DE60214877T2

DE60214877T2 - Transfektionskinetik und strukturelle promotoren

Info

Publication number: DE60214877T2
Application number: DE60214877T
Authority: DE
Inventors: C. Lansdale SATISHCHANDRAN; J. Catherine Lansdale PACHUK
Original assignee: Nucleonics Inc
Current assignee: Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2001-10-22
Filing date: 2002-10-22
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2022-10-23
Also published as: EP1444363A4; EP1444363B1; AU2002348372B2; AU2002348372A2; CA2464464A1; AU2008249197B2; WO2003035910A9; WO2003035910A1; DK1444363T3; DE60214877D1; EP1444363A1; ATE340271T1; AU2008249197A1

Description

Die WO 95/22623 betrifft ein Verfahren zum Nachweisen einer Zielnukleinsäuresequenz in einer Probe. Es wird wirksam die Tatsache verwendet, dass eine Sonde, die derart gestaltet ist, dass sie in der Anwesenheit einer Zielsequenz zirkularisiert bzw. sich ringförmig schließt, veranlasst werden kann, sich um den Ziel enthaltenden Nukleinsäurestrang, zum Beispiel eine DNA, zu schließen, so dass sich die zyklische Sonde einlagert und dadurch wirksam mit der nachzuweisenden Zielnukleinsäure verbunden wird. Aufgrund der helikalen Natur von doppelsträngigen Nukleinsäuren wenden sich zirkularisierte Sonden um den Zielstrang, und verbinden topologisch Sonden, um auf Moleküle durch Katemerisierung abzuzielen. Die WO 95/22623 offenbart nicht die Verwendung einer zirkularisierenden Sonde, um einen erzwungenen offenen Promotorkomplex zu bilden, um die Transkriptionsinitiation zu fördern.
Padlock Sonden, die Oligonukleotide zirkularisieren, können ein Mittel bereitstellen, um sehr große Zahlen von DNA oder RNA Sequenzen nachzuweisen, zu unterscheiden, zu quantifizieren und auch zu lokalisieren. Hierfür entwickelten Banér et al. Verfahren, die eine Kombination von High Throughput, Sensitivität und Spezifität des Nachweises bieten. Eine Padlock Sonde kann durch eine Ligase in einen Ring verwandelt werden, aber die Ligation wird inhibiert, wenn die Enden der Sonde mit ihrem Ziel eine Fehlpaarung aufweisen und die Sonde linear bleibt. Ein direkter Nachweis einer reagierten Sonde, als Katemer an eine Zielsequenz angelagert, ist möglich, und die Sichtbarmachung der gebundenen Sonde steht zur Verfügung (Banér et al. (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:11–15). Jedoch offenbaren Banér et al. nicht die Zirkularisierung von Sonden, um einen erzwungenen offenen Promotorkomplex zu bilden, um die transkriptionelle Initiation zu fördern und dadurch die Transkription einer Nukleinsäuresequenz zu steigern.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt Verfahren zum Quantifizieren und Beschreiben der Transfektionskinetiken bereit. Es wird auch ein Verfahren zur Bildung eines permanenten und transienten erzwungenen offenen Komplexes in supercoiled DNA bereitgestellt, die als starke transkriptionelle Promotoren wirken.
In einem Aspekt wird die Wirkung irgendeines Expressionselements auf die Transfektion gemessen durch (i) Transfizieren einer Wirtszelle mit mehreren subgesättigten Konzentrationen eines Vektors umfassend das Expressionselement; (ii) Messen der Aktivität eines Reporter Proteins; (iii) Messen der Expression desselben Reporter Proteins unter denselben Transfektionsbedingungen, wobei ein Vektor in identische Wirtszellen transfiziert wurde, der defizient bezüglich des untersuchten Expressionselements ist; und (iv) Vergleichen der Expressionsmengen unter Verwendung einer inversen Plot Transformation.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Exprimieren eines Proteins bereit, das aus den Schritten (i) Annealing bzw. Anlagern eines Oligonukleotids an eine supercoiled DNA, das komplementär ist zu einer DNA Sequenz oberhalb der Protein kodierenden Sequenz; (ii) Transfizieren der resultierenden supercoiled DNA in eine Wirtszelle; (iii) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression des Proteins fördern, besteht.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die supercoiled DNA ein Expressionsvektor. Bevorzugte Expressionsvektoren enthalten einen transkriptionellen Promotor, der funktionell mit einer Protein kodierenden Sequenz verbunden ist. Vorzugsweise bildet das Oligonukleotid einen Heteroduplex mit der supercoiled DNA. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Oligonukleotid komplementär zu einer natürlich vorkommenden oder künstlich eingeführten Promotorsequenz. Das Oligonukteotid besteht aus mindestens 10 Nukleotiden, vorzugsweise mindestens 20 Nukleotiden, weiter bevorzugt mindestens 30 Nukleotiden, am meisten bevorzugt mindestens 40 Nukleotiden oder sogar mindestens 50 Nukleotiden.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Exprimieren eines Proteins bereit, das die Schritte (ii) Annealing bzw. Anlagerung einer linearen einzelsträngigen DNA an die supercoiled DNA; (ii) Ligieren des 3' Endes an die lineare DNA an das 5' Ende; (iii) Transfizieren der resultierenden supercoiled DNA in eine Wirtszelle; und (iv) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression des Proteins fördern, umfasst.
