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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Verwendung eines Mediums zum
Einbetten von Zellen und Geweben, die native DNA und/oder natives
RNA enthalten, um deren Struktur zu erhalten, wenn sie aufbewahrt
wird. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren der Verwendung
des Einbettmediums zum Schützen
nativer DNA/RNA, die zur Verwendung bei einer DNA/RNA-Amplifikation bestimmt
sind, insbesondere durch PCR und RT-PCR.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Durch
Amplifikation mit der Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain
Reaction, PCR) können
von DNA oder mit der Reversen-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion
(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) von RNA Kopien
spezifischer Nukleinsäuresequenzen
(Fragmente) in hoher Zahl erhalten werden. Für Einzelheiten zur PCR siehe
PCR, A Practical Approach, McPherson, Quirke and Taylor, Hrsg. IRL
Press, Oxford 1991.
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Quantitative
PCR und RT-PCR werden verwendet, um pathologische Zustände von
Zellen und Geweben zu untersuchen, beispielsweise das Vorhandensein
pathogener Mikroorganismen und genetischer Mutationen, welche eine
Malignität
verursachen, beispielsweise eine Malignität in Lymphozyten, die aus Patienten
isoliert worden sind, bei denen der Verdacht besteht, dass sie an
einem Lymphom leiden, beispielsweise einem T- oder B-Zelllymphom des
Morbus Hodgkins. Meistens können
Zellen und Gewebe, die aus diesem Grund entnommen sind, nicht an
Ort und Stelle untersucht werden, sondern müssen vor der Testung eine gewisse
Zeit lang aufbewahrt werden. Es ist wichtig, dass die DNA wäh rend einer
solchen Aufbewahrung in ihrem nativen Zustand erhalten bleibt. Das
Problem der Aufbewahrung ist erheblich, da berichtet wurde (G. R.
Turbett and Loryn N. Sellner, Diagn. Mol. Pathol. 6(5): 298–303, 1997),
dass die Konservierung gefrorenen Gewebes in einem häufig gebrauchten
Einbettmedium „Optimal
Cutting TemperatureTM" (OTC) PCR und RT-PCR hemmen kann. „Native
DNA" und „native RNA" bezeichnen native
DNA/RNA in einer Gewebeprobe sowie isolierte native chromosomale DNA/RNA
und Sequenzen davon.
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AUFGABEN DER
ERFINDUNG
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Es
ist eine Aufgabe der Erfindung, eine Verwendung eines Mediums der
oben erwähnten
Art bereit zu stellen, welches DNA/RNA für längere Zeiträume in ihren nativen Zustand
konserviert.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Verwenden
eines Mediums bei der Konservierung nativer DNA/RNA in Zellen und
Geweben bereit zu stellen, die für
den Gebrauch in DNA/RNA-Amplifizierungsverfahren bestimmt sind.
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Weitere
Aufgaben der Erfindung werden bei der Lektüre der folgenden Zusammenfassung
der Erfindung, der Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen
und der beiliegenden Ansprüche
offensichtlich.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Verwendung eines Mediums bereit gestellt, das
im Wesentlichen aus einer wässrigen
Lösung
eines oder mehrerer wasserlöslicher
Cellulosederivate und wahlweise einem Mittel zum Stabilisieren des
osmotischen Drucks besteht, zum Einbetten einzelner Zellen oder
Zellgeweben zum Konservieren darin enthaltener nativer DNA und/oder
RNA in einem Zustand, der für
eine DNA- und/oder RNA-Amplifizierung geeignet ist, für einen
verlängerten
Zeitraum bei einer Temperatur, die 0°C nicht überschreitet.
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Bevorzugte
wasserlösliche
Cellulosederivate sind aus alkylierter, hydroxyalkylierter und alkylierter/hydroxyalkylierter
Cellulose ausgewählt.
Besonders bevorzugt ist Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose,
Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylmethylcellulose, Hydroxyethylethylcellulose,
Hydroxypropylmethylcellulose. Am meisten bevorzugt ist Hydroxypropylmethylcellulose
(HPMC). Am meisten bevorzugt ist Hydroxypropylmethylcellulose.
