃度 塩緩衝液3 ml（1 M NaCl、20 mM Tris、pH 7.4、1 mM EDTA）により開始され、 その後低濃度塩緩衝液5 mlで洗浄される。DNA溶液は、カラムマトリクスにDNAを
結合するためにカラムに3回通される。低濃度塩緩衝液3 mlで1回洗浄後、DNAは0
.4mlの高濃度緩衝液で溶解され、エタノール2容量により沈殿される。DNA濃度は
UV分光光度計において260 nmでの吸収度により測定される。顕微注射に関しては
、DNA濃度が5mM Trisで3μg/ml、pH7.4、0.1mMEDTAに補正された。
ンドは臭化エチジウムを使用した染色により視覚化され、発現配列を含むそのバ
ンドは切除される。切除されたバンドはその後0.3M酢酸ナトリウム、pH 7.0を含
む透析バッグの中に置かれる。DNAは透析バッグの中に電気溶離されて入れられ 、1：1フェノール：クロロホルム溶液で抽出され、エタノールの2容量により沈 殿される。DNAは低濃度塩緩衝液1ml（0.2 M NaCl、20 mM Tris、pH 7.4、1 mM E
DTA）で再溶解され、Elutip-DTMカラム上で精製される。カラムは最初、高濃度 塩緩衝液3 ml（1 M NaCl、20 mM Tris、pH 7.4、1 mM EDTA）により開始され、 その後低濃度塩緩衝液5 mlで洗浄される。DNA溶液は、カラムマトリクスにDNAを
結合するためにカラムに3回通される。低濃度塩緩衝液3 mlで1回洗浄後、DNAは0
.4mlの高濃度緩衝液で溶解され、エタノール2容量により沈殿される。DNA濃度は
UV分光光度計において260 nmでの吸収度により測定される。顕微注射に関しては
、DNA濃度が5mM Trisで3μg/ml、pH7.4、0.1mMEDTAに補正された。
【００５０】 顕微注射用DNAの精製のための他の方法は、Hoganら編『マウス胚の操作；ラボ
マニュアル（Manipulating the Mouse Embryo；A Laboratory Manual）』（Cold
Spring Harbor Laboratory Press刊、1986年、Palmiterら、Nature300：611（1
982）、『キアゲノロジスト、アプリケーションプロトコル（Qiagenologist, Ap
plication Protocols）』第３版、Quiagen Inc.刊、カリフォルニア州チャット ワース市、Sambrookら編『分子クローニング；ラボマニュアル（Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual）』（Cold Spring Harbor Laboratory Press刊、ニ ューヨーク州コールドスプリングハーバー市、1989年、に説明されている。
マニュアル（Manipulating the Mouse Embryo；A Laboratory Manual）』（Cold
Spring Harbor Laboratory Press刊、1986年、Palmiterら、Nature300：611（1
982）、『キアゲノロジスト、アプリケーションプロトコル（Qiagenologist, Ap
plication Protocols）』第３版、Quiagen Inc.刊、カリフォルニア州チャット ワース市、Sambrookら編『分子クローニング；ラボマニュアル（Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual）』（Cold Spring Harbor Laboratory Press刊、ニ ューヨーク州コールドスプリングハーバー市、1989年、に説明されている。
【００５１】 実例としての顕微注射手順では、6週齢の雌マウスは、妊娠雌馬血清ゴナドト ロピン（PMSG；Sigma製）の5 IU注射（0.1cc、腹腔内）により、また48時間後に
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG；Sigma製）の5 IU注射（0.1cc、腹腔内）によ り過剰排卵することを誘発される。雌はhCG注射直後に雄により交配される。hCG
注射後21時間で、交配された雌はCO2窒息あるいは頚部転位により犠牲にされ、 胚は切除された卵管から回収され、0.5%ウシ血清アルブミン（BSA；Sigma製）を
加えたDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水に置かれる。周辺の蓄積細胞はヒアルロ
ニダーゼ（1mg/ml）により除去される。前核胚はその後洗浄され、注射時まで5%
CO2、95%空気で湿気を含んだ大気により37.5℃定温器で0.5%BSA（EBSS）を含む
Earleの平衡食塩溶液の中に置かれる。胚は2つの細胞の段階で植え付けることが
できる。
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG；Sigma製）の5 IU注射（0.1cc、腹腔内）によ り過剰排卵することを誘発される。雌はhCG注射直後に雄により交配される。hCG
注射後21時間で、交配された雌はCO2窒息あるいは頚部転位により犠牲にされ、 胚は切除された卵管から回収され、0.5%ウシ血清アルブミン（BSA；Sigma製）を
加えたDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水に置かれる。周辺の蓄積細胞はヒアルロ
ニダーゼ（1mg/ml）により除去される。前核胚はその後洗浄され、注射時まで5%
CO2、95%空気で湿気を含んだ大気により37.5℃定温器で0.5%BSA（EBSS）を含む
Earleの平衡食塩溶液の中に置かれる。胚は2つの細胞の段階で植え付けることが
できる。
【００５２】 無作為な周期の成体雌マウスが精管切除された雄とつがいにされる。C57BL/6あ るいはスイスマウスあるいは他の匹敵する系はこの目的のために使用することが
できる。受容者の雌は供与者の雄と同時に交配させる。胚転位時に、受容者の雌
は、 体重グラム当たり2.5% アバーチン0.015 ml腹腔内注射により麻酔をか けられる。卵管は単一正中線背部表面切開により露出させる。切開はその後、体
壁を通じて卵管の上で直接的に行われる。卵巣嚢はその後時計工鉗子で断裂され
る。転移されるべき胚はDPBS（Dulbeccoリン酸緩衝生理食塩水）の中に置き、転
移ピペットの先端（約10〜12個の胚）に入れる。ピペットの先端は卵管漏斗の中
に挿入され、胚は転移される。転移後、切除箇所が2針で縫合されて閉じられる 。
できる。受容者の雌は供与者の雄と同時に交配させる。胚転位時に、受容者の雌
は、 体重グラム当たり2.5% アバーチン0.015 ml腹腔内注射により麻酔をか けられる。卵管は単一正中線背部表面切開により露出させる。切開はその後、体
壁を通じて卵管の上で直接的に行われる。卵巣嚢はその後時計工鉗子で断裂され
る。転移されるべき胚はDPBS（Dulbeccoリン酸緩衝生理食塩水）の中に置き、転
移ピペットの先端（約10〜12個の胚）に入れる。ピペットの先端は卵管漏斗の中
に挿入され、胚は転移される。転移後、切除箇所が2針で縫合されて閉じられる 。
【００５３】 上述のように、こうした動物から誘導されたトランスジェニック動物と細胞系は
ある種の試験的実験の中で用途を見出す可能性がある。この点に関しては、突然
変異NF-AT3を発現させることができるトランスジェニック動物と細胞系は薬物を
試験するのに供せられる。これらの試験物質はNF-AT3発現ないしは機能を減らす
、あるいは発現を減ずる能力に関してスクリーニングすることができる。こうし
た手順により同定された組成物は心疾患の治療において有用であろう。
ある種の試験的実験の中で用途を見出す可能性がある。この点に関しては、突然
変異NF-AT3を発現させることができるトランスジェニック動物と細胞系は薬物を
試験するのに供せられる。これらの試験物質はNF-AT3発現ないしは機能を減らす
、あるいは発現を減ずる能力に関してスクリーニングすることができる。こうし
た手順により同定された組成物は心疾患の治療において有用であろう。
【００５４】 ４．トランスジェニックマウスとその用途 本発明のトランスジェニック動物には、非トランスジェニック動物同腹子と比較
した場合に、自発的に心肥大を発症する確率が実質的に増加しているものが含ま
れている。心肥大を自発的に発症する確率が「実質的に増加する」ということは
、心肥大の測定可能な症状の統計的に有意な増加が、非トランスジェニック同腹
子とトランスジェニック動物を比較する際に、観察されることを意味する。
した場合に、自発的に心肥大を発症する確率が実質的に増加しているものが含ま
れている。心肥大を自発的に発症する確率が「実質的に増加する」ということは
、心肥大の測定可能な症状の統計的に有意な増加が、非トランスジェニック同腹
子とトランスジェニック動物を比較する際に、観察されることを意味する。
【００５５】 本発明のトランスジェニック動物は、肥大型シグナルに応答して心筋細胞で発現
される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する、1つの遺伝子生成物をコードす
るコード領域を含むトランス遺伝子により産生される。
される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する、1つの遺伝子生成物をコードす
るコード領域を含むトランス遺伝子により産生される。
【００５６】 本明細書で使用されているように、「肥大型シグナル」は心肥大の測定可能な
症状に結果としてなる、何らかの機械的ないしは化学的刺激を示す。肥大型シグ
ナルには、機械的な伸張、β-アドレナリン作動性アンタゴ二スト、α1-アドレ ナリン作動性受容体アンタゴ二スト、アンギオテンシンIIに限定されるわけでは
ないが、それらが含まれる。心肥大の症状は、左心室質量/体重比、心筋細胞の 大きさと組織の変化、心臓遺伝子発現の変化、心機能の変化に限定されるわけで
はないが、それを含む様々なパラメータで測定ができる。
症状に結果としてなる、何らかの機械的ないしは化学的刺激を示す。肥大型シグ
ナルには、機械的な伸張、β-アドレナリン作動性アンタゴ二スト、α1-アドレ ナリン作動性受容体アンタゴ二スト、アンギオテンシンIIに限定されるわけでは
ないが、それらが含まれる。心肥大の症状は、左心室質量/体重比、心筋細胞の 大きさと組織の変化、心臓遺伝子発現の変化、心機能の変化に限定されるわけで
はないが、それを含む様々なパラメータで測定ができる。
【００５７】 トランスジェニックマウスを構築する際に使用するためのコード領域には、NF
-AT遺伝子、とくにNF-AT3が含まれる。GATA4トランスジェニックマウスもまた企
図されている。コード領域は、ポリペプチドの所望の機能が維持されている間、
完全なポリペプチド、あるいはその断片をコードする、すなわち、そのポリペプ
チドは肥大型シグナルに応答して心筋細胞に発現させられる少なくとも1つの遺 伝子の転写を調節することができる。本発明のトランス遺伝子を構築する際に使
用するためのコード領域にはさらに、サイレント突然変異、さらに活性タンパク
質に結果的になる突然変異、構成的に活性タンパク質に結果的になる突然変異、
活性が減少するタンパク質に結果的になる突然変異などの突然変異を含むそうし
た領域が含まれる。NF-AT3が、本明細書で同定されているように、以下の論議は
NF-AT3トランスジェニックマウスを基礎とするが、動物の肥大型応答を仲介する
かぎりは、本明細書に提供された教えは、NF-AT3の効果の上流あるいは下流にも
心肥大を及ぼす可能性がある他のトランス遺伝子にも等しく適用可能であること
が分かる。
-AT遺伝子、とくにNF-AT3が含まれる。GATA4トランスジェニックマウスもまた企
図されている。コード領域は、ポリペプチドの所望の機能が維持されている間、
完全なポリペプチド、あるいはその断片をコードする、すなわち、そのポリペプ
チドは肥大型シグナルに応答して心筋細胞に発現させられる少なくとも1つの遺 伝子の転写を調節することができる。本発明のトランス遺伝子を構築する際に使
用するためのコード領域にはさらに、サイレント突然変異、さらに活性タンパク
質に結果的になる突然変異、構成的に活性タンパク質に結果的になる突然変異、
活性が減少するタンパク質に結果的になる突然変異などの突然変異を含むそうし
た領域が含まれる。NF-AT3が、本明細書で同定されているように、以下の論議は
NF-AT3トランスジェニックマウスを基礎とするが、動物の肥大型応答を仲介する
かぎりは、本明細書に提供された教えは、NF-AT3の効果の上流あるいは下流にも
心肥大を及ぼす可能性がある他のトランス遺伝子にも等しく適用可能であること
が分かる。
【００５８】 本発明の1つの実施形態では、NF-AT3の活性化した形態を発現するトランスジ ェニック動物が提供されている。「活性化されているNF-AT3遺伝子」によりとい
う表現により、NF-AT3遺伝子は核に転移することが可能である機能的なタンパク
質を発現させることを意味する。動物の好適な形態は、カルシニューリンの作用
により正常であれば除去されるリン酸化部位の切断あるいは置換を含むマウスで
ある。驚くべきことに、構成的に活性化されたNF-AT3遺伝子を発現させるトラン
スジェニックマウスの心臓は、ヒト心不全の分子上の応答および病理生理学的応
答に非常な類似性を示す。
う表現により、NF-AT3遺伝子は核に転移することが可能である機能的なタンパク
質を発現させることを意味する。動物の好適な形態は、カルシニューリンの作用
により正常であれば除去されるリン酸化部位の切断あるいは置換を含むマウスで
ある。驚くべきことに、構成的に活性化されたNF-AT3遺伝子を発現させるトラン
スジェニックマウスの心臓は、ヒト心不全の分子上の応答および病理生理学的応
答に非常な類似性を示す。
【００５９】 本発明のトランスジェニックマウスは異なった様々な用途を有している。まず
最初に、NF-AT3が定常的に活性化されている動物モデルを作成することにより、
本発明者はNF-AT3の機能をさらに詳細に分析することが可能な、生きている「容
器」を提供した。例えば、欠失変異体、置換変異体、挿入変異体、標識化ないし
は標識化されていない断片および野生型タンパク質などのNF-AT3の様々な形態を
用意することで、以前はできなかった心肥大についての数多くの研究が可能にな
った。
最初に、NF-AT3が定常的に活性化されている動物モデルを作成することにより、
本発明者はNF-AT3の機能をさらに詳細に分析することが可能な、生きている「容
器」を提供した。例えば、欠失変異体、置換変異体、挿入変異体、標識化ないし
は標識化されていない断片および野生型タンパク質などのNF-AT3の様々な形態を
用意することで、以前はできなかった心肥大についての数多くの研究が可能にな
った。
【００６０】 1つの特定なシナリオでは、トランスジェニックマウスはGATA4などの付加的な
核因子とのNF-AT3の相互作用を解明するのに使用することができる。このように
、はっきりと、本発明はまた、NF-AT3との相互作用を介して作用する核因子の分
離を達成している。
核因子とのNF-AT3の相互作用を解明するのに使用することができる。このように
、はっきりと、本発明はまた、NF-AT3との相互作用を介して作用する核因子の分
離を達成している。
【００６１】 本発明のトランスジェニックマウスのもう1つの用途は、NF-AT3活性の活性調 節因子のin vivoでの同定、最終的には心肥大のin vivoでの同定にある。トラン
スジェニックマウスにおける構成的に活性なNF-AT3が存在することは、100%NF-A
T3仲介心肥大機能が存在することを表す。推定NF-AT3阻害薬によるトランスジェ
ニックマウスの治療と、本治療マウスの肥大型応答と非治療トランスジェニック
動物との比較は、候補となる阻害薬の活性を評価する手段を提供する。
スジェニックマウスにおける構成的に活性なNF-AT3が存在することは、100%NF-A
T3仲介心肥大機能が存在することを表す。推定NF-AT3阻害薬によるトランスジェ
ニックマウスの治療と、本治療マウスの肥大型応答と非治療トランスジェニック
動物との比較は、候補となる阻害薬の活性を評価する手段を提供する。
【００６２】 本明細書で説明されているNF-AT3トランスジェニックマウスのさらにもう1つ の用途は、心肥大のための新しい疾患モデルを提供することである。実施例の中
のデータで示されているように、本発明のトランスジェニックマウスは心肥大の
すべての臨床的な特徴を示す。このように、NF-AT3トランスジェニックマウスは
心疾患の研究のための新規なモデルを提供する。本モデルは心肥大を潜在的な阻
害し、また心疾患を治療する組成物により動物を治療することによって用いられ
ることができた。
のデータで示されているように、本発明のトランスジェニックマウスは心肥大の
すべての臨床的な特徴を示す。このように、NF-AT3トランスジェニックマウスは
心疾患の研究のための新規なモデルを提供する。本モデルは心肥大を潜在的な阻
害し、また心疾患を治療する組成物により動物を治療することによって用いられ
ることができた。
【００６３】 ５．心疾患の治療 Ca++仲介経路はある種の心疾患に関与していることが報告されているが、本発
明は、肥大型応答の中心となるメディエーターとしてのNF-AT3に関する初めての
証拠を提供する。本質的には、Ca++-依存性タンパク質カルシニューリンは脱リ ン酸化により細胞質のNF-AT3を活性化することが見つかっている。脱リン酸化NF
-AT3は、GATA4と相互作用し、肥大型応答に関与する遺伝子をアップレギュレー ションする場所である核の中に移される（ 例えば、α-骨格アクチン、β-MHC 、ANF、BNP）。
明は、肥大型応答の中心となるメディエーターとしてのNF-AT3に関する初めての
証拠を提供する。本質的には、Ca++-依存性タンパク質カルシニューリンは脱リ ン酸化により細胞質のNF-AT3を活性化することが見つかっている。脱リン酸化NF
-AT3は、GATA4と相互作用し、肥大型応答に関与する遺伝子をアップレギュレー ションする場所である核の中に移される（ 例えば、α-骨格アクチン、β-MHC 、ANF、BNP）。
【００６４】 このように、本発明の1つの具体的な実施形態では、心肥大の治療のための方 法が提供される。これらの方法は、NF-AT3が肥大型応答に関与する遺伝子の発現
をアップレギュレーションしているようにみえるという、以下に詳細に説明され
る、本発明者の観察結果を用いている。その最も基本的なところでは、本実施形
態は肥大型応答を蒙ったことがあること、肥大型応答を現在蒙っていること、あ
るいは心肥大になる危険性に陥っていることが疑われる個人におけるNF-AT3のin
vivoでの活性を減少させることにより機能する。これはいくつかの異なったメ カニズムのうちの1つにより達成することが可能である。まず第1に、NF-AT3タン
パク質の発現を阻止することが考えられる。第2に、NF-AT3タンパク質に結合す るあるいはそれを不活性化する薬剤を提供することによりNF-AT3タンパク質の機
能を直接的に阻止することが考えられる。第3には、GATA4などの1つないしはそ れ以上のNF-AT3の標的、あるいはα-骨格アクチン、β-MHC、ANF、BNPなどの、G
ATA4とNF-AT3の相互作用により影響を受けた遺伝子を干渉することによりNF-AT3
の効果を間接的に阻止することが考えられる。
をアップレギュレーションしているようにみえるという、以下に詳細に説明され
る、本発明者の観察結果を用いている。その最も基本的なところでは、本実施形
態は肥大型応答を蒙ったことがあること、肥大型応答を現在蒙っていること、あ
るいは心肥大になる危険性に陥っていることが疑われる個人におけるNF-AT3のin
vivoでの活性を減少させることにより機能する。これはいくつかの異なったメ カニズムのうちの1つにより達成することが可能である。まず第1に、NF-AT3タン
パク質の発現を阻止することが考えられる。第2に、NF-AT3タンパク質に結合す るあるいはそれを不活性化する薬剤を提供することによりNF-AT3タンパク質の機
能を直接的に阻止することが考えられる。第3には、GATA4などの1つないしはそ れ以上のNF-AT3の標的、あるいはα-骨格アクチン、β-MHC、ANF、BNPなどの、G
ATA4とNF-AT3の相互作用により影響を受けた遺伝子を干渉することによりNF-AT3
の効果を間接的に阻止することが考えられる。
【００６５】 本発明の治療的組成物は心臓の病状のための、アスピリン、硝酸塩、ベータ遮
断薬などの現行の治療法の投与法と同様の方法で投与することが可能である。こ
のように、治療用製剤は飲み込めるように（アスピリンと同様に）、あるいは舌
下で溶けるように（硝酸塩と同様に）錠剤の形態の経口投与用である。これらの
薬剤はまた皮膚に貼り付けるパッチとして、あるいは皮膚に適用する局所用クリ
ームとして提供することができる。
断薬などの現行の治療法の投与法と同様の方法で投与することが可能である。こ
のように、治療用製剤は飲み込めるように（アスピリンと同様に）、あるいは舌
下で溶けるように（硝酸塩と同様に）錠剤の形態の経口投与用である。これらの
薬剤はまた皮膚に貼り付けるパッチとして、あるいは皮膚に適用する局所用クリ
ームとして提供することができる。
【００６６】 a. NF-AT3発現の阻止 NF-AT3発現を阻止するための最も直接的な方法はアンチセンス技術によるもので
ある。「アンチセンス」という用語は、NF-AT3 RNAの一部に相補的なポリペプチ
ド分子、あるいはDNAのそれに対応するものへの言及を意図する。「相補的」ポ リペプチドは、標準的なワトソン-クリック相補性則にしたがって塩基対合が可 能なポリペプチドである。それは、より大きなプリンが、シトシンと対合するグ
アニン（G：C）、DNAの場合はチミンと対合するアデニン（A：T）、あるいはRNA
の場合はウラシルと対合するアデニン（A：U）の組み合わせを形成するために、
より小さなピリミジンとの塩基対合を行うことである。配列をハイブリッド形成
する際にイノシン、5-メチルシトシン、6-メチルアデニン、ヒポキサンチンやそ
の他などの、より共通ではない塩基を包含することは、対合を干渉しない。
ある。「アンチセンス」という用語は、NF-AT3 RNAの一部に相補的なポリペプチ
ド分子、あるいはDNAのそれに対応するものへの言及を意図する。「相補的」ポ リペプチドは、標準的なワトソン-クリック相補性則にしたがって塩基対合が可 能なポリペプチドである。それは、より大きなプリンが、シトシンと対合するグ
アニン（G：C）、DNAの場合はチミンと対合するアデニン（A：T）、あるいはRNA
の場合はウラシルと対合するアデニン（A：U）の組み合わせを形成するために、
より小さなピリミジンとの塩基対合を行うことである。配列をハイブリッド形成
する際にイノシン、5-メチルシトシン、6-メチルアデニン、ヒポキサンチンやそ
の他などの、より共通ではない塩基を包含することは、対合を干渉しない。
【００６７】 ポリペプチドを伴う二本鎖（ds）DNAを標的にすることは、三重らせん形成に繋 がる。すなわち、RNAを標的にすることは二重らせん形成に繋がる。アンチセン スポリペプチドは、標的細胞の中に導入されるときには、その標的ポリペプチド
に特異的に結合し、また転写、RNAプロセシング、輸送、翻訳および/または安定
性に干渉する。アンチセンスRNA構築物、あるいはこうしたアンチセンスRNAの構
築物をコードするDNAは、ヒトの対象者を含めた宿主動物内などの、in vitroあ るいはin vivoのいずれかで、宿主細胞内で遺伝子転写あるいは翻訳あるいはそ の両方を阻害するのに用いられることが考えられる。
に特異的に結合し、また転写、RNAプロセシング、輸送、翻訳および/または安定
性に干渉する。アンチセンスRNA構築物、あるいはこうしたアンチセンスRNAの構
築物をコードするDNAは、ヒトの対象者を含めた宿主動物内などの、in vitroあ るいはin vivoのいずれかで、宿主細胞内で遺伝子転写あるいは翻訳あるいはそ の両方を阻害するのに用いられることが考えられる。
【００６８】 アンチセンス構築物は、プロモーターや他の制御領域、エキソン、イントロン
、あるいは1つの遺伝子のエキソン-イントロン境界にも結合するように設計され
ていることが考えられる。本発明に関する最も効果的なアンチセンス構築物には
mRNA開始部位に相補的な領域が含まれることが企図されている。標的タンパク質
の値が影響を受けているかどうかを判定するために、in vitroでその構築物を試
験することによって簡単に、そうした構築物を容易に試験することができる。同
様に、タンパク質合成の有害な、非特異的な阻害はまた、in vitroでの標的細胞
生存率を測定することにより、測定することができる。
、あるいは1つの遺伝子のエキソン-イントロン境界にも結合するように設計され
ていることが考えられる。本発明に関する最も効果的なアンチセンス構築物には
mRNA開始部位に相補的な領域が含まれることが企図されている。標的タンパク質
の値が影響を受けているかどうかを判定するために、in vitroでその構築物を試
験することによって簡単に、そうした構築物を容易に試験することができる。同
様に、タンパク質合成の有害な、非特異的な阻害はまた、in vitroでの標的細胞
生存率を測定することにより、測定することができる。
【００６９】 本明細書で使用されている、「相補的」あるいは「アンチセンス」という用語は
、実質的にその全長にわたって相補的であり、またほとんど塩基の誤対合がない
ポリペプチドを意味する。例えば、15塩基の長さの配列は、それらが15のうち、
13ないしは14のヌクレオチドで相補的なヌクレオチドを有している場合には、相
補的であると称することができる。自然に、「完全に相補的」である配列はその
全長を通じて全体に相補的であり、またまったく塩基の誤対合がない配列となる
。
、実質的にその全長にわたって相補的であり、またほとんど塩基の誤対合がない
ポリペプチドを意味する。例えば、15塩基の長さの配列は、それらが15のうち、
13ないしは14のヌクレオチドで相補的なヌクレオチドを有している場合には、相
補的であると称することができる。自然に、「完全に相補的」である配列はその
全長を通じて全体に相補的であり、またまったく塩基の誤対合がない配列となる
。
【００７０】 相同性がより低い程度である他の配列もまた企図されている。例えば、高度な相
同性に関して限定された領域を有しながら、非相同領域（例えば、リボザイム）
を含んでいるアンチセンス構築物は、設計が可能であった。これらの分子は、50
%未満の相同性しか有していないが、適当な条件下であれば標的配列に結合され ることになるであろう。
同性に関して限定された領域を有しながら、非相同領域（例えば、リボザイム）
を含んでいるアンチセンス構築物は、設計が可能であった。これらの分子は、50
%未満の相同性しか有していないが、適当な条件下であれば標的配列に結合され ることになるであろう。
【００７１】 本発明によるポリペプチドは、NF-AT3遺伝子、あるいはタンパク質発現のアンチ
センス阻害に影響を及ぼすのに十分なそうした遺伝子の一部分をコードすると考
えられる。ポリペプチドはゲノムDNAから誘導され、すなわち、特定の生物体の ゲノムから直接クローニングされる可能性がある。しかし、他の実施形態では、
ポリペプチドは相補的DNA（cDNA）であると考えられる。cDNAは鋳型としてメッ センジャーRNA（mRNA）を使用して作成されたDNAである。このように、cDNAは何
らかの切断コード配列を包含してはおらず、また通常は対応するタンパク質に関
するコード領域（単数/複数）をほとんど排他的に包含している。他の実施形態 では、アンチセンスポリペプチドは合成的に産生されることがある。
センス阻害に影響を及ぼすのに十分なそうした遺伝子の一部分をコードすると考
えられる。ポリペプチドはゲノムDNAから誘導され、すなわち、特定の生物体の ゲノムから直接クローニングされる可能性がある。しかし、他の実施形態では、
ポリペプチドは相補的DNA（cDNA）であると考えられる。cDNAは鋳型としてメッ センジャーRNA（mRNA）を使用して作成されたDNAである。このように、cDNAは何
らかの切断コード配列を包含してはおらず、また通常は対応するタンパク質に関
するコード領域（単数/複数）をほとんど排他的に包含している。他の実施形態 では、アンチセンスポリペプチドは合成的に産生されることがある。
【００７２】 特異的な構築物を生成するために、ゲノムDNAの部分とcDNAあるいは合成配列を 組み合わせることは利得があることであろう。例えば、イントロンが最終的な構
築物において所望される場合には、ゲノムクローンが使用されることが必要とな
る。cDNAあるいは合成ポリペプチドは、構築物の残りの部分に対する都合のよい
部位をさらに提供し、したがって、その配列の残りのために使用されることにな
る。
築物において所望される場合には、ゲノムクローンが使用されることが必要とな
る。cDNAあるいは合成ポリペプチドは、構築物の残りの部分に対する都合のよい
部位をさらに提供し、したがって、その配列の残りのために使用されることにな
る。
【００７３】 ヒトのNF-AT3ファミリーメンバーに関するDNAとタンパク質配列が公表され、ま た米国特許第5,708,158号に開示されており、その全テキストが本明細書にとく に参照として掲載されている。本明細書で開示されているそうしたものよりも異
なった配列を有する存在する自然変異体が企図されている。このように、本発明
はNF-AT3に関する提供されたポリペプチド配列の使用法に限定されることはなく
、というよりも、いかなる自然に発生する変異体の使用法を含む。こうした変異
体の特定の配列に拠り、標的選択という見地からみると、付加的な長所を提供し
、すなわち、関連した転写の必要のないアンチセンス阻害を避ける。本発明には
また、これらの配列に関する化学的に合成された突然変異体が包含される。
なった配列を有する存在する自然変異体が企図されている。このように、本発明
はNF-AT3に関する提供されたポリペプチド配列の使用法に限定されることはなく
、というよりも、いかなる自然に発生する変異体の使用法を含む。こうした変異
体の特定の配列に拠り、標的選択という見地からみると、付加的な長所を提供し
、すなわち、関連した転写の必要のないアンチセンス阻害を避ける。本発明には
また、これらの配列に関する化学的に合成された突然変異体が包含される。
【００７４】 上述のように、アンチセンス配列は完全な長さのゲノムあるいはcDNAコピー、あ
るいはその大きな断片であることがあるが、アンチセンス配列はまたより短い断
片、あるいは50ないしはそれ未満の塩基のポリペプチドとして本明細書では定義
されている「オリゴヌクレオチド」であることもある。より短いオリゴヌクレオ
チド（8〜20）はin vivoでの接近可能性を生み出し、また増大させることがより
容易であるが、数多くの他の因子が塩基対合の特異性を決定することには関与し
ている。例えば、1つのオリゴヌクレオチドのその相補的な標的に対する結合親 和性と配列特異性の両方とも増大する長さとともに増大する。8、9、10、11、12
、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45ないしは50塩基対のオ
リゴヌクレオチドを使用することが企図される。遺伝子配列のすべてあるいは一
部がアンチセンス構築の文脈の中で用いられることがあるが、統計的には、17塩
基長のいずれの配列もヒトゲノムにおいてはたった一回しか起こらず、したがっ
て、ユニークな標的配列を特定するのには十分である。
るいはその大きな断片であることがあるが、アンチセンス配列はまたより短い断
片、あるいは50ないしはそれ未満の塩基のポリペプチドとして本明細書では定義
されている「オリゴヌクレオチド」であることもある。より短いオリゴヌクレオ
チド（8〜20）はin vivoでの接近可能性を生み出し、また増大させることがより
容易であるが、数多くの他の因子が塩基対合の特異性を決定することには関与し
ている。例えば、1つのオリゴヌクレオチドのその相補的な標的に対する結合親 和性と配列特異性の両方とも増大する長さとともに増大する。8、9、10、11、12
、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45ないしは50塩基対のオ
リゴヌクレオチドを使用することが企図される。遺伝子配列のすべてあるいは一
部がアンチセンス構築の文脈の中で用いられることがあるが、統計的には、17塩
基長のいずれの配列もヒトゲノムにおいてはたった一回しか起こらず、したがっ
て、ユニークな標的配列を特定するのには十分である。
【００７５】 ある実施形態では、他のエレメント、例えば、C-5プロピンピラミジンを含む そうしたエレメントを含めたアンチセンス構築物を用いたいと考えることがある
。ウリジン、シチジンのC-5プロピン類似体を含むオリゴヌクレオチドが、高い 親和性でRNAを結合し、遺伝子発現の潜在的なアンチセンス阻害薬であることが 示された。
。ウリジン、シチジンのC-5プロピン類似体を含むオリゴヌクレオチドが、高い 親和性でRNAを結合し、遺伝子発現の潜在的なアンチセンス阻害薬であることが 示された。
【００７６】 標的化アンチセンスデリバリーに対する代替物として、標的化リボザイムを使用
することが可能である。「リボザイム」という用語は、DNAとRNAの両方で特定の
塩基配列を標的にし、また切断することができるRNAをベースにした1つの酵素を
称する。リボザイムは、リボザイム配列を組み込んだRNAヌクレオチドの形態で 直接細胞を標的とするか、あるいは所望されるリボザイムRNAをコードする発現 ベクターとして細胞の中に導入するかのいずれかが可能である。リボザイムは、
アンチセンスポリヌクレオチドに関して説明されたのと多くの点で同じ方法で使
