DE10126371A1 - Verfahren zur Identifizierung von Substanzen gegen Herzmuskelzellen-Hypertrophie - Google Patents

Verfahren zur Identifizierung von Substanzen gegen Herzmuskelzellen-Hypertrophie

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DE10126371A1
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur in vitro Untersuchung von Herzmuskelzellen-Hypertrophie, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Parameter für Herzmuskelzellen-Hypertrophie über die Expressionsrate eines heterologen Markerproteins in mindestens einer Herzmuskelzelle, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für das heterologe Markerprotein, messbar ist.

Description

  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis und/oder Identifizierung herzaktiver Substanzen sowie ein Verfahren zur in vitro Untersuchung von Herzmuskelzellen-Hypertrophie.
  • Die Bedeutung morphologischer Veränderungen auf zellulärer Ebene während der Embryogenese und der Organogenese ist in der Vergangenheit gut untersucht worden. Beispiele für derartige Veränderungen der Zellform, welche die Reifting der Organe oder des ganzen Organismus zentral steuern, sind die Neurogenese und die Gastrulation von Vertebraten-Embryos. Erst kürzlich wurde entdeckt, daß diese Veränderungen in der Zellarchitektur ebenfalls für die Pathogenese verschiedener Krankheiten verantwortlich ist. Solche Krankheiten sind beispielsweise Congestive Heart Failure (CHF), starke Herzmuskelfunktionsstörungen, mehrere Entwicklungsstadien einer Hypertrophie des ventrikulären Herzmuskels, die sich in der Hypertrophie einzelner Herzmuskelzellen widerspiegeln.
  • Die Beobachtung, daß Hypertrophie von Herzmuskelzellen nicht nur in dem gesamten Gewebe, sondern ebenfalls in vitro auf der Ebene einzelner Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen analysiert werden kann, bildet die Grundlage zur Bestimmung und Messung zellulärer Parameter von Herzmuskelzellen- Hypertrophie (Wollert K. C. et al. (1996): Cardiotrophin-1 Activates a Distinct From of Cardiac Muscle Cell Hypertrophy. JBC 271, 16, 9535-9545). Der bislang bekannteste Parameter ist die zunehmende Syntheserate des Atrial Natriuretic Factors (ANF), welcher vermutlich im Zusammenhang mit der Herzmukelzellen- Hypertrophie steht. Ebenso stellt die Schaltung des Expressionsmusters eines fetalen Gens einen Indikator für Herzmuskelzellen-Hypertrophie dar (Shubeita H. E. et al. (1990): Endothelin Induction of Inositol Phospholipid Hydrolysis, Sarcomere Assembly, and Cardiac Gene Expression in Ventricular Myocytes. JBC 265, 33, 20555-20562; Iwaki K. et al. (1990): α- and β-Adrenergic Stimulation Induces Distinct Patterns of Immediate Early Gene Expression in Neonatal Rat Myocardial Cells. JBC 265, 23, 13809-13817).
  • Faktoren, die mit den morphologischen Veränderungen in engerem Zusammenhang stehen, sind zunehmendes Zellvolumen und zunehmende Proteinsyntheserate. Von diesen Parametern kann lediglich die ANF-Produktion in automatisierter Weise (z. B. ELISA) gemessen werden. Da jedoch die Bedeutung dieses unspezifischen Parameters für die Herzmuskelzellen-Hypertrophie unklar ist, besteht ein hoher Bedarf für die Entwicklung eines automatisierten Screening-Tests zur Identifizierung hypotrophischer Reize in Herzmuskelzellen oder anderen Zelltypen.
  • Überraschenderweise konnte ein Zusammenhang zwischen der Zunahme der Zellgröße und der Expression von rekombinantem Green Fluorescence Protein (GFP) von einem geeigneten Promotor aus bei Kultur-Herzmuskelzellen, die mit verschiedenen Hypertrophie-Erregern stimuliert wurden, festgestellt werden. Die zunehmende Fluoreszenzintensität in lebenden Zellen konnte mittels eines Fluoreszenz-Mikroskops untersucht und quantifiziert werden.
