DE60218843T2

DE60218843T2 - Verfahren zur identifizierung von mitteln zur behandlung von diabetes

Info

Publication number: DE60218843T2
Application number: DE60218843T
Authority: DE
Inventors: Christina Bendz; Staffan Lake
Original assignee: Biovitrum AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 2001-06-18
Filing date: 2002-06-18
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2022-06-19
Also published as: PT1397681E; JP4475945B2; WO2002103361A1; DE60218843D1; JP2005500033A; DK1397681T3; AU2002311737B2; SE0102147D0; CA2446284A1; ES2284879T3; ATE356995T1; EP1397681B1; EP1397681A1; US20030022241A1; CY1107640T1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von humanen "MAP-Kinase interagierenden Kinasen" Mnk2a und Mnk2b in Verfahren für die Identifizierung von pharmazeutisch brauchbaren Mitteln, im speziellen Mittel, die für die Behandlung von Typ-II-Diabetes brauchbar sind.
STAND DER TECHNIK
Eines der bedeutesten Hormone, die den Metabolismus beeinflussen, ist Insulin, welches in den Beta-Zellen von den Langerhansschen Inseln des Pankreas hergestellt wird. Insulin reguliert primär die Richtung des Metabolismus, indem es viele Vorgänge zur Speicherung von Substraten hin und weg von ihrem Abbau verlagert (für Überblickartikel siehe z.B. Shepherd, P.R., et al. (1998) Biochem. J. 333: 471-490; Alessi, D. R., & Downes, C.P. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1436: 151-164). Insulin bewirkt eine Steigerung des Transports von Glucose und Aminosäuren, sowie von Schlüsselmineralien wie Natrium, Magnesium und Phosphat aus dem Blut in die Zellen hinein. Es reguliert ebenfalls eine Vielzahl an enzymatischen Reaktionen innerhalb der Zellen, welche allesamt eine gemeinsame Gesamtrichtung besitzen, nämlich die Synthese von großen Molekülen aus kleinen Einheiten. Ein Defizit in der Insulinfunktion (Diabetes mellitus) verursacht eine massive Beeinträchtigung bzgl. (i) der Speicherung von Glucose in der Form von Glykogen und der Oxidation von Glukose für Energie; (ii) der Synthese und Speicherung von Fett aus Fettsäuren und deren Vorläufern und der Vervollständigung der Fettsäureoxidation; und (iii) der Synthese von Proteinen aus Aminosäuren.
Es gibt zwei Arten von Diabetes. Typ-I ist der insulinabhängige Diabetes mellitus (IDDM; ehemals als Jugenddiabetes bezeichnet), für welchen Insulin-Injektion benötigt wird. Bei diesem Typ wird Insulin nicht vom Pankreas ausgeschieden und muss deshalb mittels Injektion genommen werden. Typ-II-Diabetes, nichtinsulinabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM), ist klinisch charakterisiert durch Hyperglykämie und Insulinresistenz und ist für gewöhnlich mit Adipositas assoziiert. Typ-II-Diabetes ist eine heterogene Gruppe von Fehlfunktionen, in welcher Hyperglykämie resultiert sowohl aus einer beeinträchtigten Insulinsekretionsantwort auf Glukose als auch einer verminderten Insulinwirksamkeit bei der Stimulierung von Glukoseaufnahme durch die Skelettmuskulatur und bei der Beschränkung der hepatischen Glukoseproduktion (Insulin-Resistenz). Bevor sich Diabetes entwickelt, verlieren die Patienten im Allgemeinen die frühe Insulinsekretionsantwort auf Glukose und könnten relativ große Mengen an Proinsulin sezernieren. Bei etabliertem Diabetes, obwohl Fasten-Plasmainsulinwerte normal sein können oder sogar erhöht bei Typ-II-Diabetes-Patienten, ist die durch Glukose stimulierte Insulinsekretion deutlich vermindert. Die verminderten Insulinwerte reduzieren die von Insulin vermittelte Glukoseaufnahme und sind nicht im Stande, die hepatische Glukoseproduktion zu beschränken.
Die Glukosehomöostase hängt von einem Gleichgewicht zwischen der Glukoseproduktion von der Leber und der Glukoseverwertung von Insulin-abhängigen Geweben, wie Fett und Muskel, und Insulin-unabhängigen Geweben, wie Gehirn und Niere, ab. In Typ-II-Diabetes ist der Zugang von Glukose in Fett und Muskel reduziert, und die Glukoseproduktion in der Leber ist aufgrund der Insulinresistenz in den Geweben verstärkt.
Die Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs) sind ein Haupttyp von Zelloberflächen-Rezeptoren. Die Liganden für RTKs sind Peptid/Protein-Hormone, einschließlich Nervenwachstumsfaktor (NGF), Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und Insulin. Das Binden eines Liganden an eine RTK stimuliert die intrinsische Protein-Tyrosinkinase-Aktivität des Rezeptors, welche anschließend eine Signal-Transduktions-Kaskade stimuliert, welche zu Änderungen in der zellulären Physiologie und Mustern der Genexpression führt. RTK-Signalwege besitzen ein breites Spektrum an Funktionen, welche die Regulation der Zellproliferation und Differenzierung, die Förderung des Zellüberlebens und die Modulation des zellulären Metabolismus einschließen.
Ras ist ein GTP-bindendes Schalterprotein, welches sich wie ein Schlüssel-Signalleitungsmolekül in Wegen, die durch die Aktivierung von RTKs ausgelöst werden, verhält. Alle Ras-gekoppelten RTKs in Säugetierzellen scheinen einen hoch konservierten Signal-Transduktions-Weg zu verwenden, in welchem aktiviertes Ras eine Kinasekaskade induziert, welche ihren Höhepunkt in der Aktivierung von MAP-Kinase erreicht (Mitogen-aktivierte Proteinkinase). Diese Serin/Threoninkinase, welche in den Nukleus translozieren kann, phosphoryliert zahlreiche unterschiedliche Proteine, einschließlich Transkriptionsfaktoren, welche die Expression von wichtigen zellzyklus- und differenzierungsspezifischen Proteinen reguliert.