In bevorzugten Ausführungsformen ist jedes des 3' Endes und des 5' Endes der linearen DNA komplementär zu mindestens 5 Nukleotiden der supercoiled DNA, weiter bevorzugt ist jedes komplementär zu mindestens 10 Nukleotiden, noch weiter bevorzugt mindestens 15 Nukleotiden, am meisten bevorzugt mindestens 20 Nukleotiden oder sogar 30 Nukleotiden. Vorzugsweise sind die Regionen der Komplementarität kontinuierlich und sind innerhalb einer Promotorregion enthalten.
Unter "Expressionselement" wird irgendein Merkmal oder eine Sequenz eines DNA Moleküls verstanden, das die Transkription oder Translation einer Nukleinsäuresequenz beeinflusst. Beispiele von Expressionselementen schließen Promotoren, Enhancer, Repressoren und Introns ein. Expressionselemente, die unter Verwendung dieser Erfindung bewertet werden können, schließen auch Proteinelemente, wie transkriptionelle oder translationale Enzyme, zum Beispiel Polymerasen oder Transkriptionsfaktoren ein.
Unter "Festlegung der Expression" wird die Wahrscheinlichkeit der Transkriptionsinitiation" verstanden. Die Festlegung der Expression wird nummerisch durch den K_m quantifiziert.
Unter "funktionell verbunden" wird verstanden, dass ein Nukleinsäuremolekül und eine oder mehrere regulatorische Sequenzen (z.B. ein Promotor) derart miteinander verbunden sind, um Expression und/oder Sekretion des Produkts (d.h. eines Polypeptids) von dem Nukleinsäuremolekül zu erlauben, wenn die geeigneten Moleküle an die regulatorischen Sequenzen gebunden sind.
Unter einem "Promotor" wird eine Nukleinsäuresequenz verstanden, die ausreichend ist, um die Transkription eines kovalent gebundenen Nukleinsäuremoleküls zu steuern.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 ist ein Graph einer Reportergen Expression als eine Funktion der Plasmid DNA Konzentration, die in dem Transfektionsverfahren verwendet wurde.
2 ist eine Reihe von Graphen, welche die β-gal enzymatische Aktivität und mRNA Mengen in RD Zellen nach Transfektion mit verschiedenen Mengen an Vektor DNA zeigen.
3 ist eine Reihe von Graphen, die zeigen, dass der Transfektionsvorgang der Steady State kinetischen Analyse zugänglich ist.
4 ist eine Reihe von Graphen, welche die β-gal Aktivität nach Transfektion unter subsättigenden Bedingungen in RD Zellen vergleichen. β-gal steht unter der Kontrolle entweder des HCMV, SCMV oder HCMVm Promotors.
5 ist ein Graph, der die β-gal Aktivität in RD Zellen nach Transfektion mit Vektoren mit entweder einem HCMV oder SCMV Promotor vergleicht. Einzelne Konstrukt Transfektionen werden mit gemischten Transfektionen verglichen.
6 ist ein Graph, der die Wirkungen von Einschluss oder Deletion des Enhancer Elements des Efα Promotors vergleicht.
7 ist ein Graph, der die Wirkungen des HCMV und Pmin Promotors auf die β-gal Expression in RD Zellen nach Transfektion unter subsättigenden Bedingungen vergleicht.
8 ist ein Graph, der die Wirkungen des HCMV und RSV Promotors auf die β-gal Expression in RD Zellen nach Transfektion unter Verwendung von subsättigenden Bedingungen vergleicht.
9 ist eine schematische offene Komplexbildung unter normalen und erzwungenen Bedingungen.
10 ist ein Schema, das die natürliche "Atmung" von supercoiled DNA und eine Strategie für die Bildung eines offenen Komplexes durch Bilden eines Heteroduplex innerhalb des Supercoils, zeigt.
11 ist ein Schema, das den molekularen Mechanismus für die Heteroduplex Bildung in einem DNA Supercoil zeigt.
12 ist ein Schema, das die Strategie zeigt, die für das Design von Oligonukleotiden verwendet wurde, die für Heteroduplex Bildung nützlich sind.
13 ist ein Graph, der die β-gal Aktivität in RD Zellen zeigt, die unter subsättigenden Bedingungen transfiziert wurden, wobei der Vektor mit einem synthetischen Oligonukleotid vor der Transfektion inkubiert wurde.
14 ist ein Graph, der die β-gal Aktivität in RD Zellen vergleicht, die unter subsättigenden Bedingungen transfiziert wurden, wobei der Vektor mit synthetischen Oligonukleotiden von verschiedenen Längen und Spezifitäten inkubiert wurde.
15 zeigt eine elektrophoretische Trennung von Vektor DNA nach Inkubation und enzymatischer Ligation mit einem ³²P-markierten "Padlock" Oligonukleotid. Die linke Figur ist eine Fotografie des Gels, das mit Ethidiumbromid gefärbt wurde. Die rechte Figur ist ein Autoradiogramm desselben Gels.