  • Die vorliegende Erfindung eröffnet neue Möglichkeiten der in vitro-Untersuchung von Herzmuskelzellen-Hypertrophie anhand der Kombination von drei wichtigen Merkmalen:
    • a) Messung eines direkten Parameters für Herzmuskelzellen-Hypertrophie,
    • b) Untersuchung lebender Zellen und
    • c) Vereinfachung durch Automatisierung des Systems.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht die direkte Messung eines Hypertrophie- Parameters (Proteinsyntheserate), die für die Zunahme der Zellmasse (Hypertrophie) in lebenden Zellen erforderlich ist. Die neue Möglichkeit, mit einem System lebender Zellen zu arbeiten, fördert darüber hinaus kinetische Untersuchungen von hypertrophischen Antworten in einzelnen Zellpopulationen. Die Vereinfachung der Detektion bildet die Basis für eine Automatisierung des Systems, um einen mittleren Durchsatz-Test für die Detektion hypertrophischer Reize herzustellen.
  • Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur in vitro Untersuchung von Herzmuskelzellen-Hypertrophie, wobei mindestens ein Parameter für Herzmuskelzellen-Hypertrophie über die Expressionsrate eines heterologen Markerproteins in mindestens einer Herzmuskelzelle enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für das heterologe Markerprotein messbar ist. Dabei wird die Expression des heterologen Markerproteins durch einen geeigneten Promotor kontrolliert, beispielsweise durch einen starken konstitutiven Promotor, insbesondere durch den CMV Promotor.
  • Parameter für Herzmuskelzellen-Hypertrophie im Sinne der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise Proteinsyntheserate, Zellvolumen, Zellmorphologie, die zunehmende Syntheserate des Atrial Natriuretic Factors (ANF), die Regulation der Genexpression einiger fetaler Gene, beispielsweise myosin heavy chain β oder skeletal α-actin, die subzelluläre Translokation von Proteinen, beispielsweise DCMAG-1 und/oder die Aktivierung und/oder Deaktivierung von Signaltransduktionsmolekülen, beispielsweise PKCβ, PKB/AKT, Erk und/oder p38.
  • Unter einem heterologen Markerprotein im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Protein zu verstehen, welches nicht Herzmuskel-spezifisch ist, insbesondere nicht im Herzmuskelgewebe vorkommt, beispielsweise das Green Fluorescence Protein (GFP) (Prasher et al., (1992), Gene 111: 229-33), GFP-Mutanten (Heim et al., (1994) PNAS 91: 12501-12504; Zernicka-Goeta et al. (1997) Development 124: 1133-1137), blue-, cyano-, yellow fluorescent proteins (BFP, CFP, YFP) (Mitra RD et al., (1996), Gene 173: 13-7).
  • Vorzugsweise liegt das Markerprotein nicht als Fusion mit einem anderen Protein oder Proteinfragment, insbesondere einem zellulären oder Herzmuskelspezifischem Protein oder Proteinfragment, vor.
  • Die Untersuchung von Herzmuskelzellen wird vorzugsweise auf Einzelebene durchgeführt. Der Begriff Einzelebene im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet beispielsweise die mikroskopische Untersuchung einzelner Herzmuskelzellen in Bezug auf spezifische Eigenschaften, beispielsweise morphologische Merkmale in ihrer Größe oder Form. Bevorzugt ist ein Nachweis von Signalmolekülen, insbesondere Proteinen, auf Einzelebene durch mikroskopische Untersuchungen mit Hilfe von Immunfluoreszenz. Insbesondere sind Methoden wie "fluorescence resonance energy transfer" (FRET), "fluorescence lifetime imaging microscopy" (FLIM) oder FRET-FLIM-kombinierte Methoden (Harpur A. G. et al., (2001) Nat. Biotechnol. 19(2): 167293-303; Gordon G. W. et al., (1998) Biophys J 74(5): 2702-13; Periasamy A., Day R. N., (1999) Methods Cell Biol. 58: 293-314) anwendbar. Bei diesen Methoden werden Signalmoleküle, insbesondere Proteine, durch Ko-Lokalisation mit bekannten fluoreszierenden Markerproteinen innerhalb ihrer zellulären Struktur nachgewiesen.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die Herzmuskelzelle im wesentlichen gleichzeitig durch mindestens ein, vorzugsweise zwei, insbesondere drei verschiedene Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine stimuliert, wobei die Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine insbesondere aus PE, ET-1, ISO und/oder LIF ausgewählt sind.
  • Stimulieren im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet eine Steigerung der Aktivität der Herzmuskelzellen, beispielsweise der Kontraktionskraft und/oder - frequenz durch Zugabe geeigneter Substanzen.
  • Unter dem Begriff Hormone werden im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere die Hormone Adrenalin, Noradrenalin einschließlich deren Derivate, Endothelin-1, Endothelin-2 und Endothelin-3 (ET-1, ET-2, ET-3), Angiotensin I und II, Insulin, IGF-I und Myotrophin verstanden.