Die Maus-Genprodukte Mnk1 und Mnk2 ("MAP-Kinase-interagierende Kinase" oder "MAP-Kinase-Signal integrierende Kinase" 1 und 2) sind Einzeldomänen-Serin/Threoninkinasen, welche 72% Sequenzidentität gemeinsam haben (Waskiewicz A.J. et al (1997) EMBO J. 16: 1909-1920; GenBank Zugangs-Nr. Y11091 und Y11092). Humanes Mnk1 ist ebenfalls beschrieben worden (Fukunaga, R. et al (1999) EMBO J. 16: 1921-1933; GenBank Zugangs-Nr. AB000409). All diese drei Proteine wurden anhand ihres Vermögens, fest an MAP-Kinasen zu binden, identifiziert. Mnk1 und Mnk2 binden beide die extrazellulären signalregulierten Kinasen ERK1 und ERK2, und Mnk1 bindet ebenfalls die Stress-aktivierte Kinase p38. Der eukaryontische Initiationsfaktor 4E (eIF4E) ist als eines der physiologischen Substrate von Mnk1 und Mnk2 identifiziert worden (Scheper, G.C., et al. (2001) Mol. Cell. Bio. 21: 743-754).
Das humane Mnk2-Gen ist durch ein Hefe-Zwei-Hybrid-Screen identifiziert und charakterisiert worden, bei welchem das Mnk2-Protein mit der Liganden-Bindungsdomäne des Östrogenrezeptors ϑ (ERβ) interagierte (Slentz-Kesler, K., et al (2000) Genomics 69: 63-71). Es wurde gezeigt, dass das humane Mnk2-Gen zwei C-terminale Spleissvarianten besitzt, bezeichnet als Mnk2a (die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Mnk2a wurden als SEQ ID-Nr. 1 beziehungsweise 2 bezeichnet; GenBank Zugangs-Nr. AF237775) und Mnk2b (die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Mnk2b wurden als SEQ ID-Nr. 3 beziehungsweise 4 bezeichnet; GenBank Zugangs-Nr. AF237776). Die zwei Isoformen sind über die ersten 385 Aminosäuren der codierenden Sequenz identisch und unterschieden sich nur im letzten Exon, welches zusätzliche 80 Reste für Mnk2a und 29 Reste für Mnk2b codiert. Es wurde weiter gezeigt, dass die Mnk2-Interaktion für den Östrogenrezeptor (ER) θ selektiv war, im Gegensatz zu ERI, und dass die Interaktion zu Mnk2b im Gegensatz zu Mnk2a und Mnk1 spezifisch war.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, welches den Effekt von Mnk2b-Überexpression in Adipozyten 3T3-L1, transfiziert mit GLU-REx3, CRE, IRE oder SREBP-RE, darstellt. Kontrollzellen wurden mit einem leeren Plasmidvektor transfiziert, und der Kontrollexpressionswert wurde auf 1,00 festgelegt.
Die 2 ist ein Diagramm, welches den Effekt von Mnk2b auf die Glukoseaufnahme zeigt, wenn dieses in (2A) differenzierten Adipozyten 3T3-T1 und (2B) humaner neuronaler Zelllinie SHSY überexprimiert wird. Kontrollzellen (Ktrl.) wurden mit einem leeren Plasmidvektor transfiziert. Graue Balken zeigen nicht-stimulierte Zellen, weiße Balken zeigen Insulin-stimulierte Zellen.
Die 3 ist ein Diagramm, welches den Effekt von Mnk2b-Überexpression und RNAi-Knockdown von Mnk2b-Expression auf die Glukoseaufnahme in humane Zellen darstellt.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Es wurde überraschenderweise herausgefunden, dass Mnk2 im Insulin-Signalweg involviert ist.
In einem Aspekt zeichnet die Erfindung ein Verfahren für die Identifizierung eines Mittels aus, welches das Vermögen eines Mnk2-Polypeptids moduliert (erhöht oder erniedrigt), die Glukoseaufnahme in einer Zelle zu modulieren, wobei das Verfahren folgendes beinhaltet: das Kontaktieren eines Mnk2-Polypeptids mit einem Kandidatenmittel; und die Bestimmung des Effektes des Kandidatenmittels auf das Vermögen des Mnk2-Polypeptids, die Glukoseaufnahme in einer Zelle zu modulieren. In einem Beispiel verringert das Kandidatenmittel das Vermögen des Mnk2-Polypeptids, die Glukoseaufnahme in der Zelle zu vermindern.
In einem anderen Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch ein Verfahren zur Identifizierung eines Mittels aus, welches das Vermögen eines Mnk2-Polypeptids, die Aktivität eines Glukose-Response-Elementes in einer Zelle zu modulieren, moduliert, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Kontaktieren eines Mnk2-Polypeptids mit einem Kandidatenmittel; und die Bestimmung des Effektes des Kandidatenmittels auf das Vermögen des Mnk2-Polypeptids, die Aktivität eines Glukose-Response-Elementes in einer Zelle zu modulieren. In einem Beispiel erniedrigt das Kandidatenmitel das Vermögen des Mnk2-Polpeptides, die Aktivität eines Glukose-Response-Elementes (z.B. ein hier beschriebenes Response-Element) in der Zelle zu vermindern.
