DE10029131A1

DE10029131A1 - Nukleinsäure codierend eine Bindungsstelle einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade für ein die Glykolyse katalysierendes Enzym

Info

Publication number: DE10029131A1
Application number: DE10029131A
Authority: DE
Inventors: Ulf R Rapp; Erich Eigenbrodt
Original assignee: Individual
Current assignee: RAPP, ULF R., PROF. DR.MED., 97078 WUERZBURG, DE S
Priority date: 2000-06-14
Filing date: 2000-06-14
Publication date: 2002-01-03
Also published as: US20040115631A1; AU7234301A; EP1290189A2; WO2001096535A3; WO2001096535A2

Abstract

Die Erfindung lehrt eine Nukleinsäure codierend für zumindest eine Teilsequenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade, wobei die Teilsequenz für eine Bindungsstelle für ein die Glykolyse katalysierendes Enzym codiert, oder stille Mutation einer solchen Nukleinsäure oder mit einer solchen Nukleinsäure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleinsäure.

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, welche Protein Kinasen der mitogenen Signalisierungskaskade codieren, Wechselwirkungen solcher Kinasen mit anderen Stoffen in einem Organismus, Screening Verfahren zur Identi fizierung der wechselwirkenden anderen Stoffe, und Substanzen zur Inhibierung der Wechselwirkungen in einem Organismus sowie mit solchen Substanzen herg estellte pharmazeutische Präparate.

Hintergrund der Erfindung

Die Rolle von c-raf-1 in der klassischen mitogenen MAP Kinase Kaskade ist recht gut untersucht. Weniger gut bekannt sind die Funktionen und Zusammenhänge der bei den anderen raf-Isoformen B-raf und A-raf. raf Pro toonkogene sind hoch konservierte Gene, welche Serin/Threonin-spezifische Kinasen des Zytoplasmas codieren. Diese Kinasen weisen Funktionen in der mito genen Signaltransduktion auf. Diese Kaskade überträgt Signale von Rezeptor Tyrosin-Kinasen über ras, raf, MEK und ERK zu Targets in dem Zytoplasma und im Kern zur Regulation der Proliferation und Differenzierung der Zellen. Im einzelnen wird hierzu lediglich beispielhaft auf U. R. Rapp in The Oncogene Handbook, T. Curran et al., Eds, Elsevier Science Publishers, Niederlande, 1988, Seiten 115-154, verwiesen. Während c-raf-1 im menschlichen Organismus praktisch ubiquitär ist, kommt A-raf natürlicherweise im wesen tlichen in Geweben des Urogenitaltraktes und B-raf überwiegend im Cerebrum und Testis vor. Für weiter führende Informationen und Literaturangaben hierzu wird im einzelnen auf das Dokument US-5,869,308 verwiesen.

Klassische biochemische Untersuchungen an Tumoren ha ben bereits vor längerer Zeit belegt, daß Tumore einem veränderten Metabolismus unterliegen. Wenn auch dieser veränderte Metabolismus nicht die fundamentale Ursache von Tumorerkrankungen ist, so hat er doch beachtlichen Einfluß auf das Verhalten eines dreidimensionalen Tu morgewebes. Typischerweise weist solches Tumorgewebe eine ausgeprägte Hypoxie, i. e. Mangel an Sauerstoff, auf aufgrund des in der Regel desorganisierten Wachstums von Blutgefäßen in dem Tumorgewebe. Dies macht deutlich, daß ein Anpassung an hypoxische Bedin gungen ein wesentlicher Schritt im Tumorwachstum ist. Der anaerobe Umsatz von Glukose zwecks Ener gieerzeugung durch Glykolyse ist daher ein gemeinsames Merkmal der meisten Tumorgewebeaggregate. Bezüglich allgemeiner weiterführender Literatur hierzu wird auf die Literaturstelle C. V. Dang et al., TIBS 24: 68-72, 1999, verwiesen. Pyruvatkinasen (PK) sind Schlüsselen zyme der Glykolyse und katalysieren die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat in Pyruvat, die letzte Reaktion der Reaktionsfolge der Umwandlung von Glukose in Pyruvat, und spielen folglich eine wichtige Rolle in der Bildung von ATP aus ADP. Vier gewebespezifische Iso formen sind bekannt, PK Typ L, R, M1 und M2 (siehe E. Eigenbrodt et al., Critical Reviews in Oncogenesis, Vol. 3, M. Perucho, Ed., CRC-Press, Boca Raton, Flor ida, Seiten 91-115, 1992). M2-PK ist die embryonale Form und ersetzt alle anderen Formen in proliferier enden Zellen und Tumorzellen (siehe G. E. J Staal et al., Biochemical and Molecular Aspects of Selected Cancers, T. G. Pretlow et al., Eds., Academic Press Inc., San Diego, 1, Seiten 313-337, 1991, sowie U. Brinck et al., Virchows Archiv 424, Seiten 177-185, 1994). M2-PK Protein der Ratte besteht aus 530 Ami nosäuren und unterscheidet sich nur in einem Rest von humanem M2-PK (siehe T. Noguchi et al., J. Biol. Chem., 261, Seiten 13807-13812, 1986, sowie K. Tani et al, Gene, 73, Seiten 509-516, 1988). M2-PK ist ein glykolytisches Emzym, welches in einer aktiven tetrameren und einer inaktiven dimeren Form vorliegt. Der Übergang zwischen beiden Formen reguliert letz tendlich den glykolytischen Umsatz in Tumorzellen (siehe W. Zwerschke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, Seiten 1291-1296, 1999, sowie S. Mazurek et al., J. Bioeneg. Biomembr., 29, Seiten 315 v- 330, 1997). Die Aktivität von M2-PK kontrolliert also den Transit des glykolytischen Pfades und bestimmt somit den relativen Anteil an Glukose, welche in den Synthe seprozeß gechannelt oder für glykolytische Ener gieerzeugung verwendet wird. Die Überexpression von M2-PK erlaubt Zellen das Überleben unter Bedingungen mit niedrigem Sauerstofflevel, da oxidative Phospho rylisierung für die Produktion von ATP durch PK nicht benötigt wird. Generell wird in bösartigen Tumoren und in dem Blut von Tumorpatienten eine erhöhte Menge an M2-PK gefunden.