  • Hormonanaloga im Sinne der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise Katecholamin-Derivate, wie beispielsweise Isoproterenol (ISO) und Phenylephrin (PE).
  • Zytokine im Sinne der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt Leukemia Inhibitory Factor (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), Interleukin-6 und Interleukin-11 (IL-6, IL-11), Oncostatin M und der Ciliary Neurotrophic Factor.
  • Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung mindestens einer herzaktiven Substanz, wobei in mindestens einer Herzmuskelzelle, die
    • a) eine Nukleinsäure kodierend für ein heterologes Markerprotein enthält, und
    • b) mindestens eine Prüfsubstanz enthält oder mit mindestens einer Prüfsubstanz in-Kontakt-gebracht wird,
    mindestens eine herzaktive Substanz durch Messung der Expressionsrate des heterologen Markerproteins nachweis- und/oder bestimmbar ist.
  • Ein geeignetes Testsystem zur Identifizierung von Substanzen basiert auf der Identifikation funktioneller Interaktionen mit dem "Two-Hybrid-System" (Fields und Sternglanz, (1994), TIGS 10, S. 286-292). Dieses Testsystem läßt sich weiterhin zum Screening von Substanzen verwenden, die eine Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einem funktionellen Interaktor inhibieren. Auf diesem Weg lassen sich neue herzaktive Substanzen schnell nachweisen und/oder identifizieren.
  • Eine herzaktive Substanz im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine biologisch aktive Substanz, die eine Wirkung auf das Herzmuskelgewebe, insbesondere auf mindestens eine Herzmuskelzelle, ausübt, wobei beispielsweise durch die Einwirkung auf die Herzmuskelzellen die Wirkung am Herzen positiv oder negativ inotrop, chronotrop und/oder dromotrop beeinflußt wird.
  • Der Begriff Prüfsubstanz im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet diejenigen Moleküle, Verbindungen und/oder Zusammensetzungen oder Stoffgemische, die mit der erfindungsgemäßen Herzmuskelzelle unter geeigneten Bedingungen in Wechselwirkung treten können, insbesondere niedermolekulare, organische oder anorganische Moleküle oder Verbindungen, vorzugsweise Moleküle oder Verbindungen mit einer relativen Molmasse bis ca. 1.000, insbesondere von ca. 500.
  • Prüfsubstanzen können weiterhin auch natürliche und synthetische Peptide, bevorzugt mit einer relativen Molmasse bis ca. 1.000, insbesondere bis ca. 500, sowie Proteine, insbesondere Proteine mit einer relativen Molmasse von größer als ca. 1.000, vorzugsweise größer als ca. 10.000, oder Komplexe, beispielsweise Fusionsproteine, sein.
  • Ferner fallen unter den Begriff Prüfsubstanz Nukleinsäuren, insbesondere ein Protein, ein Peptid, eine Antisense-RNA oder ein Ribozym kodierend, oder welche unabhängig von ihrer Transkription bzw. Translation eine Wirkung, beispielsweise als Antisense-RNA oder als Ribozym, entfalten.
  • Ebenfalls unter den Begriff Prüfsubstanz fallen Modifikationen dieser Substanzen, insbesondere Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Farnelsylierung, Hydroxylierung, Veresterung sowie Kinase-Inhibitoren, Phosphatase-Inhibitoren und deren Derivate.
  • Vorzugsweise hat die Prüfsubstanz in Abhängigkeit von der Formulierung, Darreichungsform, Dosis und/oder Indikation eine pharmazeutische oder toxische Wirkung.
  • In-Kontakt-bringen im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst die nach dem Stand der Technik üblichen Verfahren, die das Einführen von Substanzen in intakte Zellen erlauben, beispielsweise Inkubation bei Substanzen, die aktiv oder passiv durch die Zellmembran transportiert werden, Elektroporation, Infektion, Transfektion und/oder Transformation.
  • Eine Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für das heterologe Markerprotein kodiert, im allgemeinen eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA. Für die Expression des betreffenden Gens ist im allgemeinen eine doppelsträngige DNA bevorzugt.