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Bevorzugte
DNA-Amplifizierungsverfahren umfassen die Polymerasekettenreaktion
(Polymerase Chain Reaction, PCR). Bevorzugte RNA-Amplifizierungsverfahren
umfassen die Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (Reverse
Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR).
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Der
verlängerte
Zeitraum, über
den native DNA und/oder RNA durch das erfindungsgemäße Verfahren
konserviert werden können,
ist zwei Monate oder mehr bei Temperaturen unter 0°C, vorzugsweise
bei einer Temperatur von –20°C oder weniger, am
meisten bevorzugt bei etwa –70°C. Der Begriff „konserviert" bezeichnet insbesondere
die konservierte Möglichkeit
einer DNA- und/oder RNA-Amplifizierung.
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Das
Mittel zum Stabilisieren des osmotischen Druckes kann jedes physiologisch
annehmbare Mittel sein, umfasst aber vorzugsweise eines oder mehrere
von Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid.
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Bevorzugte
Konzentrationen des löslichen Cellulosederivates
liegen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 5 Gew.-%. Wenn eine Kombination
aus löslichen Cellulosederivaten
verwendet wird, zeigen diese Zahlen ihre Gesamtkonzentration an.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist auch ein Verfahren der Amplifizierung nativer DNA und/oder
nativer RNA beschrieben, das Folgendes umfasst:
- – Beschaffung
einer Probe, die native DNA und/oder native RNA von einer Person,
einem Tier oder von einer einzelnen Zelle oder einer Vielzahl einzelner
Zellen enthält;
- – Bereitstellen
der Probe mit einer wässrigen
Lösung
zur Konservierung von DNA/RNA enthält, welche im Wesentlichen
aus einer oder mehreren wasserlöslichen
Cellulosederivaten und wahlweise einem Mittel zum Stabilisieren
des osmotischen Druckes besteht;
- – Einfrieren
der Kombination aus Probe und DNA/RNA-Konservierungslösung;
- – Lagern
der gefrorenen Kombination bei einer Temperatur von 0°C oder niedriger
für einen
verlängerten
Zeitraum:
- – Bringen
der gefrorenen Kombination auf eine Temperatur über 0°C;
- – Entfernen
der gesamten oder eines Teils der Konservierungslösung durch
Spülen
oder Waschen;
- – Wahlweise
Isolieren der DNA und/oder RNA aus der Probe;
- – Amplifizieren
der DNA und/oder RNA.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird DNA vorzugsweise durch die Polymerasekettenreaktion (Polymerase
Chain Reaction, PCR) amplifiziert, und RNA wird vorzugsweise durch
die Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (Reverse Transcriptase
Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)
amplifiziert.
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Wasserlösliche Cellulosederivate,
die für
das Verfahren geeignet sind, sind ausgewählt aus alkylierter, hydroxyalkylierter
und alkylierter/hydroxyalkylierter Cellulose ausgewählt. Insbesondere
umfassen sie Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose,
Ethylcellulose, Hydroxyethylmethylcellulose, Hydroxyethylethylcellulose,
Hydroxypropylmethylcellulose. Am meisten bevorzugt ist Hydroxypropylmethylcellulose
(HPMC).
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Gemäß einem
ersten bevorzugten Aspekt der Erfindung ist DANN beschrieben, die
durch Amplifikation von DANN erhalten wird, welche in nativer Form
(in Zellen oder Geweben) für
einen verlängerten
Zeitraum bei einer Temperatur unter 0°C in einer wässrigen Lösung gehalten wurde, die im
Wesentlichen aus einem wasserlöslichen
Cellulosederivat und wahlweise einem Mittel zum Stabilisieren des
osmotischen Druckes besteht. Die Amplifikation erfolgt vorzugsweise
durch die Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR).