Bekannt ist eine Bindung von A-raf an H-ras, MEK und CK2ß (siehe A. B. Vojtek et al., Cell, 74, Seiten 205- 214, 1993, und X. Wu et al., J. Biol. Chem., 271, Seiten 3265-3271, 1996, und B. Boldyreffet al., FEBS Lett., 403, Seiten 197-199, 1997, sowie C. Hagemann et al., FEBS Lett., 403, Seiten 200-202, 1997). Ebenso bekannt ist eine Bindung von B-raf und c-raf-1 an Mitglieder der 14-3-3 Familie (siehe B. Yamamori et al., J. Biol. Chem., 270, Seiten 11723- 11726, 1995, und C. Papin et al., Oncogene, 12, Seiten 2213-2221, 1996, und E. Freed et al., Science, 265, Seiten 1713-1716, 1994, sowie K. Irie et al, Sci ence, 265, Seiten 1716-1719, 1994). Es ist auch ver mutet worden, daß 14-3-3 Proteine ebenso an A-raf binden, da die Bindungsstellen in allen raf-Isoformen hoch konserviert sind (siehe G. Daum et al., Trends Biochem. Sci., 19, Seiten 474-480, 1994). Eine di rekte Bindung von A-raf oder anderen Elementen der mitogenen Signalisierungskaskade an Faktoren der me tabolischen Regulation ist dagegen unbekannt.

Technisches Problem

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, einen Ansatz zur Hemmung des anaeroben Stoffwechsels in Tumorzellenverbänden zu finden, und daran anschließend Wirkstoffe zu finden, die das Wachstum von Tumorzellverbänden zumindest verlangsamen bzw. Apoptose in solchen Tumorzellverbänden aufgrund von unzureichender Energieerzeugung in Tumorzellen fördern.

Der Erfindung zugrundeliegende Erkenntnis

Mittels eines Two-Hybrid Systems und unter Verwendung von A-raf als bait ("Köder") wurde eine PC12 cDNA- library gescreent. Unter anderem wurde dabei M2-PK als ein Bindungspartner für A-raf gefunden. Mit weiteren Experimenten wurde gefunden, daß die Kooperation zwischen A-raf und M2-PK zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen der dimeren und der tetrameren M2-PK Formen zu Gunsten der tetrameren, also aktiven Form, führt. Somit ist A-raf Teil des glykolytischen Enzym Komplexes. Transformation von NIH 3T3 Zellen durch A-raf führt zu einer Zunahme im phosphoserin Gehalt des M2-PK Proteins im Zusammenhang mit der Ver schiebung des genannten Gleichgewichts.

Es wurde damit zu ersten Mal demonstriert, daß ein Onkogen der mitogenen Signalisierungskaskade zudem auch direkt auf ein die (anaerobe) Glykolyse kata lysierendes Enzym wirkt, und zwar verstärkend und somit tumorwachstumsfördernd. Ein solcher Synergismus ist überraschend und es steht zu erwarten, daß durch Hemmer der Wechselwirkung gleich mehrere positive Ef fekte im Rahmen einer Tumortherapie erzielt werden können.

Zwar sind Wechselwirkungen von Oncoproteinen, aufweis end völlig andere physiologischen Mechanismen, mit M2-PK bekannt, so beispielsweise pp60^v-src Kinase oder HPV 16 Oncoprotein E7, welche zu einer Verschiebung des tetramer/dimer-Verhältnisses führen. Diese haben aber eine Verschiebung in Richtung auf Dimer und folglich reduzierender Aktivität zur Folge, im Gegen satz zu A-raf.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft zunächst eine Nukleinsäure cod ierend für zumindest eine Teilsequenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade, wobei die Teilsequenz für eine Bindungsstelle für ein die Glyk olyse katalysierendes Enzym codiert, oder stille Muta tion einer solchen Nukleinsäure oder mit einer solchen Nukleinsäure oder deren stillen Mutation hybridisier ende Nukleinsäure. Der Begriff der Nukleinsäure umfaßt insbesondere DNA, RNA und PNA. Ebenfalls subsumiert unter den Begriff sind doppelsträngige Nukleinsäuren sowie einzelsträngige Nukleinsäure und folglich auch zueinander komplementäre Nukleinsäuren. Stille Muta tionen meint Varianten in der Sequenz, die zu keinem funktionalen Unterschied, bezogen auf die Bindungsstelle für ein die Glykolyse katalysierendes Enzym, der Variante gegenüber der natürlichen, nicht mutierten Sequenz führen. Stille Mutationen können Allele oder künstliche Mutationen sein. Derivate fallen ebenfalls unter die Erfindung. Derivate sind nicht-natürliche chemische Modifikationen.