  • Die für das heterologe Markerprotein kodierende Nukleinsäure wird in die Herzmuskelzelle bevorzugt durch Transfektion mittels viraler oder nicht-viraler Vektoren, beispielsweise rekombinanter Adenoviren oder Liposomen, besonders bevorzugt durch Infektion der Herzmuskelzelle mit einem rekombinanten Adenovirus, vorzugsweise mittels dem Fachmann geläufiger physikalisch-chemischer Verfahren, beispielsweise Elektroporation oder Kalziumphosphat-Transfektion eingebracht.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Herzmuskelzelle, insbesondere eine gesunde, kranke oder krankhaft veränderte Herzmuskelzelle, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure, kodierend für ein heterologes Markerprotein.
  • Bevorzugt stammen diese Herzmuskelzellen aus Herzgewebe von Säugetieren, insbesondere von Menschen, Kaninchen, Nagern, vorzugsweise Mäusen oder Ratten oder von Vögeln, insbesondere von Hühnern.
  • Unter dem Begriff gesunde Herzmuskelzelle im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine aus Herzgewebe isolierte Zelle zu verstehen, die klinisch unauffällig ist. Die Herzmuskelzellen wurden aus Biopsiematerial isoliert, deren Spender keine Anzeichen einer chronischen Herzinsuffizienz, einhergehend mit Hypertrophie der Herzmuskelzellen zeigte.
  • Demzufolge ist unter dem Begriff krankhafte Herzmuskelzelle im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Herzmuskelzelle zu verstehen, die aus Biopsiematerial eines herzkranken, beispielsweise insuffizienten Patienten isoliert wurde.
  • Unter dem Begriff krankhaft veränderte Herzmuskelzelle im Sinne der vorliegdenden Erfindung wird eine gemäß der Erfindung stimulierte Herzmuskelzelle verstanden, die histopathologisch das Erscheinungsbild einer solchen krankhaften Herzmuskelzelle besitzt. Erreicht werden kann das durch in vitro Stimulation der Herzmuskelzellen, die dadurch eine Verschiebung der Lokalisation bestimmter Signalmoleküle vom Zytoplasma in die Z-Bande des Sarkomers zeigen. Diese Verschiebung gleicht jener, die in Herzmuskelzellen erkennbar ist, die aus Herzen insuffizienter Patienten gewonnen wurden.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Herzmuskelzelle, wobei das Verfahren folgende Schritte enthält:
    • a) Bereitstellen oder Isolieren von mindestens einer Herzmuskelzelle;
    • b) Einbringen einer Nukleinsäure kodierend für mindestens ein heterologes Markerprotein.
  • Vorzugsweise enthält das Verfahren zur Herstellung einer Herzmuskelzelle den zusätzlichen Schritt:
    • a) Stimulieren der isolierten Herzmuskelzelle durch geeignete Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine, insbesondere durch PE, ET-1, ISO und/oder LIF,
    wobei Schritt (iii) nach Schritt (i) oder (ii) erfolgen kann.
  • Eine Isolation der Herzmuskelzellen erfolgt bevorzugt aus dem Herzgewebe von Menschen, Kanninchen, Nagern, vorzugsweise Mäusen oder Ratten oder von Vögeln, bevorzugt Hühner.
  • Die Stimmulation der Herzmuskelzellen erfolgt mit den oben beschriebenen Hormonen, Hormonanaloge und/oder Zytokinen. Bevorzugt können verschiedene Stimulanzien vermischt werden, wodurch eine absolut gleichzeitige Verabreichung erfolgt. Weiterhin bevorzugt können die Stimulanzien unmittelbar nacheinander verabreicht werden, wodurch eine im wesentlichen gleichzeitige Verabreichung erfolgt.
  • Bevorzugt ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Herzmuskelzelle zur Untersuchung von Herzmuskelzellen-Hyperthrophie, besonders bevorzugt zum Nachweis und/oder zur Identifizierung einer oder mehrerer herzaktiver Substanzen.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines herzaktiven Arzneimittels, enthaltend die folgenden Schritte:
    • a) Auffinden einer herzaktiven Substanz mittels des oben genannten Verfahrens zum Nachweis und/oder zur Identifizierung mindestens einer herzaktiven Substanz, und
    • b) Versetzen der herzaktiven Substanz mit mindestens einem Hilfs- und/oder Zusatzstoff.
  • Hilfs- und/oder Zusatzstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Stoffe, die beispielsweise der Stabilisierung oder Konservierung des Arzneimittels dienen, und die dem Fachmann allgemein bekannt sind. Beispiele für solche Hilfs- und/oder Zusatzstoffe sind physiologische Kochsalzlösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose, Ringer-Laktat, entmineralisiertes Wasser, Stabilisatoren, Antioxidantien, Komplexbildner, antimikrobielle Verbindungen, Proteinaseinhibitoren und/oder inerte Gase.