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Gemäß einem
zweiten bevorzugten Aspekt der Erfindung ist RNA oder DANN beschrieben,
die durch Amplifikation von RNA erhalten wird, welche in nativer
Form in Zellen oder Geweben für
einen verlängerten
Zeitraum bei einer Temperatur unter 0°C in einer wässrigen Lösung gehalten wurde, die im
Wesentlichen aus einem wasserlöslichen
Cellulosederivat und wahlweise einem Mittel zum Stabilisieren des osmotischen
Druckes besteht. Die Amplifikation erfolgt vorzugsweise durch die
Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (Reverse Transcriptase
Polymerase Chain Reaction, RT-PCR).
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Weitere
Vorteile und Anwendungen der Erfindung werden durch die Lektüre der Beschreibung bevorzugter
Ausführungsformen
der Erfindung und der Ansprüche
offensichtlich.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die
Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf eine Reihe von bevorzugten,
aber nicht einschränkenden
Ausführungsformen
davon ausführlich erläutert, die
in einer Zeichnung veranschaulicht sind, welche eine Reihe von elektrophoretischen
Auftrennungsdiagrammen auf Agarose von DANN und RNA umfassen, die
respektive in PCR- und RT-PCR-Assays
erhalten wurden, wobei Folgendes gezeigt ist:
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1 Die
Bildung eines durch PCR in Gegenwart des erfindungsgemäßen HPMC-Mediums und
eines Gewebekonservierungsmediums aus dem Stand der Technik aus
humaner DANN erhaltenen Betaglobinfragmentes mit 268 Basenpaaren;
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2 Die
Bildung eines durch RT-PCR aus humaner mRNA in Gegenwart des erfindungsgemäßen HPMC-Mediums
und eines Gewebekonservierungsmediums aus dem Stand der Technik
erhaltenen Betaaktinfragmentes mit 259 Basenpaaren;
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3 Die
Bildung des Betaglobinfragmentes mit 268 Basenpaaren aus 1,
welches durch PCR aus DANN der humanen Zelllinie U2904 in Gegenwart
des erfindungsgemäßen HPMC-Mediums
und eines Gewebekonservierungsmediums aus dem Stand der Technik
erhalten wurde;
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4 Die
Bildung des Betaglobinfragmentes mit 536 Basenpaaren durch PCR genomischer DANN
aus B-Lymphozytenzellen U2904, die in Gegenwart des erfindungsgemäßen HPMC-Mediums und eines
Gewebekonservierungsmediums aus dem Stand der Technik bei –70°C aufbewahrt
worden sind.
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5 Die
Bildung des Betaglobinfragmentes mit 536 Basenpaaren durch PCR genomischer DANN
aus B-Lymphozytenzellen U2904, die in Gegenwart des erfindungsgemäßen HPMC- Mediums und eines
Gewebekonservierungsmediums aus dem Stand der Technik bei –20°C aufbewahrt
worden sind.
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6 Die
Bildung des Betaaktinfragmentes mit 259 Basenpaaren durch RT-PCR
zytoplasmatischer mRNA aus t(99;22)-positiven K562-Zellen, die in
Gegenwart des erfindungsgemäßen HPMC-Mediums
und eines Gewebekonservierungsmediums aus dem Stand der Technik
bei –70°C aufbewahrt
worden sind.
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7 Die
Bildung des Betaaktinfragmentes mit 259 Basenpaaren durch RT-PCR
zytoplasmatischer mRNA aus t(99;22)-positiven K562-Zellen, die in
Gegenwart des erfindungsgemäßen HPMC-Mediums
und eines Gewebekonservierungsmediums aus dem Stand der Technik
bei –20°C aufbewahrt
worden sind.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
DER ERFINDUNG
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Zellproben
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- a) [für
PCR] U2904 monoklonale B-Lymphozyten, bei denen die spezifische
Neuanordnung des Immunglobulingens als ein klonaler Marker dient, wurde
als eine positive PCR-Kontrolle für klonale B-Zell-Analyse verwendet,
um monoklonale Proliferation wie beispielsweise B-Zellmalignitäten festzustellen.
- b) [für
PCR] B-Lymphozyten, die aus einem Patienten mit Verdacht auf hämopathologische
lymphoproliferative Krankheit mit Lymphoprep® (Nycomed,
Norwegen) isoliert und in PBS gewaschen wurden.