用、適用することが可能である。リボザイム配列はまた、アンチセンスポリヌク
レオチドに関して説明されたのと多くの点で同じ方法で修飾することができる。
例えば、非ワトソン-クリック塩基を組み込む、あるいはRNA/DNAオリゴヌクレオ
チドを混合する、あるいはリン酸ジエステルバックボーンを修飾する、あるいは
RNAのリボース糖基の中の2'−ヒドロキシを修飾することができる。
することが可能である。「リボザイム」という用語は、DNAとRNAの両方で特定の
塩基配列を標的にし、また切断することができるRNAをベースにした1つの酵素を
称する。リボザイムは、リボザイム配列を組み込んだRNAヌクレオチドの形態で 直接細胞を標的とするか、あるいは所望されるリボザイムRNAをコードする発現 ベクターとして細胞の中に導入するかのいずれかが可能である。リボザイムは、
アンチセンスポリヌクレオチドに関して説明されたのと多くの点で同じ方法で使
用、適用することが可能である。リボザイム配列はまた、アンチセンスポリヌク
レオチドに関して説明されたのと多くの点で同じ方法で修飾することができる。
例えば、非ワトソン-クリック塩基を組み込む、あるいはRNA/DNAオリゴヌクレオ
チドを混合する、あるいはリン酸ジエステルバックボーンを修飾する、あるいは
RNAのリボース糖基の中の2'−ヒドロキシを修飾することができる。
【００７７】 代替的には、本発明によるアンチセンスオリゴ-およびポリヌクレオチドは、オ リゴ‐あるいはポリヌクレオチドをコードする核酸を運ぶ発現構築物からの転写
によるRNAとして提供することができる。この適用により、「発現構築物」とい う用語は、核酸配列の一部あるいはすべてが転写可能であるアンチセンス生成物
をコードする核酸を含む遺伝子構築物のいずれかのタイプを包含することを意味
する。典型的な発現ベクターには、pUCあるいはBluescriptTMプラスミドシリー ズあるいは、さらに以下に論じているように、真核細胞に使用するために適応さ
れているウイルスベクターのいずれかなどの細菌プラスミドあるいはファージが
含まれる。
によるRNAとして提供することができる。この適用により、「発現構築物」とい う用語は、核酸配列の一部あるいはすべてが転写可能であるアンチセンス生成物
をコードする核酸を含む遺伝子構築物のいずれかのタイプを包含することを意味
する。典型的な発現ベクターには、pUCあるいはBluescriptTMプラスミドシリー ズあるいは、さらに以下に論じているように、真核細胞に使用するために適応さ
れているウイルスベクターのいずれかなどの細菌プラスミドあるいはファージが
含まれる。
【００７８】 好適な実施形態では、核酸はアンチセンス分子の発現をcis作用転写および翻訳 シグナルにより支持する複製可能なクローンビーイクルの中に置かれる。発現構
築物は、問題となっている遺伝子と、本明細書の以下に説明されているような様
々な調節エレメントと、を含むであろう。
築物は、問題となっている遺伝子と、本明細書の以下に説明されているような様
々な調節エレメントと、を含むであろう。
【００７９】 b. NF‐AT3機能の阻止 もう1つの実施形態では、NF‐AT3の発現を阻害するよりもNF‐AT3ポリペプチド の機能を阻止することが望ましいことがある。これはNF‐AT3の機能を干渉する 有機化学組成物の使用により、NF‐AT3上の活性部位あるいは結合部位を遮断す る抗体の使用により、あるいはNF‐AT3標的を真似る分子の使用により、達成す ることができる。
【００８０】 有機化学的阻害薬に関しては、こうした組成物は標準的なスクリーニング測定法
で同定可能である。例えば、NF‐AT3はカルシニューリン結合機能を所持してい ることが知られている。様々な候補となる薬物をNF‐AT3と接触させることがで き、その後処理されたNF‐AT3がカルシニューリンを結合する能力をさらに測定 することができる。代替的には、NF‐AT3が、カルシニューリンにより脱リン酸 化の結果として活性化され、また肥大型応答のアップレギュレーションを生み出
すのはこの活性化であるという知識が得られたので、今では適当な動物、例えば
、マウスにin vivoで阻害薬を提供し、心肥大が軽減するのを期待できる。一度 確認されれば、こうした阻害薬は治療的な文脈の中でNF‐AT3機能を阻害するの に使用することが可能である。
で同定可能である。例えば、NF‐AT3はカルシニューリン結合機能を所持してい ることが知られている。様々な候補となる薬物をNF‐AT3と接触させることがで き、その後処理されたNF‐AT3がカルシニューリンを結合する能力をさらに測定 することができる。代替的には、NF‐AT3が、カルシニューリンにより脱リン酸 化の結果として活性化され、また肥大型応答のアップレギュレーションを生み出
すのはこの活性化であるという知識が得られたので、今では適当な動物、例えば
、マウスにin vivoで阻害薬を提供し、心肥大が軽減するのを期待できる。一度 確認されれば、こうした阻害薬は治療的な文脈の中でNF‐AT3機能を阻害するの に使用することが可能である。
【００８１】 抗体に関しては、すべての抗体がその標的について同じ機能的な効果を有してい
るとは考えられない点に注意すべきである。これは抗体の異なった特異性とその
性質、すなわち、そのイソ型の両方から生じる。このように、これはオステオカ
ルシンに対する数多くの異なった単クローン性および多クローン性製剤を生成す
るのに有用であろう。これはまた、抗オステオカルシン抗体に対する抗イディオ
タイプ抗体を生成するのに有用であることも証明されるであろう。これらの組成
物はGATA4や他の核転写因子などのNF‐AT3推定結合パートナーに対するプローブ
として使用することができる。
るとは考えられない点に注意すべきである。これは抗体の異なった特異性とその
性質、すなわち、そのイソ型の両方から生じる。このように、これはオステオカ
ルシンに対する数多くの異なった単クローン性および多クローン性製剤を生成す
るのに有用であろう。これはまた、抗オステオカルシン抗体に対する抗イディオ
タイプ抗体を生成するのに有用であることも証明されるであろう。これらの組成
物はGATA4や他の核転写因子などのNF‐AT3推定結合パートナーに対するプローブ
として使用することができる。
【００８２】 抗体が生成される方法は当業者には周知のことであり、また明細書のいずれかの
箇所に詳細が記されている。再び、NF‐AT3に結合する抗体が他の機能的属性に 関して、例えば、カルシニューリン結合の遮断に関しては、それらをin vivoで 実施する前にin vitroの測定法でスクリーニングすることができる。
箇所に詳細が記されている。再び、NF‐AT3に結合する抗体が他の機能的属性に 関して、例えば、カルシニューリン結合の遮断に関しては、それらをin vivoで 実施する前にin vitroの測定法でスクリーニングすることができる。
【００８３】 NF‐AT3の作用を阻止するためにとくに有用な抗体は単鎖抗体である。単鎖抗体 の産生方法は当業者には周知のことである。熟練した技術者であれば、そうした
方法について、米国特許第5,359,046号（本明細書に参照として記載）を参照す る。単鎖抗体は、本発明には好適なものであり、短いペプチドリンカーを使用し
て重鎖と軽鎖の可変ドメインを一緒に融合することにより作成され、それによっ
て単一分子上で抗体結合部位を再構成する。
方法について、米国特許第5,359,046号（本明細書に参照として記載）を参照す る。単鎖抗体は、本発明には好適なものであり、短いペプチドリンカーを使用し
て重鎖と軽鎖の可変ドメインを一緒に融合することにより作成され、それによっ
て単一分子上で抗体結合部位を再構成する。
【００８４】 1つの可変ドメインのC‐末端が15〜20アミノ酸ペプチドないしはリンカーを介し
て他方のN‐末端に繋ぎ止められている単鎖抗体可変断片（Fvs）は、抗体結合あ
るいは結合の特異性を有意には妨害せずに作り出されてきた（Bedzykら、1990；
Chaudharyら、1990）。これらのFvsは在来抗体の重鎖と軽鎖の中に存在する定常
領域（Fc）を欠いている。
て他方のN‐末端に繋ぎ止められている単鎖抗体可変断片（Fvs）は、抗体結合あ
るいは結合の特異性を有意には妨害せずに作り出されてきた（Bedzykら、1990；
Chaudharyら、1990）。これらのFvsは在来抗体の重鎖と軽鎖の中に存在する定常
領域（Fc）を欠いている。
【００８５】 NF‐AT3標的を真似る阻害薬に関しては、擬似物の使用法ではカスタム設計の分 子の1例が提供される。こうした分子は、とくにNF‐AT3タンパク質活性あるいは
GATA4への結合を阻害する小さな分子阻害薬でありうる。こうした分子は、少な くとも標的の構造およびまたは有機学的構造の主要な部分では実際の標的組成物
に原子の立体的に配置に関して類似している。代替的にはこれら阻害薬はペプチ
ド組成物であり、これらはペプチド擬似物と呼ばれている。ペプチド擬似品はタ
ンパク質二次構造のエレメントを真似るペプチド含有分子である。これについて
は、例えば、Johnsonら（1993）を参照のこと。ペプド擬似物の使用の背後にあ る根本的理由は主に、タンパク質のペプチドバックボーンが、リガンドと受容体
の相互作用といった分子の相互作用を容易にするような、そうしたやり方でアミ
ノ酸側鎖を配向することにある。本発明の実例としてのペプチド擬似物は、対象
者に対して投与される場合には、GATA4に類似する方法でNF‐AT3に結合すること
になる。
GATA4への結合を阻害する小さな分子阻害薬でありうる。こうした分子は、少な くとも標的の構造およびまたは有機学的構造の主要な部分では実際の標的組成物
に原子の立体的に配置に関して類似している。代替的にはこれら阻害薬はペプチ
ド組成物であり、これらはペプチド擬似物と呼ばれている。ペプチド擬似品はタ
ンパク質二次構造のエレメントを真似るペプチド含有分子である。これについて
は、例えば、Johnsonら（1993）を参照のこと。ペプド擬似物の使用の背後にあ る根本的理由は主に、タンパク質のペプチドバックボーンが、リガンドと受容体
の相互作用といった分子の相互作用を容易にするような、そうしたやり方でアミ
ノ酸側鎖を配向することにある。本発明の実例としてのペプチド擬似物は、対象
者に対して投与される場合には、GATA4に類似する方法でNF‐AT3に結合すること
になる。
【００８６】 ペプチド擬似物構想の成功適用例では、高度に抗原的であることが知られている
タンパク質内のβ‐ターンの擬似物にこれまでこのように焦点が当てられてきた
。本発明の抗原内のβ‐ターン構造はおそらく、上述に論議されたように、コン
ピュータをベースにしたアルゴリズムにより予測することができる。一度そのタ
ーンの組成アミノ酸が判明されれば、擬似物は、Johnsonら（1993）で論議され ているように、構築されて、アミノ酸側鎖の主要なエレメントの類似の空間配向
を達成することができる。
タンパク質内のβ‐ターンの擬似物にこれまでこのように焦点が当てられてきた
。本発明の抗原内のβ‐ターン構造はおそらく、上述に論議されたように、コン
ピュータをベースにしたアルゴリズムにより予測することができる。一度そのタ
ーンの組成アミノ酸が判明されれば、擬似物は、Johnsonら（1993）で論議され ているように、構築されて、アミノ酸側鎖の主要なエレメントの類似の空間配向
を達成することができる。
【００８７】 c. NF‐AT3の標的到達阻止 上述したように、本発明の利得の1つはNF‐AT3が作用する標的の同定である。こ
れらの標的は、α‐骨格アクチン、β‐MHC、ANF、BNPといった、活性化されたN
F‐AT3のGATA4との相互作用によりアップレギュレーションされるカルシニュー リンやGATA4あるいは他の遺伝子などの結合パートナーであることがある。これ らの標的とNF‐AT3が相互作用することを防ぐため、異なった様々なアプローチ を用いることができる。例えば、標的に対する抗体を生成し、その後に問題とな
っている対象にその抗体を提供することができ、それによってその標的分子に対
してNF‐AT3が到達するのを阻止することができる。
れらの標的は、α‐骨格アクチン、β‐MHC、ANF、BNPといった、活性化されたN
F‐AT3のGATA4との相互作用によりアップレギュレーションされるカルシニュー リンやGATA4あるいは他の遺伝子などの結合パートナーであることがある。これ らの標的とNF‐AT3が相互作用することを防ぐため、異なった様々なアプローチ を用いることができる。例えば、標的に対する抗体を生成し、その後に問題とな
っている対象にその抗体を提供することができ、それによってその標的分子に対
してNF‐AT3が到達するのを阻止することができる。
【００８８】 さらにもう1つの実施形態では、NF‐AT3結合パートナーがDNA分子であることに みられるように、NF‐AT3のその標的との相互作用を阻害するためにアンチセン ス方法論が用いられることがある。代替的には、NF‐AT3と同じようにNF‐AT3標
的と相互作用することができるが、しかしその標的にはNF‐AT3様の効果はない ポリペプチドあるいはペプチド擬似物を設計することができる。
的と相互作用することができるが、しかしその標的にはNF‐AT3様の効果はない ポリペプチドあるいはペプチド擬似物を設計することができる。
【００８９】 好適な1つの実施形態では、本発明はGATA4に競合的に結合する薬剤を提供する。
さらに好適な1つの実施形態では、その薬剤は、NF‐AT3よりもGATA4に対するよ り強力な親和性を有する。GATA4に対する親和性は結合率に関する速動性調査を 行うことによりin vitroで測定することができる。
さらに好適な1つの実施形態では、その薬剤は、NF‐AT3よりもGATA4に対するよ り強力な親和性を有する。GATA4に対する親和性は結合率に関する速動性調査を 行うことによりin vitroで測定することができる。
【００９０】 他の組成物は、NF‐AT3分子と同定された標的分子の両方ともに関して、コンピ ュータモデリングと予測高次数構造をベースにして作り出すことができる。この
アプローチは数多くの受容体‐リガンド相互作用に対する阻害薬を開発する際に
うまくいくことが証明されている。
アプローチは数多くの受容体‐リガンド相互作用に対する阻害薬を開発する際に
うまくいくことが証明されている。
【００９１】 ６．遺伝子構築物ならびに遺伝子転移 本発明の具体的な形態では、発現構築の中に様々な心臓遺伝子を置き、それら
の発現をモニターすることが望ましい。例えば、BNP、MHCなどといった心肥大遺
伝子は、培養心筋細胞の中に肥大感受性遺伝子あるいは遺伝子（複数）に操作可
能にリンクされているプロモーターを含む発現構築物を導入することで試験し、
また肥大感受性遺伝子あるいは遺伝子（複数）の発現をモニターすることができ
る。トランスジェニック動物を生成するのにも使用されている発現構築物には、
動物の細胞における構築物の発現のためのプロモーターと肥大型シグナルに応答
して心筋細胞で発現する少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子生成物 をコードする領域が含まれている。他の実施形態では、アンチセンスオリゴ‐あ
るいはポリペプチドをコードする発現構築物は、上記で論議した治療目的に対す
るアンチセンス分子の発現を支持する複製可能なクローンビーイクルの中に置か
れる。
の発現をモニターすることが望ましい。例えば、BNP、MHCなどといった心肥大遺
伝子は、培養心筋細胞の中に肥大感受性遺伝子あるいは遺伝子（複数）に操作可
能にリンクされているプロモーターを含む発現構築物を導入することで試験し、
また肥大感受性遺伝子あるいは遺伝子（複数）の発現をモニターすることができ
る。トランスジェニック動物を生成するのにも使用されている発現構築物には、
動物の細胞における構築物の発現のためのプロモーターと肥大型シグナルに応答
して心筋細胞で発現する少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子生成物 をコードする領域が含まれている。他の実施形態では、アンチセンスオリゴ‐あ
るいはポリペプチドをコードする発現構築物は、上記で論議した治療目的に対す
るアンチセンス分子の発現を支持する複製可能なクローンビーイクルの中に置か
れる。
【００９２】 a. 遺伝子構築物 本適用法により、「発現構築物」という用語は、核酸コード配列の一部あるい
はすべてが転写されることが可能である遺伝子生成物をコードする核酸を含む遺
伝子構築物のいずれのタイプをも含むことを意味する。転写はタンパク質に翻訳
することができるが、しかしその必要はない。ある実施形態では、発現には遺伝
子の転写と、遺伝子生成物へのmRNAの翻訳が含まれる。他の実施形態では、発現
には関心の対象である遺伝子をコードする核酸の転写のみが含まれる。
はすべてが転写されることが可能である遺伝子生成物をコードする核酸を含む遺
伝子構築物のいずれのタイプをも含むことを意味する。転写はタンパク質に翻訳
することができるが、しかしその必要はない。ある実施形態では、発現には遺伝
子の転写と、遺伝子生成物へのmRNAの翻訳が含まれる。他の実施形態では、発現
には関心の対象である遺伝子をコードする核酸の転写のみが含まれる。
【００９３】 ｉ．心筋細胞特異的調節エレメント 本発明での使用に適している転写調節エレメントには、心筋細胞において優先
的に操作可能にリンクされているコード領域の転写を指示する転写調節エレメン
トを含む。「優先的に」という用語により、心筋細胞におけるトランス遺伝子の
発現は非心筋細胞における発現よりも少なくとも約10倍多く、さらに好適には少
なくとも10倍〜約50倍多く、なおさらに好適には約50倍〜100倍多く、なおさら に好適には100倍以上多いことを意味する。好適には、トランス遺伝子の発現は 、当業者には周知のリポーター遺伝子測定法により示されているように、心筋細
胞ではない細胞においては検出可能な限度以下である。
的に操作可能にリンクされているコード領域の転写を指示する転写調節エレメン
トを含む。「優先的に」という用語により、心筋細胞におけるトランス遺伝子の
発現は非心筋細胞における発現よりも少なくとも約10倍多く、さらに好適には少
なくとも10倍〜約50倍多く、なおさらに好適には約50倍〜100倍多く、なおさら に好適には100倍以上多いことを意味する。好適には、トランス遺伝子の発現は 、当業者には周知のリポーター遺伝子測定法により示されているように、心筋細
胞ではない細胞においては検出可能な限度以下である。
【００９４】 様々な心筋細胞特異的TREsが論文の中で説明されてきたが、本発明の中で使用
することができる。例えば、これらには、ミオシン軽鎖‐2から誘導されたTREs 、α‐ミオシン重鎖、AE3、心臓トロポニンC、心臓α‐アクチンに限定されない
が、それらが含まれる（Franzら、1997；Robbinsら、1995；Parmacekら、1994；
Hunterら、1993；Sartorelliら、1992）。
することができる。例えば、これらには、ミオシン軽鎖‐2から誘導されたTREs 、α‐ミオシン重鎖、AE3、心臓トロポニンC、心臓α‐アクチンに限定されない
が、それらが含まれる（Franzら、1997；Robbinsら、1995；Parmacekら、1994；
Hunterら、1993；Sartorelliら、1992）。
【００９５】 1つの好適な実施形態では、TREは、α‐MHC遺伝子の5'フランキング領域由来 のプロモーター領域を含む。マウスα‐MHC遺伝子の5443塩基5'フランキング配 列はGenBankで受入番号U71441の下で提供される。全5.4kb配列は本発明のトラン
ス遺伝子において使用することができるが、心筋細胞において優先的に操作可能
にリンクしているコード領域の直接的な転写のその部分はまた使用することがで
きる。α‐MHC発現ベクタークローン26は、コード領域はJonesら（1994）により
説明されているとおりに、α‐MHCプロモーターに操作可能にリンクするように 、所望されるコード領域を挿入するのに使用することができる。
ス遺伝子において使用することができるが、心筋細胞において優先的に操作可能
にリンクしているコード領域の直接的な転写のその部分はまた使用することがで
きる。α‐MHC発現ベクタークローン26は、コード領域はJonesら（1994）により
説明されているとおりに、α‐MHCプロモーターに操作可能にリンクするように 、所望されるコード領域を挿入するのに使用することができる。
【００９６】 もう1つの実施形態では、TREは、脳ナトリウム利尿ペプチド遺伝子の5'フラン
キング領域由来のプロモーター領域を含む（BNP；ThueraufとGlembotski、1997 ；La Pointeら、1996、全体として本明細書に参照としてそれぞれとくに記載） 。
キング領域由来のプロモーター領域を含む（BNP；ThueraufとGlembotski、1997 ；La Pointeら、1996、全体として本明細書に参照としてそれぞれとくに記載） 。
【００９７】 ii. 一般的なプロモーター 遺伝子生成物をコードする核酸はプロモーターの転写制御下にある。「プロモ
ーター」とは、細胞の合成機構によって認識され、あるいは合成機構により導入
され、遺伝子の特異的な転写を開始することを要求されるDNA配列を称する。「 転写制御下」という表現は、プロモーターは遺伝子のRNAポリメラーゼ開始と発 現を制御するために、核酸に関連する正確な位置と配向にある。
ーター」とは、細胞の合成機構によって認識され、あるいは合成機構により導入
され、遺伝子の特異的な転写を開始することを要求されるDNA配列を称する。「 転写制御下」という表現は、プロモーターは遺伝子のRNAポリメラーゼ開始と発 現を制御するために、核酸に関連する正確な位置と配向にある。
【００９８】 プロモーターという用語は、RNAポリメラーゼIIの開始部位の周辺に密集して いる転写制御モジュール群に言及するのにここでは使用される。どのようにプロ
モーターが組織化されているかについて考えることの多くは、HSVチミジンキナ ーゼ（tk）とSV40初期転写ユニットに対するプロモーターを含むいくつかのウイ
ルスのプロモーターの分析から得られている。これらの研究調査は、さらに最近
の研究によって増加しているが、プロモーターは分離した機能的モジュールから
構成され、それぞれDNAのおよそ7〜20bpから成り、また転写活性化因子あるいは
抑制タンパク質の1つないしはそれ以上の認識部位を含んでいることを示してい る。
モーターが組織化されているかについて考えることの多くは、HSVチミジンキナ ーゼ（tk）とSV40初期転写ユニットに対するプロモーターを含むいくつかのウイ
ルスのプロモーターの分析から得られている。これらの研究調査は、さらに最近
の研究によって増加しているが、プロモーターは分離した機能的モジュールから
構成され、それぞれDNAのおよそ7〜20bpから成り、また転写活性化因子あるいは
抑制タンパク質の1つないしはそれ以上の認識部位を含んでいることを示してい る。
【００９９】 各プロモーターで少なくとも1つのモジュールがRNA合成の開始部位の位置を定
めるために機能する。これに関して最もよく知られている実施例はTATAボックス
であるが、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチド転移酵素遺伝子のプロモーター
やSV40後期遺伝子のプロモーターなどのTATAボックスを欠くいくつかのプロモー
ターでは、開始部位にそれ自身が重なっている分離エレメントが開始の場所を決
めるのを助ける。
めるために機能する。これに関して最もよく知られている実施例はTATAボックス
であるが、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチド転移酵素遺伝子のプロモーター
やSV40後期遺伝子のプロモーターなどのTATAボックスを欠くいくつかのプロモー
ターでは、開始部位にそれ自身が重なっている分離エレメントが開始の場所を決
めるのを助ける。
【０１００】 付加的なプロモーターエレメントは転写開始の頻度を調節する。典型的には、
数多くのプロモーターが最近になって、開始部位の下流にも機能的なエレメント
が含まれていることが示されているが、これらは開始部位の上流30〜110 bpの領
域に位置している。プロモーターエレメント間の間隔を頻繁にあけることには柔
軟であり、そのため、プロモーター機能が逆方向あるいは互いに関連して移動さ
れるときには保存される。tkプロモーターでは、プロモーターエレメント間の間
隔をあけることは、活性が下降しはじめる前に50 bp離れるまでに増大すること ができる。プロモーターにより、個々のエレメントは協同的にか、あるいは独自
に、かのいずれかで転写を活性化するように機能することができると考えられる
。
数多くのプロモーターが最近になって、開始部位の下流にも機能的なエレメント
が含まれていることが示されているが、これらは開始部位の上流30〜110 bpの領
域に位置している。プロモーターエレメント間の間隔を頻繁にあけることには柔
軟であり、そのため、プロモーター機能が逆方向あるいは互いに関連して移動さ
れるときには保存される。tkプロモーターでは、プロモーターエレメント間の間
隔をあけることは、活性が下降しはじめる前に50 bp離れるまでに増大すること ができる。プロモーターにより、個々のエレメントは協同的にか、あるいは独自
に、かのいずれかで転写を活性化するように機能することができると考えられる
。
【０１０１】 関心の対象である核酸配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモー
ターは、それが標的細胞中の核酸の発現を指示することができる間は別であるが
、重要なものであると考えられているわけではない。このように、ヒト細胞が標
的にされる箇所では、プロモーターに隣接する核酸コード領域の位置を定め、ヒ
ト細胞の中で発現させることができるプロモーターの制御下で位置を定めること
が望ましい。一般的に言って、こうしたプロモーターはヒトか、あるいはウイル
スのプロモーターかのいずれかを含むことが多い。
ターは、それが標的細胞中の核酸の発現を指示することができる間は別であるが
、重要なものであると考えられているわけではない。このように、ヒト細胞が標
的にされる箇所では、プロモーターに隣接する核酸コード領域の位置を定め、ヒ
ト細胞の中で発現させることができるプロモーターの制御下で位置を定めること
が望ましい。一般的に言って、こうしたプロモーターはヒトか、あるいはウイル
スのプロモーターかのいずれかを含むことが多い。
【０１０２】 様々な実施形態で、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）即時型遺伝子プロモー ター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復（LTR）、β‐ア クチン、ラットインスリンプロモーター、グリセルアルデヒド‐3‐リン酸デヒ ドロゲナーゼを、関心の対象であるコード配列の高いレベルの発現を得るために
使用することができる。発現のレベルが任意の目的に十分である場合には、関心
の対象であるコード配列の発現を達成するため、当業者には周知のものである、
他のウイルスあるいは哺乳動物の細胞あるいは細菌ファージプロモーターの使用
もまた企図される。周知の特性をもったプロモーターを用いることにより、トラ
ンスフェクションあるいは形質転換の後、関心の対象であるタンパク質の発現の
レベルとパターンが最適化できる。
使用することができる。発現のレベルが任意の目的に十分である場合には、関心
の対象であるコード配列の発現を達成するため、当業者には周知のものである、
他のウイルスあるいは哺乳動物の細胞あるいは細菌ファージプロモーターの使用
もまた企図される。周知の特性をもったプロモーターを用いることにより、トラ
ンスフェクションあるいは形質転換の後、関心の対象であるタンパク質の発現の
レベルとパターンが最適化できる。
【０１０３】 特異的な生理学上のシグナル、あるいは合成シグナルに応答して調節されるプ
ロモーターの選択は、遺伝子生成物の誘導性発現を可能にすることができる。例
えば、多シストロン性ベクターが利用される場合のトランス遺伝子（単数）ある
いはトランス遺伝子（複数）の発現は、ベクターが生産される細胞にとって毒性
がある場合には、そのトランス遺伝子の1つないしはそれ以上の発現を妨げる、 あるいは減らすことが望ましいと考えられる。産生細胞系に対して毒性があると
考えられるトランス遺伝子の実施例は、プロアポトーシス遺伝子とサイトカイン
遺伝子である。いくつかの誘導性プロモーターシステムが、トランス遺伝子生成
物が毒性である箇所ではウイルスベクターの産生のために入手可能である。
ロモーターの選択は、遺伝子生成物の誘導性発現を可能にすることができる。例
えば、多シストロン性ベクターが利用される場合のトランス遺伝子（単数）ある
いはトランス遺伝子（複数）の発現は、ベクターが生産される細胞にとって毒性
がある場合には、そのトランス遺伝子の1つないしはそれ以上の発現を妨げる、 あるいは減らすことが望ましいと考えられる。産生細胞系に対して毒性があると
考えられるトランス遺伝子の実施例は、プロアポトーシス遺伝子とサイトカイン
遺伝子である。いくつかの誘導性プロモーターシステムが、トランス遺伝子生成
物が毒性である箇所ではウイルスベクターの産生のために入手可能である。
【０１０４】 エクジソンシステム（Invitrogen社製、カリフォルニア州カールスバッド市）
はこうしたシステムの1つである。このシステムは、哺乳動物の細胞において関 心の対象となる遺伝子の調節された発現を可能にするよう設計されている。トラ
ンス遺伝子の基底レベルの発現は、実質的にはできない、厳しく調節された発現
システムから成っているが、しかし誘導性は200倍を越える。このシステムはシ ョウジョウバエのヘテロダイマーエクジソン受容体をベースにしており、エクジ
ソンあいはムリステロンAといった類似体が受容体に結合する場合には、その受 容体は、mRNA転写の高いレベルが達成される下流のトランス遺伝子の発現を開始
させるためにプロモーターを活性化する。このシステムでは、ヘテロダイマー受
容体の両方のモノマーは1つのベクターから構成的に発現させられるが、一方、 関心の対象である遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターはもう
1つのプラスミド上にある。このタイプのシステムを関心の対象である遺伝子転 移ベクターの中に遺伝子工学的に組み込むことは、したがって、有用なことであ
ろう。関心の対象である遺伝子と産生細胞系の中の受容体モノマーを含むプラス
ミドのコトランスフェクションは、潜在的に毒性のあるトランス遺伝子の発現な
しに遺伝子転移ベクターの産生を可能にするであろう。適当な時間で、トランス
遺伝子の発現はエクジソンないしはムリステロンAにより活性化することが可能 である。他の誘導プロモーターシステムには、ホルモン応答性システム、インタ
ーフェロン誘導システム、金属誘導システム、熱誘導システムが含まれる（ＷＯ
93/20218）。
はこうしたシステムの1つである。このシステムは、哺乳動物の細胞において関 心の対象となる遺伝子の調節された発現を可能にするよう設計されている。トラ
ンス遺伝子の基底レベルの発現は、実質的にはできない、厳しく調節された発現
システムから成っているが、しかし誘導性は200倍を越える。このシステムはシ ョウジョウバエのヘテロダイマーエクジソン受容体をベースにしており、エクジ
ソンあいはムリステロンAといった類似体が受容体に結合する場合には、その受 容体は、mRNA転写の高いレベルが達成される下流のトランス遺伝子の発現を開始
させるためにプロモーターを活性化する。このシステムでは、ヘテロダイマー受
容体の両方のモノマーは1つのベクターから構成的に発現させられるが、一方、 関心の対象である遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターはもう
1つのプラスミド上にある。このタイプのシステムを関心の対象である遺伝子転 移ベクターの中に遺伝子工学的に組み込むことは、したがって、有用なことであ
ろう。関心の対象である遺伝子と産生細胞系の中の受容体モノマーを含むプラス
ミドのコトランスフェクションは、潜在的に毒性のあるトランス遺伝子の発現な
しに遺伝子転移ベクターの産生を可能にするであろう。適当な時間で、トランス
遺伝子の発現はエクジソンないしはムリステロンAにより活性化することが可能 である。他の誘導プロモーターシステムには、ホルモン応答性システム、インタ
ーフェロン誘導システム、金属誘導システム、熱誘導システムが含まれる（ＷＯ
93/20218）。
【０１０５】 有用な特定の誘導システムの1つは、元々はGossenとBujardにより開発されたT
et‐OffTMあるいはTet‐OffTMシステム（Clontech社製、カリフォルニア州パロ アルト市）である（GossenとBujard、1992；Gossenら、1995；WO94/29442；WO96
/40892とWO/96/01313；それぞれ参照として本明細書に記載）。このシステムで はまた、テトラサイクリンあるいはドキサイクリンなどのテトラサイクリン誘導
体に応答して調節されるべき遺伝子発現の高いレベルが実現される。Tet‐OnTM システムでは、遺伝子発現はドキシサイクリンの存在下で始まるが、一方、Tet ‐OffTMシステムでは、遺伝子発現はドキシサイクリンが存在しないときに始ま る。これらのシステムは、E.coliのテトラサイクリン抵抗性オペロンから誘導さ
れた2つの調節エレメントをベースにしている。テトラサイクリン抑制因子が結 合するテトラサイクリンオペレータ配列と、テトラサイクリン抑制因子タンパク
質である。関心の対象である遺伝子は、その中に存在しているテトラサイクリン