Detaillierte Beschreibung
Die Transfektion von DNA in Zellen ist der erste Schritt in der Analyse von Gen Expression. Die quantitative Analyse von Gen Expression macht es notwendig, dass die Unterschiede in der Transfektionseffizienz nicht die vergleichende Analyse von Expressionselementen beeinflusst. Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Analysieren der relativen Expression von Transfektionskonstrukten. Die Verfahren beruhen auf unserer Entdeckung, dass Transfektion ein sättigbarer Vorgang ist, und dass das Expressionsprofil eines Reporter Konstrukts der Steady State kinetischen Analyse zugänglich ist.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung, unter Verwendung der analytischen Verfahren, haben wir die Gen Promotoren durch strukturelle anstelle von Sequenzkriterien erneut definiert. Beruhend auf der Entdeckung der strukturellen Eigenschaften von Promotoren, stellen wir eine Strategie für die Bildung von "Super Promotoren" bereit, die signifikant stärker sind als die nativen Promotoren, auf denen sie beruhen. Zusätzlich kann diese Strategie verwendet werden, um eine funktionelle Promotorstelle an genetischen Stellen zu bilden, die keines der Expressionselemente kodieren.
Transfektionskinetiken
Die Expression von verschiedenen genetischen Elementen kann unter Verwendung der Standard kinetischen Konstanten, V_max und K_m, beschrieben werden. Der K_m ist eine Messung der Festlegung der Expression eines genetischen Elements. Der V_max ist eine Messung des relativen Expressionspotenzials des Elements, bei unbestimmten (nicht begrenzten) Konzentrationen von Matrizen DNA. K_m und V_max kosegregieren nicht mit denselben DNA Sequenzen. Deshalb ist es möglich, artifizielle Promotoren unter Verwendung von Elementen mit niedrigem K_m und hohem V_max zu bilden.
Die Zellkultur Transfektion führt typischerweise zu der zellulären Aufnahme von Hunderten von DNA Molekülen pro Zelle; ein Vorgang, der gesättigt werden kann.
Bei Transfektionssättigung erreichen die Protein Expressionsmengen ein Plateau, so dass weitere Anstiege von transfizierter DNA nicht zu proportionalen Anstiegen in der Gen Expression führen. Folglich müssen bedeutende und akkurate Messungen der relativen Expressionsmengen bei subsaturierenden Konzentrationen aufgenommen werden. Die subsättigenden Konzentrationen sind oft um Größenordnungen kleiner als jene, die für in vitro Transfektionen verwendet werden, und sie können geeigneter für in vivo Anwendungen sein.
Wir haben einen Matrix Transfektionsassay erfunden, der Protein Expression in dem linearen Bereich der Transfektion als eine wahre Messung der Unterschiede unter Expressionselementen misst. Der Assay erlaubt die Unterscheidung von Wirkungen der Transfektionseffizienz. Unter Verwendung dieses Assays haben wir entdeckt, dass: (1) die Transfektion sättigbar ist; (2) die Sättigung der Transfektion bei einem posttranskriptionellen Schritt stattfindet; und (3) die Kotransfektion kein verlässlicher Indikator von Transfektionseffizienz ist, wenn sie unter sättigenden Bedingungen durchgeführt wird.
Beispiel 1 – Messung der Transfektionskinetiken
Die Transfektionen wurden unter Verwendung von kationischer Lipid (Lipofectamin) komplexierter DNA in humanen Rhabdomyosarkom (RD) Zellen durchgeführt. Die Mengen an transfiziertem Reportergen Plasmid in den Transfektionsgemischen reichten von 50 ng bis 2,5 μg/Transfektion. Die Gesamtmenge an DNA pro Transfektion wurde konstant bei 2,5 μg durch Zugabe eines promotorlosen Kontroll Plasmids zu jeder Transfektionsreaktion gehalten.
Eine Vielzahl von Reporter Plasmiden wurde verwendet. Die Plasmide wurden gestaltet, um β-Galactosidase oder humane segregierte alkalische Phosphatase (SEAP) zu exprimieren, und sie enthielten verschiedene Promotorelemente einschließlich dem HCMV, SCMV, HCMVm(gfi) und den Elongationsfaktor Alpha (minimale und vollständige) Promotoren. Zusätzlich wurden Intron enthaltende und Intron lose Vektoren verglichen.
Enzym Expressionsanalyse: Die Beta-Galactosidase (β-gal) Aktivität wurde in den Lysaten von transfizierten Zellen unter Verwendung eines kolorimetrischen kinetischen Enzym Assays gemessen und gegenüber gesamtzellulärem Protein normalisiert. Die SEAB Aktivität wurde in den Medien von transfizierten Zellen gemessen. Die Expression ist als die initiale Geschwindigkeit der Reaktion für jede getestete DNA Konzentration aufgetragen. Die anfängliche Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktionen ist direkt proportional zu der Menge des anwesenden Enzyms. Die enzymatischen Assays wurden nach 1, 2 und 4 Tagen nach der Transfektion durchgeführt. Alle Vektoren, unabhängig vom Zelltyp, führten zu Transfektionssättigung. Die Sättigung fand bei Expressionsvektormengen im Bereich von 200 ng–1 μg pro 6–7 × 10⁵ Zellen statt. Die Sättigung variierte in Abhängigkeit von dem spezifischen Vektorkonstrukt und dem Zeitpunkt, der nach der Transfektion analysiert wurde.