- c) [für
RT-PCR] t(99;22)-positive Zelllinie K562.
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Zellbehandlung
und -aufbewahrung. Es wurden Proben von etwa 50 × 106 Zellen
pelletiert.
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Kontrollen:
Fünf Proben
wurden bei –20°C, fünf bei –70°C aufbewahrt
und nach dem Standard für
molekularpathologische Analysen, d. h. ohne Zugabe eines Reagens,
behandelt.
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Mit
OTC-Medium behandelte Proben und mit HPMC-Medium behandelte Proben:
Zehn Proben jedes Mediums wurden mit einer Schicht des entsprechenden
Mediums überlagert.
Von jedem Medium wurden fünf
Proben bei –20°C und fünf bei –70°C aufbewahrt.
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Alle
Proben wurden 2 Monate lang aufbewahrt.
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Präparation
von RNA und DNA. Die Pellets wurden aufgetaut und in PBS durch wiederholte
Resuspension und Zentrifugation bei etwa 2.000 × g für 1 Min. zweimal gewaschen,
um das Einbettmedium zu entfernen.
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Zytoplasmatische
RNA wurde gewonnen, indem zu dem Pellet von K562-Zellen ein wässriger
Lysepuffer gegeben wurde, der 0,14 M Natriumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid
und 10 mM Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 8,6 enthielt. Darüber hinaus
wurde 20 mM Vanadylribonukleosidkomplex und 1 mM Dithiothreitol
Nonidet P-40 zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,5 Gew.-%
herzustellen. Zur Lyse wurden die Zellen in dem Lysepuffer suspendiert
und auf Eis 5 Min. lang inkubiert. Die Suspension wurde bei 15.000 × g 1,5
Min. lang zentrifugiert. Für
die Isolierung von genomischer DNA aus t(99;22)-positiven K562-Zellen
wurde das Pellet aus Zellkernen verwendet. Der Überstand wurde in ein anderes
Röhrchen überführt und
mit einem Proteinverdau-Puffer gemischt, der 0,2 M Tris mit einem
pH-Wert von 8,0, 0,3 M Natriumchlorid, 2% SDS und 80 ng/μl Proteinase
K enthielt. Die Lösung
wurde 30 Min. lang bei 56°C
inkubiert, gründlich
mit 500 μl
Phenol gemischt und 5 Min. bei 2.500 × g zentri fugiert. Die obere
Phase wurde in ein neues Röhrchen überführt, mit
500 μl kaltem
Isopropanol gemischt, um zytoplasmatische RNA auszufällen, 30
Min. lang bei 15.000 × g
bei einer Temperatur von 4°C
zentrifugiert. Das dadurch gebildete RNA-Pellet wurde in einem geeigneten
Volumen von mit wässrigem
DEPC (Diethylpyrocarbonat) behandeltem Wasser aufgelöst.
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Genomische
DNA von U2904-B-Lymphozyten oder den Lymphozyten von dem Patienten
wurde gewonnen, indem je 106 Zellen 20 μl 1 × PCR-Puffer (unten
beschrieben) und Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von
300 μg/ml
zugegeben wurden. Die Zellen wurden 4 Std. lang bei 56°C, anschließend 4 Min.
lang auf 95°C
erhitzt, um Proteinase K zu inaktivieren. Nach dem Pelletieren der
Zelltrümmer durch
10-minütige
Zentrifugation bei 12.000 × g
wurde je PCR-Reaktion
mit einem Gesamtvolumen von 15 μl
1 μl des Überstandes
verwendet. Bei Anwendung dieses Verfahrens war es nicht möglich, die DNA-Konzentration
spektroskopisch zu ermitteln. Die DNA-Konzentration wurde ausgehend
von der Tatsache, dass jede Zelle 6 pg DNA enthält und in 1.015 μl Lösung 50 × 106 Zellen lysiert wurden, auf 300 ng/μl berechnet.