応答性エレメントを有するプロモーターの背後にあるプラスミドの中にクローン
化される。第二のプラスミドには、Tet‐OffTMシステムでは、単純疱疹ウイルス
由来のVP16ドメインと野生型テトラサイクリン抑制因子を含むテトラサイクリン
制御トランス作用因子と呼ばれる調節エレメントが含まれる。このように、ドキ
シサイクリンが存在しないときには、転写は構成的に始まる。Tet‐OnTMシステ ムでは、テトラサイクリン抑制因子は野生型ではなく、ドキシサイクリンの存在
下では転写を活性化させる。遺伝子転移ベクター産生に関しては、Tet‐OffTMシ
ステムは、産生細胞がテトラサイクリンあるいはドキシサイクリンの存在下では
増殖し、潜在的に毒性のあるトランス遺伝子の発現を予防するが、しかし、ベク
ターが患者に導入されるときには、遺伝子発現は構成的に始まる。
et‐OffTMあるいはTet‐OffTMシステム（Clontech社製、カリフォルニア州パロ アルト市）である（GossenとBujard、1992；Gossenら、1995；WO94/29442；WO96
/40892とWO/96/01313；それぞれ参照として本明細書に記載）。このシステムで はまた、テトラサイクリンあるいはドキサイクリンなどのテトラサイクリン誘導
体に応答して調節されるべき遺伝子発現の高いレベルが実現される。Tet‐OnTM システムでは、遺伝子発現はドキシサイクリンの存在下で始まるが、一方、Tet ‐OffTMシステムでは、遺伝子発現はドキシサイクリンが存在しないときに始ま る。これらのシステムは、E.coliのテトラサイクリン抵抗性オペロンから誘導さ
れた2つの調節エレメントをベースにしている。テトラサイクリン抑制因子が結 合するテトラサイクリンオペレータ配列と、テトラサイクリン抑制因子タンパク
質である。関心の対象である遺伝子は、その中に存在しているテトラサイクリン
応答性エレメントを有するプロモーターの背後にあるプラスミドの中にクローン
化される。第二のプラスミドには、Tet‐OffTMシステムでは、単純疱疹ウイルス
由来のVP16ドメインと野生型テトラサイクリン抑制因子を含むテトラサイクリン
制御トランス作用因子と呼ばれる調節エレメントが含まれる。このように、ドキ
シサイクリンが存在しないときには、転写は構成的に始まる。Tet‐OnTMシステ ムでは、テトラサイクリン抑制因子は野生型ではなく、ドキシサイクリンの存在
下では転写を活性化させる。遺伝子転移ベクター産生に関しては、Tet‐OffTMシ
ステムは、産生細胞がテトラサイクリンあるいはドキシサイクリンの存在下では
増殖し、潜在的に毒性のあるトランス遺伝子の発現を予防するが、しかし、ベク
ターが患者に導入されるときには、遺伝子発現は構成的に始まる。
【０１０６】 ある状況では、遺伝子転移ベクターの中のトランス遺伝子の発現を調節するこ
とが望ましい。例えば、様々な活性の強さをもつ、異なったウイルスプロモータ
ーは所望される発現レベルにより使用される。哺乳動物の細胞では、強い転写活
性化を提供するのに使用するのであれば、CMV即時型プロモーターである。より 潜在力が弱いCMVプロモーターの修飾バージョンもまた、トランス遺伝子の軽減 した発現レベルが所望されるときに使用されてきた。造血細胞におけるトランス
遺伝子の発現が所望される場合には、MLVあるいはMMTV由来のLTRなどのリトリー
バルプロモーターがよく使用される。所望される効果により使用される他のウイ
ルスのプロモーターには、E1A、E2AあるいはMLP領域、AAV LTR、ハナヤサイモザ
イクウイルス、HSV‐TK、ニワトリ肉腫ウイルス由来などのSV40、RSV LTR、HIV ‐1、HIV‐2 LTR、アデノウイルスプロモーターが含まれる。
とが望ましい。例えば、様々な活性の強さをもつ、異なったウイルスプロモータ
ーは所望される発現レベルにより使用される。哺乳動物の細胞では、強い転写活
性化を提供するのに使用するのであれば、CMV即時型プロモーターである。より 潜在力が弱いCMVプロモーターの修飾バージョンもまた、トランス遺伝子の軽減 した発現レベルが所望されるときに使用されてきた。造血細胞におけるトランス
遺伝子の発現が所望される場合には、MLVあるいはMMTV由来のLTRなどのリトリー
バルプロモーターがよく使用される。所望される効果により使用される他のウイ
ルスのプロモーターには、E1A、E2AあるいはMLP領域、AAV LTR、ハナヤサイモザ
イクウイルス、HSV‐TK、ニワトリ肉腫ウイルス由来などのSV40、RSV LTR、HIV ‐1、HIV‐2 LTR、アデノウイルスプロモーターが含まれる。
【０１０７】 同様に、組織特異的プロモーターは潜在的な毒性、あるいは非標的組織に対する
望ましくない効果を軽減するように、特定の組織あるいは細胞における転写を成
し遂げるために使用されることがある。例えば、PSA、プロベイスン、前立腺酸 ホスファターゼあるいは前立腺特異的腺カリクレイン（hK2）などのプロモータ ーは、前立腺における遺伝子発現を標的にするのに使用されることがある。こう
した細胞型特異的TREsには、血管内皮成長因子受容体（内皮に特異的）、アルブ
ミン（肝臓に特異的）、因子VII（肝臓）、脂肪酸シンターゼ（肝臓）、フォン ウィルブランド因子（脳内皮）、α‐アクチンとミオシン重鎖（共に平滑筋）、
シンテターゼII（小腸）、Na‐K‐Cl輸送体（腎臓）、前立腺特異的抗原（前立 腺）、腺カリクレイン‐I遺伝子（前立腺）から誘導されたTREsに限定されるわ けではないが、それらが含まれる。
望ましくない効果を軽減するように、特定の組織あるいは細胞における転写を成
し遂げるために使用されることがある。例えば、PSA、プロベイスン、前立腺酸 ホスファターゼあるいは前立腺特異的腺カリクレイン（hK2）などのプロモータ ーは、前立腺における遺伝子発現を標的にするのに使用されることがある。こう
した細胞型特異的TREsには、血管内皮成長因子受容体（内皮に特異的）、アルブ
ミン（肝臓に特異的）、因子VII（肝臓）、脂肪酸シンターゼ（肝臓）、フォン ウィルブランド因子（脳内皮）、α‐アクチンとミオシン重鎖（共に平滑筋）、
シンテターゼII（小腸）、Na‐K‐Cl輸送体（腎臓）、前立腺特異的抗原（前立 腺）、腺カリクレイン‐I遺伝子（前立腺）から誘導されたTREsに限定されるわ けではないが、それらが含まれる。
【０１０８】 さらにもう1つのTREsのクラスには、低酸素状態に応答して操作可能にリンク したポリヌクレオチドの転写を活性化するTREsがある。これらには、低酸素症誘
導因子1により、少なくとも部分的に調節されたTREsが含まれる（BunnとPoyton 、1996；DachsとStafford、1996；GuilleminとKrasnow、1997；Firthら、1994；
Jiangら、1997）。
導因子1により、少なくとも部分的に調節されたTREsが含まれる（BunnとPoyton 、1996；DachsとStafford、1996；GuilleminとKrasnow、1997；Firthら、1994；
Jiangら、1997）。
【０１０９】 上記のプロモーターのいずれかが、単独であるいは他のものと組み合わせて、
所望される作用により、本発明にしたがい有用となることが考えられる。さらに
、プロモーターのこの一覧表は余すところなく書き込まれているとか限定的なも
のであるとか解釈すべきではなく、当業者であれば、本明細書に開示されている
プロモーターと方法とともに使用することが可能であるその他のプロモーターを
知ることとなるであろう。
所望される作用により、本発明にしたがい有用となることが考えられる。さらに
、プロモーターのこの一覧表は余すところなく書き込まれているとか限定的なも
のであるとか解釈すべきではなく、当業者であれば、本明細書に開示されている
プロモーターと方法とともに使用することが可能であるその他のプロモーターを
知ることとなるであろう。
【０１１０】 iii. エンハンサー エンハンサーは、DNAの同じ分子上に、離れた位置にあるプロモーターからの 転写を増加させる遺伝的エレメントである。エンハンサーはまるでプロモーター
のように組織化されている。それは、エンハンサーもプロモーターも多くの個々
のエレメントから構成されていて、そのそれぞれが1つないしはそれ以上の転写 タンパク質に結合している点である。エンハンサーとプロモーターの間の基本的
な区別は操作上のものである。全体としてエンハンサー領域は離れて転写を刺激
することが可能でなければならないが、これはプロモーター領域あるいはその組
成エレメントに関してはそうはならない。一方、プロモーターは特定の部位で、
また特定の配向でRNA合成の開始を指示する1つないしはそれ以上のエレメントを
有していなければならないが、もう一方のエンハンサーの方はこれらの特異性に
欠ける。プロモーターとエンハンサーはよく重複し、また隣接しており、非常に
よく似たモジュール構成を有しているようにみえることが多い。
のように組織化されている。それは、エンハンサーもプロモーターも多くの個々
のエレメントから構成されていて、そのそれぞれが1つないしはそれ以上の転写 タンパク質に結合している点である。エンハンサーとプロモーターの間の基本的
な区別は操作上のものである。全体としてエンハンサー領域は離れて転写を刺激
することが可能でなければならないが、これはプロモーター領域あるいはその組
成エレメントに関してはそうはならない。一方、プロモーターは特定の部位で、
また特定の配向でRNA合成の開始を指示する1つないしはそれ以上のエレメントを
有していなければならないが、もう一方のエンハンサーの方はこれらの特異性に
欠ける。プロモーターとエンハンサーはよく重複し、また隣接しており、非常に
よく似たモジュール構成を有しているようにみえることが多い。
【０１１１】 本発明の好適な実施形態では、発現構築物はウイルスゲノムから誘導されるウイ
ルスあるいは遺伝子工学的に処理された構築物から成る。受容体仲介エンドサイ
トーシスを介して細胞に入り、宿主細胞ゲノムの中に組み込まれ、ウイルス遺伝
子を安定的また効率的に発現させる能力がある種のウイルスにはあるため、外来
遺伝子を哺乳動物の細胞の中に転移する役割を担うという点でウイルスは魅力的
な候補となってきた（Ridgeway、1988；NicolasとRubenstein、1988；Baichwal とSugden、1986；Temin、1986）。遺伝子ベクターとして使用された最初のウイ ルスは、パポバウイルス（シミアンウイルス40、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオー
マウイルス）（Ridgeway1988；BaichwalとSugden、1986）とアデノウイルス（Ri
dgeway1988；BaichwalとSugden、1986）を含むDNAウイルスであった。これらは 外来DNA配列に対する比較的少ない容量、制限された宿主スペクトラムを有する 。さらに、それらには許容細胞における腫瘍遺伝子的にみて潜在的かつ細胞病理
学的な効果があり、安全の問題が起きている。それらは外来遺伝子物質について
は8 kBまでしか収容できないが、様々な細胞系とラボの動物に容易に導入するこ
とができる（NicolasとRubenstein、1988；Temin、1986）。
ルスあるいは遺伝子工学的に処理された構築物から成る。受容体仲介エンドサイ
トーシスを介して細胞に入り、宿主細胞ゲノムの中に組み込まれ、ウイルス遺伝
子を安定的また効率的に発現させる能力がある種のウイルスにはあるため、外来
遺伝子を哺乳動物の細胞の中に転移する役割を担うという点でウイルスは魅力的
な候補となってきた（Ridgeway、1988；NicolasとRubenstein、1988；Baichwal とSugden、1986；Temin、1986）。遺伝子ベクターとして使用された最初のウイ ルスは、パポバウイルス（シミアンウイルス40、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオー
マウイルス）（Ridgeway1988；BaichwalとSugden、1986）とアデノウイルス（Ri
dgeway1988；BaichwalとSugden、1986）を含むDNAウイルスであった。これらは 外来DNA配列に対する比較的少ない容量、制限された宿主スペクトラムを有する 。さらに、それらには許容細胞における腫瘍遺伝子的にみて潜在的かつ細胞病理
学的な効果があり、安全の問題が起きている。それらは外来遺伝子物質について
は8 kBまでしか収容できないが、様々な細胞系とラボの動物に容易に導入するこ
とができる（NicolasとRubenstein、1988；Temin、1986）。
【０１１２】 iv. ポリアデニル化シグナル cDNA挿入が用いられる場合は、典型的には、遺伝子転写の適当なポリアデニル化
を成し遂げるためにポリアデニル化シグナルを含めることが所望されることであ
ろう。ポリアデニル化シグナルの性向は、本発明を成功裡に実施するのに必須の
ものであるとは考えられておらず、ヒトあるいはウシ成長ホルモン、あるいはSV
40ポリアデニル化シグナルなどのいずれかのこうした配列は用いられることがあ
る。発現カセットのエレメントは転写終結区であるとも考えられている。これら
のエレメントはメッセージレベルを向上させ、カセットから他の配列の中までの
読み通しを最小限にするのに役立つことができる。
を成し遂げるためにポリアデニル化シグナルを含めることが所望されることであ
ろう。ポリアデニル化シグナルの性向は、本発明を成功裡に実施するのに必須の
ものであるとは考えられておらず、ヒトあるいはウシ成長ホルモン、あるいはSV
40ポリアデニル化シグナルなどのいずれかのこうした配列は用いられることがあ
る。発現カセットのエレメントは転写終結区であるとも考えられている。これら
のエレメントはメッセージレベルを向上させ、カセットから他の配列の中までの
読み通しを最小限にするのに役立つことができる。
【０１１３】 b. 遺伝子転移 発現ベクターは細胞の中に導入される方法は数多くある。本発明のある実施形
態では、発現構築物はウイルスゲノムから誘導されるウイルスあるいは遺伝子工
学的に処理される構築物から成る。他の実施形態では、非ウイルス性デリバリー
が企図されている。受容体仲介エンドサイトーシスを介して細胞に入り、宿主細
胞ゲノムの中に組み込み、ウイルス遺伝子を安定的また効率的に発現させる能力
がある種のウイルスにはあるため、外来遺伝子を哺乳動物の細胞の中に転移する
役割を担うという点でウイルスは魅力的な候補となってきた（Ridgeway、1988；
NicolasとRubenstein、1988；BaichwalとSugden、1986；Temin、1986）。デリバ
リーメカニズムは本明細書で以下にさらに詳細に論じられる。
態では、発現構築物はウイルスゲノムから誘導されるウイルスあるいは遺伝子工
学的に処理される構築物から成る。他の実施形態では、非ウイルス性デリバリー
が企図されている。受容体仲介エンドサイトーシスを介して細胞に入り、宿主細
胞ゲノムの中に組み込み、ウイルス遺伝子を安定的また効率的に発現させる能力
がある種のウイルスにはあるため、外来遺伝子を哺乳動物の細胞の中に転移する
役割を担うという点でウイルスは魅力的な候補となってきた（Ridgeway、1988；
NicolasとRubenstein、1988；BaichwalとSugden、1986；Temin、1986）。デリバ
リーメカニズムは本明細書で以下にさらに詳細に論じられる。
【０１１４】 i. 非ウイルス転移 本セクションでは非ウイルス遺伝子転移の方法と組成物に関する論議が提供さ
れる。本発明のDNA構築物は一般的には、細胞にデリバリーされ、またある状況 では、転移されるべき核酸あるいはタンパク質が非ウイルス方法を使用して転移
されることがある。
れる。本発明のDNA構築物は一般的には、細胞にデリバリーされ、またある状況 では、転移されるべき核酸あるいはタンパク質が非ウイルス方法を使用して転移
されることがある。
【０１１５】 発現構築物を培養した哺乳動物の細胞の中に転移させるためのいくつかの非ウ
イルス方法が本発明により企図される。これらにはカルシウムリン酸沈殿法（Gr
ahamとVan Der Eb、1973；ChenとOkayama、1987；Rippeら、1990）、DEAE‐デキ
ストラン法（Gopal、1985）、電気穿孔法（Tur‐Kaspaら、1986；Potterら、198
4）、直接顕微注射法（HarlandとWeintraub、1985）、DNA負荷リポゾーム法（Ni
colauとSene、1982；Fraleyら、1979）、細胞音波処理法（Fechhiemerら、1987 ）、高速微小突起物を使用する遺伝子ボンバード法（Yangら、1990）、受容体仲
介トランスフェクション法（WuとWu、1987；WuとWu、1988）が含まれる。
イルス方法が本発明により企図される。これらにはカルシウムリン酸沈殿法（Gr
ahamとVan Der Eb、1973；ChenとOkayama、1987；Rippeら、1990）、DEAE‐デキ
ストラン法（Gopal、1985）、電気穿孔法（Tur‐Kaspaら、1986；Potterら、198
4）、直接顕微注射法（HarlandとWeintraub、1985）、DNA負荷リポゾーム法（Ni
colauとSene、1982；Fraleyら、1979）、細胞音波処理法（Fechhiemerら、1987 ）、高速微小突起物を使用する遺伝子ボンバード法（Yangら、1990）、受容体仲
介トランスフェクション法（WuとWu、1987；WuとWu、1988）が含まれる。
【０１１６】 一旦構築物が細胞の中にデリバリーされると、関心の対象である特定の遺伝子
をコードする核酸は異なった部位で位置を定め、また発現する。ある実施形態で
は、遺伝子をコードする核酸は細胞のゲノムの中に安定的に一体化されることが
ある。この一体化は相同組換え（遺伝子置換）を介して同起源の位置と配向にお
いて行われるか、あるいは無作為、非特異的位置で一体化（遺伝子増加）される
ことがある。なおさらなる実施形態では、核酸はDNAの分離、エピソームセグメ ントとして細胞の中に安定的に維持されることがある。こうした核酸セグメント
あるいは「エピソーム」は、宿主細胞サイクルからは独立して、あるいは宿主細
胞サイクルと同期して維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする
。発現構築物がいかに細胞にデリバリーされるのか、核酸が残っているのは細胞
の中のどこなのかは、用いられた発現構築物の型に依存する。
をコードする核酸は異なった部位で位置を定め、また発現する。ある実施形態で
は、遺伝子をコードする核酸は細胞のゲノムの中に安定的に一体化されることが
ある。この一体化は相同組換え（遺伝子置換）を介して同起源の位置と配向にお
いて行われるか、あるいは無作為、非特異的位置で一体化（遺伝子増加）される
ことがある。なおさらなる実施形態では、核酸はDNAの分離、エピソームセグメ ントとして細胞の中に安定的に維持されることがある。こうした核酸セグメント
あるいは「エピソーム」は、宿主細胞サイクルからは独立して、あるいは宿主細
胞サイクルと同期して維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする
。発現構築物がいかに細胞にデリバリーされるのか、核酸が残っているのは細胞
の中のどこなのかは、用いられた発現構築物の型に依存する。
【０１１７】 本発明のもう1つの具体的な実施形態では、発現構築物はリポソームにトラッ プされていることがある。リポソームは、リン脂質二重層膜と内側水性媒質によ
り特徴付けられる小胞構造である。多重膜リポソームは水性媒質により分離され
ている複数の脂質層を有している。それらは、リン脂質が過剰な水性溶液中に懸
濁されるときに自発的に形成する。脂質組成物は、閉鎖構造の形成前に自己配列
を経験し、水と脂質二重層の間の溶解溶質をトラップする（GhoshとBachhawat、
1991）。陽イオンリポソームにDNAを付加すると、随意にリポソームから複屈折 性液体‐結晶濃縮小球に位相的な遷移を起こす（Radlerら、1997）。これらのDN
A‐脂質複合体は遺伝子デリバリーにおいて使用される、潜在的な非ウイルスベ クターである。
り特徴付けられる小胞構造である。多重膜リポソームは水性媒質により分離され
ている複数の脂質層を有している。それらは、リン脂質が過剰な水性溶液中に懸
濁されるときに自発的に形成する。脂質組成物は、閉鎖構造の形成前に自己配列
を経験し、水と脂質二重層の間の溶解溶質をトラップする（GhoshとBachhawat、
1991）。陽イオンリポソームにDNAを付加すると、随意にリポソームから複屈折 性液体‐結晶濃縮小球に位相的な遷移を起こす（Radlerら、1997）。これらのDN
A‐脂質複合体は遺伝子デリバリーにおいて使用される、潜在的な非ウイルスベ クターである。
【０１１８】 リポソーム仲介核酸デリバリーとin vitroでの外来DNAの発現は非常なる成功 をおさめた。β‐ラクタマーゼ遺伝子を使用して、Wongら（1980）は培養ニワト
リ胚、HeLa、肝癌細胞の中のリポソーム仲介デリバリーと外来DNAの発現の実行 可能性を示した。Nicolauら（1987）は静脈注射後ラットにおいてリポソーム仲 介遺伝子転移を成功裡に達成した。「リポフェクション」技術に関する様々な商
業的なアプローチも含まれる。
リ胚、HeLa、肝癌細胞の中のリポソーム仲介デリバリーと外来DNAの発現の実行 可能性を示した。Nicolauら（1987）は静脈注射後ラットにおいてリポソーム仲 介遺伝子転移を成功裡に達成した。「リポフェクション」技術に関する様々な商
業的なアプローチも含まれる。
【０１１９】 本発明のある実施形態では、リポソームは赤血球凝集ウイルス（HVJ）との複 合体である。これは細胞膜との融合を容易にし、またリポソームカプセル化DNA の細胞エントリーを促進することが示された（Kanedaら、1989）。他の実施形態
では、リポソームは核非ヒストン染色体タンパク質（HMG‐1）とともに複合体化
されるかあるいは用いられることがある（Katoら、1991）。 こうした発現構築 物が、in vitroまたin vivoに転移と核酸の発現において成功裡に用いられたと いう点から、それらの発現構築物は本発明に適用可能である。
では、リポソームは核非ヒストン染色体タンパク質（HMG‐1）とともに複合体化
されるかあるいは用いられることがある（Katoら、1991）。 こうした発現構築 物が、in vitroまたin vivoに転移と核酸の発現において成功裡に用いられたと いう点から、それらの発現構築物は本発明に適用可能である。
【０１２０】 特定の遺伝子をコードする核酸を細胞の中にデリバリーするのに用いることが
できる他のベクターデリバリーシステムは、受容体仲介デリバリービーイクルで
ある。これらは、ほとんどすべての真核細胞において受容体仲介エンドサイトー
シスにより巨大分子の選択的摂取を行うという利点がある。様々な受容体の細胞
型特異的分布のため、デリバリーは高度に特異的でありうる（WuとWu、1993）。
できる他のベクターデリバリーシステムは、受容体仲介デリバリービーイクルで
ある。これらは、ほとんどすべての真核細胞において受容体仲介エンドサイトー
シスにより巨大分子の選択的摂取を行うという利点がある。様々な受容体の細胞
型特異的分布のため、デリバリーは高度に特異的でありうる（WuとWu、1993）。
【０１２１】 ビーイクルを標的とする受容体仲介遺伝子は一般的に、二つの組成物から構成
される。すなわち、細胞受容体特異的リガンドとDNA結合薬剤である。いくつか のリガンドが受容体仲介遺伝子転移のために使用されてきた。一番敷衍して特徴
付けられたリガンドはアシアロオロソムコイド（ASOR）（WuとWu、1987）とトラ
ンスフェリン（Wagnerら、1990）である。最近では、ASORと同じ受容体を認識す
る合成ネオ糖タンパク質が遺伝子デリバリービーイクルとして使用されてきてお
り（Ferkolら、1993；Peralesら、1994）、また上皮成長因子（EGF）もまた扁平
上皮癌細胞に対して遺伝子をデリバリーするのに使用されてきた（Myers、EPO 0
273085）。
される。すなわち、細胞受容体特異的リガンドとDNA結合薬剤である。いくつか のリガンドが受容体仲介遺伝子転移のために使用されてきた。一番敷衍して特徴
付けられたリガンドはアシアロオロソムコイド（ASOR）（WuとWu、1987）とトラ
ンスフェリン（Wagnerら、1990）である。最近では、ASORと同じ受容体を認識す
る合成ネオ糖タンパク質が遺伝子デリバリービーイクルとして使用されてきてお
り（Ferkolら、1993；Peralesら、1994）、また上皮成長因子（EGF）もまた扁平
上皮癌細胞に対して遺伝子をデリバリーするのに使用されてきた（Myers、EPO 0
273085）。
【０１２２】 他の実施形態では、デリバリーシステムは1つのリガンドと1つのリポソームか
ら成ることがある。例えば、Nicolauら（1987）は、リポソームの中に組み込ま れたラクトシルセラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシドを用い、肝
細胞によるインスリン遺伝子の摂取における増加を観察した。
ら成ることがある。例えば、Nicolauら（1987）は、リポソームの中に組み込ま れたラクトシルセラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシドを用い、肝
細胞によるインスリン遺伝子の摂取における増加を観察した。
【０１２３】 本発明のもう1つの実施形態では、発現構築物は単に裸の組換えＤＮAあるいは
プラスミドから成ることがある。この構築物の転移は、物理的あるいは化学的に
細胞膜の透過性を上げる上述の方法のいずれかにより行われることがある。これ
はとくにin vitroに転移するのに適用可能であるが、しかし、in vivoでの使用 にも適用されることがある。Dubenskyら（1984）は、CaPO4析出物の形態で、活 発なウイルス複製と急性感染を示す成体および新生マウスの肝臓および脾臓の中
にポリオーマウイルスを成功裡に注射した。BenvenistyとNeshif（1986）はまた
、CaPO4析出プラスミドの直接腹腔内注射を行い、その結果、トランスフェクシ ョンされた遺伝子の発現を生じることを示した。NF‐AT3をコードするDNAはまた
in vivoに同様な方法でトランスフェクションされ、NF‐AT3を発現することがあ
ることが考えられる。
プラスミドから成ることがある。この構築物の転移は、物理的あるいは化学的に
細胞膜の透過性を上げる上述の方法のいずれかにより行われることがある。これ
はとくにin vitroに転移するのに適用可能であるが、しかし、in vivoでの使用 にも適用されることがある。Dubenskyら（1984）は、CaPO4析出物の形態で、活 発なウイルス複製と急性感染を示す成体および新生マウスの肝臓および脾臓の中
にポリオーマウイルスを成功裡に注射した。BenvenistyとNeshif（1986）はまた
、CaPO4析出プラスミドの直接腹腔内注射を行い、その結果、トランスフェクシ ョンされた遺伝子の発現を生じることを示した。NF‐AT3をコードするDNAはまた
in vivoに同様な方法でトランスフェクションされ、NF‐AT3を発現することがあ
ることが考えられる。
【０１２４】 裸のDNA発現構築物を細胞の中に転移するための本発明のもう1つの実施形態に
は、粒子ボンバード法が含まれる。本方法は、微小突起物被包ＤＮAを高速に加 速してそのDNAを細胞膜通過させ、細胞を殺傷することなく細胞に入る能力に拠 っている（Kleinら、1987）。小粒子を加速するいくつかの装置が開発されてい る。そうした装置の1つは、電流を生成する高い電圧電荷に拠る装置であり、次 々に起動力を提供していく装置である（Yangら、1990）。使用されている微小突
起物は、タングステンあるいは金ビーズなどの生物学的に不活性な物質から成る
。
は、粒子ボンバード法が含まれる。本方法は、微小突起物被包ＤＮAを高速に加 速してそのDNAを細胞膜通過させ、細胞を殺傷することなく細胞に入る能力に拠 っている（Kleinら、1987）。小粒子を加速するいくつかの装置が開発されてい る。そうした装置の1つは、電流を生成する高い電圧電荷に拠る装置であり、次 々に起動力を提供していく装置である（Yangら、1990）。使用されている微小突
起物は、タングステンあるいは金ビーズなどの生物学的に不活性な物質から成る
。
【０１２５】 ある実施形態では、遺伝子転移はex vivo状態下ではさらに容易に実施するこ とができる。Ex vivo遺伝子適用とは、動物から細胞を分離し、in vitroの細胞 の中に核酸をデリバリーし、その後動物の中に修飾した細胞を戻すことを称して
言う。これには、動物あるいは細胞と組織の初代培養から組織/器官を外科的に 除去することが含まれる。
言う。これには、動物あるいは細胞と組織の初代培養から組織/器官を外科的に 除去することが含まれる。
【０１２６】 ｉ．ウイルス転移 アデノウイルス。In vivoデリバリーのための1つの好適な方法には、アデノウ
イルス発現ベクターの使用が含まれる。「アデノウイルス発現ベクター」は、（
a）その構築物のパッケージを支持する、また（b）それにクローン化されるアン
チセンスポリヌクレオチド、タンパク質、ポリヌクレオチド（例えば、リボザイ
ム、あるいはmRNA）を発現させる、のに十分なアデノウイルス配列を含有してい
るそうした構築物を含んでいることを意味する。この文脈では、発現にはその遺
伝子生成物が合成されていることは必要ではない。
イルス発現ベクターの使用が含まれる。「アデノウイルス発現ベクター」は、（
a）その構築物のパッケージを支持する、また（b）それにクローン化されるアン
チセンスポリヌクレオチド、タンパク質、ポリヌクレオチド（例えば、リボザイ
ム、あるいはmRNA）を発現させる、のに十分なアデノウイルス配列を含有してい
るそうした構築物を含んでいることを意味する。この文脈では、発現にはその遺
伝子生成物が合成されていることは必要ではない。
【０１２７】 発現ベクターはアデノウイルスの遺伝子工学的に処理された形態から成る。ア
デノウイルスの遺伝子体制、36 kb、線形、二本鎖DNAウイルスであることが分か
れば、アデノウイルスDNAの大きな部分を7 kbまでの外来配列で代替することが 可能である（GrunhausとHorwitz、1992）。レトロウイルスとは対照的に、宿主 細胞のアデノウイルス感染は、アデノウイルスDNAが潜在的な遺伝子毒性なしで エピソーム的な方法で複製可能であるため、染色体の統合化という結果にはなら
ない。本明細書に使用されている「遺伝子毒性」という用語は、永久遺伝的宿主
細胞遺伝子変化を称して言う。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、ゲ
ノムの再配列は正常誘導体の拡大増幅後にはまったく検出されなかった。アデノ
ウイルスは、それらの細胞サイクルの段階には関係なく実質的にすべての上皮細
胞に感染を起こすことができる。これまでのところ、アデノウイルス感染は、免
疫抑制されていないヒトにおける急性呼吸器疾患などの軽度の疾患にのみ関連し
ているようにみえる。
デノウイルスの遺伝子体制、36 kb、線形、二本鎖DNAウイルスであることが分か
れば、アデノウイルスDNAの大きな部分を7 kbまでの外来配列で代替することが 可能である（GrunhausとHorwitz、1992）。レトロウイルスとは対照的に、宿主 細胞のアデノウイルス感染は、アデノウイルスDNAが潜在的な遺伝子毒性なしで エピソーム的な方法で複製可能であるため、染色体の統合化という結果にはなら
ない。本明細書に使用されている「遺伝子毒性」という用語は、永久遺伝的宿主
細胞遺伝子変化を称して言う。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、ゲ
ノムの再配列は正常誘導体の拡大増幅後にはまったく検出されなかった。アデノ
ウイルスは、それらの細胞サイクルの段階には関係なく実質的にすべての上皮細
胞に感染を起こすことができる。これまでのところ、アデノウイルス感染は、免
疫抑制されていないヒトにおける急性呼吸器疾患などの軽度の疾患にのみ関連し
ているようにみえる。
【０１２８】 アデノウイルスは、その中等度の大きさのゲノム、操作の簡便さ、高い力価、
広範な標識細胞範囲、高い感染率のため、遺伝子転移ベクターとして使用するの
にはとくに適している。このウイルスゲノムの両端には、ウイルスDNA複製とパ ッケージングに必要なcisエレメントである、100〜200塩基対逆方向末端反復（I
TRs）が含まれる。ゲノムの初期（E）と後期（L）領域には、ウイルスDNA複製の
開始により分割される異なった転写ユニットが含まれる。E1領域（E1AとE1B）ウ
イルスゲノムの転写の調節を担当しているタンパク質をコードする。E2領域の発
現（E2AとE2B）はウイルスDNA複製のためのタンパク質の合成という結果になる 。れこらのタンパク質はDNA複製、後期遺伝子発現、宿主細胞シャットオフに関 与する（Renan、1990）。ウイルスキャプシドタンパク質の大多数を含め、後期 遺伝子の生成物は、主要な後期プロモーター（MLP）により起こる単一の初代転 写の有意な処理後にのみ発現される。MLP（16.8 m.u.に位置）は感染後期の間と
くに効率的であり、このプロモーターから生起するmRNAの転写は、それらを翻訳
に好適なmRNAの転写にする5'‐三分節系リーダー（TPL）配列を所持している。
広範な標識細胞範囲、高い感染率のため、遺伝子転移ベクターとして使用するの
にはとくに適している。このウイルスゲノムの両端には、ウイルスDNA複製とパ ッケージングに必要なcisエレメントである、100〜200塩基対逆方向末端反復（I
