DE4306338C1 - Verfahren zur Bestimmung der biologischen Funktion und/oder Charakterisierung von DNA und RNA Sequenzen von Organismen - Google Patents

Description

Verfahren zur Bestimmung der Funktion und/oder Charakterisierung von Nukle­ insäure-Fragmenten von Genomen verschiedener Organismen aus der Reihenfolge der Basen in ihren DNA- oder RNA-Sequenzen.

Die Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 1 bis 4 angegebene Verfahren zur Bestimmung der biologischen Funktion und/oder Charakterisierung von DNA- und RNA-Sequenzen von Organismen.

Wichtige technische Gebiete, zu denen die Erfindung gehört, sind:

• - Analyse von DNA und RNA, die genetische Verfahrenstechnik betreffen;
• - Aufklärung der biologischen Funktion bzw. Charakterisierung von DNA und RNA komplette Einheiten oder Fragmente (kurz auch Sequenzen genannt), deren Basen-Reihenfolge bekannt ist;
• - physikalische und/oder informationstheoretische Analyse von DNA und RNA;
• - Identifikation und/oder Lokalisierung von Genen in neu sequenzierter DNA;
• - Identifikation und/oder Lokalisierung von Exons und Introns in neu sequen­ zierter DNA;
• - Herstellung neuer und/oder Ergänzung vorhandener, Datenbanken, die DNA- und RNA-Sequenzen von Organismen enthalten.

Diese Auflistung ist nicht vollständig; vgl. auch die Ausführungen zum "Stand der Technik" und zum "zugrundeliegenden technischen Problem" weiter unten.

Zum Stand der Technik, die für das Verständnis und technische Relevanz der Erfindung von Wichtigkeit ist, sei folgendes angeführt:

Während der letzten zehn bis zwanzig Jahre ist es - durch eine beträchtliche Anzahl von Erfindungen und Entdeckungen - ermöglicht worden, die Sequenzierung (d. h., die Bestimmung der Reihenfolge der Basen) von DNA zu automatisieren. Als Folge davon ist eine immens große Menge von DNA- (und RNA-) Sequenzen heute bekannt. Diese Daten sind in Datenbanken zusammengefaßt; als Beispiele seien die Datenbanken EMBL (European Molecular Biology Laboratory) und GenBank genannt. Diese Datenbanken werden ständig aktualisiert, und somit wächst auch ihr Umfang kontinuierlich. Solche Datenbanken, die sowohl für die Forschung als auch für die Biotechnologie absolut unverzichtbar sind, sind kommerziell erhältlich.

Diese Entwicklung ist kürzlich sogar beschleunigt worden, und zwar durch den Start des multinationalen "Human Genome Project" (öfters mit HUGO abgekürzt). Die Gesamtkosten dieses Projektes, das die Sequenzierung des gesamten menschli­ chen Genoms zum Ziel hat, wurden bekanntlich mit drei Milliarden (3 · 10⁹) US-Dollar abgeschätzt. (An diesem Projekt beteiligen sich sowohl Forschungsanstalten als auch industrielle Einrichtungen). Die dadurch erwartete riesige Datenmenge (ungefähr 2,9 Milliarden Basen) - in Zusammenhang mit den bisherigen arbeitsintensiven und kostspieligen Analysen kleiner DNA-Fragmente - lassen schon jetzt die potenti­ elle wirtschaftliche Bedeutung eines Verfahrens, wie das im Teil "Patentansprüche" beschriebene, deutlich erkennbar werden.

Es hat schon mehrere - meistens erfolglose - Versuche gegeben, aus der Kennt­ nis der Sequenz eines DNA- oder RNA-Fragments Schlüsse über seine biologische Funktion zu ziehen. Als Beispiele seien hier drei der neuesten - soweit dem Antrag­ steller bekannt - diesbezüglichen Publikationen genannt:
C.-K. Peng et al., Nature, Vol. 356, Seiten 168-170 (1992);
R. F. Voss, Physical Review Letters Vol. 68, Seiten 3805-3808 (1992);
W. Li, Europhysics Letters Vol. 17, Seiten 655-660 (1992).