In einem anderen Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch ein Verfahren für die Identifizierung eines Modulators der Glukoseaufnahme aus, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Bereitstellen einer Zelle, die ein rekombinantes Mnk2-Polpeptid exprimiert; Exponieren der Zelle an ein Kandidatenmittel; und Messen der Glukoseaufnahme in der Zelle in Gegenwart des Kandidatenmittels, wobei eine veränderte Glukoseaufnahme in der Zelle in Gegenwart des Kandidatenmittels, im Vergleich zur Abwesenheit des Kandidatenmittels, zeigt, dass das Kandidatenmittel ein Modulator der Glukoseaufnahme ist. In einem Beispiel verursacht das Kandidatenmittel eine Erhöhung der Glukoseaufnahme.
Ein Kandidatenmittel kann zum Beispiel eine) Peptid, Peptidomimetikum, Aminosäure, Aminosäure-Analogon, Polynukleotid, Polynukleotid-Analogon, Nukleotid, Nukleotid-Analogon oder anderes kleines Molekül beinhalten. In einem Beispiel inhibiert das Kandidatenmittel eine biologische Mnk2-Aktivität, wie die Serin/Threonin-Kinaseaktivität, das Vermögen, die Glukoseaufnahme in einer Zelle zu reduzieren, das Vermögen, die Aktivität eines Glukose-Response-Elementes zu vermindern (z.B. ein hier beschriebenes Element), und/oder das Vermögen, einen hierin beschriebenen Mnk2-Liganden zu binden. In einer Ausführungsform bindet das Kandidatenmittel an ein Mnk2-Polypeptid oder eine Nukleinsäure (RNA oder DNA), welche ein Mnk2-Polypeptid codiert.
Die hier beschriebenen Screening-Methoden können optional einen Schritt der Einführung einer Nukleinsäure, codierend ein Mnk2-Polypeptid, in eine Zelle einschließen. Die Auswirkung eines Kandidatenmittels auf eine biologische Aktivität, hier beschieben, kann in Gegenwart und/oder Abwesenheit eines Mnk2-Polypeptids oder einer Nukleinsäure, codierend ein Mnk2-Polypeptid, evaluiert werden. Die hier beschriebenen Verfahren können in vitro oder in vivo unter Anwendung eines zellbasierenden Systems, eines zellfreien Systems oder einer Kombination von zellbasierenden und zellfreien Systemen durchgeführt werden.
In einem anderen Aspekt zeichnet die Erfindung ein Verfahren zur Modulierung der Glukoseaufnahme in vitro in einer Zelle aus, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Zelle mit einer Menge einer Verbindung, die zur Modulierung der Expression oder Aktivität eines Mnk2-Polypeptids und somit zur Modulierung der Glukoseaufnahme in der Zelle wirksam ist, umfasst.
Das in den hier beschriebenen Verfahren verwendete Mnk2-Polypeptid kann ein Säuger-Mnk2-Polypeptid sein, z.B. ein humanes Mnk2-Polypeptid. Zum Beispiel kann das Mnk2-Polypeptid ein humanes Mnk2a- oder Mnk2b-Polypeptid sein.
Das Mnk2-Polypeptid kann eine Sequenz, ausgewiesen als SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 4, besitzen. Ein Mnk2-Polypeptid kann sich auch von der korrespondierenden Sequenz, ausgewiesen als SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 4, unterscheiden. Die Unterschiede sind vorzugsweise Unterschiede oder Änderungen an einem nicht essentiellen Rest oder eine konservative Substitution. In einer Ausführungsform beinhaltet das Mnk2-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu etwa 60% identisch zu einer Sequenz ist, welche als SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 4 gezeigt ist, oder einem Fragment davon. Bevorzugt ist die Aminosäuresequenz mindestens zu 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr identisch zu SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 4 und besitzt eine hier beschriebene biologische Mnk2-Aktivität. Die Aminosäuresequenz kann zum Beispiel identisch zu SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 4 sein.
Bevorzugte Mnk2-Polypeptide weisen zumindest 10%, vorzugsweise zumindest 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% und mehr von der Länge der Sequenz auf, die als SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 4 gezeigt ist, und besitzen eine hierin beschriebene biologische Mnk2-Aktivität. Ein Mnk2-Polypeptid kann zum Beispiel eine Serin/Threonin-Kinaseaktivität besitzen, die Glukoseaufnahme in einer Zelle reduzieren, die Aktivität eines Glukose-Response-Elements senken (z.B. eines hierin beschriebenen Elementes) und/oder einen hierin beschriebenen Mnk2-Liganden binden.
Ein Mnk2-Polypeptid schließt ferner ein Polypeptid ein, das eine funktionelle Domäne des Polypeptids der hier beschriebenen SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 4, z.B. eine Kinasedomäne, umfasst. In einer Ausführungsform besitzt das Mnk2-Polypeptid Kinaseaktivität.
Ein Mnk2-Polypeptid schließt auch ein Polypeptid ein, das mindestens 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 oder mehr fortlaufende Aminosäurereste der SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 4, umfasst. Vorzugsweise hat das Polypeptid eine biologische Mnk2-Aktivität, die hierin beschrieben wird.
Das Mnk2-Polypeptid kann in einigen Aspekten der Erfindung im Wesentlichen ein reines Polypeptid sein. Der Ausdruck "im Wesentlichen rein", wie er hierin in Bezug auf ein gegebenes Polypeptid verwendet, bedeutet, dass das Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen biologi schen Makromolekülen ist. Zum Beispiel ist das im Wesentlichen reine Polypeptid zu mindestens 75%, 80%, 85%, 95% oder 99% bezüglich des Trockengewichtes rein. Reinheit kann durch jedes angemessene im Fachbereich bekannte Standardverfahren gemessen werden, zum Beispiel durch Säulenchromatographie, Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder HPLC-Analyse.