TRs）が含まれる。ゲノムの初期（E）と後期（L）領域には、ウイルスDNA複製の
開始により分割される異なった転写ユニットが含まれる。E1領域（E1AとE1B）ウ
イルスゲノムの転写の調節を担当しているタンパク質をコードする。E2領域の発
現（E2AとE2B）はウイルスDNA複製のためのタンパク質の合成という結果になる 。れこらのタンパク質はDNA複製、後期遺伝子発現、宿主細胞シャットオフに関 与する（Renan、1990）。ウイルスキャプシドタンパク質の大多数を含め、後期 遺伝子の生成物は、主要な後期プロモーター（MLP）により起こる単一の初代転 写の有意な処理後にのみ発現される。MLP（16.8 m.u.に位置）は感染後期の間と
くに効率的であり、このプロモーターから生起するmRNAの転写は、それらを翻訳
に好適なmRNAの転写にする5'‐三分節系リーダー（TPL）配列を所持している。
【０１２９】 E3領域は、感染細胞のTNF仲介細胞溶解とCTL仲介溶解を予防するだけでなく、
Ad感染細胞の効率的な溶解に必要であると思われるタンパク質をコードする。一
般的には、E4領域のコードは7つのタンパク質をコードすると考えられており、 そのうちのいくつかはE2プロモーターを活性化する。宿主mRNA輸送を阻止し、細
胞質へのウイルスRNAの輸送を促進する。さらに、E4生成物は感染の後期にみら れる初期遺伝子発現における減少に対する責任を部分的に負っている。E4はまた
E1AとE4（E1Bではない）発現を溶解増殖の間阻害する。いくつかのE4タンパク質
は、効率的なDNA複製には必要であるが、しかしこの関与についてのメカニズム は分かっていない。E4はまたウイルス後期遺伝子発現における転写後出来事に関
与している。すなわち、溶解増殖における三分節系リーダーの代替的なスプライ
シングである。他の機能には、ウイルスDNA合成の負の制御、アデノウイルス感 染の間に通常みられるサブ核再組織化の誘導が含まれ、またウイルス複製に必要
な他の機能には、後期ウイルスmRNA蓄積、宿主細胞転写シャットオフが含まれる
。
Ad感染細胞の効率的な溶解に必要であると思われるタンパク質をコードする。一
般的には、E4領域のコードは7つのタンパク質をコードすると考えられており、 そのうちのいくつかはE2プロモーターを活性化する。宿主mRNA輸送を阻止し、細
胞質へのウイルスRNAの輸送を促進する。さらに、E4生成物は感染の後期にみら れる初期遺伝子発現における減少に対する責任を部分的に負っている。E4はまた
E1AとE4（E1Bではない）発現を溶解増殖の間阻害する。いくつかのE4タンパク質
は、効率的なDNA複製には必要であるが、しかしこの関与についてのメカニズム は分かっていない。E4はまたウイルス後期遺伝子発現における転写後出来事に関
与している。すなわち、溶解増殖における三分節系リーダーの代替的なスプライ
シングである。他の機能には、ウイルスDNA合成の負の制御、アデノウイルス感 染の間に通常みられるサブ核再組織化の誘導が含まれ、またウイルス複製に必要
な他の機能には、後期ウイルスmRNA蓄積、宿主細胞転写シャットオフが含まれる
。
【０１３０】 現行の1つのシステムでは、組換えアデノウイルスはシャトルベクターとプロ ウイルスベクターの間の相同組換えから生成される。293細胞におけるプロウイ ルスベクターとAd配列の間の可能な組換え、あるいは挿入pBR322配列のpjM17プ ラスミド自発的欠失の場合では、完全長野生型Ad5アデノウイルスを生成する。 したがって、個々のプラーク由来ウイルスの単一クローンを分離し、またそのゲ
ノム構造を調べることが必須である。
ノム構造を調べることが必須である。
【０１３１】 複製が不十分である現行のアデノウイルスベクターの世代と増殖はAd5 DNA断 片によりヒト胚芽性腎細胞から形質転換され、構成的にE1タンパク質を発現する
ユニークなヘルパー細胞系、すなわち、企図されている293に依存している（Gra
hamら、1977）。E3領域はアデノウイルスゲノムからは省くことができるので（J
onesとShenk、1978）、現行のアデノウイルスベクターは、293細胞の助けを借り
て、E1かE3のいずれか、あるいは両方の領域に外来DNAを運ぶ（GrahamとPrevec 、1991）。性質上、アデノウイルスは野生型ゲノムのおよそ105％をパッケージ することができ（Ghosh‐Choudhuryら、1987）、DNAの約2kbの分を余分に収容す
る能力を提供することができる。E1とE3領域において置換可能であるDNAのおよ そ5.5 kbと組み合わせて、現行アデノウイルスベクターの最大の収容能力は7.5k
b未満、あるいはベクターの全長の約15％となる。アデノウイルスウイルスゲノ ムの80％以上がベクターバックボーンに残り、またベクターに由来する細胞毒性
の源である。また、E1欠失ウイルスの複製の欠失は不完全である。例えば、ウイ
ルス遺伝子発現の漏洩は高い感染多重度（MOI）で、現在入手可能なベクターで 観察されている（Mulligan、1993；Shenk、1978）。
ユニークなヘルパー細胞系、すなわち、企図されている293に依存している（Gra
hamら、1977）。E3領域はアデノウイルスゲノムからは省くことができるので（J
onesとShenk、1978）、現行のアデノウイルスベクターは、293細胞の助けを借り
て、E1かE3のいずれか、あるいは両方の領域に外来DNAを運ぶ（GrahamとPrevec 、1991）。性質上、アデノウイルスは野生型ゲノムのおよそ105％をパッケージ することができ（Ghosh‐Choudhuryら、1987）、DNAの約2kbの分を余分に収容す
る能力を提供することができる。E1とE3領域において置換可能であるDNAのおよ そ5.5 kbと組み合わせて、現行アデノウイルスベクターの最大の収容能力は7.5k
b未満、あるいはベクターの全長の約15％となる。アデノウイルスウイルスゲノ ムの80％以上がベクターバックボーンに残り、またベクターに由来する細胞毒性
の源である。また、E1欠失ウイルスの複製の欠失は不完全である。例えば、ウイ
ルス遺伝子発現の漏洩は高い感染多重度（MOI）で、現在入手可能なベクターで 観察されている（Mulligan、1993；Shenk、1978）。
【０１３２】 ヘルパー細胞系は、ヒト胚芽性腎細胞、筋細胞、造血細胞あるいは他のヒト胚
芽性間葉性あるいは上皮細胞などのヒト細胞から誘導されることがある。代替的
には、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに対して許容的である他の哺乳動物
種の細胞から誘導されることがある。こうした細胞には、例えば、Vero細胞ある
いは他のサル胚芽性間葉細胞あるいは上皮細胞が含まれる。上述のように、好適
なヘルパー細胞系は293である。
芽性間葉性あるいは上皮細胞などのヒト細胞から誘導されることがある。代替的
には、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに対して許容的である他の哺乳動物
種の細胞から誘導されることがある。こうした細胞には、例えば、Vero細胞ある
いは他のサル胚芽性間葉細胞あるいは上皮細胞が含まれる。上述のように、好適
なヘルパー細胞系は293である。
【０１３３】 最近、Racherら、（1995）は293細胞を培養し、またアデノウイルスを増殖す るための改善された方法を開示した。1つのフォーマットの中で、自然細胞集合 体が個々の細胞を100〜200ml培地を含む1リットルシリコン化攪拌フラスコ（Tec
hne社製、英国ケンブリッジ市）の中に播種することにより増殖する。40rpmで攪
拌した後、細胞の生存率はトリパンブルーで推定される。もう1つのフォーマッ トでは、Fibra‐Celマイクロキャリア（Bibby Sterlin社製、英国ストーン市） （5g/l）が以下のように用いられる。5 ml培地に懸濁した細胞接種物が、250 ml
Erlenmeyerフラスコの中にあるキャリア（50 ml）に加えられ、1〜4時間、静止
状態で放置し、ときどき攪拌される。培地はその後50mlの新鮮な培地に取り替え
られ、振とうが開始される。ウイルス産生のため、細胞は増殖して約80％の融合
率となることが可能で、その所要時間の後、培地は取り替えられ（最終容量の25
％まで）、MOI 0.05でアデノウイルスが加えられる。培養培地は静止状態で一夜
放置され、続いて、その容量が100％まで増加され、振とうが始められ、さらに7
2時間行われる。
hne社製、英国ケンブリッジ市）の中に播種することにより増殖する。40rpmで攪
拌した後、細胞の生存率はトリパンブルーで推定される。もう1つのフォーマッ トでは、Fibra‐Celマイクロキャリア（Bibby Sterlin社製、英国ストーン市） （5g/l）が以下のように用いられる。5 ml培地に懸濁した細胞接種物が、250 ml
Erlenmeyerフラスコの中にあるキャリア（50 ml）に加えられ、1〜4時間、静止
状態で放置し、ときどき攪拌される。培地はその後50mlの新鮮な培地に取り替え
られ、振とうが開始される。ウイルス産生のため、細胞は増殖して約80％の融合
率となることが可能で、その所要時間の後、培地は取り替えられ（最終容量の25
％まで）、MOI 0.05でアデノウイルスが加えられる。培養培地は静止状態で一夜
放置され、続いて、その容量が100％まで増加され、振とうが始められ、さらに7
2時間行われる。
【０１３４】 アデノウイルスベクターが複製欠失である、少なくとも条件によっては不完全
であるという必要条件以外に、アデノウイルスの性質は本発明を成功裡に実施す
るのに必須のものではないと考えられる。アデノウイルスは42の異なった公知の
血清型あるいはサブグループA〜Fのいずれかのものである。サブグループCのア デノウイルスタイプ5は、本発明で使用するための条件付き複製欠失アデノウイ ルスベクターを得るためには好適な開始物質である。これはアデノウイルスタイ
プ5がヒトアデノウイルスであり、それについて生物化学的、医学的、遺伝子的 情報が多く知られており、また歴史的にベクターとしてアデノウイルスを用いる
たいていの構築物用に使用されてきたからである。
であるという必要条件以外に、アデノウイルスの性質は本発明を成功裡に実施す
るのに必須のものではないと考えられる。アデノウイルスは42の異なった公知の
血清型あるいはサブグループA〜Fのいずれかのものである。サブグループCのア デノウイルスタイプ5は、本発明で使用するための条件付き複製欠失アデノウイ ルスベクターを得るためには好適な開始物質である。これはアデノウイルスタイ
プ5がヒトアデノウイルスであり、それについて生物化学的、医学的、遺伝子的 情報が多く知られており、また歴史的にベクターとしてアデノウイルスを用いる
たいていの構築物用に使用されてきたからである。
【０１３５】 上述のように、本発明による典型的なベクターは、複製欠失性であり、アデノ
ウイルスE1領域を有しない。このように、これは、E1コード配列が除去された位
置で、関心の対象である遺伝子をコードするポリペプチドを導入するのに最も都
合が良いものであろう。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入位置は本
発明には重要なことではない。関心の対象である遺伝子をコードするポリヌクレ
オチドはまた、Karlssonら（1986）により説明されているように、E3置換ベクタ
ーにおける欠失E3領域の場所に挿入されることもあり、あるいはヘルパー細胞系
ないしはヘルパーウイルスがE4欠損を補完する場所であるE4領域に挿入されるこ
ともある。
ウイルスE1領域を有しない。このように、これは、E1コード配列が除去された位
置で、関心の対象である遺伝子をコードするポリペプチドを導入するのに最も都
合が良いものであろう。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入位置は本
発明には重要なことではない。関心の対象である遺伝子をコードするポリヌクレ
オチドはまた、Karlssonら（1986）により説明されているように、E3置換ベクタ
ーにおける欠失E3領域の場所に挿入されることもあり、あるいはヘルパー細胞系
ないしはヘルパーウイルスがE4欠損を補完する場所であるE4領域に挿入されるこ
ともある。
【０１３６】 アデノウイルスは、増殖し、操作し、in vitroとin vivoに広範な宿主域を示 すことが容易である。ウイルスのこのグループは例えば、109〜1011プラーク形 成単位/mlといった高い力価で得ることができ、また高度に感染性である。アデ ノウイルスのライフサイクルでは、一体化して宿主細胞ゲノムの中に入っていく
必要はない。アデノウイルスベクターによりデリバリーされる外来遺伝子は、エ
ピソームのベクターであり、したがって、宿主細胞に対しては低い遺伝子毒性を
有する。野生型のアデノウイルスに関するワクチン化の研究では副作用は報告さ
れて折らず（Couchら、1963；Topら、1971）、in vivoでの遺伝子転移ベクター としてのそれらの安全性と治療上の潜在力が示されている。
必要はない。アデノウイルスベクターによりデリバリーされる外来遺伝子は、エ
ピソームのベクターであり、したがって、宿主細胞に対しては低い遺伝子毒性を
有する。野生型のアデノウイルスに関するワクチン化の研究では副作用は報告さ
れて折らず（Couchら、1963；Topら、1971）、in vivoでの遺伝子転移ベクター としてのそれらの安全性と治療上の潜在力が示されている。
【０１３７】 アデノウイルスベクターは真核細胞遺伝子発現研究調査とワクチン開発（Grun
hausとHorwitz、1992；GrahamとPrevec、1992）において使用されてきた（Levre
roら、1991；Gomez‐Foixら、1992）。最近では、動物研究で、組換えアデノウ イルスが遺伝子転移に使用することができることが示唆されている（Stratford ‐PerricaudetとPerricaudet、1991；Stratford‐Perricaudetら、1990；Richら
、1993）。点滴注入（Rosenfeldら、１９９１；Rosenfeldら、1992）、筋注（Ra
gotら、1993）、末梢静脈注射（HerzとGerard、1993）、鼻腔内接種（Ginsberら
、1991）、肺へのエアゾール投与（Bellon、1996）、腹腔内投与（Songら、1997
）、胸腔内注射（Elshamiら、1996）、膀胱内投与法を使用した膀胱への投与（W
erthman、1996）、腹腔内、胸腔内、筋内あるいは皮下を含む皮下注射（Ogawa、
1989）、心筋層への心室注射（心臓、Frenchら、1994）、肝灌流（冠動脈あるい
は門脈、Shiraishiら、1997）、脳への定位的接種（Le Gal La Salleら、1993）
を含めて、様々な異なった組織に組換えアデノウイルスを投与するに当たっての
研究がある。
hausとHorwitz、1992；GrahamとPrevec、1992）において使用されてきた（Levre
roら、1991；Gomez‐Foixら、1992）。最近では、動物研究で、組換えアデノウ イルスが遺伝子転移に使用することができることが示唆されている（Stratford ‐PerricaudetとPerricaudet、1991；Stratford‐Perricaudetら、1990；Richら
、1993）。点滴注入（Rosenfeldら、１９９１；Rosenfeldら、1992）、筋注（Ra
gotら、1993）、末梢静脈注射（HerzとGerard、1993）、鼻腔内接種（Ginsberら
、1991）、肺へのエアゾール投与（Bellon、1996）、腹腔内投与（Songら、1997
）、胸腔内注射（Elshamiら、1996）、膀胱内投与法を使用した膀胱への投与（W
erthman、1996）、腹腔内、胸腔内、筋内あるいは皮下を含む皮下注射（Ogawa、
1989）、心筋層への心室注射（心臓、Frenchら、1994）、肝灌流（冠動脈あるい
は門脈、Shiraishiら、1997）、脳への定位的接種（Le Gal La Salleら、1993）
を含めて、様々な異なった組織に組換えアデノウイルスを投与するに当たっての
研究がある。
【０１３８】 レトロウイルス。レトロウイルスは、逆転写のプロセスにより感染細胞の中で
そのRNAを二本鎖DNAに変換する能力によって特徴付けられる一本鎖RNAウイルス のグループの1つである（Coffin、1990）。結果的に生じるDNAは安定的に一体化
して、プロウイルスとして細胞染色体の中に入り、ウイルスタンパク失の合成を
指示する。一体化は受容者細胞とその子孫の中にあるウイルス遺伝子配列の維持
という結果になる。レトロウイルスゲノムには、キャプシドタンパク質、ポリメ
ラーゼ酵素、エンベロープ組成物をそれぞれコードする三つの遺伝子、gag、pol
、envが含まれる。Ggag遺伝子から上流で発見される配列には、ビリオンに入っ ていくゲノムのパッケージを行うためのシグナルが含まれる。2つの長末端反復 （LTR）配列はウイルスゲノムの5'と3'末端に存在する。これらには、強力なプ ロモーターとエンハンサー配列が含まれており、一体化して宿主細胞ゲノムの中
に入ることも必要となる（Coffin、1990）。
そのRNAを二本鎖DNAに変換する能力によって特徴付けられる一本鎖RNAウイルス のグループの1つである（Coffin、1990）。結果的に生じるDNAは安定的に一体化
して、プロウイルスとして細胞染色体の中に入り、ウイルスタンパク失の合成を
指示する。一体化は受容者細胞とその子孫の中にあるウイルス遺伝子配列の維持
という結果になる。レトロウイルスゲノムには、キャプシドタンパク質、ポリメ
ラーゼ酵素、エンベロープ組成物をそれぞれコードする三つの遺伝子、gag、pol
、envが含まれる。Ggag遺伝子から上流で発見される配列には、ビリオンに入っ ていくゲノムのパッケージを行うためのシグナルが含まれる。2つの長末端反復 （LTR）配列はウイルスゲノムの5'と3'末端に存在する。これらには、強力なプ ロモーターとエンハンサー配列が含まれており、一体化して宿主細胞ゲノムの中
に入ることも必要となる（Coffin、1990）。
【０１３９】 レトロウイルスベクターを構築するために、関心の対象である遺伝子をコード
する核酸が、複製欠陥性であるウイルスを産生するために、ある種のウイルス配
列の場所で、ウイルスゲノムの中に挿入される。ビリオンを産生するために、ga
g、pol、env遺伝子を含むが、しかしLTRは含まないパッケージング細胞系とパッ
ケージング組成物が構築される（Mannら、1983）。レトロウイルスLTRとパッケ ージング配列とともにcDNAを含む組換えプラスミドはこの細胞系の中に導入され
る場合（例えば、カルシウムリン酸塩析出物により）、そのパッケージング配列
は、ウイルス粒子の中にパッケージされるべき組換えプラスミドをRNA転写する ことが可能となるが、ウイルス粒子はその後分泌が行われれば、培養培地の中に
入れられる（NicolasとRubenstein、1988；Temin、1986；Mannら、1983）。組換
えレトロウイルスを含む培地はその後回収され、任意に濃縮され、遺伝子転移に
使用される。レトロウイルスベクターは広範な様々な細胞のタイプを感染させる
ことができる。しかし、一体化と安定した発現には、宿主細胞の分割が必要であ
る（Paskind、1975）。
する核酸が、複製欠陥性であるウイルスを産生するために、ある種のウイルス配
列の場所で、ウイルスゲノムの中に挿入される。ビリオンを産生するために、ga
g、pol、env遺伝子を含むが、しかしLTRは含まないパッケージング細胞系とパッ
ケージング組成物が構築される（Mannら、1983）。レトロウイルスLTRとパッケ ージング配列とともにcDNAを含む組換えプラスミドはこの細胞系の中に導入され
る場合（例えば、カルシウムリン酸塩析出物により）、そのパッケージング配列
は、ウイルス粒子の中にパッケージされるべき組換えプラスミドをRNA転写する ことが可能となるが、ウイルス粒子はその後分泌が行われれば、培養培地の中に
入れられる（NicolasとRubenstein、1988；Temin、1986；Mannら、1983）。組換
えレトロウイルスを含む培地はその後回収され、任意に濃縮され、遺伝子転移に
使用される。レトロウイルスベクターは広範な様々な細胞のタイプを感染させる
ことができる。しかし、一体化と安定した発現には、宿主細胞の分割が必要であ
る（Paskind、1975）。
【０１４０】 レトロウイルスベクターの特異的標的誘導を可能にするように設計された新規
なアプローチが、ウイルスエンベロープにラクトース残基の化学的付加によるレ
トロウイルスの化学的修飾をベースにして最近開発された。この修飾はシアロ糖
タンパク質受容体を介して肝細胞の特異的感染を可能にすることができた。
なアプローチが、ウイルスエンベロープにラクトース残基の化学的付加によるレ
トロウイルスの化学的修飾をベースにして最近開発された。この修飾はシアロ糖
タンパク質受容体を介して肝細胞の特異的感染を可能にすることができた。
【０１４１】 組換えレトロウイルスの標的誘導に対する異なったアプローチが設計されたが
、それにはレトロウイルスエンベロープタンパク質と特異的な細胞受容体に対す
るビオチニル化抗体が使用された。抗体は、ストレプタビジンを使用することに
よりビオチン組成物を介して結合された（Rouxら、1989）。主要な組織適合性複
合体クラスIとクラスII抗原に対する抗体を使用した場合では、抗体は、in vitr
oで自己指向性ウイルスをこうした表面抗原に帯びた、様々なヒト細胞の感染を 示した（Rouxら、1989）。
、それにはレトロウイルスエンベロープタンパク質と特異的な細胞受容体に対す
るビオチニル化抗体が使用された。抗体は、ストレプタビジンを使用することに
よりビオチン組成物を介して結合された（Rouxら、1989）。主要な組織適合性複
合体クラスIとクラスII抗原に対する抗体を使用した場合では、抗体は、in vitr
oで自己指向性ウイルスをこうした表面抗原に帯びた、様々なヒト細胞の感染を 示した（Rouxら、1989）。
【０１４２】 本発明のすべての形態ではレトロウイルスベクターの使用には一定の限度がある
。例えば、レトロウイルスベクターは通常細胞ゲノムにおいて無作為な部位の中
に一体化する。これは、宿主遺伝子の切断により、あるいは隣接遺伝子の機能を
干渉できるウイルス制御配列の挿入により、挿入的突然変異誘発に繋がる可能性
がある（Varmusら、1981）。不完全なレトロウイルスベクターの使用に関するも
う1つの関心事は、パッケージング細胞における野生型複製感応ウイルスの潜在 的な発生である。これは、組換えウイルス由来の完全な配列が、宿主細胞ゲノム
において一体化されたgag、pol、env配列から上流に挿入されるという組換え出 来事から結果的に生じる可能性がある。しかし、組換えの可能性を非常に軽減す
ることとした新しいパッケージング細胞系が現在では入手可能である（Markowit
zら、1988；Hersdorfferら、1990）。
。例えば、レトロウイルスベクターは通常細胞ゲノムにおいて無作為な部位の中
に一体化する。これは、宿主遺伝子の切断により、あるいは隣接遺伝子の機能を
干渉できるウイルス制御配列の挿入により、挿入的突然変異誘発に繋がる可能性
がある（Varmusら、1981）。不完全なレトロウイルスベクターの使用に関するも
う1つの関心事は、パッケージング細胞における野生型複製感応ウイルスの潜在 的な発生である。これは、組換えウイルス由来の完全な配列が、宿主細胞ゲノム
において一体化されたgag、pol、env配列から上流に挿入されるという組換え出 来事から結果的に生じる可能性がある。しかし、組換えの可能性を非常に軽減す
ることとした新しいパッケージング細胞系が現在では入手可能である（Markowit
zら、1988；Hersdorfferら、1990）。
【０１４３】 ヘルペスウイルス。単純疱疹ウイルス（HSV）は、神経向性であるので、神経系 障害を治療するに当たってかなりの関心を呼んだ。さらに、宿主細胞染色体の中
に一体化することなく非分割ニューロン細胞において潜伏期の感染を確立する、
あるいは、潜伏期の間活性であるプロモーターの存在に沿って、宿主細胞の代謝
を変更するHSVの能力はHSVを魅力的なベクターにしている。HSVの神経向性適用 に多くの関心が集まったが、このベクターもまた、その広範な宿主域を他の組織
に対して用いることができる。
に一体化することなく非分割ニューロン細胞において潜伏期の感染を確立する、
あるいは、潜伏期の間活性であるプロモーターの存在に沿って、宿主細胞の代謝
を変更するHSVの能力はHSVを魅力的なベクターにしている。HSVの神経向性適用 に多くの関心が集まったが、このベクターもまた、その広範な宿主域を他の組織
に対して用いることができる。
【０１４４】 HSVを魅力的なベクターにしているもう1つの要因はそのサイズであり、またゲ
ノムの構成である。HSVは大きいため、複数遺伝子あるいは発現カセットの組込 みは、他のより小さなウイルス系よりも問題がない。さらに、様々な性能（一過
性、強さ、など）を伴っているため、異なったウイルス制御配列の有用性があり
、他のシステムにおけるものよりも、ずっと大きな割合で発現を制御することが
できるようになっている。このウイルスは比較的に数が少なくてほとんどない、
スプライシングされたメッセージを有しており、さらに遺伝子操作を容易にする
という点もまた利点である。
ノムの構成である。HSVは大きいため、複数遺伝子あるいは発現カセットの組込 みは、他のより小さなウイルス系よりも問題がない。さらに、様々な性能（一過
性、強さ、など）を伴っているため、異なったウイルス制御配列の有用性があり
、他のシステムにおけるものよりも、ずっと大きな割合で発現を制御することが
できるようになっている。このウイルスは比較的に数が少なくてほとんどない、
スプライシングされたメッセージを有しており、さらに遺伝子操作を容易にする
という点もまた利点である。
【０１４５】 HSVはまた、操作するのが比較的容易であり、増殖させて高い力価にすることが できる。このようにデリバリーは、十分なMOIを達成するのに必要な容量という 点、また反復投与に対する必要性が軽減されているという点の両方で、問題が少
ない。遺伝子転移ベクターとしてのHSVの総説に関しては、Gloriosoら（1995） を参照のこと。
ない。遺伝子転移ベクターとしてのHSVの総説に関しては、Gloriosoら（1995） を参照のこと。
【０１４６】 HSVと言えば、サブタイプ1と2を意味するが、ヒトが遭遇した最も普遍的な感染 性病原体である外被ウイルスであり、世界中で数百万人のヒト対象者を感染させ
ている。大きくて、複合的で、二本鎖DNAゲノムは十数の異なった遺伝子生成物 をコードし、そのうちのいくつかはスプライシングされた転写物から誘導される
。ビリオンと外被構造組成物に加えて、ウイルスはプロテアーゼ、リボヌクレオ
チド還元酵素、DNAポリメラーゼ、ssDNA結合タンパク質、ヘリカーゼ/プリマー ゼ、DNA依存性ATPアーゼ、dUTPアーゼ、他を含む数多くのその他のタンパク質を
コードする。
ている。大きくて、複合的で、二本鎖DNAゲノムは十数の異なった遺伝子生成物 をコードし、そのうちのいくつかはスプライシングされた転写物から誘導される
。ビリオンと外被構造組成物に加えて、ウイルスはプロテアーゼ、リボヌクレオ
チド還元酵素、DNAポリメラーゼ、ssDNA結合タンパク質、ヘリカーゼ/プリマー ゼ、DNA依存性ATPアーゼ、dUTPアーゼ、他を含む数多くのその他のタンパク質を
コードする。
【０１４７】 HSV遺伝子は、カスケード様式でその発現が共同的に調節され、逐次的に順序立 てられているいくつかのグループを形成する（HonessとRoizman、1974；Honess とRoizman、1975；RoizmanとSears、1995）。α遺伝子の発現、感染後に発現す べき遺伝の第一セットは、ビリオンタンパク質No.16、あるいはα‐形質導入因 子により促進される（Postら、1981；BattersonとRoizman、1983）。β遺伝子の
発現は機能的なα遺伝子生成物を必要とするが、最も顕著なものはICP4であり、
これはα4遺伝子によりコードされる（DeLucaら、1985）。γ遺伝子は、大部分 ビリオン構造タンパク質をコードする遺伝子のヘテロ遺伝子グループであり、最
適な発現のためにはウイルスDNA合成の開始が必要である（Hollandら、1980）。
発現は機能的なα遺伝子生成物を必要とするが、最も顕著なものはICP4であり、
これはα4遺伝子によりコードされる（DeLucaら、1985）。γ遺伝子は、大部分 ビリオン構造タンパク質をコードする遺伝子のヘテロ遺伝子グループであり、最
適な発現のためにはウイルスDNA合成の開始が必要である（Hollandら、1980）。
【０１４８】 HSVのライフサイクルがゲノムの複合体に調和してとてもよく関与している。ウ イルス粒子の合成と、最終的には細胞死という結果になる溶解サイクルに加えて
、いままでのところまだ定義されていないシグナルのいくつかが、溶解サイクル
の再発のきっかけとなるまで、そのゲノムが神経節に維持されている潜伏期の状
態に入る能力をウイルスは有している。HSVの無毒性変異体が開発され、遺伝子 転移の文脈における用途で容易に入手可能である（米国特許第5,672,344号）。
、いままでのところまだ定義されていないシグナルのいくつかが、溶解サイクル
の再発のきっかけとなるまで、そのゲノムが神経節に維持されている潜伏期の状
態に入る能力をウイルスは有している。HSVの無毒性変異体が開発され、遺伝子 転移の文脈における用途で容易に入手可能である（米国特許第5,672,344号）。
【０１４９】 アデノ関連ウイルス。最近、アデノ関連ウイルス（AAV）はもっと通常的に使用 されているレトロウイルスとアデノウイルスベクターに対する潜在的な代替物と
して出現してきた。レトロウイルスとアデノウイルス仲介遺伝子転移に関する研
究は、前者の潜在的な腫瘍学的特性上の関心事を掘り起こし、また後者に関連す
る免疫原性の問題を提起したが、AAVがいずれのそうした病理学的適応には関連 がなかった。
して出現してきた。レトロウイルスとアデノウイルス仲介遺伝子転移に関する研
究は、前者の潜在的な腫瘍学的特性上の関心事を掘り起こし、また後者に関連す
る免疫原性の問題を提起したが、AAVがいずれのそうした病理学的適応には関連 がなかった。
【０１５０】 さらに、AAVは、他のベクターよりもさらに望ましいものにするいくつかのユニ ークな特徴を所持している。レトロウイルスとは違って、AAVは非分割細胞を感 染させることができる。すなわち、野生型AAVは部位特異的なやり方で、ヒト細 胞の染色体19の中に入り、一体化することによって特徴付けられる（KotinとBer
ns、1989；Kotinら、1990；Kotinら、1991；Samulskiら、1991）。AAVはまた抗 腫瘍学的特性を所持する（Ostroveら、1981；BernsとGiraud、1996）。組換えAA
Vゲノムは、AAV ITRsの間にある関心の対象であるDNA配列を分子的にクローニン
グし、野生型AAVゲノムの全コード配列を除外することにより構築される。この ように産生されるAAVベクターは野生型AAVのコード配列のいずれかを欠くが、安
定した染色体の一体化の特性と、in vitroとin vivoの両方で形質導入において 組換え遺伝子の発現の特性をまだ保っている（Berns、1990；BernsとBohensky、
1987；Bertranら、1996；Kearnsら、1996；Ponazhaganら、1997a）。最近まで、
AAVはほとんどすべての細胞のタイプを感染させる、種の壁も越えてしまうと考 えられていた。しかし、現在は、AAV感染は受容体仲介されていることが判明し た（Ponnazhaganら、1996；Mizukamiら、1996）。
ns、1989；Kotinら、1990；Kotinら、1991；Samulskiら、1991）。AAVはまた抗 腫瘍学的特性を所持する（Ostroveら、1981；BernsとGiraud、1996）。組換えAA
Vゲノムは、AAV ITRsの間にある関心の対象であるDNA配列を分子的にクローニン
グし、野生型AAVゲノムの全コード配列を除外することにより構築される。この ように産生されるAAVベクターは野生型AAVのコード配列のいずれかを欠くが、安
定した染色体の一体化の特性と、in vitroとin vivoの両方で形質導入において 組換え遺伝子の発現の特性をまだ保っている（Berns、1990；BernsとBohensky、
1987；Bertranら、1996；Kearnsら、1996；Ponazhaganら、1997a）。最近まで、
AAVはほとんどすべての細胞のタイプを感染させる、種の壁も越えてしまうと考 えられていた。しかし、現在は、AAV感染は受容体仲介されていることが判明し た（Ponnazhaganら、1996；Mizukamiら、1996）。
【０１５１】 AAVは、約4700塩基対の線形、一本鎖DNAを利用している。逆方向末端反復がその
ゲノムの側面に位置する。2つの遺伝子はゲノム内に存在し、数々の明瞭な遺伝 子生成物を生じさせる。第1に、cap遺伝子は、VP‐1、VP‐2、VP‐3と呼ばれる3
つの異なったビリオンタンパク質（VP）を産生する。第2に、rep遺伝子は四つの
非構造タンパク質（NS）をコードする。これらのrep遺伝子生成物の1つないしは
それ以上はAAV転写をトランス作用する責を負っている。AAVの配列はSrivastava
ら（1983）により、また米国特許第5,252,479号（その全テキストが参照として 本明細書にとくに記載されている）の中に提供されている。
ゲノムの側面に位置する。2つの遺伝子はゲノム内に存在し、数々の明瞭な遺伝 子生成物を生じさせる。第1に、cap遺伝子は、VP‐1、VP‐2、VP‐3と呼ばれる3