Die in diesen Publikationen dargestellten Methoden zur Analyse der DNA basieren auf der Verteilung der einzelnen Basen (A, C, G und T), oder der Verteilung von Purinen (A und G) gegenüber Pyrimidinen (C und T), in der jeweils betrachteten Sequenz. Eine aufgestellte Behauptung dabei war, daß man Unterschiede zwischen Intron-enthaltenden und Intron-freien Sequenzen festgestellt hat (vgl. die Publika­ tionen von Peng et al. und Li). Dies könnte natürlich von immenser Wichtigkeit sein, z. B. bei der routinemäßigen Analyse von DNA. Neueste Publikationen weisen jedoch zweifelsfrei nach, daß diese Behauptung irrtümlich ist; vgl. z. B. V. V. Prabhu und J.-M. Claverie, Nature Vol. 359, Seite 782 (1992), C. A. Chatzidimitriou-Dreismann und D. Larhammar, Nature Vol. 361, Seiten 212- 213 (1993).

Voss dagegen behauptet, daß er Unterschiede zwischen DNA′s verschiedener evolu­ tionärer Kategorien von Organismen feststellen kann. Leider sind die festgestellten Unterschiede zwischen einzelnen DNA-Sequenzen beträchtlich größer als diejenigen zwischen Kategorien von Organismen; somit ist der Befund von Voss ohne prakti­ sche Relevanz, d. h. nur von "akademischem" Interesse.

Der in den Patentansprüchen angegebenen Erfindung liegt das technische Pro­ blem zugrunde, Informationen zu der biologischen Funktion (oder den Funktionen) bzw. zur Charakterisierung von DNA- und RNA-Sequenzen aus der Kenntnis der Reihenfolge der Basen in diesen Sequenzen zu gewinnen, und hiermit die Kosten und den Zeitaufwand der schon bekannten Gen-analytischen Verfahren zu erniedrigen.

Das zugrundegelegte technische Problem wird durch die in den Patentansprüchen aufgeführten Merkmale (genauer: durch die in den kennzeichnenden Teilen der Pa­ tentansprüche aufgeführten Verfahrensschritte) gelöst. Der Gegenstand der vorlie­ genden Erfindung (bzw. die Lehre zum technischen Handeln, bzw. der Erfindungs­ gedanke) besteht aus dieser Lösung.

An dieser Stelle könnten die folgenden ergänzenden Bemerkungen angebracht sein. Nach gültiger Rechtslage braucht der Erfinder keine wissenschaftlich stichhaltige Erklärung für die Funktionsweise seiner Erfindung zu geben, insbesondere braucht er nicht die diesbezüglichen physikalischen oder chemischen Ursachen darzulegen. We­ gen dem - nach Meinung des Erfinders - hohen Neuheitsgrad der dem Erfindungs­ gedanken zugrundeliegenden Lehre, sollten doch einige diesbezügliche physikalische Grundlagen, die als Erläuterung der Erfindung für den Fachmann von gewissem In­ teresse sein könnten, kurz erwähnt werden:

• (A) Üblicherweise wird die DNA-Struktur dadurch bestimmt, daß man die Kerne der beteiligten Atome als klassische Partikeln betrachtet und nur die Elektronen quan­ tenmechanisch behandelt.(Dies ist die sogenannte Born-Oppenheimer Näherung). Neuere Untersuchungen zeigten jedoch, daß Protonen (bzw. H Atome), wegen ihrer kleinen Masse, unter gewissen Bedingungen auch Quanteneigenschaften vorweisen; siehe, z. B., C. A. Chatzidimitriou-Dreismann, Advances in Chemical Physics, Vol. 80, Seiten 201-314 (1991). Solche Effekte wurden inzwischen in Wasser, wäßrigen Lösungen und organischen Kristallen untersucht und nachgewiesen.
• (B) Weitere Untersuchungen ergaben, daß die Protonen der H-Bindungen in Watson- Crick-Basenpaaren, die die zwei Stränge der DNA-Doppelhelix zusammenhalten, un­ ter gewissen Umständen ähnlich geartete Quanteneffekte zeigen können.
• (C) Weiterführende Untersuchungen (noch nicht veröffentlicht) ergaben, daß die die­ sen Effekten zugrundeliegende quantenmechanische Theorie sich weiter entwickeln läßt, mit dem Ziel, Quanteneffekte zwischen Protonen der H-Bindungen entlang der Achse der DNA-Doppelhelix (in der biologisch aktiven B-Form) erstmalig vorauszu­ sagen.
• (D) Ein neues Resultat (noch nicht veröffentlicht) dieser Forschungsarbeiten ist, ver­ einfacht formuliert, daß die in den Patentansprüchen definierten Klassen K1 solche Paare benachbarter Basen enthalten, die einen hohen Grad an Quanteninterferenz zwi­ schen einigen Protonen der H-Bindungen aufweisen (und zwar zwischen denjenigen, welche nahe der DNA-Achse an der großen Furche positioniert sind), wohingegen die zu den Klassen K2 gehörenden Paare diese Quanten-Eigenschaft in kleinerem Maße oder gar nicht besitzen. (Die hier genannten Paare benachbarter Basen befinden sich an ein und demselben DNA-Strang und sollten deswegen nicht mit Watson-Crick- Basenpaaren verwechselt werden). In moderner Terminologie kann man sagen, daß der betrachtete Effekt "Quantenkorrelationen zwischen Protonen" repräsentiert.

Die Art und Weise, in der der Gegenstand der Erfindung gewerblich anwend­ bar ist, ergibt sich offensichtlich aus den obigen Ausführungen zum Stand der Tech­ nik und zum zugrundeliegenden technischen Problem, aus den folgenden Angaben zu vorteilhaften Wirkungen der Erfindung, sowie auch aus den Ausführungsbeispielen.

Es folgt die Beschreibung einiger Ausführungsbeispiele.

Das erste Beispiel betrifft die Analyse der DNA-Sequenz des Sendai-Virus (Da­ tenbank: EMBL; Identifikationszeichen: ID=SNDZSTR; Sequenzlänge: N=15384; weiteres Charakteristikum: "complete coding sequence").

Durch das im Patentanspruch 1 beschriebene Verfahren (Merkmale c und d, samt aller Untermerkmale) wird daraus die numerische Sequenz S* eindeutig erzeugt. Eine einfache numerische Methode (Merkmal e) ist durch die Korrelationsfunktion gege­ ben, die im wesentlichen folgendermaßen definiert ist:

Meistens wird daraus der "konstante Untergrund" C*(∞) subtrahiert, was wohl der Anschaulichkeit dient. Üblich - aber keineswegs notwendig - ist auch die Normierung auf die Varianz σ² der Elemente von S*, sodaß man endgültig für die Korrelationsfunktion C(l) schreiben kann

l ist der Abstand zwischen zwei (beliebigen) Elementen der Sequenz S* und somit auch der Abstand zwischen den entsprechenden Paaren benachbarter Basen der ur­ sprünglichen DNA-Sequenz. Der aktuelle Wert der Funktion (C(l) ist bekanntlich das übliche Maß für die Stärke der (möglicherweise existierenden) Korrelation der entsprechenden Elemente (bzw. Paaren von Basen).

In der ersten Zeichnung (Fig. 1) ist die hierdurch berechnete Korrelationsfunktion des Sendai Virus für die ersten 150 Werte des Abstandes l dargestellt. Es ist so­ fort ersichtlich, daß C(l) eine periodische Oszillation der Periode 3 aufweist. Diese überraschende Periodizität hat eine sehr lange Reichweite: sie ist bis zum Abstand l=1500 sofort und klar ersichtlich.

Das zweite Beispiel betrifft die DNA-Sequenz des Lambda Phagen (Datenbank: EMBL; Identifikationszeichen: ID=LAMBDA; Sequenzlänge: N=48502; weiteres Charakteristikum: "complete genome").

In der zweiten Zeichnung (Fig. 2) ist die zugehörige Korrelationsfunktion C(l) dar­ gestellt, welche nach den im ersten Beispiel dargestellten Schritten völlig analog berechnet wurde. Auch hier ist die periodische Oszillation der Periode 3 klar er­ sichtlich. Weitere Rechnungen zeigen, daß hier jedoch diese Periodizität ungefähr bei l=600 zerfällt.