Durchgehend in dieser Beschreibung sollen die Ausdrücke "Standardprotokolle" und "Standardprozeduren", wenn im Zusammenhang mit molekularbiologischen Techniken benutzt, als Protokolle und Prozeduren verstanden werden, die in einem gewöhnlichen Laborhandbuch gefunden werden, wie etwa: Current Protocols in Molecular Biology, Herausgeber: F. Ausubel et al., John Wiley and Sons, Inc. 1994, oder Sambrook, J., Fritsch, E.E., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2te Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989.
Falls nicht anderweitig definiert, haben alle hier benutzten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke dieselbe Bedeutung, wie allgemein verstanden von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu welchem diese Erfindung gehört. Angemessene Verfahren and Materialien sind nachstehend beschieben, obwohl ähnliche und gleichwertige Verfahren und Materialien zu den hierin beschriebenen auch in der Praxis oder Prüfung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere hier erwähnte Referenzen sind durch den Bezug darauf in ihrer Gesamtheit einbezogen. Im Fall eines Konfliktes wird die vorliegende Beschreibung, einschließlich Definitionen, bestimmen. Zusätzlich sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur veranschaulichend und nicht einschränkend gemeint.
Nachstehend ist die Erfindung in den angehängten Beispielen beschrieben, welche zur Veranschaulichung der Erfindung beabsichtigt sind, ohne den Umfang der Erfindung einzuschränken.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: Identifizierung von LK6 und Mnk
P-Element-vermittelte Mutagenese ist eine weit verbreitete Technologie in der Drosophila-Genetik (Cooley, L. et al. (1988) Science 239: 1121-1128, Robertson, H. M. et al. (1988) Genetics 118: 461-470). Das P-Element ist ein gut charakterisiertes transponierbares Element, welches erbliche Funktionsverlustmutationen in ein breites Spektrum von Genen einbringen kann. Gekoppelt mit genomischer Annotation der P-Element-Insertions-Stelle bieten P-Element-Bibliotheken ein wertvolles Instrument der reversen Genetik. Genetische Screens unter Verwendung von Bibliotheken von P-Insertionsmutanten in bekannten Genen ermöglichen ein zügiges Durchsuchen des Genoms für die Identifizierung potentieller Modifikator-Gene.
Verschlechterte Insulinrezeptor-Signalleitung besitzt eine phänotypische Erscheinungsform in kleinerer Zellgröße (Huang, H., et al. (1999) PTEN affects cell size, cell proliferation and apoptosis during Drosophila eye development. Development 126: 5365-5372.) Es wurde ein genetischer Screen durchgeführt, um Modifikatoren der Insulinrezeptor-Signalleitung zu identifizieren, unter Verwendung einer Bibliothek von P-Insertions-mutagenisierten Drosophila-Linien. In diesem Screen, wurde die phänotypische Erscheinungsform von kleinen Augen als Ablesung verwendet. Das D. melanogaster-Gen LK6 (GenBank Zugangs-Nr. U76378) wurde als ein schwacher, aber beständiger Verstärker des D. N.-Insulinrezeptor-Phänotyps identifiziert.
Das Drosophila melanogaster-L6K-Protein wurde in einer TBLASTN-Suche (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/blasttutorial.html) in den öffentlichen Nukleotid-Datenbanken (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) verwendet. Die humanen Treffer waren MNK1 (AB000409; e-Wert von e-113), MNK2a (AF237775; e-Wert von e-114) und MNK2b (AF237776; e-Wert von e-110). Somit wurde durch Bioinformatik-Analyse gefolgert, dass das D. melanogaster-Gen LK6 zwei humane Homologe, Mnk1 und Mnk2, besitzt.
BEISPIEL 2: Klonierung von MNK2b
Das 3'-Ende der Mnk2b-cDNA wurde aus dem Incyte-Klon Nr. 1309709 isoliert. Dieser Klon beinhaltet eine Sequenz entsprechend der letzten 570 bp von Mnk2b. Das cDNA-Insert des Incyte-Klons wurde durch Sequenzierung überprüft, ausgeführt durch das ABI PrismBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, und zwar mit dem Applied Biosystems Model ABI 377 XL/96 DNA Sequenzierungs-System.
Um einen cDNA-Klon, codierend das 5'-Ende von Mnk2b (670 bp), zu isolieren, wurde die öffentliche Mnk2b-Sequenz (GenBank Zugangs-Nr. AF237776 verwendet, um PCR-Primer für die PCR-Amplifikation zu konstruieren.
Als Matrize für das Klonieren wurde aus humaner Leber hergestellte cDNA verwendet. Eine Erststrang-cDNA-Synthese, unter Nutzung des SUPERSCRIPT Choice Systems (Life Technologies; Kat. # 18090-019), wurde unter Verwendung von 1 μg humaner Leber-mRNA (Clontech; Kat. # 6510-1) mit statistischen Hexameren gemäß den Instruktionen des Herstellers ausgeführt.
Die 100 μl PCR wurde, unter Verwendung des "Nativen-Pfu-DNA-Polymerase"-Kits (Stratagene; Kat. # 600135) und 5 μl von jedem der genspezifischen Primer LAKQ166 (SEQ ID Nr.: 5) und LAKQ168 (SEQ ID Nr.: 6), durchgeführt. Der Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 480 wurde mit dem Programm verwendet: 1 Zyklus bei 94°C, 2 min; 60°C, 1 min; 74°C, 2 min; 25 Zyklen bei 94°C, 1 min; 58°C, 1 min; 74°C, 2 min und schließlich 72°C, 7 min, gefolgt von einer Abkühlung auf 4°C. Zusätzliche fünf Runden der Amplifikation wurden wie oben durchgeführt, mit der Ausnahme jedoch, dass die Annealing-Temperatur auf 55°C gesenkt wurde.