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PCR
und RT-PCR. Zur Bestimmung des Abbaugrades nativer DNA durch Aufbewahrung
in verschiedenen Medien wurden drei PCR-Assays und ein RT-PCR Assay
verwendet. Zur Bestimmung von Betaglobulin, welches als Laborqualitätskontrolle
für genomische
DNA diente, wurden zwei PCR-Assays mit Primer-Paaren aufgesetzt,
die Fragmente von respektive 268 bp und 536 bp erzeugen; die Verfahren wurden
in Bezug auf die Magnesiumchloridkonzentration (1,5 mM) optimiert.
Der dritte PCR-Assay betraf den Nachweis von Immunglobulingenen
mithilfe von Konsensusprimern (M. Deane and J. D. Norton, Immunoglobulin
Gene „Fingerprinting", an Approach to
Analysis of B-lymphoid Clonality in Lymphoproliferative Disorders.
British J. Haematol. 1991, 77: 274–281), die in der klinischen
Routine zum Feststellen von B-Zell-Malignitäten verschiedener Art verwendet
werden. Die dabei gebildeten Amplikons variieren von 280–350 bp.
Als Vorlage (Template) wurde genomische DNA von U2904 verwendet.
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Zum
Analyiseren isolierter RNA wurde der RT-PCR-Assay durchgeführt, bei dem als Ziel für Betaaktin
kodierende mRNA und spezifische Primer, die ein Fragment mit 392
bp erzeugen, verwendet wurden.
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Die
PCR- und RT-PCR-Assays wurden in Thermocyclern (GeneAmp PCR-System
Modell 9600 und 9700, PE Biosystems; es wurde davon ausgegangen,
dass die Modelle gleichwertige Ergebnisse liefern) durchgeführt.
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PCR-
und RT-PCR-Immunglobulingen-Analyse in B-Zellen; die Reagenzien wurden von PE
Biosystems, Folter City, CA, USA, Erworben. 5'Ende-Primer VH3 (Sequenz: GGT CCC TGA
GAC TCT CCT GTG CA); 3'-Ende-Primer
VLJH (Sequenz: ACC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT). Die PCR-Reaktion
wurde in PCR-Puffer durchgeführt,
der 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl, pH 8,3, 0,5 μM Primer, 3 mM Magnesiumchlorid,
0,2 mM jedes Nukleotids (dATP, dCTP, dGTP und dUTP), 0,025 E/μl Ampli-Taq-Polymerase enthielt.
Um einen Heißstart
zu erreichen wurde der Polymerase der TaqStart-Antikörper (Clontech
Laboratories, Palo Alto, CA, USA) zugegeben. Zyklusbedingungen:
40 Zyklen mit je 95°C,
30 Sek.; 69°C,
30 Sek.; 72°C,
30 Sek.. Betaglobinanalyse: 5-Ende-Primer GH 20 (Sequenz: GAA GAG
CCA AGG ACA GGT AC); 3'-Ende-Primer
PC 04 (Sequenz: CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC). Das Primerpaar erzeugte
ein Amplikon einer Länge
von 268 bp. Zum Erhalten eines Amplikons von 536 bp wurden der 5'-Ende-Primer KM29
(Sequenz : GGT TGG CCA ATC TAC TCC CAG G) und der 3'-Ende-Primer RS 42 (Sequenz:
GCT CAC TCA GTG TGG CAA AG) verwendet. Die PCR-Reaktion wurde unter
den gleichen Bedingungen wie für
das Immunglobulingen durchgeführt,
außer,
dass die Konzentration von Magnesiumchlorid 1,5 mM war. Die Zyklus bedingungen waren
ebenfalls gleich, außer,
dass die Anheftungs-(Annealing)-Temperatur 55°C war.
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Für die Betaaktinanalyse
wurden zwei Primer der Sequenz TGG GTC ATC TTC TCG CGG TT und GTG
GGG CGC CCC AGG CAC CA verwendet, die ein Amplikon der Länger von
259 bp produzieren. Die RT-PCR-Reaktion wurde mit rtTH-Enzym (hergestellt
von PE Biosystems) als Reverse Transkriptase und Polymerase nach
den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Die Konzentration von
Manganacetat war 2,5 mM. Zyklusbedingungen: 1 Zyklus von 60°C, 30 Min.
und 94°C,
2 Min.; gefolgt von 40 Zyklen von jeweils 94°C, 30 Sek. und 60°C, 1 Min.
Die Verlängerung
(Extension) fand bei 72°C
für 2 Min.
statt.