Das dritte Beispiel betrifft die DNA-Sequenz eines menschlichen Intron-Fragments (Datenbank: EMBL; Identifikationszeichen: ID=HSHBEG; Sequenzlänge: N= 11128; weiteres Charakteristikum: "from intergenic region of globin genes"). Die berechnete Korrelationsfunktion C(l) (siehe Fig. 3) zeigt, daß es im vorliegenden Fall die in den anderen zwei Beispielen ersichtliche Periodizität nicht gibt. (Weitere Rechnungen haben weiterhin gezeigt, daß die Korrelationsfunktion zu dieser DNA- Sequenz keine einfach strukturierte Periodizität oder Muster aufweist).

Umfangreiche weitere Untersuchungen (noch nicht veröffentlicht) haben zweifels­ frei gezeigt, daß solche Periodizitäten (bzw. Oszillationen) der Korrelationsfunktion für viele eukariontische und fast alle prokariontischen Protein-kodierende Genome charakteristisch sind. (Vermutlich existiert ein - noch nicht bekannter - intrin­ sischer Zusammenhang mit dem bekannten genetischen Code der Translation, was jedoch für die Anwendung des Verfahrens ohne Belang ist). Weiterhin hat sich ge­ zeigt, daß sowohl die Reichweite der durch die Korrelationsfunktion C(l) quantitativ erfaßten Korrelationen, als auch die durch die Größe von C(l) quantitativ erfaßte Korrelationsstärke, zwischen den verschiedenen Organismen signifikant variieren.

Die in den obigen Patentansprüchen genannten verschiedenen Klassen K1 (siehe Merkmale c.1, f, g und h) repräsentieren verschiedene mögliche Varianten für die oben erwähnten Quantenkorrelationen zwischen den beteiligten Protonen. Die Un­ tersuchung der biologischen Relevanz dieser Varianten (bezüglich verschiedener Arten von DNA) ist völlig analog der in den drei Beispielen dargestellten Vorgehensweise durchführbar.

Zur weiteren Ausgestaltung der Erfindung sei folgendes erwähnt: Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist durch die obigen Beispiele demon­ striert. Hier sei ausdrücklich darauf hingewiesen, daß die in den Beispielen benutzte Korrelationsfunktion zwar eine einfache, jedoch nur eine aus vielen möglichen ma­ thematischen Analysemethoden darstellt (vgl. Merkmal e der Patentansprüche). Weitere geeignete numerische Methoden werden vom Erfinder zur Zeit untersucht. Zur Ausgestaltung der Erfindung gehört auch die Erweiterung ihres Anwendungs­ bereiches. Diesbezüglich sei die Veränderung der Bindungsstärke eines Proteins an einem DNA-Fragment beim Vorliegen verschiedener Mutationen dieses Fragments erwähnt. Laufende Untersuchungen zeigen, daß die Analyse der DNA-Mutanten an­ hand der oben genannten Klassen K1 bei der Bestimmung der optimal bindenden DNA brauchbare Resultate liefern kann. Diese Anwendungsmöglichkeit wäre für die Entwicklung neuer Medikamente (das sogenannte Drug Design) von Interesse.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß die für die biologische Analyse (Untersuchung, Charakterisierung) großer Mengen von neu sequenzierter DNA (oder RNA) erforderlichen langwierigen Arbeitsvorgänge ver­ einfacht werden, der dazu gehörige Zeitaufwand reduziert wird, und dadurch auch die dazu gehörigen Kosten erniedrigt werden. Diesbezüglich sei auf das oben erwähnte Human Genome Project (HUGO) hingewiesen, in dessen Rahmen menschliche DNA sequenziert wird, die, wie bekannt, ungefähr aus 90% Introns besteht. Nun sind die pharmazeutischen und die biotechnologischen Industrien größtenteils an Protein­ kodierenden DNA-Teilen interessiert, und nicht an Introns. Es ist also offensichtlich, daß ein Verfahren - wie das durch die vorliegende Erfindung angegebene - zur Lokalisierung der Introns und/oder der Exons im vorliegenden Fall von beträchtlichem gewerblichem Interesse sein kann. Dasselbe gilt für die Lokalisierung auch anderer biologisch interessanter DNA-Teile, wie z. B. Promotor-Regionen, Bindungsstellen spezieller Proteine, etc. Ergänzend sei bemerkt, daß gewisse numerische Analysen von DNA-Sequenzen (wie z. B. sogenannte Homologie-Vergleiche) schon heute eine ziemlich verbreitete Anwendung in der biotechnologischen und pharmazeutischen Forschung finden. Da die entsprechenden Rechenanlagen bei den diesbezüglichen Firmen bzw. Einrichtungen schon vorhanden sind, läßt sich das durch die vorliegende Erfindung vorgeschlagene Verfahren (mit seinen verschiedenen Varianten) ohne ho­ hen Kostenaufwand zur Anwendung bringen.