Ein 15 μl-Aliquot der PCR wurde auf ein 1%iges Gel aus NuSieve GTG-Agarose von niedriger Schmelztemperatur geladen (FMC BioProduct; Kat. # 50082), und das Fragment von etwa 670 bp wurde aus dem Gel herausgeschnitten. 3 μl des isolierten Fragments wurden in 1 μl Plasmid pCR2.1-TOPO kloniert unter Verwendung des TOPO TA-Klonierungs-Kits (Invitrogen; Kat. # K4500-01). 3 μl der Ligations-Mischung wurden in chemisch kompetente E. coli One-Shot-Zellen TOP 10 (Invitrogen; Kat. # C4040-03) transformiert.
Plasmid-DNA aus drei Klonen (3 ml Übernachtkultur) wurden durch die Verwendung des QIAprep Spin Miniprep-Kits (QIAGEN, Kat. # 27104) erhalten, und die anschließende Sequenzierung (# A0452) wurde wie oben durchgeführt. Das Plasmid mit korrekter Sequenz wurde als pMB 1500 bezeichnet.
Die zwei Teile von Mnk2b, das 3'-Ende von Incyte 1309709 und das 5'-Ende von pMB1500 wurden durch eine Drei-Fragment-Ligation in pCR2.1-TOPO zusammengefügt, wodurch man pBV 1556 erhielt.
2,4 μl pBM1500 wurden mit EcoRI und SacI verdaut, und 1,8 μg des selben Plasmids wurden mit EcoRI und BglII verdaut. Die Hälfte der Verdaue wurden auf ein 1,2% E-Gel, Invitrogen, geladen und eine Bande von in etwa 3800 bp (Fragment a) wurde aus dem EcoRI-SacI-Verdau herausgeschnitten, und eine Bande von ungefähr 680 bp (Fragment b) wurde aus dem EcoRI-BglII Verdau herausgeschnitten. 2,7 μg des Plasmids Incyte 1309709 wurde mit SacI und BglII verdaut. Die Hälfte des Verdaus wurde auf ein E-Gel geladen und eine Bande von ungefähr 700 bp (Fragment c) wurde aus dem Gel herausgeschnitten. Die Fragmente wurden durch das QIAquik Gel-Extraktionskit (Qiagen; Kat. # 28704) und nachfolgende Elution in 50 μl H₂O aufgereinigt.
Die Ligation wurde unter Verwendung von Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia Biotech; Kat. # 27-0361-01) durchgeführt. 6 μl von Fragment A wurde mit 7 μl der Fragmente B bzw. C gemischt. Die Ligations-Mischung wurde in chemisch kompetente Top10 E. coli One-Shot-Zellen transformiert, und die Plasmid-DNA wurde wie oben erhalten. Kontrollverdaue unter Verwendung der für das Klonieren verwendeten Restriktionsenzyme EcoRI, SacI und BglII bestätigten das Insert.
Mnk2b zur Säuger-Expression wurde durch Anwendung von "Gateway^TM Cloning Technology" von Life Technologies hergestellt. Gateway-kompatible Primer wurden entworfen (SEQ ID Nr.: 7 und 8), und die PCR wurde unter Verwendung von pBV 1556 als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde in 50 μl unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase, Roche (Kat. # 1 435 094) und 1 μl von jedem der Primer BEKA 248 und BEKA 247 durchgeführt. Das Perkin Elmer "Gene Amp" PCR-System 2400 wurde mit folgendem Programm verwendet: 95°C, 5 min; (95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2 min) × 25; und 72°C, 7 min; gefolgt von Abkühlen auf 4°C. 10 μl der Re aktion wurde auf ein 1,2% E-Gel geladen, und ein Fragment von ungefähr 1400 bp wurde aus dem Gel herausgeschnitten und unter Verwendung des QIAquik-Gelextraktions-Kits aufgereinigt.
Das PCR-Fragment wurde in pDONR201 (Life Technologies; Kat. # 11798-014) gemäß der Instruktionen des Herstellers kloniert. Der resultierende Eingangsklon wurde als pBV27 bezeichnet, und das Insert wurde durch Sequenzierung bestätigt. Ein Säuger-Expressionsklon mit einer 5'-GST-Fusion, bezeichnet als pBV44 (SEQ ID Nr.: 9), wurde (gemäß den Instruktionen des Herstellers) unter Verwendung des Destinationsvektors pDEST27 (Life Technologies; Kat. # 11812-013) konstruiert. In der SEQ ID Nr.: 9 repräsentieren die Aminosäuren 1 bis 226 die GST-Domäne, während die Aminosäuren 237 bis 649 das humane Mnk2b repräsentieren.
BEISPIEL 3: Expressionsprofil
Um die relativen Expressions-Spiegel von MNK2b in unterschiedlichen Geweben zu bestimmen, wurde ein Mehrfachgewebe-Expressions-Feld bzw. "Multiple Tissue Expression Array" (CLONTECH; Kat. # 775) in einem Hybridisierungsexperiment mit einer 106 bp langen Genspezifischen Sonde verwendet.
Der MNK2b-cDNA-Klon pBV27 wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und PpuMI verdaut. Die Fragmente wurden auf einem 1,2%-Agarosegel (Invitrogen; Kat. # G5018-01) aufgetrennt. Das 106 bp große Fragment wurde aus dem Gel herausgeschnitten und unter Verwendung des QIAquick Gelextraktions-Kits (QIAGEN; Kat. # 28704) gereinigt.
25 ng des gereinigten Fragmentes wurde in einer ³²P-Markierungsreaktion verwendet, durchgeführt mit Reagenzien, wie im "Strip-EZ DNA-Sonden-Synthese"-Instruktionshandbuch (Ambion; Kat. # 1470) empfohlen. Das in der Reaktion verwendete [α-³²P] dATP wurde von Amersham Pharmacia Biotech (Kat. # AA0004) erworben.