Mittels solchen Nukleinsäuren kann beispielsweise nach Kooperationspartnern der Protein Kinase der mitogenen Singnalisierungskaskade im Bereich der die Glykolyse katalysierenden Enzyme gesucht werden. Gleichfalls kann nach Inhibitoren für den Bindungsstellen gesucht werden. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren sind daher letztendlich insbesondere als Sreening Tool brauchbar.

Bevorzugt ist eine Nukleinsäure codierend für ein Pro tein oder Peptid enthaltend die Sequenz A-raf (587-606) oder stille Mutation einer solchen Nuklein säure oder mit einer solchen Nukleinsäure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleinsäure. Bevor zugterweise handelt es sich im Rahmen der Erfindung um human A-raf. Zu Forschungszwecken kann es sich aber auch um A-raf von nicht menschlichen Säugetieren han deln. Die Sequenz 587-606, insbesondere 602-603, wurde als Bereich identifiziert, wo die Bindungsstelle für die Glykolyse katalysierenden Enzyme liegt. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann gegenüber der vol len Sequenz von A-raf verkürzt sein, und zwar insbe sondere am N-terminalen Ende. Sie codiert dann für ein Protein oder Peptid bestehend aus der Sequenz A-raf (255 bis 587-606) oder stille Mutation einer solchen Nukleinsäure oder mit einer solchen Nukleinsäure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleinsäure. Mit anderen Worten ausgedrückt, die Sequenz kann in dem Bereich liegen, der begrenzt wird durch die Se quenzen (255-606) und (587-606).

Weiterhin lehrt die Erfindung eine cDNA des vorste henden Aufbaus sowie einen isolierten rekombinanten Vektor enthaltend eine Nukleinsäure des vorstehenden Aufbaus bzw. ein Expressionsplasmid mit dieser Nuk leinsäure. Hierbei kann zwecks stabiler Expression ein für ein geeignetes virales Protein codierendes DNA Fragment, beispielsweise gag, mit eingesetzt sein (Fu sion gag mit beispielsweise A-raf bzw. A-raf Fragment). Mittels des Expressionsplasmids läßt sich eine Transformante bilden, welche wiederum zur Her stellung des durch die Nukleinsäure codierten Proteins bzw. Peptids verwendet werden kann. Hierzu wird die Transformante nach üblichen Methoden auf geeignete Weise kultiviert.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine antisense Nukleinsäure oder Ribozym bindend an eine beispiel sweise oncogene Nukleinsäure, insbesondere RNA, cod ierend für eine Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade. Mittels einer solchen Substanz kann die Expression von A-raf unterdrückt werden mit der Folge einer Hemmung der (anaeroben) Glykolyse in dem Tumorgewebe. Prinzipiell gleiches kann erreicht werden mit einer Substanz mit einer Bindungsstelle für ein durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure codiertes Protein oder Peptid, ausgewählt aus der Gruppe beste hend aus a) deaktivierte, die Glykolyse katalysierende Enzme, b) inaktive Proteine oder Peptide und c) Aptamere.

Dies kann insbesondere eine Kinase-inaktiven Form von M2-PK sein, vorzugsweise von human M2-PK. In diesem Fall kann die Kinase-inaktive Form durch eine Mutation im Bereich der ADP-Bindungsstelle und/oder der ATP- Bindungsstelle, gebildet sein, insbesondere ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "M2-PK K366M, R119C, T340M, Q377K, K161M, K165M und mehrere dieser Muta tionen". Der Ausdruck der Kinase-inaktiven Form umfaßt auch in der Kinase Aktivität gegenüber normaler M2-PK lediglich reduzierte Formen. Inaktive Mutanten eignen sich generell deshalb zur Auslösung von Apoptose der Tumorzellen, weil damit ein Abfall der ATP- und ADP- Spiegel erreicht wird. Als natürliche Mutante kommt auch M1-PK in Frage. M1-PK wird in allen nicht prolif erierenden Zellen exprimiert. In M2-PK exprimierenden Zellen trit bei zusätzlicher Expression von M1-PK durch konkurriernde Reaktionen eine Hemmung der Zell proliferation ein. M1-PK und M2-PK sind unterschiedli che Splicing-Produkte, wobei nur ein Exon mit 51 Aminosäuren ausgetauscht ist. M1-PK und M2-PK unter scheiden sich in insgesamt nur 21 Aminosäuren. M1-PK wird nicht phosphoryliert. Hiermit können durch Se quenzvergleich mit M2-PK Phosphorylierungsstellen ab geleitet werden. Im Ergebnis werden jedenfalls nicht phosphorylierbare M2-PK-Mutanten als tumorsupprimerend und proliferationshemmend wirken. Solche Mutanten er geben sich unmttelbar aus dem folgenden Sequenzver gleich, in welchem potentielle Phosphorylierungs stellen angegeben sind. Folglich sind insbesondere solche M2-PK Mutanten einsetzbar, welche zumindest an zumindest einer der markierten Stellen entsprechend dem Sequenzvergleich mutiert ist. Alternativ oder zusätzlich können an Stellen anderer Abweichungen in dem Sequenzvergleich eine oder mehrere Mutationen (in beliebigen Permutationen) eingerichtet sein.