RNA Analyse: Gesamt RNA wurde aus Zellen unter Verwendung des StrataPrep Total RNA Miniprep Kit (Stratagene) isoliert. Drei Mikrogramm Gesamt RNA wurde auf einem 1,2% Agarose-Formaldehyd Gel aufgetrennt, auf Zeta-Sonden Membran (Bio-Rad) transferiert und mit β-gal Sequenzen als Sonde inkubiert. Nach der anfänglichen Hybridisierung wurde die Membran gestrippt und hinsichtlich Actin RNA mit Sonde inkubiert. Die Sonden waren ³²P-markiert unter Verwendung von zufällig geprimter Synthese. Die resultierenden Signale wurden sichtbar gemacht und durch Phosphorimager Analyse quantifiziert. Die relativen RNA Werte wurden durch Normalisieren der β-gal RNA gegenüber Actin RNA erhalten.
Experiment#1: Die 2 zeigt repräsentative Ergebnisse von β-gal enzymatischer Aktivität und mRNA Menge, als eine Funktion der Vektor DNA Konzentration. Die Ergebnisse wurden doppelt durchgeführt. Es wurde gefunden, dass die β-gal Expression linear bis zu 1 μg transfiziertes Reporter Plasmid ist, danach waren die Expressionsmengen gesättigt. Die β-gal RNA Mengen waren linear über den gesamten Bereich der verwendeten DNA Konzentration. Die Replikate zeigten weniger als 5% Variation. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass Sättigung auf einer posttranskriptionellen Stufe stattfindet.
Subsättigende Konzentrationen von β-gal Vektor DNA wurden verwendet, um andere kinetische Eigenschaften des Transkriptionssystems zu untersuchen. Die 3 zeigt, dass die β-gal Aktivität linear, unter subsättigenden Bedingungen ansteigt, wobei die Zeit nach der Transfektion (A und B) mit der Zelldichte (C) ansteigt.
Experiment#2: Die subsättigenden Mengen von β-gal Reporter Plasmid (200 ng) wurden mit einer super gesättigten Menge eines zweiten Plasmids (2,3 μg) kotransfiziert. Das zweite Plasmid war entweder HCMV-HSVgD (exprimiert ein Proteinprodukt), HCMV0HPVL1 (exprimiert mRNA, die transkribiert, in das Zytoplasma transportiert aber nicht translatiert wird) oder pLUC (promotorloses Plasmid, das nicht transkribiert wird).
Das β-gal Protein und die mRNA wurden wie zuvor beschrieben gemessen und normalisiert. Der niedrigsten Expression von Protein und RNA wurde ein willkürlicher Wert von Eins zugewiesen, und das Verhältnis von β-gal Protein:RNA wurde verglichen.
Ungefähr gleiche Mengen an mRNA wurden von dem HCMV-HSVgD und dem HCMV-HPVL1 Plasmid hergestellt, wie durch RT-PCR gemessen wurde. Es gab keinen Unterschied in der Menge von β-gal Protein pro Einheit β-gal RNA in Zellen, die mit nicht Protein kodierenden Plasmiden kotransfiziert wurden, im Vergleich zu Zellen, die ohne ein kompetitierendes Plasmid transfiziert wurden. Jedoch wurde in Zellen, die mit Plasmiden kotransfiziert wurden, welche die Synthese eines Proteins steuerten, 14-18 fach weniger β-gal Protein pro Einheit β-gal RNA gebildet (vergleiche pLUC oder HCMV-HPVL1 mit HCMV-HSVgD). Diese Ergebnisse zeigen weiter, dass die Sättigung posttranslational stattfindet.
Experiment#3: Die kinetischen Konstanten von zwei verschiedenen Promotorkonstrukten wurden verglichen. Die 4 zeigt den inversen Auftrag von anfänglichen Geschwindigkeiten als eine Funktion von DNA Konzentration. Das V_max ist von dem Y-Achsenabschnitt und das K_m von dem X-Achsenabschnitt abgeleitet. Der HCMV Promotor, wenn er mit dem SCMV Promotor verglichen wird, zeigt Unterschiede in den anfänglichen Geschwindigkeitsraten. Deshalb wird vorhergesagt, dass diese zwei Promotoren, selbst bei sättigenden Substrat Konzentrationen, verschiedene Mengen an Aktivität (HCMV > SCMV) aufweisen. Die Ähnlichkeit der K_m Werte liegt eine ähnliche Festlegung der Katalyse nahe.
Wenn der HCMV Promotor mit der HCMVm Version verglichen wird, die eine Mutation in der gfi Box (transkriptionelle Repressorstelle) aufweist, weisen die zwei Promotoren signifikante Unterschiede in ihren anfänglichen Geschwindigkeitsraten auf, aber bei sättigenden Konzentrationen von DNA wird vorhergesagt, dass sie ähnliche Geschwindigkeiten (V_max) aufweisen. Die Promotoren weisen jedoch verschiedene K_m Werte auf, wobei die Mutante eine höhere Festlegung der Katalyse (geringerer K_m) zeigt. Die K_m Unterschiede spiegeln Unterschiede in Ereignissen wieder, die zur Transkriptionsinitiation führen, die von Unterschieden in der Affinität für die Transkriptionsmaschinerie herrühren. Die V_max Unterschiede reflektieren in den meisten Fällen die Aktivität nach Transfektion mit unbestimmten DNA Konzentrationen.