Hybridisierungs- und Waschbedingungen wurden, wie im CLONTECH-Handbuch PT3307-1 empfohlen, ausgeführt. Der MTE-Array wurde in einer STORM860 Phosphor Screen während 70 Stunden exponiert. ImageQuant wurde verwendet, um das Hybridisierungssignal zu analysieren.
Die Ergebnissen zeigten die höchsten Expressionsspiegel für MNK2b im Skelettmuskel. Dies war unerwartet, weil veröffentlichte Ergebnisse bei adultem Mäusegewebe Expression von Mnk2-mRNA in allen untersuchten Geweben, außer dem Gehirn, zeigten (Waskiewicz, A. J., et al. (1997) EMBO J. 16: 1909-1920).
BEISPIEL 4: Überexpression von Mnk2b beeinflusst das Glukose-Ansprechverhalten und den Lipidmetabolismus in Adipozyten der Maus
Induzierbare Reportervektoren, welche das Photinus pyralis (Leuchtkäfer) Luciferase-Reportergen beinhalten, gesteuert durch ein basales Promotorelement (TATA-Box), sowie auch induzierbare cis-Enhancer-Elemente (direkte Wiederholungseinheiten bzw. Repeats aus der Promotorregionen von verschiedenen Genen) wurden hergestellt oder gekauft. Die Reportervektoren sind für die in vivo-Ablesung von Signal-Transduktionswegen entworfen, weil die Enhancer Konvergenzpunkte von vielen Signal-Transduktionswegen sind. Wenn ein Plasmid, welches das Gen von Interesse exprimiert, in Säugerzellen mit einem cis-Reporter-Plasmid cotransfiziert wird, zeigt die erhöhte Luciferase-Expression entweder direkt oder indirekt transkriptionelle Aktivierung an.
Ein Vektor, bezeichnet als pGluREx3-Luciferase ((gtgCACGTGtgaCAGCTGcaa)x3), wurde unter Verwendung des pTAL-Promotor-Vektors (Clontech; Kat. # 6252) hergestellt. Der pGluREx3-Vektor wurde entworfen, um Effekte bzgl. der Glukoseantwort (Portois, L., et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 8181-8190) zu überwachen bzw. zu verfolgen.
Ein Vektor, bezeichnet als pSREBP-Luciferase (aTCACcCCAC), wurde durch Klonierung zweier Sterol-regulatorisches-Element-Bindungsprotein(SREBP)-Response-Elemente in den pGLE2-Promotor-Vektor (Promega; Kat. # E1631) hergestellt. Der pSREBP-Vektor wurde entworfen, um Effekte bzgl. des Steroid-Response-Elementes zu verfolgen (Yokyama, C., et al. (1993) Cell 75: 187-197).
Der Vektor pCRE-Luciferase, entworfen, um die Aktivierung von cAMP-Bindeprotein (CREB) und cAMP-vermittelter Signal-Transduktionwege zu verfolgen, wurde von Stratagene gekauft (Kat. # 219075).
Ein Vektor, bezeichnet als pIRE-Luciferase ((tagCAAAACAaactTATTTTGaaca)x3), wurde unter Verwendung des pGL2-Promotor-Vektors (Promega; Kat. # E1631), hergestellt. Der pIRE-Vektor wurde entworfen, um Insulin-Rezeptor-vermittelte-Signalgebung durch das Insulinähnliche-Wachstumsfaktor-Bindeprotein (IGFBP-1) zu verfolgen.
Mäuse-Adipozyten (differenzierte 3T3-L1-Zellen) wurden transient mit dem Response-Element-Konstrukt von Interesse infiziert, in Kombination mit Mnk2b oder einem Grundgerüst(Kontroll)-Plasmid-Konstrukt, unter Verwendung von LipofectAmine^TM2000 (Life Technologies). Nach 48 Std. wurden die Zellen unter Verwendung eines Lyse-Puffers (Tris-EDTA + 0,25% Triton-X100) während 10 min bei Raumtemperatur lysiert, und die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung eines Luciferase-Aktivitäts-Assays (BioThema) gemessen.
Die Ergebnisse (1) zeigen, dass Mnk2b-Überexpression in Mäuse-Adipozyten zu einer 70%-Verminderung der Aktivität des GLUx3-Luciferase-Reporters führte, was eine Verminderung des Glukose-Ansprechverhaltens in den Zellen anzeigt. Nach dem Wissen der Erfinder, gibt es keine zuvor offenbarten Ergebnisse, welche eine Verbindung zwischen Mnk2b und Glukoseaufnahme zeigen.
Die in 1 gezeigten Ergebnisse zeigen weiter, dass Mnk2b-Überexpression in Mäuse-Adipozyten zu einer verminderten Aktivität des SREBP-Response-Elementes führt. Unsere Schlussfolgerung ist, dass Mnk2b den Lipidmetabolismus beeinflusst, weil gezeigt wurde, dass das SREBP-Response-Element die Transkription vom z.B. Niedrig-Dichte-Lipoprotein-Rezeptor-Gen steuert (Yokoyama, C., et al. (1993) Cell 75: 187-197), und den Cholesterin-Metabolismus reguliert (Brown, M. S., und Goldstein, J. L. (1997) Cell 83: 331-340).
Die Überexpression von Mnk2b in Mäuse-Adipozyten führt ebenfalls zu verminderter Aktivität von den pCRE- und pIRE-Reportern. Diese Ergebnisse bestätigen veröffentlichte Daten über Mnk2b als Teil des MAP-Kinase-Signalgebungsweges (Waskiewicz, A., et al. (1997) EMBO J. 16: 1909-1920; Fukunaga, R., und Hunter, T. (1997) EMBO J. 16: 1921-1933).