Im Falle der Aptamere empfiehlt es sich, diese gegen nukleinsäurespaltende Enzyme zu stabilisieren. Im Falle der Proteine bzw. Peptide handelt es sich um für die Bindungsstelle des durch die erfindungsgemäße Nuk leinsäure codierten Proteins bzw. Peptids "geschneiderte" hochspezifische synthethische Moleküle.

Wegen der die Glykolyse hemmenden Wirkung der vorste henden Substanzen ist Teil der Erfindung auch deren Verwendung zur Blockierung der Kooperation bzw. Bindung zwischen einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade und einem die Glykolyse kata lysierenden Enzym, insbesondere der A-raf/M2-PK Koop eration, sowie deren Verwendung zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung von Krebser krankungen, beispielsweise des Urogenitaltraktes. Mit einer solchen Blockierung wird vermutlich gleichzeitig die mitogene Signalisierungskaskade blockiert und somit ein synergistischer Effekt erzielt.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines hier durch kodierten Proteins oder Peptids in einem screen ing Verfahren zur Ermittelung eines mit einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskette kooperier enden, die Glykolyse katalysierenden Enzyms, sowie die Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines hierdurch kodierten Proteins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung einer an einer Protein Kinase der mitogenen Signalis ierungskette bindenden, jedoch nicht, die Glykolyse katalysierenden Stoffes. In der erstgenannten Ver wendung können weitere Bindungspartner in gesundem oder krankem Gewebe gefunden werden. In der letztgenannten Verwendung können Inhibitoren der nor malerweise in gesundem oder krankem Gewebe stattfin denden Bindungsprozesse gefunden werden.

Die Erläuterungen für eine Anspruchskategorie der Er findung gelten entsprechend für andere Anspruchskate gorien. Die Erfindung betrifft letztendlich auch Heilverfahren, beispielsweise klassisch durch geeignete Verabreichung von pharmazeutischen Präparaten aber auch gentherapeutisch, mittels welcher eine oder mehrere Substanzen gemäß der Ansprüche 6 bis 9 in eine Zielzelle eingebracht oder in der Zielzelle erzeugt werden.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausführungsbeispiele darstellenden Figuren und Experi menten näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1: spezifische Wechselwirkung von A-raf und M2-PK in einem Two-Hybrid binding assay,

Fig. 2: Isoelektrische Fokussierung von M2-PK in Kon trollzellen und in A-raf transformierten NIH 3T3 Zellen,

Fig. 3: Isoelektrische Fokussierung des glycolytischen Enzym Komplexes in A-raf transformierten NIH 3T3 Zellen,

Fig. 4: Inhibierung der Transformation von NIH 3T3 Zellen mittels Kinase inaktivem M2-PK K336A.

Beil. 1: DNA Sequenz von Ratten M1-PK und M2-PK,

Beil. 2: DNA Sequenz von human v-raf,

1: Methoden 1.1: Plasmid Konstruktion

Die Two-Hybrid Vektoren pPC86 und pPC97 wurden von D. Nathans zur Verfügung gestellt (siehe auch: P. M. Chevrey & D. Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, Seiten 5789-5793, 1992). Vollängen A-raf, B-raf und c-raf-1 cDNA wurden in Fusion mit der Gal4 DNA Bindungsdomäne in pPC97 subkloniert. Die PC12 cDNA library wurde in Fusion mit der Gal4 Aktivierungs domäne in pPC97 subkloniert. Die Klonierung der A-raf Deletionskonstrukte ist in C. Hagemann et al., FEBS Lett., 403, Seiten 200-202, 1997, ausführlich beschrieben worden. A-raf (554-606) wurde unter Ver wendung der Primer 5'-CTC AAG TTG TCG ACG GAG GAG CGG CCC CTC TTC-3' (upstream, unter Einführung einer SalL site) und 5'-GTG GCT TGG CGG CCG CCT AAG GCA CAA G-3' (downstream, unter Einführung einer NotI site).

Das HA-tag und das untranslatierte 5' Ende des "gean gelten" M2-PK (Klon 71) wurden dadurch entfernt, daß ein neues SalI site mittels des site-gerichteten Mutagenesis Kits von Stratagene erzeugt wurde, und daß die resultierende pPC86-M2-PK mit SalI verdaut wurde und Plasmid-Religation. Dies resultierte im Plasmid pPC86-PK. Für die Expression in E. coli und in Säuget ierzellen wurde M2-PK cDNA als EcoRI Fragment aus pPC86 (Klon 71) isoliert, zu pGEX-2T ligiert sowie pcDNA3 verdaut mit EcoRI. Die untranslatierte Region wurde durch Einführung einer BamHI site (Mutagenesis Kit Stratagene) und Entfernung des BamHI Fragments aus diesem Konstrukt entfernt. Das 3' Ende der codierenden Region der M2-PK cDNA wurde mittels PCR aus der PC12 library isoliert unter Verwendung der Primer 5'-GCC CGG TAC CGC CCA AGG GCT C-3' (sense) und 5'-CCA GGG CTG GGA ATT CTC TGG-3' (antisense). Vollängen M2-PK wurde durch Subklonierung des PCR Produkts KpnI/EcoRI in pGEX-M2-PKΔBam und pcDNA-M2-PKΔBam, respektive, erzeugt, resultierend in Plasmiden pGEX-M2-PK und pcDNA3-M2-PK.

pPC97-A-raf AA602/603RP, pcDNA3-M2-PK K366M und pGEX-2T-M2-PK K366M wurden mittels des Mutagenesis Kits von Stratagene hergestellt.