Experiment#4: Die relative Aktivität des HCMV Promotors und des SCMV Promotors in RD Zellen wurde verglichen (5). Die Transfektion wurde im linearen Bereich der DNA Konzentration durchgeführt, und die Enzym Aktivitätsergebnisse wurden hinsichtlich der Unterschiede in der Transfektionseffizienz korrigiert. Die HCMV und SCMV β-gal Expressionsvektoren waren in allen Aspekten zueinander identisch, mit der Ausnahme der Promotorsequenzen.
Die RD Zellen wurden mit dem HCMV β-gal Reporter Plasmid, dem SCMV β-gal Reporter Plasmid oder einem Gemisch der zwei Plasmide (H + SCMV) transfiziert. Für einzelne Plasmid Transfektionen betrugen die Reporter Plasmid DNA Mengen 50–400 ng. Die Gesamt DNA pro Transfektion wurde konstant bei 2,5 μg durch Zugabe eines promotorlosen Kontroll Plasmids gehalten. Für die gemischte Plasmid Transfektion (H + SCMV) wurden gleiche Mengen jedes Plasmids verwendet (z.B. die 50 ng Transfektion enthielt 25 ng jedes Plasmids).
Die relative Expressionsmenge von HCMV gegenüber SCMV (2,022) ist von dem Verhältnis der Steigungen (1,998 ÷ 0,988) abgeleitet. Die Unterschiede können jedoch Variationen in den Transfektionseffizienzen anstelle von wahren Unterschieden in relativen Expressionsmengen wiederspiegeln. Die Variationen in der Transfektionseffizienz wurden in einer gemischten Transfektion gemessen.
Wenn keine Unterschiede in der Transfektionseffizienz zwischen den HCMV und SCMV Präparationen existieren, wird eine gemischte Plasmid Transfektion zu einer theoretischen Steigung von 1,493 führen. Die Anwesenheit von Inhibitoren oder Enhancern der Transfektion in einer der Präparationen würde die theoretische Steigung ändern. Tatsächlich bildete die gemischte Transfektion eine geringere Steigung (1,195) als die theoretische Steigung, was anzeigt, dass die verringerte Expression von SCMV teilweise ein Ergebnis von Unterschieden in der Transfektionseffizienz war. Die Menge von Repression, die durch Transfektionsinhibition verursacht wurde, kann durch Teilen der theoretischen Steigung durch die Steigung von H + SCMV; 1,255 in diesem Experiment, berechnet werden. Die Expression von SCMV wird anschließend durch Multiplizieren des experimentellen Werts (0,988) mit dem Repressionsfaktor (1,255) korrigiert. Die wahre relative Aktivität wird anschließend durch Dividieren der HCMV Aktivität durch die korrigierte SCMV Aktivität bestimmt.
Experiment#5: Dieselbe kinetische Analyse wurde durchgeführt, um die Wirkungen von anderen Promotoren und anderen genetischen Elementen zu untersuchen. Die 6 zeigt die Wirkung des Enhancer Elements auf den Elongationsfaktor Alpha Promotor EfαP, wobei Pe der minimale EF Promotor, der native Enhancer und die kodierende Sequenz ist. Das Px Konstrukt besteht aus dem minimalen EF Promotor und der kodierenden Region; das native Enhancer Element ist deletiert. Der inverse Auftrag zeigt, dass das Enhancer Element die Festlegung des Promotors zur Transkription (steigert K_m) verringert, aber die maximale Geschwindigkeit erhöht, mit der das Gen transkribiert wird (steigert V_max).
Ein anderes Experiment (7) vergleicht die Kinetiken des HCMV Promotors mit dem Efα1P ohne den Enhancer (Pmin). Der inverse Auftrag zeigt, dass der HCMV Promotor eine relativ starke Festlegung der Transkription aufweist. Deshalb wird erwartet, dass der HCMV Promotor bei einer niedrigen Kopienzahl aktiv ist, und dass er unter subsättigenden Transfektionsbedingungen verwendet werden kann.
Die 8 vergleicht die Kinetiken des HCMV Promotors mit dem Rous Sarkom Virus Promotor (RSV). Beide Promotoren sind ungefähr gleich auf die Transkription festgelegt; jedoch wird der HCMV Promotor zu höheren Expressionsmengen bei irgendeiner Konzentration von transfizierter DIVA führen.
Die Experimente, die in 6–8 gezeigt sind, wurden hinsichtlich Unterschieden in der Transfektionseffizienz kontrolliert. In allen Fällen führte das Gemisch von zwei Plasmiden zu einer β-gal Aktivität zwischen der Aktivität, die mit jedem Vektor alleine beobachtet wurde. Deshalb war keine Effizienzkorrektur notwendig.