つの異なったビリオンタンパク質（VP）を産生する。第2に、rep遺伝子は四つの
非構造タンパク質（NS）をコードする。これらのrep遺伝子生成物の1つないしは
それ以上はAAV転写をトランス作用する責を負っている。AAVの配列はSrivastava
ら（1983）により、また米国特許第5,252,479号（その全テキストが参照として 本明細書にとくに記載されている）の中に提供されている。
【０１５２】 AAVの3つのプロモーターは、地図単位の中、ゲノムの中のそれらの位置により呼
称されている。これらは左から右に、p5、p19、p40である。転写は6つの転写物 を生じさせ、3つのプロモーターのそれぞれで2つが開始され、各対のうちの1つ がスプライシングされる。地図単位42〜46から誘導されるスプランシング部位は
各転写物で同じである。4つの非構造タンパク質は明らかに転写物の長い方のも のから誘導されており、3つのビリオンタンパク質はすべて最も小さい転写物か ら生じる。
称されている。これらは左から右に、p5、p19、p40である。転写は6つの転写物 を生じさせ、3つのプロモーターのそれぞれで2つが開始され、各対のうちの1つ がスプライシングされる。地図単位42〜46から誘導されるスプランシング部位は
各転写物で同じである。4つの非構造タンパク質は明らかに転写物の長い方のも のから誘導されており、3つのビリオンタンパク質はすべて最も小さい転写物か ら生じる。
【０１５３】 AVVはヒトではいずれの病理学的状態とも関連がない。興味深いことに、効率的 な複製については、AAVは単純疱疹ウイルスIとII、サイトメガロウイルス、仮性
狂犬病ウイルス、そしてもちろんアデノウイルスなどからの「助けてくれる」機
能を必要としている。ヘルパーのうちで最も良く特徴付けられているのはアデノ
ウイルスであり、このウイルスに関する多くの「初期」機能はAAV複製を助ける ことが示されている。AAV repタンパク質の低いレベルの発現はAAV構造発現をチ
ェックして抑えていると考えられ、ヘルパーウイルス感染はこの阻止しているも
のを取り除いていると考えられている。
狂犬病ウイルス、そしてもちろんアデノウイルスなどからの「助けてくれる」機
能を必要としている。ヘルパーのうちで最も良く特徴付けられているのはアデノ
ウイルスであり、このウイルスに関する多くの「初期」機能はAAV複製を助ける ことが示されている。AAV repタンパク質の低いレベルの発現はAAV構造発現をチ
ェックして抑えていると考えられ、ヘルパーウイルス感染はこの阻止しているも
のを取り除いていると考えられている。
【０１５４】 ワクシニアウイルス。ワクシニアウイルスベクターは、その構築が容易で、比較
的高いレベルの発現が得られ、広範な宿主域とDNAを運ぶための大きな収容能力 のため、拡大して使用されてきた。ワクシニアには、線形、顕著な「A〜T」優先
を示す二本鎖DNAゲノムが含まれる。約10.5 kbの逆方向末端反復がゲノムの側面
に隣接する。重要な遺伝子の大半が中央領域内に位置決めするようにみえるが、
これはポックスウイルスの間では最も高度に保存されているところである。ワク
シニアウイルスにおいて推定される読み枠は150〜200から成る。両方の鎖はコー
ドされるが、読み枠の広範な重複は通常ない。
的高いレベルの発現が得られ、広範な宿主域とDNAを運ぶための大きな収容能力 のため、拡大して使用されてきた。ワクシニアには、線形、顕著な「A〜T」優先
を示す二本鎖DNAゲノムが含まれる。約10.5 kbの逆方向末端反復がゲノムの側面
に隣接する。重要な遺伝子の大半が中央領域内に位置決めするようにみえるが、
これはポックスウイルスの間では最も高度に保存されているところである。ワク
シニアウイルスにおいて推定される読み枠は150〜200から成る。両方の鎖はコー
ドされるが、読み枠の広範な重複は通常ない。
【０１５５】 少なくとも25 kbをワクシニアウイルスゲノムの中に挿入することができる（Smi
thとMoss、1983）。プロトタイプのワクシニアベクターには、相同組換えを介し
てウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子の中に挿入されたトランス遺伝子が含まれ
る。ベクターはtk‐表現型を基礎にして選択される。脳心筋炎ウイルスの非翻訳
リーダー配列を含めると、発現レベルは通常のベクターの発現レベルよりも高く
なり、それとともに24時間で感染した細胞のタンパク質の10％あるいはそれ以上
にトランス遺伝子が蓄積する。
thとMoss、1983）。プロトタイプのワクシニアベクターには、相同組換えを介し
てウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子の中に挿入されたトランス遺伝子が含まれ
る。ベクターはtk‐表現型を基礎にして選択される。脳心筋炎ウイルスの非翻訳
リーダー配列を含めると、発現レベルは通常のベクターの発現レベルよりも高く
なり、それとともに24時間で感染した細胞のタンパク質の10％あるいはそれ以上
にトランス遺伝子が蓄積する。
【０１５６】 c.選択方法 初代哺乳動物細胞培養は様々な方法で作成することができる。In vitroで、ま
た発現構築物と接触して細胞が生存を維持するようにするためには、細胞が酸素
と二酸化炭素と栄養の正しい割合で接するように維持するが、しかし微生物汚染
からは保護することを確実にする必要がある。細胞培養技術はよく報告されてお
り、本明細書で参照として開示される（Freshner、1992）。
た発現構築物と接触して細胞が生存を維持するようにするためには、細胞が酸素
と二酸化炭素と栄養の正しい割合で接するように維持するが、しかし微生物汚染
からは保護することを確実にする必要がある。細胞培養技術はよく報告されてお
り、本明細書で参照として開示される（Freshner、1992）。
【０１５７】 上記の1つの実施形態には、タンパク質の産生のため細胞を不死化するのに遺 伝子転移の使用が含まれる。関心の対象であるタンパク質の遺伝子は上述のよう
に適当な宿主細胞の中に転移され、その後、適当な条件下で細胞の培養を行う。
実質的には何らかのポリペプチドの遺伝子がこの方法で用いられうる。組換え発
現ベクターの世代と、そこに含まれるエレメントは上述した。代替的には、産生
されるべきタンパク質は該当する細胞により正常に合成される内在性タンパク質
であることがある。
に適当な宿主細胞の中に転移され、その後、適当な条件下で細胞の培養を行う。
実質的には何らかのポリペプチドの遺伝子がこの方法で用いられうる。組換え発
現ベクターの世代と、そこに含まれるエレメントは上述した。代替的には、産生
されるべきタンパク質は該当する細胞により正常に合成される内在性タンパク質
であることがある。
【０１５８】 有用な哺乳動物宿主細胞系の実施例は、VeroとHeLa細胞ならびにチャイニーズハ
ムスター卵巣、W138、BHK、COS‐7、293、HepG2、NIH3T3、RIN、MDCK細胞である
。さらに、宿主細胞株は挿入配列の発現を調節する、あるいは所望されるやり方
で遺伝子生成物を修飾し、処理する宿主細胞株が選択される。タンパク質生成物
のこうした修飾（例えば、グリコシル化）と処理（例えば、切断）はタンパク質
の機能にとっては重要である。宿主細胞が異なれば、タンパク質の翻訳後処理と
修飾に関する特性や特異的なメカニズムも異なる。適当な細胞系あるいは宿主系
は、発現される外来タンパク質の正しい修飾と処理を確実にするよう選択するこ
とができる。
ムスター卵巣、W138、BHK、COS‐7、293、HepG2、NIH3T3、RIN、MDCK細胞である
。さらに、宿主細胞株は挿入配列の発現を調節する、あるいは所望されるやり方
で遺伝子生成物を修飾し、処理する宿主細胞株が選択される。タンパク質生成物
のこうした修飾（例えば、グリコシル化）と処理（例えば、切断）はタンパク質
の機能にとっては重要である。宿主細胞が異なれば、タンパク質の翻訳後処理と
修飾に関する特性や特異的なメカニズムも異なる。適当な細胞系あるいは宿主系
は、発現される外来タンパク質の正しい修飾と処理を確実にするよう選択するこ
とができる。
【０１５９】 このように、発現構築物の細胞への導入後、リポーター遺伝子は通常の手段によ
り測定することができる。リポーター遺伝子の生成物を検出するいずれの測定法
も、リポーター遺伝子によりコードされたタンパク質を直接検出する方法であっ
ても、あるいはリポーター遺伝子コード酵素の酵素生成物を検出する方法であっ
ても、本発明での使用には適合する。測定法には、比色計法、蛍光定量法、発光
測定法、あるいはタンパク質標識化の場合であれば、ラジオイムノアッセイ法あ
るいは他の免疫学的測定法が含まれる。トランスフェクション効率は、構成的に
リポーター遺伝子に操作可能にリンクされている活性プロモーターを含む発現構
築物をコトランスフェクションすることによってモニターすることができる。
り測定することができる。リポーター遺伝子の生成物を検出するいずれの測定法
も、リポーター遺伝子によりコードされたタンパク質を直接検出する方法であっ
ても、あるいはリポーター遺伝子コード酵素の酵素生成物を検出する方法であっ
ても、本発明での使用には適合する。測定法には、比色計法、蛍光定量法、発光
測定法、あるいはタンパク質標識化の場合であれば、ラジオイムノアッセイ法あ
るいは他の免疫学的測定法が含まれる。トランスフェクション効率は、構成的に
リポーター遺伝子に操作可能にリンクされている活性プロモーターを含む発現構
築物をコトランスフェクションすることによってモニターすることができる。
【０１６０】 tk‐、hgprt‐、aprt‐細胞の中にそれぞれ存在するHSVチミジンキナーゼ、ヒポ
キサンチン‐グアニンホスホリボシル転移酵素、アデニンホスホリボシル転移酵
素に限定されるわけではないが、それらを含む数々の選択システムが使用されう
る。また、抗代謝耐性は、dhfr、マイコフェノール酸に対する耐性を付与するgp
t、アミノグリコシドG418に対する耐性を付与するneo、ヒグロマイシンに対する
耐性を付与するhygroに対する選択を基礎として使用することができる。
キサンチン‐グアニンホスホリボシル転移酵素、アデニンホスホリボシル転移酵
素に限定されるわけではないが、それらを含む数々の選択システムが使用されう
る。また、抗代謝耐性は、dhfr、マイコフェノール酸に対する耐性を付与するgp
t、アミノグリコシドG418に対する耐性を付与するneo、ヒグロマイシンに対する
耐性を付与するhygroに対する選択を基礎として使用することができる。
【０１６１】 動物細胞は二つのモードでin vitroに増殖することができる。すなわち、大量培
養により懸濁液の中で増殖する非基質依存性細胞として、あるいはその増殖のた
めに固形基質に接することを必要とする基質依存性細胞として、増殖することが
できる。
養により懸濁液の中で増殖する非基質依存性細胞として、あるいはその増殖のた
めに固形基質に接することを必要とする基質依存性細胞として、増殖することが
できる。
【０１６２】 ６．トランス遺伝子発現のモニタリング 活性NF‐AT3が成功裡にトランスジェニック動物のゲノムの中に組み込まれた かどうかを判定するために、様々な異なった測定法が行われうる。トランスジェ
ニック動物はそのDNAを分析することにより同定されうる。この目的のために、 トランスジェニック動物がげっ歯類である場合は、尾部標本（1〜2cm）が3週齢 動物から切除されうる。これらの標本あるいは他の標本からのDNAは、トランス ジェニック創始動物（F0）とその子孫（F1とF2）を検出するために調整され、ま
たサザンブロット法、PCR法、あるいはスロットブロット法により分析されうる 。
ニック動物はそのDNAを分析することにより同定されうる。この目的のために、 トランスジェニック動物がげっ歯類である場合は、尾部標本（1〜2cm）が3週齢 動物から切除されうる。これらの標本あるいは他の標本からのDNAは、トランス ジェニック創始動物（F0）とその子孫（F1とF2）を検出するために調整され、ま
たサザンブロット法、PCR法、あるいはスロットブロット法により分析されうる 。
【０１６３】 a.病理学的研究 トランス遺伝子を運ぶ様々なF0、F1、F2動物が、免疫組織学、電子顕微鏡、心
電図検査法を含む様々な技術のいずれかにより、また全体および領域心重量を測
定することにより、心筋細胞横断領域を測定することにより、心筋細胞の数を測
定することにより分析することができる。適当な特異性をもつ抗体を使用するト
ランス遺伝子発現の免疫組織学的分析は公知の方法を使用して実施することがで
きる。領域体重、心筋細胞横断領域、心筋細胞核の数を測定する体型測定分析は
公知の方法を使用して実施することができる。心臓は機能、組織、胚芽性心臓遺
伝子に関して分析することができる。
電図検査法を含む様々な技術のいずれかにより、また全体および領域心重量を測
定することにより、心筋細胞横断領域を測定することにより、心筋細胞の数を測
定することにより分析することができる。適当な特異性をもつ抗体を使用するト
ランス遺伝子発現の免疫組織学的分析は公知の方法を使用して実施することがで
きる。領域体重、心筋細胞横断領域、心筋細胞核の数を測定する体型測定分析は
公知の方法を使用して実施することができる。心臓は機能、組織、胚芽性心臓遺
伝子に関して分析することができる。
【０１６４】 免疫を基礎とした分析では、NF‐AT3結合抗体に頼らなければならないことが ある。抗体産生技術の一般的な見直しがもたらされる。これらの技術は様々な動
物で使用することが可能であるが、抗体産生のための好適な宿主は本発明のNF‐
AT3ノックアウトマウスである。
物で使用することが可能であるが、抗体産生のための好適な宿主は本発明のNF‐
AT3ノックアウトマウスである。
【０１６５】 当業者には周知のことであるが、任意の組成物はその免疫原性において様々で
ある。したがって、ペプチドあるいはポリペプチド免疫原をキャリアに結合する
ことにより達成することができるので、宿主免疫系を押し上げることが多くの場
合、必要である。具体例および好適なキャリアはスカシ貝ヘモシアニン（KLH） とウシ血清アルブミン（BSA）である。オバルブミン、マウス血清アルブミン、 あるいは家兎血清アルブミンなどの他のアルブミンもまたキャリアとして使用す
ることができる。キャリアタンパク質にポリペプチドを接合するための手段は当
業者には周知のものであり、グルタルアルデヒド、m‐マレイミドベンコイル‐N
‐ヒドロキシスクシミドエステル、カルボジイミド、ビス‐ニ窒化ベンジジンを
含む。
ある。したがって、ペプチドあるいはポリペプチド免疫原をキャリアに結合する
ことにより達成することができるので、宿主免疫系を押し上げることが多くの場
合、必要である。具体例および好適なキャリアはスカシ貝ヘモシアニン（KLH） とウシ血清アルブミン（BSA）である。オバルブミン、マウス血清アルブミン、 あるいは家兎血清アルブミンなどの他のアルブミンもまたキャリアとして使用す
ることができる。キャリアタンパク質にポリペプチドを接合するための手段は当
業者には周知のものであり、グルタルアルデヒド、m‐マレイミドベンコイル‐N
‐ヒドロキシスクシミドエステル、カルボジイミド、ビス‐ニ窒化ベンジジンを
含む。
【０１６６】 特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られている免疫反応
の非特異的刺激物の使用により促進することができる。具体例と好適なアジュバ
ントには、完全Freudのアジュバント（殺傷したMycobacterium tuberculosisを 含む免疫反応非特異的刺激物）、不完全Freundのアジュバントとアルブミンヒド
ロキシドアジュバントが含まれる。
の非特異的刺激物の使用により促進することができる。具体例と好適なアジュバ
ントには、完全Freudのアジュバント（殺傷したMycobacterium tuberculosisを 含む免疫反応非特異的刺激物）、不完全Freundのアジュバントとアルブミンヒド
ロキシドアジュバントが含まれる。
【０１６７】 多クローン性抗体の産生に使用される免疫原組成物の分量は免疫化用に使用さ
れる動物と同様、免疫原の性質に関して様々である。様々な経路が免疫原を投与
するのに使用可能である（皮下、筋内、皮内、静脈内、腹腔内）。多クローン性
抗体の産生は免疫化の後様々な時点で、免疫化された動物の標本血によりモニタ
ーすることがある。第2の、追加抗原が注射で投与されることもある。追加抗原 投与と力価測定のプロセスは適当な力価が達成されるまで繰り返される。免疫原
性の所望されるレベルが得られれば、免疫動物は採血し、血清を分離して貯蔵す
ることができ、および/またはその動物はmAbsを生成するために使用することが できる。
れる動物と同様、免疫原の性質に関して様々である。様々な経路が免疫原を投与
するのに使用可能である（皮下、筋内、皮内、静脈内、腹腔内）。多クローン性
抗体の産生は免疫化の後様々な時点で、免疫化された動物の標本血によりモニタ
ーすることがある。第2の、追加抗原が注射で投与されることもある。追加抗原 投与と力価測定のプロセスは適当な力価が達成されるまで繰り返される。免疫原
性の所望されるレベルが得られれば、免疫動物は採血し、血清を分離して貯蔵す
ることができ、および/またはその動物はmAbsを生成するために使用することが できる。
【０１６８】 多クローン性抗体はNF‐AT3ペプチドあるいはその断片を含む免疫原により動 物を免疫化することによって作成され、その免疫動物から抗血清が回収される。
広範な動物種が抗血清の産生に使用可能である。典型的には、抗血清産生に使用
される動物は家兎、マウス、ラット、ハムスター、あるいはモルモットである。
家兎は血液量が比較的大量であるため、家兎は多クローン性抗体産生については
1つの好適な選択肢である。
広範な動物種が抗血清の産生に使用可能である。典型的には、抗血清産生に使用
される動物は家兎、マウス、ラット、ハムスター、あるいはモルモットである。
家兎は血液量が比較的大量であるため、家兎は多クローン性抗体産生については
1つの好適な選択肢である。
【０１６９】 モノクローナル抗体を得るため、NF‐AT3組成物により実験動物、好適にはノ ックアウトマウスをこれまた免疫化する。抗体世代を可能にするのに十分な時間
経過の後、動物から脾臓あるいはリンパ細胞集団を得る。脾臓あるいはリンパ細
胞はその後、抗体分泌ハイブリドーマを産生するため、ヒトあるいはマウス筋腫
株などの細胞系と融合させることができる。これらのハイブリドーマは所望され
ている標的ペプチドに対する抗体の産生をスクリーニングできる個々のクローン
を得るため、分離することがある。
経過の後、動物から脾臓あるいはリンパ細胞集団を得る。脾臓あるいはリンパ細
胞はその後、抗体分泌ハイブリドーマを産生するため、ヒトあるいはマウス筋腫
株などの細胞系と融合させることができる。これらのハイブリドーマは所望され
ている標的ペプチドに対する抗体の産生をスクリーニングできる個々のクローン
を得るため、分離することがある。
【０１７０】 本発明のモノクローナル抗体はまた、NF‐AT3エピトープに特異的な抗体を利 用する他の手順と同様に、ELISA法やウェスタンブロット法などの標準的な免疫 化学的手順において有用な適用を見出すことになるだろう。さらに、NF‐AT3に 特異的なモノクローナル抗体は他の有用な適用において利用可能である。例えば
、抗NF‐AT3抗体に対する抗イディオタイプ抗体はNF‐AT3結合部位をうまく擬態
することができ、そのため、NF‐AT3標的の同定のための道具を提供することが できる。
、抗NF‐AT3抗体に対する抗イディオタイプ抗体はNF‐AT3結合部位をうまく擬態
することができ、そのため、NF‐AT3標的の同定のための道具を提供することが できる。
【０１７１】 b. mRNAレベル測定によりトランス遺伝子発現を分析 メッセンジャーRNAは、ノーザンブロット法、RNAアーゼ、ヌクレアーゼ保護測
定法により発現レベルを測定するため、トランスジェニック動物の細胞系と組織
から採取して酸グアニジウムチオシアネート‐フェニール：クロロホルム抽出法
（ChomczynskiとSacchi、1987）に限定されるわけではないが、これを含めた、 当業者には公知のいずれかの方法により、分離することができる。
定法により発現レベルを測定するため、トランスジェニック動物の細胞系と組織
から採取して酸グアニジウムチオシアネート‐フェニール：クロロホルム抽出法
（ChomczynskiとSacchi、1987）に限定されるわけではないが、これを含めた、 当業者には公知のいずれかの方法により、分離することができる。
【０１７２】 c. タンパク質レベル測定によるトランス遺伝子発現の分析 タンパク質レベルは、トランス遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的
な1つないしはそれ以上の抗体を使用して、ウェスタンブロット分析、ELISA、ラ
ジオイムノアッセイに限定されるわけではないが、それらを含む当業者には公知
のいずれかの手段により測定される。
な1つないしはそれ以上の抗体を使用して、ウェスタンブロット分析、ELISA、ラ
ジオイムノアッセイに限定されるわけではないが、それらを含む当業者には公知
のいずれかの手段により測定される。
【０１７３】 ウェスタンブロット分析に関しては、タンパク質分画は組織ホモジネートと細
胞リゼイトから分離し、例えば、Harlowら『抗体‐ラボマニュアル（Antibodies
：A Laboratory Manual）』、Cold Spring Harbor刊、NY、1988年；Brownら（19
83）；Tate‐Ostroffら（1989）により説明されているように、ウェスタンブロ ット分析にかける。
胞リゼイトから分離し、例えば、Harlowら『抗体‐ラボマニュアル（Antibodies
：A Laboratory Manual）』、Cold Spring Harbor刊、NY、1988年；Brownら（19
83）；Tate‐Ostroffら（1989）により説明されているように、ウェスタンブロ ット分析にかける。
【０１７４】 例えば、タンパク質分画はLaemmli標本緩衝液の中で変性され、SDS‐ポリアク
リラミドゲル上で電気泳動にかけることができる。タンパク質はその後、電気ブ
ロット法によりニトロセルローズフィルターに移される。フィルターは遮断され
、初代抗体とともに温置され、最終的には二次性抗体に接合した酵素と反応させ
る。続いて適当な色素産生基質により温置され、トランス遺伝子コードタンパク
質の位置が明らかになる。
リラミドゲル上で電気泳動にかけることができる。タンパク質はその後、電気ブ
ロット法によりニトロセルローズフィルターに移される。フィルターは遮断され
、初代抗体とともに温置され、最終的には二次性抗体に接合した酵素と反応させ
る。続いて適当な色素産生基質により温置され、トランス遺伝子コードタンパク
質の位置が明らかになる。
【０１７５】 ELISA法は本発明とともに好適に使用される。例えば、ELISA測定法は標本から
のNF‐AT3が選択表面、好適にはポリスチレーンマイクロタイタープレートのも のなどと同様にタンパク質親和性を示す表面上に固定されるところで実施するこ
とができる。このプレートは不完全に吸着した物質を除去するために洗浄され、
プレートは、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、あるいは粉ミルク溶液な どの試験抗体に関しては抗原的に中性であることが知られている日特異的タンパ
ク質で被膜される。これにより、固定表面上の非特異的吸着部位の阻止とその表
面上に抗血清の非特異的結合により引き起こされる基底値を減少することが可能
になる。
のNF‐AT3が選択表面、好適にはポリスチレーンマイクロタイタープレートのも のなどと同様にタンパク質親和性を示す表面上に固定されるところで実施するこ
とができる。このプレートは不完全に吸着した物質を除去するために洗浄され、
プレートは、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、あるいは粉ミルク溶液な どの試験抗体に関しては抗原的に中性であることが知られている日特異的タンパ
ク質で被膜される。これにより、固定表面上の非特異的吸着部位の阻止とその表
面上に抗血清の非特異的結合により引き起こされる基底値を減少することが可能
になる。
【０１７６】 次に、NF‐AT3抗体がそのプレートに免疫複合体（抗原/抗体）形成に繋がるよ
うな方法で加えられる。こうした条件には好適には、BSA、ウシガンマグロブリ ン（BGG）、リン酸緩衝液生理食塩水（PBS）/TweedRなどの希釈剤により抗血清/
抗体を希釈することが含まれる。これらの付加薬剤にはまた、非特異的基底値の
減少を助ける傾向がある。プレートではその後、好適には約25〜約27℃といった
程度の温度で約2〜約4時間の間温置することが可能である。温置後、非免疫複合
物質を除去するように洗浄される。好適な洗浄手順にはPBS/TweenRなどあるいは
ボレイト緩衝液による洗浄が含まれる。
うな方法で加えられる。こうした条件には好適には、BSA、ウシガンマグロブリ ン（BGG）、リン酸緩衝液生理食塩水（PBS）/TweedRなどの希釈剤により抗血清/
抗体を希釈することが含まれる。これらの付加薬剤にはまた、非特異的基底値の
減少を助ける傾向がある。プレートではその後、好適には約25〜約27℃といった
程度の温度で約2〜約4時間の間温置することが可能である。温置後、非免疫複合
物質を除去するように洗浄される。好適な洗浄手順にはPBS/TweenRなどあるいは
ボレイト緩衝液による洗浄が含まれる。
【０１７７】 標本と抗体の間に特異的な免疫複合体の形成、また引き続いての洗浄後、免疫
複合体形成の頻度と量が、プレートを第2の抗体プローブにかけることにより、 測定することができるが、その第2の抗体は第1のもの（通常は第1のFc部分が標 的）に対して特異性を有している。検出手段を提供するために、第2の抗体は好 適には、適当な色素産生性基質により温置する際に発色を生成する関連酵素を有
する。このように、例えば、ある一定期間、免疫複合体形成の発達を好都合にす
る条件下でウレアーゼあるいはペルオキシダーゼ接合抗ヒトIgGにより抗体結合 表面と接触し、温置することが望まれる（例えば、PBS/TweenRなどのPBS含有溶 液、室温で2時間加温放置）。
複合体形成の頻度と量が、プレートを第2の抗体プローブにかけることにより、 測定することができるが、その第2の抗体は第1のもの（通常は第1のFc部分が標 的）に対して特異性を有している。検出手段を提供するために、第2の抗体は好 適には、適当な色素産生性基質により温置する際に発色を生成する関連酵素を有
する。このように、例えば、ある一定期間、免疫複合体形成の発達を好都合にす
る条件下でウレアーゼあるいはペルオキシダーゼ接合抗ヒトIgGにより抗体結合 表面と接触し、温置することが望まれる（例えば、PBS/TweenRなどのPBS含有溶 液、室温で2時間加温放置）。
【０１７８】 第2の酵素標識化抗体を加温放置し、続いて非結合物質を除去するために洗浄 した後、標識の分量が、酵素標識としてペルキシダーゼを使用する場合は、尿素
と臭化クレゾール紫、あるいは2,2'‐アジノ‐ジ‐（3‐エチル‐ベンゾチアゾ リン）‐6‐硫酸（ABTS）とH2O2により加温放置することによって定量化される 。定量化は、例えば、視覚的なスペクトル分光光度計を使用して色素生成の程度
を測定することにより、達成される。この測定法については、まったく異なった
測定法だけでなく、様々なものがあって（放射線免疫沈降法、免疫親和性クロマ
トグラフィ、ウェスタンブロット法）本発明の一部としても企図されている。
と臭化クレゾール紫、あるいは2,2'‐アジノ‐ジ‐（3‐エチル‐ベンゾチアゾ リン）‐6‐硫酸（ABTS）とH2O2により加温放置することによって定量化される 。定量化は、例えば、視覚的なスペクトル分光光度計を使用して色素生成の程度
を測定することにより、達成される。この測定法については、まったく異なった
測定法だけでなく、様々なものがあって（放射線免疫沈降法、免疫親和性クロマ
トグラフィ、ウェスタンブロット法）本発明の一部としても企図されている。
【０１７９】 ELISA法変法の1つは、国際的な検出システムとして標識化酵素RVV‐XAと組み 合わせた凝結カスケードを使用する、酵素凝結測定法あるいはELCA（米国特許第
4,668,621号）である。本発明にとってこのシステムの長所は、広範な、様々な 緩衝液の存在下に生理学的pHで凝結反応を実施できることである。したがって、
複合体分析の統合化を保持することが可能である。
4,668,621号）である。本発明にとってこのシステムの長所は、広範な、様々な 緩衝液の存在下に生理学的pHで凝結反応を実施できることである。したがって、
複合体分析の統合化を保持することが可能である。
【０１８０】 本発明により包含される他の免疫測定法には、米国特許第4,367,110号（二重 モノクローナル抗体サンドイッチ測定法）、米国特許第4,452,901号（ウェスタ ンブロット法）に述べられているそうしたものに限定されるわけではないが、そ
れらが含まれる。他の測定法には標識化リガンドの免疫沈降法と、免疫細胞化学
法が含まれるが、共にin vitroとin vivoに実施される。
れらが含まれる。他の測定法には標識化リガンドの免疫沈降法と、免疫細胞化学
法が含まれるが、共にin vitroとin vivoに実施される。
【０１８１】 ８．心肥大の活性調節因子に関するスクリーニング 本発明はまた、心肥大を阻害する能力に関して組成物をスクリーニングすること
を企図している。この疾患を真似る細胞、器官、組織系を作り出す本発明の能力
は、治療的活性のための様々な組成物を試験する理想的な設定を提供する。とく
に好適な組成物は、心肥大を阻害し、また心疾患を予防しあるいは留保除外する
際に有用なものである。本発明のスクリーニング測定法では、候補となる薬物は
最初例えば、標的分子への結合といった基本的な生物化学的活性をスクリーニン
グされ、それから、細胞、組織、あるいは動物全体のレベルで肥大表現型を阻害
する能力に関して試験される。
を企図している。この疾患を真似る細胞、器官、組織系を作り出す本発明の能力
は、治療的活性のための様々な組成物を試験する理想的な設定を提供する。とく
に好適な組成物は、心肥大を阻害し、また心疾患を予防しあるいは留保除外する
際に有用なものである。本発明のスクリーニング測定法では、候補となる薬物は
最初例えば、標的分子への結合といった基本的な生物化学的活性をスクリーニン
グされ、それから、細胞、組織、あるいは動物全体のレベルで肥大表現型を阻害
する能力に関して試験される。
【０１８２】 a.阻害薬と測定フォーマット i.測定フォーマット 本発明は心肥大の阻害薬に関するスクリーニング方法を提供する。このスクリー
ニング技術は心肥大を阻止し、および/または一度発症した心肥大を軽減する組 成物の同定に有用であることが証明される。
ニング技術は心肥大を阻止し、および/または一度発症した心肥大を軽減する組 成物の同定に有用であることが証明される。
【０１８３】 これらの実施形態では、本発明は肥大を阻害する候補となる薬物の能力を測定す
るための方法に関する。本発明には一般的に以下の工程が含まれる。すなわち、 （a）肥大表現型を示す心筋細胞を提供する工程と、 （b）候補となる阻害薬と上記細胞とを接触させる工程と、 （c）上記候補となる阻害薬によっては治療されない類似の細胞に比較して 抗肥大効果に関して上記細胞をモニタリングする工程。
るための方法に関する。本発明には一般的に以下の工程が含まれる。すなわち、 （a）肥大表現型を示す心筋細胞を提供する工程と、 （b）候補となる阻害薬と上記細胞とを接触させる工程と、 （c）上記候補となる阻害薬によっては治療されない類似の細胞に比較して 抗肥大効果に関して上記細胞をモニタリングする工程。
【０１８４】 候補となる薬物を上記の測定法において肥大表現型を阻害することができるもの
として同定するために、付け加えた候補となる薬物が存在しない場合に、その細
胞の様々な特性、例えば、増殖、同心円状拡大心室塊、離心円状拡大心室塊、拡
張型心筋症に向かっての病状の進行、拡大線維性蓄積、心筋細胞混乱；カルシウ
ムイオン放出ならび摂取（すなわちCa2+代謝速度）発作短縮、心室駆出量減少、
不整脈、頻脈、中央要求量における変化、心不全、Ca++依存性遺伝子発現などを
測定あるいは判定する。それから、その細胞に候補となる薬物を加えて、候補と
なる薬物の存在下でのその反応を測定する。それが存在しない場合と比較して、
増殖あるいは肥大遺伝子発現を減少させる候補となる薬物が阻害能力をもった候
補となる薬物であることを示唆している。本発明のスクリーニング測定法では、
一定期間にわたってまた様々な投与方法で、組成物が細胞に加えられ、心肥大が
測定される。
として同定するために、付け加えた候補となる薬物が存在しない場合に、その細
胞の様々な特性、例えば、増殖、同心円状拡大心室塊、離心円状拡大心室塊、拡
張型心筋症に向かっての病状の進行、拡大線維性蓄積、心筋細胞混乱；カルシウ
ムイオン放出ならび摂取（すなわちCa2+代謝速度）発作短縮、心室駆出量減少、
不整脈、頻脈、中央要求量における変化、心不全、Ca++依存性遺伝子発現などを
測定あるいは判定する。それから、その細胞に候補となる薬物を加えて、候補と
なる薬物の存在下でのその反応を測定する。それが存在しない場合と比較して、
増殖あるいは肥大遺伝子発現を減少させる候補となる薬物が阻害能力をもった候
補となる薬物であることを示唆している。本発明のスクリーニング測定法では、
一定期間にわたってまた様々な投与方法で、組成物が細胞に加えられ、心肥大が
測定される。
【０１８５】 とくに好適な形態では、細胞は、この因子の構成的に活性化した形態である、