1.2: Two-Hybrid library screening

Hefekulturen wurden bei 30°C unter Standardbedingungen in flüssigem oder festem Medium basierend auf entweder YPD oder minimal SD Medium gezogen.

Die Hefe Linie HF7c wurde sequenziell transformiert mit zunächst dem "Köder"-Plasmid und dann der cDNA library. Transformanten wurden gezogen auf SD Medium unter Fehlen der Aminosäuren Leucin, Tryptophan und Histidin. Nach 4 Tagen wurden die wachsenden Klone auf Aktivierung des lacZ reporter Gens in einem β-Gal Fil terassay getestet. Positive Klone wurden weiter unter sucht durch Retransformierung des isolierten library-Plasmids zusammen mit verschiedenen "Köder"- Plasmiden in HF7c. Klone, welche nur in der Gegenwart von rafeinen β-Gal positiven Phenotyp zeigten, wurden als positiv bewertet und weiter untersucht durch Se quenzierung und Kolonie-Hybridisierung. Für direkte Wechselwirkungstests wurde die Hefelinie HF7c mit A raf Deletionskonstrukten und pPC86-M2-PKΔSal cotransformiert.

Allgemeine Informationen zum Two-Hybrid Vektorsystem bzw. Varianten hierzu könen der Literaturstelle Bio spektrum, 3/95, S. 12-14, sowie der dort genannten Literatur entnommen werden.

1.3: Zellkulturen

Die NIH 3T3 Zellen wurden unter Standardbedingungen (37°C, 5% CO₂) in DMEM (Life Technologies, Inc.), sup plementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fetal bovine serum (Hyclone), 168 mM L-Glutamin (Life Technologies, Inc.) und 100 units/ml Streptomycin und Penicillin (Life Technologies, Inc.) gezogen.

1.4: Focus Formierung und colony yield assay

7 × 10⁴ NIH 3T3 Zellen und 1,5 × 10⁵ NIH 6A-leuk Zel len (stabil gag-A-raf exprimierend, siehe M. Huleihel, Mol. Cell. Biol., 6, Seiten 2655-2662, 1986) wurden in 90 mm Gewebekultur Schalen einen Tag vor der Trans fektion gesäht. Die Transfektionen wurden mittels der Lipofectamin Methode (Life Technologies, Inc.) und entsprechend der Herstelleranweisungen ausgeführt. Focus Formierung wurde 10 Tage später gescored. Trans fizierte Kulturen wurden zwecks besserer Visualis ierung der transformierten Foci mittels 0,4% Kristallviolett gefärbt. Für das colony yield assay wurden Zellen wie oben beschrieben gesäht und für 10 Tage in selektivem Medium enthaltend 450 µg/ml G418 (Geneticin; GIBCO BRL; siehe auch U. R. Rapp, Oncogene, 9, Seiten 3493-3498, 1994) kultiviert.

1.5: Isoelektrische Fokussierung glykolytischer Enzyme

Kontrollzellen NIH 3T3 und A-raf transformierte NIH 3T3 Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von 3,5 × 10⁶ Zellen/Schale kultiviert. Für jedes Fokussierungs experiment wurden 26 × 10⁶ Zellen in 3 ml Lysispuffer mit einer niedrigen Salzkonzentration (10 mM Tris, 1 mM NaF, 1 mM EDTA-Na₂ und 1 mM Mercaptoethanol, pH 7,4) extrahiert zwecks Erhalt des glykolytischen Enzym Kom plexes und dann für 20 min. bei 40.000 g zentrifugiert zur Entfernung von Zellfeststoffen. Homogenate wurden der isoelektrischen Fokussierung unterworfen und Enzym Aktivitäten wurden, wie vorbeschrieben (siehe S. Mazurek, J. Cell. Physiol., 167, Seiten 238-250, 1996), in individuellen Fraktionen bestimmt.

1.6: Gelfiltration-Analyse von M2-PK

Extrakte von Kontrollzellen NIH 3T3 und stabil gag-A- raf exprimierenden NIH 3T36A Zellen wurden wie in W. Zwerschke, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, Seiten 1291 -1296, 1999, beschrieben hergestellt.

1.7: Immunologische Detektion von M2-PK, A-raf, c-raf, MEK1, Phosphoserin und Phosphothreonin

Die individuellen Fraktionen der Fokussierungsexperi mente oder Gelfiltrationsexperimente wurden 1 : 10 mit sample Puffer verdünnt. Nach Trennung auf einem 10% SDS Polyacrylamid Gel wurden die Proteine auf eine Nitrocellulose Membran mittels Electroblotting tran ferriert. Zur Detektion der verschiedenen Antigene wurden die folgenden Antikörper benutzt: M2-PK: monok lonale Antikörper DF4 (ScheBo Tech, Giessen, Deutschland); A-raf: polyklonale Antikörper, welche gegen 12 C-terminale Reste von A-raf representierende synthetische Peptide gezogen wurden (siehe C. Hagemann et al., FEBS Lett. 403, Seiten 200-202, 1997); gag- A-raf: Ziegenserum erzeugt gegen p30^gag (siehe M. Huleihel, Mol. Cell. Biol., 6, Seiten 2655-2662, 1986); c-raf: monoklonale Antikörper (Dianova, Ham burg, Deutschland; MEK und ERK: monoklonale Antikörper (Transduction Laboratories); p-Serin, p-Threonin und p-Tyrosin: monoklonale biotinylierte Antikörper (Sigma, Deisenhofen, Deutschland).