Beispiel 2 – Kartierung von Promotorelementen unter Verwendung eines genetischen Ansatzes
Die Sequenzelemente, die zu K_m und V_max Wirkungen beitragen, können durch zufällige Mutation entweder in vitro (PCR beruhend, Sequenz Shuffling, Mutagenese) oder in vivo in Bakterien oder eukaryonten Zellen mit Plasmiden mit einer Kopie oder multiplen Kopien oder integrierten Sequenzen (Retroviren, zufällige Integration, CreLox) kartiert werden. Sobald sie identifiziert sind, können die Sequenzelemente zusammen gespleißt werden, um den gewünschten Promotoreffekt zu erhalten, wie einen Promotor mit einem niedrigem K_m und einem hohem V_max.
Die beschriebene Methodik des kinetischen Testens ist nicht auf die Promotorbewertung beschränkt. Diese Techniken können verwendet werden, um die Wirkungen irgendwelcher transkriptioneller oder translationaler Kontrollelemente zu messen, wobei Promotoren nur ein Beispiel sind. Diese Verfahren sind auch für die Optimierung von Transfektionsbedingungen verwendbar.
Beispiel 3 – Erzwungener offener Promotorkomplex
Die Funktion eines Promotors ist es, die Transkriptionsinitiation, den geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt der Transkription zu beeinflussen. Der traditionelle Ansatz, die Promotorfunktionalität zu verbessern, lief über die Identifizierung und Optimierung von Nukleinsäuresequenzen mit gewünschten Eigenschaften, die zu einer hohen Menge der Transkriptionsinitiation führen. Bis heute waren Versuche, einen unregulierten Promotor herzustellen, nicht erfolgreich.
Die Geschwindigkeit der Transkriptionsinitiation ist durch die offene Komplexbildung begrenzt (Schmelzen der transkriptionellen Startstelle), und sie ist abhängig von der Promotorsequenz und den Transkriptionsfaktoren, welche die Promotorsequenzen binden (9). Eine Blase von nicht basengepaarter DNA gleicht der Transkriptionsblase, die mit den offenen Promotorkomplexen assoziiert ist. Die Transkription dieser Blasen wird im Übermaß von einhundertfach relativ zu den vollständig duplizierten Promotorelementen stimuliert, was nahelegt, dass das Blockieren der vollständigen Basenpaarung innerhalb einer Promotorsequenz offene Promotorkomplexe bilden kann.
Supercoiled DNA schlägt einzelsträngige DNA Schleifen aus, um Torsionsstress abzubauen. Die Schleifenbildung ist zufällig und dynamisch (10). Wenn die Oligonukleotid Konzentrationen hoch im Vergleich zu den Plasmid Konzentrationen sind, dann werden die Schleifen sich an komplementäre Oligonukleotide anstelle des Partner Plasmid Strangs anlagern. Dies bildet einen Heteroduplex. Weiterhin zeigt die Verwendung von Kaliumpermanganat als Sonde, dass die Regionen der Plasmid DNA auf jeder Seite des angelagerten Oligonukleotids nicht mit dem Partner Plasmid DNA Strang basengepaart sind. Diese Basenpaarung ist wahrscheinlich thermodynamisch ungünstig. Der Heteroduplex zwischen dem Oligonukleotid und dem supercoiled Vektor, was einen freien einzelnen Strang in dem Vektor bildet, bildet einen offenen Promotorkomplex, der die transkriptionelle Initiation fördert.
Ein unregulierter oder "Super Promotor" würde gebildet, wenn der Heteroduplex für einen unbestimmten Zeitraum stabilisiert würde. Wir haben entdeckt, dass die Stabilisierung durch das Bilden eines Heteroduplex "Padlock" in der Promotorsequenz verstärkt ist. Das DNA Padlocking wird durch Inkubieren von supercoiled Plasmiden mit einer relativ hohen Konzentration (1000-fach molarer Überschuss) einer linearen DNA (Padlock) mit einem 5' Ende, das komplementär ist zu dem 3' Ende der Zielsequenz, und einem 3' Ende, das komplementär ist zu dem 5' Ende der Zielsequenz, durchgeführt. Die Regionen der Komplementarität des 5' und 3' Endes der DNA müssen kontinuierlich sein und sollten mindestens 10 Nukleotide lang sein. Die sich zwischenlagernde Verbindungssequenz kann eine zufällige Sequenz sein, die nicht komplementär zu irgendeinem Abschnitt des Vektors ist, oder sie kann eine Sequenz sein, die für das Targeting oder transkriptionelle Zwecke nützlich ist. Beispiele von nützlichen, nicht zufälligen Sequenzen schließen Sequenzen ein, welche die RNA Polymerasebindung fördern. Anschließend zu dem Annealen der Vektor DNA und der Padlock DNA wird die Padlock DNA durch chemische oder enzymatische Mittel ligiert (11). Die Ligation des 5' und 3' Endes der Padlock DNA bildet eine "geknotete" Struktur, wobei die Padlock DNA um die Vektor DNA einmal pro ungefähr alle zehn Nukleotide gewickelt wird. Der resultierende Heteroduplex ist deshalb unbestimmt stabilisiert, bildet einen permanenten erzwungenen offenen Komplex und sollte durch transkriptionelle Repressoren oder einen Mangel an transkriptionellen Enhancern nicht beeinflusst werden.