BEISPIEL 5: Mnk2b-Überexpression moduliert die Glukoslaufnahme in Adipozyten
Die Glukoseaufnahme wurde gemäß dem Verfahren von Hundal et al. (1994) Biochem. J. 297: 289-295 bestimmt. Kurz gesagt, wurden nach der Inkubation mit Hormonen während 45 Minuten, wenn nicht anderweitig angegeben, Zell-Monoschichten mit Glukose-freiem PBS gespült. Die Glukoseaufnahme wurde durch Inkubation der Zellen in Anwesenheit von 1 μCi/ml ³H-2-Desoxyglukose in PBS während 8 min quantifiziert. Die nicht-spezifische Aufnahme wurde durch Quantifizieren der Zell-assoziierten Radioaktivität in Anwesenheit von 10 μM Cytochalasin B bestimmt. Die 2-Desoxyglukose-Aufnahme wurde beendet, indem das Medium schnell abgesaugt wurde, gefolgt von drei aufeinander folgenden Waschungen von Zell-Monoschichten mit eiskaltem PBS. Die Zellen wurden in 0,5 M NaOH lysiert, gefolgt von Flüssigszintillationszählung. Die Transportraten wurden in jeder Vertiefung auf den Proteingehalt normiert.
Die Ergebnisse (2) zeigen, dass die Mnk2b-Überexpression in Adipozyten (differenzierte 3T3-L1-Zellen) und einer humanen Zelllinie (SHSY) die Rate der Glukoseaufnahme in einer Insulin-abhängigen Weise vermindert. Die Ergebnisse bestätigen die Ergebnisse aus dem Reporter-Assay (Beispiel 4) und zeigen weiter, dass ein Effekt der Mnk2b-Expression eine Reduzierung der Glukoseaufnahme ist.
BEISPIEL 6: Strukturmodelle von Mnk-Proteinen
Dreidimensionale Strukturmodelle von Mnk1, Mnk2a und Mnk2b wurden aus Homologie-Daten erstellt. Die Struktur der Calmodulin-abhängigen Proteinkinase der Ratte (Proteindatenbank-Eintrag 1A06) wurde als Vorlage für alle drei Modelle verwendet. (Die Protein-Datenbank ist erhältlich unter http://www.rcsb.org/pdb; siehe auch Berman et al. (2000) Nucleic Acid Research 28: 235-242). Die Strukturmodelle wurden unter Verwendung der ICM-Software von MolSoft Inc. (http://www.molsoft.com) hergestellt.
Die Modelle von Mnk1, Mnk2a und Mnk2b waren sehr ähnlich, aber einige strukturelle Unterschiede wurden identifiziert, welche zur Anwendung kommen könnten, um Bindungsselektivität zu erreichen. Eine Anzahl von 87 nicht-identischen Resten wurde identifiziert, als Mnk2b mit Mnk1 verglichen wurde. Viele von diesen sind von der aktiven Stelle entfernt lokalisiert, aber zwei interessante Unterschiede zwischen Mnk1 und Mnk2 sind Y→H in der aktiven Stelle (siehe Position 95 in SEQ ID Nr.: 4) und T→L in einer Schleife, welcher an der Substraterkennung beteiligt sein könnte (siehe Position 248 in SEQ ID Nr.: 4)
Ein Vergleich zwischen Mnk2a und Mnk2b zeigte, dass der C-Terminus, welcher der einzige unterschiedliche Abschnitt zwischen den beiden Spleissvarianten ist, sich gegen die aktive Stelle in den Modellen faltet. Dies weist auf die Möglichkeit der Identifizierung von Agenzien hin, welche Spezifität zwischen Mnk2a und Mnk2b besitzen.
BEISPIEL 7: Knock-Down von Mnk2 moduliert die Glukoseantwort in humanen Neuroblastom-Zellen
RNAi (RNA-Interferenz) bezieht sich auf die Einführung von homologer doppelsträngiger RNA (dsRNA), um auf ein Produkt eines Gens spezifisch abzuzielen, was zu Null- oder hypomorphen Phänotypen führt. Die RNAi-Technik wurde verwendet, um die Effekte auf die Glukose-Antwort in kultivierten Zellen nach dem Knock-Down der Mnk2-Proteinexpression zu untersuchen. Humane Neuroblastom-Zellen (SH-SY5y) wurden transient tranzfiziert mit einem Glukose-Response-Element, gekoppelt an ein Luciferase-Reportergen (GluREx3-Luciferase), Mnk2b oder Grundgerüst-Plasmid und [RNAi-Mnk2], und zwar unter Verwendung von LipofectAmine2000 (LifeTechnologies). Für jede Vertiefung in einer 96-Vertiefungs-Platte wurden 0,2 μg GluREx3-Luciferase, 0,07 μg Mnk2b/Grundgerüst und 0,13 μg [RNAi-Mnk2] vermischt mit 1,8 μl LA2000/μg DNA, das in 50 μl Opti-MEM (Gibco) verdünnt war. Nach 48 h wurden die Zellen unter Verwendung von 15 μ/Vertiefung an Lyse-Puffer (Tris-EDTA mit 0,25% Triton × 100) lysiert, und die Luciferase-Aktivität wurde gemessen (Luciferase-Aktivitäts-Assaykit, BioTherma).
Die Ergebnisse (3) zeigen, dass das Knock-Down der Mnk2-Protein-Expression in humanen Neuroblastoma-Zellen (SH-SY5y) durch die Verwendung von RNAi zu einer Erhöhung der Aktivität des Glukose-Response-Elementes führt. Die Überexpression von Mnk2b-Protein in den selben Zellen vermindert die Aktivität des Glukose-Response-Elementes. Diese Verminderung wird durch den Knock-Down des überexprimierten Mnk2b-Proteins neutralisiert, das heißt kombinierte Transfektion von Expressionsplasmid und RNAi in den selben Zellen.