Claims (5)

1. Verfahren zur Bestimmung der biologischen Funktion und/oder Charakterisie­ rung von DNA- und RNA-Sequenzen von Organismen, wobei die Reihenfolge der Basen der jeweils betrachteten Sequenz durch

• a) eins der üblichen molekularbiologischen Verfahren bestimmt wird, oder
• b) aus Datenbanken und/oder einschlägigen Publikationen zu entnehmen ist,

gekennzeichnet durch die folgenden Merkmale:

• c) alle möglichen 16 Paare benachbarter Basen, im folgenden abgekürzt mit XY bezeichnet (wobei die Reihenfolge der Basen der üblichen Konven­ tion 5′-(Base X)-(Base Y)-3′ entspricht), werden in den folgenden zwei Klassen eingeteilt:
  • c.1) zur Klasse K1 gehören die möglichen XY-Paare AG, CT, CA, CG, TA und TG,
  • c.2) zur Klasse K2 gehören alle übrigen möglichen XY-Paare, d. h. GA, TC, AC, GC, TA, GT, AA, CC, GG und TT;
• d) zu jeder jeweils betrachteten Sequenz, genannt S, der Länge N (d. h., die Sequenz enthält N Basen) wird eine neue numerische Sequenz, genannt S*, der Länge (N-1) erzeugt durch die Ersetzung jedes Paares XY
  • d.1) durch die Zahl 1 (oder durch eine andere Zahl oder ein anderes geeignetes Symbol) falls XY der Klasse K1 angehört,
  • d.2) durch die Zahl 0 (oder durch eine andere Zahl oder ein anderes geeignetes Symbol, das sich jedoch von dem unter d.1 genannten unterscheiden muß) falls XY der Klasse K2 angehört;
• e) die nach Verfahrensschritten c und d eindeutig erzeugte numerische Se­ quenz S* wird einer oder mehrerer der üblichen numerischen Methoden der Signal- bzw. Meßreihenanalyse unterworfen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

• f) die im Verfahrensschritt c.1 genannte Klasse K1 neu definiert wird und jetzt die möglichen XY-Paare AG, CT, CA, CG und TG enthält, die im Verfahrensschritt c.2 genannte Klasse K2 alle übrigen möglichen XY-Paare enthält, und die übrigen Verfahrensschritte des kenn­ zeichnenden Teils unverändert bleiben.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

• g) die im Verfahrensschritt c.1 genannte Klasse K1 neu definiert wird und jetzt die möglichen XY-Paare CA, CG, TA und TG enthält, die im Verfahrensschritt c.2 genannte Klasse K2 alle übrigen möglichen XY-Paare enthält, und die übrigen Verfahrensschritte des kenn­ zeichnenden Teils unverändert bleiben.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

• h) die im Verfahrensschritt c.1 genannte Klasse K1 neu definiert wird und jetzt die möglichen XY-Paare AG, CT, GC, AA, TT, CC und GG enthält, die im Verfahrensschritt c.2 genannte Klasse K2 alle übrigen möglichen XY-Paare enthält, und die übrigen Verfahrensschritte des kenn­ zeichnenden Teils unverändert bleiben.