野生型NF‐AT3のリン酸化部位を欠くNF‐AT3の突然変異体を発現する。ある実施
形態では、NF‐AT3経路に関与している他の遺伝子はNF‐AT3の助けがなくても機
能することができるGATA4の突然変異体の形態などと同じ効果に達するように変 更されることがある。
野生型NF‐AT3のリン酸化部位を欠くNF‐AT3の突然変異体を発現する。ある実施
形態では、NF‐AT3経路に関与している他の遺伝子はNF‐AT3の助けがなくても機
能することができるGATA4の突然変異体の形態などと同じ効果に達するように変 更されることがある。
【０１８６】 ii.NF‐AT3の阻害薬と活性化因子（アクチベータ） 本発明による阻害薬は、NF−AT3の上流か下流で、あるいはNF−AT3に直接その
阻害効果を発揮するものである。本スクリーニング方法により同定される阻害薬
のタイプにかかわらず、こうした組成物による阻害の効果は心肥大の阻害という
結果になり、あるいは加えられた候補となる薬物が存在しない場合は、いくつか
の関連生物化学的あるいは生理学的側面から、例えば、増殖、Ca＋＋依存性遺伝
子発現などの結果になる。
阻害効果を発揮するものである。本スクリーニング方法により同定される阻害薬
のタイプにかかわらず、こうした組成物による阻害の効果は心肥大の阻害という
結果になり、あるいは加えられた候補となる薬物が存在しない場合は、いくつか
の関連生物化学的あるいは生理学的側面から、例えば、増殖、Ca＋＋依存性遺伝
子発現などの結果になる。
【０１８７】 他の実施形態では、カルシニューリン−NF−AT3−GATA4経路を実際に増加させ
る組成物を調べる。これには、上述したように、NF−AT3突然変異細胞の使用を 必要とせず、むしろ、正常経路の少なくとも一部は完全であったが、しかし、シ
グナルにおける増加が経路での活性増加を示すように下流のシグナルエレメント
が細胞の中に取り付けられた。1つの考えられるシグナルは、NF−AT3/GATA4によ
り活性化された調節制御領域にリンクしたグリーン蛍光タンパク質などの1つの 遺伝子であると思われる。
る組成物を調べる。これには、上述したように、NF−AT3突然変異細胞の使用を 必要とせず、むしろ、正常経路の少なくとも一部は完全であったが、しかし、シ
グナルにおける増加が経路での活性増加を示すように下流のシグナルエレメント
が細胞の中に取り付けられた。1つの考えられるシグナルは、NF−AT3/GATA4によ
り活性化された調節制御領域にリンクしたグリーン蛍光タンパク質などの1つの 遺伝子であると思われる。
【０１８８】 iii.候補となる薬物 本明細書で使用されているように、「候補となる薬物」とは心肥大を潜在的に阻
害する何らかの分子を称して言う。最も有用な薬学的な組成物は、シクロスポリ
ンA（英国特許公報No.GB2,257,359、参照として本明細書に組み込んである）、A
P1510、FK1012、FK506とその他の関連薬剤など、他の公知の肥大活性調節因子で
ある。こうした努力はよく「合理的薬剤設計」として知られるが、公知の阻害薬
との比較のみでなく、標的分子の構造に関連した予測も含む。これらの薬剤は日
常的には免疫抑制剤として使用されているが、心肥大あるいは心不全を治療する
のには使用されたことはない。
害する何らかの分子を称して言う。最も有用な薬学的な組成物は、シクロスポリ
ンA（英国特許公報No.GB2,257,359、参照として本明細書に組み込んである）、A
P1510、FK1012、FK506とその他の関連薬剤など、他の公知の肥大活性調節因子で
ある。こうした努力はよく「合理的薬剤設計」として知られるが、公知の阻害薬
との比較のみでなく、標的分子の構造に関連した予測も含む。これらの薬剤は日
常的には免疫抑制剤として使用されているが、心肥大あるいは心不全を治療する
のには使用されたことはない。
【０１８９】 合理的薬剤設計の目標は、生物学的活性ポリペプチドあるいは標的組成物の構
造類似体を産生することである。こうした類似体を作り出すことにより、自然な
分子よりもより活性あるいは安定しており、変更に対して異なった感受性を有し
ており、あるいは他の様々な分子の機能に影響を及ぼす可能性のある薬剤を形作
ることが可能である。1つのアプローチでは、NF-AT3、あるいはその断片のよう な分子の三次元構造を生成する。これは、X線結晶構造解析、コンピュータモデ リング、あるいは両方のアプローチを組み合わせたものにより達成することがで
きる。
造類似体を産生することである。こうした類似体を作り出すことにより、自然な
分子よりもより活性あるいは安定しており、変更に対して異なった感受性を有し
ており、あるいは他の様々な分子の機能に影響を及ぼす可能性のある薬剤を形作
ることが可能である。1つのアプローチでは、NF-AT3、あるいはその断片のよう な分子の三次元構造を生成する。これは、X線結晶構造解析、コンピュータモデ リング、あるいは両方のアプローチを組み合わせたものにより達成することがで
きる。
【０１９０】 標的組成物あるいは阻害薬の構造を確かめるのに抗体を使用することも可能で
ある。原則として、このアプローチは、薬剤設計がそれをベースとして使用でき
る薬の核となるものを生み出す。機能的な、薬理学的な活性抗体に対して抗イデ
ィオタイプ抗体を生成することにより、タンパク質結晶構造解析をすべて迂回す
ることが可能である。鏡像の鏡像のように、抗イディオタイプの結合部位は元の
抗原の類似体であると予測される。抗イディオタイプは化学的に、あるいは生物
学的に産生されたペプチドという堤防からペプチドを同定分離するのに使用する
ことができる。選択されたペプチドは薬の核として役立つ。抗イディオタイプは
、抗原として抗体を使用して、抗体を産生するために本明細書に説明されている
方法を使用して生成される。
ある。原則として、このアプローチは、薬剤設計がそれをベースとして使用でき
る薬の核となるものを生み出す。機能的な、薬理学的な活性抗体に対して抗イデ
ィオタイプ抗体を生成することにより、タンパク質結晶構造解析をすべて迂回す
ることが可能である。鏡像の鏡像のように、抗イディオタイプの結合部位は元の
抗原の類似体であると予測される。抗イディオタイプは化学的に、あるいは生物
学的に産生されたペプチドという堤防からペプチドを同定分離するのに使用する
ことができる。選択されたペプチドは薬の核として役立つ。抗イディオタイプは
、抗原として抗体を使用して、抗体を産生するために本明細書に説明されている
方法を使用して生成される。
【０１９１】 他方、有用な組成物の同定を「暴力的に行う」といった努力をしながらも、有
用な薬剤に対する基本的な基準に合致すると考えられる様々な商業的な源から、
つまり小さな分子ライブラリーから簡単に入手することがある。組み合わせで生
成されたライブラリー（例えば、ペプチドライブラリー）を含むこうしたライブ
ラリーのスクリーニングは、活性に関して数多くの関連のある（また関連のない
）組成物をスクリーニングするには急速で効率的な方法である。組み合わせアプ
ローチ法はまた、活性に関してモデル化された第2、第3、第4世代の組成物の創 造により潜在的な薬剤の急速な改革に自ら手を貸すが、そうでない場合には望ま
しくない組成物になってしまう。
用な薬剤に対する基本的な基準に合致すると考えられる様々な商業的な源から、
つまり小さな分子ライブラリーから簡単に入手することがある。組み合わせで生
成されたライブラリー（例えば、ペプチドライブラリー）を含むこうしたライブ
ラリーのスクリーニングは、活性に関して数多くの関連のある（また関連のない
）組成物をスクリーニングするには急速で効率的な方法である。組み合わせアプ
ローチ法はまた、活性に関してモデル化された第2、第3、第4世代の組成物の創 造により潜在的な薬剤の急速な改革に自ら手を貸すが、そうでない場合には望ま
しくない組成物になってしまう。
【０１９２】 候補組成物には断片あるいは自然発生的な組成物が含まれ、あるいはそうでな
ければ不活性である公知の組成物の活性組み合わせとして見出されることがある
。動物、細菌、菌類、葉や樹皮を含む植物源、海洋標本などの自然源から分離さ
れる組成物は、潜在的に有用な製薬薬剤という存在の候補として測定されること
がある。スクリーニングすべき製薬薬剤はまた化学的合成物あるいは人工的な化
合物から誘導される、あるいは合成されることができる。このように、本発明に
より同定される候補となる薬物はポリペプチド、ポリヌクレオチド、小さな分子
阻害薬、あるいは公知の肥大型応答の阻害薬から始めた合理的薬剤設計により設
計される何らかの他の化合物であることがある。
ければ不活性である公知の組成物の活性組み合わせとして見出されることがある
。動物、細菌、菌類、葉や樹皮を含む植物源、海洋標本などの自然源から分離さ
れる組成物は、潜在的に有用な製薬薬剤という存在の候補として測定されること
がある。スクリーニングすべき製薬薬剤はまた化学的合成物あるいは人工的な化
合物から誘導される、あるいは合成されることができる。このように、本発明に
より同定される候補となる薬物はポリペプチド、ポリヌクレオチド、小さな分子
阻害薬、あるいは公知の肥大型応答の阻害薬から始めた合理的薬剤設計により設
計される何らかの他の化合物であることがある。
【０１９３】 他の適当な阻害薬には、アンチセンス分子、リボザイム、抗体（単鎖抗体を含
む）、カルシニューリン−NF−AT3−GATA4経路内に位置する標的に特異的である
それぞれのものが含まれる。こうした化合物はこの文書の中のどこかにさらに詳
細に説明される。例えば、NF−AT3の翻訳あるいは転写開始部位に結合するアン チセンス分子、あるいはNF−AT3ｋC−末端に結合する抗体は理想的な候補となる
阻害薬である。
む）、カルシニューリン−NF−AT3−GATA4経路内に位置する標的に特異的である
それぞれのものが含まれる。こうした化合物はこの文書の中のどこかにさらに詳
細に説明される。例えば、NF−AT3の翻訳あるいは転写開始部位に結合するアン チセンス分子、あるいはNF−AT3ｋC−末端に結合する抗体は理想的な候補となる
阻害薬である。
【０１９４】 ある状況での「効果的な用量」とは、それらの正常レベルに比較して細胞から
肥大を再生可能に減少させるのに効果的なそうした用量である。活性における有
意に適当な変化に達する化合物は使用されるであろう。
肥大を再生可能に減少させるのに効果的なそうした用量である。活性における有
意に適当な変化に達する化合物は使用されるであろう。
【０１９５】 例えば、心筋細胞増殖、Ca++応答、心遺伝子発現などを使用して測定される心
肥大における有意な変化は、少なくとも約30％〜40％の活性における減少により
、最も好適には少なくとも約50％の活性の変化により、さらに高い途中経過の値
が可能であるということも併せて、表わされる。本発明の活性化合物はまた、さ
らなるこうした阻害薬を検出し、定量化するための分析的な、また予備的な作成
上の技術において使用することができる抗体の世代のために使用することができ
る。
肥大における有意な変化は、少なくとも約30％〜40％の活性における減少により
、最も好適には少なくとも約50％の活性の変化により、さらに高い途中経過の値
が可能であるということも併せて、表わされる。本発明の活性化合物はまた、さ
らなるこうした阻害薬を検出し、定量化するための分析的な、また予備的な作成
上の技術において使用することができる抗体の世代のために使用することができ
る。
【０１９６】 もちろん、本発明のすべてのスクリーニング方法は、効果的な候補が見つから
ないことがあるという事実にもかかわらず、それら自身は有用であることが理解
されるであろう。
ないことがあるという事実にもかかわらず、それら自身は有用であることが理解
されるであろう。
【０１９７】 b.In vivoでの測定法 運転するのに迅速、廉価で容易な測定法は結合測定法である。分子の標的への結
合は、それ自身の中に、およびそれ自身に関して、立体的、アロステリック、あ
るいは電荷−電荷相互作用のために、阻害的である。この種の1つの実施形態で は、NF−AT3分子あるいはその断片に結合する化合物のスクリーニングが提供さ れる。
合は、それ自身の中に、およびそれ自身に関して、立体的、アロステリック、あ
るいは電荷−電荷相互作用のために、阻害的である。この種の1つの実施形態で は、NF−AT3分子あるいはその断片に結合する化合物のスクリーニングが提供さ れる。
【０１９８】 標的は溶液中で遊離していて、支持体に固定されていて、発現させられるのか、
あるいは細胞の表面上にあるのかのいずれかである。標的かあるいは化合物かの
いずれかが標識化され、それによって結合の測定を可能にする。もう1つの実施 形態では、測定は自然あるいは人工的な基質に、あるいは結合パートナー（NF−
AT3やGATA4など）に標的を結合するという阻害行為を測定する。競合的な結合測
定は、病原体（例えば、NF−AT3）が標識化されるところで行うことができる。 通常は、標的は標識化された種であり、標識化は結合部分の機能を干渉するとい
う機会は減少する。結合あるいは結合の阻害を測定するために遊離標識 対 結合
標識の分量を測定することがある。
あるいは細胞の表面上にあるのかのいずれかである。標的かあるいは化合物かの
いずれかが標識化され、それによって結合の測定を可能にする。もう1つの実施 形態では、測定は自然あるいは人工的な基質に、あるいは結合パートナー（NF−
AT3やGATA4など）に標的を結合するという阻害行為を測定する。競合的な結合測
定は、病原体（例えば、NF−AT3）が標識化されるところで行うことができる。 通常は、標的は標識化された種であり、標識化は結合部分の機能を干渉するとい
う機会は減少する。結合あるいは結合の阻害を測定するために遊離標識 対 結合
標識の分量を測定することがある。
【０１９９】 化合物の高流量スクリーニング技術はWO84/03564に説明されている。数多くの小
さなペプチド試験化合物が、プラスチックピンあるいは何らかの他の表面などを
有する固形基質上で合成される。ペプチド試験化合物は、例えば、NF−AT3と反 応させられ、洗浄される。結合ポリペプチドは様々な方法により検出される。
さなペプチド試験化合物が、プラスチックピンあるいは何らかの他の表面などを
有する固形基質上で合成される。ペプチド試験化合物は、例えば、NF−AT3と反 応させられ、洗浄される。結合ポリペプチドは様々な方法により検出される。
【０２００】 NF−AT3などの精製された標的は、前述の薬剤スクリーニング技術において使用 するためにプレート上に直接塗ることができる。しかし、ポリペプチドに対して
非中性化した抗体を、固形相にポリペプチドを固定するのに使用することができ
る。また、反応領域（好適には末端領域）を含む融合タンパク質は固形相に活性
領域（例えば、NF−AT3のC−末端）をリンクするのに使用することもある。
非中性化した抗体を、固形相にポリペプチドを固定するのに使用することができ
る。また、反応領域（好適には末端領域）を含む融合タンパク質は固形相に活性
領域（例えば、NF−AT3のC−末端）をリンクするのに使用することもある。
【０２０１】 c.In cytoでの測定 心肥大の特徴を示す様々な細胞系は候補となる薬物のスクリーニングに利用する
ことができる。例えば、遺伝工学的に処理されたNF−AT3突然変異体を含む細胞 は、上述したように、候補となる化合物の様々な機能的な属性を研究するのに使
用することができる。こうした測定では、化合物は適切に製剤化され、その生物
化学的性質が分かったら、標的細胞と接触させる。
ことができる。例えば、遺伝工学的に処理されたNF−AT3突然変異体を含む細胞 は、上述したように、候補となる化合物の様々な機能的な属性を研究するのに使
用することができる。こうした測定では、化合物は適切に製剤化され、その生物
化学的性質が分かったら、標的細胞と接触させる。
【０２０２】 その測定によるが、培養が必要になる場合がある。上述したように、細胞はそ
の後、数多くの生理学的測定（増殖、大きさ、Ca++効果）によって調べることが
できる。代替的には、分子分析はNF−AT3の機能と関連経路が調べられる箇所で 行われる。これには、タンパク質発現、酵素機能、基質利用、mRNA発現（細胞全
体あるいはポリA RNAのディファレンシャルディスプレイを含む）やその他のた めの測定などの測定が含まれる。
の後、数多くの生理学的測定（増殖、大きさ、Ca++効果）によって調べることが
できる。代替的には、分子分析はNF−AT3の機能と関連経路が調べられる箇所で 行われる。これには、タンパク質発現、酵素機能、基質利用、mRNA発現（細胞全
体あるいはポリA RNAのディファレンシャルディスプレイを含む）やその他のた めの測定などの測定が含まれる。
【０２０３】 d.In vivoでの測定 本発明はとくに、様々な動物モデルの使用を企図している。ここでは、トラン
スジェニックマウスが作り出されたが、動物系全体における心肥大用モデルとし
て提供される。これらの動物の世代はこの文書の他所に説明がなされている。し
たがって、これらのモデルは、心肥大型応答に阻害に関するスクリーニングだけ
ではなく、心疾患の進行を追跡するのにも使用することができる。
スジェニックマウスが作り出されたが、動物系全体における心肥大用モデルとし
て提供される。これらの動物の世代はこの文書の他所に説明がなされている。し
たがって、これらのモデルは、心肥大型応答に阻害に関するスクリーニングだけ
ではなく、心疾患の進行を追跡するのにも使用することができる。
【０２０４】 試験化合物を用いたこれらの動物の治療には、動物に対して、適当な形態で、
その化合物を投与することが含まれる。投与は、経口、鼻腔、口腔粘膜頬側、あ
るいは外用に限定されるわけではないが、それらを含む、臨床あるいは非臨床目
的に利用することができるいずれかの投与経路により行われる。代替的には、投
与は気管内滴下、気管支への滴下、皮内、皮下、筋内、腹腔内あるいは静脈内注
射により行われる。とくに企図されているのは、静脈内注射による全身的投与、
血液ないしはリンパ供給を介する局所的投与である。
その化合物を投与することが含まれる。投与は、経口、鼻腔、口腔粘膜頬側、あ
るいは外用に限定されるわけではないが、それらを含む、臨床あるいは非臨床目
的に利用することができるいずれかの投与経路により行われる。代替的には、投
与は気管内滴下、気管支への滴下、皮内、皮下、筋内、腹腔内あるいは静脈内注
射により行われる。とくに企図されているのは、静脈内注射による全身的投与、
血液ないしはリンパ供給を介する局所的投与である。
【０２０５】 In vivoでの化合物の効果測定には様々な異なった基準が含まれる。こうした 基準には、生存率、心臓の大きさないしは質量の減少率、活性を含めた一般的な
健康状態の改善率に限定されないが、それらが含まれる。これらのマウスから採
った組織についての組織学的研究を行い、肥大関連遺伝子の発現における細胞の
大きさあるいは変化を含めた、細胞の分子状態を調べることも可能である。
健康状態の改善率に限定されないが、それらが含まれる。これらのマウスから採
った組織についての組織学的研究を行い、肥大関連遺伝子の発現における細胞の
大きさあるいは変化を含めた、細胞の分子状態を調べることも可能である。
【０２０６】 ９．薬理学的組成物 活性生物（アンチセンスオリゴ−ないしはポリヌクレオチドないしは発現ベク
ターを含む薬剤、ポリペプチド、抗体あるいはリポソーム）の臨床適用が実施さ
れる場合には、意図される適用に適当な製薬的組成物を作成する必要がある。一
般的に言うと、これには、ヒトあるいは動物に対して害毒がある何らかの他の不
純物だけでなく、発熱物質が本質的にない製薬的組成物を作成する必要がある。
その複合体を安定化し、また標的細胞による摂取を可能にするために適当な緩衝
液を用いることが一般的には望ましい。
ターを含む薬剤、ポリペプチド、抗体あるいはリポソーム）の臨床適用が実施さ
れる場合には、意図される適用に適当な製薬的組成物を作成する必要がある。一
般的に言うと、これには、ヒトあるいは動物に対して害毒がある何らかの他の不
純物だけでなく、発熱物質が本質的にない製薬的組成物を作成する必要がある。
その複合体を安定化し、また標的細胞による摂取を可能にするために適当な緩衝
液を用いることが一般的には望ましい。
【０２０７】 本発明の水性組成物はさらに、上述のように、製薬的に受け入れ可能なキャリ
アあるいは水性培地の中で分散する活性成分の有効な分量から成る。こうした組
成物はまた、接種物として引用される。「製薬的にあるいは薬理学的に受け入れ
可能な」という表現は、動物あるいはヒトに対して適切なものとして投与される
場合に、副作用、アレルギー性、ないしはその他の厄介な反応を生み出すことが
ない組成物を称して言う。
アあるいは水性培地の中で分散する活性成分の有効な分量から成る。こうした組
成物はまた、接種物として引用される。「製薬的にあるいは薬理学的に受け入れ
可能な」という表現は、動物あるいはヒトに対して適切なものとして投与される
場合に、副作用、アレルギー性、ないしはその他の厄介な反応を生み出すことが
ない組成物を称して言う。
【０２０８】 本明細書に使用されているように、「製薬的に受け入れ可能なキャリア」には
、いずれかの、またすべての溶媒、分散媒体、被膜剤、抗菌薬、抗真菌薬、等張
性および吸収遅延薬などが含まれる。こうした製薬的に活性な物質の媒体と薬剤
の使用は、当業者には周知のことである。いずれかの従来の媒体あるいは薬剤が
活性成分とは不適合である場合を除き、治療組成物としてのその使用が企図され
る。補完的な活性成分もまたその組成物に組み入れることができる。
、いずれかの、またすべての溶媒、分散媒体、被膜剤、抗菌薬、抗真菌薬、等張
性および吸収遅延薬などが含まれる。こうした製薬的に活性な物質の媒体と薬剤
の使用は、当業者には周知のことである。いずれかの従来の媒体あるいは薬剤が
活性成分とは不適合である場合を除き、治療組成物としてのその使用が企図され
る。補完的な活性成分もまたその組成物に組み入れることができる。
【０２０９】 治療組成の溶液はヒドロキシプロピルセルロースなどのサーファクタントと適
切に水の中で混合して作成することができる。分散剤もまたグリセロール、液体
ポリエチレングルコール、その混合剤、および油の中で作成することができる。
通常の貯蔵と使用条件下では、これらの製剤には微生物の増殖を予防する保存剤
が含まれる。
切に水の中で混合して作成することができる。分散剤もまたグリセロール、液体
ポリエチレングルコール、その混合剤、および油の中で作成することができる。
通常の貯蔵と使用条件下では、これらの製剤には微生物の増殖を予防する保存剤
が含まれる。
【０２１０】 本発明の治療組成物には、液体溶液かあるいは懸濁液かのいずれかのものとし
て注射することが可能な組成物の形態で投与することができる利点がある。すな
わち、溶液あるいは懸濁液、注射用液体の中に入れるのに適当な固形形態も作成
可能である。これらの製剤はまた、乳化することが可能である。こうした目的の
ための典型的な組成物は製薬的に受け入れ可能なキャリアを含む。例えば、その
組成物はリン酸緩衝液生理食塩水の1ml当たりヒト血清アルブミン10mg、25mg、5
0mgあるいは約100mgまでが含められる。他の製薬的に受け入れ可能なキャリアに
は、塩、保存剤、緩衝液などの水性溶液、非毒性賦形剤が含まれる。
て注射することが可能な組成物の形態で投与することができる利点がある。すな
わち、溶液あるいは懸濁液、注射用液体の中に入れるのに適当な固形形態も作成
可能である。これらの製剤はまた、乳化することが可能である。こうした目的の
ための典型的な組成物は製薬的に受け入れ可能なキャリアを含む。例えば、その
組成物はリン酸緩衝液生理食塩水の1ml当たりヒト血清アルブミン10mg、25mg、5
0mgあるいは約100mgまでが含められる。他の製薬的に受け入れ可能なキャリアに
は、塩、保存剤、緩衝液などの水性溶液、非毒性賦形剤が含まれる。
【０２１１】 非水性溶媒の実施例は、プロピルグリコール、ポリエチレングリコール、野菜
油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機塩である。水性キャリアには
水、アルコール/水性溶液、塩化ナトリウムなどの非経口ビーイクル、リンゲル デキストロース液などが含まれる。静脈内ビーイクルには、液性および栄養補填
剤が含まれる。保存剤には、抗菌剤、抗オキシダント剤、キレート剤、不活性ガ
スが含まれる。pHと様々な組成物の正確な濃度に関して、製薬組成物は周知のパ
ラメーターにより補正される。
油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機塩である。水性キャリアには
水、アルコール/水性溶液、塩化ナトリウムなどの非経口ビーイクル、リンゲル デキストロース液などが含まれる。静脈内ビーイクルには、液性および栄養補填
剤が含まれる。保存剤には、抗菌剤、抗オキシダント剤、キレート剤、不活性ガ
スが含まれる。pHと様々な組成物の正確な濃度に関して、製薬組成物は周知のパ
ラメーターにより補正される。
【０２１２】 経口投与には付加的な調剤が適当である。経口製剤には、例えば、マンニトー
ル、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム
、セルロース、炭化マグネシウムなどのそうした製薬的グレードの典型的な賦形
剤が含まれる。組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤あ
るいは散剤の形態をとる。投与経路が外用である場合は、形態はクリーム、軟膏
、放出制御貼付薬、軟膏剤あるいはスプレー剤である。
ル、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム
、セルロース、炭化マグネシウムなどのそうした製薬的グレードの典型的な賦形
剤が含まれる。組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤あ
るいは散剤の形態をとる。投与経路が外用である場合は、形態はクリーム、軟膏
、放出制御貼付薬、軟膏剤あるいはスプレー剤である。
【０２１３】 本発明の治療組成物には、古典的な製薬製剤が含まれることがある。本発明に
よる治療組成物の投与はその投与経路を介して標的組織に有効であるかぎりはい
ずれの通常の投与経路を介してもよい。これには、経口、点鼻、口腔粘膜頬側、
経直腸、経膣あるいは外用が含まれる。代替的には、投与は通常の経路、皮内皮
下、筋内、腹腔内あるいは静脈内注射による。こうした組成物は通常は緩衝液あ
るいは他の賦形剤を含む生理学的に受け入れ可能なキャリアとして投与される。
好適な実施形態のデリバリー経路は、播種性疾患状態の治療に関しては全身性投
与であるが、しかし、局所的なデリバリーもまた企図されている。
よる治療組成物の投与はその投与経路を介して標的組織に有効であるかぎりはい
ずれの通常の投与経路を介してもよい。これには、経口、点鼻、口腔粘膜頬側、
経直腸、経膣あるいは外用が含まれる。代替的には、投与は通常の経路、皮内皮
下、筋内、腹腔内あるいは静脈内注射による。こうした組成物は通常は緩衝液あ
るいは他の賦形剤を含む生理学的に受け入れ可能なキャリアとして投与される。
好適な実施形態のデリバリー経路は、播種性疾患状態の治療に関しては全身性投
与であるが、しかし、局所的なデリバリーもまた企図されている。
【０２１４】 治療組成物の効果的な用量は意図されている目標をベースに決定される。「単
位投与量」あるいは「投与量」という用語は、対象者においてしようするのに適
当な物理的に分離した単位を称して言うが、各単位には、その投与、すなわち、
適当な投与経路と治療処方に関連した、上記で論じた、所望される反応を作り出
すために計算された治療組成物の前もって決められた用量が含まれている。投与
される用量は、治療と単位投与量の数量にしたがい、所望されている防御内容に
拠る。
位投与量」あるいは「投与量」という用語は、対象者においてしようするのに適
当な物理的に分離した単位を称して言うが、各単位には、その投与、すなわち、
適当な投与経路と治療処方に関連した、上記で論じた、所望される反応を作り出
すために計算された治療組成物の前もって決められた用量が含まれている。投与
される用量は、治療と単位投与量の数量にしたがい、所望されている防御内容に
拠る。
【０２１５】 治療組成物の正確な用量はまた、実地医家の判断にも拠り、また各個人に特有
のものとなる。投与量に影響を及ぼす因子には、患者の理学的および臨床上所見
、投与経路、意図されている治療目的、特定の治療薬物の安定性と毒性が含まれ
る。
のものとなる。投与量に影響を及ぼす因子には、患者の理学的および臨床上所見
、投与経路、意図されている治療目的、特定の治療薬物の安定性と毒性が含まれ
る。
【０２１６】 １０．実施例 以下の実施例が、本発明の好適な実施形態を示すために、含められる。以下の
実施例に開示される技術は、本発明の実施においてうまく機能するように発明者
により発見された技術を提示され、したがって、その実施のための好適な形態を
構成することが考慮されうると、当業者には理解されるべきである。しかし、当
業者であれば、本開示に照らして、数多くの変更を、開示される具体的な実施形
態の中で行うことができ、また本発明の精神と範囲から離れることなく同様ない
しは類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
実施例に開示される技術は、本発明の実施においてうまく機能するように発明者
により発見された技術を提示され、したがって、その実施のための好適な形態を
構成することが考慮されうると、当業者には理解されるべきである。しかし、当
業者であれば、本開示に照らして、数多くの変更を、開示される具体的な実施形
態の中で行うことができ、また本発明の精神と範囲から離れることなく同様ない
しは類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【０２１７】 実施例1 材料および方法 2−ハイブリッドスクリーン。酵母2−ハイブリッドスクリーン用に使用される
GATA4囮には、GAL4 DNA結合ドメインと枠内で融合したアミノ酸130〜409が含ま れていた。GATA4の領域には2つのジンクフィンガードメインが包含され、pAS酵 母発現ベクターにおいてクローン化されてPsI部位の中に入ったPstI−NsiI断片 内でコードされた。PpAS−GATA4はランダムcDNAに融合したGAL4活性化ドメイン を含んだ胚性10.5マウスcDNAライブラリーにより酵母の中にコ−トランスフェク
ションされた。スクリーニングされた5百万を越える初代コロニーから、陽性の 約100コロニーが同定された。各個々のコロニーから、活性化プラスミドが救助 され、cDNA挿入が配列決定された。アンチセンス配向あるいは枠外のcDNA挿入を
含むクローンは放棄された。残りのクローン（約21）は特異性を試験するために
再形質転換されて酵母の中に戻された。3つの別個の基準が特異性の測定のため に設定された。まず第1に、分離クローンは作用を反復しなければならなかった 。第2に、分離クローンは、非特異的囮、この場合はGATA4−E12融合体と相互作 用することはできなかった。第3の基準は、GATA4とGATA5のジンクフィンガー内 に92％よりも多いアミノ酸保存量があるため、GATA5と相互作用することも可能 であった因子に焦点を当てた。NF−AT3犠牲クローンはこれらの基準を満たして いた。
GATA4囮には、GAL4 DNA結合ドメインと枠内で融合したアミノ酸130〜409が含ま れていた。GATA4の領域には2つのジンクフィンガードメインが包含され、pAS酵 母発現ベクターにおいてクローン化されてPsI部位の中に入ったPstI−NsiI断片 内でコードされた。PpAS−GATA4はランダムcDNAに融合したGAL4活性化ドメイン を含んだ胚性10.5マウスcDNAライブラリーにより酵母の中にコ−トランスフェク
ションされた。スクリーニングされた5百万を越える初代コロニーから、陽性の 約100コロニーが同定された。各個々のコロニーから、活性化プラスミドが救助 され、cDNA挿入が配列決定された。アンチセンス配向あるいは枠外のcDNA挿入を
含むクローンは放棄された。残りのクローン（約21）は特異性を試験するために
再形質転換されて酵母の中に戻された。3つの別個の基準が特異性の測定のため に設定された。まず第1に、分離クローンは作用を反復しなければならなかった 。第2に、分離クローンは、非特異的囮、この場合はGATA4−E12融合体と相互作 用することはできなかった。第3の基準は、GATA4とGATA5のジンクフィンガー内 に92％よりも多いアミノ酸保存量があるため、GATA5と相互作用することも可能 であった因子に焦点を当てた。NF−AT3犠牲クローンはこれらの基準を満たして いた。
【０２１８】 救助されたNF−AT3 cDNA断片はまた、哺乳動物GAL4融合プラスミドpM1のSal I
部位の中にXho I断片としてサブクローン化されて入れられ、GAL4依存リポータ ーの活性化のために試験された。CAT活性の分析に沿って10T1/2細胞の培養とト ランスフェクションを行うための方法は以前に説明されている（Molkentinら、1
996）。
部位の中にXho I断片としてサブクローン化されて入れられ、GAL4依存リポータ ーの活性化のために試験された。CAT活性の分析に沿って10T1/2細胞の培養とト ランスフェクションを行うための方法は以前に説明されている（Molkentinら、1
996）。
【０２１９】 In vitroでの翻訳ならびに免疫沈降。2−ハイブリッド犠牲プラスミドから救助 された部分NF−AT3 cDNA領域はpECE−フラッグ哺乳動物発現ベクターのSal I部 位の中にXhoI断片としてサブクローン化されて入れられた。In vitroでの翻訳に
適しているベクターを生成するため、NF−AT3 cDNA断片は5'フラッグエピトープ
に沿ってpECE−フラッグ−NF−AT3からNot I−Xba I断片として切断され、クロ ーン化されてin vitroでの転写ベクター（Invitrogen社製）を含むpCite2B T7プ