  • Die Figuren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
    • Figuren
  • Fig. 1 zeigt einen Fluoreszenz-Hypertrophie-Test stimulierter primärer Herzmuskelzellen aus neugeborenen Ratten
  • Fig. 2 zeigt eine morphometrische Untersuchungen stimulierter Herzmuskelzellen
  • Fig. 3 zeigt Immunoblot-Untersuchungen von Proteinlysaten aus stimulierten Herzmuskelzellen
    • Beispiele
  • Primäre Herzmuskelzellen von neugeborenen Ratten wurden isoliert und in Anwesenheit verschiedener Hypertrophie-induzierender Erreger kultiviert, wie in DE 199 62 154 beschrieben. Für die Expression des GFP's wurden die Zellen mit rekombinanten Adenoviren infiziert. Nach 2 Tagen wurde für jede Stimulation die Signalintensität mittels Fluoreszenz-Mikroskop in Verbindung mit einer Digitalkamera gemessen.
    • 1. Isolierung primärer Herzmuskelzellen von neugeborenen Ratten
  • Neugeborene Ratten (P2-P7) wurden durch Genickbruch getötet. Es wurden die Ventrikel der schlagenden Herzen entfernt und die Herzmuskelzellen nach dem Protokoll der "Neonatal Cardiomyocyte Isolation System" (Worthington Biochemicals Corporation, Ladewood, New Jersey) isoliert. Die Ventrikel wurden zweimal kurz mit eiskalter "Hank's ausgewogener Salzlösung ohne Kalium und Magnesium (CMF-HBBS)" gewaschen und mit einem Skalpell zu einem geeigneten Volumen von 1 Kubikmillimeter zerkleinert. Das Herzgewebe wurde über Nacht bei 10°C mit Trypsin verdaut. Am nächsten Morgen wurden ein Trypsin-Inhibitor und eine Kollagenase hinzugefügt. Nach Inkubation bei 37°C unter mäßigem Rühren für 45 Minuten wurden die Zellen durch Pipettieren verteilt. Die Lösung wurde weiterhin über ein 70 µm Netz (Cell Strainer) gereinigt und zweimal für 5 Minuten bei 60 × g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Plattenmedium resuspendiert und die Zellen wurden gezählt. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 2,5 × 105/cm2 auf Gelatine (Sigma, Deisenhofen) überzogenen Schalen ausgesät. Am nächsten Morgen wurden die Zellen zweimal mit DMEM gewaschen und ein Aufbewahrungsmedium hinzugefügt.
    Plattenmedium: DMEM/M-199(4/1); 10% Pferdeserum, 5% fötales Kälberserum; 1 mM Sodiumpyruvat; Antibiotika und Antimykotika
    Aufbewahrungsmedium: DMEM/M-199 (4/1); 1 mM Sodiumpyruvat
    • 2. Herstellung rekombinanter Adenoviren
  • Rekombinante Adenoviren wurden gemäß des vereinfachten Systems von He et al. (HE TC, Zhou S. da Costa LT, Yu J, Kinzler KW und Vogelstein B (1998): A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 2509-2514) hergestellt. Um ein rekombinantes Adenovirusgenom, welches GFP exprimiert, herzustellen, wurde der pAdTrack-Vektor mit dem pAdEasy-1-Plasmid mittels homologer Rekombination kombiniert. 5 µg des pAdTrack-Plasmids wurden mit dem Restriktionsenzym PmeI linearisiert und über ein Gel aufgetrennt. Ungefähr 100 ng des linearisierten Vektors wurden mit 100 ng des pAdEasy-I-Plasmids kombiniert und bi-destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 7 µl hinzugefügt. Diese Lösung wurde mit 20 µl elektrokompetenter Bakterien (BJ5183) kombiniert und in eine Elektroporations-Kuvette (2,0 mm) transferiert. Die Elektroporation wurde unter Verwendung des Bio-Rad Gene Pulser (2.500 V, 200 Ohm, 25 µFD). Danach wurden 500 µl LB-Medium hinzugefügt. Die Bakterienkultur wurde bei 37°C für 20 Minuten in einem Bakterium-Schüttler inkubiert und danach auf zwei LB-Agar-Platten (1/10, 9/10) mit 50 µg/ml Kanamycin ausplattiert. Nach Übernacht-Inkubation bei 37°C wurden 12 der kleinsten Kolonien gepickt und für mindestens 12 Stunden in 2 ml LB-Medium (50 µg Kanamycin) bei 37°C in einem Bakterium-Schüttler wachsen gelassen. Plasmid- DNA dieser Übernacht-Kulturen wurde durch basische Lyse aufgereinigt und mit dem Restriktionsenzym PacI verdaut. Einer der positiven Klone, der nach der Restriktion zwei Fragmente (30 kb und 3,0 oder 4,5 kb) aufwies, wurde mittels Elektroporation (2.500 V, 200 Ohm, 25 µFD) in den Bakterienstamm DH5α transformiert. Eine einzelne Kolonie wurde gepickt, in 500 ml LB- Medium (50 µg/ml Kanamycin) transferiert und für 12-16 Stunden in einem Bakterien-Schüttler wachsen gelassen. Plasmid-DNA wurde über eine Tip- 500-Säule (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Anleitung des Herstellers aufbereitet. 10 µg DNA wurden dann mit dem Restriktionsenzym PacI verdaut, mit Ethanol ausgefällt und in 40 µl H2O (Zellkultur-Qualitätsgrad) resuspendiert.