1.8: Bestimmung der Metabolitkonzentrationen

Fructose 1,6-bisphosphat, Pyruvat und Phosphoenolpyru vat Konzentrationen wurden in Perchlorsäure-Extraten der Zellen bestimmt, wie in S. Mazurek et al., J. Biol. Chem. 272, Seiten 4941-4952, 1997, beschrie ben. Gemäß dieser Literaturstelle wurden auch die Konzentrationen von Glucose, Glutamin, Glutamat und Lactat in den Zellüberständen bestimmt zwecks Bestim mung der Flußraten.

2. Identifizierung Charakterisierung der Wechsel wirkung A-raf mit M2-PK mittels des Two Hybrid binding assay

Mittels des Two-Hybrid Systems wurden 3,3 × 10⁷ Klone einer Ratten Pheochromocytoma PC12 cDNA library unter Verwendung von A-raf als "Köder" gescreent. 73 Klone zeigten einen Histidin und LacZ positiven Phenotypus. Diese Klone wurden weiter untersucht durch colony hybridization und Sequenzierung. Sie codieren H-ras (1 Klon), MEK-2 (3 Klone), 14-3-3β (5 Klone), 14-3-3ζ (15 Klone), 14-3-3ε/η (11 Klone), 14-3-3θ (7 Klone), CK2ß (26 Klone) und M2-PK (1 Klon). Vier verbleibende Klone sind noch zu untersuchen. Mit Ausnahme von M2-PK sind die vorstehenden Wechselwirkungen bekannt und dienen insofern als Beleg für die Funktionsfähigkeit des ver wendeten Systems (Expression und Faltung). Die erstmalig festgestellte Wechselwirkung von A-raf mit einem die Glykolyse katalysierenden Enzym, nämlich M2-PK, bildet die Grundlage der Erfindung.

Der isolierte Klon representiert eine Teilsequenz, welche einen Teil der untranslatierten Region vor dem N-Terminus enthält und dem 29 Aminosäuren am C. Terminus fehlen (M2-PK (1-501)).

Bei Versuchen mit c-raf-1 und B-raf als "Köder" waren keine M2-PK Klone isolierbar, was eine A-raf isozym spezifische Wechselwirkung belegt. Mittels deletion mapping konnte gezeigt werden, daß die Wechselwirkung innerhalb einer sehr C-terminalen Domäne von A-raf erfolgt, da Wechselwirkung von M2-PK mit A-raf (255- 606) und A-raf (554-606) festgestellt werden konnte, nicht jedoch mit A-raf (255-587). Hierzu wird im Einzelnen auf die Fig. 1a verwiesen. Die fest gestellte wechselwirkende variable Region ist nicht konserviert zwischen verschiedenen raf-Isoformen der Säugetiere, was in Übereinstimmung mit der beo bachteten isozymspezifischen Bindung von M2-PK in den Two Hybrid Tests ist und auch eine Erklärung hierfür bieten könnte. Um die Exakte Bindungsdomäne zu bestim men wurde der Mutant A-raf AA602/603RP generiert, in welchem die vermuteten Bindungstellen durch die ent sprechenden c-raf-1 Aminosäuren ausgetauscht wurden, und dann einem direkten Two Hybrid Test unterworfen. In der Fig. 1b erkennt man, daß mit dieser Mutation jegliche Wechselwirkung verschwunden war, was belegt, daß die A-raf spezifischen Bindungsstellen verantwortlich sind für die Spezifität der Wechsel wirkung mit M2-PK.

3: Untersuchung des Effekts der Wechselwirkung A-raf mit M2-PK auf die metabolische Regulation

Der Übergang der inaktiven dimeren in die aktive te tramere Form von M2-PK bestimmt den glykolytischen Fluß in Tumorzellen. Zwecks Untersuchung eines even tuellen Effekts der Wechselwirkung A-raf mit M2-PK hierauf in vivo wurden isoelektrische Fokussierungsex perimente durchgeführt. Zwei Peaks konnten getrennt werden für die tetramere Form (Fraktionen 35-42) und die dimere Form (Fraktionen 43-47), wie in der Fig. 2 ersichtlich. Im Gegensatz zur dimeren Form hat die 1 tetramere Form eine hohe Affinität zu seinem Substrat Phosphoenolpyruvat (PEP). In Übereinstimmung mit den differentiellen Substrataffinitäten wurde gefunden, daß die tetramere Form gleich aktiv ist bei hohen (2 mM) und niedrigen (0,2 mM) PEP Konzentrationen, 1 während die dimere Form weniger aktiv ist bei niedri gen Konzentrationen (Fig. 2).

In der Fig. 2 sieht man im einzelnen die Bestimmung der M2-PK Aktivität in der Gegenwart von 2 mM und 0,2 mM PEP in den verschiedenen Fraktionen (oberer Teil) sowie die Bestimmung von M2-PK, p-Serin und p-Threonin durch direktes Immunoblotting nach SDS Gelelektropho rese der verschiedenen Fraktionen.