Erfindungsgemäß ist diese Technik nicht auf die Verwendung der zuvor identifizierten Promotorsequenzen begrenzt. Ein permanenter erzwungener offener Komplex kann mit irgendeiner DNA Sequenz gebildet werden, und er wirkt, um die Transkription der nachfolgenden Sequenz zu fördern.
Experiment#1: Drei Oligonukleotide (38-mere), die komplementär zu den Regionen des HCMV Promotors sind, wurden synthetisiert (12). Das HCMV-β-gal Plasmid (oben beschrieben) wurde mit einem der Oligonukleotide komplexiert und anschließend in RD Zellen transfiziert. Wenn sie mit der β-gal Expression, die durch den nicht modifizierten HCMV Promotor gesteuert wird, verglichen wurden, verstärkten alle drei Oligonukleotide signifikant die Expression nach Transfektion unter subsättigenden Bedingungen. Der größte Expressionsanstieg wurde mit dem Oligonukleotid beobachtet, das komplementär sowohl zu der CAT als auch der TATA Box war (13). Jedoch zeigt das Ergebnis von SC003, das weder an die CAT noch an die TATA Box bindet, dass die Anwesenheit eines offenen Komplexes in der Nähe der transkriptionellen Startstelle zu signifikant gesteigerter Expression führt.
Experiment#2: Um die strukturellen Bedürfnisse für die Promotoraktivität bei einem erzwungenen offenen Komplex weiter zu definieren, wurden neue Oligonukleotide hergestellt. SC1001 ist ein 38-mer, das mit den CAT und TATA Boxen des HCMV-β-gal Plasmids überlappt. SC1002 ist ein 45-mer, das SC1001 enthält, aber sich in Richtung der +1 Stelle erstreckt. SC1003 ist ein zufälliges 45-mer mit derselben Nukleotidzusammensetzung wie SC1002, aber ohne Komplementarität in irgendeiner Region des Plasmids. 14 zeigt, dass nach Inkubation mit dem Vektor (Oligonukleotide in 1000-fach molarem Überschuss) beide der komplementären Oligonukleotide als starke Promotoren mit sehr niedrigen K_m Werten wirken. Es wurde kein signifikanter Unterschied in dem V_max beobachtet. Der erzwungene offene Komplex weist einen K_m Wert von mindestens mehreren hundertfach weniger als der native HCMV Promotor auf, was nahe legt, dass dieses Konstrukt bei nur einigen wenigen oder sogar einer einzelnen Kopie pro Zelle aktiv sein wird.
Experiment#3: Das HCMV-β-gal Plasmid (Konstrukt 017) und das peaShooter Plasmid (Invitrogen) wurden auf 95°C erhitzt, um eine gemischte Lösung von linearer, geöffneter (nicked) und supercoiled Plasmid DNA herzustellen. Die Plasmid DNA wurde mit linearer Padlock DNA (³²P-markiert) inkubiert, wobei die 5' und 3' Enden zu einer kontinuierlichen 38 Nukleotidsequenz komplementär sind, welche die CAT und TATA Box des HCMV Promotors abdeckt. Nach dem Annealen wurde die Padlock DNA unter Verwendung einer thermostabilen Ligase (Epicenter Inc., Wisconsin, USA) ligiert und auf einem Agarose Gel aufgetrennt. 15 ist eine Fotografie des Agarose Gels, das mit Ethidiumbromid gefärbt wurde, was die Anwesenheit von allen drei Formen der DNA (supercoiled, nicked und linear) zeigt. Ebenfalls eingeschlossen ist eine Autoradiogramm desselben Gels, was zeigt, dass nur die supercoiled DNA in der Lage ist, ein Padlock zu bilden. Zusätzlich band das Padlock nicht an das Kontroll Plasmid.
Andere Ausführungsformen
Aus der vorherigen Beschreibung ist offensichtlich, dass Variationen und Modifikationen an der hier beschriebenen Erfindung durchgeführt werden können, um sie an die verschiedenen Verwendungen und Bedingungen anzupassen. Solche Ausführungsformen liegen innerhalb des Schutzumfangs der folgenden Patentansprüche.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines erzwungenen offenen Promotorkomplexes, wobei der erzwungenen offene Promotorkomplex eine verstärkte Transkription einer Nukleinsäuresequenz fördert, das Verfahren umfasst die Schritte: (i) Annealing eines linearen einzelsträngigen Oligonukleotids, umfassend ein 5'-Ende und ein 3'-Ende an ein supercoiled doppelsträngiges DNA Plasmid, umfassend die Nukleinsäuresequenz, wobei das 5'-Ende und das 3'-Ende des Oligonukleotids jeweils annealt an bzw. einen Heteroduplex bildet mit mindestens fünf Nukleotiden, innerhalb einer einzelsträngigen Schleife des supercoiled DNA Plasmids, was einen freien einzelnen Strang in dem Plasmid oberhalb der Nukleinsäuresequenz bildet; und (ii) Ligieren des 5'-Endes des Oligonukleotids an das 3'-Ende des Oligonukleotids, um ein ringförmig geschlossenes Oligonukleotid zu bilden; wodurch der erzwungene offene Promotorkomplex gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ligieren des 5'-Endes des Oligonukleotids an das 3'-Ende des Oligonukleotids den erzwungenen offenen Promotorkomplex stabilisiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das 5'-Ende des Oligonukleotids an ein oberhalb gelegenes Ende einer Zielsequenz der supercoiled DNA annealt und das 3'-Ende des Oligonukleotids an ein unterhalb gelegenes Ende der Zielsequenz annealt, wobei die oberhalb und unterhalb gelegenen Enden der Zielsequenz eine benachbarte Sequenz der supercoiled DNA umfassen und wobei die Ligation des annealten 5'-Endes des Oligonukleotids an das annealte 3'-Ende des Oligonukleotids den erzwungenen offenen Promotorkomplex bildet, wobei der erzwungene offene Promotorkomplex das Annealen von komplementären Strängen der Zielsequenz des supercoiled DNA Plasmids verhindert und die Transkription der Nukleinsäuresequenz unterhalb der Zielsequenz fördert.