  • Die Virusverpackung wurde mittels Lipofektion in HEK 293-Zellen eingebracht. Am Tag vor der Transfektion wurden die Zellen in zwei T-25- Flakonen (2 × 106 Zellen/Flakon) in DMEM (10% fötales Kälberserum) ausgesät. Für jeden der Flakone wurden 20 µl des PacI-verdauten Adenovirusgenoms mit 20 µl Lipofektamin (GIBCO BRL) vermischt und in 500 µl Opti- Mem I-Medium für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Währenddessen wurden die Zellen zweimal mit 4 ml Serumfreien DMEM gewaschen. Danach wurden 2,5 ml OptiMem I in jeden der Flakone gefüllt und die DNA- Lipofektamin-Lösung hinzugefügt. Nach einer Inkubationszeit von 6 Stunden bei 37°C und 5% CO2 wurde das Medium durch DMEM (10% fötales Kälberserum) ersetzt. Die Virusverpackung wurde über GFP-Expression in den transfektierten Zellen kontrolliert. Je nach Effizienz der Virusverpackung wurden die Zellen nach 7-14 Tagen geerntet.
  • Um die Zellen zu ernten, wurden sie durch Pipettieren voneinander getrennt. Durch Zentrifugation bei 100 × g für 5 Minuten wurden die Zellen sedimentiert, das Pellet wurde in 1 ml (20 mM Tris pH 8,0, 2 mM Mg Cl2, 140 mM NaCl, 3 mM KCl) resuspendiert. Nach drei Gefrier-Schmelz-Zyklen in flüssigem Stickstoff und einem 37°C-Wasserbad wurde das Zellysat bei 150 × g zentrifugiert. Für die Amplifikation des rekombinanten Adenovirus wurden 80% des Überstandes verwendet. Der Rest wurde nach Zugabe von Glycerol bis zu einer Endkonzentration von 25% bei -80°C aufbewahrt.
  • Die erste Amplifikation wurde in einem T-25-Flakon mit HEK 293-Zellen einer Dichte von 70-80% durchgeführt. Die Zellen wurden geerntet und wie oben beschrieben lysiert. Der Virus-Titer wurde nach 2-4 weiteren Amplifikationsrunden in T-75-Flakonen bestimmt. Der Titer der infektiösen Partikel wurde durch Endpunktverdünnung mit HEK 293-Zellen nach der TCID 50- Methode (Nyberg-Hoffmann C., Shabram P., Li W., Giroux, D., Aguilar- Cordova, E. (1997) Sensitivity and reproducibility in adenoviral infectious titer determination, Nat. Med. 1997, 3(7): 808-11) bestimmt.
    • 3. Stimulation der isolierten Herzmuskelzellen aus neugeborenen Ratten
  • Die Stimulation der primären Herzmuskelzellen aus neugeborenen Ratten (pCMs) wurde 2-6 Stunden nach Zufügen des Aufbewahrungsmedium gestartet. Direkt nach der Stimulation wurden die pCMs mit rekombinanten Adenoviren (s. Beispiel 2) bei einem MOI von 5 infiziert. Die Zellen wurden für 48 Stunden in feuchter Atmosphäre bei 37°C und 5% CO2 inkubiert, nachfolgend wurde die Fluoreszenzintensität gemessen.