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Elektrophorese
von Amplikons und genomischer DNA. Um einen eventuellen DNA-Abbau
festzustellen, wurde mit 10 μg
genomischer DNA eine Elektrophorese in einem 2%igen Agarosegel durchgeführt. Dasselbe
Gelmedium wurde zur Feststellung von Amplikons verwendet. Mit Hae
III gespaltene PhIX-DNA (Promega, Madison, WI, USA) wurde als ein
DNA-Größenmarker
verwendet. Der Ladepuffer bestand aus Glycerol und Bromphenolblau.
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Feststellung
des pH-Wertes von Zell- und Gewebekonservierungsmedium. Geschätzt durch Verwendung
von pH-Indikatorstäbchen
(Merck, Darmstadt), pH-Bereich 5–10 und 7,5–14.
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Kontrollen.
In den verschiedenen Experimenten bezeichnet "Kontrolle(n)" Proben des respektiven Zelltyps, die
nicht mit Zellkonservierungsmedium versehen wurde, sondern ansonsten
auf die gleiche Weise wie die mit dem Zellkonservierungsmedium versehenen
Proben behandelt wurden.
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Beobachtungen
während
der Gewinnung von RNA in Gegenwart von Zellkonservierungsmedium.
Bei der Gewinnung von RNA und DNA wurde beobachtet, dass die mit
OTC-Medium bei –70°C eingefrorenen
und aufbewahrten Zellpellets in PBS leicht resuspendiert wurden.
Zentrifugation der resuspendierten Zellen führte jedoch zu Lyse; anstelle
eines neues Pellets bildete sich eine visköse Masse, die sich nicht vom Überstand
trennen ließ.
Die Isolierung von RNA aus den Proben erwies sich als schwierig oder
in manchen Fällen
als unmöglich.
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Pellets,
die mit HPMC-Medium eingefroren und aufbewahrt wurden, bildete eine
agglutinierte Masse, die sich nicht leicht resuspendieren ließ. Bei Verwendung
zur Gewinnung von RNA verhielten sich die mit HPMC-Medium behandelten
agglutinierten Zellen jedoch wie unbehandelte Zellen und lieferten einen
guten Ertrag von RNA.
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BEISPIEL 1
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Effekt
von zugegebenem Konservierungsmittel zur PCR. Zu aus frischen U2904-Zellen
gewonnener DNA wurde 10% (Vol./Vol.) OTC-Medium oder HPMC-Medium
gegeben (3 μl
je PCR-Reaktion mit 30 μl).
Dies ist wesentlich mehr Einbettmedium, als normalerweise in DNA,
die aus einem Stück
eingefrorenen Gewebes gewonnen wird, aus Versehen, beispielsweise
durch unzureichendes Spülen,
auf einem Stück
eingefrorenen Gewebes verbleiben würde. PCR (1):
Betaglobin, 268-bp-Amplikon. Identifikation der Spuren: 1, 2, Positivkontrollen;
3, 4, 10% (Vol./Vol.) HPMC; 5, 6, 10% (Vol./Vol.) OTC; 7, Marker.
RT-PCR (2): Betaaktin, 259-bp-Amplikon. Identifikation
der Spuren: 1, 2, Positivkontrollen; 3, 4, 10% (Vol./Vol.) HPMC;
5, 6, 10% (Vol./Vol.) OTC; 7, Marker.
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Wie
aus 1 und 2 ersichtlich ist, sind die
PCR und RT-PCR nur am Rande von der Gegenwart erheblicher Mengen
von erfindungsgemäßem HPMC-Medium
betroffen; entsprechende Mengen des Zellkonservierungsmediums OTC
aus dem Stand der Technik wirken in denselben Assays zerstörend.
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BEISPIEL 2
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Effekt
der Zugabe variierender Mengen von Zellkonservierungsmedium zu PCR.