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Zielsequenz eine Promotorregion der supercoiled DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Promotorregion natürlich vorkommt oder künstlich eingeführt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die supercoiled DNA ein Expressionsvektor ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der erzwungene offene Promotorkomplex für einen unbestimmten Zeitraum stabil ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid mindestens 10 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 20 Nukleotide, weiter bevorzugt mindestens 30 Nukleotide, noch weiter bevorzugt mindestens 40 Nukleotide und am meisten bevorzugt mindestens 50 Nukleotide umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Oligonukleotid weiterhin eine dazwischenliegende Verbindungssequenz umfasst, die das 5'-Ende mit dem 3'-Ende verbindet.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die dazwischenliegende Verbindungssequenz keine Region der Komplementarität mit der supercoiled DNA aufweist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die dazwischenliegende Verbindungssequenz eine Sequenz umfasst, die für das Targeting oder transkriptionelle Zwecke verwendet werden kann.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die dazwischenliegende Verbindungssequenz eine Sequenz umfasst, welche die RNA Polymerasebindung fördert.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Zielsequenz eine TATA oder CAT Box ist, die oberhalb von der Transkriptionsinitiationsstelle der Nukleinsäuresequenz liegt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei mindestens 10 benachbarte Nukleotide der supercoiled DNA mit dem 5'- und/oder 3'-Ende des Oligonukleotids basengepaart sind.
Zusammensetzung, umfassend ein supercoiled doppelsträngiges DNA Plasmid und ein lineares einzelsträngiges Oligonukleotid, das an eine Region des supercoiled DNA Plasmids annealt ist, wobei das Oligonukleotid einen Heteroduplex mit dem supercoiled DNA Plasmid bildet und einen freien Einzelstrang in dem supercoiled DNA Plasmid bildet, wobei das lineare einzelsträngige Oligonukleotid ein 5'-Ende und ein 3'-Ende umfasst, wobei das 5'-Ende des Oligonukleotids mindestens fünf Nukleotide umfasst, die an ein oberhalb gelegenes Ende einer Zielsequenz des supercoiled DNA Plasmids annealt sind, und das 3'-Ende des Oligonukleotids mindestens fünf Nukleotide umfasst, die an ein unterhalb gelegenes Ende der Zielsequenz annealt sind, die oberhalb und unterhalb gelegenen Enden der Zielsequenz eine benachbarte Sequenz des supercoiled DNA Plasmids umfassen; wobei die Zusammensetzung einen erzwungenen offenen Promotorkomplex umfasst, der das Annealen von komplementären Strängen der Zielsequenz des supercoiled DNA Plasmids verhindert und die Transkription einer Nukleotidsequenz unterhalb der Zielsequenz fördert.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die Ligation des 5'-Endes des Oligonukleotids an das 3'-Ende des Oligonukleotids einen stabilisierten, erzwungenen offenen Promotorkomplex bildet.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei der stabilisierte, erzwungene offene Promotorkomplex für einen unbestimmten Zeitraum stabil ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das supercoiled DNA Plasmid ein Expressionsvektor ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die Zielsequenz eine Promotorsequenz ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei die Promotorsequenz natürlich vorkommt oder künstlich eingeführt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das Oligonukleotid mindestens 10 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 20 Nukleotide, weiter bevorzugt mindestens 30 Nukleotide, noch weiter bevorzugt mindestens 40 Nukleotide und am meisten bevorzugt mindestens 50 Nukleotide umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das Oligonukleotid weiterhin eine dazwischenliegende Verbindungssequenz umfasst, die das 5'-Ende mit dem 3'-Ende verbindet.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei die dazwischenliegende Verbindungssequenz keine Region der Komplementarität mit der supercoiled DNA aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei die dazwischenliegende Verbindungssequenz eine Sequenz umfasst, die für das Targeting oder transkriptionelle Zwecke verwendet werden kann.
Zusammensetzung nach Anspruch 24, wobei die dazwischenliegende Verbindungssequenz eine Sequenz umfasst, welche die RNA Polymerasebindung fördert.
Zusammenfassung nach Anspruch 15, wobei die Zielsequenz eine TATA oder CAT Box ist, die oberhalb von der Transkriptionsinitiationsstelle der Nukleinsäuresequenz liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei mindestens 10 benachbarte Nukleotide der supercoiled DNA mit dem 5'- und/oder 3'-Ende des Oligonukleotids basengepaart sind.