ロモーターの中に入れられた。これは387アミノ酸NF−AT3フラッグ融合タンパク
質の世代を考慮に入れていた。GATA4において示されたアミノ酸SalI−XbaI断片 は、pCite2A−GATA4 80−441、pCite2A−GATA4 181−441、pCite2A−GATA4 239 −441、pCite2A−GATA4 80−328、pCite−GATA4 181−328、pCite2A 80−441/d2
65−294を生成するためにサブクローン化された。マウスGATA6のアミノ酸130〜3
50をコードするcDNA断片もまたSalI−XbaI断片としてクローン化されてpCite2A の中に入れられた。さらに、ヒトNF−AT3タンパク質（アミノ酸404〜694）のRel
相同ドメイン全体をコードするT7プロモーター指示構築物がこれらの研究におい
て使用された（Hoeyら、1995）。
適しているベクターを生成するため、NF−AT3 cDNA断片は5'フラッグエピトープ
に沿ってpECE−フラッグ−NF−AT3からNot I−Xba I断片として切断され、クロ ーン化されてin vitroでの転写ベクター（Invitrogen社製）を含むpCite2B T7プ
ロモーターの中に入れられた。これは387アミノ酸NF−AT3フラッグ融合タンパク
質の世代を考慮に入れていた。GATA4において示されたアミノ酸SalI−XbaI断片 は、pCite2A−GATA4 80−441、pCite2A−GATA4 181−441、pCite2A−GATA4 239 −441、pCite2A−GATA4 80−328、pCite−GATA4 181−328、pCite2A 80−441/d2
65−294を生成するためにサブクローン化された。マウスGATA6のアミノ酸130〜3
50をコードするcDNA断片もまたSalI−XbaI断片としてクローン化されてpCite2A の中に入れられた。さらに、ヒトNF−AT3タンパク質（アミノ酸404〜694）のRel
相同ドメイン全体をコードするT7プロモーター指示構築物がこれらの研究におい
て使用された（Hoeyら、1995）。
【０２２０】 T7プロモーターからのin vitro結合転写−翻訳がTNTキットプロトコル（Prome
ga社製、ウィスコンシン州マジソン市）により35S−メチオニンの存在下で行わ れた。フラッグ抗体（Kodak IBI社製、コネチカット州ニューへブン市）を使用 してフラッグエピトープに対して、あるいはNF−AT3のRel相同ドメインに対して
免疫沈降が指示された（Lyakhら、1997に記載されている抗体）。In vitroでの 転写−翻訳が各構築物の0.5μgに対して25μgの反応用量で行われた。この反応 混合の5mlが製造業者（Kodak IBI社製、コネチカット州ニューへブン市）の推奨
する条件により、抗フラッグモノクローナル抗体の2μgを加えた100μgの全用量
で、あるいはタンパク質−A/Gアガロースの25μgを加えて一緒にしたNF−AT3特 異的抗体の5μgにおいて免疫沈降が行われた。沈降生成物はSDS−PAGEとオート ラジオフィーにより分析された。
ga社製、ウィスコンシン州マジソン市）により35S−メチオニンの存在下で行わ れた。フラッグ抗体（Kodak IBI社製、コネチカット州ニューへブン市）を使用 してフラッグエピトープに対して、あるいはNF−AT3のRel相同ドメインに対して
免疫沈降が指示された（Lyakhら、1997に記載されている抗体）。In vitroでの 転写−翻訳が各構築物の0.5μgに対して25μgの反応用量で行われた。この反応 混合の5mlが製造業者（Kodak IBI社製、コネチカット州ニューへブン市）の推奨
する条件により、抗フラッグモノクローナル抗体の2μgを加えた100μgの全用量
で、あるいはタンパク質−A/Gアガロースの25μgを加えて一緒にしたNF−AT3特 異的抗体の5μgにおいて免疫沈降が行われた。沈降生成物はSDS−PAGEとオート ラジオフィーにより分析された。
【０２２１】 初代ラット心筋細胞の作成。心筋細胞培養培地が1日齢新生ラットの心臓を解 離することにより作成され、線維芽細胞を除去するために分別して培養基で培養
された。肥大型応答を誘発するため、無血清M199培地においてそれぞれAngIIとP
Eが10 nMと10μMで心筋細胞培養培地に加えられた。いずれかのアゴニストを含 む培養培地は72時間の期間の間12時間毎に替えられた。CsAとFK−506は72時間の
全培養期間にわたって500 ng/mlと150 ng/mlで存在した。これらの薬剤のNF−AT
3活性に関する効果を分析するため、NF−AT3依存リポーターがM199無血清培地に
おいてCa++リン酸トランスフェクションにより心筋細胞の中にトランスフェクシ
ョンされた。心筋細胞はその後、その同定されている薬剤とともに72時間の間培
養された。NF−AT3依存リポ―ターには、チミジンキナーゼ最小プロモーターの 上流でクローン化されたIL−2プロモーター由来の3つのNF−AT結合部位とルシフ
ェラーゼ遺伝子が含まれていた。細胞抽出の作成方法とルシフェラーゼ測定方法
は説明されている（Molkentinら、1994）。
された。肥大型応答を誘発するため、無血清M199培地においてそれぞれAngIIとP
Eが10 nMと10μMで心筋細胞培養培地に加えられた。いずれかのアゴニストを含 む培養培地は72時間の期間の間12時間毎に替えられた。CsAとFK−506は72時間の
全培養期間にわたって500 ng/mlと150 ng/mlで存在した。これらの薬剤のNF−AT
3活性に関する効果を分析するため、NF−AT3依存リポーターがM199無血清培地に
おいてCa++リン酸トランスフェクションにより心筋細胞の中にトランスフェクシ
ョンされた。心筋細胞はその後、その同定されている薬剤とともに72時間の間培
養された。NF−AT3依存リポ―ターには、チミジンキナーゼ最小プロモーターの 上流でクローン化されたIL−2プロモーター由来の3つのNF−AT結合部位とルシフ
ェラーゼ遺伝子が含まれていた。細胞抽出の作成方法とルシフェラーゼ測定方法
は説明されている（Molkentinら、1994）。
【０２２２】 ゲル移動シフト測定と突然変異誘発。BNPプロモーター内にある部分NF−AT結 合部位を同定するため、ゲル移動シフト測定が転写開始部位に関して−927、−3
27、−27に位置している推定部位、あるいはIL−2プロモーターからの共通部位 に応じた二本鎖オリゴヌクレオチドにより行われた（Owagaら、1995）。プロー ブの配列は以下のとおりであった。すなわち、BNP−927：5'−CTATCCTTTTGTTTTC
CATCCTG−3'；（配列識別番号：1）、BNP−327：5'−TCCCTGCCTTTTCCAGCAACGGT −3'；（配列識別番号：2）、BNP−27：5'−GCTCCAGGATAAAAGGCCACGGT−3'；（ 配列識別番号：3）、IL−2：5'−TACATTGGAAAATTTTATTACAC−3'（配列識別番号 ：4）。ゲル移動シフト測定に関しては、NF−AT3Rel相同ドメインを使用して、 結合in vitro転写−翻訳生成物（TNTキット、Promega社製、ウィスコンシン州マ
ジソン市）が、室温で20分間ポリ（dI−dC）の1μlの存在下で、指示されたオリ
ゴヌクレオチドプローブ（32P標識化プローブの40,000cpm/反応）により加温放 置され、その後非変性電気泳動にかけられた。非標識化競合オリゴヌクレオチド
が100倍モル過剰で加えられ、NF−AT3特異的抗血清（N.Riceから贈呈；Lyakhら 、1997）の2μlがスーパーシフト実験のために加えられた。ゲル移動シフト緩衝
液と電気泳動の条件は他で説明されている（Molentinら、1994）。部位指示突然
変異が、（Molkentinら、1994）に説明されているとおりに、1800 bp BNPプロモ
ーター（Ogawaら、1995）の中にローリングサイクルポリメラーゼ鎖反応により 導入された。
27、−27に位置している推定部位、あるいはIL−2プロモーターからの共通部位 に応じた二本鎖オリゴヌクレオチドにより行われた（Owagaら、1995）。プロー ブの配列は以下のとおりであった。すなわち、BNP−927：5'−CTATCCTTTTGTTTTC
CATCCTG−3'；（配列識別番号：1）、BNP−327：5'−TCCCTGCCTTTTCCAGCAACGGT −3'；（配列識別番号：2）、BNP−27：5'−GCTCCAGGATAAAAGGCCACGGT−3'；（ 配列識別番号：3）、IL−2：5'−TACATTGGAAAATTTTATTACAC−3'（配列識別番号 ：4）。ゲル移動シフト測定に関しては、NF−AT3Rel相同ドメインを使用して、 結合in vitro転写−翻訳生成物（TNTキット、Promega社製、ウィスコンシン州マ
ジソン市）が、室温で20分間ポリ（dI−dC）の1μlの存在下で、指示されたオリ
ゴヌクレオチドプローブ（32P標識化プローブの40,000cpm/反応）により加温放 置され、その後非変性電気泳動にかけられた。非標識化競合オリゴヌクレオチド
が100倍モル過剰で加えられ、NF−AT3特異的抗血清（N.Riceから贈呈；Lyakhら 、1997）の2μlがスーパーシフト実験のために加えられた。ゲル移動シフト緩衝
液と電気泳動の条件は他で説明されている（Molentinら、1994）。部位指示突然
変異が、（Molkentinら、1994）に説明されているとおりに、1800 bp BNPプロモ
ーター（Ogawaら、1995）の中にローリングサイクルポリメラーゼ鎖反応により 導入された。
【０２２３】 免疫細胞化学。初代心筋細胞のサルコメア組織を視覚化するために、抗−a− アクチニンマウスモノクローナル抗体が使用された（Sigma社製）。細胞は1×PB
Sで洗浄され、5分間3.7％パラホルムアルデヒドで固定され、3回1×PBSで洗浄さ
れ、その後、30分間2％ウマ血清、2％BSA、0.1％NP40を含む1×PBSで前遮断され
た。抗−a−アクチニン抗体が新鮮な前遮断溶液において1：800の希釈率で加え られ、さらに30分間加温放置された。代替的には、細胞は1：400の希釈率で抗NF
−AT3多クローン性抗血清により加温放置された（Lyakhら、1997）。続いて、細
胞は0.1％NP40を加えた1×PBSで3回洗浄された。抗マウスTRITC接合二次抗体が その後に前遮断溶液において30分間1：400の希釈率で加えられ、細胞は再び0.1 ％NP40を含む1×PBSで3回洗浄された。DNAの核染色がPBSに入れたビス−ベンズ イミドの0.5μg/mlにより15分間行われ、その後に3回PBSで洗浄された。
Sで洗浄され、5分間3.7％パラホルムアルデヒドで固定され、3回1×PBSで洗浄さ
れ、その後、30分間2％ウマ血清、2％BSA、0.1％NP40を含む1×PBSで前遮断され
た。抗−a−アクチニン抗体が新鮮な前遮断溶液において1：800の希釈率で加え られ、さらに30分間加温放置された。代替的には、細胞は1：400の希釈率で抗NF
−AT3多クローン性抗血清により加温放置された（Lyakhら、1997）。続いて、細
胞は0.1％NP40を加えた1×PBSで3回洗浄された。抗マウスTRITC接合二次抗体が その後に前遮断溶液において30分間1：400の希釈率で加えられ、細胞は再び0.1 ％NP40を含む1×PBSで3回洗浄された。DNAの核染色がPBSに入れたビス−ベンズ イミドの0.5μg/mlにより15分間行われ、その後に3回PBSで洗浄された。
【０２２４】 トランスジェニックマウス。心臓でカルシニューリンとNF−AT3を発現するト ランスジェニックマウスが以下のように作り出された。カルシニューリンA触媒 サブユニットの構成的な活性形態をコードするcDNA（O'Keefeら、1992）が5'Sal
Iリンカーと3'Hind IIIリンカーを用いてPCR法によりクローン化され、α−MHC
プロモーターを含む発現ベクターの中に入れられた。この発現ベクターの発現パ
ターンと特性は説明されている（Jonesら、1994）。心臓のNF−AT3タンパク質の
構成的な核形態を発現させるトランスジェニックマウスを生成するため、PCRプ ライマーがNF−AT3Δ317と称されるヒトNF−AT3タンパク質のアミノ酸317〜902 をコードする配列の領域の特異的な増幅を可能にするよう生成された。これらの
プライマーの両端にあるXho Iリンカーは、α−MHC発現ベクターのSal I部位の 中にクローン化することが可能になった。カルシニューリン−とNF−AT3Δ317−
α−MHCベクターの両方ともNot Iにより加水分解され、卵母細胞注入緩衝液（5
mM Tris−HCl pH 7.4と0.2 mM EDTA）でα−MHC融合cDNA断片が精製され、溶離 された。DNAはその後FVBマウスから誘導された受精卵母細胞の中に注入され、卵
母細胞は偽妊娠ICRマウスの輸卵管の中に移された。
Iリンカーと3'Hind IIIリンカーを用いてPCR法によりクローン化され、α−MHC
プロモーターを含む発現ベクターの中に入れられた。この発現ベクターの発現パ
ターンと特性は説明されている（Jonesら、1994）。心臓のNF−AT3タンパク質の
構成的な核形態を発現させるトランスジェニックマウスを生成するため、PCRプ ライマーがNF−AT3Δ317と称されるヒトNF−AT3タンパク質のアミノ酸317〜902 をコードする配列の領域の特異的な増幅を可能にするよう生成された。これらの
プライマーの両端にあるXho Iリンカーは、α−MHC発現ベクターのSal I部位の 中にクローン化することが可能になった。カルシニューリン−とNF−AT3Δ317−
α−MHCベクターの両方ともNot Iにより加水分解され、卵母細胞注入緩衝液（5
mM Tris−HCl pH 7.4と0.2 mM EDTA）でα−MHC融合cDNA断片が精製され、溶離 された。DNAはその後FVBマウスから誘導された受精卵母細胞の中に注入され、卵
母細胞は偽妊娠ICRマウスの輸卵管の中に移された。
【０２２５】 RNA分析。全RNAが収集され、推奨されたとおりにTriazol試薬（Gibco BRL社製
）を用いて回収、精製された。培養された心筋細胞だけでなく、野生型とトラン
スジェニックの心臓由来のRNAが、以前に説明されているとおりにオリゴヌクレ オチドプローブのパネルに対してドットブロットハイブリッド形成にかけられた
（Jonesら、1996）。
）を用いて回収、精製された。培養された心筋細胞だけでなく、野生型とトラン
スジェニックの心臓由来のRNAが、以前に説明されているとおりにオリゴヌクレ オチドプローブのパネルに対してドットブロットハイブリッド形成にかけられた
（Jonesら、1996）。
【０２２６】 組織学。野生型とトランスジェニックマウスから得た心臓が組織学的分析にか
けられた。手短に言うと、心臓が回収され、PBS緩衝液を加えた10％ホルマリン で一夜固定され、エタノールで脱水され、キシレンに移され、その後パラフィン
の中に入れられた。パラフィンに埋め込んだ心臓は4μMの薄片に切り、続いて日
常的な組織学的検査に関してはヘマトキシリンとエオシンで染色し、あるいはコ
ラーゲンに関してはＭassonトリクロームを用いて染色した（WoodsEllis、1994 ）。
けられた。手短に言うと、心臓が回収され、PBS緩衝液を加えた10％ホルマリン で一夜固定され、エタノールで脱水され、キシレンに移され、その後パラフィン
の中に入れられた。パラフィンに埋め込んだ心臓は4μMの薄片に切り、続いて日
常的な組織学的検査に関してはヘマトキシリンとエオシンで染色し、あるいはコ
ラーゲンに関してはＭassonトリクロームを用いて染色した（WoodsEllis、1994 ）。
【０２２７】 実施例2 NF−AT3とGATA4との間の相互作用 本発明の1つの目的は、酵母2−はハイブリッドシステムを使用して、心臓のGA
TA3の補因子として作用するタンパク質を同定することであった。GATA4囮は、枠
内で酵母GAL4タンパク質に融合したアミノ酸130〜409から成っていた（図1A）。
GATA4のこの領域は、2つのジンクフィンガーとカルボキシル末端のほとんどを包
含しているが、アミノ末端転写活性化ドメインを欠いており、したがって酵母に
おいてはGATA4それ自体には転写を活性化しない。10.5日齢マウス胚性cDNAライ ブラリーのスクリーニングは、その1つがNF−AT3であった、数多くのGATA4−相 互作用因子の同定という結果になった。このスクリーニングで同定された他のGA
TA4−相互作用因子は他所で説明される。
TA3の補因子として作用するタンパク質を同定することであった。GATA4囮は、枠
内で酵母GAL4タンパク質に融合したアミノ酸130〜409から成っていた（図1A）。
GATA4のこの領域は、2つのジンクフィンガーとカルボキシル末端のほとんどを包
含しているが、アミノ末端転写活性化ドメインを欠いており、したがって酵母に
おいてはGATA4それ自体には転写を活性化しない。10.5日齢マウス胚性cDNAライ ブラリーのスクリーニングは、その1つがNF−AT3であった、数多くのGATA4−相 互作用因子の同定という結果になった。このスクリーニングで同定された他のGA
TA4−相互作用因子は他所で説明される。
【０２２８】 GATA4とNF−AT3の間の相互作用の特異性は、救助NF−AT3−GAL4活性化ドメイ ンプラスミドと様々なGAL4 DNA結合ドメイン囮プラスミドにより酵母を再形質転
換することにより試験された。この測定では、NF−AT3はまた唯一ジンクフィン ガーDNA結合ドメインのみを包含しているGATA5の残基133〜265と相互作用するこ
とが発見された。しかし、NF−AT3は塩基へリックス−ループ−へリックスタン パク質E12あるいはGAL4 DNA結合ドメインのみと相互作用することはなかった。
換することにより試験された。この測定では、NF−AT3はまた唯一ジンクフィン ガーDNA結合ドメインのみを包含しているGATA5の残基133〜265と相互作用するこ
とが発見された。しかし、NF−AT3は塩基へリックス−ループ−へリックスタン パク質E12あるいはGAL4 DNA結合ドメインのみと相互作用することはなかった。
【０２２９】 GATA4とNF−AT3の間の相互作用をさらに実証するために、救助NF−AT3 cDNA断
片がGAL4 DNA結合ドメインに融合され、またトランスフェクションされた哺乳動
物の細胞において完全長GATA4と相互作用する能力に関して試験された。PpG5E1b
CATは、CATにリンクされている最小E1bプロモーターの上流にある5タンデムGAL4
DNA結合部位を含むリポータープラスミドとして使用された。このリポーターは
、GAL4−NF−AT3かあるいはGATA4のみかのいずれかにより有意に活性化されるこ
とはなかったが、しかし、初代新生ラット心筋細胞におけるのと同様に、10T1/2
線維芽細胞で一緒になった2つの因子によって強力に活性化された（図1B）。完 全長NF−AT3はまた、哺乳動物トランスフェクション測定においてGAL4−GATA4囮
と相互作用した。
片がGAL4 DNA結合ドメインに融合され、またトランスフェクションされた哺乳動
物の細胞において完全長GATA4と相互作用する能力に関して試験された。PpG5E1b
CATは、CATにリンクされている最小E1bプロモーターの上流にある5タンデムGAL4
DNA結合部位を含むリポータープラスミドとして使用された。このリポーターは
、GAL4−NF−AT3かあるいはGATA4のみかのいずれかにより有意に活性化されるこ
とはなかったが、しかし、初代新生ラット心筋細胞におけるのと同様に、10T1/2
線維芽細胞で一緒になった2つの因子によって強力に活性化された（図1B）。完 全長NF−AT3はまた、哺乳動物トランスフェクション測定においてGAL4−GATA4囮
と相互作用した。
【０２３０】 実施例3 GATA4−NF−AT3相互作用のタンパク質決定因子地図作成 GATA4とNF−AT3の間の相互作用をさらに定義するため、対応する35S−メチオ ニン標識化in vitro翻訳生成物の間の相互作用が検出できるかどうかが試験され
た。フラッグエピトープタッグを伴ったNF−AT3とGATA4は、35S−メチオニンの 存在下で家兎の網状赤血球リゼイトにおいて翻訳された。抗フラッグ抗体はその
後共同免疫沈降測定のために使用された。タンパク質はSDS−PAGEにより分解さ れた。抗フラッグ抗体はNF−AT3を選択的に免疫沈降したが、しかしGATA4を認識
しなかった。しかし、NF−AT3がGATA4と混合される場合には、GATA4は共同免疫 沈降された。このように、C−末端でフラッグエピトープに融合された残基522〜
902を含むNF−AT3欠失突然変異体との完全長GATA4の共同翻訳、それに続く抗フ ラッグ抗体とSDS−PAGEの免疫沈降は、2つの共同免疫沈降されたタンパク質と抗
フラッグ抗体はNF−AT3−フラッグが存在しない場合には、GATA4を免疫沈降しな
かった。
た。フラッグエピトープタッグを伴ったNF−AT3とGATA4は、35S−メチオニンの 存在下で家兎の網状赤血球リゼイトにおいて翻訳された。抗フラッグ抗体はその
後共同免疫沈降測定のために使用された。タンパク質はSDS−PAGEにより分解さ れた。抗フラッグ抗体はNF−AT3を選択的に免疫沈降したが、しかしGATA4を認識
しなかった。しかし、NF−AT3がGATA4と混合される場合には、GATA4は共同免疫 沈降された。このように、C−末端でフラッグエピトープに融合された残基522〜
902を含むNF−AT3欠失突然変異体との完全長GATA4の共同翻訳、それに続く抗フ ラッグ抗体とSDS−PAGEの免疫沈降は、2つの共同免疫沈降されたタンパク質と抗
フラッグ抗体はNF−AT3−フラッグが存在しない場合には、GATA4を免疫沈降しな
かった。
【０２３１】 さらに正確にこの相互作用の決定因子の位置を決めるために、一連のGATA4欠 失突然変異体がNF−AT3−フラッグと共同免疫沈降する能力に関して試験された 。2つのジンクフィンガーとNLSを包含するGATA4の残基181〜328は、完全長GATA4
と同様に効率的にNF−AT3と相互作用した。第2ジンクフィンガーからC−末端ま で伸展するGATA4の残基239〜441はまたNF−AT3とも相互作用したが、一方、第2 ジンクフィンガー（80−441/d265−294）を欠く内部欠失突然変異体は相互作用 しなかった。これらの実験では、GATA4の第2ジンクフィンガーはNF−AT3との相 互作用には必須であり、一方、N−末端、第1ジンクフィンガー、C−末端はこの 相互作用に関しては重要ではなかった（図2）。また注意すべきは、GATA6のジン
クフィンガー領域（アミノ酸130〜350）はNF−AT3により免疫沈降されたことで ある。
と同様に効率的にNF−AT3と相互作用した。第2ジンクフィンガーからC−末端ま で伸展するGATA4の残基239〜441はまたNF−AT3とも相互作用したが、一方、第2 ジンクフィンガー（80−441/d265−294）を欠く内部欠失突然変異体は相互作用 しなかった。これらの実験では、GATA4の第2ジンクフィンガーはNF−AT3との相 互作用には必須であり、一方、N−末端、第1ジンクフィンガー、C−末端はこの 相互作用に関しては重要ではなかった（図2）。また注意すべきは、GATA6のジン
クフィンガー領域（アミノ酸130〜350）はNF−AT3により免疫沈降されたことで ある。
【０２３２】 Rel相同ドメイン（RHD）を包含し、またフラッグエピトープを含むNF−AT3のC
−末端領域はGATA4欠失突然変異体80〜328とは別に、あるいは一緒に翻訳された
。NF−AT3 RHDを認識する抗NF−AT3抗体との免疫沈降の結果、この領域はGATA4 との相互作用には十分であることが示された。NF−AT3の欠失突然変異体はRel相
同ドメインのみを包含していたが、残基404〜694もまた試験された。この領域は
GATA4と相互作用するには十分であった。まとめると、これらの結果から、NF−A
T3のRel相同領域には、GATA4の第2ジンクフィンガーとの相互作用を仲介する決 定因子が含まれていたことが示された。
−末端領域はGATA4欠失突然変異体80〜328とは別に、あるいは一緒に翻訳された
。NF−AT3 RHDを認識する抗NF−AT3抗体との免疫沈降の結果、この領域はGATA4 との相互作用には十分であることが示された。NF−AT3の欠失突然変異体はRel相
同ドメインのみを包含していたが、残基404〜694もまた試験された。この領域は
GATA4と相互作用するには十分であった。まとめると、これらの結果から、NF−A
T3のRel相同領域には、GATA4の第2ジンクフィンガーとの相互作用を仲介する決 定因子が含まれていたことが示された。
【０２３３】 実施例4 GATA4とNF−AT3によるBNP遺伝子の相乗的活性化 GATA4−NF−AT3相互作用が心臓遺伝子発現において機能的な役割を有していた
かどうかの調査を開始するために、心肥大の間アップレギュレーションされるAN
F、BNP、心臓トポロニンIプロモーターが、トランスフェクションされた新生ラ ット心筋細胞におけるこれらの因子への応答性に関して試験された。BNPプロモ ーターは、劇的な応答を示し、したがってさらに分析された。これらの実験に関
しては、C−末端自己阻害ドメインを欠くカルシニューリン触媒Aサブユニットの
構成的な活性形態をコードするcDNA発現プラスミドもまた使用された（O'Keefe ら、1992）。このカルシニューリン突然変異体はCa++依存ホスファターゼとして
機能するが、CsAとFK506に対する感受性を維持する。図3に示されているように 、BNPプロモーターはGATA4、NF−AT3、カルシニューリンの存在下で100倍以上活
性化された。GATA4のみはまた、以前に報告されたように（Grepinら、1994）、 このプロモーターを活性化することができたが、しかし活性化の程度はNF−AT3 とカルシニューリンも存在した場合のそれの1/10未満であった。GATA4とNF−AT3
が新生ラット心筋細胞において発現され、それらはトランスフェクション測定の
このタイプには限界があるようにみえるので、BNPプロモーターの最大応答をみ るためには外因性タンパク質を発現させる必要がある。
かどうかの調査を開始するために、心肥大の間アップレギュレーションされるAN
F、BNP、心臓トポロニンIプロモーターが、トランスフェクションされた新生ラ ット心筋細胞におけるこれらの因子への応答性に関して試験された。BNPプロモ ーターは、劇的な応答を示し、したがってさらに分析された。これらの実験に関
しては、C−末端自己阻害ドメインを欠くカルシニューリン触媒Aサブユニットの
構成的な活性形態をコードするcDNA発現プラスミドもまた使用された（O'Keefe ら、1992）。このカルシニューリン突然変異体はCa++依存ホスファターゼとして
機能するが、CsAとFK506に対する感受性を維持する。図3に示されているように 、BNPプロモーターはGATA4、NF−AT3、カルシニューリンの存在下で100倍以上活
性化された。GATA4のみはまた、以前に報告されたように（Grepinら、1994）、 このプロモーターを活性化することができたが、しかし活性化の程度はNF−AT3 とカルシニューリンも存在した場合のそれの1/10未満であった。GATA4とNF−AT3
が新生ラット心筋細胞において発現され、それらはトランスフェクション測定の
このタイプには限界があるようにみえるので、BNPプロモーターの最大応答をみ るためには外因性タンパク質を発現させる必要がある。
【０２３４】 NF−AT3にBNPプロモーターの劇的な応答性を付与した場合に、上記のトランス
フェクション測定において使用された1800 bpプロモーター領域が潜在的なNF−A
T3共通結合部位（GGAAAAT）に関して調べられた。この部位に関する3つの配列は
、−927（TGGAAAACAA、配列識別番号：5）、−327（TGGAAAAGGC、配列識別番号 ：6）、−27（AGGATAAAAG、配列識別番号：7）で同定された。−27部位はまたGA
TA4を結合しており、BNP発現が必要である（Grepinら、1994）。これらの配列に
対応して32P−標識化オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ゲル移動シフト 測定がin vitro翻訳された家兎の網状赤血球リゼイトにおいて生成されるNF−AT
3タンパク質への結合に関して試験するのに使用された。−927における推定部位
は、IL−2プロモーターからの共通NF−AT3部位と同様強くNF−AT3を結合してい たが、一方、−327あるいは−27部位に対しては何らの結合も検出されなかった 。
フェクション測定において使用された1800 bpプロモーター領域が潜在的なNF−A
T3共通結合部位（GGAAAAT）に関して調べられた。この部位に関する3つの配列は
、−927（TGGAAAACAA、配列識別番号：5）、−327（TGGAAAAGGC、配列識別番号 ：6）、−27（AGGATAAAAG、配列識別番号：7）で同定された。−27部位はまたGA
TA4を結合しており、BNP発現が必要である（Grepinら、1994）。これらの配列に
対応して32P−標識化オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ゲル移動シフト 測定がin vitro翻訳された家兎の網状赤血球リゼイトにおいて生成されるNF−AT
3タンパク質への結合に関して試験するのに使用された。−927における推定部位
は、IL−2プロモーターからの共通NF−AT3部位と同様強くNF−AT3を結合してい たが、一方、−327あるいは−27部位に対しては何らの結合も検出されなかった 。
【０２３５】 心筋細胞由来のNF−AT3もまた、BNPプロモーターからの−927部位を結合する ことができたのを確認するため、心臓タンパク質抽出物がプローブとして−927 部位を用いたゲル移動シフト測定に使用された。心臓抽出物は同じ標識化されて
いないオリゴヌクレオチドが過剰に存在している場合には除外することができる
複数の複合体、あるいはIL−2プロモーターにおけるNF−AT3部位に対応する配列
により除外できる複数の複合体であって、非特定の配列によっては除外できない
複数の複合体を生じさせる。心筋細胞複合体はまた、NF−AT3特異的抗体を使用 して大部分は除外することができた。
いないオリゴヌクレオチドが過剰に存在している場合には除外することができる
複数の複合体、あるいはIL−2プロモーターにおけるNF−AT3部位に対応する配列
により除外できる複数の複合体であって、非特定の配列によっては除外できない
複数の複合体を生じさせる。心筋細胞複合体はまた、NF−AT3特異的抗体を使用 して大部分は除外することができた。
【０２３６】 −927部位がNF−AT3により転写活性のために必要とされたかどうかを判定する
ために、この部位を変異させた。突然変異体プロモーターはNF−AT3に対して感 受性がなかったことが見出された（図3）。これらの結果から、BNPプロモーター
は、心筋細胞におけるGATA4とNF−AT3による相乗活性化のために直接的な転写標
的であることが示された。
ために、この部位を変異させた。突然変異体プロモーターはNF−AT3に対して感 受性がなかったことが見出された（図3）。これらの結果から、BNPプロモーター
は、心筋細胞におけるGATA4とNF−AT3による相乗活性化のために直接的な転写標
的であることが示された。
【０２３７】 実施例5 CsAとFK506はAngIIとPEの肥大効果を阻害する 初代心筋細胞のAngIIとPEへの曝露は細胞内Ca++と肥大型応答における増加と いう結果になる。これらのアゴニストに対する心筋細胞の肥大型応答がカルシニ
ューリンにより仲介されたかどうかを判定するために、新生ラット心筋細胞がCs
AないしはFK−506の存在する場合と存在しない場合で、AngII（10nM）とPE（10 μM）に曝露された。心筋細胞はAngIIとPEに72時間曝露後大きさとサルコメア集
合体における劇的な増大をみせた。CsAないしはFK−506の存在下では、AngIIに 対する応答は完全になくなり、PEに対する応答は劇的に減少した。
ューリンにより仲介されたかどうかを判定するために、新生ラット心筋細胞がCs
AないしはFK−506の存在する場合と存在しない場合で、AngII（10nM）とPE（10 μM）に曝露された。心筋細胞はAngIIとPEに72時間曝露後大きさとサルコメア集
合体における劇的な増大をみせた。CsAないしはFK−506の存在下では、AngIIに 対する応答は完全になくなり、PEに対する応答は劇的に減少した。
【０２３８】 AngIIに応答する心筋細胞遺伝子発現における変化もまたカルシニューリン依 存シグナリング経路による制御されているかどうかを判定するために、ドットブ
ロット測定がCsAが存在する場合と存在しない場合でAngIIにより処理された心筋
細胞でのANFmRNAの発現を検出するために行われた。AngIIに対する曝露はANF mR
NAにおける15倍増という結果になったが、それはCsAにより完全に阻止された。G
APDH mRNAが対照として測定された。まとめると、これらの形態学的および分子 データからは、AngIIとPE肥大型シグナリング経路はCsA−/FK−506感受性であり
、したがってカルシニューリン活性化を包含していることが示された。
ロット測定がCsAが存在する場合と存在しない場合でAngIIにより処理された心筋
細胞でのANFmRNAの発現を検出するために行われた。AngIIに対する曝露はANF mR
NAにおける15倍増という結果になったが、それはCsAにより完全に阻止された。G