BEISPIEL 8: NMR-Screening für Mnk2b-bindende Verbindungen
Eine Diversitäts-Bibliothek, bestehend aus relativ kleinen und hoch-wasserlöslichen Verbindungen, wurde verwendet, um natives MNK-2B hinsichtlich Bindemitteln durch NMR (kernmagnetische Resonanz) zu durchsuchen. Die verwendete NMR-Technik, um Bindemittel zu identifizieren, war die Sättigungstransferdifferenz (STD): die Protein-¹H-Resonanzen werden mittels eines schwachen Radiofrequenz-Feldes, das auf einen schmalen spektralen Bereich angelegt wird, gesättigt. Die Sättigung wird durch Spin-Diffusion auf den Rest des Proteins transferiert und anschließend weiter auf Verbindungen, welche an das Protein binden, was ihre Signale im NMR-Spektrum abschwächt. Das Spektrum wird dann von einem unter nicht-sättigenden Bedingungen erhaltenen Spektrum subtrahiert, um ein STD-Spektrum zu erhalten, das nur die Signale von mit dem Protein interagierenden Verbindungen zeigt. In der Praxis wird die Puls-Sequenz in solcher Weise geschrieben, dass die Subtraktion automatisch in jedem anderen Scan vorgenommen wird, d.h. die individuellen Spektren werden nie beobachtet (Mayer & Meyer, Angew. Chem. Int. Ed., 38, 1784-1788, 1999).
Die Verbindungen in der Bibliothek sind in Mischungen, bestehend aus je 4-8 Verbindungen, unterteilt. Jede Probe enthielt 1 μM natives MNK-2B, 200 μM Verbindungsmischung, 50 mM Natriumphosphat-Puffer, 1 mM DTT, pH 7,5 in ca. 98% D₂O/2% H₂O. Eine Probe enthielt keine Verbindungen und fungierte als eine Negativ-Kontrolle. Das Volumen war 600 μl und Standard-NMR-Röhrchen wurden verwendet. Experimente wurden auf einem 600 MHz Varian Unity NMR-Spektrometer bei 20°C durchgeführt. Als Referenz wurden bei jeder Probe ein ¹H-1D-Experiment und ein STD-Experiment aufgenommen. Die aus dem Screen identifizierten Bindemittel wurden zur Bestätigung als Einzel-Verbindung erneut eingesetzt. Für diese Nachfolge-Experimente wurden Proben, die 2 μM natives Mnk2B und 250 μM der individuellen Verbindung enthielten, verwendet. Mehrere Verbindungen, zum Beispiel 4-Hydroxybenzoesäuremethylester, wurden als Mnk2b-Liganden identifiziert.
4-Hydroxybenzoesäuremethylester
Ein Kinase-Aktivitäts-Assay gemäß Standard-Methoden zeigte, dass die identifizierten Verbindungen Mnk2-Kinaseaktivität in einer Dosis-abhängigen-Weise inhibierten. Folglich wurde gezeigt, dass es möglich ist, kleine Verbindungen als Mnk2b-Liganden zu identifizieren.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, welches die Fähigkeit eines Mnk2-Polypeptids moduliert, die Glucoseaufnahme in einer Zelle zu modulieren, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Kontaktieren eines Mnk2 (MAP-Kinase-interagierende Kinase 2)-Polypeptids mit einem Kandidatenmittel; und Bestimmen des Effektes des Kandidatenmittels auf das Vermögen des Mnk2-Polypeptids, die Glucoseaufnahme in einer Zelle zu modulieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Mnk2-Polypeptid ein Säuger-Mnk2-Polypeptid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Säuger-Mnk2-Polypeptid ein humanes Mnk2-Polypeptid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Säuger-Mnk2-Polypeptid Mnk2a ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das Mnk2a-Polypeptid die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Säuger-Mnk2-Polypeptid Mnk2b ist
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Mnk2b-Polypeptid die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 4 umfasst.
Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, welches die Fähigkeit eines Mnk2-Polypeptids moduliert, die Aktivität eines Glucose-Response-Elementes in einer Zelle zu modulieren, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Kontaktieren eines Mnk2-Polypeptids mit einem Kandidatenmittel; und Bestimmen des Effektes des Kandidatenmittels auf das Vermögen des Mnk2-Polypeptids, die Aktivität eines Glucose-Response-Elementes in einer Zelle zu modulieren.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Mnk2-Polypeptid ein Säuger-Mnk2-Polypeptid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Säuger-Mnk2-Polypeptid ein humanes Mnk2-Polypeptid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Säuger-Mnk2-Polypeptid Mnk2a ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Mnk2a-Polypeptid die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Säuger-Mnk2-Polypeptid Mnk2b ist
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das Mnk2b-Polypeptid die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 4 umfasst.
Verfahren zum Identifizieren eines Modulators der Glucoseaufnahme, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Bereitstellen einer Zelle, die ein rekombinantes Mnk2-Polypeptid exprimiert; Exponieren der Zelle an ein Kandidatenmittel; und Messen der Glucoseaufnahme in der Zelle in Gegenwart des Kandidatenmittels, wobei die veränderte Glucoseaufnahme in der Zelle in Gegenwart des Kandidatenmittels im Vergleich zur Abwesenheit des Kandidatenmittels angibt, dass das Kandidatenmittel ein Modulator der Glucoseaufnahme ist.
In vitro-Verfahren zur Modulierung der Glucoseaufnahme in einer Zelle, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Zelle mit einer Menge an einer Verbindung, die zur Modulierung der Expression oder Aktivität eines Mnk2-Polypeptids wirksam ist und somit die Glucoseaufnahme in der Zelle moduliert, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Verbindung die Expression oder Aktivität des Mnk2-Polypeptids senkt und dadurch die Glucoseaufnahme in der Zelle erhöht.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Verbindung die Kinaseaktivität des Mnk2-Polypeptids verringert.