    • 4. Fluoreszenzuntersuchung von GFP-exprimierenden Herzmuskelzellen
  • Eine Bestimmung der Fluoreszenzintensität von GFP-exprimierenden pCMs wurde 48 Stunden nach Stimulation und Infektion durchgeführt. Die Zellen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop (Axiovert 100S, Zeiss, Jena, Deutschland) untersucht, es wurden Bilder mit einer Digitalkamera (LAS- 1000, Fuji) aufgenommen und mit dem AIDA-Softwarepaket (Raytest) untersucht. Für jede Welle einer 6-Wellen-Platte, die ein einzelnes Stimulierungsexperiment repräsentiert, wurden 5 willkürlich ausgewählte Regionen mit einem 20x-Objektiv und einem GFP-Filterset (AF-Analysetechnik, Tübingen, Deutschland) untersucht. Anhand des maximalen Wertes vor Sättigung wurde eine entsprechende Belichtungszeit ausgewählt. Die fünf individuellen Werte wurden verwendet, um einen Hauptwert für jede Stimulierung zu berechnen. Nach Abzug von Hintergrundsignalen (Signale von uninfizierten Zellen) wurden die Hauptwerte von neun unabhängigen Experimenten berechnet und analysiert (Fig. 1). Der Vergleich der Fluoreszenzintensitäten von nichtstimulierten Zellen und PE- oder LIF-stimulierten Zellen zeigte einen klaren Anstieg für die beiden letztgenannten. Eine ET-1/PE-Stimulation führte zu ähnlichen Werten, während eine ET-1/ISO/LIF-stimulierte Zellen ein weiteres Anwachsen des GFP-Signals zeigten. Eine ET-1-Stimulation wiederum ergab eine Intensität, welche nur geringfügig über der der Hintergrundsignale lag.
    • 5. Morphometrische Untersuchung von stimulierten Herzmuskelzellen
  • Morphometrische Untersuchungen von Herzmuskelzellen wurden 48 Stunden nach Stimulation durchgeführt. Für jede Stimulation wurden 11 willkürlich ausgesuchte Zellen unter Verwendung der AIDA-Software (Raytest) untersucht. Nach Bestimmung der größten und der kleinsten senkrechten Extension der einzelnen Zellen wurde der Hauptwert für jede Stimulation berechnet und mit nichtstimulierten Zellen verglichen (Fig. 2). Eine PE-Stimulation führte zu einer Zunahme in der Hauptbreite der pCMs, während eine LIF- Stimulation in einer Verlängerung der pCMs resultierte. Eine ET-1/PE- Stimulation ergab ähnliche Ergebnisse wie die PE-Stimulation, während die Werte von ET-1-stimulierten Zellen nur geringfügig über denen der Hintergrundsignale lagen. Eine ET-1/ISO/LIF-Stimulation im Vergleich zu LIF- stimulierten Zellen führte im Gegensatz dazu zu einer geringfügigen Zunahme in Breite und Länge der pCMs.
  • 6. Immunoblot-Analysen von stimulierten Herzmuskelzellen
  • Primäre Herzmuskelzellen von neugeborenen Ratten mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen wurden pro Welle in einer 6-Wellen-Platte ausgesät und wie oben beschrieben kultiviert. Einen Tag nach ihrer Ausplattierung wurden sie zur Expression von Flag-CFP mit einem rekombinanten Adenovirus (MOI von 20) infiziert und für 48 Stunden stimuliert. Danach wurden die Zellen einmal in PBS gewaschen und in 100 µl 2x loading Farbstoff (50% Glycerol, 10% SDS, 500 mM DTT in Tris pH 6,8, Bromphenolblau) abgekratzt. Das Lysat wurde gevortext, um die DNA zu scheren, und dann 5 Minuten aufgekocht.
  • Die Proteine wurde durch 10% SDS PAGE getrennt. Die Anwesenheit des viral exprimiertem Flag-CFP-Konstruktes wurde mittels Western Blotting getestet. Danach wurde das Protein unter Verwendung von Standardmethoden auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit 1% BSA TBS-T geblockt. Dann wurde die Membran für 2 Stunden anti-FLAG-Antikörper (M2, Sigma) bei einer 1 : 1000-Verdünnung in 1% BSA inkubiert. Die Membran wurde viermal in TBS-T für jeweils 5 Minuten gewaschen und sodann mit anti-Maus-HRP bei einer Verdünnung von 1 : 10.000 (Amersham) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Membran wiederum viermal in TBS-T gewaschen und unter Verwendung von ECL-Plus-Reagenz (Amersham) gemäß Produktanleitung entwickelt. Die Signale wurden unter Verwendung einer Fuji LAS1000 Digitalkamera und der AIDA-Software detektiert und quantifiziert.