Transformation von NIH 3T3 Zellen durch stabile Ex pression einer Fusion zwischen der A-raf-Kinase Domäne mit viralem gag-Protein (gag-A-raf; siehe M: Huleihel et al., Mol. Cell. Biol., 6, Seiten 2655-2662, 1986) führte zu selektivem Anstieg der tetrameren Form (Menge der Tetrameren in Kontrollzellen: 69%; nach A-raf Transformation: 76%), wozu auf die Fig. 2 ver wiesen wird.

Die Fig. 3 zeigt im oberen Teil die Bestimmung der Aktivitäten von Pyruvat Kinase (Kreise) und Phospho glyceromutase in den verschiedenen Fraktionen. pI Werte für einige Fraktionen sind als Bezug angegeben. Im unteren Teil ist die Detektion von A-raf, gag-A- raf, M2-PK und MEK 1 durch direktes Immunoblotting nach SDS Gelelektrophorese der verschiedenen Frak tionen. Man entnimmt zunächst, daß die tetramere Form von M2-PK mit Enolase, Glyceraldehyd 3-phosphatde hydrogenase (nicht gezeigt) und einem Teil von Phos phoglyceromutase Typ B cofokussiert. A-raf und c-raf fukussieren in dem glykolytischen Enzym Komplex in Fraktionen 35-37 und gag-A-raf in Fraktionen 40- 44. Eine proteolytisch modifizierte Form von gag-A-raf mit einem Molekulargewicht zwischen 45 und 50 kDa fokussierte in den Fraktionen 39-42 (nicht dargestellt). MEK 1 und MEK 2, die Substrate der raf Kinasen fokussierten beide in den gleichen Fraktionen 34-45 des glykolytischen Enzym Komplexes. Der Großteil von ERK 1 und ERK 2, die Substrate von MEK, fokussierten außerhalb des glykolytischen Enzym Kom plexes in den Fraktionen 32-35 (nicht gezeigt).

M2-PK, A-raf, gag-A-raf, c-raf, MEK und ERK wurden mit 1 den unter Methoden angegebenen Antikörpern detektiert.

Die immunologisch detektierbare Menge von M2-PK Pro tein und die Mengen von Phosphoserin und Phosphothreonin an dem M2-PK Protein wurden densi trometrisch mittels des Scion Image Programms (Beta 3B-Version, Scion Corporation) bestimmt. Im Vergleich zu Kontrollzellen nahm der Gesamtgehalt an M2-PK Pro tein 1,3-fach in A-raf transformierten Zellen zu, während der Phosphoserin Gehalt des M2-PK Proteins 2,6-fach und jener des Phosphothreonin 1,2-fach zu nahm. Das Verhältnis zwischen Phosphoserin und M2-PK Protein nahm von 0,7 in Kontrollzellen auf 1,3 in A- raf transformierten Zellen zu. Das Verhältnis für Phosphothreonin war dagegen unverändert. Der höchste Phosphorylisierungsgrad wurde in den Fraktionen 35- 38 gefunden, in welchen auch A-raf und c-raf lagen. Hieraus folgt, daß A-raf Transformation selektiv den Phosphoserin Gehlat des M2-PK Proteins erhöht. Der gleiche Anstieg im Phosphorylisierungsgrad und Gehalt an M2-PK Protein wurde auch in andern Tumor Zellinien, wie pp60^v-src transformierten NIH 3T3 Zellen und Glioma Zellinien, gefunden.

In einem weiteren Experiment wurde der glykolytische Komplex durch Extraktionen der Zellen mit hohen Phos phatkonzentrationen und wurde das Verhältnis zwischen der tetrameren und der dimeren Form von M2-PK direkt mittels Gelpermeation bestimmt. In Übereinstimmung mit den Daten der isoelektrischen Fokussierung zeigte die Gelpermeation auch eine Verschiebung der dimeren Form zur tetrameren Form in A-raf transformierten Zellen (tetramere Form in Kontrollzellen: 77%; in A-raf transformierten Zellen: 87%). In A-raf transformierten Zellen war die Intensität der Phosphoserin-Färbung von tetramerem M2-PK stärker als in Kontrollzellen.

In völliger Übereinstimmung mit den Veränderungen der M2-PK Aktivität wurde gefunden, daß A-raf Transforma tion die glycolytische Flußrate erhöht (siehe Tab. 1). Gleichzeitig wurde eine Abnahme der Fructose 1,6-bisphosphat Niveaus von 63,8 ± 13,1 (4) nmol/mg Protein in Kontrollzellen auf 39,5 ± 13,6 (5) nmol/mg Protein (x ± SD, p < 0,050) gefunden. Pyruvat Niveaus nahmen von 6,9 ± 0,9 (4) nmol/mg Protein in Kontroll zellen auf 9,3 ± 2,7 (5) nmol/mg Protein in A-raf transformierten Zellen zu (x ± SD, p < 0,054) Phosphoe nolpyruvat Konzentrationen wurden nicht signifikant geändert.