Bedingungen wie in Beispiel 1. 3: Betaglobin,
268-bp-Amplikon. Identifikation der Spuren: 1, 10% (Vol./Vol.) HPMC;
2, 20% (Vol./Vol.) HPMC; 3, 30% (Vol./Vol.) HPMC; 3, 40% (Vol./Vol.)
HPMC, 5, Marker; 1a, 10% (Vol./Vol.) OTC; 2a, 5% (Vol./Vol.) OTC;
3a, 2,5% (Vol./Vol.) OTC; 4a, 1,25% (Vol./Vol.) OTC; 5a, 1% (Vol./Vol.)
OTC; 6a, (0,5); 7a, Marker. Wie in 3 gezeigt,
is die PCR nur am Rande von der Gegenwart erheblicher Mengen von
erfindungsgemäßem HPMC-Medium
in einer Konzentration von 30% (Vol./Vol.) betroffen, während das
OTC-Medium aus dem Stand der Technik bei Konzentrationen (Vol./Vol.) über etwa
1% zerstörend
wirkt.
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BEISPIEL 3
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Konservierung
genomischer DNA in Zellen, die in Gegenwart von Konservierungsmedien
aufbewahrt werden. Größenanalyse
der genomischen DNA-Fragmente auf Agarose zeigte, dass der DNA-Abbau
in OTC-behandelten U2904-Zellen, die bei –20°C gelagert wurden, praktisch
vollständig
war, während
ein PCR-Assay dieser DNA-Präparationen zeigte,
dass in manchen Proben ausreichend intakte DNA als Vorlage (Template)
für die
Amplifikation übrig
war (5, Spur 11–15). Ähnliche
Ergebnisse wurden bei einer Aufbewahrungstemperatur von –70°C erhalten
(4, Spur 12–16).
Dagegen produzierte DNA von Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen HPMC-Medium
behandelt wurden, große
Mengen von Amplikons in allen Proben bei beiden Aufbewahrungstemperaturen
(4, Spur 7–11
und 5, Spur 6–10,
Spur 1–5
in diesen Figuren sind Kontrollen).
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BEISPIEL 4
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Konservierung
zytoplasmatischer RNA in Zellen, die in Zellkonservierungsmedium
aufbewahrt werden. RT-PCR mit RNA, die aus gelagerten U2904-Zellen
isoliert wurde: Ziel Betaaktin, PCR-Fragment mit etwa 259 bp, 6;
Aufbewahrungstemperatur –70°C; Spuridentifikation:
1–5, Kontrollen;
6–10,
HPMC (RNA konnte aus den bei –70°C in OTC
aufbewahrten Zellen nicht gewonnen werden); 14, Marker. 7:
Aufbewahrungstemperatur –20°C; Spuridentifikation:
1–5, Kontrollen;
6, 7, 9–11, HPMC;
8, Marer; 12–15,
OTC; 16, Marker. Aus 6 und 7 ist es
ersichtlich, dass die Konservierung zytoplasmatischer RNA mit OTC-Medium
schlecht ist, während
sie mit dem erfindungsgemäßen HPMC-Medium
gut ist. Während
die Konservierung bei –70°C selbst
in Abwesenheit eines Konservierungsmediums gut ist, wurde in Abwesenheit
von Medium bei einer Aufbewahrungstemperatur von –20°C keine Konservierung
beobachtet.
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Anmerkungen
zu den Beispielen in Bezug auf OTC-Medium. Man würde erwarten, dass DNA in bei –20°C aufbewahrten
Zellen von OTC-Medium mehr betroffen ist als in Zellen, die bei –70°C aufbewahrt
werden. Dies trifft jedoch nicht zu. Während zwei von fünf Proben,
die bei –70°C aufbewahrt
wurden, gar nicht amplifiziert werden konnten, enthielten alle 5
Proben, die bei –20°C aufbewahrt
wurden, amplifizierbare DNA, aber die DNA war von viel schlechterer
Qualität
als von unbehandelten Zellen oder von Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen HPMC-Medium
behandelt wurden, wie sich an der Anzahl der produzierten Amplikons
zeigte (vergleiche 5).