  • Die Immunoblot-Untersuchungen von Proteinextrakten, angefertigt von nichtstimulierten und von ET-1/ISO/LIF-stimulierten Herzmuskelzellen zeigten 48 Stunden nach Stimulierung eine deutliche Zunahme der Flag-YFP-Protein- Menge (Fig. 3). Da beide Proben von derselben Anzahl von Zellen erstellt wurden, muß diesem Anwachsen von Flag-YFP eine Zunahme der Proteinmenge pro Zelle entsprechen.
  • Zusammenfassend ist festzustellen, daß ein dichter Zusammenhang zwischen der Zunahme der Zellfläche als ein Maß für zunehmende Masse oder Hypertrophie (Fig. 1) und dem Level an GFP-Expression (Fig. 2 und 3) von stimulierten Herzmuskelzellen beobachtet wurde. Dies ist ein Parameter, der als Hauptanzeige für einen mittleren Durchsatz-Test zur Identifizierung von hypertrophischen Reizen einfach und auf automatisiertem Weg gemessen werden kann.

Claims (15)

1. Verfahren zur in vitro Untersuchung von Herzmuskelzellen-Hypertrophie, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Parameter für Herzmuskelzellen-Hypertrophie über die Expressionsrate eines heterologen Markerproteins in mindestens einer Herzmuskelzelle enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für das heterologe Markerprotein, messbar ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Herzmuskelzelle im wesentlichen gleichzeitig durch mindestens ein, vorzugsweise zwei, insbesondere drei verschiedene Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine stimuliert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine aus PE, ET-1, ISO und/oder LIF ausgewählt sind.
4. Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung mindestens einer herzaktiven Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer Herzmuskelzelle, die
a) eine Nukleinsäure kodierend für ein heterologes Markerprotein enthält, und
b) mindestens eine Prüfsubstanz enthält oder mit mindestens einer Prüfsubstanz in-Kontakt-gebracht wird,
mindestens eine herzaktive Substanz durch Messung der Expressionsrate des heterologen Markerproteins nachweis- und/oder bestimmbar ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Prüfsubstanz eine pharmazeutische Wirkung hat.
6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Prüfsubstanz eine toxische Wirkung hat.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die genannte Prüfsubstanz ein niedermolekulares, anorganisches oder organisches Molekül, ein Protein, ein natürliches oder synthetisches Peptid oder ein Komplex hiervon und/oder chemische Modifikationen von diesen, bevorzugt eine Nukleinsäure, welche für ein Protein, ein Peptid, eine Antisense-RNA oder ein Ribozym kodiert, oder welche unabhängig von ihrer Transkription bzw. Translation eine Wirkung, beispielsweise als Antisense-RNA oder als Ribozym entfaltet.
8. Herzmuskelzelle, insbesondere krankhafte oder krankhaft veränderte Herzmuskelzelle, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure kodierend für ein heterologes Markerprotein.
9. Herzmuskelzelle nach Anspruch 8, wobei das Herzgewebe von Säugetieren, insbesondere von Menschen, Kaninchen, Nagern, vorzugsweise Mäusen oder Ratten oder von Vögeln, insbesondere von Hühnern stammt.
10. Verfahren zur Herstellung einer Herzmuskelzelle nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte enthält:
a) Bereitstellen oder Isolieren von mindestens einer Herzmuskelzelle;
b) Einbringen einer Nukleinsäure kodierend für mindestens ein heterologes Markerprotein.
11. Verfahren nach Anspruch 10, enthaltend den zusätzlichen Schritt:
a) Stimulieren der isolierten Herzmuskelzelle durch geeignete Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine,
wobei Schritt (iii) nach Schritt (i) oder (ii) erfolgen kann.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine aus PE, ET-1, ISO und/oder LIF ausgewählt sind.
13. Verwendung einer Herzmuskelzelle nach einem der Ansprüche 8, oder 9 zur Untersuchung von Herzmuskelzellen-Hypertrophie.
14. Verwendung einer Herzmuskelzelle nach einem der Ansprüche 8, oder 9 zum Nachweis und/oder zur Identifizierung einer oder mehrerer herzaktiver Substanzen.
15. Verfahren zur Herstellung eines herzaktiven Arzneimittels enthaltend die folgenden Schritte:
a) Auffinden einer herzaktiven Substanz mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 4 bis 7, und
b) Versetzen der herzaktiven Substanz mit mindestens einem Hilfs- und/oder Zusatzstoff.
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