Ob die metabolischen Änderungen essentiell für die Transformation und Proliferation der Zellen war, wurde in Überexpressionsexperimenten untersucht. NIH 3T3 Zellen wurden mit gag-A-raf und M2-PK cDNA trans fiziert und die Fokusbildung nach 10 Tagen Kul tivierung untersucht (Tabelle 2). Während A-raf Transfektion nur zur Bildung von 2 Foci je 1 µg trans fizierter DNA führte, ergab die Cotransfektion eine Zunahme der Anzahl auf 6 Foci je 1 µg DNA, was für einen kooperativen Effekt von A-raf und M2-PK in der Zelltransformation spricht. Um zu prüfen, ob eine ho cheffiziente Transformation durch A-raf M2-PK erfor dert, wurde eine Kinase-inaktive Form von M2-PK, M2-PK K366M, mutiert an der vermuteten ADP Bindungsstelle, eingesetzt, in der Hoffnung damit einen inhibierenden Mutanten zu erhalten, welcher die A-raf M2-PK Koopera tion bzw. Bindung hemmt. Dieser Mutant hat tatsächlich die Eigenschaft die Focusformation in NIH 3T3 Zellen vollständig zu unterdrücken. In einem colony yield assay ergab sich, daß der M2-PK K366M Mutant die Bildung von Kolonien stabil A-raf exprimierender NIH 6A-leuk Zellen reduziert, so daß unter G418 Selektion nur 18 Kolonien je 1 µg transfizierter DNA wuchsen; während wildtype M2-PK Expression im Wachstum von 75 Kolonien je 1 µg DNA resultierte (Tabelle 1). Weiter hin war Wachstum unter wildtype M2-PK in der Lage die transformierte Morphologie von NIH 3T3 Zellen zu fördern, während M2-PK K366M dies nicht zeigt, sondern faktisch die morphologische Transformation durch A-raf antagonisierte. Die Zellen zeigten nämlich einen eher flachen, weniger refraktilen Phenotypus, wie in der Fig. 4 zu erkennen (Leervektor: pcDNA3). Protein Ex pression (M2-PK und A-raf) wurde in allen Experimenten mittels Western-blots kontrolliert (Daten nicht gezeigt).

Tabelle 1

Für die Kalkulation der Metabolit Konversion mußte die Abhängigkeit von der Zelldichte berücksichtigt werden.

Für die Konversion von Glucose, Lactat, Glutamin und Pyruvat wurde eine logarithmische Transformation der Daten verwendet, da die Daten nach rechts verzerrt waren. x_g. DF^±1 ist die delogarithmisierte Form des ar ithmetischen Mittels und der Standardabweichung der zuvor logarithmisch transformierten Daten. Für die sta tistische Analyse wurde eine Einweg Analyse der Covari anz mit der Zelldichte als Covariable durchgeführt. Im Falle von Glutamat bedeuten positive Werte mittlere 1 Produktion und negative Werte Verbrauch.

Tabelle 2

Tabelle 3

NIH 3T3 Zellen wurden mit A-raf, M2-PK und M2-PK K366M transfiziert in den angegebenen Kombinationen. Focus Bildung wurde nach 10 Tagen Wachstum bestimmt (linke Spalte). Stbail gag-A-raf exprimierende NIH 6A-leuk Zellen wurden mit M2-PK und M2-PK K366M transfiziert. Kolonien überlebender Zellen wurden nach 10 Tagen G418 Selektion gezählt (rechte Spalte). Vector = Leervector pcDNA3.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Nukleinsäure codierend für zumindest eine Teilse quenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalis ierungskaskade, wobei die Teilsequenz für eine Bindungsstelle für ein die Glykolyse katalysier endes Enzym codiert, oder stille Mutation einer solchen Nukleinsäure oder mit einer solchen Nuk leinsäure oder deren stillen Mutation hybridisier ende Nukleinsäure.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1 codierend für ein Pro tein oder Peptid enthaltend die Sequenz A-raf (587-606), insbesondere (602-603); oder stille Mutation einer solchen Nukleinsäure oder mit einer solchen Nukleinsäure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleinsäure.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 codierend für ein Protein oder Peptid bestehend aus der Sequenz A-raf (255 bis 587-606) oder stille Mutation einer solchen Nukleinsäure oder mit einer solchen Nukleinsäure oder deren stillen Mutation hybridis ierende Nukleinsäure.

4. cDNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

5. Isolierter rekombinanter Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Antisense Nukleinsäure oder Ribozym bindend an eine Nukleinsäure, insbesondere RNA, nach einem der An sprüche 1 bis 3.

7. Substanz mit einer Bindungsstelle für ein durch eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiertes Protein oder Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) deaktivierte, die Glykolyse katalysierende Enzme,
b) inaktive Proteine oder Peptide,
c) Aptamere.

8. Substanz nach Anspruch 7 in Form von einer Kinase inaktiven Form von M2-PK.

9. Substanz nach Anspruch 8, wobei die Kinase-inaktive Form durch eine Mutation im Bereich der ADP- Bindungsstelle und/oder der ATP-Bindungsstelle, gebildet ist, insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "M2-PK K366M, R119C, T340M, Q377K, K161M, K165M und mehrere dieser Mutationen" oder ausgewählt ist aus einer oder mehrerer Muta tionen entsprechend korrespondierenden aber von M2-PK abweichenden Aminosäuren gemäß M1-PK.

10. Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Blockierung der Kooperation zwischen einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierung skaskade und einem die Glykolyse katalysierenden Enzym, insbesondere der A-raf/M2-PK Kooperation.

11. Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung von Krebserkrankungen.

12. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der An sprüche 1 bis 3 oder eines hierdurch kodierten Proteins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung eines mit einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskette kooperierenden, die Glykolyse katalysierenden Enzyms.

13. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der An sprüche 1 bis 3 oder eines hierdurch kodierten Proteins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung einer an einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskette bindenden, jedoch nicht die Glykolyse katalysierenden Stoffes.