APDH mRNAが対照として測定された。まとめると、これらの形態学的および分子 データからは、AngIIとPE肥大型シグナリング経路はCsA−/FK−506感受性であり
、したがってカルシニューリン活性化を包含していることが示された。
【０２３９】 NF−AT3活性化がCa++依存性肥大型シグナリングを仲介する場合は、AngIIとPE
はNF−AT活性を誘発することが予想される。これを試験するために、初代ラット
心筋細胞は、チミジンキナーゼ最小プロモーターにリンクされたNF−AT共通配列
の3つのコピーを含むNF−AT依存ルシフェラーゼリポーターによりトランスフェ クションされた。AngII（10 nM）とPE（10μM）の存在下で、リポーター遺伝子 発現はアップレギュレーションされた。このアップレギュレーションは、CsAな いしはFK−506の存在下で完全になくなり、AngIIとPEがカルシニューリン依存シ
グナル形質導入経路によりNF−ATを活性化するという結論を支持した。
はNF−AT活性を誘発することが予想される。これを試験するために、初代ラット
心筋細胞は、チミジンキナーゼ最小プロモーターにリンクされたNF−AT共通配列
の3つのコピーを含むNF−AT依存ルシフェラーゼリポーターによりトランスフェ クションされた。AngII（10 nM）とPE（10μM）の存在下で、リポーター遺伝子 発現はアップレギュレーションされた。このアップレギュレーションは、CsAな いしはFK−506の存在下で完全になくなり、AngIIとPEがカルシニューリン依存シ
グナル形質導入経路によりNF−ATを活性化するという結論を支持した。
【０２４０】 実施例6 活性化カルシニューリンによるin vivoでの心肥大誘発 カルシニューリンシグナル形質導入経路もまたin vivoでの心筋層において作 動することができるかどうかを判定するため、心臓においてカルシニューリン触
媒サブユニットの構成的な活性形態を発現したトランスジェニックマウスが、発
現を駆動するα−MHCプロモーターを使用して、生成された。以前の研究では、 この心臓特異的プロモーターは主として生後心室において活性があることが示さ
れている（Jonesら、1994）。合計10の別個の創始トランスジェニックマウスが 生成されたが、それにはMHC−カルシニューリントランス遺伝子の2〜68コピーの
間でコピーが包含されていた（表1）。
媒サブユニットの構成的な活性形態を発現したトランスジェニックマウスが、発
現を駆動するα−MHCプロモーターを使用して、生成された。以前の研究では、 この心臓特異的プロモーターは主として生後心室において活性があることが示さ
れている（Jonesら、1994）。合計10の別個の創始トランスジェニックマウスが 生成されたが、それにはMHC−カルシニューリントランス遺伝子の2〜68コピーの
間でコピーが包含されていた（表1）。
【０２４１】
【表１】
【０２４２】 分析にかけられたカルシニューリントランスジェニックマウスはすべて、非ト
ランスジェニック同腹子に比して心臓の大きさで劇的な増加をみせた。生後18日
という早期であっても、対照同腹子と比較して、カルシニューリントランスジェ
ニックマウスでは心臓の質量がが平均で2〜3倍大きかった（表1）。組織学的分 析では、心室壁と心室間隔壁の横断面域で劇的に増大した同心円状肥大を示した
。左心室が最も影響を受けたが、右心室と心房もまた大きくなった。正常の心室
壁のうまく組織化され、横紋筋系とは対照的に、カルシニューリントランスジェ
ニックマウスの心臓から得た心筋細胞は組織崩壊され、明らかに肥大型となった
。肥大型心筋細胞はよく劇的な核肥大を有する。左心室壁内筋細胞の横断面域の
測定で、対照に比較してカルシニューリントランスジェニックマウスでは2倍以 上の増大を示した。
ランスジェニック同腹子に比して心臓の大きさで劇的な増加をみせた。生後18日
という早期であっても、対照同腹子と比較して、カルシニューリントランスジェ
ニックマウスでは心臓の質量がが平均で2〜3倍大きかった（表1）。組織学的分 析では、心室壁と心室間隔壁の横断面域で劇的に増大した同心円状肥大を示した
。左心室が最も影響を受けたが、右心室と心房もまた大きくなった。正常の心室
壁のうまく組織化され、横紋筋系とは対照的に、カルシニューリントランスジェ
ニックマウスの心臓から得た心筋細胞は組織崩壊され、明らかに肥大型となった
。肥大型心筋細胞はよく劇的な核肥大を有する。左心室壁内筋細胞の横断面域の
測定で、対照に比較してカルシニューリントランスジェニックマウスでは2倍以 上の増大を示した。
【０２４３】 ヒトでは、心肥大は高い頻度で心室拡張、心不全、突然死に進行する。同様に
、カルシニューリントランスジェニックマウスでは加齢とともに心室の拡張があ
った。カルシニューリントランスジェニックマウスはまた突然死に対して高度に
感受性であった。これは操作ないしは麻酔中に自発的に起こった。突然死により
死亡したマウスでは、心不全を示す右と左の心室拡張がみられた。肺の組織学で
はまた、赤血球を含む拡張性血管周囲浮腫と肺内胞マクロファージが明らかにな
り、所見は心不全と一致していた。心不全の顕著な特徴の1つは心室壁の線維増 多である。トリクローム染色により明らかにされたように、カルシニューリント
ランスジェニックマウスの心臓には拡張性、主に間隙性のコラーゲン蓄積が含ま
れていた。顕著な線維増多を伴う病巣では、筋線維変性が明らかであった。
、カルシニューリントランスジェニックマウスでは加齢とともに心室の拡張があ
った。カルシニューリントランスジェニックマウスはまた突然死に対して高度に
感受性であった。これは操作ないしは麻酔中に自発的に起こった。突然死により
死亡したマウスでは、心不全を示す右と左の心室拡張がみられた。肺の組織学で
はまた、赤血球を含む拡張性血管周囲浮腫と肺内胞マクロファージが明らかにな
り、所見は心不全と一致していた。心不全の顕著な特徴の1つは心室壁の線維増 多である。トリクローム染色により明らかにされたように、カルシニューリント
ランスジェニックマウスの心臓には拡張性、主に間隙性のコラーゲン蓄積が含ま
れていた。顕著な線維増多を伴う病巣では、筋線維変性が明らかであった。
【０２４４】 実施例7 カルシニューリンによるin vivoでの肥大に対する分子応答の活性化 定量的ドットブロット測定法が、活性化カルシニューリンが肥大と心不全が特
徴的な心臓遺伝子発現において変化を誘導したかどうかを判定するために、カル
シニューリントランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウス同腹子の
心臓から得たRNAを調べるのに使用された。遺伝子発現の胚性プログラムの再活 性化と一致しており、β−MHC、β−骨格アクチン、BNP転写物がトランスジェニ
ックマウスの心臓では劇的にアップレギュレーションされたが、一方、α−MHC はダウンレギュレーションされた（図5）。筋小胞体Ca++−ATPアーゼ（SERCA） とホスホランバン（PLB）の転写は欠点のある心筋層が欠陥のあるCa++操作を示 すように、心不全の間ダウンレギュレーションされることが以前に示されている
（Schwingerら、1995）。すなわち、転写物はカルシニューリンマウストランス ジェニックマウスでは減少する。GAPDH発現では有意な変化はなかった。
徴的な心臓遺伝子発現において変化を誘導したかどうかを判定するために、カル
シニューリントランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウス同腹子の
心臓から得たRNAを調べるのに使用された。遺伝子発現の胚性プログラムの再活 性化と一致しており、β−MHC、β−骨格アクチン、BNP転写物がトランスジェニ
ックマウスの心臓では劇的にアップレギュレーションされたが、一方、α−MHC はダウンレギュレーションされた（図5）。筋小胞体Ca++−ATPアーゼ（SERCA） とホスホランバン（PLB）の転写は欠点のある心筋層が欠陥のあるCa++操作を示 すように、心不全の間ダウンレギュレーションされることが以前に示されている
（Schwingerら、1995）。すなわち、転写物はカルシニューリンマウストランス ジェニックマウスでは減少する。GAPDH発現では有意な変化はなかった。
【０２４５】 実施例8 活性化NF−AT3によるin vivoでの心肥大の誘発 NF−AT3タンパク質の活性化はT細胞におけるカルシニューリン作用のうまく特
徴付けられたメカニズムであり、またNF-ATはGATA4と相乗作用することができた
が、in vivoでのカルシニューリンに対する肥大型応答にはNF-AT依存メカニズム
が含まれることは形式上は可能性がある。活性化NF-AT3は肥大型シグナリングカ
スケードにおける全上流エレメントを代替することができたかどうかを判定する
ため、構成的に活性であるNF-AT3突然変異体がN−末端調節ドメインを欠失する ことにより作り出された。この突然変異体は、NF-AT3Δ317と称されるが、タン パク質の第1の317アミノ酸を欠いていたが、Rel相同および転写ドメインは保持 していた（図6）。
徴付けられたメカニズムであり、またNF-ATはGATA4と相乗作用することができた
が、in vivoでのカルシニューリンに対する肥大型応答にはNF-AT依存メカニズム
が含まれることは形式上は可能性がある。活性化NF-AT3は肥大型シグナリングカ
スケードにおける全上流エレメントを代替することができたかどうかを判定する
ため、構成的に活性であるNF-AT3突然変異体がN−末端調節ドメインを欠失する ことにより作り出された。この突然変異体は、NF-AT3Δ317と称されるが、タン パク質の第1の317アミノ酸を欠いていたが、Rel相同および転写ドメインは保持 していた（図6）。
【０２４６】 NF-AT3Δ317がトランスフェクションされた心筋細胞で発現された場合、核局 在のカルシニューリンシグナリングを必要とした野生型タンパク質とは対照的に
、NF-AT3Δ317は核に構成的に位置することになった。NF-AT3Δ317突然変異体は
また、一過性のトランスフェクション測定においてNF-AT依存リポーター構築物 を活性化した。したがって、この突然変異体はα−MHCプロモーターの制御下で 、トランスジェニックマウスの心臓で発現した。3つの独立した創始トランスジ ェニックマウスが得られ、すべてが顕著な左および右心室の同心円状肥大を示し
た。カルシニューリントランスジェニックマウスのように、NF-AT3Δ317トラン スジェニックマウスの心室壁は、筋線維混乱と心筋細胞拡大を伴う拡張性線維症
を示した。対照的に、α−MHCプロモーターの制御下では野生型NF-AT3の発現は 肥大には繋がらなかった。このように、活性化されたNF-AT3単独で、心臓におけ
るCa++シグナルを代替し、in vivoに肥大型応答を引き起こすには十分である。
、NF-AT3Δ317は核に構成的に位置することになった。NF-AT3Δ317突然変異体は
また、一過性のトランスフェクション測定においてNF-AT依存リポーター構築物 を活性化した。したがって、この突然変異体はα−MHCプロモーターの制御下で 、トランスジェニックマウスの心臓で発現した。3つの独立した創始トランスジ ェニックマウスが得られ、すべてが顕著な左および右心室の同心円状肥大を示し
た。カルシニューリントランスジェニックマウスのように、NF-AT3Δ317トラン スジェニックマウスの心室壁は、筋線維混乱と心筋細胞拡大を伴う拡張性線維症
を示した。対照的に、α−MHCプロモーターの制御下では野生型NF-AT3の発現は 肥大には繋がらなかった。このように、活性化されたNF-AT3単独で、心臓におけ
るCa++シグナルを代替し、in vivoに肥大型応答を引き起こすには十分である。
【０２４７】 実施例9 CsAによる心肥大の予防 In vivoでのカルシニューリン活性の阻害が心肥大を予防する1つの効果的な手
段になるかどうかの判定を開始するため、本発明者はCsAの皮下注射がカルシニ ューリントランスジェニックマウスにおける心機能不全を予防することができる
かどうかを試験した。これらの実験に関しては、トランスジェニックマウス＃37
の1つの腹から生まれた8匹のトランスジェニック同腹子が使用された（表1を参 照）。4匹のトランス遺伝子陽性子孫が1日に2回25 mg/ml CsAを注射され、4匹は
ビーイクルのみを注射された。4匹の非トランスジェニック同腹子もまたCsAで潜
在的な毒性効果あるいはCsAにより誘発された心臓の異常を制御するために治療 された。CsA治療は9日齢で開始され、動物は16日後に犠牲にされた。図7Aと図7B
に示されているように、ビーイクルで処理された動物の心臓は25日目までに高度
に肥大また拡張されたが、一方、CsA治療の同腹子は非トランスジェニックマウ ス対照と大きさにおいて有意に異なることはなかった。カルシニューリントラン
スジェニックマウスに関する平均心臓/体重比はCsA治療トランスジェニックマウ
スおよび非トランスジェニックマウスのそれよりも3倍近く大きかった。CsA治療
はまたカルシニューリントランスジェニックマウスの心臓の線維症を予防した。
段になるかどうかの判定を開始するため、本発明者はCsAの皮下注射がカルシニ ューリントランスジェニックマウスにおける心機能不全を予防することができる
かどうかを試験した。これらの実験に関しては、トランスジェニックマウス＃37
の1つの腹から生まれた8匹のトランスジェニック同腹子が使用された（表1を参 照）。4匹のトランス遺伝子陽性子孫が1日に2回25 mg/ml CsAを注射され、4匹は
ビーイクルのみを注射された。4匹の非トランスジェニック同腹子もまたCsAで潜
在的な毒性効果あるいはCsAにより誘発された心臓の異常を制御するために治療 された。CsA治療は9日齢で開始され、動物は16日後に犠牲にされた。図7Aと図7B
に示されているように、ビーイクルで処理された動物の心臓は25日目までに高度
に肥大また拡張されたが、一方、CsA治療の同腹子は非トランスジェニックマウ ス対照と大きさにおいて有意に異なることはなかった。カルシニューリントラン
スジェニックマウスに関する平均心臓/体重比はCsA治療トランスジェニックマウ
スおよび非トランスジェニックマウスのそれよりも3倍近く大きかった。CsA治療
はまたカルシニューリントランスジェニックマウスの心臓の線維症を予防した。
【０２４８】 細胞レベルでは、顕著な濃色色調核を伴う筋線維混乱と散乱細胞の分離域があ
ったが、カルシニューリントランスジェニックマウスにおける心筋細胞の肥大型
応答は大半はCsAによって阻害された。CsA投与が開始された時点でこれらの提示
細胞はすでに肥大していたかどうか、あるいはCsAの効果を逸したいくつかの細 胞があるかどうかはさらなる研究調査が必要となろう。それにもかかわらず、Cs
A治療は、in vivoでの活性化カルシニューリンに応答して、粗大な心肥大とそれ
に関連する異常を予防した。
ったが、カルシニューリントランスジェニックマウスにおける心筋細胞の肥大型
応答は大半はCsAによって阻害された。CsA投与が開始された時点でこれらの提示
細胞はすでに肥大していたかどうか、あるいはCsAの効果を逸したいくつかの細 胞があるかどうかはさらなる研究調査が必要となろう。それにもかかわらず、Cs
A治療は、in vivoでの活性化カルシニューリンに応答して、粗大な心肥大とそれ
に関連する異常を予防した。
【０２４９】 本明細書で開示され、主張された組成物および/または方法はすべて、本開示 に照らして不当な実験をせずに作成および実施することができる。本発明の組成
物ならびに方法は好適な実施形態によって説明されてきたが、その変形は、本発
明の概念、精神、範囲から離れることなく本明細書に説明されている組成物およ
び/または方法、また本方法の工程あるいは工程の結果において適用することが できることは、当業者には明らかなことであろう。さらに詳細には、化学的およ
び生理学的に、その両方で関連しているある種の薬剤は、同じないしは同様の結
果を達成し、本明細書に記述されている薬剤と代替することが可能であることは
明らかであろう。
物ならびに方法は好適な実施形態によって説明されてきたが、その変形は、本発
明の概念、精神、範囲から離れることなく本明細書に説明されている組成物およ
び/または方法、また本方法の工程あるいは工程の結果において適用することが できることは、当業者には明らかなことであろう。さらに詳細には、化学的およ
び生理学的に、その両方で関連しているある種の薬剤は、同じないしは同様の結
果を達成し、本明細書に記述されている薬剤と代替することが可能であることは
明らかであろう。
【０２５０】 参考文献 以下の参照文献は、本明細書に示される方法及び詳記を補足する例示的な方法
及び詳記の程度で、引用することにより、本明細書に特に組み込まれるものとす
る。
及び詳記の程度で、引用することにより、本明細書に特に組み込まれるものとす
る。
【０２５１】
【表２】
【０２５２】
【表３】
【０２５３】
【表４】
【０２５４】
【表５】
【０２５５】
【表６】
【０２５６】
【表７】
【０２５７】
【表８】
【０２５８】
【配列表】
図1Aと図1B。2−ハイブリッドシステムにおけるGATA4とNF−AT3の間の相互作用 。図1Aは、GATA4とNF−AT3タンパク質の略線図である。2−ハイブリッドシステ ムにおける囮として使用されているGATA4の一部はアミノ酸130〜409にわたり、 その全長タンパク質の下に示されている。酵母2−ハイブリッドスクリーンにお いて回収されたNF−AT3の一部は、アミノ酸522〜902にわたっていた。Rel相同ド
メイン（RHD）はアミノ酸404から694に拡張しており、保存的リン酸化ドメイン は145から275に拡張している。図1Bでは、NF−AT3のアミノ酸522〜902はGAL4 DN
A結合ドメイン（DBD）に対する枠内で融合され、トランスフェクションされた10
T1/2細胞における2−ハイブリッド測定で囮として使用された。 図2。共同免疫沈降結果の概要。F1とF2は2つのジンクフィンガーを表し、NLS は核局在シグナルを表す。 図3。初代心筋細胞でのNF−AT3によるBNPプロモーターの調節。初代ラット心 筋細胞は、示されているように、BNP 5'−フランキング領域にリンクされたCAT リポーター遺伝子、NF−AT3、活性化されたカルシニューリン、あるいはGATA4を
コードする発現ベクターにより一過性にトランスフェクションされた。48時間後
、細胞は収集され、CAT活性は測定された。レーン標識化−927部位突然変異では
、−927でNF−AT3部位が突然変異されたBNP−CATリポーター遺伝子が使用された
。 図4。CsAとFK506による初代心臓細胞に関するAngII‐とPE‐依存性心肥大。初
代ラット心筋細胞は一過性にNF‐AT3依存性ルシフェラーゼリポーター遺伝子に よりトランスフェクションされた。細胞はその後、上述のように、CsAの存在下 あるいは存在しない場合でAngIIあるいはPEで処理された。48時間後、細胞は収 集され、ルシフェラーゼ活性が測定された。 図5。α‐MHC‐カルシニューリントランスジェニックマウスでの心臓遺伝子発
現における変化。総RNAは、6週齢で対照とα‐MHC‐カルシニューリントランス ジェニックマウスの心臓から分離された。示されている転写はドット部ロット法
により検出され、対照に比したトランスジェニック動物の心臓における値が示さ
れている。 図6。NF‐AT3とNF‐AT3Δ317突然変異の構造。RHD, Rel‐相同性ドメイン；Re
g.は 調節ドメインである。アミノ酸位置が示されている。 図7Aと図7B。CsAによるカルシニューリン依存性心肥大の予防。図7Aでは、CsA
治療の方法が示されている。図7Bでは、示されているように、α‐MHC‐カルシ ニューリントランスジェニックおよび非トランスジェニックマウスが、CsA（25m
g/kg）を加えて、あるいは加えずに治療された。心臓/体重比が±標準偏差で表 現されている。雄カルシニューリントランスジェニック#37から得られたトラン スジェニック同腹子（表1参照）は、実施例1で説明されているように、CsAによ り、あるいは9日齢で始まるビーイクル単独で治療される。25日齢で、動物は犠 牲にされ、心臓は除去され、縦に切片化された。 図8。心肥大におけるカルシニューリン依存性転写経路に関する動物モデル。A
ngII、PEと細胞膜でおそらく作用する他の肥大刺激が細胞内Ca++の上昇と細胞質
におけるカルシニューリンの活性化に繋がっている。カルシニューリンはNF‐AT
3を脱リン酸化し、相乗的に転写を活性化するためにカルシニューリンがGATA4と
相互作用する場所である核に転移する結果となる。NF‐AT3のすべての作用がGAT
A4との相互作用により仲介されるか、あるいはある種の肥大型応答の活性化に対
するGATA4依存性経路があるかどうかが判定されるべきものとして残る。実線の 矢印は公知の経路を表す。点線は示されていなかった可能性のある経路を表して
いる。
メイン（RHD）はアミノ酸404から694に拡張しており、保存的リン酸化ドメイン は145から275に拡張している。図1Bでは、NF−AT3のアミノ酸522〜902はGAL4 DN
A結合ドメイン（DBD）に対する枠内で融合され、トランスフェクションされた10
T1/2細胞における2−ハイブリッド測定で囮として使用された。 図2。共同免疫沈降結果の概要。F1とF2は2つのジンクフィンガーを表し、NLS は核局在シグナルを表す。 図3。初代心筋細胞でのNF−AT3によるBNPプロモーターの調節。初代ラット心 筋細胞は、示されているように、BNP 5'−フランキング領域にリンクされたCAT リポーター遺伝子、NF−AT3、活性化されたカルシニューリン、あるいはGATA4を
コードする発現ベクターにより一過性にトランスフェクションされた。48時間後
、細胞は収集され、CAT活性は測定された。レーン標識化−927部位突然変異では
、−927でNF−AT3部位が突然変異されたBNP−CATリポーター遺伝子が使用された
。 図4。CsAとFK506による初代心臓細胞に関するAngII‐とPE‐依存性心肥大。初
代ラット心筋細胞は一過性にNF‐AT3依存性ルシフェラーゼリポーター遺伝子に よりトランスフェクションされた。細胞はその後、上述のように、CsAの存在下 あるいは存在しない場合でAngIIあるいはPEで処理された。48時間後、細胞は収 集され、ルシフェラーゼ活性が測定された。 図5。α‐MHC‐カルシニューリントランスジェニックマウスでの心臓遺伝子発
現における変化。総RNAは、6週齢で対照とα‐MHC‐カルシニューリントランス ジェニックマウスの心臓から分離された。示されている転写はドット部ロット法
により検出され、対照に比したトランスジェニック動物の心臓における値が示さ
れている。 図6。NF‐AT3とNF‐AT3Δ317突然変異の構造。RHD, Rel‐相同性ドメイン；Re
g.は 調節ドメインである。アミノ酸位置が示されている。 図7Aと図7B。CsAによるカルシニューリン依存性心肥大の予防。図7Aでは、CsA
治療の方法が示されている。図7Bでは、示されているように、α‐MHC‐カルシ ニューリントランスジェニックおよび非トランスジェニックマウスが、CsA（25m
g/kg）を加えて、あるいは加えずに治療された。心臓/体重比が±標準偏差で表 現されている。雄カルシニューリントランスジェニック#37から得られたトラン スジェニック同腹子（表1参照）は、実施例1で説明されているように、CsAによ り、あるいは9日齢で始まるビーイクル単独で治療される。25日齢で、動物は犠 牲にされ、心臓は除去され、縦に切片化された。 図8。心肥大におけるカルシニューリン依存性転写経路に関する動物モデル。A
ngII、PEと細胞膜でおそらく作用する他の肥大刺激が細胞内Ca++の上昇と細胞質
におけるカルシニューリンの活性化に繋がっている。カルシニューリンはNF‐AT
3を脱リン酸化し、相乗的に転写を活性化するためにカルシニューリンがGATA4と
相互作用する場所である核に転移する結果となる。NF‐AT3のすべての作用がGAT
A4との相互作用により仲介されるか、あるいはある種の肥大型応答の活性化に対
するGATA4依存性経路があるかどうかが判定されるべきものとして残る。実線の 矢印は公知の経路を表す。点線は示されていなかった可能性のある経路を表して
いる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｈ０４５ 48/00 49/00 49/00 Ａ６１Ｐ 9/04 Ａ６１Ｐ 9/04 Ｃ０７Ｋ 14/58 Ｃ０７Ｋ 14/58 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ６０／０８１，８５３ (32)優先日 平成10年４月15日(1998．4．15) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／０６１，４１７ (32)優先日 平成10年４月16日(1998．4．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 オルソン，エリック・エヌ アメリカ合衆国テキサス州75225，ダラス, サウスウェスタン・ブールヴァード 3700 (72)発明者 グラント，スティーヴン・アール アメリカ合衆国テキサス州76132，フォー ト・ワース，クウェイル・リッジ・ロード 7136 (72)発明者 モルケンティン，ジェフリー・ディー アメリカ合衆国オハイオ州45231，シンシ ナティ，サンダーバード・ドライヴ 1037 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA11 BA80 CA04 CA06 CA11 DA02 EA04 FA02 GA11 HA01 HA17 4B063 QA05 QQ08 QQ43 QQ61 QQ89 QQ91 QR77 QS11 4C084 AA02 AA13 AA17 BA44 DA11 DA39 DC50 NA14 ZA362 4C085 AA13 AA14 BB11 DD63 DD88 GG02 GG03 GG04 GG05 GG06 4C086 AA01 AA02 CB22 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA36 4H045 AA11 BA10 CA40 DA76 EA23 FA72 FA73 FA74
Claims (40)
- 【請求項１】 ＮＦ−ＡＴ３の機能を阻害する工程を含む心筋細胞における
肥大を治療する方法。 - 【請求項２】 ＮＦ−ＡＴ３の機能を阻害することがＮＦ−ＡＴ３の脱リン
酸化を阻害することを含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ＮＦ−ＡＴ３の機能を阻害することがＮＦ−ＡＴ３の発現を
減少させることを含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 ＮＦ−ＡＴ３の機能を阻害することがＮＦ−ＡＴ３に結合し
、また不活性化する薬剤とＮＦ−ＡＴ３を接触させることを含む請求項１に記載
の方法。 - 【請求項５】 前記方法がさらにＮＦ−ＡＴ３により調節される遺伝子のア
ップレギュレーションを阻害することを含み、前記遺伝子が心房性ナトリウム利
尿因子遺伝子、β−ミオシン重鎖遺伝子、β型利尿ペプチド、α−骨格アクチン
遺伝子から構成されるグループから選択される請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 ＮＦ−ＡＴ３の機能を阻害することがＧＡＴＡ４とのＮＦ−
ＡＴ３の相互作用を阻害することを含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 脱リン酸化を阻害する薬剤がシクロスポリンＡあるいはＦＫ
５０６である請求項２に記載の方法。 - 【請求項８】 ＮＦ−ＡＴ３の発現を減少させる薬剤がアンチセンス構築物
である請求項３に記載の方法。 - 【請求項９】 ＮＦ−ＡＴ３に結合し、不活性化する薬剤が抗体製剤あるい
は小さな分子阻害薬である請求項４に記載の方法。 - 【請求項１０】 抗体製剤が単鎖抗体を含む請求項９に記載の方法。
- 【請求項１１】 前記抗体製剤が主にモノクローナル抗体から構成される請
求項９に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記遺伝子の機能を阻害する薬剤がアンチセンス構築物で
ある請求項５に記載の方法。 - 【請求項１３】 その細胞が真核細胞において活性であるプロモーターの制
御下で異種ＮＦ−ＡＴ３遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項１４】 前記哺乳動物はマウスである請求項１３に記載のトランス
ジェニック哺乳動物。 - 【請求項１５】 前記異種ＮＦ−ＡＴ３遺伝子がリン酸化部位を破壊する少
なくとも１つの突然変異を含む請求項１３に記載のトランスジェニック哺乳動物
。 - 【請求項１６】 前記異種ＮＦ−ＡＴ３遺伝子がヒトのものである請求項１
３に記載のトランスジェニック哺乳動物。 - 【請求項１７】 前記異種ＮＦ−ＡＴ３遺伝子が野生型ＮＦ−ＡＴ３の１つ
ないしはそれ以上のリン酸化部位を欠くタンパク質をコードする請求項１５に記
載のトランスジェニック哺乳動物。 - 【請求項１８】 前記ＮＦ−ＡＴ３遺伝子が野生型ＮＦ−ＡＴ３のすべての
リン酸化部位を欠くタンパク質をコードする請求項１５に記載のトランスジェニ
ック哺乳動物。 - 【請求項１９】 前記ＮＦ−ＡＴ３遺伝子が野生型ＮＦ−ＡＴ３のアミノ酸
１〜１３７を欠くタンパク質をコードする請求項１５に記載のトランスジェニッ
ク哺乳動物。 - 【請求項２０】 前記プロモーターが組織特異的プロモーターである請求項
１３に記載のトランスジェニック哺乳動物。 - 【請求項２１】 前記組織特異的プロモーターが心筋細胞特異的プロモータ
ーである請求項２０に記載のトランスジェニック哺乳動物。 - 【請求項２２】 前記心筋細胞特異的プロモーターが、ＢＮＰ、β−ＭＨＣ
、心臓トロポニンＩ、α−ＭＨＣ、ＳＭ２２α、α−骨格アクチンプロモーター
から構成されるグループから選択される請求項２１に記載のトランスジェニック
哺乳動物。 - 【請求項２３】 心肥大の活性調節因子をスクリーニングする方法であって
、前記方法は、 （ａ）１つないしはそれ以上のリン酸化部位を欠く突然変異体ＮＦ−ＡＴ３遺伝
子を有する細胞を提供する工程と、 （ｂ）候補となる活性調節因子と前記細胞を接触させる工程と、 （ｃ）前記細胞が前記候補となる活性調節因子によっては治療されないときには
存在しない効果に関して前記細胞をモニタリングする工程と、 を含む前記方法。 - 【請求項２４】 前記細胞は心筋細胞系から誘導される請求項２３に記載の
方法。 - 【請求項２５】 前記細胞が初代心筋細胞から誘導される請求項２３に記載
の方法。 - 【請求項２６】 接触がｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる請求項２３に記載の方
法。 - 【請求項２７】 前記モニタリングが心房性ナトリウム利尿因子遺伝子、β
−ミオシン重鎖遺伝子、心臓アクチン遺伝子、α−骨格アクチン遺伝子から構成
されるグループから選択される遺伝子の活性あるいは発現を測定することを含む
請求項２６に記載の方法。 - 【請求項２８】 前記モニタリングが前記細胞の大きさあるいは質量を測定
することを含む請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２９】 前記モニタリングが前記細胞におけるＣａ++応答をモニタ
リングすることを含む請求項２４に記載の方法。 - 【請求項３０】 前記Ｃａ++応答のモニタリングが前記細胞におけるＣａ++
依存性遺伝子発現をモニタリングすることを含む請求項２９に記載の方法。 - 【請求項３１】 前記接触がｉｎ ｖｉｖｏに行われる請求項２３に記載の
方法。 - 【請求項３２】 前記細胞がトランスジェニック非ヒト哺乳動物の一部であ
る請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３３】 前記モニタリングが心肥大を測定することを含む請求項３
１に記載の方法。 - 【請求項３４】 前記ＮＦ−ＡＴ３遺伝子が野生型ＮＦ−ＡＴ３の１つない
しはそれ以上のリン酸化部位を欠くタンパク質をコードする請求項２３に記載の
方法。 - 【請求項３５】 前記ＮＦ−ＡＴ３遺伝子が野生型ＮＦ−ＡＴ３のすべての
リン酸化部位を欠くタンパク質をコードする請求項２３に記載の方法。 - 【請求項３６】 前記ＮＦ−ＡＴ３遺伝子が野生型ＮＦ−ＡＴ３のアミノ酸
１〜１３７を欠くタンパク質をコードする請求項２３に記載の方法。 - 【請求項３７】 前記候補となる活性調節因子がアンチセンス構築物である
請求項２３に記載の方法。 - 【請求項３８】 前記候補となる活性調節因子が小さな分子ライブラリー由
来のものである請求項２３に記載の方法。 - 【請求項３９】 前記候補となる活性調節因子が抗体である請求項２３に記
載の方法。 - 【請求項４０】 前記抗体が単鎖抗体である請求項４１に記載の方法。
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| US6517897P | 1997-11-10 | 1997-11-10 | |
| US60/065,178 | 1997-11-10 | ||
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| US60/081,853 | 1998-04-15 | ||
| US6141798A | 1998-04-16 | 1998-04-16 | |
| US09/061,417 | 1998-04-16 | ||
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